JP7082050B2 - 脊髄性筋萎縮症の処置において有用なアデノ－関連ウイルスベクター - Google Patents

Description

脊髄性筋萎縮症の処置に有用な組成物及び方法を提供する。該組成物はＡＡＶキャプシド、例えばＡＡＶｒｈ．１０キャプシド及び機能があるＳＭＮタンパク質をコードする核酸配列を含む組換えアデノ関連ウイルスベクターを含む。前記方法は、これらの組成物を必要のあるヒトに投与することを含む。

電子形態で提出された材料の文献援用
出願人は、電子形態で添付して申請される配列表材料を、本明細書の一部を構成するものとして援用する。このファイルは“１６－７６５５ＰＣＴ＿ＳＥＱ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ”と標識される。

発明の背景
脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）は、スプライセオソーム（ｓｐｌｉｃｅｓｏｍｅ）生合成に含まれる普遍的に発現されるタンパク質（ｓｕｒｖｉｖａｌ ｏｆ ｍｏｔｏｒ ｎｅｕｒｏｎ－ＳＭＮ）をコードする遺伝子であるテロメアＳＭＮ１中の突然変異により引き起こされる神経筋疾患である。不明確な理由で、ＳＭＮ欠乏は下位運動ニューロンへの選択的な毒性を生じ、進行性のニューロン消失及び筋力低下を生ずる。疾患の重篤度は、少量の全長ＳＭＮ転写物の産生しか生じないスプライス部位の突然変異を有する相同遺伝子（ＳＭＮ２）のセントロメア複製のコピー数により変化する。１－２個のＳＭＮ２のコピーを有する患者は、ＳＭＡの重症を呈し、それは生後数か月内の発症及び呼吸不全への急速な進行を特徴とする。３個のＳＭＮ２のコピーを有する患者は、一般に軽症の疾患を示し、典型的には６月齢後に発症する。多くは歩行能力を得ることはないが、めったに呼吸不全に進行せず、多くの場合に成人まで生きる。４個のＳＭＮ２のコピーを有する患者は成人まで発症せず、筋力低下が徐々に発症する。緩和ケア以外にＳＭＡのための現在の処置はない。

ＳＭＮ機能の消失と疾患の重篤度の間の関連性は、ＳＭＡを遺伝子療法に関する標的候補とする。アデノ関連ウイルス、ＡＡＶ８－ｈＳＭＮのＳＭＡ－マウスモデルにおけるＣＮＳ（中枢神経系）への投与を含む以前の研究は、脊髄におけるＳＭＮの発現を示し、ＳＭＡ表現型を救い得ることを示した；しかしながら運動ニューロンの数の控えめな保存しか生じず－長期生存は達成されなかった（非特許文献１）。

ＳＭＮ遺伝子産物は細胞内にあることが理由の一部であるため、疾患は遺伝子療法に関する独特の挑戦を与える。かくして含まれる運動ニューロンの原因となる（ｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇ）サブセットに関する安定した形質導入効率は、薬効性のために重要である。処置のための代替的な方法は、ＳＭＮ２のスプライシングを変えて、ＳＭＮタンパク質の産生を増加させるために、マウスＣＮＳに注入されるアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用を研究した。（非特許文献２）。

遺伝子療法に関し、ＡＡＶ９は、ＣＮＳへの遺伝子の導入を含む動物研究において達成された結果に基づいて、最適のベクターとして浮上した。例えばＳＭＡマウスモデルにおけるＳＭＮのＡＡＶ９形質導入の用量－反応研究に基づき、Ｐａｓｓｉｎｉは非ヒト霊長類（“ＮＨＰｓ”）においてクモ膜下腔内に注入されるＡＡＶ９の用量を試験し、運動ニューロンへのマーカー遺伝子（緑色蛍光タンパク質、“ＧＦＰ”）の十分な導入が達成されたか否かを決定した。（非特許文献３）。そして他の研究者はＡＡＶ９のクモ膜下腔内注入を受けたマウス及びＮＨＰｓのＣＮＳにおけるＧＦＰの広範囲の分布を報告した。（
非特許文献４及び非特許文献５）。ＡＡＶ９の全身的送達は血液脳関門を通過し、ＣＮＳへのＧＦＰの広範囲の遺伝子導入を達成することも示された。（非特許文献６；非特許文献７）。

近年、マウスにおける多くの組織の形質導入のために少なくともＡＡＶ９と同様に有効であると報告された別のＡＡＶベクターである、ＡＡＶｒｈ１０を分析し、新生仔マウスにおける血管内送達後のＣＮＳ及びＰＮＳ（末梢神経系）へのマーカー遺伝子ＧＦＰの遺伝子導入を達成する能力を比較した。低用量のＡＡＶｒｈ１０は試験された組織においてより高い形質導入を引き起こすように思われたが、治療効果のために必要と考えられるより高い用量において、差はあまり明白でなかった。（非特許文献８）。

必要なのはＳＭＡのための有効な処置である。

Ｐａｓｓｉｎｉら、２０１０，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １２０：１２５３－１２６４ Ｐａｓｓｉｎｉら、２０１１，Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ３：７２ｒａ１８ Ｐａｓｓｉｎｉら、２０１４，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２５：６１９－６３０ Ｍｙｅｒら、２０１４，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２３：４７７－４８７ Ｈｉｎｄｅｒｅｒら、２０１４，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ １：１４０５１ Ｆｏｕｓｔら、２００９，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２７：５９－６５ Ｄｕｑｕｅら、２００９，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １７：１１８７－１１９６ Ｔａｎｇｕｙら、２０１５，Ｆｒｏｎｔ Ｍｏｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ８：ａｒｔｉｃｌｅ ３６

１つの側面において、アデノ－関連ウイルスベクター（ＡＡＶ）ベクターは、ＡＡＶｒｈ１０キャプシドと、ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ（ｓ））及びＳＭＮタンパク質をコードする核酸配列及び宿主細胞におけるＳＭＮの発現を方向付ける発現調節配列を含むベクターゲノムとを含む。

さらなる側面において本発明は、核酸を包むＡＡＶｒｈ１０キャプシドを有し、動物の患者におけるクモ膜下腔内投与に適した組換えアデノ－関連ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）に関し、前記核酸は、ＡＡＶＩＴＲ（ｓ）（逆位末端反復）を含み、ＳＭＮをコードし、宿主細胞におけるＳＭＮ発現を方向付ける調節エレメントにより調節される（“ｒＡＡＶ．ＳＭＮ”）。そのようなｒＡＡＶ．ＳＭＮｓは、複製欠損性であり、ＳＭＮ欠乏と診断される患者；特にＳＭＡと診断されるヒトの患者のＣＮＳにＳＭＮを送達するために有利に用いられ得る。好ましい態様において、ｒＡＡＶは脳及び脊髄においてニューロンそして特に運動ニューロンを形質導入する。別の好ましい態様において、本発明のｒＡＡＶは、処置されるべき患者中に存在する場合があるＡＡＶ９キャプシドへの抗血清により中
和されない。ある態様において、核酸配列は配列番号１又はそれと少なくとも９５％の同一性を共有する配列をコードする。

ある態様において、ヒトＳＭＮタンパク質（“ｈＳＭＮ”）タンパク質をコードする核酸配列をコドン最適化することができる。例えばＳＭＮタンパク質をコードする核酸配列は配列番号２のＳＭＮ１配列又はそれと少なくとも７０％の同一性を共有する配列である。

別の側面において、製薬学的に許容され得る担体及び本明細書に記載されるｒＡＡＶベクターを含む製薬学的組成物を提供する。

さらに別の側面において、患者における脊髄性筋萎縮症の処置方法を提供する。方法は、本明細書に記載される製薬学的組成物を必要のある患者に投与することを含む。

さらに別の側面において、患者においてＳＭＮを発現させる方法を提供する。１つの態様において、方法は本明細書に記載される製薬学的組成物を必要のある患者に投与することを含む。

本発明の他の側面及び利点は、以下の本発明の詳細な記述から容易に明らかになるであろう。

ＳＭＮベクターゲノム構造を示す図である。ＩＴＲ＝ＡＡＶ２逆位末端反復。ＣＢ７＝サイトメガロウイルスエンハンサーを有するチキンベータアクチンプロモーター。ＲＢＧ＝ウサギベータグロブリンポリアデニル化シグナル。 ベクター処置されたＳＭＮΔ７マウスの脊髄及び後根神経節におけるヒトＳＭＮ発現を示す顕微鏡写真である。コドン－最適化されたヒトＳＭＮ ｃＤＮＡ及びＣＢプロモーターから成る発現コンストラクトをＡＡＶｒｈ１０キャプシド中に包んだ。新生ＳＭＮΔ７マウスの顔面静脈中に５ｘ１０¹⁰個のＧＣを注入した。生後７日に動物を犠牲にし、ヒトＳＭＮに対する抗体（２Ｂ１，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）で組織を染色した。脊髄はたまに形質導入された細胞を示したが、後根神経節は多くが形質転換された。 ｐＡＡＶ．ＣＢ７．Ｃ１．ｈＳＭＮを用いるＨＥＫ ２９３及びＨｕｈ７細胞ライセート＋／－トランスフェクションのウエスターンブロットである。リポフェクタミン２０００を用いて９０％の集密度で細胞をトランスフェクションし、４８時間後に収穫した。 図４Ａ及び図４Ｂは、本明細書に記載されるコドン最適化された配列（クエリー；配列番号２）に対する天然の（ｎａｔｉｖｅ）ｈＳＭＮ１，変異型ｄ（アクセッション番号ＮＭ＿０００３４４．３）（サブジェクト；配列番号３）のアラインメントである。 図４Ａ及び図４Ｂは、本明細書に記載されるコドン最適化された配列（クエリー；配列番号２）に対する天然の（ｎａｔｉｖｅ）ｈＳＭＮ１，変異型ｄ（アクセッション番号ＮＭ＿０００３４４．３）（サブジェクト；配列番号３）のアラインメントである。 本明細書に記載されるＡＡＶｒｈ．１０．ｈＳＭＮ１コンストラクトのプラスミドマップである。 実施例２に記載されるものに類似の種々の用量のＡＡＶｒｈ．１０．ｈＳＭＮ１を用いて静脈内処置されたＳＭＮΔ７仔マウスの生存曲線である。

発明の詳細な説明

遺伝子操作されたヒト（ｈ）生存運動ニューロン１（ＳＭＮ１）ｃＤＮＡが本明細書に
提供され、それは天然のｈＳＭＮ１配列と比較して翻訳を最大にするように設計された（図５及び配列番号３に示される通り）。５’キャッピング及びｍＲＮＡの安定性を向上させるためにイントロンをコード配列の上流に導入した（図５及び配列番号４を参照されたい）。

遺伝子操作されたｈＳＭＮ１配列を含むウイルスベクターも本明細書に提供される。これらの組成物を本明細書に説明される通りに脊髄性筋萎縮症の処置方法において用いる場合がある。比較の目的で、天然のヒトＳＭＮ１コード配列及び遺伝子操作されたｃＤＮＡのアラインメントを図４に示す。

国際ＳＭＡコンソーシアム分類（ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＳＭＡ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ）は、発症の年齢及び運動発達の目安（ｍｏｔｏｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｍｉｌｅｓｔｏｎｅ）に応じて、ＳＭＡ表現型におけるいくつかの重篤度を定義している。ＳＭＡ０指定は出生前発症ならびに重症の関節拘縮、顔面両麻痺及び呼吸不全を反映するように提案されている。Ｉ型ＳＭＡ、Ｗｅｒｄｎｉｇ－Ｈｏｆｆｍａｎｎ Ｉ病は生後６ヶ月以内に発症する最も重症の出生後形態である。患者は起き上がることができず、重症の呼吸機能障害を有する。ＩＩ型ＳＭＡは最初の２年以内に発症する中程度の形態である；子供は起き上がることができるが、歩行できない。臨床経過は様々である。ＩＩＩ型（Ｋｕｇｅｌｂｅｒｇ－Ｗｅｌａｎｄｅｒ病とも呼ばれる）は２歳より後に始まり、通常は慢性の展開を有する。子供は少なくとも幼少期には自力で立ち歩くことができる。成人形態（ＩＶ型）は最も軽度であり、３０歳より後に発症する；数例しか報告されておらず、その頻度は正確に知られていない。

ＳＭＡは常染色体劣性遺伝疾患であり、ＳＭＡ患者の約９５％はＳＭＮ１遺伝子のエクソン７及び８（又はエクソン７のみ）のホモ接合不在（ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ ａｂｓｅｎｃｅ）を有する。患者の残りはＳＭＮ１突然変異に関して複合ヘテロ接合体であり、一方の染色体上に微細突然変異（ｓｕｂｔｌｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ）及び他方の上に欠失又は遺伝子変換を有する。機能があるＳＭＮ１遺伝子を与えることは表現型を救い得ることが示された。上記で引用されたＴａｎｇｕｙを参照されたい。

１つの側面において、機能があるＳＭＮタンパク質をエンコードするコード配列を提供する。１つの態様において、機能があるＳＭＮ１のアミノ酸配列は配列番号１の配列又はそれと９５％の同一性を共有する配列である。１つの態様において、改変ｈＳＭＮ１コード配列を提供する。好ましくは、改変ｈＳＭＮ１コード配列は全長の天然のｈＳＭＮ１コード配列（図４、配列番号３）と約８０％未満の同一性、好ましくは約７５％以下の同一性を有する。１つの態様において、改変されたｈＳＭＮ１コード配列は、天然のｈＳＭＮ１と比較される時のＡＡＶ－媒介送達（例えばｒＡＡＶ）後の翻訳速度の向上を特徴とする。１つの態様において、改変ｈＳＭＮ１コード配列は、全長の天然のｈＳＭＮ１コード配列と約８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％、７０％、６９％、６８％、６７％、６６％、６５％、６４％、６３％、６２％、６１％又はそれ未満の同一性を共有する。１つの態様において、改変ｈＳＭＮ１コード配列は配列番号２又は配列番号２と７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくはそれより高い同一性を有する配列である。

核酸配列の文脈における「パーセント（％）同一性」、「配列同一性」、「パーセント配列同一性」又は「パーセント同一の」という用語は、対応させるために整列させた時に２つの配列で同一の残基を指す。配列同一性を比較する長さは、ゲノムの全長か、遺伝子コード配列の全長か、又は少なくとも約５００～５０００個のヌクレオチドのフラグメントかが望ましい。しかしながら、例えば、少なくとも約９個のヌクレオチド、通常少なくとも約２０～２４個のヌクレオチド、少なくとも約２８～３２個のヌクレオチド、少なく
とも約３６個以上のヌクレオチドのより短いフラグメント間の同一性が望ましい場合もある。

全長のタンパク質に及ぶアミノ酸配列、ポリペプチド、約３２個のアミノ酸、約３３０個のアミノ酸又はそのペプチドフラグメントあるいは対応する核酸配列コード配列に関してパーセント同一性を容易に決定することができる。適したアミノ酸フラグメントは少なくとも約８個の長さのアミノ酸である場合があり、最高で約７００個のアミノ酸である場合がある。一般に２つの異なる配列間の「同一性」、「相同性」又は「類似性」に言及する場合、「同一性」、「相同性」又は「類似性」は「整列した」配列を参照して決定される。「整列した」配列又は「アラインメント」は、多くの場合に参照配列と比較して欠失しているか又は追加の塩基又はアミノ酸に関する修正を含む複数の核酸配列又はタンパク質（アミノ酸）配列を指す。

アラインメントは、公開されているか又は商業的に入手可能な多様な複数配列アラインメントプログラム（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍｓ）のいずれかを用いて行われる。アミノ酸配列に関して配列アラインメントプログラム、例えば“Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ”、“ＭＡＰ”、“ＰＩＭＡ”、“ＭＳＡ”、“ＢＬＯＣＫＭＡＫＥＲ”、“ＭＥＭＥ”及び“Ｍａｔｃｈ－Ｂｏｘ”プログラムが入手可能である。一般にこれらのプログラムのいずれもデフォルト設定で用いられるが、当該技術分野における熟練者は必要に応じてこれらの設定を変えることができる。あるいはまた、当該技術分野における熟練者は、少なくとも言及されたアルゴリズム及びプログラムにより与えられる同一性又はアラインメントと同様のレベルのそれらを与える別のアルゴリズム又はコンピュータープログラムを用いることができる。例えばＪ．Ｄ．Ｔｈｏｍｓｏｎら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，“Ａ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ”，２７（１３）：２６８２－２６９０（１９９０）を参照されたい。

複数配列アラインメントプログラムが核酸配列に関しても入手可能である。そのようなプログラムの例には“Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ”、“ＣＡＰ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｓｓｅｍｂｌｙ”、“ＢＬＡＳＴ”、“ＭＡＰ”及び“ＭＥＭＥ”が含まれ、それらはインターネット上のウェブサーバー（Ｗｅｂ Ｓｅｒｖｅｒｓ）を介して利用可能である。そのようなプログラムに関する他の源は当該技術分野における熟練者に既知である。あるいはまた、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩユーティリティーも用いられる。上記のプログラム中に含有されるものも含めて、ヌクレオチド配列同一性の測定に用いられ得る当該技術分野において既知の複数のアルゴリズムもある。別の例として、ＧＣＧ Ｖｅｒｓｉｏｎ ６．１中のプログラムであるＦａｓｔａ（商標）を用いてポリヌクレオチド配列を比較することができる。Ｆａｓｔａ（商標）はクエリー及びサーチ配列の間の最高重複（ｂｅｓｔ ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ）領域のアラインメント及びパーセント配列同一性を与える。例えば、引用することによりその記載事項が本明細書の内容となるＧＣＧ Ｖｅｒｓｉｏｎ ６．１中に与えられるＦａｓｔａ（商標）をそのデフォルトパラメーター（６の文字列の長さ及びスコアリングマトリックス（ｓｃｏｒｉｎｇ ｍａｔｒｉｘ）のためのＮＯＰＡＭ因子）と共に用いて核酸配列間のパーセント配列同一性を決定することができる。

１つの態様において、改変されたｈＳＭＮ１コード配列は、患者の種における発現のために最適化されたコドン最適化配列である。本明細書で用いられる場合、「患者」は哺乳類、例えばヒト、マウス、ラット、モルモット、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタあるいはサル、チンパンジー、ヒヒ又はゴリラのような非ヒト霊長類である。好ましい態様において、患者はヒトである。１つの態様において、配列はヒトにおける発現のためにコドン最適化される。

種々の異なる方法によりコドン最適化コード領域を設計することができる。この最適化は、オンラインで入手可能な方法（例えばＧｅｎｅＡｒｔ）、公開されている方法又はコドン最適化サービス、例えばＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ）を提供する会社を用いて行われる場合がある。１つのコドン最適化法が例えば米国国際特許公開番号国際公開第２０１５／０１２９２４号パンフレット中に記載されており、それは引用することによりその記載事項全体が本明細書の内容となる。例えば米国特許公開第２０１４／００３２１８６号明細書及び米国特許公開第２００６／０１３６１８４号明細書も参照されたい。適切には、産物に関するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の全長が改変される。しかしながらいくつかの態様において、ＯＲＦの１つのフラグメントのみが改変される場合がある。これらの方法の１つの使用により、いずれかの与えられるポリペプチド配列に頻度を適用し、ポリペプチドをコードするコドン最適化コード領域の核酸フラグメントを作製することができる。

コドンに実際の変更を行うため、又は本明細書に説明される通りに設計されるコドン最適化コード領域を合成するための複数の選択肢が利用可能である。当該技術分野における通常の熟練者に周知の標準的かつ慣例的な分子生物学的操作を用いてそのような改変又は合成を行うことができる。１つの方法では、それぞれ長さが８０－９０個のヌクレオチドであり、所望の配列の長さに及ぶ一連の相補的オリゴヌクレオチド対は標準的な方法により合成される。これらのオリゴヌクレオチド対は、アニーリングされるとそれらが付着末端を含有する８０－９０個の塩基対の二本鎖フラグメントを形成するように合成され、例えば塩基対中の各オリゴヌクレオチドは塩基対中の他のオリゴヌクレオチドに相補的である領域を越えて３、４、５、６、７、８、９、１０個か又はそれ以上の塩基を延ばして合成される。オリゴヌクレオチドの各対の一本鎖末端は、オリゴヌクレオチドの別の対の一本鎖末端とアニーリングするように設計される。オリゴヌクレオチド対はアニーリングされ、これらの二本鎖フラグメントの約５～６個は次いで付着一本鎖末端を介して一緒にアニーリングされ、次いでそれらは連結されて標準的なバクテリアクローニングベクター、例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆから入手可能なＴＯＰＯ（登録商標）ベクター中にクローニングされる。次いでコンストラクトを標準的な方法により配列決定する。連結された８０－９０塩基対フラグメントの５～６個のフラグメント、例えば約５００塩基対のフラグメントから成るこれらのコンストラクトのいくつかを、所望の配列全体が一連のプラスミドコンストラクトに表されるように作成する。これらのプラスミドの挿入片（ｉｎｓｅｒｔｓ）を次いで適した制限酵素を用いて切断し、連結して最終的なコンストラクトを形成する。最終的なコンストラクトを次いで標準的なバクテリアクローニングベクター中にクローニングし、配列決定する。さらなる方法はすぐに熟練者に明らかになるであろう。さらに遺伝子合成は商業的に容易に入手可能である。

１つの態様において、本明細書に記載される改変されたｈＳＭＮ１遺伝子は、ウイルスベクターの作成のため、及び／又は保有するｈＳＭＮ１配列を転送する宿主細胞、例えば裸のＤＮＡ、ファージ、トランスポゾン、コスミド、エピソームなどへの送達のために、有用な適した遺伝子エレメント（ベクター）中に遺伝子操作される。選択されるベクターは、トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソーム送達、膜融合法、高速ＤＮＡコーテッドペレット（ｈｉｇｈ ｖｅｌｏｓｉｔｙ ＤＮＡ－ｃｏａｔｅｄ ｐｅｌｌｅｔ）、ウイルス感染及びプロトプラスト融合を含むいずれかの適した方法により送達される場合がある。そのようなコンストラクトの作成のために用いられる方法は核酸操作の熟練者に既知であり、遺伝子工学、組換え遺伝子工学及び合成法が含まれる。例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹを参照されたい。

１つの側面において、ｈＳＭＮ１核酸配列を含む発現カセットが提供される。本明細書で用いられる場合、「発現カセット」はｈＳＭＮ１配列、プロモーターを含み、かつそれらのための他の調節配列を含むことがある核酸分子を指し、そのカセットはウイルスベクター（例えばウイルス粒子）のキャプシド中に包まれる場合がある。典型的に、ウイルスベクターの作成のためのそのような発現カセットは、ウイルスゲノムのパッケージングシグナル及び本明細書に記載されるもののような他の発現調節配列に挟まれる本明細書に記載されるｈＳＭＮ１配列を含む。例えばＡＡＶウイルスベクターにとって、パッケージングシグナルは５’逆位末端反復（ＩＴＲ）及び３’ＩＴＲである。ＡＡＶキャプシド中に包まれると、ＩＴＲｓは発現カセットと共に本明細書で「組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ゲノム」又は「ベクターゲノム」と呼ばれる。

かくして１つの側面において、ＡＡＶキャプシド及び少なくとも１つの発現カセットを含むアデノ関連ウイルスベクターが提供され、ここで少なくとも１つの発現カセットはＳＭＮ１をコードする核酸配列及び宿主細胞におけるＳＭＮ１配列の発現を方向付ける発現調節配列を含む。ＡＡＶベクターはＡＡＶ ＩＴＲ配列も含む。１つの態様において、ＩＴＲｓはキャプシドを供給するＡＡＶと異なるＡＡＶ由来のものである。好ましい態様において、ＩＴＲ配列はＡＡＶ２又はその欠失バージョン（ΔＩＴＲ）由来のものであり、それは便宜上又は規制に関する承認を速めるために用いられ得る。しかしながら他のＡＡＶ源からのＩＴＲｓが選択される場合がある。ＩＴＲｓの出所がＡＡＶ２であり、ＡＡＶキャプシドが別のＡＡＶ由来のものである場合、得られるベクターは偽型（ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅｄ）と称される場合がある。典型的にＡＡＶベクターゲノムはＡＡＶ５’ＩＴＲ、ｈＳＭＮ１コード配列及びいずれかの調節配列ならびにＡＡＶ３’ＩＴＲを含む。しかしながらこれらのエレメントの他の配置が適している場合がある。Ｄ－配列及び末端切開部位（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｓｉｔｅｓ）（ｔｒｓ）が欠失しているΔＩＴＲと称される５’ＩＴＲの短縮バージョンが記載されている。他の態様において、全長ＡＡＶ５’及び３’ＩＴＲｓが用いられる。

１つの側面において、ウイルスベクターの作製に有用なＤＮＡ分子であるコンストラクト（例えばプラスミド）を提供する。所望のベクターエレメントを含有する代表的なプラスミドはｐＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＭＮにより示され、そのマップは図５に示され、その配列は配列番号４であり、それは引用により本明細書に取り込まれる。この代表的なプラスミドは：５’ＩＴＲ（配列番号４のｎｔ ４１５０－４２７９）、ＴＡＴＡシグナル（配列番号４のｎｔ ４９８５－４９８８）、合成ｈＳＭＮ１コード配列（配列番号４のｎｔ １８－８９９）、ポリＡ（配列番号４のｎｔ ９８４－１１１０）、３’ＩＴＲ（配列番号４のｎｔ １１９９－１３２８）、ＣＭＶエンハンサー（配列番号４のｎｔ ４３４７－４７２８）、チキンベータアクチンイントロン（配列番号４のｎｔ ５１０７－６０７９）及びＣＢプロモーター（配列番号４のｎｔ ４７３１－５０１２）を含む核酸配列を含有する。本明細書に記載される他の合成ｈＳＭＮ１コード配列及び本明細書に記載される他の発現調節エレメントを用いて他の発現カセットを作成する場合がある。

発現カセットは、発現調節配列の一部として、例えば選ばれた５’ＩＴＲ配列とｈＳＭＮ１コード配列との間に置かれるプロモーター配列を含有するのが典型的である。本明細書に記載される代表的なプラスミド及びベクターは、遍在するニワトリβ－アクチンプロモーター（ＣＢ）をＣＭＶ即時型エンハンサー（ＣＭＶ ＩＥ）と一緒に用いる。あるいはまた、他のニューロン特異的なプロモーターが用いられる場合がある［例えばｈｔｔｐ：／／ｃｈｉｎｏｏｋ．ｕｏｒｅｇｏｎ．ｅｄｕ／ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ．ｈｔｍｌにおいてアクセスされるｔｈｅ Ｌｏｃｋｅｒｙ Ｌａｂ ｎｅｕｒｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ ｄａｔａｂａｓｅを参照されたい］。そのようなニューロン特異的なプロモーターには、例えばシナプシンＩ（ＳＹＮ）、カルシウム／カルモジュリン－依存性タンパク質キナーゼＩＩ、チューブリンアルファＩ、ニューロン－特異的エノラーゼ
及び血小板－由来成長因子ベータ鎖プロモーターが含まれるがこれらに限られない。引用によりその記載事項が本明細書に取り込まれるＨｉｏｋｉら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｊｕｎｅ ２００７，１４（１１）：８７２－８２を参照されたい。他のニューロン特異的なプロモーターには６７ｋＤａグルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ６７）、ホメオボックスＤｌｘ５／６、グルタメートレセプター１（ＧｌｕＲ１）、プレプロタキキニン１（Ｔａｃ１）プロモーター、ニューロン－特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）及びドーパミンレセプター１（Ｄｒｄ１ａ）プロモーターが含まれる。例えばＤｅｌｚｏｒら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄ．Ａｕｇｕｓｔ ２０１２，２３（４）：２４２－２５４を参照されたい。別の態様において、プロモーターはＧＵＳｂプロモーター ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｊｃｉ．ｏｒｇ／ａｒｔｉｃｌｅｓ／ｖｉｅｗ／４１６１５＃Ｂ３０である。

構成的プロモーター、調節可能プロモーター［例えば国際公開第２０１１／１２６８０８号パンフレット及び国際公開第２０１３／０４９４３号パンフレットを参照されたい］又は生理学的合図（ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃ ｃｕｅｓ）に反応性のプロモーターのような他のプロモーターが本明細書に記載されるベクター中で用いられる場合がある。プロモーターは種々の出所、例えばヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）即時型エンハンサー／プロモーター、ＳＶ４０初期エンシンサー／プロモーター、ＪＣポリモウイルスプロモーター、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）又はグリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ－１）潜在関連プロモーター（ＬＡＰ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）長末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、ニューロン特異的プロモーター（ＮＳＥ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）プロモーター、ｈＳＹＮ、メラニン－濃縮ホルモン（ＭＣＨ）プロモーター、ＣＢＡ、マトリックス金属タンパク質（ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎ）プロモーター（ＭＰＰ）及びニワトリベータ－アクチンプロモーターから選ばれる場合がある。

プロモーターに加え、発現カセット及び／又はベクターは、１つ以上の他の適切な転写開始、停止、エンハンサー配列と、スプライシング及びポリアデニル化（ポリＡ）シグナルのような有効なＲＮＡプロセシングシグナルと、細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列、例えばＷＰＲＥ；翻訳効率を増強する配列（すなわちコザック共通配列）と、タンパク質安定性を増強する配列と、ならびに所望なら、コードされる産物の分泌を増強する配列とを含む場合がある。適したポリＡ配列の例には、例えばＳＶ４０、ＳＶ５０、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）、ヒト成長ホルモン及び合成ポリＡｓが含まれる。適したエンハンサーの例はＣＭＶエンハンサーである。他の適したエンハンサーにはＣＮＳ適応症（ＣＮＳ ｉｎｄｉｃａｔｉｏｎｓ）に適しているものが含まれる。１つの態様において、発現カセットは１つ又はそれより多い発現エンハンサーを含む。１つの態様において、発現カセットは２つ以上の発現エンハンサーを含む。これらのエンハンサーはすべて同一であるか又は互いに異なる場合がある。例えばエンハンサーはＣＭＶ即時型エンハンサーを含む場合がある。このエンハンサーは互いに隣接して位置する２つのコピー中に存在する場合がある。あるいはまた、エンハンサーの２個のコピー（ｄｕａｌ ｃｏｐｉｅｓ）が１つ以上の配列により隔てられている場合がある。さらに別の態様において、発現カセットはさらにイントロン、例えばニワトリベータ－アクチンイントロンを含有する。他の適したイントロンには、例えば国際公開第２０１１／１２６８０８号パンフレットに説明されているような当該技術分野において既知のものが含まれる。場合により、ｍＲＮＡの安定化のための１つ以上の配列が選ばれることがある。そのような配列の例は改変ＷＰＲＥ配列であり、それをポリＡ配列の上流かつコード配列の下流に遺伝子操作で導入される場合がある［例えばＭＡ Ｚａｎｔａ－Ｂｏｕｓｓｉｆら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（２００９）１６：６０５－６１９を参照されたい］。

これらの調節配列はｈＳＭＮ１遺伝子配列に「作動可能に連結」される。本明細書で用
いられる場合、「作動可能に連結」という用語は、問題の遺伝子と連続している発現調節配列と、トランスで（ｉｎ ｔｒａｎｓ）又は問題の遺伝子を調節する距離で働く発現調節配列との両方を指す。

アデノ－関連ウイルス（ＡＡＶ）ウイルスベクターは、ＡＡＶタンパク質キャプシドを有するＡＡＶ ＤＮａｓｅ耐性粒子であり、核酸配列が標的細胞への送達のためにキャプシド中に包まれている。ＡＡＶキャプシドは６０個のキャプシド（ｃａｐ）タンパク質サブユニット、ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３から構成され、それらは選ばれるＡＡＶに応じて約１：１：１０～１：１：２０の比率で正二十面体対称に配置されている。ＡＡＶキャプシドはそれらの変異体を含む当該技術分野おいて既知のものから選ばれる場合がある。１つの態様において、ＡＡＶキャプシドはニューロン細胞を有効に形質導入するものから選ばれる。１つの態様において、ＡＡＶキャプシドはＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶ５、ＡＡＶｈｕ．１１、ＡＡＶ８ＤＪ、ＡＡＶｈｕ．３２、ＡＡＶｈｕ．３７、ＡＡＶｐｉ．２、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｈｕ．４８Ｒ３及びそれらの変異体から選ばれる。それぞれ引用によりそれらの記載事項が本明細書に取り込まれるＲｏｙｏら、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ，２００８ Ｊａｎ，１１９０：１５－２２；Ｐｅｔｒｏｓｙａｎら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，２０１４ Ｄｅｃ，２１（１２）：９９１－１０００；Ｈｏｌｅｈｏｎｎｕｒら、ＢＭＣ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，２０１４，１５：２８及びＣｅａｒｌｅｙら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２００８ Ｏｃｔ；１６（１０）：１７１０－１７１８を参照されたい。本明細書で有用な他のＡＡＶキャプシドにはＡＡＶｒｈ．３９、ＡＡＶｒｈ．２０、ＡＡＶｒｈ．２５、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｂｂ．１及びＡＡＶｂｂ．２及びそれらの変異体が含まれる。例えばＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ６４Ｒ１、ＡＡＶｒｈ６４Ｒ２、ｒｈ８、ｒｈ．１０と、既知の又は挙げられたＡＡＶｓのいずれかの変異体あるいは未発見のＡＡＶｓとを含む他のＡＡＶ血清型がＡＡＶウイルスベクター（ＤＮａｓｅ耐性ウイルス粒子）のキャプシドのための源として選ばれる場合がある。例えば米国公開特許出願第２００７－００３６７６０－Ａ１号明細書；米国公開特許出願第２００９－０１９７３３８－Ａ１号明細書；欧州特許第１３１０５７１号明細書を参照されたい。国際公開第２００３／０４２３９７号パンフレット（ＡＡＶ７及び他のサルＡＡＶ）、米国特許第７７９０４４９号明細書及び米国特許第７２８２１９９号明細書（ＡＡＶ８）、国際公開第２００５／０３３３２１号パンフレット及び米国特許第７，９０６，１１１号明細書（ＡＡＶ９）ならびに国際公開第２００６／１１０６８９号パンフレット及び国際公開第２００３／０４２３９７号パンフレット（ｒｈ．１０）も参照されたい。あるいはまた、挙げられたＡＡＶｓのいずれかに基づく組換えＡＡＶがＡＡＶキャプシドのための源として用いられる場合がある。これらの文書はＡＡＶの作成のために選ばれることがある他のＡＡＶも記載しており、それらの記載事項は引用により本明細書に取り込まれる。いくつかの態様において、ウイルスベクター中で用いるためのＡＡＶ ｃａｐを、上記で挙げたＡＡＶ Ｃａｐｓ又はそのコード核酸の１つの突然変異誘発により（すなわち挿入、欠失又は置換により）作成することができる。いくつかの態様において、ＡＡＶキャプシドは、前記で挙げたＡＡＶキャプシドたんぱく質の２つ又は３つ又は４つ以上からのドメインを含むキメラである。いくつかの態様において、ＡＡＶキャプシドは２又は３種のＡＡＶｓあるいは組換えＡＡＶｓからのＶｐ１、Ｖｐ２及びＶｐ３モノマーのモザイクである。いくつかの態様において、ｒＡＡＶ組成物は前記で挙げたＣａｐｓの１つ以上を含む。ＡＡＶに関して本明細書で用いられる場合、変異体という用語は既知のＡＡＶ配列から誘導されるＡＡＶ配列を意味し、アミノ酸又は核酸配列上で（ｏｖｅｒ）少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％又はそれ以上の配列同一性を共有するものを含む。他の態様において、ＡＡＶキャプシドは、いずれかの記載された又は既知のＡＡＶキャプシド配列からの最高で約１０％の変異を含む場合がある変異体を含む。すなわちＡＡＶキャプシドは、本明細書
で提示された及び／又は当該技術分野において既知のＡＡＶキャプシドに約９０％の同一性～約９９．９％の同一性、約９５％～約９９％の同一性又は約９７％～約９８％の同一性を共有する。１つの態様において、ＡＡＶキャプシドはＡＡＶキャプシドと少なくとも９５％の同一性を共有する。ＡＡＶキャプシドのパーセント同一性を決定する場合、様々な（ｖａｒｉａｂｌｅ）タンパク質（例えばｖｐ１、ｖｐ２又はｖｐ３）のいずれかについて比較を行う場合もある。１つの態様において、ＡＡＶキャプシドはＡＡＶ８ ｖｐ３と少なくとも９５％同一性を共有する。別の態様において、自己－相補性ＡＡＶが用いられる。

１つの態様において、キャプシドはＡＡＶｒｈ．１０キャプシド又はその変異体である。本明細書で用いられる場合、「ＡＡＶｒｈ１０キャプシド」は、引用することによりその記載事項が本明細書の内容となるＧｅｎＢａｎｋ，アクセッション：ＡＡＯ８８２０１のアミノ酸配列を有するｒｈ．１０を指す。この配列は配列番号５にも再現される。このコードされる配列からのいくらかの変異は許容され得、配列番号５、ＡＡＯ８８２０１及び米国特許第２０１３／００４５１８６Ａ１号明細書において言及されるアミノ酸配列に約９９％の同一性を有する配列を含む場合がある。キャプシドの作成方法、それのためのコード配列及びｒＡＡＶウイルスベクターの作成方法は記載されている。例えばＧａｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００（１０），６０８１－６０８６（２００３）及び米国特許第２０１３／００４５１８６Ａ１号明細書を参照されたい。例えば引用することによりそれらの記載事項が本明細書の内容となる国際公開第２００３／０４２３９７号パンフレット；国際公開第２００５／０３３３２１号パンフレット、国際公開第２００６／１１０６８９号パンフレット；米国特許第７５８８７７２Ｂ２号明細書に記載されているもののような他のキャプシドをヒトの患者において用いる場合がある。

１つの態様において、自己－相補性ＡＡＶを提供する。本状況下における「ｓｃ」という略語は自己－相補性を指す。「自己－相補性ＡＡＶ」は、組換えＡＡＶ核酸配列が保有するコード領域が分子内二本鎖ＤＮＡテンプレートを形成するように設計されているコンストラクトを指す。感染すると、第２の鎖の細胞媒介合成を待つのではなく、ｓｃＡＡＶの２つの相補的半分（ｔｗｏ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｈａｌｖｅｓ）が会合して、即時複製及び転写への準備ができている１つの二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）単位を形成するであろう。例えばＤ Ｍ ＭｃＣａｒｔｙら、”Ｓｅｌｆ－ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ（ｓｃＡＡＶ） ｖｅｃｔｏｒｓ ｐｒｏｍｏｔｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ ｏｆ ＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，（Ａｕｇｕｓｔ ２００１），Ｖｏｌ ８，Ｎｕｍｂｅｒ １６，ｐａｇｅｓ １２４８－１２５４を参照されたい。自己－相補性ＡＡＶｓは、例えば米国特許第６，５９６，５３５；７，１２５，７１７及び７，４５６，６８３号明細書に記載されており、それらのそれぞれの記載事項全体は引用により本明細書に取り込まれる。

患者への送達に適したＡＡＶウイルスベクターの作製及び単離方法は当該技術分野において既知である。例えば米国公開特許出願第２００７／００３６７６０号明細書（２００７年２月１５日）、米国特許第７７９０４４９号明細書；米国特許第７２８２１９９号明細書；国際公開第２００３／０４２３９７号パンフレット；国際公開第２００５／０３３３２１号パンフレット、国際公開第２００６／１１０６８９号パンフレット及び米国特許第７５８８７７２Ｂ２号明細書を参照されたい。１つの系において、ＩＴＲｓに挟まれた導入遺伝子をコードするコンストラクト及びｒｅｐとｃａｐをコードするコンストラクトを用いてプロデューサー細胞株を一過的にトランスフェクションする。第２の系において、ｒｅｐとｃａｐを安定して供給するパッケージング細胞株を、ＩＴＲｓに挟まれた導入遺伝子をコードするコンストラクトを用いて一過的にトランスフェクションする。これらの系のそれぞれにおいて、汚染ウイルスからのｒＡＡＶｓの分離を必要とするヘルパーアデノウイルス又はヘルペスウイルスの感染に反応して、ＡＡＶビリオンが産生される。もっと最近には、ＡＡＶの回収にヘルパーウイルスの感染を必要としない系が開発された－必要なヘルパー機能（すなわちアデノウイルスＥ１、Ｅ２ａ、ＶＡ及びＥ４又はヘルペスウイルスＵＬ５、ＵＬ８、ＵＬ５２及びＵＬ２９ならびにヘルペスウイルスポリメラーゼ）も系によりトランスで供給される。これらのより新しい系において、必要なヘルパー機能をコードするコンストラクトを用いる細胞の一過性トランスフェクションによりヘルパー機能を供給することができるか、又はヘルパー機能をコードする遺伝子を安定して含有するように細胞を遺伝子操作することができ、その遺伝子の発現は転写レベル又は転写後レベルで調節され得る。さらに別の系において、ＩＴＲｓによりフランキングされた導入遺伝子及びｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子を、バキュロウイルスに基づくベクターを用いる感染により昆虫細胞中に導入する。これらの生産系についての総説に関し、一般に例えばＺｈａｎｇら、２００９，”Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ－ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｈｙｂｒｉｄ ｆｏｒ ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，”Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０：９２２－９２９を参照されたく、それらのそれぞれの記載事項全体は引用により本明細書に取り込まれる。これら及び他のＡＡＶ生産系の作製及び使用方法は以下の米国特許にも記載されており、それらのそれぞれの記載事項全体は引用により本明細書に取り込まれる：５，１３９，９４１；５，７４１，６８３；６，０５７，１５２；６，２０４，０５９；６，２６８，２１３；６，４９１，９０７；６，６６０，５１４；６，９５１，７５３；７，０９４，６０４；７，１７２，８９３；７，２０１，８９８；７，２２９，８２３；及び７，４３９，０６５号明細書。

場合により、本明細書に記載されるｈＳＭＮ１遺伝子を用いてｒＡＡＶ以外のウイルスベクターを製作することがある。そのような他のウイルスベクターは、アデノウイルス；ヘルペスウイルス；レンチウイルス；レトロウイルス；などを含むがこれらに限られない遺伝子療法に適したいずれかのウイルスを含む場合がある。適切には、これらの他のベクターの１つを作成する場合、それは複製欠損ウイルスベクターとして作成される。

「複製欠損ウイルス」又は「ウイルスベクター」は、問題の遺伝子を含有する発現カセットがウイルスキャプシド又はエンベロープ中に包まれており、ここでやはりウイルスキャプシド又はエンベロープ中に包まれているいずれかのウイルスゲノム配列が複製欠損性である合成又は人工ウイルス粒子を指し、すなわちそれらは子孫ビリオンを生産できないが標的細胞に感染する能力を保持している。１つの態様において、ウイルスベクターのゲノムは複製に必要な酵素をコードする遺伝子を含まないが（ゲノムを、人工ゲノムの増幅及びパッケージングに必要なシグナルにより挟まれた問題の導入遺伝子のみを含有する「ガットレス（ｇｕｔｌｅｓｓ）」であるように遺伝子操作することができる）、生産の間にこれらの遺伝子を供給する場合がある。従って、複製に必要なウイルス酵素の存在下を除いて、子孫ビリオンによる複製及び感染は起こり得ないので、それは遺伝子療法における使用に関して安全であるとみなされる。そのような複製欠損ウイルスはアデノ－関連ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、レンチウイルス（インテグレーション又は非インテグレーション）あるいは別の適したウイルス源である場合がある。

本明細書に製薬学的組成物も提供する。本明細書に記載される製薬学的組成物は、いずれかの適した経路又は異なる経路の組み合わせにより、送達の必要のある患者に送達するために設計される。１つの態様において、ＣＮＳへの直接送達が望ましく、クモ膜下腔内注入により行われる場合がある。「クモ膜下腔内投与」という用語は、脳脊髄液（ＣＳＦ）を標的とする送達を指す。これを脳室又は腰椎ＣＳＦ中への直接注入により、後頭下穿刺により、又は他の適した手段により行う場合がある。Ｍｅｙｅｒら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ（２０１４年１０月３１日）は、直接ＣＳＦ注入の有効性を示し、それは静脈内適用と比較して１０倍低い用量を用いた場合に、マウス及び非ヒト霊長類における脊髄全体で広範囲に導入遺伝子が発現した。この文書は引用によりその記載事項が本明細書に取り込まれる。１つの態様において、脳室内ウイルス注入を介して組成物を送達する（例えば引用することによりその記載事項が本明細書の内容となるＫｉｍら、Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ．２０１４ Ｓｅｐ １５；（９１）：５１８６３を参照されたい）。引用することによりその記載事項が本明細書の内容となるＰａｓｓｉｎｉら、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１４ Ｊｕｌ；２５（７）：６１９－３０も参照されたい。別の態様において、腰椎注入を介して組成物を送達する。

典型的にこれらの送達手段は、本明細書に記載されるＡＡＶ組成物を含有する懸濁剤の直接全身送達を避けるように設計される。適切には、これは全身投与と比較して用量を減らす、毒性を低下させるならびに／あるいはＡＡＶ及び／又は導入遺伝子産物への望ましくない免疫反応を低下させる利益を有する場合がある。

あるいはまた、他の投与経路（例えば経口的、吸入、鼻内、気管内、動脈内、眼内、静脈内、筋肉内及び他の非経口的経路）を選ぶ場合がある。

本明細書に記載されるｈＳＭＮ１送達コンストラクトを、単一の組成物において又は複数の組成物において送達する場合がある。場合により２種以上のＡＡＶを送達することがある［例えば国際公開第２０１１／１２６８０８号パンフレット及び国際公開第２０１３／０４９４９３号パンフレットを参照されたい］。別の態様において、そのような複数のウイルスは異なる複製欠損ウイルス（例えばＡＡＶ、アデノウイルス及び／又はレンチウイルス）を含む場合がある。あるいはまた、例えばミセル、リポソーム、カチオン性脂質－核酸組成物、ポリ－グリカン組成物及び他のポリマー、脂質又はコレステロールに基づく核酸複合体ならびに本明細書に記載されているような他のコンストラクトを含む種々の送達組成物及びナノ粒子と合体した（ｃｏｕｐｌｅｄ）非ウイルスコンストラクト、例えば「裸のＤＮＡ」、「裸のプラスミドＤＮＡ」、ＲＮＡ及びｍＲＮＡにより送達が媒介される場合がある。例えば両方とも引用によりその記載事項が本明細書に取り込まれるＸ．Ｓｕら、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，２０１１，８（３），ｐｐ７７４－７８７；ウェブ刊行日：２０１１年３月２１日；国際公開第２０１３／１８２６８３号パンフレット、国際公開第２０１０／０５３５７２号パンフレット及び国際公開第２０１２／１７０９３０号パンフレットを参照されたい。そのような非ウイルスｈＳＭＮ１送達コンストラクトを前に記載した経路により投与する場合がある。

ウイルスベクター又は非ウイルスＤＮＡもしくはＲＮＡ導入部分を、遺伝子導入及び遺伝子療法用途における使用のために、生理学的に許容され得る担体を用いて調製することができる。複数の適した精製法を選ぶことができる。ベクター粒子から空のキャプシドを分離するための適した精製法の例は説明されおり、例えば方法は２０１６年１２月９日に申請された国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１６／６５９７６及びその優先権書類、２０１６年４月１３日に申請された米国特許出願第６２／３２２，０９８号明細書及び２０１５年１２月１１日に申請された米国特許第６２／２６６，３４１号明細書に記載されており、”Ｓｃａｌａｂｌｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ＡＡＶ８”という表題であり、それらは引用によりその記載事項が本明細書に取り込まれる。２０１６年１２月９日に出願された国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１６／６５９７４ならびにその優先権書類、２０１６年４月１３日に出願された米国特許出願第６２／３２２，０８３号明細書及び２０１５年１２月１１日に出願された第６２／２６６，３５１号明細書（ＡＡＶ１）；２０１６年１２月９日に出願された国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１６／６６０１３ならびにその優先権書類、２０１６年４月１３日に出願された米国特許暫定出願第６２／３２２，０５５号明細書及び２０１５年１２月１１日に出願された第６２／２６６，３４７号明細書（ＡＡＶｒｈ１０）；ならびに２０１６年１２月９日に出願された国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１６／６５９７０ならびにその優先権出願、米国特許仮出願第６２／２６６，３５７号明細書及び第６２／２６６，３５７号明細書（ＡＡＶ９）に記載されている精製法も参照されたく、それらは引用によりその記載事項が本明細書に取り込まれる。要するに、ｒＡＡＶ生産細胞培養物の透明化濃縮上清ゲノム－含有ｒＡＡＶベクター粒子を選択的に捕捉して単離する２段階精製案が記載されている。方法は高塩濃度において行われるアフィニティー捕捉法を用い、それに高ｐＨで行われるアニオン交換樹脂法が続き、実質的にｒＡＡＶ中間体を含まないｒＡＡＶベクター粒子を与える。

ＡＡＶウイルスベクターの場合、調製物中に含有される用量の尺度としてゲノムコピー（”ＧＣ”）の定量を用いる場合がある。本発明の複製－欠損ウイルス組成物のゲノムコピー（ＧＣ）数の決定のために、当該技術分野において既知のいずれの方法を用いることもできる。ＡＡＶ ＧＣ数測定を行うための１つの方法は以下の通りである：精製されたＡＡＶベクター試料を最初にＤＮａｓｅで処理して生産プロセスからの汚染宿主ＤＮＡを取り除く。次いでＤＮａｓｅ耐性粒子を熱処理に供してキャプシドからゲノムを放出させる。放出されたゲノムを、次いでウイルスゲノムの特定の領域（例えばポリＡシグナル）を標的とするプライマー／プローブセットを用いるリアルタイムＰＣＲにより定量する。ゲノムコピーの決定のための別の適した方法は、定量的－ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、特に最適化ｑＰＣＲ又はデジタルドロップレットＰＣＲ（ｄｉｇｉｔａｌ ｄｒｏｐｌｅｔ ＰＣＲ）である［Ｌｏｃｋ Ｍａｒｔｉｎら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ａｐｒｉｌ ２０１４，２５（２）：１１５－１２５．ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｇｔｂ．２０１３．１３１，２０１３年１２月１３日に編集の前にオンラインで公開された］。

複製欠損ウイルス組成物をヒトの患者用に、すべての整数又は分数量を範囲内に含む約１．０ｘ１０⁹個のＧＣ～約１．０ｘ１０¹⁵個のＧＣ（体重が７０ｋｇの平均的な患者の処置のため）そして好ましくは１．０ｘ１０¹²個のＧＣ～約１．０ｘ１０¹⁴個のＧＣの範囲内である量の複製欠損ウイルスを含有するように、投薬単位において調製することができる。１つの態様において、組成物は、すべての整数又は分数量を範囲内に含む用量当たり少なくとも１ｘ１０⁹、２ｘ１０⁹、３ｘ１０⁹、４ｘ１０⁹、５ｘ１０⁹、６ｘ１０⁹、７ｘ１０⁹、８ｘ１０⁹又は９ｘ１０⁹個のＧＣを含有するように調製される。別の態様において、組成物は、すべての整数又は分数量を範囲内に含む用量当たり少なくとも１ｘ１０¹⁰、２ｘ１０¹⁰、３ｘ１０¹⁰、４ｘ１０¹⁰、５ｘ１０¹⁰、６ｘ１０¹⁰、７ｘ１０¹⁰、８ｘ１０¹⁰又は９ｘ１０¹⁰個のＧＣを含有するように調製される。別の態様において、組成物は、すべての整数又は分数量を範囲内に含む用量当たり少なくとも１ｘ１０¹¹、２ｘ１０¹¹、３ｘ１０¹¹、４ｘ１０¹¹、５ｘ１０¹¹、６ｘ１０¹¹、７ｘ１０¹¹、８ｘ１０¹¹又は９ｘ１０¹¹個のＧＣを含有するように調製される。別の態様において、組成物は、すべての整数又は分数量を範囲内に含む用量当たり少なくとも１ｘ１０¹²、２ｘ１０¹²、３ｘ１０¹²、４ｘ１０¹²、５ｘ１０¹²、６ｘ１０¹²、７ｘ１０¹²、８ｘ１０¹²又は９ｘ１０¹²個のＧＣを含有するように調製される。別の態様において、組成物は、すべての整数又は分数量を範囲内に含む用量当たり少なくとも１ｘ１０¹³、２ｘ１０¹³、３ｘ１０¹³、４ｘ１０¹³、５ｘ１０¹³、６ｘ１０¹³、７ｘ１０¹³、８ｘ１０¹³又は９ｘ１０¹³個のＧＣを含有するように調製される。別の態様において、組成物は、すべての整数又は分数量を範囲内に含む用量当たり少なくとも１ｘ１０¹⁴、２ｘ１０¹⁴、３ｘ１０¹⁴、４ｘ１０¹⁴、５ｘ１０¹⁴、６ｘ１０¹⁴、７ｘ１０¹⁴、８ｘ１０¹⁴又は９ｘ１０¹⁴個のＧＣを含有するように調製される。別の態様において、組成物は、すべての整数又は分数量を範囲内に含む用量当たり少なくとも１ｘ１０¹⁵、２ｘ１０¹⁵、３ｘ１０¹⁵、４ｘ１０¹⁵、５ｘ１０¹⁵、６ｘ１０¹⁵、７ｘ１０¹⁵、８ｘ１０¹⁵又は９ｘ１０¹⁵個のＧＣを含有するように調製される。１つの態様において、ヒトへの適用のために用量は、すべての整数又は分数量を範囲内に含む用量当たり１ｘ１０¹⁰～約１ｘ１０¹²個のＧＣの範囲であることができる。

これらの上記の用量を、処置されるべき領域のサイズ、用いられるウイルス力価、投与経路及び望まれる方法の効果に応じて、すべての数を範囲内に含んで約２５～約１０００マイクロリットルの範囲の多様な容積の担体、賦形剤又は緩衝剤調製物中で投与する場合がある。１つの態様において、担体、賦形剤又は緩衝剤の容積は少なくとも約２５μＬである。１つの態様において、容積は約５０μＬである。別の態様において、容積は約７５μＬである。別の態様において、容積は約１００μＬである。別の態様において、容積は約１２５μＬである。別の態様において、容積は約１５０μＬである。別の態様において、容積は約１７５μＬである。さらに別の態様において、容積は約２００μＬである。別の態様において、容積は約２２５μＬである。さらに別の態様において、容積は約２５０μＬである。さらに別の態様において、容積は約２７５μＬである。さらに別の態様において、容積は約３００μＬである。さらに別の態様において、容積は約３２５μＬである。別の態様において、容積は約３５０μＬである。別の態様において、容積は約３７５μＬである。別の態様において、容積は約４００μＬである。別の態様において、容積は約４５０μＬである。別の態様において、容積は約５００μＬである。別の態様において、容積は約５５０μＬである。別の態様において、容積は約６００μＬである。別の態様において、容積は約６５０μＬである。別の態様において、容積は約７００μＬである。別の態様において、容積は約７００～１０００μＬである。

１つの態様において、約１μＬ～１５０ｍＬの容積が選ばれることがあり、より大きい容積が成人用に選ばれる。典型的に新生児のために適した容積は約０．５ｍＬ～約１０ｍＬであり、より大きい乳児（ｏｌｄｅｒ ｉｎｆａｎｔｓ）のために約０．５ｍＬ～約１５ｍＬが選ばれる場合がある。幼児のために約０．５ｍＬ～約２０ｍＬの容積を選ぶ場合がある。子供のために、最高で約３０ｍＬの容積を選ぶ場合がある。１０才以前及び１０才台のために、最高で約５０ｍＬの容積を選ぶ場合がある。さらに別の態様において、患者は約５ｍＬ～約１５ｍＬ又は約７．５ｍＬ～約１０ｍＬの容積においてクモ膜下腔内投与を受ける場合がある。他の適した容積及び用量が決定される場合がある。用量は、何らかの副作用に対して治療的利益を釣り合わせるように調整され、そのような用量は組換えベクターが用いられる治療的用途に応じて変わる場合がある。

１つの態様において、マウスのような小動物の患者のために約１μＬ～約３μＬの容積において少なくとも１ｘ１０⁹～約１ｘ１０¹¹個のＧＣｓの用量でウイルスコンストラクトを送達する場合がある。より大きな獣医学的患者のために、上記で述べたより大きなヒト用の用量（ｌａｒｇｅｒ ｈｕｍａｎ ｄｏｓａｇｅｓ）及び容積が有用である。種々の獣医学的動物への物質の投与のための実施基準の議論に関し、例えばＤｉｅｈｌら、Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，２１：１５－２３（２００１）を参照されたい。この文書は引用によりその記載事項が本明細書に取り込まれる。

上記の組換えベクターを、公開されている方法に従って宿主細胞に送達する場合がある。好ましくは生理学的に適合性の担体中に懸濁されたｒＡＡＶをヒト又は非－ヒトの哺乳類患者に投与する場合がある。別の態様において、組成物は担体、希釈剤、賦形剤及び／又は添加剤を含む。適切な担体は、導入ウイルスが向けられる適応症を見て、当該技術分野における熟練者が容易に選択し得る。例えば１つの適した担体には食塩水が含まれ、それは多様な緩衝溶液と調製される場合がある（例えばリン酸塩緩衝食塩水）。他の代表的な担体には無菌食塩水、ラクトース、スクロース、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストラン、寒天、ペクチン、ピーナツ油、ゴマ油及び水が含まれる。緩衝剤／担体は、ｒＡＡＶが輸液チューブに吸着するのを防ぐが生体内におけるｒＡＡＶ結合活性を妨げない成分を含むべきである。

場合により、本発明の組成物は、ｒＡＡＶ及び担体に加えて、防腐剤又は化学的安定剤のような他の通常の製薬学的成分を含有することがある。適した代表的な防腐剤にはクロ
ロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン、エチルバニリン、グリセリン、フェノール及びパラクロロフェノールが含まれる。適切な化学的安定剤にはゼラチン及びアルブミンが含まれる。

本発明に従う組成物は、上記で定義されたような製薬学的に許容され得る担体を含む場合がある。適切には、本明細書に記載される組成物は、製薬学的に適した担体中に懸濁され、ならびに／あるいは注入、浸透圧ポンプ、クモ膜下腔内カテーテルを介する患者への送達用又は別の装置若しくは経路による送達用に設計される適した賦形剤と混合される、１種又はそれより多種のＡＡＶの有効量を含む。１つの例において、組成物はクモ膜下腔内送達用に調製される。１つの態様においてクモ膜下腔内送達は、脊柱管、例えばクモ膜下腔中への注入を包む。

本明細書に記載されるウイルスベクターは、必要のある患者（例えばヒトの患者）にｈＳＭＮ１を送達するため、患者に機能があるＳＭＮを供給するため及び／又は脊髄性筋萎縮症を処置するための薬剤の製造において用いられる場合がある。処置経過は、場合により同じウイルスベクター（例えばＡＡＶｒｈ．１０ベクター）又は異なるウイルスベクター（例えばＡＡＶ９とＡＡＶｒｈ１０）の繰り返し投与を含むことがある。本明細書に記載されるウイルスベクター及び非－ウイルス送達系を用いてさらに別の組み合わせが選ばれる場合がある。

当該技術分野において周知の方法を用いて、本明細書に記載されるｈＳＭＮ１ ｃＤＮＡ配列を試験管内で及び合成的に作成することができる。例えばＸｉｏｎｇら、ＰＣＲ－ｂａｓｅｄ ａｃｃｕｒａｔｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｌｏｎｇ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ，Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ １，７９１－７９７（２００６）により記載されている通り、長いＤＮＡ配列のＰＣＲに基づく正確な合成（ＰＡＳ）法が用いられる場合がある。二重非対称ＰＣＲとオーバーラップ伸長ＰＣＲ法を組み合わせた方法はＹｏｕｎｇおよびＤｏｎｇ，Ｔｗｏ－ｓｔｅｐ ｔｏｔａｌ ｇｅｎｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｍｅｔｈｏｄ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００４；３２（７）：ｅ５９により記載されている。Ｇｏｒｄｅｅｖａら、Ｊ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ＰＣＲ－ｂａｓｅｄ ｇｅｎｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｉｔｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ ｐｈｙｔａｓｅ ｇｅｎｅ ｃｏｄｏｎ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ．２０１０ Ｍａｙ；８１（２）：１４７－５２．Ｅｐｕｂ ２０１０ Ｍａｒ
１０も参照されたい。オリゴヌクレオチド合成及び遺伝子合成についての以下の特許も参照されたい。Ｇｅｎｅ Ｓｅｑ．２０１２ Ａｐｒ；６（１）：１０－２１；米国特許第８００８００５号明細書；及び米国特許第７９８５５６５号明細書。それらの文書のそれぞれは引用によりその記載事項が本明細書に取り込まれる。さらに、ＰＣＲを介してＤＮＡを作製するためのキット及びプロトコルは商業的に入手可能である。これらはＴａｑポリメラーゼ；ＯｎｅＴａｑ（登録商標）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）；Ｑ５（登録商標）Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）；及びＧｏＴａｑ（登録商標）Ｇ２ポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を含むがこれらに限られないポリメラーゼの使用を含む。本明細書に記載されるｈＳＭＮ配列を含有するプラスミドを用いてトランスフェクションされた細胞からＤＮＡを作製する場合もある。キット及びプロトコルは既知でありかつ商業的に入手可能であり、ＱＩＡＧＥＮプラスミドキット；Ｃｈａｒｇｅｓｗｉｔｃｈ（登録商標）Ｐｒｏ Ｆｉｌｔｅｒ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｋｉｔｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；及びＧｅｎＥｌｕｔｅ（商標）Ｐｌａｍｉｄ Ｋｉｔｓ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）が含まれるがこれらに限られない。本明細書において有用な他の方法には、熱サイクルの必要性を取り除いた配列－特異的等温増幅法が含まれる。これらの方法は、二重鎖ＤＮＡを分離するために、熱の代わりに典型的にＢｓｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｌａｒｇｅ Ｆｒａｇｍｅ
ｎｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）のような鎖置換ＤＮＡポリメラーゼを用いる。ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼである逆転写酵素（ＲＴ）の使用を介する増幅を介してＲＮＡ分子からＤＮＡを作成する場合もある。ＲＴｓは、最初のＲＮＡテンプレートに相補的でありｃＤＮＡと呼ばれるＤＮＡの鎖を重合させる。このｃＤＮＡを次いでＰＣＲ又は上記で概述した等温法を介してさらに増幅することができる。ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ；ＧＥＮＥＷＩＺ（登録商標）；ＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）（ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）；及びＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓを含むがこれらに限られない会社から商業的にカスタムＤＮＡ（ｃｕｓｔｏｍ ＤＮＡ）を作成することもできる。

「発現」という用語は本明細書においてその最も広い意味で用いられ、ＲＮＡの産生又はＲＮＡおよびタンパク質の産生を含む。ＲＮＡに関し、「発現」又は「翻訳」という用語は特にペプチド又はタンパク質の産生に関する。発現は一過性又は持続性の場合がある。

本発明の状況下における「翻訳」という用語は、ｍＲＮＡ鎖がアミノ酸配列の集合を調節してタンパク質又はペプチドを生成するリボソームにおけるプロセスに関する。

本発明に従うと、「治療的に有効な量」のｈＳＭＮ１を本明細書に記載される通りに送達して所望の結果、すなわちＳＭＡ又は１つ以上のその症状の処置を達成する。本明細書に記載される通り、所望の結果には筋力低下の軽減、筋力及び筋緊張の向上、脊柱側弯症の予防又は軽減あるいは呼吸器健康の保持又は向上あるいは振戦又は単収縮の軽減が含まれる。他の所望のエンドポイントは、医師により決定され得る。

いくつかの場合、妊娠約３０～３６週の胎児においてＳＭＡが検出される。この状況で、出産後可能な限りすぐに新生児を処置するのが望ましい場合がある。子宮内で胎児を処置するのが望ましい場合もある。かくして新生児患者（例えばヒトの患者）のニューロン細胞にｈＳＭＮ１遺伝子を送達する段階を含む、ＳＭＡに罹った新生児患者を救う及び／又は処置する方法を提供する。子宮内の胎児のニューロン細胞にｈＳＭＮ１遺伝子を送達する段階を含むＳＭＡに罹った胎児を救う及び／又は処置する方法を提供する。１つの態様において、遺伝子は本明細書に記載される組成物中でクモ膜下腔内注入を介して送達される。この方法は、本明細書に記載されるコドン最適化ｈＳＭＮ１であろうと又は天然のｈＳＭＮ１であろうと又は「野生型」タンパク質と比較して強められた活性を有するｈＳＭＮ１アレレであろうと又はそれらの組み合わせであろうと、機能があるｈＳＭＮタンパク質をコードするいずれかの核酸配列を用いる場合もある。１つの態様において、子宮内における処置は、胎児におけるＳＭＡの検出後に本明細書に記載されるｈＳＭＮ１コンストラクトを投与することと定義される。例えば引用によりその記載事項が本明細書に取り込まれるＤａｖｉｄら、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｎ ｕｔｅｒｏ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｇｉｖｅｓ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｓｈｅｅｐ，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１１ Ａｐｒ；２２（４）：４１９－２６．ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｕｍ．２０１０．００７．Ｅｐｕｂ ２０１１
Ｆｅｂ ２を参照されたい。

１つの態様において新生児処置は、出産の８時間以内、最初の１２時間以内、最初の２４時間以内又は最初の４８時間以内に本明細書に記載されるｈＳＭＮ１コンストラクトを投与されることと定義される。別の態様において、特に霊長類（ヒト又は非ヒト）に関し、新生児送達は約１２時間～約１週間、２週間、３週間又は約１ヵ月以内あるいは約２４時間～約４８時間後である。

別の態様において、後期発症ＳＭＡに関し、組成物は症状の発症後に送達される。１つの態様において、患者の処置（例えば１回目の注入）は生後１年より前に開始される。別の態様において、処置は生後１年より後に、あるいは２～３歳より後、５歳より後、１１歳より後又はもっと高齢に開始される。

別の態様において、コンストラクトを後日に再投与する。場合により１回より多い再投与が許される。そのような再投与は同じ型のベクターを用いるか、異なるウイルスベクターを用いるか又は本明細書に記載される非ウイルス送達を介する場合がある。例えば患者がＳＭＮをコードするｒＡＡＶ９で処置され、２回目の処置必要としている場合、続いてｒＡＡＶｒｈ．１０．ＳＭＮを投与することができ、逆も真である。また、患者がＡＡＶ９に対する中和抗体を有している場合、代わりにｒＡＡＶｒｈ．１０．ＳＭＮを患者に投与することができる。

ＳＭＡ患者の処置は、本発明の組成物を用いる処置の前、間及び／又は後の免疫抑制剤を用いる一過性の併用処置（ｃｏ－ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）のような併用療法を必要とする場合がある。そのような併用療法のための免疫抑制剤には、ステロイド、代謝拮抗剤、Ｔ－細胞阻害剤及びアルキル化剤が含まれるがこれらに限られない。例えばそのような一過性の処置は、約６０ｍｇで開始して１０ｍｇ／日で減少させる（７日は投薬なし）量において用量を減少させて７日間、１日１回投薬されるステロイド（例えばプレドニゾール（ｐｒｅｄｎｉｓｏｌｅ））を含む場合がある。他の用量及び免疫抑制剤が選ばれる場合がある。

「機能があるｈＳＭＮ１」により、配列番号１により特徴付けられるもののような天然のＳＭＮタンパク質あるいは天然の生存運動ニューロンタンパク質の少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％又は大体同じか若しくは１００％より高い生物学的活性レベルを与える別のＳＭＮタンパク質あるいは疾患と関連しないその天然の変異体又は多形をコードする遺伝子を意味するものとする。さらにＳＭＮ１のホモログであるＳＭＮ２もＳＭＮタンパク質をコードするが、機能があるタンパク質のプロセシングの効率は低い。機能があるｈＳＭＮ１遺伝子がない患者は、ＳＭＮ２のコピー数に基づき様々な程度までＳＭＡを示す。かくしていくらかの患者に関し、ＳＭＮタンパク質が天然のＳＭＮタンパク質の１００％未満生物学的活性を与えるのが望ましい場合がある。

１つの態様において、そのような機能があるＳＭＮは、天然のタンパク質又は配列番号１の全長配列に約９５％以上同一性あるいはアミノ酸レベルで配列番号１に約９７％か若しくはそれより高い又は約９９％か若しくはそれより高い同一性を有する配列を有する。そのような機能があるＳＭＮタンパク質は天然の多形も包む場合がある。同一性は、配列のアラインメントを準備することにより、かつ当該技術分野において既知であるか又は商業的に入手可能な多様なアルゴリズム及び／又はコンピュータープログラムの使用を介して、決定される場合がある［例えばＮｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを用いる例えばＢＬＡＳＴ，ＥｘＰＡＳｙ；ＣｌｕｓｔａｌＯ；ＦＡＳＴＡ；］。

試験管内でＳＭＮ発現及び活性レベルを測定するための多様なアッセイが存在する。例えば上記で引用したＴａｎｇｕｙら、２０１５を参照されたい。本明細書に説明される方法をＳＭＡ又はその症状の処置のための他のいずれかの治療と組み合わせることもできる。例えばＳＭＡのための現在の治療標準の議論を提供するＷａｎｇら、Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ Ｓｔａｔｅｍｅｎｔ ｆｏｒ Ｓｔａｎｄａｒｄ ｏｆ Ｃａｒｅ ｉｎ Ｓｐｉｎａｌ Ｍｕｓｃｕｌａｒ Ａｔｒｏｐｙ及びｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｏｏｋｓ／ＮＢＫ１３５２／も参照されたい。例えばＳＭＡにおいて
栄養が懸念である場合、胃瘻管の造設が適している。呼吸機能が悪化する時、気管切開又は非侵襲性呼吸支持器（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｕｐｐｏｒｔ）が提供される。睡眠時呼吸障害は持続気道陽圧の夜間使用を用いて処置され得る。ＳＭＡ ＩＩ及びＳＭＡ ＩＩＩの患者における脊柱側弯症のための外科手術は、努力肺活量が３０％－４０％より高い場合、安全に行われ得る。電動車いす（ｐｏｗｅｒ ｃｈａｉｒ）及び他の装置は生活の質の向上を可能にする。引用によりその記載事項が本明細書に取り込まれる米国特許第８２１１６３１号明細書も参照されたい。

“ａ”又は“ａｎ”は１つ又は２つ以上を指すことに注意するべきである。従って“ａ”（又は“ａｎ”）、「１つ又は２つ以上」（“ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ”）及び「少なくとも１つ」（“ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ”）は本明細書で互換的に用いられる。

「含む」（“ｃｏｍｐｒｉｓｅ”）、「含む」（“ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ”）及び「含む」（“ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ”）という用語は排他的にではなく包含的に解釈されるべきである。「からなる」（“ｃｏｎｓｉｓｔ”）、「からなる」（“ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ”）という用語及びその変形は包含的にではなく排他的に解釈されるべきである。明細書中の種々の態様は「含む」（“ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ”）の語法（ｌａｎｇｕａｇｅ）を用いて提示されるが、他の状況下で、関連する態様は「からなる」（“ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ”）又は「本質的にからなる」（“ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ”）の語法を用いて解釈されるべきことも意図されており、そのように記載される。

本明細書で用いられる場合、「約」という用語は、他に特定されなければ与えられる基準から１０％（±１０％）の変動を意味する。

本明細書で用いられる場合、「疾患」、「障害」及び「状態」は、患者における異常な状態を示すために互換的に用いられる。

本明細書で他に定義されなければ、本明細書で用いられる技術的及び科学的用語は、当該技術分野における通常の熟練者により、及び、出版された本への参照により、通常理解されると同じ意味を有し、刊行されたテキストは本出願中で用いられる用語の多くへの一般的な指針を当該技術分野における熟練者に与える。

以下の実施例は例示のみであり、本発明を制限することを意図していない。

ｈＳＭＮ１を含有するＡＡＶベクター
ＳＭＮΔ７マウスモデルを用い、我々はＳＭＡの処置のためのＡＡＶ媒介遺伝子療法を評価した。遍在性ＣＢプロモーターの調節下にコドン最適化ヒトＳＭＮ１ ｃＤＮＡを保有する向神経性ＡＡＶｒｈ．１０ベクターを構築した（図１）。ＳＭＮΔ７新生仔に顔面静脈を介してベクターの５ｘ１０¹⁰個のゲノムコピー（ｋｇ当たり５ｘ１０¹³個のゲノムコピー）を注入した。処置はこの用量において後根神経節のような末梢ニューロンにおける健常な発現（図２）ならびに脊髄内における形質導入を生じた。生存期間のいくらかの向上（未処置マウスにおける１４日に対して２１日）も観察された。

追加の用量研究
ＳＭＮΔ７新生仔に１尾当たり５ｘ１０¹²個のゲノムコピーのベクターを静脈内注入を介して注入した。仔マウスのメジアン生存期間は１０日であった。アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）及びアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）レベル
は上昇した。図６。

４－１５日の日齢範囲内の４９匹のＳＭＮΔ７仔マウスに１尾当たり５ｘ１０¹¹個のゲノムコピーのベクターを、静脈内注入を介して注入した。Ｍ４４、Ｍ４６、Ｍ３７、Ｍ４５、Ｍ４７及びＭ３６という呼称は、研究において用いられた異なる一腹の仔マウスを指す。３０日に４９匹の仔マウスは生き残っていた。

ｈＳＭＮを含有するＡＡＶベクターのクモ膜下腔内送達
１回の注入を介して脳脊髄液（ＣＳＦ）に直接送達されるＡＡＶｒｈ．１０．ＳＭＮの投薬及び薬効を評価する。

ＡＡＶｒｈ．１０．ＳＭＮ又はｓＡＡＶｒｈ．１０．ＧＦＰの脳室内（ＩＣＶ）送達をＳＭＮΔ７新生仔において評価する。ベクター投与から７、１４、３０，６０又は９０日後に、各処置グループからの動物をベクター生体内分布及び酵素発現の分析のために屠殺する。マウスを生存及び体重増加に関して毎日監視する。マウスについての行動試験は、それらが横向きに置かれてから３０秒以内に立ち直る能力を決定することにより、立ち直り反射（ｒｉｇｈｔｉｎｇ ｒｅｆｌｅｘ）に関して試験することを含む。仔マウスの表現型を救うＡＡＶｒｈ．１０．ＳＭＮの用量を決定し、それはブタＳＭＡモデルに投与される用量に関して有益である。

Ｄｕｑｕｅら、Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ．２０１５，７７（３）：３９９－４１４に記載されている通りにブタＳＭＡモデルにおいてＡＡＶｒｈ．１０．ＳＭＮ又はｓＡＡＶｒｈ．１０．ＧＦＰのクモ膜下腔内送達を評価する。薬効、ベクター生体内分布及び酵素発現の分析のために、縦断的（ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ）電気生理学的研究、組織学及び神経病理学研究を行う。ブタの表現型を救うＡＡＶｒｈ．１０．ＳＭＮの用量を決定し、それは非ヒト霊長類及びヒトに投与するための用量に関して有益である。

１回のクモ膜下腔内仙椎輸液又は注入を用い、カニクイザルにｓＡＡＶｒｈ．１０．ＧＦＰを投与する。投薬から２週間後、ベクター生体内分布と、酵素発現と、ＤＮＡ及びＲＮＡ生体内分布との分析のためにカニクイザルを安楽死させ、免疫蛍光染色を行う。

以下の情報は識別子＜２２３＞の下のフリーテキストを含む配列に関して提供される。

本明細書において引用されたすべての公開文書及び優先権書類、２０１４年１２月１４日に出願された米国仮特許出願第６２／２６７，０１２号明細書は、引用によりその記載事項全体が本明細書に取り込まれる。同様に、本明細書で言及され、かつ添付の配列表中に現れる配列番号は引用により本明細書に取り込まれる。特定の態様を参照して本発明を説明してきたが、本発明の趣旨から逸脱することなく変更を成し得ることは了解されるであろう。そのような変更は添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図されている。

Claims (21)

1. 配列番号５のアミノ酸配列又はそれに少なくとも９９％同一な配列を含むＡＡＶｒｈ１０キャプシドと、機能がある生存運動ニューロン（ＳＭＮ）タンパク質をコードする配列番号２により定義される核酸配列及び宿主細胞におけるＳＭＮ配列の発現を方向付ける発現調節配列を含むベクターゲノムとを含む、組換えアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクター。
2. 前記発現調節配列はプロモーターを含む、請求項１に記載のＡＡＶベクター。
3. 前記プロモーターはＣＢプロモーターである、請求項２に記載のＡＡＶベクター。
4. 前記プロモーターはＣＢ７プロモーターである、請求項３に記載のＡＡＶベクター。
5. 前記発現調節配列は組織特異的プロモーターを含む、請求項２に記載のＡＡＶベクター。
6. 組織特異的プロモーターはニューロン－特異的プロモーターである、請求項５に記載のＡＡＶベクター。
7. イントロン、コザック配列、ポリＡ、ＷＰＲＥ及び転写後調節エレメントの１つ以上をさらに含む、請求項１～６のいずれかに記載のＡＡＶベクター。
8. ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲｓ）配列をさらに含む、請求項１～７のいずれかに記載のＡＡＶベクター。
9. 前記ＩＴＲｓは、キャプシドを供給するＡＡＶと異なるＡＡＶに由来する、請求項８に記載のＡＡＶベクター。
10. 前記ＩＴＲｓはＡＡＶ２に由来する、請求項８に記載のＡＡＶベクター。
11. 製薬学的に許容され得る担体及び請求項１～１０のいずれか１つに記載のＡＡＶベクターを含む、医薬組成物。
12. ヒト患者の脊髄性筋萎縮症の処置に使用するための、請求項１～１０のいずれか１つに記載のＡＡＶベクター又は請求項１１に記載の組成物。
13. 前記ＡＡＶベクター又は組成物は別の療法と併用して投与可能である、請求項１２に記載の使用のための、ＡＡＶベクター又は組成物。
14. 前記ＡＡＶベクター又は組成物は体重ｋｇ当たり約１ｘ１０¹⁰個のゲノムコピー（ＧＣ）ないし体重ｋｇ当たり約１ｘ１０¹⁴個のＧＣの用量で投与可能である、請求項１３に記載の使用のための、ＡＡＶベクター又は組成物。
15. 前記ＡＡＶベクター又は組成物は体重ｋｇ当たり約５ｘ１０¹³個のＧＣの用量で投与可能である、請求項１４に記載の使用のための、ＡＡＶベクター又は組成物。
16. 前記ＡＡＶベクター又は組成物は体重ｋｇ当たり約２．５ｘ１０¹²個のＧＣの用量で投与可能である、請求項１４に記載の使用のための、ＡＡＶベクター又は組成物。
17. 前記ＡＡＶベクター又は組成物は１回以上投与可能である、請求項１２～１６のいずれかに記載の使用のための、ＡＡＶベクター又は組成物。
18. 患者における脊髄性筋萎縮症を処置するための薬剤を製造するための、請求項１～１０のいずれか１に記載のＡＡＶベクター又は請求項１１に記載の組成物の使用。
19. 前記薬剤がクモ膜下腔内投与のために調整される、請求項１８に記載の使用。
20. 前記患者が哺乳類である、請求項１８又は１９に記載の使用。
21. 前記患者がヒトである、請求項２０に記載の使用。

Images