CN115997012A - Rpe65相关眼睛疾病和障碍的治疗 - Google Patents

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Abstract

本文所述的本公开提供了重组腺相关病毒(rAAV)病毒颗粒，其包含AAV9血清型衣壳和编码RPE65(例如，hRPE65)多肽的载体基因组、以及相关组合物及其用途(例如，治疗莱伯氏先天性黑矇2型(LCA2)的用途)。

Description

RPE65相关眼睛疾病和障碍的治疗
相关申请的引用
本申请要求于2021年9月6日提交的国际专利申请号PCT/CN2021/116781的优先权，该申请的全部内容(包括所有附图和序列表)通过引用并入本文。
序列表
本申请含有已经以ASCII格式电子递交的序列表，并且所述序列表通过引用以其全文特此并入。所述XML副本创建于2022年9月4日，名称为HGP016PCT-Sequence Listing(132045-00919)，大小为23,248字节。
背景技术
全世界范围内大约每2,300人中有1人患有由多种基因引起的遗传性视网膜疾病(IRD)，但有效的治疗方法却很少。已经发现了超过300种单基因的突变会导致功能性蛋白质的丢失，而功能性蛋白质影响视觉功能。这些功能基因大多在视网膜色素上皮(RPE)细胞和感光细胞中表达。它们的功能失调或缺乏可能会导致某些IRD，例如：视网膜色素变性、斯特格氏病、脉络膜炎和莱伯氏先天性黑矇(Leber's congenital amaurosis，LCA)。
LCA病由德国眼科医生Theodor Leber于1869年首次报道，是最早发现和最严重的遗传性视网膜病变之一，患有LCA的人从婴儿期开始视觉功能就严重受损。LCA占遗传性视网膜病变的超过5％，是儿童先天性失明的主要原因(10％-20％)。LCA的临床特征是眼球震颤、瞳孔反应迟钝或几乎消失、视力严重下降、畏光和高度远视。
LCA病大多为常染色体隐性遗传，目前已知的致病基因至少有22个。由RPE65基因突变引起的LCA病称为LCA2(莱伯氏先天性黑矇2型)，占LCA总数的约6％-15％。RPE65大小为65kD，主要在视网膜色素上皮细胞中表达，又称为类视黄醇色素异构酶。RPE65蛋白在视循环中催化全反式视黄醇异构化为11-顺式-视黄醇，这对维持视觉功能起着重要作用。RPE65突变导致全反式视黄醇累积，视紫红质无法再生，导致视觉功能失调。
目前对LCA2的治疗主要是基因疗法。将AAV用作载体以将正确的RPE65基因递送到靶细胞，从而恢复视觉功能。2017年，FDA批准了首个基因治疗药物
Figure BDA0003938719500000011
(voretigene neparvovec-rzyl)用于治疗LCA2。
Figure BDA0003938719500000012
(voretigene neparvovec-rzyl)是一种具有携带人RPE65基因的AAV2血清型(即AAV2衣壳)的基因治疗药物，其临床结果表现出了对视力的改善。然而，据报道，通过
Figure BDA0003938719500000013
(voretigene neparvovec-rzyl)恢复的视觉功能仍有进一步改善的空间。
因此，有必要提供另外的基因疗法来治疗RPE65相关眼睛疾病和障碍。
发明内容
本公开的一方面提供了重组腺相关病毒(rAAV)病毒颗粒，其包含AAV9血清型衣壳和编码RPE65(例如，hRPE65)多肽的载体基因组，例如与SEQ ID NO:1具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、或99.9％同一性的多核苷酸。
本公开的相关方面提供了编码RPE65(例如，hRPE65)多肽的重组腺相关病毒(rAAV)载体基因组，例如与SEQ ID NO:1具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的多核苷酸。
在某些实施方式中，所述rAAV载体基因组包含：a)5’末端反向重复(ITR)；b)编码RPE65多肽的RPE65多核苷酸，其中所述RPE65多核苷酸包含SEQ ID NO:2的多核苷酸序列或与SEQ ID NO:2的多核苷酸序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.2％、99.4％、99.6％、或99.8％序列同一性的多核苷酸序列；c)可操作地连接至所述RPE65多核苷酸并驱动其转录的启动子；d)位于所述RPE65多核苷酸上游和所述启动子下游的任选的Kozak序列；e)聚A(polyA)信号序列；以及f)3’ITR。在某些实施方式中，所述RPE65多肽具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述5’ITR和3’ITR源自AAV2或AAV9。在某些实施方式中，所述5’ITR包含SEQ ID NO:7的核苷酸序列。在某些实施方式中，所述3’ITR包含SEQ ID NO:8的核苷酸序列。
在某些实施方式中，所述启动子是广谱(ubiquitous)启动子。在某些实施方式中，所述启动子是组织特异性启动子。在某些实施方式中，所述启动子是组成型启动子。在某些实施方式中，所述启动子是诱导型启动子。
在某些实施方式中，所述启动子选自pol I启动子、pol II启动子、pol III启动子、T7启动子、U6启动子、H1启动子、逆转录病毒劳斯肉瘤病毒LTR启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、SV40启动子、二氢叶酸还原酶启动子、β-肌动蛋白启动子、延伸因子1α短(EFS)启动子、β葡萄糖醛酸酶(GUSB)启动子、巨细胞病毒(CMV)即早期(IE)增强子和/或启动子、鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子或其衍生物如CAG启动子、CB启动子、(人)延伸因子1α-亚基(EF1α)启动子、泛素C(UBC)启动子、朊病毒启动子、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经丝轻链(NFL)启动子、神经丝重链(NFH)启动子、血小板衍生生长因子(PDGF)启动子、血小板衍生生长因子B链(PDGF-β)启动子、突触蛋白(Syn)启动子、突触蛋白1(Syn1)启动子、甲基-CpG结合蛋白2(MeCP2)启动子、Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II(CaMKII)启动子、代谢型谷氨酸受体2(mGluR2)启动子、神经丝轻链(NFL)启动子、神经丝重链(NFH)启动子、β-珠蛋白小基因nβ2启动子、前脑啡肽原(PPE)启动子、脑啡肽(Enk)启动子、兴奋性氨基酸转运蛋白2(EAAT2)启动子、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)启动子、髓鞘碱性蛋白(MBP)启动子、或其功能片段。
在某些实施方式中，所述启动子是CAG启动子。
在某些实施方式中，所述CAG启动子包含与SEQ ID NO:4具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。
在某些实施方式中，所述CAG启动子包含SEQ ID NO:4、基本上由其组成、或由其组成。
在某些实施方式中，所述聚A信号序列选自牛生长激素聚腺苷酸化信号序列(bGH聚A)、小聚A信号序列(SPA)、人生长激素聚腺苷酸化信号序列(hGH聚A)、兔β珠蛋白聚A信号序列(rBG聚A)、SV40聚A信号序列(SV40聚A)、或其变体。在某些实施方式中，所述聚A信号序列是bGH聚A。
在某些实施方式中，所述bGH聚A包含SEQ ID NO:5、基本上由其组成、或由其组成。
在某些实施方式中，所述Kozak序列是GCCACC(SEQ ID NO:6)；或是包含与GCCACC(SEQ ID NO:6)相比最多1、2、3或4个核苷酸差异的序列，并且任选地其中最后三个核苷酸是ACC或GCC。
在某些实施方式中，所述载体基因组按5’至3’方向包含：
(1)SEQ ID NO:7的5’ITR，
(2)SEQ ID NO:4的CAG启动子，
(3)GCCACC(SEQ ID NO:6)的Kozak序列，
(4)SEQ ID NO:2的hRPE65多核苷酸序列，
(5)SEQ ID NO:5的bGH聚A信号序列，以及
(6)SEQ ID NO:8的3’ITR，
在(1)和(2)之间，(2)和(3)之间，(3)和(4)之间，(4)和(5)之间、和/或(5)和(6)之间具有任选的接头。
在某些实施方式中，所述载体基因组包含以下、基本上由以下组成、或由以下组成：SEQ ID NO:1，或者与SEQ ID NO:1具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的、编码与SEQ ID NO:3具有至少95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性(例如，与SEQ ID NO:3具有100％同一性)的RPE65多肽的多核苷酸。
在某些实施方式中，所述载体基因组与SEQ ID NO:1具有至少99％序列同一性。
在某些实施方式中，所述载体基因组由SEQ ID NO:1组成。
在某些实施方式中，所述AAV9血清型衣壳包含AAV9 VP1、AAV9 VP2和AAV9VP3；或分别与其独立地具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的VP1、VP2和VP3变体。
在某些实施方式中，所述AAV9血清型衣壳包含AAV9 VP1(SEQ ID NO:9)、AAV9 VP2和AAV9 VP3。
本公开的另一方面提供了重组AAV(rAAV)载体基因组，其包含以下、基本上由以下组成、或由以下组成：SEQ ID NO:1，或者与SEQ ID NO:1具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的、编码与SEQ ID NO:3具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的RPE65多肽的多核苷酸。
在某些实施方式中，所述rAAV载体基因组是SEQ ID NO:1或与其具有至少95％或99％序列同一性的多核苷酸。
在某些实施方式中，所述rAAV载体基因组是SEQ ID NO:1。
本公开的另一方面提供了重组(rAAV)病毒颗粒，其具有本公开的rAAV载体基因组。
在某些实施方式中，所述rAAV病毒颗粒具有血清型为AAV9的衣壳。
本公开的另一方面提供了重组AAV(rAAV)病毒颗粒，其包含本公开的rAAV载体基因组，所述载体基因组衣壳化于血清型为AAV9的衣壳中。
在某些实施方式中，所述rAAV载体基因组是SEQ ID NO:1。
本公开的另一方面提供了药物组合物，所述药物组合物包含本公开的rAAV载体基因组、或本公开的rAAV病毒颗粒、以及药学上可接受的赋形剂。
在某些实施方式中，所述rAAV载体基因组是SEQ ID NO:1。
本公开的另一方面提供了在有需要的受试者中治疗(例如，(人)RPE65缺陷型)RPE65相关眼睛疾病或障碍的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的本公开的rAAV载体基因组、本公开的rAAV病毒颗粒、或本公开的药物组合物，其中所述rAAV载体基因组或所述rAAV病毒颗粒特异性诱导(例如，在视网膜色素上皮(RPE)细胞中)从所述rAAV病毒颗粒的所述载体基因组表达所述RPE65多肽。
在某些实施方式中，所述施用包括使细胞与所述治疗有效量的本公开的rAAV载体基因组、本公开的rAAV病毒颗粒、或本公开的药物组合物接触。
在某些实施方式中，所述细胞位于所述受试者的眼睛中。
在某些实施方式中，所述RPE65相关眼睛疾病或障碍是脉络膜炎、视网膜色素变性、黄斑病变、包括莱伯氏先天性黑矇2型(LCA2)的莱伯氏先天性黑矇(LCA)、莱伯氏遗传性视神经病变、早发型严重视网膜营养不良、全色盲、视网膜劈裂症、眼白化病、眼皮肤白化病、斯特格氏病、无脉络膜、脊髓小脑性共济失调7型(SCAT)、色盲、影响角膜的溶酶体贮积症例如黏多糖贮积症(MPS)IV型和MPS VII型、阿米巴角膜炎、真菌性角膜炎、细菌性角膜炎、病毒性角膜炎、盘尾丝虫性角膜炎、角膜结膜炎、细菌性角膜结膜炎、病毒性角膜结膜炎、春季角膜结膜炎、特应性角膜结膜炎、角膜营养不良性疾病、富克斯内皮营养不良、干燥综合征、史-约综合征、自身免疫性干眼病、环境性干眼病、角膜新生血管形成疾病、角膜移植后排斥反应的预防和治疗、自身免疫性葡萄膜炎、感染性葡萄膜炎、非感染性葡萄膜炎、前葡萄膜炎、后葡萄膜炎(包括弓形虫病)、泛葡萄膜炎、玻璃体或视网膜的炎性疾病、眼内炎的预防和治疗、黄斑水肿、黄斑变性、湿性年龄相关性黄斑变性(湿性AMD)、干性年龄相关性黄斑变性(干性AMD)、糖尿病性黄斑水肿(DME)、过敏性结膜炎、增殖性和非增殖性糖尿病性视网膜病变、高血压性视网膜病变、视网膜的自身免疫性疾病、原发性和转移性眼内黑素瘤、其他眼内转移性肿瘤、青光眼、开角型青光眼、眼底黄色斑点症、闭角型青光眼、色素性青光眼，或其组合。在某些实施方式中，所述RPE65相关眼睛疾病或障碍是莱伯氏先天性黑矇2型(LCA2)。
在某些实施方式中，所述受试者是人，例如具有活视网膜细胞的人。
在某些实施方式中，与尚未与本公开的rAAV载体基因组、本公开的rAAV病毒颗粒、或本公开的药物组合物接触的细胞相比，所述细胞中的所述RPE65多肽的表达增加。
在某些实施方式中，与所述施用前的视网膜电图b波幅度相比，所述受试者的眼睛中的视网膜电图b波幅度增加了至少约30％、约40％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、或约80％。
在某些实施方式中，所述受试者的眼睛中所述视网膜电图b波幅度的增加稳定至少约2周、约3周、约4周、约5周、约6周、约7周、约8周、约9周、约10周、约11周、约12周、约13周、约14周、约15周、约16周、约17周、约18周、约19周、或约20周。
在某些实施方式中，将所述rAAV载体基因组、所述rAAV病毒颗粒或所述药物组合物经由视网膜下注射施用。
在某些实施方式中，在玻璃体切除术后进行所述视网膜下注射。
应理解，本文所述的任何一个实施方式，包括仅在实施例或权利要求中描述的那些实施方式，可以与本公开的任何一个或多个另外的实施方式组合，除非明确否认或认为不当。
附图说明
图1是包含(人)RPE65(视网膜色素上皮65)编码序列的示例性AAV病毒载体基因组的示意(非按比例)。
图2A示出了野生型小鼠以及未经处理的和用AAV9血清型载体
AAV9-CAG-RPE65(“HG-004”)处理过的RPE65-/-敲除小鼠的眼睛中的RPE65染色。ONL：外核层；INL：内核层。
图2B示出了对野生型小鼠以及未经处理的和用AAV9-CAG-RPE65(“HG-004”)处理过的RPE65-/-敲除小鼠中通过视网膜电描记术(ERG)测量的视觉功能。
图2C示出了野生型小鼠和RPE65-/-敲除小鼠的眼睛视网膜电描记术(暗适应3.0ERG)的条形图。在RPE RPE65-/-小鼠中暗适应3.0ERG被破坏。WT，N＝12；RPE65-/-，N＝10。
图3A示出了用不同剂量AAV9-CAG-hRPE65处理过的RPE65-/-敲除小鼠的眼睛视网膜电描记术图。AAV9-CAG-hRPE65以剂量依赖性方式恢复了RPE65-/-小鼠的视觉功能-在HG-004(3E+7或剂量3)给药后第3、6、9和14周RPE65-/-小鼠的视觉功能恢复至约50％/60％/70％/72％。N＝3-5只/组。*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001。
图3B示出了于图3A的第3、6、9和14周测量的、用AAV9-CAG-hRPE65处理过的RPE65-/-敲除小鼠中处理后眼睛的ERG图。剂量1：3E+6；剂量3：3E+7；剂量4：1E+8。
图4示出了用AAV9-CAG-hRPE65或AAV2-CAG-hRPE65处理过的RPE65-/-敲除小鼠的眼睛视网膜电描记术图。AAV9-CAG-hRPE65(AAV9衣壳)与AAV2衣壳中其他方面相同的载体基因组相比以远远(约10-100倍)更低的剂量展现出了更好的治疗效果。N＝2-5只/组。
具体实施方式
1.概述
本文所述的本公开提供了重组AAV(rAAV)病毒颗粒(rAAV)，其包含AAV9血清型衣壳外壳(例如，AAV9衣壳外壳)和rAAV载体基因组，所述载体基因组包含编码多肽的编码序列，例如RPE65，所述rAAV病毒颗粒用于治疗眼睛疾病或障碍例如莱伯氏先天性黑矇(LCA)。
本公开部分地基于以下令人惊讶的发现：，当将rAAV载体基因组衣壳化于AAV9衣壳外壳时，以远远(约10-100倍)更低的剂量提供比衣壳化于AAV2衣壳外壳的相同载体基因组更好的治疗效果，rAAV载体基因组包含编码多肽的基因序列，例如RPE65。
如本文所用，rAAV载体、载体基因组、和重组AAV病毒颗粒在本文中也分别称为rAAV载体(重组腺相关病毒)、载体基因组(例如，ITR至ITR序列)和重组rAAV病毒(rAAV)颗粒。特别地，一方面，本发明AAV9血清型rAAV载体可以由见于野生型AAV9或与其具有相似或相同血清型和向性的变体(例如AAV9血清型)的相同衣壳外壳中的任一个构成，其携带本公开的rAAV载体基因组作为病毒基因材料。因此，本发明rAAV载体具有源自AAV9外壳的所有常见优势，如特异性/广泛向性和低免疫原性。
本公开的rAAV病毒载体可用于将包含转基因例如RPE65(例如人RPE65)的rAAV载体基因组递送至与AAV9病毒衣壳外壳的向性相容的宿主细胞。宿主细胞可以来自眼睛或眼组织。眼睛或眼组织可以来自哺乳动物，特别是来自人，例如具有活视网膜色素细胞的人。
因此，本公开的一方面提供了rAAV病毒颗粒，其包含AAV9血清型衣壳和rAAV载体基因组，所述rAAV载体基因组包含编码RPE65基因的转基因并用于治疗眼睛疾病或障碍。
在一些实施方式中，眼睛疾病或障碍由基因突变引起。在一些实施方式中，基因突变在RPE65基因中。在一些实施方式中，所述眼睛疾病或障碍是眼底白点症、脉络膜炎、视网膜色素变性、黄斑病变、包括莱伯氏先天性黑矇2型(LCA2)的莱伯氏先天性黑矇(LCA)、莱伯氏遗传性视神经病变、早发型严重视网膜营养不良、全色盲、视网膜劈裂症、眼白化病、眼皮肤白化病、斯特格氏病、无脉络膜、脊髓小脑性共济失调7型(SCAT)、色盲、影响角膜的溶酶体贮积症例如黏多糖贮积症(MPS)IV型和MPS VII型、阿米巴角膜炎、真菌性角膜炎、细菌性角膜炎、病毒性角膜炎、盘尾丝虫性角膜炎、角膜结膜炎、细菌性角膜结膜炎、病毒性角膜结膜炎、春季角膜结膜炎、特应性角膜结膜炎、角膜营养不良性疾病、富克斯内皮营养不良、干燥综合征、史-约综合征、自身免疫性干眼病、环境性干眼病、角膜新生血管形成疾病、角膜移植后排斥反应的预防和治疗、自身免疫性葡萄膜炎、感染性葡萄膜炎、非感染性葡萄膜炎、前葡萄膜炎、后葡萄膜炎(包括弓形虫病)、泛葡萄膜炎、玻璃体或视网膜的炎性疾病、眼内炎的预防和治疗、黄斑水肿、黄斑变性、湿性年龄相关性黄斑变性(湿性AMD)、干性年龄相关性黄斑变性(干性AMD)、糖尿病性黄斑水肿(DME)、过敏性结膜炎、增殖性和非增殖性糖尿病性视网膜病变、高血压性视网膜病变、视网膜的自身免疫性疾病、原发性和转移性眼内黑素瘤、其他眼内转移性肿瘤、青光眼、开角型青光眼、眼底黄色斑点症、闭角型青光眼、色素性青光眼，或其组合。在一些实施方式中，所述眼睛疾病或障碍是视网膜色素变性、斯特格氏病、脉络膜炎、眼底白点症或莱伯氏先天性黑矇(LCA)。在一些实施方式中，所述眼睛疾病或障碍是莱伯氏先天性黑矇2型(LCA2)。
本公开的另一方面提供了能够包装到AAV病毒颗粒中的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列包含(不一定按此顺序)：(1)有效负荷或转基因(例如，RPE65编码序列，包括经密码子优化的RPE65编码序列，其针对RPE在哺乳动物(例如人)中表达进行优化)；(2)AAV末端反向重复(ITR)；(3)启动子；(4)任选的Kozak序列；以及(5)聚A序列。
例如，在具体实施方式中，所述载体基因组包含：a)5’末端反向重复(ITR，例如可以是正转或倒转构型的野生型AAV2或AAV9 5’ITR)；b)编码RPE65多肽的RPE65多核苷酸，其中所述RPE65多核苷酸与SEQ ID NO:2具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％同一性；b)可操作地连接至所述RPE65多核苷酸并驱动其转录的启动子；c)任选的Kozak序列；e)聚A信号序列；以及f)3’ITR(例如可以是正转或倒转构型的野生型AAV2 3’ITR)，任选地其中所述RPE65多肽具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列。在一些实施方式中，Kozak序列位于RPE65多核苷酸上游和启动子下游。
在某些实施方式中，AAV病毒颗粒源自AAV9或具有AAV9血清型，例如野生型AAV9。
在某些实施方式中，所述5’ITR和3’ITR源自AAV2或AAV9，任选地，所述5’ITR包含SEQ ID NO:7的核苷酸序列，和/或所述3’ITR包含SEQ ID NO:8的核苷酸序列。
野生型AAV9的VP1衣壳序列提供于SEQ ID NO:9。
如本文所用，“AAV病毒颗粒”包括包含以下的病毒颗粒：腺相关病毒(AAV)(属于依赖性细小病毒属，其又属于细小病毒科)的任何野生型衣壳、以及其具有经修饰的序列和/或组织或宿主向性的工程化变体。
如本文所用，“AAV9血清型”包括与野生型AAV9具有相同或相似向性的任何AAV9变体，其包含所有天然存在的进化枝F衣壳(包括AAV0、AAVhu.31和AAVhu.32)。它还包括具有不导致wt AAV9向性实质损失的突变的AAV9的任何改进的变体(例如可以包括wt AAV9中不存在的另外的功能性)、以及具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.2％、99.4％、99.6％、99.8％、99.9％氨基酸序列同一性的AAV9突变体，其中突变或序列变化不导致wt AAV9向性的实质损失。
如本文所用，“感兴趣的基因”或“GOI”包括蛋白质或多肽的任何编码序列，编码序列包括内含子和外显子序列，和/或任何非翻译RNA或非编码RNA(ncRNA，如siRNA、piRNA、短发夹RNA或shRNA、微RNA或miRNA或其前体，包括前体miRNA和初级miRNA、反义序列或寡核苷酸(ASO)、CRISPR/Cas的指导RNA或gRNA、rRNA、tRNA、snoRNA、snRNA、exRNA、scaRNA、lncRNA、Xist、和HOTAIR等)的编码序列。GOI可以包含一个编码序列或多于一个(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个)编码序列。GOI编码序列的长度或GOI的所有编码序列的组合长度不超过可包装到特定或选择的AAV病毒颗粒中的RNA的最大长度，在一种特定的AAV病毒颗粒和另一种病毒颗粒之间其可以是不同的。在某些实施方式中，GOI是RPE65，例如人PRE65(参见例如，具有SEQ ID NO:2的核苷酸序列的人RPE65、或编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列的RPE65编码序列)。
如本文所用，“聚A序列”或“聚A尾”是指腺嘌呤核糖核苷酸或腺苷一磷酸的串(例如，其中每个碱基是腺嘌呤的RNA的串)。这种聚A尾对于mRNA的核输出、翻译和稳定性很重要。在本公开的不同mRNA或RNA序列中聚A序列的长度可以不同，并且可以是聚A的约250个核苷酸、聚A的约230个核苷酸、聚A的约200个核苷酸、聚A的约180个核苷酸、聚A的约160个核苷酸、聚A的约140个核苷酸、聚A的约120个核苷酸、聚A的约100个核苷酸、或更少。
如本文所用，“聚A信号序列”是指位于最3’外显子下游的RNA序列(如AAUAAA)，并由RNA切割复合物识别，所述复合物通过RNA聚合酶(如Pol II)切割新转录的RNA的3’末端序列，从而可以发生聚腺苷酸化。然后，通过将腺苷一磷酸单元从ATP添加到RNA的新生切割的3’端，聚腺苷酸聚合酶添加并延伸聚(A)尾。初始RNA切割通常由酶CPSF(切割/聚腺苷酸化特异性因子)催化，并发生在其结合位点-聚A信号序列(通常是经转录的RNA上的AAUAAA)下游约10-30个核苷酸。位于/或紧邻RNA切割位点5’端的序列经常(但不总是)为CA。由RNA切割复合物识别的聚A信号序列在不同的真核生物组中存在不同，大多数人聚腺苷酸化位点含有AAUAAA序列，尽管这种序列在植物和真菌mRNA中不太常见。此外，还存在与CPSF更弱结合的其他变体。由RNA切割复合物识别以使RNA切割以及随后的聚腺苷酸化的所有这些序列基序都在聚A信号序列的范围内。
在一些实施方式中，所述聚A序列是牛生长激素聚腺苷酸化信号(bGH聚A)、小聚A信号(SPA)、人生长激素聚腺苷酸化信号(hGH聚A)、SV40聚A信号(SV40聚A)、兔β珠蛋白聚A序列(rBG聚A)、或其变体。
在某些实施方式中，本公开的多核苷酸经密码子优化以在真核生物、哺乳动物(例如，人或非人哺乳动物)，例如在人眼睛中，尤其是在人视网膜色素上皮(RPE)细胞中表达。
在相关方面，本公开提供了多核苷酸，所述多核苷酸(i)与上文描述的本发明多核苷酸(例如，SEQ ID NO:1或2)相比具有一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)核苷酸添加、缺失或取代；(ii)与上文描述的本发明多核苷酸(例如，SEQ ID NO:1或2)具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性；(iii)在严格条件下与上文描述的本发明多核苷酸、或(i)和(ii)中的任一者杂交；或(iv)是(i)-(iii)中的任一者的互补序列。
在某些实施方式中，所述多核苷酸与启动子和任选的增强子可操作地连接。例如，在一些实施方式中，所述启动子是组成型启动子、诱导型启动子、广谱启动子或组织特异性启动子。
在另一相关方面，本公开提供了载体，所述载体包含或涵盖本文所述的本公开的任一多核苷酸。所述载体可以是克隆载体或表达载体。仅举几例，所述载体可以是质粒、噬菌粒或粘粒。在某些实施方式中，所述载体可用于在哺乳动物细胞例如人细胞中表达多核苷酸、SEQ ID NO:3的RPE65多肽、或其直系同源物、同源物、衍生物、功能性片段、融合物；或本公开的任一多核苷酸；或本公开的任一复合物。
在某些实施方式中，所述载体是质粒。在某些实施方式中，所述载体是逆转录病毒载体、噬菌体载体、腺病毒载体、单纯疱疹病毒(HSV)载体、AAV载体或慢病毒载体。
在某些实施方式中，所述AAV载体是血清型AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAVrh74、AAV8、AAV9、AAV10、AAV 11、AAV 12、AAV 13、AAV.PHP.eB或AAV-DJ的重组AAV载体。
本公开的另一方面提供了递送系统，所述递送系统包含(1)递送媒介物，和(2)本公开的多核苷酸或本公开的载体。
在某些实施方式中，所述递送媒介物是纳米颗粒、脂质体、外泌体、微泡或基因枪。
本公开的另外的方面提供了细胞或其后代，所述细胞或其后代包含本公开的多核苷酸、本公开的载体、本公开的rAAV载体基因组、或本公开的rAAV病毒颗粒。所述细胞可以是原核生物(如大肠杆菌)或来自真核生物(如酵母、昆虫、植物、动物(例如，哺乳动物，包括人和小鼠))的细胞。所述细胞可以是分离的原代细胞或已建立的细胞系例如肿瘤细胞系、293细胞或293T细胞、或干细胞、iPC等。在某些实施方式中，宿主细胞是哺乳动物细胞，如HEK293细胞或其变体(例如，HEK293T细胞)、Vero细胞或其变体、或昆虫细胞，如Sf9或Sf21细胞。
本公开的另一方面提供了产生本公开的AAV病毒颗粒的方法，所述方法包括将本公开的载体基因组在合适的包装细胞系中包装以衣壳化所述载体基因组于AAV9血清型的AAV衣壳内。在某些实施方式中，所述方法进一步包括分离或纯化本公开的rAAV病毒颗粒。
在某些实施方式中，所述细胞或其后代是真核细胞(例如，非人哺乳动物细胞、人细胞或植物细胞)或原核生物细胞(例如，细菌细胞)。
在某些实施方式中，本公开的AAV病毒颗粒在哺乳动物细胞例如海拉(HeLa)细胞或HEK293/293T细胞中通过以下质粒的三重转染产生：编码AAV辅助功能的质粒、包含侧翼于用于AAV包装的ITR序列(例如AAV2或AAV9)的GOI(例如，RPE65)的质粒、和包含rep/cap编码序列的质粒。
在某些实施方式中，本公开的AAV病毒颗粒在昆虫细胞(例如Sf9)中通过杆状病毒包装系统产生。
在某些实施方式中，本公开的AAV病毒颗粒在包含Vero细胞和ICP27缺失的HSV载体的HSV相容性包装系统中产生。
本公开的另外的方面提供了非人多细胞真核生物，其包含本公开的细胞、载体基因组或病毒颗粒。
在某些实施方式中，所述非人多细胞真核生物是针对人遗传障碍的动物(例如啮齿动物或灵长类动物，例如非人灵长类动物(NHP))模型。在某些实施方式中，所述NHP是猴，如食蟹猴(食蟹猕猴(Macaca fascicularis))。
在某些实施方式中，所述ITR序列在3’端和5’端处。在某些实施方式中，所述3’ITR和所述5’ITR源自AAV2或AAV9，例如wt AAV2 ITR序列。
在相关方面，本公开提供了包含rAAV病毒基因组的真核细胞，所述rAAV病毒基因组包含：(1)编码感兴趣的基因的核酸分子，例如，RPE65多肽或其变体；(2)可操作地连接至核酸分子的启动子；以及(3)3’ITR和5’ITR。在一些实施方式中，所述rAAV病毒基因组进一步包含Kozak序列和聚A序列。
在另一方面，本公开提供了组合物，所述组合物包含本公开的一种或多种载体，所述一种或多种载体包含：(i)编码以下的第一多核苷酸：RPE65，例如基于SEQ ID NO:3的RPE65蛋白或其直系同源物、同源物、衍生物、功能性片段、融合物；所述第一多核苷酸任选地可操作地连接至第一调节元件和第二调节元件；和(ii)聚A序列。所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸在相同的载体上。在一些实施方式中，所述第一调节元件是启动子，例如诱导型启动子或组织特异性启动子。在一些实施方式中，所述第二调节元件是Kozak序列。
在一些实施方式中，所述载体是质粒。在一些实施方式中，所述载体是病毒载体，所述病毒载体基于逆转录病毒、不能复制的逆转录病毒、腺病毒、不能复制的腺病毒或AAV。在一些实施方式中，所述载体可以在宿主细胞中自我复制(例如，具有细菌复制起点序列)。在一些实施方式中，所述载体可以整合到宿主基因组中并与其一起复制。在一些实施方式中，所述载体是克隆载体。在一些实施方式中，所述载体是表达载体。
本公开进一步提供了递送组合物，所述递送组合物用于递送本公开的基于SEQIDNO:2或3的RPE65多肽或其直系同源物、同源物、衍生物、缀合物、功能性片段、融合物；本公开的多核苷酸；本公开的载体；本公开的细胞和本公开的组合物。递送可以使用媒介物(如一种或多种脂质体、一种或多种纳米颗粒、一种或多种外泌体、一种或多种微泡、基因枪或一种或多种病毒载体)通过本领域已知的任何一种方式，如转染、脂质转染、电穿孔、基因枪、显微注射、超声、磷酸钙转染、阳离子转染、病毒载体递送等来进行。
本公开进一步提供试剂盒，所述试剂盒包含以下中的任一者或多者：本公开的基于SEQ ID NO:2或3的RPE65多肽或本公开的其直系同源物、同源物、衍生物、缀合物、功能性片段、融合物；本公开的多核苷酸；本公开的载体；本公开的rAAV载体基因组；本公开的rAAV病毒颗粒、本公开的细胞和本公开的组合物。在一些实施方式中，所述试剂盒可进一步包含关于如何使用试剂盒组分和/或如何从第3方获得用于与所述试剂盒组分一起使用的其他组分的说明。所述试剂盒的任何组分都可以储存在任何合适的容器中。
本公开的另外的方面提供了向细胞或动物中递送感兴趣的基因(GOI)的方法，所述方法包括使所述细胞或所述动物与本公开的rAAV病毒颗粒或本公开的rAAV病毒颗粒的群体接触，其中所述GOI由本公开的多核苷酸序列编码。
上文大体描述了本公开，本公开各个方面的更详细描述在下文的单独部分中提供。然而，应理解，为了简洁和减少冗余，本公开的某些实施方式仅在一个部分下描述或仅在权利要求或实施例中描述。因此，还应理解，本公开的任何一个实施方式，包括仅在一个方面、部分下或仅在权利要求或实施例中描述的那些实施方式，可以与本公开的任何其他实施方式组合，除非特别否认或组合不当。
2.多核苷酸或核酸
本公开还提供了编码本文所述的蛋白质(例如RPE65蛋白)的多核苷酸或核酸。
在一些实施方式中，所述核酸是合成的核酸。在一些实施方式中，所述核酸是DNA分子。在一些实施方式中，所述核酸是RNA分子(例如，编码RPE65多肽的mRNA分子)。在一些实施方式中，将所述mRNA加帽、聚腺苷酸化、用5-甲基胞苷取代、用假尿苷取代、或其组合。
在某些实施方式中，编码本文所述的蛋白质(例如RPE65蛋白)的多核苷酸或核酸包含或可操作地连接至驱动所述多核苷酸转录的转录调节序列，例如启动子。
如本文所用，术语“启动子”限定为启动多核苷酸序列的特异性转录所需的由细胞合成机器或引入的合成机器所识别的DNA序列。
如本文所用，术语“启动子/调节序列”意指表达与启动子/调节序列可操作地连接的基因产物所需的核酸序列。在一些情况下，这种序列可以是核心启动子序列。在其他情况下，这种序列还可以包括增强子序列和表达基因产物所需的其他调节元件。启动子/调节序列可以是例如以组织或细胞类型特异性方式表达基因产物(例如，本公开的RNA序列)的启动子/调节序列。
如本文所用，术语“可操作的连接”或“可操作地连接”是指如此描述的组分的物理并列或功能性并列以允许它们以其预期方式起作用。在与异源多核苷酸(例如，RPE65编码序列)可操作连接的表达控制元件的实例中，这种关系使得控制元件调控异源多核苷酸的表达。更特别地，例如，两个可操作地连接的DNA序列意指两个DNA以这样的关系排列(顺式或反式)，使得DNA序列中的至少一个能够对另一个序列发挥生理作用。
在一些实施方式中，所述核酸(例如，DNA)与调节元件(例如，启动子)可操作地连接以控制所述核酸(例如RPE65核酸)的表达。在一些实施方式中，所述启动子是广谱的。在一些实施方式中，所述启动子是组成型启动子。在一些实施方式中，所述启动子是诱导型启动子。在一些实施方式中，所述启动子是细胞特异性启动子。在一些实施方式中，所述启动子是生物特异性启动子，例如组织特异性启动子。
在某些实施方式中，所述启动子是组成型启动子。
如本文所用，“组成型”启动子是当与编码或指定基因产物的多核苷酸可操作地连接时，在细胞的大多数或全部生理条件下致使基因产物在细胞中产生的核苷酸序列。
在某些实施方式中，所述启动子是诱导型启动子。
如本文所用，“诱导型”启动子是当与编码或指定基因产物的多核苷酸可操作地连接时，基本上仅在对应于启动子的诱导物存在于细胞中时才致使基因产物在细胞中产生的核苷酸序列。
在某些实施方式中，所述启动子是组织特异性启动子、物种特异性启动子、或细胞周期特异性启动子。
如本文所用，“组织或细胞类型特异性”启动子是当与编码基因或由基因指定的多核苷酸可操作地连接时，由于例如细胞/组织是启动子通常在其中具有活性的细胞类型或组织类型，优选地导致基因产物在特定细胞类型或特定组织中产生的核苷酸序列。
在一些实施方式中，启动子与感兴趣的基因异源。在一些实施方式中，启动子是感兴趣的基因的天然启动子。在一些实施方式中，异源启动子包括插入、缺失、取代、和/或其他突变。在一些实施方式中，天然启动子包括插入、缺失、取代、和/或其他突变。
在某些实施方式中，启动子是Pol II启动子。在某些实施方式中，启动子是PolIII启动子，如U6启动子。
合适的启动子是本领域已知的并且包括例如pol I启动子、pol II启动子、polIII启动子、T7启动子、U6启动子、H1启动子、逆转录病毒劳斯肉瘤病毒LTR启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、SV40启动子、二氢叶酸还原酶启动子、β-肌动蛋白启动子、延伸因子1α短(EFS)启动子、β葡萄糖醛酸酶(GUSB)启动子、巨细胞病毒(CMV)即早期(IE)增强子和/或启动子、鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子或其衍生物如CAG启动子、CB启动子、(人)延伸因子1α-亚基(EF1α)启动子、泛素C(UBC)启动子、朊病毒启动子、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经丝轻链(NFL)启动子、神经丝重链(NFH)启动子、血小板衍生生长因子(PDGF)启动子、血小板衍生生长因子B链(PDGF-β)启动子、突触蛋白(Syn)启动子、突触蛋白1(Syn1)启动子、甲基-CpG结合蛋白2(MeCP2)启动子、Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II(CaMKII)启动子、代谢型谷氨酸受体2(mGluR2)启动子、神经丝轻链(NFL)启动子、神经丝重链(NFH)启动子、β-珠蛋白小基因nβ2启动子、前脑啡肽原(PPE)启动子、脑啡肽(Enk)启动子、兴奋性氨基酸转运蛋白2(EAAT2)启动子、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)启动子、髓鞘碱性蛋白(MBP)启动子、或其功能片段。
在一些实施方式中，启动子是CAG启动子(例如SEQ ID NO:4)或其变体，其可用于调节本文所述的RPE65编码序列的表达。
在一些实施方式中，一个或多个核酸存在于载体(例如，病毒载体或噬菌体)中。所述载体可以是克隆载体或表达载体。所述载体可以是质粒、噬菌粒、粘粒等。所述载体可以包括一个或多个允许所述载体在感兴趣的细胞(例如，细菌细胞或哺乳动物细胞)中繁殖的调节元件。在一些实施方式中，载体包括编码如本文所述的感兴趣的基因(例如RPE65)的核酸。在一些实施方式中，载体包括多种核酸，其各自编码感兴趣的基因，或包括如本文所述的一种感兴趣的基因的多个拷贝，例如RPE65的多个拷贝。
在一方面，本公开提供了与本文所述的核酸序列(即，编码感兴趣的基因如RPE65的核酸序列)具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核酸序列。
在另一方面，本公开还提供了编码如下氨基酸序列的核酸序列，所述氨基酸序列与本发明RPE65多肽的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
在一些实施方式中，所述核酸序列具有至少一部分(例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50、60、70、80、90或100个核苷酸，例如，连续或非连续核苷酸)与本文所述的序列相同。在一些实施方式中，所述核酸序列具有至少一部分(例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50、60、70、80、90或100个核苷酸，例如，连续或非连续核苷酸)与本文所述的序列不同。
在相关的实施方式中，本公开提供如下氨基酸序列，所述氨基酸序列具有至少一部分(例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50、60、70、80、90或100个氨基酸残基，例如，连续或非连续氨基酸残基)与本文所述的序列相同。在一些实施方式中，所述氨基酸序列具有至少一部分(例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50、60、70、80、90或100个氨基酸残基，例如，连续或非连续氨基酸残基)与本文所述的序列不同。
为了确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的序列同一性百分比，出于最佳比较目的对序列进行比对(例如，可以在第一和第二氨基酸或核酸序列的一者或两者中引入空位以用于最佳比对，并且出于比较目的可以忽略非同源序列)。一般来说，出于比较目的而比对的参考序列的长度应是参考序列长度的至少80％，并且在一些实施方式中是参考序列长度的至少90％、95％或100％。然后比较对应的氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置被与第二序列中的对应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则分子在该位置处是相同的。将空位的数量和每个空位的长度考虑在内，两个序列之间的同一性百分比是所述序列共享的相同位置的数量的函数，需要引入所述空位以进行所述两个序列的最佳比对。出于本公开的目的，序列的比较和两个序列之间同一性百分数的确定可以使用具有空位罚分12、空位延伸罚分4、以及移码空位罚分5的Blosum 62评分矩阵实现。
本文所述的蛋白质(例如RPE65多肽)可以作为核酸分子或多肽递送或使用。
在某些实施方式中，编码所述RPE65多肽、其衍生物或功能性片段的核酸分子经密码子优化以在宿主细胞或生物中表达。所述宿主细胞可以包括已建立的细胞系(如293T细胞)或分离的原代细胞。所述核酸可以经密码子优化以用于在任何感兴趣的生物(特别是人细胞或细菌)中使用。例如，所述核酸可以针对以下进行密码子优化：任何原核生物(如大肠杆菌)或任何真核生物，如人和其他非人真核生物，包括酵母、蠕虫、昆虫、植物和藻类(包括粮食作物、稻、玉米、蔬菜、水果、树木、草)、脊椎动物、鱼、非人哺乳动物(例如，小鼠、大鼠、兔、狗、鸟(如鸡)、牲畜(母牛或牛、猪、马、绵羊、山羊等)、或非人灵长类动物)。密码子使用表易于获得，例如在www.kazusa.orjp/codon/上可获得的“密码子使用数据库(CodonUsage Database)”中，并且这些表能以多种方式进行调整。参见Nakamura等人,Nucl.AcidsRes.[核酸研究]28:292,2000(将所述文献通过引用以其全文并入本文)。用于密码子优化特定序列以在特定宿主细胞中表达的计算机算法也是可获得的，如基因制造(Gene Forge)(Aptagen公司；宾夕法尼亚州雅各布斯(Jacobus,Pa))。
在这种情况下，经密码子优化的序列的实例是经优化以在以下中表达的序列：真核生物，例如人(即，经优化以在人中表达)，或如本文所讨论的另一真核生物、动物或哺乳动物。尽管这是优选的，但应理解其他实例是可能的，并且针对人以外的宿主物种的密码子优化或针对特定器官的密码子优化是已知的。一般来说，密码子优化是指在维持天然氨基酸序列的情况下通过以下方式修饰核酸序列以增强在感兴趣的宿主细胞中的表达的方法：用该宿主细胞的基因中更频繁使用或最频繁使用的密码子替代天然序列的至少一个密码子(例如，约或超过约1、2、3、4、5、10、15、20、25、50或更多个密码子)。多种物种对特定氨基酸的某些密码子展现出特定偏倚。密码子偏倚(生物之间密码子使用的差异)通常与信使RNA(mRNA)的翻译效率相关，而信使RNA的翻译效率又被认为尤其依赖于经翻译的密码子的特性和特定的转移RNA(tRNA)分子的可获得性。选定的tRNA在细胞中的优势通常反映出肽合成中最频繁使用的密码子。相应地，可以对基因进行定制以基于密码子优化在给定生物中实现最佳基因表达。密码子使用表易于获得，例如在http://www.kazusa.orjp/codon/上可获得的“密码子使用数据库”中，并且这些表能以多种方式进行调整。参见Nakamura,Y.等人“Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases:statusfor the year2000[从国际DNA序列数据库中制表的密码子使用：2000年的状态]”Nucl.Acids Res.[核酸研究]28:292(2000)。用于密码子优化特定序列以在特定宿主细胞中表达的计算机算法也是可获得的，如基因制造(Aptagen公司；宾夕法尼亚州雅各布斯)也是可获得的。在一些实施方式中，编码RPE65多肽的序列中的一个或多个密码子(例如，1、2、3、4、5、10、15、20、25、50或更多个或所有密码子)对应于特定氨基酸最频繁使用的密码子。
3.载体(质粒或杆粒)
如本文所用，“载体”通常是指包含分离的核酸并且可用于向细胞内部递送所述分离的核酸的物质的组合物。
“表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体，所述重组多核苷酸包含与有待表达的核苷酸序列可操作地连接的表达控制序列。表达载体包含足够的用于表达的顺式作用元件；用于表达的其他元件可以由宿主细胞提供或在体外表达系统中提供。表达载体包括本领域已知的所有表达载体，如掺入重组多核苷酸的粘粒、质粒、杆粒(例如，裸露的或包含在脂质体中)和病毒(例如，慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
包含GOI(例如RPE65多肽)的本公开的rAAV载体基因组序列是用于通过衣壳化所述载体基因组的rAAV病毒颗粒向靶细胞/宿主细胞递送所述GOI的载体。
在某些实施方式中，本公开的RPE65多核苷酸序列编码与野生型RPE65的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
为了确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的百分比同一性，出于最佳比较目的对序列进行比对(例如，可以在第一和第二氨基酸或核酸序列的一者或两者中引入空位以用于最佳比对，并且出于比较目的可以忽略非同源序列)。一般来说，出于比较目的而比对的参考序列的长度应是参考序列长度的至少80％，并且在一些实施方式中是参考序列长度的至少90％、95％或100％。然后比较对应的氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置被与第二序列中的对应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则分子在该位置处是相同的。将空位的数量和每个空位的长度考虑在内，两个序列之间的同一性百分比是所述序列共享的相同位置的数量的函数，需要引入所述空位以进行所述两个序列的最佳比对。出于本公开的目的，序列的比较和两个序列之间同一性百分数的确定可以使用具有空位罚分12、空位延伸罚分4、以及移码空位罚分5的Blosum 62评分矩阵实现。
在某些实施方式中，编码RPE65蛋白的核酸分子经密码子优化以在宿主细胞或生物中表达。所述宿主细胞可以包括已建立的细胞系(如海拉细胞、293细胞、或293T细胞)或分离的原代细胞。所述核酸可以经密码子优化以用于在任何感兴趣的生物(特别是人细胞或细菌)中使用。例如，所述核酸可以针对以下进行密码子优化：任何原核生物(如大肠杆菌)或任何真核生物，如人和其他非人真核生物，包括酵母、蠕虫、昆虫、植物和藻类(包括粮食作物、稻、玉米、蔬菜、水果、树木、草)、脊椎动物、鱼、非人哺乳动物(例如，小鼠、大鼠、兔、狗、鸟(如鸡)、牲畜(母牛或牛、猪、马、绵羊、山羊等)、或非人灵长类动物)。密码子使用表易于获得，例如在www.kazusa.orjp/codon/上可获得的“密码子使用数据库”中，并且这些表能以多种方式进行调整。参见Nakamura等人,Nucl.Acids Res.[核酸研究]28:292,2000(将所述文献通过引用以其全文并入本文)。用于密码子优化特定序列以在特定宿主细胞中表达的计算机算法也是可获得的，如基因制造(Gene Forge)(Aptagen公司；宾夕法尼亚州雅各布斯)。
在这种情况下，经密码子优化的序列的实例是经优化以在以下中表达的序列：真核生物，例如人(即，经优化以在人中表达)，或如本文所讨论的另一真核生物、动物或哺乳动物。尽管这是优选的，但应理解其他实例是可能的，并且针对人以外的宿主物种的密码子优化或针对特定器官的密码子优化是已知的。一般来说，密码子优化是指在维持天然氨基酸序列的情况下通过以下方式修饰核酸序列以增强在感兴趣的宿主细胞中的表达的方法：用该宿主细胞的基因中更频繁使用或最频繁使用的密码子替代天然序列的至少一个密码子(例如，约或超过约1、2、3、4、5、10、15、20、25、50或更多个密码子)。多种物种对特定氨基酸的某些密码子展现出特定偏倚。密码子偏倚(生物之间密码子使用的差异)通常与信使RNA(mRNA)的翻译效率相关，而信使RNA的翻译效率又被认为尤其依赖于经翻译的密码子的特性和特定的转移RNA(tRNA)分子的可获得性。选定的tRNA在细胞中的优势通常反映出肽合成中最频繁使用的密码子。相应地，可以对基因进行定制以基于密码子优化在给定生物中实现最佳基因表达。密码子使用表易于获得，例如在http://www.kazusa.orjp/codon/上可获得的“密码子使用数据库”中，并且这些表能以多种方式进行调整。参见Nakamura,Y.等人“Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases:statusfor the year2000[从国际DNA序列数据库中制表的密码子使用：2000年的状态]”Nucl.Acids Res.[核酸研究]28:292(2000)。用于密码子优化特定序列以在特定宿主细胞中表达的计算机算法也是可获得的，如基因制造(Aptagen公司；宾夕法尼亚州雅各布斯)也是可获得的。在一些实施方式中，编码Cas的序列中的一个或多个密码子(例如，1、2、3、4、5、10、15、20、25、50或更多个或所有密码子)对应于特定氨基酸最频繁使用的密码子。
在某些实施方式中，载体基因组包含5’末端反向重复(ITR)序列、3’ITR序列或两者。
末端反向重复(ITR)序列对于病毒DNA复制的启动和腺相关病毒基因组的环化很重要。在ITR序列内，二级结构(例如，由回文序列形成的茎和环)在病毒复制和/或包装中是重要的一种或多种ITR功能。这样的序列元件包括RBE序列(Rep结合元件)、RBE'序列和trs(末端分解序列(terminal resolution sequence))。
在某些实施方式中，所述rAAV载体基因组包含5'AAV ITR序列和3'AAV ITR序列。
在某些实施方式中，所述5'AAV ITR序列和所述3'AAV ITR序列都是来自以下的野生型AAV ITR序列：AAV1、AAV2、AAV3A、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAVrh74、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、或所述AAV1-AAV13中的任一者所属的进化枝的成员。
在某些实施方式中，所述5'AAV ITR序列和所述3'AAV ITR序列都是来自AAV2的野生型AAV ITR序列。
在某些实施方式中，所述5'ITR序列和/或3'ITR序列是经修饰的ITR序列。例如，可以缺失野生型ITR序列(例如，AAV2 ITR序列)的5'最末端或3'最末端。缺失可以为至多18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、或1个核苷酸。
在某些实施方式中，可以缺失野生型AAV2 ITR序列的5'最末端核苷酸的至多15个(如正好15个)核苷酸、和/或3'最末端核苷酸的至多15个(如正好15个)核苷酸。
因此，所述5'和/或3'经修饰的ITR可包含145个nt的野生型AAV ITR序列的至多144、143、142、141、140、139、138、137、136、135、134、133、132、131、130、129、128、或127个nt(如130个核苷酸)。
在某些实施方式中，所述经修饰的ITR序列包含wt ITR序列的RBE序列、RBE'序列、和/或trs。
在某些实施方式中，所述经修饰的ITR序列包含RBE序列和RBE'序列两者。
在某些实施方式中，所述经修饰的ITR序列赋予本公开的包含AAV载体基因组的质粒(参见下文)在细菌中的稳定性，例如在质粒产生期间的稳定性。
在某些实施方式中，所述经修饰的ITR不干扰本公开的包含AAV载体基因组的质粒的测序验证。
在某些实施方式中，所述经修饰的5'ITR序列包含不是野生型AAV 5'ITR序列的一部分的5'异源序列。在某些实施方式中，所述经修饰的3'ITR序列包含不是野生型AAV 3'ITR序列的一部分的3'异源序列。
在某些实施方式中，所述经修饰的5'ITR序列包含不是野生型AAV(例如，wt AAV2)5'ITR序列的一部分的5'异源序列，并且所述经修饰的3'ITR序列包含不是野生型AAV(例如，wt AAV2)3'ITR序列的一部分的3'异源序列，其中所述5'异源序列和所述3'异源序列彼此互补。
在某些实施方式中，所述5'异源序列和所述3'异源序列各自包含II型限制性内切核酸酶识别序列，如Sse8387I的识别序列(CCTGCAGG)或PacI的识别序列(TTAATTAA)。
在某些实施方式中，所述5'异源序列包含CCTGCAGGCAG(SEQ ID NO:11)、基本上由其组成、或由其组成，并且所述3'异源序列包含SEQ ID NO:11的反向互补序列、基本上由其组成、或由其组成。
在某些实施方式中，所述5'异源序列包含TTAATTAAGG(SEQ ID NO:12)、基本上由其组成、或由其组成，并且所述3'异源序列包含SEQ ID NO:12的反向互补序列、基本上由其组成、或由其组成。
在某些实施方式中，所述5'ITR和所述3'ITR都是flip ITR。
在某些实施方式中，所述5'ITR和所述3'ITR都是flop ITR。
在某些实施方式中，所述5'ITR和所述3'ITR独立地是flip ITR或flop ITR。
在某些实施方式中，所述5'ITR是flip ITR，并且所述3'ITR是flop ITR。
在某些实施方式中，所述5'ITR是flop ITR，并且所述3'ITR是flip ITR。
在某些实施方式中，所述5'ITR是flip ITR，并且所述3'ITR是flip ITR。
在某些实施方式中，所述5'ITR是flop ITR，并且所述3'ITR是flop ITR。
如本文所用，5'flip ITR的B:B'区段比C:C'区段更靠近5'末端。3'flip ITR的B:B'区段比C:C'区段更靠近3'末端。5'flop ITR的C:C'区段比B:B'区段更靠近5'末端。3'flop ITR的C:C'区段比B:B'区段更靠近3'末端。
在某些实施方式中，所述经修饰的5'ITR和所述经修饰的3'ITR都是flop ITR，所述经修饰的5'ITR包含不是野生型AAV2 5'ITR序列的一部分的5'异源序列(如SEQ ID NO:11或12)，并且所述经修饰的3'ITR序列包含不是野生型AAV2 3'ITR序列的一部分的3'异源序列，其中所述5'异源序列和所述3'异源序列彼此互补并且各自包含II型限制性内切核酸酶识别序列，如Sse8387I或PacI的识别序列；任选地，所述经修饰的5'ITR序列进一步包含C:C'区段中的缺失，如11个nt缺失AAAGCCCGGGC(SEQ ID NO:13)。
在某些实施方式中，所述5'ITR包含145个nt的wt AAV2 5'ITR的3'最末端核苷酸的至多141个nt(例如，145个nt的wt AAV2 5'ITR的5'最末端核苷酸的4个或更多个的缺失)。
在某些实施方式中，所述5'ITR包含145个nt的wt AAV2 5'ITR的3'最末端核苷酸的至多130个nt(例如，145个nt的wt AAV2 5'ITR的5'最末端核苷酸的15个或更多个的缺失)。
在某些实施方式中，所述3'ITR包含145个nt的wt AAV2 3'ITR的5'最末端核苷酸的至多141个nt(例如，145个nt的wt AAV2 3'ITR的3'最末端核苷酸的4个或更多个的缺失)。
在某些实施方式中，所述3'ITR包含145个nt的wt AAV2 3'ITR的5'最末端核苷酸的至多130个nt(例如，145个nt的wt AAV2 3'ITR的3'最末端核苷酸的15个或更多个的缺失)。
在某些实施方式中，所述5'ITR序列和3’ITR序列对基于三重转染在哺乳动物细胞中的AAV生产兼容。
在某些实施方式中，所述5'ITR序列和3’ITR序列对基于杆状病毒载体在昆虫细胞(例如，Sf9)中的AAV生产兼容(参见下文)。
在某些实施方式中，所述5'ITR序列和3’ITR序列对基于HSV载体在哺乳动物细胞中的AAV生产兼容(参见下文)。
在某些实施方式中，本公开的rAAV载体基因组进一步包含Kozak序列或其功能性变体。在某些实施方式中，所述Kozak序列是SEQ ID NO:6；或是包含与SEQ ID NO:6相比最多1、2、3或4个核苷酸差异的序列，并且任选地其中最后三个核苷酸是ACC或GCC。
在某些实施方式中，本公开的rAAV载体基因组进一步包含聚腺苷酸化(聚A)信号序列。在某些实施方式中，所述聚A信号序列选自生长激素聚腺苷酸化信号(bGH聚A)、小聚A信号(SPA)、人生长激素聚腺苷酸化信号(hGH聚A)、SV40聚A信号(SV40聚A)、兔β珠蛋白聚A信号(rBG聚A)、或其变体。在某些实施方式中，所述聚A信号序列是SV40聚A信号序列或其功能性变体。
在某些实施方式中，所述rAAV载体基因组是SEQ ID NO:1或与其具有至少95％或99％同一性的多核苷酸。在某些实施方式中，所述rAAV载体基因组是SEQ ID NO:1。
在某些实施方式中，与本文所述的核酸序列(例如核酸序列(例如ITR至ITR序列，例如SEQ ID NO:1))具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的rAAV载体基因组。
在一些实施方式中，所述rAAV载体基因组存在于载体(例如，病毒载体或噬菌体，如HSV载体、杆状病毒载体、或AAV载体)中。所述载体可以是克隆载体或表达载体。所述载体可以是质粒、噬菌粒、粘粒等。所述载体可以包括一个或多个允许所述载体在感兴趣的细胞(例如，细菌细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞)中繁殖的调节元件。
在某些实施方式中，本公开的rAAV载体基因组由DNA表达载体编码，如质粒或杆粒(例如，可以像昆虫细胞内的杆状病毒一样维持或复制的载体)。这种DNA表达载体可以在合适的宿主细胞中转录本公开的RNA序列，如哺乳动物包装细胞(例如，HEK293T细胞)或昆虫包装细胞(例如，Sf9细胞)，从而可以在rAAV包装所需的其他元件(如rep和cap编码序列)存在下产生本发明rAAV病毒颗粒。
许多载体在本领域中是已知的，包括但不限于线性多核苷酸、与离子化合物或两亲化合物相关的多核苷酸、质粒、以及病毒。因此，术语“载体”包括自主复制的质粒或病毒。所述术语还应当解释为包括促进将核酸转移到细胞中的非质粒和非病毒化合物，例如像聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒载体的实例包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体等。
在一些实施方式中，所述rAAV载体基因组从质粒或杆粒复制。所述质粒或杆粒可以包括感兴趣的基因序列。在一些实施方式中，启动子与感兴趣的基因可操作地连接并且位于感兴趣的基因的上游。
4.AAV颗粒和AAV颗粒的群体
在某些实施方式中，本公开提供了分离的rAAV病毒颗粒，其包含衣壳化在本文所述的AAV9或其变体、衣壳或病毒颗粒中的本公开的任一种多核苷酸序列。
在某些实施方式中，分离的rAAV病毒颗粒包含AAV9衣壳。
在某些实施方式中，分离的rAAV病毒颗粒包含进化枝F AAV衣壳、或基于AAV9的突变体/衍生物(例如，与AAV9共享显著的序列同源性和向性谱(spectrum of tropism))。
在一些实施方式中，AAV衣壳或病毒颗粒是本文所述的血清型或一种或多种血清型的组合。
本公开的相关方面还提供了本公开的分离rAAV病毒颗粒的群体。
在一些实施方式中，rAAV病毒颗粒的群体含有本公开的多个rAAV病毒颗粒，其中所述群体中的rAAV颗粒的约40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多具有本公开的衣壳化rAAV载体基因组序列。
5.宿主细胞以及AAV生产
rAAV生产的一般原理是本领域已知的。参见以下综述，例如，Carter(CurrentOpinions in Biotechnology[生物技术新见],1533-539,1992)；和Muzyczka,Curr.Topicsin Microbial,and Immunol[微生物学和免疫学的当前主题]158:97-129,1992，二者通过引用并入本文)。以下文献中描述了多种方法：Ratschin等人(Mol.Cell.Biol.[分子细胞生物学杂志]4:2072,1984；Hermonat等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]81:6466,1984)；Tratschin等人(Mol.Cell.Biol.[分子细胞生物学杂志]5:3251,1985)；McLaughlin等人(J.Virol[病毒学杂志]62:1963,1988)；和Lebkowski等人(Mol.Cell.Biol[分子细胞生物学杂志]7:349,1988)、Samulski等人(J.Virol[病毒学杂志]63:3822-3828,1989)；U.S.5,173,414；WO 95/13365和U.S.5,658,776；WO95/13392；WO 96/17947；PCT/US98/18600；WO 97/09441；WO 97/08298；WO 97/21825；WO 97/06243；WO 99/11764；Perrin等人(Vaccine[疫苗]13:1244-1250,1995；Paul等人(Human Gene Therapy[人基因疗法]4:609-615,1993)；Clark等人(Gene Therapy[基因疗法]3:1124-1132,1996；U.S.5,786,211；U.S.5,871,982；以及U.S.6,258,595。
AAV载体血清型可以与靶细胞类型匹配。例如，WO 2018002719 A1的表2列出了可以被指定的AAV血清型转导的示例性细胞类型(通过引用并入本文)。
包装细胞用于形成能够感染宿主细胞的病毒颗粒。这种细胞包括HEK293和Sf9细胞，其可用于包装AAV和腺病毒。
通常通过将核酸载体包装到病毒颗粒中的生产者细胞系来生成基因疗法中使用的病毒载体。载体典型地含有包装并且随后整合到宿主(如果合适的话)中所需的最小病毒序列，其他病毒序列被编码有待表达的蛋白的表达盒替代。缺失的病毒功能可以由包装细胞系以反式形式提供，通常是由于这些病毒功能/蛋白(如AAV的rep和cap基因)作为整合到包装细胞中的转基因或作为引入到所述包装细胞中的第二病毒载体或表达载体上的转基因而表达的结果。
例如，基因疗法中使用的AAV载体典型地仅具有来自AAV基因组的末端反向重复(ITR)序列，所述序列是包装并整合到宿主基因组中所需的。将病毒DNA包装在细胞系中，所述细胞系含有编码其他AAV基因即rep和cap但缺乏ITR序列的辅助质粒。所述细胞系还被作为辅助者的腺病毒感染。辅助病毒促进AAV载体复制和来自辅助质粒的AAV基因表达。辅助质粒由于缺乏ITR序列而未大量包装。腺病毒的污染可以通过例如进行腺病毒比AAV更敏感的热处理来减少。
在一些实施方式中，可以使用三重转染方法(在美国专利号6,001,650中详细描述)产生重组AAV。典型地，通过用有待包装到AAV颗粒中重组AAV载体(包含感兴趣的基因)、AAV辅助功能载体和辅佐功能载体转染宿主细胞产生重组AAV。AAV辅助功能载体编码“AAV辅助功能”序列(例如，rep和cap)，所述序列以反式起作用，用于生产性AAV复制和衣壳化。优选地，AAV辅助功能载体支持高效的AAV载体生产，而不生成任何可检测的野生型AAV病毒粒子(例如，含有功能性rep和cap基因的AAV病毒粒子)。所述辅佐功能载体编码用于AAV进行复制所依赖的非AAV衍生的病毒和/或细胞功能(例如，“辅佐功能”)的核苷酸序列。辅佐功能包括AAV复制所需的那些功能，包括但不限于参与激活AAV基因转录、阶段特异性AAVmRNA剪接、AAV DNA复制、cap表达产物合成和AAV衣壳组装的那些部分。基于病毒的辅佐功能可源自已知的辅助病毒的任一种，如腺病毒、疱疹病毒(除了单纯疱疹病毒-1型)和牛痘病毒。
在一些实施方式中，使用包装在昆虫细胞(如Sf9细胞)中的杆状病毒表达系统产生本发明rAAV病毒颗粒。参见例如，WO 2007046703、WO 2007148971、WO2009014445、WO2009104964、WO 2013036118、WO 2011112089、WO 2016083560、WO 2015137802和WO2019016349，将所有文献通过引用并入本文。
载体滴度通常表示为病毒基因组/ml(vg/ml)。在某些实施方式中，病毒滴度高于1×109、高于5×1010、高于1×1011、高于5×1011、高于1×1012、高于5×1012、或高于1×1013vg/ml。
6.细胞和治疗应用
本公开的一方面提供了rAAV载体基因组或包含所述rAAV载体基因组的rAAV病毒颗粒，所述载体基因组或病毒颗粒包含编码以下的多核苷酸：如本文所述的感兴趣的基因，例如其RPE65同源物、直系同源物、融合物、衍生物、缀合物或功能片段。在一些实施方式中，所述rAAV载体基因组进一步包含启动子、Kozak序列、和/或聚A序列。在一些实施方式中，所述rAAV病毒颗粒包含AAV衣壳，例如AAV9衣壳。在一些实施方式中，所述AAV血清型源自AAV9。
在相关方面，本公开还提供了包含本公开的rAAV病毒颗粒或rAAV载体基因组中的任一者的细胞。在某些实施方式中，所述细胞是原核生物。在某些实施方式中，所述细胞是真核细胞。在某些实施方式中，所述细胞是哺乳动物细胞或非哺乳动物细胞。在某些实施方式中，所述细胞是人细胞。
本文所述的rAAV载体基因组和rAAV病毒颗粒可以具有多种治疗应用。这样的应用可基于rAAV病毒颗粒的以下体外和体内能力中的一种或多种：向细胞递送多核苷酸以表达感兴趣的基因，例如RPE65多肽，替代所述RPE65基因的突变的或缺失的内源性拷贝。术语“治疗(treatment或treating)”是指出于以下目的向受试者施用如本文所述的组合物(例如，包含转基因的AAV和/或细胞)，所述目的包括1)预防或保护免于疾病或病症，即，使临床症状不发展；2)抑制疾病或病症，即，阻滞、减缓、缓解或阻遏临床症状的发展；3)减轻疾病或病症，即，引起临床症状的消退；和/或4)替代和/或恢复病变细胞、组织和/或器官丧失的功能。在一些实施方式中，术语“治疗(treatment或treating)”是指减轻疾病或病症；即，引起临床症状的消退。在一些实施方式中，术语“治疗(treatment或treating)”可替代地或另外地是指在有需要的受试者中的预防性治疗。预防性治疗可以通过向有患病风险的受试者提供适当剂量的治疗剂来完成，从而基本上避免疾病的发作。本领域技术人员将理解，并不总是能够区分“预防(preventing)”和“阻遏(suppressing)”，因为最终的一个或多个诱发事件可能是未知的或潜在的，或者直到所述一个或多个事件发生后很久才可确定患者。因此，如本文所用，术语“预防”意在作为“治疗”的一个要素，以涵盖如本文所定义的“预防”和“阻遏”。
术语“受试者”指动物，例如哺乳动物，例如人。本文所述的方法可用于人类治疗学、临床前和兽医应用。在一些实施方式中，所述受试者是哺乳动物，并且在一些实施方式中，所述受试者是人。
在某些实施方式中，本公开的方法可用于治疗眼睛疾病或障碍。在一些实施方式中，所述眼睛疾病或障碍是阿米巴角膜炎、真菌性角膜炎、细菌性角膜炎、病毒性角膜炎、盘尾丝虫性角膜炎、角膜结膜炎、细菌性角膜结膜炎、病毒性角膜结膜炎、春季角膜结膜炎、特应性角膜结膜炎、角膜营养不良性疾病、富克斯内皮营养不良、干燥综合征、史-约综合征、自身免疫性干眼病、环境性干眼病、角膜新生血管形成疾病、角膜移植后排斥反应的预防和治疗、自身免疫性葡萄膜炎、感染性葡萄膜炎、非感染性葡萄膜炎、前葡萄膜炎、后葡萄膜炎(包括弓形虫病)、泛葡萄膜炎、玻璃体或视网膜的炎性疾病、眼内炎的预防和治疗、黄斑水肿、黄斑变性、湿性年龄相关性黄斑变性(湿性AMD)、干性年龄相关性黄斑变性(干性AMD)、糖尿病性黄斑水肿(DME)、过敏性结膜炎、增殖性和非增殖性糖尿病性视网膜病变、高血压性视网膜病变、视网膜的自身免疫性疾病、原发性和转移性眼内黑素瘤、其他眼内转移性肿瘤、开角型青光眼、斯特格氏病、眼底黄色斑点症、闭角型青光眼、色素性青光眼、视网膜色素变性(RP)、包括莱伯氏先天性黑矇2型(LCA2)的莱伯氏先天性黑矇(LCA)、厄舍综合征、无脉络膜、视杆-视锥细胞或视锥-视杆细胞营养不良、纤毛病、线粒体障碍、进行性视网膜萎缩、退行性视网膜疾病、地图状萎缩、家族性或获得性黄斑病变、视网膜光感受器疾病、基于视网膜色素上皮的疾病、黄斑囊样水肿、视网膜脱离、外伤性视网膜损伤、医源性视网膜损伤、黄斑裂孔、黄斑毛细血管扩张、神经节细胞疾病、视神经细胞疾病、视神经病变、缺血性视网膜疾病、早产儿视网膜病变、视网膜血管阻塞、家族性大动脉瘤、视网膜血管疾病、眼血管疾病、血管疾病、缺血性视神经病变疾病、糖尿病性视网膜水肿、由视网膜下新生血管形成引起的老年性黄斑变性、近视性视网膜病变、视网膜缺血、脉络膜血管功能不全、脉络膜血栓形成和由颈动脉缺血引起的新生血管性视网膜病变、角膜新生血管形成、伴有渗出性或炎性组分的角膜疾病或混浊、弥漫性板层角膜炎、由于眼睛穿透伤或挫伤性眼损伤导致的新生血管形成、红斑虹膜炎、富克斯异色性虹膜睫状体炎、慢性葡萄膜炎、前葡萄膜炎、由手术如LASIK、LASEK、屈光手术、IOL植入引起的炎性病症；作为白内障手术并发症的不可逆角膜水肿、损伤或外伤引起的水肿、炎症、感染性和非感染性结膜炎、虹膜睫状体炎、虹膜炎、巩膜炎、巩膜外层炎、浅表点状角膜炎、圆锥角膜、后部多形性营养不良、富克斯营养不良、无晶状体性和假晶状体性大泡性角膜病变、角膜水肿、巩膜疾病、眼瘢痕性类天疱疮、睫状体扁平部炎、青光眼睫状体炎综合征、白塞病、福格特-小柳-原田综合征、超敏性反应、眼表障碍、结膜水肿、弓形虫病脉络膜视网膜炎、眼眶炎性假瘤、球结膜水肿、结膜静脉充血、眶周蜂窝组织炎、急性泪囊炎、非特异性血管炎、结节病、巨细胞病毒感染、及其组合。在某些实施方式中，所述眼睛疾病或障碍是年龄相关性黄斑变性。在一些实施方式中，所述眼睛疾病或障碍是LCA、视网膜色素变性、斯特格氏病或脉络膜炎。在一些实施方式中，所述眼睛疾病或障碍是LCA。在一些实施方式中，所述眼睛疾病或障碍是莱伯氏先天性黑矇2型(LCA2)。
7.递送
通过本公开和本领域的知识，本文所述的rAAV载体基因组和/或rAAV病毒颗粒可以通过多种递送系统(如载体，例如质粒和病毒递送载体)使用本领域中任何合适的手段递送，所述rAAV载体基因组和/或rAAV病毒颗粒包含编码感兴趣的基因(如RPE65多肽或其变体)的核酸分子。这样的方法包括(但不限于)电穿孔、脂质转染、显微注射、转染、超声、基因枪等。
在某些实施方式中，所述RPE65多肽或变体可以使用合适的载体递送，所述载体例如质粒或病毒载体(如腺相关病毒(AAV)、慢病毒、腺病毒、逆转录病毒载体和其他病毒载体、或其组合)。可以将所述RPE65编码序列包装到一种或多种载体(例如，质粒或病毒载体)中。对于细菌应用，可以使用噬菌体将本文所述编码RPE65多肽或其变体的核酸递送至细菌。示例性噬菌体包括但不限于T4噬菌体、Mu噬菌体、λ噬菌体、T5噬菌体、T7噬菌体、T3噬菌体、Φ29、M13、MS2、Qβ和ΦX174。
在某些实施方式中，所述递送通过AAV9血清型病毒载体(如AAV9或其他进化枝F衣壳)、或基于AAV9的突变体/衍生物(例如，与AAV9共享显著的序列同源性和向性谱)进行。
在一些实施方式中，通过例如肌内注射、静脉内施用、经皮施用、鼻内施用、口服施用或粘膜施用将所述载体(例如，质粒或病毒载体(例如，AAV病毒载体))递送至感兴趣的组织。
在某些实施方式中，本公开的AAV病毒颗粒(例如，AAV9病毒颗粒)通过视网膜下注射(如玻璃体切除术后的视网膜下注射)递送。在某些实施方式中，所述递送是每只眼睛进行一次视网膜下注射。例如，在充分麻醉下，使用针对视网膜下手术的标准玻璃体视网膜技术分别对每只人眼进行视网膜下注射，注射治疗有效量的本公开的载体基因组(vg)的合适总体积(例如，约0.1-0.5mL，如0.3mL)。在某些实施方式中，在对每只需要治疗的眼睛进行视网膜下注射之前和/或之后，给予受试者口服泼尼松(或等效物)的短期皮质类固醇方案。
在除小鼠以外的哺乳动物(例如人)中，本发明病毒颗粒的治疗有效剂量可以基于在小鼠中测试的有效剂量，即：约1E+7(1×107vg/小鼠眼睛)至约3E+9(3×109vg/小鼠眼睛)，例如约1E+7(1×107vg/小鼠眼睛)、约3E+7(3×107vg/小鼠眼睛)、约1E+8(1×108vg/小鼠眼睛)、约3E+8(3×108vg/小鼠眼睛)、约1E+9(1×109vg/小鼠眼睛)、约3E+9(3×109vg/小鼠眼睛)。人眼的大小、人眼视网膜色素上皮细胞层的面积和人眼RPE细胞的数量等因素可以用来确定剂量水平和间隔时间，再加上医生基于患者的具体情况自行增减剂量。
在一些实施方式中，通过例如肌内注射、静脉内施用、经皮施用、鼻内施用、口服施用或粘膜施用将所述载体(例如，质粒或病毒载体)递送至感兴趣的组织。这样的递送可以经由单剂量或多剂量进行。本领域技术人员应理解，本文待递送的实际剂量可取决于多种因素而大幅变化，如载体选择、靶细胞、生物、组织、待治疗受试者的一般状况、所寻求的转化/修饰的程度、施用途径、施用模式、所寻求的转化/修饰的类型等。
在某些实施方式中，所述递送经由腺病毒进行，其可以是含有至少1×105个颗粒(也称为颗粒单位，pu)的腺病毒的单剂量。在一些实施方式中，所述剂量优选地是至少约1×106个颗粒、至少约1×107个颗粒、至少约1×108个颗粒、和至少约1×109个颗粒的腺病毒。所述递送方法和所述剂量描述于例如WO 2016205764 A1和美国专利号8,454,972B2中，将所述两个文献通过引用以全文并入本文。
在一些实施方式中，所述递送经由质粒进行。所述剂量可以是足够数量的质粒以引发响应。在一些情况下，质粒组合物中质粒DNA的合适量可以是从约0.1至约2mg。质粒将通常包括(i)启动子；(ii)编码感兴趣的基因(例如RPE65多肽或其变体)的、可操作地连接至所述启动子的序列；(iii)可选择标志物；(iv)复制起点；以及(v)位于(ii)的下游并与其可操作地连接的转录终止子。施用频率在医学或兽医学从业者(例如，医师、兽医师)或本领域技术人员的范围内。
在另一实施方式中，所述递送经由脂质体或脂质转染配制品等进行，并且可以通过本领域技术人员已知的方法制备。这样的方法描述于例如WO 2016205764和美国专利号5,593,972、5,589,466、和5,580,859中，将各个文献通过引用以其全文并入本文。
在一些实施方式中，所述递送经由纳米颗粒或外泌体进行。例如，已表明外泌体在递送RNA方面特别有用。
8.试剂盒
本公开的另一方面提供了试剂盒，所述试剂盒包含：含有编码感兴趣的基因(如RPE65多肽或其功能变体)的多核苷酸的本文所述的rAAV载体基因组或rAAV病毒颗粒、涵盖它们的载体、或涵盖它们的宿主。
在某些实施方式中，所述试剂盒进一步包括使用其中涵盖的组分的说明，和/或与可在别处获得的其他组分组合的说明。
在某些实施方式中，所述试剂盒进一步包含一种或多种核苷酸，例如对应于以下的一种或多种核苷酸：可用于将指导RNA编码序列插入载体中并将所述编码序列与所述载体的一种或多种控制元件可操作地连接的那些。
在某些实施方式中，所述试剂盒进一步包含一种或多种缓冲液，所述缓冲液可用于溶解任一所述组分和/或为一种或多种所述组分提供合适的反应条件。这样的缓冲液可以包括以下中的一种或多种：PBS、HEPES、Tris、MOPS、Na2CO3、NaHCO3、NaB、或其组合。在某些实施方式中，所述反应条件包括适当的pH，如碱性pH。在某些实施方式中，所述pH在7-10之间。
在某些实施方式中，任一种或多种所述试剂盒组分可以储存在合适的容器中。
9.药物组合物
本公开的另一方面提供了药物组合物，所述药物组合物包含如本文所述的分离的核酸或rAAV以及药学上可接受的载剂。
如本文所用，术语“药学上可接受的”是指不会消除化合物的生物活性或性质且相对无毒的材料，如载剂或稀释剂，即，可将该材料向个体施用，而不会引起不希望的生物效应或以有害方式与包含该材料的组合物的任何组分相互作用。
如本文所用，术语“药学上可接受的载剂”是指药学上可接受的材料、组合物或载剂，例如液体或固体填充剂、稳定剂、分散剂、悬浮剂、稀释剂、赋形剂、增稠剂、溶剂或包封材料，这些材料涉及将本公开中有用的化合物在患者体内载运或输送或载运或输送到患者体内以使其可发挥预期的功能。可以包括在用于实施本公开的药物组合物中的另外成分在本领域中是已知的，并且例如在Remington’s Pharmaceutical Sciences[雷明顿药物科学](Genaro编辑,Mack Publishing Co.[马克出版公司],1985,宾夕法尼亚州伊斯顿)中描述，该文献通过引用并入本文。
可以通过任何途径来施用本文所提供的组合物(例如，药物组合物)，这些途径包括肠内(例如，口服)、肠胃外、静脉内、肌内、动脉内、髓内、鞘内、皮下、心室内、经皮、皮间(interdermal)、直肠、阴道内、腹膜内、局部(如通过粉剂、软膏剂、霜剂和/或滴剂)、粘膜、鼻、颊、舌下；通过气管内滴注、支气管滴注和/或吸入来施用；和/或呈一种口服喷雾剂、鼻喷雾剂和/或气雾剂来施用。
特别考虑的途径包括视网膜下注射，例如玻璃体切除术后的视网膜下注射。
例如，在某些实施方式中，编码RPE65的rAAV病毒颗粒经由视网膜下注射(例如玻璃体切除术后的本公开的rAAV病毒颗粒的视网膜下注射)递送至患者受影响的眼睛。玻璃体切除术可以是标准的三孔睫状体扁平部玻璃体切除术(three-port pars planavitrectomy)，切除了后皮质玻璃体(参见Maguire等人,Safety and efficacy of genetransfer for Leber congenital amaurosis[基因转移对于莱伯氏先天性黑矇的安全性和有效性].N Engl J Med.[新英格兰医学杂志]358:2240-2248,2008，所述文献通过引用并入)。
在某些实施方式中，每次注射包含1.5×1010个载体基因组(例如，以约1.0×108vg/μL的浓度)至1.5×1011个载体基因组(例如，以约5.0×108vg/μL的浓度)。
一般来说，最适当的施用途径将取决于多种因素，这些因素包括试剂的性质(例如，其在胃肠道的环境中的稳定性)和/或受试者的情况(例如，所述受试者是否能够耐受口服施用)。
在某些实施方式中，本文所述的化合物或药物组合物适合于局部施用到受试者的眼睛。
实施例
实施例1rAAV病毒颗粒恢复视觉功能
构建了代表性AAV9载体(AAV9-CAG-hRPE65，“HG004”)作为治疗LCA2的新疗法，所述载体具有AAV9血清型衣壳，其包封编码人RPE65基因的载体基因组(图1)。所述载体基因组(SEQ ID NO:1，从5’ITR至3’ITR)包括编码人RPE65多肽(SEQ ID NO:3)的人RPE65编码序列(SEQ ID NO:2)、可操作地连接至所述人RPE65编码序列并驱动其转录的CAG启动子(SEQID NO:4)、所述人RPE65编码序列上游并紧邻其5’端的Kozak序列(SEQ ID NO:6)、所述人RPE65编码序列下游的bGH聚A序列(SEQ ID NO:5)，侧翼为源自AAV2的5’ITR(SEQ ID NO:7)和3’ITR(SEQ ID NO:8)。
首先，为评估AAV9-CAG-hRPE65(“HG004”)对LCA2疗法的作用，通过缺失RPE65外显子3来产生RPE65敲除小鼠(RPE65-/-)来作为LCA2小鼠模型。基于通过ERG(视觉电生理检查)所测量的视觉功能，与相应野生型(RPE65+/+)小鼠相比(图2B和图2C)，在视网膜色素上皮细胞中成功敲除了RPE65表达(图2A)。与相应的野生型(RPE65+/+)小鼠相比，RPE65-/-小鼠的B波信号示出至少5倍的降低(图2C)。
观察到，向RPE65-/-小鼠施用AAV9-CAG-hRPE65(“HG004”)恢复了RPE65在视网膜色素上皮细胞中的表达(图2A)并使通过ERG测量的视觉功能恢复至与相应的野生型(RPE65+/+)小鼠相当的水平(图2B)。
向RPE65-/-小鼠的一只眼睛中，视网膜下注射不同剂量(3×106或3E+6、1×107或1E+7、3×107或3E+7、1×108或1E+8、3×108或3E+8、1×109或1E+9、3×109或3E+9、和1×1010或1E+10vg/眼睛(“vg”，病毒基因组)，或者分别是“剂量1-8”)施用的AAV9-CAG-hRPE65(“HG-004”)，并在给药后第3、6、9和14周测量ERG。视网膜下注射PBS至对侧眼，作为对照测量。
结果示出了从1E+7vg/眼睛(剂量2)至3E+9vg/眼睛(剂量7)的有效剂量范围。视觉功能的恢复在给药后第9周时达到了最大化(B波，277.84±25.55uv，剂量为1E+8vg/眼睛(剂量4)，为相应的野生型(RPE65+/+)小鼠的B波值的约70％(数据未示出))，并且该治疗作用持续到给药后至少第14周和更多(图3A和图3B)。例如，以3E+7的剂量(剂量3)施用AAV9-CAG-hRPE65(“HG-004”)在第3、6、9、14周分别使视力恢复了约50％、60％、70％和72％。
为进一步研究AAV9-CAG-hRPE65(“HG-004”)的优化作用，使用AAV2载体(具有AAV2衣壳)而非AAV9递送编码hRPE65基因的相同载体基因组，用于直接比较。令人惊讶地，使用AAV2-CAG-hRPE65的剂量的约1/10至约1/100，AAV9-CAG-hRPE65就实现了相似的视觉功能恢复效果(图4)，这说明了令人惊讶且预料不到的结果，即，AAV9会比AAV2更有效地递送RPE65转基因。
该结果示出，AAV9-CAG-hRPE65(“HG-004”)成功地拯救了RPE65敲除LCA2小鼠模型的视觉功能，并且更令人惊讶地，所述AAV9载体比使用AAV2载体的已报告策略更有效。向RPE65敲除LCA2小鼠模型中视网膜下注射AAV9-CAG-hRPE65(“HG-004”)恢复了约70％的野生型(RPE65+/+)视觉功能。该结果表明了LCA2的新的、有希望的临床疗法。
方法
动物
使用CRISPR-Cas9产生RPE65-/-，在C57BL/6J背景下繁育至少一代。将动物饲养在室内动物设施中，明/暗周期为12h:12h。随意给予食物和水。所有实验方案均经动物护理和使用委员会(Animal Care and Use Committee)批准。
AAV载体制备
通过使用聚乙烯亚胺(PEI)对HEK293T细胞进行三重转染，产生了重组AAV9和AAV2病毒颗粒。在转染后72小时时从培养基中收获了病毒颗粒，并且在120小时时从细胞和培养基中收获了病毒颗粒。将细胞沉淀物重悬于具有10mM MgCl2和150mM氯化钠的10mM Tris(pH 7.6)中，冻融三次，并在37℃下使用125U/mL的苯佐那酶(Benzonase)(西格玛公司(Sigma))处理至少1小时。通过以下浓缩病毒培养基：使用具有625mM氯化钠的10％聚乙二醇8000(西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich))进行沉淀，重悬于具有0.001％ PluronicTMF-68非离子表面活性剂的PBS中，然后添加到裂解物中。然后将合并的原液调整至100mMNaCl，在37℃下孵育1小时，并通过以2,000g离心进行了澄清。然后经碘克沙醇(Optiprep，西格玛公司；D1556)分步梯度(15％、25％、40％和58％)纯化了澄清的原液。将病毒颗粒浓缩并在具有0.001％ PluronicTM F-68非离子表面活性剂的PBS中配制。通过使用以线性化基因组质粒作为标准品的qPCR测量DNA酶I抗性载体基因组的数目确定了病毒滴度。
视网膜下注射
用唑替尔(zoletil)(60μg/g)和甲苯噻嗪(10μg/g)的混合物麻醉了4-8周龄的小鼠。在瞳孔扩张后，用无菌的31G 1/2针在角膜缘稍后方穿刺小孔。使用带有33G钝针的汉密尔顿(Hamilton)注射器通过所述孔在视网膜下注射约1μL rAAV注射液。
荧光免疫染色
将RPE65-/-(LCA2模型)或RPE65+/+(WT)小鼠麻醉，灌注PBS，再灌注冰冷的4％多聚甲醛。分离眼睛，用4％多聚甲醛后固定过夜。对于视网膜复合体，在眼睛脱水前在角膜上做一个刀切，在包埋前取出晶状体。使用冷冻切片机(徕卡公司(Leica)CM1950)将组织切成20μm厚的切片，将切片直接封于载玻片上。将载玻片在60℃下烘烤1-2小时，然后与RPE65抗体(1:000，MAB5428，密理博公司(Millipore))在4℃下孵育过夜。第二天，将载玻片用PBS洗涤，然后与驴抗小鼠抗体(1:1000，715-545-151，杰克逊免疫研究实验室(JacksonImmunoReseach labs))和DAPI(1:1000，D3571，英杰公司(Invitrogen))孵育2小时。随后用尼康Ni-E显微镜捕获图像。
ERG
使小鼠进行暗适应多于2小时，然后用唑替尔(60μg/g)和甲苯噻嗪(10μg/g)的混合物麻醉。双眼各置入一滴托品酰胺苯肾上腺素(Tropicamide Phenylephrine)诱导散瞳。将小鼠置于加热垫(37℃)上，将电极连接到角膜上。然后3.0cd.s/m2刺激下测试暗适应3.0ERG。
示例性序列
CAG-hRPE65编码序列(ITR至ITR)(SEQ ID NO:1)
CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTGCGGCCATCGATGGCGCGCCGGATTCGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGCTGCGTTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTCGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTAAAGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGGGGAGCGGCTCGGGGGGTGCGTGCGTGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCCCGCGCTGCCCGGCGGCTGTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTGTGCGCTCCGCGTGTGCGCGAGGGGAGCGCGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGCGGGGGGGCTGCGAGGGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTGTGTGCGTGGGGGGGTGAGCAGGGGGTGTGGGCGCGGCGGTCGGGCTGTAACCCCCCCCTGCACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTGCGGGGCTCCGTGCGGGGCGTGGCGCGGGGCTCGCCGTGCCGGGCGGGGGGTGGCGGCAGGTGGGGGTGCCGGGCGGGGCGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGAGGGCTCGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCCCGGAGCGCCGGCGGCTGTCGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATTGCCTTTTATGGTAATCGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGTCCCAAATCTGGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGCGGGCGAAGCGGTGCGGCGCCGGCAGGAAGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGTCGCCGCGCCGCCGTCCCCTTCTCCATCTCCAGCCTCGGGGCTGCCGCAGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGATCCTTAATGCCACCATGTCTATCCAGGTTGAGCATCCTGCTGGTGGTTACAAGAAACTGTTTGAAACTGTGGAGGAACTGTCCTCGCCGCTCACAGCTCATGTAACAGGCAGGATCCCCCTCTGGCTCACCGGCAGTCTCCTTCGATGTGGGCCAGGACTCTTTGAAGTTGGATCTGAGCCATTTTACCACCTGTTTGATGGGCAAGCCCTCCTGCACAAGTTTGACTTTAAAGAAGGACATGTCACATACCACAGAAGGTTCATCCGCACTGATGCTTACGTACGGGCAATGACTGAGAAAAGGATCGTCATAACAGAATTTGGCACCTGTGCTTTCCCAGATCCCTGCAAGAATATATTTTCCAGGTTTTTTTCTTACTTTCGAGGAGTAGAGGTTACTGACAATGCCCTTGTTAATGTCTACCCAGTGGGGGAAGATTACTACGCTTGCACAGAGACCAACTTTATTACAAAGATTAATCCAGAGACCTTGGAGACAATTAAGCAGGTTGATCTTTGCAACTATGTCTCTGTCAATGGGGCCACTGCTCACCCCCACATTGAAAATGATGGAACCGTTTACAATATTGGTAATTGCTTTGGAAAAAATTTTTCAATTGCCTACAACATTGTAAAGATCCCACCACTGCAAGCAGACAAGGAAGATCCAATAAGCAAGTCAGAGATCGTTGTACAATTCCCCTGCAGTGACCGATTCAAGCCATCTTACGTTCATAGTTTTGGTCTGACTCCCAACTATATCGTTTTTGTGGAGACACCAGTCAAAATTAACCTGTTCAAGTTCCTTTCTTCATGGAGTCTTTGGGGAGCCAACTACATGGATTGTTTTGAGTCCAATGAAACCATGGGGGTTTGGCTTCATATTGCTGACAAAAAAAGGAAAAAGTACCTCAATAATAAATACAGAACTTCTCCTTTCAACCTCTTCCATCACATCAACACCTATGAAGACAATGGGTTTCTGATTGTGGATCTCTGCTGCTGGAAAGGATTTGAGTTTGTTTATAATTACTTATATTTAGCCAATTTACGTGAGAACTGGGAAGAGGTGAAAAAAAATGCCAGAAAGGCTCCCCAACCTGAAGTTAGGAGATATGTACTTCCTTTGAATATTGACAAGGCTGACACAGGCAAGAATTTAGTCACGCTCCCCAATACAACTGCCACTGCAATTCTGTGCAGTGACGAGACTATCTGGCTGGAGCCTGAAGTTCTCTTTTCAGGGCCTCGTCAAGCATTTGAGTTTCCTCAAATCAATTACCAGAAGTATTGTGGGAAACCTTACACATATGCGTATGGACTTGGCTTGAATCACTTTGTTCCAGATAGGCTCTGTAAGCTGAATGTCAAAACTAAAGAAACTTGGGTTTGGCAAGAGCCTGATTCATACCCATCAGAACCCATCTTTGTTTCTCACCCAGATGCCTTGGAAGAAGATGATGGTGTAGTTCTGAGTGTGGTGGTGAGCCCAGGAGCAGGACAAAAGCCTGCTTATCTCCTGATTCTGAATGCCAAGGACTTAAGTGAAGTTGCCCGGGCTGAAGTGGAGATTAACATCCCTGTCACCTTTCATGGACTGTTCAAAAAATCTTGACTAACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTGCGGCCGCGTCGGCCGCAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG
hRPE65编码序列(SEQ ID NO:2)
ATGTCTATCCAGGTTGAGCATCCTGCTGGTGGTTACAAGAAACTGTTTGAAACTGTGGAGGAACTGTCCTCGCCGCTCACAGCTCATGTAACAGGCAGGATCCCCCTCTGGCTCACCGGCAGTCTCCTTCGATGTGGGCCAGGACTCTTTGAAGTTGGATCTGAGCCATTTTACCACCTGTTTGATGGGCAAGCCCTCCTGCACAAGTTTGACTTTAAAGAAGGACATGTCACATACCACAGAAGGTTCATCCGCACTGATGCTTACGTACGGGCAATGACTGAGAAAAGGATCGTCATAACAGAATTTGGCACCTGTGCTTTCCCAGATCCCTGCAAGAATATATTTTCCAGGTTTTTTTCTTACTTTCGAGGAGTAGAGGTTACTGACAATGCCCTTGTTAATGTCTACCCAGTGGGGGAAGATTACTACGCTTGCACAGAGACCAACTTTATTACAAAGATTAATCCAGAGACCTTGGAGACAATTAAGCAGGTTGATCTTTGCAACTATGTCTCTGTCAATGGGGCCACTGCTCACCCCCACATTGAAAATGATGGAACCGTTTACAATATTGGTAATTGCTTTGGAAAAAATTTTTCAATTGCCTACAACATTGTAAAGATCCCACCACTGCAAGCAGACAAGGAAGATCCAATAAGCAAGTCAGAGATCGTTGTACAATTCCCCTGCAGTGACCGATTCAAGCCATCTTACGTTCATAGTTTTGGTCTGACTCCCAACTATATCGTTTTTGTGGAGACACCAGTCAAAATTAACCTGTTCAAGTTCCTTTCTTCATGGAGTCTTTGGGGAGCCAACTACATGGATTGTTTTGAGTCCAATGAAACCATGGGGGTTTGGCTTCATATTGCTGACAAAAAAAGGAAAAAGTACCTCAATAATAAATACAGAACTTCTCCTTTCAACCTCTTCCATCACATCAACACCTATGAAGACAATGGGTTTCTGATTGTGGATCTCTGCTGCTGGAAAGGATTTGAGTTTGTTTATAATTACTTATATTTAGCCAATTTACGTGAGAACTGGGAAGAGGTGAAAAAAAATGCCAGAAAGGCTCCCCAACCTGAAGTTAGGAGATATGTACTTCCTTTGAATATTGACAAGGCTGACACAGGCAAGAATTTAGTCACGCTCCCCAATACAACTGCCACTGCAATTCTGTGCAGTGACGAGACTATCTGGCTGGAGCCTGAAGTTCTCTTTTCAGGGCCTCGTCAAGCATTTGAGTTTCCTCAAATCAATTACCAGAAGTATTGTGGGAAACCTTACACATATGCGTATGGACTTGGCTTGAATCACTTTGTTCCAGATAGGCTCTGTAAGCTGAATGTCAAAACTAAAGAAACTTGGGTTTGGCAAGAGCCTGATTCATACCCATCAGAACCCATCTTTGTTTCTCACCCAGATGCCTTGGAAGAAGATGATGGTGTAGTTCTGAGTGTGGTGGTGAGCCCAGGAGCAGGACAAAAGCCTGCTTATCTCCTGATTCTGAATGCCAAGGACTTAAGTGAAGTTGCCCGGGCTGAAGTGGAGATTAACATCCCTGTCACCTTTCATGGACTGTTCAAAAAATCTTGA
hRPE65氨基酸序列(SEQ ID NO:3)
MSIQVEHPAGGYKKLFETVEELSSPLTAHVTGRIPLWLTGSLLRCGPGLFEVGSEPFYHLFDGQALLHKFDFKEGHVTYHRRFIRTDAYVRAMTEKRIVITEFGTCAFPDPCKNIFSRFFSYFRGVEVTDNALVNVYPVGEDYYACTETNFITKINPETLETIKQVDLCNYVSVNGATAHPHIENDGTVYNIGNCFGKNFSIAYNIVKIPPLQADKEDPISKSEIVVQFPCSDRFKPSYVHSFGLTPNYIVFVETPVKINLFKFLSSWSLWGANYMDCFESNETMGVWLHIADKKRKKYLNNKYRTSPFNLFHHINTYEDNGFLIVDLCCWKGFEFVYNYLYLANLRENWEEVKKNARKAPQPEVRRYVLPLNIDKADTGKNLVTLPNTTATAILCSDETIWLEPEVLFSGPRQAFEFPQINYQKYCGKPYTYAYGLGLNHFVPDRLCKLNVKTKETWVWQEPDSYPSEPIFVSHPDALEEDDGVVLSVVVSPGAGQKPAYLLILNAKDLSEVARAEVEINIPVTFHGLFKKS
CAG启动子(SEQ ID NO:4)
GACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGCTGCGTTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTCGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTAAAGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGGGGAGCGGCTCGGGGGGTGCGTGCGTGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCCCGCGCTGCCCGGCGGCTGTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTGTGCGCTCCGCGTGTGCGCGAGGGGAGCGCGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGCGGGGGGGCTGCGAGGGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTGTGTGCGTGGGGGGGTGAGCAGGGGGTGTGGGCGCGGCGGTCGGGCTGTAACCCCCCCCTGCACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTGCGGGGCTCCGTGCGGGGCGTGGCGCGGGGCTCGCCGTGCCGGGCGGGGGGTGGCGGCAGGTGGGGGTGCCGGGCGGGGCGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGAGGGCTCGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCCCGGAGCGCCGGCGGCTGTCGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATTGCCTTTTATGGTAATCGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGTCCCAAATCTGGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGCGGGCGAAGCGGTGCGGCGCCGGCAGGAAGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGTCGCCGCGCCGCCGTCCCCTTCTCCATCTCCAGCCTCGGGGCTGCCGCAGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGATCC
bGH聚A信号序列(SEQ ID NO:5)
CTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGG
Kozak序列(SEQ ID NO:6)
GCCACC
基于AAV2 5’ITR的5’ITR序列(SEQ ID NO:7)
CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT
基于AAV2 3’ITR的3’ITR序列(SEQ ID NO:8)
AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG
AAV9 VP1衣壳序列(SEQ ID NO:9)
MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPQPKANQQHQDNARGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSAGIGKSGAQPAKKRLNFGQTGDTESVPDPQPIGEPPAAPSGVGSLTMASGGGAPVADNNEGADGVGSSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNSTSGGSSNDNAYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTDNNGVKTIANNLTSTVQVFTDSDYQLPYVLGSAHEGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNDGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYEFENVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSKTINGSGQNQQTLKFSVAGPSNMAVQGRNYIPGPSYRQQRVSTTVTQNNNSEFAWPGASSWALNGRNSLMNPGPAMASHKEGEDRFFPLSGSLIFGKQGTGRDNVDADKVMITNEEEIKTTNPVATESYGQVATNHQSAQAQAQTGWVQNQGILPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGMKHPPPQILIKNTPVPADPPTAFNKDKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSNNVEFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL
CCTGCAGGCAG(SEQ ID NO:11)
TTAATTAAGG(SEQ ID NO:12)
AAAGCCCGGGC(SEQ ID NO:13)

Claims (32)

1.一种重组腺相关病毒(rAAV)病毒颗粒，其包含AAV9血清型衣壳和编码RPE65(例如，hRPE65)多肽的载体基因组，例如与SEQ ID NO:1具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％同一性的多核苷酸。
2.如权利要求1所述的rAAV病毒颗粒，其中所述载体基因组包含：
a)5’末端反向重复(ITR)；
b)编码RPE65多肽的RPE65多核苷酸，其中所述RPE65多核苷酸包含SEQ ID NO:2的多核苷酸序列或与SEQ ID NO:2的多核苷酸序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.2％、99.4％、99.6％或99.8％序列同一性的多核苷酸序列；
c)可操作地连接至所述RPE65多核苷酸并驱动其转录的启动子；
d)位于所述RPE65多核苷酸上游和所述启动子下游的任选的Kozak序列；
e)聚A信号序列；以及
f)3’ITR，
任选地，其中所述RPE65多肽具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列。
3.如权利要求2所述的rAAV病毒颗粒，其中所述5’ITR和3’ITR源自AAV2或AAV9，任选地，所述5’ITR包含SEQ ID NO:7的核苷酸序列，和/或所述3’ITR包含SEQ ID NO:8的核苷酸序列。
4.如权利要求2或3所述的rAAV病毒颗粒，其中所述启动子是广谱启动子。
5.如权利要求2或3所述的rAAV病毒颗粒，其中所述启动子是组织特异性启动子。
6.如权利要求2-5中任一项所述的rAAV病毒颗粒，其中所述启动子是组成型启动子。
7.如权利要求2-5中任一项所述的rAAV病毒颗粒，其中所述启动子是诱导型启动子。
8.如权利要求2-7中任一项所述的rAAV病毒颗粒，其中所述启动子选自pol I启动子、pol II启动子、pol III启动子、T7启动子、U6启动子、H1启动子、逆转录病毒劳斯肉瘤病毒LTR启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、SV40启动子、二氢叶酸还原酶启动子、β-肌动蛋白启动子、延伸因子1α短(EFS)启动子、β葡萄糖醛酸酶(GUSB)启动子、巨细胞病毒(CMV)即早期(IE)增强子和/或启动子、鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子或其衍生物如CAG启动子、CB启动子、(人)延伸因子1α-亚基(EF1α)启动子、泛素C(UBC)启动子、朊病毒启动子、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经丝轻链(NFL)启动子、神经丝重链(NFH)启动子、血小板衍生生长因子(PDGF)启动子、血小板衍生生长因子B链(PDGF-β)启动子、突触蛋白(Syn)启动子、突触蛋白1(Syn1)启动子、甲基-CpG结合蛋白2(MeCP2)启动子、Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II(CaMKII)启动子、代谢型谷氨酸受体2(mGluR2)启动子、神经丝轻链(NFL)启动子、神经丝重链(NFH)启动子、β-珠蛋白小基因nβ2启动子、前脑啡肽原(PPE)启动子、脑啡肽(Enk)启动子、兴奋性氨基酸转运蛋白2(EAAT2)启动子、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)启动子、髓鞘碱性蛋白(MBP)启动子、或其功能片段。
9.如权利要求8所述的rAAV病毒颗粒，其中所述启动子是CAG启动子。
10.如权利要求9所述的rAAV病毒颗粒，其中所述CAG启动子包含与SEQ ID NO:4具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。
11.如权利要求10所述的rAAV病毒颗粒，其中所述CAG启动子包含SEQ ID NO:4、基本上由其组成、或由其组成。
12.如权利要求2-11中任一项所述的rAAV病毒颗粒，其中所述聚A信号序列选自牛生长激素聚腺苷酸化信号序列(bGH聚A)、小聚A信号序列(SPA)、人生长激素聚腺苷酸化信号序列(hGH聚A)、兔β珠蛋白聚A信号序列(rBG聚A)、SV40聚A信号序列(SV40聚A)、或其变体。
13.如权利要求12所述的rAAV病毒颗粒，其中所述聚A信号序列是bGH聚A。
14.如权利要求13所述的rAAV病毒颗粒，其中所述bGH聚A包含SEQ ID NO:5、基本上由其组成、或由其组成。
15.如权利要求2-14中任一项所述的rAAV病毒颗粒，其中所述Kozak序列是GCCACC(SEQID NO:6)，或是包含与GCCACC(SEQ ID NO:6)相比最多1、2、3或4个核苷酸差异的序列且任选地其中最后三个核苷酸是ACC或GCC。
16.如权利要求1-15中任一项所述的rAAV病毒颗粒，其中所述载体基因组按5’至3’方向包含：
(1)SEQ ID NO:7的5’ITR，
(2)SEQ ID NO:4的CAG启动子，
(3)GCCACC(SEQ ID NO:6)的Kozak序列，
(4)SEQ ID NO:2的hRPE65多核苷酸序列，
(5)SEQ ID NO:5的bGH聚A信号序列，以及
(6)SEQ ID NO:8的3’ITR，
在(1)和(2)之间，(2)和(3)之间，(3)和(4)之间，(4)和(5)之间、和/或(5)和(6)之间具有任选的接头；
任选地其中所述载体基因组包含以下、基本上由以下组成、或由以下组成：SEQ ID NO:1，或者与SEQ ID NO:1具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的、编码与SEQ ID NO:3具有至少95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性(例如，与SEQ IDNO:3具有100％同一性)的RPE65多肽的多核苷酸。
17.如权利要求16所述的rAAV病毒颗粒，其中所述载体基因组与SEQ ID NO:1具有至少99％序列同一性。
18.如权利要求16所述的rAAV病毒颗粒，其中所述载体基因组由SEQ ID NO:1组成。
19.如权利要求1-18中任一项所述的rAAV病毒颗粒，其中所述AAV9血清型衣壳包含AAV9 VP1、AAV9 VP2和AAV9 VP3；或分别与其独立地具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的VP1、VP2和VP3变体。
20.如权利要求19所述的rAAV病毒颗粒，其中所述AAV9血清型衣壳包含AAV9 VP1(SEQID NO:9)、AAV9 VP2和AAV9 VP3。
21.一种药物组合物，其包含权利要求1-20中任一项所述的rAAV病毒颗粒、和药学上可接受的赋形剂。
22.一种在有需要的受试者中治疗(例如，(人)RPE65缺陷型)RPE65相关眼睛疾病或障碍的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求1-20中任一项所述的rAAV病毒颗粒或权利要求21所述的药物组合物，其中所述rAAV病毒颗粒特异性诱导(例如，在视网膜色素上皮(RPE)细胞中)从所述rAAV病毒颗粒的所述载体基因组表达所述RPE65多肽。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述施用包括使细胞与所述治疗有效量的权利要求1-20中任一项所述的rAAV病毒颗粒或权利要求21所述的药物组合物接触。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述细胞位于所述受试者的眼睛中。
25.如权利要求22-24中任一项所述的方法，其中所述RPE65相关眼睛疾病或障碍是脉络膜炎、视网膜色素变性、黄斑病变、包括莱伯氏先天性黑矇2型(LCA2)的莱伯氏先天性黑矇(LCA)、莱伯氏遗传性视神经病变、早发型严重视网膜营养不良、全色盲、视网膜劈裂症、眼白化病、眼皮肤白化病、斯特格氏病、无脉络膜、脊髓小脑性共济失调7型(SCAT)、色盲、影响角膜的溶酶体贮积症例如黏多糖贮积症(MPS)IV型和MPS VII型、阿米巴角膜炎、真菌性角膜炎、细菌性角膜炎、病毒性角膜炎、盘尾丝虫性角膜炎、角膜结膜炎、细菌性角膜结膜炎、病毒性角膜结膜炎、春季角膜结膜炎、特应性角膜结膜炎、角膜营养不良性疾病、富克斯内皮营养不良、干燥综合征、史-约综合征、自身免疫性干眼病、环境性干眼病、角膜新生血管形成疾病、角膜移植后排斥反应的预防和治疗、自身免疫性葡萄膜炎、感染性葡萄膜炎、非感染性葡萄膜炎、前葡萄膜炎、后葡萄膜炎(包括弓形虫病)、泛葡萄膜炎、玻璃体或视网膜的炎性疾病、眼内炎的预防和治疗、黄斑水肿、黄斑变性、湿性年龄相关性黄斑变性(湿性AMD)、干性年龄相关性黄斑变性(干性AMD)、糖尿病性黄斑水肿(DME)、过敏性结膜炎、增殖性和非增殖性糖尿病性视网膜病变、高血压性视网膜病变、视网膜的自身免疫性疾病、原发性和转移性眼内黑素瘤、其他眼内转移性肿瘤、青光眼、开角型青光眼、眼底黄色斑点症、闭角型青光眼、色素性青光眼，或其组合。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述RPE65相关眼睛疾病或障碍是莱伯氏先天性黑矇2型(LCA2)。
27.如权利要求22-26中任一项所述的方法，其中所述受试者是人，例如具有活视网膜细胞的人。
28.如权利要求23-27中任一项所述的方法，其中与尚未与权利要求1-20中任一项所述的rAAV病毒颗粒或权利要求21所述的药物组合物接触的细胞相比，所述细胞中的所述RPE65多肽的表达增加。
29.如权利要求22-28中任一项所述的方法，其中与所述施用前的视网膜电图b波幅度相比，所述受试者的眼睛中的视网膜电图b波幅度增加了至少约30％、约40％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、或约80％。
30.如权利要求29所述的方法，其中所述受试者的眼睛中所述视网膜电图b波幅度的增加稳定至少约2周、约3周、约4周、约5周、约6周、约7周、约8周、约9周、约10周、约11周、约12周、约13周、约14周、约15周、约16周、约17周、约18周、约19周、或约20周。
31.如权利要求22-28中任一项所述的方法，其中将所述rAAV病毒颗粒或所述药物组合物经由视网膜下注射施用。
32.如权利要求31所述的方法，其中在玻璃体切除术后进行所述视网膜下注射。
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