CN108103096A

CN108103096A - 一种先天性黒曚症的基因治疗药物

Info

Publication number: CN108103096A
Application number: CN201710462597.5A
Authority: CN
Inventors: 田文洪; 董小岩; 吴小兵; 马思思
Original assignee: Beijing FivePlus Molecular Medicine Institute Co Ltd
Current assignee: Beijing FivePlus Molecular Medicine Institute Co Ltd
Priority date: 2017-06-19
Filing date: 2017-06-19
Publication date: 2018-06-01
Anticipated expiration: 2037-06-19
Also published as: CN108103096B

Abstract

本发明提供一种眼睛特异性表达视网膜色素上皮65（retinal pigment epithelium 65,RPE65）以治疗Leber先天性黒曚症的基因治疗药物。所述载体含有CMV增强子、人RPE65基因的启动子、人RPE65基因编码区和内含子组成序列、polyA序列和人为拼接的RPE65基因增强子。所述重组载体由单链和/或双链腺相关病毒（adeno‑associated virus，AAV）载体介导，包括但不限于9型腺相关病毒（AAV type 9，AAV9）。

Description

一种先天性黒曚症的基因治疗药物

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种单链和/或双链AAV9病毒载体介导的眼睛特异性RPE65基因表达载体及其用途，包含与该载体的组合物、重组表达单元及基因治疗方式。

背景技术

Leber先天性黒曚（Leber congenital amaurosis，LCA）是一种导致儿童双眼先天盲的遗传性视网膜疾病，占儿童先天性双眼盲的10-20%，占遗传性视网膜变性类疾病的5%（Cremers FP, et al. Molecular genetics of Leber congenital amaurosis. Hum MolGenet. 2002; 11(10): 1169-1176.）。该病呈常染色体隐性遗传，目前已知的至少有22个致病基因，其中视网膜色素上皮65（retinal pigment epithelium 65，RPE65）基因突变导致的LCA称为LCA Ⅱ，约占LCA总数的6%（den Hollander AI, et al. Leber congenitalamaurosis: genes, proteins and disease mechanisms. Prog Retin Eye Res. 2008;27(4): 391-419.）。

视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）细胞在眼的发育和视觉功能中起着重要的作用，具有分泌生长因子、抗氧化、参与视循环代谢、维持血-视网膜屏障和吞噬视细胞脱落的外节盘膜等重要生理功能。RPE细胞的正常结构和功能为视网膜感光细胞的正常发育及功能发挥所必需，若RPE细胞出现结构或功能异常则会导致视网膜感光细胞功能受损、视网膜退化等疾病。RPE65 基因编码一个由533个氨基酸组成的蛋白质，主要表达于RPE细胞中，是催化全-反式视黄酯转变成11-顺式视黄醇的异构酶之一，后者经过一系列代谢可转变成视紫红质，参与光信号的传导过程。RPE65基因突变导致视网膜中视紫红质含量降低，相当于视网膜长时间处于暗环境中，造成视力下降。

用于基因替换试验的第一个LCA II小鼠模型是RPE65敲除（Rpe65^-/-）小鼠，由Redmond实验室构建和表征（Redmond TM, et al. An RPE65 knockout: Targeteddisruption of the mouse RPE65 gene. Invest Ophthalmol Vis Sci. 1997; 38:S699.）。为Rpe65^-/-小鼠进行视网膜下腔AAV1-RPE65注射，试验对象包括各个年龄阶段的小鼠（最早的尚在子宫内），试验后进行跟踪，直至术后24个月，ERG结果均进步显著（DejnekaNS, et al. In utero gene therapy rescues vision in a murine model ofcongenital blindness. Mol Ther. 2004; 9(2): 182-188.）。向RPE65^-/-小鼠视网膜下腔注射腺病毒-RPE65，小鼠重获类视黄醇异构酶活性，避免了视锥细胞的损失（Chen Y, et al. RPE65 gene delivery restores isomerohydrolase activity and prevents earlycone loss in Rpe65-/- mice. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2006; 47(3): 1177-1184.）。rd12小鼠，一种天生的RPE65突变小鼠，也被广泛地用作基因治疗的模型（Pang JJ,et al. Retinal degeneration 12 (rd12): a new, spontaneously arising mousemodel for human Leber congenital amaurosis (LCA). Mol Vis. 2005; 11: 152-162.）。其临床和眼底表现与人LCA II型非常相似，具有发病早、视功能损害十分严重的特点，对研究人的Leber先天性黑曚具有重要的理论和临床价值。

与LCA II患者一样，在异构酶活性缺失的RPE65敲除小鼠、突变基因敲入的小鼠、天生RPE65突变的小鼠和狗的疾病模型中，也出现了视网膜降解和严重的视觉损伤症状。前期大量动物实验研究显示，将RPE65基因的cDNA包装入AAV2病毒载体中（AAV2-RPE65），注射至视网膜下腔，能明显延缓感光细胞变性，改善视功能，并且未发现明显的局部及全身不良反应。近年，在动物实验的基础上，开展了一系列RPE65基因治疗的临床研究。Maguire（2008）等将AAV2-RPE65注射到3名LCA II患者的视网膜下腔，随访1 年，患者视野有了显著改善，视觉敏感度得到持续而稳定的提高(Maguire AM, et al. Safety and efficacy ofgene transfer for Leber's congenital amaurosis. New England Journal ofMedicine. 2008; 358(21): 2240-2248.)。Hauswirth（2012）课题组(Jacobson SG, et al. Gene therapy for leber congenital amaurosis caused by RPE65 mutations:safety and efficacy in 15 children and adults followed up to 3 years.Archives of ophthalmology. 2012; 130(1): 9-24.)和 Bainbridge（2015）课题组(Bainbridge JWB, et al. Long-term effect of gene therapy on Leber’scongenital amaurosis. New England Journal of Medicine. 2015; 372(20): 1887-1897.)等也做了类似研究，临床观察也获得了类似的结果，并且无明显不良反应。2016年8月份，AAV2-RPE65的3期临床试验结果发布，在这项关键性的多中心、随机、对照3期临床试验中，经AAV2-RPE65治疗一年后，93％（27/29）的患者功能性视力有所改善，并且基因治疗的疗效长达两年之久(Bennett J, et al. Safety and durability of effect ofcontralateral-eye administration of AAV2 gene therapy in patients withchildhood-onset blindness caused by RPE65 mutations: a follow-on phase 1trial. The Lancet. 2016; 388(10045): 661-672.)。与此同时，AAV2-RPE65被证明使用安全，没有严重不良事件。

中国遗传性眼病患者众多，具有丰富的病例资源，并且中国人的基因突变频谱与西方国家有很大差异。中国已搭建了世界一流的“遗传性眼病基因诊断和遗传咨询平台”，收集了5000余例遗传性眼病患者的血样，并已经完成1000余例遗传性眼病患者的基因检测，其中有多例患者携带RPE65基因突变。鉴于我国尚未具有自主知识产权的RPE65基因治疗临床研究，因此急需开发相应的基因治疗药物来填补国内空白。

腺相关病毒（Adeno-associated virus, AAV）载体作为一类新型的安全载体，其重要性正被研究者逐渐认识到。它是细小病毒家族成员，为无包膜的线性单链DNA病毒，具有广泛的宿主范围，既能感染分裂细胞又能感染非分裂细胞，并能介导外源基因的长期表达。作为病毒载体的重要一员，AAV不具有明显的细胞毒性效应，并且不会像其他病毒载体那样引起细胞强烈的免疫反应；同时在构建重组AAV病毒时，可使其编码序列完全缺失而仅保留其145 bp的末端重复序列，从而有效降低其重组和表达自身蛋白的可能性，使安全性得到进一步提高。加之，AAV病毒本身不具有致病性，使AAV载体成为公认的最安全的病毒载体之一。删除AAV病毒的一侧ITR序列中的D序列和trs（terminal resolution site）序列还能够使包装得到的重组AAV病毒载体携带基因组自我互补，形成双链，显著提高AAV载体的体内外转导效率（Wang Z, et al. Rapid and highly efficient transduction bydouble-stranded adeno-associated virus vectors in vitro and in vivo. GeneTher. 2003; 10(26): 2105-2111. McCarty DM, et al. Adeno-associated virusterminal repeat (TR) mutant generates self-complementary vectors to overcomethe rate-limiting step to transduction in vivo. Gene Ther. 2003; 10(26):2112-2118.）。包装得到的病毒成为scAAV（self-complementary AAV）病毒，即所谓的双链AAV病毒。不同于双侧ITR均未突变的ssAAV（single-stranded AAV），即传统的AAV病毒。scAAV病毒的包装容量更小，仅为ssAAV包装容量的一半，约为2.2kb-2.5kb，但感染细胞后转导效率更高。AAV病毒血清型众多，不同的血清型具有不同的组织感染嗜性，因此应用AAV载体能够将外源基因转运至特定的器官和组织(Wu Z, et al. Adeno-associated virusserotypes: vector toolkit for human gene therapy. Mol Ther. 2006; 14(3): 316-327.)。AAV作为一种理想的基因治疗载体，正在越来越多地引起人们的兴趣和关注（Lu Y.Recombinant adeno-associated virus as delivery vector for gene therapy-areview. Stem Cells Dev. 2004; 13(1): 133-145; Daly TM. Overview of adeno-associated viral vectors. Methods Mol Biol. 2004; 246: 157-165.）。不同血清型的AAV对不同组织的感染能力略有差异，其中AAV9对视网膜色素上皮（retinal pigmentepithelium, RPE）细胞的感染能力很好（Vandenberghe LH, et al. Cone and rodtransduction with alternative AAV serotypes in the macula of non-humanprimates. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 2011; 52(14): 1409-1409. Allocca M, et al. Novel adeno-associated virus serotypes efficientlytransduce murine photoreceptors. Journal of virology. 2007; 81(20): 11372-11380.），可直接采用视网膜下腔注射的方式进行有效感染。

ITR是AAV载体基因组的顺式作用元件，在AAV病毒的整合、拯救、复制和基因组包装中发挥重要作用（Xiao X, et al. A novel 165-base-pair terminal repeatsequence is the sole cis requirement for the adeno-associated virus lifecycle. J Virol. 1997; 71(2): 941-948.）。ITR序列中包含Rep蛋白结合位点（Repbinding site，RBS）和末端解链位点trs（terminal resolution site），能够被Rep蛋白结合识别并在trs处产生切口（Linden RM, et al. The recombination signals foradeno-associated virus site-specific integration. Proc Natl Acad Sci USA.1996; 93(15): 7966-7972.）。ITR序列还可形成独特的“T”字母型二级结构，在AAV病毒的生活周期中发挥重要作用（Ashktorab H, et al. Identification of nuclear proteinsthat specifically interact with adeno-associated virus type 2 invertedterminal repeat hairpin DNA. J Virol. 1989; 63(7): 3034-3039.）。

如前所述，在病理状态下，RPE65基因突变可导致LCA，因而可用基因替代疗法，依此设计高表达正确RPE65蛋白的表达载体。转录水平一方面引入CMV增强子（Boshart M, et al. A very strong enhancer is located upstream of an immediate early gene ofhuman cytomegalovirus. Cell. 1985; 41(2): 521-530.）来增强转录效率，另一方面对RPE65的基因序列进行分析，确定RPE65的启动子和增强子元件序列（Nicoletti A, et al.Promoter analysis of RPE65, the gene encoding a 61-kDa retinal pigmentepithelium-specific protein. Invest Ophthalmol Vis Sci. 1998; 39(3): 637-644.），利用RPE65的启动子来调控其表达，同时将RPE65的增强子元件序列进行人为拼接，插入设计RPE65表达框的加尾信号下游，进一步提高转录效率。对RPE65基因转录区DNA序列分析发现，内部含有两个长度分别为56bp和55bp的内含子，由于内含子能够增加mRNA的转录效率，因此在单链AAV质粒载体设计中保留了这两个内含子序列，而在双链AAV质粒载体中，由于病毒包装容量的限制，只保留一个内含子来共同提高RPE65的表达水平。单链AAV质粒载体选用较长的BGH polyA序列，而双链AAV质粒载体由于受到包装容量的限制，则选择使用一个较短的60bp polyA序列。

因此，将CMV增强子、人RPE65基因的基础启动子、改造后的人RPE65基因编码区、polyA序列和人为拼接的RPE65基因增强子组合起来，并用单链和/或双链AAV9载体将正确的RPE65基因准确导入视网膜色素上皮细胞层并实现高效表达，是一个能够从根本上解决RPE65突变导致的先天性黒曚症的方法。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种AAV9病毒载体介导的眼睛特异性RPE65基因表达载体及其用途，包含与该载体的组合物、重组表达单元及基因治疗方式。该重组病毒能有效替换突变的RPE65基因，从而达到治疗先天性黒曚症的目的。本发明提供的重组病毒是有生物学活性的，有希望成为先天性黒曚症基因治疗的候选病毒。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种重组载体表达单元，其特征在于，包括：

（1）如SEQ ID No.1或如SEQ ID No.2所示的CMV增强子的核苷酸序列；和/或

（2）如SEQ ID No.3所示的人RPE65基因的启动子的核苷酸序列；和/或

（3）如SEQ ID No.4或如SEQ ID No.5所示的人RPE65基因编码区和内含子组合的核苷酸序列；和/或

（4）如SEQ ID No.6或如SEQ ID No.7所示的polyA序列；和/或

（5）如SEQ ID No.8所示的人为拼接的RPE65基因增强子的核苷酸序列。

本发明还提供了所述重组载体表达单元的构建方法，其碱基全序列如SEQ IDNo.9和SEQ ID No.10所示。

本发明提供了重组载体表达单元的碱基全序列，其特征在于，具有：

（Ⅰ）、如SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示的核苷酸序列；或

（Ⅱ）、如SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示的核苷酸序列的互补序列；或

（Ⅲ）、与（Ⅰ）或（Ⅱ）的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与（Ⅰ）或（Ⅱ）的核苷酸序列不同的序列；或

（Ⅳ）、与（Ⅰ）或（Ⅱ）或（Ⅲ）所述序列至少有70%同源性的序列。

在本发明的一些具体实施方案中，所述重组载体表达单元的构建方法，是将CMV增强子、人RPE65基因的启动子、人RPE65基因编码区和内含子组合序列、polyA序列和人为拼接的RPE65基因的增强子组合起来连接到载体中，构建表达载体。

本发明还提供了所述重组载体的制备方法：

步骤1：将CMV增强子、人RPE65基因的启动子、人RPE65基因编码区和内含子组合序列、polyA序列和人为拼接的RPE65基因的增强子组合起来连接到载体中，构建表达载体。

步骤2：将所述表达载体同包装AAV病毒需要的其他质粒共转染宿主细胞，包装、纯化即得充足AAV载体。

在本发明的一些具体实施方案中，所述重组表达载体构建方法中的载体为质粒或病毒。

在本发明的一些具体实施方案中，所述重组表达载体构建方法中的病毒为单链和/或双链病毒，包括但不限于9型腺相关病毒。

所述重组载体为AAV9重组载体，其携带基因组结构为ITR-CMV enhancer-RPE65core promoter-RPE65 CDS-polyA-RPE65 enhancer-ITR的AAV9重组表达载体，简称AAV9-RPE65。

所述重组载体表达单元包括：ITR (adeno-associated virus 2 invertedterminal repeat sequence)、CMV增强子（CMV enhancer）、人RPE65基因的启动子（RPE65core promoter）、人RPE65基因编码区和内含子组合序列（RPE65 CDS/Intron）、polyA、人为拼接的RPE65基因的增强子组合（artificial RPE65 enhancer）和ITR (adeno-associatedvirus 2 inverted terminal repeat sequence)。

其中，ITR sequence (Patent WO0220748)的序列如SEQ ID No.11所示；CMVenhancer的序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示；RPE65 core promoter的序列如SEQID No.3所示；RPE65 CDS的序列如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示；polyA的序列如SEQ IDNo.6和SEQ ID No.7所示；RPE65 enhancer的序列如SEQ ID No.8所示。

本发明还提供了一种重组病毒，其特征在于，包括AAV9携带所述重组载体表达单元。

本发明还提供了一种基因治疗方式，其特征在于，所述基因治疗方式为视网膜下腔注射重组病毒。

本发明还提供了所述重组表达载体和基因治疗方式在制备治疗先天性黒曚症中的应用。

在本发明的一些具体实施方案中，所述先天性黒曚症为遗传性视网膜疾病。

本发明的实验中，设计了一种单链RPE65重组表达载体（图2）和双链RPE65重组表达载体（图3）。在病理状态下，RPE65基因突变可导致LCA，因而可用基因替代疗法，依此设计高表达正确RPE65基因的表达载体。转录水平一方面引入CMV增强子（Boshart M, et al. Avery strong enhancer is located upstream of an immediate early gene of humancytomegalovirus. Cell. 1985; 41(2): 521-530.）来增强转录效率，另一方面对RPE65的启动子进行分析，确定RPE65的启动子和人为拼接的增强子元件序列（Nicoletti A, et al. Promoter analysis of RPE65, the gene encoding a 61-kDa retinal pigmentepithelium-specific protein. Invest Ophthalmol Vis Sci. 1998; 39(3): 637-644.）来提高转录效率。对RPE65的编码基因进行分析发现，内部含有两个长度分别为56bp和55bp的内含子，由于内含子能够增加mRNA的转录效率，因此在单链AAV质粒载体中引入两个内含子，而在双链AAV质粒载体中则只保留长度为56bp的内含子来共同提高RPE65的表达水平。单链AAV质粒载体选用较长的BGH polyA序列，而双链AAV质粒载体由于受到包装容量的限制，则选择使用一个较短的60bp polyA序列。

进一步按照文献（Xiao X, et al. Production of High-Titer RecombinantAdeno-Associated Virus Vectors in the Absence of Helper Adenovirus. J Virol.1998; 72(3): 2224-2232.）报道的方法进行重组AAV载体的包装和纯化，定量PCR方法测定病毒的基因组滴度。具体地，采用三质粒共转染方法对该重组载体进行AAV病毒包装，氯化铯密度梯度离心纯化包装得到重组AAV病毒，SYBR Green定量PCR方法测定病毒基因组滴度。选取对眼睛组织有更好亲和性的9型AAV病毒。

以视网膜下腔注射的方式向小鼠动物模型中分别注射ssAAV9-EGFP和scAAV9-EGFP病毒，注射剂量为1×10¹⁰vg/只小鼠，可以看到，单链和双链9型腺相关病毒都可以高效感染视网膜色素上皮层细胞并实现高效表达（图4）。与对照组相比，经AAV9-RPE65治疗后，小鼠ERG检测结果显示，暗视和明视反应的a波和b波振幅逐渐提高，并且疗效随着时间延长而有所增加。其中，用ssAAV9-RPE65治疗后，明视反应b波振幅分别提高至（130±7）%和（188±10）%（图5A），暗视反应a波振幅分别提高至（117±4）%和（156±9）%（图5B）。用scAAV9-RPE65治疗后，明视反应b波振幅分别提高至（126±5）%和（190±11）%（图5C），暗视反应a波振幅分别提高至（120±4）%和（143±6）%（图5D）。即经ssAAV9-RPE65或scAAV9-RPE65治疗后，小鼠先天性黒曚症情况明显好转，表明ssAAV9-RPE65或scAAV9-RPE65有望成为治疗先天性黒曚症的基因药物。

本发明用到的重要原始实验材料如下所示：

pHelper质粒，来源于AAV Helper Free System（Agilent Technologies，美国），由本公司购自AgilentTechnologies公司并保存。该质粒包含三质粒共转染HEK293细胞制备重组AAV病毒所需要的腺病毒来源辅助功能基因E2A、E4和VA RNA等。

pAAV-R2C9质粒，由本公司构建保存。以AAV Helper Free System（AgilentTechnologies，美国）中的pAAV-RC质粒为基本骨架，用AAV9外壳蛋白编码序列（GenBankID：AY530579）替换pAAV-RC质粒中第2013至4220位序列，即得pAAV-R2C9质粒。简要的构建过程为，根据前述思路获得pAAV-R2C9质粒序列信息，人工合成pAAV-R2C9质粒中Hind III至Pme I酶切位点之间序列，采用标准的分子克隆方法，用合成序列替换pAAV-RC质粒HindIII至Pme I之间序列，获得pAAV-R2C9质粒。pAAV-R2C9质粒包含完整的AAV9的cap基因和AAV2的rep基因，在三质粒共转染包装制备重组AAV9病毒中提供包装所必须的4种Rep蛋白（Rep78、Rep68、Rep52和Rep40）和AAV9外壳蛋白。

pAAV2neo质粒，本公司构建保存，一种常用的AAV质粒克隆载体，含有两个AAV2的反向末端重复序列（inverted terminal repeat，ITR），在两个ITR之间包含人巨细胞病毒早期启动子、多克隆位点和牛生长激素polyA加尾信号等元件。质粒构建过程参见文献（Dong X, et al. Establishment of an AAV reverse infection-based array. PLoSONE. 2010; 5(10): e13479.）。在本发明中用作克隆RPE65基因表达单元和EGFP表达单元的基本骨架。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1 pAAV2neo载体结构示意图。本公司保存的两侧ITR均为145bp野生型ITR的AAV载体pAAV2neo（Dong X, et al. Establishment of an AAV reverse infection-basedarray. PLoS ONE. 2010; 5(10) :e13479.）。ITR，inverted terminal repeat，长度为145bp的反向末端重复序列。CMV promoter，人巨细胞病毒早期启动子。BGH polyA，牛生长激素的多聚核苷酸加尾信号。Amp，氨苄青霉素抗性基因读框。Neo，新霉素抗性基因读框。Xho I、Kpn I、EcoR I、Sal I、Bgl II、BamH I和Apa I均为限制性酶切位点。

图2 pAAV-RPE65载体结构示意图。ITR，inverted terminal repeat，长度为145bp的野生型反向末端重复序列。CMV enhancer，人巨细胞病毒增强子。RPE65 promoter，人RPE65基因启动子。RPE65-1，添加了两个内含子的人RPE65编码区序列。BGH polyA，牛生长激素的多聚核苷酸加尾信号。A-RPE65 enhancer，人为拼接的RPE65基因增强子。Amp，氨苄青霉素抗性基因读框。Neo，新霉素抗性基因读框。Xho I、BamH I和ApaI均为限制性酶切位点。

图3 pscAAV-RPE65载体结构示意图。ITR，inverted terminal repeat，长度为145bp的野生型反向末端重复序列。CMV enhancer，人巨细胞病毒增强子。RPE65 promoter，人RPE65基因启动子。RPE65-2，添加了一个内含子的人RPE65编码区序列。polyA signal，长度为60bp的多聚核苷酸加尾信号。A-RPE65 enhancer，人为拼接的RPE65基因增强子。ΔITR，人工合成的缺失AAV2 ITR中trs(terminal resolution site)和D序列的突变ITR序列。Amp，氨苄青霉素抗性基因读框。Neo，新霉素抗性基因读框。Xho I、BamH I和ApaI均为限制性酶切位点。

图4 视网膜下腔法注射单链ssAAV9-EGFP和双链scAAV9-EGFP病毒后，视网膜色素上皮细胞层表达绿色荧光蛋白情况。

图5 视网膜下腔法注射单链ssAAV9-RPE65和双链scAAV9-RPE65病毒后，小鼠ERG反应检测分析结果：

（A）经ssAAV9-RPE65治疗后，明视反应b波振幅变化；

（B）经ssAAV9-RPE65治疗后，暗视反应a波振幅变化；

（C）经scAAV9-RPE65治疗后，明视反应b波振幅变化；

（D）经scAAV9-RPE65治疗后，暗视反应a波振幅变化。

具体实施方式

本发明公开了一种AAV9病毒载体介导的眼睛特异性RPE65基因表达载体及其用途，包含与该载体的组合物、重组表达单元及基因治疗方式，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明的第一个目的在于提供一种重组载体表达单元。

所述重组载体表达单元包括CMV增强子、人RPE65基因的启动子、人RPE65基因编码区和内含子组合序列、polyA序列和人为拼接的RPE65基因增强子。

本发明的第二个目的在于提供一种重组载体的制备方法，此重组载体携带基因组结构为ITR-CMV enhancer-RPE65 core promoter-RPE65 CDS-polyA-RPE65 enhancer-ITR，属于AAV9重组表达载体，简称AAV9-RPE65。

所述重组载体表达单元包括：ITR (adeno-associated virus 2 invertedterminal repeat sequence)、CMV enhancer、RPE65 core promoter、RPE65 CDS、polyA、RPE65 enhancer和ITR (adeno-associated virus 2 inverted terminal repeatsequence)。

其中，ITR sequence (Patent WO0220748)的序列如SEQ ID No.11所示；CMVenhancer的序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示；RPE65 core promoter的序列如SEQID No.3所示；RPE65 CDS/Intron的序列如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示；polyA的序列如SEQ ID No.6和SEQ ID No.7所示；RPE65 enhancer的序列如SEQ ID No.8所示。

所述载体为质粒或病毒，所述病毒可以为单链和/或双链病毒，包括但不限于9型腺相关病毒。

本发明的第三个目的在于提供一种组合物，所述组合物为AAV9和所述重组载体表达单元。

本发明的第四个目的在于提供一种基因药物，所述给药方式为视网膜下腔注射重组病毒。

本发明的第五个目的在于提供上述任一项的载体、病毒、组合物或基因药物在治疗Leber先天性黒曚症中的用途。

在本发明中，采用基因工程等现代生物学技术和方法，提供了包含CMV增强子、人RPE65基因的启动子、人RPE65基因编码区和内含子组合序列、polyA序列和人为拼接的RPE65基因增强子的重组AAV质粒载体和重组AAV病毒的制备、包装、及其应用。

本发明提供了AAV9病毒载体介导的眼睛特异性RPE65基因表达载体及其用途，包含与该载体的组合物、重组表达单元及基因治疗方式。其中，如无特殊说明，实施例中涉及的各种反应试剂均可以通过商业渠道购买得到；如无特殊说明，实施例中涉及的具体操作参见《分子克隆实验指南第三版》。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1 质粒载体构建

为了构建获得包装重组双链AAV病毒需要的pscAAV-EGFP和pscAAV-RPE65质粒，我们首先以公司保存的pAAV2neo为基础，构建pscAAV载体。具体地，以AAV2基因组（GenBank No.AF043303）中的左侧ITR序列为基础，根据文献报道删除ITR序列中的trs序列和D序列（WangZ, et al. Rapid and highly efficient transduction by double-stranded adeno-associated virus vectors in vitro and in vivo. Gene Ther. 2003; 10(26): 2105-2111.），得到ΔITR序列（SEQ ID No.12）。为了便于克隆操作，将pAAV2neo载体中1392-1668bp之间序列（靠近BGH polyA的ITR和ApaI酶切位点之间序列）同ΔITR序列融合，得到融合序列。在融合序列两端分别添加BamHI和ApaI酶切位点后，由金斯瑞生物科技有限公司合成，克隆入pUC57 simple载体，获得pUC57-ΔITR。BamH I和Apa I分别双酶切消化pUC57-ΔITR载体和pAAV2neo载体(附图1)，回收含有ΔITR片段和切去ITR序列的pAAV2neo载体片段。两片段连接后，转化E.coli JM109感受态细胞（宝生物，大连），筛选、鉴定获得pscAAV载体。

（1）pAAV-EGFP和pscAAV-EGFP载体构建

以pCMV-C-EGFP（上海碧云天生物技术有限公司，上海）为模板，设计合成EGFP-F（SEQID No.13）和EGFP-R（SEQ ID No.14）两条引物，EGFP-F和EGFP-R引物中分别含有KpnI和EcoRI酶切位点，用于将扩增得到EGFP片段克隆入pAAV2neo或pscAAV载体的KpnI和EcoRI酶切位点之间。EGFP-F和EGFP-R序列信息如下，

EGFP-F: 5’attGGTACcgccaccatggtgagcaag3’ (SEQ ID No.13)

EGFP-R: 5’cgcgaattcttacttgtacagctcgtc3’(SEQ ID No.14)。

以pCMV-C-EGFP（上海碧云天生物技术有限公司，上海）为模板，EGFP-F和EGFP-R为引物，采用PrimeSTAR HS DNA Polymerase（宝生物，大连）试剂扩增得到EGFP片段。扩增操作过程参见试剂说明书。用KpnI和EcoRI双酶切消化EGFP片段、pAAV2neo和pscAAV载体。将消化后的EGFP片段分别和线性化的pAAV2neo和pscAAV载体连接，转化E.coli JM109感受态细胞（宝生物，大连），筛选、鉴定后得到含有EGFP的单链AAV质粒载体pAAV-EGFP（载体骨架为pAAV2neo）和双链AAV质粒载体pscAAV-EGFP（载体骨架为pscAAV）。

（2）pAAV-RPE65和pscAAV-RPE65载体构建

参考文献（Boshart M, et al. A very strong enhancer is located upstream ofan immediate early gene of human cytomegalovirus. Cell. 1985; 41(2): 521-530.）设计得到CMV增强子序列（SEQ ID No.1和SEQ ID No.2）。参考文献（Nicoletti A, et al. Promoter analysis of RPE65, the gene encoding a 61-kDa retinal pigmentepithelium-specific protein. Invest Ophthalmol Vis Sci. 1998; 39(3): 637-644.）对RPE65启动子进行分析，确定RPE65的基础启动子序列（SEQ ID No.3）和增强子元件序列（SEQ ID No.8）。对RPE65编码基因序列（GenBank No. AH006060.1）分析发现，RPE65编码基因内部含有两个长度分别为56bp和55bp的内含子，由于内含子能够增加mRNA的转录效率，因此在单链AAV质粒载体中选择了两个内含子（SEQ ID No.4），而在双链AAV质粒载体中则保留了一个内含子（SEQ ID No.5）。单链AAV质粒载体选用较长的BGH polyA序列（SEQ IDNo.6），而双链载体则选用一个较短的60bp polyA序列（SEQ ID No.7）。接下来，将人工合成的序列分别克隆入pAAV2neo载体和pscAAV载体，得到pssAAV-RPE65和pscAAV-RPE65载体。

将CMV增强子（SEQ ID No.1）、人RPE65基因的基础启动子（SEQ ID No.3）、改造后的人RPE65基因编码区（SEQ ID No.4）、polyA序列（SEQ ID No.6）和人为拼接的RPE65基因的增强子（SEQ ID No.8）拼接，再在序列的两端分别添加Xho I和Bgl II酶切位点（SEQ IDNo.9）。添加酶切位点后序列由金斯瑞生物科技有限公司合成，合成序列克隆入金斯瑞生物科技有限公司的pUC57 simple载体（金斯瑞生物科技，南京），得到pUC57-ssRPE65。用Xho I和Bgl II分别双酶切消化pUC57-ssRPE65载体和pAAV2neo载体，回收RPE65片段和切去CMV启动子的pAAV2neo载体片段（约6.3kb），两片段连接后转化E.coli JM109感受态细胞（宝生物，大连），筛选、鉴定后得到含有RPE65的单链AAV质粒载体pAAV-RPE65。

将CMV增强子（SEQ ID No.2）、人RPE65基因的基础启动子（SEQ ID No.3）、改造后的人RPE65基因编码区（SEQ ID No.5）、polyA序列（SEQ ID No.7）和人为拼接的RPE65基因的增强子（SEQ ID No.8）拼接，再在序列的两端分别添加Xho I和Bgl II酶切位点（SEQ IDNo.10）。添加酶切位点后序列由金斯瑞生物科技有限公司合成，合成序列克隆入金斯瑞生物科技有限公司的pUC57 simple载体（金斯瑞生物科技，南京），得到pUC57-scRPE65。用XhoI和Bgl II分别双酶切消化pUC57-scRPE65载体和pAAV2neo载体，回收RPE65片段和切去CMV启动子的pscAAV载体片段（约6.3kb），两片段连接后转化E.coli JM109感受态细胞（宝生物，大连），筛选、鉴定后得到含有RPE65的双链AAV质粒载体pscAAV-RPE65。

质粒载体设计及构建结果：

图1示pAAV2neo载体结构示意图；

图2示pAAV-RPE65载体结构示意图；

图3示pscAAV-RPE65载体结构示意图。

实施例2 重组AAV病毒制备及检定

参照文献（Xiao X, et al. Production of High-Titer Recombinant Adeno-Associated Virus Vectors in the Absence of Helper Adenovirus. J Virol. 1998;72(3): 2224-2232.），应用三质粒包装系统包装和纯化重组AAV病毒。简要地，AAV载体质粒（pAAV-EGFP、pAAV-RPE65、pscAAV-EGFP或pscAAV-RPE65）、辅助质粒（pHelper）和AAV的Rep及Cap蛋白表达质粒（pAAV-R2C9）按照1:1:1的摩尔比混匀后，采用磷酸钙方法转染HEK293细胞，转染48h后，收获细胞和培养上清，应用氯化铯密度梯度离心法分离纯化重组AAV病毒。包装纯化得到ssAAV9-EGFP、ssAAV9-RPE65、scAAV9-EGFP或scAAV9-RPE65等4种重组病毒。

采用定量PCR方法测定制备得到AAV病毒的基因组滴度。具体过程如下：

在CMV增强子中设计两条引物CMV-Q-F和CMV-Q-R：

CMV-Q-F：5’-TGACGTCAATGGGTGGAGTA-3’ (SEQ ID No.15)

CMV-Q-R：5’-CCGTAAGGTCATGTACTGGGC-3’ (SEQ ID No.16)

以CMV-Q-F和CMV-Q-R为引物特异性地扩增CMV增强子长度为142bp片段，采用SYBRGreen染料结合法，以1μg/μl的pscAAV-RPE65质粒及其10倍梯度稀释的样品为标准品，应用SYBR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)试剂（Takara，大连，中国），使用荧光定量PCR仪（型号：ABI 7500 fast，ABI）检测病毒基因组滴度。操作过程参见SYBR Premix Ex TaqII (Tli RNaseH Plus)试剂说明书。病毒的处理方法参见文献（Rohr UP, et al. Fastand reliable titration of recombinant adeno-associated virus type-2 usingquantitative real-time PCR. J Virol Methods. 2002; 106(1): 81-88.）。

实施例3 ssAAV9-EGFP和scAAV9-EGFP在小鼠视网膜色素上皮细胞层的表达

从北京华阜康生物科技股份有限公司购买10只8周龄C57BL/6J小鼠，雌雄各半，随机分为两组，繁殖饲养于SPF级实验动物中心。小鼠在昼夜12h周期交替，相对湿度60±10%，温度22±1ºC条件下饲养。用视网膜下腔法注射ssAAV9-EGFP和scAAV9-EGFP病毒。每只小鼠随机选择注射左眼或者右眼，另一只眼注射等体积的无菌磷酸盐缓冲液作为对照，每只眼的注射剂量为1μL的浓度为1×10¹³vg/ml的病毒溶液。2周后处死小鼠，分离视网膜，冰冻切片后，采用荧光显微镜观察各组小鼠RPE细胞表达绿色荧光蛋白情况。

ssAAV9-EGFP和scAAV9-EGFP在视网膜色素上皮细胞层表达结果：

图4示ssAAV9-EGFP和scAAV9-EGFP病毒介导的EGFP在视网膜色素上皮细胞层的表达情况，可以看到单链和双链AAV9病毒（ssAAV9-EGFP和scAAV9-EGFP）携带的EGFP均能成功感染视网膜色素上皮细胞并实现高效表达。

实施例4 小鼠动物模型的建立

遗传性视网膜疾病LCA的自发突变动物模型Rpe65rd12 (B6(A)-Rpe65rd12/J)小鼠，简称rd12，购自美国缅因州巴港Jackson实验室，繁殖饲养于SPF级实验动物中心。小鼠在昼夜12h周期交替，相对湿度60±10%，温度22±1ºC条件下饲养。鼠龄21(±2)天，体重10.5~16.73g。

实施例5 视网膜下腔注射AAV病毒

解剖显微镜下，先用30g 1/2英寸的注射器针头在小鼠颞侧角巩膜下方2mm处做一个通道，然后用5μl微量注射器装配33g钝性针头通过已有的通道穿过神经视网膜至视网膜下腔，注射1μl/眼的AAV病毒。注射成功后眼底可立刻观察到一小泡状的隆起，一定时间后小泡消失，视网膜局部隆起逐渐变平。

实施例6 AAV9-RPE65在先天性黑曚症中的治疗效果

取21天的rd12小鼠20只，随机分为单链组、双链组，每组10只小鼠。用视网膜下腔法注射ssAAV9-EGFP、ssAAV9-RPE65、scAAV9-EGFP或scAAV9-RPE65四种病毒，小鼠每只眼睛剂量为1×10¹⁰vg，即每只小鼠左眼和右眼均注射1μL浓度为1×10¹³vg/ml的病毒溶液。注射时，单链组内每只小鼠的左眼和右眼互为对照，即当左眼注射ssAAV9-EGFP时，右眼则注射等量的ssAAV9-RPE65病毒；当左眼注射ssAAV9-RPE65时，右眼则注射等量的ssAAV9-EGFP病毒。双链组同单链组一样。分别于注射病毒7天和14天后，进行小鼠的视网膜电图（Electroretinograph，ERG）测定。实验采用德国罗兰（Roland）Q450SC UV电生理仪检测Retiport记录系统，全视野球形刺激器，分别进行暗适应和明适应功能检查。记录暗适应ERG，采用发光二极管（Light Emitting Diode，LED）刺激，强度分别为-35、-25、-15、-5、5、15db。记录总的椎体细胞ERG采用单次白色发光二极管闪光刺激，刺激强度分别为1 cds/m²、1.96 cds/m²，背景光为白色光（30 cds/m²），频率0.9Hz，脉冲扩大1k，过滤1~100Hz，电阻小于10Ω。视网膜暗适应和明适应电生理同时检测，检查暗适应电生理前暗适应过夜，每次在8:00-11:00时间点进行检测。步骤如下：

（1）检测暗适应电生理反应前暗适应过夜；

（2）检测前15min用2.5%美多丽滴眼液充分散瞳；

（3）用氯胺酮注射液（72mg/kg）和甲苯噻嗪（4mg/kg）混合液进行小鼠腹部皮下麻醉；

（4）将麻醉小鼠固定在实验台（37℃恒温水浴检测平台），保持小鼠体温恒定；

（5）用0.5%爱尔卡因表面麻醉角膜；

（6）在小鼠角巩膜缘上放置0.2mm氯化银丝制成的环形角膜电极，小鼠同侧颊部皮下放置不锈钢参考电极，尾部皮下放置不锈钢接地电极；

（7）电极安好后在角膜表面滴加0.1%羟甲基纤维素；

（8）进行暗适应电生理检测，记录由低到高不同刺激光照强度的ERG结果；

（9）明适应10min；

（10）进行明适应电生理检测，记录由低到高不同刺激光照强度的ERG结果。

ERG检测结果显示，与注射ssAAV9-EGFP或scAAV9-EGFP病毒眼相比，注射ssAAV9-RPE65或scAAV9-RPE65病毒眼睛的暗视和明视反应的a波和b波振幅逐渐提高，并且疗效随着时间延长而有所增加。其中，注射ssAAV9-RPE65病毒后，明视反应b波振幅分别提高至（130±7）%和（188±10）%，暗视反应a波振幅分别提高至（117±4）%和（156±9）%。注射scAAV9-RPE65病毒后，明视反应b波振幅分别提高至（126±5）%和（190±11）%，暗视反应a波振幅分别提高至（120±4）%和（143±6）%。

ssAAV9-RPE65或scAAV9-RPE65在小鼠中治疗先天性黑曚症的结果：

图5A示经ssAAV9-RPE65治疗后，明视反应b波振幅明显提高；

图5B示经ssAAV9-RPE65治疗后，暗视反应a波振幅明显提高；

图5C示经scAAV9-RPE65治疗后，明视反应b波振幅明显提高；

图5D示经scAAV9-RPE65治疗后，暗视反应a波振幅明显提高。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

SEQ ID

No.1

5'-CGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTCGTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTCCGGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTACGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACACCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTG-3'

No.2

5'-CGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTCGTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTCCGGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTACGGGACTTTC-3'

No.3

5'-TGAAGGGGTGGGGAAGGGCTCCCAAAGCCATAACTCCTTTTAAGGGATTTAGAAGGCATAAAAA-3'

No.4

5'-ATGTCTATCCAGTAAGTATCTCTGGGAGACTTTTTTGGGCTTCTTCCTTATTCTTCCACCATTTCAGGGTTGAGCATCCTGCTGGTGGTTACAAGAAACTGTTTGAAACTGTGGAGGAACTGTCCTCGCCGCTCACAGCTCATGTAACAGGTTGGTCTCGCCCATCTTGAAGCCATCCTCTTTTTCTGTCTCCCCTTCATCACAGGCAGGATCCCCCTCTGGCTCACCGGCAGTCTCCTTCGATGTGGGCCAGGACTCTTTGAAGTTGGATCTGAGCCATTTTACCACCTGTTTGATGGGCAAGCCCTCCTGCACAAGTTTGACTTTAAAGAAGGACATGTCACATACCACAGAAGGTTCATCCGCACTGATGCTTACGTACGGGCAATGACTGAGAAAAGGATCGTCATAACAGAATTTGGCACCTGTGCTTTCCCAGATCCCTGCAAGAATATATTTTCCAGGTTTTTTTCTTACTTTCGAGGAGTAGAGGTTACTGACAATGCCCTTGTTAATGTCTACCCAGTGGGGGAAGATTACTACGCTTGCACAGAGACCAACTTTATTACAAAGATTAATCCAGAGACCTTGGAGACAATTAAGCAGGTTGATCTTTGCAACTATGTCTCTGTCAATGGGGCCACTGCTCACCCCCACATTGAAAATGATGGAACCGTTTACAATATTGGTAATTGCTTTGGAAAAAATTTTTCAATTGCCTACAACATTGTAAAGATCCCACCACTGCAAGCAGACAAGGAAGATCCAATAAGCAAGTCAGAGATCGTTGTACAATTCCCCTGCAGTGACCGATTCAAGCCATCTTACGTTCATAGTTTTGGTCTGACTCCCAACTATATCGTTTTTGTGGAGACACCAGTCAAAATTAACCTGTTCAAGTTCCTTTCTTCATGGAGTCTTTGGGGAGCCAACTACATGGATTGTTTTGAGTCCAATGAAACCATGGGGGTTTGGCTTCATATTGCTGACAAAAAAAGGAAAAAGTACCTCAATAATAAATACAGAACTTCTCCTTTCAACCTCTTCCATCACATCAACACCTATGAAGACAATGGGTTTCTGATTGTGGATCTCTGCTGCTGGAAAGGATTTGAGTTTGTTTATAATTACTTATATTTAGCCAATTTACGTGAGAACTGGGAAGAGGTGAAAAAAAATGCCAGAAAGGCTCCCCAACCTGAAGTTAGGAGATATGTACTTCCTTTGAATATTGACAAGGCTGACACAGGCAAGAATTTAGTCACGCTCCCCAATACAACTGCCACTGCAATTCTGTGCAGTGACGAGACTATCTGGCTGGAGCCTGAAGTTCTCTTTTCAGGGCCTCGTCAAGCATTTGAGTTTCCTCAAATCAATTACCAGAAGTATTGTGGGAAACCTTACACATATGCGTATGGACTTGGCTTGAATCACTTTGTTCCAGATAGGCTCTGTAAGCTGAATGTCAAAACTAAAGAAACTTGGGTTTGGCAAGAGCCTGATTCATACCCATCAGAACCCATCTTTGTTTCTCACCCAGATGCCTTGGAAGAAGATGATGGTGTAGTTCTGAGTGTGGTGGTGAGCCCAGGAGCAGGACAAAAGCCTGCTTATCTCCTGATTCTGAATGCCAAGGACTTAAGTGAAGTTGCCCGGGCTGAAGTGGAGATTAACATCCCTGTCACCTTTCATGGACTGTTCAAAAAATCT-3'

No.5

5'-ATGTCTATCCAGTAAGTATCTCTGGGAGACTTTTTTGGGCTTCTTCCTTATTCTTCCACCATTTCAGGGTTGAGCATCCTGCTGGTGGTTACAAGAAACTGTTTGAAACTGTGGAGGAACTGTCCTCGCCGCTCACAGCTCATGTAACAGGCAGGATCCCCCTCTGGCTCACCGGCAGTCTCCTTCGATGTGGGCCAGGACTCTTTGAAGTTGGATCTGAGCCATTTTACCACCTGTTTGATGGGCAAGCCCTCCTGCACAAGTTTGACTTTAAAGAAGGACATGTCACATACCACAGAAGGTTCATCCGCACTGATGCTTACGTACGGGCAATGACTGAGAAAAGGATCGTCATAACAGAATTTGGCACCTGTGCTTTCCCAGATCCCTGCAAGAATATATTTTCCAGGTTTTTTTCTTACTTTCGAGGAGTAGAGGTTACTGACAATGCCCTTGTTAATGTCTACCCAGTGGGGGAAGATTACTACGCTTGCACAGAGACCAACTTTATTACAAAGATTAATCCAGAGACCTTGGAGACAATTAAGCAGGTTGATCTTTGCAACTATGTCTCTGTCAATGGGGCCACTGCTCACCCCCACATTGAAAATGATGGAACCGTTTACAATATTGGTAATTGCTTTGGAAAAAATTTTTCAATTGCCTACAACATTGTAAAGATCCCACCACTGCAAGCAGACAAGGAAGATCCAATAAGCAAGTCAGAGATCGTTGTACAATTCCCCTGCAGTGACCGATTCAAGCCATCTTACGTTCATAGTTTTGGTCTGACTCCCAACTATATCGTTTTTGTGGAGACACCAGTCAAAATTAACCTGTTCAAGTTCCTTTCTTCATGGAGTCTTTGGGGAGCCAACTACATGGATTGTTTTGAGTCCAATGAAACCATGGGGGTTTGGCTTCATATTGCTGACAAAAAAAGGAAAAAGTACCTCAATAATAAATACAGAACTTCTCCTTTCAACCTCTTCCATCACATCAACACCTATGAAGACAATGGGTTTCTGATTGTGGATCTCTGCTGCTGGAAAGGATTTGAGTTTGTTTATAATTACTTATATTTAGCCAATTTACGTGAGAACTGGGAAGAGGTGAAAAAAAATGCCAGAAAGGCTCCCCAACCTGAAGTTAGGAGATATGTACTTCCTTTGAATATTGACAAGGCTGACACAGGCAAGAATTTAGTCACGCTCCCCAATACAACTGCCACTGCAATTCTGTGCAGTGACGAGACTATCTGGCTGGAGCCTGAAGTTCTCTTTTCAGGGCCTCGTCAAGCATTTGAGTTTCCTCAAATCAATTACCAGAAGTATTGTGGGAAACCTTACACATATGCGTATGGACTTGGCTTGAATCACTTTGTTCCAGATAGGCTCTGTAAGCTGAATGTCAAAACTAAAGAAACTTGGGTTTGGCAAGAGCCTGATTCATACCCATCAGAACCCATCTTTGTTTCTCACCCAGATGCCTTGGAAGAAGATGATGGTGTAGTTCTGAGTGTGGTGGTGAGCCCAGGAGCAGGACAAAAGCCTGCTTATCTCCTGATTCTGAATGCCAAGGACTTAAGTGAAGTTGCCCGGGCTGAAGTGGAGATTAACATCCCTGTCACCTTTCATGGACTGTTCAAAAAATCT-3'

No.6

5'-GCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTAT-3'

No.7

5'-TCGAGAGGCCTAATAAAGAGCTCAGATGCATCGATCAGAGTGTGTTGGTTTTTTGTGTG-3'

No.8

5'-TCCATAACATTTTATAGATCGACCAATACCCATCTCTGTCGCACGTCGTGCCAAGGTGGGTACGTCTTCTGTTCCCCC-3'

No.9

5'-CTCGAGCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTCGTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTCCGGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTACGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACACCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGTGAAGGGGTGGGGAAGGGCTCCCAAAGCCATAACTCCTTTTAAGGGATTTAGAAGGCATAAAAAGGCCCCTGGCTGAGAACTTCCTTCTTCATTCTGCAGTTGGTGCCAGAACTCTGGATCCTGAACTGGGCCACCATGTCTATCCAGTAAGTATCTCTGGGAGACTTTTTTGGGCTTCTTCCTTATTCTTCCACCATTTCAGGGTTGAGCATCCTGCTGGTGGTTACAAGAAACTGTTTGAAACTGTGGAGGAACTGTCCTCGCCGCTCACAGCTCATGTAACAGGTTGGTCTCGCCCATCTTGAAGCCATCCTCTTTTTCTGTCTCCCCTTCATCACAGGCAGGATCCCCCTCTGGCTCACCGGCAGTCTCCTTCGATGTGGGCCAGGACTCTTTGAAGTTGGATCTGAGCCATTTTACCACCTGTTTGATGGGCAAGCCCTCCTGCACAAGTTTGACTTTAAAGAAGGACATGTCACATACCACAGAAGGTTCATCCGCACTGATGCTTACGTACGGGCAATGACTGAGAAAAGGATCGTCATAACAGAATTTGGCACCTGTGCTTTCCCAGATCCCTGCAAGAATATATTTTCCAGGTTTTTTTCTTACTTTCGAGGAGTAGAGGTTACTGACAATGCCCTTGTTAATGTCTACCCAGTGGGGGAAGATTACTACGCTTGCACAGAGACCAACTTTATTACAAAGATTAATCCAGAGACCTTGGAGACAATTAAGCAGGTTGATCTTTGCAACTATGTCTCTGTCAATGGGGCCACTGCTCACCCCCACATTGAAAATGATGGAACCGTTTACAATATTGGTAATTGCTTTGGAAAAAATTTTTCAATTGCCTACAACATTGTAAAGATCCCACCACTGCAAGCAGACAAGGAAGATCCAATAAGCAAGTCAGAGATCGTTGTACAATTCCCCTGCAGTGACCGATTCAAGCCATCTTACGTTCATAGTTTTGGTCTGACTCCCAACTATATCGTTTTTGTGGAGACACCAGTCAAAATTAACCTGTTCAAGTTCCTTTCTTCATGGAGTCTTTGGGGAGCCAACTACATGGATTGTTTTGAGTCCAATGAAACCATGGGGGTTTGGCTTCATATTGCTGACAAAAAAAGGAAAAAGTACCTCAATAATAAATACAGAACTTCTCCTTTCAACCTCTTCCATCACATCAACACCTATGAAGACAATGGGTTTCTGATTGTGGATCTCTGCTGCTGGAAAGGATTTGAGTTTGTTTATAATTACTTATATTTAGCCAATTTACGTGAGAACTGGGAAGAGGTGAAAAAAAATGCCAGAAAGGCTCCCCAACCTGAAGTTAGGAGATATGTACTTCCTTTGAATATTGACAAGGCTGACACAGGCAAGAATTTAGTCACGCTCCCCAATACAACTGCCACTGCAATTCTGTGCAGTGACGAGACTATCTGGCTGGAGCCTGAAGTTCTCTTTTCAGGGCCTCGTCAAGCATTTGAGTTTCCTCAAATCAATTACCAGAAGTATTGTGGGAAACCTTACACATATGCGTATGGACTTGGCTTGAATCACTTTGTTCCAGATAGGCTCTGTAAGCTGAATGTCAAAACTAAAGAAACTTGGGTTTGGCAAGAGCCTGATTCATACCCATCAGAACCCATCTTTGTTTCTCACCCAGATGCCTTGGAAGAAGATGATGGTGTAGTTCTGAGTGTGGTGGTGAGCCCAGGAGCAGGACAAAAGCCTGCTTATCTCCTGATTCTGAATGCCAAGGACTTAAGTGAAGTTGCCCGGGCTGAAGTGGAGATTAACATCCCTGTCACCTTTCATGGACTGTTCAAAAAATCTTGATAAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATTCCATAACATTTTATAGATCGACCAATACCCATCTCTGTCGCACGTCGTGCCAAGGTGGGTACGTCTTCTGTTCCCCCAGATCT-3'

No.10

5'-CTCGAGCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTCGTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTCCGGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTACGGGACTTTCTGAAGGGGTGGGGAAGGGCTCCCAAAGCCATAACTCCTTTTAAGGGATTTAGAAGGCATAAAAAGGCCCCTGGCTGAGAACTTCCTTCTTCATTCTGCAGTTGGTGCCAGAACTCTGGATCCTGAACTGGGCCACCATGTCTATCCAGTAAGTATCTCTGGGAGACTTTTTTGGGCTTCTTCCTTATTCTTCCACCATTTCAGGGTTGAGCATCCTGCTGGTGGTTACAAGAAACTGTTTGAAACTGTGGAGGAACTGTCCTCGCCGCTCACAGCTCATGTAACAGGCAGGATCCCCCTCTGGCTCACCGGCAGTCTCCTTCGATGTGGGCCAGGACTCTTTGAAGTTGGATCTGAGCCATTTTACCACCTGTTTGATGGGCAAGCCCTCCTGCACAAGTTTGACTTTAAAGAAGGACATGTCACATACCACAGAAGGTTCATCCGCACTGATGCTTACGTACGGGCAATGACTGAGAAAAGGATCGTCATAACAGAATTTGGCACCTGTGCTTTCCCAGATCCCTGCAAGAATATATTTTCCAGGTTTTTTTCTTACTTTCGAGGAGTAGAGGTTACTGACAATGCCCTTGTTAATGTCTACCCAGTGGGGGAAGATTACTACGCTTGCACAGAGACCAACTTTATTACAAAGATTAATCCAGAGACCTTGGAGACAATTAAGCAGGTTGATCTTTGCAACTATGTCTCTGTCAATGGGGCCACTGCTCACCCCCACATTGAAAATGATGGAACCGTTTACAATATTGGTAATTGCTTTGGAAAAAATTTTTCAATTGCCTACAACATTGTAAAGATCCCACCACTGCAAGCAGACAAGGAAGATCCAATAAGCAAGTCAGAGATCGTTGTACAATTCCCCTGCAGTGACCGATTCAAGCCATCTTACGTTCATAGTTTTGGTCTGACTCCCAACTATATCGTTTTTGTGGAGACACCAGTCAAAATTAACCTGTTCAAGTTCCTTTCTTCATGGAGTCTTTGGGGAGCCAACTACATGGATTGTTTTGAGTCCAATGAAACCATGGGGGTTTGGCTTCATATTGCTGACAAAAAAAGGAAAAAGTACCTCAATAATAAATACAGAACTTCTCCTTTCAACCTCTTCCATCACATCAACACCTATGAAGACAATGGGTTTCTGATTGTGGATCTCTGCTGCTGGAAAGGATTTGAGTTTGTTTATAATTACTTATATTTAGCCAATTTACGTGAGAACTGGGAAGAGGTGAAAAAAAATGCCAGAAAGGCTCCCCAACCTGAAGTTAGGAGATATGTACTTCCTTTGAATATTGACAAGGCTGACACAGGCAAGAATTTAGTCACGCTCCCCAATACAACTGCCACTGCAATTCTGTGCAGTGACGAGACTATCTGGCTGGAGCCTGAAGTTCTCTTTTCAGGGCCTCGTCAAGCATTTGAGTTTCCTCAAATCAATTACCAGAAGTATTGTGGGAAACCTTACACATATGCGTATGGACTTGGCTTGAATCACTTTGTTCCAGATAGGCTCTGTAAGCTGAATGTCAAAACTAAAGAAACTTGGGTTTGGCAAGAGCCTGATTCATACCCATCAGAACCCATCTTTGTTTCTCACCCAGATGCCTTGGAAGAAGATGATGGTGTAGTTCTGAGTGTGGTGGTGAGCCCAGGAGCAGGACAAAAGCCTGCTTATCTCCTGATTCTGAATGCCAAGGACTTAAGTGAAGTTGCCCGGGCTGAAGTGGAGATTAACATCCCTGTCACCTTTCATGGACTGTTCAAAAAATCTTGATAATCGAGAGGCCTAATAAAGAGCTCAGATGCATCGATCAGAGTGTGTTGGTTTTTTGTGTGTCCATAACATTTTATAGATCGACCAATACCCATCTCTGTCGCACGTCGTGCCAAGGTGGGTACGTCTTCTGTTCCCCCAGATCT-3'

No.11

5'-CATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTGGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGGAGACCACGGCAGGTCTCAGTTTTAGTACTCTGGAAACAGAATCTACTAAAACAAGGCAAAATGCCGTGTTTATCTCGTCAACTTGTTGGCGAGATTTTTGCGGCCGCAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACNGAGGCCGGGCGACCAAAGGT-3'

No.12

5'-CCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGACAGATCCC-3'

No.13

5'-ATTGGTACCGCCACCATGGTGAGCAAG-3'

NO.14

5'-CGCGAATTCTTACTTGTACAGCTCGTC-3'

No.15

5'-TGACGTCAATGGGTGGAGTA-3'

No.16

5'-CCGTAAGGTCATGTACTGGGC-3'

Claims

1.一种重组载体表达单元，其特征在于，包括：

（4）如SEQ ID No.6或如SEQ ID No.7所示的polyA序列；和/或

2.根据权利要求1所述的重组载体表达单元的构建方法，其碱基全序列如SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示。

3.根据权利要求1和权利要求2所述的重组载体表达单元，其特征在于，具有：

（Ⅰ）、如SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示的核苷酸序列；或

4.根据权利要求1、权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述载体为质粒或病毒。

5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述病毒可以为单链和/或双链腺相关病毒，包括但不限于9型腺相关病毒。

6.一种组合物，其特征在于，包括AAV9和如权利要求1、权利要求2、权利要求3所述的重组载体表达单元。

7.根据权利要求6所述的组合物，其特征在于，包括编码AAV9复制所需蛋白的载体、编码AAV9外壳蛋白的载体和如权利要求1所述重组表达载体。

8.一种基因药物，其特征在于，包括如权利要求1、权利要求2、权利要求3所述的重组载体表达单元，权利要求4、权利要求5所述的重组质粒或病毒和权利要求6、权利要求7所述的组合物。

9.根据权利要求8所述的基因药物，其特征在于，所述给药方式为视网膜下腔注射重组病毒。

10.根据权利要求6或7所述的组合物、权利要求8或9所述的基因药物在治疗Leber先天性黒曚症中的应用。