CN111788311A - 用于治疗年龄相关性黄斑变性的组合物和方法 - Google Patents

用于治疗年龄相关性黄斑变性的组合物和方法 Download PDF

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    • C12N2840/007—Vectors comprising a special translation-regulating system cell or tissue specific

Abstract

本公开提供了用于治疗、预防或抑制眼疾病的组合物和方法。在一个方面，本公开提供了包含补体系统基因的重组CFH或FHL‑1腺相关病毒(rAAV)载体。

Description

用于治疗年龄相关性黄斑变性的组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2017年10月20日提交的美国临时专利申请序列号62/574,814的优先权。上述申请的公开内容通过引用整体结合于此。
背景技术
年龄相关性黄斑变性(AMD)是一种医学病症，并且是西方社会法定盲的主要原因。AMD通常影响老年人并由于黄斑的变性和新生血管变化而导致中央视觉丧失，黄斑是视网膜中心处负责视敏度的色素区域。有四种主要的AMD亚型：早期AMD；中期AMD；晚期非新生血管性(“干性”)AMD；和晚期新生血管性(“湿性”)AMD。通常，通过视网膜色素上皮(RPE)的局灶性过度色素沉着和玻璃膜疣沉积的积累来鉴定AMD。玻璃膜疣沉积物的大小和数量通常与AMD严重程度相关。60岁以上的个体中多达8％发生AMD，并且AMD的患病率随着年龄的增长而持续提高。预计到2050年，美国有近2200万例AMD，而到2040年，全球的AMD病例预计接近2.88亿。
需要新的治疗来防止AMD从早期发展到中期和/或从中期发展到晚期，以防止视力丧失。
发明内容
在一些实施方式中，本公开提供了编码补体因子H(CFH)或人因子H样1(FHL1)蛋白或其生物活性片段的腺相关病毒(AAV)载体，其中所述载体包含与SEQ ID NO:1-3或5的核苷酸序列或其片段至少80％相同的核苷酸序列。在一些实施方式中，该核苷酸序列与SEQID NO:1-3或5的核苷酸序列或者其密码子优化的变体和/或其片段至少90％相同。在一些实施方式中，核苷酸序列与SEQ ID NO:1-3或5的核苷酸序列或者其密码子优化的变体和/或其片段至少95％相同。在一些实施方式中，核苷酸序列是SEQ ID NO:1-3或5的序列，或者其密码子优化的变体和/或其片段。在一些实施方式中，载体编码包含至少四个CCP结构域的CFH蛋白或其生物活性片段。在一些实施方式中，载体编码包含至少五个CCP结构域的CFH蛋白或其生物活性片段。在一些实施方式中，载体编码包含至少六个CCP结构域的CFH蛋白或其生物活性片段。在一些实施方式中，载体编码包含至少七个CCP结构域的CFH蛋白或其生物活性片段。在一些实施方式中，载体编码包含至少三个CCP结构域的CFH蛋白或其生物活性片段。在一些实施方式中，载体编码包含H402多态性的CFH蛋白或其生物活性片段。在一些实施方式中，载体编码包含V62多态性的CFH蛋白或其生物活性片段。在一些实施方式中，CFH蛋白或其生物活性片段包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。在一些实施方式中，SEQ IDNO:4的氨基酸序列是CFH蛋白的C-末端序列。在一些实施方式中，CFH蛋白或其生物活性片段能够跨布鲁赫膜(Bruch’s membrane)扩散。在一些实施方式中，CFH蛋白或其生物活性片段能够结合C3b。在一些实施方式中，CFH蛋白或其生物活性片段能够促进C3b的分解。在一些实施方式中，载体包含长度小于1000个核苷酸的启动子。在一些实施方式中，载体包含长度小于500个核苷酸的启动子。在一些实施方式中，载体包含长度小于400个核苷酸的启动子。在一些实施方式中，启动子包括具有SEQ ID NO:6的核苷酸序列或其片段的启动子。在一些实施方式中，启动子包括具有SEQ ID NO:8的核苷酸序列或其片段的启动子。在一些实施方式中，启动子包括具有SEQ ID NO:12的核苷酸序列或其片段的启动子。在一些实施方式中，启动子包括具有SEQ ID NO:14的核苷酸序列或其片段的启动子。在一些实施方式中，启动子包括具有SEQ ID NO:16的核苷酸序列或其片段的启动子。在一些实施方式中，启动子包括具有SEQ ID NO:18的核苷酸序列或其片段的启动子。在一些实施方式中，启动子包括具有SEQ ID NO:20的核苷酸序列或其片段的启动子。在一些实施方式中，启动子包括具有SEQ ID NO:31的核苷酸序列或其片段的启动子。在一些实施方式中，启动子包括具有SEQID NO:32的核苷酸序列或其片段的启动子。在一些实施方式中，启动子包括具有与SEQ IDNO:6的核苷酸序列或其生物活性片段至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、93％、95％、98％或99％相同的核苷酸序列的启动子。在一些实施方式中，启动子包括具有与SEQID NO:8的核苷酸序列或其生物活性片段至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、93％、95％、98％或99％相同的核苷酸序列的启动子。在一些实施方式中，启动子包括具有与SEQ ID NO:12的核苷酸序列或其生物活性片段至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、93％、95％、98％或99％相同的核苷酸序列的启动子。在一些实施方式中，启动子包括具有与SEQ ID NO:14的核苷酸序列或其生物活性片段至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、93％、95％、98％或99％相同的核苷酸序列的启动子。在一些实施方式中，启动子包括具有与SEQ ID NO:16的核苷酸序列或其生物活性片段至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、93％、95％、98％或99％相同的核苷酸序列的启动子。在一些实施方式中，启动子包括具有与SEQ ID NO:18的核苷酸序列或其生物活性片段至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、93％、95％、98％或99％相同的核苷酸序列的启动子。在一些实施方式中，启动子包括具有与SEQ ID NO:20的核苷酸序列或其生物活性片段至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、93％、95％、98％或99％相同的核苷酸序列的启动子。在一些实施方式中，启动子包括具有与SEQ ID NO:31的核苷酸序列或其生物活性片段至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、93％、95％、98％或99％相同的核苷酸序列的启动子。在一些实施方式中，启动子包括具有与SEQ ID NO:32的核苷酸序列或其生物活性片段至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、93％、95％、98％或99％相同的核苷酸序列的启动子。在一些实施方式中，启动子包括具有与SEQ ID NO:32的核苷酸序列或其生物活性片段至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、93％、95％、98％或99％相同的核苷酸序列的启动子。在一些实施方式中，启动子包含另外的病毒内含子(viral intron)。在一些实施方式中，另外的病毒内含子包含SEQ ID NO:10的核苷酸序列或其片段。在一些实施方式中，载体是AAV2载体。在一些实施方式中，载体包含CMV启动子。在一些实施方式中，载体包含Kozak序列。在一些实施方式中，载体包含在编码CFH的载体部分侧翼的一个或多个ITR序列。在一些实施方式中，载体包含多腺苷酸化序列。在一些实施方式中，载体包含选择标记。在一些实施方式中，选择标记是抗生素抗性基因。在一些实施方式中，抗生素抗性基因是氨苄青霉素抗性基因。
在一些实施方式中，本公开提供了包含本文公开的任何载体(vector)和药学上可接受的载体(carrier)的组合物。
在一些实施方式中，本公开提供了一种治疗患有与补体旁路途径的不良活性相关的障碍的受试者的方法，其包括向所述受试者施用本文公开的任何载体或本文公开的任何组合物的步骤。
在一些实施方式中，本公开提供了治疗患有年龄相关性黄斑变性(AMD)的受试者的方法，其包括向受试者施用本文公开的任何载体或本文公开的任何组合物的步骤。在一些实施方式中，载体或组合物玻璃体内施用。在一些实施方式中，不向受试者施用蛋白酶或编码蛋白酶的多核苷酸。在一些实施方式中，不向受试者施用弗林蛋白酶或编码弗林蛋白酶的多核苷酸。在一些实施方式中，受试者是人。在一些实施方式中，所述人年龄为至少40岁。在一些实施方式中，所述人年龄为至少50岁。在一些实施方式中，所述人年龄为至少65岁。在一些实施方式中，载体或组合物是局部施用的。在一些实施方式中，载体或组合物是全身性施用的。在一些实施方式中，载体或组合物包含与肝脏中的强表达相关的启动子。在一些实施方式中，所述启动子包含与SEQ ID NO:16、18或20中任一个的核苷酸序列至少90％、95％或100％相同的核苷酸序列。在一些实施方式中，载体或组合物包含与眼中的强表达相关的启动子。在一些实施方式中，所述启动子包含与SEQ ID NO:6或32中任一个的核苷酸序列至少90％、95％或100％相同的核苷酸序列。在一些实施方式中，受试者在所述受试者的CFI基因中具有功能丧失突变。在一些实施方式中，受试者具有一个或多个选自以下的CFI突变：G119R、L131R、V152M、G162D、R187Y、R187T、T203I、A240G、A258T、G287R、A300T、R317W、R339Q、V412M和P553S。在一些实施方式中，受试者在该受试者的CFH基因中具有功能丧失突变。在一些实施方式中，所述受试者具有一种或多种选自以下的CFH突变：R2T、L3V、R53C、R53H、S58A、G69E、D90G、R175Q、S193L、I216T、I221V、R303W、H402Y、Q408X、P503A、G650V、R1078S和R1210C。在一些实施方式中，受试者患有非典型溶血性尿毒综合征(aHUS)。在一些实施方式中，所述受试者患有肾脏疾病或并发症。在一些实施方式中，与靶细胞(例如RPE或肝细胞)中CFH或FHL的内源性表达相比，本文公开的任何载体或本文公开的任何组合物能够诱导靶细胞中高至少20％、50％、100％、150％、200％、250％、300％、400％、500％、700％、900％、1000％、1100％、1500％或2000％的CFH或FHL的表达。在一些实施方式中，本文公开的任何载体或本文公开的任何组合物的表达导致靶细胞(例如RPE或肝细胞)中CFH或FHL活性水平与靶细胞中的内源性CFH或FHL活性水平相比高至少20％、50％、100％、150％、200％、250％、300％、400％、500％、700％、900％、1000％、1100％、1500％或2000％。在一些实施方式中，本文公开的任何载体或本文公开的任何组合物在眼的靶细胞中诱导CFH表达。在一些实施方式中，本文公开的任何载体或组合物在视网膜或黄斑的靶细胞中诱导CFH表达。在一些实施方式中，视网膜的靶细胞选自于由以下组成的层的组：内界膜、神经纤维、神经节细胞层(GCL)、内网层、内核层、外网层、外核层、外界膜、视杆和视锥以及视网膜色素上皮(RPE)。在一些实施方式中，靶细胞在脉络丛中。在一些实施方式中，靶细胞在黄斑中。在一些实施方式中，本文公开的任何载体或组合物在GCL和/或RPE的细胞中诱导CFH表达。在一些实施方式中，载体或组合物以1×1010vg/眼至1×1013vg/眼范围的剂量施用于视网膜。在一些实施方式中，载体或组合物以约1.4×1012vg/眼的剂量施用于视网膜。在一些实施方式中，启动子包含具有SEQ ID NO:36的核苷酸序列或其片段的启动子。
附图说明
图1显示了用于表达CFH的全载体基因组构建体的载体图。“ITR”对应于反向末端重复序列；“CRALBP启动子”对应于细胞视黄醛结合蛋白启动子；“CFH”对应于编码补体因子H的基因；“polyA”对应于多腺苷酸化序列；“Amp R”对应于氨苄青霉素抗性盒。对应于图1中所示载体的核苷酸序列是SEQ ID NO:7。
图2显示了用于表达CFH的全载体基因组构建体的载体图。“ITR”对应于反向末端重复序列；“EF1a启动子”对应于延伸因子-1α启动子；“CFH”对应于编码补体因子H的基因；“polyA”对应于多腺苷酸化序列；“AmpR”对应于氨苄青霉素抗性盒。对应于图2所示载体的核苷酸序列是SEQ ID NO:9。
图3显示了用于表达CFH的全载体基因组构建体的载体图。“ITR”对应于反向末端重复序列；“EF1a.SV40i”对应于包含猿猴病毒40内含子的延伸因子-1α启动子；“CFH”对应于编码补体因子H的基因；“polyA”对应于多腺苷酸化序列；“AmpicillinR”对应于氨苄青霉素抗性盒。对应于图3所示载体的核苷酸序列是SEQ ID NO:11。
图4显示了用于表达CFH的全载体基因组构建体的载体图。“ITR”对应于反向末端重复序列；“HSP70启动子”对应于热休克蛋白70启动子；“CFH”对应于编码补体因子H的基因；“polyA”对应于多腺苷酸化序列；“AmpR”对应于氨苄青霉素抗性盒。对应于图4中所示载体的核苷酸序列是SEQ ID NO:13。
图5显示了用于表达CFH的全载体基因组构建体的载体图。“ITR”对应于反向末端重复序列；“sCBA启动子”对应于鸡β肌动蛋白启动子；“CFH”对应于编码补体因子H的基因；“polyA”对应于多腺苷酸化序列；“AmpR”对应于氨苄青霉素抗性盒。该载体还包含SV40i内含子。对应于图5所示载体的核苷酸序列是SEQ ID NO:15。
图6显示了用于表达CFH的全载体基因组构建体的载体图。“ITR”对应于反向末端重复序列；“AAT1”对应于α-1抗胰蛋白酶1启动子；“CFH”对应于编码补体因子H的基因；“polyA”对应于多腺苷酸化序列；“AmpR”对应于氨苄青霉素抗性盒。对应于图6所示载体的核苷酸序列是SEQ ID NO:17。
图7显示了用于表达CFH的全载体基因组构建体的载体图。“ITR”对应于反向末端重复序列；“ALB”对应于基于人白蛋白启动子的合成启动子；“CFH”对应于编码补体因子H的基因；“polyA”对应于多腺苷酸化序列；“AmpR”对应于氨苄青霉素抗性盒。对应于图7所示载体的核苷酸序列是SEQ ID NO:19。
图8显示了用于表达CFH的全载体基因组构建体的载体图。“ITR”对应于反向末端重复序列；“PCK1”对应于磷酸烯醇丙酮酸羧激酶1启动子；“CFH”对应于编码补体因子H的基因；“polyA”对应于多腺苷酸化序列；“AmpR”对应于氨苄青霉素抗性盒。对应于图8所示载体的核苷酸序列是SEQ ID NO:21。
图9显示了用于表达FHL-1的全载体基因组构建体的载体图。“ITR”对应于反向末端重复序列；“EF1a”对应于延伸因子-1α启动子；“FHL-1”对应于编码因子H样蛋白1的基因；“polyA”对应于多腺苷酸化序列；“AmpR”对应于氨苄青霉素抗性盒。对应于图9所示载体的核苷酸序列是SEQ ID NO:22。
图10显示了用于表达FHL-1的全载体基因组构建体的载体图。“ITR”对应于反向末端重复序列；“ALB”对应于基于人白蛋白启动子的合成启动子；“FHL-1”对应于编码因子H样蛋白1的基因；“polyA”对应于多腺苷酸化序列；“AmpR”对应于氨苄青霉素抗性盒。对应于图10中所示的载体的核苷酸序列是SEQ ID NO:23。
图11显示了用于表达FHL-1的全载体基因组构建体的载体图。“ITR”对应于反向末端重复序列；“AAT1”对应于α-1抗胰蛋白酶1启动子；“FHL-1”对应于编码因子H样蛋白1的基因；“polyA”对应于多腺苷酸化序列；“AmpR”对应于氨苄青霉素抗性盒。对应于图11中所示载体的核苷酸序列是SEQ ID NO:24。
图12显示了用于表达FHL-1的全载体基因组构建体的载体图。“ITR”对应于反向末端重复序列；“EF1a.SV40i”对应于包含猿猴病毒40内含子的延伸因子-1α启动子；“FHL-1”对应于编码因子H样蛋白1的基因；“polyA”对应于多腺苷酸化序列；“AmpR”对应于氨苄青霉素抗性盒。对应于图12所示的载体的核苷酸序列是SEQ ID NO:25。
图13显示了用于表达FHL-1的全载体基因组构建体的载体图。“ITR”对应于反向末端重复序列；“CAG”对应于包含巨细胞病毒(CMV)早期增强子元件、鸡β-肌动蛋白基因的启动子/第一外显子/第一内含子和兔β-球蛋白基因的剪接受体的合成启动子；“FHL-1”对应于编码因子H样蛋白1的基因；“polyA”对应于多腺苷酸化序列；“AmpR”对应于氨苄青霉素抗性盒。对应于图13中所示的载体的核苷酸序列是SEQ ID NO:26。
图14显示了用于表达FHL-1的全载体基因组构建体的载体图。“ITR”对应于反向末端重复序列；“CRALBP”对应于细胞视黄醛结合蛋白启动子；“FHL-1”对应于编码因子H样蛋白1的基因；“polyA”对应于多腺苷酸化序列；“AmpR”对应于氨苄青霉素抗性盒。对应于图14所示载体的核苷酸序列是SEQ ID NO:27。
图15显示了用于表达FHL-1的全载体基因组构建体的载体图。“ITR”对应于反向末端重复序列；“hRPE65”对应于视网膜色素上皮65启动子；“FHL-1”对应于编码因子H样蛋白1的基因；“polyA”对应于多腺苷酸化序列；“AmpR”对应于氨苄青霉素抗性盒。对应于图15中所示的载体的核苷酸序列是SEQ ID NO:28。
图16显示了用于表达FHL-1的全载体基因组构建体的载体图。“ITR”对应于反向末端重复序列；“HSP70”对应于热休克蛋白70启动子；“FHL-1”对应于编码因子H样蛋白1的基因；“polyA”对应于多腺苷酸化序列；“AmpR”对应于氨苄青霉素抗性盒。对应于图16中所示载体的核苷酸序列是SEQ ID NO:29。
图17显示了用于表达FHL-1的全载体基因组构建体的载体图。“ITR”对应于反向末端重复序列；“PCK1”对应于磷酸烯醇丙酮酸羧激酶1启动子；“FHL-1”对应于编码因子H样蛋白1的基因；“polyA”对应于多腺苷酸化序列；“AmpR”对应于氨苄青霉素抗性盒。对应于图17中所示的载体的核苷酸序列是SEQ ID NO:30。
图18显示了来自其中在用各种CFH或对照质粒转染的HEK细胞中检测的CFH(或加载对照(loading control)GAPDH)水平的实验的蛋白质印迹。
图19显示的条形图比较了相对于GAPDH蛋白水平的来自图18的蛋白质印迹分析的CFH蛋白水平。
图20显示了来自其中在用各种CFH或对照AAV载体转染的HEK细胞中检测的CFH或GFP(或加载对照GAPDH)水平的实验的蛋白质印迹。
具体实施方式
本公开提供了用于治疗、预防或抑制眼疾病的组合物和方法。一个方面，本公开提供了包含补体系统基因(例如，但不限于编码补体因子H(CFH)或因子-H样蛋白1(FHL1)的基因)的重组腺相关病毒(rAAV)载体。在另一方面，本公开提供了通过眼内(例如，玻璃体内)施用有效量的本公开的rAAV载体以递送和驱动补体因子基因的表达来治疗、预防或抑制眼疾病的方法。
使用本文提供的病毒载体和方法可以治疗或预防各种各样的眼疾病。可以使用本公开的载体和方法治疗或预防的眼疾病包括但不限于青光眼、黄斑变性(例如，年龄相关性黄斑变性)、糖尿病性视网膜病、遗传性视网膜变性如色素性视网膜炎、视网膜脱离或损伤和视网膜病变(例如，遗传性的，由手术、创伤、基础病因(例如严重贫血、SLE、高血压、血液异常、系统性感染或基础颈动脉疾病)、毒性化合物或药剂或者光(photically)引起的视网膜病)。
通用技术
除非本文另有定义，否则本申请中使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。通常，本文描述的与药理学、细胞和组织培养、分子生物学、细胞和癌症生物学、神经生物学、神经化学、病毒学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白质和核酸化学结合使用的术语和技术是那些在本领域众所周知的和常用的。在发生冲突的情况下，以本说明书(包括定义)为准。
除非另有说明，否则本公开的实践将采用分子生物学(包含重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，其在本领域技术范围内。此类技术在文献中有充分的解释，诸如，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,second edition(Sambrook等,1989)Cold Spring Harbor Press；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait，编辑,1984)；Methods in Molecular Biology,Humana Press；Cell Biology:A LaboratoryNotebook(J.E.Cellis；编辑,1998)Academic Press；Animal Cell Culture(R.I.Freshney，编辑,1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P.Mather和P.E.Roberts,1998)Plenum Press；Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures(A.Doyle,J.B.Griffiths和D.G.Newel，编辑,1993-1998)J.Wiley和Sons；Methods inEnzymology(Academic Press,Inc.)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M.Miller和M.P.Calos，编辑,1987)；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等,编辑,1987)；PCR:The Polymerase Chain Reaction,(Mullis等,编辑,1994)；Sambrook和Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd.编辑,ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY(2001)；Ausubel等，CurrentProtocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,NY(2002)；Harlow and Lane UsingAntibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,NY(1998)；Coligan等,Short Protocols in Protein Science,JohnWiley&Sons,NY(2003)；Short Protocols in Molecular Biology(Wiley和Sons,1999)。
酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书进行，如本领域通常完成的或如本文所述的。本文描述的与分析化学、生物化学、免疫学、分子生物学、合成有机化学以及医学和药物化学结合使用的术语以及实验室程序和技术是本领域众所周知的和常用的。标准技术用于化学合成和化学分析。
在整个说明书和实施方式中，单词“包含”或诸如“包含的”或“包含着”的变体将被理解为表明包含陈述的整数或整数组，但不排除任何其他整数或整数组。
要理解的是，无论在何处用语言“包含”描述实施方式，也提供用“由...组成”和/或“基本上由...组成”描述的另外的类似实施方式。
术语“包括”用于表示“包括但不限于”。“包括”和“包括但不限于”可互换使用。
术语“例如”或“譬如”之后的任何示例并不意味着是穷举或限制的。
除非上下文另有要求，否则单数术语应包含复数，且复数术语应包含单数。
冠词“一”和“一个”在本文中用于指代冠词的一个或超过一个(即，至少一个)语法对象。举例来说，“一个元件”是指一个元件或超过一个元件。本文中对“约”一个值或参数的提及包含(并描述)指示该值或参数本身的实施方式。例如，提及“大约X”的描述包含对“X”的描述。数字范围包含定义范围的数字。
尽管阐述本发明的宽范围的数值范围和参数是近似值，但是在具体实施例中阐述的数值被尽可能精确地报告。但是，任何数值都固有地包含必然由它们各自的测试测量中存在的标准偏差导致的某些误差。此外，本文公开的所有范围应理解为涵盖其中包括的任何和所有子范围。例如，陈述的“1到10”的范围应被视为包括最小值1和最大值10之间(包含该最小值和最大值)的任何和所有子范围；也就是说，所有子范围均以最小值1或较大的值开始(例如1到6.1)，且以最大值10或较小的值结束(例如5.5到10)。
在根据马库什(Markush)项或替代的其他分组来描述本公开的方面或实施方式的情况下，本公开不仅涵盖整体列出的整个组，还单独包含该组的每个成员以及大组的所有可能的子组，而且还涵盖缺少一个或多个组成员的大组。本公开还设想了在实施的公开中明确排除任何组成员中的一个或多个。
尽管在本文中描述了示例性的方法和材料，但是与本文描述的方法和材料类似或等同的方法和材料也可以用于本公开的实践或测试中。材料、方法和示例仅是说明性的，而无意于限制。
定义
除非另有说明，否则以下术语应被理解为具有以下含义：
如本文所用，“残基”是指蛋白质中的位置及其相关的氨基酸身份。
如本领域中已知的，本文可互换使用的“多核苷酸”或“核酸”是指任何长度的核苷酸链，并且包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基和/或其类似物，或可以通过DNA或RNA聚合酶掺入链中的任何底物。多核苷酸可包含修饰的核苷酸，例如甲基化的核苷酸及其类似物。如果存在的话，可以在链组装之前或之后施加对核苷酸结构的修饰。核苷酸的序列可以被非核苷酸成分打断。多核苷酸可在聚合后进一步修饰，例如通过与标记组分缀合。其他类型的修饰包括，例如“帽”，用类似物取代一个或多个天然存在的核苷酸的置换、核苷酸间修饰，例如，具有不带电荷的连接的那些(例如，甲基膦酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)和具有带电荷的连接的那些(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)、包含侧基部分(例如，蛋白质(例如，核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚L-赖氨酸等)的那些、具有嵌入剂(如吖啶、补骨脂素等)的那些、含有螯合剂(如金属、放射性金属、硼、氧化性金属等)的那些、含有烷基化剂的那些、具修饰的连接(如α-异头核酸等)的那些以及未修饰形式的多核苷酸。此外，糖中通常存在的任何羟基可被例如膦酸酯基、磷酸基取代，通过标准保护基团保护或被活化以制备与另外的核苷酸的另外的连接，或者可与固体支持物缀合。5'和3'末端的OH可被磷酸化或用1-20个碳原子的胺或有机帽部分取代。其他羟基也可以被衍生为标准保护基。多核苷酸还可以包含本领域通常已知的核糖或脱氧核糖的类似形式，包括例如，2'-O-甲基-、2'-O-烯丙基、2'-氟-或2'-叠氮基-核糖、碳环糖类似物、α-或β-异构糖(anomeric sugar)、差向异构糖例如阿拉伯糖、木糖类或来苏糖类、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖、无环类似物和无碱基核苷类似物(如甲基核糖苷)。一个或多个磷酸二酯键可以被替代的连接基团取代。这些替代的连接基团包括但不限于其中磷酸酯被P(O)S(“硫代酸酯”)、P(S)S(“二硫代酸酯”)、(O)NR2(“酰胺酯”)、P(O)R、P(O)OR'、CO或CH2(“甲缩醛”)取代的实施方式，其中各个R或R'独立地为H或者取代的或未取代的烷基(1-20C)，任选地包含醚(-O-)键、芳基、烯基、环烷基、环烯基或芳烷基。并非多核苷酸中的所有连接都需要相同。先前的描述适用于本文所指的所有多核苷酸，包括RNA和DNA。
术语“多肽”、“寡肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用以指任何长度的氨基酸链。该链可以是线性或分支的，它可以包含修饰的氨基酸和/或可以被非氨基酸中断。该术语还涵盖经天然修饰或通过干预修饰的氨基酸链；例如，二硫键的形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或修饰，例如，与标记组分的缀合。该定义中还包括，例如，含有一种或多种氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸等)，以及本领域已知的其他修饰的多肽。应当理解，多肽可以作为单链或关联链存在。
所有语法形式和拼写变化的“同源的”是指具有“共同进化起源”的两种蛋白质之间的关系，包括来自相同生物物种的超家族的蛋白质，以及来自不同生物物种的同源蛋白质。此类蛋白质(及其编码核酸)具有序列同源性，如通过其序列相似性反映的，无论是以百分同一性的方式还是通过特定残基或基序和保守位置的存在。
然而，在通常的用法和本申请中，术语“同源的”当用副词例如“高度”修饰时，可以指序列相似性，并且可以与或不与共同的进化起源相关。
所有语法形式的术语“序列相似性”是指可能具有或不具有共同进化起源的核苷酸或氨基酸序列之间同一性或对应性的程度。
相对于参考多肽(或核苷酸)序列的“百分(％)序列同一性”或“与……相同的百分比(％)”定义为在比对序列和引入空位(如有必要)以达到最大的百分序列同一性且不考虑任何保守转换作为序列同一性的部分后，候选序列中与参考多肽(核苷酸)序列中的氨基酸残基(或核酸)相同的氨基酸残基(或核酸)的百分比。用于确定氨基酸序列同一性的目的的比对可以以本领域技术范围内的各种方式来实现，例如，使用诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件的公众可获得的计算机软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的合适参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。
如本文所用，“宿主细胞”包括可以是或已经是用于引入多核苷酸插入序列的载体的接受者的单个细胞或细胞培养物。术语宿主细胞可以指其中从质粒产生rAAV的包装细胞系。可选地，术语“宿主细胞”可以指其中需要转基因表达的靶细胞。
如本文所用，“载体”是指重组质粒或病毒，其包含在体外或体内递送到宿主细胞中的核酸。“重组病毒载体”是指包含一个或多个异源序列(即非病毒来源的核酸序列)的重组多核苷酸载体。在重组AAV载体的情况下，重组核酸侧邻至少一个反向末端重复序列(ITR)。在一些实施方式中，重组核酸侧邻两个ITR。
“重组AAV载体(rAAV载体)”是指基于腺相关病毒的多核苷酸载体，包含一个或多个异源序列(即，非AAV来源的核酸序列)，其侧邻至少一个AAV反向末端重复序列(ITR)。当存在于已被合适的辅助病毒感染(或表达合适的辅助功能)的和表达AAV rep和cap基因产物(即AAV Rep和Cap蛋白)的宿主细胞中时，这种rAAV载体可以复制并包装到感染性病毒颗粒中。当rAAV载体整合到较大的多核苷酸中(例如，染色体中或另一载体(例如用于克隆或转染的质粒)中时，rAAV载体可称为可以通过在存在AAV包装功能和合适的辅助功能的情况下复制和衣壳化来“拯救”的“原载体(pre-vector)”。rAAV载体可以是多种形式中的任一种，包括但不限于质粒、线性人工染色体、与脂质复合、包封在脂质体内和在病毒颗粒(例如AAV颗粒)中衣壳化。rAAV载体可以包装到AAV病毒衣壳中以产生“重组腺相关病毒颗粒(rAAV颗粒)”。
“rAAV病毒”或“rAAV病毒颗粒”是指由至少一种AAV衣壳蛋白和衣壳化的rAAV载体基因组组成的病毒颗粒。
术语“转基因”是指被引入细胞中且能够被转录成RNA和任选地在适当条件下翻译和/或表达的多核苷酸。在一些方面，它对其所引入的赋予细胞所需的特性，或另外地导致所需的治疗或诊断结果。在另一方面，它可以被转录成介导RNA干扰的分子，例如miRNA、siRNA或shRNA。
如本文所用，术语“载体基因组(vg)”可以指包含载体(例如病毒载体)的一组多核苷酸序列的一个或多个多核苷酸。载体基因组可以在病毒颗粒中衣壳化。取决于特定的病毒载体，载体基因组可以包含单链DNA、双链DNA或者单链RNA或双链RNA。载体基因组可包含与特定病毒载体相关的内源序列和/或通过重组技术插入特定病毒载体中的任何异源序列。例如，重组AAV载体基因组可包含启动子侧翼的至少一个ITR序列、填充物(stuffer)、目的序列(例如，RNAi)和多腺苷酸化序列。完整的载体基因组可以包含载体的完整多核苷酸序列组。在一些实施方式中，可以按照vg/mL来测量病毒载体的核酸滴度。适合于测量该滴度的方法是本领域已知的(例如定量PCR)。
“反向末端重复序列”或“ITR”序列是本领域众所周知的术语，并且是指在以相反定向存在于病毒基因组的末端处的相对短的序列。
在本领域中众所周知的术语“AAV反向末端重复(ITR)”序列是在天然单链AAV基因组的两个末端处存在的约145个核苷酸的序列。ITR的最外侧125个核苷酸可以两种可选定向的任一种存在，从而导致不同AAV基因组之间以及单个AAV基因组两端之间的异质性。最外侧的125个核苷酸还包含几个较短的自我互补区(称为A、A'、B、B'、C、C和D区)，从而允许在ITR的这一部分内发生链内碱基配对。
用于AAV的“辅助病毒”是指允许AAV(其为缺陷的细小病毒)复制和被宿主细胞包装的病毒。许多这样的辅助病毒是本领域已知的。
如本文所用，“表达控制序列”是指导核酸转录的核酸序列。表达控制序列可以是启动子(例如，组成型启动子)或增强子。表达控制序列与待转录的核酸序列可操作地连接。
如本文所用，“分离的分子”(其中该分子是例如，多肽、多核苷酸或其片段)是按照其起源或衍生来源(1)与其天然状态下伴随的一个或多个天然相关的成分不相关联，(2)基本不含来自同一物种的一个或多个其他分子，(3)由来自不同物种的细胞表达，或(4)自然界中不存在的分子。
如本文所用，“纯化”及其语法变体是指从包含多肽和一种或多种杂质的混合物中完全或部分去除至少一种杂质，从而提高了组合物中多肽的纯度水平(即，通过减少组合物中的一种或多种杂质的量(ppm))。
如本文所用，“基本上纯的”是指至少50％纯(即，没有污染物)，更优选至少90％纯，更优选至少95％纯，还更优选至少98％纯，和最优选至少99％纯的材料。
术语“患者”、“受试者”或“个体”在本文可互换使用，且是指人类或非人类动物。这些术语包括哺乳动物，例如人类、非人类灵长动物、实验室动物、家畜(包括牛、猪、骆驼等)、陪伴动物(例如犬、猫、其他家养动物等)和啮齿动物(例如，小鼠和大鼠)。在一些实施方式中，受试者是年龄至少40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90或95岁的人。
在一个实施方式中，受试者患有眼疾病或处于发生眼疾病的风险中。眼疾病包括但不限于色素性视网膜炎、视杆-视锥细胞营养不良、莱伯先天性黑蒙症(Leber'scongenital amaurosis)、厄舍氏综合征(Usher's syndrome)、巴尔得-别德尔综合征(Bardet-Biedl Syndrome)、卵黄状黄斑变性(Best disease)、视网膜劈裂症、斯塔加特病(stargardt disease)(常染色体显性或常染色体隐性的)、未治疗的视网膜脱离、模式营养不良、视锥-视杆细胞营养不良、色盲、眼白化病、增强S锥体综合征、糖尿病性视网膜病、年龄相关性黄斑变性、早产儿视网膜病变、镰状细胞视网膜病、先天性静止性夜盲症、青光眼或视网膜静脉阻塞。在另一实施方式中，所述受试者患有青光眼、莱伯遗传性视神经病(Leber's hereditary optic neuropathy)、溶酶体贮积障碍或过氧化物酶体障碍或处于发病风险中。在另一实施方式中，受试者需要光遗传学治疗。在另一实施方式中，受试者已经显示出眼疾病的临床体征。
在一些实施方式中，受试者患有肾病或并发症，或处于发生肾病或并发症的风险中。在一些实施方式中，肾脏疾病或并发症与AMD或aHUS相关。
在一些实施方式中，受试者患有AMD或aHUS，或牌发生AMD或aHUS的风险中。
眼疾病的临床体征包括但不限于，周边视力减弱、中央(阅读)视力下降、夜视力下降、色觉丧失、视敏度下降、光感受器功能下降和色素改变。在一个实施方式中，受试者显示外核层(ONL)的变性。在另一个实施方式中，受试者已经诊断患有眼疾病。在又一个实施方式中，受试者尚未显示出眼疾病的临床体征。
如本文所用，术语“预防”、“防止”和“阻止”是指由于施用治疗(例如，预防剂或治疗剂)而在受试者中预防疾病或病症(例如，眼疾病)的复发或发作或者减轻疾病或病症(例如，眼疾病)的一种或多种症状。例如，在对受试者施用感染治疗的情况中，“预防”、“防止”和“阻止”是指因施用治疗(例如，预防剂或治疗剂)或施用疗法(例如，预防剂或治疗剂的组合)的组合而导致在受试者中抑制或减少疾病或病症(例如，眼疾病)的发生或发作，或者预防疾病或病症(例如，眼疾病)的一种或多种症状的复发、发作或发展。
“治疗”病症或患者是指采取步骤以获得有益或期望的结果，包括临床结果。关于疾病或病症(例如，眼疾病)，治疗是指减少或改善感染(例如眼疾病或与之相关的症状)的进展、严重性和/或持续时间，或者因施用一种或多种疗法(包括但不限于施用一种或多种预防剂或治疗剂)导致一种或多种症状的缓解。
可以使用本领域技术人员已知的多种方法中的一种完成向受试者“实施”或“施用”物质、化合物或药剂。例如，可以玻璃体内或视网膜下施用化合物或药剂。在特定的实施方式中，玻璃体内施用化合物或药剂。在一些实施方式中，施用可以是局部的。在其他实施方式中，施用可以是全身性的。也可以例如一次、多次和/或在一个或多个延长的时期内进行施用。在一些方面，施用包括直接施用(包括自我施用)和间接施用(包括开处方药的行为)。例如，如本文中所使用的，指导患者自我施用药物或者由另一人施用药物和/或向患者提供药物处方的医师向患者施用药物。
如本文所用，术语“眼细胞”是指眼中的或与眼睛的功能相关的任何细胞。该术语可以指感光细胞(包括视杆细胞、视锥细胞和感光神经节细胞)、视网膜色素上皮(RPE)细胞、神经胶质细胞、穆勒细胞、双极细胞、水平细胞、无长突细胞中的任何一种或多种。在一个实施方式中，眼细胞是双极细胞。在另一个实施方式中，眼细胞是水平细胞。在另一个实施方式中，眼细胞是神经节细胞。在特定的实施方式中，细胞是RPE细胞。
本文描述的各个实施方式可以单独使用或与本文描述的任何其他实施方式结合使用。
rAAV载体的构建
本公开提供了重组AAV(rAAV)载体，其包含补体系统基因(例如，CFH、FHL1、FHR1、FHR2、FHR3、FHR4或FHR5)、剪接变体(例如，FHL1)或其片段，其在合适的启动子的控制下以指导眼中补体系统基因、剪接变体或其片段的表达。本公开进一步提供了包含rAAV载体的治疗组合物，该rAAV载体包含在合适的启动子控制下的补体系统基因、剪接变体或其片段(例如，CFH、FHL1、FHR1、FHR2、FHR3、FHR4或FHR5)。多种rAAV载体可用于将所需的补体系统基因递送至眼并指导其表达。已知来自人类和非人类灵长动物的30多种天然存在的AAV血清型。存在AAV衣壳的许多天然变体，并且可以基于具有特别适合于眼细胞的特性的AAV来设计本公开的rAAV载体。在某些实施方式中，补体系统基因是剪接变体(例如，FHL1，其是CFH的截短的剪接变体)。
通常，rAAV载体按顺序由5'腺-相关病毒反向末端重复序列、可操作地与调节其在靶细胞中表达的序列连接的编码补体系统多肽(例如，CFH、FHL1、FHR1、FHR2、FHR3、FHR4或FHR5)或其生物活性片段的转基因或目的基因和3'腺-相关病毒反向末端重复序列组成。另外，rAAV载体可以优选具有多腺苷酸化序列。通常，rAAV载体应在转基因或目的基因的各个末端具有一个拷贝的AAV ITR，以允许复制、包装和高效整合到细胞染色体中。在本公开的优选实施方式中，编码补体系统多肽(例如，CFH、FHL1、FHR1、FHR2、FHR3、FHR4或FHR5)或其生物活性片段的转基因序列的长度为约2至5kb(或可选地，转基因可以另外地包含“填充物”或“填充”序列以使两个ITR之间的核酸序列的总大小在2到5kb之间)。或者，编码补体系统多肽(例如，CFH、FHL1、FHR1、FHR2、FHR3、FHR4或FHR5)或其生物活性片段的转基因可以多次由相同的异源序列(例如，，由核糖体通读终止密码子分隔的，或可选地由内部核糖体进入位点或“IRES”分隔的两个补体系统基因的核酸分子)组成，或由几个不同的异源序列(例如，由核糖体通读终止密码子或IRES分隔的不同补体系统成员如FHL1)组成。
本公开的重组AAV载体可以从多种腺相关病毒产生。例如，来自任何AAV血清型的ITR预期在复制、整合、切除和转录机制方面具有相似的结构和功能。AAV血清型的实例包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11和AAV12。在一些实施方式中，rAAV载体从血清型AAV1、AAV2、AAV4、AAV5或AAV8产生。已知这些血清型靶向感光细胞或视网膜色素上皮细胞。在特定的实施方式中，rAAV载体从血清型AAV2产生。在某些实施方式中，AAV血清型包括AAVrh8、AAVrh8R或AAVrh10。还应理解，rAAV载体可以是选自血清型AAV1至AAV12的两种或更多种血清型的嵌合体。可以通过将一种血清型的重组基因组包装到衍生自另一种AAV血清型的衣壳中来改变载体的嗜性。在一些实施方式中，rAAV病毒的ITR可以基于AAV1-12中任一种的ITR，并且可以与选自AAV1-12、AAV-DJ、AAV-DJ8、AAV-DJ9或其他修饰血清型的AAV衣壳组合。在某些实施方式中，任何AAV衣壳血清型可以与本公开的载体一起使用。AAV血清型的实例包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11，AAV12、AAV-DJ、AAV-DJ8、AAV-DJ9、AAVrh8、AAVrh8R或AAVrh10。在某些实施方式中，AAV衣壳血清型是AAV2。
用于组装成载体的所需AAV片段可以包括cap蛋白(包括vp1、vp2、vp3和高变区)，rep蛋白(包括rep78、rep68、rep52和rep40)和编码这些蛋白质的序列。这些片段可以容易地用于多种载体系统和宿主细胞中。此类片段可单独使用，与其他AAV血清型序列或片段结合使用，或与来自其他AAV或非AAV病毒序列的元件结合使用。如本文所用，人工AAV血清型包括但不限于具有非天然存在的衣壳蛋白的AAV。这样的人工衣壳可以通过任何合适的技术使用选择的AAV序列(例如，vpl衣壳蛋白的片段)结合异源序列来产生，所述异源序列可以获自不同的所选择AAV血清型、相同的AAV血清型的非连续部分、非AAV病毒来源或非病毒来源。人工AAV血清型可以是但不限于假型AAV、嵌合AAV衣壳、重组AAV衣壳或“人源化”AAV衣壳。其中一种AAV的衣壳被异源衣壳蛋白替代的假型载体可用于本公开中。在一些实施方式中，AAV是AAV2/5。在另一个实施方式中，AAV是AAV2/8。当对AAV载体进行假型化时，编码各个必需rep蛋白的序列可以由不同的AAV来源(例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7，AAV8)提供。例如，rep78/68序列可以来自AAV2，而rep52/40序列可以来自AAV8。
在一个实施方式中，本公开的载体至少包含编码选择的AAV血清型衣壳(例如，AAV2衣壳或其片段)的序列。在另一个实施方式中，本公开的载体至少包含编码选择的AAV血清型rep蛋白(例如，AAV2 rep蛋白)或其片段的序列。任选地，这样的载体可以同时包含AAV cap和rep蛋白。在其中提供AAV rep和cap两者的载体中，AAV rep和AAV cap序列两者可以是一个血清型起源，例如全部AAV2起源。在某些实施方式中，载体可包含来自不同于提供cap序列的血清型的AAV血清型的rep序列。在一些实施方式中，rep和cap序列是从单独的来源(例如，单独的载体，或者宿主细胞和载体)表达的。在一些实施方式中，这些rep序列在框内与不同AAV血清型的cap序列融合以形成嵌合AAV载体，例如，美国专利号7,282,199中描述的AAV2/8，该专利通过引用并入本文。AAV血清型的实例包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV-DJ、AAV-DJ8、AAV-DJ9、AAVrh8、AAVrh8R或AAVrh10。在一些实施方式中，该cap源自AAV2。
在一些实施方式中，本文公开的任何载体包含间隔区，即插置在启动子和rep基因ATG起始位点之间的DNA序列。在一些实施方式中，间隔区可以是随机的核苷酸序列，或者可选地，其可以编码基因产物，例如标记基因。在一些实施方式中，间隔区可包含通常整合起始/终止和polyA位点的基因。在一些实施方式中，间隔区可以是来自原核生物或真核生物的非编码DNA序列、重复的非编码序列、没有转录控制的编码序列或有转录控制的编码序列。在一些实施方式中，间隔区是噬菌体梯序列或酵母梯序列。在一些实施方式中，间隔区的大小足以减少rep78和rep68基因产物的表达，从而使rep52、rep40和cap基因产物以正常水平表达。因此，在一些实施方式中，间隔区的长度可以在约10bp至约10.0kbp的范围内，优选在约100bp至约8.0kbp的范围内。在一些实施方式中，间隔区的长度小于2kbp。
在某些实施方式中，衣壳被修饰以改善治疗。衣壳可以使用常规分子生物学技术来修饰。在某些实施方式中，衣壳为使免疫原性最小化、具有更好的稳定性和颗粒寿命、有效降解和/或将编码补体系统多肽(例如，CFH、FHL1、FHR1、FHR2、FHR3、FHR4或FHR5)或其生物活性片段的转基因准确递送至细胞核而修饰。在一些实施方式中，修饰或突变是衣壳蛋白中的氨基酸删除、插入、置换或其任何组合。修饰的多肽可包含1、2、3、4、5、直至10个或更多个氨基酸置换和/或删除和/或插入。“删除”可包含单个氨基酸的缺失、小组氨基酸(例如2、3、4或5个氨基酸)的缺失或较大氨基酸区域的缺失，例如特定氨基酸结构域或其他特征的缺失。“插入”可包含单个氨基酸的插入、小组氨基酸(例如2、3、4或5个氨基酸)的插入或较大氨基酸区域的插入，例如特定氨基酸结构域或其它特征。“置换”包括用另一种氨基酸(例如，非野生型氨基酸)替代野生型氨基酸。在一些实施方式中，该另一个(例如，非野生型)或插入的氨基酸是Ala(A)、His(H)、Lys(K)、Phe(F)、Met(M)、Thr(T)、Gln(Q)、Asp(D)或Glu(E)。在一些实施方式中，该另一个(例如，非野生型)或插入的氨基酸是A。在一些实施方式中，该另一个(例如，非野生型)氨基酸是Arg(R)、Asn(N)、Cys(C)、Gly(G)、Ile(I)、Leu(L)、Pro(P)、Ser(S)、Trp(W)、Tyr(Y)或Val(V)。常规或天然存在的氨基酸根据共同的侧链特性分为以下基本组：(1)非极性的：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)极性无电荷：Cys、Ser、Thr、Asn、Gin；(3)酸性的(带负电荷)：Asp、Glu；(4)碱性的(带正电荷)：Lys、Arg；(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；和(6)芳香族的：Trp、Tyr、Phe、His。常规氨基酸包括L或D立体化学。在一些实施方式中，该另一个(例如，非野生型)氨基酸是不同组的成员(例如，芳香族氨基酸置换非极性氨基酸)。多肽的生物学特性的实质性改变通过选择在维持以下方面的作用中显著差异的置换来实现：(a)置换区域中多肽主链的结构，例如，β-折叠或螺旋构象，(b)分子在靶位点处的电荷或疏水性，或(c)侧链的体积。天然存在的残基根据共同的侧链特性分组：(1)非极性的：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)极性无电荷：Cys、Ser、Thr、Asn、Gin；(3)酸性(带负电荷)：Asp、Glu；(4)碱性(带正电荷)：Lys、Arg；(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；和(6)芳香族：Trp、Tyr、Phe、His。在一些实施方式中，该另一个(例如，非野生型)氨基酸是不同组的成员(例如，疏水氨基酸替换亲水性氨基酸、带电氨基酸替换中性氨基酸的、酸性氨基酸替换碱性氨基酸，等)。在一些实施方式中，该另一种(例如，非野生型)氨基酸是相同组的成员(例如，另一种碱性氨基酸、另一种酸性氨基酸、另一种中性氨基酸、另一种带电氨基酸、另一种亲水性氨基酸、另一种疏水性氨基酸、另一种极性氨基酸、另一种芳族氨基酸或另一种脂族氨基酸)。在一些实施方式中，该另一种(例如，非野生型)氨基酸是非常规氨基酸。非常规氨基酸是非天然存在的氨基酸。非常规氨基酸的实例包括但不限于，氨基己二酸、β-丙氨酸、β-氨基丙酸、氨基丁酸、哌啶酸、氨基癸酸、氨基庚酸、氨基异丁酸、氨基庚二酸、瓜氨酸、二氨基丁酸、锁链(赖氨)素、二氨基庚二酸、二氨基丙酸、N-乙基甘氨酸、N-乙基天冬氨酸、羟赖氨酸、别-羟基赖氨酸、羟脯氨酸、异锁链赖氨素、别-异亮氨酸、N-甲基甘氨酸、肌氨酸、N-甲基异亮氨酸、N-甲基缬氨酸、正缬氨酸、正亮氨酸、鸟氨酸(orithine)、4-羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、ε-N,N,N-三甲基赖氨酸、ε-N-乙酰赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰丝氨酸、N-甲酰基甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟基赖氨酸、σ-N-甲基精氨酸和其他相似的氨基酸和氨基酸(例如4-羟脯氨酸)。在一些实施方式中，一个或多个氨基酸置换引入VP1、VP2和VP3中的一个或多个中。一个方面，相对于野生型多肽，修饰的衣壳蛋白包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个保守或非保守置换。在另一方面，本公开的修饰的衣壳多肽包含修饰的序列，其中这样的修饰可以包括保守和非保守置换、缺失和/或添加，并且通常包括与相应的野生型衣壳蛋白共有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少87％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的肽。
在一些实施方式中，可使用任何合适的遗传元件(载体)将重组AAV载体、rep序列、cap序列和产生本公开的rAAV所需的辅助功能递送至包装宿主细胞。在一些实施方式中，编码所有三种衣壳蛋白(例如，VP1、VP2和VP3)的单一核酸在单个载体中递送到包装宿主细胞中。在一些实施方式中，通过两个载体将编码衣壳蛋白的核酸递送到包装宿主细胞中；包含编码两个衣壳蛋白(例如，VP1和VP2)的第一核酸的第一载体，以及包含编码单一衣壳蛋白(例如，VP3)的第二核酸的第二载体。在一些实施方式中，各自包含编码不同衣壳蛋白的核酸的三个载体递送至包装宿主细胞。可以通过任何合适的方法(包括本文所述的那些)递送选择的遗传元件。用于构建本公开的任何实施方式的方法是具有核酸操作技能的技术人员已知的，并且包括遗传工程、重组工程和合成技术。参见，例如，Sambrook等，MolecularCloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,N.Y.。类似地，产生rAAV病毒体的方法是众所周知的，并且合适方法的选择不是对本公开的限制。参见，例如，K.Fisher等人，J.Virol.,70:520-532(1993)和美国专利No.5,478,745。
在一些实施方式中，可以使用三重转染方法(在美国专利号6,001,650中详细描述)产生重组AAV。通常，重组AAV通过用待包装到AAV颗粒中的重组AAV载体(包含转基因)、AAV辅助功能载体和附属功能载体(accessory function vector)转染宿主细胞来产生。AAV辅助功能载体编码“AAV辅助功能”序列(例如rep和cap)，它们反式发挥作用用于生产性AAV复制和衣壳化。优选地，AAV辅助功能载体支持有效的AAV载体产生而不产生任何可检测的野生型AAV病毒体(例如，包含功能性rep和cap基因的AAV病毒体)。在一些实施方式中，适用于本公开的载体可以是pHLP19，其描述于美国专利No.6,001,650中，以及pRep6cap6载体，其描述于美国专利No.6,156,303中，两者的全部内容通过引用引入本文。附属功能载体编码用于AAV依赖于其进行复制的非AAV衍生的病毒和/或细胞功能(例如，“附属功能”)的核苷酸序列。附属功能包括AAV复制所需的那些功能，其包括但不限于，涉及AAV基因转录的激活、阶段特异性AAV mRNA剪接、AAV DNA复制、cap表达产物的合成和AAV衣壳装配的那些部分。基于病毒的附属功能可以源自任何已知的辅助病毒，例如腺病毒、疱疹病毒(除1型单纯疱疹病毒以外)和牛痘病毒。
也可以用向AAV提供辅助功能的载体(例如，辅助载体)转染细胞。提供辅助功能的载体可以提供腺病毒功能，包括例如，E1a、E1b、E2a、E4ORF6。提供这些功能的腺病毒基因的序列可获自任何已知的腺病毒血清型，例如血清型2、3、4、7、12和40，并且还包括本领域已知的任何目前鉴定的人类型。因此，在一些实施方式中，该方法包括用表达一种或多种AAV复制、AAV基因转录和/或AAV包装必要的基因的载体转染细胞。
通过将编码AAV衣壳蛋白或其片段的核酸序列；功能性rep基因或其片段；至少由AAV反向末端重复序列(ITR)和编码补体系统多肽(例如，CFH、FHL1、FHR1、FHR2、FHR3、FHR4或FHR5)或其生物活性片段的转基因组成的小基因；以及足以将小基因包装到AAV衣壳中的辅助功能引入宿主细胞中而产生本公开的rAAV载体。用于将AAV小基因包装至AAV衣壳中所需的组分可以反式提供给宿主细胞。可选地，可以由稳定的宿主细胞提供任何一种或多种所需组分(例如，小基因、rep序列、cap序列和/或辅助功能)，该宿主细胞已经使用本领域技术人员已知的方法工程化以包含一种或多种所需组分。
在一些实施方式中，这种稳定的宿主细胞包含在诱导型启动子的控制下的所需的组分。或者，所需组分可以在组成型启动子的控制下。在下文的适合用于转基因(即，编码补体系统多肽(例如，CFH、FHL1、FHR1、FHR2、FHR3、FHR4或FHR5)或其生物活性片段的核酸)的调控元件的讨论中，本文提供了合适的诱导型和组成型启动子的实例。在另一可选方案中，选择的稳定宿主细胞可包含在组成型启动子控制下的选择组分和在一个或多个诱导型启动子控制下的其他选择组分。例如，可以产生稳定的宿主细胞，其源自293细胞(其包含在组成型启动子控制下的E1辅助功能)，但包含在诱导型启动子控制下的rep和/或cap蛋白。本领域技术人员还可以产生其他稳定的宿主细胞。
产生本公开的rAAV所需的小基因、rep序列、cap序列和辅助功能可以以转移序列的任何遗传元件的形式递送至包装宿主细胞。可以通过本领域已知的任何合适方法来递送所选择的遗传元件。参见，例如，Sambrook等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,NY.。类似地，产生rAAV病毒体的方法是众所周知的，并且合适方法的选择不是对本公开的限制。参见例如，K.Fisher等，1993J.Virol,70:520-532和美国专利5,478,745，以及其它。这些出版物通过引用引入本文。
除非另有说明，本文所述的AAV ITR和其他选择的AAV组分可以容易地选自于任何AAV血清型，包括但不限于，AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV10、AAV11、AAV12、AAV-DJ、AAV-DJ8、AAV-DJ9、AAVrh8、AAVrh8R或AAVrh10或者其他已知和未知的AAV血清型。可以使用本领域技术人员可用的技术容易地从AAV血清型分离这些ITR或其他AAV组分。可以从学术、商业或公共来源(例如，American Type CultureCollection,Manassas,VA)分离或获得这种AAV。可选地，可以通过合成的或其他合适的方式，通过参考文献或诸如例如GenBank，PubMed等的数据库中的公布序列获得AAV序列。
小基因至少由编码补体系统多肽(例如，CFH、FHL1、FHR1、FHR2、FHR3、FHR4或FHR5)或其生物活性片段的转基因(如上所述)及其调控序列，以及5'和3'AAV反向末端重复序列(ITR)组成。在一个理想的实施方式中，使用AAV血清型2的ITR。但是，可以选择来自其他合适血清型的ITR。小基因被包装到衣壳蛋白中并被递送至选定的宿主细胞。
在一些实施方式中，调控序列与编码补体系统多肽(例如，CFH、FHL1、FHR1、FHR2、FHR3、FHR4或FHR5)或其生物活性片段的转基因可操作地连接。调控序列可以包括常规的控制元件，其以允许其在用载体转染或用由本公开产生的病毒感染的细胞中转录、翻译和/或表达的方式与补体系统基因、剪接变体或其片段可操作地连接。如本文所用，“可操作地连接”的序列包括与目的基因连续的表达控制序列和以反式或在一定距离作用以控制目的基因的表达控制序列。表达控制序列包括适当的转录起始、终止、启动子和增强子序列；有效的RNA加工信号，例如剪接和多腺苷酸化(polyA)信号；稳定细胞质mRNA的序列；增强翻译效率的序列(即，Kozak共有序列)；增强蛋白质稳定性的序列；和当需要时，增强编码产物分泌的序列。包括启动子的许多表达控制序列是本领域已知的并且可以被利用。
可用于本公开的构建体中的调控序列还可包含内含子，其理想地位于启动子/增强子序列与基因之间。在一些实施方式中，内含子序列源自SV-40，并且是100bp的小内含子剪接供体/剪接受体，称为SD-SA。另一合适的序列包括土拨鼠肝炎病毒转录后元件。(参见，例如，L.Wang和I.Verma，11999Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,96:3906-3910)。PolyA信号可以源自许多合适的物种，包括但不限于SV-40，人和牛。
在本公开的方法中有用的rAAV的另一调控组分是内部核糖体进入位点(IRES)。IRES序列或其他合适的系统可用于从单个基因转录物产生多于一种的多肽(例如，产生多于一种补体系统多肽)。IRES(或其他合适的序列)用于产生包含超过一条多肽链的蛋白质，或从相同的细胞或在相同的细胞内表达两种不同的蛋白质。示例性的IRES是脊髓灰质炎病毒内部核糖体进入序列，其支持感光细胞、RPE和神经节细胞中的转基因表达。优选地，IRES位于rAAV载体中转基因的3'侧。
在一些实施方式中，编码补体系统多肽(例如，CFH、FHL1、FHR1、FHR2、FHR3、FHR4或FHR5)或其生物活性片段的转基因的表达通过单独的启动子(例如病毒启动子)驱动。在某些实施方式中，适用于AAV载体的任何启动子可以与本公开的载体一起使用。可以从可以在期望的眼细胞中表达选择的转基因的众多组成型或诱导型启动子中选择在rAAV中使用的转基因启动子。合适的启动子的实例如下所述。
在本公开中有用的其他调控序列包含增强子序列。可用于本公开的增强子序列包括1RBP增强子(Nicoud 2007，上文引用)，立即早期巨细胞病毒增强子，一种源自免疫球蛋白基因的增强子，或SV40增强子，在小鼠近端启动子中鉴定的顺式作用元件，等。
这些以及其他常见载体和调控元件的选择是众所周知的，并且许多这样的序列是可用的。参见，例如，Sambrook等，以及其中，例如在第3.18-3.26和16.17-16.27页引用的参考文献以及Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,New York,1989)。
rAAV载体还可包含例如来自腺病毒的另外的序列，其有助于实现用于该载体的所需功能。此类序列包括例如有助于将rAAV载体包装在腺病毒相关病毒颗粒中的那些序列。
rAAV载体还可以包含用于共表达的报道序列，例如但不限于lacZ、GFP、CFP、YFP、RFP、mCherry、tdTomato，等。在一些实施方式中，rAAV载体可以包含选择标记。在一些实施方式中，选择标记是抗生素抗性基因。在一些实施方式中，抗生素抗性基因是氨苄青霉素抗性基因。在一些实施方式中，氨苄青霉素抗性基因是β-内酰胺酶。
在一些实施方式中，rAAV颗粒是ssAAV。在一些实施方式中，rAAV颗粒是自身互补AAV(sc-AAV)(参见，US 2012/0141422，其通过引用引入本文)。自身互补载体包装可以折叠成dsDNA而无需DNA合成或多个载体基因组之间的碱基配对的反向重复基因组。因为scAAV不需要在表达前将单链DNA(ssDNA)基因组转换为双链DNA(dsDNA)，所以它们是更有效的载体。但是，这种效率的代价是损失了载体一半的编码能力，ScAAV可用于小的蛋白质编码基因(最高-55kd)和任何目前可用的基于RNA的疗法。
AAV基因组的单链性质可能比其他任何生物学特征对rAAV载体的表达影响更大。不是依赖于潜在可变的细胞机制为rAAV载体提供互补链，现在已经发现可以通过将两条链包装为单个DNA分子来解决该问题。在本文描述的研究中，在HeLa细胞中观察到了双链体载体比传统rAAV更高的转导效率(5-140倍)。更重要的是，与常规的单链AAV载体不同，DNA复制的抑制剂不影响本发明的双链体载体的转导。另外，与在体内小鼠肝细胞中的rAAV载体相比，本发明的双链体细小病毒载体表现出更快的发作和更高的转基因表达水平。所有这些生物学特性支持一类新的细小病毒载体(递送双链DNA)的产生和表征，这显著促进了基于细小病毒的基因递送系统的不断发展。
总体而言，通过本文所述的研究构建并表征了携带双链基因组的新型细小病毒载体，该双链基因组导致正负极性的共包装链一起束缚在单个分子中。因此，本发明提供了包含细小病毒衣壳(例如，AAV衣壳)和编码异源核苷酸序列的载体基因组的细小病毒颗粒，其中载体基因组是自身互补的，即载体基因组是二聚的反向重复序列。载体基因组优选地约为对应于将被包装入其中的细小病毒衣壳的野生型细小病毒基因组(例如，AAV基因组)的大小，并包含适当的包装信号。本发明进一步提供了上述载体基因组和编码该载体基因组的模板。
在本公开的方法中有用的rAAV载体在PCT公开号WO2015168666和PCT公开号WO2014011210中进一步描述，其内容通过引用合并于此。
在一些实施方式中，本文公开的任何载体能够在靶细胞(例如，RPE或肝细胞)中诱导CFH或FHL的表达与靶细胞中CFH或FHL的内源性表达相比高至少20％、50％、100％、150％、200％、250％、300％、400％、500％、700％、900％、1000％、1100％、1500％或2000％。在一些实施方式中，本文公开的任何载体在靶细胞(例如，RPE或肝细胞)中的表达导致靶细胞中CFH或FHL活性水平高与靶细胞中的内源性CFH或FHL活性水平相比高至少20％、50％、100％、150％、200％、250％、300％、400％、500％、700％、900％、1000％、1100％、1500％或2000％。
补体系统基因
在寻找与年龄相关性黄斑变性有关的致病因子时，流行病学和遗传学研究已经确定了几个补体基因(CFH、C2/CFB、C3、CFI和C9)处或附近的许多AMD常见和稀有等位基因。全基因组关联研究(GWAS)确定了编码CFH的基因上的单核苷酸多态性(SNP)，Y402H。Y402HSNP使AMD发生的风险增加了2到7倍(Klein RJ等Science.2005；308：385-9；Edwards AO等Science.2005；308：421-4；Hageman GS等PNAS.2005；102:7227-32；Haines JL等Science.2005；308:419-21)。另外的GWAS导致鉴定了与晚期AMD相关的CFH基因座上的其他变体(Raychaudhuri S等，Nat Genet.2011；43：1232-6)。总体而言，这些研究已经确定，六个补体基因(CFH、C2/CFB、C3、CFI和C9)附近的变体一起占到AMD遗传风险的近60％(Fritsche LG等，Annu Rev Genomics Hum Genet.2014；15:151-71)。
提供补体系统基因(例如CFH、FHL-1、FHR1、FHR2、FHR3、FHR4或FHR5)、剪接变体(例如FHL1)或其片段作为本公开的重组AAV(rAAV)载体中的转基因。该转基因是与转基因侧翼的载体序列异源的核酸序列，其编码目的多肽、蛋白质或其他产物。核酸编码序列以允许转基因在靶细胞(例如，眼细胞)中转录、翻译和/或表达的方式与调控组分可操作地连接。异源核酸序列(转基因)可以源自任何生物体。在某些实施方式中，转基因源自人。在某些实施方式中，转基因编码补体蛋白的成熟形式。在一些实施方式中，转基因编码包含与SEQ IDNO:33的氨基酸序列至少80％、85％、90％、92％、95％或97％相同的氨基酸序列的多肽或其生物活性片段。在一些实施方式中，转基因编码包含与SEQ ID NO:34的氨基酸序列至少80％、85％、90％、92％、95％或97％相同的氨基酸序列的多肽或其生物活性片段。在某些实施方式中，rAAV载体可以包含一个或多个转基因。
在一些实施方式中，转基因包含超过一个补体系统基因、剪接变体或源自超过一个补体系统基因的片段。这可以使用带有两个或更多个异源序列的单一载体，或者使用两个或更多个各自携带一个或多个异源序列的rAAV载体来实现。在一些实施方式中，除了补体系统基因、剪接变体或其片段之外，rAAV载体还可以编码另外的蛋白质、肽、RNA、酶或催化RNA。理想的RNA分子包括shRNA、tRNA、dsRNA、核糖体RNA、催化RNA和反义RNA。有用的RNA序列的一个实例是在被治疗的受试者中消除靶向的核酸序列的表达的序列。另外的蛋白质、肽、RNA、酶或催化RNA和补体因子可以由带有两个或更多个异源序列的单一载体编码，或使用两个或更多个各自带有一个或多个异源序列的rAAV载体编码。
在某些方面，本公开提供了编码人补体因子H或因子H样1(FHL1)蛋白或其生物活性片段的重组腺相关病毒(rAAV)载体。在某些实施方式中，载体包含与本文公开的编码CFH或CFHL蛋白或其生物活性片段的任何序列至少80％、85％、90％、92％、94％、95％、97％、99％或100％相同的核苷酸序列。在某些实施方式中，载体包含与SEQ ID No：1-3或5中任何一个至少80％、85％、90％、92％、94％、95％、97％、99％或100％相同的核苷酸序列或其生物活性片段。在一些实施方式中，载体包含与SEQ ID NO:1至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、94％、95％、97％、99％或100％相同的核苷酸序列或其生物活性片段。在一些实施方式中，载体包含与SEQ ID NO:2至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、94％、95％、97％、99％或100％相同的核苷酸序列或其生物活性片段。在一些实施方式中，载体包含与SEQ ID NO:3至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、94％、95％、97％、99％或100％相同的核苷酸序列或其生物活性片段。在一些实施方式中，载体包含与SEQ ID NO:5至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、94％、95％、97％、99％或100％相同的核苷酸序列或其生物活性片段。在某些实施方式中，载体包含与SEQ ID NO:1-3或5的核苷酸序列或其片段至少80％相同的核苷酸序列。在某些实施方式中，核苷酸序列与SEQ ID NO:1-3或5的核苷酸序列或其片段至少90％相同。在某些实施方式中，核苷酸序列与SEQ ID NO:1-3或5的核苷酸序列或其片段至少95％相同。在某些实施方式中，核苷酸序列是SEQ ID NO:1-3或5的序列或其片段。在某些实施方式中，载体编码包含至少四个CCP结构域的CFH或FHL1蛋白或其生物活性片段。在某些实施方式中，载体编码包含至少五个CCP结构域的CFH或FHL1蛋白或其生物活性片段。在某些实施方式中，载体编码包含至少六个CCP结构域的CFH或FHL1蛋白或其生物活性片段。在某些实施方式中，载体编码包含至少七个CCP结构域的CFH或FHL1蛋白或其生物活性片段。在某些实施方式中，载体编码包含至少三个CCP结构域的FHL1蛋白或其生物活性片段。在某些实施方式中，载体编码包含至少CFH的CCP 1-2的CFH或FHL1蛋白或其生物活性片段。在某些实施方式中，载体编码包含至少CFH的CCP 1-4的CFH的生物活性片段。在某些实施方式中，载体编码包含至少CFH的CCP 19-20的CFH或FHL1蛋白或其生物活性片段。Schmidt C O,Herbert A P,Kavanagh D,Gandy C,Fenton C J,Blaum B S,Lyon M,Uhrin D,Barlow P N.J Immunol,2008,181:2610-9。在某些实施方式中，载体编码包含H402多态性的CFH或FHL1蛋白或其生物活性片段。在某些实施方式中，载体编码包含V62多态性的CFH或FHL1蛋白或其生物活性片段。在某些实施方式中，CFH或FHL1蛋白或其生物活性片段包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。在某些实施方式中，SEQ ID NO:4的氨基酸序列是CFH或FHL1蛋白的C末端序列。在某些实施方式中，CFH或FHL1蛋白或其生物活性片段能够跨布鲁赫膜扩散。在某些实施方式中，CFH或FHL1蛋白或其生物活性片段能够结合C3b。在某些实施方式中，CFH或FHL1蛋白或其生物活性片段能够促进C3b的分解。
在某些实施方式中，载体包含与SEQ ID NO:7、9、11、13、15、17、19或21-30的任何一个至少80％、85％、90％、92％、94％、95％、97％、99％或100％相同的核苷酸序列或其生物活性片段。
在SEQ ID NO:1-3或5中示出了转基因的示例性序列。在一些实施方式中，本公开的转基因包含SEQ ID NO:1所示的核酸序列。在一些实施方式中，本公开的转基因包含SEQID NO:2所示的核酸序列。在一些实施方式中，本公开的转基因包含SEQ ID NO:3所示的核酸序列。在一些实施方式中，本公开的转基因包含SEQ ID NO:5所示的核酸序列。在一些实施方式中，本公开的转基因包含这些序列的变体，其中此类变体可以包含错义突变、无义突变、重复、缺失和/或添加，并且通常包含与SEQ ID NO:1-3或5所示的特定核酸序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少87％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的多核苷酸。本领域普通技术人员应理解，与该核酸互补的核酸序列以及该核酸的变体也在本公开的范围内。在进一步的实施方式中，本公开的核酸序列可以与异源核苷酸序列分离、重组和/或融合。在一些实施方式中，本文公开的任何核苷酸(例如，SEQ ID No:1-3或5)是密码子优化的(例如，对于人表达密码子优化的)。
一个方面，转基因编码相对于野生型多肽具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸置换、缺失和/或添加的补体系统多肽。在一些实施方式中，转基因编码相对于野生型多肽具有1、2、3、4或5个氨基酸缺失的补体系统多肽。在一些实施方式中，转基因编码相对于野生型多肽具有1、2、3、4或5个氨基酸置换的多肽。在一些实施方式中，转基因编码相对于野生型多肽具有1、2、3、4或5个氨基酸插入的多肽。与本文公开的任何多核苷酸序列互补的多核苷酸也被本公开涵盖。多核苷酸可以是单链的(编码或反义)或双链的，并且可以是DNA(基因组或合成的)、cDNA或RNA分子。RNA分子包括mRNA分子。另外的编码或非编码序列可以，但不是必需存在于本公开的多核苷酸内，并且多核苷酸可以，但不是必需与其他分子和/或支持材料连接。
如果两个序列中的核苷酸或氨基酸序列如下所述为最大对应性比对时是相同的，则该两个多核苷酸或多肽序列称为“相同的”。通常通过在比较窗口上比较序列以鉴定和比较局部的序列相似性区域来进行两个序列之间的比较。如本文所用，“比较窗口”是指至少约20个，通常30至约75或40至约50个连续位置的片段，其中在两个序列最佳比对后，可以将一个序列与相同数目的连续位置的参考序列进行比较。
可以利用生物信息学软件
Figure BDA0002522611500000341
套件中的
Figure BDA0002522611500000342
程序(
Figure BDA0002522611500000343
Inc.,Madison,WI)使用默认参数进行用于比较的序列的最佳比对。该程序实施以下参考文献中描述的几种比对方案：Dayhoff,M.O.,1978,A model ofevolutionary change in proteins-Matrices for detecting distantrelationships.In Dayhoff,M.O.(ed.)Atlas of Protein Sequence and Structure,National Biomedical Research Foundation,Washington DC Vol.5,Suppl.3,pp.345-358；Hein J.,1990,Unified Approach to Alignment and Phylogenes pp.626-645Methods in Enzymology vol.183,Academic Press,Inc.,San Diego,CA；Higgins,D.G.和Sharp,P.M.,1989,CABIOS 5:151-153；Myers,E.W.和Muller W.,1988,CABIOS 4:11-17；Robinson,E.D.,1971,Comb.Theor.11:105；Santou,N.,Nes,M.,1987,Mol.Biol.Evol.4:406-425；Sneath,P.H.A.和Sokal,R.R.,1973,Numerical Taxonomy thePrinciples and Practice of Numerical Taxonomy,Freeman Press,San Francisco,CA；Wilbur,W.J.and Lipman,D.J.,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:726-730。
优选地，通过在至少20个位置的比较窗口上比较两个最佳比对的序列来确定“序列同一性的百分比”，其中比较窗口中的多核苷酸或多肽序列的部分与参考序列(其不包含添加或缺失)相比可以包含20％或更低，通常为5％至15％，或10％至12％的添加或缺失(即空位)用于两个序列的最佳比对。通过测定两个序列中相同核酸碱基或氨基酸残基出现的位置数以产生匹配位置数，将匹配位置数除以参考序列中的总位置数(即窗口大小)并将结果乘以100以得出序列同一性的百分比来计算百分比。转基因或变体也可以或者可选地与天然基因或其部分或互补序列基本上同源。这样的多核苷酸变体能够在中等严格条件下与编码补体因子(或互补序列)的天然存在的DNA序列杂交。合适的“中等严格条件”包括在5XSSC，0.5％SDS，1.0mM EDTA(pH 8.0)的溶液中预洗涤；在50℃-65℃，5X SSC下杂交过夜；然后在65℃下用含0.1％SDS的2X、0.5X和0.2X SSC分别洗涤两次，持续20分钟。如本文所用，“高严格条件”或“高严格性条件”是以下那些：(1)采用低离子强度和高温进行洗涤，例如0.015M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1％十二烷基硫酸钠，50℃；(2)在杂交过程中使用变性剂，例如甲酰胺，例如50％(v/v)甲酰胺与0.1％牛血清白蛋白/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸钠缓冲液pH 6.5与750mM氯化钠，75mM柠檬酸钠，42℃；或(3)使用50％甲酰胺，5x SSC(0.75M NaCl，0.075M柠檬酸钠)，50mM磷酸钠(pH 6.8)，0.1％焦磷酸钠，5xDenhardt溶液，超声处理的鲑精DNA(50μg/毫升)、0.1％SDS和10％硫酸右旋糖酐，42℃，在42℃下0.2x SSC(氯化钠/柠檬酸钠)和55℃下50％甲酰胺中洗涤，然后在55℃下进行由含EDTA的0.1x SSC组成的高严格性洗涤。本领域技术人员将认识到如何按照需要调节温度、离子强度等以适应诸如探针长度等的因素。
本领域普通技术人员将理解，由于遗传密码的简并性，存在许多编码如本文所述的多肽的核苷酸序列。这些多核苷酸中的一些与任何天然基因的核苷酸序列具有最小的同源性。但是，本公开特别考虑了由于密码子使用的差异而变化的多核苷酸。此外，包含本文提供的多核苷酸序列的基因的等位基因在本公开的范围内。等位基因是由于一个或多个突变(例如，核苷酸的缺失、添加和/或取代)而改变的内源基因。所得的mRNA和蛋白质可以但不是必需具有改变的结构或功能。等位基因可以使用标准技术(例如杂交、扩增和/或数据库序列比较)鉴定。
可以使用化学合成、重组方法或PCR获得本公开的核酸/多核苷酸。化学多核苷酸合成的方法是本领域众所周知的，且在此无需详细描述。本领域技术人员可以使用本文提供的序列和商业DNA合成仪来产生所需的DNA序列。在其他实施方式中，本公开的核酸还包含在高度严格的条件下与SEQ ID NO:1、2、3和5所示的核苷酸序列或其互补序列杂交的核苷酸序列。本领域普通技术人员将容易理解，可以改变促进DNA杂交的适当严格性条件。例如，可以在约45℃下6.0x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)进行杂交，然后在50℃下进行2.0x SSC的洗涤。例如，洗涤步骤中的盐浓度可以从50℃下约2.0x SSC的低严格性到50℃下约0.2xSSC的高严格性选择。另外，洗涤步骤中的温度可从室温(约22℃)下的低严格性条件提高到约65℃下的高严格性条件。温度和盐两者都可以改变，或者温度或盐浓度可以保持恒定而其他变量改变。在一个实施方式中，本公开提供了在室温下6×SSC的低严格性条件下杂交，然后在室温下2×SSC下洗涤的核酸。
由于遗传密码的简并性而不同的分离的核酸也在本公开的范围内。例如，多个氨基酸通过超过一个三联体命名。指定相同氨基酸的密码子或同义词(例如CAU和CAC是组氨酸的同义词)可能导致“沉默”突变，其不影响蛋白质的氨基酸序列。本领域技术人员将理解，由于天然的等位基因变异，编码特定蛋白质的核酸的一个或多个核苷酸(最多约3-5％的核苷酸)的这些变异可能存在于给定物种的成员之间。任何和所有这样的核苷酸变异和所产生的氨基酸多态性在本公开的范围内。
本公开进一步提供了与具有SEQ ID NO:1、2、3和5所示的核苷酸序列的多核苷酸，或与具有作为上述序列的互补序列的核苷酸序列的多核苷酸分子杂交的寡核苷酸。此类寡核苷酸的长度为至少约10个核苷酸，并且优选地长度为约15至约30个核苷酸，并且在高度严格条件下与上述多核苷酸分子之一杂交，即对于大约14个碱基的寡核苷酸在大约37℃下6×SSC/0.5％焦磷酸钠中洗涤，对于大约17个碱基的寡核苷酸在大约48℃下，对于大约20个碱基的寡核苷酸在大约55℃下，和对于大约23个碱基的寡核苷酸在大约60℃下。在优选的实施方式中，寡核苷酸与上述多核苷酸分子之一的一部分互补。这些寡核苷酸可用于多种目的，包括编码或用作可用于基因调控的反义分子，或者用作扩增编码补体系统的多核苷酸分子的引物。
在另一个实施方式中，可用于本文的转基因包括报告子序列，其在表达时产生可检测的信号。此类报告子序列包括但不限于编码β-内酰胺酶、β-半乳糖苷酶(LacZ)、碱性磷酸酶、胸苷激酶、绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、荧光素酶、膜结合蛋白(包括例如CD2、CD4、CD8)、流行性感冒血凝素蛋白和本领域熟知的其他蛋白(针对它们的高亲和力抗体存在或可以通过常规方法产生)，以及包含与尤其来自血凝素或Myc的抗原标签结构域适当融合的膜结合蛋白的融合蛋白的DNA序列。当这些编码序列与驱动其表达的调控元件相关联时，它们提供通过常规手段可检测的信号，包括酶学、放射照相、比色测定、荧光或其他光谱学测定，荧光激活细胞分选测定和免疫测定，包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫分析(RIA)和免疫组织化学。例如，在标志物序列是LacZ基因的情况下，携带信号的载体的存在通过β-半乳糖苷酶活性的分析来检测。当转基因是绿色荧光蛋白或荧光素酶时，携带信号的载体可以通过在发光计中的颜色或光产生来目视测量。
补体系统基因或其片段(例如，编码CFH、FHL1、FHR1、FHR2、FHR3、FHR4或FHR5的基因)可用于纠正或缓解基因缺陷，其可包括其中正常补体系统基因以低于正常水平表达的缺陷或其中不表达功能补体系统基因产物的缺陷。在一些实施方式中，转基因序列编码单个补体系统蛋白或其生物活性片段。本公开进一步包括使用多个转基因，例如，编码两个或更多个补体系统多肽或其生物活性片段的转基因。在某些情况下，可以使用不同的转基因来编码不同的补体蛋白或其生物活性片段(例如，CFH、FHL1、FHR1、FHR2、FHR3、FHR4或FHR5)。或者，不同的补体蛋白(例如，CFH、FHL1、FHR1、FHR2、FHR3、FHR4或FHR5)或其生物活性片段可以由相同的转基因编码。在这种情况下，单一转基因包括编码各个补体蛋白(例如，CFH、FHL1、FHR1、FHR2、FHR3、FHR4或FHR5)或其生物活性片段的DNA，其中各个蛋白质或其功能片段的DNA通过内部核酶进入位点(IRES)分隔。当编码各个亚基的DNA的尺寸较小时，例如，编码亚基的DNA和IRES的总尺寸小于5千碱基时，这是理想的。作为IRES的替代，DNA可以通过编码2A肽的序列分隔，该2A肽在翻译后事件中自我切割。参见，例如，MX.Donnelly等，J.Gen.Virol,78(Pt 1):13-21(Jan 1997)；Furler,S.等,Gene Ther.,8(11):864-873(June 2001)；Klump H.等,Gene Ther.,8(10):811-817(May 2001)。这种2A肽明显小于IRES，使其非常适合于在空间是限制因素的情况下使用。
调控序列包括常规控制元件，其以允许其在用载体转染或感染如本文所述产生的病毒的细胞中转录、翻译和/或表达的方式与编码补体系统多肽(例如，CFH、FHL1、FHR1、FHR2、FHR3、FHR4或FHR5)或其生物活性片段的转基因可操作地连接。如本文所用，“可操作地连接”的序列包括与目的基因毗连的表达控制序列和以反式或以一定距离发挥作用以控制目的基因的表达控制序列。
表达控制序列包括适当的转录起始、终止、启动子和增强子序列；有效的RNA加工信号，例如剪接和多腺苷酸化(polyA)信号；稳定细胞质mRNA的序列；增强翻译效率的序列(即，Kozak共有序列)；增强蛋白质稳定性的序列；和当需要时，增强编码产物分泌的序列。许多表达控制序列(包括启动子)是本领域已知的并且可以被利用。
可用于本文提供的构建体中的调控序列还可包含内含子，其理想地位于启动子/增强子序列与基因之间。一种理想的内含子序列源自SV-40，并且是100bp的小内含子剪接供体/剪接受体，称为SD-SA。在一些实施方式中，内含子包含SEQ ID NO:10的核苷酸序列，或密码子优化的或其片段。另一个合适的序列包括土拨鼠肝炎病毒转录后元件。(参见，例如，L.Wang和I.Verma，11999Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,96:3906-3910)。PolyA信号可以源自许多合适的物种，包括但不限于SV-40、人和牛。
在本文描述的方法中有用的rAAV的另一调控成分是内部核糖体进入位点(IRES)。可以使用IRES序列或其他合适的系统从单一基因转录物产生超过一个多肽。IRES(或其他合适的序列)用于产生包含超过一个多肽链的蛋白质，或从相同的细胞或在相同的细胞内表达两种不同的蛋白质。示例性的IRES是脊髓灰质炎病毒内部核糖体进入序列，其支持在感光细胞、RPE和神经节细胞中的转基因表达。优选地，IRES位于rAAV载体中转基因的3'侧。
在一个实施方式中，AAV包含启动子(或启动子的功能性片段)。可以从可以在期望的靶细胞中表达选择的转基因的大量启动子中选择用于rAAV中的启动子。在一个实施方式中，靶细胞是眼细胞。在一些实施方式中，靶细胞是神经元细胞(即，载体靶向神经元细胞)。然而，在特定的实施方式中，靶细胞是非神经元细胞(即，载体不靶向神经元细胞)。在一些实施方式中，靶细胞是神经胶质细胞、穆勒细胞和/或视网膜色素上皮(RPE)细胞。该启动子可以源自任何物种，包括人类。在一个实施方式中，启动子是“细胞特异性的”。术语“细胞特异性的”是指为重组载体选择的特定启动子可以指导所选择的转基因在特定细胞或眼细胞类型中的表达。在一个实施方式中，启动子对转基因在感光细胞中的表达是特异性的。在另一个实施方式中，启动子对于在视杆细胞和/或视锥细胞中表达是特异性的。在另一个实施方式中，启动子对于转基因在RPE细胞中的表达是特异性的。在另一个实施方式中，启动子对于转基因在神经节细胞中的表达是特异性的。在另一个实施方式中，启动子对于转基因在穆勒细胞中的表达是特异性的。在另一个实施方式中，启动子对于转基因在双极细胞中的表达是特异性的。在另一个实施方式中，启动子对于转基因在ON-双极细胞中的表达是特异性的。在一个实施方式中，该启动子是代谢型谷氨酸受体6(mGluR6)启动子(参见，Vardi等，mGluR6 Transcripts in Non-neuronal Tissues,J Histochem Cytochem.2011December；59(12):1076-1086，其通过引用引入本文)。在另一个实施方式中，启动子是增强子连接的mGluR6启动子。在另一个实施方式中，启动子对于转基因在OFF-双极细胞中的表达是特异性的。在另一个实施方式中，启动子对于转基因在水平细胞中的表达是特异性的。在另一个实施方式中，该启动子对于转基因无长突细胞中的表达是特异性的。在另一个实施方式中，转基因在任何上述眼细胞中表达。在另一个实施方式中，启动子是人G蛋白偶联受体蛋白激酶1(GRK1)启动子(Genbank登录号AY327580)。在另一个实施方式中，启动子是人感光细胞间维生素A类结合蛋白近端(IRBP)启动子。
在一些实施方式中，由于AAV载体的大小限制，启动子是小尺寸的，例如低于1000bp。在一些实施方式中，启动子的尺寸小于1000、900、800、700、600、500、400或300bp。在特定的实施方式中，启动子低于400bp。在一些实施方式中，启动子是选自CRALBP(RLBP)、EF1a、HSP70、AAT1、ALB、PCK1、CAG、RPE65、MECP或sCBA启动子的启动子。在一些实施方式中，启动子包含与SEQ ID NO:6、8、12、14、16、18、20、31、32或36中的任何一个或者其密码子优化的和/或其片段具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方式中，启动子包含SEQ ID NO:6、8、12、14、16、18、20、31、32或36中的任何一个或者其密码子优化的和/或其片段的核苷酸序列。在一些实施方式中，启动子与眼中的强表达相关。在一些实施方式中，启动子是CRALBP或RPE65启动子(例如，具有SEQ IDNO:6或32的核苷酸序列的启动子)。在一些实施方式中，启动子与肝脏中的强表达相关。在一些实施方式中，启动子是AAT1、ALB或PCK1启动子(例如，具有SEQ ID NO:16、18或20的核苷酸序列的启动子)。在一些实施方式中，如果要在AAV载体中表达的基因是CFH或CFHL(例如，包含SEQ ID NO:1-3或5中的任何一个的核苷酸序列或者其密码子优化的和/或其片段的基因)，则启动子尺寸小于1000、900、800、700、600、500、400或300bp。在一些实施方式中，如果要在AAV载体中表达的基因是CFH或CFHL(例如，包含SEQ ID NO:1-3或5中的任何一个的核苷酸序列或者其密码子优化和/或其片段的基因)，则启动子是选自CRALBP、EF1a、HSP70或sCBA启动子的启动子。在一些实施方式中，如果要在AAV载体中表达的基因是CFH或CFHL(例如，包含SEQ ID NO:1-3或5中的任何一个的核苷酸序列或者其密码子优化和/或其片段的基因)，则启动子包含SEQ ID NO:6、8、12、14、16、18、20、31、32或36中任何一个的核苷酸序列或者其密码子优化和/或其片段。在一些实施方式中，本文公开的任何启动子与病毒内含子(例如SV40i内含子)偶联。
在另一个实施方式中，启动子是用于待表达基因的天然启动子。有用的启动子包括但不限于，视杆视蛋白启动子、红-绿视蛋白启动子、蓝视蛋白启动子、cGMP-β-磷酸二酯酶启动子、小鼠视蛋白启动子(上文引用的Beltran等，2010)、视紫质启动子(Mussolino等，Gene Ther,July 2011,18(7):637-45)；视锥转导蛋白的α亚基(Morrissey等，BMC Dev,Biol,Jan 2011,11:3)；β磷酸二酯酶(PDE)启动子；色素性视网膜炎(RP1)启动子(Nicoud等，J.Gene Med,Dec 2007,9(12):1015-23)；NXNL2/NXNL1启动子(Lambard等，PLoS One,Oct.2010,5(10):el3025)、RPE65启动子；视网膜变性慢/外周蛋白2(Rds/perph2)启动子(Cai等，Exp Eye Res.2010 Aug；91(2):186-94)；以及VMD2启动子(Kachi等，Human GeneTherapy,2009(20:31-9))。这些文件的每一个都通过引用引入本文。在一个实施方式中，由于AAV载体的尺寸限制，启动子是小尺寸的，低于1000bp。在另一个实施方式中，启动子小于400bp。
在某些实施方式中，适用于AAV载体中的任何启动子可以与本公开的载体一起使用。合适的启动子的实例包括组成型启动子，例如CMV启动子(任选地具有CMV增强子)、RSV启动子(任选地具有RSV增强子)、SV40启动子、MoMLV启动子、CB启动子、二氢叶酸还原酶启动子、鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子、CBA/CAG启动子以及与CBA启动子偶联的立即早期CMV增强子，或EF1a启动子等。在一些实施方式中，利用细胞或组织特异性的启动子(例如，视杆、视锥或神经节来源的启动子)。在某些实施方式中，启动子足够小以与公开的构建体相容，例如CB启动子。优选地，启动子是组成型启动子。在另一个实施方式中，启动子是细胞特异性的。术语“细胞特异性”是指为重组载体选择的特定启动子可以指导所选择的转基因在特定眼细胞类型中的表达。在一个实施方式中，启动子对转基因在感光细胞中的表达是特异性的。在另一个实施方式中，启动子对于在视杆和视锥中的表达是特异性的。在另一个实施方式中，启动子对于在视杆中的表达是特异性的。在另一个实施方式中，启动子对于在视锥中的表达是特异性的。在另一个实施方式中，启动子对于转基因在RPE细胞中的表达是特异性的。在另一个实施方式中，转基因在任何上述眼细胞中表达。
其他有用的启动子包括转录因子启动子，包括但不限于，用于神经视网膜亮氨酸拉链(Nrl)、光感受器特异性核受体Nr2e3和碱性亮氨酸拉链(bZIP)的启动子。在一个实施方式中，由于AAV载体的尺寸限制，启动子是小尺寸的，低于1000bp。在另一个实施方式中，启动子小于400bp。
本文中可用的其他调控序列包括增强子序列。本文中可用的增强子序列包括IRBP增强子(Nicoud 2007，上文引用)、立即早期巨细胞病毒增强子(一种源自免疫球蛋白基因的增强子)或SV40增强子(在小鼠近端启动子中鉴定的顺式作用元件)等。
这些和其他常见的载体和调控元件的选择是常规的，并且许多这样的序列是可用的。参见，例如，Sambrook等，及其中，例如在第3.18-3.26页和16.17-16.27页引用的参考文献，以及Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,NewYork,1989)。应当理解，并非所有的载体和表达控制序列同样好地发挥功能以表达本文所述的所有转基因。然而，本领域技术人员可以在这些和其他表达控制序列中进行选择以产生本公开的rAAV载体。
rAAV载体的产生
用于产生rAAV载体的许多方法在本领域中是已知的，包括转染、稳定的细胞系产生以及传染性杂合病毒产生系统，其包括腺病毒-AAV杂合体、疱疹病毒-AAV杂合体(Conway，JE等，(1997).Virology 71(11):8780-8789)和杆状病毒AAV杂合体。用于产生rAAV病毒颗粒的rAAV生产培养物都需要；1)在杆状病毒产生系统的情况下，合适的宿主细胞，包括例如人来源的细胞系，例如HeLa、A549或293细胞，或昆虫来源的细胞系，例如SF-9；2)合适的辅助病毒功能，其由野生型或突变型腺病毒(例如温度敏感性腺病毒)、疱疹病毒、杆状病毒或提供辅助功能的质粒构建体提供；3)AAV rep和cap基因及基因产物；4)侧接至少一个AAV ITR序列的转基因(例如，编码补体系统多肽(例如，CFH、FHL1、FHR1、FHR2、FHR3、FHR4或FHR5)或其生物活性片段的转基因)；和5)支持rAAV产生的合适的培养基和培养基组分。本领域已知的合适培养基可以用于产生rAAV载体。这些培养基包括但不限于由HycloneLaboratories and JRH生产的培养基，包括改良的Eagle培养基(MEM)、Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)、定制制剂，如美国专利号6,566,118中所描述的那些，以及如美国专利号6,723,551中所描述的Sf-900 II SFM培养基，其每一个均通过引用整体引入本文，特别是关于用于产生重组AAV载体的定制培养基制剂。
可以使用本领域已知的方法来产生rAAV颗粒。参见，例如，美国专利号6,566,118；6,989,264；和6,995,006。在实施本公开中，用于产生rAAV颗粒的宿主细胞包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、微生物和酵母。宿主细胞也可以是包装细胞，其中AAV rep和cap基因稳定地维持在宿主细胞或生产细胞中，其中AAV载体基因组被稳定地维持。示例性包装和生产细胞源自293、A549或HeLa细胞。使用本领域已知的标准技术纯化和配制AAV载体。
重组AAV颗粒通过用含有rAAV基因组的质粒(顺式质粒)(其包含145个核苷酸长的AAV ITR侧邻的转基因)和一个反式表达AAV rep和CAP基因的单独构建体转染生产细胞而产生。另外，腺病毒辅助因子例如E1A、E1B、E2A、E4ORF6和VA RNA等可以通过腺病毒感染或通过将提供腺病毒辅助基因的第三质粒转染到生产细胞中来提供。生产细胞可以是HEK293细胞。通过容易获得的技术(参见，例如，美国专利号5,872,005)，可以容易地完成适于产生腺相关病毒载体的包装细胞系。提供的辅助因子根据所使用的生产细胞以及生产细胞是否已经携带这些辅助因子的一些而变化。
在一些实施方式中，rAAV颗粒可以通过三重转染方法产生，例如下文提供的示例性三重转染方法。简而言之，可以将包含rep基因和衣壳基因的质粒与辅助腺病毒质粒一起转染(例如，使用磷酸钙方法)到细胞系(例如，HEK-293细胞)中，并且可以收集病毒并任选地纯化。
在一些实施方式中，rAAV颗粒可以通过生产细胞系方法产生，例如下文提供的示例性生产细胞系方法(也参见在Martin等，(2013)Human Gene Therapy Methods 24:253-269中引用的)。简而言之，可以用包含rep基因、衣壳基因和启动子-转基因序列的质粒稳定转染细胞系(例如，HeLa细胞系)。可以筛选细胞系以选择用于产生rAAV的先导克隆，其然后可以扩增到生产型生物反应器中，并用作为辅助者的腺病毒(例如，野生型腺病毒)感染以启动rAAV的产生。随后可以收获病毒，腺病毒可以灭活(例如，通过热)和/或去除，和rAAV颗粒可以纯化。
在一些方面，提供了用于产生任何本文公开的rAAV颗粒的方法，该方法包括(a)在产生rAAV颗粒的条件下培养宿主细胞，其中所述宿主细胞包含(i)一个或多个AAV包装基因，其中各个所述AAV包装基因编码AAV复制和/或衣壳化蛋白；(ii)rAAV前载体，其包含侧接至少一个AAV ITR编码治疗性多肽的核酸和/或本文所述的核酸，和(iii)AAV辅助功能；和(b)回收通过宿主细胞产生的rAAV颗粒。在一些实施方式中，所述至少一个AAV ITR选自是AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV DJ、山羊AAV、牛AAV或小鼠AAV等的AAV ITR。在一些实施方式中，衣壳化蛋白是AAV2衣壳化蛋白。
本公开的合适的rAAV生产培养基可以补充有0.5-20(v/v或w/v)水平的血清或源自血清的重组蛋白。可选地，如本领域中已知的，rAAV载体可以在无血清的条件下产生，其也可以被称为没有动物源产物的培养基。本领域普通技术人员可以理解，设计用于支持rAAV载体产生的商业或定制培养基也可以补充本领域已知的一种或多种细胞培养组分，包括但不限于葡萄糖、维生素、氨基酸和/或生长因子，以增加生产培养物中rAAV的滴度。
rAAV生产培养物可以在适合所利用的特定宿主细胞的多种条件下(在宽温度范围内，用于变化的时间长度等)生长。如本领域已知的，rAAV生产培养物包括可以在合适的粘附依赖性容器例如滚瓶、中空纤维过滤器、微载体和填充床或流化床生物反应器中培养的粘附依赖性培养物。rAAV载体生产培养物还可以包括悬浮适应的宿主细胞，例如HeLa、293和SF-9细胞，其可以通过多种方式包括例如旋转瓶、搅拌槽生物反应器和一次性系统如波浪袋系统(Wave bag system)进行培养。
可以通过裂解生产培养物的宿主细胞或通过从生产培养物收获用过的培养基来从rAAV生产培养物收获本公开的rAAV载体颗粒，条件是细胞在本领域已知的条件下培养以引起rAAV颗粒从完整细胞释放到培养基中，如美国专利号6,566,118中更充分描述的。裂解细胞的合适方法在本领域中也是已知的，并且包括例如，多个冷冻/解冻循环、超声处理、微流化和化学物质例如去污剂和/或蛋白酶的处理。
在进一步的实施方式中，纯化rAAV颗粒。如本文所用，术语“纯化的”包括不含至少一些其中rAAV颗粒天然存在或最初由其制备的情况下可能存在的其他组分的rAAV颗粒的制剂。因此，例如，可以使用纯化技术来制备分离的rAAV颗粒以从来源混合物(例如，培养物裂解物或生产培养物上清液)富集它。可以通过多种方式来测量富集，例如，通过溶液中存在的DNase抗性颗粒(DRP)或基因组拷贝(gc)的比例，或通过传染性来测量，或者其可以相对于在来源混合物中存在的第二潜在干扰物质如污染物(包含生产培养物污染物或过程中污染物，包括辅助病毒、培养基成分等)来测量。
在一些实施方式中，rAAV生产培养物收获物澄清以去除宿主细胞碎片。在一些实施方式中，通过一系列深度过滤器进行过滤来澄清生产培养物收获物，所述深度过滤器包括，例如等级DOHC Millipore Millistak+HC Pod过滤器、等级A1HC Millipore Millistak+HC Pod过滤器和0.2μm过滤器Opticap XL 10Millipore Express SHC亲水膜过滤器。也可以通过本领域已知的多种其他标准技术来实现澄清，例如，离心或通过本领域已知的0.2μm或更大孔径的任何乙酸纤维素过滤器的过滤。
在一些实施方式中，rAAV生产培养物收获物进一步用
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处理以消化生产培养物中存在的任何高分子量DNA。在一些实施方式中，在本领域已知的标准条件下进行
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消化，包括例如，在从室温至37℃的温度下，1-2.5单位/ml的
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的终浓度，持续30分钟到几个小时的时间。
可以使用以下一个或多个纯化步骤分离或纯化rAAV颗粒：平衡离心；流通式阴离子交换过滤；用于浓缩rAAV颗粒的切向流过滤(TFF)；通过磷灰石色谱的rAAV捕获；辅助病毒的热灭活；通过疏水相互作用色谱的rAAV捕获；通过尺寸排阻色谱法(SEC)的缓冲液交换；纳米过滤；以及通过阴离子交换色谱、阳离子交换色谱或亲和色谱的rAAV捕获。这些步骤可以单独使用，以各种组合使用或以不同的顺序使用。在一些实施方式中，该方法包含如下所述顺序的所有步骤。纯化rAAV颗粒的方法可见于，例如，Xiao等，(1998)Journal ofVirology 72:2224-2232；美国专利号6,989,264和8,137,948；以及WO 2010/148143。
药物组合物
本文还提供了包含rAAV颗粒的药物组合物，所述rAAV颗粒包含编码补体系统多肽(例如，CFH、FHL1、FHR1、FHR2、FHR3、FHR4或FHR5)或其生物活性片段的转基因和/或治疗性核酸，以及药学上可接受的载体。所述药物组合物可以适用于本文所述的任何施用方式；例如，通过玻璃体内施用。
在一些实施方式中，组合物包含加工(例如，切割)由rAAV中的转基因编码的补体系统多肽的多肽(或编码多肽的核酸)。但是，在特定的实施方式中，组合物不包含加工(例如，切割)由rAAV中的转基因编码的补体系统多肽的多肽(或编码多肽的核酸)。
用于视网膜疾病(例如LCA、色素性视网膜炎和年龄相关性黄斑变性)的基因治疗方案要求将载体局部递送至视网膜中的细胞。作为在这些疾病中的治疗靶标的细胞是视网膜中的感光细胞或神经感觉视网膜下的RPE细胞。向这些细胞递送基因治疗载体需要注射到视网膜和RPE之间的视网膜下间隙中。在一些实施方式中，本公开提供了将编码补体系统多肽(例如，CFH、FHL1、FHR1、FHR2、FHR3、FHR4或FHR5)或其生物活性片段的rAAV基因治疗载体递送至视网膜细胞的方法。
在一些实施方式中，包含本文所述的rAAV和药学上可接受的载体的药物组合物适合于施用于人类受试者。这样的载体是本领域众所周知的(参见，例如，Remington'sPharmaceutical Sciences，第15版，1035-1038页和1570-1580页)。在一些实施方式中，包含本文所述的rAAV和药学上可接受的载体的药物组合物适合于眼部注射。在一些实施方式中，药物组合物适合于玻璃体内注射。在一些实施方式中，药物组合物适合于视网膜下递送。这样的药学上可接受的载体可以是无菌液体，例如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些油，例如花生油、大豆油、矿物油等。盐水溶液和葡萄糖水溶液、聚乙二醇(PEG)和甘油溶液也可以用作液体载体，特别是用于可注射溶液。药物组合物可进一步包含另外的成分，例如防腐剂、缓冲剂、张度剂、抗氧化剂和稳定剂、非离子润湿剂或澄清剂、增粘剂等。本文所述的药物组合物可以单一单位剂量或以多剂量形式包装。所述组合物通常配制成无菌且基本上等渗的溶液。
在一个实施方式中，将包含编码补体系统多肽(例如，CFH、FHL1、FHR1、FHR2、FHR3、FHR4或FHR5)或其生物活性片段的所需转基因以及如上所述用于目标眼细胞中的组成型或者组织或细胞特异性启动子的重组AAV配制成意图用于视网膜下或玻璃体内注射的药物组合物。在一些实施方式中，本文公开的组合物靶向黄斑的任何一个或多个区域的细胞，包括例如，黄斑凹(umbo)、中心凹、中心凹无血管区、中央凹、侧凹或周围凹。这样的制剂涉及使用药学和/或生理上可接受的介质或载体，特别是适合于例如通过视网膜下注射向眼睛施用的介质或载体，例如，缓冲盐水或其他缓冲剂，例如HEPES，以将pH维持在适当的生理水平，以及任选地其他药用制剂、药物剂、稳定剂、缓冲液、载体、佐剂、稀释剂等。对于注射，载体通常为液体。示例性的生理上可接受的载体包括无菌的、无热原的水和无菌的、无热原的磷酸盐缓冲盐水。在美国专利公开号7,629,322中提供了多种这样的已知载体，其通过引用引入本文。在一个实施方式中，载体是等渗氯化钠溶液。在另一个实施方式中，载体是平衡盐溶液。在一个实施方式中，载体包括吐温(tween)。如果病毒要长期储存，其可以在甘油或Tween20存在的情况下冷冻。在另一个实施方式中，药学上可接受的载体包含表面活性剂，例如全氟辛烷(Perfluoton液体)。
在本文描述的方法的某些实施方式中，通过视网膜下注射将上述药物组合物施用于受试者。在其他实施方式中，通过玻璃体内注射施用药物组合物。可用于本文所述方法的其他施用形式包括但不限于直接递送至所需器官(例如，眼睛)、口服、吸入、鼻内、气管内、静脉内、肌肉内、皮下、皮内以及其他胃肠外施用途径。如果需要，施用途径可以组合。在某些实施方式中，本公开的药物组合物在施用初始加载剂量的补体系统蛋白之后施用。
在一些实施方式中，本文公开的任何载体/药物组合物施用于患者以使得它们靶向神经胶质细胞、穆勒细胞和/或视网膜色素上皮细胞。在一些实施方式中，施用途径不特异性地靶向神经元。在一些实施方式中，选择施用途径以使其降低患者中视网膜脱离的风险(例如，玻璃体内而不是视网膜下施用)。在一些实施方式中，如果将载体/组合物施用于老年人(例如，至少60岁的年龄)，则选择玻璃体内施用。在特定的实施方式中，本文公开的任何载体/药物组合物玻璃体内施用于受试者。玻璃体内注射的程序是本领域已知的(参见，例如，Peyman，GA等(2009)Retina 29(7):875-912和Fagan,X.J.和Al-Qureshi,S.(2013)Clin.Experiment.Ophthalmol.41(5):500-7)。简而言之，用于玻璃体内注射的受试者可以通过瞳孔扩张、眼睛的灭菌和施用麻醉剂准备用于该过程。本领域已知的任何合适的散瞳剂可以用于瞳孔扩张。治疗前可以确认充分的瞳孔扩张。可以通过进行灭菌眼睛处理，例如含碘溶液如聚维酮-碘
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来实现灭菌。类似的溶液也可用于清洁眼睑、睫毛和任何其他附近的组织(例如，皮肤)。可以任何合适浓度使用任何合适的麻醉剂，例如利多卡因或丙卡因。可以通过本领域已知的任何方法来施用麻醉剂，包括但不限于局部滴剂、凝胶或胶冻剂，以及结膜下施用麻醉剂。在注射之前，可以使用灭菌的眼睑窥器从该区域清除睫毛。注射部位可以用注射器标记。可以基于患者的晶状体选择注射部位。例如，在假晶状体或无晶状体患者中，注射部位可以距角膜缘(limus)3-3.5mm，和在有晶状体患者中，距角膜缘3.5-4mm。患者可以向与注射部位相反的方向看。在注射过程中，针头可垂直于巩膜插入并指向眼睛中心。可以插入针头以使得尖端终止在玻璃体而不是视网膜下间隙中。可以使用本领域已知用于注射的任何合适的体积。注射后，眼睛可用消毒剂(如抗生素)处理。也可以冲洗眼睛以去除多余的消毒剂。
此外，在某些实施方式中，期望的是进行非侵入性视网膜成像和功能研究以确定待靶向用于治疗的特定眼细胞的区域。在这些实施方式中，采用临床诊断测试来确定一次或多次视网膜下注射的精确位置。这些测试可能包括检眼镜、视网膜电图(ERG)(特别是b波测量)、视野检查、视网膜层的地形图绘制以及通过共聚焦扫描激光检眼镜(cSLO)和光学相干断层扫描(OCT)的方式对其层厚度的测量、通过自适应光学器件(AO)的锥体密度地形图绘制、功能性眼检查等。
这些以及其他期望的测试在国际专利申请No.PCT/US2013/022628中进行了描述。考虑到成像和功能研究，在一些实施方式中，在同一只眼中进行一次或多次注射以靶向保留的双极细胞的不同区域。单独地测定每次注射的体积和病毒滴度，如下文进一步所述的，并且可以与在同一或对侧眼中进行的其他注射相同或不同。在另一个实施方式中，进行单次较大体积的注射以便治疗整个眼睛。在一个实施方式中，选择rAAV组合物的体积和浓度，以使得仅影响眼细胞的特定区域。在另一个实施方式中，rAAV组合物的体积和/或浓度为较大的量，以便到达眼睛的较大部分，包括未受损的眼细胞。
所述组合物可以约0.1μL至约1mL的体积递送，包括该范围内的所有数量，这取决于待治疗区域的大小、使用的病毒滴度、施用途径和该方法所需的效果。在一个实施方式中，体积为约50μL。在另一个实施方式中，体积为约70μL。在优选的实施方式中，体积为约100μL。在另一个实施方式中，体积为约125μL。在另一个实施方式中，体积为约150μL。在另一个实施方式中，体积为约175μL。在又一个实施方式中，体积为约200μL。在另一个实施方式中，体积为约250μL。在另一个实施方式中，体积为约300μL。在另一个实施方式中，体积为约450μL。在另一个实施方式中，体积为约500μL。在另一个实施方式中，体积为约600μL。在另一个实施方式中，体积为约750μL。在另一个实施方式中，体积为约850μL。在另一个实施方式中，体积为约1000μL。携带在细胞特异性启动子序列控制下的编码所需转基因的核酸序列的重组腺相关病毒的有效浓度范围在约107和1013载体基因组/毫升(vg/mL)(也称为基因组拷贝/mL(GC/mL))之间。rAAV感染单位如S.K.McLaughlin等，1988J.Virol.,62:1963所述的测定，其通过引用引入本文。优选地，视网膜中的浓度为约1.5×109vg/mL至约1.5×1012vg/mL，更优选为约1.5×109vg/mL至约1.5×1011vg/mL。在某些优选的实施方式中，有效浓度为约2.5×1010vg至约1.4×1011。在一个实施方式中，有效浓度为约1.4×108vg/mL。在一个实施方式中，有效浓度为约3.5×1010vg/mL。在另一个实施方式中，有效浓度为约5.6×1011vg/mL。在另一个实施方式中，有效浓度为约5.3×1012vg/mL。在又一个实施方式中，有效浓度为约1.5×1012vg/mL。在另一个实施方式中，有效浓度为约1.5×1013vg/mL。在一个实施方式中，有效剂量(递送的总基因组拷贝)为约107至1013个载体基因组。希望的是使用最低有效浓度的病毒，以减少不良效应如毒性、视网膜发育不良和脱离的风险。在这些范围内的再其他的剂量和施用体积可以由主治医师考虑被治疗的受试者(优选人)的身体状况、受试者的年龄、特定的眼障碍以及该障碍(如果是逐步发展的)的发展程度来选择。对于眼外递送，剂量根据距视网膜的比例增加而提高。例如，静脉内递送可能需要大约1.5×1013vg/kg的剂量。
在本公开的方法中有用的药物组合物进一步描述于PCT公开号WO2015168666和PCT公开号WO2014011210中，其内容通过引用合并于此。
治疗/预防方法
本文描述了预防、治疗眼部障碍和与之相关的视网膜变化、阻止其进展或改善该眼部障碍和与之相关的视网膜变化的各种方法。通常，该方法包括向需要的哺乳动物受试者施用有效量的包含携带在调控序列控制下的编码补体系统多肽(例如，CFH、FHL1、FHR1、FHR2、FHR3、FHR4或FHR5)或其生物活性片段的转基因的上述重组腺相关病毒(AAV)以及药学上可接受的载体的组合物，其在受试者的眼细胞中表达该基因的产物。本文所述的任何AAV可用于下文所述的方法中。
用于视网膜疾病(例如LCA、色素性视网膜炎和年龄相关性黄斑变性)的基因治疗方案要求将载体局部递送至视网膜中的细胞。作为这些疾病中的治疗靶标的细胞是视网膜中的感光细胞或神经感觉视网膜下的RPE细胞。向这些细胞递送基因治疗载体需要注射到视网膜和RPE之间的视网膜下间隙中。在一些实施方式中，本公开提供了将包含补体系统基因或其片段的rAAV基因治疗载体递送至视网膜细胞的方法。
在某些方面，本公开提供了一种治疗患有年龄相关性黄斑变性(AMD)的受试者的方法，其包括向受试者施用本公开的任何载体的步骤。在某些实施方式中，载体以约50μl至约100μl中每只眼睛2.5×1010vg至1.4×1011vg的剂量施用。在某些实施方式中，载体以约50μl至约100μl中每只眼睛1.0×1011vg至1.5×1013vg的剂量施用。在某些实施方式中，载体以约50μl至约100μl中每只眼睛1.0×1011vg至1.5×1012vg的剂量施用。在某些实施方式中，载体以约50μl至约100μl中每只眼睛约1.4×1012vg的剂量施用。在某些实施方式中，载体以约50μl至约100μl中每只眼睛1.4x1012vg的剂量施用。在某些实施方式中，本公开的药物组合物包含药学上可接受的载体。在某些实施方式中，本公开的药物组合物包含PBS。在某些实施方式中，本公开的药物组合物包含普朗尼克(pluronic)。在某些实施方式中，本公开的药物组合物包含PBS、NaCl和普朗尼克。在某些实施方式中，载体在具有另外的NaCl和普朗尼克的PBS溶液中通过玻璃体内注射来施用。
在一些实施方式中，与靶细胞中CFH和/或FHL1的内源性表达相比，根据本文公开的方法使用的本公开的任何载体能够在本文公开的靶细胞(例如，RPE或肝细胞)中诱导高至少5％、10％、20％、50％、100％、150％、200％、250％、300％、400％、500％、700％、900％、1000％、1100％、1500％或2000％的CFH和/或FHL1的表达。在一些实施方式中，与靶细胞中CFH和/或FHL1活性的内源性水平相比，本文公开的任何载体在本文公开的靶细胞(例如，RPE或肝细胞)中的表达导致靶细胞中高至少5％、10％、20％、50％、100％、150％、200％、250％、300％、400％、500％、700％、900％、1000％、1100％、1500％或2000％的CFH和/或FHL1活性水平。
在一些实施方式中，本文公开的任何载体施用至测试受试者中的细胞或组织。在一些实施方式中，测试受试者中的细胞或组织与参考对照受试者或参考对照受试者群体中的相同细胞类型或组织类型中表达的相比表达更少的CFH和/或FHL1，或较低功能性的CFH和/或FHL1。在一些实施方式中，参考对照受试者与测试受试者具有相同的年龄和/或性别。在一些实施方式中，参考对照受试者是健康受试者，例如，该受试者没有眼睛的疾病或障碍。在一些实施方式中，参考对照受试者没有与补体级联的激活相关的眼睛的疾病或障碍。在一些实施方式中，参考对照受试者没有黄斑变性。在一些实施方式中，与参考对照受试者或参考对照受试者群体中的水平相比，测试受试者的眼睛和/或眼睛的特定细胞类型(例如，中心凹区域中的细胞)表达低至少95％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％或1％的CFH和/或FHL1或功能性CFH和/或FHL1。在一些实施方式中，测试受试者的眼睛或眼睛的特定细胞类型(例如，中心凹区域中的细胞)表达具有本文公开的任何CFH和/或FHL1突变的CFH和/或FHL1蛋白。在一些实施方式中，参考对照受试者的眼睛或眼睛的特定细胞类型(例如，中心凹区域中的细胞)不表达具有本文公开的任何CFH和/或FHL1突变的CFH和/或FHL1蛋白。在一些实施方式中，在测试受访者的细胞或组织中表达本文公开的任何载体导致CFH和/或FHL1蛋白或功能性CFH和/或FHL1蛋白的水平增加。在一些实施方式中，在测试受试者的细胞或组织中本文公开的任何载体的表达导致CFH和/或FHL1蛋白或功能性CFH和/或FHL1蛋白的水平增加，以使得增加的水平在参考对照受试者或参考对照受试者群体中相同细胞类型或组织类型所表达的CFH和/或FHL1蛋白或功能性CFH和/或FHL1蛋白的水平的90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％或1％内或者与其相同。在一些实施方式中，在测试受访者的细胞或组织中本文公开的任何载体的表达导致CFH和/或FHL1蛋白或功能性CFH和/或FHL1蛋白的水平增加，但是CFH和/或FHL1蛋白或功能性CFH和/或FHL1蛋白的增加的水平不超过参考对照受试者或参考对照受试者群体中相同细胞类型或组织类型表达的CFH和/或FHL1蛋白或功能性CFH和/或FHL1蛋白的水平。在一些实施方式中，在测试受访者的细胞或组织中本文公开的任何载体的表达导致CFH和/或FHL1蛋白或功能性CFH和/或FHL1蛋白的水平增加，但是CFH和/或FHL1蛋白或功能性CFH和/或FHL1蛋白的增加水平超过参考对照受试者或参考对照受试者群体中相同细胞类型或组织类型表达的水平的不高于1％、5％、10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的CFH和/或FHL1蛋白或功能性CFH和/或FHL1蛋白水平。在一些实施方式中，本文公开的任何治疗和/或预防方法应用于受试者。在一些实施方式中，受试者是哺乳动物。在一些实施方式中，受试者是人。在一些实施方式中，人是成年人。在一些实施方式中，所述人是老年人。在一些实施方式中，人的年龄为至少40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90或95岁。在特定的实施方式中，该人为至少60或65岁。
在一些实施方式中，本文公开的任何治疗和/或预防方法用于治疗具有导致视黄变性(AMD)或增加患者发生AMD的可能性的一个或多个突变的患者。在一些实施方式中，本文公开的任何治疗和/或预防方法用于治疗具有引起非典型溶血性尿毒综合征(aHUS)或增加患者发生aHUS的可能性的一种或多种突变的患者。在一些实施方式中，一种或多种突变在患者的CFI基因中。在一些实施方式中，一种或多种突变在患者的CFH基因中。在一些实施方式中，一种或多种突变存在于患者的CFH基因和CFI基因两者中。在一些实施方式中，所述受试者在受试者的CFH基因中具有功能丧失突变。在一些实施方式中，所述受试者在受试者的CFI基因中具有功能丧失突变。
在一些实施方式中，本文公开的任何治疗和/或预防方法用于治疗在患者的CFI基因中具有一个或多个突变的患者。在一些实施方式中，患者在FIMAC、CD5、L1、L1-Ca结合、L1-二硫键、L2、L2-Ca结合、丝氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶活性位点结构域的一个或多个中具有突变。在一些实施方式中，患者在CFI蛋白的二硫键位点中具有一个或多个突变。在一些实施方式中，所述突变是选自以下所组成的组的一种或多种突变：E548Q、V412M、A431T、A431S、K441R、P553S、A240G、A258T、G119R、G261D、R202I、T300A、T203I、V152M、R317W、G287R、E554V、I340T、G162D、P50A、Y206N、D310E、H418L、p.(Tyr411Stop)、p.(Arg187Stop)、R474Q、Y459S、R187Q、R339Q、G263V、p.(Arg339Stop)、D477H、p.(Ile357Met)、P64L、E109A、G125R、N177I、F198L、S221Y、D224N、C229R、V230M、G248E、G280D、A356P、V20I、Y369S、W374C、R389H、W399R、C467R、G487C、I492L、G500R、R502C、W541*、V543A、Q580*、V355M、I578T、R474*、R406H、D44N、p.(Arg406Cys)、D403N、I416L、G328R、G512S、p.(Gly542Ser)、p.(Cys106Arg)、V127A、p.(Ile55Phe)、H40R、C54R、C54*、V184M、G362A、Q462H、N536K、R317Q、p.(His183Arg)、p.(Ile306Val)、p.(Gly342Glu)、p.(Asp429Glu)、R448H、D519N、S493R、R448C、K338Q、G104R、C259R、G372S、A360V、E290A、V213F、F13V、Y514Ter、V396A、E303Q、H401Q、I306T、E479G、c.772+1G>T、F498L、Y411H、S24T、C255Y、R168S、Q228R、V469I、Q250K、Y241C、G232V、G248R、G110R、E109K、N422D、C550R、G242AfsTer9、R345G、N428MfsTer5、C550WfsTer17、V341E、N428S、H334P、W51R、A452S、T72S、T72S、V558I、E445G、C444Y、L351I、G261S、M138I、A563S、G263AfsTer37、K142E、c.658+2T>C、G205D、T197A、G188V、A378V、L376P、C365Y、M147V、Q161Ter、G439R、G269S、R201S、P576S、Y65H、
Figure BDA0002522611500000561
Y22C、I407T、M204V、A384T、G516V、R336G、F139V、L4H、K117E、V489I、P402L、G547R、A346T、S326P、I126T、D283G、S298F、Met1缺失、Ter584QextTer24、C521Y、R168G、S457P、A423E、L34V、A452T、K442E、N245K、D173N、K267E、S146R、E302K、G295V、V299L、K111N、S113N、F17V、Q391E、H14L、T394I、c.659-2A>G、A511V、E303K、D398G、Ter584KextTer24、V583A、A163T、H118Q、A309S、T23I、G473R、V530I、E26Ter、K497N、S496C、S496T、L491R、V412E、F417S、S570G、D465G、E124K、D567V、G557D、E548G、W546G、V543I、N464K、P463A、N564S、K561E、E445D、C444G、D443H、E434KfsTer2、I430T、I244S、I244V、c328+1G>A、R345Q、S175F、N331KfsTer46、C327R、K130I、Q260E、P96S、I140T、T137I、D135G、K69E、G57D、G371V、G367A、N279S、Y276C、G269C、E190D、T300A、G261D、N151S、R406H、V152M、G362A、E554V、S570T、I340T、K441R、T203I、Y206N、G328R、T107A、P553S、G287R、N70T、P50A、R406C、R187Q、G119R、.1429+1G>C、D477H、N177I、V129A、I55V、W399R、G500R、I492L、R339Ter、I357M、R474Q、D44N、D403N、R474Ter、R317W、G512S、R339Q、A356P、R187Ter、I416L、R317L、R389H、I306V、D224Y、R317Q、A258T、Q580Tet、H418L、I578T、G542S、P64L、C106R、Y369S、Q462H、A240G、H183R、R502G、H40R或G162D。在特定实施方式中，所述突变是选自以下组成的组中的任一突变：G119R、L131R、V152M、G162D、R187Y、R187T、T203I、A240G、A258T、G287R、A300T、R317W、R339Q、V412M和P553S。在一些实施方式中，本文所述的任何CFI突变氨基酸位置对应于SEQ ID NO:35的野生型氨基酸CFI序列。
在一些实施方式中，本文公开的任何治疗和/或预防方法用于治疗在患者的CFH基因中具有一个或多个突变的患者。在一些实施方式中，患者在pre-SCR1或任何SCR1-SCR20结构域的一个或多个中具有突变。在一些实施方式中，患者在SCR之间的一个或多个过渡区域中具有突变。在一些实施方式中，突变是选自以下组成的组的一个或多个突变：H402Y、G69E、D194N、W314C、A806T、Q950H、p.Ile184fsX、p.Lys204fsX、c.1697-17_-8del、A161S、A173G、R175Q、V62I、V1007L、S890I、S193L、I216T、A301Nfs*25、W379R、Q400K、Q950H、T956M、R1210C、N1050Y、E936D、Q408X、R1078S、c.350+6T->G、R567G、R53C、R53H、R2T、A892V、R567G、I221V、S159N、P562H、F960S、R303W、R303Q、K666N、G1194D、P258L、G650V、D130N、S58A、R166W、R232Q、R127H、K1202N、G397Stop、Stop450R、R830W、I622L、T732M、S884Y、L24V、Y235H、K527N、R582H、C973Y、V1089M、E123G、T291S、R567K、E625Stop、N802S、N1056K、R1203W、Q1076E、P26S、T46A、T91S、C129Y、R166Q、E167Q、R175P、C192F、W198*、V206M、G218*、M239T、Y277*、C325Y、R341H、R364L、P384R、C431S、D454A、A473V、P503A、N516K、I551T、H699R、F717L、W978R、P981S、A1010V、W1037*、P1051L、I1059T、Q1143E、R1206H、T1227I、L24V、H169R、R257H、K410E、V609I、D619N、A892V、G1002R、G278S、T30*、I32Stop、R78G、Q81P、V111E、W134R、P139S、M162V、E189Stop、K224Del、K224Del、A307A、H332Y、S411T、C448Y、L479Stop、R518T、T519A、C536R、C564P、C569Stop、L578Stop、P621T、C623S、C630W、E635D、K670T、Q672Q、C673Y、C673S、S714Stop、S722*、C733Y、V737V、E762Stop、N774Stop、R780I、G786*、M823T、V835L、E847V、E850K、C853R、C853T、C864S、C870R、H878H、I881L、E889Stop、H893R、Y899Stop、Y899D、C915S、C915Stop、W920R、Q925Stop、C926F、Y951H、C959Y、P968*、I970V、T987A、N997T、G1011*、T1017I、Y1021F、C1043R、T1046T、V1054I、V1060A、V1060L、C1077W、T1097W、T1097T、D1119G、D1119N、P1130L、V1134G、E1135R、E1137L、E1139Stop、Y1142D、Y1142C、C1152S、W1157R、P1161T、C1163T、P1166L、V1168E、V1168Stop、I1169L、E1172Stop、Y1177C、R1182S、W1183L、W1183R、W1183L、W1183Stop、W1183C、T1184R、T1184A、K1186H、K1188Del、L1189R、L1189F、S1191L、S1191W、E1195Stop、V1197A、E1198A、E1198Stop、F1199S、V1200L、G1204E、L1207R、S1211P、R1215Q、R1215G、T1216Del、C1218R、Y1225*、P1226S、L3V、H821Y、E954del、G255E、T1038R、V383A、V641A、P213A、I221V、E229K、R2T、R1072G、G967E、N819S、V579F、G19K、A18S、K834E、T504M、R662I、P668L、G133R、I184T、L697F、H1165Y、G1110A、pIle808_Gln809del、I760L、T447R、I808M、I868M、L765F、N767S、R567G、K768N、S209L、Q628K、D214Y、N401D、I216K、Q464R、I777V、E229D、M823I、R232Ter、S266L、P260S、E23G、C80Y、R78T、R582H、N638D、N638S、P258L、L3F、R257H、G240R、G69R、D855N、M11I、K472N、Q840H、E850K、Y899H、T645M、M805V、K919T、E201G、V407A、I907L、T914K、H332R、V144M、S652G、D195N、C146S、P661R、E677Q、V482I、T34R、A421T、R281G、C509Y、K666N、P440S、C442G、N607D、A425V、G667E、P440L、I49V、R387G、E625K、E625Ter、T135S、P43S、K283E、I124V、T36V、I563T、G350E、D619G、T321I、T286A、P384L、T739N、M515L、V158A、G727R、T724K、F717L、M162V、C178R、G700R、A161T、F176L、R295S、F298Y、G297S、P300L、R1040K、V552L、T310I、T531A、G928D、Ter386RextTer 69a€、Q1143K、Y534C、P981L、K308N、D538E、R1215Ter、E105V、T1017I、N1050I、P935S、Y951H、T1097M、D947H、E961D、G962S、G964E、I970V、R1072T、P1114L、S1122T、F960C、R1074C、R1182T、R1074L、S884Y、S890T、V837I、V941F、V158I、D748V、I216T、H371N、L750F、P418T、M432V、D693N、A746E、V111E、c.2237-2A>G、P982S、V579A、E591D、V579I、V65I、P418S、Y1067C、D772N、V72L、E189K、A1027P、D798N、N61D、P384S、N521S、P1068S、E395K、N774S、H577R、E833K、K6E、H337R、R444C、L741F、Y42F、D288E、S705F、R1040G、D214H、N757D、I861M、G848E、P923S、E201K、E902A、R303Q、G366E、D538H、K82R、E721K、Y1008H、R1074P、A806S、Q807R、C389Y、H764Y、K867N、P392T、L394M、E456K、F459L、Y398C、E570K、D214N、I574V、I574T、G631C、T880I、V865F、V576A、N776S、P633S、N22D、P634A、N822I、R885S、R232L、E635D、R778K、L827V、C267R、Y779C、R582C、L77S、R257C、Y327H、N75K、L74F、S836T、Y243H、c.1519+5_1519+8delGT…、K507Q、A892S、I15T、P924L、A14V、N842K、G894R、G894E、Y271C、C9W、T504R、V683M、L385Phea€、S898R、Q408H、G409S、T34K、E648G、I412V、E338D、P799S、G480E、D798E、D195Y、R341C、D485H、D485G、K598Q、Y420H、P599T、N434H、R441T、C431G、V149A、V349I、T679A、P43T、G45D、R662G、T519I、L121P、P364L、P621A、H373Y、D538MfsTer14、H371P、T544A、T131A、R166G、V177I、V177A、R729S、F717V、N718S、S991G、L98I、Y1016Ter、T1217del、M1001T、K1004E、A1010T、G1011D、T1017A、T1031A、L1125F、R1203G、L1214M、W1096DfsTer20、H939N F960L、D966H、M1064I、E1071K、N1095K、T1106A、G1107E、C1109W、P1111S、V1197I、Y1075F、S1079N、P1080S、E1082G或Sto1232。在特定实施方式中，所述突变是选自以下组成的组的一种或多种突变：R2T、L3V、R53C、R53H、S58A、G69E、D90G、R175Q、S193L、I216T、I221V、R303W、H402Y、Q408X、P503A、G650V、R1078S和R1210C。在一些实施方式中，本文所述的任何CFH突变氨基酸位置对应于SEQ ID NO:33的野生型氨基酸CFH序列。
在一些实施方式中，本文公开的任何载体用于治疗肾脏疾病或并发症。在一些实施方式中，肾脏疾病或并发症与患者中的AMD相关。在一些实施方式中，肾脏疾病或并发症与患者中的aHUS相关。在一些实施方式中，为治疗肾脏疾病或并发症而施用的载体包含与肝脏中的强表达相关的启动子。在一些实施方式中，启动子是AAT1、PCK1或ALB1启动子(例如，包含SEQ ID No:16、18或20中任一的核苷酸序列的启动子)。
上述视网膜疾病与各种视网膜变化相关。这些可能包括光感受器结构或功能的丧失；外核层(ONL)变薄或增厚；外网层(OPL)变薄或增厚；组织破坏随后视杆和视锥外段的损失；视杆和视锥内段的缩短；双极细胞树突的退缩；内视网膜层(包括内核层、内网层、神经节细胞层和神经纤维层)的变薄或增厚；视蛋白错误定位；神经丝过表达；视网膜特定部分(例如中央凹或黄斑)变薄；ERG功能丧失；视敏度和对比敏感度下降；视动反射丧失；瞳孔光反射丧失；以及视觉指导行为的丧失。在一个实施方式中，提供了一种预防与这些视网膜疾病相关的任何视网膜变化、阻止其进展或对其改善的方法。结果，改善了受试者的视力，或阻止和/或改善了视力丧失。
在特定的实施方式中，提供了一种预防与受试者的眼部障碍相关的视力丧失、阻止其进展或改善其的方法。与眼部障碍相关的视力丧失是指周围视力、中心(阅读)视力、夜视力、日视力的任何下降，色觉丧失、对比敏感度丧失或视敏度下降。
在另一个实施方式中，提供了靶向一种或多种眼细胞类型用于在需要的受试者中进行基因增强治疗的方法。在另一个实施方式中，提供了靶向一种或多种眼细胞类型用于在需要的受试者中进行基因抑制治疗的方法。在又一个实施方式中，提供了靶向一种或多种眼细胞类型用于在需要的受试者中进行基因敲除/增强治疗的方法。在另一个实施方式中，提供了靶向一种或多种眼细胞类型用于在需要的受试者中进行基因校正治疗的方法。在又一个实施方式中，提供了靶向一种或多种眼细胞类型用于在需要的受试者中进行神经营养因子基因治疗的方法。
在本文描述的任何方法中，靶向的细胞可以是眼细胞。在一个实施方式中，靶向的细胞是神经胶质细胞。在一个实施方式中，靶向的细胞是RPE细胞。在另一个实施方式中，靶向的细胞是光感受器。在另一个实施方式中，光感受器是视锥细胞。在另一个实施方式中，靶向的细胞是穆勒细胞。在另一个实施方式中，靶向的细胞是双极细胞。在又一个实施方式中，靶向的细胞是水平细胞。在另一个实施方式中，靶向的细胞是无长突细胞。而在另一个实施方式中，靶向的细胞是神经节细胞。在又一个实施方式中，基因可以被表达并递送至细胞内细胞器，例如线粒体或溶酶体。
如本文所用，“光感受器功能丧失”是指与正常的、未患病的眼睛或较早的时间点的同一只眼睛相比，光感受器功能的降低。如本文所用，“提高光感受器功能”是指与患病的眼睛(患有相同的眼疾病)、在较早的时间点的同一只眼睛、同一只眼睛的未治疗部分或同一患者的对侧眼睛相比，改善光感受器的功能或增加功能性光感受器的数量或百分比。可以使用本领域常规的以上和以下实施例中描述的功能研究，例如ERG或视野测定法来评估光感受器功能。
对于每一种所描述的方法，治疗可用于预防视网膜损伤的发生或挽救患有轻度或晚期疾病的眼睛。如本文所用，术语“挽救”是指防止疾病进展至完全失明，防止损伤扩散至未受伤的眼细胞，改善受损眼细胞的损伤或提供增强的视力。在一个实施方式中，组合物在疾病变得有症状之前或在光感受器丧失之前施用。有症状是指上述各种视网膜改变或视力丧失的发作。在另一个实施方式中，组合物在疾病变得有症状后施用。在又一个实施方式中，组合物在光感受器丧失开始后施用。在另一个实施方式中，组合物在外核层(ONL)变性开始后施用。在一些实施方式中，期望的是组合物在到神经节细胞和视神经的双极细胞回路保持完整的同时施用。
在另一个实施方式中，组合物在光感受器丧失开始后施用。在又一个实施方式中，组合物在与未患病的眼睛相比少于90％的光感受器起作用或保留时施用。在另一个实施方式中，组合物在少于80％的光感受器起作用或保留时施用。在另一个实施方式中，组合物在少于70％的光感受器起作用或保留时施用。在另一个实施方式中，组合物在少于60％的光感受器起作用或保留时施用。在另一个实施方式中，组合物在少于50％的光感受器起作用或保留时施用。在另一个实施方式中，组合物在少于40％的光感受器起作用或保留时施用。在另一个实施方式中，组合物在少于30％的光感受器起作用或保留时施用。在另一个实施方式中，组合物在少于20％的光感受器起作用或保留时施用。在另一个实施方式中，组合物在少于10％的光感受器起作用或保留时施用。在一个实施方式中，组合物仅施用于眼睛的一个或多个区域。在另一个实施方式中，将组合物施用于整个眼睛。
在另一个实施方式中，该方法包括进行功能和成像研究以测定治疗的功效。这些研究包括ERG和体内视网膜成像，如以下实施例中所述的。除了视野研究、视野测量和微视野检查外，还可以进行瞳孔测定、活动度测试、视敏度、对比敏感度、色觉测试。
在又一个实施方式中，任何上述方法与另一或第二疗法联合进行。该疗法可以是任何现在已知的或尚未知道的疗法，其有助于预防、阻止或改善任何所述的视网膜改变和/或视力丧失。在一个实施方式中，第二疗法是包封细胞疗法(例如，递送睫状神经营养因子(Ciliary Neurotrophic Factor，CNTF)的疗法)。参见，Sieving，P.A.等，2006.Proc NatlAcad Sci USA,103(10):3896-3901，其通过引用引入本文。在另一个实施方式中，第二疗法是神经营养因子疗法(例如色素上皮衍生因子，PEDF；睫状神经营养因子3；视杆源的视锥细胞活力因子(RdCVF)或神经胶质源的神经营养因子)。在另一个实施方式中，第二疗法是抗凋亡疗法(例如，递送X连锁凋亡抑制剂XIAP的疗法)。在又一个实施方式中，第二疗法是视杆源的视锥细胞活力因子2。第二疗法可以在上述rAAV的施用之前、同时或之后施用。
在一些实施方式中，本文公开的任何载体或组合物与本文公开的任何其他载体或组合物组合施用于受试者。在一些实施方式中，本文公开的任何载体或组合物与另一种治疗剂或治疗过程组合施用于受试者。在一些实施方式中，另外的治疗剂是抗VEGF治疗剂(例如，诸如抗VEGF抗体或其片段，如雷尼单抗、贝伐单抗或阿柏西普)、维生素或矿物质(例如，维生素C、维生素E、叶黄素、玉米黄质、锌或铜)、ω-3脂肪酸和/或VisudyneTM。在一些实施方式中，另一治疗过程是具有降低的ω-6脂肪酸的饮食、激光手术、激光凝固、黄斑下手术、视网膜移位和/或光动力疗法。
在一些实施方式中，本文公开的任何载体与加工由载体/组合物编码的蛋白质和/或改善其功能所需的另外的试剂组合施用于受试者。例如，如果载体包含CFH基因，则可以将载体与增强表达的CFH蛋白的活性的抗体(或编码该抗体的载体)组合施用于患者。此类抗体的实例见于WO2016/028150，其全文引入本文。在一些实施方式中，载体与另外的多肽(或编码该另外的多肽的载体)组合施用，其中另外的多肽能够加工由载体编码的蛋白质，例如，将编码的前体蛋白质加工成其成熟形式。在一些实施方式中，加工蛋白质是蛋白酶(例如，弗林蛋白酶)。
试剂盒
在一些实施方式中，本文公开的任何载体组装到药物或诊断或研究试剂盒中以利于它们在治疗、诊断或研究应用中的使用。试剂盒可包含一个或多个容纳本文公开的任何载体的容器和使用说明书。
该试剂盒可以设计成利于研究人员使用本文所述的方法，并且可以采取多种形式。试剂盒的每一种组合物(如果适用)可以以液体形式(例如，溶液)或以固体形式(例如，干粉)提供。在某些情况下，组合物中的一些可以是可组成的或另外可加工的(例如，加工成活性形式)，例如，通过添加合适的溶剂或其他物质(例如，水或细胞培养基)，其可以随试剂盒一起提供或者不随试剂盒一起提供。如本文所使用的，“说明书”可以限定说明和/或推广的组分，并且通常涉及在本公开的包装上或与本公开的包装相关联的书面说明。说明书还可以包括以任何方式提供的任何口头或电子说明书，以使用户清楚地认识到该说明书与试剂盒相关联，例如，视听(例如，录像带、DVD等)、互联网和/或基于Web的通信等。书面说明可以为规范药品或生物制品的生产、使用或销售的政府机构规定的形式，该说明书也可以反映出机构批准用于动物施用的生产、使用或销售。
实施例
现在总体上描述了本公开，通过参考以下实施例将更容易理解本公开，其被包含仅用于说明某些实施方式和本公开的实施方式的目的，而无意限制本公开。
实施例1：AAV载体的构建
设计了包含密码子优化的或非密码子优化的CFH和/或CFHL序列的AAV2载体，其与各种不同的启动子及在某些情况下SV40内含子相结合。图1-6显示了生成的不同载体的载体图。下面提供了概述了盒中所包含的基因、所包含的启动子、列出了构建体图的附图以及与载体相关的序列的表格。
Figure BDA0002522611500000641
Figure BDA0002522611500000651
AAV.CFH和AAV.FHL1载体转导细胞并调节补体活性的能力：
上面指出的CFH载体各自首先在HEK293和ARPE19细胞中通过转染体外测试，并评估人CFH和FHL1蛋白在细胞沉淀和上清液两者中的表达。如蛋白质印迹的技术用于蛋白质检测和定量。用实时定量PCR来测定mRNA表达水平。如van der Burght等，ActaOphthalmol,2013中所述的，在A2E-laden视网膜色素上皮细胞的蓝光照射的细胞培养模型中测试补体活性的调节。简而言之，ARPE-19细胞系生长至汇合并在标准培养基±10uM A2E的中培养4周。RPE用蓝光照射。培养基用PBS加钙、镁和5.5mM葡萄糖代替，并且细胞用蓝光(430+/-30nm)照射0、5或10分钟。将RPE细胞与适当补体耗尽的人血清+/-一起孵育，并用AAV.CFH和AAV.FHL1载体转染。通过荧光显微镜或蛋白质印迹评估RPE与细胞表面标志物，CD46、CD55和CD59以及C3和MAC沉淀的免疫反应性。iC3b的水平通过蛋白质印迹测量。
在ARPE19细胞中评估后，通过玻璃体内注射在光诱导的视网膜变性和激光诱导的脉络膜新血管生成的小鼠模型中测试AAV.CFH和AAV.FHL1载体。通过蛋白质印迹和免疫组织化学测试产生的蛋白质的量及其在视网膜中的生物分布。光感受器变薄和RPE细胞死亡的挽救通过光学相干断层扫描、眼底照相和组织学分析进行评估。RPE与细胞表面标志物，CD46、CD55和CD59以及C3和MAC沉淀的免疫反应性通过荧光显微镜或蛋白质印迹进行评估。iC3b(C3的裂解产物)的水平通过蛋白质印迹测量。
非人类灵长动物的适宜剂量根据小鼠研究确定。非人类灵长动物研究通过玻璃体内注射在食蟹猴中进行。根据RPE产生和分泌的CFH和FHL1蛋白水平评估治疗益处。与未注射组或假注射群组相比，测量视网膜和脉络膜中的分泌CFH和FHL1蛋白的量。视网膜和脉络膜中CFH和FHL1的增加水平预期在具有导致这些蛋白质的损失或量减少的罕见突变的AMD人群中提供治疗益处。
实施例2：用CFH质粒转染HEK-293T细胞
能够在几种特异性启动子(EF1a.SV40i；EF1a；CRALBP或AAT1)之一控制下表达CFH或GFP的质粒转染到HEK-293T细胞中。使用1mg/L质粒DNA转染细胞。用PEI以1：1的DNA：PEI比率转染细胞。将细胞培养120小时并取样进行分析。裂解细胞，收集上清液并在还原PAGE凝胶上电泳和转移至膜上进行蛋白质印迹。用于检测CFH的主要抗体是抗人CFH的Quidel山羊抗血清，其在4℃下以1：1000，伴随旋转O/N。第二抗体是兔抗山羊，其在室温下以1：5000进行1小时。包含兔抗GAPDH多克隆抗体用于上样对照(1：1000稀释)，和第二抗体是兔抗山羊(1：5000)，在室温下1小时。图18描绘了来自蛋白质印迹分析的结果。用EF1a.SV40i、EF1a或CRALBP启动子控制下的CFH质粒转染的细胞样品中观察到了稳健的CFH表达，而在用AAT1启动子控制下的CFH质粒转染的样品中观察到较低的表达。在阴性对照样品中未检测到CFH。通过密度测定法量化来自蛋白质印迹的数据，并计算对于每一个样品CFH表达水平和GAPDH表达水平之间的比率(图19)。
实施例3：用CFH-AAV载体转染HEK细胞
用各种CFH-AAV2构建体转导HEK-293细胞三天，收集上清液样品，并和各种对照(例如，重组CFH、重组GFP、未转染的细胞裂解液或用重组GFP而不是CFH转染的细胞)一起在还原PAGE凝胶上进行电泳。使用Quidel山羊抗人CFH(A312)检测CFH，并且印迹以1：1,000的稀释度孵育过夜，并在洗涤后以1：5000稀释的兔抗山羊HRP二抗(JacksonImmunoresearch)于室温下伴随旋转孵育1小时。将印迹单独地与小鼠抗eGFP抗体(ThermoFisher，MA 1-952)以1：1,000稀释度孵育过夜，并在洗涤后以1：5000稀释的兔抗山羊HRP二抗(Jackson Immunoresearch)于室温下伴随旋转孵育1小时。来自蛋白质印迹的结果描绘于图20中。在来自用AAV-CFH构建体转染的细胞的上清液中检测到CFH的表达比未转染或模拟转染的细胞中更高。
实施例4：用AAV2-CFH载体对小鼠的玻璃体内治疗
小鼠玻璃体内注射在EF1a.SV40i或EF1a启动子控制下的AAV2-CFH载体。注射后21天收集眼睛，并进行免疫组织化学用于检测CFH蛋白。通过标准方法将眼睛包埋和切片并放置在载玻片上。载玻片在1X PBS中洗涤3x 5分钟。室温下在黑暗的潮湿室中用封闭缓冲液(5％BSA，10％驴血清，0.5％Triton X-100)封闭切片1小时。将样品在黑暗的潮湿室中在4℃下用CFH抗体(Novus cat.AF4779-SP)以1:20的浓度染色过夜。抗体溶液在封闭缓冲液中制备。然后将载玻片在1X PBS中洗涤3x5分钟。在黑暗的潮湿室中用驴抗山羊二抗(Thermofisher cat.A11056)以1：1000的浓度在室温下对样品染色1小时。抗体溶液在封闭缓冲液中制备。将载玻片在1X PBS中洗涤3x5分钟。样品用Hoechst溶液装载，并密封和成像。使用555(德克萨斯红，Texas Red)通道检测CFH。在神经节细胞层中观察到适度的CFH蛋白表达，而在内核层中观察到CFH蛋白的弱表达。
实施例5：用AAV载体治疗患有AMD的患者
该研究评估实施例1的载体用于治疗患有AMD的患者的功效。将使用任一CFH AAV2载体或对照治疗患有AMD的患者。载体以每只眼睛2.5x108vg至1.4x1011vg的不同剂量在约100μl中施用。载体通过玻璃体内注射在具有另外的NaCl和普朗尼克的PBS溶液中来施用。监测患者的AMD症状的改善。
预期CFH和/或FHL1 AAV2载体治疗将改善AMD症状。
通过引用引入
本文提及的所有出版物和专利均通过引用整体引入本文，就好像每个单独的出版物或专利均被明确地和单独地指出通过引用引入。
尽管已经讨论了主题的特定实施方式，但是以上说明是说明性的而不是限制性的。通过阅读本说明书和下面的权利要求书，许多变化对于本领域技术人员将变得显而易见。本公开的全部范围应该通过参考权利要求书及其等同物的全部范围，和说明书以及这类变型来确定。
序列表
SEQ ID NO:1—密码子优化的人因子H样1(FHL1)
GCGGCCGCCACCATGAGACTTCTAGCAAAGATTATTTGCCTTATGTTATGGGCTATTTGTGTAGCAGAAGATTGCAATGAACTTCCTCCAAGAAGAAATACAGAAATTCTGACAGGTTCCTGGTCTGACCAAACATATCCAGAAGGCACCCAGGCTATCTATAAATGCCGCCCTGGATATAGATCTCTTGGAAATGTAATAATGGTATGCAGGAAGGGAGAATGGGTTGCTCTTAATCCATTAAGGAAATGTCAGAAAAGGCCCTGTGGACATCCTGGAGATACTCCTTTTGGTACTTTTACCCTTACAGGAGGAAATGTGTTTGAATATGGTGTAAAAGCTGTGTATACATGTAATGAGGGGTATCAATTGCTAGGTGAGATTAATTACCGTGAATGTGACACAGATGGATGGACCAATGATATTCCTATATGTGAAGTTGTGAAGTGTTTACCAGTGACAGCACCAGAGAATGGAAAAATTGTCAGTAGTGCAATGGAACCAGATCGGGAATACCATTTTGGACAAGCAGTACGGTTTGTATGTAACTCAGGCTACAAGATTGAAGGAGATGAAGAAATGCATTGTTCAGACGATGGTTTTTGGAGTAAAGAGAAACCAAAGTGTGTGGAAATTTCATGCAAATCCCCAGATGTTATAAATGGATCTCCTATATCTCAGAAGATTATTTATAAGGAGAATGAACGATTTCAATATAAATGTAACATGGGTTATGAATACAGTGAAAGAGGAGATGCTGTATGCACTGAATCTGGATGGCGTCCGTTGCCTTCATGTGAAGAAAAATCATGTGATAATCCTTATATTCCAAATGGTGACTACTCACCTTTAAGGATTAAACACAGAACTGGAGATGAAATCACGTACCAGTGTAGAAATGGTTTTTATCCTGCAACCCGGGGAAATACAGCAAAATGCACAAGTACTGGCTGGATACCTGCTCCGAGATGTACCTTGAAACCTTGTGATTATCCAGACATTAAACATGGAGGTCTATATCATGAGAATATGCGTAGACCATACTTTCCAGTAGCTGTAGGAAAATATTACTCCTATTACTGTGATGAACATTTTGAGACTCCGTCAGGAAGTTACTGGGATCACATTCATTGCACACAAGATGGATGGTCGCCAGCAGTACCATGCCTCAGAAAATGTTATTTTCCTTATTTGGAAAATGGATATAATCAAAATTATGGAAGAAAGTTTGTACAGGGTAAATCTATAGACGTTGCCTGCCATCCTGGCTACGCTCTTCCAAAAGCGCAGACCACAGTTACATGTATGGAGAATGGCTGGTCTCCTACTCCCAGATGCATCCGTGTCAGCTTTACCCTCTAATAAGCTTGGATCCAGATCT,
SEQ ID NO:2—密码子优化的人因子H样1(FHL1)
GCGGCCGCCACCATGAGACTGCTGGCTAAAATTATCTGCCTGATGCTGTGGGCTATCTGCGTCGCTGAGGATTGTAACGAGCTGCCCCCCCGGAGAAATACAGAGATCCTGACCGGCTCTTGGAGCGACCAGACATATCCCGAGGGCACCCAGGCCATCTACAAGTGCAGGCCTGGCTATCGCTCTCTGGGCAACGTGATCATGGTGTGCAGGAAGGGAGAGTGGGTGGCCCTGAATCCCCTGAGGAAGTGCCAGAAGCGCCCTTGTGGACACCCAGGCGACACACCCTTCGGCACCTTTACACTGACCGGCGGCAACGTGTTCGAGTACGGCGTGAAGGCCGTGTATACCTGCAACGAGGGCTACCAGCTGCTGGGCGAGATCAATTACAGAGAGTGTGACACAGATGGCTGGACCAACGATATCCCTATCTGCGAGGTGGTGAAGTGTCTGCCTGTGACCGCCCCAGAGAATGGCAAGATCGTGAGCTCCGCCATGGAGCCAGACAGGGAGTATCACTTCGGCCAGGCCGTGCGCTTCGTGTGCAACTCCGGCTACAAGATCGAGGGCGATGAGGAGATGCACTGTAGCGACGATGGCTTCTGGTCCAAGGAGAAGCCCAAGTGCGTGGAGATCAGCTGTAAGTCCCCTGACGTGATCAATGGCTCTCCAATCAGCCAGAAGATCATCTATAAGGAGAACGAGAGGTTTCAGTACAAGTGCAATATGGGCTACGAGTATTCTGAGAGGGGCGATGCCGTGTGCACAGAGAGCGGATGGCGGCCCCTGCCTTCCTGCGAGGAGAAGTCTTGTGACAACCCTTATATCCCAAATGGCGATTACAGCCCACTGCGGATCAAGCACAGAACAGGCGATGAGATCACCTATCAGTGCCGGAACGGCTTTTACCCCGCCACAAGAGGCAATACCGCCAAGTGTACATCCACCGGATGGATCCCAGCACCAAGATGCACCCTGAAGCCCTGTGACTATCCTGATATCAAGCACGGCGGCCTGTATCACGAGAACATGAGACGGCCCTACTTCCCTGTGGCCGTGGGCAAGTACTATTCCTACTATTGCGACGAGCACTTTGAGACACCCTCCGGCTCTTACTGGGACCACATCCACTGTACCCAGGATGGATGGAGCCCCGCAGTGCCATGCCTGAGGAAGTGTTACTTCCCTTATCTGGAGAATGGCTACAACCAGAATTATGGCCGCAAGTTTGTGCAGGGCAAGAGCATCGATGTGGCATGCCACCCAGGATACGCACTGCCAAAGGCACAGACCACAGTGACCTGTATGGAAAACGGCTGGTCCCCTACCCCTCGCTGTATCAGAGTGTCATTCACCCTGTAATAAGCTTGGATCCAGATCT
SEQ ID NO:3—非密码子优化的人因子H样1(FHL1)
GCGGCCGCCACCATGAGACTTCTAGCAAAGATTATTTGCCTTATGTTATGGGCTATTTGTGTAGCAGAAGATTGCAATGAACTTCCTCCAAGAAGAAATACAGAAATTCTGACAGGTTCCTGGTCTGACCAAACATATCCAGAAGGCACCCAGGCTATCTATAAATGCCGCCCTGGATATCGAAGTCTTGGAAATGTAATAATGGTATGCAGGAAGGGAGAATGGGTTGCTCTTAATCCATTAAGGAAATGTCAGAAAAGGCCCTGTGGACATCCTGGAGATACTCCTTTTGGTACTTTTACCCTTACAGGAGGAAATGTGTTTGAATATGGTGTAAAAGCTGTGTATACATGTAATGAGGGGTATCAATTGCTAGGTGAGATTAATTACCGTGAATGTGACACAGATGGATGGACCAATGATATTCCTATATGTGAAGTTGTGAAGTGTTTACCAGTGACAGCACCAGAGAATGGAAAAATTGTCAGTAGTGCAATGGAACCAGATCGGGAATACCATTTTGGACAAGCAGTACGGTTTGTATGTAACTCAGGCTACAAGATTGAAGGAGATGAAGAAATGCATTGTTCAGACGATGGTTTTTGGAGTAAAGAGAAACCAAAGTGTGTGGAAATTTCATGCAAATCCCCAGATGTTATAAATGGATCTCCTATATCTCAGAAGATTATTTATAAGGAGAATGAACGATTTCAATATAAATGTAACATGGGTTATGAATACAGTGAAAGAGGAGATGCTGTATGCACTGAATCTGGATGGCGTCCGTTGCCTTCATGTGAAGAAAAATCATGTGATAATCCTTATATTCCAAATGGTGACTACTCACCTTTAAGGATTAAACACAGAACTGGAGATGAAATCACGTACCAGTGTAGAAATGGTTTTTATCCTGCAACCCGGGGAAATACAGCAAAATGCACAAGTACTGGCTGGATACCTGCTCCGAGATGTACCTTGAAACCTTGTGATTATCCAGACATTAAACATGGAGGTCTATATCATGAGAATATGCGTAGACCATACTTTCCAGTAGCTGTAGGAAAATATTACTCCTATTACTGTGATGAACATTTTGAGACTCCGTCAGGAAGTTACTGGGATCACATTCATTGCACACAAGATGGATGGTCGCCAGCAGTACCATGCCTCAGAAAATGTTATTTTCCTTATTTGGAAAATGGATATAATCAAAATTATGGAAGAAAGTTTGTACAGGGTAAATCTATAGACGTTGCCTGCCATCCTGGCTACGCTCTTCCAAAAGCGCAGACCACAGTTACATGTATGGAGAATGGCTGGTCTCCTACTCCCAGATGCATCCGTGTCAGCTTTACCCTCTAATAAGCTTGGATCCAGATCT
SEQ ID NO:4:SFTL序列
SFTL
SEQ ID NO:5—CFH核苷酸序列
ATGAGACTTCTAGCAAAGATTATTTGCCTTATGTTATGGGCTATTTGTGTAGCAGAAGATTGCAATGAACTTCCTCCAAGAAGAAATACAGAAATTCTGACAGGTTCCTGGTCTGACCAAACATATCCAGAAGGCACCCAGGCTATCTATAAATGCCGCCCTGGATATAGATCTCTTGGAAATGTAATAATGGTATGCAGGAAGGGAGAATGGGTTGCTCTTAATCCATTAAGGAAATGTCAGAAAAGGCCCTGTGGACATCCTGGAGATACTCCTTTTGGTACTTTTACCCTTACAGGAGGAAATGTGTTTGAATATGGTGTAAAAGCTGTGTATACATGTAATGAGGGGTATCAATTGCTAGGTGAGATTAATTACCGTGAATGTGACACAGATGGATGGACCAATGATATTCCTATATGTGAAGTTGTGAAGTGTTTACCAGTGACAGCACCAGAGAATGGAAAAATTGTCAGTAGTGCAATGGAACCAGATCGGGAATACCATTTTGGACAAGCAGTACGGTTTGTATGTAACTCAGGCTACAAGATTGAAGGAGATGAAGAAATGCATTGTTCAGACGATGGTTTTTGGAGTAAAGAGAAACCAAAGTGTGTGGAAATTTCATGCAAATCCCCAGATGTTATAAATGGATCTCCTATATCTCAGAAGATTATTTATAAGGAGAATGAACGATTTCAATATAAATGTAACATGGGTTATGAATACAGTGAAAGAGGAGATGCTGTATGCACTGAATCTGGATGGCGTCCGTTGCCTTCATGTGAAGAAAAATCATGTGATAATCCTTATATTCCAAATGGTGACTACTCACCTTTAAGGATTAAACACAGAACTGGAGATGAAATCACGTACCAGTGTAGAAATGGTTTTTATCCTGCAACCCGGGGAAATACAGCAAAATGCACAAGTACTGGCTGGATACCTGCTCCGAGATGTACCTTGAAACCTTGTGATTATCCAGACATTAAACATGGAGGTCTATATCATGAGAATATGCGTAGACCATACTTTCCAGTAGCTGTAGGAAAATATTACTCCTATTACTGTGATGAACATTTTGAGACTCCGTCAGGAAGTTACTGGGATCACATTCATTGCACACAAGATGGATGGTCGCCAGCAGTACCATGCCTCAGAAAATGTTATTTTCCTTATTTGGAAAATGGATATAATCAAAATTATGGAAGAAAGTTTGTACAGGGTAAATCTATAGACGTTGCCTGCCATCCTGGCTACGCTCTTCCAAAAGCGCAGACCACAGTTACATGTATGGAGAATGGCTGGTCTCCTACTCCCAGATGCATCCGTGTCAAAACATGTTCCAAATCAAGTATAGATATTGAGAATGGGTTTATTTCTGAATCTCAGTATACATATGCCTTAAAAGAAAAAGCGAAATATCAATGCAAACTAGGATATGTAACAGCAGATGGTGAAACATCAGGATCAATTACATGTGGGAAAGATGGATGGTCAGCTCAACCCACGTGCATTAAATCTTGTGATATCCCAGTATTTATGAATGCCAGAACTAAAAATGACTTCACATGGTTTAAGCTGAATGACACATTGGACTATGAATGCCATGATGGTTATGAAAGCAATACTGGAAGCACCACTGGTTCCATAGTGTGTGGTTACAATGGTTGGTCTGATTTACCCATATGTTATGAAAGAGAATGCGAACTTCCTAAAATAGATGTACACTTAGTTCCTGATCGCAAGAAAGACCAGTATAAAGTTGGAGAGGTGTTGAAATTCTCCTGCAAACCAGGATTTACAATAGTTGGACCTAATTCCGTTCAGTGCTACCACTTTGGATTGTCTCCTGACCTCCCAATATGTAAAGAGCAAGTACAATCATGTGGTCCACCTCCTGAACTCCTCAATGGGAATGTTAAGGAAAAAACGAAAGAAGAATATGGACACAGTGAAGTGGTGGAATATTATTGCAATCCTAGATTTCTAATGAAGGGACCTAATAAAATTCAATGTGTTGATGGAGAGTGGACAACTTTACCAGTGTGTATTGTGGAGGAGAGTACCTGTGGAGATATACCTGAACTTGAACATGGCTGGGCCCAGCTTTCTTCCCCTCCTTATTACTATGGAGATTCAGTGGAATTCAATTGCTCAGAATCATTTACAATGATTGGACACAGATCAATTACGTGTATTCATGGAGTATGGACCCAACTTCCCCAGTGTGTGGCAATAGATAAACTTAAGAAGTGCAAATCATCAAATTTAATTATACTTGAGGAACATTTAAAAAACAAGAAGGAATTCGATCATAATTCTAACATAAGGTACAGATGTAGAGGAAAAGAAGGATGGATACACACAGTCTGCATAAATGGAAGATGGGATCCAGAAGTGAACTGCTCAATGGCACAAATACAATTATGCCCACCTCCACCTCAGATTCCCAATTCTCACAATATGACAACCACACTGAATTATCGGGATGGAGAAAAAGTATCTGTTCTTTGCCAAGAAAATTATCTAATTCAGGAAGGAGAAGAAATTACATGCAAAGATGGAAGATGGCAGTCAATACCACTCTGTGTTGAAAAAATTCCATGTTCACAACCACCTCAGATAGAACACGGAACCATTAATTCATCCAGGTCTTCACAAGAAAGTTATGCACATGGGACTAAATTGAGTTATACTTGTGAGGGTGGTTTCAGGATATCTGAAGAAAATGAAACAACATGCTACATGGGAAAATGGAGTTCTCCACCTCAGTGTGAAGGCCTTCCTTGTAAATCTCCACCTGAGATTTCTCATGGTGTTGTAGCTCACATGTCAGACAGTTATCAGTATGGAGAAGAAGTTACGTACAAATGTTTTGAAGGTTTTGGAATTGATGGGCCTGCAATTGCAAAATGCTTAGGAGAAAAATGGTCTCACCCTCCATCATGCATAAAAACAGATTGTCTCAGTTTACCTAGCTTTGAAAATGCCATACCCATGGGAGAGAAGAAGGATGTGTATAAGGCGGGTGAGCAAGTGACTTACACTTGTGCAACATATTACAAAATGGATGGAGCCAGTAATGTAACATGCATTAATAGCAGATGGACAGGAAGGCCAACATGCAGAGACACCTCCTGTGTGAATCCGCCCACAGTACAAAATGCTTATATAGTGTCGAGACAGATGAGTAAATATCCATCTGGTGAGAGAGTACGTTATCAATGTAGGAGCCCTTATGAAATGTTTGGGGATGAAGAAGTGATGTGTTTAAATGGAAACTGGACGGAACCACCTCAATGCAAAGATTCTACAGGAAAATGTGGGCCCCCTCCACCTATTGACAATGGGGACATTACTTCATTCCCGTTGTCAGTATATGCTCCAGCTTCATCAGTTGAGTACCAATGCCAGAACTTGTATCAACTTGAGGGTAACAAGCGAATAACATGTAGAAATGGACAATGGTCAGAACCACCAAAATGCTTACATCCGTGTGTAATATCCCGAGAAATTATGGAAAATTATAACATAGCATTAAGGTGGACAGCCAAACAGAAGCTTTATTCGAGAACAGGTGAATCAGTTGAATTTGTGTGTAAACGGGGATATCGTCTTTCATCACGTTCTCACACATTGCGAACAACATGTTGGGATGGGAAACTGGAGTATCCAACTTGTGCAAAAAGATAG
SEQ ID NO:6—CRALBP启动子
ACGCGTTAACTAGTACCCTGGTGGTGGTGGTGGGGGGGGGGGGGTGCTCTCTCAGCAACCCCACCCCGGGATCTTGAGGAGAAAGAGGGCAGAGAAAAGAGGGAATGGGACTGGCCCAGATCCCAGCCCCACAGCCGGGCTTCCACATGGCCGAGCAGGAACTCCAGAGCAGGAGCACACAAAGGAGGGCTTTGATGCGCCTCCAGCCAGGCCCAGGCCTCTCCCCTCTCCCCTTTCTCTCTGGGTCTTCCTTTGCCCCACTGAGGGCCTCCTGTGAGCCCGATTTAACGGAAACTGTGGGCGGTGAGAAGTTCCTTATGACACACTAATCCCAACCTGCTGACCGGACCACGCCTCCAGCGGAGGGAACCTCTAGAGCTCCAGGACATTCAGGTACCAGGTAGCCCCAAGGAGGAGCTGCCGACCATCGAT
SEQ ID NO:7—典型的CFH AAV载体(具有CRALBP启动子)
CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTGCGGCCGCACGCGTTAACTAGTACCCTGGTGGTGGTGGTGGGGGGGGGGGGGTGCTCTCTCAGCAACCCCACCCCGGGATCTTGAGGAGAAAGAGGGCAGAGAAAAGAGGGAATGGGACTGGCCCAGATCCCAGCCCCACAGCCGGGCTTCCACATGGCCGAGCAGGAACTCCAGAGCAGGAGCACACAAAGGAGGGCTTTGATGCGCCTCCAGCCAGGCCCAGGCCTCTCCCCTCTCCCCTTTCTCTCTGGGTCTTCCTTTGCCCCACTGAGGGCCTCCTGTGAGCCCGATTTAACGGAAACTGTGGGCGGTGAGAAGTTCCTTATGACACACTAATCCCAACCTGCTGACCGGACCACGCCTCCAGCGGAGGGAACCTCTAGAGCTCCAGGACATTCAGGTACCAGGTAGCCCCAAGGAGGAGCTGCCGACCATCGATAGCTGCAGGCGGCCGCCGCCACCATGAGACTTCTAGCAAAGATTATTTGCCTTATGTTATGGGCTATTTGTGTAGCAGAAGATTGCAATGAACTTCCTCCAAGAAGAAATACAGAAATTCTGACAGGTTCCTGGTCTGACCAAACATATCCAGAAGGCACCCAGGCTATCTATAAATGCCGCCCTGGATATAGATCTCTTGGAAATGTAATAATGGTATGCAGGAAGGGAGAATGGGTTGCTCTTAATCCATTAAGGAAATGTCAGAAAAGGCCCTGTGGACATCCTGGAGATACTCCTTTTGGTACTTTTACCCTTACAGGAGGAAATGTGTTTGAATATGGTGTAAAAGCTGTGTATACATGTAATGAGGGGTATCAATTGCTAGGTGAGATTAATTACCGTGAATGTGACACAGATGGATGGACCAATGATATTCCTATATGTGAAGTTGTGAAGTGTTTACCAGTGACAGCACCAGAGAATGGAAAAATTGTCAGTAGTGCAATGGAACCAGATCGGGAATACCATTTTGGACAAGCAGTACGGTTTGTATGTAACTCAGGCTACAAGATTGAAGGAGATGAAGAAATGCATTGTTCAGACGATGGTTTTTGGAGTAAAGAGAAACCAAAGTGTGTGGAAATTTCATGCAAATCCCCAGATGTTATAAATGGATCTCCTATATCTCAGAAGATTATTTATAAGGAGAATGAACGATTTCAATATAAATGTAACATGGGTTATGAATACAGTGAAAGAGGAGATGCTGTATGCACTGAATCTGGATGGCGTCCGTTGCCTTCATGTGAAGAAAAATCATGTGATAATCCTTATATTCCAAATGGTGACTACTCACCTTTAAGGATTAAACACAGAACTGGAGATGAAATCACGTACCAGTGTAGAAATGGTTTTTATCCTGCAACCCGGGGAAATACAGCAAAATGCACAAGTACTGGCTGGATACCTGCTCCGAGATGTACCTTGAAACCTTGTGATTATCCAGACATTAAACATGGAGGTCTATATCATGAGAATATGCGTAGACCATACTTTCCAGTAGCTGTAGGAAAATATTACTCCTATTACTGTGATGAACATTTTGAGACTCCGTCAGGAAGTTACTGGGATCACATTCATTGCACACAAGATGGATGGTCGCCAGCAGTACCATGCCTCAGAAAATGTTATTTTCCTTATTTGGAAAATGGATATAATCAAAATTATGGAAGAAAGTTTGTACAGGGTAAATCTATAGACGTTGCCTGCCATCCTGGCTACGCTCTTCCAAAAGCGCAGACCACAGTTACATGTATGGAGAATGGCTGGTCTCCTACTCCCAGATGCATCCGTGTCAAAACATGTTCCAAATCAAGTATAGATATTGAGAATGGGTTTATTTCTGAATCTCAGTATACATATGCCTTAAAAGAAAAAGCGAAATATCAATGCAAACTAGGATATGTAACAGCAGATGGTGAAACATCAGGATCAATTACATGTGGGAAAGATGGATGGTCAGCTCAACCCACGTGCATTAAATCTTGTGATATCCCAGTATTTATGAATGCCAGAACTAAAAATGACTTCACATGGTTTAAGCTGAATGACACATTGGACTATGAATGCCATGATGGTTATGAAAGCAATACTGGAAGCACCACTGGTTCCATAGTGTGTGGTTACAATGGTTGGTCTGATTTACCCATATGTTATGAAAGAGAATGCGAACTTCCTAAAATAGATGTACACTTAGTTCCTGATCGCAAGAAAGACCAGTATAAAGTTGGAGAGGTGTTGAAATTCTCCTGCAAACCAGGATTTACAATAGTTGGACCTAATTCCGTTCAGTGCTACCACTTTGGATTGTCTCCTGACCTCCCAATATGTAAAGAGCAAGTACAATCATGTGGTCCACCTCCTGAACTCCTCAATGGGAATGTTAAGGAAAAAACGAAAGAAGAATATGGACACAGTGAAGTGGTGGAATATTATTGCAATCCTAGATTTCTAATGAAGGGACCTAATAAAATTCAATGTGTTGATGGAGAGTGGACAACTTTACCAGTGTGTATTGTGGAGGAGAGTACCTGTGGAGATATACCTGAACTTGAACATGGCTGGGCCCAGCTTTCTTCCCCTCCTTATTACTATGGAGATTCAGTGGAATTCAATTGCTCAGAATCATTTACAATGATTGGACACAGATCAATTACGTGTATTCATGGAGTATGGACCCAACTTCCCCAGTGTGTGGCAATAGATAAACTTAAGAAGTGCAAATCATCAAATTTAATTATACTTGAGGAACATTTAAAAAACAAGAAGGAATTCGATCATAATTCTAACATAAGGTACAGATGTAGAGGAAAAGAAGGATGGATACACACAGTCTGCATAAATGGAAGATGGGATCCAGAAGTGAACTGCTCAATGGCACAAATACAATTATGCCCACCTCCACCTCAGATTCCCAATTCTCACAATATGACAACCACACTGAATTATCGGGATGGAGAAAAAGTATCTGTTCTTTGCCAAGAAAATTATCTAATTCAGGAAGGAGAAGAAATTACATGCAAAGATGGAAGATGGCAGTCAATACCACTCTGTGTTGAAAAAATTCCATGTTCACAACCACCTCAGATAGAACACGGAACCATTAATTCATCCAGGTCTTCACAAGAAAGTTATGCACATGGGACTAAATTGAGTTATACTTGTGAGGGTGGTTTCAGGATATCTGAAGAAAATGAAACAACATGCTACATGGGAAAATGGAGTTCTCCACCTCAGTGTGAAGGCCTTCCTTGTAAATCTCCACCTGAGATTTCTCATGGTGTTGTAGCTCACATGTCAGACAGTTATCAGTATGGAGAAGAAGTTACGTACAAATGTTTTGAAGGTTTTGGAATTGATGGGCCTGCAATTGCAAAATGCTTAGGAGAAAAATGGTCTCACCCTCCATCATGCATAAAAACAGATTGTCTCAGTTTACCTAGCTTTGAAAATGCCATACCCATGGGAGAGAAGAAGGATGTGTATAAGGCGGGTGAGCAAGTGACTTACACTTGTGCAACATATTACAAAATGGATGGAGCCAGTAATGTAACATGCATTAATAGCAGATGGACAGGAAGGCCAACATGCAGAGACACCTCCTGTGTGAATCCGCCCACAGTACAAAATGCTTATATAGTGTCGAGACAGATGAGTAAATATCCATCTGGTGAGAGAGTACGTTATCAATGTAGGAGCCCTTATGAAATGTTTGGGGATGAAGAAGTGATGTGTTTAAATGGAAACTGGACGGAACCACCTCAATGCAAAGATTCTACAGGAAAATGTGGGCCCCCTCCACCTATTGACAATGGGGACATTACTTCATTCCCGTTGTCAGTATATGCTCCAGCTTCATCAGTTGAGTACCAATGCCAGAACTTGTATCAACTTGAGGGTAACAAGCGAATAACATGTAGAAATGGACAATGGTCAGAACCACCAAAATGCTTACATCCGTGTGTAATATCCCGAGAAATTATGGAAAATTATAACATAGCATTAAGGTGGACAGCCAAACAGAAGCTTTATTCGAGAACAGGTGAATCAGTTGAATTTGTGTGTAAACGGGGATATCGTCTTTCATCACGTTCTCACACATTGCGAACAACATGTTGGGATGGGAAACTGGAGTATCCAACTTGTGCAAAAAGATAGCTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGGTTAACTCGAGGGATCCCGGACCGAGCGGCCGCAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGGGGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATACGTCAAAGCAACCATAGTACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTTGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGGCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTACAATTTTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGT
SEQ ID NO:8—EF1a启动子
ACGCGTTAACTAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAG
SEQ ID NO:9—典型的CFH AAV载体(EF1a启动子)
CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTGCGGCCGCACGCGTTAACTAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGATCGATAGCTGCAGGCGGCCGCCGCCACCATGAGACTTCTAGCAAAGATTATTTGCCTTATGTTATGGGCTATTTGTGTAGCAGAAGATTGCAATGAACTTCCTCCAAGAAGAAATACAGAAATTCTGACAGGTTCCTGGTCTGACCAAACATATCCAGAAGGCACCCAGGCTATCTATAAATGCCGCCCTGGATATAGATCTCTTGGAAATGTAATAATGGTATGCAGGAAGGGAGAATGGGTTGCTCTTAATCCATTAAGGAAATGTCAGAAAAGGCCCTGTGGACATCCTGGAGATACTCCTTTTGGTACTTTTACCCTTACAGGAGGAAATGTGTTTGAATATGGTGTAAAAGCTGTGTATACATGTAATGAGGGGTATCAATTGCTAGGTGAGATTAATTACCGTGAATGTGACACAGATGGATGGACCAATGATATTCCTATATGTGAAGTTGTGAAGTGTTTACCAGTGACAGCACCAGAGAATGGAAAAATTGTCAGTAGTGCAATGGAACCAGATCGGGAATACCATTTTGGACAAGCAGTACGGTTTGTATGTAACTCAGGCTACAAGATTGAAGGAGATGAAGAAATGCATTGTTCAGACGATGGTTTTTGGAGTAAAGAGAAACCAAAGTGTGTGGAAATTTCATGCAAATCCCCAGATGTTATAAATGGATCTCCTATATCTCAGAAGATTATTTATAAGGAGAATGAACGATTTCAATATAAATGTAACATGGGTTATGAATACAGTGAAAGAGGAGATGCTGTATGCACTGAATCTGGATGGCGTCCGTTGCCTTCATGTGAAGAAAAATCATGTGATAATCCTTATATTCCAAATGGTGACTACTCACCTTTAAGGATTAAACACAGAACTGGAGATGAAATCACGTACCAGTGTAGAAATGGTTTTTATCCTGCAACCCGGGGAAATACAGCAAAATGCACAAGTACTGGCTGGATACCTGCTCCGAGATGTACCTTGAAACCTTGTGATTATCCAGACATTAAACATGGAGGTCTATATCATGAGAATATGCGTAGACCATACTTTCCAGTAGCTGTAGGAAAATATTACTCCTATTACTGTGATGAACATTTTGAGACTCCGTCAGGAAGTTACTGGGATCACATTCATTGCACACAAGATGGATGGTCGCCAGCAGTACCATGCCTCAGAAAATGTTATTTTCCTTATTTGGAAAATGGATATAATCAAAATTATGGAAGAAAGTTTGTACAGGGTAAATCTATAGACGTTGCCTGCCATCCTGGCTACGCTCTTCCAAAAGCGCAGACCACAGTTACATGTATGGAGAATGGCTGGTCTCCTACTCCCAGATGCATCCGTGTCAAAACATGTTCCAAATCAAGTATAGATATTGAGAATGGGTTTATTTCTGAATCTCAGTATACATATGCCTTAAAAGAAAAAGCGAAATATCAATGCAAACTAGGATATGTAACAGCAGATGGTGAAACATCAGGATCAATTACATGTGGGAAAGATGGATGGTCAGCTCAACCCACGTGCATTAAATCTTGTGATATCCCAGTATTTATGAATGCCAGAACTAAAAATGACTTCACATGGTTTAAGCTGAATGACACATTGGACTATGAATGCCATGATGGTTATGAAAGCAATACTGGAAGCACCACTGGTTCCATAGTGTGTGGTTACAATGGTTGGTCTGATTTACCCATATGTTATGAAAGAGAATGCGAACTTCCTAAAATAGATGTACACTTAGTTCCTGATCGCAAGAAAGACCAGTATAAAGTTGGAGAGGTGTTGAAATTCTCCTGCAAACCAGGATTTACAATAGTTGGACCTAATTCCGTTCAGTGCTACCACTTTGGATTGTCTCCTGACCTCCCAATATGTAAAGAGCAAGTACAATCATGTGGTCCACCTCCTGAACTCCTCAATGGGAATGTTAAGGAAAAAACGAAAGAAGAATATGGACACAGTGAAGTGGTGGAATATTATTGCAATCCTAGATTTCTAATGAAGGGACCTAATAAAATTCAATGTGTTGATGGAGAGTGGACAACTTTACCAGTGTGTATTGTGGAGGAGAGTACCTGTGGAGATATACCTGAACTTGAACATGGCTGGGCCCAGCTTTCTTCCCCTCCTTATTACTATGGAGATTCAGTGGAATTCAATTGCTCAGAATCATTTACAATGATTGGACACAGATCAATTACGTGTATTCATGGAGTATGGACCCAACTTCCCCAGTGTGTGGCAATAGATAAACTTAAGAAGTGCAAATCATCAAATTTAATTATACTTGAGGAACATTTAAAAAACAAGAAGGAATTCGATCATAATTCTAACATAAGGTACAGATGTAGAGGAAAAGAAGGATGGATACACACAGTCTGCATAAATGGAAGATGGGATCCAGAAGTGAACTGCTCAATGGCACAAATACAATTATGCCCACCTCCACCTCAGATTCCCAATTCTCACAATATGACAACCACACTGAATTATCGGGATGGAGAAAAAGTATCTGTTCTTTGCCAAGAAAATTATCTAATTCAGGAAGGAGAAGAAATTACATGCAAAGATGGAAGATGGCAGTCAATACCACTCTGTGTTGAAAAAATTCCATGTTCACAACCACCTCAGATAGAACACGGAACCATTAATTCATCCAGGTCTTCACAAGAAAGTTATGCACATGGGACTAAATTGAGTTATACTTGTGAGGGTGGTTTCAGGATATCTGAAGAAAATGAAACAACATGCTACATGGGAAAATGGAGTTCTCCACCTCAGTGTGAAGGCCTTCCTTGTAAATCTCCACCTGAGATTTCTCATGGTGTTGTAGCTCACATGTCAGACAGTTATCAGTATGGAGAAGAAGTTACGTACAAATGTTTTGAAGGTTTTGGAATTGATGGGCCTGCAATTGCAAAATGCTTAGGAGAAAAATGGTCTCACCCTCCATCATGCATAAAAACAGATTGTCTCAGTTTACCTAGCTTTGAAAATGCCATACCCATGGGAGAGAAGAAGGATGTGTATAAGGCGGGTGAGCAAGTGACTTACACTTGTGCAACATATTACAAAATGGATGGAGCCAGTAATGTAACATGCATTAATAGCAGATGGACAGGAAGGCCAACATGCAGAGACACCTCCTGTGTGAATCCGCCCACAGTACAAAATGCTTATATAGTGTCGAGACAGATGAGTAAATATCCATCTGGTGAGAGAGTACGTTATCAATGTAGGAGCCCTTATGAAATGTTTGGGGATGAAGAAGTGATGTGTTTAAATGGAAACTGGACGGAACCACCTCAATGCAAAGATTCTACAGGAAAATGTGGGCCCCCTCCACCTATTGACAATGGGGACATTACTTCATTCCCGTTGTCAGTATATGCTCCAGCTTCATCAGTTGAGTACCAATGCCAGAACTTGTATCAACTTGAGGGTAACAAGCGAATAACATGTAGAAATGGACAATGGTCAGAACCACCAAAATGCTTACATCCGTGTGTAATATCCCGAGAAATTATGGAAAATTATAACATAGCATTAAGGTGGACAGCCAAACAGAAGCTTTATTCGAGAACAGGTGAATCAGTTGAATTTGTGTGTAAACGGGGATATCGTCTTTCATCACGTTCTCACACATTGCGAACAACATGTTGGGATGGGAAACTGGAGTATCCAACTTGTGCAAAAAGATAGCTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGGTTAACTCGAGGGATCCCGGACCGAGCGGCCGCAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGGGGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATACGTCAAAGCAACCATAGTACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTTGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGGCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTACAATTTTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGT
SEQ ID NO:10—SV40i内含子
GTAAGTTTAGTCTTTTTGTCTTTTATTTCAGGTCCCGGATCCGGTGGTGGTGCAAATCAAAGAACTGCTCCTCAGTGGATGTTGCCTTTACTTCTAGGCCTGTACGGAAGTGTTACTTCTGCTCTAAAAGCTGCGGAATTGTACCCGCGG
SEQ ID NO:11—典型的CFH AAV载体(具有EF1a启动子和SV40i内含子)
CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTGCGGCCGCACGCGTTAACTAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTAAGTTTAGTCTTTTTGTCTTTTATTTCAGGTCCCGGATCCGGTGGTGGTGCAAATCAAAGAACTGCTCCTCAGTGGATGTTGCCTTTACTTCTAGGCCTGTACGGAAGTGTTACTTCTGCTCTAAAAGCTGCGGAATTGTACCCGCGGATCGATAGCTGCAGGCGGCCGCCGCCACCATGAGACTTCTAGCAAAGATTATTTGCCTTATGTTATGGGCTATTTGTGTAGCAGAAGATTGCAATGAACTTCCTCCAAGAAGAAATACAGAAATTCTGACAGGTTCCTGGTCTGACCAAACATATCCAGAAGGCACCCAGGCTATCTATAAATGCCGCCCTGGATATAGATCTCTTGGAAATGTAATAATGGTATGCAGGAAGGGAGAATGGGTTGCTCTTAATCCATTAAGGAAATGTCAGAAAAGGCCCTGTGGACATCCTGGAGATACTCCTTTTGGTACTTTTACCCTTACAGGAGGAAATGTGTTTGAATATGGTGTAAAAGCTGTGTATACATGTAATGAGGGGTATCAATTGCTAGGTGAGATTAATTACCGTGAATGTGACACAGATGGATGGACCAATGATATTCCTATATGTGAAGTTGTGAAGTGTTTACCAGTGACAGCACCAGAGAATGGAAAAATTGTCAGTAGTGCAATGGAACCAGATCGGGAATACCATTTTGGACAAGCAGTACGGTTTGTATGTAACTCAGGCTACAAGATTGAAGGAGATGAAGAAATGCATTGTTCAGACGATGGTTTTTGGAGTAAAGAGAAACCAAAGTGTGTGGAAATTTCATGCAAATCCCCAGATGTTATAAATGGATCTCCTATATCTCAGAAGATTATTTATAAGGAGAATGAACGATTTCAATATAAATGTAACATGGGTTATGAATACAGTGAAAGAGGAGATGCTGTATGCACTGAATCTGGATGGCGTCCGTTGCCTTCATGTGAAGAAAAATCATGTGATAATCCTTATATTCCAAATGGTGACTACTCACCTTTAAGGATTAAACACAGAACTGGAGATGAAATCACGTACCAGTGTAGAAATGGTTTTTATCCTGCAACCCGGGGAAATACAGCAAAATGCACAAGTACTGGCTGGATACCTGCTCCGAGATGTACCTTGAAACCTTGTGATTATCCAGACATTAAACATGGAGGTCTATATCATGAGAATATGCGTAGACCATACTTTCCAGTAGCTGTAGGAAAATATTACTCCTATTACTGTGATGAACATTTTGAGACTCCGTCAGGAAGTTACTGGGATCACATTCATTGCACACAAGATGGATGGTCGCCAGCAGTACCATGCCTCAGAAAATGTTATTTTCCTTATTTGGAAAATGGATATAATCAAAATTATGGAAGAAAGTTTGTACAGGGTAAATCTATAGACGTTGCCTGCCATCCTGGCTACGCTCTTCCAAAAGCGCAGACCACAGTTACATGTATGGAGAATGGCTGGTCTCCTACTCCCAGATGCATCCGTGTCAAAACATGTTCCAAATCAAGTATAGATATTGAGAATGGGTTTATTTCTGAATCTCAGTATACATATGCCTTAAAAGAAAAAGCGAAATATCAATGCAAACTAGGATATGTAACAGCAGATGGTGAAACATCAGGATCAATTACATGTGGGAAAGATGGATGGTCAGCTCAACCCACGTGCATTAAATCTTGTGATATCCCAGTATTTATGAATGCCAGAACTAAAAATGACTTCACATGGTTTAAGCTGAATGACACATTGGACTATGAATGCCATGATGGTTATGAAAGCAATACTGGAAGCACCACTGGTTCCATAGTGTGTGGTTACAATGGTTGGTCTGATTTACCCATATGTTATGAAAGAGAATGCGAACTTCCTAAAATAGATGTACACTTAGTTCCTGATCGCAAGAAAGACCAGTATAAAGTTGGAGAGGTGTTGAAATTCTCCTGCAAACCAGGATTTACAATAGTTGGACCTAATTCCGTTCAGTGCTACCACTTTGGATTGTCTCCTGACCTCCCAATATGTAAAGAGCAAGTACAATCATGTGGTCCACCTCCTGAACTCCTCAATGGGAATGTTAAGGAAAAAACGAAAGAAGAATATGGACACAGTGAAGTGGTGGAATATTATTGCAATCCTAGATTTCTAATGAAGGGACCTAATAAAATTCAATGTGTTGATGGAGAGTGGACAACTTTACCAGTGTGTATTGTGGAGGAGAGTACCTGTGGAGATATACCTGAACTTGAACATGGCTGGGCCCAGCTTTCTTCCCCTCCTTATTACTATGGAGATTCAGTGGAATTCAATTGCTCAGAATCATTTACAATGATTGGACACAGATCAATTACGTGTATTCATGGAGTATGGACCCAACTTCCCCAGTGTGTGGCAATAGATAAACTTAAGAAGTGCAAATCATCAAATTTAATTATACTTGAGGAACATTTAAAAAACAAGAAGGAATTCGATCATAATTCTAACATAAGGTACAGATGTAGAGGAAAAGAAGGATGGATACACACAGTCTGCATAAATGGAAGATGGGATCCAGAAGTGAACTGCTCAATGGCACAAATACAATTATGCCCACCTCCACCTCAGATTCCCAATTCTCACAATATGACAACCACACTGAATTATCGGGATGGAGAAAAAGTATCTGTTCTTTGCCAAGAAAATTATCTAATTCAGGAAGGAGAAGAAATTACATGCAAAGATGGAAGATGGCAGTCAATACCACTCTGTGTTGAAAAAATTCCATGTTCACAACCACCTCAGATAGAACACGGAACCATTAATTCATCCAGGTCTTCACAAGAAAGTTATGCACATGGGACTAAATTGAGTTATACTTGTGAGGGTGGTTTCAGGATATCTGAAGAAAATGAAACAACATGCTACATGGGAAAATGGAGTTCTCCACCTCAGTGTGAAGGCCTTCCTTGTAAATCTCCACCTGAGATTTCTCATGGTGTTGTAGCTCACATGTCAGACAGTTATCAGTATGGAGAAGAAGTTACGTACAAATGTTTTGAAGGTTTTGGAATTGATGGGCCTGCAATTGCAAAATGCTTAGGAGAAAAATGGTCTCACCCTCCATCATGCATAAAAACAGATTGTCTCAGTTTACCTAGCTTTGAAAATGCCATACCCATGGGAGAGAAGAAGGATGTGTATAAGGCGGGTGAGCAAGTGACTTACACTTGTGCAACATATTACAAAATGGATGGAGCCAGTAATGTAACATGCATTAATAGCAGATGGACAGGAAGGCCAACATGCAGAGACACCTCCTGTGTGAATCCGCCCACAGTACAAAATGCTTATATAGTGTCGAGACAGATGAGTAAATATCCATCTGGTGAGAGAGTACGTTATCAATGTAGGAGCCCTTATGAAATGTTTGGGGATGAAGAAGTGATGTGTTTAAATGGAAACTGGACGGAACCACCTCAATGCAAAGATTCTACAGGAAAATGTGGGCCCCCTCCACCTATTGACAATGGGGACATTACTTCATTCCCGTTGTCAGTATATGCTCCAGCTTCATCAGTTGAGTACCAATGCCAGAACTTGTATCAACTTGAGGGTAACAAGCGAATAACATGTAGAAATGGACAATGGTCAGAACCACCAAAATGCTTACATCCGTGTGTAATATCCCGAGAAATTATGGAAAATTATAACATAGCATTAAGGTGGACAGCCAAACAGAAGCTTTATTCGAGAACAGGTGAATCAGTTGAATTTGTGTGTAAACGGGGATATCGTCTTTCATCACGTTCTCACACATTGCGAACAACATGTTGGGATGGGAAACTGGAGTATCCAACTTGTGCAAAAAGATAGCTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGGTTAACTCGAGGGATCCCGGACCGAGCGGCCGCAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGGGGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATACGTCAAAGCAACCATAGTACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTTGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTT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SEQ ID NO:12—HSP70启动子
ACTAGTCCTGCAGGGCCGCCCACTCCCCCTTCCTCTCAGGGTCCCTGTCCCCTCCAGTGAATCCCAGAAGACTCTGGAGAGTTCTGAGCAGGGGGCGGCACTCTGGCCTCTGATTGGTCCAAGGAAGGCTGGGGGGCAGGACGGGAGGCGAAAACCCTGGAATATTCCCGACCTGGCAGCCTCATCGAGCTCGGTGATTGGCTCAGAAGGGAAAAGGCGGGTCTCCGTGACGACTTATAAAAGCCCAGGGGCAAGCGGTCCGGATAACGGCTAGCCTGAGGAGCTGCTGCGACAGTCCACTACCTTTTTCGAGAGTGACTCCCGTTGTCCCAAGGCTTCCCAGAGCGAACCTGTGCGGCTGCAGGCACCGGCGCGTCGAGTTTCCGGCGTCCGGAAGGACCGAGCTCTTCTCGCGGATCCAGTGTTCCGTTTCCAGCCCCCAATCTCAGAGCGGAGCCGACAGAGAGCAGGGAACC
SEQ ID NO:13—典型的CFH AAV载体(具有HSP70启动子)
CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTGCGGCCGCGTTAACTAGTCCTGCAGGGCCGCCCACTCCCCCTTCCTCTCAGGGTCCCTGTCCCCTCCAGTGAATCCCAGAAGACTCTGGAGAGTTCTGAGCAGGGGGCGGCACTCTGGCCTCTGATTGGTCCAAGGAAGGCTGGGGGGCAGGACGGGAGGCGAAAACCCTGGAATATTCCCGACCTGGCAGCCTCATCGAGCTCGGTGATTGGCTCAGAAGGGAAAAGGCGGGTCTCCGTGACGACTTATAAAAGCCCAGGGGCAAGCGGTCCGGATAACGGCTAGCCTGAGGAGCTGCTGCGACAGTCCACTACCTTTTTCGAGAGTGACTCCCGTTGTCCCAAGGCTTCCCAGAGCGAACCTGTGCGGCTGCAGGCACCGGCGCGTCGAGTTTCCGGCGTCCGGAAGGACCGAGCTCTTCTCGCGGATCCAGTGTTCCGTTTCCAGCCCCCAATCTCAGAGCGGAGCCGACAGAGAGCAGGGAACCCTGCAGATCGATGCGGCCGCACCATGAGACTTCTAGCAAAGATTATTTGCCTTATGTTATGGGCTATTTGTGTAGCAGAAGATTGCAATGAACTTCCTCCAAGAAGAAATACAGAAATTCTGACAGGTTCCTGGTCTGACCAAACATATCCAGAAGGCACCCAGGCTATCTATAAATGCCGCCCTGGATATAGATCTCTTGGAAATGTAATAATGGTATGCAGGAAGGGAGAATGGGTTGCTCTTAATCCATTAAGGAAATGTCAGAAAAGGCCCTGTGGACATCCTGGAGATACTCCTTTTGGTACTTTTACCCTTACAGGAGGAAATGTGTTTGAATATGGTGTAAAAGCTGTGTATACATGTAATGAGGGGTATCAATTGCTAGGTGAGATTAATTACCGTGAATGTGACACAGATGGATGGACCAATGATATTCCTATATGTGAAGTTGTGAAGTGTTTACCAGTGACAGCACCAGAGAATGGAAAAATTGTCAGTAGTGCAATGGAACCAGATCGGGAATACCATTTTGGACAAGCAGTACGGTTTGTATGTAACTCAGGCTACAAGATTGAAGGAGATGAAGAAATGCATTGTTCAGACGATGGTTTTTGGAGTAAAGAGAAACCAAAGTGTGTGGAAATTTCATGCAAATCCCCAGATGTTATAAATGGATCTCCTATATCTCAGAAGATTATTTATAAGGAGAATGAACGATTTCAATATAAATGTAACATGGGTTATGAATACAGTGAAAGAGGAGATGCTGTATGCACTGAATCTGGATGGCGTCCGTTGCCTTCATGTGAAGAAAAATCATGTGATAATCCTTATATTCCAAATGGTGACTACTCACCTTTAAGGATTAAACACAGAACTGGAGATGAAATCACGTACCAGTGTAGAAATGGTTTTTATCCTGCAACCCGGGGAAATACAGCAAAATGCACAAGTACTGGCTGGATACCTGCTCCGAGATGTACCTTGAAACCTTGTGATTATCCAGACATTAAACATGGAGGTCTATATCATGAGAATATGCGTAGACCATACTTTCCAGTAGCTGTAGGAAAATATTACTCCTATTACTGTGATGAACATTTTGAGACTCCGTCAGGAAGTTACTGGGATCACATTCATTGCACACAAGATGGATGGTCGCCAGCAGTACCATGCCTCAGAAAATGTTATTTTCCTTATTTGGAAAATGGATATAATCAAAATTATGGAAGAAAGTTTGTACAGGGTAAATCTATAGACGTTGCCTGCCATCCTGGCTACGCTCTTCCAAAAGCGCAGACCACAGTTACATGTATGGAGAATGGCTGGTCTCCTACTCCCAGATGCATCCGTGTCAAAACATGTTCCAAATCAAGTATAGATATTGAGAATGGGTTTATTTCTGAATCTCAGTATACATATGCCTTAAAAGAAAAAGCGAAATATCAATGCAAACTAGGATATGTAACAGCAGATGGTGAAACATCAGGATCAATTACATGTGGGAAAGATGGATGGTCAGCTCAACCCACGTGCATTAAATCTTGTGATATCCCAGTATTTATGAATGCCAGAACTAAAAATGACTTCACATGGTTTAAGCTGAATGACACATTGGACTATGAATGCCATGATGGTTATGAAAGCAATACTGGAAGCACCACTGGTTCCATAGTGTGTGGTTACAATGGTTGGTCTGATTTACCCATATGTTATGAAAGAGAATGCGAACTTCCTAAAATAGATGTACACTTAGTTCCTGATCGCAAGAAAGACCAGTATAAAGTTGGAGAGGTGTTGAAATTCTCCTGCAAACCAGGATTTACAATAGTTGGACCTAATTCCGTTCAGTGCTACCACTTTGGATTGTCTCCTGACCTCCCAATATGTAAAGAGCAAGTACAATCATGTGGTCCACCTCCTGAACTCCTCAATGGGAATGTTAAGGAAAAAACGAAAGAAGAATATGGACACAGTGAAGTGGTGGAATATTATTGCAATCCTAGATTTCTAATGAAGGGACCTAATAAAATTCAATGTGTTGATGGAGAGTGGACAACTTTACCAGTGTGTATTGTGGAGGAGAGTACCTGTGGAGATATACCTGAACTTGAACATGGCTGGGCCCAGCTTTCTTCCCCTCCTTATTACTATGGAGATTCAGTGGAATTCAATTGCTCAGAATCATTTACAATGATTGGACACAGATCAATTACGTGTATTCATGGAGTATGGACCCAACTTCCCCAGTGTGTGGCAATAGATAAACTTAAGAAGTGCAAATCATCAAATTTAATTATACTTGAGGAACATTTAAAAAACAAGAAGGAATTCGATCATAATTCTAACATAAGGTACAGATGTAGAGGAAAAGAAGGATGGATACACACAGTCTGCATAAATGGAAGATGGGATCCAGAAGTGAACTGCTCAATGGCACAAATACAATTATGCCCACCTCCACCTCAGATTCCCAATTCTCACAATATGACAACCACACTGAATTATCGGGATGGAGAAAAAGTATCTGTTCTTTGCCAAGAAAATTATCTAATTCAGGAAGGAGAAGAAATTACATGCAAAGATGGAAGATGGCAGTCAATACCACTCTGTGTTGAAAAAATTCCATGTTCACAACCACCTCAGATAGAACACGGAACCATTAATTCATCCAGGTCTTCACAAGAAAGTTATGCACATGGGACTAAATTGAGTTATACTTGTGAGGGTGGTTTCAGGATATCTGAAGAAAATGAAACAACATGCTACATGGGAAAATGGAGTTCTCCACCTCAGTGTGAAGGCCTTCCTTGTAAATCTCCACCTGAGATTTCTCATGGTGTTGTAGCTCACATGTCAGACAGTTATCAGTATGGAGAAGAAGTTACGTACAAATGTTTTGAAGGTTTTGGAATTGATGGGCCTGCAATTGCAAAATGCTTAGGAGAAAAATGGTCTCACCCTCCATCATGCATAAAAACAGATTGTCTCAGTTTACCTAGCTTTGAAAATGCCATACCCATGGGAGAGAAGAAGGATGTGTATAAGGCGGGTGAGCAAGTGACTTACACTTGTGCAACATATTACAAAATGGATGGAGCCAGTAATGTAACATGCATTAATAGCAGATGGACAGGAAGGCCAACATGCAGAGACACCTCCTGTGTGAATCCGCCCACAGTACAAAATGCTTATATAGTGTCGAGACAGATGAGTAAATATCCATCTGGTGAGAGAGTACGTTATCAATGTAGGAGCCCTTATGAAATGTTTGGGGATGAAGAAGTGATGTGTTTAAATGGAAACTGGACGGAACCACCTCAATGCAAAGATTCTACAGGAAAATGTGGGCCCCCTCCACCTATTGACAATGGGGACATTACTTCATTCCCGTTGTCAGTATATGCTCCAGCTTCATCAGTTGAGTACCAATGCCAGAACTTGTATCAACTTGAGGGTAACAAGCGAATAACATGTAGAAATGGACAATGGTCAGAACCACCAAAATGCTTACATCCGTGTGTAATATCCCGAGAAATTATGGAAAATTATAACATAGCATTAAGGTGGACAGCCAAACAGAAGCTTTATTCGAGAACAGGTGAATCAGTTGAATTTGTGTGTAAACGGGGATATCGTCTTTCATCACGTTCTCACACATTGCGAACAACATGTTGGGATGGGAAACTGGAGTATCCAACTTGTGCAAAAAGATAGCTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGGTTAACTCGAGGGATCCCGGACCGAGCGGCCGCAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGGGGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATACGTCAAAGCAACCATAGTACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTT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SEQ ID NO:14—sCBA启动子
ACTAGTCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGG
SEQ ID NO:15—典型的CFH AAV载体(具有sCBA启动子和SV40i内含子)
CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTGCGGCCGCACGCGTTAACTAGTCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGGTAAGTTTAGTCTTTTTGTCTTTTATTTCAGGTCCCGGATCCGGTGGTGGTGCAAATCAAAGAACTGCTCCTCAGTGGATGTTGCCTTTACTTCTAGGCCTGTACGGAAGTGTTACTTCTGCTCTAAAAGCTGCGGAATTGTACCCGCGGATCGATAGCTGCAGGCGGCCGCCGCCACCATGAGACTTCTAGCAAAGATTATTTGCCTTATGTTATGGGCTATTTGTGTAGCAGAAGATTGCAATGAACTTCCTCCAAGAAGAAATACAGAAATTCTGACAGGTTCCTGGTCTGACCAAACATATCCAGAAGGCACCCAGGCTATCTATAAATGCCGCCCTGGATATAGATCTCTTGGAAATGTAATAATGGTATGCAGGAAGGGAGAATGGGTTGCTCTTAATCCATTAAGGAAATGTCAGAAAAGGCCCTGTGGACATCCTGGAGATACTCCTTTTGGTACTTTTACCCTTACAGGAGGAAATGTGTTTGAATATGGTGTAAAAGCTGTGTATACATGTAATGAGGGGTATCAATTGCTAGGTGAGATTAATTACCGTGAATGTGACACAGATGGATGGACCAATGATATTCCTATATGTGAAGTTGTGAAGTGTTTACCAGTGACAGCACCAGAGAATGGAAAAATTGTCAGTAGTGCAATGGAACCAGATCGGGAATACCATTTTGGACAAGCAGTACGGTTTGTATGTAACTCAGGCTACAAGATTGAAGGAGATGAAGAAATGCATTGTTCAGACGATGGTTTTTGGAGTAAAGAGAAACCAAAGTGTGTGGAAATTTCATGCAAATCCCCAGATGTTATAAATGGATCTCCTATATCTCAGAAGATTATTTATAAGGAGAATGAACGATTTCAATATAAATGTAACATGGGTTATGAATACAGTGAAAGAGGAGATGCTGTATGCACTGAATCTGGATGGCGTCCGTTGCCTTCATGTGAAGAAAAATCATGTGATAATCCTTATATTCCAAATGGTGACTACTCACCTTTAAGGATTAAACACAGAACTGGAGATGAAATCACGTACCAGTGTAGAAATGGTTTTTATCCTGCAACCCGGGGAAATACAGCAAAATGCACAAGTACTGGCTGGATACCTGCTCCGAGATGTACCTTGAAACCTTGTGATTATCCAGACATTAAACATGGAGGTCTATATCATGAGAATATGCGTAGACCATACTTTCCAGTAGCTGTAGGAAAATATTACTCCTATTACTGTGATGAACATTTTGAGACTCCGTCAGGAAGTTACTGGGATCACATTCATTGCACACAAGATGGATGGTCGCCAGCAGTACCATGCCTCAGAAAATGTTATTTTCCTTATTTGGAAAATGGATATAATCAAAATTATGGAAGAAAGTTTGTACAGGGTAAATCTATAGACGTTGCCTGCCATCCTGGCTACGCTCTTCCAAAAGCGCAGACCACAGTTACATGTATGGAGAATGGCTGGTCTCCTACTCCCAGATGCATCCGTGTCAAAACATGTTCCAAATCAAGTATAGATATTGAGAATGGGTTTATTTCTGAATCTCAGTATACATATGCCTTAAAAGAAAAAGCGAAATATCAATGCAAACTAGGATATGTAACAGCAGATGGTGAAACATCAGGATCAATTACATGTGGGAAAGATGGATGGTCAGCTCAACCCACGTGCATTAAATCTTGTGATATCCCAGTATTTATGAATGCCAGAACTAAAAATGACTTCACATGGTTTAAGCTGAATGACACATTGGACTATGAATGCCATGATGGTTATGAAAGCAATACTGGAAGCACCACTGGTTCCATAGTGTGTGGTTACAATGGTTGGTCTGATTTACCCATATGTTATGAAAGAGAATGCGAACTTCCTAAAATAGATGTACACTTAGTTCCTGATCGCAAGAAAGACCAGTATAAAGTTGGAGAGGTGTTGAAATTCTCCTGCAAACCAGGATTTACAATAGTTGGACCTAATTCCGTTCAGTGCTACCACTTTGGATTGTCTCCTGACCTCCCAATATGTAAAGAGCAAGTACAATCATGTGGTCCACCTCCTGAACTCCTCAATGGGAATGTTAAGGAAAAAACGAAAGAAGAATATGGACACAGTGAAGTGGTGGAATATTATTGCAATCCTAGATTTCTAATGAAGGGACCTAATAAAATTCAATGTGTTGATGGAGAGTGGACAACTTTACCAGTGTGTATTGTGGAGGAGAGTACCTGTGGAGATATACCTGAACTTGAACATGGCTGGGCCCAGCTTTCTTCCCCTCCTTATTACTATGGAGATTCAGTGGAATTCAATTGCTCAGAATCATTTACAATGATTGGACACAGATCAATTACGTGTATTCATGGAGTATGGACCCAACTTCCCCAGTGTGTGGCAATAGATAAACTTAAGAAGTGCAAATCATCAAATTTAATTATACTTGAGGAACATTTAAAAAACAAGAAGGAATTCGATCATAATTCTAACATAAGGTACAGATGTAGAGGAAAAGAAGGATGGATACACACAGTCTGCATAAATGGAAGATGGGATCCAGAAGTGAACTGCTCAATGGCACAAATACAATTATGCCCACCTCCACCTCAGATTCCCAATTCTCACAATATGACAACCACACTGAATTATCGGGATGGAGAAAAAGTATCTGTTCTTTGCCAAGAAAATTATCTAATTCAGGAAGGAGAAGAAATTACATGCAAAGATGGAAGATGGCAGTCAATACCACTCTGTGTTGAAAAAATTCCATGTTCACAACCACCTCAGATAGAACACGGAACCATTAATTCATCCAGGTCTTCACAAGAAAGTTATGCACATGGGACTAAATTGAGTTATACTTGTGAGGGTGGTTTCAGGATATCTGAAGAAAATGAAACAACATGCTACATGGGAAAATGGAGTTCTCCACCTCAGTGTGAAGGCCTTCCTTGTAAATCTCCACCTGAGATTTCTCATGGTGTTGTAGCTCACATGTCAGACAGTTATCAGTATGGAGAAGAAGTTACGTACAAATGTTTTGAAGGTTTTGGAATTGATGGGCCTGCAATTGCAAAATGCTTAGGAGAAAAATGGTCTCACCCTCCATCATGCATAAAAACAGATTGTCTCAGTTTACCTAGCTTTGAAAATGCCATACCCATGGGAGAGAAGAAGGATGTGTATAAGGCGGGTGAGCAAGTGACTTACACTTGTGCAACATATTACAAAATGGATGGAGCCAGTAATGTAACATGCATTAATAGCAGATGGACAGGAAGGCCAACATGCAGAGACACCTCCTGTGTGAATCCGCCCACAGTACAAAATGCTTATATAGTGTCGAGACAGATGAGTAAATATCCATCTGGTGAGAGAGTACGTTATCAATGTAGGAGCCCTTATGAAATGTTTGGGGATGAAGAAGTGATGTGTTTAAATGGAAACTGGACGGAACCACCTCAATGCAAAGATTCTACAGGAAAATGTGGGCCCCCTCCACCTATTGACAATGGGGACATTACTTCATTCCCGTTGTCAGTATATGCTCCAGCTTCATCAGTTGAGTACCAATGCCAGAACTTGTATCAACTTGAGGGTAACAAGCGAATAACATGTAGAAATGGACAATGGTCAGAACCACCAAAATGCTTACATCCGTGTGTAATATCCCGAGAAATTATGGAAAATTATAACATAGCATTAAGGTGGACAGCCAAACAGAAGCTTTATTCGAGAACAGGTGAATCAGTTGAATTTGTGTGTAAACGGGGATATCGTCTTTCATCACGTTCTCACACATTGCGAACAACATGTTGGGATGGGAAACTGGAGTATCCAACTTGTGCAAAAAGATAGCTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGGTTAACTCGAGGGATCCCGGACCGAGCGGCCGCAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGGGGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATACGTCAAAGCAACCATAGTACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTTGGGTGA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SEQ ID NO:16—hAAT1启动子
GTTAACGGCTGCCCACTGGGCATTTCATAGGTGGCTCAGTCCTCTTCCCTCTGCAGCTGGCCCCAGAAACCTGCCAGTTATTGGTGCCAGGTCTGTGCCAGGAGGGCGAGGCCTGTCATTTCTAGTAATCCTCTGGGCAGTGTGACTGTACCTCTTGCGGCAACTCAAAGGGAGAGGGTGACTTGTCCCGGGTCACAGAGCTGAAAGGGCAGGTACAACAGGTGACATGCCGGGCTGTCTGAGTTTATGAGGGCCCAGTCTTGTGTCTGCCGGGCAATGAGCAAGGCTCCTTCCTGTCCAAGCTCCCCGCCCCTCCCCAGCCTACTGCCTCCACCCGAAGTCTACTTCCTGGG
SEQ ID NO:17—典型的CFH AAV载体(具有hAAT1启动子)
CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTGCGGCCGCACGCGTGTTAACGGCTGCCCACTGGGCATTTCATAGGTGGCTCAGTCCTCTTCCCTCTGCAGCTGGCCCCAGAAACCTGCCAGTTATTGGTGCCAGGTCTGTGCCAGGAGGGCGAGGCCTGTCATTTCTAGTAATCCTCTGGGCAGTGTGACTGTACCTCTTGCGGCAACTCAAAGGGAGAGGGTGACTTGTCCCGGGTCACAGAGCTGAAAGGGCAGGTACAACAGGTGACATGCCGGGCTGTCTGAGTTTATGAGGGCCCAGTCTTGTGTCTGCCGGGCAATGAGCAAGGCTCCTTCCTGTCCAAGCTCCCCGCCCCTCCCCAGCCTACTGCCTCCACCCGAAGTCTACTTCCTGGGATCGATAGCTGCAGGCGGCCGCCGCCACCATGAGACTTCTAGCAAAGATTATTTGCCTTATGTTATGGGCTATTTGTGTAGCAGAAGATTGCAATGAACTTCCTCCAAGAAGAAATACAGAAATTCTGACAGGTTCCTGGTCTGACCAAACATATCCAGAAGGCACCCAGGCTATCTATAAATGCCGCCCTGGATATAGATCTCTTGGAAATGTAATAATGGTATGCAGGAAGGGAGAATGGGTTGCTCTTAATCCATTAAGGAAATGTCAGAAAAGGCCCTGTGGACATCCTGGAGATACTCCTTTTGGTACTTTTACCCTTACAGGAGGAAATGTGTTTGAATATGGTGTAAAAGCTGTGTATACATGTAATGAGGGGTATCAATTGCTAGGTGAGATTAATTACCGTGAATGTGACACAGATGGATGGACCAATGATATTCCTATATGTGAAGTTGTGAAGTGTTTACCAGTGACAGCACCAGAGAATGGAAAAATTGTCAGTAGTGCAATGGAACCAGATCGGGAATACCATTTTGGACAAGCAGTACGGTTTGTATGTAACTCAGGCTACAAGATTGAAGGAGATGAAGAAATGCATTGTTCAGACGATGGTTTTTGGAGTAAAGAGAAACCAAAGTGTGTGGAAATTTCATGCAAATCCCCAGATGTTATAAATGGATCTCCTATATCTCAGAAGATTATTTATAAGGAGAATGAACGATTTCAATATAAATGTAACATGGGTTATGAATACAGTGAAAGAGGAGATGCTGTATGCACTGAATCTGGATGGCGTCCGTTGCCTTCATGTGAAGAAAAATCATGTGATAATCCTTATATTCCAAATGGTGACTACTCACCTTTAAGGATTAAACACAGAACTGGAGATGAAATCACGTACCAGTGTAGAAATGGTTTTTATCCTGCAACCCGGGGAAATACAGCAAAATGCACAAGTACTGGCTGGATACCTGCTCCGAGATGTACCTTGAAACCTTGTGATTATCCAGACATTAAACATGGAGGTCTATATCATGAGAATATGCGTAGACCATACTTTCCAGTAGCTGTAGGAAAATATTACTCCTATTACTGTGATGAACATTTTGAGACTCCGTCAGGAAGTTACTGGGATCACATTCATTGCACACAAGATGGATGGTCGCCAGCAGTACCATGCCTCAGAAAATGTTATTTTCCTTATTTGGAAAATGGATATAATCAAAATTATGGAAGAAAGTTTGTACAGGGTAAATCTATAGACGTTGCCTGCCATCCTGGCTACGCTCTTCCAAAAGCGCAGACCACAGTTACATGTATGGAGAATGGCTGGTCTCCTACTCCCAGATGCATCCGTGTCAAAACATGTTCCAAATCAAGTATAGATATTGAGAATGGGTTTATTTCTGAATCTCAGTATACATATGCCTTAAAAGAAAAAGCGAAATATCAATGCAAACTAGGATATGTAACAGCAGATGGTGAAACATCAGGATCAATTACATGTGGGAAAGATGGATGGTCAGCTCAACCCACGTGCATTAAATCTTGTGATATCCCAGTATTTATGAATGCCAGAACTAAAAATGACTTCACATGGTTTAAGCTGAATGACACATTGGACTATGAATGCCATGATGGTTATGAAAGCAATACTGGAAGCACCACTGGTTCCATAGTGTGTGGTTACAATGGTTGGTCTGATTTACCCATATGTTATGAAAGAGAATGCGAACTTCCTAAAATAGATGTACACTTAGTTCCTGATCGCAAGAAAGACCAGTATAAAGTTGGAGAGGTGTTGAAATTCTCCTGCAAACCAGGATTTACAATAGTTGGACCTAATTCCGTTCAGTGCTACCACTTTGGATTGTCTCCTGACCTCCCAATATGTAAAGAGCAAGTACAATCATGTGGTCCACCTCCTGAACTCCTCAATGGGAATGTTAAGGAAAAAACGAAAGAAGAATATGGACACAGTGAAGTGGTGGAATATTATTGCAATCCTAGATTTCTAATGAAGGGACCTAATAAAATTCAATGTGTTGATGGAGAGTGGACAACTTTACCAGTGTGTATTGTGGAGGAGAGTACCTGTGGAGATATACCTGAACTTGAACATGGCTGGGCCCAGCTTTCTTCCCCTCCTTATTACTATGGAGATTCAGTGGAATTCAATTGCTCAGAATCATTTACAATGATTGGACACAGATCAATTACGTGTATTCATGGAGTATGGACCCAACTTCCCCAGTGTGTGGCAATAGATAAACTTAAGAAGTGCAAATCATCAAATTTAATTATACTTGAGGAACATTTAAAAAACAAGAAGGAATTCGATCATAATTCTAACATAAGGTACAGATGTAGAGGAAAAGAAGGATGGATACACACAGTCTGCATAAATGGAAGATGGGATCCAGAAGTGAACTGCTCAATGGCACAAATACAATTATGCCCACCTCCACCTCAGATTCCCAATTCTCACAATATGACAACCACACTGAATTATCGGGATGGAGAAAAAGTATCTGTTCTTTGCCAAGAAAATTATCTAATTCAGGAAGGAGAAGAAATTACATGCAAAGATGGAAGATGGCAGTCAATACCACTCTGTGTTGAAAAAATTCCATGTTCACAACCACCTCAGATAGAACACGGAACCATTAATTCATCCAGGTCTTCACAAGAAAGTTATGCACATGGGACTAAATTGAGTTATACTTGTGAGGGTGGTTTCAGGATATCTGAAGAAAATGAAACAACATGCTACATGGGAAAATGGAGTTCTCCACCTCAGTGTGAAGGCCTTCCTTGTAAATCTCCACCTGAGATTTCTCATGGTGTTGTAGCTCACATGTCAGACAGTTATCAGTATGGAGAAGAAGTTACGTACAAATGTTTTGAAGGTTTTGGAATTGATGGGCCTGCAATTGCAAAATGCTTAGGAGAAAAATGGTCTCACCCTCCATCATGCATAAAAACAGATTGTCTCAGTTTACCTAGCTTTGAAAATGCCATACCCATGGGAGAGAAGAAGGATGTGTATAAGGCGGGTGAGCAAGTGACTTACACTTGTGCAACATATTACAAAATGGATGGAGCCAGTAATGTAACATGCATTAATAGCAGATGGACAGGAAGGCCAACATGCAGAGACACCTCCTGTGTGAATCCGCCCACAGTACAAAATGCTTATATAGTGTCGAGACAGATGAGTAAATATCCATCTGGTGAGAGAGTACGTTATCAATGTAGGAGCCCTTATGAAATGTTTGGGGATGAAGAAGTGATGTGTTTAAATGGAAACTGGACGGAACCACCTCAATGCAAAGATTCTACAGGAAAATGTGGGCCCCCTCCACCTATTGACAATGGGGACATTACTTCATTCCCGTTGTCAGTATATGCTCCAGCTTCATCAGTTGAGTACCAATGCCAGAACTTGTATCAACTTGAGGGTAACAAGCGAATAACATGTAGAAATGGACAATGGTCAGAACCACCAAAATGCTTACATCCGTGTGTAATATCCCGAGAAATTATGGAAAATTATAACATAGCATTAAGGTGGACAGCCAAACAGAAGCTTTATTCGAGAACAGGTGAATCAGTTGAATTTGTGTGTAAACGGGGATATCGTCTTTCATCACGTTCTCACACATTGCGAACAACATGTTGGGATGGGAAACTGGAGTATCCAACTTGTGCAAAAAGATAGCTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGGTTAACTCGAGGGATCCCGGACCGAGCGGCCGCAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGGGGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATACGTCAAAGCAACCATAGTACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTTGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTA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GTTAACACGCGTTAACTAGTCAGTTCCAGATGGTAAATATACACAAGGGATTTAGTCAAACAATTTTTTGGCAAGAATATTATGAATTTTGTAATCGGTTGGCAGCCAATGAAATACAAAGATGAGTCTAGTTAATAATCTACAATTATTGGTTAAAGA
SEQ ID NO:19—典型的CFH AAV载体(具有ALB启动子)
CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTGCGGCCGCACGCGTGTTAACACGCGTTAACTAGTCAGTTCCAGATGGTAAATATACACAAGGGATTTAGTCAAACAATTTTTTGGCAAGAATATTATGAATTTTGTAATCGGTTGGCAGCCAATGAAATACAAAGATGAGTCTAGTTAATAATCTACAATTATTGGTTAAAGAATCGATAGCTGCAGGCGGCCGCCGCCACCATGAGACTTCTAGCAAAGATTATTTGCCTTATGTTATGGGCTATTTGTGTAGCAGAAGATTGCAATGAACTTCCTCCAAGAAGAAATACAGAAATTCTGACAGGTTCCTGGTCTGACCAAACATATCCAGAAGGCACCCAGGCTATCTATAAATGCCGCCCTGGATATAGATCTCTTGGAAATGTAATAATGGTATGCAGGAAGGGAGAATGGGTTGCTCTTAATCCATTAAGGAAATGTCAGAAAAGGCCCTGTGGACATCCTGGAGATACTCCTTTTGGTACTTTTACCCTTACAGGAGGAAATGTGTTTGAATATGGTGTAAAAGCTGTGTATACATGTAATGAGGGGTATCAATTGCTAGGTGAGATTAATTACCGTGAATGTGACACAGATGGATGGACCAATGATATTCCTATATGTGAAGTTGTGAAGTGTTTACCAGTGACAGCACCAGAGAATGGAAAAATTGTCAGTAGTGCAATGGAACCAGATCGGGAATACCATTTTGGACAAGCAGTACGGTTTGTATGTAACTCAGGCTACAAGATTGAAGGAGATGAAGAAATGCATTGTTCAGACGATGGTTTTTGGAGTAAAGAGAAACCAAAGTGTGTGGAAATTTCATGCAAATCCCCAGATGTTATAAATGGATCTCCTATATCTCAGAAGATTATTTATAAGGAGAATGAACGATTTCAATATAAATGTAACATGGGTTATGAATACAGTGAAAGAGGAGATGCTGTATGCACTGAATCTGGATGGCGTCCGTTGCCTTCATGTGAAGAAAAATCATGTGATAATCCTTATATTCCAAATGGTGACTACTCACCTTTAAGGATTAAACACAGAACTGGAGATGAAATCACGTACCAGTGTAGAAATGGTTTTTATCCTGCAACCCGGGGAAATACAGCAAAATGCACAAGTACTGGCTGGATACCTGCTCCGAGATGTACCTTGAAACCTTGTGATTATCCAGACATTAAACATGGAGGTCTATATCATGAGAATATGCGTAGACCATACTTTCCAGTAGCTGTAGGAAAATATTACTCCTATTACTGTGATGAACATTTTGAGACTCCGTCAGGAAGTTACTGGGATCACATTCATTGCACACAAGATGGATGGTCGCCAGCAGTACCATGCCTCAGAAAATGTTATTTTCCTTATTTGGAAAATGGATATAATCAAAATTATGGAAGAAAGTTTGTACAGGGTAAATCTATAGACGTTGCCTGCCATCCTGGCTACGCTCTTCCAAAAGCGCAGACCACAGTTACATGTATGGAGAATGGCTGGTCTCCTACTCCCAGATGCATCCGTGTCAAAACATGTTCCAAATCAAGTATAGATATTGAGAATGGGTTTATTTCTGAATCTCAGTATACATATGCCTTAAAAGAAAAAGCGAAATATCAATGCAAACTAGGATATGTAACAGCAGATGGTGAAACATCAGGATCAATTACATGTGGGAAAGATGGATGGTCAGCTCAACCCACGTGCATTAAATCTTGTGATATCCCAGTATTTATGAATGCCAGAACTAAAAATGACTTCACATGGTTTAAGCTGAATGACACATTGGACTATGAATGCCATGATGGTTATGAAAGCAATACTGGAAGCACCACTGGTTCCATAGTGTGTGGTTACAATGGTTGGTCTGATTTACCCATATGTTATGAAAGAGAATGCGAACTTCCTAAAATAGATGTACACTTAGTTCCTGATCGCAAGAAAGACCAGTATAAAGTTGGAGAGGTGTTGAAATTCTCCTGCAAACCAGGATTTACAATAGTTGGACCTAATTCCGTTCAGTGCTACCACTTTGGATTGTCTCCTGACCTCCCAATATGTAAAGAGCAAGTACAATCATGTGGTCCACCTCCTGAACTCCTCAATGGGAATGTTAAGGAAAAAACGAAAGAAGAATATGGACACAGTGAAGTGGTGGAATATTATTGCAATCCTAGATTTCTAATGAAGGGACCTAATAAAATTCAATGTGTTGATGGAGAGTGGACAACTTTACCAGTGTGTATTGTGGAGGAGAGTACCTGTGGAGATATACCTGAACTTGAACATGGCTGGGCCCAGCTTTCTTCCCCTCCTTATTACTATGGAGATTCAGTGGAATTCAATTGCTCAGAATCATTTACAATGATTGGACACAGATCAATTACGTGTATTCATGGAGTATGGACCCAACTTCCCCAGTGTGTGGCAATAGATAAACTTAAGAAGTGCAAATCATCAAATTTAATTATACTTGAGGAACATTTAAAAAACAAGAAGGAATTCGATCATAATTCTAACATAAGGTACAGATGTAGAGGAAAAGAAGGATGGATACACACAGTCTGCATAAATGGAAGATGGGATCCAGAAGTGAACTGCTCAATGGCACAAATACAATTATGCCCACCTCCACCTCAGATTCCCAATTCTCACAATATGACAACCACACTGAATTATCGGGATGGAGAAAAAGTATCTGTTCTTTGCCAAGAAAATTATCTAATTCAGGAAGGAGAAGAAATTACATGCAAAGATGGAAGATGGCAGTCAATACCACTCTGTGTTGAAAAAATTCCATGTTCACAACCACCTCAGATAGAACACGGAACCATTAATTCATCCAGGTCTTCACAAGAAAGTTATGCACATGGGACTAAATTGAGTTATACTTGTGAGGGTGGTTTCAGGATATCTGAAGAAAATGAAACAACATGCTACATGGGAAAATGGAGTTCTCCACCTCAGTGTGAAGGCCTTCCTTGTAAATCTCCACCTGAGATTTCTCATGGTGTTGTAGCTCACATGTCAGACAGTTATCAGTATGGAGAAGAAGTTACGTACAAATGTTTTGAAGGTTTTGGAATTGATGGGCCTGCAATTGCAAAATGCTTAGGAGAAAAATGGTCTCACCCTCCATCATGCATAAAAACAGATTGTCTCAGTTTACCTAGCTTTGAAAATGCCATACCCATGGGAGAGAAGAAGGATGTGTATAAGGCGGGTGAGCAAGTGACTTACACTTGTGCAACATATTACAAAATGGATGGAGCCAGTAATGTAACATGCATTAATAGCAGATGGACAGGAAGGCCAACATGCAGAGACACCTCCTGTGTGAATCCGCCCACAGTACAAAATGCTTATATAGTGTCGAGACAGATGAGTAAATATCCATCTGGTGAGAGAGTACGTTATCAATGTAGGAGCCCTTATGAAATGTTTGGGGATGAAGAAGTGATGTGTTTAAATGGAAACTGGACGGAACCACCTCAATGCAAAGATTCTACAGGAAAATGTGGGCCCCCTCCACCTATTGACAATGGGGACATTACTTCATTCCCGTTGTCAGTATATGCTCCAGCTTCATCAGTTGAGTACCAATGCCAGAACTTGTATCAACTTGAGGGTAACAAGCGAATAACATGTAGAAATGGACAATGGTCAGAACCACCAAAATGCTTACATCCGTGTGTAATATCCCGAGAAATTATGGAAAATTATAACATAGCATTAAGGTGGACAGCCAAACAGAAGCTTTATTCGAGAACAGGTGAATCAGTTGAATTTGTGTGTAAACGGGGATATCGTCTTTCATCACGTTCTCACACATTGCGAACAACATGTTGGGATGGGAAACTGGAGTATCCAACTTGTGCAAAAAGATAGCTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGGTTAACTCGAGGGATCCCGGACCGAGCGGCCGCAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGGGGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATACGTCAAAGCAACCATAGTACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTTGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGGCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTACAATTTTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGT
SEQ ID NO:20—PCK1启动子
GTTAACAGCCCCCAGTTAGGTTAGGCATTTCCAATCTTTGCCAATAAGCCACATATTTGCCCAAGTTAGGGTGCATCCTTCCCATGAACTTTGACTGTGACCTTTGACTATGGGGTGACATCTTATAGCTGTGGTGTTTTGCCAACCAGCAGCTCTTGGTACACAAAATGTGCTGCTAGCAGGTGCCCCGGCCAACCTTGTCCTTGACCCACCTGCCTGTTAAGAAAAGGGTGTTGTGTTTTGCAACAGCAGTAAAATGGGTCAAGGTTTAGTCAGTTGGAAGTTGTGTCAAAACTCACTATGGTTGGTTGAGGGCTCGAAGTCTCCCAGCATTCATTAACAACTATCTGTTCAATGATTATCTCCCTGGGGCGTGTTGCAGTGAGTTGGCCCAAAGCATAACTGACCCTGGCCGTGATCCAGAGACCTGCCCCCTGACGTCAGTGGCGAGCCTCCCTGGGTGCAGCTGAGGGGCAGGGCTATTCTTTTCCACAGT
SEQ ID NO:21—典型的CFH AAV载体(具有PCK1启动子)
CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTGCGGCCGCACGCGTGTTAACAGCCCCCAGTTAGGTTAGGCATTTCCAATCTTTGCCAATAAGCCACATATTTGCCCAAGTTAGGGTGCATCCTTCCCATGAACTTTGACTGTGACCTTTGACTATGGGGTGACATCTTATAGCTGTGGTGTTTTGCCAACCAGCAGCTCTTGGTACACAAAATGTGCTGCTAGCAGGTGCCCCGGCCAACCTTGTCCTTGACCCACCTGCCTGTTAAGAAAAGGGTGTTGTGTTTTGCAACAGCAGTAAAATGGGTCAAGGTTTAGTCAGTTGGAAGTTGTGTCAAAACTCACTATGGTTGGTTGAGGGCTCGAAGTCTCCCAGCATTCATTAACAACTATCTGTTCAATGATTATCTCCCTGGGGCGTGTTGCAGTGAGTTGGCCCAAAGCATAACTGACCCTGGCCGTGATCCAGAGACCTGCCCCCTGACGTCAGTGGCGAGCCTCCCTGGGTGCAGCTGAGGGGCAGGGCTATTCTTTTCCACAGTATCGATAGCTGCAGGCGGCCGCCGCCACCATGAGACTTCTAGCAAAGATTATTTGCCTTATGTTATGGGCTATTTGTGTAGCAGAAGATTGCAATGAACTTCCTCCAAGAAGAAATACAGAAATTCTGACAGGTTCCTGGTCTGACCAAACATATCCAGAAGGCACCCAGGCTATCTATAAATGCCGCCCTGGATATAGATCTCTTGGAAATGTAATAATGGTATGCAGGAAGGGAGAATGGGTTGCTCTTAATCCATTAAGGAAATGTCAGAAAAGGCCCTGTGGACATCCTGGAGATACTCCTTTTGGTACTTTTACCCTTACAGGAGGAAATGTGTTTGAATATGGTGTAAAAGCTGTGTATACATGTAATGAGGGGTATCAATTGCTAGGTGAGATTAATTACCGTGAATGTGACACAGATGGATGGACCAATGATATTCCTATATGTGAAGTTGTGAAGTGTTTACCAGTGACAGCACCAGAGAATGGAAAAATTGTCAGTAGTGCAATGGAACCAGATCGGGAATACCATTTTGGACAAGCAGTACGGTTTGTATGTAACTCAGGCTACAAGATTGAAGGAGATGAAGAAATGCATTGTTCAGACGATGGTTTTTGGAGTAAAGAGAAACCAAAGTGTGTGGAAATTTCATGCAAATCCCCAGATGTTATAAATGGATCTCCTATATCTCAGAAGATTATTTATAAGGAGAATGAACGATTTCAATATAAATGTAACATGGGTTATGAATACAGTGAAAGAGGAGATGCTGTATGCACTGAATCTGGATGGCGTCCGTTGCCTTCATGTGAAGAAAAATCATGTGATAATCCTTATATTCCAAATGGTGACTACTCACCTTTAAGGATTAAACACAGAACTGGAGATGAAATCACGTACCAGTGTAGAAATGGTTTTTATCCTGCAACCCGGGGAAATACAGCAAAATGCACAAGTACTGGCTGGATACCTGCTCCGAGATGTACCTTGAAACCTTGTGATTATCCAGACATTAAACATGGAGGTCTATATCATGAGAATATGCGTAGACCATACTTTCCAGTAGCTGTAGGAAAATATTACTCCTATTACTGTGATGAACATTTTGAGACTCCGTCAGGAAGTTACTGGGATCACATTCATTGCACACAAGATGGATGGTCGCCAGCAGTACCATGCCTCAGAAAATGTTATTTTCCTTATTTGGAAAATGGATATAATCAAAATTATGGAAGAAAGTTTGTACAGGGTAAATCTATAGACGTTGCCTGCCATCCTGGCTACGCTCTTCCAAAAGCGCAGACCACAGTTACATGTATGGAGAATGGCTGGTCTCCTACTCCCAGATGCATCCGTGTCAAAACATGTTCCAAATCAAGTATAGATATTGAGAATGGGTTTATTTCTGAATCTCAGTATACATATGCCTTAAAAGAAAAAGCGAAATATCAATGCAAACTAGGATATGTAACAGCAGATGGTGAAACATCAGGATCAATTACATGTGGGAAAGATGGATGGTCAGCTCAACCCACGTGCATTAAATCTTGTGATATCCCAGTATTTATGAATGCCAGAACTAAAAATGACTTCACATGGTTTAAGCTGAATGACACATTGGACTATGAATGCCATGATGGTTATGAAAGCAATACTGGAAGCACCACTGGTTCCATAGTGTGTGGTTACAATGGTTGGTCTGATTTACCCATATGTTATGAAAGAGAATGCGAACTTCCTAAAATAGATGTACACTTAGTTCCTGATCGCAAGAAAGACCAGTATAAAGTTGGAGAGGTGTTGAAATTCTCCTGCAAACCAGGATTTACAATAGTTGGACCTAATTCCGTTCAGTGCTACCACTTTGGATTGTCTCCTGACCTCCCAATATGTAAAGAGCAAGTACAATCATGTGGTCCACCTCCTGAACTCCTCAATGGGAATGTTAAGGAAAAAACGAAAGAAGAATATGGACACAGTGAAGTGGTGGAATATTATTGCAATCCTAGATTTCTAATGAAGGGACCTAATAAAATTCAATGTGTTGATGGAGAGTGGACAACTTTACCAGTGTGTATTGTGGAGGAGAGTACCTGTGGAGATATACCTGAACTTGAACATGGCTGGGCCCAGCTTTCTTCCCCTCCTTATTACTATGGAGATTCAGTGGAATTCAATTGCTCAGAATCATTTACAATGATTGGACACAGATCAATTACGTGTATTCATGGAGTATGGACCCAACTTCCCCAGTGTGTGGCAATAGATAAACTTAAGAAGTGCAAATCATCAAATTTAATTATACTTGAGGAACATTTAAAAAACAAGAAGGAATTCGATCATAATTCTAACATAAGGTACAGATGTAGAGGAAAAGAAGGATGGATACACACAGTCTGCATAAATGGAAGATGGGATCCAGAAGTGAACTGCTCAATGGCACAAATACAATTATGCCCACCTCCACCTCAGATTCCCAATTCTCACAATATGACAACCACACTGAATTATCGGGATGGAGAAAAAGTATCTGTTCTTTGCCAAGAAAATTATCTAATTCAGGAAGGAGAAGAAATTACATGCAAAGATGGAAGATGGCAGTCAATACCACTCTGTGTTGAAAAAATTCCATGTTCACAACCACCTCAGATAGAACACGGAACCATTAATTCATCCAGGTCTTCACAAGAAAGTTATGCACATGGGACTAAATTGAGTTATACTTGTGAGGGTGGTTTCAGGATATCTGAAGAAAATGAAACAACATGCTACATGGGAAAATGGAGTTCTCCACCTCAGTGTGAAGGCCTTCCTTGTAAATCTCCACCTGAGATTTCTCATGGTGTTGTAGCTCACATGTCAGACAGTTATCAGTATGGAGAAGAAGTTACGTACAAATGTTTTGAAGGTTTTGGAATTGATGGGCCTGCAATTGCAAAATGCTTAGGAGAAAAATGGTCTCACCCTCCATCATGCATAAAAACAGATTGTCTCAGTTTACCTAGCTTTGAAAATGCCATACCCATGGGAGAGAAGAAGGATGTGTATAAGGCGGGTGAGCAAGTGACTTACACTTGTGCAACATATTACAAAATGGATGGAGCCAGTAATGTAACATGCATTAATAGCAGATGGACAGGAAGGCCAACATGCAGAGACACCTCCTGTGTGAATCCGCCCACAGTACAAAATGCTTATATAGTGTCGAGACAGATGAGTAAATATCCATCTGGTGAGAGAGTACGTTATCAATGTAGGAGCCCTTATGAAATGTTTGGGGATGAAGAAGTGATGTGTTTAAATGGAAACTGGACGGAACCACCTCAATGCAAAGATTCTACAGGAAAATGTGGGCCCCCTCCACCTATTGACAATGGGGACATTACTTCATTCCCGTTGTCAGTATATGCTCCAGCTTCATCAGTTGAGTACCAATGCCAGAACTTGTATCAACTTGAGGGTAACAAGCGAATAACATGTAGAAATGGACAATGGTCAGAACCACCAAAATGCTTACATCCGTGTGTAATATCCCGAGAAATTATGGAAAATTATAACATAGCATTAAGGTGGACAGCCAAACAGAAGCTTTATTCGAGAACAGGTGAATCAGTTGAATTTGTGTGTAAACGGGGATATCGTCTTTCATCACGTTCTCACACATTGCGAACAACATGTTGGGATGGGAAACTGGAGTATCCAACTTGTGCAAAAAGATAGCTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGGTTAACTCGAGGGATCCCGGACCGAGCGGCCGCAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGGGGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATACGTCAAAGCAACCATAGTACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAA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SEQ ID NO:22—典型的FHL AAV载体(具有EF1a启动子)
CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTGCGGCCGGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGACCGGTCTCGAAGGCCTGCAGGCGGCCGCCGCCACCATGAATGAGACTTCTAGCAAAGATTATTTGCCTTATGTTATGGGCTATTTGTGTAGCAGAAGATTGCAATGAACTTCCTCCAAGAAGAAATACAGAAATTCTGACAGGTTCCTGGTCTGACCAAACATATCCAGAAGGCACCCAGGCTATCTATAAATGCCGCCCTGGATATAGATCTCTTGGAAATGTAATAATGGTATGCAGGAAGGGAGAATGGGTTGCTCTTAATCCATTAAGGAAATGTCAGAAAAGGCCCTGTGGACATCCTGGAGATACTCCTTTTGGTACTTTTACCCTTACAGGAGGAAATGTGTTTGAATATGGTGTAAAAGCTGTGTATACATGTAATGAGGGGTATCAATTGCTAGGTGAGATTAATTACCGTGAATGTGACACAGATGGATGGACCAATGATATTCCTATATGTGAAGTTGTGAAGTGTTTACCAGTGACAGCACCAGAGAATGGAAAAATTGTCAGTAGTGCAATGGAACCAGATCGGGAATACCATTTTGGACAAGCAGTACGGTTTGTATGTAACTCAGGCTACAAGATTGAAGGAGATGAAGAAATGCATTGTTCAGACGATGGTTTTTGGAGTAAAGAGAAACCAAAGTGTGTGGAAATTTCATGCAAATCCCCAGATGTTATAAATGGATCTCCTATATCTCAGAAGATTATTTATAAGGAGAATGAACGATTTCAATATAAATGTAACATGGGTTATGAATACAGTGAAAGAGGAGATGCTGTATGCACTGAATCTGGATGGCGTCCGTTGCCTTCATGTGAAGAAAAATCATGTGATAATCCTTATATTCCAAATGGTGACTACTCACCTTTAAGGATTAAACACAGAACTGGAGATGAAATCACGTACCAGTGTAGAAATGGTTTTTATCCTGCAACCCGGGGAAATACAGCAAAATGCACAAGTACTGGCTGGATACCTGCTCCGAGATGTACCTTGAAACCTTGTGATTATCCAGACATTAAACATGGAGGTCTATATCATGAGAATATGCGTAGACCATACTTTCCAGTAGCTGTAGGAAAATATTACTCCTATTACTGTGATGAACATTTTGAGACTCCGTCAGGAAGTTACTGGGATCACATTCATTGCACACAAGATGGATGGTCGCCAGCAGTACCATGCCTCAGAAAATGTTATTTTCCTTATTTGGAAAATGGATATAATCAAAATCATGGAAGAAAGTTTGTACAGGGTAAATCTATAGACGTTGCCTGCCATCCTGGCTACGCTCTTCCAAAAGCGCAGACCACAGTTACATGTATGGAGAATGGCTGGTCTCCTACTCCCAGATGCATCCGTGTCAGCTTTACCCTCTGATAAGATATCGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGATATCGTTAACTCGAGGGATCCCACGTGCTGATTTTGTAGGTAACCACGTGCGGACCGAGCGGCCGCAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGGGGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATACGTCAAAGCAACCATAGTACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTTGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGGCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTACAATTTTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGT
SEQ ID NO:23—典型的FHL AAV载体(具有ALB启动子)
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SEQ ID NO:24—典型的FHL AAV载体(具有AAT1启动子)
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SEQ ID NO:25—典型的FHL AAV载体(具有EF1a.SV40i启动子)
CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTGCGGCCGACGCGTTAACTAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTAAGTTTAGTCTTTTTGTCTTTTATTTCAGGTCCCGGATCCGGTGGTGGTGCAAATCAAAGAACTGCTCCTCAGTGGATGTTGCCTTTACTTCTAGGCCTGTACGGAAGTGTTACTTCTGCTCTAAAAGCTGCGGAATTGTACCCGCGGACCGGTCTCGAAGGCCTGCAGGCGGCCGCCGCCACCATGAATGAGACTTCTAGCAAAGATTATTTGCCTTATGTTATGGGCTATTTGTGTAGCAGAAGATTGCAATGAACTTCCTCCAAGAAGAAATACAGAAATTCTGACAGGTTCCTGGTCTGACCAAACATATCCAGAAGGCACCCAGGCTATCTATAAATGCCGCCCTGGATATAGATCTCTTGGAAATGTAATAATGGTATGCAGGAAGGGAGAATGGGTTGCTCTTAATCCATTAAGGAAATGTCAGAAAAGGCCCTGTGGACATCCTGGAGATACTCCTTTTGGTACTTTTACCCTTACAGGAGGAAATGTGTTTGAATATGGTGTAAAAGCTGTGTATACATGTAATGAGGGGTATCAATTGCTAGGTGAGATTAATTACCGTGAATGTGACACAGATGGATGGACCAATGATATTCCTATATGTGAAGTTGTGAAGTGTTTACCAGTGACAGCACCAGAGAATGGAAAAATTGTCAGTAGTGCAATGGAACCAGATCGGGAATACCATTTTGGACAAGCAGTACGGTTTGTATGTAACTCAGGCTACAAGATTGAAGGAGATGAAGAAATGCATTGTTCAGACGATGGTTTTTGGAGTAAAGAGAAACCAAAGTGTGTGGAAATTTCATGCAAATCCCCAGATGTTATAAATGGATCTCCTATATCTCAGAAGATTATTTATAAGGAGAATGAACGATTTCAATATAAATGTAACATGGGTTATGAATACAGTGAAAGAGGAGATGCTGTATGCACTGAATCTGGATGGCGTCCGTTGCCTTCATGTGAAGAAAAATCATGTGATAATCCTTATATTCCAAATGGTGACTACTCACCTTTAAGGATTAAACACAGAACTGGAGATGAAATCACGTACCAGTGTAGAAATGGTTTTTATCCTGCAACCCGGGGAAATACAGCAAAATGCACAAGTACTGGCTGGATACCTGCTCCGAGATGTACCTTGAAACCTTGTGATTATCCAGACATTAAACATGGAGGTCTATATCATGAGAATATGCGTAGACCATACTTTCCAGTAGCTGTAGGAAAATATTACTCCTATTACTGTGATGAACATTTTGAGACTCCGTCAGGAAGTTACTGGGATCACATTCATTGCACACAAGATGGATGGTCGCCAGCAGTACCATGCCTCAGAAAATGTTATTTTCCTTATTTGGAAAATGGATATAATCAAAATCATGGAAGAAAGTTTGTACAGGGTAAATCTATAGACGTTGCCTGCCATCCTGGCTACGCTCTTCCAAAAGCGCAGACCACAGTTACATGTATGGAGAATGGCTGGTCTCCTACTCCCAGATGCATCCGTGTCAGCTTTACCCTCTGATAAGATATCGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGATATCGTTAACTCGAGGGATCCCACGTGCTGATTTTGTAGGTAACCACGTGCGGACCGAGCGGCCGCAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGGGGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATACGTCAAAGCAACCATAGTACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTTGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGGCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTACAATTTTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGT
SEQ ID NO:26—典型的FHL AAV载体(具有CAG启动子)
CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTGCGGCCGTTGGCAAAGAATTCTGCAGTCGACGGTACCGCGGGCCCGGGATCCACCGGTCGCCACCATGGTGCGCTCCTCCAAGAACGTCATCAAGGAGTTCATGCGCTTCAAGGTGCGCATGGAGGGCACCGTGAACGGCCACGAGTTCGAGATCGAGGGCGAGGGCGAGGGCCGCCCCTACGAGGGCCACAACACCGTGAAGCTGAAGGTGACCAAGGGCGGCCCCCTGCCCTTCGCCTGGGACATCCTGTCCCCCCAGTTCCAGTACGGCTCCAAGGTGTACGTGAAGCACCCCGCCGACATCCCCGACTACAAGAAGCTGTCCTTCCCCGAGGGCTTCAAGTGGGAGCGCGTGATGAACTTCGAGGACGGCGGCGTGGTGACCGTGACCCAGGACTCCTCCCTGCAGGACGGCTGCTTCATCTACAAGGTGAAGTTCATCGGCGTGAACTTCCCCTCCGACGGCCCCGTAATGCAGAAGAAGACCATGGGCTGGGAGGCCTCCACCGAGCGCCTGTACCCCCGCGACGGCGTGCTGAAGGGCGAGATCCACAAGGCCCTGAAGCTGAAGGACGGCGGCCACTACCTGGTGGAGTTCAAGTCCATCTACATGGCCAAGAAGCCCGTGCAGCTGCCCGGCTACTACTACGTGGACTCCAAGCTGGACATCACCTCCCACAACGAGGACTACACCATCGTGGAGCAGTACGAGCGCACCGAGGGCCGCCACCACCTGTTCCTGTAGCGGCCGCACTCCTCAGGTGCAGGCTGCCTATCAGAAGGTGGTGGCTGGTGTGGCCAATGCCCTGGCTCACAAATACCACTGAGATCTTTTTCCCTCTGCCAAAAATTATGGGGACATCATGAAGCCCCTTGAGCATCTGACTTCTGGCTAATAAAGGAAATTTATTTTCATTGCAATAGTGTGTTGGAATTTTTTGTGTCTCTCACTCGGAAGGACATATGGGAGGGCAAATCACCGGTCTCGAAGGCCTGCAGGCGGCCGCCGCCACCATGAATGAGACTTCTAGCAAAGATTATTTGCCTTATGTTATGGGCTATTTGTGTAGCAGAAGATTGCAATGAACTTCCTCCAAGAAGAAATACAGAAATTCTGACAGGTTCCTGGTCTGACCAAACATATCCAGAAGGCACCCAGGCTATCTATAAATGCCGCCCTGGATATAGATCTCTTGGAAATGTAATAATGGTATGCAGGAAGGGAGAATGGGTTGCTCTTAATCCATTAAGGAAATGTCAGAAAAGGCCCTGTGGACATCCTGGAGATACTCCTTTTGGTACTTTTACCCTTACAGGAGGAAATGTGTTTGAATATGGTGTAAAAGCTGTGTATACATGTAATGAGGGGTATCAATTGCTAGGTGAGATTAATTACCGTGAATGTGACACAGATGGATGGACCAATGATATTCCTATATGTGAAGTTGTGAAGTGTTTACCAGTGACAGCACCAGAGAATGGAAAAATTGTCAGTAGTGCAATGGAACCAGATCGGGAATACCATTTTGGACAAGCAGTACGGTTTGTATGTAACTCAGGCTACAAGATTGAAGGAGATGAAGAAATGCATTGTTCAGACGATGGTTTTTGGAGTAAAGAGAAACCAAAGTGTGTGGAAATTTCATGCAAATCCCCAGATGTTATAAATGGATCTCCTATATCTCAGAAGATTATTTATAAGGAGAATGAACGATTTCAATATAAATGTAACATGGGTTATGAATACAGTGAAAGAGGAGATGCTGTATGCACTGAATCTGGATGGCGTCCGTTGCCTTCATGTGAAGAAAAATCATGTGATAATCCTTATATTCCAAATGGTGACTACTCACCTTTAAGGATTAAACACAGAACTGGAGATGAAATCACGTACCAGTGTAGAAATGGTTTTTATCCTGCAACCCGGGGAAATACAGCAAAATGCACAAGTACTGGCTGGATACCTGCTCCGAGATGTACCTTGAAACCTTGTGATTATCCAGACATTAAACATGGAGGTCTATATCATGAGAATATGCGTAGACCATACTTTCCAGTAGCTGTAGGAAAATATTACTCCTATTACTGTGATGAACATTTTGAGACTCCGTCAGGAAGTTACTGGGATCACATTCATTGCACACAAGATGGATGGTCGCCAGCAGTACCATGCCTCAGAAAATGTTATTTTCCTTATTTGGAAAATGGATATAATCAAAATCATGGAAGAAAGTTTGTACAGGGTAAATCTATAGACGTTGCCTGCCATCCTGGCTACGCTCTTCCAAAAGCGCAGACCACAGTTACATGTATGGAGAATGGCTGGTCTCCTACTCCCAGATGCATCCGTGTCAGCTTTACCCTCTGATAAGATATCGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGATATCGTTAACTCGAGGGATCCCACGTGCTGATTTTGTAGGTAACCACGTGCGGACCGAGCGGCCGCAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGGGGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATACGTCAAAGCAACCATAGTACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTTGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGGCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTACAATTTTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACC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SEQ ID NO:27—典型的FHL AAV载体(具有CRALBP启动子)
CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTGCGGCCGACGCGTTAACTAGTACCCTGGTGGTGGTGGTGGGGGGGGGGGGGTGCTCTCTCAGCAACCCCACCCCGGGATCTTGAGGAGAAAGAGGGCAGAGAAAAGAGGGAATGGGACTGGCCCAGATCCCAGCCCCACAGCCGGGCTTCCACATGGCCGAGCAGGAACTCCAGAGCAGGAGCACACAAAGGAGGGCTTTGATGCGCCTCCAGCCAGGCCCAGGCCTCTCCCCTCTCCCCTTTCTCTCTGGGTCTTCCTTTGCCCCACTGAGGGCCTCCTGTGAGCCCGATTTAACGGAAACTGTGGGCGGTGAGAAGTTCCTTATGACACACTAATCCCAACCTGCTGACCGGACCACGCCTCCAGCGGAGGGAACCTCTAGAGCTCCAGGACATTCAGGTACCAGGTAGCCCCAAGGAGGAGCTGCCGACCACCGGTCTCGAAGGCCTGCAGGCGGCCGCCGCCACCATGAATGAGACTTCTAGCAAAGATTATTTGCCTTATGTTATGGGCTATTTGTGTAGCAGAAGATTGCAATGAACTTCCTCCAAGAAGAAATACAGAAATTCTGACAGGTTCCTGGTCTGACCAAACATATCCAGAAGGCACCCAGGCTATCTATAAATGCCGCCCTGGATATAGATCTCTTGGAAATGTAATAATGGTATGCAGGAAGGGAGAATGGGTTGCTCTTAATCCATTAAGGAAATGTCAGAAAAGGCCCTGTGGACATCCTGGAGATACTCCTTTTGGTACTTTTACCCTTACAGGAGGAAATGTGTTTGAATATGGTGTAAAAGCTGTGTATACATGTAATGAGGGGTATCAATTGCTAGGTGAGATTAATTACCGTGAATGTGACACAGATGGATGGACCAATGATATTCCTATATGTGAAGTTGTGAAGTGTTTACCAGTGACAGCACCAGAGAATGGAAAAATTGTCAGTAGTGCAATGGAACCAGATCGGGAATACCATTTTGGACAAGCAGTACGGTTTGTATGTAACTCAGGCTACAAGATTGAAGGAGATGAAGAAATGCATTGTTCAGACGATGGTTTTTGGAGTAAAGAGAAACCAAAGTGTGTGGAAATTTCATGCAAATCCCCAGATGTTATAAATGGATCTCCTATATCTCAGAAGATTATTTATAAGGAGAATGAACGATTTCAATATAAATGTAACATGGGTTATGAATACAGTGAAAGAGGAGATGCTGTATGCACTGAATCTGGATGGCGTCCGTTGCCTTCATGTGAAGAAAAATCATGTGATAATCCTTATATTCCAAATGGTGACTACTCACCTTTAAGGATTAAACACAGAACTGGAGATGAAATCACGTACCAGTGTAGAAATGGTTTTTATCCTGCAACCCGGGGAAATACAGCAAAATGCACAAGTACTGGCTGGATACCTGCTCCGAGATGTACCTTGAAACCTTGTGATTATCCAGACATTAAACATGGAGGTCTATATCATGAGAATATGCGTAGACCATACTTTCCAGTAGCTGTAGGAAAATATTACTCCTATTACTGTGATGAACATTTTGAGACTCCGTCAGGAAGTTACTGGGATCACATTCATTGCACACAAGATGGATGGTCGCCAGCAGTACCATGCCTCAGAAAATGTTATTTTCCTTATTTGGAAAATGGATATAATCAAAATCATGGAAGAAAGTTTGTACAGGGTAAATCTATAGACGTTGCCTGCCATCCTGGCTACGCTCTTCCAAAAGCGCAGACCACAGTTACATGTATGGAGAATGGCTGGTCTCCTACTCCCAGATGCATCCGTGTCAGCTTTACCCTCTGATAAGATATCGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGATATCGTTAACTCGAGGGATCCCACGTGCTGATTTTGTAGGTAACCACGTGCGGACCGAGCGGCCGCAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGGGGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATACGTCAAAGCAACCATAGTACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTTGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGGCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTACAATTTTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGT
SEQ ID NO:28—典型的FHL AAV载体(具有hRPE65启动子)
CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTGCGGCCGTATATTTATTGAAGTTTAATATTGTGTTTGTGATACAGAAGTATTTGCTTTAATTCTAAATAAAAATTTTATGCTTTTATTGCTGGTTTAAGAAGATTTGGATTATCCTTGTACTTTGAGGAGAAGTTTCTTATTTGAAATATTTTGGAAACAGGTCTTTTAATGTGGAAAGATAGATATTAATCTCCTCTTCTATTACTCTCCAAGATCCAACAAAAGTGATTATACCCCCCAAAATATGATGGTAGTATCTTATACTACCATCATTTTATAGGCATAGGGCTCTTAGCTGCAAATAATGGAACTAACTCTAATAAAGCAGAACGCAAATATTGTAAATATTAGAGAGCTAACAATCTCTGGGATGGCTAAAGGATGGAGCTTGGAGGCTACCCAGCCAGTAACAATATTCCGGGCTCCACTGTTGAATGGAGACACTACAACTGCCTTGGATGGGCAGAGATATTATGGATGCTAAGCCCCAGGTGCTACCATTAGGACTTCTACCACTGTCCCTAACGGGTGGAGCCCATCACATGCCTATGCCCTCACTGTAAGGAAATGAAGCTACTGTTGTATATCTTGGGAAGCACTTGGATTAATTGTTATACAGTTTTGTTGAAGAAGACCCCTAGGGTAAGTAGCCATAACTGCACACTAAATTTAAAATTGTTAATGAGTTTCTCAAAAAAAATGTTAAGGTTGTTAGCTGGTATAGTATATATCTTGCCTGTTTTCCAAGGACTTCTTTGGGCAGTACCTTGTCTGTGCTGGCAAGCAACTGAGACTTAATGAAAGAGTATTGGAGATATGAATGAATTGATGCTGTATACTCTCAGAGTGCCAAACATATACCAATGGACAAGAAGGTGAGGCAGAGAGCAGACAGGCATTAGTGACAAGCAAAGATATGCAGAATTTCATTCTCAGCAAATCAAAAGTCCTCAACCTGGTTGGAAGAATATTGGCACTGAATGGTATCAATAAGGTTGCTAGAGAGGGTTAGAGGTGCACAATGTGCTTCCATAACATTTTATACTTCTCCAATCTTAGCACTAATCAAACATGGTTGAATACTTTGTTTACTATAACTCTTACAGAGTTATAAGATCTGTGAAGACAGGGACAGGGACAATACCCATCTCTGTCTGGTTCATAGGTGGTATGTAATAGATATTTTTAAAAATAAGTGAGTTAATGAATGAGGGTGAGAATGAAGGCACAGAGGTATTAGGGGGAGGTGGGCCCCAGAGAATGGTGCCAAGGTCCAGTGGGGTGACTGGGATCAGCTCAGGCCTGACGCTGGCCACTCCCACCTAGCTCCTTTCTTTCTAATCTGTTCTCATTCTCCTTGGGAAGGATTGAGGTCTCTGGAAAACAGCCAAACAACTGTTATGGGAACAGCAAGCCCAAATAAAGCCAAGCATCAGGGGGATCTGAGAGCTGAAAGCAACTTCTGTTCCCCCTCCCTCAGCTGAAGGGGTGGGGAAGGGCTCCCAAAGCCATAACTCCTTTTAAGGGATTTAGAAGGCATAAAAAGGCCCCTGGCTGAGAACTTCCTTCTTCATTCTGCAGTACCGGTCTCGAAGGCCTGCAGGCGGCCGCCGCCACCATGAATGAGACTTCTAGCAAAGATTATTTGCCTTATGTTATGGGCTATTTGTGTAGCAGAAGATTGCAATGAACTTCCTCCAAGAAGAAATACAGAAATTCTGACAGGTTCCTGGTCTGACCAAACATATCCAGAAGGCACCCAGGCTATCTATAAATGCCGCCCTGGATATAGATCTCTTGGAAATGTAATAATGGTATGCAGGAAGGGAGAATGGGTTGCTCTTAATCCATTAAGGAAATGTCAGAAAAGGCCCTGTGGACATCCTGGAGATACTCCTTTTGGTACTTTTACCCTTACAGGAGGAAATGTGTTTGAATATGGTGTAAAAGCTGTGTATACATGTAATGAGGGGTATCAATTGCTAGGTGAGATTAATTACCGTGAATGTGACACAGATGGATGGACCAATGATATTCCTATATGTGAAGTTGTGAAGTGTTTACCAGTGACAGCACCAGAGAATGGAAAAATTGTCAGTAGTGCAATGGAACCAGATCGGGAATACCATTTTGGACAAGCAGTACGGTTTGTATGTAACTCAGGCTACAAGATTGAAGGAGATGAAGAAATGCATTGTTCAGACGATGGTTTTTGGAGTAAAGAGAAACCAAAGTGTGTGGAAATTTCATGCAAATCCCCAGATGTTATAAATGGATCTCCTATATCTCAGAAGATTATTTATAAGGAGAATGAACGATTTCAATATAAATGTAACATGGGTTATGAATACAGTGAAAGAGGAGATGCTGTATGCACTGAATCTGGATGGCGTCCGTTGCCTTCATGTGAAGAAAAATCATGTGATAATCCTTATATTCCAAATGGTGACTACTCACCTTTAAGGATTAAACACAGAACTGGAGATGAAATCACGTACCAGTGTAGAAATGGTTTTTATCCTGCAACCCGGGGAAATACAGCAAAATGCACAAGTACTGGCTGGATACCTGCTCCGAGATGTACCTTGAAACCTTGTGATTATCCAGACATTAAACATGGAGGTCTATATCATGAGAATATGCGTAGACCATACTTTCCAGTAGCTGTAGGAAAATATTACTCCTATTACTGTGATGAACATTTTGAGACTCCGTCAGGAAGTTACTGGGATCACATTCATTGCACACAAGATGGATGGTCGCCAGCAGTACCATGCCTCAGAAAATGTTATTTTCCTTATTTGGAAAATGGATATAATCAAAATCATGGAAGAAAGTTTGTACAGGGTAAATCTATAGACGTTGCCTGCCATCCTGGCTACGCTCTTCCAAAAGCGCAGACCACAGTTACATGTATGGAGAATGGCTGGTCTCCTACTCCCAGATGCATCCGTGTCAGCTTTACCCTCTGATAAGATATCGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGATATCGTTAACTCGAGGGATCCCACGTGCTGATTTTGTAGGTAACCACGTGCGGACCGAGCGGCCGCAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGGGGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATACGTCAAAGCAACCATAGTACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTTGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGGCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTACAATTTTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGAT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SEQ ID NO:29—典型的FHL AAV载体(具有HSP70启动子)
CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTGCGGCCGTTAACTAGTCCTGCAGGGCCGCCCACTCCCCCTTCCTCTCAGGGTCCCTGTCCCCTCCAGTGAATCCCAGAAGACTCTGGAGAGTTCTGAGCAGGGGGCGGCACTCTGGCCTCTGATTGGTCCAAGGAAGGCTGGGGGGCAGGACGGGAGGCGAAAACCCTGGAATATTCCCGACCTGGCAGCCTCATCGAGCTCGGTGATTGGCTCAGAAGGGAAAAGGCGGGTCTCCGTGACGACTTATAAAAGCCCAGGGGCAAGCGGTCCGGATAACGGCTAGCCTGAGGAGCTGCTGCGACAGTCCACTACCTTTTTCGAGAGTGACTCCCGTTGTCCCAAGGCTTCCCAGAGCGAACCTGTGCGGCTGCAGGCACCGGCGCGTCGAGTTTCCGGCGTCCGGAAGGACCGAGCTCTTCTCGCGGATCCAGTGTTCCGTTTCCAGCCCCCAATCTCAGAGCGGAGCCGACAGAGAGCAGGGAACCACCGGTCTCGAAGGCCTGCAGGCGGCCGCCGCCACCATGAATGAGACTTCTAGCAAAGATTATTTGCCTTATGTTATGGGCTATTTGTGTAGCAGAAGATTGCAATGAACTTCCTCCAAGAAGAAATACAGAAATTCTGACAGGTTCCTGGTCTGACCAAACATATCCAGAAGGCACCCAGGCTATCTATAAATGCCGCCCTGGATATAGATCTCTTGGAAATGTAATAATGGTATGCAGGAAGGGAGAATGGGTTGCTCTTAATCCATTAAGGAAATGTCAGAAAAGGCCCTGTGGACATCCTGGAGATACTCCTTTTGGTACTTTTACCCTTACAGGAGGAAATGTGTTTGAATATGGTGTAAAAGCTGTGTATACATGTAATGAGGGGTATCAATTGCTAGGTGAGATTAATTACCGTGAATGTGACACAGATGGATGGACCAATGATATTCCTATATGTGAAGTTGTGAAGTGTTTACCAGTGACAGCACCAGAGAATGGAAAAATTGTCAGTAGTGCAATGGAACCAGATCGGGAATACCATTTTGGACAAGCAGTACGGTTTGTATGTAACTCAGGCTACAAGATTGAAGGAGATGAAGAAATGCATTGTTCAGACGATGGTTTTTGGAGTAAAGAGAAACCAAAGTGTGTGGAAATTTCATGCAAATCCCCAGATGTTATAAATGGATCTCCTATATCTCAGAAGATTATTTATAAGGAGAATGAACGATTTCAATATAAATGTAACATGGGTTATGAATACAGTGAAAGAGGAGATGCTGTATGCACTGAATCTGGATGGCGTCCGTTGCCTTCATGTGAAGAAAAATCATGTGATAATCCTTATATTCCAAATGGTGACTACTCACCTTTAAGGATTAAACACAGAACTGGAGATGAAATCACGTACCAGTGTAGAAATGGTTTTTATCCTGCAACCCGGGGAAATACAGCAAAATGCACAAGTACTGGCTGGATACCTGCTCCGAGATGTACCTTGAAACCTTGTGATTATCCAGACATTAAACATGGAGGTCTATATCATGAGAATATGCGTAGACCATACTTTCCAGTAGCTGTAGGAAAATATTACTCCTATTACTGTGATGAACATTTTGAGACTCCGTCAGGAAGTTACTGGGATCACATTCATTGCACACAAGATGGATGGTCGCCAGCAGTACCATGCCTCAGAAAATGTTATTTTCCTTATTTGGAAAATGGATATAATCAAAATCATGGAAGAAAGTTTGTACAGGGTAAATCTATAGACGTTGCCTGCCATCCTGGCTACGCTCTTCCAAAAGCGCAGACCACAGTTACATGTATGGAGAATGGCTGGTCTCCTACTCCCAGATGCATCCGTGTCAGCTTTACCCTCTGATAAGATATCGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGATATCGTTAACTCGAGGGATCCCACGTGCTGATTTTGTAGGTAACCACGTGCGGACCGAGCGGCCGCAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGGGGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATACGTCAAAGCAACCATAGTACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTTGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGGCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTACAATTTTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGT
SEQ ID NO:30—典型的FHL AAV载体(具有PCK1启动子)
CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTGCGGCCGAGCCCCCAGTTAGGTTAGGCATTTCCAATCTTTGCCAATAAGCCACATATTTGCCCAAGTTAGGGTGCATCCTTCCCATGAACTTTGACTGTGACCTTTGACTATGGGGTGACATCTTATAGCTGTGGTGTTTTGCCAACCAGCAGCTCTTGGTACACAAAATGTGCTGCTAGCAGGTGCCCCGGCCAACCTTGTCCTTGACCCACCTGCCTGTTAAGAAAAGGGTGTTGTGTTTTGCAACAGCAGTAAAATGGGTCAAGGTTTAGTCAGTTGGAAGTTGTGTCAAAACTCACTATGGTTGGTTGAGGGCTCGAAGTCTCCCAGCATTCATTAACAACTATCTGTTCAATGATTATCTCCCTGGGGCGTGTTGCAGTGAGTTGGCCCAAAGCATAACTGACCCTGGCCGTGATCCAGAGACCTGCCCCCTGACGTCAGTGGCGAGCCTCCCTGGGTGCAGCTGAGGGGCAGGGCTATTCTTTTCCACAGTACCGGTCTCGAAGGCCTGCAGGCGGCCGCCGCCACCATGAATGAGACTTCTAGCAAAGATTATTTGCCTTATGTTATGGGCTATTTGTGTAGCAGAAGATTGCAATGAACTTCCTCCAAGAAGAAATACAGAAATTCTGACAGGTTCCTGGTCTGACCAAACATATCCAGAAGGCACCCAGGCTATCTATAAATGCCGCCCTGGATATAGATCTCTTGGAAATGTAATAATGGTATGCAGGAAGGGAGAATGGGTTGCTCTTAATCCATTAAGGAAATGTCAGAAAAGGCCCTGTGGACATCCTGGAGATACTCCTTTTGGTACTTTTACCCTTACAGGAGGAAATGTGTTTGAATATGGTGTAAAAGCTGTGTATACATGTAATGAGGGGTATCAATTGCTAGGTGAGATTAATTACCGTGAATGTGACACAGATGGATGGACCAATGATATTCCTATATGTGAAGTTGTGAAGTGTTTACCAGTGACAGCACCAGAGAATGGAAAAATTGTCAGTAGTGCAATGGAACCAGATCGGGAATACCATTTTGGACAAGCAGTACGGTTTGTATGTAACTCAGGCTACAAGATTGAAGGAGATGAAGAAATGCATTGTTCAGACGATGGTTTTTGGAGTAAAGAGAAACCAAAGTGTGTGGAAATTTCATGCAAATCCCCAGATGTTATAAATGGATCTCCTATATCTCAGAAGATTATTTATAAGGAGAATGAACGATTTCAATATAAATGTAACATGGGTTATGAATACAGTGAAAGAGGAGATGCTGTATGCACTGAATCTGGATGGCGTCCGTTGCCTTCATGTGAAGAAAAATCATGTGATAATCCTTATATTCCAAATGGTGACTACTCACCTTTAAGGATTAAACACAGAACTGGAGATGAAATCACGTACCAGTGTAGAAATGGTTTTTATCCTGCAACCCGGGGAAATACAGCAAAATGCACAAGTACTGGCTGGATACCTGCTCCGAGATGTACCTTGAAACCTTGTGATTATCCAGACATTAAACATGGAGGTCTATATCATGAGAATATGCGTAGACCATACTTTCCAGTAGCTGTAGGAAAATATTACTCCTATTACTGTGATGAACATTTTGAGACTCCGTCAGGAAGTTACTGGGATCACATTCATTGCACACAAGATGGATGGTCGCCAGCAGTACCATGCCTCAGAAAATGTTATTTTCCTTATTTGGAAAATGGATATAATCAAAATCATGGAAGAAAGTTTGTACAGGGTAAATCTATAGACGTTGCCTGCCATCCTGGCTACGCTCTTCCAAAAGCGCAGACCACAGTTACATGTATGGAGAATGGCTGGTCTCCTACTCCCAGATGCATCCGTGTCAGCTTTACCCTCTGATAAGATATCGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGATATCGTTAACTCGAGGGATCCCACGTGCTGATTTTGTAGGTAACCACGTGCGGACCGAGCGGCCGCAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGGGGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATACGTCAAAGCAACCATAGTACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTTGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGGCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTACAATTTTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGT
SEQ ID NO:31—CAG启动子
GTTAACTTGGCAAAGAATTCTGCAGTCGACGGTACCGCGGGCCCGGGATCCACCGGTCGCCACCATGGTGCGCTCCTCCAAGAACGTCATCAAGGAGTTCATGCGCTTCAAGGTGCGCATGGAGGGCACCGTGAACGGCCACGAGTTCGAGATCGAGGGCGAGGGCGAGGGCCGCCCCTACGAGGGCCACAACACCGTGAAGCTGAAGGTGACCAAGGGCGGCCCCCTGCCCTTCGCCTGGGACATCCTGTCCCCCCAGTTCCAGTACGGCTCCAAGGTGTACGTGAAGCACCCCGCCGACATCCCCGACTACAAGAAGCTGTCCTTCCCCGAGGGCTTCAAGTGGGAGCGCGTGATGAACTTCGAGGACGGCGGCGTGGTGACCGTGACCCAGGACTCCTCCCTGCAGGACGGCTGCTTCATCTACAAGGTGAAGTTCATCGGCGTGAACTTCCCCTCCGACGGCCCCGTAATGCAGAAGAAGACCATGGGCTGGGAGGCCTCCACCGAGCGCCTGTACCCCCGCGACGGCGTGCTGAAGGGCGAGATCCACAAGGCCCTGAAGCTGAAGGACGGCGGCCACTACCTGGTGGAGTTCAAGTCCATCTACATGGCCAAGAAGCCCGTGCAGCTGCCCGGCTACTACTACGTGGACTCCAAGCTGGACATCACCTCCCACAACGAGGACTACACCATCGTGGAGCAGTACGAGCGCACCGAGGGCCGCCACCACCTGTTCCTGTAGCGGCCGCACTCCTCAGGTGCAGGCTGCCTATCAGAAGGTGGTGGCTGGTGTGGCCAATGCCCTGGCTCACAAATACCACTGAGATCTTTTTCCCTCTGCCAAAAATTATGGGGACATCATGAAGCCCCTTGAGCATCTGAcTTCTGGCTAATAAAGGAAATTTATTTTCATTGCAATAGTGTGTTGGAATTTTTTGTGTCTCTCACTCGGAAGGACATATGGGAGGGCAAATC
SEQ ID NO:32—hRPE65启动子
GTTAACTATATTTATTGAAGTTTAATATTGTGTTTGTGATACAGAAGTATTTGCTTTAATTCTAAATAAAAATTTTATGCTTTTATTGCTGGTTTAAGAAGATTTGGATTATCCTTGTACTTTGAGGAGAAGTTTCTTATTTGAAATATTTTGGAAACAGGTCTTTTAATGTGGAAAGATAGATATTAATCTCCTCTTCTATTACTCTCCAAGATCCAACAAAAGTGATTATACCCCCCAAAATATGATGGTAGTATCTTATACTACCATCATTTTATAGGCATAGGGCTCTTAGCTGCAAATAATGGAACTAACTCTAATAAAGCAGAACGCAAATATTGTAAATATTAGAGAGCTAACAATCTCTGGGATGGCTAAAGGATGGAGCTTGGAGGCTACCCAGCCAGTAACAATATTCCGGGCTCCACTGTTGAATGGAGACACTACAACTGCCTTGGATGGGCAGAGATATTATGGATGCTAAGCCCCAGGTGCTACCATTAGGACTTCTACCACTGTCCCTAACGGGTGGAGCCCATCACATGCCTATGCCCTCACTGTAAGGAAATGAAGCTACTGTTGTATATCTTGGGAAGCACTTGGATTAATTGTTATACAGTTTTGTTGAAGAAGACCCCTAGGGTAAGTAGCCATAACTGCACACTAAATTTAAAATTGTTAATGAGTTTCTCAAAAAAAATGTTAAGGTTGTTAGCTGGTATAGTATATATCTTGCCTGTTTTCCAAGGACTTCTTTGGGCAGTACCTTGTCTGTGCTGGCAAGCAACTGAGACTTAATGAAAGAGTATTGGAGATATGAATGAATTGATGCTGTATACTCTCAGAGTGCCAAACATATACCAATGGACAAGAAGGTGAGGCAGAGAGCAGACAGGCATTAGTGACAAGCAAAGATATGCAGAATTTCATTCTCAGCAAATCAAAAGTCCTCAACCTGGTTGGAAGAATATTGGCACTGAATGGTATCAATAAGGTTGCTAGAGAGGGTTAGAGGTGCACAATGTGCTTCCATAACATTTTATACTTCTCCAATCTTAGCACTAATCAAACATGGTTGAATACTTTGTTTACTATAACTCTTACAGAGTTATAAGATCTGTGAAGACAGGGACAGGGACAATACCCATCTCTGTCTGGTTCATAGGTGGTATGTAATAGATATTTTTAAAAATAAGTGAGTTAATGAATGAGGGTGAGAATGAAGGCACAGAGGTATTAGGGGGAGGTGGGCCCCAGAGAATGGTGCCAAGGTCCAGTGGGGTGACTGGGATCAGCTCAGGCCTGACGCTGGCCACTCCCACCTAGCTCCTTTCTTTCTAATCTGTTCTCATTCTCCTTGGGAAGGATTGAGGTCTCTGGAAAACAGCCAAACAACTGTTATGGGAACAGCAAGCCCAAATAAAGCCAAGCATCAGGGGGATCTGAGAGCTGAAAGCAACTTCTGTTCCCCCTCCCTCAGCTGAAGGGGTGGGGAAGGGCTCCCAAAGCCATAACTCCTTTTAAGGGATTTAGAAGGCATAAAAAGGCCCCTGGCTGAGAACTTCCTTCTTCATTCTGCAGTTGG
SEQ ID NO:33-CFH氨基酸序列
MRLLAKIICLMLWAICVAEDCNELPPRRNTEILTGSWSDQTYPEGTQAIYKCRPGYRSLGNVIMVCRKGEWVALNPLRKCQKRPCGHPGDTPFGTFTLTGGNVFEYGVKAVYTCNEGYQLLGEINYRECDTDGWTNDIPICEVVKCLPVTAPENGKIVSSAMEPDREYHFGQAVRFVCNSGYKIEGDEEMHCSDDGFWSKEKPKCVEISCKSPDVINGSPISQKIIYKENERFQYKCNMGYEYSERGDAVCTESGWRPLPSCEEKSCDNPYIPNGDYSPLRIKHRTGDEITYQCRNGFYPATRGNTAKCTSTGWIPAPRCTLKPCDYPDIKHGGLYHENMRRPYFPVAVGKYYSYYCDEHFETPSGSYWDHIHCTQDGWSPAVPCLRKCYFPYLENGYNQNYGRKFVQGKSIDVACHPGYALPKAQTTVTCMENGWSPTPRCIRVKTCSKSSIDIENGFISESQYTYALKEKAKYQCKLGYVTADGETSGSITCGKDGWSAQPTCIKSCDIPVFMNARTKNDFTWFKLNDTLDYECHDGYESNTGSTTGSIVCGYNGWSDLPICYERECELPKIDVHLVPDRKKDQYKVGEVLKFSCKPGFTIVGPNSVQCYHFGLSPDLPICKEQVQSCGPPPELLNGNVKEKTKEEYGHSEVVEYYCNPRFLMKGPNKIQCVDGEWTTLPVCIVEESTCGDIPELEHGWAQLSSPPYYYGDSVEFNCSESFTMIGHRSITCIHGVWTQLPQCVAIDKLKKCKSSNLIILEEHLKNKKEFDHNSNIRYRCRGKEGWIHTVCINGRWDPEVNCSMAQIQLCPPPPQIPNSHNMTTTLNYRDGEKVSVLCQENYLIQEGEEITCKDGRWQSIPLCVEKIPCSQPPQIEHGTINSSRSSQESYAHGTKLSYTCEGGFRISEENETTCYMGKWSSPPQCEGLPCKSPPEISHGVVAHMSDSYQYGEEVTYKCFEGFGIDGPAIAKCLGEKWSHPPSCIKTDCLSLPSFENAIPMGEKKDVYKAGEQVTYTCATYYKMDGASNVTCINSRWTGRPTCRDTSCVNPPTVQNAYIVSRQMSKYPSGERVRYQCRSPYEMFGDEEVMCLNGNWTEPPQCKDSTGKCGPPPPIDNGDITSFPLSVYAPASSVEYQCQNLYQLEGNKRITCRNGQWSEPPKCLHPCVISREIMENYNIALRWTAKQKLYSRTGESVEFVCKRGYRLSSRSHTLRTTCWDGKLEYPTCAK
SEQ ID NO:34-FHL1氨基酸序列
MRLLAKIICLMLWAICVAEDCNELPPRRNTEILTGSWSDQTYPEGTQAIYKCRPGYRSLGNVIMVCRKGEWVALNPLRKCQKRPCGHPGDTPFGTFTLTGGNVFEYGVKAVYTCNEGYQLLGEINYRECDTDGWTNDIPICEVVKCLPVTAPENGKIVSSAMEPDREYHFGQAVRFVCNSGYKIEGDEEMHCSDDGFWSKEKPKCVEISCKSPDVINGSPISQKIIYKENERFQYKCNMGYEYSERGDAVCTESGWRPLPSCEEKSCDNPYIPNGDYSPLRIKHRTGDEITYQCRNGFYPATRGNTAKCTSTGWIPAPRCTLKPCDYPDIKHGGLYHENMRRPYFPVAVGKYYSYYCDEHFETPSGSYWDHIHCTQDGWSPAVPCLRKCYFPYLENGYNQNYGRKFVQGKSIDVACHPGYALPKAQTTVTCMENGWSPTPRCIRVSFTL
SEQ ID NO:35-CFI氨基酸序列
MKLLHVFLLFLCFHLRFCKVTYTSQEDLVEKKCLAKKYTHLSCDKVFCQPWQRCIEGTCVCKLPYQCPKNGTAVCATNRRSFPTYCQQKSLECLHPGTKFLNNGTCTAEGKFSVSLKHGNTDSEGIVEVKLVDQDKTMFICKSSWSMREANVACLDLGFQQGADTQRRFKLSDLSINSTECLHVHCRGLETSLAECTFTKRRTMGYQDFADVVCYTQKADSPMDDFFQCVNGKYISQMKACDGINDCGDQSDELCCKACQGKGFHCKSGVCIPSQYQCNGEVDCITGEDEVGCAGFASVTQEETEILTADMDAERRRIKSLLPKLSCGVKNRMHIRRKRIVGGKRAQLGDLPWQVAIKDASGITCGGIYIGGCWILTAAHCLRASKTHRYQIWTTVVDWIHPDLKRIVIEYVDRIIFHENYNAGTYQNDIALIEMKKDGNKKDCELPRSIPACVPWSPYLFQPNDTCIVSGWGREKDNERVFSLQWGEVKLISNCSKFYGNRFYEKEMECAGTYDGSIDACKGDSGGPLVCMDANNVTYVWGVVSWGENCGKPEFPGVYTKVANYFDWISYHVGRPFISQYNV
SEQ ID NO:36-MECP启动子序列
GGCCGAAATGGACAGGAAATCTCGCCAATTGACGGCATCGCCGCTGAGACTCCCCCCTCCCCCGTCCTCCCCGTCCCAGCCCGGCCATCACAGCCAATGACGGGCGGGCTCGCAGCGGCGCCGAGGGCGGGGCGCGGGCGCGCAGGTGCAGCAGCGCGCGGGCCGGCCAAGAGGGCGGGGCGCGACGTCGGCCGTGCGGGGTCCCGGCGTCGGCGGCGCGCGC

Claims (71)

1.一种编码补体因子H(CFH)或人因子H样1(FHL1)蛋白或其生物活性片段的腺相关病毒(AAV)载体，其中所述载体包含与SEQ ID NO:1-3或5的核苷酸序列或其片段至少80％相同的核苷酸序列。
2.如权利要求1所述的AAV载体，其中所述核苷酸序列与SEQ ID NO:1-3或5的核苷酸序列，或其密码子优化的变体和/或片段至少90％相同。
3.如权利要求1所述的AAV载体，其中所述核苷酸序列与SEQ ID NO:1-3或5的核苷酸序列，或其密码子优化的变体和/或片段至少95％相同。
4.如权利要求1所述的AAV载体，其中所述核苷酸序列是SEQ ID NO:1-3或5的序列，或其密码子优化的变体和/或片段。
5.如权利要求1-4中任一项所述的AAV载体，其中所述载体编码包含至少四个CCP结构域的CFH蛋白或其生物活性片段。
6.如权利要求1-4中任一项所述的AAV载体，其中所述载体编码包含至少五个CCP结构域的CFH蛋白或其生物活性片段。
7.如权利要求1-4中任一项所述的AAV载体，其中所述载体编码包含至少六个CCP结构域的CFH蛋白或其生物活性片段。
8.如权利要求1-4中任一项所述的AAV载体，其中所述载体编码包含至少七个CCP结构域的CFH蛋白或其生物活性片段。
9.如权利要求1-4中任一项所述的AAV载体，其中所述载体编码包含至少三个CCP结构域的CFH蛋白或其生物活性片段。
10.如权利要求1-4中任一项所述的AAV载体，其中所述载体编码包含H402多态性的CFH蛋白或其生物活性片段。
11.如权利要求1-4中任一项所述的AAV载体，其中所述载体编码包含V62多态性的CFH蛋白或其生物活性片段。
12.如权利要求1-11中任一项所述的AAV载体，其中所述CFH蛋白或其生物活性片段包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
13.如权利要求12所述的AAV载体，其中所述SEQ ID NO:4的氨基酸序列是所述CFH蛋白的C-末端序列。
14.如权利要求1-13中任一项所述的AAV载体，其中所述CFH蛋白或其生物活性片段能够跨布鲁赫膜扩散。
15.如权利要求1-14中任一项所述的AAV载体，其中所述CFH蛋白或其生物活性片段能够结合C3b。
16.如权利要求1-15中任一项所述的AAV载体，其中所述CFH蛋白或其生物活性片段能够促进C3b的分解。
17.如权利要求1-16中任一项所述的AAV载体，其中所述载体包含长度小于1000个核苷酸的启动子。
18.如权利要求1-16中任一项所述的AAV载体，其中所述载体包含长度小于500个核苷酸的启动子。
19.如权利要求1-16中任一项所述的AAV载体，其中所述载体包含长度小于400个核苷酸的启动子。
20.如权利要求1-16中任一项所述的AAV载体，其中所述启动子包括具有SEQ ID NO:6的核苷酸序列或其片段的启动子。
21.如权利要求1-16中任一项所述的AAV载体，其中所述启动子包括具有SEQ ID NO:8的核苷酸序列或其片段的启动子。
22.如权利要求1-16中任一项所述的AAV载体，其中所述启动子包括具有SEQ ID NO:12的核苷酸序列或其片段的启动子。
23.如权利要求1-16中任一项所述的AAV载体，其中所述启动子包括具有SEQ ID NO:14的核苷酸序列或其片段的启动子。
24.如权利要求1-16中任一项所述的AAV载体，其中所述启动子包括具有SEQ ID NO:16的核苷酸序列或其片段的启动子。
25.如权利要求1-16中任一项所述的AAV载体，其中所述启动子包括具有SEQ ID NO:18的核苷酸序列或其片段的启动子。
26.如权利要求1-16中任一项所述的AAV载体，其中所述启动子包括具有SEQ ID NO:20的核苷酸序列或其片段的启动子。
27.如权利要求1-16中任一项所述的AAV载体，其中所述启动子包括具有SEQ ID NO:31的核苷酸序列或其片段的启动子。
28.如权利要求1-16中任一项所述的AAV载体，其中所述启动子包括具有SEQ ID NO:32的核苷酸序列或其片段的启动子。
29.如权利要求1-28中任一项所述的AAV载体，其中所述启动子包含另外的病毒内含子。
30.如权利要求29所述的AAV载体，其中所述另外的病毒内含子包含SEQ ID NO:10的核苷酸序列或其片段。
31.如权利要求1-30中任一项所述的AAV载体，其中所述载体是AAV2载体。
32.如权利要求1-31中任一项所述的AAV载体，其中所述载体包含CMV启动子。
33.如权利要求1-32中任一项所述的AAV载体，其中所述载体包含Kozak序列。
34.如权利要求1-30中任一项所述的AAV载体，其中所述载体包含在编码CFH的载体部分侧翼的一个或多个ITR序列。
35.如权利要求1-34中任一项所述的AAV载体，其中所述载体包含多腺苷酸化序列。
36.如权利要求1-34中任一项所述的AAV载体，其中所述载体包含选择标记。
37.如权利要求36所述的AAV载体，其中所述选择标记是抗生素抗性基因。
38.如权利要求37所述的AAV载体，其中所述抗生素抗性基因是氨苄青霉素抗性基因。
39.一种组合物，其包含如权利要求1-38中任一项所述的AAV载体和药学上可接受的载体。
40.一种治疗患有与补体旁路途径的不良活性相关的障碍的受试者的方法，其包括向所述受试者施用如权利要求1-38中任一项所述的载体或如权利要求39所述的组合物中任一种的步骤。
41.一种治疗患有年龄相关性黄斑变性(AMD)的受试者的方法，其包括向所述受试者施用如权利要求1-38中任一项所述的载体或如权利要求39所述的组合物中任一种的步骤。
42.如权利要求40或41所述的方法，其中所述载体或组合物玻璃体内施用。
43.如权利要求40-42中任一项所述的方法，其中所述受试者不施用蛋白酶或编码蛋白酶的多核苷酸。
44.如权利要求40-43中任一项所述的方法，其中所述受试者不施用弗林蛋白酶或编码弗林蛋白酶的多核苷酸。
45.如权利要求40-43中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
46.如权利要求45所述的方法，其中所述人年龄为至少40岁。
47.如权利要求45所述的方法，其中所述人年龄为至少50岁。
48.如权利要求45所述的方法，其中所述人年龄为至少65岁。
49.如权利要求40-48中任一项所述的方法，其中所述载体或组合物局部施用。
50.如权利要求40-48中任一项所述的方法，其中所述载体或组合物全身性施用。
51.如权利要求40-48中任一项所述的方法，其中所述载体或组合物包含与肝脏中的强表达相关的启动子。
52.如权利要求51所述的方法，其中所述启动子包含与SEQ ID NO:16、18或20中任一个的核苷酸序列至少90％、95％或100％相同的核苷酸序列。
53.如权利要求40-48中任一项所述的方法，其中所述载体或组合物包含与眼中的强表达相关的启动子。
54.如权利要求53所述的方法，其中所述启动子包含与SEQ ID NO:6或32中任一个的核苷酸序列至少90％、95％或100％相同的核苷酸序列。
55.如权利要求40-54中任一项所述的方法，其中所述受试者在所述受试者的CFI基因中具有功能丧失突变。
56.如权利要求40-55中任一项所述的方法，其中所述受试者具有一个或多个选自以下的CFI突变：G119R、L131R、V152M、G162D、R187Y、R187T、T203I、A240G、A258T、G287R、A300T、R317W、R339Q、V412M和P553S。
57.如权利要求40-56中任一项所述的方法，其中所述受试者在所述受试者的CFH基因中具有功能丧失突变。
58.如权利要求40-57中任一项所述的方法，其中所述受试者具有一种或多种选自以下的CFH突变：R2T、L3V、R53C、R53H、S58A、G69E、D90G、R175Q、S193L、I216T、I221V、R303W、H402Y、Q408X、P503A、G650V、R1078S和R1210C。
59.如权利要求40-58中任一项所述的方法，其中所述受试者患有非典型溶血性尿毒综合征(aHUS)。
60.如权利要求40-59中任一项所述的方法，其中所述受试者患有肾脏疾病或并发症。
61.如权利要求1-38中任一项所述的载体或如权利要求39所述的组合物，其中与靶细胞(例如RPE或肝细胞)中CFH或FHL的内源性表达相比，所述载体或组合物能够诱导所述靶细胞中高至少20％、50％、100％、150％、200％、250％、300％、400％、500％、700％、900％、1000％、1100％、1500％或2000％的CFH或FHL的表达。
62.如权利要求1-38中任一项所述的载体或如权利要求39所述的组合物，其中与靶细胞(例如RPE或肝细胞)中的内源性CFH或FHL活性水平相比，所述载体或组合物在所述靶细胞中的表达导致所述靶细胞中高至少20％、50％、100％、150％、200％、250％、300％、400％、500％、700％、900％、1000％、1100％、1500％或2000％的CFH或FHL活性水平。
63.如权利要求1-38、61或62中任一项所述的载体或组合物或如权利要求39所述的组合物，其中所述载体或组合物在眼的靶细胞中诱导CFH表达。
64.如权利要求63所述的载体或组合物，其中所述载体或组合物在视网膜或黄斑的靶细胞中诱导CFH表达。
65.如权利要求63或64所述的载体或组合物，其中所述视网膜的靶细胞选自于由以下组成的层的组：内界膜、神经纤维、神经节细胞层(GCL)、内网层、内核层、外网层、外核层、外界膜、视杆和视锥以及视网膜色素上皮(RPE)。
66.如权利要求64所述的载体或组合物，其中所述靶细胞在脉络丛中。
67.如权利要求64所述的载体或组合物，其中所述靶细胞在黄斑中。
68.如权利要求1-38或61-68中任一项所述的载体或组合物，其中所述载体或组合物在GCL和/或RPE的细胞中诱导CFH表达。
69.如权利要求40-60中任一项所述的方法，其中所述载体或组合物以1×1010vg/眼至1×1013vg/眼范围的剂量施用于所述视网膜。
70.如权利要求70所述的方法，其中所述载体或组合物以约1.4×1012vg/眼的剂量施用于所述视网膜。
71.如权利要求1-16或29-38中任一项所述的AAV载体，其中所述启动子包括具有SEQID NO:36的核苷酸序列或其片段的启动子。
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