CN114144518A - 用于基因疗法的双亮氨酸拉链激酶抑制剂 - Google Patents

Abstract

本公开提供了可用于治疗与双亮氨酸拉链(DLK)相关的病状，例如包括视神经病变的神经退行性病症的组合物和方法。本公开提供了调节双亮氨酸拉链激酶(DLK)或亮氨酸拉链激酶(LZK)的活性的基因构建体和载体。本公开还提供了抑制DLK的激酶和/或信号传导活性的显性负DLK(DN‑DLK)蛋白质。本公开还提供了载体、药物组合物和抑制DLK的方法。

Description

用于基因疗法的双亮氨酸拉链激酶抑制剂

发明领域

本公开大体上涉及使用双亮氨酸拉链激酶的工程化抑制剂的细胞或基因疗法，包括用于神经退行性病症，诸如青光眼。

相关申请

本申请要求2019年2月15日提交的美国临时专利申请号62/806,213和2019年2月15日提交的美国临时专利申请号62/806,210的优先权，其中每一个以引用的方式整体并入本文中。

背景技术

双亮氨酸拉链激酶(DLK)是人类中由DLK基因编码的丝氨酸/苏氨酸蛋白质激酶家族的成员，也称为有丝分裂原活化的蛋白质激酶12或MAP3K12。这种激酶含有亮氨酸-拉链结构域，并且主要在神经元细胞中表达。显示这种激酶在突触末端中的磷酸化状态通过膜去极化经由钙调磷酸酶(calcineurin)进行调节。这种激酶形成同二聚体，以及具有含有转录因子的亮氨酸拉链的异二聚体，诸如cAMP反应性元件结合蛋白(CREB)和MYC，并且因此可在PKA或视网膜酸诱导的神经元分化中发挥调节作用。或者，已描述了编码不同蛋白质的剪接的转录变体。在激酶结果的活性位点中具有K152A点突变的DLK的表达对内源性DLK具有显性负效应。Xu等人Mol Cell Biol.21(14):4713-24(2001)。

DLK已被证明是对轴突损伤的神经元反应的必要组分。DLK蛋白存在于轴突中，并且蛋白质水平响应于轴突损伤而增加(Xiong X等人J.Cell Biol,2010；191(1):211–223)。DLK启动了将凋亡和再生反应与轴突损伤联合的转录程序(Watkins等人,Proc Natl AcadSci,2013；110(10):4039-4044)。

视神经病变是与神经元细胞死亡，特别是称为视网膜神经节细胞(RGC)的投射神经元的死亡相关的一组视觉疾病。在视神经病变中，美国每年花费19亿美元来治疗青光眼。

因此，对于用于治疗与DLK相关的疾病或病症的组合物和方法，以及对于用于青光眼的细胞或基因疗法的组合物和方法，存在长期未满足的需求。本公开提供了此类新型组合物和方法来处理和解决这种需求。

发明内容

本公开提供了DLK抑制剂的各种实施方案，例如，通过与内源性DLK(称为显性负双亮氨酸拉链激酶(DN-DLK))形成非活性异二聚体而以显性负方式起作用的DLK抑制剂。

在一个方面，本公开提供了可用于治疗与DLK和视网膜细胞相关的疾病或病症的组合物和方法。具体地讲，本公开提供了用于递送DN-DLK的载体(包括病毒载体)、在治疗中使用此类载体的方法以及抑制细胞中的DLK活性的方法。

在一些实施方案中，本公开提供了抑制剂，其包含使用全长人DLK(SEQ ID NO:1)的编号的在位置391和393中的至少一个处具有取代的与DLK(SEQ ID NO:3)的亮氨酸拉链结构域至少95％相同的序列。

本公开还提供了重组病毒载体，包括重组腺相关病毒(rAAV)载体，其包含多核苷酸序列编码本公开的抑制剂中的一种的表达盒。

本公开还提供了使用载体抑制细胞中的DLK活性的方法，以及包括本公开的一种或多种载体的药物组合物和单位剂量。本公开还提供了针对包括但不限于与视网膜细胞功能障碍相关的疾病或病症的病状的治疗方法，所述视网膜细胞功能障碍选自以下组成的组：青光眼、湿性黄斑变性、干性黄斑变性、地理性萎缩、视网膜脱离和视网膜营养不良，诸如亚瑟氏综合征(Usher’s syndrome)、斯塔加特氏病(Stargardt’s disease)、利伯氏先天性黑内障(Leber’s congenital amaurosis)或色素性视网膜炎。在另外其他实施方案中，所述疾病与视网膜病变相关，诸如糖尿病视网膜病变、近视性黄斑病变。在其他实施方案中，所述疾病是视神经病变，诸如视神经炎、非动脉炎性前部缺血性视神经病变(NAION)、动脉炎性前部缺血性视神经病变(AION)、创伤性视神经病变、利伯氏视神经病变(Leber’soptic neuropathy)、显性视神经萎缩、隐性视神经萎缩或放射性视神经病变。在其他实施方案中，所述疾病可以包括肌萎缩侧索硬化(ALS)、帕金森病(Parkinson Disease)、阿尔茨海默病(Alzheimer Disease)、朊病毒相关神经退行性疾病、亨廷顿氏病(Huntington’sdisease)、脊髓小脑性共济失调、肌肉萎缩和多系统萎缩中的一种或多种。

在另一个方面，本公开提供了包含编码双亮氨酸拉链激酶(DLK)抑制剂的多核苷酸的载体。多核苷酸可以可操作地连接至启动子。所述抑制剂能够结合(i)内源性DLK蛋白，或(ii)编码内源性DLK的内源性mRNA。在一些实施方案中，抑制剂能够降低视网膜细胞中内源性DLK的表达、信号传导活性或激酶活性。本公开还提供了治疗涉及将此类载体施用于受试者的视网膜的与视网膜细胞相关的疾病或病症的方法。可以治疗的疾病或病症包括(但不限于)与视网膜细胞功能障碍相关的疾病或病症。实例包括青光眼、视网膜病变、视网膜脱离、视神经病变和视网膜营养不良。

本公开还提供了经基因修饰的视网膜细胞，其包括已描述的多核苷酸类型，所述多核苷酸编码双亮氨酸拉链激酶(DLK)的抑制剂。本公开提供了制备此类细胞的方法，包括使其与病毒载体接触。本文还提供了药物组合物。

前述段落并非旨在定义本发明的每个方面，并且在其他章节，诸如具体实施方式中描述额外方面。整个文件旨在作为统一公开内容而相关，并且应理解，即使特征的组合并未在本文件的同一句子或段落或部分中一起出现，也涵盖本文中所描述的特征的所有组合。作为额外方面，本发明包括本发明的所有实施方案，其范围以任何方式比由上文特定段落定义的变化更窄。举例来说，在将本发明的某些方面描述为属的情况下，应理解，属的每个成员单独地是本发明的一个方面。

附图说明

图1A-1B描绘了双亮氨酸拉链激酶(DLK)的亮氨酸拉链结构域。图1A显示了亮氨酸拉链的单个七肽重复序列(heptad repeat)的二聚化的示意图。一个单体上的七肽内的氨基酸残基由N末端至C末端方向上的字母(a)至(g)表示。其他单体上的等效位置由字母(a’)至(g’)表示。在二聚体的一个链上的e与相对链上的g’之间形成的对(称为e-g’或e’-g对)可以形成静电相互作用，并且在确定亮氨酸拉链二聚体的稳定性方面是重要的。图1B显示了根据同种型1编号(UniProt Q12852)，人DLK(也称为MAP3K12)的残基387至467的氨基酸序列。遵循图1A中所示的惯例，八个七肽重复序列标记为L1至L8，并且重复序列中的每个残基标记为a到g。

图2A-2H描绘了八个七肽重复序列L1(图2A)、L2(图2B)、L3(图2C)、L4(图2D)、L5(图2E)、L6(图2F)、L7(图2G)、L8(图2H)。在DLK的天然同二聚体中，七肽重复序列中的每一个与等效的七肽(L1与L1、L2与L2等)同二聚化。在每个小图中，一个七肽的二聚化显示在标准的螺旋轮图示中，如图1A中所示。每个氨基酸位置使用标准的单字母缩写。关键位置处的氨基酸的特征指示为正性(+)、负性(–)或疏水性(hydro)。g-e’和e-g’相互作用由每个小图的中心顶部或中心底部处的阻挡箭头(排斥性或带电-疏水相互作用)或指向箭头(电荷-有吸引力的力)指示。

图3描绘了设计的显性负DLK(DN-DLK)构建体。相对于天然DLK的取代显示为下划线和粗体。

图4A-4C描绘了图3的DLK和DN-DLN的同二聚化或异二聚化相互作用。仅显示g和e残基以突出显示g-e’和g’-e相互作用。静电相互作用由线描绘。相反电荷之间的相互作用显示为粗实线以指示吸引力。类似电荷之间的相互作用显示为虚线以指示排斥力。图4A显示了DLK的同二聚体。图4B显示了DLK和DN-DLK的异二聚体。图4C示出了DN-DLK的同二聚体。

具体实施方式

1.概述

本公开提供了可用于治疗与视网膜细胞相关的疾病或病症的组合物和方法。具体地讲，本发明提供了包含编码双亮氨酸拉链激酶(DLK)抑制剂的多核苷酸的细胞和载体，和其使用方法。有利地，载体能够减少细胞中内源性DLK的表达、信号传导活性或激酶活性，在一些实施方案中，所述细胞是视网膜细胞。

2.定义

本文提及的所有出版物和专利在此以引用的方式整体并入，如同每个个别出版物或专利被具体且个别地指示以引用的方式并入一般。在发生冲突的情况下，以本申请(包括本文的任何定义)为准。但是，提及本文引用的任何参考文献、文章、出版物、专利、专利出版物和专利申请并不且不应被视为承认或任何形式的建议，即其构成有效的现有技术或构成世界上任何国家的公知常知的部分。

在本描述中，除非另外指示，否则任何浓度范围、百分比范围、比率范围或整数范围应理解为包括所叙述范围内的任何整数的值，且适当时包括其分数(诸如整数的十分之一和百分之一)。当紧接在数量或数字之前时，术语“约”意指数量或数字范围加减10％。应理解，除非另外指示，否则如本文所用，术语“一(a)”和“一(an)”是指所列举的组分中的“一个或多个”。替代物(例如，“或”)的使用应理解为意指替代物中的一个、两个或其任何组合。术语“和/或”应理解为意指替代物中的一个或两个。如本文所用，术语“包括(include)”和“包括/包含(comprise)”是同义使用的。

如本申请中所用，术语“约”和“大约”用作等效物。本申请中使用的带有或不带约/大约的任何数字意在涵盖相关领域的普通技术人员所理解的任何正常波动。在某些实施方案中，除非另有说明或从上下文中显而易见，术语“大约”或“约”是指处于所陈述参考值的任一方向上(大于或小于)的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小的值(除非数量将超过可能值的100％)。

“减少”或“降低”是指与参考值相比，特定值减少或降低至少5％，例如，5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％。特定值的减少或降低也可以表示为与参考值相比值的倍数变化，例如，与参考值相比，减少至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、500倍、1000倍或更多倍。

“增加”是指与参考值相比，特定值增加至少5％，例如，5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、100％、200％、300％、400％、500％或更多。特定值的增加还可表示为与参考值相比值的倍数变化，例如，与参考值的水平相比，增加至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、500倍、1000倍或更多倍。

“互补”是指通过碱基堆叠和特异性氢键合在两个序列之间配对的能力，所述两个序列包含天然存在的或非天然存在的(例如，如上所描述修饰的)碱基(核苷)或其类似物。举例来说，如果核酸的一个位置处的碱基能够与靶标的对应位置处的碱基氢键合，则将碱基视为在所述位置处彼此互补。核酸可以包含不向氢键合提供正贡献或负贡献的通用碱基或惰性脱碱基间隔物。碱基配对可包括规范性沃森-克里克碱基配对(Watson-Crick basepairing)和非沃森-克里克碱基配对(non-Watson-Crick base pairing)(例如，摆动碱基配对(Wobble base pairing)和胡斯坦碱基配对(Hoogsteen base pairing))。应理解，对于互补碱基配对，腺苷型碱基(A)与胸苷型碱基(T)或尿嘧啶型碱基(U)互补，胞嘧啶型碱基(C)与鸟嘌呤型碱基(G)互补，并且诸如3-硝基吡咯或5-硝基吲哚的通用碱基可与任何A、C、U或T杂交并被认为是互补的。Nichols等人,Nature,1994；369:492-493和Loakes等人,Nucleic Acids Res.,1994；22:4039-4043。肌苷(I)在本领域中也被认为是通用碱基，并且被视为与任何A、C、U或T互补。参见Watkins和SantaLucia,Nucl.Acids Research,2005；33(19):6258-6267。

术语“受试者”包括动物，诸如例如哺乳动物。在一些实施方案中，哺乳动物是灵长类动物。在一些实施方案中，哺乳动物是人。在一些实施方案中，受试者是家畜，诸如牛、绵羊、山羊、奶牛、猪等；或家畜，诸如犬和猫。在一些实施方案中(例如，特别是在研究环境中)，受试者是啮齿动物(例如，小鼠、大鼠、仓鼠)、兔、灵长类动物或猪，诸如近交系猪等。术语“受试者”和“患者”在本文中可互换使用。

“施用”在本文中指将药剂或组合物引入受试者中。

如本文所用，“治疗”是指将药剂或组合物递送至受试者，以影响生理结果。在一些实施方案中，治疗是指治疗受试者，例如人的疾病，包括(a)抑制疾病，例如阻止疾病发展或预防疾病进展；(b)缓解疾病，例如引起疾病状态的消退；(c)治愈疾病；和(d)预防疾病的发作，例如阻止被鉴定为遗传缺陷携带者的无症状受试者的疾病发展。在一个方面，治疗不包括防治或预防。

术语“有效量”或“治疗有效量”是指产生特定生理效应所需的药剂或组合物的最小量(例如，增加、活化或增强特定生理效应所需的量)。特定药剂的有效量或治疗有效量可以基于药剂的性质以各种方式表示，诸如质量/体积、细胞数量/体积、颗粒/体积、(药剂的质量)/(受试者的质量)、细胞数量/(受试者的质量)或颗粒/(受试者的质量)。特定药剂的有效量或治疗有效量也可以表示为半最大有效浓度(EC₅₀)，其是指导致特定生理反应的量值在参考水平与最大反应水平之间的中间的药剂浓度。

细胞“群体”指大于1的任何数量的细胞，但优选是至少1×10³个细胞、至少1×10⁴个细胞、至少1×10⁵个细胞、至少1×10⁶个细胞、至少1×10⁷个细胞、至少1×10⁸个细胞、至少1×10⁹个细胞、至少1×10¹⁰个细胞或更多细胞。细胞群体可以指体外群体(例如，培养中的细胞群体)或体内群体(例如，驻留在特定组织中的细胞群体)。

短语“药学上可接受的”在本文中用于指与合理的益处/风险比相称的在合理的医学判断范围内适合与人类和动物的组织接触使用而无过度毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症那些化合物、材料、组合物和/或剂型。

如本文所用，“药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂”包括但不限于已被美国食品和药物管理局(the United States Food and Drug Administration)批准用于人类/或家畜中的任何佐剂、载体、赋形剂、助流剂、甜味剂、稀释剂、防腐剂、染料/着色剂、调味剂、表面活性剂、润湿剂、分散剂、悬浮剂、稳定剂、等渗剂、溶剂、表面活性剂或乳化剂。

如本文所用，“载体”是指能够将核酸分子连同病毒载体中的一种或多种病毒蛋白(诸如对于被包封的病毒，病毒的衣壳)一起转移或转运至细胞中的核酸分子。转移的核酸通常连接至(例如插入至)载体核酸分子中。载体可以包括引导细胞中的自主复制或逆转录的序列，或者可以包括足以允许整合到宿主细胞DNA中的序列。“载体”包括基因治疗载体。如本文所用，术语“基因治疗载体”是指能够用于执行基因疗法的载体，例如，将编码治疗性多肽的多核苷酸序列递送至受试者。基因治疗载体可以包含编码蛋白质的多核苷酸(“转基因”)。

如本文所用，术语“表达盒”是指能够在驱动编码并入所述表达盒中的蛋白质的多核苷酸(例如，转基因)的表达的适当背景下的DNA区段。当引入宿主细胞中时，表达盒尤其能够引导细胞的机制将转基因转录成RNA，所述RNA随后通常进一步加工并且最终翻译成治疗活性多肽。基因治疗载体可以包含表达盒或基本上由表达盒组成。术语表达盒不包括5'ITR的5'和3'ITR的3'的多核苷酸序列。本文提供宿主细胞，其包含本公开的载体或基本上由本公开的载体组成或另外由本公开的载体组成。细胞可以是任何适当的物种，例如哺乳动物细胞。

如本文所用，关于多核苷酸的短语“可操作地连接”或“在转录控制下”可互换地指启动子和多核苷酸的构型，其使得多核苷酸能够由能够与启动子结合的聚合酶转录。

术语“序列同一性”是指两个多核苷酸或多肽序列之间的相同且处于相同相对位置的碱基或氨基酸的百分比。因此，与另一个多核苷酸或多肽序列相比，一种多核苷酸或多肽序列具有一定百分比的序列同一性。对于序列比较，通常一个序列充当参考序列，测试序列与参考序列进行比较。术语“参考序列”是指与测试序列进行比较的分子。与参考序列具有一定百分比的“序列同一性”(例如，60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％)的多核苷酸或多核苷酸区域(或多肽或多肽区域)意指，当比对时，测试序列中的每个位置处的碱基(或氨基酸)的百分比与参考序列中的相同位置处的碱基(或氨基酸)相同。可以使用本领域已知的软件程序，例如描述于Ausubel等人编(2007)Current Protocolsin Molecular Biology中的那些软件程序来确定这种比对和同源性百分比或序列同一性优选地，使用默认参数进行比对。一个比对程序是使用默认参数的BLAST。具体地讲，程序是使用以下默认参数的BLASTN和BLASTP：遗传代码＝标准；过滤器＝无；链＝两者；截止值＝60；期望值＝10；基质＝BLOSUM62；描述＝50个序列；排序依据＝高得分；数据库＝非冗余，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS翻译+SwissProtein+SPupdate+PIR。这些程序的详细信息可在以下互联网地址找到：ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi。

多肽或蛋白质的“等效”或“功能等效””是与所述参考多肽或蛋白质具有一定的序列同一性(例如，与参考的60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性)并且与参考多肽或蛋白质相比保留相似活性或功能的多肽或蛋白质。

“包括/包含(Comprising/comprises)”旨在意指组合物，例如培养基，并且方法包括所叙述的元素，但不排除其他元素。当用于定义组合物和方法时，“基本上由......组成”应意指排除对用于所陈述目的的组合具有任何重要意义的其他元素。因此，基本上由如本文定义的元素组成的组合物不排除基本上不影响所要求保护的发明的基本和新颖特征的其他材料或步骤。“由......组成”应意指排除超过微量元素的其他成分和实质性方法步骤。由这些转换术语中的每一个定义的实施方案在本公开的范围内。

分子和细胞生物化学中的一般方法可见于诸如Molecular Cloning:ALaboratory Manual,第3版(Sambrook等人,HaRBor Laboratory Press 2001)；ShortProtocols in Molecular Biology,第4版(Ausubel等人编,John Wiley&Sons 1999)；Protein Methods(Bollag等人,John Wiley&Sons 1996)；Nonviral Vectors for GeneTherapy(Wagner等人编,Academic Press 1999)；Viral Vectors(Kaplift&Loewy编,Academic Press 1995)；Immunology Methods Manual(I.Lefkovits编,Academic Press1997)；和Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures in Biotechnology(Doyle&Griffiths,John Wiley&Sons 1998)的标准教科书，其公开内容以引用方式并入本文。

本文使用的章节标题仅用于组织目的，并且不应解释为限制所描述的主题。

3.1载体

本发明的各种实施方案包括病毒载体和非病毒载体。病毒载体包括腺相关病毒、腺病毒、慢病毒、睡美人(Sleeping Beauty)、疱疹病毒和本领域已知的其他病毒。使本发明的多核苷酸适用于各种病毒载体在普通技术人员的技能范围内。非病毒载体包括脂质体、脂质样颗粒和阳离子型聚合物，以及质粒、杆粒、线性、小环状或其他形式的裸DNA的电穿孔。本公开的多核苷酸可以DNA或RNA形式递送。经修饰的多核苷酸是本领域已知的，并且包括本公开的方法和组合物。本文所描述的特定实施方案中特定类型的病毒载体和非病毒载体的公开内容不旨在限制本发明。

如本文所用，术语“AAV”是腺相关病毒或其重组载体的标准缩写。腺相关病毒是单链DNA细小病毒，其仅在其中某些功能由共感染辅助病毒提供的细胞中生长。AAV的一般信息和综述可见于例如Carter,1989,Handbook of Parvoviruses,第1卷,第169-228页,和Berns,1990,Virology,第1743-1764页Raven Press,(New York)。完全预期描述于这些综述中的相同原理将适用于综述出版日期后表征的额外AAV血清型，因为众所周知，即使在遗传水平上，各种血清型在结构上和功能上都非常紧密相关。(参见例如，Blacklowe,1988,第165-174页,Parvoviruses and Human Disease,J.R.Pattison编；和Rose,ComprehensiveVirology 3:1-61(1974))。举例来说，所有AAV血清型明显展现出由同源rep基因介导的非常相似的复制特性；并且所有携带三种相关的衣壳蛋白，诸如在AAV2中表达的那些衣壳蛋白。通过异源双链体分析进一步表明相关性程度，所述异源双链体分析揭示了沿着基因组长度的血清型之间的广泛交叉杂交；以及对应于“反向末端重复序列”(ITR)的在末端处存在类似的自退火区段。类似的感染模式还表明，每种血清型中的复制功能处于相似的调节控制下。

如本文所用，“AAV载体”或“rAAV载体”是指重组载体，其包含侧接AAV末端重复序列(ITR)的一个或多个所关注多核苷酸(或转基因)。此类AAV载体在存在于已经用编码和表达rep和cap基因产物的载体转染的宿主细胞中时可以复制并包装到感染性病毒颗粒中。

如本文所用，“AAV病毒粒子”或“AAV病毒颗粒”或“AAV载体颗粒”是指由至少一种AAV衣壳蛋白和衣壳化多核苷酸AAV载体构成的病毒颗粒。如本文所用，如果颗粒包含异源多核苷酸(即，除野生型AAV基因组之外的多核苷酸，诸如待递送至哺乳动物细胞的转基因)，则其通常被称为“AAV载体颗粒”或简称为“AAV载体”。因此，AAV载体颗粒的产生必然包括AAV载体的产生，因为载体包含在AAV载体颗粒内。

腺相关病毒(AAV)是一种复制缺陷型细小病毒，其单链DNA基因组的长度为约4.7kb，包括两个145个核苷酸反向末端重复序列(ITR)。存在多种已知AAV变体，当通过抗原表位分类时有时也称为血清型。AAV血清型的基因组的核苷酸序列是已知的。举例来说，AAV-1的完整基因组在GenBank登录号NC_002077中提供；AAV-2的完整基因组在GenBank登录号NC_001401和Srivastava等人,J.Virol.,45:555-564(1983)中提供；AAV-3的完整基因组在GenBank登录号NC_1829中提供；AAV-4的完整基因组在GenBank登录号NC_001829中提供；AAV-5基因组在GenBank登录号AF085716中提供；AAV-6的完整基因组在GenBank登录号NC_001862中提供；AAV-7和AAV-8基因组的至少一部分分别在GenBank登录号AX753246和AX753249中提供；AAV-9基因组在Gao等人,J.Virol.,78:6381-6388(2004)中提供；AAV-10基因组在Mol.Ther.,13(1):67-76(2006)中提供；并且AAV-11基因组在Virology,330(2)375-383(2004)中提供。AAV rh.74基因组的序列在以引用的方式并入本文的美国专利9,434,928中提供。包括AAV.Anc80、AAV.Anc80L65和其衍生物的祖先AAV的序列描述于WO2015054653A2和Wang等人Single stranded adeno-associated virus achievesefficient gene transfer to anterior segment in the mouse eye.PLoS One.2017年8月1日；12(8):e0182473中。

AAV载体可以指天然存在的AAV，诸如AAV-1至AAV-10，或非天然存在的载体，诸如通过合理设计、定向进化等进行工程化的那些载体。引导病毒DNA复制(rep)、衣壳化/包装和宿主细胞染色体整合的顺式作用序列包含在AAV ITR内。三个AAV启动子(对于其相对图谱位置命名为p5、pl9和p40)驱动编码rep和cap基因的两个AAV内部开放阅读框的表达。两个rep启动子(p5和p9)与单一AAV内含子(在核苷酸2107和2227处)的差异剪接相结合，导致由rep基因产生四种rep蛋白(rep 78、rep 68、rep 52和rep 40)。Rep蛋白具有多重酶促特性，其最终负责复制病毒基因组。cap基因由p40启动子表达，并且其编码三个衣壳蛋白VP1、VP2和VP3。替代剪接和非一致翻译起始位点负责三个相关衣壳蛋白的产生。单个共有聚腺苷酸化位点位于AAV基因组的图谱位置95处。AAV的生命周期和遗传学综述于Muzyczka,Current Topics in Microbiology and Immunology,158:97-129(1992)中。

AAV具有独特的特征，其使其作为例如在基因疗法中将外来DNA递送至细胞的载体具有吸引力。培养中细胞的AAV感染是非细胞病变的，并且人和其他动物的天然感染是沉默的和无症状的。此外，AAV感染许多哺乳动物细胞，从而允许在体内靶向许多不同组织的可能性。此外，AAV转导缓慢分裂和非分裂的细胞，并且可以基本上作为转录活性核附加体(染色体外元件)在这些细胞的寿命期间持续存在。AAV病毒前基因组作为克隆DNA插入质粒中，这使得重组基因组的构建成为可行的。此外，由于导引AAV复制和基因组衣壳化的信号包含在AAV基因组的ITR内，因此基因组的内部大约4.3kb的一些或全部(编码复制和结构衣壳蛋白，rep-cap)可以被外源DNA替换。为了产生AAV载体，可以反式形式提供rep和cap蛋白。AAV的另一显著特征是其是极其稳定且强大的病毒。其容易承受用于灭活腺病毒的条件(56℃至65℃，持续数小时)，使得AAV的冷藏不太重要。甚至可以冻干AAV。最后，AAV感染的细胞对双重感染不具有抗性。

3.2AAV血清型和基因组

rAAV基因组中的AAV DNA可以来自可以衍生出重组病毒的任何AAV变体或血清型，包括但不限于AAV变体或血清型AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10、AAV-11、AAV-12、AAV-13和Anc80L65。假型rAAV的产生公开于例如WO 01/83692中。还考虑了其他类型的rAAV变体，例如具有衣壳突变的rAAV。参见例如Marsic等人,Molecular Therapy,22(11):1900-1909(2014)。各种AAV血清型的基因组的核苷酸序列是本领域已知的。为了促进眼特异性表达，可以使用AAV6、AAV8或AAV9。

在一些情况下，rAAV包含自互补基因组。如本文所定义，包含“自互补”或“双链”基因组的rAAV是指已经工程化的rAAV，使得rAAV的编码区被配置为形成分子内双链DNA模板，如McCarty等人Self-complementary recombinant adeno-associated virus(scAAV)vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis.GeneTherapy.8(16):1248-54(2001)中所描述。在一些情况下，本公开考虑使用包含自互补基因组的rAAV，因为在感染(此类转导)时，而不是等待细胞介导的rAAV基因组的第二链的合成，scAAV的两个互补半体将结合以形成一个双链DNA(dsDNA)单元，所述双链DNA准备立即复制和转录。应理解，代替在rAAV中发现的完全编码能力(4.7-6kb)，包含自互补基因组的rAAV只能容纳所述量的约一半(≈2.4kb)。

在其他情况下，rAAV载体包含单链基因组。如本文所定义，“单一标准”基因组是指不是自互补的基因组。在大多数情况下，非重组AAV具有单链DNA基因组。已经有一些迹象指示，rAAV应当是scAAV，以实现细胞，诸如眼细胞的高效转导。然而，本公开考虑了可具有单链基因组而非自互补基因组的rAAV载体，其理解rAAV载体的其他基因修饰可能有益于在靶细胞中获得最佳基因转录。在一些情况下，本公开涉及能够实现有效基因转移至小鼠眼的前部区段的单链rAAV载体。参见Wang等人Single stranded adeno-associated virusachieves efficient gene transfer to anterior segment in the mouse eye.PLoSONE 12(8):e0182473(2017)。

在一些情况下，rAAV载体是血清型AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV2.7m8或Anc80L65。Anc80L65描述于Sharma等人Transduction efficiency of AAV 2/6,2/8and 2/9vectors for delivering genes inhuman corneal fibroblasts.PLoS ONE 12(8):e0182473(2017)中。假型rAAV的生产公开于例如WO 01/83692中。还考虑了其他类型的rAAV变体，例如具有衣壳突变的rAAV。参见例如Marsic等人,Molecular Therapy,22(11):1900-1909(2014)。在一些情况下，rAAV载体具有血清型AAV9。在一些实施方案中，所述rAAV载体具有血清型AAV9，并且包含单链基因组。在一些实施方案中，所述rAAV载体具有血清型AAV9，并且包含自互补基因组。在一些实施方案中，rAAV载体包含AAV2的反向末端重复(ITR)序列。在一些实施方案中，rAAV载体包含AAV2基因组，使得rAAV载体是AAV-2/9载体、AAV-2/6载体或AAV-2/8载体。本公开涵盖基因组和血清型的其他组合，包括但不限于通过合理设计、定向进化等制备的非天然存在的变体，以及描述于Brain Res Bull.2010年2月15日；81(2-3):273；Castle等人ControllingAAV Tropism in the Nervous System with Natural and Engineered Capsids.MethodsMol Biol.2016；1382:133–149；和Kay等人Targeting Photoreceptors via IntravitrealDelivery Using Novel,Capsid-Mutated AAV Vectors.PLoS One.2013年4月26日；8(4):e62097中的那些变体。

3.3启动子

在一些情况下，编码转基因的多核苷酸序列可操作地连接至诱导型启动子。可操作地连接至诱导型启动子的多核苷酸序列可以被配置成响应于药剂的添加或累积或响应于药剂的去除、降解或稀释而使多核苷酸序列转录表达或不转录表达。药剂可以是药物。药剂可以是四环素(tetracycline)或其衍生物中的一种，包括但不限于强力霉素(doxycycline)。在一些情况下，诱导型启动子是tet-on启动子、tet-off启动子、化学调节的启动子、物理调节的启动子(即，对光的存在或不存在或对低温或高温作出反应的启动子)。此诱导型启动子列表是非限制性的。

在一些实施方案中，编码转基因的多核苷酸序列可操作地连接至CMV启动子。本公开进一步考虑使用其他启动子序列。可用于本公开的实施方案中的启动子包括但不限于巨细胞病毒(CMV)和鼠干细胞病毒(MSCV)、磷酸甘油酯激酶(PGK)、由CMV增强子和鸡β-肌动蛋白启动子和兔β-球蛋白基因(CAG)的部分构成的启动子序列、CBh启动子、由SV40启动子和CD43启动子(SV40/CD43)的部分构成的启动子序列和含有具有骨髓增生性肉瘤病毒增强子(MND)的修饰的MoMuLV LTR的U3区的合成启动子。在一些情况下，启动子可以是合成启动子。示例性合成启动子由Schlabach等人Synthetic design of strong promoters.ProcNatl Acad Sci U S A.2010年2月9日；107(6):2538-2543提供。

在一些实施方案中，编码转基因的多核苷酸序列可操作地连接至Nefh启动子，如Hanlon等人Front Neurosci.11:521(2017)(PMID:28983234)中所描述。在一些实施方案中，编码转基因的多核苷酸序列可操作地连接至DCX启动子，如Smith等人Sci.Rep.8:1490(2018)(PMID:29367685)中所描述。在一些实施方案中，编码转基因的多核苷酸序列可操作地连接至Thy1启动子、核糖蛋白酶启动子、核糖蛋白酶激酶启动子、pR2.1启动子或MNTC启动子。由本公开提供的启动子包括描述于US20180100165A1、US20180066022A1、US20180258446A1、US20150259395A1、US20140248701A1、US20120278912A1、WO2006108201A1中的那些启动子，其各自的公开内容以引用的方式整体并入本文。

3.4双亮氨酸拉链激酶(DLK)

如本文所用，术语“双亮氨酸Spl激酶”或“DLK”是指由DLK基因编码的激酶，在本领域中也称有丝分裂原活化的蛋白激酶激酶12(MAP3K12)。DLK是混合谱系激酶(MLK)的成员。MLK最初被鉴定为神经系统中的信号传导分子。还显示其在细胞周期中起作用。与其他MLK一样，DLK具有激酶催化结构域，C端接两个由短空间序列隔开的亮氨酸/异亮氨酸拉链。Mata等人J.Bio.Chem.271,16888-16896(1996)。

DLK主要在神经元细胞中表达。显示这种激酶在突触末端中的磷酸化状态通过膜去极化经由钙调磷酸酶进行调节。这种激酶形成具有含有转录因子的亮氨酸拉链的异二聚体，诸如cAMP反应性元件结合蛋白(CREB)和MYC，并且因此可在PKA或视网膜酸诱导的神经元分化中发挥调节作用。

表1提供了人DLK、同种型1和同种型2的天然蛋白质序列。来自其他物种的DLK可用于本发明中。通过本公开，使用人同种型1的编号。表1还提供了其他蛋白质序列。表2提供了相应的多核苷酸序列，包括表达盒和载体。所公开的多核苷酸可用于各种病毒和非病毒载体中。具体地讲，作为SEQ ID NO:22提供的AAV基因组可以作为质粒提供，以用于产生病毒颗粒或作为预先形成的病毒颗粒的组成成分。修饰这些序列完全在本领域的技术人员的技能范围内，诸如通过密码子优化、假起始或终止密码子的去除、减少G/C含量、CpG二核苷酸或CpG岛的去除、启动子或其他遗传元件的取代、慢病毒LTR而非AAV ITR的使用等。此类多核苷酸本身是本公开的实施方案。

作为SEQ ID NO:22公开的AAV基因组具有4099bp的总长度。在一些实施方案中，通过在侧翼ITR之间插入其他多核苷酸来修饰SEQ ID NO:22，以将序列长度增加至约4.2至约4.5千碱基，这与这种大小在某些情况下对于AAV载体是最佳的预期一致，只要SEQ ID NO:22的修饰不破坏多核苷酸序列作为AAV基因组的功能。本公开考虑将DLK抑制剂的各种编码区取代为SEQ ID NO:22，或取代为其他病毒基因组，包括其他AAV基因组。

表1：示例性双亮氨酸拉链激酶序列

表2：示例性多核苷酸序列

其已显示DLK是至少一种微小RNA，miR-130a的靶标。Ye等人MicroRNA-130aTargets MAP3K12 to Modulate Diabetic Endothelial Progenitor CellFunction.Cell Physiol Biochem.2015；36(2):712-26(2015)。DLK的微小RNA抑制剂的其他实例是hsa-miR-10a-3p、hsa-miR-155-5p和hsa-miR-30a-5p。Hu等人Oncology Lett.15:467-474(2018)。在一些实施方案中，抑制剂包含表3的微小RNA或其功能等效物。

表3：示例性微小RNA序列

3.5体内和体外测定

本公开还涉及评定基因治疗载体在体外测定系统中的功效和安全性。表达水平可以通过靶细胞或组织的免疫组织化学来测量。在一些实施方案中，本公开的载体包含编码荧光蛋白或用于评定转导效率或基因表达水平的其他标记蛋白质的核酸。功能测定包括标准的视力测试以及受试者的眼睛检查。

3.6治疗组合物和方法

如本文所用，术语“有需要的患者”或“有需要的受试者”是指患有或罹患适合于用如本文所提供的载体治疗或改善的疾病、病症或病状的患者或受试者。有需要的患者或受试者可以是例如被诊断患有疾病相关视网膜细胞的患者或受试者。“受试者”和“患者”在本文中可互换使用。

通过本文所描述的方法治疗的受试者可以是哺乳动物。在一些情况下，受试者是人、非人灵长类动物、猪、马、牛、狗、猫、兔、小鼠或大鼠。受试者可以是人类女性或人类男性。受试者可能年龄不等。因此，本公开考虑将本公开的载体中的任一种施用于罹患视神经病变的受试者。

本发明也考虑了组合疗法。如本文所用的组合包括同时治疗或依序治疗。特别考虑本发明的方法与标准医学治疗(例如，皮质类固醇或局部减压药物)的组合，同样考虑与新型疗法的组合。在一些情况下，受试者可以用类固醇治疗以防止或减少对施用本文所描述的载体的免疫反应。在某些情况下，受试者可以在施用本文所描述的载体之前、期间或之后接受局部减压药物。在某些情况下，受试者可以接受能够使眼睛瞳孔扩张的药物(例如，托吡卡胺(tropicamide)和/或苯肾上腺素)。在某些情况下，受试者可以在恢复期间接受滋润凝胶以防止角膜脱水。

治疗有效量的rAAV载体是范围介于约1e8至约1e13载体基因组(vg)，更具体地1e10至1e12 vg或1e11 vg的rAAV剂量。

在一些情况下，治疗组合物包含每注射体积的治疗组合物超过约1e9、1e10或1e11个基因组的rAAV载体。在一些情况下，治疗组合物包含每毫升超过大约1e10、1e11、1e12或1e13个基因组的rAAV载体。

3.7组合物的施用

组合物的有效剂量的施用可通过本领域中标准的途径进行，包括但不限于房内接种、玻璃体内接种、视网膜下接种、脉络膜上接种、腺体成形术或巩膜上静脉介导的递送。考虑所治疗的疾病状态和靶细胞/组织，本领域的技术人员可以选择和/或匹配本发明的rAAV的AAV组分(特别是AAV ITR和衣壳蛋白)的施用途径和血清型。

本公开提供了有效剂量的rAAV和本发明的组合物的局部施用和全身施用。举例来说，全身施用施用至循环系统中，使得整个身体受到影响。全身施用包括肠内施用，诸如通过胃肠道吸收和通过注射、输注或植入或静脉内施用进行肠胃外施用。

具体地讲，本发明的rAAV的实际施用可以通过使用将rAAV重组载体转运至动物的靶组织中的任何物理方法来实现。根据本发明的施用包括但不限于注射至血流中和/或直接注射至眼中。简单地在磷酸盐缓冲盐水中重悬rAAV已证实足以提供可用于眼部表达的媒介物，并且对于可以与rAAV共同施用的载体或其他组分不存在已知限制(但降解DNA的组合物应该以正常方式避免使用rAAV)。

可以修饰rAAV的衣壳蛋白，使得rAAV靶向特定的目标组织，诸如眼。参见例如WO02/053703，其公开内容以引用的方式并入本文。药物组合物可以制备为可注射配方或作为局部配方，以通过滴眼药水或其他方式递送至眼部。另外，当四环素诱导型启动子用于控制转基因表达时，通过滴眼剂共施用强力霉素可能是有利的。先前已研发出许多rAAV配方，并且可用于实践本发明。rAAV可与任何药学上可接受的载体一起使用，以易于施用和处理。

出于注射目的，可以采用各种溶液，诸如无菌水溶液。如果需要，可以缓冲此类水溶液，并且首先使液体稀释剂与盐水或葡萄糖等渗。rAAV作为游离酸的溶液(DNA含有酸性磷酸酯基团)或药理学可接受的盐可以在水中与诸如羟丙基纤维素的表面活性剂适当地混合。rAAV的分散液也可以在甘油、液体聚乙二醇和其混合物以及在油中制备。在通常的存储和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物的生长。在这一点上，所采用的无菌水性介质均可通过本领域技术人员熟知的标准技术容易地获得。

适合可注射使用的药物形式包括无菌水溶液或分散液和用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。在所有情况下，所述形式必须无菌且必须是达到易于注射的程度的流体。其必须在制造和存储条件下稳定，并且必须防止诸如细菌和真菌的微生物的污染作用。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)、其合适的混合物和植物油的溶剂或分散介质。适当的流动性可以例如通过使用诸如卵磷脂的涂层、通过在分散液的情况下维持所需的粒度以及通过使用表面活性剂来维持。微生物作用的预防可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞(thimerosal)等来实现。在许多情况下，优选的是包括等渗剂，例如糖或氯化钠。通过使用延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸铝和明胶)引起可注射组合物的延长吸收。

通过根据需要将所需量的rAAV与上文列举的各种其他成分一起并入适当的溶剂中，然后进行过滤器灭菌来制备无菌可注射溶液。通常，通过将灭菌的活性成分并入含有碱性分散介质和来自上文列举的那些的所需其他成分的无菌媒介物中来制备分散液。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，从其先前无菌过滤的溶液中产生活性成分加上任何额外所需成分的粉末。

用rAAV转导也可以在体外进行。在一个实施方案中，从受试者移除所需靶细胞，用rAAV转导，并重新引入受试者中。或者，可以使用同种异体或异种眼部细胞，其中这些细胞不会在受试者中产生不适当的免疫反应。

用于转导和将转导的细胞再引入受试者中的合适方法是本领域已知的。在一个实施方案中，可以通过例如在适当的培养基中将rAAV与细胞组合，并且使用常规技术(诸如Southern印迹和/或PCR)或通过使用选择性标记来筛选携带所关注DNA的那些细胞而在体外转导细胞。然后可以将转导的细胞配制成药物组合物，并且通过各种技术将组合物引入受试者中，诸如通过房内接种、玻璃体内接种、视网膜下接种、腺体成形术、鞘内递送、向脑的立体定向递送或巩膜上静脉介导的递送。在一些实施方案中，用本发明的rAAV转导细胞导致DLK抑制剂持续表达超过1个月、超过2个月、超过3个月、超过4个月、超过5个月、超过6个月、超过9个月或超过12个月。因此，本发明提供了向哺乳动物受试者，优选人施用/递送表达DLK抑制剂的rAAV的方法。这些方法包括用本发明的一种或多种rAAV转导组织(包括眼组织、运动神经元组织或脑组织)。可以使用包含组织特异性控制元件的基因盒进行转导。举例来说，本发明的一个实施方案提供了转导眼细胞和由眼特异性控制元件(包括本文所描述的启动子)引导的眼组织的方法。

4.1抑制剂

在一些实施方案中，本公开提供了一种抑制剂，其包含含有与SEQ ID NO:3共享至少95％同一性的亮氨酸拉链结构域的蛋白质，其中相对于SEQ ID NO:1，所述亮氨酸拉链结构域在位置391和393处包含至少一个或至少两个取代。在一些实施方案中，所述取代包含K391变为D或K391变为E，以及H393变为D或H393变为E。在一些实施方案中，与不具有所述取代的相应蛋白质相比，所述取代单独地或共同地(i)增加亮氨酸拉链结构域对内源性DLK的结合亲和力或(ii)降低所述抑制剂对自身的亲和力。

在一些实施方案中，亮氨酸拉链结构域还包含与SEQ ID NO:1相关的选自K398、L407、H405、V412、R414、K453、L458和R460中的一个或多个的一个或多个位置处的一个或多个额外取代。在一些实施方案中，如果一个或多个位置包括K398，则一个或多个取代包括K398变为R；如果一个或多个位置包含L407，则L407变为D或L407变为E；如果一个或多个位置包含H405，则H405变为D或H405变为E；如果一个或多个位置包括V412，则V412变为D或V412变为E；如果一个或多个位置包含R414，则R414变为D或R414变为E；如果一个或多个位置包含K453，则K453变为R；如果一个或多个位置包含L458，则L458变为D或L458变为E；如果一个或多个位置包含R460，则R460变为D或R460变为E。

在一些实施方案中，抑制性结构域在N末端至C末端的顺序上包含具有序列REEVXLXFEKIYSEGTCLXRXEEELXMX(SEQ ID NO:9)的第一多肽；包含20至30个氨基酸残基、任选地SEQ ID NO:11的多肽桥；以及具有序列YMELNALMLQLELYERELXRXEQALERR(SEQ ID NO:10)的第二多肽，其中X＝E或D并且Y＝R、H或K。

在一些实施方案中，第一多肽选自以下组成的组：具有序列REEVDLDFEKIYSEGTCLXRXEEELXMX(SEQ ID NO:12)的多肽；具有序列REEVELDFEKIYSEGTCLXRXEEELXMX(SEQ ID NO:13)的多肽；具有序列REEVDLEFEKIYSEGTCLXRXEEELXMX(SEQ ID NO:14)的多肽；和具有序列REEVELEFEKIYSEGTCLXRXEEELXMX(SEQ ID NO:15)的多肽；其中X＝E或D并且Y＝R、H或K。

在一些实施方案中，亮氨酸拉链结构域包含与SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7中的一个共享至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性的多肽。在一些实施方案中，亮氨酸拉链结构域包含与SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7中的一个相同的多肽。在一些实施方案中，所述取代(i)增加亮氨酸拉链结构域对内源性DLK的亲和力，或(ii)降低亮氨酸拉链结构域对自身的亲和力；与在取代位置处具有天然残基的相同亮氨酸拉链结构域相比，(i)和(ii)中的每一个。在一些实施方案中，与(i)抑制剂的同二聚体或(ii)DLK同二聚体中的任一个相比，亮氨酸拉链优先与内源性DLK形成异二聚体。

在一些实施方案中，抑制剂包含与SEQ ID NO:5具有至少95％同一性的DLK激酶结构域，其中所述DLK激酶结构域包含降低DLK激酶结构域的激酶活性的取代。在一些实施方案中，降低DLK激酶结构域的激酶活性的取代是从赖氨酸(K)变为丙氨酸(A)的相对于SEQID NO:1的位置152处的赖氨酸(K)的取代。在一些实施方案中，DLK激酶结构域包含SEQ IDNO.8。

在一些实施方案中，抑制剂包含LZK的功能性片段。在一些实施方案中，抑制剂包含功能性片段神经营养因子，任选地BDNF、GDNF、NT4、TrkB、RdCVF或CNTF或其功能性片段。在一些实施方案中，抑制剂还包含能够通过mAKAP抑制cAMP介导的信号传导，任选地cAMP介导的信号传导的功能性片段。在一些实施方案中，抑制剂包含第二结构域，并且抑制剂能够在细胞中具有神经营养活性。

4.2载体

本公开提供了一种载体，其包含编码双亮氨酸拉链激酶(DLK)抑制剂的多核苷酸，所述多核苷酸可操作地连接至启动子，其中所述抑制剂能够结合(i)内源性DLK蛋白，或(ii)编码内源性DLK的内源性mRNA；并且其中所述抑制剂能够降低内源性DLK在视网膜细胞中的表达、信号传导活性或激酶活性。如已陈述，载体可以是病毒或非病毒的。在一些实施方案中，载体是重组AAV。

在一些实施方案中，启动子是遍在启动子。如本文所用，“遍在启动子”是能够介导多核苷酸在靶生物体的许多(如果不是大多数)细胞中的表达的启动子。通常，一种真核生物中的遍在启动子能够介导在其他真核生物中的表达。遍在启动子包括哺乳动物启动子。在一些实施方案中，遍在启动子包含CMV启动子、CAG启动子、CBA启动子或CBh启动子。在一些实施方案中，启动子是视网膜细胞型特异性的。在一些实施方案中，启动子是RGC特异性启动子。示例性RGC特异性启动子(例如Nefh启动子)由Hanlon等人Front Neurosci.2017年9月21日；11:521提供。

在一些实施方案中，启动子是Thy1启动子、Nefh启动子或DCX启动子。DCX启动子描述于Smith等人Sci Rep.8:1490(2018)；和US20140248701A1中。在一些实施方案中，启动子是微型启动子。在一些实施方案中，所述微型启动子源自POU4F1、TUBB3、NEFL或NEFM。NEFL启动子描述于Simpson等人New MiniPromoter Ple345(NEFL)Drives Strong andSpecific Expression in Retinal Ganglion Cells of Mouse and Primate Retina.HumGene Ther.(2018)中。在一些实施方案中，启动子是视杆细胞特异性(rod photoreceptor-specific)启动子。在一些实施方案中，启动子是核糖蛋白酶启动子或RK启动子。在一些实施方案中，启动子是视锥细胞特异性(cone photoreceptor-specific)启动子。在一些实施方案中，启动子是pR2.1启动子或MNTC启动子，如美国专利号10,000,741中所公开，所述美国专利整体并入本文中。

在一些实施方案中，抑制剂是能够结合编码内源性DLK的内源mRNA的RNA，并且其中所述抑制剂能够减少细胞中的内源性DLK的表达。在一些实施方案中，抑制剂是shRNA或siRNA。在一些实施方案中，抑制剂是微小RNA。在一些实施方案中，微小RNA是miR-130a、miR-122-5p、miR-30a-5p或miR-10-3p。在一些实施方案中，抑制剂是能够结合内源性DLK的蛋白质，并且在一些实施方案中，抑制剂能够降低细胞中的内源性DLK的信号传导活性或激酶活性。

在一些实施方案中，蛋白质包含抑制性结构域，所述抑制性结构域包含亮氨酸拉链结构域。在一些实施方案中，抑制性结构域能够结合内源性DLK的亮氨酸拉链结构域，由此竞争性地抑制所述内源性DLK的同二聚化或竞争性地抑制所述内源性DLK和内源性亮氨酸拉链激酶(LZK)的异二聚化。在一些实施方案中，抑制性结构域包含与SEQ ID NO:3或SEQID NO:4至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的多肽、基本上其组成或由其组成。

在一些实施方案中，抑制性结构域的亮氨酸拉链结构域包含相对于SEQ ID NO:1的至少一个氨基酸取代，并且在一些实施方案中，所述取代增加了亮氨酸拉链结构域对内源性DLK的亲和力或降低了亮氨酸拉链结构域对自身的亲和力。在一些实施方案中，抑制性结构域含有选自表4中列出的那些的取代。

在一些实施方案中，抑制性结构域在N末端至C末端的顺序上包含具有序列REEVXLXFEKIYSEGTCLXRXEEELXMX(SEQ ID NO:9)的多肽；包含20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸残基、任选地SEQ ID NO:11的多肽桥；以及具有序列YMELNALMLQLELYERELXRXEQALERR(SEQ ID NO:10)的多肽，其中X＝E或D并且Y＝R、H或K。

在一些实施方案中，抑制性结构域包含与SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7中的一个共享至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性的多肽。在一些实施方案中，抑制性拉链结构域包含与SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7中的一个相同的多肽。在一些实施方案中，与在取代位置处具有天然残基的相同亮氨酸拉链结构域相比，取代增加了亮氨酸拉链结构域对内源性DLK的亲和力或降低了亮氨酸拉链结构域对自身的亲和力。在一些实施方案中，与(i)抑制剂同二聚体或(ii)DLK同二聚体中的任一个相比，亮氨酸拉链优先与内源性DLK形成异二聚体。

在一些实施方案中，抑制剂包含与SEQ ID NO:5具有至少75％同一性的DLK激酶结构域，其中所述DLK激酶结构域包含降低DLK激酶结构域的激酶活性的取代。在一些实施方案中，抑制剂是DLK的无活性形式。在一些实施方案中，所述抑制剂含有从赖氨酸(K)变为丙氨酸(A)的相对于SEQ ID NO:1的位置152处的取代。在一些实施方案中，DLK激酶结构域包含SEQ ID NO.8。在一些实施方案中，抑制剂包含LZK的功能性片段。在一些实施方案中，抑制剂包含功能性片段神经营养因子，任选地BDNF、GDNF、NT4、TrkB、RdCVF或CNTF或其功能性片段。在一些实施方案中，抑制剂包含能够通过mAKAP抑制cAMP介导的信号传导，任选地cAMP介导的信号传导的功能性片段。在一些实施方案中，抑制剂包含第二结构域，并且其中所述抑制剂能够在细胞中具有神经营养活性。

在一些实施方案中，载体是重组腺相关病毒(rAAV)载体。在一些实施方案中，载体是非病毒载体。

在一些实施方案中，本公开提供了一种重组病毒载体，其包含表达盒，所述表达盒包含编码可操作地连接至启动子的如权利要求1所述的抑制剂的多核苷酸。

在一些实施方案中，病毒是重组腺相关病毒(rAAV)载体。在一些实施方案中，表达盒侧接5'ITR和3'ITR。在一些实施方案中，载体包含介于3.2kb与5.0kb、3.4kb与4.9kb、3.6kb与4.8kb、3.8kb与4.7kb、3.8kb与4.6kb、4.0kb与4.6kb、4.2kb与4.6kb、4.2kb与4.4kb或4.4kb与4.6kb之间的基因组。在一些实施方案中，载体包含介于3.2kb与3.4kb、3.4kb与3.6kb、3.6kb与3.8kb、3.8kb与4.0kb、4.0kb与4.2kb、4.2kb与4.4kb、4.4kb与4.6kb、4.6kb与4.8kb或4.8kb与5.0kb之间的基因组。在一些实施方案中，载体包含约3.2kb、3.3kb、3.4kb、3.5kb、3.6kb、3.7kb、3.8kb、3.9kb、4.0kb、4.1kb、4.2kb、4.3kb、4.4kb、4.5kb、4.6kb、4.7kb或4.8kb的基因组。在一些实施方案中，rAAV包含一个或多个非必需基因的缺失。在一些实施方案中，rAAV包含在rAAV的产生期间以反式形式提供的一个或多个必需基因的缺失。在一些实施方案中，rAAV包含rep、cap和rep或cap的缺失。在一些实施方案中，rAAV是自互补AAV。在一些实施方案中，rAAV包含在5'ITR和3'ITR中的任一个或两个的D区中的缺失。在一些实施方案中，rAAV是杂交体AAV。在一些实施方案中，rAAV包含填充序列(stuffer sequence)。在一些实施方案中，rAAV包含AAV2的5’ITR和3’ITR以及除AAV2之外的AAV血清型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，rAAV包含来自不同血清型的5’ITR和3’ITR。在一些实施方案中，rAAV通过转壳(transcapsidation)、吸附修饰、镶嵌衣壳(mosaiccapsid)或嵌合衣壳中的一种或多种进行修饰(例如，如Choi等人Curr Gene Ther.2005年6月；5(3):299–310中所描述)。

在一些实施方案中，载体包含血清型AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV7、AAV8、AAV9或AAV2/2(7m8)的衣壳。在一些实施方案中，rAAV选择性地感染细胞类型，诸如神经元、视网膜细胞或RGC。可用于本公开的载体中的血清型包括Lebherz等人J Gene Med.2008年4月；10(4):375–382；Hanlon等人Front Neurosci.2017；11:521；和Hickey等人Gene Therapy 24:787–800(2017)。

在一些实施方案中，启动子是遍在启动子。如本文所用，“遍在启动子”是能够介导多核苷酸在靶生物体的许多(如果不是大多数)细胞中的表达的启动子。通常，一种真核生物中的遍在启动子能够介导在其他真核生物中的表达。遍在启动子包括哺乳动物启动子。在一些实施方案中，遍在启动子包含CMV启动子、CAG启动子、CBA启动子或CBh启动子。在一些实施方案中，启动子是视网膜细胞型特异性的。在一些实施方案中，启动子是RGC特异性启动子。示例性RGC特异性启动子(例如Nefh启动子)由Hanlon等人Front Neurosci.2017年9月21日；11:521提供。

在一些实施方案中，启动子是Thy1启动子、Nefh启动子或DCX启动子。DCS启动子描述于Smith等人Sci Rep.8:1490(2018)；和US20140248701A1中。在一些实施方案中，启动子是微型启动子。在一些实施方案中，所述微型启动子源自POU4F1、TUBB3、NEFL或NEFM。NEFL启动子描述于Simpson等人New MiniPromoter Ple345(NEFL)Drives Strong andSpecific Expression in Retinal Ganglion Cells of Mouse and Primate Retina.HumGene Ther.(2018)中。在一些实施方案中，启动子是视杆细胞特异性启动子。在一些实施方案中，启动子是核糖蛋白酶启动子或RK启动子。在一些实施方案中，启动子是视锥细胞特异性启动子。在一些实施方案中，启动子是pR2.1启动子或MNTC启动子。

4.3治疗方法

在一些实施方案中，本公开提供了一种治疗疾病或病症的方法，其包括使细胞与本公开的载体中的任一种接触。在一些实施方案中，细胞是视网膜细胞。在一些实施方案中，视网膜细胞是视网膜神经节细胞(RGC)、感光细胞或视网膜神经元(例如，双极细胞、无长突细胞(amacrine cell)或水平细胞)。在一些实施方案中，细胞是多巴胺能神经元、背侧纹状体神经元或基底前脑胆碱能神经元。在一些实施方案中，通过注射约10μL至100μL，优选50μL的溶液体积来施用载体。在一些实施方案中，所述疾病或病症与视网膜细胞中的功能障碍相关。在一些实施方案中，与视网膜细胞功能障碍相关的疾病或病症选自青光眼、湿性黄斑变性、干性黄斑变性、地理性萎缩、视网膜脱离和视网膜营养不良，诸如亚瑟氏综合征、斯塔加特氏病、利伯氏先天性黑内障或色素性视网膜炎。在另外其他实施方案中，所述疾病与视网膜病变相关，诸如糖尿病视网膜病变、近视性黄斑病变。在其他实施方案中，所述疾病是视神经病变，诸如视神经炎、非动脉炎性前部缺血性视神经病变(NAION)、动脉炎性前部缺血性视神经病变(AION)、创伤性视神经病变、利伯氏视神经病变、显性视神经萎缩、隐性视神经萎缩或放射性视神经病变。

在一些实施方案中，本公开提供了一种治疗与视网膜细胞相关的疾病或病症的方法，其包括向受试者的视网膜施用本公开的载体中的任一种。在一些实施方案中，视网膜细胞是视网膜神经节细胞(RGC)、感光细胞或视网膜神经元(诸如双极细胞、无长突细胞或水平细胞)。在一些实施方案中，通过注射约10μL至100μL，优选50μL的溶液体积来施用载体。在一些实施方案中，与视网膜细胞功能障碍相关的疾病或病症选自青光眼、湿性黄斑变性、干性黄斑变性、地理性萎缩、视网膜脱离和视网膜营养不良，诸如亚瑟氏综合征、斯塔加特氏病、利伯氏先天性黑内障或色素性视网膜炎。在另外其他实施方案中，所述疾病与视网膜病变相关，诸如糖尿病视网膜病变、近视性黄斑病变。在其他实施方案中，所述疾病是视神经病变，诸如视神经炎、非动脉炎性前部缺血性视神经病变(NAION)、动脉炎性前部缺血性视神经病变(AION)、创伤性视神经病变、利伯氏视神经病变、显性视神经萎缩、隐性视神经萎缩或放射性视神经病变。

4.4视网膜细胞

在一些实施方案中，本公开提供了经基因修饰的视网膜细胞，其包含编码双亮氨酸拉链激酶(DLK)抑制剂的多核苷酸，所述多核苷酸可操作地连接至启动子。在一些实施方案中，抑制剂能够结合(i)内源性DLK蛋白，或(ii)编码内源性DLK的内源性mRNA。在一些实施方案中，其中所述抑制剂能够降低视网膜细胞中的内源性DLK的表达、信号传导活性或激酶活性。上文关于载体所描述的多核苷酸的特征的任何实施方案可以并入本公开的视网膜细胞中。实际上，考虑使用本公开的载体直接或间接产生所公开的视网膜细胞。

在一些实施方案中，本公开提供了一种产生经遗传修饰的视网膜细胞的方法，其包括使视网膜细胞与本公开的任何载体接触。本公开还提供了包含本公开的载体或视网膜细胞中的任一种的药物组合物。

4.5药物组合物和治疗方法

在一些实施方案中，本公开提供了药物组合物，其包含如权利要求18至33中任一项所述的载体和药学上可接受的载体。在一些实施方案中，药物组合物包含至少1e9–1e13载体基因组(vg)的载体。在一些实施方案中，本公开提供单位剂量，其包含本公开的载体中的任一种，其中所述单位剂量包含总体积为10-200μL、在一些实施方案中为50-100μL的1e9-1e13 vg的载体。

在一些实施方案中，本公开提供了一种治疗有需要的受试者的病状的方法，其包括向所述受试者施用有效量的本公开的药物组合物。在一些实施方案中，病症是青光眼、视神经病变、视网膜病变、视网膜脱离、色素性视网膜炎、视网膜营养不良、黄斑变性、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、帕金森病、阿尔茨海默病、先前相关的神经退化性疾病、亨廷顿氏病、脊髓小脑性共济失调、肌肉萎缩、多系统萎缩。在一些实施方案中，青光眼是原发性开角(例如，慢性青光眼)、正常眼压性青光眼、闭角型青光眼(例如，急性青光眼)、继发性青光眼、遗传性青光眼(例如，色素性青光眼)或肌纤蛋白(MYOC)青光眼。在一些实施方案中，神经病变是利伯遗传性视神经病变(Leber hereditary optic neuropathy；LHON)或常染色体显性视神经萎缩(ADOA或DOA)。在一些实施方案中，视网膜病变是早产儿视网膜病变(retinopathy of prematurity；ROP)或糖尿病性视网膜病变。

在一些实施方案中，色素性视网膜炎与利伯先天性黑内障相关。色素性视网膜炎可以由已知与病状具有致病关系的任何基因型引起。已知超过60个基因中的突变引起非综合征性色素性视网膜炎。这些基因中的超过20个与病症的常染色体显性形式相关。RHO基因中的突变是常染色体显性色素性视网膜炎的最常见原因，占所有病例的20％至30％。至少35个基因已与病症的常染色体隐性形式相关。其中最常见的是USH2A；此基因中的突变占所有常染色体隐性色素性视网膜炎病例的10％至15％。至少六个基因的变化被认为引起所述病症的X连锁形式。总之，RPGR和RP2基因中的突变是大多数X连锁色素性视网膜炎病例的原因。在一些实施方案中，色素性视网膜炎与选自由以下组成的组的基因中的一个或多个基因的等位基因的遗传相关：C2ORF71、C8ORF37、CA4、CERKL、CLRN1、CNGA1、CNGB1、CRB1、CRX、DHDDS、EYS、FAM161A、FSCN2、GUCA1B、IDH3B、IMPDH1、IMPG2、KLHL7、LRAT、MAK、MERTK、NR2E3、NRL、OFD1、PDE6A、PDE6B、PDE6G、PRCD、PROM1、PRPF3、PRPF6、PRPF8、PRPF31、PRPH2、RBP3、RDH12、RGR、RHO、RLBP1、ROM1、RP1、RP2、RP9、RPE65、RPGR、SAG、SEMA4A、SNRNP200、SPATA7、TOPORS、TTC8、TULP1、USH2A和ZNF513，如Daiger等人Clin Genet.84:132-141(2013)中所描述。

在一些实施方案中，视网膜营养不良是斯塔加特黄斑变性、杆体-锥体营养不良或锥体-杆体营养不良。

实施例

以下实施例进一步描述本发明，其不限制权利要求书中描述的本发明的范围。

实施例1：改进的显性负DLK(DN-DLK)的工程化

已显示DLK的亮氨酸拉链结构域的表达具有DLK功能的显性负效应。Nihalani等人J.Bio Chem.275,7273-7279(2000)。为了产生改进的显性负DLK(DN-DLK)，申请人鉴定了亮氨酸拉链结构域中的突变，其旨在(1)增加DLK/DN-DLK异二聚体相互作用的亲和力和/或(2)降低DN-DLK/DN-DLK同二聚体相互作用的亲和力，其目的是有利于破坏DLK/DLK同二聚体。

使用亮氨酸拉链的已知针轮结构(图1A)，将序列DLK(图1B；SEQ ID NO:4)建模为八个针轮(图2A-2H)。通过分析这些模型鉴定的氨基酸取代列出在表4中。

表4：增强DN-DLK的取代

产生编码具有表5中列出的取代的各种组合的DLK片段的多核苷酸。产生编码具有表5中列出的两种或更多种取代的组合的DLK片段的多核苷酸。产生编码具有十个取代的DLK片段的多核苷酸(SEQ ID NO:6)。产生编码具有相同十个取代的较大DLK片段的多核苷酸(SEQ ID NO:7)。这些设计通过作为分离的DLK片段的表达和作为全长DLK中的突变来测试。

表5：示例性显性负双亮氨酸拉链激酶序列

替代地或与亮氨酸拉链结构域的这些突变中的任一个结合，DLK激酶结构域可以被缺失或者被激酶死亡的激酶结构域替换。一个示例性的激酶死亡的激酶结构域是具有K152A取代的激酶结构域，其将赖氨酸K152替换为丙氨酸(A)，如SEQ ID NO:8所示。

测试各种构建体与天然DLK的体外竞争以及DLK激酶活性或下游信号传导的体内抑制。

****

在本申请中引用的所有文件、专利、专利申请、出版物、产品描述和协议出于所有目的通过引用整体并入本文。

本说明书中说明和讨论的实施方案仅旨在教导本领域技术人员发明者已知的制造和使用本发明的最佳方式。如本领域技术人员根据上述教导所理解的，在不脱离本发明的情况下，本发明的上述实施方案的修改和变化是可能的。因此应当理解，在权利要求及其等效物的范围内，本发明可以不同于具体描述的方式实施。

Claims (145)

1.一种抑制剂，其包含含有与SEQ ID NO:1共享至少95％同一性的亮氨酸拉链结构域的蛋白质，其中所述亮氨酸拉链结构域在位置391和393中的一者或多者处包含至少一个取代。

2.如权利要求1所述的抑制剂，其中所述取代包含以下中的至少一者：

a)K391变为D或K391变为E，和/或

b)H393变为D或H393变为E。

3.一种抑制剂，其包含含有与SEQ ID NO:1共享至少95％同一性的亮氨酸拉链结构域的蛋白质，所述亮氨酸拉链结构域具有至少一个取代，其中与不具有所述取代的对应蛋白质相比，所述取代单独或共同地(i)增加亮氨酸拉链结构域对内源性DLK的结合亲和力或(ii)降低所述抑制剂对自身的结合亲和力。

4.如权利要求1所述的抑制剂，其中所述亮氨酸拉链结构域还包含与SEQ ID NO:1相关的选自(c)至(j)中的一个或多个的一个或多个位置处的一个或多个额外取代：

a)K398,

b)L407,

c)H405,

d)V412,

e)R414,

f)K453,

g)L458，和

h)R460。

5.如权利要求4所述的抑制剂，其中相对于SEQ ID NO:1，所述一个或多个取代包含：

a)如果所述一个或多个位置包含K398，则K398变为R，

b)如果所述一个或多个位置包含L407，则L407变为D或L407变为E，

c)如果所述一个或多个位置包含H405，则H405变为D或H405变为E，

d)如果所述一个或多个位置包含V412，则V412变为D或V412变为E，

e)如果所述一个或多个位置包含R414，则R414变为D或R414变为E，

f)如果所述一个或多个位置包含K453，则K453变为R，

g)如果所述一个或多个位置包含L458，则L458变为D或L458变为E，并且

h)如果所述一个或多个位置包含R460，则R460变为D或R460变为E。

6.如权利要求4所述的抑制剂，其中所述抑制性结构域在N末端至C末端的顺序上包含：

a)具有序列REEVXLXFEKIYSEGTCLXRXEEELXMX(SEQ ID NO:9)的第一多肽，

b)包含20个至30个氨基酸残基、任选地SEQ ID NO:11的多肽桥，和

c)具有序列YMELNALMLQLELYERELXRXEQALERR(SEQ ID NO:10)的第二多肽；

其中X＝E或D并且Y＝R、H或K。

7.如权利要求6所述的抑制剂，其中所述第一多肽选自由以下组成的组：

a)具有序列REEVDLDFEKIYSEGTCLXRXEEELXMX(SEQ ID NO:12)的多肽，

b)具有序列REEVELDFEKIYSEGTCLXRXEEELXMX(SEQ ID NO:13)的多肽，

c)具有序列REEVDLEFEKIYSEGTCLXRXEEELXMX(SEQ ID NO:14)的多肽，和

d)具有序列REEVELEFEKIYSEGTCLXRXEEELXMX(SEQ ID NO:15)的多肽；

其中X＝E或D并且Y＝R、H或K。

8.如权利要求4所述的抑制剂，其中所述亮氨酸拉链结构域包含与SEQ ID NO:6或SEQID NO:7中的一个共享至少95％同一性的多肽。

9.如权利要求5所述的抑制剂，其中所述取代(i)增加所述亮氨酸拉链结构域对内源性DLK的亲和力，或(ii)降低所述亮氨酸拉链结构域对自身的亲和力；与在所述取代位置处具有天然残基的相同亮氨酸拉链结构域相比，(i)和(ii)中的每一个。

10.如权利要求9所述的抑制剂，其中与(i)所述抑制剂的同二聚体或(ii)DLK同二聚体中的任一个相比，所述亮氨酸拉链优先与内源性DLK形成异二聚体。

11.如权利要求1所述的抑制剂，其中所述抑制剂还包含与SEQ ID NO:5具有至少95％同一性的DLK激酶结构域，其中所述DLK激酶结构域包含降低所述DLK激酶结构域的激酶活性的取代。

12.如权利要求11所述的抑制剂，其中所述降低所述DLK激酶结构域的激酶活性的取代是从赖氨酸(K)变为丙氨酸(A)的相对于SEQ ID NO:1的位置152处的赖氨酸(K)的取代。

13.如权利要求12所述的抑制剂，其中所述DLK激酶结构域包含SEQ ID NO:8。

14.如权利要求2所述的抑制剂，其中所述抑制剂还包含LZK的功能性片段。

15.如权利要求2所述的抑制剂，其中所述抑制剂还包含功能性片段神经营养因子，任选地BDNF、GDNF、NT4、TrkB、RdCVF或CNTF或其功能性片段。

16.如权利要求2所述的抑制剂，其中所述抑制剂还包含能够例如通过mAKAP抑制cAMP介导的信号传导的功能性片段。

17.如权利要求2所述的抑制剂，其中所述抑制剂包含第二结构域，并且其中所述第二结构域赋予神经营养活性。

18.一种重组病毒载体，其包含表达盒，所述表达盒包含可操作地连接至启动子的编码如权利要求1所述的抑制剂的多核苷酸。

19.如权利要求18所述的载体，其中所述病毒是重组腺相关病毒(rAAV)载体。

20.如权利要求18所述的载体，其中所述表达盒侧接5’ITR和3’ITR。

21.如权利要求18所述的载体，其中所述载体包含4.2kb与4.6kb之间的基因组。

22.如权利要求18所述的载体，其中所述载体包含血清型AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV7、AAV8、AAV9、AAV2/2(7m8)或Anc80L65的衣壳。

23.如权利要求18所述的载体，其中所述启动子是遍在启动子。

24.如权利要求23所述的载体，其中所述遍在启动子包含CMV启动子、CAG启动子、CBA启动子或CBh启动子。

25.如权利要求18所述的载体，其中所述启动子是视网膜细胞型特异性的。

26.如权利要求25所述的载体，其中所述启动子是RGC特异性启动子。

27.如权利要求26所述的载体，其中所述启动子是Thy1启动子、Nefh启动子或DCX启动子。

28.如权利要求18所述的载体，其中所述启动子是微型启动子。

29.如权利要求1所述的载体，其中所述微型启动子源自POU4F1、TUBB3、NEFL或NEFM。

30.如权利要求25所述的载体，其中所述启动子是视杆细胞特异性启动子。

31.如权利要求30所述的载体，其中所述启动子是视紫红质启动子或RK启动子。

32.如权利要求25所述的载体，其中所述启动子是视锥细胞特异性启动子。

33.如权利要求32所述的载体，其中所述启动子是pR2.1启动子或MNTC启动子。

34.一种抑制细胞中的DLK活性的方法，其包括使所述细胞与如权利要求18至33中任一项所述的载体接触。

35.如权利要求34所述的方法，其中所述细胞是视网膜神经节细胞(RGC)。

36.如权利要求34所述的方法，其中所述细胞是感光细胞。

37.如权利要求34所述的方法，其中所述细胞是视网膜神经元。

38.如权利要求37所述的方法，其中所述细胞是视网膜神经元是双极细胞、无长突细胞或水平细胞。

39.如权利要求34所述的方法，其中所述细胞是多巴胺能神经元。

40.如权利要求34所述的方法，其中所述细胞是背侧纹状体神经元。

41.如权利要求34所述的方法，其中所述细胞是基底前脑胆碱能神经元。

42.一种药物组合物，其包含如权利要求18至33中任一项所述的载体和药学上可接受的载体。

43.如权利要求42所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含至少1e9–1e13载体基因组(vg)的所述载体。

44.一种单位剂量，其包含如权利要求43所述的载体，其中所述单位剂量包含总体积为10-200μL、优选50-100μL的1e9–1e13 vg的载体。

45.一种治疗有需要的受试者的病状的方法，其包括向所述受试者施用有效量的如权利要求42所述的药物组合物。

46.如权利要求45所述的方法，其中所述病状是青光眼。

47.如权利要求45所述的方法，其中所述病状是视神经病变。

48.如权利要求45所述的方法，其中所述病状是视网膜病变。

49.如权利要求45所述的方法，其中所述病状是视网膜脱离。

50.如权利要求45所述的方法，其中所述病状是色素性视网膜炎。

51.如权利要求45所述的方法，其中所述病状是视网膜营养不良。

52.如权利要求45所述的方法，其中所述病状是黄斑变性。

53.如权利要求45所述的方法，其中所述病状是肌萎缩侧索硬化(ALS)。

54.如权利要求45所述的方法，其中所述病状是帕金森病。

55.如权利要求45所述的方法，其中所述病状是阿尔茨海默病。

56.如权利要求45所述的方法，其中所述病状是朊病毒相关神经退行性疾病。

57.如权利要求45所述的方法，其中所述病状是亨廷顿氏病。

58.如权利要求45所述的方法，其中所述病状是脊髓小脑性共济失调。

59.如权利要求45所述的方法，其中所述病状是肌肉萎缩。

60.如权利要求45所述的方法，其中所述病状是多系统萎缩。

61.一种经基因修饰的视网膜细胞，其包含编码双亮氨酸拉链激酶(DLK)抑制剂的多核苷酸，所述多核苷酸可操作地连接至启动子，

其中所述抑制剂能够结合(i)内源性DLK蛋白，或(ii)编码内源性DLK的内源性mRNA；以及

其中所述抑制剂能够降低所述视网膜细胞中的所述内源性DLK的表达、信号传导活性或激酶活性。

62.如权利要求61所述的细胞，其中所述视网膜细胞是视网膜神经节细胞(RGC)。

63.如权利要求61所述的细胞，其中所述视网膜细胞是感光细胞。

64.如权利要求61所述的细胞，其中所述视网膜细胞是视网膜神经元。

65.如权利要求64所述的细胞，其中所述视网膜神经元是双极细胞、无长突细胞或水平细胞。

66.如权利要求61所述的细胞，其中所述启动子是遍在启动子。

67.如权利要求66所述的细胞，其中所述遍在启动子包含CMV启动子、CAG启动子、CBA启动子或CBh启动子。

68.如权利要求61所述的细胞，其中所述启动子是视网膜细胞型特异性的。

69.如权利要求68所述的细胞，其中所述启动子是RGC特异性启动子。

70.如权利要求69所述的细胞，其中所述启动子是Thy1启动子、Nefh启动子或DCX启动子。

71.如权利要求69所述的细胞，其中所述启动子是微型启动子。

72.如权利要求71所述的细胞，其中所述微型启动子源自POU4F1、TUBB3、NEFL或NEFM。

73.如权利要求68所述的细胞，其中所述启动子是视杆细胞特异性启动子。

74.如权利要求73所述的细胞，其中所述启动子是视紫红质启动子或RK启动子。

75.如权利要求68所述的细胞，其中所述启动子是视锥细胞特异性启动子。

76.如权利要求75所述的细胞，其中所述启动子是pR2.1启动子或MNTC启动子。

77.如权利要求61所述的细胞，其中所述抑制剂是能够结合编码内源性DLK的内源性mRNA的RNA，并且其中所述抑制剂能够减少所述细胞中的所述内源性DLK的表达。

78.如权利要求77所述的细胞，其中所述抑制剂是shRNA或siRNA。

79.如权利要求77所述的细胞，其中所述抑制剂是微小RNA。

80.如权利要求79所述的细胞，其中所述微小RNA是miR-130a、miR-122-5p、miR-30a-5p或miR-10-3p。

81.如权利要求61所述的细胞，其中所述抑制剂是能够结合内源性DLK的蛋白质，并且其中所述抑制剂能够降低所述细胞中的所述内源性DLK的信号传导活性或激酶活性。

82.如权利要求81所述的细胞，其中所述蛋白质包含抑制性结构域，所述抑制性结构域包含亮氨酸拉链结构域，

其中所述抑制性结构域能够结合内源性DLK的所述亮氨酸拉链结构域，从而竞争性地抑制所述内源性DLK的同二聚化或竞争性地抑制所述内源性DLK和内源性亮氨酸拉链激酶(LZK)的异二聚化。

83.如权利要求82所述的细胞，其中所述抑制性结构域包含与SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:4至少95％相同的多肽。

84.如权利要求82所述的细胞，其中所述抑制性结构域的所述亮氨酸拉链结构域包含相对于SEQ ID NO:1的至少一个氨基酸取代，并且

其中所述取代增加所述亮氨酸拉链结构域对内源性DLK的亲和力或降低所述亮氨酸拉链结构域对自身的亲和力。

85.如权利要求82所述的细胞，其中相对于SEQ ID NO:1，所述抑制性结构域含有选自(a)至(j)中的一个或多个的取代：

a)K391变为D或K391变为E，

b)H393变为D或H393变为E，

c)K398变为R，

d)L407变为D或L407变为E，

e)H405变为D或H405变为E，

f)V412变为D或V412变为E，

g)R414变为D或R414变为E，

h)K453变为R，

i)L458变为D或L458变为E，以及

j)R460变为D或R460变为E。

86.如权利要求82所述的细胞，其中所述抑制性结构域在N末端至C末端的顺序上包含：

a)具有序列REEVXLXFEKIYSEGTCLXRXEEELXMX(SEQ ID NO:9)的多肽，

b)包含20个至30个氨基酸残基、任选地SEQ ID NO:11的多肽桥，和

c)具有序列YMELNALMLQLELYERELXRXEQALERR(SEQ ID NO:10)的多肽；

其中X＝E或D并且Y＝R、H或K。

87.如权利要求82所述的细胞，其中所述抑制性结构域包含与SEQ ID NO:6或SEQ IDNO:7中的一个共享至少95％同一性的多肽。

88.如权利要求82所述的细胞，其中所述抑制性拉链结构域包含与SEQ ID NO.6或SEQID NO.7中的一个相同的多肽。

89.如权利要求82所述的细胞，其中与在所述取代的位置处具有天然残基的相同亮氨酸拉链结构域相比，所述取代增加了所述亮氨酸拉链结构域对内源性DLK的亲和力或降低了所述亮氨酸拉链结构域对自身的亲和力。

90.如权利要求82所述的细胞，其中与(i)抑制剂同二聚体或(ii)DLK同二聚体中的任一个相比，所述亮氨酸拉链优先与内源性DLK形成异二聚体。

91.如权利要求82所述的细胞，其中所述抑制剂包含与SEQ ID NO:5具有至少75％同一性的DLK激酶结构域，其中所述DLK激酶结构域包含降低所述DLK激酶结构域的激酶活性的取代。

92.如权利要求82所述的细胞，其中所述抑制剂是DLK的无活性形式。

93.如权利要求92所述的细胞，其中所述抑制剂含有从赖氨酸(K)变为丙氨酸(A)的相对于SEQ ID NO:1的位置152处的取代。

94.如权利要求93所述的细胞，其中所述DLK激酶结构域包含SEQ ID NO.8。

95.如权利要求82所述的细胞，其中所述抑制剂包含LZK的功能性片段。

96.如权利要求82所述的细胞，其中所述抑制剂包含功能性片段神经营养因子，任选地BDNF、GDNF、NT4、TrkB、RdCVF或CNTF。

97.如权利要求82所述的细胞，其中所述抑制剂包含能够通过mAKAP抑制cAMP介导的信号传导，任选地cAMP介导的信号传导的功能性片段。

98.如权利要求82所述的细胞，其中所述抑制剂包含第二结构域，并且其中所述抑制剂能够在所述细胞中具有神经营养活性。

99.一种产生如权利要求61至98中任一项所述的经遗传修饰的视网膜细胞的方法，其包括使视网膜细胞与包含编码双亮氨酸拉链激酶(DLK)抑制剂的多核苷酸的载体接触。

100.一种载体，其包含编码双亮氨酸拉链激酶(DLK)抑制剂的多核苷酸，所述多核苷酸可操作地连接至启动子，

其中所述抑制剂能够结合(i)内源性DLK蛋白，或(ii)编码内源性DLK的内源性mRNA；以及

其中所述抑制剂能够降低视网膜细胞中的所述内源性DLK的表达、信号传导活性或激酶活性。

101.如权利要求100所述的载体，其中所述启动子是遍在启动子。

102.如权利要求101所述的载体，其中所述遍在启动子包含CMV启动子、CAG启动子、CBA启动子或CBh启动子。

103.如权利要求100所述的载体，其中所述启动子是视网膜细胞型特异性的。

104.如权利要求103所述的载体，其中所述启动子是RGC特异性启动子。

105.如权利要求104所述的载体，其中所述启动子是Thy1启动子、Nefh启动子或DCX启动子。

106.如权利要求100所述的载体，其中所述启动子是微型启动子。

107.如权利要求106所述的载体，其中所述微型启动子源自POU4F1、TUBB3、NEFL或NEFM。

108.如权利要求103所述的载体，其中所述启动子是视杆细胞特异性启动子。

109.如权利要求108所述的载体，其中所述启动子是视紫红质启动子或RK启动子。

110.如权利要求25所述的载体，其中所述启动子是视锥细胞特异性启动子。

111.如权利要求110所述的载体，其中所述启动子是pR2.1启动子或MNTC启动子。

112.如权利要求100所述的载体，其中所述抑制剂是能够结合编码内源性DLK的内源性mRNA的RNA，并且其中所述抑制剂能够减少所述细胞中的所述内源性DLK的表达。

113.如权利要求112所述的载体，其中所述抑制剂是shRNA或siRNA。

114.如权利要求112所述的载体，其中所述抑制剂是微小RNA。

115.如权利要求114所述的载体，其中所述微小RNA是miR-130a、miR-122-5p、miR-30a-5p或miR-10-3p。

116.如权利要求100所述的载体，其中所述抑制剂是能够结合内源性DLK的蛋白质，并且

其中所述抑制剂能够降低所述细胞中的所述内源性DLK的信号传导活性或激酶活性。

117.如权利要求116所述的载体，其中所述蛋白质包含抑制性结构域，所述抑制性结构域包含亮氨酸拉链结构域，

其中所述抑制性结构域能够结合内源性DLK的所述亮氨酸拉链结构域，从而竞争性地抑制所述内源性DLK的同二聚化或竞争性地抑制所述内源性DLK和内源性亮氨酸拉链激酶(LZK)的异二聚化。

118.如权利要求117所述的载体，其中所述抑制性结构域包含与SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:4至少95％相同的多肽。

119.如权利要求117所述的载体，其中所述抑制性结构域的所述亮氨酸拉链结构域包含相对于SEQ ID NO:1的至少一个氨基酸取代，并且

其中所述取代增加所述亮氨酸拉链结构域对内源性DLK的亲和力或降低所述亮氨酸拉链结构域对自身的亲和力。

120.如权利要求117所述的载体，其中相对于SEQ ID NO:1，所述抑制性结构域含有选自(a)至(j)中的一个或多个的取代：

a)K391变为D或K391变为E，

b)H393变为D或H393变为E，

c)K398变为R，

d)L407变为D或L407变为E，

e)H405变为D或H405变为E，

f)V412变为D或V412变为E，

g)R414变为D或R414变为E，

h)K453变为R，

i)L458变为D或L458变为E，以及

j)R460变为D或R460变为E。

121.如权利要求117所述的载体，其中所述抑制性结构域在N端至C端上包含：

a)具有序列REEVXLXFEKIYSEGTCLXRXEEELXMX(SEQ ID NO:9)的多肽，

b)包含20个至30个氨基酸残基、任选地SEQ ID NO:11的多肽桥，和

c)具有序列YMELNALMLQLELYERELXRXEQALERR(SEQ ID NO:10)的多肽；

其中X＝E或D并且Y＝R、H或K。

122.如权利要求117所述的载体，其中所述抑制性结构域包含与SEQ ID NO:6或SEQ IDNO:7中的一个共享至少95％同一性的多肽。

123.如权利要求117所述的载体，其中所述抑制性拉链结构域包含与SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7中的一个相同的多肽。

124.如权利要求117所述的载体，其中与在所述取代的位置处具有天然残基的相同亮氨酸拉链结构域相比，所述取代增加了所述亮氨酸拉链结构域对内源性DLK的亲和力或降低了所述亮氨酸拉链结构域对自身的亲和力。

125.如权利要求117所述的载体，其中与(i)抑制剂同二聚体或(ii)DLK同二聚体中的任一个相比，所述亮氨酸拉链优先与内源性DLK形成异二聚体。

126.如权利要求117所述的载体，其中所述抑制剂包含与SEQ ID NO:5具有至少75％同一性的DLK激酶结构域，其中所述DLK激酶结构域包含降低所述DLK激酶结构域的激酶活性的取代。

127.如权利要求117所述的载体，其中所述抑制剂是DLK的无活性形式。

128.如权利要求127所述的载体，其中所述抑制剂含有从赖氨酸(K)变为丙氨酸(A)的相对于SEQ ID NO:1的位置152处的取代。

129.如权利要求128所述的载体，其中所述DLK激酶结构域包含SEQ ID NO.8。

130.如权利要求117所述的载体，其中所述抑制剂包含LZK的功能性片段。

131.如权利要求117所述的载体，其中所述抑制剂包含功能性片段神经营养因子，任选地BDNF、GDNF、NT4、TrkB、RdCVF或CNTF。

132.如权利要求117所述的载体，其中所述抑制剂包含能够通过mAKAP抑制cAMP介导的信号传导，任选地cAMP介导的信号传导的功能性片段。

133.如权利要求117所述的载体，其中所述抑制剂包含第二结构域，并且其中所述抑制剂能够在所述细胞中具有神经营养活性。

134.如权利要求99至133中任一项所述的载体，其中所述载体是重组腺相关病毒(rAAV)载体。

135.如权利要求100至133中任一项所述的载体，其中所述载体是非病毒载体。

136.一种治疗与视网膜细胞相关的疾病或病症的方法，其包括向受试者的视网膜施用如权利要求100至135中任一项所述的载体。

137.如权利要求136所述的方法，其中所述视网膜细胞是视网膜神经节细胞(RGC)。

138.如权利要求136所述的方法，其中所述视网膜细胞是感光细胞。

139.如权利要求136所述的方法，其中所述视网膜细胞是视网膜神经元。

140.如权利要求139所述的方法，其中所述视网膜神经元是双极细胞、无长突细胞或水平细胞。

141.如权利要求136至140中任一项所述的方法，其中所述载体通过注射约10μL至100μL，优选50μL的溶液体积来施用。

142.如权利要求136至141中任一项所述的方法，其中与视网膜细胞功能障碍有关的所述疾病或病症选自青光眼、视网膜病变、视网膜脱离和视网膜营养不良。

143.一种产生经基因修饰的视网膜细胞的方法，其包括使视网膜细胞与如权利要求100至135中任一项所述的载体接触。

144.一种药物组合物，其包含如权利要求100至135中任一项所述的载体。

145.一种药物组合物，其包含如权利要求61至98中任一项所述的细胞。

Images