CN110684737A

CN110684737A - 一种rpe65基因突变患者的诱导多能干细胞

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Publication number: CN110684737A
Application number: CN201910810072.5A
Authority: CN
Inventors: 钟秀风; 李桂兰; 高冠杰; 张清炯; 王攀峰
Original assignee: Zhongshan Ophthalmic Center
Current assignee: Zhongshan Ophthalmic Center
Priority date: 2019-08-29
Filing date: 2019-08-29
Publication date: 2020-01-14
Anticipated expiration: 2039-08-29
Also published as: CN110684737B

Abstract

本发明公开了一种RPE65基因突变患者的诱导多能干细胞。本发明获得RPE65基因突变患者的诱导多能干细胞为非基因整合的，提高了后续应用的安全性；本发明获得的RPE65‑hiPSCs包含2个新的基因位点突变(c.200T>G(p.L67R)和c.430T>C(p.Y144H))，为该类疾病的发病机制研究提供生物材料；本发明获得的RPE65‑hiPSCs，具有多胚层分化能力(神经，软骨，粘膜等)，包括向所有视网膜细胞分化的能力，可为同种或自体细胞移植提供种子细胞，为下游研究提供细胞材料。

Description

一种RPE65基因突变患者的诱导多能干细胞

技术领域：

本发明属于干细胞再生生物领域，具体涉及一种RPE65基因突变患者的诱导多能干细胞。

背景技术

先天性黑朦(Leber’s congenital amaurosis,LCA)是一类遗传性视网膜疾病，具有严重的视觉损伤，多发于儿童时期。这类疾病的主要特征是新生儿或出生后数月视力下降，眼球震颤，视杆和视锥细胞的光反射下降或缺损。目前，至少有20种突变基因被认为可以引起该类疾病，相关致病基因有CEP290，GUCY2D，CRB1和RPE65等(Wang et al.,2015；Jacobson et al.,2016；Kumaran et al.,2017)。

RPE65是一种异构水解酶，主要存在于视网膜色素上皮细胞(retinal pigmentepithelium,RPE)中，它的主要作用是催化全反视黄酯转变为11-顺视黄醇，这个过程称为视黄酸循环(Jin et al.,2005)。RPE65基因突变不仅会扰乱视循环过程，还会进一步引起神经视网膜和RPE细胞的退化，造成不可逆的盲性疾病(Parinot et al.,2014)。通过基因表型分析，RPE65是主要致病基因的一种，而且高度异质性。目前研究发现RPE65有上百种突变模式，但是病理机制尚未完全阐述清楚(Astuti et al.,2016；Bernardis et al.,2016)。

迄今为止，遗传性视网膜疾病还没有很好的治疗方法。对于RPE65突变引起的LCA，临床上有开展初期的基因治疗研究(Bainbridge et al.,2008；Russell et al.,2017)。虽然基因治疗可以改善光敏感性，但改善的功能会在三年后进行退化，而且不能阻止视网膜的退化，导致光感受器和RPE细胞的凋亡(Liu et al.,2018)。除此之外，该治疗方案仅适用于视网膜结构保存尚完好的患者。因此急需开展新的治疗模式的研究。干细胞治疗为该类疾病带来了新的希望。十多年前，诱导多能干细胞(iPSCs)问世。该类细胞具有向人体细胞分化的能力，而且具有患者特异性，可减少免疫排斥的优势(Takahashi et al.,2007)。

因此，构建RPE65-hiPSCs也可以为该类疾病的治疗提供种子细胞，为疾病的分子和细胞发病机制及药物筛查研究提供细胞模型。

发明内容：

本发明的目的是克服现有技术中的缺陷，提供了一种RPE65基因突变患者的诱导多能干细胞。

本发明的目的是提供一种RPE65基因突变患者的诱导多能干细胞，是RPE65基因发生突变的诱导多能干细胞。优选，是RPE65基因的200位由T突变为G(c.200T>G(p.L67R))和430位由T突变为C(c.430T>C(p.Y144H))的诱导多能干细胞。

所述的RPE65基因突变患者的诱导多能干细胞是通过以下方法制备得到的：将质粒pEP4-EO2S-ET2K和pCEP4-miR-302-367转入RPE65基因突变患者的体细胞中，诱导并挑取形态类似胚胎干细胞的克隆进行传代培养，获得RPE65基因突变患者的诱导多能干细胞。

所述的RPE65基因突变患者的体细胞优选为突变位点为c.200T>G(p.L67R)和c.430T>C(p.Y144H)的RPE65基因突变患者的尿液细胞。

所述的RPE65基因突变患者的诱导多能干细胞是通过以下方法制备得到的：收集突变位点为c.200T>G(p.L67R)和c.430T>C(p.Y144H)的RPE65基因突变患者的尿液细胞，进行原代和传代培养，通过电转法将质粒pEP4-EO2S-ET2K和pCEP4-miR-302-367转入尿液细胞中，诱导并挑取形态类似胚胎干细胞的克隆进行传代培养，获得RPE65基因突变患者的诱导多能干细胞。

本发明的有益效果如下：

1)本发明获得RPE65基因突变患者的诱导多能干细胞(RPE65-hiPSCs)(10株以上)，获得的RPE65-hiPSCs为非基因整合的，提高了后续应用的安全性。

2)本发明获得的RPE65-hiPSCs包含2个新的基因位点突变(c.200T>G(p.L67R)和c.430T>C(p.Y144H))，为该类疾病的发病机制研究提供生物材料。

3)本发明获得的RPE65-hiPSCs，具有多胚层分化能力(神经，软骨，粘膜等)，包括向所有视网膜细胞分化的能力，可为同种或自体细胞移植提供种子细胞，为下游研究提供细胞材料。

附图说明：

图1为RPE65-LCA患者眼底照图(Yabin Chen,et al.Invest Ophthalmol VisSci.2013；54(6):4351-7)。

图2为RPE65-LCA尿液细胞的扩增培养图：尿液细胞分离后贴壁生长，细胞有两种类型1型(圆形而且致密生长，长箭头标识)和2型(长条形而且呈松散生长，短箭头标识)，传代细胞生长7天后密度可达90％以上。

图3为免疫组化鉴定RPE65-LCA尿液细胞特性图，尿液细胞表达E-cadherin，CD44和KRT7。

图4为RPE65-LCA尿液细胞重编程后hiPSCs克隆逐渐形成过程的图，第15天获得边界清楚的典型克隆；

图5为Sanger测序确认RPE65-hiPSCs存在两个突变位点c.200T>G(p.L67R)和c.430T>C(p.Y144H)；

图6为RPE65-hiPSCs两个突变位点c.200T>G(p.L67R)和c.430T>C(p.Y144H)所致突变蛋白的3D结构预测图：预测分析显示突变位点L67and Y144分别定位在第7和第1折叠片上。

图7为免疫染色鉴定RPE65-hiPSCs干性图：表达相关标志物OCT4，SOX2，NANOG，SSEA4，TRA-1-81和TRA-1-60。

图8为RT-PCR鉴定内源和外源基因表达图：A：RT-PCR验证5个RPE65-hiPSCs细胞系(C11-1,C4,C10,C13and C14)均表达内源性干性基因OCT4,SOX2和NANOG，说明重编程过程激活了内源性干性标志物表达。B：随着hiPSCs传代生长，质粒本身(oriP and EBNA-1)以及带有的外源基因(OCT4,SOX2,KLF4，SV40LT and miR-302-367)丧失表达能力，RT-PCR检测为阴性,证明无外源基因整合。

图9为RPE65-hiPSCs的核型图，具有正常核型。

图10为RPE65-hiPSCs在小鼠体内形成畸胎瘤，向三胚层分化的图，可以在体内分化为外胚层(神经花环结构)，中胚层(软骨组织)和内胚层(肠上皮组织)。

图11为RPE65-hiPSCs向3D视网膜分化的鉴定图；其中A：获得的原代克隆；B：传代扩增后的RPE65-hiPSCs；C：拟胚体；D：RPE65-hiPSCs分化的3D视网膜组织；E，F：RPE65-hiPSCs分化得到的视网膜组织表达视网膜前体标志物VSX2和MCM2。

图12为RPE65-hiPSCs获得的3D视网膜向神经视网膜亚类细胞分化鉴定图；其中A：神经节细胞(BRN3⁺)；B：光感受器前体细胞(OTX2⁺)；C：无长突细胞(AP2⁺)；D：水平细胞(PROX1⁺)；E：双极细胞(PKC-ɑ⁺)；F：Muller胶质细胞(CRALBP⁺)；G：光感受器细胞(Recoverin⁺)；H：视杆细胞(Rhodopsin⁺)；I：视锥细胞(L/M opsin⁺)；J：视锥细胞(S opsin⁺)。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：

1.尿液细胞分离培养及重编程

①细胞：RPE65-LCA患者尿液细胞

②试剂及耗材：

1)DMEM/Ham’s F-12nutrient mix(1:1)：STEM CELL，#05851，4℃；

2)FBS:

3)Renal epithelial cell growth medium(REGM)补剂；

4)TrypLE express:Life technologies；

5)双抗；

6)0.1％明胶溶液

7)PBS:吉诺生物医药技术有限公司，14111202，常温；

8)质粒:pEP4-EO2S-ET2Kh和pCEP4-miR-302-367

③仪器：

1)CO₂培养箱：SANYO，MCO-20A1C；

2)倒置显微镜：Nikon，TS100；

3)离心机

4)电转移:Invitrogen Neon transfection system

④步骤：

1)尿液样本来自于一个9岁LCA患者，带有RPE65基因突变，突变位点为c.200T>G(p.L67R)和c.430T>C(p.Y144H)，眼底照显示患者有明显的临床症状(RPE65-LCA患者，图1)，用酒精清洁后，收集RPE65-LCA患者约100-200ml的中段尿，置于无菌容器中，保持收集过程以及各种容器无菌；

2)尿液样本离心，400g，10min；

3)细胞沉淀用加有1％双抗(青霉素-链霉素)的PBS清洗2次；

4)细胞沉淀接种在0.1％明胶溶液包被的12孔板中，加入2ml原代培养基(DMEM/Ham’s F-12nutrient mix(1:1)+10％FBS(血清)+Renal epithelial cell growth medium(REGM)补剂(Lonza，CC-3191&CC-4127)+1％双抗(青霉素-链霉素))，置于37℃，5％CO₂培养箱培养；

5)细胞生长一周出现成簇贴壁细胞，细胞密度长至80-90％，用TrypLE express(Life technologies,Inc.,Grand Island,NY,USA)进行消化传代；

6)细胞进行计数，将1×10⁶个尿液细胞重悬于100μl的PBS，加入6μg的OriP/EBNA1非整合质粒pEP4-EO2S-ET2K(包含OCT4,SOX2,SV40LT和KLF4)和4μg的pCEP4-miR-302-367质粒(miR-302b,c,a,d and miR-367)进行非整合质粒电转，电转参数1200V,30ms,1pulse；

7)电转后的细胞接种在Matrigel包被的6孔板上，加入2ml REGM培养基，置于37℃，5％的CO₂培养箱培养；

8)从第2到第6天，开始加入诱导培养基(mTeSR1+0.5μM A-83-01+3μM CHIR99021+0.5μM Tzv+0.5μM PD0325901)，隔天换液；

9)诱导后7-10天左右，出现克隆样细胞，换mTeSR1培养基继续培养，克隆逐渐增大。

⑤结果分析

获得的尿液细胞呈贴壁生长，具有成簇状克隆样结构(图2)。免疫荧光染色显示，获得的尿液细胞表达尿液上皮细胞相关标志物E-cadherin，CD44和KRT7(图3)。

2.RPE65-hiPSCs的克隆挑取与扩增传代

①细胞：RPE65-hiPSCs原代克隆和传代细胞

②试剂及耗材：

1)mTeSR1培养基：STEM CELL,#05851；

2)EDTA：Invitrogen，15575-038；

3)PBS(1×)：吉诺生物医药技术有限公司，14111202；

4)Matrigel：Corning，354277；

5)六孔板：FALCON，353046；

6)离心管：BD FALCON，352096。

③仪器：

1)CO₂培养箱：SANYO，MCO-20A1C；

2)倒置显微镜：Nikon，TS100；

3)离心机。

④步骤：

1)原代克隆生长至D16-D22(诱导后第16-22天)，克隆变大呈扁平状，克隆细胞较密集；

2)用tip头将克隆边缘划开，轻轻刮起，呈小片状(类似胚胎干细胞的克隆)，接种到Matrigel包被的6孔板中，加入2ml mTeSR1培养基，放入37℃的CO₂培养箱中培养；

3)克隆小片贴壁生长，逐渐增大呈扁平状，细胞密集核质比较大，连续培养约5-7天；

4)选取生长良好的克隆，吸去培养液，用无菌PBS润洗1遍，加入已复温至37℃的0.5mM EDTA 1ml，放入37℃CO₂培养箱中消化5-6min，吸去EDTA，取1ml mTeSR1培养基轻轻吹落细胞；

5)消化的细胞重新接种到Matrigel包被的6孔板中，进行扩增培养，即为RPE65-hiPSCs(即RPE65基因突变患者的诱导多能干细胞)。

6)RPE65-hiPSCs维持培养于mTeSR1培养基中，约4-5天克隆可生长至占满约80％底面积，可以进一步传代扩增，方法同前。

⑤结果分析

尿液细胞经过基因重编程后，获得数十个hESC样的克隆(例如：C4，C10，C11-1，C13和C14等)，命名为RPE65-hiPSCs。RPE65-hiPSCs具有很好的增殖能力，可以连续传代20代以上(图4)。通过Sanger测序结果显示，RPE65-hiPSCs存在两个突变位点c.200T>G(p.L67R)和c.430T>C(p.Y144H)，与体细胞的突变位点一致(图5)。3D蛋白结构预测显示突变位点L67and Y144分别定位在第7和第1折叠片上(图6)。

3.RPE65-hiPSCs的干细胞特性鉴定

重编程后获得的克隆样细胞(RPE65-hiPSCs)进行了干细胞特性鉴定，以确定获得的细胞是诱导多能干细胞。采用免疫组化方法鉴定细胞表达干性标志物(OCT4，NANOG，SOX2，SSEA4，TRA1-81，TRA1-60)，采用RT-PCR方法鉴定内外源基因的表达情况，采用畸胎瘤实验验证干细胞的三胚层分化能力，并进一步进行了核型分析，了解获得的hiPSCs株是否有正确的核型。对母本细胞(尿液细胞)和传代的hiPSCs进行STR鉴定，确认hiPSCs与母本细胞的关系，排除细胞污染。

①免疫荧光染色实验

1)细胞：RPE65-hiPSCs

2)试剂及耗材：

a:PBS：NATOCOR,NTC-HK026

b:4％多聚甲醛(PFA)：Sigma

c:驴血清：XT-100

d:Triton 100：Biomedicals，

e:第一抗体和第二抗体清单见表6；

f:DAPI：碧云天(XY-C005)

g:抗猝灭封片剂：beyotime

h:cover slip：

3)仪器：

a:荧光显微镜：Observer 7，ZEISS

4)步骤：

a:培养的RPE65-hiPSCs消化后接种在加有cover slips的24孔板中，培养2-3天；

b:用4％PFA固定，5min，室温；

c:加入PBS清洗一遍，加入封闭穿透液(0.2％Triton 100溶液：含有10％驴血清)，封闭穿透40min；

d:加入目标1抗，4℃，过夜；

e:PBS洗，3次，每次5min；

f:加入相应的二抗，室温孵育1h；

g:PBS洗，3次，每次5min；

h：加入DAPI溶液，5min；

i：PBS洗，1次，每次5min；

j:用镊子夹出cover slips，加封片剂，倒置封片于玻片上；

k：荧光显微镜观察和拍照。

5)结果分析

用免疫荧光染色的方法检测人多能干细胞相关表达标志物的情况，结果显示RPE65-hiPSCs表达OCT4，SOX2，NANOG，SSEA4，TRA-1-81和TRA-1-60等干细胞标志物(图7)。

②RT-PCR

1)细胞：不同RPE65-hiPSCs细胞系(C11-1,C4,C10,C13and C14)

2)试剂及耗材：

a:Trizol：Tri reagent T9424 200ml Sigma

b:无水乙醇：广州化学试剂厂

c:异丙醇：广州化学试剂厂

d:氯仿：

e:琼脂粉：Agarose BFOFROX

f:50X TAE：Tris-乙酸电泳缓冲液(50X TAE)

g:EB：北京定国长生生物技术责任有限公司

h：DNA loading buffer：TaKaRa SD0503

i：EasyScript one step gDNA remover and cDNA synthesis supermix,Transgene Lot#.M20428

j：Taq酶：Takara，RR902A

3)仪器：

a:PCR仪：Biometra,070-851

b:电泳仪：北京六一生物科技有限公司

c：凝胶成像系统：BIO-RAD chemiDoc^TMMP全能型成像系统

4)步骤：

a:收集细胞沉淀，加入1ml的Trizol；

b:RNA提取：采用经典Trizol方法按照步骤进行RNA提取，并检测RNA浓度；

c:逆转录：用逆转录试剂盒按照说明进行，RNA转录量为1μg；

d:PCR扩增：采用Takara的试剂盒按说明书进行；

e:电泳：PCR产物进行1％琼脂糖电泳，观察结果

5)结果分析

RT-PCR验证5个RPE65-hiPSC细胞系(C11-1,C4,C10,C13and C14)的内源和外源基因表达(图8)。5个细胞系均表达内源性基因OCT4,SOX2和NANOG，说明重编程过程激活了干性标志物表达。随着hiPSCs传代生长，质粒本身(oriP and EBNA-1)以及带有的外源基因(OCT4,SOX2,KLF4,SV40LT and miR-302-367)丧失表达能力，RT-PCR检测为阴性,证明无外源基因整合，PCR引物见表7。

③核型分析

1)细胞：RPE65-hiPSCs

2)试剂及耗材：

a:秋水仙碱；

b:0.5mM EDTA：0.5M EDTA溶液，Invitrogen，15575-038，常温

c:0.075M氯化钾溶液；

d:吉姆萨染色，

3)仪器：

a:显微镜：Olympus BX51microscope；

b:核型分析软件：Ikaros Karyotyping System(MetaSystems)。

4)步骤：

a:RPE65-hiPSCs生长在Matrigel包被的板上，密度生长至约70％；

b:加入终浓度为0.2μg/ml的秋水仙碱，孵育2h；

c:RPE65-hiPSCs用0.5mM EDTA进行消化，5min，细胞液离心1000rpm，5min，收集细胞沉淀；

d:细胞沉淀加入8ml的0.075M的氯化钾溶液，37℃孵育20min；

e:用固定液(甲醇:乙酸＝3:1)固定细胞，37℃孵育10min，离心；

f:细胞悬滴冰冻涂片，80℃，2h；

g:脱酶和吉姆萨染色；

h:拍照，核型分析。

5)结果分析

核型结果显示获得的RPE65-hiPSCs具有正确的核型，见图9。

④畸胎瘤实验

1)细胞：RPE65-hiPSCs

2)动物：NOD-SCID小鼠

3)试剂及耗材：

a:30％Matrigel:

b:福尔马林:

c:苏木素；

d:石蜡；

e:吉姆萨染色。

4)仪器：

a:显微镜：Nikon，TS100；

b:石蜡切片机。

5)步骤：

a:1-2×10⁶个细胞的RPE65-hiPSCs，混悬于30％Matrigel中；

b:含有1-2×10⁶个细胞的细胞团通过肌肉注射到NOD-SCID小鼠的后腿；

c:移植后W8-W10(8-10周)，去除畸胎瘤；

d:畸胎瘤组织用福尔马林固定，嵌入石蜡中，进行切片；

e:石蜡切片进行苏木素染色(HE染色)；

f:显微镜观察，拍照。

6)结果分析

通过畸胎瘤实验鉴定RPE65-hiPSCs在体内的三胚层分化能力，结果显示RPE65-hiPSCs在小鼠体内形成畸胎瘤，具有三胚层分化能力，可以分化为神经玫瑰花环样结构(外胚层)，软骨样结构(中胚层)和肠上皮样结构(内胚层)(图10)。

⑤STR鉴定

1)细胞：尿液细胞(UC)和RPE65-hiPSCs(克隆编号分别为：C4和C13)；

2)方法：收集细胞沉淀，样本送南京福克赛科佰生物科技有限公司进行检测；

3)结果分析：STR鉴定结果显示，RPE65-hiPSCs与尿液细胞具有相同的短串联重复序列，而且无其他细胞污染(表1)。

4.RPE65-hiPSCs视网膜诱导分化

①细胞：RPE65-hiPSCs

②试剂及耗材：

1)mTeSR1培养基：STEM CELL,#05851

2)EDTA：Invitrogen，15575-038；

3)PBS(1×)：吉诺生物医药技术有限公司，14111202；

4)Matrigel：Corning，354277；

5)10mM Blebbistatin：sigma

6)heparin：sigma

7)六孔板：FALCON，353046；

8)离心管：BD FALCON，352096。

③仪器：

1)CO₂培养箱：SANYO，MCO-20A1C；

2)倒置显微镜：Nikon，TS100；

3)离心机。

④步骤：

干细胞特性鉴定完毕后，进一步验证RPE65-hiPSCs的视网膜分化能力。按已报道的方案进行视网膜诱导分化(参考文献1：Li,G.,Xie,B.,He,L.,Zhou,T.,Gao,G.,Liu,S.,et al.(2018).Generation of Retinal Organoids with Mature Rods and Cones fromUrine-Derived Human Induced Pluripotent Stem Cells.Stem Cells Int 2018,4968658.doi:10.1155/2018/4968658.和参考文献2：Zhong,X.,Gutierrez,C.,Xue,T.,Hampton,C.,Vergara,M.N.,Cao,L.H.,et al.(2014).Generation of three-dimensionalretinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs.Nat Commun 5,4047.doi:10.1038/ncomms5047)。

1)RPE65-hiPSCs接种在Matrigel包被的板上，细胞密度生长至约80％左右，用0.5mM的EDTA消化，消化为小细胞团；

2)消化后的小细胞团加入含10mM Blebbistatin的mTeSR1培养液，促进细胞聚集，将细胞转移到10mm的低吸附皿中，37℃，培养过夜，第二天可见拟胚体(EBs)形成；

3)EBs诱导分化当天标记为第0天(D0)，次日记为第1天(D1)，以此类推。第1天，培养液替换为25％NIM(NIM培养液配方见表2)+75％mTeSR1；第2天，培养液替换为50％NIM+50％mTeSR1，从第三天开始全部换成NIM培养液培养，连续悬浮培养至第6-7天。

4)第6-7天，将悬浮培养的EBs重新接种在Matrigel包被的培养皿中，加入NIM培养基，开始贴壁培养诱导分化；

5)该诱导系统中，EBs诱导分化20天左右，形成明显视杯样结构，与周围组织比结构清晰立体突出，用Tungsten针将这些视杯结构挑起，悬浮培养，即为3D视网膜组织。

⑤结果分析

RPE65-hiPSCs具有很好的视网膜分化能力，EB形态良好，贴壁生长后出现视泡样结构，用Tungsten针将视泡样结构挑起进行悬浮培养，用RDM培养基培养(培养成分见表3)，形成3D视网膜，获得的视网膜有一圈透明的神经视网膜结构以及附着一个RPE球样结构，从分化后42天到90天用RC2培养基进行培养(培养成分见表4)，分化后91天开始换RC1培养基进行长期培养(培养成分见表5)。免疫荧光鉴定显示，3D视网膜表达视网膜前体细胞标志物(VSX2)和增殖标志物(MCM2)(图11)。获得的3D视网膜进行长期培养，选取不同分化阶段进行鉴定，结果显示3D视网膜含有主要视网膜细胞：神经节细胞(BRN3⁺)，视网膜前体细胞(OTX2⁺)无长突细胞(AP⁺)，水平细胞(PROX1⁺)，双极细胞(PKC-ɑ⁺)，胶质细胞(CRALBP⁺)，视杆细胞(Rhodopsin⁺)和视锥细胞(L/M opsin⁺和S opsin⁺)(图12)。

表1STR鉴定结果

表2NIM培养液从第3-15天

Ingredient	Amount(ml)	Final concentration
			DMEM/F12(1:1)(Gibco,C11330500BT)	500.00
100×N2(Gibco,17502-048)	5.00	0.01
			Heparin(2mg/ml in PBS,)	0.50	2ug/ml
100×MEM-NEAA(Gibco,11140-050)	5.00	0.01
				510.50

表3RDM培养液从第16-41天

Ingredient	Amount(ml)	Final concentration
			DMEM/F12(1:1)(Gibco,C11330500BT)	300.00
DMEM basic(Gibco,C11995500BT)	200.00
			50×B27without vitamin A(Gibco,17504044)	10.00
100×antibiotic and antimycotic(Gibco,15240)	5.00
			100×MEM-NEAA(Gibco,11140-050)	5.00
	520.00

表4RC2培养液从第42-90天

表5RC1培养液从第91天

Ingredient	Amount(ml)	Final concentration
			DMEM/F12-Glutamax(Gibco,C10565-018)	450.00
100×N2supplement(Invitrogen,17502-048)	5.00
			100×antibiotic and antimycotic(Gibco,15240)	5.00
100×MEM-NEAA(Gibco,11140-050)	5.00
			FBS(Gibco,10099-141)	50.00	10％
1000×Taurine(sigma,#T-0625)	0.50	100μM
				515.50

表6抗体表

表7引物表

Claims

1.一种RPE65基因突变患者的诱导多能干细胞，其特征在于，是RPE65基因发生突变的诱导多能干细胞。

2.根据权利要求1所述的RPE65基因突变患者的诱导多能干细胞，其特征在于，是RPE65基因的200位由T突变为G和430位由T突变为C的诱导多能干细胞。

3.根据权利要求1或2所述的RPE65基因突变患者的诱导多能干细胞，其特征在于，所述的RPE65基因突变患者的诱导多能干细胞是通过以下方法制备得到的：将质粒pEP4-EO2S-ET2K和pCEP4-miR-302-367转入RPE65基因突变患者的体细胞中，诱导并挑取形态类似胚胎干细胞的克隆进行传代培养，获得RPE65基因突变患者的诱导多能干细胞。

4.根据权利要求3所述的RPE65基因突变患者的诱导多能干细胞，其特征在于，所述的RPE65基因突变患者的体细胞为突变位点为c.200T>G(p.L67R)和c.430T>C(p.Y144H)的RPE65基因突变患者的尿液细胞。

5.根据权利要求4所述的RPE65基因突变患者的诱导多能干细胞，其特征在于，所述的RPE65基因突变患者的诱导多能干细胞是通过以下方法制备得到的：收集突变位点为c.200T>G(p.L67R)和c.430T>C(p.Y144H)的RPE65基因突变患者的尿液细胞，进行原代和传代培养，通过电转法将质粒pEP4-EO2S-ET2K和pCEP4-miR-302-367转入尿液细胞中，诱导并挑取形态类似胚胎干细胞的克隆进行传代培养，获得RPE65基因突变患者的诱导多能干细胞。