JP5759536B2

JP5759536B2 - 角膜上皮分化指向性ｉＰＳ細胞

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Publication number: JP5759536B2
Application number: JP2013511044A
Authority: JP
Inventors: 竜平林; 幸二西田
Original assignee: Osaka University NUC
Current assignee: Osaka University NUC
Priority date: 2011-04-20
Filing date: 2012-04-20
Publication date: 2015-08-05
Anticipated expiration: 2032-04-20
Also published as: JPWO2012144582A1; WO2012144582A1; CN103492555A; US20140127803A1; EP2700709A1; EP2700709A4

Description

本発明は、主に、多能性幹細胞の角膜上皮幹細胞および／または角膜上皮細胞への分化誘導方法、角膜上皮幹細胞および／または角膜上皮細胞の製造方法、該角膜上皮幹細胞に由来する角膜上皮細胞シート、ならびに、角膜上皮幹細胞および／または角膜上皮細胞への分化誘導に用いられる誘導多能性幹細胞（iPS細胞）に関する。

良好な視機能を保つことは、ＱＯＬの維持に極めて重要である。そのため、視機能が害される眼疾患、特に難治性の眼疾患に対する根本的治療の開発は社会的ニーズが極めて高い。難治性の眼疾患の一群として、Stevens-Johnson症候群、眼類天疱瘡、アルカリ腐食などの疾患が、角膜上皮幹細胞疲弊症として知られている。角膜上皮幹細胞疲弊症においては、外傷や自己免疫などによる慢性的な炎症反応により眼の角膜輪部に存在する角膜上皮幹細胞が不可逆的な機能不全に陥るあるいは消失してしまい、角膜が混濁するとの症状を呈する。その結果として、眼の結膜上皮が、角膜中央部に侵入することにより角膜が本来有する透明性が失われて、著しい視力低下がもたらされる。角膜上皮幹細胞疲弊症などの重篤な角膜疾患患者の視力を回復するための処置として、従来から角膜移植術が行なわれてきた。特に、両眼で疾病が発症する両眼性の患者に対しては、患者本人由来の正常な角膜が存在しないため、他家の角膜移植術しか行えないのが現状である。しかしながら、他家の角膜移植術を行なうにあたって必要な角膜を供給できるドナーが不足しているとの問題や、ドナー由来の角膜に対して生じうる拒絶反応の問題があるため、自家細胞源を用いた治療法の開発が望まれている。

片眼性の角膜疾患患者においては、正常な眼の角膜周辺（角膜輪部）に角膜上皮幹細胞が存在するため、この細胞を採取して、これより角膜シートを再生し移植する方法が行なわれている（非特許文献１）。自己の角膜上皮幹細胞より再生した角膜シートは、自己の細胞由来であるため、拒絶反応が生じないという利点がある。

一方、両眼性の角膜疾患患者においては、角膜上皮幹細胞が存在しないため、上記の処置を行なうことはできない。なお、角膜上皮幹細胞疲弊症の患者の多くは、両眼性である。両眼性の角膜疾患患者における自家細胞を用いた再生治療法として、患者自身の口腔粘膜上皮の幹細胞を使用する自家口腔粘膜上皮細胞シート移植法が開発されている（非特許文献２）。自家口腔粘膜上皮細胞シート移植法は既に臨床適用がされており、良好な臨床成績を残している。具体的には、15症例において、1年間の観察期間中での透明治癒率は93％（14/15眼）であり、視力改善率は80％（12/15眼）である。すなわち、自家口腔粘膜上皮細胞シート移植法によって多くの眼疾患患者の視力が達成されることが報告されている。

一方で、口腔粘膜は血管に富む組織であるため、自家口腔粘膜上皮細胞シート移植法を適用した患者において、長期的には移植した口腔粘膜上皮細胞シートに血管侵入が起きうる可能性、さらには血管侵入が起きて口腔粘膜上皮細胞シートの透明性が低下するおそれが考えられる。そのため、患者由来の自家細胞より角膜上皮そのものを作製することが理想的である。しかしながら、患者由来の自家細胞より角膜上皮、特に角膜上皮シートを作製するための角膜上皮細胞や角膜上皮幹細胞を分化誘導するための方法は、知られていないのが現状である。

特定の細胞を分化誘導する方法は、一部の特定細胞について知られるのみである。例えば、胚性幹細胞を神経幹細胞、神経細胞、神経堤の細胞又は神経官等に分化誘導する方法として、ＳＤＩＡ法が知られている（特許文献２および非特許文献３）。ＳＤＩＡ法は胚性幹細胞をストローマ細胞の存在下で行なうことを特徴としており、胚性幹細胞において表皮細胞等への分化を抑制し、神経細胞等への分化誘導をするため方法であると考えられている。このように、ＳＤＩＡ法により分化誘導されるのは神経細胞等であり、発生学的に表皮細胞に近いと考えられる角膜上皮細胞や角膜上皮幹細胞の分化誘導方法とは異なる。

近年、山中らにより開発された人工誘導多能性幹細胞（iPS細胞）は、容易に採取できる患者自身の線維芽細胞等の体細胞から樹立することが可能である（特許文献１）。iPS細胞は、胚性幹細胞（ES細胞）に匹敵する多分化能を有していることが知られている。iPS細胞を細胞源に用いる再生医療は、ドナー不足の問題および拒絶反応の問題を同時に解決できる手法として期待されている。また、ES細胞の場合は必須である初期胚を破壊する工程が必要ないため、初期胚の破壊に関する倫理的問題も存在しない。しかしながら、ヒトES細胞やヒトiPS細胞から角膜上皮を分化誘導したとの報告は、これまでにないのが現状である。

国際公開第2007/069666号国際公開第2001/088100号特開2004-261533号特開2005-333904号

Nishida K., et al., Transplantation 2004, 77: 379-385. Nishida K., et al., N Engl J Med 2004, 351: 1187-1195. Kawasaki H., et al., Neuron 2000, 28: 31-40.

本発明は、従来の自家口腔粘膜上皮細胞シートと同等に取得が容易で、かつ、血管侵入が生じる可能性の観点などにおいてより安全性が高い角膜上皮細胞シートを得るための、角膜上皮幹細胞および／または角膜上皮細胞を分化誘導および製造する方法を提供することを目的とする。また、本発明は上記角膜上皮幹細胞および／または角膜上皮細胞に由来する角膜上皮細胞シート、角膜上皮幹細胞および／または角膜上皮細胞への分化誘導のための細胞材料などを提供することをも目的とする。

本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討を行ったところ、驚くべきことに、多能性幹細胞をストローマ細胞の存在下において培養することにより、誘導多能性幹細胞を角膜上皮細胞および角膜上皮幹細胞へと分化誘導できることを見出した。また、眼表面上皮由来の細胞から調製される誘導多能性幹細胞を用いて、分化誘導を行なうことで、より効率的に角膜上皮幹細胞および／または角膜上皮細胞への分化誘導が達成されることをも見出した。本発明は、かかる知見に基づいてさらに検討を重ねることにより完成したものである。

即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を包含する。
項１、多能性幹細胞をストローマ細胞または羊膜由来因子の存在下において培養する工程を含む、多能性幹細胞の角膜上皮幹細胞および／または角膜上皮細胞への分化誘導方法。
項２、前記培養が、無血清培地中で行なわれる、項１に記載の分化誘導方法。
項３、前記無血清培地が、少なくとも培養開始から培養開始後１〜２週間の間ＢＭＰ４を実質的に含まない、項２に記載の分化誘導方法。
項４、前記多能性幹細胞が、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）または誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）である、項１〜３のいずれかに記載の分化誘導方法。
項５、前記誘導多能性幹細胞が、眼表面上皮由来の細胞に、多能性幹細胞に誘導可能な再プログラム因子を導入することにより得られる誘導多能性幹細胞である、項４に記載の方法。
項６、下記の工程を含む、角膜上皮幹細胞および／または角膜上皮細胞の製造方法：
（１）多能性幹細胞をストローマ細胞または羊膜由来因子の存在下で培養する工程、および
（２）前記培養した細胞から、角膜上皮幹細胞および／または角膜上皮細胞を選択する工程。
項７、前記角膜上皮幹細胞を選択する工程が、自己増殖能を有し、かつ、角膜上皮幹細胞特異的マーカーを発現している細胞を選択する工程である、項６に記載の製造方法。
項８、項６または７に記載の製造方法により得られる角膜上皮幹細胞および／または角膜上皮細胞に由来する、角膜上皮細胞シート。
項９、眼表面上皮由来の細胞に対して、多能性幹細胞に誘導可能な再プログラム因子を導入することにより得られる誘導多能性幹細胞。
項１０、角膜上皮幹細胞および／または角膜上皮細胞への分化誘導に用いられる、項９に記載の誘導多能性幹細胞。
項１１、項９または１０に記載の誘導多能性幹細胞を含む、角膜上皮幹細胞および／または角膜上皮細胞への分化誘導のための細胞材料。

本発明によれば、患者自身の細胞を用いて角膜上皮幹細胞および／または角膜上皮細胞への分化誘導および製造する方法が世界で初めて提供される。本発明に従って得られた角膜上皮幹細胞、およびそれに由来する角膜上皮細胞シートは、口腔粘膜上皮細胞シートと同程度に取得が容易である。また、患者自身の細胞から分化誘導した角膜上皮細胞、角膜上皮幹細胞、およびそれに由来する角膜上皮細胞シートは、当該患者自身に移植（自家移植）した場合には、患者自身の細胞であるため拒絶反応がないものである。加えて、本発明によれば、口腔粘膜上皮細胞シートの場合のような血管侵入の問題もない従来技術と比べてより安全性が高い角膜上皮細胞シートが提供される。

また、本発明によれば、角膜上皮幹細胞および／または角膜上皮細胞への分化誘導に好適に用いられる誘導多能性幹細胞が提供される。

さらに、本発明により人工的に作製される角膜上皮幹細胞および／または角膜上皮細胞は、従来は患者より採取することでのみ得ることができた角膜上皮幹細胞および／または角膜上皮細胞の供給源となり得るため、眼角膜分野の再生医療における、さらなる技術向上に資するための有用なツールとして用いることができる。

（ａ）眼表面上皮より樹立したヒトiPS細胞株 B31（上段左）、B34（上段中）、B41（上段右）、C51（下段中）およびD43（下段左）の位相差顕微鏡像を示す。対照として、ヒトiPS細胞株253G1（下段右）の位相差顕微鏡像を示す。（ｂ）B41細胞株のES細胞マーカー（ES Marker）染色像。E-Cadherin、Nanog、Oct3/4およびSox2のそれぞれについて、位相差顕微鏡像（左）、核染色（中）、免疫染色像（右）を示す。（ａ）B34、B41、C51およびD43細胞株の核型解析の結果を示す。（ｂ）Ｂ41細胞株により形成された奇形腫（上段）、ならびに、奇形腫において形成された外胚葉（中段左：色素上皮および表皮、中段右：神経）、中胚葉（下段左）、および内胚葉（下段右）を示す。分化誘導条件下でのB41株、201B7株および253G1株における、pax6およびK12（ケラチン12）の遺伝子発現量をRT-PCRにより測定した結果を示す。最下段は、B41株の誘導初期（２週間）にBMP4を添加した場合のpax6とK12の遺伝子発現解析結果である。横軸は分化誘導後の経過期間を週で示したものであり、縦軸は標準遺伝子GAPDHの発現量に対する相対比を示す。は、分化誘導条件下でのＢ41株における、pax6（右上及び右下）およびK12（左上及び左下）の発現を示す。は、同B41株におけるK14およびK12の発現を免疫染色により示す：位相差顕微鏡図（左上）、K12（右上）、K14（左下）、K14+K12（右下）は、分化誘導された253G1株におけるp63、K14、及びK12の発現を免疫染色により示す：位相差顕微鏡図（上段左）、p63（上段右）、K14（中断左）、K12（中断右）、p63+K12+K14（下段左）。は、BMP4を添加した条件にて分化誘導をしたB41株についてpax6、K12、及びK14の発現を調べた結果を示す：位相差顕微鏡図（左上）、K12（右上）、pax6（左下）、K14(右下)。は、BMP4を添加した条件にて分化誘導をした253G1株についてpax6、K12、及びK14の発現を調べた結果を示す：位相差顕微鏡図（左上）、K12（右上）、pax6（左下）、K14(右下)。（ａ）は、Ｂ41株より分化誘導された角膜上皮幹細胞（または前駆細胞）の位相差像（phase）、ならびに、pax6およびK14（ケラチン14）の免疫染色像を示す：位相差顕微鏡図（左上）、pax6（右上）、K14（左下）、K14及びpax6（右下）。（ｂ）は、同細胞の位相差像（phase）、ならびに、p63＋K14（ケラチン14）の免疫染色像を示す：位相差顕微鏡図（左上）、pax6（右上）、K14（左下）、K14＋pax6（右下）。

本発明は、主に多能性幹細胞の角膜上皮幹細胞および／または角膜上皮細胞への分化誘導方法、製造方法、角膜上皮細胞シート、誘導多能性幹細胞および細胞材料の提供を目的とする。以下、分化誘導方法、製造方法、角膜上皮細胞シート、誘導多能性幹細胞、細胞材料の順番で説明する。

１．分化誘導方法
本発明の、多能性幹細胞の角膜上皮幹細胞および／または角膜上皮細胞への分化誘導方法は、多能性幹細胞をストローマ細胞の存在下または羊膜由来因子の存在下において培養する工程含む分化誘導方法である。以下、本発明の分化誘導方法について詳述するが、この説明は後述する角膜上皮幹細胞及び／又は角膜上皮細胞の製造方法についても共通する。

本発明において、多能性幹細胞が角膜上皮幹細胞および／または角膜上皮細胞へと分化誘導される。本発明の分化誘導方法は、角膜上皮幹細胞および角膜上皮細胞への分化誘導方法、角膜上皮幹細胞の分化誘導方法、および角膜上皮細胞の分化誘導方法を包含する。好適には、角膜上皮幹細胞への分化誘導方法であるが、これに限定されるものではない。

ここで、角膜は、ヒトを含む多くの哺乳類の眼球に存在する、眼球壁の前面で外界に接する部分の外層を形成する膜であり、透明な皿状形態を有している膜である。角膜は、解剖学的に、外側から角膜上皮、角膜実質、および角膜内皮から主になることが知られている。

角膜上皮は、発生においては外胚葉性由来であり、表皮より分化すると考えられている。正常な角膜上皮は再生能を有することが知られており、角膜上皮の再生は、角膜上皮幹細胞が自己増殖および分化を繰り返すことにより達成される。すなわち、角膜上皮幹細胞は、娘細胞が自身と同じ特性を有する自己増殖能と、最終的に角膜上皮細胞へと分化する分化能を有する細胞である。角膜上皮幹細胞は、角膜上皮前駆細胞およびtransient amplifying cell（TA細胞）を経て、角膜上皮細胞へ分化すると考えられている。角膜上皮幹細胞は、正常な角膜において、角膜上皮と結膜との境界に位置する角膜輪部、特に輪部上皮基底部に存在する。一方で、Stevens-Johnson症候群、眼類天疱瘡、アルカリ腐食などの角膜上皮幹細胞疲弊症を発症した角膜においては、角膜上皮幹細胞は不可逆的な機能不全に陥っている、または消失している。

本発明で角膜上皮幹細胞および／または角膜上皮細胞へと分化誘導される多能性幹細胞は、分化多能性を有し、かつ、増殖能を有する細胞であれば、あらゆる多能性幹細胞を用いることができる。上記分化多能性は、外胚葉性の細胞、好ましくは表皮系の細胞、特に好ましくは角膜上皮細胞を含む細胞へと分化する能力を含むものである。

上記多能性幹細胞は、分化誘導される角膜上皮幹細胞および／または角膜上皮細胞の使用目的に応じて、角膜上皮幹細胞が存在する哺乳類（例えば、ヒト、マウス、サル、ウシ、イヌ、ネコ、ウサギ、ブタ、ヤギ等）に由来するものを適宜選択することができる。ヒト眼疾患の治療やヒト眼疾患の治療の分野における開発ツール等の目的で使用する場合には、上記多能性幹細胞はヒト由来のものが好適である。ヒト由来の多能性幹細胞は、あらゆる世代のヒト（乳児、幼児、少年、青年、成年、壮年、老年）に由来するものであってもよい。また、ヒトの性別は問わない。分化誘導される角膜上皮幹細胞および／または角膜上皮細胞をヒト眼疾患の治療目的で使用する場合は、眼疾患の患者から採取した細胞由来であることが好ましい。なお、患者から採取した細胞を用いる場合には、いわゆるインフォームドコンセントを行なうことが望ましい。

上記多能性幹細胞の好ましい具体例として、胚性幹細胞および誘導多能性幹細胞が例示されるが、これに限定されるものではない。

上記胚性幹細胞（ES細胞）は、初期胚の内部細胞塊由来の、実質的にあらゆる細胞への分化させることができる分化多能性および自己増殖能を有する幹細胞である。上記胚性幹細胞として、現在樹立されている、または今後新たに樹立されるあらゆる胚性幹細胞の株由来の細胞を用いることができる。なお、一般に、胚性幹細胞は、例えば、初期胚（例えば受精卵から胚盤胞の間の初期胚）を母胎から摘出し、初期胚の内部細胞塊をフィーダー細胞（例えば、マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ細胞、Mouse Embryonic Fibroblast））の存在下で培養することで作製できることが公知であるが、本発明に用いる胚性幹細胞の作製手法はこれに限定されるものではない。

上記誘導多能性幹細胞（iPS細胞）は、多能性幹細胞に誘導可能な再プログラム因子を体細胞に導入することで、分化多能性および自己増殖能を備えるに至った、体細胞由来の細胞である（例えば、特許文献１参照）。

上記誘導性多能性幹細胞を製造する方法としては、当業者に公知の手法及び今後確立されるであろう手法を広く用いることができる。すなわち、誘導多能性幹細胞は、体細胞に多能性幹細胞に誘導可能な再プログラム因子を体細胞に導入することで製造することができる。あるいは、本発明で用いる誘導多能性幹細胞として、既に樹立された誘導多能性幹細胞株を用いることができる。

上記体細胞を多能性幹細胞に誘導可能な再プログラム因子は、体細胞を初期化することが可能なものであれば特に制限されず、現在公知のものおよび今後開発されるものを広く用いることができる。

上記体細胞を多能性幹細胞に誘導可能な再プログラム因子の具体例としては、OCTファミリー、SOXファミリーおよびKLFファミリーの組み合わせ、OCTファミリー、SOXファミリー、KLFファミリーおよびMYCファミリーの組み合わせ、OCTファミリー、SOXファミリー、NANOGおよびLIN28の組み合わせなどが挙げられるが、これに限定されるものではない。

上記OCTファミリーとして、OCT3/4、OCT1AおよびOCT6からなる群から選択される少なくとも１つが挙げられるが、これに限定されない。上記SOXファミリーとして、SOX1、SOX2、SOX3、SOX7、SOX15、SOX17およびSOX18からなる群から選択される少なくとも１つ、好ましくは、SOX1および／またはSOX2が挙げられるが、これに限定されない。上記KLF4として、KLF1、KLF2、KLF4およびKLF5からなる群から選択される１以上、好ましくは、KLF2、KLF4およびKLF5からなる群から選択される少なくとも１つが挙げられるが、これに限定されない。上記MYCファミリーは、C-MYC、N-MYC、及びL-MYCからなる群から選択される少なくとも１つが挙げられるが、これに限定されない。

上記体細胞を多能性幹細胞に誘導可能な再プログラム因子としては、好適には広く知られたａ）ヒトにおいてはOCT3/4、SOX2およびKLF4の３因子の組み合わせ、または前記３因子にさらにC-MYCを加えた４因子の組み合わせ、ならびに、OCT3/4、SOX2、NANOGおよびLIN28の４因子の組み合わせ、ｂ）マウスにおいてはOct3/4、Sox2およびKlf4の３因子の組み合わせ、または前記３因子にさらにc-Mycを加えた４因子の組み合わせ、などを用いることができる。なお、OCT3/4、SOX2、KLF4およびC-MYC（Oct3/4、Sox2、Klf4およびc-Myc）の組み合わせは、「山中因子」としても知られている。

上記体細胞を多能性幹細胞に誘導可能な再プログラム因子は、体細胞を多能性幹細胞に誘導可能であることを限度として、遺伝子（核酸分子）又は遺伝子産物（タンパク質）のいずれであってもよいが、誘導多能性幹細胞の樹立効率を高めるという観点から、遺伝子（核酸分子）であることが好適である。なお、上記の具体的な誘導因子について塩基配列（遺伝子）およびアミノ酸配列（タンパク質）はいずれも当業者において公知である。当該塩基配列およびアミノ酸配列は、例えば、米国立生物工学情報センター（National Center for Biotechnology Information、NCBI）が公表するデータベースにおいて公開されている。

上記体細胞を多能性幹細胞に誘導可能な再プログラム因子は、再プログラム因子が導入される体細胞と、同種の生物由来であっても、異種の生物由来であってもよい。誘導多能性幹細胞の樹立効率を高めるという観点から、同種の生物由来であることが好ましい。

上記体細胞を多能性幹細胞に誘導可能な再プログラム因子を、初期化される体細胞に導入する方法は、当業者が適宜選択することができる。例えば、上記剤プログラム因子が遺伝子の場合には、上記再プログラム因子の体細胞への導入は、動物細胞のトランスフェクションにおいて通常使用される方法で行うことができる。具体的には、上記再プログラム因子を体細胞へ導入する方法として、ベクターを使用する方法；リン酸カルシウム法；リポフェクション法；エレクトロポレーション法；マイクロインジェクション法等が例示される。これらの中でも、導入効率の点から、ベクターを使用する方法が好ましい。ベクターを使用して上記再プログラム因子を体細胞に導入する場合には、ベクターとして、ウイルスベクター、非ウイルスベクター、人工ウイルス等を用いることができるが、レンチウイルス、アデノウイルス及びレトロウイルス等のウイルスベクターが、安全性の観点から好適に使用される。なお、ベクターを使用する場合、上記再プログラム因子は、各遺伝子が各々別のベクターに組み込まれていてもよく、１つのベクターに２種以上の遺伝子が組み込まれていてもよい。

上記誘導多能性幹細胞が由来する体細胞は、誘導多能性幹細胞が誘導される体細胞であればあらゆる体細胞を用いることができる。好ましくは、誘導多能性幹細胞が誘導される体細胞は、正常および腫瘍性のうち、正常な体細胞である。

上記誘導多能性幹細胞を得るために用いられる細胞は、特に制限されず、これまでにiPS細胞の製造が確認されている任意の細胞（例えば、線維芽細胞）及び今後報告される任意の細胞を含む。角膜上皮細胞への分化誘導の効率が特に高いとの観点からは、眼表面上皮由来の細胞に対して、多能性幹細胞に誘導可能な再プログラム因子を導入することにより得られる誘導多能性幹細胞を用いることが好ましい。眼表面上皮由来の細胞は、例えば、角膜輪部上皮、角膜上皮または結膜上皮から採取した約2 mm²程度の組織片より入手することができるが、これに限定されない。眼表面上皮由来の細胞は、上記の如く採取した組織片から得られる細胞、または当該細胞を適宜培養して得られる細胞であってもよい。

上記多能性幹細胞に誘導可能な再プログラム因子を導入された体細胞は、培養を行なうことで、誘導多能性幹細胞に誘導される。用いる培地、培養条件、培養期間は、当業者が幅広い範囲から適宜選択することができる。

誘導多能性幹細胞を製造する場合において、誘導多能性幹細胞が製造されたことは、当業者に公知の手法により確認することができる。例えば、簡便のためにSSEA3、SSEA4、E-Cadherin、Nanog、Oct3/4、Sox2などの胚性幹細胞マーカーが発現していることにより、誘導多能性幹細胞が製造されたことを確認することができるが、これに限定されるものではない。

上記培養工程において、多能性幹細胞を、ストローマ細胞の存在下または羊膜由来因子の存在下において培養する。

上記培養をストローマ細胞の存在下で行なう場合、その具体的手段は当業者が適宜選択することができる。例えば、ストローマ細胞の存在下での培養は、ストローマ細胞をフィーダー細胞として用いる方法とすることができる。具体的には、ストローマ細胞の存在下での培養は、ストローマ細胞が培養容器中でコンフルエント状態に達した状態において多能性幹細胞を培養する手段により行なうことができる。ここで、「コンフルエント状態」とは、当業者に公知の、細胞が培養容器の表面をほぼ前面に覆う細胞数にまで増殖した状態を指す。ストローマ細胞をフィーダー細胞として用いる場合、必要に応じて、マイトマイシンＣ（ＭＭＣ）処理、Ｘ線照射等の手段により、ストローマ細胞に細胞分裂の不活性化処理を行なうことができる。

上記ストローマ細胞は、本発明の目的を達成できる範囲内において、当業者が適宜選択することができる。ここで、ストローマ細胞とは、一般に組織（例えば、上皮および内皮）または臓器を取り囲んでいる支持細胞を指す。上記ストローマ細胞として、好適には、当業者においてＳＤＩＡ法（特許文献２および非特許文献３）として公知の手法により用いられるストローマ細胞を用いることができるが、これに限定されるものではない。

該ストローマ細胞の具体例として、マウス頭蓋冠由来ＭＣ３Ｔ３−Ｇ２／ＰＡ６細胞、Ｍ−ＣＳＦ欠損マウス頭蓋冠由来ＯＰ９細胞、およびマウス胎児由来ＮＩＨ／３Ｔ３細胞が例示されるが、これに限定されるものではない。上記ストローマ細胞は、１種または２種以上を組み合わせて使用することができる。好ましくは、上記ストローマ細胞は、マウス頭蓋冠由来ＭＣ３Ｔ３−Ｇ２／ＰＡ６細胞である。なお、上記細胞は、いずれも当業者において公知であり、当業者が容易に入手をすることができる。

ここで、ＳＤＩＡ法とは、胚性幹細胞を外胚葉細胞（神経幹細胞、神経細胞、神経堤の細胞又は神経官）に分化誘導する方法であり、特許文献２および非特許文献３により公知の方法である。ＳＤＩＡ法は胚性幹細胞をストローマ細胞の存在下で行なうことを特徴としており、胚性幹細胞において表皮細胞等への分化を抑制し、神経細胞等への分化誘導をするため方法であると考えられている。

上記羊膜由来因子の存在下での培養は、特許文献４に開示される方法に従って行なうことができる。上記羊膜由来因子の存在下での培養は、羊膜または羊膜に由来する加工物の存在下で培養することで達成することができるが、これに限定されるものではない。上記羊膜または羊膜に由来する加工物は、共培養する多能性幹細胞が由来する生物と、同一の生物由来であっても、異なる生物由来であってもよい。上記羊膜または羊膜に由来する加工物は、当業者が公知の手法に基づいて適宜取得することができる。

上記培養は、ストローマ細胞の存在下または羊膜由来因子の存在下において行なわれる。「存在下において培養」とは、ストローマ細胞または羊膜由来因子と、多能性幹細胞とが物質の行き来が可能な状態で培養されるものあれば、特に制限されるものではない。すなわち、ストローマ細胞の存在下で培養する場合には、ストローマ細胞と多能性幹細胞とが接触できる状態、または接触できない状態のいずれであってもよい。

上記培養は、ストローマ細胞の存在下または羊膜由来因子の存在下で行なわれるものであれば、多能性幹細胞の状態は特に限定されるものではなく、凝集状態（clump）であっても非凝集状態のいずれであってもよい。多能性幹細胞が誘導多能性幹細胞や胚性幹細胞である場合には、誘導多能性幹細胞の培養を凝集状態で行なうことが好ましいが、これに限定されるものではない。

ここで、「凝集状態」とは、培養される多能性幹細胞を酵素処理等により完全に分散状態にするのではなく、細胞同士の接着が存在する状態（clump状態）で培養を開始し、細胞同士の接着が存在する状態で培養を継続することを指す。細胞を凝集状態にする手段については当業者において公知であり、当該公知の手段より当業者が適宜選択することができる。一般に、多能性幹細胞のclump状態には、約50〜10000程度の多能性幹細胞が含まれるが、これに限定されるものではない。尚、「凝集状態」には、「embryoid bodies」が包含される。

上記培養において、多能性幹細胞とストローマ細胞もしくは羊膜由来因子との存在比は、特に限定されるものではなく、当業者が適宜設定することができる。上記培養をストローマ細胞の存在下で培養を行なう場合、多能性幹細胞とストローマ細胞の存在比は、コンフルエントに達したストローマ細胞の層3.8 cm²に対して、好ましくは約1〜150 clumps程度、より好ましくは約15〜40 clumps程度でとすることができる。なお、3.8 cm²とは、通常培養容器として用いられる12穴培養容器（12 well plate）の１ wellあたりの面積である。

上記培養は、角膜上皮幹細胞および／または角膜上皮細胞への分化誘導が達成される期間にわたって行なう。培養期間は、使用する多能性幹細胞の種類等によって異なり得、当業者が適宜設定でき特に限定されるものではない。例えば、後述する角膜上皮幹細胞及び／又は角膜上皮細胞に特異的なマーカー遺伝子の発現が観られるまで、培養することが出来る。十分な分化誘導が達成されるとの観点からは、例えば、約６週間以上、好ましくは約８週間以上、特に好ましくは約１２週間以上培養を行なうことが好ましい。例えば、培養期間を約６〜２０週間程度、好ましくは約８〜１６週間程度、より好ましくは約８〜１４週間程度とすることができる。

本発明の培養工程では、無血清培地を用いることが好ましい。無血清培地については、公知のものおよび今後新たに開発されるものの中から、哺乳類の細胞が培養することができる血清を実質的に含まない培地より、当業者が適宜選択することができる。例えば、グラスゴー最小必須培地（Glasgow Minimum Essential Medium, G-MEM）、ダルベッコ変法イーグル培地（Dulbecco's Modified Eagle Medium, D-MEM）などが上記無血清培地として例示されるが、これに限定されるものではない。上記無血清培地には、約5〜20 ％程度、好ましくは約10 %程度のKnockout Serum Replacement（KSR、商品名、Invitogen社）；約0.5〜 5 mM程度、好ましくは約2 mM程度のL-Glutamine；約0.5〜5 ％程度、好ましくは約1 %程度のピルビン酸（sodium pyruvate, Gibco社）、約0.5〜5 ％程度、好ましくは約1 %程度の非必須アミノ酸溶液（nonessential amino acids、Gibco社）；約0〜1％程度、好ましくは約0.1 %程度の2−メルカプトエタノール（2-mercaptoethanol）などの添加物を含ませることができる。

常法に従い、上記無血清培地は定期的に交換することが好ましい。無血清培地の交換は、当業者において公知の手法により行なうことができる。無血清培地の交換に際して、交換の前後で用いる無血清培地は、組成が同じものを用いることも、組成が異なるものを用いることもできる。交換と交換との間の期間、および交換を行なう頻度は、当業者が適宜設定することができる。好ましくは、培地交換は、約１〜３日程度に一度、より好ましくは約２日程度に一度の頻度で行なう。ストローマ細胞をフィーダー細胞として用いる場合、通常はフィーダー細胞を交換しないが、これに限定されるものではない。

上記無血清培地は、少なくとも培養開始から培養開始後約１〜２週間程度目（例えば、約２週間目程度）までの間は、ＢＭＰ４を実質的に含まないものであることが好ましい。ＢＭＰ４（Bone Morphorogenic Protein 4）は、公知のタンパク質である。本発明以前に、ＢＭＰ４は、外胚葉性細胞の神経分化を抑制し、上皮細胞（表皮・角膜上皮等）へと分化誘導する作用を有すると考えられていた。上記無血清培地は、少なくとも培養工程の開始から約１〜２週間程度は、ＢＭＰ４を実質的に含まないものであることが特に好ましい。ここで、「ＢＭＰ４を実質的に含まない」とは、培地中のＢＭＰ４含有量が、本発明の分化誘導方法の効果に影響を及ぼさない程度未満の量であればよく、例えば、0.5nM未満、より好ましくは0.1nM未満、更に好ましくは0.05nM未満であり、別の観点からは、意図的に含有させないものであることが好ましい。簡便には、ＢＭＰ４を含まない培地として販売される市販の培地試薬、およびこれを複数組み合わせたものを、ＢＭＰ４を実質的に含まない無血清培地として用いることができる。

上記無血清培地は、レチノイン酸を実質的に含まないものとすることができるが、これに限定されるものではない。

上記培養は、例えば上記の無血清培地を用いて、当業者に公知の手法で行なうことができる。好適な培養を行なう手法として、約37℃程度および二酸化炭素濃度約5％程度の条件下で培養する手法が例示されるが、これに限定されるものではない。上記条件での培養は、例えば公知のCO₂インキュベータを用いて行なうことができる。

かくして、角膜上皮幹細胞および／または角膜上皮細胞への分化誘導方法が達成される。なお、本発明により分化誘導方法される角膜上皮幹細胞は、角膜上皮前駆細胞を含んでもよい。

角膜上皮幹細胞および／または角膜上皮細胞が分化誘導されたことは、当業者に公知の手段により検証することができる。上記検証を行なうための具体的な手法としては、例えば、上記培養中の細胞の一部を定期的（例えば、２週間ごと）に採取し、定量的RT-PCR法によりマーカー遺伝子（例えば、眼組織特異的に発現するpax6遺伝子、分化した角膜上皮特異的に発現するK12（ケラチン12）遺伝子）など）の発現を検出することが挙げられる。この場合、マーカー遺伝子の発現が確認できることを、角膜上皮幹細胞および／または角膜上皮細胞が分化誘導されたことの指標とすることができる。

２．製造方法
本発明の角膜上皮幹細胞および／または角膜上皮細胞の製造方法は、下記の工程を含む：
（１）多能性幹細胞を培養する工程、および
（２）前記培養した細胞から、角膜上皮幹細胞および／または角膜上皮細胞を選択する工程。

以下、本発明の製造方法について詳述する。

工程（１）の多能性幹細胞を培養する工程は、上記「１．分化誘導方法」欄に記載の多能性幹細胞を培養する工程である。即ち、ストローマ細胞の存在下または羊膜由来因子の存在下において多能性肝細胞を培養する工程である。工程（１）は、例えば、培養される多能性幹細胞において、角膜上皮幹細胞及び／又は角膜上皮細胞に特異的なマーカーが発現されるまで継続することができる。

次いで、工程（２）において、工程（１）で培養した細胞（集団）から、角膜上皮幹細胞および／または角膜上皮細胞を選択する。角膜上皮幹細胞および／または角膜上皮細胞を選択する手段は、当業者が適宜設定することができる。

例えば、角膜上皮幹細胞を選択する場合、選択手段の一態様として、工程（１）で培養した細胞（集団）から、自己増殖能及び／又は角膜上皮幹細胞特異的マーカーの発現を指標として選択することを挙げることができる。より具体的には、自己増殖能を有する細胞を選択する工程および、角膜上皮幹細胞特異的マーカーを発現している細胞を選択する工程を行なうことにより角膜上皮幹細胞を選択することができるが、これに限定されるものではない。なお、自己増殖能を有する細胞を選択する工程と、角膜上皮幹細胞特異的マーカーを発現している細胞を選択する工程とは、その行なう順序は限定されるものではなく、いずれを先に行なっても角膜上皮幹細胞を選択することができる。

細胞が増殖能を有することの評価については、当業者に公知の手法により行なうことができる。例えば、細胞を培養系へと播種し継代培養を行い、細胞が増殖することにより確認することができるが、これに限定されない。細胞が増殖することは、継代培養でコロニーを形成することにより確認することができる。好ましくは、コロニーを形成することを確認するための継代培養は、フィーダー細胞（例えば、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞など）との共培養系で行なうこと、または、上皮幹細胞用の培地で行なうことができるが、これに限定されるものではない。

上記継代培養を行なうための培地は、角膜上皮幹細胞を培養できる培地（例えば、当業者において公知のkeratinocyte-conditioned medium（KCM培地）、keratinocyte serum-free medium（KSFM培地、Invitrogen社等から購入可能）、CnT-20培地（CELLnTEC社）、CnT-50培地（CELLnTEC社）など）である限り、特に限定されるものではない。

上記継代培養において、例えば12 well plateを用いる場合は、再播種密度は2000〜16000 cells/well程度とすることが好ましい。

上記増殖能は、自己複製能であることが好ましい。細胞が自己増殖能を有することの評価については、これに限定されるものではないが、例えば、細胞が増殖能を有することに加えて、増殖後の細胞が有する特質が継代培養によって変化しないことを指標とすることができる。増殖後の細胞が有する特質については、後述の角膜上皮幹細胞マーカーによって好適に確認することができるが、これに限定されるものではない。

細胞が角膜上皮幹細胞特異的マーカーを発現していることの評価については、当業者に公知の手法により行なうことができる。角膜上皮幹細胞マーカーとしては、例えば重層上皮幹細胞（および前駆細胞）の特異的マーカーであるK14（ケラチン14）タンパク質および／またはp63タンパク質および／またはN-cadherinタンパク質などが例示されるが、これに限定されるものではない。加えて、眼組織特異的マーカー（例えば、pax6タンパク質）および／または角膜上皮特異的分化マーカー（例えば、K12（ケラチン12）タンパク質）をも検出することができる。また、角膜上皮特異的分化マーカー（K12）を検出した後に、角膜上皮幹細胞に特異的に発現している細胞表面マーカー（例えば、Integrin alpha 6、N-cadherinなど）を検出することもできる。

角膜上皮幹細胞マーカーを発現していることの具体的な検出方法は公知であるが、例えば、免疫細胞化学による検出が好適である。より詳細には、抗体染色法を用いた顕微鏡観察による検出、セルソーター（フローサイトメーター）による細胞表面マーカーの検出などが例示される。あるいは、分化誘導を行なう多能性幹細胞に上記角膜上皮幹細胞マーカーのレポーター遺伝子（例えば、角膜上皮幹細胞マーカーをコードする遺伝子のプロモーター領域と、緑色蛍光タンパク質（GFP）等の蛍光タンパク質とを連結したレポーター遺伝子）を導入し、分化誘導後にレポーター遺伝子の発現を検出してもよい。

また、角膜上皮細胞を選択する場合、角膜上皮細胞マーカーを発現している細胞を選択する工程を挙げることができる。角膜上皮細胞マーカーとしては、眼組織特異的マーカー（例えば、pax6タンパク質）、角膜上皮特異的分化マーカー（例えば、K12（ケラチン12）タンパク質）などが挙げられるが、これに限定されるものではない。角膜上皮細胞マーカーの発現を検出する手段としては、例えば、分化誘導を行なう多能性幹細胞に上記角膜上皮細胞マーカーのレポーター遺伝子（例えば、角膜上皮細胞マーカーをコードする遺伝子のプロモーター領域と、緑色蛍光タンパク質（GFP）等の蛍光タンパク質とを連結したレポーター遺伝子）を導入し、分化誘導後にレポーター遺伝子の発現を検出する手段が例示される。

角膜上皮幹細胞を選択する場合、上記工程（２）の具体的態様として、下記（ａ）および（ｂ）の態様が例示されるが、これに限定されるものではない：
（ａ）工程（１）の分化誘導後、角膜上皮幹細胞マーカーを発現する細胞を確認し、その後、細胞を酵素処理等により回収し、角膜上皮幹細胞を選択的に培養することができる系（例えば、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞をフィーダー細胞とした共培養系など）に再播種し、コロニーが形成されることを指標として増殖する細胞を選択することで、角膜上皮幹細胞を純化する。
（ｂ）工程（１）の分化誘導後、角膜上皮特異的マーカーを発現する細胞を確認し、その後、セルソーター等を用いて角膜上皮幹細胞に特異的に発現している細胞表面マーカーを発現する細胞を選択することで、角膜上皮幹細胞を純化する。

かくして、角膜上皮幹細胞および／または角膜上皮細胞が製造される。なお、本発明の製造方法により得られる角膜上皮幹細胞は、角膜上皮前駆細胞を含んでもよい。

３．角膜上皮細胞シート
本発明の角膜上皮細胞シートは、上記「２．製造方法」欄に記載の方法により得られる角膜上皮幹細胞および／または角膜上皮細胞に由来する、角膜上皮細胞シートである。上記角膜上皮細胞シートは、角膜上皮細胞シートの重層化シートであってもよい。

角膜上皮細胞シートの製造手段については、当業者が公知の手法および今後開発される手法より適宜選択することができる。例えば、特許文献３もしくは４、または非特許文献１もしくは２などに開示される下記の方法を用いることができる。

角膜上皮細胞シートの製造手段の具体例としては、特に限定されるものではないが、上記角膜上皮幹細胞を、フィーダー細胞の存在下で、温度応答性培養皿もしくはキャリア上で培養を行なう工程、および前記工程により得られる細胞シートを回収する工程を含む手段が挙げられる。

上記培養工程で用いるフィーダー細胞としては、例えば、Mitomycin C（MMC）処理したＮＩＨ／３Ｔ３細胞を使用することができるが、これに限定されるものではない。

上記培養工程で用いる温度応答性培養皿は、温度を変化（好ましくは下げる）ことにより、細胞シートを剥離することができる培養皿であれば特に限定されるものではない。具体的には、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）などの温度応答性高分子を被覆した培養皿が例示される。簡便のために、市販される温度応答性培養皿を用いてもよい。

上記キャリアとしては、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン（好ましくは、コラーゲン）などの細胞外マトリックスが例示されるが、これに限定されるものではない。

上記培養工程を行なう条件は、当業者が適宜設定することができる。例えば、約37℃程度および二酸化炭素濃度約5％程度の条件下で培養することができるがこれに限定さえるものではない。培養期間は、約２週間程度とすることができる。

上記回収は、培養を温度応答性培養皿上で行なった場合は、温度を下げて、形成された細胞シートを温度応答性培養皿から剥離することにより行なうことができる。培養をキャリア上で行なった場合は、形成されたシートをキャリアと共に回収することができる。

上記角膜上皮細胞シートは、Stevens-Johnson症候群、眼類天疱瘡、アルカリ腐食などの難治性の眼疾患の治療などに、好適に使用することができる。

４．角膜上皮幹細胞及び角膜上皮細胞へ効率的に分化する誘導多能性幹細胞
眼表面上皮由来の細胞に対して、多能性幹細胞に誘導可能な再プログラム因子を導入することにより得られる誘導多能性幹細胞は、線維芽細胞などに再プログラム因子を導入して得られる誘導多能性幹細胞と比較して、より早く、より効率良く角膜上皮細胞及び／又は角膜上皮細胞に分化誘導され得るため有益である。

上記眼表面上皮由来の細胞は、前述の「１．分化誘導方法」欄に記載の眼表面上皮由来の細胞を用いる。具体的には、例えば、角膜輪部上皮、角膜上皮または結膜上皮から採取した約2mm²程度の組織片より入手することができる眼表面上皮由来の細胞が例示されるが、これに限定されない。眼表面上皮由来の細胞は、上記の如く採取した組織片から得られる細胞、または当該細胞を適宜培養して得られる細胞であってもよい。

上記多能性幹細胞に誘導可能な再プログラム因子は、前述の「１．分化誘導方法」欄に記載の多能性幹細胞に誘導可能な再プログラム因子を好適に用いることができる。また、当該多能性幹細胞に誘導可能な再プログラム因子を、眼表面上皮由来の細胞へ導入する手段についても、前述の「１．分化誘導方法」欄に記載の細胞へ導入する手段を好適に用いることができる。

本発明の誘導多能性幹細胞は、後述の実施例で示すように、角膜上皮幹細胞へと分化誘導される高い指向性を有する。ここで「角膜上皮幹細胞へと分化誘導される高い指向性」として、例えば、角膜上皮特異的マーカーのケラチン１２（Ｋ１２）の発現指向性を用いることができる。角膜上皮幹細胞へと分化誘導される高い指向性がＫ１２の発現指向性である場合、分化誘導開始後早い段階でK12を高発現する。従って、本発明の誘導多能性幹細胞は、角膜上皮幹細胞への分化誘導に好適に用いることができる。

５．細胞材料
前述の通り、本発明の誘導多能性幹細胞は角膜上皮幹細胞へと分化誘導される高い指向性を有する。従って、本発明は、前述「４．誘導多能性幹細胞」欄に記載の誘導多能性幹細胞を含む、角膜上皮幹細胞への分化誘導のための細胞材料をも提供する。

上記細胞材料は、角膜上皮幹細胞への分化誘導およびその製造に好適に使用することができる。さらに、得られた角膜上皮細胞は、さらに、角膜上皮細胞シートの製造に用いること、創薬ツールとして用いることなどができるが、これに限定されない。

以下に、実施例等に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。

（Ｉ）眼表皮細胞由来のiPS細胞の製造
研究用の輸入強角膜片より、ヒト由来角膜内皮細胞、周辺の結合組織等を取り除いた上で、ディスパーゼ処理により眼表面の角結膜上皮層のみを単離した。得られた上皮細胞をトリプシン処理により単一細胞として、NIH/3T3細胞の培養上清と新鮮KCM培地との１：１混合培地中で培養した。

次いで、増殖させた眼表面由来の上皮細胞にヒトOct3/4、Sox2、Klf4およびc-Myc（山中4因子）をそれぞれ搭載したレンチウイルスベクターを感染させた。感染後２〜４日後に細胞をiPS細胞の培養系（iPS培地中でMEFフィーダー上）に再播種し、約３〜６週間培養を行なった。外因性の山中4因子の消失を確認し、SSE4抗体で陽性であったコロニーをピックアップし、iPS細胞株を樹立した（B31、B34、B41、C51およびD43；計５株）。樹立したiPS細胞株および既存のiPS細胞株253G1の位相差顕微鏡像を図１（ａ）に示す。今回
樹立したいずれのヒトiPS細胞株も公知の繊維芽細胞由来ヒトiPS細胞株と同様にMEFフィーダー細胞上で、多能性幹細胞に特徴的な敷石状のコロニーを形成した。

製造したiPS細胞株の１つであるB41株について、ES細胞マーカーであるE-cadherin（H-108 ウサギポリクローナル抗体、SantaCruz社、50倍希釈）、Nanog（R&D社、ヤギポリークローナル抗体、100倍希釈）、Oct3/4（R&D社、ヤギポリークローナル抗体、100倍希釈）およびSox2（245610、マウスモノクローナル抗体、R&D社、100倍希釈）について、発現を免疫染色により検証した。2次抗体は各一次抗体の動物種に対応したAlexa568抗体（Invitrogen社、200倍希釈）を用いた。最後に核をHoechest 33342により染色した。免疫染色像を図１（ｂ）に示す。製造したiPS細胞は４種のES細胞マーカーであるE-cadherin、Nanog、Oct3/4およびSox2のいずれをも発現していることが確認された。すなわち、iPS細胞への誘導が正常に行なわれたと考えられる。

また、製造したiPS細胞４株（B34、B41、C51およびD43）の核型を、常法に従い検証した。核型分析の結果を図２（ａ）に示す。検証したヒトiPS細胞４株のいずれも、50細胞中50細胞において核型は46, XX[20]であり、正常なヒトの核型を有することが確認された。

さらに常法により、得られたiPS細胞について奇形腫形成試験を行なった。結果を図２（ｂ）に示す。奇形腫において、外胚葉（網膜色素上皮、表皮および神経）、中胚葉および内胚葉が確認された。

（ＩＩ）角膜上皮細胞および角膜上皮幹細胞への分化誘導
上記（Ｉ）で製造したiPS細胞（Ｂ41株）、および公知のヒト線維芽細胞由来253G1株および201B7株について、MC3T3-G2/PA6細胞（PA6細胞）をフィーダーとして培養を行なった。
（１）上記３種のヒトiPS細胞それぞれについて、MEF（mouse embryonic fibroblast）フィーダー細胞上にて下記培地中を用いて継代培養を行なった。
ヒトiPS用培地
DMEM/F12 （Invitrogen）
25% KSR （Invitrogen）
2mM L-Glutamine （Invitrogen）
1% nonessential amino acids （Invitrogen, 100x）
0.1% 2-mercaptoethanol (Invitrogen 1000x)。

培養後、各ヒトiPS細胞について、解離液を加えてclump（細胞塊）として回収した。

（２）回収したclumpを0.1%ゼラチン溶液でコーティングした培養皿上に播種し、37℃で４５分間インキュベートすることで、MEFを除去した。これは、MEFの方が先に培養皿に接着し、ヒトiPS細胞は接着性が低いため上清にとどまることによると考えられる。

（３）ヒトiPS細胞のclumpを回収し、マウス頭蓋冠由来MC3T3-G2/PA6細胞（PA6細胞）をフィーダーとして播種した12 well plateに20〜40 clumps/wellの密度となるように播種した。培地は、下記の組成のものを用いた。各iPS細胞について、温度37℃および二酸化炭素濃度5% の条件下で培養をした。
角膜誘導培地
G-MEM （Invitrogen）
10% KSR（Invitrogen)
2mM L-Glutamine （Invitrogen）
1% Pyruvate （Invitrogen, 100x）
1% nonessential amino acids （Invitrogen, 100x）
0.1% 2-mercaptoethanol （Invitrogen, 1000x）。

（４）分化誘導は12-15週間実施した。2週ごとに細胞を回収し、眼組織特異的マーカーpax6および角膜上皮特異的マーカーK12の発現をreal-time PCR法により解析した。また、B41株について、培地に終濃度が0.5 nM となるようにBMP4を添加した以外は同様の条件でも培養を行ない、pax6およびK12の発現をreal-time PCR法により解析した。結果を図３に示す。

B41株においては、眼組織特異的マーカーpax6の発現が誘導され、さらに誘導後６〜８週後において成熟角膜上皮特異的マーカーK12発現の上昇が認められた。一方で、繊維芽細胞由来株である201B7株および253G1株では眼組織特異的マーカーpax6発現は概ねB41株と同様に認められ、K12発現は、B41株よりも4週間程遅れた第８週目から認められた。また、B41株に誘導初期（2週間）にBMP4を添加した場合は、pax6の発現およびK12の発現は確認されなかった。

なお、real-time PCR法による発現量は、標準遺伝子GAPDHの発現量に対する相対量として求めた。各遺伝子の発現量の検出には、市販のTaqMan Gene Expression Assays（Applied Biosystem社）をプローブとして用いた。
用いたプローブは、下記の通りである：
＜TaqManプローブ＞
Pax6: Hs00240871_m1
K12: Hs00165015_m1
GAPDH: Hs99999905_m1。

（５）また、分化誘導後のB41株に由来する細胞を固定し、pax6とK12およびK14とK12の共局在を免疫染色により確認した。染色像を図４に示す。分化誘導後のいくつかのコロニーにおいて角膜上皮特異的マーカーK12陽性であり、かつ、眼組織特異的マーカーpax6陽性の細胞集団が認められた（図４a）。また、上皮前駆細胞マーカーであるK14と角膜上皮特異的マーカーであるK12とは、一部の細胞では共局在しており、一部の細胞では個別に存在していることが明らかとなった（図４b）。これらの発現パターンは、生体における角膜上皮・輪部上皮の場合と同様である。

線維芽細胞由来の253G1株についても、より長期間の分化誘導（約10週間以上）の後、B41株と同様に、p63、K12、及びK14の発現及び共局在を調べたところ、一部の細胞では共局在しており、一部の細胞では個別に存在していることが確認された（図４ｃ）。一方で、培養初期にBMP4を添加して分化誘導を行ったB41株及び253G1株では、K12、K14、及びpax6のいずれも発現している細胞は確認されなかった（図４ｄ及び図４e）。これは、0.5nMのBMP4の添加によって、角膜上皮への誘導が抑制されたことを示す。

（６）分化誘導後８〜１２週間目のiPS細胞（B41株）をトリプシン処理により回収し、フィーダー細胞のNIH/3T3細胞との共培養系（上皮幹細胞培養系）に播種した。再播種密度はや8000 cells/well (12 well plate)程度とした。再播種後の培地は下記のものを用いた：
KCM培地組成
69% Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM) （Sigma-Aldrich）
23% Nutrient Mixture F-12 Ham （Sigma-Aldrich）
5% Fetus Bovine Serum(FBS) （Japan Bio Serum）
1% Penicillin-Streptomycin （Invitrogen,100x）
0.4 μg/ml Hydrocortisone Succinate （Wako）
2 nM 3,3',5-Triiodo-L-thyronine sodium salt （MP BIOMEDICALS）
100 nM Cholera Toxin （Calbiochem）
2mM L-Glutamine （Invitrogen）
0.5% Insuline Transferrin Selenium （GIBCO, 200x）
10 ng/ml Recombinant Human EGF （R&D Systems）。

2〜3週間培養の後、細胞を固定し、pax6、K12、p63、およびK14発現を免疫染色により確認した。

位相差像および染色像を図５に示す。得られたB41株由来のコロニーは上皮細胞特有の敷石状形態を示し、角膜上皮前駆細胞マーカーであるK14およびpax6を発現していた（図５（ａ））。さらに、同様に角膜上皮前駆細胞マーカーであるp63およびK14の発現も認められた（図５（ｂ））。

Claims

多能性幹細胞をストローマ細胞または羊膜由来因子の存在下において、少なくとも培養開始から培養開始後１〜２週間の間、ＢＭＰ４を実質的に含まない無血清培地中で培養する工程を含む、多能性幹細胞の角膜上皮幹細胞および／または角膜上皮細胞への分化誘導方法。
前記多能性幹細胞が、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）または誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）である、請求項１に記載の分化誘導方法。
前記誘導多能性幹細胞が、眼表面上皮由来の細胞に、多能性幹細胞に誘導可能な再プログラム因子を導入することにより得られる誘導多能性幹細胞である、請求項２に記載の分化誘導方法。
下記の工程を含む、角膜上皮幹細胞および／または角膜上皮細胞の製造方法：
（１）多能性幹細胞をストローマ細胞又は羊膜由来因子の存在下で少なくとも培養開始から培養開始後１〜２週間の間、ＢＭＰ４を実質的に含まない無血清培地中で培養する工程、および
（２）前記培養した細胞から、角膜上皮幹細胞および／または角膜上皮細胞を選択する工程。
前記角膜上皮幹細胞を選択する工程が、増殖能を有し、かつ、角膜上皮幹細胞特異的マーカーを発現している細胞を選択する工程である、請求項４に記載の製造方法。