KR102210180B1

KR102210180B1 - 모양체 주연부형 구조체의 제조 방법

Info

Publication number: KR102210180B1
Application number: KR1020157000463A
Authority: KR
Inventors: 도쿠시게 나카노; 사토시 안도; 요시키 사사이; 모토츠구 에이라쿠
Original assignee: 스미또모 가가꾸 가부시끼가이샤; 고쿠리쓰 겐큐 가이하쓰 호징 리가가쿠 겐큐소
Priority date: 2012-06-08
Filing date: 2013-06-07
Publication date: 2021-01-29
Also published as: US20150132787A1; US10077425B2; CN104508125B; CA2876047A1; WO2013183774A1; US11542471B2; EP3842524A1; US20180371409A1; EP2860245A4; AU2019229463A1; CA3134317A1; JPWO2013183774A1; JP6393614B2; EP2860245B1; CA2876047C; KR20150021567A; AU2013272548A1; EP2860245A1; CN104508125A; AU2013272548B2

Abstract

본 발명은, 망막 조직을 포함하는 세포 응집체이고, 상기 망막 조직에 있어서의 Chx10 양성 세포의 존재 비율이 20 ％ 이상인 세포 응집체를, 각각 Wnt 시그널 경로 작용 물질을 함유하는 무혈청 배지 또는 혈청 배지 중에서, RPE65 유전자를 발현하는 세포가 출현하기 이전까지의 기간 중에 한하여 배양한 후, 얻어진 "RPE65 유전자를 발현하는 세포가 출현하고 있지 않은 세포 응집체" 를, 각각 Wnt 시그널 경로 작용 물질을 함유하지 않는 무혈청 배지 또는 혈청 배지 중에서 배양하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 모양체 주연부형 구조체를 포함하는 세포 응집체의 제조 방법 등을 제공한다. 본 발명에 의해 모양체 주연부형 구조체를 고효율로 제조하는 것이 가능해진다.

Description

모양체 주연부형 구조체의 제조 방법{METHOD FOR PRODUCING CILIARY MARGINAL ZONE-LIKE STRUCTURE}

본 발명은, 모양체 주연부형 구조체의 제조 방법 등에 관한 것이다.

생체 망막의 모양체 (毛樣體) 주연부 (Ciliary Marginal Zone) 는 망막 조직의 구조 형성이나 유지에 중요한 기능을 하고 있는 것으로 알려져 있고 (예를 들어, 비특허문헌 1 참조), 모양체 주연부의 유전자 마커로서 예를 들어 Rdh10 유전자 (비특허문헌 2) 및 Otx1 유전자 (비특허문헌 1) 가 알려져 있다. 그러나, 이와 같은 모양체 주연부형 구조체를 다능성 간세포 (pluripotent stem cell)로부터 고효율로 제조하는 방법은 알려지지 않았다.

W. Zac Stephens, Megan Senecal, Minhtu Nguyen, and Tatjana Piotrowski (2010) Loss of adenomatous polyposis coli (apc) Results in an Expanded Ciliary Marginal Zone in the Zebrafish Eye. DEVELOPMENTAL DYNAMICS Volume : 239, Pages : 2066-2077 Fumi Kubo and Shinichi Nakagawa (2009) Hairy1 acts as a node downstream of Wnt signaling to maintain retinal stem cell-like progenitor cells in the chick ciliary marginal zone. Development Volume : 136, Pages : 1823-1833

모양체 주연부형 구조체를 고효율로 제조하는 방법의 개발이 갈망되고 있었다.

본 발명자들은 이와 같은 상황을 감안하여 예의 검토한 결과, 본 발명에 이르렀다.

즉, 본 발명은,

1. 망막 조직을 포함하는 세포 응집체이고, 상기 조직에 있어서의 Chx10 양성 세포의 존재 비율이 20 ％ 이상인 세포 응집체를, 각각 Wnt 시그널 경로 작용 물질을 함유하는 무혈청 배지 또는 혈청 배지 중에서, RPE65 유전자를 발현하는 세포가 출현하기 이전까지의 기간 중에 한하여 배양한 후, 얻어진 "RPE65 유전자를 발현하는 세포가 출현하고 있지 않은 세포 응집체" 를, 각각 Wnt 시그널 경로 작용 물질을 함유하지 않는 무혈청 배지 또는 혈청 배지 중에서 배양하는 공정을 포함하는, 모양체 주연부형 구조체를 포함하는 세포 응집체의 제조 방법 (이하, 본 발명 제조 방법이라고 기재하는 경우도 있다) ;

2. RPE65 유전자를 발현하는 세포가 출현하기 이전까지의 기간이, 상기 망막 조직에 있어서의 Chx10 양성 세포의 존재 비율이 조직의 50 ％ 내지 1 ％ 의 범위 내인 기간이고, 또한 RPE65 유전자를 발현하는 세포가 출현하고 있지 않은 세포 응집체가, 상기 망막 조직에 있어서의 Chx10 양성 세포의 존재 비율이 조직의 50 ％ 내지 1 ％ 의 범위 내인 세포 응집체인, 전항 1 에 기재된 제조 방법 ;

3. 얻어진 "RPE65 유전자를 발현하는 세포가 출현하고 있지 않은 세포 응집체" 를, 상기 망막 조직에 있어서의 Chx10 양성 세포의 존재 비율이 조직의 50 ％ 이상에 이를 때까지, 각각 Wnt 시그널 경로 작용 물질을 함유하지 않는 무혈청 배지 또는 혈청 배지 중에서 배양하는, 전항 2 에 기재된 제조 방법 ;

4. 상기 망막 조직이 인간 다능성 간세포 유래인 전항 1 내지 3 중 어느 하나에 기재된 제조 방법 ;

5. 전항 1 내지 4 중 어느 하나에 기재된 제조 방법에 의해 제조되는 모양체 주연부형 구조체를 포함하는 세포 응집체의 독성 또는 약물 효능 평가용 시약으로서의 용도 ;

6. 전항 1 내지 4 중 어느 하나에 기재된 제조 방법에 의해 제조되는 모양체 주연부형 구조체를 포함하는 세포 응집체의 이식용 생체 재료로서의 용도 ;

등을 제공하는 것이다.

본 발명 제조 방법에 의하면, 모양체 주연부형 구조체를 고효율로 제조하는 것이 가능해진다. 본 발명 제조 방법에 의해 제조된 모양체 주연부형 구조체를 포함하는 세포 응집체에 있어서, 모양체 주연부형 구조체는 progress zone 으로서 기능하고, 당해 모양체 주연부형 구조체에 근접하여, 층 구조를 갖고 연속된 신경 망막이 고빈도로 형성될 수 있다.

도 1 은 Wnt 시그널 경로 작용 물질을 함유하는 무혈청 배지에서 부유 배양 (suspension culture) 하기 전의 세포 응집체의 동결 절편에 있어서의 Rax 유전자 발현 세포의 GFP 형광상을 나타내는 도면이다.
도 2 는 Wnt 시그널 경로 작용 물질을 함유하는 무혈청 배지에서 부유 배양하기 전의 세포 응집체의 동결 절편에 있어서의 항 Chx10 항체를 사용한 형광 면역 염색상을 나타내는 도면이다. 도 1 (망막 조직 세포의 전체의 존재를 나타내는 도면) 과 도 2 (Chx10 양성 세포의 존재를 나타내는 도면) 를 비교하면, Wnt 시그널 경로 작용 물질을 첨가하기 전에는 Chx10 양성 세포가 전체의 40 ％ 정도 존재 하고 있는 것을 확인할 수 있다.
도 3 은 Wnt 시그널 경로 작용 물질을 함유하는 무혈청 배지 중에서 부유 배양 후 3 일째의 세포 응집체의 동결 절편에 있어서의 Rax 유전자 발현 세포의 GFP 형광상을 나타내는 도면이다.
도 4 는 Wnt 시그널 경로 작용 물질을 함유하는 무혈청 배지 중에서 부유 배양 후 3 일째의 세포 응집체의 동결 절편에 있어서의 항 Chx10 항체를 사용한 형광 면역 염색상을 나타내는 도면이다. 도 3 (망막 조직 세포의 전체의 존재를 나타내는 도면) 과 도 4 (Chx10 양성 세포의 존재를 나타내는 도면) 를 비교하면, Wnt 시그널 경로 작용 물질을 배지에 첨가하여 3 일 후면, Chx10 양성 세포가 전체의 3 ％ 정도 밖에 존재하지 않고, 분명하게 감소하고 있는 것을 확인할 수 있다.
도 5 는 Wnt 시그널 경로 작용 물질을 함유하는 무혈청 배지 중에서 3 일간 부유 배양한 후, Wnt 시그널 경로 작용 물질을 함유하지 않는 혈청 배지 중에서 39 일간 부유 배양한 세포 응집체의 동결 절편에 있어서의 Rax 유전자 발현 세포의 GFP 형광상을 나타내는 도면이다.
도 6 은 Wnt 시그널 경로 작용 물질을 함유하는 무혈청 배지 중에서 3 일간 부유 배양한 후, Wnt 시그널 경로 작용 물질을 함유하지 않는 혈청 배지 중에서 39 일간 부유 배양한 세포 응집체의 동결 절편에 있어서의 항 Rdh10 항체를 사용한 형광 면역 염색상을 나타내는 도면이다. 도 5 (망막 조직 세포의 전체의 존재를 나타내는 도면) 와 도 6 (Rdh10 양성 세포의 존재를 나타내는 도면) 을 비교하면, Wnt 시그널 경로 작용 물질을 첨가하여 3 일간 배양한 후 Wnt 시그널 경로 작용 물질을 함유하지 않는 혈청 배지에서 배양하면 Rdh10 양성 세포가 존재하고 있는 것을 확인할 수 있다.
도 7 은 Wnt 시그널 경로 작용 물질을 함유하는 무혈청 배지 중에서 3 일간 부유 배양한 후, Wnt 시그널 경로 작용 물질을 함유하지 않는 혈청 배지 중에서 50 일간 부유 배양한 세포 응집체의 동결 절편에 있어서의 Rax 유전자 발현 세포의 GFP 형광상을 나타내는 도면이다.
도 8 은 Wnt 시그널 경로 작용 물질을 함유하는 무혈청 배지 중에서 3 일간 부유 배양한 후, Wnt 시그널 경로 작용 물질을 함유하지 않는 혈청 배지 중에서 50 일간 부유 배양한 세포 응집체의 동결 절편에 있어서의 항 Rdh10 항체를 사용한 형광 면역 염색상을 나타내는 도면이다.
도 9 는 Wnt 시그널 경로 작용 물질을 함유하는 무혈청 배지 중에서 3 일간 부유 배양한 후, Wnt 시그널 경로 작용 물질을 함유하지 않는 혈청 배지 중에서 50 일간 부유 배양한 세포 응집체의 동결 절편에 있어서의 항 Otx1 항체를 사용한 형광 면역 염색상을 나타내는 도면이다. 도 7 (망막 조직 세포의 전체의 존재를 나타내는 도면) 과 도 8 (Rdh10 양성 세포의 존재를 나타내는 도면) 과 도 9 (Otx1 양성 세포의 존재를 나타내는 도면) 를 비교하면, Wnt 시그널 경로 작용 물질을 첨가하여 3 일간 배양한 후 Wnt 시그널 경로 작용 물질을 함유하지 않는 혈청 배지에서 배양하면, Rdh10 양성 세포 및 Otx1 양성 세포가 존재하고 있는 것을 확인할 수 있다.
도 10 은 하기와 같이 조제된 세포 응집체에 포함되는 모양체 주연부형 구조체를 포함하는 영역의 동결 절편의 염색상이다. 부유 배양 개시 후 18 일째의 세포 응집체를 Wnt 시그널 경로 작용 물질을 함유하는 무혈청 배지 중에서 3 일간 부유 배양한 후, Wnt 시그널 경로 작용 물질을 함유하지 않는 혈청 배지 중에서 46 일간 부유 배양하고, 이어서 BrdU 존재 하에서 1 일간 배양하고, BrdU 비존재 하에서 13 일간 배양한 후에, EdU (Invitrogen) 존재 하에서 1 일간 배양하였다. 얻어진 세포 응집체의 동결 절편을 제조하여, 항 Ki67 항체 (좌측 도면) 혹은 항 BrdU 항체 (우측 도면) 에 의한 형광 면역 염색, 또는 EdU 의 발색 반응 (중간 도면) 을 실시하였다.
도 11 은 하기와 같이 조제된 세포 응집체에 포함되는 모양체 주연부형 구조체를 포함하는 영역의 동결 절편의 염색상이다. 부유 배양 개시 후 18 일째의 세포 응집체를 Wnt 시그널 경로 작용 물질을 함유하는 무혈청 배지 중에서 3 일간 부유 배양한 후, Wnt 시그널 경로 작용 물질을 함유하지 않는 혈청 배지 중에서 46 일간 부유 배양하고, 이어서 BrdU 존재 하에서 1 일간 배양하고, BrdU 비존재 하에서 13 일간 배양한 후에, EdU (Invitrogen) 존재 하에서 1 일간 배양하고, 추가로 EdU 비존재 하에서 13 일간 배양하였다. 얻어진 세포 응집체의 동결 절편을 제조하여, 항 Ki67 항체 (좌측 도면), 항 BrdU 항체 (우측 도면) 혹은 항 Rdh10 항체 (하측 도면) 에 의한 형광 면역 염색, 또는 EdU 의 발색 반응 (중간 도면) 을 실시하였다.
도 12 는 부유 배양 개시 후 18 일째의 세포 응집체를 Wnt 시그널 경로 작용 물질을 함유하는 무혈청 배지 중에서 3 일간 부유 배양한 후, Wnt 시그널 경로 작용 물질을 함유하지 않는 혈청 배지 중에서 75 일간 부유 배양한 세포 응집체를 해석한 도면이다.
도 12A 는 당해 조건에서의 세포 응집체의 예이고, 모양체 주연부형 구조체 (CMZ) 를 포함하지 않는 세포 응집체의 위상차상 (A, 좌열, 상단), 모양체 주연부형 구조체를 포함하지 않는 세포 응집체의 Crx 유전자 발현 세포의 GFP 형광상 (A, 좌열, 하단), 모양체 주연부형 구조체를 포함하는 세포 응집체의 위상차상 (A, 우열, 상단), 모양체 주연부형 구조체를 포함하는 세포 응집체의 Crx 유전자 발현 세포의 GFP 형광상 (A, 우열, 하단) 이다.
도 12B 는 모양체 주연부형 구조체를 포함하지 않는 세포 응집체 (CMZ-) 와, 모양체 주연부형 구조체를 포함하는 세포 응집체 (CMZ+) 에 관해, 층 구조를 갖고 연속된 신경 망막이 세포 응집체 원주의 10 ％ 이상 존재하는 세포 응집체의 비율을 Crx 유전자 발현 세포의 형태를 지표로서 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.

이하, 본 발명을 실시하기 위한 형태에 대해 상세하게 설명한다.

본 발명에 있어서 "간세포" 로는, 예를 들어 세포 분열을 거쳐도 동일한 분화능을 유지하는 세포이고, 조직이 상해를 입었을 때에 그 조직을 재생할 수 있는 세포를 들 수 있다. 여기서 "간세포" 는, 배성 간세포 (ES 세포) 혹은 조직 간세포 (조직성 간세포, 조직 특이적 간세포 또는 체성 간세포라고도 한다) 또는 인공 다능성 간세포 (iPS 세포 : induced pluripotent stem cell) 일 수 있지만, 그것들에 한정되지 않는다. 간세포 유래의 조직 세포는, 조직 재생이 가능한 점에서 알 수 있는 바와 같이 생체에 가까운 정상적인 세포를 분화할 수 있는 것으로 알려져 있다.

본 발명에 있어서의 "다능성 간세포" 로는, 예를 들어, 인비트로에 있어서 배양하는 것이 가능하고, 또한, 태반을 제외한 배성 간세포 (ES 세포)를 포함하는 생체를 구성하는 모든 세포 (3 배엽 (외배엽, 중배엽, 내배엽) 유래의 조직) 로 분화할 수 있는 능력 (다능성 (pluripotency)) 을 갖는 간세포를 들 수 있다. "다능성 간세포" 는, 수정란, 클론배, 생식 간세포, 조직내 간세포로부터 얻어진다. 또, 체세포에 여러 종류의 유전자를 도입함으로써, 배성 간세포에 유사한 다능성을 인공적으로 갖게 한 세포 (인공 다능성 간세포라고도 한다) 도 포함한다. 다능성 간세포는 자체 공지된 방법으로 제조하는 것이 가능하다. 제조 방법으로는, 예를 들어, Cell 131(5) pp.861-872 (2007), Cell 126 (4) pp.663-676 (2006) 등에 기재되는 방법을 들 수 있다.

본 발명에 있어서의 "배성 간세포 (ES 세포)" 로는, 예를 들어, 자기 복제능을 갖고, 다분화능 (즉 다능성 "pluripotency") 을 갖는 간세포이고, 초기배에서 유래하는 다능성 간세포를 들 수 있다. 배성 간세포는, 1981년에 처음으로 수립되고, 1989년 이후 녹아웃 마우스 제조에도 응용되고 있다. 1998년에는 인간 배성 간세포가 수립되어 있으며, 재생 의학에도 이용되고 있다.

본 발명에 있어서의 "인공 다능성 간세포" 로는, 예를 들어, 섬유아 세포 등의 분화한 세포를 Oct3/4, Sox2, Klf4, Myc 등의 여러 종류의 유전자의 발현에 의해 직접 초기화하여 다분화능을 유도한 세포를 들 수 있다. 2006년, 야마나카들에 의해 마우스 세포로 인공 다능성 간세포가 수립되었다 (Takahashi K, Yamanaka S. Cell. 2006, 126(4), p 663-676). 인공 다능성 간세포는, 2007년에 인간 섬유아 세포에서도 수립되고, 배성 간세포와 동일하게 다분화능을 갖는다 (Takahashi K, Tanabe K, Ohnuki M, Narita M, Ichisaka T, Tomoda K, Yamanaka S. Cell. 2007, 131(5), p 861-872. ; Yu J, Vodyanik MA, Smuga-Otto K, Antosiewicz-Bourget J, Frane JL, Tian S, Nie J, Jonsdottir GA, Ruotti V, Stewart R, Slukvin II, Thomson JA., Science. 2007, 318(5858), p 1917-1920. ; Nakagawa M, Koyanagi M, Tanabe K, Takahashi K, Ichisaka T, Aoi T, Okita K, Mochiduki Y, Takizawa N, Yamanaka S. Nat Biotechnol., 2008, 26(1), p 101-106).

다능성 간세포는, 소정의 기관으로부터 입수할 수 있으며, 시판품을 구입할 수도 있다. 예를 들어, 인간 배성 간세포인 KhES-1, KhES-2 및 KhES-3 은, 쿄토 대학 재생 의과학 연구소로부터 입수 가능하다. 마우스 배성 간세포인 EB5 세포는 독립 행정 법인 이화학 연구소로부터, D3 주는 ATCC 로부터 각각 입수 가능하다.

다능성 간세포는 자체 공지된 방법에 의해 유지 배양할 수 있다. 예를 들어, 인간 간세포는 Knockout Serum Replacement (KSR) 를 사용하여 배양함으로써 유지할 수 있다. 예를 들어, 마우스 간세포는, 우태아 혈청 (FCS), LIF 를 첨가하여 피더 세포 없이 배양함으로써 유지할 수 있다.

본 발명에 있어서의 "조직" 으로는, 예를 들어, 형태나 성질이 상이한 복수 종류의 세포가 일정한 패턴으로 입체적으로 배치된 구조를 갖는 세포 집단의 구조체를 들 수 있다.

본 발명에 있어서의 "망막 조직" 으로는, 예를 들어, 생체 망막에 있어서 각 망막층을 구성하는 시세포, 수평 세포, 쌍극 세포, 아마크린 세포, 망막절 세포, 이들의 전구 세포 또는 망막 전구 세포 등의 세포가 적어도 복수 종류, 층상으로 입체적으로 배열된 망막 조직 등을 들 수 있다. 각각의 세포가 어느 망막층을 구성하는 세포인지에 대해서는 공지된 방법, 예를 들어, 세포 마커의 발현 유무 혹은 그 정도 등에 따라 확인할 수 있다.

망막 세포 마커로는, Rax (망막의 전구 세포), PAX6 (전구 세포), Chx10 (신경 망막 전구 세포), nestin (시상하부 뉴런의 전구 세포에서는 발현되지만 망막 전구 세포에서는 발현되지 않는다), Sox1 (시상하부 신경 상피로 발현되고, 망막에서는 발현되지 않는다), Crx (시세포의 전구 세포) 등을 들 수 있다. 상기 망막층 특이적 뉴런의 마커로는, Chx10 (신경 망막 전구 세포 또는 쌍극 세포), L7 (쌍극 세포), Tuj1 (마디 세포), Brn3 (마디 세포), Calretinin (아마크린 세포), Calbindin (수평 세포), Rhodopsin (광수용체), Recoverin (광수용체), RPE65 (색소 상피 세포), Mitf (색소 상피 세포), Nrl (간체 세포), Rxr-gamma (추체 세포) 등을 들 수 있다.

본 발명에 있어서의 "망막층" 이란, 망막을 구성하는 각 층을 의미하고, 구체적으로는 망막 색소 상피층, 시세포층, 외경계막, 외과립층, 외망상층, 내과립층, 내망상층, 신경절 세포층, 신경 섬유층 및 내경계막을 들 수 있다.

본 발명에 있어서의 "모양체 주연부 (ciliary marginal zone ; CMZ)" 로는, 예를 들어, 생체 망막에 있어서 망막 조직 (구체적으로는 신경 망막) 과 망막 색소 상피의 경계 영역에 존재하는 조직이고, 또한 망막의 조직 간세포 (망막 간세포) 를 포함하는 영역을 들 수 있다. 모양체 주연부의 마커 유전자로는, 예를 들어, Rdh10 유전자 (양성) 및 Otx1 유전자 (양성) 등을 들 수 있다. 모양체 주연부는, 망막 조직에 대한 망막 전구 세포나 분화 세포의 공급이나 망막 조직 구조의 유지 등에 중요한 역할을 하고 있는 것으로 알려져 있다.

본 발명에 있어서의 "progress zone (진행대)" 으로는, 예를 들어 조직의 일부분에 국한되어 존재하는 미분화 세포의 집합체이고, 발생이나 재생의 과정에 있어서 지속적으로 성장하여 조직 전체의 성장에 기여하는 성질, 및 또는, 성장 인자 등을 분비함으로써 주변 조직의 성장에 기여하는 성질을 갖는 세포의 집합체를 들 수 있다. progress zone 의 구체예로는 지아 (Limb bud) 의 선단부에 있어서의 미분화 세포의 집합체를 들 수 있다.

본 발명에 있어서의 "응집체" 로는, 배지 중에 분산되어 있던 세포가 집합하여 형성한 덩어리를 들 수 있고, 본 발명에 있어서의 "응집체" 에는, 부유 배양 개시시에 분산되어 있던 세포가 형성한 응집체와 부유 배양 개시시에 이미 형성되어 있던 응집체가 포함되는 것으로 한다.

"응집체를 형성시키는" 이란, 세포를 집합시켜 세포의 응집체를 형성시켜 부유 배양시킬 때, "일정수의 분산된 간세포를 신속히 응집" 시킴으로써 질적으로 균일한 세포의 응집체를 형성시키는 것을 말한다.

응집체를 형성시키는 실험적인 조작으로는, 예를 들어, 웰의 작은 플레이트 (96 구멍 플레이트) 나 마이크로포어 등을 사용하여 작은 스페이스에 세포를 가두는 방법, 작은 원심 튜브를 사용하여 단시간 원심함으로써 세포를 응집시키는 방법 등을 들 수 있다.

본 발명에 있어서 사용되는 "배지" 는, 동물 세포의 배양에 사용되는 배지를 기초 배지로서 조제하면 된다. 기초 배지로는, 예를 들어, BME 배지, BGJb 배지, CMRL 1066 배지, Glasgow MEM 배지, Improved MEM Zinc Option 배지, IMDM 배지, Medium 199 배지, Eagle MEM 배지, αMEM 배지, DMEM 배지, 햄 배지, RPMI 1640 배지, Fischer's 배지, 또는 이들의 혼합 배지 등, 동물 세포의 배양에 사용할 수 있는 배지를 들 수 있다.

본 발명에 있어서의 "무혈청 배지" 로는, 예를 들어, 무조정 또는 미정제의 혈청을 함유하지 않는 배지를 들 수 있다. 또한, 본 발명에서는, 정제된 혈액 유래 성분이나 동물 조직 유래 성분 (예를 들어, 성장 인자) 이 혼입되어 있는 배지도, 무조정 또는 미정제의 혈청을 함유하지 않는 한 무혈청 배지에 포함된다.

또한, 조제의 번잡함을 회피한다는 관점에서는, 이러한 무혈청 배지로서, 예를 들어, 시판되는 KSR 을 적당량 (예를 들어, 1 - 20 ％) 첨가한 무혈청 배지 (GMEM 또는 DMEM, 0.1 mM 2-메르캅토에탄올, 0.1 mM 비필수 아미노산 Mix, 1 mM 피루브산나트륨) 를 바람직하게 들 수 있다.

또, 무혈청 배지는 혈청 대체물을 함유하고 있어도 된다. 혈청 대체물로는, 예를 들어, 알부민, 트랜스페린, 지방산, 콜라겐 전구체, 미량 원소, 2-메르캅토에탄올 또는 3'티올글리세롤, 혹은 이들의 균등물 등을 적절히 함유하는 것 등을 들 수 있다. 이러한 혈청 대체물은, 예를 들어, WO98/30679 등에 기재되는 방법에 의해 조제하면 된다. 또, 혈청 대체물로는 시판되는 것을 이용해도 된다. 이러한 시판되는 혈청 대체물로는, 예를 들어, Chemically-defined Lipid concentrated (Gibco 사 제조), Glutamax (Gibco 사 제조) 등을 들 수 있다.

또, 부유 배양에서 사용되는 "무혈청 배지" 는, 예를 들어, 지방산, 지질, 아미노산 (예를 들어, 비필수 아미노산), 비타민, 성장 인자, 사이토카인, 항산화제, 2-메르캅토에탄올, 피루브산, 완충제, 무기 염류 등을 함유해도 된다.

본 발명에 있어서의 "혈청 배지" 로는, 예를 들어, 무조정 또는 미정제의 혈청을 함유하는 배지를 들 수 있다. 당해 배지는, 지방산, 지질, 아미노산 (예를 들어, 비필수 아미노산), 비타민, 성장 인자, 사이토카인, 항산화제, 2-메르캅토에탄올, 피루브산, 완충제, 무기 염류 등을 함유해도 된다.

본 발명에 있어서의 "부유 배양" 으로는, 예를 들어, 세포 응집체를 배지 중에 있어서, 세포 배양기에 대해 비접착성의 조건 하에서 실시되는 배양 등을 들 수 있다.

부유 배양에서 사용되는 배양기로는, 세포의 부유 배양이 가능한 것이면 특별히 한정되지 않는다. 이와 같은 배양기로는, 예를 들어, 플라스크, 조직 배양용 플라스크, 디쉬, 페트리 디쉬, 조직 배양용 디쉬, 멀티 디쉬, 마이크로 플레이트, 마이크로 웰 플레이트, 마이크로포어, 멀티 플레이트, 멀티 웰 플레이트, 챔버 슬라이드, 샬레, 튜브, 트레이, 배양 백, 롤러 보틀 등을 들 수 있다. 바람직한 배양기로는, 세포 비접착성의 배양기를 들 수 있다.

또한, 세포 비접착성의 배양기는, 배양기의 표면이 세포와의 접착성을 향상시킬 목적으로 인공적으로 처리 (예를 들어, 세포외 매트릭스 등에 의한 코팅 처리) 되어 있지 않은 것 등을 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명에 있어서 배지에 첨가되는 "혈청" 으로서, 예를 들어, 소 혈청, 송아지 혈청, 우태아 혈청, 말 혈청, 망아지 혈청, 말 태아 혈청, 토끼 혈청. 아기 토끼 혈청, 토끼 태아 혈청, 인간 혈청 등 포유 동물의 혈청 등을 들 수 있다.

본 발명 제조 방법은, 망막 조직을 포함하는 세포 응집체이고, 상기 망막 조직에 있어서의 Chx10 양성 세포의 존재 비율이 20 ％ 이상인 세포 응집체를, 각각 Wnt 시그널 경로 작용 물질을 함유하는 무혈청 배지 또는 혈청 배지 중에서, RPE65 유전자를 발현하는 세포가 출현하기 이전까지의 기간 중에 한하여 배양한 후, 얻어진 "RPE65 유전자를 발현하는 세포가 출현하고 있지 않은 세포 응집체" 를, 각각 Wnt 시그널 경로 작용 물질을 함유하지 않는 무혈청 배지 또는 혈청 배지 중에서 배양하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 한다. 그리고 본 발명 제조 방법에 의해 제조된 "모양체 주연부형 구조체를 포함하는 세포 응집체" 는, 화학 물질 등의 독성이나 약물 효능의 평가에 사용하기 위한 시약이나, 세포 치료 등을 목적으로 한 시험이나 치료에 사용하기 위한 재료로서 유용하다.

본 발명 제조 방법에서 출발 원료로서 사용되는 "망막 조직을 포함하는 세포 응집체" 는, 당해 망막 조직에 있어서의 Chx10 양성 세포의 존재 비율이 20 ％ 이상인 세포 응집체이다. 상기 "Chx10 양성 세포의 존재 비율" 로는, 바람직하게는 40 ％ 이상을 들 수 있고, 보다 바람직하게는 60 ％ 이상을 들 수 있고, 특히 바람직하게는 80 ％ 이상을 들 수 있다.

본 발명 제조 방법에서 출발 원료로서 사용되는 "망막 조직을 포함하는 세포 응집체" 는, 예를 들어 다능성 간세포 (바람직하게는 인간 다능성 간세포) 로부터 조제할 수 있다. 구체적으로는 예를 들어 하기 (1) 내지 (3) 의 공정을 포함하는 방법에 의해 조제할 수 있다.

(1) 다능성 간세포를 Wnt 시그널 경로 저해 물질을 함유하는 무혈청 배지 중에서 부유 배양함으로써 다능성 간세포의 응집체를 형성시키는 제 1 공정

(2) 제 1 공정에서 형성된 응집체를 기저막 제제를 포함하는 무혈청 배지 중에서 부유 배양하는 제 2 공정, 및

(3) 제 2 공정에서 배양된 응집체를 혈청 배지 중에서 부유 배양하는 제 3 공정

제 1 공정에서 사용하는 Wnt 시그널 경로 저해 물질로는, Wnt 에 의해 매개되는 시그널 전달을 억제할 수 있는 것인 한 특별히 한정되지 않는다. Wnt 시그널 경로 저해 물질로는, 예를 들어, Dkk1, Cerberus 단백, Wnt 수용체 저해제, 가용형 Wnt 수용체, Wnt 항체, 카세인 키나아제 저해제, 도미넌트 네거티브 Wnt 단백, CKI-7 (N-(2-아미노에틸)-5-클로로-이소퀴놀린-8-술폰아미드), D4476 (4-{4-(2,3-디하이드로벤조[1,4]디옥신-6-일)-5-피리딘-2-일-1H-이미다졸-2-일}벤즈아미드), IWR-1-endo (IWR1e), IWP-2 등을 들 수 있다. Wnt 시그널 경로 저해 물질의 농도는, 다능성 간세포의 응집체가 형성되는 농도이면 된다. 예를 들어 IWR1e 등의 통상적인 Wnt 시그널 경로 저해 물질의 경우에는, 약 0.1 μM 내지 100 μM, 바람직하게는 약 1 μM 내지 10 μM, 보다 바람직하게는 약 3 μM 의 농도로 첨가한다.

Wnt 시그널 경로 저해 물질은, 부유 배양 개시 전에 무혈청 배지에 첨가되어 있어도 되고, 또, 부유 배양 개시 후 수일 이내 (예를 들어, 5 일 이내) 에 무혈청 배지에 첨가해도 된다. 바람직하게는, Wnt 시그널 경로 저해 물질은, 부유 배양 개시 후 5 일 이내, 보다 바람직하게는 3 일 이내, 가장 바람직하게는 부유 배양 개시와 동시에 무혈청 배지에 첨가한다. 또, Wnt 시그널 경로 저해 물질을 첨가한 상태에서, 부유 배양 개시 후 18 일째까지, 보다 바람직하게는 12 일째까지 부유 배양한다.

제 1 공정에 있어서의 배양 온도, CO₂ 농도 등의 배양 조건은 적절히 설정할 수 있다. 배양 온도는 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어 약 30 내지 40 ℃, 바람직하게는 약 37 ℃ 전후이다. 또 CO₂ 농도는, 예를 들어 약 1 내지 10 ％, 바람직하게는 약 5 ％ 이다.

제 1 공정에 있어서의 다능성 간세포의 농도는, 다능성 간세포의 응집체를 보다 균일하게, 효율적으로 형성시키도록 당업자이면 적절히 설정할 수 있다. 응집체 형성시의 다능성 간세포의 농도는, 간세포의 균일한 응집체를 형성 가능한 농도인 한 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 96 구멍 마이크로 웰 플레이트를 사용하여 인간 ES 세포를 부유 배양하는 경우, 1 웰당 약 1 x 10³ 내지 약 5 x 10⁴ 세포, 바람직하게는 약 3 x 10³ 내지 약 3 x 10⁴ 세포, 보다 바람직하게는 약 5 x 10³ 내지 약 2 x 10⁴ 세포, 가장 바람직하게는 9 x 10³ 세포 전후가 되도록 조제한 액을 첨가하고, 플레이트를 정치시켜 응집체를 형성시킨다.

응집체를 형성시키기 위해서 필요한 부유 배양의 시간은, 세포를 신속히 응집시킬 수 있는 한, 사용하는 다능성 간세포에 의해 적절히 결정 가능하지만, 균일한 응집체를 형성하기 위해서는 가능한 한 단시간인 것이 바람직하다. 예를 들어, 인간 ES 세포의 경우에는, 바람직하게는 24 시간 이내, 보다 바람직하게는 12 시간 이내에 응집체를 형성시키는 것이 바람직하다. 이 응집체 형성까지의 시간은, 세포를 응집시키는 용구나, 원심 조건 등을 조정함으로써 당업자이면 적절히 조절하는 것이 가능하다.

다능성 간세포의 응집체가 형성된 것은, 응집체의 사이즈 및 세포수, 거시적 형태, 조직 염색 해석에 의한 미시적 형태 및 그 균일성, 분화 및 미분화 마커의 발현 및 그 균일성, 분화 마커의 발현 제어 및 그 동기성, 분화 효율의 응집체 사이의 재현성 등에 기초하여 당업자이면 판단하는 것이 가능하다.

제 2 공정에서 사용하는 기저막 제제로는, 그 위에 기저막 형성능을 갖는 원하는 세포를 파종하여 배양했을 경우에, 상피 세포형의 세포 형태, 분화, 성장, 운동, 기능 발현 등을 제어하는 기능을 갖는 기저막 구성 성분을 포함하는 것을 말한다. 여기서, "기저막 구성 성분" 이란, 동물의 조직에 있어서, 상피 세포층과 간질 세포층 등 사이에 존재하는 얇은 막상을 한 세포외 매트릭스 분자를 말한다. 기저막 제제는, 예를 들어 기저막을 개재하여 지지체 상에 접착되어 있는 기저막 형성능을 갖는 세포를, 그 세포의 지질 용해능을 갖는 용액이나 알칼리 용액 등을 사용하여 제거함으로써 제조할 수 있다. 바람직한 기저막 제제로는, 기저막 성분으로서 시판되고 있는 상품 (예를 들어 Matrigel (이하, 마트리겔이라고 하는 경우도 있다)) 이나, 기저막 성분으로서 공지된 세포외 매트릭스 분자 (예를 들어 라미닌, IV 형 콜라겐, 헤파란 황산 프로테오글리칸, 엔탁틴 등) 를 포함하는 것을 들 수 있다.

Matrigel 은, Engelbreth Holm Swarn (EHS) 마우스 육종 유래의 기저막 조제물이다. Matrigel 의 주성분은 IV 형 콜라겐, 라미닌, 헤파란 황산 프로테오글리칸, 엔탁틴이지만, 이들에 더하여 TGF-β, 섬유아 세포 성장 인자 (FGF), 조직 플라스미노겐 활성화 인자, EHS 종양이 천연에 산생하는 성장 인자가 포함된다. Matrigel 의 "growth factor reduced (GFR) 제품" 은, 통상적인 Matrigel 보다 성장 인자의 농도가 낮다. 본 발명에서는, GFR 제품의 사용이 바람직하다.

제 2 공정에 있어서의 부유 배양으로 무혈청 배지에 첨가되는 기저막 제제의 농도로는, 신경 조직 (예를 들어 망막 조직) 의 상피 구조가 안정적으로 유지되는 한 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 Martigel 을 사용하는 경우에는, 바람직하게는 배양액의 1/20 내지 1/200 의 용량, 보다 바람직하게는 1/100 전후의 용적을 들 수 있다. 기저막 제제는 간세포의 배양 개시시에 이미 배지에 첨가되어 있어도 되지만, 바람직하게는 부유 배양 개시 후 5 일 이내, 보다 바람직하게는 부유 배양 개시 후 2 일 이내에 무혈청 배지에 첨가된다.

제 2 공정에서 사용되는 무혈청 배지는, 제 1 공정에서 사용한 무혈청 배지를 그대로 사용할 수도 있고, 새로운 무혈청 배지로 치환할 수도 있다.

제 1 공정에서 사용한 무혈청 배지를 그대로 본 공정에 사용하는 경우, "기저막 제제" 를 배지 중에 첨가하면 된다.

제 2 공정에 있어서의 배양 온도, CO₂ 농도 등의 배양 조건은 적절히 설정할 수 있다. 배양 온도는 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어 약 30 내지 40 ℃, 바람직하게는 약 37 ℃ 전후이다. 또 CO₂ 농도는, 예를 들어 약 1 내지 10 ％, 바람직하게는 약 5 ％ 전후이다.

제 3 공정에서 사용되는 혈청 배지는, 제 2 공정에서 배양에 사용한 무혈청 배지에 혈청을 직접 첨가한 것을 사용해도 되고, 새로운 혈청 배지로 치환한 것을 사용해도 된다.

혈청의 첨가는, 부유 배양 개시 후 7 일째 이후, 보다 바람직하게는 9 일째 이후, 가장 바람직하게는 12 일째 이후에 실시한다. 혈청 농도에 대해서는, 약 1 내지 30 ％, 바람직하게는 약 3 내지 20 ％, 보다 바람직하게는 10 ％ 전후로 첨가한다.

제 3 공정에 있어서, 혈청에 더하여 Shh 시그널 경로 작용 물질을 첨가함으로써 망막 조직의 제조 효율을 상승시킬 수 있다.

Shh 시그널 경로 작용 물질로는, Shh 에 의해 매개되는 시그널 전달을 증강시킬 수 있는 것인 한 특별히 한정되지 않는다. Shh 시그널 경로 작용 물질로는, 예를 들어, Hedgehog 패밀리에 속하는 단백 (예를 들어, Shh), Shh 수용체, Shh 수용체 아고니스트, Purmorphamine, SAG 등을 들 수 있다.

본 공정에 사용되는 Shh 시그널 경로 작용 물질의 농도는, 예를 들어 SAG 등의 통상적인 Shh 시그널 경로 작용 물질의 경우에는, 약 0.1 nM 내지 10 μM, 바람직하게는 약 10 nM 내지 1 μM, 보다 바람직하게는 100 nM 전후의 농도로 첨가한다.

이와 같이 하여 제조된 망막 조직은 응집체의 표면을 덮도록 존재한다. 망막 조직이 제조된 것은 면역 염색법 등에 의해 확인할 수 있다.

예를 들어, 제 3 공정에서 배양된 응집체를 혈청 배지 중에서 부유 배양한다. 부유 배양에서 사용되는 배양기로는, 상기 서술한 것을 들 수 있다. 부유 배양에 있어서의 배양 온도, CO₂ 농도, O₂ 농도 등의 다른 배양 조건은 적절히 설정할 수 있다. 배양 온도는 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어 약 30 내지 40 ℃, 바람직하게는 약 37 ℃ 이다. 또, CO₂ 농도는, 예를 들어 약 1 내지 10 ％, 바람직하게는 약 5 ％ 이다. 한편, O₂농도에 대해서는, 예를 들어 20 내지 70 ％, 바람직하게는 20 내지 60 ％, 보다 바람직하게는 30 내지 50 ％ 이다. 배양 시간은 특별히 한정되지 않지만, 통상적으로 48 시간 이상이고, 바람직하게는 7 일 이상이다.

부유 배양 종료 후, 응집체를 파라포름알데히드 용액 등의 고정액을 사용하여 고정시켜, 동결 절편을 제조한다. 얻어진 동결 절편을 면역 염색하여, 망막 조직의 층 구조가 형성되어 있는 것을 확인하면 된다. 망막 조직은, 각 층을 구성하는 망막 전구 세포 (시세포, 수평 세포, 쌍극 세포, 아마크린 세포, 망막절 세포) 가 각각 상이하기 때문에, 이들 세포에 발현하고 있는 상기 서술한 마커에 대한 항체를 사용하여 면역 염색함으로써, 층 구조가 형성되어 있는 것을 확인할 수 있다.

상기와 같이 하여 제조된 세포 응집체에 포함되는 망막 조직에 있어서의 "Chx10 양성 세포의 존재 비율" 은, 예를 들어 이하와 같은 방법에 의해 조사할 수 있다.

(1) 먼저, "망막 조직을 포함하는 세포 응집체" 의 동결 절편을 제조한다.

(2) 이어서, Rax 단백질의 면역 염색을, 또는 Rax 유전자를 발현하는 세포로 GFP 등의 형광 단백질이 발현하도록 개변된 유전자 재조합 세포를 사용한 경우에는, 상기 형광 단백질의 발현을 형광 현미경 등을 사용하여 관찰함으로써, Rax 유전자를 발현하는 망막 조직 영역을 특정한다.

(3) Rax 유전자를 발현하는 망막 조직 영역이 특정된 동결 절편과 동일한 절편 또는 인접하는 절편을 시료로 하여, Dapi 등의 핵 염색 시약을 사용하여 핵을 염색한다. 그리고, 상기로 특정된 Rax 유전자를 발현하는 망막 조직 영역 중에 있어서, 염색된 핵의 수를 계측함으로써, 망막 조직 영역의 세포수를 측정한다.

(4) Rax 유전자를 발현하는 망막 조직 영역이 특정된 동결 절편과 동일한 절편 또는 인접하는 절편을 시료로 하여, Chx10 단백질의 면역 염색을 실시한다. 상기로 특정된 망막 조직 영역에 있어서의 Chx10 양성 세포 중의 핵의 수를 계측한다.

(5) 상기 (3) 및 (4) 로 계측된 각각의 핵의 수에 기초하여, Chx10 양성 세포 중의 핵의 수를, 상기로 특정된 망막 조직 영역에 있어서의 Chx10 양성 세포 중의 핵의 수로 나눔으로써, "Chx10 양성 세포의 존재 비율" 을 산출한다.

본 발명 제조 방법에 있어서는, 먼저, 망막 조직을 포함하는 세포 응집체이고, 상기 망막 조직에 있어서의 Chx10 양성 세포의 존재 비율이 20 ％ 이상인 세포 응집체를, Wnt 시그널 경로 작용 물질을 함유하는 무혈청 배지 또는 혈청 배지 중에서, RPE65 유전자를 발현하는 세포가 출현하기 이전까지의 기간 중에 한하여 배양한다.

여기서, 바람직한 배양으로는, 예를 들어 부유 배양을 들 수 있다. 또, 바람직한 배지로는, 예를 들어 무혈청 배지를 들 수 있다.

배양 온도, CO₂ 농도 등의 배양 조건은 적절히 설정하면 된다. 배양 온도로는, 예를 들어 약 30 ℃ 내지 약 40 ℃ 의 범위를 들 수 있다. 바람직하게는, 예를 들어 37 ℃ 전후를 들 수 있다. 또, CO₂ 농도로는, 예를 들어 약 1 ％ 내지 약 10 ％ 의 범위를 들 수 있다. 바람직하게는, 예를 들어 5 ％ 전후를 들 수 있다.

상기 "망막 조직을 포함하는 세포 응집체" 를 무혈청 배지 또는 혈청 배지 중에서 배양할 때, 그 배지에 포함할 수 있는 Wnt 시그널 경로 작용 물질로는, Wnt 에 의해 매개되는 시그널 전달을 증강시킬 수 있는 것인 한 특별히 한정되지 않는다. 구체적인 Wnt 시그널 경로 작용 물질로는, 예를 들어, Wnt 패밀리에 속하는 단백질, Wnt 수용체, Wnt 수용체 아고니스트, GSK3β 저해제 (예를 들어, 6-Bromoindirubin-3'-oxime (BIO), CHIR99021, Kenpaullone) 등을 들 수 있다.

또, 무혈청 배지 또는 혈청 배지에 함유되는 Wnt 시그널 경로 작용 물질의 농도로는, CHIR99021 등의 통상적인 Wnt 시그널 경로 작용 물질의 경우에는, 예를 들어, 약 0.1 μM 내지 100 μM 의 범위를 들 수 있다. 바람직하게는, 예를 들어 약 1 μM 내지 30 μM 의 범위를 들 수 있다. 보다 바람직하게는, 예를 들어 3 μM 전후의 농도를 들 수 있다.

본 발명 제조 방법에 있어서 "RPE65 유전자를 발현하는 세포가 출현하기 이전까지의 기간 중에 한하여 배양" 한다는 것은, RPE65 유전자를 발현하는 세포가 출현하기 이전까지의 기간의 전부 또는 그 일부에 한하여 배양하는 것을 의미한다. 요컨대, 배양계 내에 존재하는 상기 "망막 조직을 포함하는 세포 응집체" 가, RPE65 유전자를 실질적으로 발현하지 않는 세포로 구성되어 있는 기간의 전부 또는 그 일부 (임의인 기간) 에 한하여 배양하면 되고, 이와 같은 배양을 채용함으로써, RPE65 유전자를 발현하는 세포가 출현하고 있지 않은 세포 응집체를 얻을 수 있다.

이와 같은 특정한 기간을 설정하려면, 상기 "망막 조직을 포함하는 세포 응집체" 를 시료로 하여, 당해 시료 중에 포함되는 RPE65 유전자의 발현 유무 또는 그 정도를 통상적인 유전자 공학적 수법을 사용하여 측정하면 된다. 구체적으로는 예를 들어, 후술하는 실시예에 기재되는 바와 같이, 상기 "망막 조직을 포함하는 세포 응집체" 의 동결 절편을 RPE65 단백질에 대한 항체를 사용하여 면역 염색하는 방법을 사용하여 RPE65 유전자의 발현 유무 또는 그 정도를 조사할 수 있다.

바람직한 "RPE65 유전자를 발현하는 세포가 출현하기 이전까지의 기간" 으로는, 예를 들어 상기 망막 조직에 있어서의 Chx10 양성 세포의 존재 비율이 조직의 50 ％ 내지 1 ％ 의 범위 내인 기간을 들 수 있다. 이 경우에는, 얻어지는 "RPE65 유전자를 발현하는 세포가 출현하고 있지 않은 세포 응집체" 는, 상기 망막 조직에 있어서의 Chx10 양성 세포의 존재 비율이 조직의 50 ％ 내지 1 ％ 의 범위 내인 세포 응집체가 된다.

"RPE65 유전자를 발현하는 세포가 출현하기 이전까지의 기간" 의 일수는, Wnt 시그널 경로 작용 물질의 종류, 무혈청 배지 또는 혈청 배지의 종류, 다른 배양 조건 등에 따라 변화하지만, 예를 들어 5 일간 이내를 들 수 있다. 상기 기간으로서 바람직하게는, 예를 들어 4 일간 이내를 들 수 있고, 보다 바람직하게는, 예를 들어 2 일간 내지 3 일간을 들 수 있다.

이어서, 상기 서술한 바와 같이 하여 배양하여 얻어진 "RPE65 유전자를 발현하는 세포가 출현하고 있지 않은 세포 응집체" 를, 각각 Wnt 시그널 경로 작용 물질을 함유하지 않는 무혈청 배지 또는 혈청 배지 중에서 배양한다.

여기서, 바람직한 배양으로는, 예를 들어 부유 배양을 들 수 있다.

바람직한 배양 시간으로는, 예를 들어 상기 망막 조직에 있어서의 Chx10 양성 세포의 존재 비율이 50 ％ 이상에 이를 때까지 실시하는 배양 시간을 들 수 있다.

배양 온도, CO₂ 농도 등의 배양 조건은 적절히 설정하면 된다. 배양 온도로는, 예를 들어 약 30 ℃ 내지 약 40 ℃ 의 범위를 들 수 있다. 바람직하게는, 예를 들어 37 ℃ 전후를 들 수 있다. 또, CO₂ 농도로는, 예를 들어 약 1 ％ 내지 약 10 ％ 의 범위를 들 수 있고, 바람직하게는, 예를 들어 5 ％ 전후를 들 수 있다.

"모양체 주연부형 구조체를 포함하는 세포 응집체" 를 얻기까지의 상기의 배양 일수는, 무혈청 배지 또는 혈청 배지의 종류, 다른 배양 조건 등에 따라 변화하지만, 예를 들어 100 일간 이내를 들 수 있다. 상기 배양 일수로서 바람직하게는, 예를 들어 20 일간 내지 70 일간을 들 수 있고, 보다 바람직하게는, 예를 들어 30 일간 내지 60 일간을 들 수 있다.

이와 같이 하여 제조된 "모양체 주연부형 구조체를 포함하는 세포 응집체" 에 있어서는, 모양체 주연부형 구조체에 대해, 망막 색소 상피와 망막 조직 (구체적으로는 신경 망막) 이 동일한 세포 응집체 내에서 인접하여 존재하고 있다. 당해 구조에 대해서는 현미경 관찰 등으로 용이하게 확인하는 것이 가능하다.

상기 "모양체 주연부형 구조체를 포함하는 세포 응집체" 로부터 핀셋 등을 사용하여, 망막 조직 (구체적으로는 신경 망막) 을 물리적으로 잘라냄으로써, 고순도의 망막 조직 (구체적으로는 신경 망막) 을 조제하는 것이 가능하다. 고순도의 망막 조직 (구체적으로는 신경 망막) 은, 그것이 갖는 조직 구조를 양호하게 유지한 채로, 더욱 배양을 계속하는 것 (구체적으로는 예를 들어, 60 일 이상의 장기 배양) 이 가능하다. 또한, 배양 온도, CO₂ 농도, O₂ 농도 등의 배양 조건으로는, 통상적인 조직 배양에서 사용되는 것을 들 수 있다. 또, 이 때, 혈청, 이미 알려진 성장 인자, 성장을 촉진하는 첨가제나 화학 물질 등의 존재 하에서 배양해도 된다. 이미 알려진 성장 인자로는, 예를 들어 EGF, FGF 등을 들 수 있다. 성장을 촉진하는 첨가제로서 예를 들어, N2 supplement (Invitrogen 사), B27 supplement (Invitrogen 사) 등을 들 수 있다.

본 발명은, 본 발명 제조 방법에 의해 제조되는 모양체 주연부형 구조체를 포함하는 세포 응집체의 독성이나 약물 효능의 평가용 시약으로서의 용도나, 본 발명 제조 방법에 의해 제조되는 모양체 주연부형 구조체를 포함하는 세포 응집체의 이식용 생체 재료로서의 용도 등도 포함한다.

<모양체 주연부형 구조체를 포함하는 세포 응집체의 독성 또는 약물 효능 평가용 시약으로서의 용도>

본 발명 제조 방법에 의해 제조된 모양체 주연부형 구조체를 포함하는 세포 응집체는, 망막 세포의 장해에 기초하는 질환의 치료약의 스크리닝, 질환 연구 재료, 또는 약물 발견 물질로서 이용 가능하다. 또 화학 물질 등의 독성이나 약물 효능의 평가에 있어서도, 광 독성, 신경 독성 등의 독성 연구, 독성 시험 등에 활용 가능하다.

<모양체 주연부형 구조체를 포함하는 세포 응집체의 이식용 생체 재료로서의 용도>

본 발명 제조 방법에 의해 제조된 모양체 주연부형 구조체를 포함하는 세포 응집체는, 세포 손상 상태에 있어서, 장해를 입은 조직 자체를 보충하거나 하기 (예를 들어, 이식 수술에 사용하기) 위해 사용하는 이식용 생체 재료로서 사용할 수 있다.

실시예

이하, 본 발명을 실시예에 의해 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 (인간 ES 세포를 사용한 망막 조직을 포함하는 세포 응집체의 제조예 - 1)

RAX :: GFP knock-in 인간 ES 세포 (KhES-1 유래 ; Nakano, T. et al. Cell Stem Cell 2012, 10(6), 771-785) 를 "Ueno, M. et al. PNAS 2006, 103(25), 9554-9559" "Watanabe, K. et al. Nat Biotech 2007, 25, 681-686" 에 기재되는 방법에 준하여 배양하였다. 배지에는, DMEM/F12 배지 (Invitrogen) 에 20 ％ KSR (Knockout Serum Replacement ; Invitrogen), 0.1 mM 2-메르캅토에탄올, 1 mM 피루브산, 5 내지 10 ng/㎖ bFGF 를 첨가한 배지를 사용하였다. 배양된 상기 ES 세포를 0.25 ％ trypsin-EDTA (Invitrogen) 를 사용하여 ES 세포를 단일 분산시킨 후, 단일 분산된 ES 세포를 비세포 접착성의 96 구멍 배양 플레이트 (스미론 스페로이드 플레이트, 스미토모 베이클라이트사) 의 1 웰당 9 × 10³ 세포가 되도록 100 ㎕ 의 무혈청 배지에 부유시켜, 37 ℃, 5 ％ CO₂ 로 부유 배양하였다. 그 때에 사용된 무혈청 배지는, G-MEM 배지에 20 ％ KSR, 0.1 mM 2-메르캅토에탄올, 1 mM 피루브산, 20 μM Y27632, Wnt 시그널 경로 저해 물질 (3 μM IWR1e) 을 첨가한 무혈청 배지였다. 부유 배양 개시 2 일째부터 용적당 1/100 량의 GFR 마트리겔 (Invitrogen) 을 첨가하여 부유 배양하였다. 부유 배양 개시 12 일째에 용적당 1/10 량의 우태아 혈청 및 Shh 시그널 경로 작용 물질 (100 nM SAG) 을 첨가하여, 합계 18 일간 부유 배양하였다.

이와 같이 하여 제조된 세포 응집체를 4 ％ 파라포름알데히드로 고정시켜 동결 절편을 조제하였다. 조제된 동결 절편에 대해, GFP 형광상의 형광 현미경 관찰 (도 1) 및 신경 망막 전구 세포의 마커의 하나인 Chx10 의 면역 염색 (도 2) 을 실시하였다. 상기와 같이 하여 제조된 세포 응집체에 포함되는 망막 조직에는, Chx10 양성 세포가 40 ％ 정도 존재하고 있었다 (도 2 참조).

실시예 2 (인간 ES 세포를 사용한 망막 조직을 포함하는 세포 응집체의 제조예 - 2)

실시예 1 과 동일한 방법을 사용하여 부유 배양을 보다 장시간 실시한 결과, 부유 배양 개시로부터 25 일째에는 Chx10 양성 세포가 80 ％ 정도 또는 90 ％ 정도 존재하는 망막 조직을 포함하는 세포 응집체도 얻어졌다.

실시예 3 (Wnt 시그널 경로 작용 물질을 함유하는 무혈청 배지에서의 망막 조직을 포함하는 세포 응집체의 배양)

실시예 1 에 기재된 방법에 의해 제조된 부유 배양 개시 후 18 일째의 망막 조직을 포함하는 세포 응집체를, Wnt 시그널 경로 작용 물질 (3 μM CHIR99021) 을 함유하는 무혈청 배지에서 3 일간 부유 배양하였다.

얻어진 세포 응집체를 4 ％ 파라포름알데히드로 고정시켜 동결 절편을 조제하였다. 조제된 동결 절편에 대해, GFP 형광상의 형광 현미경 관찰 (도 3) 및 신경 망막 전구 세포의 마커의 하나인 Chx10 의 면역 염색 (도 4) 을 실시하였다. Wnt 시그널 경로 작용 물질을 함유하는 무혈청 배지에서 3 일간 부유 배양한 상기 세포 응집체에 포함되는 망막 조직에는, Chx10 양성 세포가 3 ％ 정도 밖에 존재하지 않아, Chx10 양성 세포의 존재 비율이 분명하게 감소하고 있는 것을 확인할 수 있었다 (도 4 참조). 이 때, 상기 세포 응집체에는 RPE65 유전자를 발현하는 세포는 출현하고 있지 않았다.

실시예 4 (Wnt 시그널 경로 작용 물질을 함유하지 않는 혈청 배지 중에서의 "RPE65 유전자를 발현하는 세포가 출현하고 있지 않은 세포 응집체" 의 부유 배양 - 1)

실시예 1 및 실시예 3 에 기재된 방법에 의해 제조된 부유 배양 개시 후 21 일째 (상기의 "18 일째" 와 "3 일간" 의 합계 일수) 의 세포 응집체 (Chx10 양성 세포의 존재 비율 : 3 ％ 정도) 를, Wnt 시그널 경로 작용 물질을 함유하지 않는 혈청 배지 (DMEM/F12, 10 ％ 우태아 혈청, N2 supplement, 0.5 μM 레티노산 등을 함유한다) 에서, 40 ％ O₂ 조건하에서 추가로 39 일간 부유 배양하였다.

얻어진 세포 응집체를 4 ％ 파라포름알데히드로 고정시켜 동결 절편을 조제하였다. 조제된 동결 절편에 대해, GFP 형광상의 형광 현미경 관찰 (도 5) 및 모양체 주연부의 마커의 하나인 Rdh10 의 면역 염색 (도 6) 을 실시하였다. 상기와 같이 하여, Wnt 시그널 경로 작용 물질을 함유하지 않는 혈청 배지에서 39 일간 부유 배양한 후의 세포 응집체에 있어서, 망막 조직 (구체적으로는 신경 망막) 과 망막 색소 상피의 경계 영역에 존재하는 조직 중에는, Rdh10 양성 세포 (즉, 모양체 주연부형 구조체의 마커 유전자인 Rdh10 유전자를 발현하는 세포) 가 대략 균일한 군 영역으로서 존재하고 있어, 모양체 주연부형 구조체를 포함하는 세포 응집체가 고효율로 제조된 것을 확인할 수 있었다 (도 6 참조).

실시예 5 (Wnt 시그널 경로 작용 물질을 함유하지 않는 혈청 배지 중에서의 "RPE65 유전자를 발현하는 세포가 출현하고 있지 않은 세포 응집체" 의 부유 배양 - 2)

실시예 1 및 실시예 3 에 기재된 방법에 의해 제조된 부유 배양 개시 후 21 일째 (상기의 "18 일째" 와 "3 일간" 의 합계 일수) 의 세포 응집체 (Chx10 양성 세포의 존재 비율 : 3 ％ 정도) 를, 실시예 4 와 동일하게, Wnt 시그널 경로 작용 물질을 함유하지 않는 혈청 배지 (DMEM/F12, 10 ％ 우태아 혈청, N2 supplement, 0.5 μM 레티노산 등을 함유한다) 에서, 40 ％ O₂ 조건 하에서 추가로 50 일간 부유 배양하였다.

얻어진 세포 응집체를 4 ％ 파라포름알데히드로 고정시켜 동결 절편을 조제하였다. 조제된 동결 절편에 대해, GFP 형광상의 형광 현미경 관찰 (도 7), 및 모양체 주연부의 마커인 Rdh10 (도 8) 또는 Otx1 (도 9) 의 면역 염색을 실시하였다. 상기와 같이 하여 Wnt 시그널 경로 작용 물질을 함유하지 않는 혈청 배지에서 50 일간 부유 배양한 후의 세포 응집체에 있어서, 망막 조직 (구체적으로는 신경 망막) 과 망막 색소 상피의 경계 영역에 존재하는 조직 중에는, Rdh10 양성 세포 (즉, 모양체 주연부형 구조체의 마커 유전자인 Rdh10 유전자를 발현하는 세포) 가 대략 균일한 군 영역으로서 존재하고 있고 (도 8 참조), Otx1 양성 세포 (즉, 모양체 주연부형 구조체의 마커 유전자인 Otx1 유전자를 발현하는 세포) 도 동일하게 존재하고 있었다 (도 9 참조). 이러한 결과로부터, 당해 제조 방법에 의해, 모양체 주연부형 구조체를 포함하는 세포 응집체가 고효율로 제조된 것을 확인할 수 있었다.

실시예 6 (모양체 주연부형 구조체를 포함하는 세포 응집체의 증식 능력의 해석 - 1)

실시예 1 에 기재된 방법에 의해 제조된 부유 배양 개시 후 18 일째의 세포 응집체를 Wnt 시그널 경로 작용 물질을 함유하는 무혈청 배지 중에서 3 일간 부유 배양한 후, 실시예 4 및 실시예 5 와 동일하게, Wnt 시그널 경로 작용 물질을 함유하지 않는 혈청 배지 중에서 46 일간 부유 배양하였다. 그 후, 성장 세포를 표지하기 위해 BrdU 존재 하에서 1 일간 배양하고, 이어서 BrdU 비존재 하에서 13 일간 배양한 후에, EdU (Invitrogen) 존재 하에서 1 일간 배양하였다. 얻어진 세포 응집체를 4 ％ 파라포름알데히드로 고정시켜 동결 절편을 제조하고, 제조된 동결 절편에 대해, 항 Ki67 항체 (도 10 좌측 도면) 혹은 항 BrdU 항체 (도 10 우측 도면) 를 사용한 형광 면역 염색, 또는 EdU 의 발색 반응 (도 10 중간 도면) 을 실시하였다.

그 결과, 상기와 같이 하여 Wnt 시그널 경로 작용 물질을 함유하지 않는 혈청 배지에서 46 일간 부유 배양한 후의 세포 응집체에 있어서, 모양체 주연부형 구조체가 Ki67 양성의 성장 세포인 것을 알 수 있었다 (도 10 좌측 도면, 화살표로 나타낸다). Ki67 양성 세포의 90 ％ 이상이 EdU 양성인 점에서 (도 10 중간 도면, 화살표), 1 일간의 EdU 의 도입에 의해 성장 세포의 90 ％ 이상을 표지할 수 있는 것을 알 수 있었다. 한편, 모양체 주연부형 구조체의 Ki67 양성 세포에서는 BrdU 의 시그널이 약한 (도 10 우측 도면, 화살표) 점에서, 상기 Ki67 양성 세포가 BrdU 표지 후의 14 일간 지속적으로 계속 성장하여, DNA 에 도입된 BrdU 가 희석된 것으로 생각되었다. 이러한 결과로부터, 상기와 같이 하여 배양된 세포 응집체에 있어서, 모양체 주연부형 구조체가 progress zone 인 것을 알 수 있었다.

실시예 7 (모양체 주연부형 구조체를 포함하는 세포 응집체의 증식 능력의 해석 - 2)

실시예 1 에 기재된 방법에 의해 제조된 부유 배양 개시 후 18 일째의 세포 응집체를 Wnt 시그널 경로 작용 물질을 함유하는 무혈청 배지 중에서 3 일간 부유 배양한 후, 실시예 4, 실시예 5 및 실시예 6 과 동일하게, Wnt 시그널 경로 작용 물질을 함유하지 않는 혈청 배지 중에서 46 일간 부유 배양하였다. 그 후, 성장 세포를 표지하기 위해 BrdU 존재 하에서 1 일간 배양하고, 이어서 BrdU 비존재 하에서 13 일간 배양한 후에, EdU (Invitrogen) 존재 하에서 1 일간 배양하고, 추가로 EdU 비존재 하에서 13 일간 배양하였다. 얻어진 세포 응집체의 동결 절편을 제조하여, 항 Ki67 항체 (도 11 좌측 도면), 항 BrdU 항체 (도 11 우측 도면) 혹은 항 Rdh10 항체 (도 11 하측 도면) 에 의한 형광 면역 염색, 또는 EdU 의 발색 반응 (도 11 중간 도면) 을 실시하였다.

그 결과, 상기와 같이 하여 Wnt 시그널 경로 작용 물질을 함유하지 않는 혈청 배지에서 46 일간 부유 배양한 후의 세포 응집체에 있어서, Rdh10 양성의 모양체 주연부형 구조체 (도 11 하측 도면, 화살표로 나타낸다) 가 Ki67 양성인 것을 알 수 있었다 (도 11 좌측 도면). 상기 모양체 주연부형 구조체의 Ki67 양성 세포에 있어서, EdU (도 11 중간 도면) 및 BrdU (도 11 우측 도면) 의 시그널이 약한 것을 알 수 있었다. 따라서, 상기 모양체 주연부형 구조체의 Ki67 양성 세포가 27 일간 지속적으로 계속 성장하여, DNA 에 도입된 EdU 와 BrdU 가 희석된 것으로 생각되었다. 이러한 결과로부터, 상기와 같이 하여 배양된 세포 응집체에 있어서, 모양체 주연부형 구조체가 progress zone 인 것을 알 수 있었다.

실시예 8 (모양체 주연부형 구조체를 포함하는 세포 응집체에 있어서의 신경 망막의 형태의 해석)

실시예 1 에 기재된 방법에 의해 제조된 부유 배양 개시 후 18 일째의 세포 응집체를 Wnt 시그널 경로 작용 물질을 함유하는 무혈청 배지 중에서 3 일간 부유 배양한 후, 실시예 4, 실시예 5, 실시예 6 및 실시예 7 과 동일하게, Wnt 시그널 경로 작용 물질을 함유하지 않는 혈청 배지 중에서 75 일간 부유 배양하고, 얻어진 세포 응집체를 해석하였다. 당해 세포 응집체의 일례로서, 모양체 주연부형 구조체 (CMZ) 를 포함하지 않는 세포 응집체의 위상차상 (A, 좌열, 상단), 모양체 주연부형 구조체를 포함하지 않는 세포 응집체의 Crx 유전자 발현 세포의 GFP 형광상 (A, 좌열, 하단), 모양체 주연부형 구조체를 포함하는 세포 응집체의 위상차상 (A, 우열, 상단), 모양체 주연부형 구조체를 포함하는 세포 응집체의 Crx 유전자 발현 세포의 GFP 형광상 (A, 우열, 하단) 을 나타낸다. 모양체 주연부형 구조체를 포함하는 세포 응집체의 Crx 유전자 발현 세포의 GFP 형광상 (A, 우열, 하단) 에서는, 우측 하부에 모양체 주연부형 구조체에 근접하여, 층 구조를 갖고 연속된 신경 망막이 존재하는 것을 알 수 있었다 (화살표로 나타낸다).

모양체 주연부형 구조체를 포함하지 않는 세포 응집체 (CMZ-) 와, 모양체 주연부형 구조체를 포함하는 세포 응집체 (CMZ+) 에 있어서, 층 구조를 갖고 연속된 신경 망막이 세포 응집체 원주의 10 ％ 이상 존재하는 세포 응집체의 비율을 Crx 유전자 발현 세포의 형태를 지표로 하여 측정하였다 (도 12B). 그 결과, 모양체 주연부형 구조체를 포함하는 세포 응집체 (CMZ+) 가, 모양체 주연부형 구조체를 포함하지 않는 세포 응집체 (CMZ-) 와 비교하여, 층 구조를 갖고 연속된 신경 망막을 갖는 세포 응집체의 비율이 높은 것을 알 수 있었다.

산업상 이용가능성

본 발명 방법에 의하면, 고효율로 모양체 주연부형 구조체를 제조하는 것이 가능하다. 본 발명 제조 방법에 의해 제조된 모양체 주연부형 구조체를 포함하는 세포 응집체에 있어서, 모양체 주연부형 구조체는 progress zone 으로서 기능하고, 당해 모양체 주연부형 구조체에 근접하여, 층 구조를 갖고 연속된 신경 망막이 고빈도로 형성될 수 있다.

본 출원은, 일본에서 출원된 일본 특허출원 2012-130521 (출원일 2012년 6월 8일) 을 기초로 하고 있으며, 그들의 내용은 본 명세서에 모두 포함되는 것이다. 본 명세서 중에서 인용하는 모든 간행물, 특허 및 특허 출원을 그대로 참조에 의해 본 명세서에 도입하는 것으로 한다.

Claims

망막 조직을 포함하는 세포 응집체이고, 상기 조직에 있어서의 Chx10 양성 세포의 존재 비율이 20 ％ 이상인 세포 응집체를, 각각 Wnt 에 의해 매개되는 시그널 전달을 증강시킬 수 있는 Wnt 시그널 경로 작용 물질을 함유하는 무혈청 배지 또는 혈청 배지 중에서, RPE65 유전자를 발현하는 세포가 출현하기 이전까지의 기간 중에 한하여 배양한 후 얻어진, RPE65 유전자를 발현하는 세포가 출현하고 있지 않고 Chx10 양성 세포가 감소된 비율로 망막 조직에 존재하는 세포 응집체를, 각각 Wnt 에 의해 매개되는 시그널 전달을 증강시킬 수 있는 Wnt 시그널 경로 작용 물질을 함유하지 않는 무혈청 배지 또는 혈청 배지 중에서 배양하는 공정을 포함하는, 모양체 주연부형 구조체를 포함하는 세포 응집체의 제조 방법으로서,
모양체 주연부형 구조체는 Rdh10 양성 세포를 포함하는, 세포 응집체의 제조 방법.
제 1 항에 있어서, RPE65 유전자를 발현하는 세포가 출현하기 이전까지의 기간이, Chx10 양성 세포의 존재 비율이 조직의 50 ％ 내지 1 ％ 의 범위 내인 기간이고, 또한 RPE65 유전자를 발현하는 세포가 출현하고 있지 않고 Chx10 양성 세포가 감소된 비율로 망막 조직에 존재하는 세포 응집체가, 상기 망막 조직에 있어서의 Chx10 양성 세포의 존재 비율이 조직의 50 ％ 내지 1 ％ 의 범위 내인 세포 응집체인, 세포 응집체의 제조 방법.
제 2 항에 있어서, RPE65 유전자를 발현하는 세포가 출현하고 있지 않고 Chx10 양성 세포가 감소된 비율로 망막 조직에 존재하는 세포 응집체를, 상기 망막 조직에 있어서의 Chx10 양성 세포의 존재 비율이 조직의 50 ％ 이상에 이를 때까지, 각각 Wnt 에 의해 매개되는 시그널 전달을 증강시킬 수 있는 Wnt 시그널 경로 작용 물질을 함유하지 않는 무혈청 배지 또는 혈청 배지 중에서 배양하는, 세포 응집체의 제조 방법.
제 1 항에 있어서, Wnt 에 의해 매개되는 시그널 전달을 증강시킬 수 있는 Wnt 시그널 경로 작용 물질이 Wnt 패밀리에 속하는 단백질, Wnt 수용체, Wnt 수용체 아고니스트, GSK3β 저해제, 6-브로모인디루빈-3'-옥심 (6-Bromoindirubin-3'-oxime, BIO), CHIR99021 및 켄파울론 (Kenpaullone) 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 세포 응집체의 제조 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 망막 조직이 인간 다능성 간세포 유래인, 세포 응집체의 제조 방법.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 따른 세포 응집체의 제조 방법에 의해 제조되는 모양체 주연부형 구조체를 포함하는 세포 응집체로서, 독성 또는 약물 효능 평가용 시약으로서 사용되는 세포 응집체.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 따른 세포 응집체의 제조 방법에 의해 제조되는 모양체 주연부형 구조체를 포함하는 세포 응집체로서, 이식용 생체 재료로서 사용되는 세포 응집체.
신경 망막의 제조 방법으로서,
(a) 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 기재된 세포 응집체의 제조 방법에 의해 모양체 주연부형 구조체를 포함하는 세포 응집체를 제조하는 단계, 여기서 망막 색소 상피 및 신경 망막은 모양체 주연부형 구조체에 인접하여 존재하고 신경 망막은 응집체의 표면을 덮음, 및
(b) 단계 (a) 에서 제조된 세포 응집체로부터 신경 망막을 잘라내어, 정제된 신경 망막을 수득하는 단계
를 포함하는, 신경 망막의 제조 방법.
모양체 주연부형 구조체, 망막 색소 상피 및 연속된 층 구조를 갖는 신경 망막을 포함하는 세포 응집체로서,
상기 신경 망막이 세포 응집체의 표면을 덮고 있고, 망막 색소 상피에 의해 덮여 있지 않고;
망막 색소 상피 및 신경 망막은 동일한 세포 응집체에서 모양체 주연부형 구조체에 인접하여 존재하고;
모양체 주연부형 구조체는 Rdh10 양성 세포를 포함하는, 세포 응집체.
제 9 항에 있어서, 신경 망막이 세포 응집체 원주의 10% 이상으로 존재하는, 세포 응집체.
제 9 항 또는 제 10 항에 따른 세포 응집체로부터 신경 망막을 잘라내어, 정제된 신경 망막을 수득하는 것을 포함하는, 신경 망막의 제조 방법.