KR102604618B1 - 망막 조직을 포함하는 세포 응집체 및 그의 제조 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명의 일 실시 형태의 스페어상 세포 응집체는, 신경 망막을 포함하는 코어부와, 상기 코어부의 표면의 적어도 일부를 연속적으로 또는 단속적으로 덮는 피복부를 구비하는 스페어상 세포 응집체로서, (1) 상기 신경 망막에 있어서, 적어도 시세포층을 포함하는 신경 망막층이 형성되어 있고, 상기 시세포층은 적어도 시세포, 시세포 전구 세포 및 망막 전구 세포로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 세포를 포함하고, 상기 시세포층에 포함되는 세포가 상기 코어부의 표면의 접선 방향으로 연속해서 존재하고 있으며, (2) 상기 피복부는, 서로 접촉하는 망막 색소 상피 세포를 포함하고, (3) 상기 세포 응집체는, 수정체, 초자체, 각막 및 혈관을 포함하지 않으며, 또한 (4) 상기 망막 색소 상피 세포는, 상기 신경 망막층과 함께 연속되는 상피 구조를 구성하고 있지 않은 것을 특징으로 한다.

Description

망막 조직을 포함하는 세포 응집체 및 그의 제조 방법
본 발명은, 신경 망막을 포함하는 스페어상 세포 응집체 및 그의 제조 방법, 특히 신경 망막을 포함하는 코어부와, 해당 코어부의 표면의 적어도 일부를 연속적으로 또는 단속적으로 덮고, 망막 색소 상피 세포를 포함하는 피복부를 구비하는 스페어상 세포 응집체 및 그의 제조 방법에 관한 것이다.
진행된 노인성 황반 변성증 등의 시세포와 망막 색소 상피(RPE) 세포가 동시에 장애되는 경우에는, 신경 망막(NR)과 망막 색소 상피(RPE) 세포의 동시 이식이 바람직하다고 여겨지고 있다.
한편, 망막 색소 변성 등 망막 조직의 장애에 기초하는 질환에 대한 망막의 이식 치료에 관련하여, 다능성 줄기 세포로부터 신경 망막이나, 망막 색소 상피(RPE) 세포를 제조하는 방법의 연구가 활발하게 행해지고 있다. 다능성 줄기 세포로부터 신경 망막을 제조하는 방법으로서, 예를 들어 다능성 줄기 세포의 응집체를, BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하는 배지 중에서 부유 배양함으로써, 신경 망막을 얻는 방법(특허문헌 1, 2 및 비특허문헌 1)이 알려져 있다. 또한, 다능성 줄기 세포로부터 RPE 세포를 제조하는 방법으로서, 예를 들어 레티노인산 수용체 안타고니스트를 포함하는 배지 중에서 유도한 망막 전구 세포로부터 RPE 세포를 얻는 방법(특허문헌 3)이 알려져 있다. 그러나, NR과 RPE 세포의 양자가 생체 망막에 있어서의 망막 조직과 동일하도록 방향성을 가지고 정확하게 국재되어 있는 상태에서, 양자를 포함하는 망막 조직을 제조하는 방법은 알려져 있지 않다.
지금까지, 망막 전구 세포와 RPE 세포의 세포 혼합물의 이식(비특허문헌 2) 및 RPE 세포 시트에 망막 전구 세포를 접착시킨 RPE 세포-망막 전구 세포 접착체의 이식은 보고되어 있었다(특허문헌 4).
그러나, 비특허문헌 2에서는 서로 접착되어 있지 않은 세포의 혼합물이 사용되고 있으며, 특허문헌 1에서는 RPE 세포 시트에 접착되어 있는 망막 전구 세포끼리는 밀하게 접착되어 있지 않고, 망막 조직으로서 기능할 수 있는 상태는 아니다. 따라서, 어느 경우에도, 이식 후의 장기 생착성이 좋지 않을 것으로 예상된다.
국제 공개 제2015/025967호 국제 공개 제2016/063986호 국제 공개 제2012/173207호 미국 특허 출원 공개 제2016/0331867호 명세서
Atsushi Kuwahara 등, Nature Communications, 6, 6286(2015) Seiler 등, Curr Eye Res. 1995 Mar; 14(3): 199-207
본 발명은, 이식에 적합한 망막 조직, 특히 신경 망막 및 망막 색소 상피 세포를 포함하는 세포 응집체 및 그의 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은, 신경 망막을 포함하는 스페어상 세포 응집체에 RPE 세포를 접촉시킴으로써, 당해 세포 응집체에 RPE 세포를 접착시킨 본 발명에 관한 스페어상 세포 응집체를 얻을 수 있고, 해당 응집체로부터 물리적으로 잘라낸 세포 시트를 망막 변성 누드 래트에 이식한 바 양호한 생착이 확인되는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은 이하에 관한 것이다.
[1] 신경 망막을 포함하는 코어부와, 상기 코어부의 표면의 적어도 일부를 연속적으로 또는 단속적으로 덮는 피복부를 구비하는 스페어상 세포 응집체로서,
(1) 상기 신경 망막에 있어서, 적어도 시세포층을 포함하는 신경 망막층이 형성되어 있고, 상기 시세포층은 적어도 시세포, 시세포 전구 세포 및 망막 전구 세포로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 세포를 포함하고, 상기 시세포층에 포함되는 세포가 상기 코어부의 표면의 접선 방향으로 연속해서 존재하고 있으며,
(2) 상기 피복부는, 서로 접촉하는 망막 색소 상피 세포를 포함하고,
(3) 상기 세포 응집체는, 수정체, 초자체, 각막 및 혈관을 포함하지 않으며, 또한
(4) 상기 망막 색소 상피 세포는, 상기 신경 망막층과 함께 연속되는 상피 구조를 구성하고 있지 않은
것을 특징으로 하는 스페어상 세포 응집체.
[2] (2)에 있어서의 시세포층과, 해당 시세포층의 적어도 일부를 덮는 망막 색소 상피 세포 사이에, 추가로 세포외 매트릭스가 존재하는, [1]의 스페어상 세포 응집체.
[3] 세포외 매트릭스가, 히알루론산, 라미닌, IV형 콜라겐, 헤파란황산프로테오글리칸 및 엔탁틴으로 이루어지는 군에서 선택되는 1개 또는 복수의 세포외 매트릭스인, [2]의 스페어상 세포 응집체.
[4] 신경 망막을 포함하는 스페어상의 세포 응집체(신경 망막의 세포 응집체)로서,
(I) 상기 신경 망막의 세포 응집체에 있어서, 상기 신경 망막은 상기 세포 응집체의 표면에 존재하고 있으며, 또한
(II) 상기 신경 망막에 있어서 적어도 시세포층을 포함하는 신경 망막층이 형성되어 있고, 상기 시세포층에는 망막 전구 세포, 시세포 전구 세포 및 시세포로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 세포가 존재하고 있는, 신경 망막의 세포 응집체를 조제하는 공정과,
망막 색소 상피 세포를 조제하는 공정과,
상기 신경 망막의 세포 응집체 및 상기 망막 색소 상피 세포를 접촉시키는 공정을 포함하는,
[1] 내지 [3] 중 어느 스페어상 세포 응집체의 제조 방법.
[5] 상기 신경 망막의 세포 응집체에 있어서의 상기 신경 망막에 있어서의 Chx10 양성 세포의 존재 비율이 20％ 이상인, [4]의 제조 방법.
[6] 접촉 공정에 있어서, 접착 인자의 존재 하에서 접촉시키는, [4] 또는 [5]의 제조 방법.
[7] 접착 인자가 세포외 매트릭스인, [6]의 제조 방법.
[8] 세포외 매트릭스가, 히알루론산, 라미닌, IV형 콜라겐, 헤파란황산프로테오글리칸 및 엔탁틴으로 이루어지는 군에서 선택되는 1개 또는 복수의 세포외 매트릭스인, [7]의 제조 방법.
[9] 신경 망막의 세포 응집체 및 망막 색소 상피 세포의 적어도 한쪽이 다능성 줄기 세포 유래인, [4] 내지 [7] 중 어느 제조 방법.
[10] 망막 색소 상피 세포를 조제하는 공정에 있어서, 망막 색소 상피 세포가 세포 시트 또는 세포 현탁액으로서 조제되는, [4] 내지 [8] 중 어느 제조 방법.
[11] 접촉 공정 후에, 망막 색소 상피 세포가 다각형 또는 포석상(敷石狀)의 세포 형태를 가질 때까지 더 배양하는, [4] 내지 [10] 중 어느 제조 방법.
[12] [1] 내지 [3] 중 어느 스페어상 세포 응집체를 함유하여 이루어지는, 피검 물질의 독성 또는 약효 평가용 시약.
[13] [1] 내지 [3] 중 어느 스페어상 세포 응집체 또는 당해 세포 응집체의 일부에 피검 물질을 접촉시켜, 피검 물질이 해당 스페어상 세포 응집체 또는 해당 스페어상 세포 응집체에 포함되는 세포에 미치는 영향을 검정하는 것을 포함하는, 피검 물질의 독성 또는 약효 평가 방법.
[14] [1] 내지 [3] 중 어느 스페어상 세포 응집체 또는 당해 세포 응집체의 일부를 함유하여 이루어지는, 망막 색소 상피 세포, 망막계 세포 혹은 망막 조직의 장애 또는 망막 조직의 손상에 기초하는 질환의 치료약.
[15] [1] 내지 [3] 중 어느 스페어상 세포 응집체 또는 당해 세포 응집체의 일부의 유효량을, 이식을 필요로 하는 대상으로 이식하는 것을 포함하는, 망막 색소 상피 세포, 망막계 세포 혹은 망막 조직의 장애 또는 망막 조직의 손상에 기초하는 질환의 치료 방법.
[16] 망막 색소 상피 세포, 망막계 세포 혹은 망막 조직의 장애 또는 망막 조직의 손상에 기초하는 질환의 치료에 있어서의 사용을 위한, [1] 내지 [3] 중 어느 스페어상 세포 응집체 또는 당해 세포 응집체의 일부.
[17] [1] 내지 [3] 중 어느 스페어상 세포 응집체 또는 당해 세포 응집체의 일부를 유효 성분으로서 함유하는 의약 조성물.
[18] [1] 내지 [3] 중 어느 스페어상 세포 응집체로부터 물리적으로 잘라내어져 이루어지는, 스페어상 세포 응집체의 일부.
[19] 망막 색소 상피 세포 및 신경 망막을 포함하는 세포 시트인, [18]의 스페어상 세포 응집체의 일부.
[20] [1] 내지 [3] 중 어느 스페어상 세포 응집체의 일부를 물리적으로 잘라내는 공정을 포함하는, 스페어상 세포 응집체의 일부의 제조 방법.
[21] 상기 스페어상 세포 응집체의 일부가, 망막 색소 상피 세포 및 신경 망막을 포함하는 세포 시트인, [20]의 제조 방법.
본 발명에 따르면, 생체 내에 있어서 각 망막계 세포가 존재해야 할 적절한 위치에, 장기간에 걸쳐 생착할 수 있는, 이식에 적합한 망막 조직, 특히 신경 망막 및 망막 색소 상피 세포를 포함하는 세포 응집체 및 그의 제조 방법을 제공할 수 있다.
도 1은 인간 ES 세포로부터 분화 유도하고, 망막 색소 상피(RPE) 세포와 신경 망막(NR)을 구분 제작한 현미경 관찰 결과 (A, B, C, D) 및 형광 현미경 관찰 결과 (A', B', C', D')를 나타내는 도면이다.
도 2는 실시예 2의 NR과 RPE 세포를 접착시키는 방법 (A), 그리고 접착 1시간 후 및 접착의 다음날의 현미경 관찰 결과 (B, C, D) 및 형광 현미경 관찰 결과 (B', C', D')를 나타내는 도면이다.
도 3은 실시예 2에서 NR과 RPE 세포를 접착시킨 후 1일째, 6일째 및 45일째의 경시 변화를 현미경으로 관찰한 결과 (E, F, G), 그리고, 45일째에 있어서의 NR 표면에 접착되어 있는 RPE 세포의 형태를 현미경으로 관찰한 결과 (H) 및 형광 현미경으로 관찰한 결과 (H')를 나타내는 도면이다.
도 4는 실시예 2에서 NR과 RPE 세포를 접착시킨 후 50일째의 NR-RPE 세포의 응집 덩어리를 면역 염색하여, 공초점 형광 현미경으로 관찰한 결과 (I, J)를 나타내는 도면이다.
도 5는 실시예 3의 NR과 RPE 세포를 접착시키는 방법 (A), 그리고 접착 직후 및 10분 후의 현미경 관찰 결과 (B)를 나타내는 도면이다.
도 6은 실시예 3에서 NR과 RPE 세포를 접착시킨 직후 및 13일째의 경시 변화를 현미경으로 관찰한 결과 (C, D) 및 형광 현미경으로 관찰한 결과 (C', D')를 나타내는 도면이다.
도 7은 실시예 4에서 제작한 NR-RPE 세포 시트를 접착시키고 나서 5일간 및 50일간 배양하여 형광 현미경으로 관찰한 결과 (A, B, C, D, E, F), 그리고 배양한 NR-RPE 세포 시트를 잘라내어, 형광 현미경으로 관찰한 결과 (A', B', C', D', E', F')를 나타내는 도면이다.
도 8은 실시예 4에서 제작한 NR-RPE 세포 시트를 이식하여 5개월 이상 후의 눈 조직 절편을 현미경 하에서 관찰한 결과 (G) 및 형광 현미경으로 관찰한 결과 (G')를 나타내는 도면이다.
도 9는 실시예 4에서 제작한 NR-RPE 세포 시트를 이식한 5개월 이상 후의 그래프트를 면역 염색하여, 공초점 형광 현미경으로 관찰한 결과 (H)를 나타내는 도면이다.
도 10은 실시예 4에서 제작한 NR-RPE 세포 시트를 이식한 5개월 이상 후의 그래프트를 면역 염색하여, 공초점 형광 현미경으로 관찰한 결과 (I)를 나타내는 도면이다.
[스페어상 세포 응집체]
본 발명의 일 실시 형태의 스페어상 세포 응집체는, 신경 망막을 포함하는 코어부와, 상기 코어부의 표면의 적어도 일부를 연속적으로 또는 단속적으로 덮는 피복부를 구비하는 것이며, 이하의 (1) 내지 (4)의 특징을 갖는다:
(1) 상기 신경 망막에 있어서, 적어도 시세포층을 포함하는 신경 망막층이 형성되어 있고, 상기 시세포층은 적어도 시세포, 시세포 전구 세포 및 망막 전구 세포로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 세포를 포함하고, 상기 시세포층에 포함되는 세포가 상기 코어부의 표면의 접선 방향으로 연속해서 존재하고 있으며,
(2) 상기 피복부는, 서로 접촉하는 망막 색소 상피 세포를 포함하고,
(3) 상기 세포 응집체는, 수정체, 초자체, 각막 및 혈관을 포함하지 않으며, 또한
(4) 상기 망막 색소 상피 세포는, 상기 신경 망막층과 함께 연속되는 상피 구조를 구성하고 있지 않다.
「스페어(sphere)상 세포 응집체」는, 구상에 가까운 입체적인 형을 갖는 세포 응집체를 의미한다. 구상에 가까운 입체적인 형이란, 삼차원 구조를 갖는 형이며, 이차원면에 투영하였을 때, 예를 들어 원형 또는 타원형을 나타내는 구상형, 및 구상형이 복수 융합하여 형성되는 형상(예를 들어 이차원에 투영한 경우에 2 내지 4개의 원형 혹은 타원형이 겹쳐서 형성하는 형을 나타냄)을 들 수 있다. 일 형태에 있어서, 응집체의 코어부는 소포성 층상 구조를 갖고, 명시야 현미경 하에서는, 중앙부가 어둡게 외연 부분이 밝게 관찰된다는 특징을 갖는다.
「세포 응집체」(Cell Aggregate)란, 복수의 세포끼리가 접착되어 입체 구조를 형성하고 있는 것이면 특별히 한정은 없으며, 예를 들어 배지 등의 매체 중에 분산되어 있었던 세포가 집합되어 형성하는 덩어리, 또는 세포 분열을 거쳐서 형성되는 세포의 덩어리 등을 말한다. 세포 응집체에는, 특정한 조직을 형성하고 있는 경우도 포함된다.
상기 세포 응집체의 코어부는 신경 망막을 포함한다. 「망막 조직(Retinal tissue 또는 Retinal organoid)」이란, 생체 망막에 있어서 각 망막층을 구성하는 망막계 세포가 1종류 또는 복수 종류, 층상으로 입체적으로 포함되는 조직을 의미하고, 「신경 망막(Neural Retina)」은 망막 조직이며, 후술하는 망막층 중 망막 색소 상피층을 포함하지 않는, 망막 색소 상피층의 내측의 신경 망막층을 포함하는 조직을 의미한다. 각각의 세포가 어느 망막층을 구성하는 세포인 지는, 공지된 방법, 예를 들어 세포 마커의 발현 유무 또는 발현의 정도 등에 의해 확인할 수 있다.
상기 「세포 응집체의 코어부」의 일부의 영역에는, 망막 색소 상피 세포 및/또는 모양체 주연부용 구조체를 포함하고 있어도 된다. 일 형태로서, 세포 응집체의 외(外) 환경에 대하여 형성하고 있는 연속적인 경계면(신경 망막에 의해 구성됨)의 일부가 망막 색소 상피 세포에 의해 구성되고, 또한 신경 망막과 망막 색소 상피 세포의 경계 영역에 모양체 주연부용 구조체가 존재한다. 이러한 「세포 응집체의 코어부」로서, 구체적으로는 WO2013/183774에 개시되는 세포 응집체를 들 수 있다(도 12A).
「망막계 세포(Retinal cell)」란, 생체 망막에 있어서 각 망막층을 구성하는 세포 또는 그의 전구 세포를 의미한다. 구체적으로는, 시세포(간체 시세포, 추체 시세포), 수평 세포, 아마크린 세포, 개재 신경 세포, 망막 신경절 세포(신경절 세포), 쌍극 세포(간체 쌍극 세포, 추체 쌍극 세포), 뮬러 글리아 세포, 망막 색소 상피(RPE) 세포, 모양체 주연부 세포, 이들의 전구 세포(예: 시세포 전구 세포, 쌍극 세포 전구 세포 등), 망막 전구 세포 등의 세포가 포함되지만 이들에 한정되지 않는다. 상기 망막계 세포 중, 신경 망막층을 구성하는 세포로서, 구체적으로는 시세포(간체 시세포, 추체 시세포), 수평 세포, 아마크린 세포, 개재 신경 세포, 망막 신경절 세포(신경절 세포), 쌍극 세포(간체 쌍극 세포, 추체 쌍극 세포), 뮬러 글리아 세포, 및 이들의 전구 세포(예: 시세포 전구 세포, 쌍극 세포 전구 세포 등) 등의 세포를 들 수 있다.
「성숙한 망막계 세포」란, 인간 성인의 망막 조직에 포함될 수 있는 세포를 의미하고, 구체적으로는 시세포(간체 시세포, 추체 시세포), 수평 세포, 아마크린 세포, 개재 신경 세포, 망막 신경절 세포(신경절 세포), 쌍극 세포(간체 쌍극 세포, 추체 쌍극 세포), 뮬러 글리아 세포, 망막 색소 상피(RPE) 세포, 모양체 주연부 세포 등이 분화된 세포를 의미한다. 「미성숙 망막계 세포」란, 성숙한 망막계 세포로의 분화가 결정지어져 있는 전구 세포(예: 시세포 전구 세포, 쌍극 세포 전구 세포, 망막 전구 세포 등)를 의미한다.
시세포 전구 세포, 수평 세포 전구 세포, 쌍극 세포 전구 세포, 아마크린 세포 전구 세포, 망막 신경절 세포 전구 세포, 뮬러 글리아 전구 세포, 망막 색소 상피 전구 세포란, 각각 시세포, 수평 세포, 쌍극 세포, 아마크린 세포, 망막 신경절 세포, 뮬러 글리아 세포, 망막 색소 상피 세포로의 분화가 결정지어져 있는 전구 세포를 말한다.
「망막 전구 세포」란, 시세포 전구 세포, 수평 세포 전구 세포, 쌍극 세포 전구 세포, 아마크린 세포 전구 세포, 망막 신경절 세포 전구 세포, 뮬러 글리아 세포, 망막 색소 상피 전구 세포 등의 어느 미성숙 망막계 세포로도 분화될 수 있는 전구 세포이며, 최종적으로 시세포, 간체 시세포, 추체 시세포, 수평 세포, 쌍극 세포, 아마크린 세포, 망막 신경절 세포, 망막 색소 상피 세포 등의 어느 성숙한 망막계 세포로도 분화될 수 있는 전구 세포를 말한다.
「시세포(photoreceptor cell)」란, 망막의 시세포층에 존재하고, 광자극을 흡수하여 전기 신호로 변환하는 역할을 갖는다. 시세포에는, 명소에서 기능하는 추체(cone)와 암소에서 기능하는 간체(杆體)(또는 간체(桿體), rod)의 2종류가 있다. 시세포는 시세포 전구 세포로부터 분화되어, 성숙한다. 세포가 시세포 혹은 시세포 전구 세포인지 여부는, 당업자라면 예를 들어 후술하는 세포 마커(시세포 전구 세포에서 발현하는 Crx 및 Blimp1, 시세포에서 발현하는 리커버린, 성숙 시세포에서 발현하는 로돕신, S-Opsin 및 M/L-Opsin 등)의 발현, 외절 구조의 형성 등에 의해 용이하게 확인할 수 있다. 일 형태에 있어서, 시세포 전구 세포는 CrX 양성 세포이며, 시세포는 로돕신, S-Opsin 및 M/L-Opsin 양성 세포이다.
「망막 색소 상피 세포」란, 생체 망막에 있어서 신경 망막의 외측에 존재하는 상피 세포를 의미한다. 세포가 망막 색소 상피 세포인지 여부는, 당업자라면 예를 들어 후술하는 세포 마커(RPE65, Mitf, CRALBP, MERTK, BEST1 등)의 발현이나, 멜라닌 과립의 존재(흑갈색), 세포간의 타이트 정션, 다각형·포석상의 특징적인 세포 형태 등에 의해 용이하게 확인할 수 있다. 세포가 망막 색소 상피 세포의 기능을 갖는지 여부는, VEGF 및 PEDF 등의 사이토카인의 분비능 등에 의해 용이하게 확인할 수 있다. 일 형태에 있어서, 망막 색소 상피 세포는 RPE65 양성 세포, Mitf 양성 세포, 또는 RPE65 양성 또한 Mitf 양성 세포이다.
망막계 세포의 존재는, 망막계 세포의 마커(이하, 「망막계 세포 마커」라고 하는 경우가 있음)의 발현의 유무에 의해 확인할 수 있다. 망막계 세포 마커의 발현 유무, 또는 세포 집단 혹은 조직에 있어서의 망막계 세포 마커 양성 세포의 비율은, 당업자라면 용이하게 확인할 수 있다. 예를 들어, 시판되고 있는 항체를 사용한 플로우 사이토메트리, 면역 염색 등의 방법에 의해, 특정한 망막계 세포 마커 양성 세포의 수를 전체 세포수로 제산함으로써 확인할 수 있다.
망막계 세포 마커로서는, 망막 전구 세포에서 발현하는 Rx(「Rax」라고도 한다.), PAX6 및 Chx10, 시세포 전구 세포에서 발현하는 Crx 및 Blimp1, 시세포에서 발현하는 리커버린, 쌍극 세포에서 발현하는 Chx10, PKCα 및 L7, 망막 신경절 세포에서 발현하는 TuJ1 및 Brn3, 아마크린 세포에서 발현하는 칼레티닌, 수평 세포에서 발현하는 칼빈딘, 성숙 시세포에서 발현하는 로돕신, 간체 시세포로 발현하는 Nrl 및 로돕신, 추체 시세포에서 발현하는 Rxr-gamma, S-Opsin 및 M/L-Opsin, 뮬러 글리아 세포에서 발현하는 GS 및 GFAP, 망막 색소 상피 세포에서 발현하는 RPE65 및 Mitf, 모양체 주연부 세포에서 발현하는 Rdh10 및 SSEA1 등을 들 수 있다.
「양성 세포」란, 특정한 마커를 세포 표면 상 또는 세포 내에 발현하고 있는 세포를 의미한다. 예를 들어, 「Chx10 양성 세포」란, Chx10 단백질을 핵 내에 발현하고 있는 세포를 의미한다.
(1) 스페어상 세포 응집체의 코어부의 신경 망막에 있어서, 적어도 시세포층을 포함하는 신경 망막층이 형성되어 있다. 「망막층」이란, 망막을 구성하는 각 층을 의미하고, 구체적으로는 망막 색소 상피층, 시세포층, 외경계막, 외과립층, 외망상층, 내과립층, 내망상층, 신경절 세포층, 신경 섬유층 및 내경계막을 들 수 있다. 「신경 망막층」이란, 신경 망막을 구성하는 각 층을 의미하고, 구체적으로는 시세포층, 외경계막, 외과립층, 외망상층, 내과립층, 내망상층, 신경절 세포층, 신경 섬유층 및 내경계막을 들 수 있다. 「시세포층」이란, 망막층 또는 신경 망막층의 1종이며, 신경 망막의 가장 외측에 형성되고, 시세포(간체 시세포, 추체 시세포), 시세포 전구 세포 및 망막 전구 세포를 많이 포함하는 망막층을 의미한다.
코어부의 신경 망막에 있어서의 시세포층은 적어도 시세포, 시세포 전구 세포 및 망막 전구 세포로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 세포(이하, 「시세포 등」이라고 하는 경우가 있음)를 포함하고, 여기서 시세포는 간체 시세포 및 추체 시세포를 포함하고, 시세포층에 존재하는 전체 세포에 대하여, 시세포 등은 핵의 수를 기준으로 70％ 이상, 바람직하게는 80％ 이상, 보다 바람직하게는 90％ 이상을 차지한다. 코어부의 신경 망막에 있어서의 시세포층은, 적어도 응집체 코어부의 가장 외측에 형성되어 있고, 또한 내측에도 시세포층이 형성되어 있어도 된다. 상기 시세포 등은 코어부 표면의 접선 방향으로 연속되고, 즉, 서로 접착되어 존재하고 있으며, 시세포 등이 코어부 표면의 접선 방향으로 연속해서 존재함으로써, 시세포 등을 포함하는 시세포층을 형성하고 있다. 또한, 접선 방향이란, 스페어상 세포 응집체의 코어부(신경 망막) 표면에 대한 접선 방향, 즉, 시세포층에 있어서의 시세포 등이 배열되어 있는 방향을 말하고, 당해 신경 망막에 대하여 평행 방향 또는 가로 방향이다.
코어부의 신경 망막의 일 형태로서, 또한 망막 색소 상피 세포의 덩어리를 동일 응집체 내에 갖고, 상술한 신경 망막과 망막 색소 상피 세포의 경계 영역에 모양체 주연부 형식 구조체를 갖는 소위 카브라형의 응집체(비특허문헌 1)일 수도 있다.
모양체 주연부 형식 구조체는, 모양체 주연부와 유사한 구조체이다. 「모양체 주연부(ciliary marginal zone; CMZ)」로서는, 예를 들어 생체 망막에 있어서 신경 망막과 망막 색소 상피의 경계 영역에 존재하는 조직이며, 또한 망막의 조직 줄기 세포(망막 줄기 세포)를 포함하는 영역을 들 수 있다. 모양체 주연부는, 모양체연(ciliary margin) 또는 망막연(retinal margin)이라고도 불리고, 모양체 주연부, 모양체연 및 망막연은 동등한 조직이다. 모양체 주연부는, 망막 조직에의 망막 전구 세포, 분화 세포의 공급, 망막 조직 구조의 유지 등에 중요한 역할을 하고 있는 것이 알려져 있다. 모양체 주연부의 마커 유전자로서는, 예를 들어 Rdh10 유전자(양성), Otx1 유전자(양성) 및 Zic1(양성)을 들 수 있다.
(2) 스페어상 세포 응집체의 피복부는, 세포 응집체의 코어부의 표면의 적어도 일부를 연속적으로 또는 단속적으로 덮고 있고, 여기에서는, 스페어상 세포 응집체의 코어부의 표면이란, 코어부의 신경 망막의 표면에 존재하는 가장 외측의 시세포층의 표면을 의미한다. 피복부는, 바람직하게는 코어부의 표면적의 30％ 이상, 보다 바람직하게는 50％ 이상을 덮고 있다. 코어부의 표면을 연속적으로 덮고 있다는 것이란, 피복부는 코어부의 표면에 있어서 연속적인 하나의 덩어리로서 존재하고 있는 것을 말하고, 코어부의 표면을 단속적으로 덮는 것이란, 피복부는 코어부의 표면에 있어서 2 이상의 연속적인 덩어리 또는 층으로서 존재하고, 각각의 연속적인 덩어리는 서로 접속되어 있지 않은 것을 말한다. 피복부가 코어부의 표면을 단속적으로 덮고 있는 경우에 있어서, 각각의 연속적인 덩어리는 코어부의 표면적의 10％ 이상, 또는 20％ 이상을 연속적으로 덮고 있는 것이 바람직하다.
피복부는, 서로 접촉하는 망막 색소 상피(RPE) 세포를 포함하고, 여기서 RPE 세포는, 망막 색소 상피 전구 세포도 포함한다. RPE 세포가 「서로 접촉하는」이란, 피복부에 있어서 1의 RPE 세포가 다른 RPE 세포와 접촉되어 있는 상태를 의미하고, 다른 RPE 세포와 접촉되지 않은 독립된 단일의 RPE 세포는 피복부를 구성하지 않는다.
상기 코어부의 표면에 존재하는 시세포층과, 해당 시세포층의 적어도 일부를 덮는 망막 색소 상피 세포 사이에, 피복부의 일부로서, 또한 1개 또는 복수의 세포외 매트릭스가 존재해도 된다. 세포외 매트릭스란, 세포의 외측 공간을 구성하는 생체 고분자를 의미하고, 피브로넥틴, 비트로넥틴, 라미닌 등의 세포 접착성 단백질, 콜라겐, 엘라스틴 등의 섬유성 단백질, 이들 단백질의 프래그먼트, 히알루론산, 콘드로이틴황산 등의 글루코사미노글리칸 또는 프로테오글리칸 등을 들 수 있다. 바람직하게는 히알루론산, 라미닌, IV형 콜라겐, 헤파란황산프로테오글리칸 및 엔탁틴으로 이루어지는 군에서 선택되는 1개 또는 복수의 세포외 매트릭스이다. 적합한 세포외 매트릭스로서, 라미닌의 프래그먼트를 들 수 있다(예: 라미닌 511-E8 프래그먼트, 라미닌 521-E8 프래그먼트).
(3) 태아 망막을 포함하는 생체 망막은, 수정체, 초자체, 각막 및 혈관을 포함하는 것에 비해, 본 발명의 스페어상 세포 응집체는, 수정체, 초자체, 각막 및 혈관을 포함하지 않는다는 특징을 갖는다.
「수정체」란, 외로부터 안구에 들어온 광을 굴절시켜, 망막에 핀트를 맞추는 렌즈의 역할을 하는 조직이다. 수정체의 부분 구조로서는, 수정체 상피, 수정체핵, 수정체낭 등을 들 수 있다. 수정체의 전구 조직으로서는, 수정체 플라코드, 수정체포 등을 들 수 있다. 수정체 플라코드란, 비후한 표피 외배엽 세포층을 포함하는 수정체 전구 조직이다. 배 발생에 있어서는, 안포의 표피 외배엽에의 접촉에 의해, 당해 접촉 영역이 비후됨으로써 형성된다. 수정체포란, 수정체 플라코드의 함입에 의해 형성되는 소포이다. 수정체, 그의 부분 구조, 또는 그의 전구 조직이 존재하는 것은, 마커의 발현에 의해 확인할 수 있다. 수정체, 그의 부분 구조, 또는 그의 전구 조직의 마커로서는, L-Maf(수정체 전구 조직), α, β 및 γ크리스탈린(수정체) 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.
「초자체」란, 수정체의 후방에 있고, 내강을 매립하는 투명한 젤리상의 조직이며, 안구의 형을 유지함과 동시에, 외력을 분산시키는 작용을 갖는다. 초자체는 수분 및 단백질(콜라겐)로 되어 있다. 초자체가 존재하는 것은, 그 젤리상의 형상에 의해 확인할 수 있다.
「각막」이란, 안구벽의 외층의 전방 약 1/6을 차지하는 투명한 시계 접시상의 조직이다. 각막의 부분 구조로서는, 각막 상피, 보우만막, 각막 실질, 데스메막, 각막 내피 등을 들 수 있다. 각막은, 통상 체표측으로부터 차례로 각막 상피, 보우만막, 각막 실질, 데스메막 및 각막 내피를 포함하는 5개의 층으로 구성된다. 각막, 그의 부분 구조, 또는 그의 전구 조직이 존재하는 것은, 마커의 발현에 의해 확인할 수 있다. 각막, 그의 부분 구조, 또는 그의 전구 조직의 마커로서는, 팬-시토케라틴(각막 상피 전구 조직), E-카드헤린(각막 상피 전구 조직), 시토케라틴 3(각막 상피), 시토케라틴 12(각막 상피), 시토케라틴 14(각막 상피), p63(각막 상피), ZO-1(각막 상피), PDGFR-α(각막 실질, 각막 내피, 또는 그의 전구 조직), Pitx2(각막 실질 및 각막 내피의 전구 조직), ABCG2(각막 실질 및 각막 내피의 전구 조직) 등을 들 수 있다.
태아 망막으로부터 수정체 등을 제거하면, 그 부분에 구멍이 뚫려버려, 조직이 공극에 의해 분단된다. 또한, 생체 망막에 비해, 스페어상 세포 응집체의 코어부의 신경 망막층을 구성하는 내층(가장 외측의 시세포층을 제외한 부분)에 존재하는 세포(예: 수평 세포, 아마크린 세포, 쌍극 세포), 및 신경절 세포의 수가 적다. 구체적으로는, 예를 들어 인간 태아 망막의 내층에 존재하는 세포수와 비교하여 80％ 이하, 70％ 이하, 60％ 이하, 50％ 이하이다. 또한, 태아 망막의 일부를 잘라내어 배양한 경우에는, 이차원의 두께를 가진 시트 구조로 되지만, 입체적인 스페어상 세포 응집체로는 될 수 없다.
한편, 다능성 줄기 세포를 분화 유도함으로써 인공적으로 만들어진 Optic cup(옵틱 컵)(예: Nature. 2011 Apr 7; 472(7341): 51-6)이 알려져 있지만, 이 Optic cup은 세포 응집체의 일부에 구멍이 뚫려 있고, 조직이 공극에 의해 분단되어 있다.
(4) 피복부에 있어서의 망막 색소 상피 세포는, 신경 망막층과 함께 연속되는 상피 구조를 구성하고 있지 않다. 「상피 구조」란, 상피 조직이 형성하고 있는 층 구조를 의미하고, 상피 구조가 연속된다는 것은, 상피 구조가 1개의 연속되는 상피 조직으로 형성되어 있는 것을 의미한다. 즉, 스페어상 세포 응집체의 피복부에 있어서의 망막 색소 상피 세포와, 코어부에 있어서의 신경 망막을 구성하는 신경 망막층은, 상피 조직으로서의 연속성을 갖지 않는다. 연속되는 상피 구조 인지 여부는, 당업자라면 현미경 하에 있어서 조직의 상태나 세포의 배열 상태를 관찰함으로써 확인할 수 있다.
생체 망막은, 내측이 신경 망막, 외측이 망막 색소 상피 세포를 포함하는, 크게 내외 2개의 상피 조직이 겹쳐 있는 상피 구조를 갖는다. 이 상피 구조는, 1개의 연속되는 상피 조직이 차곡차곡 겹쳐짐으로써 형성되어 있다. 구체예로서, 태아 망막은 1매의 상피 시트로서 신경 망막-모양체-RPE가 연속된 상피이다. 또한, 인공적으로 제조한 Optic cup도 1매의 상피 시트로서 신경 망막과 RPE가 연속되어 있다.
일 형태에 있어서, 본 발명의 스페어상 세포 응집체는, 포유 동물의 세포를 포함한다. 본 발명의 스페어상 세포 응집체는, 바람직하게는 설치류(예, 마우스, 래트) 또는 영장류(예, 인간, 원숭이)의 세포를 포함하고, 보다 바람직하게는 인간의 세포를 포함한다.
일 형태에 있어서, 본 발명의 스페어상 세포 응집체는, 망막 색소 상피 세포, 망막계 세포 혹은 망막 조직의 장애 또는 망막 조직의 손상에 기초하는 질환(특히 시세포 망막 색소 상피 세포가 동시에 장애 또는 손상되어 있는 중증예)의 치료에 있어서의 사용을 위한 스페어상 세포 응집체이다.
일 형태에 있어서, 본 발명의 스페어상 세포 응집체는, 이식을 필요로 하는 대상(예: 포유 동물)에 이식할 수 있고, 당해 이식에 의해 시기능을 개선할 수 있다. 대상이 되는 포유 동물로서는, 예를 들어 인간, 마우스, 래트, 모르모트, 햄스터, 토끼, 고양이, 개, 양, 돼지, 소, 말, 염소, 원숭이 등을 들 수 있다.
이식 시에, 스페어상 세포 응집체를 해당 스페어상 세포 응집체의 생존 능력을 유지하기 위해 필요한 매체에 있어서 보존해도 된다. 「생존 능력을 유지하기 위해 필요한 매체」로서는, 배지, 생리학적 완충 용액 등을 들 수 있지만, 망막 전구 세포 등의 망막계 세포를 포함하는 세포 집단이 생존하는 한에 있어서 특별히 한정되지 않고, 당업자라면 적절히 선택할 수 있다. 일례로서, 동물 세포의 배양에 통상 사용되는 배지를 기초 배지로서 조제한 배지를 들 수 있다. 기초 배지로서는, 예를 들어 BME 배지, BGJb 배지, CMRL 1066 배지, Glasgow MEM(GMEM) 배지, Improved MEM Zinc Option 배지, Neurobasal 배지, IMDM 배지, Medium 199 배지, Eagle MEM 배지, αMEM 배지, DMEM 배지, F-12 배지, DMEM/F12 배지, IMDM/F12 배지, 햄 배지, RPMI1640 배지, Fischer's 배지 또는 이들의 혼합 배지 등, 동물 세포의 배양에 사용할 수 있는 배지를 들 수 있다.
일 형태에 있어서, 본 발명의 스페어상 세포 응집체를, 핀셋, 나이프, 가위 등을 사용하여 적절한 크기로 세절한 후에 이식할 수도 있다. 잘라낸 후의 형상은 구애받지 않지만, 신경 망막 및 망막 색소 상피 세포를 포함하는 시트제(세포 시트, NR-RPE 세포 시트라고도 함)를 들 수 있다. 예를 들어, 하나의 세포 응집 덩어리로부터 잘라낸 세포 시트 1매(예를 들어 직경 300㎛ 높이 50㎛)를 시세포나 망막 색소 상피 세포가 변성되어 있는 영역의 면적에 따라서, 1매로부터 복수매로 이식하는 것을 들 수 있다. 당업자라면 그의 변성사되어 있는 영역에 따라서 세포 시트의 매수를 선택할 수 있다.
이식은, 예를 들어 주사 바늘을 사용하여 망막 하에 이식하는 방법이나, 안구의 일부를 절개하고, 절개 부위로부터 손상 부위 또는 병변 부위에 이식함으로써 실시된다.
이식 후 생착한 미성숙 망막계 세포의 적어도 일부는, 대상의 생체 내(눈 내)의 환경 하에서 성숙한 망막계 세포로 분화 유도된다. 여기서, 「이식 후에 유도되는 시세포」란, 대상의 눈 내에 있어서, 이식 후 생착한 망막 전구 세포 또는 시세포 전구 세포로부터 분화 유도되는 시세포를 의미한다.
여기서, 본 명세서에 있어서의 「생착」이란, 이식된 세포가 생체 내에 장기간(예: 30일 이상, 60일 이상, 90일 이상) 생존하고, 장기 내에 접착되어 머무르는 것을 의미한다.
본 명세서에 있어서의 「접촉률」이란, 이식한 망막 조직의 긴 직경에 대한, 이식한 망막 조직의 시세포층이 호스트측의 쌍극 세포를 포함하는 망막층과 접촉하고 있는 길이의 비율을 가리킨다.
본 명세서에 있어서의 「기능적 생착」이란, 이식된 세포가 생착하여, 생체 내에서 본래의 기능을 해내고 있는 상태를 의미한다.
본 명세서에 있어서의 「기능적 생착율」이란, 이식한 세포 중, 기능적 생착을 행한 세포의 비율을 의미한다. 이식된 시세포의 기능적 생착율은, 예를 들어 상기 접촉율로부터 구할 수 있다.
상기 스페어상 세포 응집체를 이식함으로써, 이식된 시세포(이식 후에 유도되는 시세포를 포함함)의 기능적 생착율은 10％ 이상, 바람직하게는 20％ 이상, 더욱 바람직하게는 40％ 이상, 더욱 바람직하게는 50％ 이상, 더욱 바람직하게는 60％ 이상이다.
생체 망막은 매우 복잡한 층 구조를 갖고 있으며, 망막층에 존재하는 세포가 질서 정연하게 존재하고 있음으로써 비로소 기능이 발휘된다. 상기 스페어상 세포 응집체는, 적어도 시세포층을 포함하는 신경 망막층을 갖고, 당해 망막층에서는 시세포 등은 접착되어 연속적으로 존재하고 있으며, 또한 그 피복부에 망막 색소 상피 세포가 존재하고 있기 때문에, 생체 망막의 구조와 매우 유사한 구조를 갖고 있다. 따라서, 본 스페어상 세포 응집체를 이식함으로써, 생체에 있어서 장애를 받은 망막이나 망막 색소 상피 세포의 대체로서, 시세포에 의한 광 수용 기능과 망막 색소 상피 세포의 시세포 보호 기능 등의 양쪽을 발휘함으로써, 장기간 생체에 생착할 것이 기대된다. 따라서, 스페어상 세포 응집체는 이식에 적합한 세포 응집체이다. 또한, 본 스페어상 세포 응집체는, 후술하는 제조 방법에 의해 제조하는 것이 가능하고, 이식이 필요한 환자에게 적시에 필요량을 제공 가능한 점에서 생체 망막보다 우수하다고 할 수 있다.
[스페어상 세포 응집체의 제조 방법]
본 발명의 일 실시 형태의 스페어상 세포 응집체의 제조 방법은, 신경 망막을 포함하는 스페어상의 세포 응집체(신경 망막의 세포 응집체)를 조제하는 공정과, 망막 색소 상피 세포를 조제하는 공정과, 신경 망막의 세포 응집체 및 망막 색소 상피 세포를 접촉시키는 공정을 포함한다.
(신경 망막의 세포 응집체)
이하, 신경 망막의 세포 응집체 및 그의 제조 방법에 대하여 설명한다. 또한, 「신경 망막의 세포 응집체」란, 신경 망막을 포함하는 스페어상의 세포 응집체를 의미한다.
(I) 신경 망막을 포함하는 스페어상의 세포 응집체(신경 망막의 세포 응집체)에 있어서, 신경 망막은 세포 응집체의 표면에 존재하고 있다. 예를 들어, 신경 망막은 신경 망막의 세포 응집체의 표면에 두께를 가지고 존재하고 있으며, 외 환경에 대하여 연속적인 면으로 경계를 형성하고 있다. 외 환경에 면해 있는 경계면은 시세포가 다수를 차지하고 있으며, 그 내측에 내층의 세포나 망막 전구 세포가 존재하고 있다. 이들 망막층을 구성하는 세포는 서로 접착되어 연속적으로 존재하고 있다. 그 내부에는 공동, 혹은 정연하게 배열된 층 구조가 형성되지 않은 공간이 있기 때문에, 그의 경계에 명료한 그림자가 관찰되고, 상피 구조를 형성하고 있는 것이 확인된다. 신경 망막을 포함하는 스페어상의 세포 응집체는, 상술한 코어부와 피복부를 구비하는 스페어상 세포 응집체의 코어부에 상당한다.
(II) 신경 망막에 있어서 적어도 시세포층을 포함하는 신경 망막층이 형성되어 있고, 시세포층에는 시세포, 시세포 전구 세포 및 망막 전구 세포로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 세포가 존재하고 있다. 신경 망막에 있어서의 Chx10 양성 세포의 존재 비율이 20％ 이상, 바람직하게는 30％ 이상, 더욱 바람직하게는 40％ 이상이다. Chx10 양성 세포로서는, 망막 전구 세포 및 시세포 전구 세포를 들 수 있다.
신경 망막의 세포 응집체는, 다능성 줄기 세포 유래인 것이 바람직하다. 「다능성 줄기 세포」란, 시험관 내에 있어서 배양하는 것이 가능하고, 또한 태반을 제외한 생체를 구성하는 모든 세포(삼배엽(외배엽, 중간층, 내배엽) 유래의 조직)로 분화될 수 있는 능력(다분화능성(pluripotency))을 갖는 줄기 세포를 말하고, 배아 줄기 세포도 이것에 포함된다.
다능성 줄기 세포는, 수정란, 클론 배, 생식 줄기 세포, 조직내 줄기 세포, 체세포 등으로부터 유도할 수 있다. 다능성 줄기 세포로서는, 배아 줄기 세포(ES 세포: Embryonic stem cell), EG 세포(Embryonic germ cell), 인공 다능성 줄기 세포(iPS 세포: induced pluripotent stem cell) 등을 들 수 있다. 간엽계 줄기 세포(mesenchymal stem cell; MSC)로부터 얻어지는 Muse 세포(Multi-lineage differentiating stress enduring cell) 및 생식 세포(예를 들어 정소)로부터 제작된 GS 세포도 다능성 줄기 세포에 포함된다. 배아 줄기 세포는, 1981년에 비로소 수립되어, 1989년 이후 녹아웃 마우스 제작에도 응용되고 있다. 1998년에는 인간 배아 줄기 세포가 수립되어 있고, 재생 의학에도 이용되고 있다. 배아 줄기 세포는, 내부 세포 덩어리를 피더 세포 상 또는 LIF(백혈병 억제 인자)를 포함하는 배지 중에서 배양함으로써 제조할 수 있다. 배아 줄기 세포의 제조 방법은, 예를 들어 WO96/22362, WO02/101057, US5,843,780, US6,200,806, US6,280,718 등에 기재되어 있다. 배아 줄기 세포는 소정의 기관으로부터 입수할 수 있고, 또한 시판품을 구입할 수도 있다. 예를 들어, 인간 배아 줄기 세포인 KhES-1, KhES-2 및 KhES-3은, 교토 대학 재생 의사 과학 연구소로부터 입수 가능하다. 인간 배아 줄기 세포인 Rx::GFP주(KhES-1주 유래)는, 국립 연구 개발 법인 이화학 연구소로부터 입수 가능하다. 마우스 배아 줄기 세포인 EB5 세포주 및 D3 세포주는, 각각 국립 연구 개발 법인 이화학 연구소 및 ATCC로부터 입수 가능하다.
배아 줄기 세포의 하나인 핵 이식 배아 줄기 세포(ntES 세포)는, 핵을 제거한 난자에 체세포의 핵을 이식하여 만든 클론 배로부터 수립할 수 있다.
EG 세포는, 시원 생식 세포를 mSCF, LIF 및 bFGF를 포함하는 배지 중에서 배양함으로써 제조할 수 있다(Cell, 70: 841-847, 1992).
본 발명에 있어서의 「인공 다능성 줄기 세포」란, 체세포를, 공지된 방법 등에 의해 초기화(reprogramming)함으로써, 다능성을 유도한 세포이다. 구체적으로는, 섬유아세포, 또는 말초혈 단핵구 등이 분화된 체세포를 Oct3/4, Sox2, Klf4, Myc(c-Myc, N-Myc, L-Myc), Glis1, Nanog, Sall4, lin28, Esrrb 등을 포함하는 초기화 유전자군에서 선택되는 복수의 유전자의 조합 중 어느 발현에 의해 초기화하여 다분화능을 유도한 세포를 들 수 있다. 바람직한 초기화 인자의 조합으로서는, (1) Oct3/4, Sox2, Klf4 및 Myc(c-Myc 또는 L-Myc), (2) Oct3/4, Sox2, Klf4, Lin28 및 L-Myc(Stem Cells, 2013; 31: 458-466)를 들 수 있다.
인공 다능성 줄기 세포는, 2006년, 야마나카 등에 의해 마우스 세포로 수립되었다(Cell, 2006, 126(4), pp.663-676). 인공 다능성 줄기 세포는, 2007년에 인간 섬유아세포에서도 수립되어, 배아 줄기 세포와 동일하게 다능성과 자기 복제능을 갖는다(Cell, 2007, 131(5), pp.861-872; Science, 2007, 318(5858), pp.1917-1920; Nat. Biotechnol., 2008, 26(1), pp.101-106).
인공 다능성 줄기 세포로서, 유전자 발현에 의한 직접 초기화로 제조하는 방법 이외에도, 화합물의 첨가 등에 의해 체세포로부터 인공 다능성 줄기 세포를 유도할 수도 있다(Science, 2013, 341, pp.651-654).
또한, 주화된 인공 다능성 줄기 세포를 입수하는 것도 가능하며, 예를 들어 교토 대학에서 수립된 201B7 세포, 201B7-Ff 세포, 253G1 세포, 253G4 세포, 1201C1 세포, 1205D1 세포, 1210B2 세포, 1231A3 세포 등의 인간 인공 다능성 세포주가, 교토 대학에서 입수 가능하다. 주화된 인공 다능성 줄기 세포로서, 예를 들어 교토 대학에서 수립된 Ff-I01 세포 및 Ff-I14 세포가, 교토 대학에서 입수 가능하다.
인공 다능성 줄기 세포를 제조할 때에 사용되는 체세포로서는, 특별히 한정되지 않지만, 조직 유래의 섬유아세포, 혈구계 세포(예를 들어, 말초혈 단핵구(PBMC), T 세포), 간 세포, 췌장 세포, 장 상피 세포, 평활근 세포 등을 들 수 있다.
인공 다능성 줄기 세포를 제조할 때, 몇종류의 유전자의 발현에 의해 초기화하는 경우, 유전자를 발현시키기 위한 수단은 특별히 한정되지 않는다. 상기 수단으로서는, 바이러스 벡터(예를 들어, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 센다이바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노수반바이러스 벡터)를 사용한 감염법, 플라스미드 벡터(예를 들어, 플라스미드 벡터, 에피소말 벡터)를 사용한 유전자 도입법(예를 들어, 인산칼슘법, 리포펙션법, 레트로넥틴법, 일렉트로포레이션법), RNA 벡터를 사용한 유전자 도입법(예를 들어, 인산칼슘법, 리포펙션법, 일렉트로포레이션법), 단백질의 직접 주입법(예를 들어, 바늘을 사용한 방법, 리포펙션법, 일렉트로포레이션법) 등을 들 수 있다.
인공 다능성 줄기 세포를 제조할 때에는, 피더 세포 존재 하 또는 피더 세포 비존재 하(피더 프리)에서 제조할 수 있다. 피더 세포 존재 하에서 인공 다능성 줄기 세포를 제조할 때에는, 공지된 방법으로, 미분화 유지 인자 존재 하에서 인공 다능성 줄기 세포를 제조할 수 있다. 피더 세포 비존재 하에서 인공 다능성 줄기 세포를 제조할 때에 사용되는 배지로서는, 특별히 한정되지 않지만, 공지된 배아 줄기 세포 및/또는 인공 다능성 줄기 세포의 유지 배지, 또는 피더 프리로 인공 다능성 줄기 세포를 수립하기 위한 배지를 사용할 수 있다. 피더 프리로 인공 다능성 줄기 세포를 수립하기 위한 배지로서는, 예를 들어 Essential 8 배지(E8 배지), Essential 6 배지, TeSR 배지, mTeSR 배지, mTeSR-E8 배지, Stabilized Essential 8 배지, StemFit 배지 등의 피더 프리 배지를 제시할 수 있다. 인공 다능성 줄기 세포를 제조할 때, 예를 들어 피더 프리로 체세포에, 센다이바이러스 벡터를 사용하여, Oct3/4, Sox2, Klf4 및 Myc의 4인자를 유전자 도입함으로써, 인공 다능성 줄기 세포를 제작할 수 있다.
본 발명에 사용되는 다능성 줄기 세포는, 바람직하게는 배아 줄기 세포 또는 인공 다능성 줄기 세포이며, 보다 바람직하게는 인공 다능성 줄기 세포이다.
본 발명에 사용하는 다능성 줄기 세포는, 포유 동물의 다능성 줄기 세포이며, 바람직하게는 설치류(예, 마우스, 래트) 또는 영장류(예, 인간, 원숭이)의 다능성 줄기 세포이며, 보다 바람직하게는 인간 또는 마우스 다능성 줄기 세포, 더욱 바람직하게는 인간 인공 다능성 줄기 세포(iPS 세포) 또는 인간 배아 줄기 세포(ES 세포)이다.
복능성 줄기 세포로서는, 조혈 줄기 세포, 신경 줄기 세포, 망막 줄기 세포, 간엽계 줄기 세포 등의 조직 줄기 세포(조직성 줄기 세포, 조직 특이적 줄기 세포 또는 체성 줄기 세포라고도 불림)를 들 수 있다.
신경 망막의 세포 응집체는, 다능성 줄기 세포를 분화 유도함으로써 얻을 수 있다. 분화 유도는 WO2011/055855, WO2013/077425, WO2015/025967, WO2016/063985, WO2016/063986, WO2017/183732, PLoS One. 2010 Jan 20; 5(1): e8763., Stem Cells. 2011 Aug; 29(8): 1206-18., Proc Natl Acad Sci USA. 2014 Jun 10; 111(23): 8518-23, Nat Commun. 2014 Jun 10; 5: 4047에 개시되어 있는 방법을 들 수 있지만, 특별히 한정되지 않는다.
구체적인 일 형태로서, 하기 공정 (A), (B) 및 (C)를 포함하는 방법에 의해 신경 망막의 세포 응집체를 조제할 수 있다.
(A) 다능성 줄기 세포를 피더 세포 비존재 하에서, 1) TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질 및/또는 소닉·헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질, 그리고2) 미분화 유지 인자를 포함하는 배지에서 배양하는 공정,
(B) 무혈청 배지 중에서 부유 배양함으로써 세포 응집체를 형성시키는 공정,
(C) 공정 (B)에서 얻어진 세포 응집체를, BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하는 배지 중에서 또한 부유 배양하는 공정.
본 방법은, 예를 들어 WO2016/063985, WO2017/183732에도 개시되어 있으며, 보다 상세하게는 WO2016/063985, WO2017/183732를 참조하는 것이 가능하다.
TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질이란, TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로, 즉, Smad 패밀리에 의해 전달되는, 시그널 전달 경로를 저해하는 물질을 나타내고, 구체적으로는 TGFβ 시그널 전달 경로 저해 물질(예: SB431542, LY-364947, SB-505124, A-83-01 등), Nodal/Activin 시그널 전달 경로 저해 물질(예: SB431542, A-83-01 등) 및 BMP 시그널 전달 경로 저해 물질(예: LDN193189, Dorsomorphin 등)을 들 수 있다. 이들 물질은 시판되어 있으며 입수 가능하다.
소닉·헤지호그(이하, 「Shh」라고 기재하는 경우가 있다.) 시그널 전달 경로 작용 물질이란, Shh에 의해 매개되는 시그널 전달을 증강할 수 있는 물질이다. Shh 시그널 전달 경로 작용 물질로서는, 예를 들어 PMA(Purmorphamine), SAG(Smoothened Agonist) 등을 들 수 있다.
TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질 및 소닉·헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질의 농도는, 망막계 세포로의 분화를 유도 가능한 농도이면 된다. 예를 들어, SB431542는 통상 0.1 내지 200μM, 바람직하게는 2 내지 50μM의 농도로 사용된다. A-83-01은 통상 0.05 내지 50μM, 바람직하게는 0.5 내지 5μM의 농도로 사용된다. LDN193189는 통상 1 내지 2000nM, 바람직하게는 10 내지 300nM의 농도로 사용된다. SAG는 통상 1 내지 2000nM, 바람직하게는 10 내지 700nM의 농도로 사용된다. PMA는 통상 0.002 내지 20μM, 바람직하게는 0.02 내지 2μM의 농도로 사용된다.
공정 (A)에 있어서의 피더 프리 조건에서의 다능성 줄기 세포의 배양에 있어서는, 배지로서 미분화 유지 인자를 포함하는 상기 피더 프리 배지를 사용하면 된다.
공정 (A)에 있어서의 피더 프리 조건에서의 다능성 줄기 세포의 배양에 있어서는, 피더 세포를 대신하는 발판을 다능성 줄기 세포에 제공하기 위해서, 적절한 매트릭스를 발판으로서 사용해도 된다. 발판으로서 사용할 수 있는 매트릭스로서는, 라미닌(Nat Biotechnol 28, 611-615, (2010)), 라미닌 단편(Nat Commun 3, 1236, (2012)), 기저막 표품(Nat Biotechnol 19, 971-974, (2001)), 젤라틴, 콜라겐, 헤파란황산프로테오글리칸, 엔탁틴, 비트로넥틴(Vitronectin) 등을 들 수 있다.
공정 (A)에 있어서의 다능성 줄기 세포의 배양 시간은, 공정 (B)에 있어서 형성되는 세포 응집체의 질을 향상시키는 효과가 달성 가능한 범위에서 특별히 한정되지 않지만, 통상 0.5 내지 144시간이다. 일 형태에 있어서, 바람직하게는 2 내지 96시간, 보다 바람직하게는 6 내지 48시간, 더욱 바람직하게는 12 내지 48시간, 보다더욱 바람직하게는 18 내지 28시간(예, 24시간)이다.
무혈청 배지의 준비 및 세포 응집체의 형성은, 상술과 동일하게 실시할 수 있다.
일 형태에 있어서, 공정 (B)에 있어서 사용되는 배지는, 소닉·헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함한다. 소닉·헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질로서는, 상술한 것을 상술한 농도로 사용할 수 있다. 소닉·헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질은, 바람직하게는 부유 배양 개시 시부터 배지에 포함된다. 배지에는, ROCK 저해제(예, Y-27632)를 첨가해도 된다. 배양 시간은 예를 들어, 12시간 내지 6일간이다.
BMP 시그널 전달 경로 작용 물질이란, BMP에 의해 매개되는 시그널 전달 경로를 증강할 수 있는 물질이다. BMP 시그널 전달 경로 작용 물질로서는, 예를 들어 BMP2, BMP4 혹은 BMP7 등의 BMP 단백질, GDF7 등의 GDF 단백질, 항BMP 수용체 항체, 또는 BMP 부분 펩티드 등을 들 수 있다. BMP2 단백질, BMP4 단백질 및 BMP7 단백질은 예를 들어 R&D Systems사에서, GDF7 단백질은 예를 들어 와코 쥰야쿠로부터 입수 가능하다.
사용되는 배지는, 예를 들어 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질이 첨가된 무혈청 배지 또는 혈청 배지(바람직하게는, 무혈청 배지)를 들 수 있다. 무혈청 배지, 혈청 배지는 상술한 바와 같이 준비할 수 있다.
BMP 시그널 전달 경로 작용 물질의 농도는, 망막계 세포로의 분화를 유도 가능한 농도이면 된다. 예를 들어 인간 BMP4 단백질의 경우에는, 약 0.01nM 내지 약 1μM, 바람직하게는 약 0.1nM 내지 약 100nM, 보다 바람직하게는 약 1nM 내지 약 10nM, 더욱 바람직하게는 약 1.5nM(55ng/mL)의 농도가 되도록 배지에 첨가한다.
BMP 시그널 전달 경로 작용 물질은, 공정 (A)의 부유 배양 개시로부터 약 24시간 후 이후에 첨가되어 있으면 되고, 부유 배양 개시 후 몇일 이내(예를 들어, 15일 이내)에 배지에 첨가해도 된다. 바람직하게는, BMP 시그널 전달 경로 작용 물질은, 부유 배양 개시 후 1일째 내지 15일째까지의 사이, 보다 바람직하게는 1일째 내지 9일째까지의 사이, 가장 바람직하게는 3일째에 배지에 첨가한다.
구체적인 형태로서, 예를 들어 공정 (B)의 부유 배양 개시 후 1 내지 9일째, 바람직하게는 1 내지 3일째에, 배지의 일부 또는 전부를 BMP4를 포함하는 배지로 교환하고, BMP4의 최종 농도를 약 1 내지 10nM으로 조제하고, BMP4의 존재 하에서 예를 들어 1 내지 12일, 바람직하게는 2 내지 9일, 더욱 바람직하게는 2 내지 5일간 배양할 수 있다. 여기에 있어서, BMP4의 농도를, 동일 농도를 유지하기 위해, 1회 혹은 2회 정도 배지의 일부 또는 전부를 BMP4를 포함하는 배지로 교환할 수 있다. 또는 BMP4의 농도를 단계적으로 저감시킬 수도 있다.
상기 공정 (A) 내지 공정 (C)에 있어서의 배양 온도, CO2 농도 등의 배양 조건은 적절히 설정할 수 있다. 배양 온도는, 예를 들어 약 30℃ 내지 약 40℃, 바람직하게는 약 37℃이다. 또한 CO2 농도는, 예를 들어 약 1％ 내지 약 10％, 바람직하게는 약 5％이다.
상기 공정 (C)에 있어서의 배양 기간을 변동시킴으로써, 신경 망막의 세포 응집체에 포함되는 망막계 세포로서, 각종 분화 단계의 망막계 세포를 제조할 수 있다. 즉, 미성숙 망막계 세포(예: 망막 전구 세포, 시세포 전구 세포)와 성숙한 망막계 세포(예: 시세포)를 다양한 비율로 포함하는, 신경 망막의 세포 응집체 내의 망막계 세포를 제조할 수 있다. 공정 (C)의 배양 기간을 연장시킴으로써, 성숙한 망막계 세포의 비율을 증가시킬 수 있다.
상기 공정 (B) 및/또는 공정 (C)는 WO2017/183732에 개시된 방법을 사용할 수도 있다. 즉, 공정 (B) 및/또는 공정 (C)에 있어서, Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질을 더 포함하는 배지에서 부유 배양하여, 신경 망막의 세포 응집체를 형성할 수 있다.
공정 (B) 및/또는 공정 (C)에 사용하는, Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질로서는, Wnt에 의해 매개되는 시그널 전달을 억제할 수 있는 것인 한 특별히 한정되지 않고, 단백질, 핵산, 저분자 화합물 등 중 어느 것이어도 된다. Wnt에 의해 매개되는 시그널은, Frizzled(Fz) 및 LRP5/6(low-density lipoprotein receptor-related protein 5/6)의 헤테로 2량체로서 존재하는 Wnt 수용체를 통해 전달된다. Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질로서는, 예를 들어 Wnt 또는 Wnt 수용체에 직접 작용하는 물질(항Wnt 중화 항체, 항Wnt 수용체 중화 항체 등), Wnt 또는 Wnt 수용체를 코딩하는 유전자의 발현을 억제하는 물질(예를 들어 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA 등), Wnt 수용체와 Wnt의 결합을 저해하는 물질(가용형 Wnt 수용체, 우성 음성 Wnt 수용체 등, Wnt 안타고니스트, Dkk1, Cerberus 단백질 등), Wnt 수용체에 의한 시그널 전달에서 기인하는 생리 활성을 저해하는 물질[CKI-7(N-(2-아미노에틸)-5-클로로이소퀴놀린-8-술폰아미드), D4476(4-[4-(2,3-디히드로-1,4-벤조디옥신-6-일)-5-(2-피리디닐)-1H-이미다졸-2-일]벤즈아미드), IWR-1-endo(IWR1e)(4-[(3aR,4S,7R,7aS)-1,3,3a,4,7,7a-헥사히드로-1,3-디옥소-4,7-메타노-2H-이소인돌-2-일]-N-8-퀴놀리닐-벤즈아미드), 그리고 IWP-2(N-(6-메틸-2-벤조티아졸릴)-2-[(3,4,6,7-테트라히드로-4-옥소-3-페닐티에노[3,2-d]피리미딘-2-일)티오]아세트아미드) 등의 저분자 화합물 등] 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질로서, 이들을 1종 또는 2종 이상 포함하고 있어도 된다. CKI-7, D4476, IWR-1-endo(IWR1e), IWP-2 등은 공지된 Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질이며, 시판품 등을 적절히 입수 가능하다. Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질로서 바람직하게는 IWR1e가 사용된다.
공정 (B)에 있어서의 Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질의 농도는, 양호한 세포 응집체의 형성을 유도 가능한 농도이면 된다. 예를 들어 IWR-1-endo의 경우에는, 약 0.1μM으로부터 약 100μM, 바람직하게는 약 0.3μM으로부터 약 30μM, 보다 바람직하게는 약 1μM으로부터 약 10μM, 더욱 바람직하게는 약 3μM의 농도가 되도록 배지에 첨가한다. IWR-1-endo 이외의 Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질을 사용하는 경우에는, 상기 IWR-1-endo의 농도와 동등한 Wnt 시그널 전달 경로 저해 활성을 나타내는 농도로 사용되는 것이 바람직하다.
공정 (B)에 있어서, Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질을 배지에 첨가하는 타이밍은, 빠른 쪽이 바람직하다. Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질은, 공정 (B)에 있어서의 부유 배양 개시로부터, 통상 6일 이내, 바람직하게는 3일 이내, 보다 바람직하게는 1일 이내, 보다 바람직하게는 12시간 이내, 더욱 바람직하게는 공정 (B)에 있어서의 부유 배양 개시 시에, 배지에 첨가된다. 구체적으로는, 예를 들어 Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질을 첨가한 기초 배지의 첨가나, 해당 기초 배지에의 일부 혹은 전부의 배지 교환을 행할 수 있다. 공정 (A)에서 얻어진 세포를, 공정 (B)에 있어서 Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질에 작용시키는 기간은 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 공정 (B)에 있어서의 부유 배양 개시 시에 배지에 첨가한 후, 공정 (B) 종료 시(BMP 시그널 전달 경로 작용 물질 첨가 직전)까지 작용시킨다. 더욱 바람직하게는, 후술한 바와 같이, 공정 (B) 종료 후(즉 공정 (C)의 기간 중)에도, 이어서 Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질에 폭로시킨다. 일 형태로서는, 후술한 바와 같이, 공정 (B) 종료 후(즉 공정 (C)의 기간 중)에도, 이어서 Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질에 작용시켜, 망막 조직이 형성될 때까지 작용시켜도 된다.
공정 (C)에 있어서, Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질로서는, 전술한 Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질 중 어느 것을 사용할 수 있지만, 바람직하게는 공정 (B)에서 사용한 Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질과 동일한 종류의 것을 공정 (C)에 있어서 사용한다.
공정 (C)에 있어서의 Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질의 농도는, 망막 전구 세포 및 망막 조직을 유도 가능한 농도이면 된다. 예를 들어 IWR-1-endo의 경우에는, 약 0.1μM으로부터 약 100μM, 바람직하게는 약 0.3μM으로부터 약 30μM, 보다 바람직하게는 약 1μM으로부터 약 10μM, 더욱 바람직하게는 약 3μM의 농도로 되도록 배지에 첨가한다. IWR-1-endo 이외의 Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질을 사용하는 경우에는, 상기 IWR-1-endo의 농도와 동등한 Wnt 시그널 전달 경로 저해 활성을 나타내는 농도로 사용되는 것이 바람직하다. 공정 (C)의 배지 중의 Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질의 농도는, 공정 (B)의 배지 중의 Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질의 농도를 100으로 하였을 때, 바람직하게는 50 내지 150, 보다 바람직하게는 80 내지 120, 더욱 바람직하게는 90 내지 110이며, 제2 공정의 배지 중의 Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질의 농도와 동등한 것이, 보다 바람직하다.
Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질의 배지에의 첨가 시기는, 망막계 세포 혹은 망막 조직을 포함하는 응집체 형성을 달성할 수 있는 범위에서 특별히 한정되지 않지만, 빠르면 빠른 것이 바람직하다. 바람직하게는, 공정 (C) 개시 시에 Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질이 배지에 첨가된다. 보다 바람직하게는, 공정 (B)에 있어서 Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질이 첨가된 후, 공정 (C)에 있어서도 계속해서(즉, 공정 (B)의 개시 시부터) 배지 중에 포함된다. 더욱 바람직하게는, 공정 (B)의 부유 배양 개시 시에 Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질이 첨가된 후, 공정 (C)에 있어서도 계속해서 배지 중에 포함된다. 예를 들어, 공정 (B)에서 얻어진 배양물(Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질을 포함하는 배지 중의 응집체의 현탁액)에 BMP 시그널 전달 작용 물질(예, BMP4)을 첨가하면 된다.
Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질에 작용시키는 기간은, 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 공정 (B)에 있어서의 부유 배양 개시 시에 Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질이 첨가되는 경우에 있어서, 공정 (B)에 있어서의 부유 배양 개시 시를 기산점으로 하여, 2일간으로부터 30일간, 보다 바람직하게는 6일간으로부터 20일간, 8일간으로부터 18일간, 10일간으로부터 18일간, 또는 10일간으로부터 17일간(예를 들어, 10일간)이다. 다른 양태에 있어서, Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질에 작용시키는 기간은, 공정 (B)에 있어서의 부유 배양 개시 시에 Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질이 첨가되는 경우에 있어서, 공정 (B)에 있어서의 부유 배양 개시 시를 기산점으로 하여, 바람직하게는 3일간으로부터 15일간(예를 들어, 5일간, 6일간, 7일간)이며, 보다 바람직하게는 6일간으로부터 10일간(예를 들어, 6일간)이다.
상술한 방법에서 얻은 신경 망막의 세포 응집체를 Wnt 시그널 전달 경로 작용 물질, 및/또는 FGF 시그널 전달 경로 저해 물질을 포함하는 무혈청 배지 또는 혈청 배지 중에서 3일간으로부터 6일간 정도의 기간 배양(공정 (D)) 후, Wnt 시그널 전달 경로 작용 물질 및 FGF 시그널 전달 경로 저해 물질을 포함하지 않는 무혈청 배지 또는 혈청 배지 중에서 30일간 내지 60일간 정도 배양함으로써(공정 (E)), 모양체 주연부 형식 구조체를 포함하는 신경 망막을 제조할 수도 있다.
일 형태로서, 공정 (A) 내지 (C)에서 얻어진 신경 망막의 세포 응집체이며, 공정 (B)의 부유 배양 개시 후 6 내지 30일째, 10 내지 20일째(10일째, 11일째, 12일째, 13일째, 14일째, 15일째, 16일째, 17일째, 18일째, 19일째 또는 20일째)의 신경 망막의 세포 응집체로부터, 상기 공정 (D) 및 공정 (E)에 의해, 모양체 주연부 형식 구조체를 포함하는 신경 망막을 제조할 수 있다.
Wnt 시그널 전달 경로 작용 물질로서는, Wnt에 의해 매개되는 시그널 전달을 증강시킬 수 있는 것인 한 특별히 한정되지 않는다. 구체적인 Wnt 시그널 전달 경로 작용 물질로서는, 예를 들어 GSK3β 저해제(예를 들어, 6-Bromoindirubin-3'-oxime(BIO), CHIR99021, Kenpaullone)를 들 수 있다. 예를 들어 CHIR99021의 경우에는, 약 0.1μM 내지 약 100μM, 바람직하게는 약 1μM 내지 약 30μM의 범위를 들 수 있다.
FGF 시그널 전달 경로 저해 물질로서는, FGF에 의해 매개되는 시그널 전달을 저해할 수 있는 것인 한 특별히 한정되지 않는다. FGF 시그널 전달 경로 저해 물질로서는, 예를 들어 SU-5402, AZD4547, BGJ398 등을 들 수 있다. 예를 들어 SU-5402의 경우, 약 0.1μM 내지 약 100μM, 바람직하게는 약 1μM 내지 약 30μM, 보다 바람직하게는 약 5μM의 농도로 첨가한다.
상술한 방법에 의해, 신경 망막의 세포 응집체를 제조할 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.
(망막 색소 상피 세포)
망막 색소 상피 세포는, 다능성 줄기 세포 유래인 것이 바람직하다. 다능성 줄기 세포로부터 망막 색소 상피 세포를 조제하는 방법은 WO2012/173207호, WO2015/053375호, WO2015/053376호, WO2015/068505호, WO2017/043605, Stem Cell Reports, 2(2), 205-218(2014) 및 Cell stem Cell, 10(6), 771-785(2012)에 개시되어 있는 방법을 들 수 있지만, 특별히 한정되지 않는다. 또한, 상술한 WO2016/063985에 기재된 방법을 개량함으로써 망막 색소 상피 세포의 응집체를 조제하는 것도 가능하다. 망막 색소 상피 세포는, 세포 시트 또는 세포 현탁액으로서 조제되어도 된다.
WO2016/063985에 기재된 방법의 개량법으로서는, 상술한 방법 중, 다능성 줄기 세포를, 피더 세포 비존재 하에서, 1) 분화 유도 1일 전에 TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질 및 소닉·헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질로 처리하고, 2) 분화 유도 개시 시에 소닉·헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질을 처리하지 않는 조건에서 배양한다. 그 후, 상술한 공정 (B) 및 (C)를 행한다. 또한, 상기 공정 (D)의 개시 시기를 빠르게 하는 것이 바람직하다. 구체적으로는, 공정 (B)의 부유 배양 개시 9일 전후(예: 7일, 8일, 9일, 10일, 11일 후)에 공정 (D)를 개시한다. 그 후, 상술한 공정 (E)를 실시하면 된다.
망막 색소 상피 세포는, 신경 망막의 세포 응집체와 접촉시키기 전에, 다각형 또는 포석상의 세포 형태를 가질 때까지 더 배양해도 된다. 이 경우의 배지는, 특별히 한정되지 않지만, 망막 색소 상피 세포의 유지 배지(이하, RPE 유지 배지라고 기재하기도 한다.)로 교환하여, 더 배양할 수도 있다. 그것에 의해, 더욱 분명히 멜라닌 색소 침착 세포군이나 기저막에 접착되는 다각 편평상의 형태를 갖는 세포군을 관찰할 수 있다. RPE 유지 배지에 의한 배양은, 망막 색소 상피 세포의 콜로니가 형성되는 한 한정되지 않지만, 예를 들어 3일에 1회 이상의 빈도로 전체량 배지 교환을 행하면서 5 내지 20일간 정도 배양을 행한다. 당업자라면, 당해 형태를 확인하면서, 배양 기간을 용이하게 설정할 수 있다. 망막 색소 상피 세포의 유지 배지는, 예를 들어 IOVS, March 2004, Vol. 45, No.3, Masatoshi Haruta 등, IOVS, November 2011, Vol. 52, No. 12, Okamoto 등, Cell Science 122(17), Fumitaka Osakadar 등, ebruary 2008, Vol. 49, No. 2, Gamm 등에 기재된 것을 사용할 수 있다.
당업자라면 상술한 방법에 의해 얻어진 망막 색소 상피 세포의 응집체 또는 세포 시트로부터, 피펫팅 등의 통상의 방법에 의해 망막 색소 상피 세포의 세포 현탁액을 조제할 수도 있다. 예를 들어, PBS(Thermo fisher사제) 등으로 응집체 또는 세포 시트를 세정한 후, Tryple select(Thermo fisher사제) 등의 세포 해리 효소에 의해 15 내지 30분간 정도 처리하고, 피펫팅함으로써 세포 현탁액을 조제할 수 있다. 셀 스트레이너(Cell strainer) 등의 메쉬를 통과시켜도 된다.
「세포 시트」란, 적어도 이차원의 방향에 생물학적 결합을 갖는 단일 또는 복수의 세포로 구성되는 단층 또는 중층의 구조체를 말한다. 세포 시트는, 접착 배양한 세포 또는 세포 응집체로부터, 핀셋, 나이프, 가위 등을 사용하여 잘라내어 제작할 수 있다.
「세포 현탁액」이란, 동일한 종류의 또는 상이한 종류의 복수의 세포를 부유 상태에서 포함하는 용액을 의미한다. 바람직하게는, 매체 중에 존재하는 세포의 대다수(예를 들어, 50％ 이상, 60％ 이상, 70％ 이상, 80％ 이상, 90％ 이상 또는 95％ 이상)가 서로 해리되어, 지속적인 물리적 접촉을 하지 않고 존재하고 있는 상태를 말한다. 기타 일부의 세포는, 세포 응집체 등으로서 존재하고 있어도 된다.
망막 색소 상피 세포의 세포 현탁액은, 예를 들어 세포 시트나 세포 응집체로서 제조된 망막 색소 상피 세포를, 단일 세포로 분산시킴으로써 조제할 수 있다. 분산 방법은 특별히 한정되지 않지만, 당업자에게 주지된 방법, 예를 들어 세포 해리 효소(예: Tryple(상표) select, 서모 피셔사) 등에 의한 화학적 처리나, 셀 스크레이퍼 등을 사용한 물리적 처리에 의해 분산할 수 있다.
(접촉 공정)
신경 망막의 세포 응집체와 망막 색소 상피 세포를 접촉시키는 방법은, 신경 망막의 세포 응집체와 망막 색소 상피 세포가 접착 가능한 한 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 신경 망막의 세포 응집체를 망막 색소 상피 세포의 현탁액과 함께 배양하고, 플레이트의 바닥에 가라앉은 신경 망막의 세포 응집체에 망막 색소 상피 세포를 접착시키는 방법, 또는 망막 색소 상피 세포 시트에 신경 망막의 세포 응집체를 접촉시키는 방법, 또한 침투압차를 이용하는 방법 등을 들 수 있다.
신경 망막의 세포 응집체를 망막 색소 상피 세포의 세포 현탁액과 함께 배양하고, 플레이트 등의 배양 용기의 바닥에 가라앉은 신경 망막의 세포 응집체에 망막 색소 상피 세포를 접착시키는 방법으로서는, 망막 색소 상피 세포가 상기 배양 용기에 접착되고, 그것에 의해 세포 응집체와의 접착이 저해되지 않도록, 저접착성의 용기 중에서 행하는 것이 바람직하다. 사용하는 용기로서는, 웰이 작은 플레이트(예를 들어, 웰의 바닥 면적이 평저 환산으로 0.1 내지 2.0cm2 정도의 플레이트)나 마이크로포어 등을 사용하여 작은 스페이스에 세포를 가두는 방법, 작은 원심 튜브 등을 들 수 있다. 웰이 작은 플레이트로서, 예를 들어 24웰 플레이트(면적이 평저 환산으로 1.88 cm2 정도), 48웰 플레이트(면적이 평저 환산으로 1.0 cm2 정도), 96웰 플레이트(면적이 평저 환산으로 0.35 cm2 정도), 384웰 플레이트를 들 수 있다. 웰이 작은 플레이트의 형상으로서, 웰을 옆에서 보았을 때의 저면의 형상으로서는, 평저 구조에서도 외주부가 높고, 내볼록부가 움푹 패여 들어간 구조여도 된다. 저면의 형상으로서는, 예를 들어 U 바닥, V 바닥, M 바닥, 평저를 들 수 있다. 웰이 작은 플레이트의 저면은 세포 비접착면의 저면, 바람직하게는 Prime surface(스미토모 베이크라이트사제) 등이 바람직하다. 세포 비접착성의 배양 용기로서는, 배양기의 표면이, 세포와의 접착성을 저하시킬 목적에서 인공적으로 처리(예를 들어, MPC 폴리머 등의 초친수성 처리, 단백질 저흡착 처리 등)된 것 등을 사용할 수 있다.
또한, 바이오리액터 등을 사용하여 교반 배양으로 접착시키는 방법도 들 수 있다.
또한, 신경 망막의 세포 응집체 표면의 전체에 망막 색소 상피 세포가 접착되도록, 신경 망막의 세포 응집체를 웰의 바닥에 침전시켜 접착시키는 방법으로 배양하는 것이 바람직하다.
망막 색소 상피 세포의 세포 현탁액의 농도 및 접착시키기 위한 배양 기간은, RPE 세포의 접착, 증식을 확인함으로써 당업자라면 용이하게 설정할 수 있다. 망막 색소 상피 세포가 신경 망막의 세포 응집체의 표면에 접착되어 있는 것은, 예를 들어 현미경 관찰이나 면역 염색에 의해 확인할 수 있다. 또한, 신경 망막의 세포 응집체의 표면에 접착된 망막 색소 상피 세포가 증식하고 있는 것은, 예를 들어 현미경 관찰이나 면역 염색에 의해 확인할 수 있다. 망막 색소 상피 세포의 세포 현탁액의 농도는, 구체적으로는 1웰당 1×104 세포 이상, 바람직하게는 1×105 세포 이상이다. 접착시키기 위한 배양 기간은, 1일간 내지 60일간, 바람직하게는 3일간 내지 30일간이다.
신경 망막의 세포 응집체와 망막 색소 상피 세포를 접촉시키기 전에, 신경 망막의 세포 응집체를 후술하는 접착 인자(예: 세포외 매트릭스)로 코팅해두는 것이 바람직하다. 신경 망막의 세포 응집체와 망막 색소 상피 세포의 배양을, 접착 인자의 존재 하에서 행해도 된다.
망막 색소 상피 세포 시트에 신경 망막의 세포 응집체 또는 그의 일부인 세포 시트를 접촉시키는 방법으로서는, 접착 배양하고 있는 망막 색소 상피 세포 시트 상에 신경 망막의 세포 응집체 또는 신경 망막의 세포 응집체를 잘라내어 얻어진 신경 망막의 세포 시트를 자중으로 또는 메쉬를 겹치는 것 등을 사용하여 가라앉혀 붙이는 방법을 들 수 있다.
신경 망막의 세포 시트를 접촉시키기 전에, 망막 색소 상피 세포 시트 상에 후술하는 접착 인자(예: 세포외 매트릭스)를 코팅하는 것이 바람직하다.
침투압차를 이용하는 방법은, 예를 들어 메틸셀룰로오스를 포함하는 매체 중에 있어서, 신경 망막의 세포 응집체와 망막 색소 상피 세포를 접촉시켜 배양함으로써 접착시킨다. 구체적으로는, 0.1％ 내지 20％(예: 3％)의 메틸셀룰로오스를 포함하는 배지 중에 신경 망막을 포함하는 신경 망막의 세포 응집체를 부유시키고, 1000cells/μL로부터 1000000cells/μL이 되도록 배지에 현탁시킨 망막 색소 상피 세포를 소량(1μL 내지 10μL, 예: 3μL), 메틸셀룰로오스를 포함하는 배지 중의 신경 망막의 세포 응집체를 향하여 천천히 토출시킨다. 본 조작에 의해, 신경 망막의 세포 응집체의 주위에 망막 색소 상피 세포를 포함하는 배지의 액적이 형성되고, 일정 시간(예: 1시간 정도) 배양함으로써, 메틸셀룰로오스를 포함하는 배지와의 침투압의 차이에 의해, 액적 중의 배지만이 외부의 액체로 확산되고, 망막 색소 상피 세포가 신경 망막의 세포 응집체의 둘레에 응집함으로써 접착이 촉진된다. 메틸셀룰로오스 대신에 히드로겔 등을 사용할 수도 있다.
또한, 상술한 3개의 접촉시키는 방법에 있어서 사용하는 매체로서는, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 망막계 세포, 망막 색소 상피 세포 또는 신경 망막의 배양에 사용되는 배지(예: DMEM/F12 배지, Neurobasal 배지, 이들의 혼합 배지, RPE 유지 배지 등)를 들 수 있다. 또한, 후술하는 접착 인자를 포함하는 것이 바람직하다.
접촉 공정에 있어서, 접착 인자의 존재 하에서 접촉시키는 것이 바람직하다. 접착 인자란, 세포끼리를 접착시키는 작용을 갖고 있는 물질을 의미하고, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 상술한 세포외 매트릭스나 인공적인 히드로겔 등을 들 수 있다. 접착 인자는 단리된 단일 물질일 필요는 없고, 예를 들어 마트리겔, 시세포간 매트릭스, 혈청 등의 생체나 세포로부터의 조제물도 포함된다. 마트리겔은, Engelbreth Holm Swarn(EHS) 마우스 육종 유래의 기저막 조제물이다. 마트리겔은, 예를 들어 US 특허 No.4829000에 개시된 방법에 의해 조제할 수 있고, 시판되는 것을 구입할 수도 있다. 마트리겔의 주성분은 라미닌, IV형 콜라겐, 헤파란황산프로테오글리칸 및 엔탁틴이다. 시세포간 매트릭스는, 생체 망막에 있어서의 시세포 등의 망막계 세포의 사이에 존재하는 세포외 매트릭스의 총칭이며, 예를 들어 히알루론산이 포함된다. 시세포간 매트릭스는, 당업자라면 예를 들어 망막을 증류수 내에 두고, 팽창시켜 분리한다는 방법에 의해, 생체 망막으로부터 채취하는 것이 가능하고, 시판되는 것을 구입할 수도 있다. 접착 인자로서는, 세포외 매트릭스인 것이 바람직하고, 또한 세포외 매트릭스가, 히알루론산, 라미닌, IV형 콜라겐, 헤파란황산프로테오글리칸, 엔탁틴으로 이루어지는 군에서 선택되는 1개 또는 복수의 세포외 매트릭스인 것이 바람직하다. 또한, 세포외 매트릭스와 함께, EGF 등의 성장 인자 등의 다른 성분의 존재 하에서 접촉시켜도 된다. 시판되고 있는 세포외 매트릭스로서는, 마트리겔(등록 상표), iMatrix511(등록 상표) 등을 들 수 있다.
접촉 공정에 있어서의 세포외 매트릭스의 농도는, 신경 망막의 세포 응집체의 크기나 망막 색소 상피 세포의 세포수에 따라서 상이하지만, 당업자라면 RPE 세포의 접착이나 증식을 확인함으로써 용이하게 설정 가능이다. 예를 들어, Matrigel이면, 기성품(벡톤 디킨슨(BD)사)를 200 내지 10000배 희석한 농도, iMatrix511이면, 0.1 내지 5ug/ml의 농도로 첨가하는 것이 바람직하다.
구체적으로는, 접착 인자를 포함하는 상기 매체 중에서, 신경 망막의 세포 응집체와 망막 색소 상피 세포를 접착시키기 위한 배양을 행하면 된다. 상술한 신경 망막의 세포 응집체와 망막 색소 상피 세포를 접착시키기 위한 배양 기간 중, 이어서 접착 인자를 포함하는 상기 매체 중에서 배양해도 되고, 접착 인자를 포함하는 상기 매체 중에서 일정 기간(예: 1일 내지 10일간) 배양 후, 접착 인자를 포함하지 않는 매체로 교환하여 배양을 계속해도 된다.
신경 망막의 세포 응집체와 망막 색소 상피 세포를 접착시키기 위한 배양을 행하기 전에, 신경 망막의 세포 응집체 또는 망막 색소 상피 세포 시트를 접착 인자로 코팅해도 된다. 구체적으로는, 접착 인자를 포함하는 상기 매체 중에서, 신경 망막의 세포 응집체 또는 망막 색소 상피 세포 시트를 배양하면 된다. 당업자라면 배양 시간은 적절히 설정 가능하지만, 10분 내지 5시간(예를 들어, 10분 내지 60분) 정도 배양하면 된다. 배양 후, PBS 등의 매체에 의해 세정해도 된다.
접촉시키는 신경 망막을 포함하는 신경 망막의 세포 응집체 및 망막 색소 상피 세포에 대하여, 상술한 제조 방법에 있어서의 다른 배양 일수의 신경 망막의 세포 응집체 및 망막 색소 상피 세포를 사용하는 경우, 제조를 개시하는 날을 어긋나게 하면 된다. 망막 색소 상피 세포가 응집체 또는 세포 시트인 경우, 신경 망막의 세포 응집체와 접촉시키기 전에, 해당 응집체 또는 세포 시트에 대하여 세포 해리 효소 처리 및/또는 피펫팅 조작을 행하고, 세포를 해리시켜, 망막 색소 상피 세포의 세포 현탁액으로 하고 나서 접촉시키면 된다.
신경 망막의 세포 응집체와 망막 색소 상피 세포를 접촉시킴으로써, 양자가 접착되어, 코어부와 피복부를 구비하는 스페어상 세포 응집체를 형성한다. 신경 망막의 세포 응집체와 망막 색소 상피 세포를 접촉시킨 후에, 양자가 보다 접착하도록, 망막 색소 상피 세포가 신경 망막의 세포 응집체의 표면 전체를 덮도록, 및/또는 망막 색소 상피 세포가 다각형 또는 포석상의 세포 형태를 갖도록, 더 배양하는 것이 바람직하다. 사용하는 배지는, 상기 목적을 달성할 수 있는 범위에 있어서 특별히 한정되지 않지만, 망막계 세포, 망막 색소 상피 세포 또는 신경 망막의 배양에 사용되는 배지(예: DMEM/F12 배지, Neurobasal 배지, 이들의 혼합 배지, RPE 유지 배지 등)를 들 수 있다. 또한, 당업자라면 현미경 하에서 세포의 접착 상태 및 신경 망막의 세포 응집체 표면에 있어서의 망막 색소 상피 세포의 존재 비율을 확인하고, 또한 망막 색소 상피 세포가 다각형 또는 포석상의 세포 형태를 나타내고 있는 것을 확인할 수 있고, 당해 형상을 확인함으로써 배양 일수를 설정할 수 있다. 상술한 접촉 공정을 실시 후, 예를 들어 1일 내지 100일(5일 내지 50일） 정도의 범위로 배양하면 된다.
[독성 또는 약효 평가용 시약 및 피검 물질의 독성 또는 약효 평가 방법]
본 발명의 일 실시 형태의 피검 물질의 독성 또는 약효 평가용 시약은, 본 발명의 일 실시 형태의 스페어상 세포 응집체 또는 당해 세포 응집체의 일부를 함유하여 이루어지고, 본 발명의 일 실시 형태의 피검 물질의 독성 또는 약효 평가 방법은, 본 발명의 일 실시 형태의 스페어상 세포 응집체 또는 당해 세포 응집체의 일부에 피검 물질을 접촉시켜, 피검 물질이 해당 스페어상 세포 응집체 또는 해당 스페어상 세포 응집체에 포함되는 세포에 미치는 영향을 검정하는 것을 포함한다.
예를 들어, 망막 조직의 장애에 기초하는 질환, 특히 유전성 장애에 기초하는 질환의 환자로부터, iPS 세포를 제작하고, 이 iPS 세포를 사용하여 본 발명의 방법에 의해, 스페어상 세포 응집체를 제조한다. 스페어상 세포 응집체는, 그 환자가 앓고 있는 질환의 원인이 되는 망막 조직의 장애를 인비트로에서 재현할 수 있다. 그래서, 본 발명은, 본 발명의 제조 방법에 의해 제조되는 스페어상 세포 응집체에 피검 물질을 접촉시켜, 피검 물질이 해당 스페어상 세포 응집체 또는 해당 스페어상 세포 응집체에 포함되는 세포에 미치는 영향을 검토하는 것을 포함하는, 해당 물질의 독성 또는 약효 평가 방법을 제공한다.
[치료약, 치료 방법 및 의약 조성물]
본 발명의 일 실시 형태의 치료약은, 스페어상 세포 응집체 또는 당해 세포 응집체의 일부를 함유하여 이루어지는, 망막 색소 상피 세포, 망막계 세포 혹은 망막 조직의 장애 또는 망막 조직의 손상에 기초하는 질환(특히 시세포 및 망막 색소 상피 세포가 동시에 장애 또는 손상되어 있는 중증예)의 치료약이다. 본 발명의 일 실시 형태의 치료 방법은, 스페어상 세포 응집체 또는 당해 세포 응집체의 일부의 유효량을, 이식을 필요로 하는 대상으로 이식하는 것을 포함하는, 망막 색소 상피 세포, 망막계 세포 혹은 망막 조직의 장애 또는 망막 조직의 손상에 기초하는 질환(특히 시세포 및 망막 색소 상피 세포가 동시에 장애 또는 손상되어 있는 중증예)의 치료 방법이다. 본 발명의 일 실시 형태의 의약 조성물은, 본 발명에 따른 스페어상 세포 응집체 또는 당해 세포 응집체의 일부를 유효 성분으로서 함유한다. 본 발명의 일 실시 형태의 의약 조성물은, 망막 색소 상피 세포, 망막계 세포 혹은 망막 조직의 장애 또는 망막 조직의 손상에 기초하는 질환(특히 시세포 및 망막 색소 상피 세포가 동시에 장애 또는 손상되어 있는 중증예)의 치료약으로서 유용하다.
망막 조직의 장애에 기초하는 질환으로서는, 예를 들어 안과 질환인 황반 변성증, 노인성 황반 변성, 망막 색소 변성, 녹내장, 각막 질환, 망막 박리, 중심성 장액성 망맥락막증, 추체 디스트로피, 추체 간체 디스트로피 등을 들 수 있다. 망막 조직의 손상 상태로서는, 예를 들어 시세포가 변성사되어 있는 상태 등을 들 수 있다.
본 발명의 일 실시 형태의 치료약 또는 의약 조성물은, 스페어상 세포 응집체 또는 당해 세포 응집체의 일부의 유효량 및 의약으로서 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 이식용 스페어상 세포 응집체의 유효량은, 투여의 목적, 투여 방법, 투여 대상의 상황(성별, 연령, 체중, 병상 등)에 따라서 상이하지만, 예를 들어 세포수로서, 1×105개, 1×106개 또는 1×107개로 할 수 있다.
의약으로서 허용되는 담체로서는, 생리적인 수성 용매(생리 식염수, 완충액, 무혈청 배지 등)를 사용할 수 있다. 필요에 따라서, 이식 의료에 있어서, 이식하는 조직 또는 세포를 포함하는 의약에, 통상 사용되는 보존제, 안정제, 환원제 등장화제 등을 배합시켜도 된다.
본 발명의 일 실시 형태의 치료약 또는 의약 조성물은, 본 발명에 따른 스페어상 세포 응집체 또는 당해 세포 응집체의 일부를, 적절한 생리적인 수성 용매로 현탁함으로써, 세포 현탁액으로서 제조할 수 있다. 필요하다면, 동결 보존제를 첨가하여 동결 보존하고, 사용 시에 해동(압축 해제)하여 완충액으로 세정하고, 이식 의료에 사용해도 된다.
일 형태에 있어서, 본 발명의 스페어상 세포 응집체를, 핀셋, 나이프, 가위 등을 사용하여 적절한 크기로 세절하고, 응집체의 일부를 이식하기 위해 잘라내어 이용할 수 있다. 잘라낸 후의 형상은 특별히 한정되지 않지만, 세포 시트를 들 수 있다.
[스페어상 세포 응집체의 일부 및 그의 제조 방법]
본 발명의 일 실시 형태의 스페어상 세포 응집체의 일부는, 본 발명의 스페어상 세포 응집체의 일부이며, 예를 들어 본 발명의 스페어상 세포 응집체로부터 물리적으로 잘라냄으로써 얻을 수 있다. 스페어상 세포 응집체의 일부의 형상은 불문이고, 스페어상이 아니어도 된다. 스페어상 세포 응집체의 일부는, 신경 망막과 그 표면의 적어도 일부를 연속적으로 또는 단속적으로 덮는, 서로 접촉하는 망막 색소 상피 세포를 포함하는 피복을 구비하는 세포 응집체이며, 예를 들어 망막 색소 상피 세포 및 신경 망막을 포함하는 세포 시트이면 된다.
본 발명의 일 실시 형태의 스페어상 세포 응집체의 일부의 제조 방법은, 본 발명의 스페어상 세포 응집체의 일부를 물리적으로 잘라내는 공정을 포함한다. 잘라내는 공정은, 통상의 방법, 예를 들어 핀셋, 나이프, 가위 등을 사용하여 적절한 크기로 세절하는 방법에 의해 실행할 수 있다.
실시예
이하에 실시예를 들어 본 발명을 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들에 한정되는 것은 전혀 아니다.
<실시예 1 망막 색소 상피(RPE) 세포와 신경 망막(NR)의 구분 제작>
Crx::Venus 리포터 유전자를 갖도록 유전자 개변한 인간 ES 세포(Kh-ES1주, Cell stem Cell, 10(6), 771-785, (2012)를, 「Scientific Reports, 4, 3594(2014)」에 기재된 방법에 준하여 피더 프리 조건 하에서 배양하였다. 피더 프리 배지로서는 StemFit 배지(상품명: AK03N, 아지노모또사제), 피더 세포를 대신하는 발판으로서 Laminin511-E8(상품명, 닛삐사제)을 사용하였다.
구체적인 인간 ES 세포의 유지 배양 조작은, 이하와 같이 행하였다. 먼저, 서브콘플렌트(배양 면적의 6할이 세포로 덮이는 정도)가 된 인간 ES 세포(KhES-1주)를 PBS로 세정 후, TrypLE Select(상품명, Life Technologies사제)를 사용하여 단일 세포로 분산하였다. 그 후, 단일 세포로 분산된 인간 ES 세포를, Laminin511-E8로 코팅한 플라스틱 배양 디쉬에 파종하고, Y27632(ROCK 저해 물질, 10μM) 존재 하, StemFit 배지에서 피더 프리 조건 하에 배양하였다. 상기 플라스틱 배양 디쉬로서, 6웰 플레이트(이와키사제, 세포 배양용, 배양 면적 9.4 cm2)를 사용한 경우, 상기 단일 세포로 분산된 인간 ES 세포의 파종 세포수는 1웰당 1.2×104 세포로 하였다. 파종한 1일 후에, Y27632를 포함하지 않는 StemFit 배지로 교환하였다. 이후, 1 내지 2일마다 1회 Y27632를 포함하지 않는 StemFit 배지로 배지 교환하였다. 그 후, 파종한 6일 후에, 서브콘플렌트가 되는 1일 전까지 배양하였다.
당해 서브콘플렌트 1일 전의 인간 ES 세포를, 다음 2개의 조건, (1) SAG(Shh 시그널 전달 경로 작용 물질, 300nM)의 존재 하, 또는 (2) SAG 및 SB431542(TGFβ 시그널 전달 경로 저해 물질, 5μM)의 존재 하에, 1일간 피더 프리 조건 하에서 배양하였다(이하, Precondition 처리라 기재하는 경우도 있음).
Precondition 처리한 인간 ES 세포를 PBS로 세정 후, TrypLE Select를 사용하여 세포 분산액 처리하고, 또한 피펫팅 조작에 의해 단일 세포로 분산한 후, 단일 세포로 분산된 인간 ES 세포를 비세포 접착성의 96웰 배양 플레이트(상품명: PrimeSurface 96 웰 V 바닥 플레이트, 스미토모 베이크라이트사제)의 1웰당 1.2×104 세포가 되게 100μL의 무혈청 배지에 부유시켜, 37℃, 5％ CO2에서 부유 배양하였다. 그 때의 무혈청 배지(gfCDM+KSR)에는, F-12 배지와 IMDM 배지의 1:1 혼합액에 10％ KSR, 450μM 1-모노티오글리세롤, 1×Chemically defined lipid concentrate를 첨가한 무혈청 배지를 사용하였다.
부유 배양 개시 시(부유 배양 개시 후 0일째)에, 상기 무혈청 배지에 Y27632(ROCK 저해 물질, 최종 농도 20μM)를 첨가하였다. 또한, 동시에 SAG(Shh 시그널 전달 경로 작용 물질, 30nM)를 첨가 유무로 검토하였다. 부유 배양 개시 후 3일째에, Y27632 및 SAG를 포함하지 않고, 인간 재조합 BMP4(상품명: Recombinant Human BMP-4, R&D사제)를 포함하는 배지를 사용하여, 외래성의 인간 재조합 BMP4를 최종 농도 1.5nM으로 포함하는 배지를 50μL 첨가하였다.
이와 같이 하여 조제된 세포를 부유 배양 개시 후 3, 6, 9, 15 및 18일째에, 무혈청 배지(gfCDM+KSR)에서 절반량 교환하였다. 당해 부유 배양 개시 후 15 또는 18일째의 응집체를, 90mm의 저접착 배양 접시(스미토모 베이크라이트사제)에 옮기고, Wnt 시그널 전달 경로 작용 물질(CHIR99021, 3μM) 및 FGF 시그널 전달 경로 저해 물질(SU5402, 5μM)을 포함하는 무혈청 배지(DMEM/F12 배지에 1％ N2 Supplement가 첨가된 배지)에서 37℃, 5％ CO2로, 3 내지 4일간 배양하였다. 그 후, 90mm의 저접착 배양 접시(스미토모 베이크라이트사제)에서, Wnt 시그널 전달 경로 작용 물질 및 FGF 시그널 전달 경로 저해 물질을 포함하지 않는 혈청 배지(DMEM/F12 배지(Thermo fisher사제)에 10％ 소태아 혈청, 1％ N2 supplement(Thermo fisher사제), Taurin이 첨가된 배지: 이하, NucT0 배지라 기재하는 경우가 있음)에서 장기간 배양하였다. 2 내지 4일에 1회 상기 혈청 배지로 절반량 배지 교환하였다. 부유 배양 개시 후 38일째에, 현미경 및 형광 현미경을 사용하여, 관찰하였다(도 1).
그 결과, SAG 및 SB 첨가에 의한 Precondition 처리를 행하고, 분화 유도 개시 시에 SAG를 첨가하지 않은 경우, RPE의 제작 효율이 양호하였다(도 1B, B'). 상기 이외의 조건에서는, CRX 양성의 시세포 전구 세포를 갖는 신경 망막을 포함하는 세포 응집체의 제작 효율이 양호하였다(도 1A, A', C, C', D, D').
<실시예 2 NR과 RPE 세포의 접착 1>
실시예 1과 같이 하여 제작된 RPE 세포와 NR을, 각각 부유 배양 개시 후 40일째 이후 Wnt 시그널 전달 경로 작용 물질 및 FGF 시그널 전달 저해 물질을 포함하지 않는 혈청 배지(NucT0 배지와 NucT2 배지를 1:3으로 혼합한 배지: 이하, NucT1 배지라 기재하는 경우가 있다. 또한, NucT2 배지란, Neurobasal Medium(Thermo fisher사제)에 10％ FBS, B27 supplement w/o V.A.(Thermo fisher사제), L-Glutamine, Taurin, T3이 첨가된 배지를 의미한다.)에서 59일째까지 장기간 배양하였다. 당해 부유 배양 개시 후 60일째 이후 Wnt 시그널 전달 경로 작용 물질 및 FGF 시그널 전달 저해 물질을 포함하지 않는 혈청 배지(NucT2 배지)에서 장기간 배양하였다.
부유 배양 개시 후 80 내지 90일째의 RPE 세포 및 50 내지 120일째의 NR을 각각 준비하고, 각각 하기와 같이 처리를 하였다(도 2 A).
RPE 세포: PBS(Thermo fisher사제)로 세정 후, Tryple select(Thermo fisher사제)로 효소 처리를 15 내지 30분간 행하여, 피펫팅함으로써 싱글 셀화하고, 40㎛의 셀 스트레이너(Cell strainer)에 통과시킨 후, Nuc 배지에 현탁시켰다.
NR: NR을 튜브에 회수하고, iMatrix511(닛삐사제) 또는 Matrigel(BD사제)로 코팅을 15 내지 60분 실시하고, PBS로 세정하였다.
상기와 같이 하여 조제한 NR과 RPE 세포를 저접착의 PrimeSurface(등록 상표) 96 V 플레이트(스미토모 베이크라이트사제)에 파종하였다. 파종 1시간 후에 현미경 및 형광 현미경을 사용하여 관찰하였다. 그 결과, NR의 둘레에 싱글 셀화된 RPE 세포가 웰의 바닥에 가라앉아 모여 있는 것이 확인되었다(도 2 B, B'). 또한, 다음 날에 PBS로 세정하여 현미경 및 형광 현미경에서 관찰한 바, NR의 표면에 RPE 세포가 접착되어 있는 것을 확인하였다(도 2 C, C', D, D').
접착 후 1일째, 6일째, 45일째의 경시 변화를 관찰하였다. 그 결과, 1일째에 접착된 RPE 세포가 6일째에서는 서서히 증식되어 NR 표면을 덮기 시작하여, 45일째에서는 NR 표면을 덮고 있는 것이 형광 현미경에서 확인되었다(도 3 E, F, G). 또한, 45일째에서는 NR 표면에 접착되어 있는 RPE 세포는 육각형 구조를 형성하는 것도 형광 현미경에서 확인되었다(도 3 H, H')
접착시킨 후 50일째 NR-RPE 세포의 응집 덩어리를, 4％ PFA로 고정시켜, 동결 절편을 제작하였다. 이들 동결 절편에 관한 것이고, MITF 단백질에 대하여 항MITF 항체(상품명: Anti MITF Antibody, EX alpha사제)를 사용하여 면역 염색을 행하였다. 이들 면역 염색된 절편을, 공초점 형광 현미경을 사용하여 관찰하였다. 그 결과, NR과 RPE 세포를 접착시킨 응집체에서는 CRX 양성의 시세포 전구 세포의 표면에 MITF 양성의 RPE 세포가 국재되어 있는 것을 확인하였다(도 4 I, J).
이들 결과로부터, 개개로 구분 제작한 RPE 세포와 NR을 접착시켜, NR 상에 RPE 세포가 국재된 NR-RPE 세포 시트를 제작할 수 있는 것을 알았다.
<실시예 3 NR과 RPE 세포의 접착 2>
실시예 1과 같이 하여 제작된 RPE 세포와 NR을, 각각 부유 배양 개시 후 40일째 이후 Wnt 시그널 전달 경로 작용 물질 및 FGF 시그널 전달 저해 물질을 포함하지 않는 혈청 배지(NucT0 배지와 NucT2 배지를 1:3으로 혼합한 NucT1 배지에서 배양. NucT2 배지: Neurobasal Medium에 10％ FBS, B27 supplement w/o V.A., L-Glutamine, Taurin, T3이 첨가된 배지)에서 59일째까지 장기간 배양하였다. 당해 부유 배양 개시 후 60일째 이후 Wnt 시그널 전달 경로 작용 물질 및 FGF 시그널 전달 저해 물질을 포함하지 않는 혈청 배지(NucT2 배지)에서 장기간 배양하였다.
3％ 메틸셀룰로오스(Sigma aldrich사제)를 넣은 혈청 배지 중에, 부유 배양 개시 후 50 내지 120일째의 NR을, 피펫을 사용하여 첨가하고, 부유시켰다. 또한, 부유 배양 개시 후 80 내지 90일째의 RPE 세포의 응집체를 10개 정도 회수하여, PBS로 세정하고, Tryple select(Thermo fisher사제)로 효소 처리를 15 내지 60분간 행하고, 피펫팅함으로써 싱글 셀화하였다. 싱글 셀화한 RPE 세포를 40㎛의 Cell strainer(Falcon사제)에 통과시킨 후, 800rpm으로 원심하고, 상청을 제거하였다. 배지를 10μL 첨가 후, 3μl 회수하고, 3％ 메틸셀룰로오스(Sigma aldrich사제)를 넣은 혈청 배지 중, NR을 향해 토출하였다(도 5 A, B). 1시간 이내에 현미경 및 형광 현미경으로 관찰한 바, 싱글 셀화한 RPE 세포가 NR에 부착되어 있는 것을 확인하였다(도 6 C, C'). 접착 13일 후, 현미경 및 형광 현미경에서 관찰한 바, NR 상에 접착되어 있는 것을 확인하였다(도 6 D, D').
이들 결과로부터, 개개로 구분 제작한 RPE 세포와 NR을 메틸셀룰로오스를 넣은 배지 중에 첨가함으로써 RPE 세포를 NR 상에 접착시키는 것이 가능한 것을 알았다.
<실시예 4: NR-RPE 세포 시트의 이식 및 생착 확인>
실시예 2에서 제작한 NR-RPE 세포 시트를 NucT2 배지에서 콘쥬게이트시키고 나서 5일간 및 50일간 배양하였다(도 7 A, A', D, D'). 상기 배양한 NR-RPE 세포 시트를 NR과 RPE 세포를 동시에 잘라내었다(도 7 B, B', C, C', E, E', F, F'). 현미경 및 형광 현미경에서 관찰한 바, 외측으로부터 관찰하면 RPE 세포가 접착되어 있는 것이 관찰되고, 내측으로부터 관찰하면, RPE 세포는 거의 관찰되지 않고 CRX::Venus의 형광을 잘 확인할 수 있었다. 따라서, NR-RPE 세포 시트에 있어서 극성을 가지고 잘라낼 수 있었다.
상기와 같이 하여 잘라낸 NR-RPE 세포 시트를, 주사기를 사용하여 시세포 변성 모델인 망막 변성 래트의 망막 하에 이식하였다. 이식 5개월 이상 후에 눈 조직을 파라포름알데히드 고정(PFA 고정)하여 수크로오스 치환하였다. 크라이오스탯을 사용하여, 조직 절편을 제작하였다(도 8 G, G'). 절편을 현미경 및 형광 현미경 하에서 관찰한 바, Host의 RPE 상에 RPE층이 있고, 그 위에 CRX::Venus 양성의 시세포 Rosette가 확인되었다(도 8 G, G').
면역 염색에 의해, Rhodopsin 항체(상품명: Anti RetP1 항체, Sigma사제)를 사용하여, 이식 후의 그래프트를 평가하였다. 또한, 인간 세포질 마커 특이적 마우스 모노클로날 항체(상품명: Stem121, TaKaRa사제), 항RPE65 항체(상품명: RPE65 Antibody, Millipore사제)를 사용하여, 각각 조직 절편 중의 인간 세포, RPE 세포를 염색하고, 이식 후의 그래프트를 평가하였다.
염색한 조직을, 공초점 현미경(상품명: TCS SP8, 라이카사제)을 사용하여 형광 관찰을 행하였다. 그 결과, 시세포는 Rhodopsin 양성인 것을 알았고, RPE 세포와 동시 이식한 시세포에 있어서도, 문제없이 성숙하는 것을 알았다(도 9 H). 또한, Stem121과 RPE65로 염색한 절편을 관찰한 바, 하측의 RPE65 양성의 RPE층은 Stem121 음성인 점에서, Host의 RPE 세포인 것, 한편으로 그의 상측에 있는 RPE65 양성의 RPE층은 Stem121 양성이었던 점에서, Graft 유래의 RPE층인 것을 알았다(도 10 I). 또한, Graft 유래의 RPE층의 바로 상측에 CRX::Venus 양성의 시세포 Rosette가 관찰되었다.
상기 결과로부터, NR-RPE 세포 시트의 동시 이식에서는 시세포는 성숙하는 것, 및 NR과 RPE 세포는 방향성을 가지고 동시 이식·생착이 가능한 것이 나타났다.

Claims (22)

  1. 신경 망막을 포함하는 코어부와, 상기 코어부의 표면의 적어도 일부를 연속적으로 또는 단속적으로 덮는 피복부를 구비하는 스페어상 세포 응집체로서,
    (1) 상기 신경 망막에 있어서, 적어도 시세포층을 포함하는 신경 망막층이 형성되어 있고, 상기 시세포층은 적어도 시세포, 시세포 전구 세포 및 망막 전구 세포로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 세포를 포함하고, 상기 시세포층에 포함되는 세포가 상기 코어부의 표면의 접선 방향으로 연속해서 존재하고 있으며,
    (2) 상기 피복부는, 서로 접촉하는 망막 색소 상피 세포를 포함하고,
    (3) 상기 세포 응집체는, 수정체, 초자체, 각막 및 혈관을 포함하지 않으며, 또한
    (4) 상기 망막 색소 상피 세포는, 상기 신경 망막층과 함께 연속되는 상피 구조를 구성하고 있지 않은
    것을 특징으로 하는 스페어상 세포 응집체.
  2. 제1항에 있어서, (1)에 있어서의 시세포층과, 해당 시세포층의 적어도 일부를 덮는 망막 색소 상피 세포 사이에, 추가로 세포외 매트릭스가 존재하는 스페어상 세포 응집체.
  3. 제2항에 있어서, 세포외 매트릭스가, 히알루론산, 라미닌, IV형 콜라겐, 헤파란황산프로테오글리칸 및 엔탁틴으로 이루어지는 군에서 선택되는 1개 또는 복수의 세포외 매트릭스인 스페어상 세포 응집체.
  4. 신경 망막을 포함하는 스페어상의 세포 응집체(신경 망막의 세포 응집체)로서,
    (I) 상기 신경 망막의 세포 응집체에 있어서, 상기 신경 망막은 상기 세포 응집체의 표면에 존재하고 있으며, 또한
    (II) 상기 신경 망막에 있어서 적어도 시세포층을 포함하는 신경 망막층이 형성되어 있고, 상기 시세포층에는 시세포, 시세포 전구 세포 및 망막 전구 세포로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 세포가 존재하고 있는, 신경 망막의 세포 응집체를 조제하는 공정과,
    망막 색소 상피 세포를 조제하는 공정과,
    상기 신경 망막의 세포 응집체 및 상기 망막 색소 상피 세포를 접촉시키는 공정을 포함하는,
    제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 기재된 스페어상 세포 응집체의 제조 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 신경 망막의 세포 응집체에 있어서의 상기 신경 망막에 있어서의 Chx10 양성 세포의 존재 비율이 20％ 이상인 제조 방법.
  6. 제4항에 있어서, 접촉 공정에 있어서, 접착 인자의 존재 하에서 접촉시키는 제조 방법.
  7. 제6항에 있어서, 접착 인자가 세포외 매트릭스인 제조 방법.
  8. 제7항에 있어서, 세포외 매트릭스가, 히알루론산, 라미닌, IV형 콜라겐, 헤파란황산프로테오글리칸 및 엔탁틴으로 이루어지는 군에서 선택되는 1개 또는 복수의 세포외 매트릭스인 제조 방법.
  9. 제4항에 있어서, 신경 망막의 세포 응집체 및 망막 색소 상피 세포의 적어도 한쪽이 다능성 줄기 세포 유래인 제조 방법.
  10. 제4항에 있어서, 망막 색소 상피 세포를 조제하는 공정에 있어서, 망막 색소 상피 세포가 세포 시트 또는 세포 현탁액으로서 조제되는 제조 방법.
  11. 제4항에 있어서, 접촉 공정 후에, 망막 색소 상피 세포가 다각형 또는 포석상의 세포 형태를 가질 때까지 더 배양하는 제조 방법.
  12. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 기재된 스페어상 세포 응집체 또는 당해 세포 응집체의 일부를 함유하여 이루어지는, 피검 물질의 독성 또는 약효 평가용 시약.
  13. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 기재된 스페어상 세포 응집체 또는 당해 세포 응집체의 일부에 피검 물질을 접촉시켜, 피검 물질이 해당 스페어상 세포 응집체 또는 해당 스페어상 세포 응집체에 포함되는 세포에 미치는 영향을 검정하는 것을 포함하는, 피검 물질의 독성 또는 약효 평가 방법.
  14. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 기재된 스페어상 세포 응집체 또는 당해 세포 응집체의 일부를 함유하여 이루어지는, 망막 색소 상피 세포, 망막계 세포 혹은 망막 조직의 장애 또는 망막 조직의 손상에 기초하는 질환의 치료약.
  15. 망막 색소 상피 세포, 망막계 세포 혹은 망막 조직의 장애 또는 망막 조직의 손상에 기초하는 질환의 치료에 있어서의 사용을 위한, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 기재된 스페어상 세포 응집체.
  16. 망막 색소 상피 세포, 망막계 세포 혹은 망막 조직의 장애 또는 망막 조직의 손상에 기초하는 질환의 치료에 있어서의 사용을 위한, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 기재된 스페어상 세포 응집체의 일부.
  17. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 기재된 스페어상 세포 응집체 또는 당해 세포 응집체의 일부를 유효 성분으로서 함유하는, 망막 색소 상피 세포, 망막계 세포 혹은 망막 조직의 장애 또는 망막 조직의 손상에 기초하는 질환을 치료하기 위한 의약 조성물.
  18. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 기재된 스페어상 세포 응집체로부터 물리적으로 잘라내어져 이루어지는, 스페어상 세포 응집체의 일부.
  19. 제18항에 있어서, 망막 색소 상피 세포 및 신경 망막을 포함하는 세포 시트인 스페어상 세포 응집체의 일부.
  20. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 기재된 스페어상 세포 응집체의 일부를 물리적으로 잘라내는 공정을 포함하는, 스페어상 세포 응집체의 일부의 제조 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 스페어상 세포 응집체의 일부가 망막 색소 상피 세포 및 신경 망막을 포함하는 세포 시트인 제조 방법.
  22. 제1항에 있어서, (1)에 있어서의 시세포층과, 해당 시세포층의 적어도 일부를 덮는 망막 색소 상피 세포 사이에, 추가로 히드로겔이 존재하는 스페어상 세포 응집체.
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