WO2022239868A1

WO2022239868A1 - 網膜組織の製造方法

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Publication number: WO2022239868A1
Application number: PCT/JP2022/020264
Authority: WO
Inventors: 道子万代; 優山▲崎▼
Original assignee: 国立研究開発法人理化学研究所; 住友ファーマ株式会社; 住友化学株式会社
Priority date: 2021-05-14
Filing date: 2022-05-13
Publication date: 2022-11-17
Also published as: JPWO2022239868A1

Abstract

本発明は、多能性幹細胞を分化誘導する際に、目的外細胞の割合が低減された網膜系細胞又は網膜組織の製造方法を提供することを目的とする。本発明の網膜系細胞又は網膜組織の製造方法は、（Ａ）多能性幹細胞を浮遊培養し、多能性幹細胞の細胞凝集体を形成させる工程と、（Ｂ）工程（Ａ）で得られた細胞凝集体を、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質及びＣＨＫ１シグナル伝達経路阻害物質の存在下に浮遊培養し、網膜系細胞を含む細胞凝集体を得る工程とを含む。

Description

網膜組織の製造方法

　本発明は、網膜系細胞又は網膜組織を製造方法に関する。本発明はまた、該製造方法によって製造される網膜色素上皮細胞を含む外側構造と、神経網膜を含む内側構造との複層構造を備えるスフェア状細胞凝集体に関する。

　近年、網膜組織を、多能性幹細胞から分化誘導させて製造することが可能となった。例えば、多能性幹細胞から多層の網膜組織を製造する方法（特許文献１及び非特許文献１）が報告された。その他にも、均一な多能性幹細胞の凝集体を、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質を含む無血清培地中で形成させ、これを基底膜標品の存在下において浮遊培養した後、血清培地中で浮遊培養することにより、多層の網膜組織を得る方法（特許文献２及び非特許文献２）、均一な多能性幹細胞の凝集体を、ＢＭＰ４シグナル伝達経路活性化物質を含む培地中で形成させ、多層の網膜組織を得る方法（特許文献３及び非特許文献３）、接着させた多能性幹細胞を自然に分化させ、その一部に含まれる網膜組織を分離して多層の網膜組織を得る方法（非特許文献４）が知られている。

　しかし、これらの製造方法においては、網膜組織の品質に一定のばらつきがあり、一定の割合で目的外細胞が誘導されることもある。これらを移植用組織に利用する場合、特にその品質を厳密に管理することが求められる。

　一方、ＢＭＰの増感剤（ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒ）としてＰＤ４０７８２４（ＣＨＫ１：Ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ　ｋｉｎａｓｅ　１阻害剤）が知られている。また、ＰＤ４０７８２４とＢＭＰの併用により、ＥＳ細胞の中胚葉系の細胞への分化誘導を亢進させることが報告されている（非特許文献５）。しかしながら、ＰＤ４０７８２４の網膜組織を含む神経系への効果は知られていない。

国際公開第２０１１／０５５８５５号国際公開第２０１３／０７７４２５号国際公開第２０１５／０２５９６７号

Eiraku M. et al., "Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture", Nature, 472, 51-56, (2011) Nakano T. et al., "Self-formation of Optic Cups and Storable Stratified Neural Retina From Human ESCs" Cell Stem Cell, 10(6), 771-785, (2012) Kuwahara A. et al., "Generation of a ciliary margin-like stem cell niche from self-organizing human retinal tissue" Nature Communications, 6, Article number:6286, (2015) Xiufeng Zhong et al., "Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs", Nature Communications volume 5, Article number: 4047 (2014) Lingling Feng et al., "Discovery of a Small-Molecule BMP Sensitizer for Human Embryonic Stem Cell Differentiation", Cell Reports, Volume 15, Issue 9, 31 May 2016, Pages 2063-2075

　そこで、本発明は上記事情に鑑みて、多能性幹細胞を分化誘導する際に、目的外細胞の割合が低減され、品質が向上した網膜系細胞又は網膜組織の製造方法を提供することを目的とする。

　本発明者らは、ＢＭＰを用いた網膜組織の製造方法に、ＣＨＫ１シグナル伝達経路阻害物質を併用することにより、添加するＢＭＰ量を通常濃度の１／１０程度までに減らすことができることを見出した。さらに、ＢＭＰとＣＨＫ１シグナル伝達経路阻害物質を組み合わせることにより、ＢＭＰを単独で用いる場合に比べて、目的外細胞の割合を減少させ、一定の形状の網膜組織を製造可能であることを見出した。さらに、本発明者らは、通常濃度のＢＭＰと、ＣＨＫ１シグナル伝達経路阻害物質を併用することにより、外側に網膜色素上皮（ＲＰＥ）、内側に網膜組織（神経網膜組織）が局在する、複層構造を備えるスフェア状細胞凝集体を選択的に製造できることを見出した。

　すなわち、本発明は以下の各発明に関する。
［１］
　（Ａ）多能性幹細胞を浮遊培養し、多能性幹細胞の細胞凝集体を形成させる工程と、
　（Ｂ）工程（Ａ）で得られた細胞凝集体を、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質及びＣＨＫ１シグナル伝達経路阻害物質の存在下に浮遊培養し、網膜系細胞を含む細胞凝集体を得る工程と
を含む、網膜系細胞又は網膜組織の製造方法。
［２］
　工程（Ｂ）において、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質が、真球に近い細胞凝集体が形成され、かつ、網膜色素上皮細胞への分化誘導が抑制されるような濃度で存在する、［１］に記載の製造方法。
［３］
　工程（Ｂ）で得られた細胞凝集体が、網膜色素上皮細胞を含む外側構造と、神経網膜を含む内側構造との複層構造を備えるスフェア状細胞凝集体であり、工程（Ｂ）において、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質が、上記複層構造を備えるスフェア状細胞凝集体が形成されるような濃度で存在している、［１］に記載の製造方法。
［４］
　上記ＣＨＫ１シグナル伝達経路阻害物質がＰＤ４０７８２４である、［１］～［３］のいずれかに記載の製造方法。
［５］
　上記ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質が、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ７及びＧＤＦ７からなる群から選択される１以上のタンパク質である、［１］～［４］のいずれかに記載の製造方法。
［６］
　工程（Ｂ）において、工程（Ａ）の浮遊培養開始後２日目から９日目の間に上記ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質が培地に添加される、［１］～［５］のいずれかに記載の製造方法。
［７］
　工程（Ｂ）において、上記ＣＨＫ１シグナル伝達経路阻害物質が、上記ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質と同時に培地に添加される、［１］～［６］のいずれかに記載の製造方法。
［８］
　上記ＣＨＫ１シグナル伝達経路阻害物質の濃度が、０．１μＭから１０μＭのＰＤ４０７８２４と同程度のＣＨＫ１シグナル伝達経路阻害作用を奏する濃度である、［１］～［７］のいずれかに記載の製造方法。
［９］
　工程（Ｂ）で得られた細胞凝集体から、移植に必要な大きさの網膜組織を切り出す工程をさらに含む、［１］～［８］のいずれかに記載の製造方法。
［１０］
　網膜色素上皮細胞を含む外側構造と、神経網膜を含む内側構造との複層構造を備えるスフェア状細胞凝集体であって、
　（１）上記内側構造における上記神経網膜において、少なくとも視細胞層を含む神経網膜層が形成されており、上記視細胞層は少なくとも視細胞、視細胞前駆細胞及び網膜前駆細胞からなる群から選択される１以上の細胞を含み、
　（２）上記内側構造において、上記神経網膜が折り重なって存在しており、
　（３）上記外側構造における上記網膜色素上皮細胞がＲＰＥ６５陽性細胞、ＭＩＴＦ陽性細胞、又は、ＲＰＥ６５陽性かつＭＩＴＦ陽性細胞であり、かつ
　（４）上記細胞凝集体は、水晶体、硝子体、角膜及び血管を含まない
ことを特徴とするスフェア状細胞凝集体。
［１１］
　上記スフェア状細胞凝集体の少なくとも一部において、上記網膜色素上皮細胞の基底面が上記内側構造に向き、上記神経網膜の基底面が上記外側構造に向いている、［１０］に記載のスフェア状細胞凝集体。
［１２］
　さらに、上記網膜色素上皮細胞と上記神経網膜が上皮構造としてつながっており、上記スフェア状細胞凝集体が、上記網膜色素上皮細胞と上記神経網膜との間に毛様体周縁部様構造体をさらに含む、［１０］又は［１１］に記載のスフェア状細胞凝集体。
［１３］
　上記毛様体周縁部様構造体が、Ｒｄｈ１０陽性細胞、Ｏｔｘ１陽性細胞、及び／又はＺｉｃ１陽性細胞を含む、［１２］に記載のスフェア状細胞凝集体。
［１４］
　上記内側構造の３０％以上が神経網膜である、［１０］～［１３］のいずれかに記載のスフェア状細胞凝集体。
［１５］
　直径が０．２ｍｍ～２ｍｍである、［１０］～［１４］のいずれかに記載のスフェア状細胞凝集体。
［１６］
　（Ａ）多能性幹細胞を浮遊培養し、多能性幹細胞の細胞凝集体を形成させる工程と、
　（Ｂ）工程（Ａ）で得られた細胞凝集体を、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質及びＣＨＫ１シグナル伝達経路阻害物質の存在下に浮遊培養し、網膜色素上皮細胞を含む外側構造と、神経網膜を含む内側構造との複層構造を備えるスフェア状細胞凝集体を得る工程と
を含む、［１０］～［１５］のいずれかに記載のスフェア状細胞凝集体の製造方法。
［１７］
　［１０］～［１５］のいずれかに記載のスフェア状細胞凝集体又はその一部を含む、医薬組成物（移植用組成物、移植用組織又はＴｒａｎｓｐｌａｎｔ）。
［１８］
　［１０］～［１５］のいずれかに記載のスフェア状細胞凝集体又はその一部を、移植を必要とする対象に移植することを含む、網膜系細胞若しくは網膜組織の障害又は網膜組織の損傷に基づく疾患の、治療方法。
［１９］
　網膜系細胞若しくは網膜組織の障害又は網膜組織の損傷に基づく疾患を治療する医薬組成物の製造における、［１０］～［１５］のいずれかに記載のスフェア状細胞凝集体又はその一部の使用。
［２０］
　網膜系細胞若しくは網膜組織の障害又は網膜組織の損傷に基づく疾患の治療における、［１０］～［１５］のいずれかに記載のスフェア状細胞凝集体又はその一部の使用。

　本発明によれば、ＢＭＰとＰＤ４０７８２４とを組み合わせることにより、ＢＭＰのみを用いた場合に比べて、目的外細胞の割合が低減された網膜系細胞又は網膜組織の製造方法を提供することが可能となり、また、良好な形状の網膜組織を製造することが可能となる。

実施例１において、ＢＭＰ４（０．１５ｎＭ又は１．５ｎＭ）とともにＰＤ４０７８２４（図中「ＰＤ」）１μＭを添加して浮遊培養開始後１７日目の凝集塊の状態を観察した蛍光顕微鏡写真である。実施例２において、１．５ｎＭ　ＢＭＰ４のみ、又は、０．１５ｎＭ　ＢＭＰ４及び１μＭ　ＰＤ４０７８２４（図中「ＰＤ」）を添加し浮遊培養開始後１５日目の凝集塊の状態を観察した蛍光顕微鏡写真である。実施例２において、１．５ｎＭ　ＢＭＰ４のみ、又は、０．１５ｎＭ　ＢＭＰ４及び１μＭ　ＰＤ４０７８２４（図中「ＰＤ」）を添加し浮遊培養開始後１５日目の凝集塊の状態を観察した蛍光顕微鏡写真である。実施例２において、１．５ｎＭ　ＢＭＰ４のみ、又は、０．１５ｎＭ　ＢＭＰ４及び１μＭ　ＰＤ４０７８２４（図中「ＰＤ」）を添加し浮遊培養開始後３６日目の凝集塊の状態を観察した明視野顕微鏡及び蛍光顕微鏡写真である。実施例３において、１．５ｎＭ　ＢＭＰ４とともに１μＭ　ＰＤ４０７８２４（図中「ＰＤ」）を添加して浮遊培養開始後２１日目の凝集塊の状態を観察した明視野顕微鏡及び蛍光顕微鏡写真である。実施例３において、１．５ｎＭ　ＢＭＰ４とともに１μＭ　ＰＤ４０７８２４（図中「ＰＤ」）を添加して浮遊培養開始後２５日目の凝集塊の切片を免疫染色し、共焦点蛍光顕微鏡にて観察した写真である。実施例３において、１．５ｎＭ　ＢＭＰ４とともに１μＭ　ＰＤ４０７８２４を添加して浮遊培養開始後２５日目の凝集体の切片を免疫染色し、共焦点蛍光顕微鏡にて観察した写真である。実施例４において、各種濃度のＢＭＰ４とともに各種濃度のＰＤ４０７８２４を添加して浮遊培養開始後９日目の凝集体の状態を観察した蛍光顕微鏡写真である。実施例５において、１．５ｎＭ　ＢＭＰ４とともに１μＭ　ＰＤ４０７８２４を添加して浮遊培養開始後６０日目の凝集体の切片を免疫染色し、共焦点蛍光顕微鏡にて観察した写真である。

〔定義〕
　「幹細胞」とは、分化能及び増殖能（特に自己複製能）を有する未分化な細胞を意味する。幹細胞には、分化能力に応じて、多能性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ）、複能性幹細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ）、単能性幹細胞（ｕｎｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ）等の亜集団が含まれる。多能性幹細胞とは、インビトロにおいて培養することが可能で、かつ、三胚葉（外胚葉、中胚葉、内胚葉）及び／又は胚体外組織に属する細胞系譜すべてに分化しうる能力（分化多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ））を有する幹細胞をいう。複能性幹細胞とは、全ての種類ではないが、複数種の組織や細胞へ分化し得る能力を有する幹細胞を意味する。単能性幹細胞とは、特定の組織や細胞へ分化し得る能力を有する幹細胞を意味する。

　「多能性幹細胞」は、受精卵、クローン胚、生殖幹細胞、組織内幹細胞、体細胞等から誘導することができる。多能性幹細胞としては、胚性幹細胞（ＥＳ細胞：Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ）、胚性生殖幹細胞（ＥＧ細胞：Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｇｅｒｍ　ｃｅｌｌ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞：ｉｎｄｕｃｅｄ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ）等を挙げることが出来る。間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ；ＭＳＣ）から得られるＭｕｓｅ細胞（Ｍｕｌｔｉ－ｌｉｎｅａｇｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ　ｓｔｒｅｓｓ　ｅｎｄｕｒｉｎｇ　ｃｅｌｌ）や、生殖細胞（例えば精巣）から作製されたＧＳ細胞も多能性幹細胞に包含される。なお、ヒト胚性幹細胞は、受精１４日以内のヒト胚から樹立されたものである。

　１９９８年にヒト胚性幹細胞が樹立されており、再生医学にも利用されつつある。胚性幹細胞は、内部細胞凝集体をフィーダー細胞上又はｂＦＧＦを含む培地中で培養することにより製造することが出来る。胚性幹細胞の製造方法は、例えば、ＷＯ９６／２２３６２、ＷＯ０２／１０１０５７、ＵＳ５，８４３，７８０、ＵＳ６，２００，８０６、ＵＳ６，２８０，７１８等に記載されている。胚性幹細胞は、所定の機関より入手でき、また、市販品を購入することもできる。例えば、ヒト胚性幹細胞であるＫｈＥＳ－１、ＫｈＥＳ－２及びＫｈＥＳ－３は、京都大学再生医科学研究所より入手可能である。ヒト胚性幹細胞である、Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓ、Ｒｘ：：ＡｃＧＦＰ及びＣｒｘ：：Ｖｅｎｕｓレポーター遺伝子を持つように遺伝子改変したヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ－１株（非特許文献３））は国立研究開発法人理化学研究所より入手可能である。

　「人工多能性幹細胞」とは、体細胞を、公知の方法等により初期化（ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ）することにより、多能性を誘導した細胞である。

　人工多能性幹細胞は、２００６年、山中らによりマウス細胞で樹立された（Ｃｅｌｌ，２００６，１２６（４），ｐｐ．６６３－６７６）。人工多能性幹細胞は、２００７年にヒト線維芽細胞でも樹立され、胚性幹細胞と同様に多能性と自己複製能を有する（Ｃｅｌｌ，２００７，１３１（５），ｐｐ．８６１－８７２；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００７，３１８（５８５８），ｐｐ．１９１７－１９２０；Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００８，２６（１），ｐｐ．１０１－１０６）。

　人工多能性幹細胞は、具体的には、線維芽細胞や末梢血単核球等分化した体細胞をＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｍｙｃ（ｃ－Ｍｙｃ、Ｎ－Ｍｙｃ、Ｌ－Ｍｙｃ）、Ｇｌｉｓ１、Ｎａｎｏｇ、Ｓａｌｌ４、ｌｉｎ２８、Ｅｓｒｒｂ等を含む初期化遺伝子群から選ばれる複数の遺伝子の組合せのいずれかの発現により初期化して多分化能を誘導した細胞が挙げられる。好ましい初期化因子の組み合わせとしては、（１）Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、及びＭｙｃ（ｃ－Ｍｙｃ又はＬ－Ｍｙｃ）、（２）Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｌｉｎ２８及びＬ－Ｍｙｃ（Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ、２０１３；３１：４５８－４６６）を挙げることが出来る。

　人工多能性幹細胞として、遺伝子発現による直接初期化で製造する方法以外に、化合物の添加等により体細胞より人工多能性幹細胞を誘導することもできる（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１３，３４１，ｐｐ．６５１－６５４）。

　また、株化された人工多能性幹細胞を入手することも可能であり、例えば、京都大学で樹立された２０１Ｂ７細胞、２０１Ｂ７－Ｆｆ細胞、２５３Ｇ１細胞、２５３Ｇ４細胞、１２０１Ｃ１細胞、１２０５Ｄ１細胞、１２１０Ｂ２細胞、１２３１Ａ３細胞等のヒト人工多能性幹細胞株が、京都大学及びｉＰＳアカデミアジャパン株式会社より入手可能である。株化された人工多能性幹細胞として、例えば、京都大学で樹立されたＦｆ－Ｉ０１細胞、Ｆｆ－Ｉ１４細胞及びＱＨＪＩ０１ｓ０４細胞が、京都大学より入手可能である。

　本明細書において、多能性幹細胞は、好ましくは胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞であり、より好ましくは人工多能性幹細胞である。

　本明細書において、多能性幹細胞は、ヒトの多能性幹細胞であり、好ましくはヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）又はヒト胚性幹細胞（ＥＳ細胞）である。

　ヒトｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞は、当業者に周知の方法で維持培養及び拡大培養に付すことができる。

　「網膜組織（Ｒｅｔｉｎａｌ　ｔｉｓｓｕｅ）」とは、生体網膜において各網膜層を構成する網膜系細胞が、一種類又は複数種類、一定の秩序に従い存在する組織を意味し、「神経網膜（Ｎｅｕｒａｌ　Ｒｅｔｉｎａ；ＮＲ）」は、網膜組織であって、後述する網膜層のうち網膜色素上皮層を含まない内側の神経網膜層を含む組織を意味する。

　「網膜系細胞（Ｒｅｔｉｎａｌ　ｃｅｌｌ）」とは、生体網膜において各網膜層を構成する細胞又はその前駆細胞を意味する。網膜系細胞には、視細胞（桿体視細胞、錐体視細胞）、水平細胞、アマクリン細胞、介在神経細胞、網膜神経節細胞（神経節細胞）、双極細胞（桿体双極細胞、錐体双極細胞）、ミュラーグリア細胞、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞、毛様体、これらの前駆細胞（例：視細胞前駆細胞、双極細胞前駆細胞等）、網膜前駆細胞等の細胞が含まれるがこれらに限定されない。網膜系細胞のうち、神経網膜層を構成する細胞（神経網膜細胞又は神経網膜系細胞（Ｎｅｕｒａｌ　ｒｅｔｉｎａ－ｒｅｌａｔｅｄ　ｃｅｌｌ）ともいう）として、具体的には、視細胞（桿体視細胞、錐体視細胞）、水平細胞、アマクリン細胞、介在神経細胞、網膜神経節細胞（神経節細胞）、双極細胞（桿体双極細胞、錐体双極細胞）、ミュラーグリア細胞、及びこれらの前駆細胞（例：視細胞前駆細胞、双極細胞前駆細胞等）等の細胞が挙げられる。すなわち、神経網膜系細胞には網膜色素上皮細胞及び毛様体細胞が含まれない。

　「成熟した網膜系細胞」とは、ヒト成人の網膜組織に含まれ得る細胞を意味し、具体的には、視細胞（桿体視細胞、錐体視細胞）、水平細胞、アマクリン細胞、介在神経細胞、網膜神経節細胞（神経節細胞）、双極細胞（桿体双極細胞、錐体双極細胞）、ミュラーグリア細胞、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞、毛様体細胞等の分化した細胞を意味する。「未成熟な網膜系細胞」とは、成熟した網膜系細胞への分化が決定づけられている前駆細胞（例：視細胞前駆細胞、双極細胞前駆細胞、網膜前駆細胞等）を意味する。

　視細胞前駆細胞、水平細胞前駆細胞、双極細胞前駆細胞、アマクリン細胞前駆細胞、網膜神経節細胞前駆細胞、ミュラーグリア前駆細胞、網膜色素上皮前駆細胞とは、それぞれ、視細胞、水平細胞、双極細胞、アマクリン細胞、網膜神経節細胞、ミュラーグリア細胞、網膜色素上皮細胞への分化が決定付けられている前駆細胞をいう。

　「網膜前駆細胞」とは、視細胞前駆細胞、水平細胞前駆細胞、双極細胞前駆細胞、アマクリン細胞前駆細胞、網膜神経節細胞前駆細胞、ミュラーグリア細胞、網膜色素上皮前駆細胞等のいずれの未成熟な網膜系細胞にも分化しうる前駆細胞であって、最終的に、視細胞、桿体視細胞、錐体視細胞、水平細胞、双極細胞、アマクリン細胞、網膜神経節細胞、網膜色素上皮細胞等のいずれの成熟した網膜系細胞にも分化しうる前駆細胞をいう。

　「視細胞（ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｃｅｌｌ）」とは、生体においては網膜の視細胞層に存在し、光刺激を吸収し電気信号へと変換する役割を持つ。視細胞には、明所で機能する錐体（ｃｏｎｅ）と暗所で機能する杆体（又は桿体、ｒｏｄ）の２種類がある（それぞれ、錐体視細胞、杆体視細胞という）。また、錐体視細胞としては、Ｓ－ｏｐｓｉｎを発現し青色光を受容するＳ錐体視細胞、Ｌ－ｏｐｓｉｎを発現し赤色光を受容するＬ錐体視細胞、及びＭ－ｏｐｓｉｎを発現し緑色光を受容するＭ錐体視細胞を挙げることができる。視細胞は視細胞前駆細胞から分化し、成熟する。細胞が視細胞若しくは視細胞前駆細胞であるか否かは、当業者であれば、例えば後述する細胞マーカー（視細胞前駆細胞で発現するＣｒｘ及びＢｌｉｍｐ１、視細胞で発現するリカバリン（Ｒｅｃｏｖｅｒｉｎ）、成熟視細胞で発現するロドプシン、Ｓ－Ｏｐｓｉｎ及びＭ／Ｌ－Ｏｐｓｉｎ等）の発現、外節構造の形成等により容易に確認できる。一態様において、視細胞前駆細胞はＣｒｘ陽性細胞であり、視細胞はロドプシン、Ｓ－Ｏｐｓｉｎ及びＭ／Ｌ－Ｏｐｓｉｎ陽性細胞である。一態様において、桿体視細胞はＮＲＬ及びＲｈｏｄｏｐｓｉｎ陽性細胞である。一態様において、Ｓ錐体視細胞はＳ－ｏｐｓｉｎ陽性細胞、Ｌ錐体視細胞はＬ－ｏｐｓｉｎ陽性細胞、及びＭ錐体視細胞はＭ－ｏｐｓｉｎ陽性細胞である。

　神経網膜系細胞の存在は、神経網膜系細胞関連遺伝子（以下、「神経網膜系細胞マーカー」、又は「神経網膜マーカー」という場合がある。）の発現の有無によって確認することができる。神経網膜系細胞マーカーの発現の有無、又は細胞集団若しくは組織における神経網膜系細胞マーカー陽性細胞の割合は、当業者であれば容易に確認することができる。例えば、抗体を用いた手法、核酸プライマーを用いた手法、シーケンス反応を用いた手法が挙げられる。抗体を用いた手法としては、神経網膜系細胞マーカーのタンパク質の発現を、例えば、市販の抗体を用いたフローサイトメトリー、免疫染色等の手法によって、特定の神経網膜系細胞マーカー陽性細胞の数を全細胞数で除することにより確認することができる。核酸プライマーを用いた手法としては、神経網膜系細胞マーカーのＲＮＡの発現を、例えば、ＰＣＲ法、半定量ＰＣＲ法、定量ＰＣＲ法（例：リアルタイムＰＣＲ法）で確認することができる。シーケンス反応を用いた手法としては、神経網膜系細胞マーカーのＲＮＡの発現を、例えば、核酸シーケンサ（例：次世代シーケンサ）を用いて確認することができる。

　神経網膜系細胞マーカーとしては、網膜前駆細胞で発現するＲｘ（Ｒａｘとも言う）及びＰＡＸ６、神経網膜前駆細胞で発現するＲｘ、ＰＡＸ６及びＣｈｘ１０（Ｖｓｘ２とも言う）、視細胞前駆細胞で発現するＣｒｘ及びＢｌｉｍｐ１等が挙げられる。また、双極細胞で強発現するＣｈｘ１０、双極細胞で発現するＰＫＣα、Ｇｏα、ＶＳＸ１及びＬ７、網膜神経節細胞で発現するＴｕＪ１及びＢｒｎ３、アマクリン細胞で発現するＣａｌｒｅｔｉｎｉｎ及びＨＰＣ－１、水平細胞で発現するＣａｌｂｉｎｄｉｎ、視細胞及び視細胞前駆細胞で発現するＲｅｃｏｖｅｒｉｎ、桿体細胞で発現するＲｈｏｄｏｐｓｉｎ、桿体視細胞及び桿体視細胞前駆細胞で発現するＮｒｌ、錐体視細胞で発現するＳ－ｏｐｓｉｎ及びＬＭ－ｏｐｓｉｎ、錐体細胞、錐体視細胞前駆細胞及び神経節細胞で発現するＲＸＲ－γ、錐体視細胞のうち、分化初期に出現する錐体視細胞又はその前駆細胞で発現するＴＲβ２、ＯＴＸ２及びＯＣ２、水平細胞、アマクリン細胞及び神経節細胞で共通して発現するＰａｘ６等が挙げられる。

　「陽性細胞」とは、特定のマーカーを細胞表面上又は細胞内に発現している細胞を意味する。例えば、「Ｃｈｘ１０陽性細胞」とは、Ｃｈｘ１０タンパク質を発現している細胞を意味する。

　「網膜色素上皮細胞」とは、生体網膜において神経網膜の外側に存在する上皮細胞を意味する。細胞が網膜色素上皮細胞であるか否かは、当業者であれば、例えば細胞マーカー（ＭＩＴＦ、Ｐａｘ６、ＰＭＥＬ１７、ＴＹＲＰ１、ＴＲＰＭ１、ＡＬＤＨ１Ａ３、ＧＰＮＭＢ、ＲＰＥ６５、ＣＲＡＬＢＰ、ＭＥＲＴＫ、ＢＥＳＴ１、ＴＴＲ等）の発現や、メラニン顆粒の存在（黒褐色）、細胞間のタイトジャンクション、多角形・敷石状の特徴的な細胞形態等により容易に確認できる。細胞が網膜色素上皮細胞の機能を有するか否かは、ＶＥＧＦ及びＰＥＤＦ等のサイトカインの分泌能や視細胞外節の貪食能等により容易に確認できる。一態様において、網膜色素上皮細胞はＲＰＥ６５陽性細胞、ＭＩＴＦ陽性細胞、又は、ＲＰＥ６５陽性かつＭＩＴＦ陽性細胞である。

　「網膜層」とは、網膜を構成する各層を意味し、具体的には、網膜色素上皮層、視細胞層、外境界膜、外顆粒層、外網状層、内顆粒層、内網状層、神経節細胞層、神経線維層及び内境界膜を挙げることができる。

　「神経網膜層」とは、神経網膜を構成する各層を意味し、具体的には、視細胞層、外境界膜、外顆粒層、外網状層、内顆粒層、内網状層、神経節細胞層、神経線維層及び内境界膜を挙げることができる。「視細胞層」とは、神経網膜の最も外側に形成され、視細胞（桿体視細胞、錐体視細胞）、視細胞前駆細胞及び網膜前駆細胞を多く含む網膜層を意味する。視細胞層以外の各層を内層という。それぞれの細胞がいずれかの網膜層を構成する細胞であるかは、公知の方法、例えば細胞マーカーの発現の有無又は発現の程度等によって確認できる。

　視細胞又は視細胞前駆細胞の出現割合が少ない段階の網膜組織の場合、増殖する神経網膜前駆細胞を含む層を「ニューロブラスティックレイヤー（neuroblastic layer）」といい、inner neuroblastic layerとouter neuroblastic layerが存在する。当業者であれば周知の方法、例えば明視野顕微鏡の下では、色の濃淡（outer neuroblastic layerが薄く、inner neuroblastic layerが濃い）により判断することができる。

　「毛様体」は、発生過程及び成体の「毛様体」、「毛様体周縁部」、「Ｃｉｌｉａｒｙ　ｂｏｄｙ」を含む。「毛様体」のマーカーとしては、Ｚｉｃ１、ＭＡＬ、ＨＮＦ１ｂｅｔａ、ＦｏｘＱ１、ＣＬＤＮ２、ＣＬＤＮ１、ＧＰＲ１７７、ＡＱＰ１及びＡＱＰ４があげられる。「毛様体周縁部（ｃｉｌｉａｒｙｍａｒｇｉｎａｌｚｏｎｅ；ＣＭＺ）」としては、例えば、生体網膜において神経網膜と網膜色素上皮との境界領域に存在する組織であり、且つ、網膜の組織幹細胞（網膜幹細胞）を含む領域を挙げることができる。毛様体周縁部は、毛様体縁（ｃｉｌｉａｒｙｍａｒｇｉｎ）又は網膜縁（ｒｅｔｉｎａｌｍａｒｇｉｎ）とも呼ばれ、毛様体周縁部、毛様体縁及び網膜縁は同等の組織である。毛様体周縁部は、網膜組織への網膜前駆細胞、分化細胞の供給、網膜組織構造の維持等に重要な役割を果たしていることが知られている。毛様体周縁部のマーカー遺伝子としては、例えば、Ｒｄｈ１０遺伝子（陽性）、Ｏｔｘ１遺伝子（陽性）及びＺｉｃ１（陽性）を挙げることができる。「毛様体周縁部様構造体」とは、毛様体周縁部と類似した構造体のことである。

　「細胞凝集体」（Ｃｅｌｌ　Ａｇｇｒｅｇａｔｅ）とは、複数の細胞同士が接着して立体構造を形成しているものであれば特に限定はなく、例えば、培地等の媒体中に分散していた細胞が集合して形成する塊、又は細胞分裂を経て形成される細胞の塊等をいう。細胞凝集体には、特定の組織を形成している場合も含まれる。

　「スフェア（ｓｐｈｅｒｅ）状細胞凝集体」は、球状に近い立体的な形を有する細胞凝集体を意味する。球状に近い立体的な形とは、三次元構造を有する形であって、二次元面に投影したときに、例えば、円形又は楕円形を示す球状形、及び球状形が複数重なり合って形成される形状（例えば二次元に投影した場合に２～４個の円形若しくは楕円形が重なりあって形成する形を示し、「クローバー型」ともいう）が挙げられる。一態様において、凝集体のコア部は、小胞性層状構造を有し、明視野顕微鏡の下では、中央部が暗く外縁部分が明るく観察されるという特徴を有する。

　「上皮組織」とは、体表面、管腔（消化管など）、体腔（心膜腔など）などの表面を細胞が隙間なく覆うことで形成される組織である。上皮組織を形成している細胞を上皮細胞という。上皮細胞は、細胞が頂端（ａｐｉｃａｌ）－基底（ｂａｓａｌ）方向の極性を持つ。上皮細胞は、接着結合（ａｄｈｅｒｅｎｃｅ　ｊｕｎｃｔｉｏｎ）及び／又は密着結合（ｔｉｇｈｔ　ｊｕｎｃｔｉｏｎ）により上皮細胞同士で強固な結合をつくり、細胞の層を形成できる。この細胞層が、１ないし十数層重なってできた組織が上皮組織である。上皮組織を形成し得る組織には、胎児期及び／又は成体の網膜組織、脳脊髄組織、眼球組織、神経組織等も含まれる。本明細書における神経網膜も上皮組織である。「上皮構造」とは、頂端面又は基底膜などの、上皮組織が特徴的に有する構造を意味する。

　「連続上皮組織」とは、連続上皮構造を有する組織である。連続上皮構造とは、上皮組織が連続している状態のことである。上皮組織が連続しているとは、例えば、上皮組織に対する接線方向に１０細胞～１０^７細胞、好ましくは接線方向に３０細胞～１０^７細胞、さらに好ましくは１０^２細胞～１０^７細胞、並んでいる状態のことである。

　例えば、網膜組織において形成される連続上皮構造は、網膜組織が上皮組織に特有の頂端面を持ち、頂端面が神経網膜層を形成する各層のうち、少なくとも視細胞層（外顆粒層）等と概ね平行に、かつ連続的に網膜組織の表面に形成される。例えば、多能性幹細胞より作製した網膜組織を含む細胞凝集体の場合、凝集体の表面に頂端面が形成され、表面に対して接線方向に１０細胞以上、好ましくは３０細胞以上、より好ましくは１００細胞以上、さらに好ましくは４００細胞以上の視細胞又は視細胞前駆細胞が規則正しく連続して配列する。

　一態様において、上皮組織は極性化して「頂端面（ａｐｉｃａｌ　ｓｕｒｆａｃｅ）」と「基底膜」ができる。「基底膜」とは、上皮細胞が産生した基底（ｂａｓａｌ）側の層のことをいい、ラミニン及びＩＶ型コラーゲンを多く含み、５０～１００ｎｍの厚さを有する。「頂端面」は、「基底膜」と反対側に形成される表面（表層面）のことをいう。一態様において、「頂端面」は視細胞又は視細胞前駆細胞が認められる程度に発生段階が進行した網膜組織においては、外境界膜が形成され、視細胞、視細胞前駆細胞が存在する視細胞層（外顆粒層）に接する面のことをいう。また、このような頂端面は、頂端面のマーカー（例：ａｔｙｐｉｃａｌ－ＰＫＣ（以下、「ａＰＫＣ」と略す）、Ｅ－ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｎ－ｃａｄｈｅｒｉｎ）に対する抗体を用いて、当業者に周知の免疫染色法等で同定することができる。

〔網膜系細胞又は網膜組織の製造方法〕
　本発明の一態様は、網膜系細胞又は網膜組織の製造方法を提供する。該製造方法は、下記工程を含む：
（Ａ）多能性幹細胞を浮遊培養し、多能性幹細胞の細胞凝集体を形成させる工程、
（Ｂ）工程（Ａ）で得られた細胞凝集体を、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質及びＣＨＫ１シグナル伝達経路阻害物質の存在下に浮遊培養し、網膜系細胞を含む細胞凝集体を得る工程。

　本発明の製造方法は、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質とＣＨＫ１シグナル伝達経路阻害物質との組み合わせを用いて、多能性幹細胞を分化誘導して、網膜系細胞又は網膜組織を製造する方法である。多能性幹細胞から網膜系細胞又は網膜組織への分化誘導方法として、ＷＯ２０１１／０５５８５５、ＷＯ２０１３／０７７４２５、ＷＯ２０１５／０２５９６７、ＷＯ２０１６／０６３９８５、ＷＯ２０１６／０６３９８６、ＷＯ２０１７／１８３７３２、ＰＬｏＳ　Ｏｎｅ．　２０１０　Ｊａｎ　２０；５（１）：ｅ８７６３．、Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ．　２０１１　Ａｕｇ；２９（８）：１２０６－１８．、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ．　２０１４　Ｊｕｎ　１０；１１１（２３）：８５１８－２３、又はＮａｔ　Ｃｏｍｍｕｎ．　２０１４　Ｊｕｎ　１０；５：４０４７に開示されている方法が知られているが、ＣＨＫ１シグナル伝達経路阻害物質を用いる網膜系細胞又は網膜組織の製造方法はなかった。

　多能性幹細胞は上記に記載のとおりであり、好ましい多能性幹細胞として、人工多能性幹細胞又はＥＳ細胞、さらに好ましくはヒト人工多能性幹細胞又はヒトＥＳ細胞が挙げられる。人工多能性幹細胞の製造方法には特に限定はなく、当業者に周知の方法で製造することができるが、人工多能性幹細胞の作成工程（すなわち、体細胞を初期化し多能性幹細胞を樹立する工程）もフィーダーフリー条件下で行うことが望ましい。

＜工程（Ａ）＞
　工程（Ａ）は、多能性幹細胞を浮遊培養し、多能性幹細胞の細胞凝集体を形成させる工程である。工程（Ａ）に用いられる多能性幹細胞は、維持培養・拡大培養によって得ることができる。すなわち、工程（Ａ）は、（Ａ－１）多能性幹細胞を維持培養・拡大培養する工程と、（Ａ－２）工程（Ａ－１）で得られた多能性幹細胞を浮遊培養し、多能性幹細胞の細胞凝集体を形成させる工程とを含んでもよい。多能性幹細胞を得るための維持培養・拡大培養は、当業者に周知の方法で実施することができる。多能性幹細胞の維持培養・拡大培養は、接着培養でも浮遊培養でも実施することができるが、好ましくは接着培養で実施される。多能性幹細胞の維持培養・拡大培養は、フィーダー存在下で実施してもよいしフィーダーフリー条件下で実施してもよいが、好ましくはフィーダーフリー条件下で実施される。フィーダーフリー条件下では、後述する未分化維持因子を含む培地を用いることができる。

　なお、工程（Ａ－１）における培地は、さらにＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及び／又はソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含んでもよい。また、工程（Ａ－２）における培地は、後述するように、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質、及び／又はＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質を含んでいてもよい。本方法は、例えばＷＯ２０１５／０２５９６７、ＷＯ２０１６／０６３９８５、ＷＯ２０１７／１８３７３２にも開示されており、より詳細にはＷＯ２０１５／０２５９６７、ＷＯ２０１６／０６３９８５、ＷＯ２０１７／１８３７３２を参照することが可能である。

　細胞凝集体の調製に使用する培地は、特段の記載がない限り、細胞増殖用基礎培地（基礎培地とも呼ぶ）を使用することができる。細胞増殖用基礎培地は細胞の培養が可能な限り特に限定はなく、適宜細胞増殖用培地として市販されている基礎培地を用いることができる。具体的には、例えば、ＢＭＥ培地、ＢＧＪｂ培地、ＣＭＲＬ　１０６６培地、Ｇｌａｓｇｏｗ　ＭＥＭ（ＧＭＥＭ）培地、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ＭＥＭ　Ｚｉｎｃ　Ｏｐｔｉｏｎ培地、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ　１９９培地、ＭＥＭ培地、Ｅａｇｌｅ　ＭＥＭ培地、αＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、Ｆ－１２培地、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、ＩＭＤＭ／Ｆ１２培地、ハム培地、ＲＰＭＩ　１６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ’ｓ　Ｌ－１５培地又はこれらの混合培地など、動物細胞の培養に用いることのできる培地を挙げることができる。また、補助培地であるＮ２培地を添加した培地を用いてもよい。

　ＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路阻害物質とは、ＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路、すなわちＳｍａｄファミリーによって伝達される、シグナル伝達経路を阻害する物質を表し、具体的にはＴＧＦβシグナル伝達経路阻害物質（例：ＳＢ４３１５４２、ＬＹ－３６４９４７、ＳＢ５０５１２４、Ａ－８３－０１等）、Ｎｏｄａｌ／Ａｃｔｉｖｉｎシグナル伝達経路阻害物質（例：ＳＢ４３１５４２、Ａ－８３－０１等）及びＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質（例：ＬＤＮ１９３１８９、Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ等）を挙げることができる。これらの物質は市販されており入手可能である。

　ソニック・ヘッジホッグ（以下、「Ｓｈｈ」と記すことがある。）シグナル伝達経路作用物質とは、Ｓｈｈによって媒介されるシグナル伝達を増強し得る物質である。Ｓｈｈシグナル伝達経路作用物質としては、例えば、ＳＨＨ、ＳＨＨの部分ペプチド、ＰＭＡ（Ｐｕｒｍｏｒｐｈａｍｉｎｅ）、ＳＡＧ（Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ　Ａｇｏｎｉｓｔ）等が挙げられる。

　ＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及びソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質の濃度は、網膜系細胞への分化を誘導可能な濃度であればよい。例えば、ＳＢ４３１５４２は、通常０．１～２００μＭ、好ましくは２～５０μＭの濃度で使用される。Ａ－８３－０１は、通常０．０５～５０μＭ、好ましくは０．５～５μＭの濃度で使用される。ＬＤＮ１９３１８９は、通常１～２０００ｎＭ、好ましくは１０～３００ｎＭの濃度で使用される。ＳＡＧは、通常、１～２０００ｎＭ、好ましくは１０～７００ｎＭの濃度で使用される。ＰＭＡは、通常０．００２～２０μＭ、好ましくは０．０２～２μＭの濃度で使用される。

　未分化維持因子は、多能性幹細胞の分化を抑制する作用を有する物質であれば特に限定はない。当業者に汎用されている未分化維持因子としては、ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質、ＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路作用物質、ｉｎｓｕｌｉｎ等を挙げることができる。ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質として具体的には、線維芽細胞増殖因子（例えば、ｂＦＧＦ、ＦＧＦ４やＦＧＦ８、更に好ましくはｂＦＧＦ）が挙げられる。また、ＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路作用物質としては、ＴＧＦβシグナル伝達経路作用物質、Ｎｏｄａｌ／Ａｃｔｉｖｉｎシグナル伝達経路作用物質が挙げられる。ＴＧＦβシグナル伝達経路作用物質としては、例えばＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２が挙げられる。Ｎｏｄａｌ／Ａｃｔｉｖｉｎシグナル伝達経路作用物質としては、例えばＮｏｄａｌ、ＡｃｔｉｖｉｎＡ、ＡｃｔｉｖｉｎＢが挙げられる。ヒト多能性幹細胞（ヒトＥＳ細胞、ヒトｉＰＳ細胞）を培養する場合、工程（Ａ－１）における培地は、好ましくは未分化維持因子として、ｂＦＧＦを含む。

　工程（Ａ－１）において用いられる培地中の未分化維持因子濃度は、培養する多能性幹細胞の未分化状態を維持可能な濃度であり、当業者であれば、適宜設定することができる。例えば、具体的には、フィーダー細胞非存在下で未分化維持因子としてｂＦＧＦを用いる場合、その濃度は、通常４ｎｇ～５００ｎｇ／ｍＬ程度、好ましくは１０ｎｇ～２００ｎｇ／ｍＬ程度、より好ましくは３０ｎｇ～１５０ｎｇ／ｍＬ程度である。

　未分化維持因子を含み、多能性幹細胞を培養するために使用可能なフィーダーフリー培地として、多くの合成培地が開発・市販されており、例えばＥｓｓｅｎｔｉａｌ　８培地（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）が挙げられる。Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　８培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に、添加剤として、Ｌ－ａｓｃｏｒｂｉｃ　ａｃｉｄ－２－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｍａｇｎｅｓｉｕｍ（６４ｍｇ／Ｌ）、ｓｏｄｉｕｍ　ｓｅｌｅｎｉｕｍ（１４μｇ／Ｌ）、ｉｎｓｕｌｉｎ（１９．４ｍｇ／Ｌ）、ＮａＨＣＯ３（５４３ｍｇ／Ｌ）、ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ（１０．７ｍｇ／Ｌ）、ｂＦＧＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）、及び、ＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路作用物質（ＴＧＦβ１（２ｎｇ／ｍＬ）又はＮｏｄａｌ（１００ｎｇ／ｍＬ））を含む（Ｎａｔｕｒｅ　Ｍｅｔｈｏｄｓ、８、４２４－４２９（２０１１））。その他市販のフィーダーフリー培地としては、Ｓ－ｍｅｄｉｕｍ（ＤＳファーマバイオメディカル社製）、ＳｔｅｍＰｒｏ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ｈＥＳＦ９（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ．　２００８　Ｓｅｐ　９；１０５（３６）：１３４０９－１４）、ｍＴｅＳＲ１（ＳＴＥＭＣＥＬＬ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ｍＴｅＳＲ２（ＳＴＥＭＣＥＬＬ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ＴｅＳＲ－Ｅ８（ＳＴＥＭＣＥＬＬ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、又はＳｔｅｍＦｉｔ（味の素社製）が挙げられる。上記工程（Ａ－１）ではこれらを用いることにより、簡便に本発明を実施することが出来る。これら培地を使用することで、フィーダーフリー条件での多能性幹細胞の培養をおこなうことが可能である。工程（Ａ－１）で使用する培地は、一例として、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質及びＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質のいずれも添加されていない無血清培地である。

　工程（Ａ－１）におけるフィーダーフリー条件での多能性幹細胞の培養においては、フィーダー細胞に代わる足場を多能性幹細胞に提供するため、適切なマトリクスを足場として用いてもよい。足場として用いることのできるマトリクスとしては、ラミニン（Ｎａｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　２８，６１１－６１５，（２０１０））、ラミニン断片（Ｎａｔ　Ｃｏｍｍｕｎ　３，１２３６，（２０１２））、基底膜標品（Ｎａｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　１９，９７１－９７４，（２００１））、ゼラチン、コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、エンタクチン、ビトロネクチン（Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ）等が挙げられる。

　工程（Ａ－１）における多能性幹細胞の培養時間は、ＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及び／又はソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質（例：１００ｎＭ～７００ｎＭ）の存在下で培養する場合、工程（Ａ－２）において形成される細胞凝集体の質を向上させる効果が達成可能な範囲で特に限定されないが、通常０．５～１４４時間である。一態様において、好ましくは２～９６時間、より好ましくは６～４８時間、さらに好ましくは１２～４８時間、よりさらに好ましくは１８～２８時間（例、２４時間）である。

　ＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及び／又はソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質（例：１００ｎＭ～７００ｎＭ）の存在下で培養する場合、工程（Ａ－１）により得られる細胞は多能性様性質（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ－ｌｉｋｅ　ｓｔａｔｅ）が維持された細胞であり、工程（Ａ－１）を通じて多能性様性質が維持される。多能性様性質とは、多能性を含む、多能性幹細胞に共通する多能性幹細胞に特有の形質の少なくとも一部を維持している状態を意味する。多能性様性質には厳密な多能性は要求されない。具体的には、多能性性質（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔａｔｅ）の指標となるマーカーの全て又は一部を発現している状態が、「多能性様性質」に含まれる。多能性様性質のマーカーとしては、Ｏｃｔ３／４陽性、アルカリホスファターゼ陽性などが挙げられる。一態様において、多能性様性質が維持された細胞は、Ｏｃｔ３／４陽性である。Ｎａｎｏｇの発現量がＥＳ細胞もしくはｉＰＳ細胞に比べて低い場合であっても「多能性様性質を示す細胞」に該当する。一態様として、工程（Ａ－１）により得られる細胞は、Ｏｃｔ３／４陽性の幹細胞を６０％以上、例えば９０％以上含む。

　工程（Ａ－２）において、工程（Ａ－１）で得られた多能性幹細胞を浮遊培養し、多能性幹細胞の細胞凝集体を形成させる。ここでいう「多能性幹細胞の細胞凝集体」とは、必ずしも全ての細胞が多能性幹細胞であることを要せず、一定の割合（例：５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上）で多能性幹細胞が含まれる場合も含む。一例として、工程（Ａ－１）をＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及び／又はソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質（例：１００ｎＭ～７００ｎＭ）の存在下で培養する場合、工程（Ａ－２）において、上述した「多能性様性質を示す細胞」（例：Ｏｃｔ３／４陽性の幹細胞を６０％以上、例えば９０％以上含む）の細胞凝集体が形成されるが、これも「多能性幹細胞の細胞凝集体」に包含される。

　浮遊培養とは、細胞を培養容器へ非接着の状態で培養することであり、特に限定はされないが、細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理（例えば、細胞外マトリックス等によるコーティング処理）されていない培養容器、若しくは、人工的に接着を抑制する処理（例えば、ポリヒドロキシエチルメタクリル酸（ｐｏｌｙ－ＨＥＭＡ）、非イオン性の界面活性ポリオール（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ－１２７等）又はリン脂質類似構造物（例えば、２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンを構成単位とする水溶性ポリマー（Ｌｉｐｉｄｕｒｅ））によるコーティング処理した培養容器を使用して行うことができる。

　浮遊培養は、例えば、ＳＦＥＢ（Ｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ　Ｆｌｏａｔｉｎｇｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　Ｅｍｂｒｙｏｉｄ　Ｂｏｄｉｅｓ－ｌｉｋｅ　ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ）法（ＷＯ２００５／１２３９０）やＳＦＥＢｑ法（ＷＯ２００９／１４８１７０）を用いることにより行うことができる。

　工程（Ａ－２）において用いられる培地は血清含有培地又は無血清培地であり得る。化学的に未決定な成分の混入を回避する観点から、無血清培地が好適に用いられる。調製の煩雑さを回避するには、例えば、市販のＫＳＲ等の血清代替物を適量添加した無血清培地が挙げられる。無血清培地へのＫＳＲの添加量としては、通常約１％から約３０％であり、好ましくは約２％から約２０％である。

　凝集体の形成に際しては、まず、工程（Ａ－１）で得られた細胞の分散操作により、分散された細胞を調製する。分散操作により得られた「分散された細胞」とは、例えば７割（好ましくは８割以上）以上が単一細胞であり２～５０細胞の塊が３割以下（好ましくは２割以下）存在する状態が挙げられる。分散された細胞とは、細胞同士の接着（例えば面接着）がほとんどなくなった状態が挙げられる。

　分散された細胞の懸濁液を培養器中に播き、分散させた細胞を、培養器に対して、非接着性の条件下で培養することにより、複数の細胞を集合させて凝集体を形成する。一態様として、９６ウェルプレートのようなマルチウェルプレート（Ｕ底、Ｖ底）の各ウェルに一定数の分散された幹細胞を入れて、これを静置培養すると、細胞が迅速に凝集することにより、各ウェルにおいて１個の凝集体が形成される（ＳＦＥＢｑ法）。９６ウェルプレートを用いて細胞を浮遊培養する場合、１ウェルあたり約１×１０^３から約１×１０^５細胞（好ましくは約３×１０^３から約５×１０^４細胞、約４×１０^３から約２×１０^４細胞）となるように調製した液をウェルに添加し、プレートを静置して凝集体を形成させる。

　一態様において、工程（Ａ－２）において用いられる培地は、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含む。すなわち、具体的な一態様として、工程（Ａ）は下記の工程（Ａ１）及び工程（Ａ２）を含む：
（Ａ１）多能性幹細胞を、フィーダー細胞非存在下で、かつ任意でＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及び／又はソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含んでもよい、未分化維持因子を含む培地で培養する工程、
（Ａ２）工程（Ａ１）で得られた細胞を、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含む培地中で浮遊培養し、細胞凝集体を形成させる工程。

　工程（Ａ－２）におけるソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質としては、上述したものを上述の濃度（例：１０ｎＭ～３００ｎＭ）で用いることができる。ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質は、好ましくは、浮遊培養開始時から培地に含まれる。培地には、ＲＯＣＫ阻害剤（例、Ｙ－２７６３２）を添加してもよい。培養時間は例えば、１２時間～６日間である。工程（Ａ－２）において用いられる培地は、一例において、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質、ＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及びＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路作用物質からなる群から選択される１以上（好ましくは全部）を添加されていない培地である。

＜工程（Ｂ）＞
　工程（Ｂ）は、工程（Ａ）で得られた細胞凝集体を、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質及びＣＨＫ１シグナル伝達経路阻害物質の存在下に浮遊培養し、網膜系細胞を含む細胞凝集体を得る工程である。

　工程（Ｂ）において用いられる培地は、例えば、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質及びＣＨＫ１シグナル伝達経路阻害物質が添加された無血清培地又は血清培地（好ましくは、無血清培地）が挙げられる。無血清培地、血清培地は上述の通り準備することができる。工程（Ｂ）において用いられる培地は、一例において、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質、ＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及びＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路作用物質からなる群から選択される１以上（好ましくは全部）を添加されていない培地である。また、工程（Ｂ）において用いられる培地は、一例において、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を添加されていない培地である。また、工程（Ｂ）において用いられる培地は、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質が添加されていてもよい培地である。

　ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質とは、ＢＭＰによって媒介されるシグナル伝達経路を増強し得る物質である。ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質としては、例えばＢＭＰ２、ＢＭＰ４若しくはＢＭＰ７等のＢＭＰタンパク質、ＧＤＦ７等のＧＤＦタンパク質、抗ＢＭＰ受容体抗体、又は、ＢＭＰ部分ペプチド等が挙げられる。ＢＭＰ２タンパク質、ＢＭＰ４タンパク質及びＢＭＰ７タンパク質は例えばＲ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社から、ＧＤＦ７タンパク質は例えば和光純薬から入手可能である。ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質は、好ましくは、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ７及びＧＤＦ７からなる群から選択される１以上のタンパク質である。

　培地におけるＢＭＰシグナル伝達経路作用物質の通常の濃度は、網膜系細胞への分化を誘導可能な濃度であればよい。例えばヒトＢＭＰ４タンパク質の場合、ＣＨＫ１シグナル伝達経路阻害物質と併用しないときは、網膜系細胞への分化を誘導可能な通常の濃度として、約０．１ｎＭ以上（０．１５ｎＭ超）、好ましくは約０．５ｎＭ以上、より好ましくは約１ｎＭ以上、さらに好ましくは約１．５ｎＭ（５５ｎｇ／ｍＬ）、又は、約１μＭ以下、好ましくは約１００ｎＭ以下、より好ましくは約１０ｎＭ以下、さらに好ましくは約５ｎＭ以下の濃度が挙げられる。他のＢＭＰシグナル伝達経路作用物質の通常の濃度は、上記濃度におけるヒトＢＭＰ４タンパク質と同程度のＢＭＰシグナル伝達経路の活性化作用を有する濃度であればよい。当該濃度は、当業者であれば容易に設定することができる。具体的には、マウス軟骨前駆細胞であるＡＴＤＣ－５細胞におけるアルカリホスファターゼ産生誘導能を測定することで、ＢＭＰ活性の測定が可能である。

　本発明の一態様として、ＣＨＫ１シグナル伝達経路阻害物質と併用する場合におけるヒトＢＭＰ４タンパク質の濃度は、真球に近い細胞凝集体が形成され、かつ、網膜色素上皮細胞への分化誘導が抑制されるような濃度である。具体的には、培地におけるヒトＢＭＰ４タンパク質の濃度は、上記の通常の濃度の約１０分の１程度の低濃度であってもよく、すなわち、約０．００１ｎＭ、好ましくは約０．０１ｎＭ、より好ましくは約０．１ｎＭ、さらに好ましくは約０．１５ｎＭ（５．５ｎｇ／ｍＬ）、又は、約０．１μＭ以下、好ましくは約１０ｎＭ以下、より好ましくは約１ｎＭ以下（１．５ｎＭ未満）、さらに好ましくは約０．５ｎＭ以下であってもよい。この場合、より良好な形状を有する（真球に近い）細胞凝集体を得ることができる。また、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞等への目的外細胞への分化誘導が抑制され、目的外細胞が少ない細胞凝集体を得ることができるまた、当該細胞凝集体は、毛様体周縁部様構造体を含む神経網膜を製造する（後述する製造方法の工程（Ｃ）及び（Ｄ）に相当）ための中間体として非常に良好である。

　本発明の一態様として、ＣＨＫ１シグナル伝達経路阻害物質と併用する場合におけるヒトＢＭＰ４の濃度は、網膜色素上皮細胞を含む外側構造と、神経網膜を含む内側構造との複層構造を備えるスフェア状細胞凝集体が形成されるような濃度である。具体的には、培地におけるヒトＢＭＰ４タンパク質の濃度は、例えば、約０．０１ｎＭ以上、好ましくは約０．１ｎＭ以上、より好ましくは約０．５ｎＭ以上、さらに好ましくは約１ｎＭ以上、最も好ましくは約１．５ｎＭ（５５ｎｇ／ｍＬ）、又は、約１μＭ以下、好ましくは約１００ｎＭ以下、より好ましくは約１０ｎＭ以下、さらに好ましくは約５ｎＭ以下であってもよい。他のＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を用いる場合、上述した濃度のヒトＢＭＰ４タンパク質と同程度のＢＭＰシグナル伝達経路活性化作用を有する濃度であればよい。

　ＣＨＫ１シグナル伝達経路阻害物質とは、ＣＨＫ１（ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ　ｋｉｎａｓｅ　１）によって媒介されるシグナル伝達経路を阻害する物質である。一態様として、ＣＨＫ１によって媒介されるシグナル伝達経路とは、ＣＨＫ１－ｐ２１－ＣＤＫ９（Ｃｙｃｌｉｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｋｉｎａｓｅ９）を介するシグナル伝達経路である。具体的には、ＣＨＫ１がｐ２１を活性化させ、活性化したｐ２１によりＣＤＫ９を阻害することにより、ＳＭＡＤ２／３のリン酸化が阻害され、ＳＭＡＤ２／３の分解が抑制される、という一連のシグナル伝達経路である。従って、ＣＨＫ１シグナル伝達経路阻害物質として、ＣＨＫ１阻害物質、ｐ２１阻害物質又はＣＤＫ９活性化物質が挙げられる。

　ＣＨＫ１シグナル伝達経路阻害物質の一態様として、ＣＨＫ１に結合し、ＣＨＫ１の活性を阻害するＣＨＫ１阻害物質が挙げられる。具体的なＣＨＫ１阻害物質として、ＰＤ４０７８２４（ＣＡＳ６２２８６４－５４－４）、ＣＨＩＲ－１２４（ＣＡＳ４０５１６８－５８－３）、Ｄｅｂｒｏｍｏｈｙｍｅｎｉａｌｄｉｓｉｎｅ（ＣＡＳ７５５９３－１７－８）、ＳＢ　２１８０７８（ＣＡＳ１３５８９７－０６－２）、Ｃｈｋ２　抑制剤（ＣＡＳ７２４７０８－２１－８）ＬＹ２６０３６１８（ＣＡＳ９１１２２２－４５－２）、ＳＣＨ　９００７７６（ＣＡＳ８９１４９４－６３－６）、ＴＣＳ　２３１２（ＣＡＳ８３８８２３－３２－８）、ＰＦ　４７７７３６（ＣＡＳ９５２０２１－６０－２）、ＵＣＮ－０１（ＣＡＳ１１２９５３－１１－４）、ＡＺＤ７７６２（ＣＡＳ８６０３５２－０１－８）、ＸＬ８４４（ＣＡＳ：ＮＯＮＥ）、ＣＢＰ５０１（ＣＡＳ５６５４３４－８５－７）、抗ＣＨＫ１抗体等が挙げられるが、これらに限定されない。ＣＨＫ１のｍＲＮＡを分解するＣＨＫ１に対するｓｉＲＮＡも、ＣＨＫ１阻害物質に含まれる。好ましくは、下記に示す構造を有するＰＤ４０７８２４（ＣＡＳ６２２８６４－５４－４）である。

　ＣＨＫ１シグナル伝達経路阻害物質の一態様として、ｐ２１に結合し、ｐ２１の活性を阻害するｐ２１阻害物質が挙げられる。具体的なｐ２１阻害物質として、抗ｐ２１抗体、ｐ２１に対するｓｉＲＮＡが挙げられる。ＣＨＫ１シグナル伝達経路阻害物質の一態様として、ＣＤＫ９に結合し、ＣＤＫ９の活性を亢進させるＣＤＫ９活性化物質が挙げられる。

　ＣＨＫ１シグナル伝達経路阻害物質の濃度は、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質の分化誘導作用を増強できる濃度であってよく、例えばＰＤ４０７８２４の場合は、約０．１μＭ～約１０μＭ、約０．３μＭ～約１０μＭ、約０．５μＭ～約１０μＭ、約０．５μＭ～約５μＭ、又は約１μＭ～約５μＭの濃度とすることができる。その他のＣＨＫ１シグナル伝達経路阻害物質の濃度としては、約０．１μＭ～約１０μＭ、約０．３μＭ～約１０μＭ、約０．５μＭ～約１０μＭ、約０．５μＭ～約５μＭ、又は約１μＭ～約５μＭのＰＤ４０７８２４と同程度のＣＨＫ１シグナル伝達経路阻害作用（例：ＣＨＫ１阻害作用）を奏する濃度であってよい。なお、ＣＨＫ１阻害作用は、当業者が適宜公知手法又は市販の試薬若しくはキット（例：プロメガ株式会社、カタログ番号：Ｖ１９４１）等を用いて検討することができる。具体的には、ヒトＣＤＣ２５Ｃ由来のペプチド（ＫＫＫＶＳＲＳＧＬＹＲＳＰＳＭＰＥＮＬＮＲＰＲ（配列番号１））、ＣＨＫ１及び評価対象物質を、ＡＴＰを含む反応容器中で混合し、当該ペプチドのリン酸化の程度を検出すればよい。ＣＨＫ１シグナル伝達経路の阻害作用として、当該経路の下流に存在するＳＭＡＤ２／３のリン酸化の程度を、市販の抗リン酸化ＳＭＡＤ２／３抗体などを用いて検出してもよい。

　ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質は、工程（Ａ）の浮遊培養開始から約２４時間後以降に添加されていればよく、浮遊培養開始後数日以内（例えば、１５日以内）に培地に添加してもよい。好ましくは、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質は、工程（Ａ）の浮遊培養開始後１日目～１５日目までの間、より好ましくは１日目～９日目までの間又は２日目～９日目の間、最も好ましくは３日目に培地に添加する。

　ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質が培地に添加され、凝集体を形成する細胞の網膜細胞への分化誘導が開始された後は、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を培地に添加する必要は無く、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を含まない無血清培地又は血清培地を用いて培地交換を行ってよい。一態様において、網膜細胞への分化誘導が開始された後、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を含まない無血清培地又は血清培地による培地交換により、培地中のＢＭＰシグナル伝達経路作用物質濃度を、２～４日につき、４０～６０％減の割合で、徐々に又は段階的に低下させる。網膜細胞への分化誘導が開始された細胞は、例えば、当該細胞における網膜前駆細胞マーカー遺伝子（例、Ｒｘ遺伝子（別名Ｒａｘ）、Ｐａｘ６遺伝子、Ｃｈｘ１０遺伝子）の発現を検出することにより確認することができる。ＧＦＰ等の蛍光レポータータンパク質遺伝子がＲｘ遺伝子座へノックインされた多能性幹細胞を用いて工程（２）により形成された凝集体を、網膜細胞への分化誘導に必要な濃度のＢＭＰシグナル伝達経路作用物質の存在下に浮遊培養し、発現した蛍光レポータータンパク質から発せられる蛍光を検出することにより、網膜細胞への分化誘導が開始された時期を確認することもできる。工程（３）の実施態様の一つとして、工程（２）で形成された凝集体を、網膜前駆細胞マーカー遺伝子（例、Ｒｘ遺伝子、Ｐａｘ６遺伝子、Ｃｈｘ１０遺伝子）を発現する細胞が出現し始めるまでの間、網膜細胞への分化誘導に必要な濃度のＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を含む無血清培地又は血清培地中で浮遊培養し、網膜前駆細胞を含む凝集体を得る工程、を挙げることができる。

　具体的な態様として、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質は例えば、工程（Ｂ）の浮遊培養開始後１～９日目の間、好ましくは２～９日目の間に培地に添加される。例えばＢＭＰシグナル伝達経路作用物質がＢＭＰ４である場合、工程（Ｂ）の浮遊培養開始後２～９日目の間、培地の一部又は全部をＢＭＰ４を含む培地に交換し、ＢＭＰ４の終濃度を約１～１０ｎＭに調製し、ＢＭＰ４の存在下で例えば１～１２日、好ましくは２～９日、さらに好ましくは２～５日間培養することができる。ここにおいて、ＢＭＰ４の濃度を、同一濃度を維持すべく、１回若しくは２回程度培地の一部又は全部をＢＭＰ４を含む培地に交換することができる。又はＢＭＰ４の濃度を段階的に減じることもできる。例えば、工程（Ｂ）の浮遊培養開始後２～１０日目までＢＭＰシグナル伝達経路作用物質（ＢＭＰ４）の濃度を維持した後、工程（Ｂ）の浮遊培養開始後６～２０日目まで段階的にＢＭＰシグナル伝達経路作用物質（ＢＭＰ４）の濃度を減じてもよい。

　ＣＨＫ１シグナル伝達経路阻害物質は、工程（Ｂ）において、一定期間培地中においてＢＭＰシグナル伝達経路作用物質と共存すればよく、好ましくは、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質と同時に培地に添加され、好ましくは、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質の添加期間と同じ期間においてＢＭＰシグナル伝達経路作用物質と共存する。

　上記工程（Ａ）～工程（Ｂ）における培養温度、ＣＯ_２濃度等の培養条件は適宜設定できる。培養温度は、例えば約３０℃～約４０℃、好ましくは約３７℃である。またＣＯ_２濃度は、例えば約１％～約１０％、好ましくは約５％である。

　上記工程（Ｂ）における培養期間を変動させることによって、細胞凝集体に含まれる網膜系細胞として、様々な分化段階の網膜系細胞を製造することができる。すなわち、未成熟な網膜系細胞（例：網膜前駆細胞、視細胞前駆細胞）と成熟した網膜系細胞（例：視細胞）とを様々な割合で含む、細胞凝集体中の網膜系細胞を製造することができる。工程（Ｂ）の培養期間を延ばすことによって、成熟した網膜系細胞の割合を増やすことができる。

　工程（Ａ）及び／又は工程（Ｂ）において、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質をさらに培地に添加してもよい。

　工程（Ａ）及び／又は工程（Ｂ）に用いる、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質としては、Ｗｎｔにより媒介されるシグナル伝達を抑制し得るものである限り特に限定されず、タンパク質、核酸、低分子化合物等のいずれであってもよい。Ｗｎｔにより媒介されるシグナルは、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ（Ｆｚ）及びＬＲＰ５／６（ｌｏｗ－ｄｅｎｓｉｔｙ　ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｒｅｌａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　５／６）のヘテロ二量体として存在するＷｎｔ受容体を介して伝達される。Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質としては、例えば、Ｗｎｔ又はＷｎｔ受容体に直接作用する物質（抗Ｗｎｔ中和抗体、抗Ｗｎｔ受容体中和抗体等）、Ｗｎｔ又はＷｎｔ受容体をコードする遺伝子の発現を抑制する物質（例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ等）、Ｗｎｔ受容体とＷｎｔの結合を阻害する物質（可溶型Ｗｎｔ受容体、ドミナントネガティブＷｎｔ受容体等、Ｗｎｔアンタゴニスト、Ｄｋｋ１、Ｃｅｒｂｅｒｕｓタンパク質等）、Ｗｎｔ受容体によるシグナル伝達に起因する生理活性を阻害する物質［ＣＫＩ－７（Ｎ－（２－アミノエチル）－５－クロロイソキノリン－８－スルホンアミド）、Ｄ４４７６（４－［４－（２，３－ジヒドロ－１，４－ベンゾジオキシン－６－イル）－５－（２－ピリジニル）－１Ｈ－イミダゾール－２－イル］ベンズアミド）、ＩＷＲ－１－ｅｎｄｏ（ＩＷＲ１ｅ）（４－［（３ａＲ，４Ｓ，７Ｒ，７ａＳ）－１，３，３ａ，４，７，７ａ－ヘキサヒドロ－１，３－ジオキソ－４，７－メタノ－２Ｈ－イソインドール－２－イル］－Ｎ－８－キノリニル－ベンズアミド）、並びに、ＩＷＰ－２（Ｎ－（６－メチル－２－ベンゾチアゾリル）－２－［（３，４，６，７－テトラヒドロ－４－オキソ－３－フェニルチエノ［３，２－ｄ］ピリミジン－２－イル）チオ］アセタミド）等の低分子化合物等］等が挙げられるが、これらに限定されない。Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質として、これらを一種又は二種以上含んでいてもよい。ＣＫＩ－７、Ｄ４４７６、ＩＷＲ－１－ｅｎｄｏ（ＩＷＲ１ｅ）、ＩＷＰ－２等は公知のＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質であり、市販品等を適宜入手可能である。Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質として好ましくはＩＷＲ１ｅが用いられる。

　工程（Ａ）におけるＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質の濃度は、良好な細胞凝集体の形成を誘導可能な濃度であればよい。例えばＩＷＲ－１－ｅｎｄｏの場合は、約０．１μＭから約１００μＭ、好ましくは約０．３μＭから約３０μＭ、より好ましくは約１μＭから約１０μＭ、さらに好ましくは約３μＭの濃度となるように培地に添加する。ＩＷＲ－１－ｅｎｄｏ以外のＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質を用いる場合には、上記ＩＷＲ－１－ｅｎｄｏの濃度と同等のＷｎｔシグナル伝達経路阻害活性を示す濃度で用いられることが望ましい。

　工程（Ａ）において、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質を培地に添加するタイミングは、早い方が好ましい。Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質は、工程（Ａ）における浮遊培養開始から、通常６日以内、好ましくは３日以内、より好ましくは１日以内、より好ましくは１２時間以内、さらに好ましくは工程（Ａ）における浮遊培養開始時に、培地に添加される。具体的には、例えば、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質を添加した基礎培地の添加や、該基礎培地への一部若しくは全部の培地交換を行うことができる。工程（Ａ）において、維持培養・拡大培養によって得られた細胞を、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質に作用させる期間は特に限定されないが、好ましくは、工程（Ａ）における浮遊培養開始時に培地へ添加した後、工程（Ａ）終了時（ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質添加直前）まで作用させる。さらに好ましくは、後述する通り、工程（Ａ）終了後（すなわち工程（Ｂ）の期間中）も、継続してＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質に曝露させる。一態様としては、後述する通り、工程（Ａ）終了後（すなわち工程（Ｂ）の期間中）も、継続してＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質に作用させ、網膜組織が形成されるまで作用させてもよい。

　工程（Ｂ）において、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質としては、前述のＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質のいずれかを用いることができるが、好ましくは、工程（Ａ）で用いたＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質と同一の種類のものを工程（Ｂ）において使用する。

　工程（Ｂ）におけるＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質の濃度は、網膜前駆細胞及び網膜組織を誘導可能な濃度であればよい。例えばＩＷＲ－１－ｅｎｄｏの場合は、約０．１μＭから約１００μＭ、好ましくは約０．３μＭから約３０μＭ、より好ましくは約１μＭから約１０μＭ、さらに好ましくは約３μＭの濃度となるように培地に添加する。ＩＷＲ－１－ｅｎｄｏ以外のＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質を用いる場合には、上記ＩＷＲ－１－ｅｎｄｏの濃度と同等のＷｎｔシグナル伝達経路阻害活性を示す濃度で用いられることが望ましい。工程（Ｂ）の培地中のＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質の濃度は、工程（Ａ）の培地中のＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質の濃度を１００としたとき、好ましくは５０～１５０、より好ましくは８０～１２０、さらに好ましくは９０～１１０であり、工程（Ｂ）の培地中のＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質の濃度と同等であることが、より好ましい。

　Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質の培地への添加時期は、網膜系細胞若しくは網膜組織を含む細胞凝集体形成を達成できる範囲で特に限定されないが、早ければ早い方が好ましい。好ましくは、工程（Ｂ）開始時にＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質が培地に添加される。より好ましくは、工程（Ａ）においてＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質が添加された後、工程（Ｂ）においても継続して（即ち、工程（Ａ）の開始時から）培地中に含まれる。さらに好ましくは、工程（Ａ）の浮遊培養開始時にＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質が添加された後、工程（Ｂ）においても継続して培地中に含まれる。例えば、工程（Ａ）で得られた培養物（Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質を含む培地中の凝集体の懸濁液）にＢＭＰシグナル伝達経路作用物質（例、ＢＭＰ４）を添加すればよい。

　Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質に作用させる期間は、特に限定されないが、好ましくは、工程（Ａ）における浮遊培養開始時にＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質が添加される場合において、工程（Ａ）における浮遊培養開始時を起算点として、２日間から３０日間、より好ましくは６日間から２０日間、８日間から１８日間、１０日間から１８日間、又は１０日間から１７日間（例えば、１０日間）である。別の態様において、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質に作用させる期間は、工程（Ａ）における浮遊培養開始時にＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質が添加される場合において、工程（Ａ）における浮遊培養開始時を起算点として、好ましくは３日間から１５日間（例えば、５日間、６日間、７日間）であり、より好ましくは６日間から１０日間（例えば、６日間）である。

　上述した方法で得た細胞凝集体をＷｎｔシグナル伝達経路作用物質、及び／又は、ＦＧＦシグナル伝達経路阻害物質を含む無血清培地又は血清培地中で２日間から４日間程度の期間培養（工程（Ｃ））後、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質及びＦＧＦシグナル伝達経路阻害物質を含まない無血清培地又は血清培地中で３０日間～２００日間程度（３０日間～１５０日間、５０日間～１２０日間、６０日間～９０日間）培養する（工程（Ｄ））ことによって、毛様体周縁部様構造体を含む神経網膜を製造することもできる。

　一態様として、工程（Ａ）及び工程（Ｂ）で得られた細胞凝集体であって、工程（Ａ）の浮遊培養開始後６～３０日目、又は１０～２０日目（１０日目、１１日目、１２日目、１３日目、１４日目、１５日目、１６日目、１７日目、１８日目、１９日目又は２０日目）の細胞凝集体から、上記工程（Ｃ）及び工程（Ｄ）により、毛様体周縁部様構造体を含む神経網膜を製造できる。

　Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質としては、Ｗｎｔによって媒介されるシグナル伝達を増強し得るものである限り特に限定されない。具体的なＷｎｔシグナル伝達経路作用物質としては、例えば、ＧＳＫ３β阻害剤（例えば、６－Ｂｒｏｍｏｉｎｄｉｒｕｂｉｎ－３’－ｏｘｉｍｅ（ＢＩＯ）、ＣＨＩＲ９９０２１、Ｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ）を挙げることができる。例えばＣＨＩＲ９９０２１の場合には、約０．１μＭ～約１００μＭ、好ましくは約１μＭ～約３０μＭの範囲を挙げることができる。

　ＦＧＦシグナル伝達経路阻害物質としては、ＦＧＦによって媒介されるシグナル伝達を阻害できるものである限り特に限定されない。ＦＧＦシグナル伝達経路阻害物質としては、例えば、ＳＵ－５４０２、ＡＺＤ４５４７、ＢＧＪ３９８等が挙げられる。例えばＳＵ－５４０２の場合、約０．１μＭ～約１００μＭ、好ましくは約１μＭ～約３０μＭ、より好ましくは約５μＭの濃度で添加する。

　工程（Ｃ）において用いられる培地は、一例において、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質、ＳＨＨシグナル伝達経路作用物質、ＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及びＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路作用物質からなる群から選択される１以上（好ましくは全部）を添加されていない培地である。

　上記工程（Ｄ）の一部又は全部の工程は、ＷＯ２０１９／０１７４９２に開示された連続上皮組織維持用培地を用いて培養することができる。すなわち、連続上皮組織維持用培地を用いて培養することにより、神経網膜の連続上皮構造を維持することができる。一例として、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（例：サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、２１１０３０４９）にＢ２７サプリメント（例：サーモフィッシャーサイエンティフィック、１２５８７０１０）を配合した培地を連続上皮組織維持用培地として挙げることができる。

　上記工程（Ｄ）における培養は、網膜系細胞（特に視細胞）の分化及び／又は成熟化と、連続上皮構造の維持を両立させるために、段階的に連続上皮組織維持用培地に交換することが好ましい。例えば、始めの１０日間～３０日間を細胞増殖用基礎培地（例：ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に１０％牛胎仔血清、１％Ｎ２　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、及び１００μＭタウリンが添加された培地）、次の１０日間～４０日間を細胞増殖用基礎培地と連続上皮組織維持用培地の混合培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に１０％牛胎仔血清、１％Ｎ２　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、及び１００μＭタウリンが添加された培地と、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地に、１０％牛胎仔血清、２％Ｂ２７　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、２ｍＭ　ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、及び１００μＭタウリンが添加された培地を１：３の比率で混合した培地）、次の２０日間～１４０日間を連続上皮組織維持用培地（例：Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地に、１０％牛胎仔血清、２％Ｂ２７　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、２ｍＭ　ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、及び１００μＭタウリンが添加された培地）、を用いて培養することができる。

　上記工程（Ｄ）の一部又は全部の工程において、細胞増殖用基礎培地、連続上皮組織維持用培地又はこれらの混合培地のいずれかの培地を用いている場合であっても、甲状腺ホルモンシグナル伝達経路作用物質をさらに含んでよい。甲状腺ホルモンシグナル伝達経路作用物質を含む培地で培養することにより、神経網膜に含まれる双極細胞、アマクリン細胞、神経節細胞又は水平細胞等の割合が低く、かつ視細胞前駆細胞の割合を増大させた網膜系細胞凝集体の製造が可能となる。

　本明細書において、甲状腺ホルモンシグナル伝達経路作用物質とは、甲状腺ホルモンにより媒介されるシグナル伝達を増強し得る物質であり、甲状腺ホルモンシグナル伝達経路を増強し得るものであれば特に限定はない。甲状腺ホルモンシグナル伝達経路作用物質としては、例えば、トリヨードサイロニン（以下、Ｔ３と略すことがある）、サイロキシン（以下、Ｔ４と略すことがある）、甲状腺ホルモン受容体（好ましくはＴＲβ受容体）アゴニスト等が挙げられる。

　また、当業者に周知の甲状腺ホルモン受容体アゴニストとして、国際公開第９７／２１９９３号パンフレット、国際公開第２００４／０６６９２９号パンフレット、国際公開第２００４／０９３７９９号、国際公開第２０００／０３９０７７号パンフレット、国際公開第２００１／０９８２５６号パンフレット、国際公開第２００３／０１８５１５号パンフレット、国際公開第２００３／０８４９１５号パンフレット、国際公開第２００２／０９４３１９号パンフレット、国際公開第２００３／０６４３６９号パンフレット、特開２００２－０５３５６４号公報、特開２００２－３７０９７８号公報、特開２０００－２５６１９０号公報、国際公開第２００７／１３２４７５号パンフレット、国際公開第２００７／００９９１３号パンフレット、国際公開第２００３／０９４８４５号パンフレット、国際公開第２００２／０５１８０５号パンフレット又は国際公開第２０１０／１２２９８０号パンフレットに記載のジフェニルメタン誘導体、ジアリールエーテル誘導体、ピリダジン誘導体、ピリジン誘導体若しくはインドール誘導体等の化合物を挙げることができる。

　甲状腺ホルモンシグナル伝達経路作用物質としてＴ３を用いる場合には、例えば、０．１～１０００ｎＭの範囲となるように培地に添加することができる。好ましくは、１～５００ｎＭ；より好ましくは１０～１００ｎＭ；さらに好ましくは３０～９０ｎＭ；さらにより好ましくは６０ｎＭ前後の濃度のＴ３に相当する甲状腺ホルモンシグナル伝達亢進活性を有する濃度が挙げられる。甲状腺ホルモンシグナル伝達経路作用物質としてＴ４を用いる場合には、例えば、１ｎＭ～５００μＭの範囲となるように培地に添加することができる。好ましくは、５０ｎＭ～５０μＭ；より好ましくは５００ｎＭ～５μＭの範囲である。その他の甲状腺ホルモン受容体アゴニストを用いる場合、上述の濃度のＴ３又はＴ４が示すアゴニスト活性と同程度の活性を示す濃度であればよい。

　工程（Ｄ）において用いられる培地は、適宜、Ｌ－グルタミン、タウリン、血清などを含んでいてもよい。工程（Ｄ）において用いられる培地は、一例において、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質、ＦＧＦシグナル伝達経路阻害物質、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質、ＳＨＨシグナル伝達経路作用物質、ＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及びＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路作用物質からなる群から選択される１以上（好ましくは全部）を添加されていない培地である。

　本発明の製造方法の具体的な一態様として、下記工程（Ａ）～（Ｅ）を含む方法によって網膜系細胞又は網膜組織を含む細胞凝集体を調製することができる：
（Ａ）多能性幹細胞を、フィーダー細胞非存在下で、未分化維持因子を含み、かつ任意でＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及び／又はソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含んでもよい培地で培養する工程、
（Ｂ）工程（Ａ）で得られた細胞を、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質及び／又はソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含んでいてもよい培地中で浮遊培養することによって細胞凝集体を形成させる工程、
（Ｃ）工程（Ｂ）で得られた細胞凝集体を、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質及びＣＨＫ１シグナル伝達経路阻害物質（例：ＣＨＫ１阻害物質）を含む培地中でさらに浮遊培養し、網膜系細胞又は網膜組織を含む細胞凝集体を得る工程、
（Ｄ）工程（Ｃ）で得られた細胞凝集体を、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質、及び／又は、ＦＧＦシグナル伝達経路阻害物質を含む無血清培地又は血清培地中で２日間から４日間程度の期間培養する工程、及び、
（Ｅ）工程（Ｄ）で得られた細胞凝集体を、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質及びＦＧＦシグナル伝達経路阻害物質を含まず、甲状腺ホルモンシグナル伝達経路作用物質を含んでいてもよい無血清培地又は血清培地中で３０日間～２００日間程度培養する工程。

　具体的な一態様として、下記工程（Ａ）～（Ｅ）を含む方法によって網膜系細胞又は網膜組織を含む細胞凝集体を調製することができる：
（Ａ）多能性幹細胞を、フィーダー細胞非存在下で、未分化維持因子を含み、かつＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及び／又はソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含む培地で１２時間～４８時間培養する工程、
（Ｂ）工程（Ａ）で得られた細胞を、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質及び／又はソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含む培地中で、１２時間～７２日間（２４時間～４８時間）浮遊培養することによって細胞凝集体を形成させる工程、
（Ｃ）工程（Ｂ）で得られた細胞凝集体を、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質及びＣＨＫ１シグナル伝達経路阻害物質（例：ＣＨＫ１阻害物質）を含む培地中でさらに８日間～１５日間（１０日間～１３日間）浮遊培養し、網膜系細胞又は網膜組織を含む細胞凝集体を得る工程、
（Ｄ）工程（Ｃ）で得られた細胞凝集体を、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質、及び／又は、ＦＧＦシグナル伝達経路阻害物質を含む無血清培地又は血清培地中で２日間から４日間培養する工程、及び、
（Ｅ）工程（Ｄ）で得られた細胞凝集体を、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質及びＦＧＦシグナル伝達経路阻害物質を含まず、甲状腺ホルモンシグナル伝達経路作用物質を含んでいてもよい無血清培地又は血清培地中で１０日間～２００日間程度培養する工程。

　ここで工程（Ｄ）は１０日間～３０日間細胞増殖用基礎培地で培養し、次いで１０日間～４０日間細胞増殖用基礎培地と甲状腺ホルモンシグナル伝達作用物質を含む連続上皮組織維持用培地の混合培地で培養し、さらに２０日間～１４０日間甲状腺ホルモンシグナル伝達作用物質を含む連続上皮組織維持用培地で培養する工程を含んでいてもよい。

　一態様において、工程（Ｄ）は、甲状腺ホルモンシグナル伝達経路作用物質の存在下に２０日間～６０日間（３０日間～５０日間）培養することを含む。

　一態様において、工程（Ａ）～工程（Ｄ）までの培養期間は、７０日間～１００日間（８０日間～９０日間）である。

　上述した工程（Ａ）～工程（Ｄ）、あるいは当該工程の一部のみにより網膜組織を製造する場合、各工程において明示的に記載したシグナル伝達作用物質を用いれば良好な網膜組織を製造することが可能である。各工程の目的の妨げ（例：網膜組織以外の組織が誘導される場合など）になるような条件では、他のシグナル伝達作用物質を含まない方がよい。一態様において、各工程における培養培地には、各工程において明示的に記載したシグナル伝達作用物質を除き、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路活性化物質／阻害物質、ＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路活性化物質／阻害物質、ＢＭＰシグナル伝達経路活性化物質／阻害物質、ＣＨＫ１シグナル伝達経路阻害物質、Ｗｎｔシグナル伝達経路活性化物質／阻害物質、ＦＧＦシグナル伝達経路活性化／阻害物質、Ｎｏｄａｌシグナル伝達経路活性化物質／阻害物質、ＭＥＫ（ＥＲＫ）活性化物質／阻害物質、ＰＩ３ｋ／Ａｋｔシグナル伝達経路活性化物質／阻害物質、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）シグナル伝達経路活性化物質／阻害物質、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）シグナル伝達経路活性化物質／阻害物質、上皮成長因子（ＥＧＦ）シグナル伝達経路活性化物質／阻害物質、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路活性化物質／阻害物質、インテグリンシグナル伝達経路活性化物質／阻害物質、レチノイン酸を含まないことができる。各工程の目的の妨げ（例：網膜組織以外の組織が誘導される場合など）にならない限り、他のシグナル伝達作用物質を含んでもよいことは当然である。

　一態様として、本発明の製造方法によって得られた細胞凝集体は、スフェア状の細胞凝集体であることが好ましく、真球に近い形状を有する細胞凝集体であることがより好ましい。該細胞凝集体は網膜系細胞を含み、一実施形態の細胞凝集体は、網膜色素上皮細胞を含む外側構造と、神経網膜を含む内側構造の複層構造を備えるスフェア状細胞凝集体である。

　スフェア（ｓｐｈｅｒｅ）状細胞凝集体とは、球状に近い立体的な形を有する細胞凝集体を意味する。球状に近い立体的な形とは、三次元構造を有する形であって、二次元面に投影したときに、例えば、円形又は楕円形を示す球状形、及び球状形が複数重なり合って形成される形状（例えば二次元に投影した場合に２～４個の円形若しくは楕円形が重なりあって形成する形を示す）が挙げられる。スフェア（ｓｐｈｅｒｅ）状細胞凝集体は、真球に近い形状であってよい。

　本明細書において、「真球」とは、中心から外周までの距離が一定である完全な球体をいみする。「真球に近い形状」とは、真球に近い球体を意味する。例えば、中心から外周までの最長の距離と最短の距離の差が、最長の距離の１０％以内、５％以内、３％以内であってよい。簡便には、顕微鏡等の観察により、２次元面に投影した円に基づき判定してもよい。例えば、２次元面に投影した円の中心から外周までの最長の距離と最短の距離の差が、最長の距離の１０％以内、５％以内、３％以内である場合も含まれる。上述の通り、細胞凝集体が「真球」又は「真球に近い形状」であるか否かを判断する。本明細書の製造方法を用いた場合、複数の形状が重なり合わない、「真球」又は「真球に近い形状」である細胞凝集体が高率に得ることができる。

　本発明の一態様として、網膜組織を含み、かつ、目的外細胞（例：ＲＰＥ細胞）を含まない、真球に近い形状を有する細胞凝集体を提供する。

　本発明の一態様として、網膜組織を含む細胞凝集体の培養物も提供する。具体的には、網膜組織を含む細胞凝集体の培養物であって、
　（１）網膜組織を含み、かつ、目的外細胞（例：ＲＰＥ細胞）を含まない、真球に近い形状を有する細胞凝集体と、
　（２）上記細胞凝集体の生存能力を維持するために必要な媒体と、
を含む、培養物を提供する。

　また、本願発明の細胞凝集体の形成において、特にＳＦＥＢｑ法（ＷＯ２００９／１４８１７０）を用いる場合、通常、９６ウェルプレートのようなマルチウェルプレート（Ｕ底、Ｖ底）を用いて培養を行い、当該プレートの１ウェルあたり１個の細胞凝集体を含む。細胞凝集体を含まないウェルがあってもよい。例えば、培地の蒸発による影響を防止する目的で、当該プレートの最も外側のウェルには培地のみを含み細胞凝集体を含まない場合がある。

　そこで、本発明の一態様として、網膜組織を含む細胞凝集体の培養物であって、
　（１）マルチウェルプレート（例：１９２ウェル、９６ウェル、４８ウェル、２４ウェル、１２ウェル）と、
　（２）当該プレートの各ウェル（少なくとも、全ウェルの５０％、６０％、７０％、８０％、９０％若しくは９５％以上）中に
　（Ａ）網膜組織を含み、かつ、目的外細胞（例：ＲＰＥ細胞）を含まない、真球に近い形状を有する細胞凝集体と、
　（Ｂ）上記移植用細胞集団の生存能力を維持するために必要な媒体と、
を含む、培養物を提供する。

　細胞凝集体を含むウェル数に対し、網膜組織を含む真球に近い形状を有する細胞凝集体を含むウェル数の割合が、例えば、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上若しくは９８％以上であってもよい。

　ここでいう「目的外細胞（例：ＲＰＥ細胞）を含まない」とは、実質的に目的外細胞（例：ＲＰＥ細胞）を含まないことを意味する。具体的には、細胞凝集体全細胞数に対する目的外細胞（例：ＲＰＥ細胞）の割合が、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下、約１％以下、約０．５％以下、約０．１％以下である。また、「目的外細胞」とは、神経網膜に含まれる細胞以外の細胞を意味する。目的外細胞の一例として、脳脊髄組織及び眼球関連組織などが含まれ、脳脊髄組織としては、終脳（大脳）、間脳（視床下部を含む）、中脳、及び脊髄の細胞、眼球関連組織としては、網膜色素上皮（ＲＰＥ）、毛様体、水晶体及びｏｐｔｉｃ　ｓｔａｌｋ（眼茎及び視神経組織）が挙げられる。

　本発明における「培養物（ｃｕｌｔｕｒｅ）」とは、生存能力を維持するために必要な媒体及び細胞凝集体を含み、更に添加した又は細胞凝集体から産生された生物学的物質を含んでもよい液体を意味する。生物学的物質としては、例えばサイトカイン、ケモカイン等が含まれるが、これらに限定されない。

　本発明における「生存能力を維持するために必要な媒体」としては、培地、生理学的緩衝溶液等が挙げられるが、網膜組織を含む細胞凝集体が生存する限りにおいて特に限定されず、当業者であれば適宜選択することができる。一例として、動物細胞の培養に通常用いられる培地を基礎培地として、調製した培地が挙げられる。基礎培地としては、例えば、ＢＭＥ培地、ＢＧＪｂ培地、ＣＭＲＬ　１０６６培地、Ｇｌａｓｇｏｗ　ＭＥＭ　（ＧＭＥＭ）培地、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ＭＥＭ　Ｚｉｎｃ　Ｏｐｔｉｏｎ培地、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ　１９９培地、Ｅａｇｌｅ　ＭＥＭ培地、αＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、Ｆ－１２培地、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、ＩＭＤＭ／Ｆ１２培地、ハム培地、ＲＰＭＩ　１６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地又はこれらの混合培地等、動物細胞の培養に用いることのできる培地を挙げることができる。

　一態様として、製造方法は、得られた細胞凝集体から、移植に必要な大きさの網膜組織を切り出す工程をさらに含んでもよい。例えば、ピンセット、ナイフ、ハサミ等を用いて切り出すことができる。

〔スフェア状細胞凝集体〕
　本発明の一態様としてのスフェア状細胞凝集体は、網膜色素上皮細胞を含む外側構造と、神経網膜を含む内側構造との複層構造を備える。該スフェア状細胞凝集体は、
（１）上記内側構造における上記神経網膜において、少なくとも視細胞層を含む神経網膜層が形成されており、上記視細胞層は少なくとも視細胞、視細胞前駆細胞及び網膜前駆細胞からなる群から選択される１以上の細胞を含み、
（２）上記内側構造において、上記神経網膜が折り重なって存在しており、
（３）上記外側構造における上記網膜色素上皮細胞がＲＰＥ６５陽性細胞、ＭＩＴＦ陽性細胞、又は、ＲＰＥ６５陽性かつＭＩＴＦ陽性細胞であり、かつ
（４）上記細胞凝集体は、水晶体、硝子体、角膜及び血管を含まない
ことを特徴とする。

　一態様として、スフェア状細胞凝集体における網膜色素上皮細胞を含む外側構造とは、スフェア状細胞凝集体の最も外側の層構造であり、神経網膜を含む内側構造の表面の少なくとも一部を連続的に又は断続的に覆う。外側構造は、好ましくは内部構造の表面積の３０％以上、より好ましくは５０％以上を覆っている。内部構造の表面を連続的に覆っていることとは、外部構造は内部構造の表面において連続的な１つの塊として存在していることをいい、内部構造の表面を断続的に覆うこととは、外部構造は内部構造の表面において２以上の連続的な塊又は層として存在し、それぞれの連続的な塊は互いに接続していないことをいう。外部構造は内部構造の表面を断続的に覆っている場合において、それぞれの連続的な塊はコア部の表面積の１０％以上、又は２０％以上を連続的に覆っていることが好ましい。

　（１）内側構造における上記神経網膜において、少なくとも視細胞層を含む神経網膜層が形成されており、上記視細胞層は少なくとも視細胞、視細胞前駆細胞及び網膜前駆細胞からなる群から選択される１以上の細胞（以下、「視細胞等」という場合がある）を含む。

　視細胞は、桿体視細胞及び錐体視細胞を含み、視細胞層に存在する全細胞に対して、視細胞等は核の数を基準に７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上を占める。

　上記内側構造の３０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは８０％以上が神経網膜である。

　（２）上記内側構造において、上記神経網膜が折り重なって存在する。上記神経網膜の折り重なる箇所・回数は特に限定されず、内側構造の一部のみにおいて折り重なっていてもよく、１回のみ折り重なっていても、複数回（２回、３回、４回、５回など）折り重なっていてもよい。内側構造の一部は網膜色素上皮細胞、毛様体周縁部用構造体及び空隙を含んでもよい。内側構造において神経網膜が折り重なる本発明の細胞凝集体の構造は、生体網膜と異なる。神経網膜は１つの連続する上皮構造を形成していてもよく、複数の上皮構造を形成していてもよい。内側構造の神経網膜における視細胞層は、少なくとも細胞凝集体の内側構造の一部においては最も外側（表面、外側構造と接する面）に形成されている。内側構造においては、神経網膜が折り重なって存在するため、内側にも視細胞層が形成されていてもよい。上記視細胞等は内側構造の連続する上皮構造の表面の接線方向に連続して、すなわち互いに接着して存在しており、視細胞等が内側構造の連続する上皮構造の表面の接線方向に連続して存在することで、視細胞等を含む視細胞層を形成している。なお、接線方向とは、スフェア状細胞凝集体の内側構造に存在する各上皮組織の表面に対する接線方向、すなわち視細胞層における視細胞等が並んでいる方向のことをいい、当該神経網膜に対して平行方向又は横方向のことである。

　（３）外側構造は、互いに接触する網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞を含み、ここでＲＰＥ細胞は、網膜色素上皮前駆細胞も含み、ＲＰＥ６５陽性細胞、ＭＩＴＦ陽性細胞、又は、ＲＰＥ６５陽性かつＭＩＴＦ陽性細胞であることが好ましい。ＲＰＥ細胞が「互いに接触する」とは、外部構造において１のＲＰＥ細胞が他のＲＰＥ細胞と接触している状態を意味し、他のＲＰＥ細胞と接触しない独立した単一のＲＰＥ細胞は外部構造を構成しない。

　細胞凝集体の少なくとも一部において、上記網膜色素上皮細胞の基底（ｂａｓａｌ）面が上記内側構造に向き、上記神経網膜の基底面（ｂａｓａｌ）が上記外側構造に向いていてもよい。すなわち、網膜色素上皮細胞の基底（ｂａｓａｌ）面と神経網膜の基底面（ｂａｓａｌ）とが向かい合っている。生体網膜において、網膜色素上皮細胞の層の基底面と、神経網膜の頂端（ａｐｉｃａｌ）面とが向き合っているため、当該構造も生体網膜と異なる特徴である。

　（４）胎児網膜を含む生体網膜は、水晶体、硝子体、角膜及び血管を含むのに対して、本発明の細胞凝集体は、水晶体、硝子体、角膜及び血管を含まない。

　「水晶体」とは、外から眼球に入ってきた光を屈折させて、網膜にピントをあわせるレンズの役割を果たす組織である。水晶体の部分構造としては、水晶体上皮、水晶体核、水晶体嚢、等が挙げられる。水晶体の前駆組織としては、水晶体プラコード、水晶体胞等が挙げられる。水晶体プラコードとは、肥厚した表皮外胚葉細胞層からなる水晶体前駆組織である。胚発生においては、眼胞の表皮外胚葉への接触により、当該接触領域が肥厚することにより形成される。水晶体胞とは、水晶体プラコードの陥入により形成される小胞である。水晶体、その部分構造、又はその前駆組織が存在することは、マーカーの発現により確認することができる。水晶体、その部分構造、又はその前駆組織のマーカーとしては、Ｌ－Ｍａｆ（水晶体前駆組織）、α、β及びγクリスタリン（水晶体）等が挙げられるが、これらに限定されない。

　「硝子体」とは、水晶体の後方にあり、内腔を埋める透明なゼリー状の組織であり、眼球の形を保つと同時に、外力を分散させる作用を持つ。硝子体は、水分及びタンパク質（コラーゲン）からできている。硝子体が存在することは、そのゼリー状の形状により確認することができる。

　「角膜」とは、眼球壁の外層の前方約１／６を占める透明な時計皿状の組織である。角膜の部分構造としては、角膜上皮、ボーマン膜、角膜実質、デスメ膜、角膜内皮等が挙げられる。角膜は、通常、体表側から順に、角膜上皮、ボーマン膜、角膜実質、デスメ膜、及び角膜内皮からなる５つの層から構成される。角膜、その部分構造、又はその前駆組織が存在することは、マーカーの発現により確認することができる。角膜、その部分構造、又はその前駆組織のマーカーとしては、パン－サイトケラチン（角膜上皮前駆組織）、Ｅ－カドヘリン（角膜上皮前駆組織）、サイトケラチン３（角膜上皮）、サイトケラチン１２（角膜上皮）、サイトケラチン１４（角膜上皮）、ｐ６３（角膜上皮）、ＺＯ－１（角膜上皮）、ＰＤＧＦＲ－α（角膜実質、角膜内皮、又はその前駆組織）、Ｐｉｔｘ２（角膜実質及び角膜内皮の前駆組織）、ＡＢＣＧ２（角膜実質及び角膜内皮の前駆組織）等が挙げられる。

　胎児網膜から水晶体等を取り除くと、その部分に穴が開いてしまい、組織が空隙によって分断される。また、生体網膜に比べて、スフェア状細胞凝集体のコア部の神経網膜層を構成する内層（最も外側の視細胞層を除いた部分）に存在する細胞（例：水平細胞、アマクリン細胞、双極細胞）、及び神経節細胞の数が少ない。具体的には、例えばヒト胎児網膜の内層に存在する細胞数と比べて８０％以下、７０％以下、６０％以下、５０％以下である。また、胎児網膜の一部を切り取り培養した場合は、二次元の厚みを持ったシート構造となるが、立体的なスフェア状細胞凝集体とはなり得ない。

　上記スフェア状細胞凝集体が、毛様体周縁部様構造体を含んでいてもよい。毛様体周縁部様構造体は外側構造及び／又は内側構造に含まれてもよい。上記網膜色素上皮細胞と上記神経網膜が上皮構造としてつながっており、上記網膜色素上皮細胞と上記神経網膜との間に毛様体周縁部様構造体に含まれていてもよい。「上皮構造としてつながっている」とは、例えば、Ａｐｉｃａｌ－Ｂａｓａｌの極性が連続的に繋がりあった状態を意味する。スフェア状細胞凝集体中には、例えば、毛様体周縁部様構造体は２個以上、３個以上、４個以上、５個以上含まれていてもよい。毛様体周縁部様構造体とは、毛様体周縁部と類似した構造体のことである。「毛様体周縁部（ｃｉｌｉａｒｙ　ｍａｒｇｉｎａｌ　ｚｏｎｅ；ＣＭＺ）」としては、例えば、生体網膜において神経網膜と網膜色素上皮との境界領域に存在する組織であり、且つ、網膜の組織幹細胞（網膜幹細胞）を含む領域を挙げることができる。毛様体周縁部は、毛様体縁（ｃｉｌｉａｒｙ　ｍａｒｇｉｎ）又は網膜縁（ｒｅｔｉｎａｌ　ｍａｒｇｉｎ）とも呼ばれ、毛様体周縁部、毛様体縁及び網膜縁は同等の組織である。毛様体周縁部は、網膜組織への網膜前駆細胞、分化細胞の供給、網膜組織構造の維持等に重要な役割を果たしていることが知られている。毛様体周縁部のマーカー遺伝子としては、例えば、Ｒｄｈ１０遺伝子（陽性）、Ｏｔｘ１遺伝子（陽性）及びＺｉｃ１（陽性）を挙げることができる。すなわち、上記毛様体周縁部様構造体が、Ｒｄｈ１０陽性細胞、Ｏｔｘ１陽性細胞、及び／又はＺｉｃ１陽性細胞を含んでいてもよい。

　スフェア状細胞凝集体の直径（最大直径）は、例えば、０．１ｍｍ以上、０．２ｍｍ以上、０．５ｍｍ以上、１ｍｍ以上、又は２ｍｍ以上であってよく、例えば、０．２ｍｍ～２ｍｍ、０．５ｍｍ～２ｍｍ、又は０．５～１ｍｍである。ここでスフェア状細胞凝集体の直径は、細胞凝集体の中心から表面までの距離のうち最も長いものとして測定される。

　本発明のスフェア状細胞凝集体を、ピンセット、ナイフ、ハサミ等を用いて適切な大きさに切り出した後に移植することもできる。切り出した後の形状は問わないが、神経網膜及び網膜色素上皮細胞を含むシート剤（細胞シート、ＮＲ－ＲＰＥ細胞シートともいう）が挙げられる。例えば、一つの細胞凝集塊から切り出した細胞シート１枚（例えば直径３００μｍ高さ５０μｍ）を視細胞や網膜色素上皮細胞が変性している領域の面積に応じて、１枚から複数枚で移植することが挙げられる。当業者であれば、その変性死しているに領域に応じて細胞シートの枚数を選択することができる。網膜色素上皮細胞の層の基底面と、神経網膜の頂端（ａｐｉｃａｌ）面とが向き合っている領域、毛様体周縁部様構造体を含まない領域、及び／又は神経網膜が折り重なっていない領域を選択的に切り出すことも可能である。

　本発明の一態様は、下記工程を含む、スフェア状細胞凝集体の製造方法も提供する。
　（Ａ）多能性幹細胞を浮遊培養し、細胞凝集体を形成させる工程、
　（Ｂ）工程（Ａ）で得られた細胞凝集体を、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質及びＣＨＫ１シグナル伝達経路阻害物質の存在下に浮遊培養し、網膜色素上皮細胞を含む外側構造と、神経網膜を含む内側構造との複層構造を備えるスフェア状細胞凝集体を得る工程。
ここで、工程（Ａ）及び工程（Ｂ）等は、上述の網膜系細胞又は網膜組織の製造方法に記載のとおりである。

〔医薬組成物、治療方法及び治療薬〕
　本発明の一態様として、本発明の細胞凝集体（段落[０１０８]、[０１１１]又は［０１２０］など）又はその一部を含む医薬組成物（移植用組成物、移植用組織またはＴｒａｎｓｐｌａｎｔ）が挙げられる。医薬組成物は好ましくは、本発明の細胞凝集体又はその一部の他に、さらに医薬として許容される担体を含む。細胞凝集体の一部とは、医薬組成物に利用できる細胞凝集体の一部であり、細胞凝集体から、移植に必要な大きさの網膜組織を切り出すことによって得ることができる。

　医薬組成物は、神経網膜系細胞若しくは神経網膜の障害又は神経網膜の損傷に基づく疾患の治療に使用し得る。神経網膜系細胞若しくは神経網膜の障害に基づく疾患としては、例えば、網膜変性疾患、黄斑変性症、加齢黄斑変性、網膜色素変性、緑内障、角膜疾患、網膜剥離、中心性漿液性網脈絡膜症、錐体ジストロフィー、錐体桿体ジストロフィー等の眼科疾患が挙げられる。神経網膜の損傷状態としては、例えは、視細胞が変性死している状態等が挙げられる。

　医薬として許容される担体としては、生理的な水性溶媒（生理食塩水、緩衝液、無血清培地等）を用いることができる。必要に応じて、医薬組成物には、移植医療において、移植する組織又は細胞を含む医薬に、通常使用される保存剤、安定剤、還元剤、等張化剤等を配合させてもよい。

　本発明の一態様として、本発明の細胞凝集体又はその一部を含む、神経網膜の障害に基づく疾患の治療薬を提供する。また、本発明の一態様として、本発明の細胞凝集体又はその一部を、移植を必要とする対象（例えば、眼科疾患が起きている眼の網膜下）に移植することを含む、神経網膜系細胞若しくは神経網膜の障害又は神経網膜の損傷に基づく疾患を治療する方法が挙げられる。神経網膜の障害に基づく疾患の治療薬として、又は、当該神経網膜の損傷状態において、該当する損傷部位を補充するために、本発明の細胞凝集体又はその一部を用いることができる。移植を必要とする、神経網膜系細胞若しくは神経網膜の障害に基づく疾患を有する患者、又は神経網膜の損傷状態の患者に、本発明の細胞凝集体又はその一部を移植し、当該神経網膜系細胞又は、障害を受けた神経網膜を補充することによって、神経網膜系細胞若しくは神経網膜の障害に基づく疾患、又は神経網膜の損傷状態を治療することができる。移植方法としては、例えば、眼球の切開などにより損傷部位の網膜下にシート状網膜組織を移植する方法が挙げられる。移植する方法としては、例えば細い管を用いて注入する方法やピンセットで挟んで移植する方法が挙げられ、細い管としては注射針等が挙げられる。

　以下に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明は何らこれらに限定されるものではない。

＜実施例１　ＢＭＰ４の感受性を高めることによる網膜分化誘導の検討＞
　Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓレポーター遺伝子を持つように遺伝子改変したヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ－１株（非特許文献３））を、「Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｒｅｐｏｒｔｓ，４，３５９４　（２０１４）」に記載の方法に準じてフィーダー細胞非存在下（フィーダーフリー条件下）で培養した。フィーダー細胞非存在下での培養に用いる培地（フィーダーフリー培地）としてはＳｔｅｍＦｉｔ培地（商品名：ＡＫ０３Ｎ、味の素社製）、フィーダー細胞に代わる足場としてＬａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８（商品名、ニッピ社製）を用いた。

　具体的なヒトＥＳ細胞の維持培養操作は、以下の様に行った。まず、サブコンフレント（培養面積の６割が細胞に覆われる程度）になったヒトＥＳ細胞を、ＰＢＳにて洗浄後、ＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔ（商品名、Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて単一細胞へ分散した。その後、単一細胞へ分散されたヒトＥＳ細胞を、Ｌａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８にてコートしたプラスチック培養ディッシュに播種し、Ｙ－２７６３２（ＲＯＣＫ阻害物質、１０μＭ）存在下、ＳｔｅｍＦｉｔ培地にてフィーダーフリー条件下で培養した。上記プラスチック培養ディッシュとして、６ウェルプレート（イワキ社製、細胞培養用、培養面積９．４ｃｍ２）を用いた場合、上記単一細胞へ分散されたヒトＥＳ細胞の播種細胞数は１ウェルあたり０．４～１．２×１０^４細胞とした。播種した１日後に、Ｙ－２７６３２を含まないＳｔｅｍＦｉｔ培地に交換した。以降、１～２日に一回Ｙ－２７６３２を含まないＳｔｅｍＦｉｔ培地にて培地交換した。その後、サブコンフレント１日前になるまでフィーダーフリー条件下で培養した。当該サブコンフレント１日前のヒトＥＳ細胞を、ＳＢ４３１５４２（ＴＧＦβシグナル伝達経路阻害物質、５μＭ）及びＳＡＧ（Ｓｈｈシグナル伝達経路作用物質、３００ｎＭ）の存在下（Ｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎ処理）で、１日間フィーダーフリー条件下で培養した。

　ヒトＥＳ細胞を、ＰＢＳにて洗浄後、ＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔを用いて細胞分散液処理し、更にピペッティング操作によって単一細胞に分散した。その後、単一細胞に分散されたヒトＥＳ細胞を非細胞接着性の９６ウェル培養プレート（商品名：ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ　９６ウェルＶ底プレート，住友ベークライト社製）の１ウェルあたり１．２×１０^４細胞になるように１００μＬの無血清培地に懸濁させ、３７℃、５％ＣＯ_２条件下で浮遊培養した。その際の無血清培地（ｇｆＣＤＭ＋ＫＳＲ）には、Ｆ－１２培地とＩＭＤＭ培地との１：１混合液に１０％　ＫＳＲ、４５０μＭ　１－モノチオグリセロール、１×Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ　ｄｅｆｉｎｅｄ　ｌｉｐｉｄ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅを添加した無血清培地を用いた。

　浮遊培養開始時（浮遊培養開始後０日目）に、上記無血清培地にＹ－２７６３２（ＲＯＣＫ阻害物質、終濃度１０μＭ）を添加した。浮遊培養開始後３日目に、外来性のヒト組み換えＢＭＰ４を終濃度０．１５ｎＭ又は１．５ｎＭになるように、Ｙ－２７６３２を含まず、ヒト組み換えＢＭＰ４（商品名：Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｈｕｍａｎ　ＢＭＰ－４、Ｒ＆Ｄ社製）を含む培地を５０μＬ添加した。また、ＢＭＰ４と同時にＰＤ４０７８２４（ＴＯＣＲＩＳ社）を終濃度１μＭとなるように添加した。浮遊培養開始後６日目以降、３日に一回、Ｙ－２７６３２、ヒト組み換えＢＭＰ４及びＰＤ４０７８２４のいずれも含まない培地で半量交換した。

　更に当該浮遊培養開始後１４日の凝集塊（細胞凝集体）を、９０ｍｍの低接着培養皿（住友ベークライト社製）に移し、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質（ＣＨＩＲ９９０２１、３μＭ）及びＦＧＦシグナル伝達経路阻害物質（ＳＵ５４０２、５μＭ）を含む無血清培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に１％　Ｎ２　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔが添加された培地）で、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で、３日間培養した。以上の方法は、以降の実施例においても、特別の記載がない場合には同様に実施した。

　浮遊培養開始後１７日間（Ｄａｙ１７）培養し、凝集塊を観察した。その結果、ＰＤ４０７８２４（図中「ＰＤ」）を併用することにより、添加するＢＭＰ量を通常の１／１０程度（０．１５ｎＭ）に減らしても、網膜組織が製造できることがわかった。また、ＰＤ４０７８２４を併用することで、１．５ｎＭ　ＢＭＰ４に比べて、０．１５ｎＭ　ＢＭＰ４を添加した場合、よりＲｘ：：Ｖｅｎｕｓ陽性のＮＲの作製効率が高いことがわかった。また、１．５ｎＭ　ＢＭＰ４にＰＤ４０７８２４を添加した場合、外側に網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞の層と、内側に神経網膜組織（ＮＲ）の層が局在する複層構造を備えるスフェア状細胞凝集体が作製されていることが観察された（図１）。

　よって、ＢＭＰ４に加えてＰＤ４０７８２４を添加することで分化誘導の効果及び効率が向上すること、特に低濃度のＢＭＰ４とＰＤ４０７８２４の組み合わせにおける分化誘導の効果及び効率が向上することがわかった。また、ＰＤ４０７８２４と組み合わせた場合には、ＢＭＰ４の濃度を高くすることにより、ＲＰＥとＮＲを同時に作製することがわかった。

＜実施例２　Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓ陽性の網膜分化誘導促進の確認＞
　実施例１のように、浮遊培養開始後３日目に（１）１．５ｎＭ　ＢＭＰ４のみ、又は（２）０．１５ｎＭ　ＢＭＰ４に加えて１μＭ　ＰＤ４０７８２４を添加して作製した凝集塊を浮遊培養開始後１５日間（Ｄａｙ１５）又は３６日間（Ｄａｙ３６）培養し、凝集塊を観察した。その結果、１．５ｎＭ　ＢＭＰ４を添加した場合、Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓ陽性の凝集塊にＲｘ：：Ｖｅｎｕｓ陰性の細胞の塊が付着して、目的外細胞が含まれているのに対し、０．１５ｎＭ　ＢＭＰ４にＰＤ４０７８２４を添加した場合、Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓ陰性の塊が大幅に減少し、Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓ陽性のＮＲの分化誘導効率が高いことがわかった（図２～４）。また、ＢＭＰとＰＤ４０７８２４を組み合わせることにより、ＢＭＰを単独で用いる場合に比べて、良好な形状（真球に近い形状）の凝集塊（網膜組織）を製造可能であることがわかった。具体的には、ＢＭＰを単独で用いる場合には、９６ウェル中、真球に近い形状を有する細胞凝集体が５ウェル、クローバー型の細胞凝集体が９１ウェルで認められたのに対し、ＰＤ４０７８２４を併用した場合には、９６ウェル中、真球に近い形状を有する細胞凝集体が９５ウェル、凝集塊形成が不良であった細胞凝集体が１ウェルで認められた。従って、製造した細胞凝集体のほぼ１００％（約９９％（９５／９６）、凝集塊形成不良を除けば１００％）が真球に近い形状を有する細胞凝集体であった。

＜実施例３　網膜色素上皮細胞のスフェア状細胞凝集体の中に神経網膜組織を分化誘導させる方法＞
　実施例１のように、浮遊培養開始後３日目に１．５ｎＭ　ＢＭＰ４に加えて１μＭ　ＰＤ４０７８２４を添加して作製した凝集塊を、浮遊培養開始後２１日間（Ｄａｙ２１）培養し、観察した。その結果、外側に網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞の層と、内側に神経網膜組織（ＮＲ）の層が局在する複層構造を備えるスフェア状細胞凝集体が作製されていることが観察された。また、良好な形状（複数の真球が重なる形状（例：クローバー））の凝集塊（網膜組織）を製造可能であることがわかった（図５）。

　浮遊培養開始後２５日目（Ｄａｙ２５）の凝集塊を、４％ＰＦＡで固定し、２０％のスクロースで置換後、凍結切片を作製した。これらの凍結切片に関し、ＤＡＰＩ、抗ＣＨＸ１０抗体（商品名：Ａｎｔｉ　ＣＨＸ１０　Ａｎｔｉｂｏｄｙ、ＥＸ　ａｌｐｈａ社製）、抗ＭＩＴＦ抗体（ＥＸ　ａｌｐｈａ社製）、抗ＣｏｌｌａｇｅｎＩＶ（Ａｂｃａｍ社製）及び抗Ｚｏ－１抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて免疫染色を行った。必要に応じて、抗原賦活化処理（Ｔｈｅｒｍｏ社製）をマイクロウェーブで行った。

　これらの免疫染色された切片を、共焦点蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ社製ＳＰ－８）を用いて観察した。その結果、凝集塊には複数の層構造が形成され、凝集塊の最も外側の細胞層にＭＩＴＦ陽性のＲＰＥ細胞が含まれ、内側の細胞層にＣｈｘ１０陽性の神経網膜前駆細胞が含まれることを確認した。また、外側のＲＰＥ細胞の層において、最も外側の表面にＺｏ－１陽性の頂端（Ａｐｉｃａｌ）面が形成されており、その内側にはコラーゲン陽性の基底（ｂａｓａｌ）面が形成されていた。さらに、内側の神経網膜層においても、外側にコラーゲン陽性の基底面が形成され、内側にＺｏ－１陽性のＡｐｉｃａｌ面が形成され、ＡｐｉｃａｌとＢａｓａｌの極性がある凝集塊が形成されていることも確認した（図６）。さらに、観察したところ、ＭＩＴＦ陽性のＲＰＥの層とＣｈｘ１０陽性の神経網膜の層の境界部に特徴的なＣｉｌｉａｒｙ　Ｍａｒｇｉｎａｌ　Ｚｏｎｅ（ＣＭＺ）の構造が多数（図７中で“［”で示されている場所、１つの凝集体あたり、３個～１０個程度）観察された（図７）。

　よって、ＢＭＰ４に加えてＰＤ４０７８２４を添加することで、スフェア状細胞凝集体において、外側のＲＰＥ細胞の層と接する内側の面に、ＣＭＺを多数含む極性をもった神経網膜組織を作製することができることがわかった。

＜実施例４　ＢＭＰ４とＰＤの濃度検討＞
　実施例１のように浮遊培養開始後３日目に、０．１５ｎＭ、０．５ｎＭ又は１．５ｎＭに加えて１μＭ又は３μＭ　ＰＤ４０７８２４を添加し浮遊培養開始後９日間（Ｄａｙ９）培養し、凝集塊を観察した。その結果、０．１５ｎＭ　ＢＭＰ４に加えてＰＤを１μＭ添加すると、凝集塊の全領域においてＲｘ：：Ｖｅｎｕｓ陽性の神経網膜が分化されることがわかった。一方で、ＢＭＰ４を０．５ｎＭ又は１．５ｎＭに加えてＰＤ４０７８２４を１μＭ又は３μＭ添加すると、外側のＲＰＥ細胞の層と、ＣＭＺを多数含む極性をもった、内側の神経網膜組織の層の複層構造を備えるスフェア状細胞凝集体が作製されていることが観察された（図８）。

　よって、０．１５ｎＭから１．５ｎＭのＢＭＰ４に加えて１μＭから３μＭのＰＤ４０７８２４を添加することで、神経網膜組織を作製することができることがわかった。

＜実施例５　長期培養による視細胞分化の確認＞
　実施例１のように１．５ｎＭ　ＢＭＰ４に加えて１μＭ　ＰＤ４０７８２４を添加する条件で、浮遊培養開始後６０日間培養して作製した凝集塊を、４％ＰＦＡで固定し、２０％のスクロースで置換後、凍結切片を作製した。これらの凍結切片に関し、マイクロウェーブを用いて抗原賦活化処理を行った後、ＤＡＰＩ、抗ＣＨＸ１０抗体（商品名：Ａｎｔｉ　ＣＨＸ１０　Ａｎｔｉｂｏｄｙ、ＥＸ　ａｌｐｈａ社製）及び抗ＣＲＸ抗体（ＴａＫａＲａ社製）を用いて免疫染色を行った。

　これらの免疫染色された切片を、共焦点蛍光顕微鏡（ライカ社製ＳＰ－８）を用いて観察した。その結果、凝集塊の最も外側の細胞層に黒い色素を持ったＲＰＥ細胞が含まれており、内側に層構造が形成されているＣｈｘ１０陽性の網膜前駆細胞が含まれることが確認された。また、内側に層構造において、ＲＰＥ細胞に近い側にＣｒｘ陽性の視細胞が局在していることも確認された（図９）。

　よって、ＢＭＰ４にＰＤ４０７８２４を添加して作成した凝集塊は視細胞に分化することがわかった。

Claims

　（Ａ）多能性幹細胞を浮遊培養し、多能性幹細胞の細胞凝集体を形成させる工程と、
　（Ｂ）工程（Ａ）で得られた細胞凝集体を、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質及びＣＨＫ１シグナル伝達経路阻害物質の存在下に浮遊培養し、網膜系細胞を含む細胞凝集体を得る工程と
を含む、網膜系細胞又は網膜組織の製造方法。
　工程（Ｂ）において、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質が、真球に近い細胞凝集体が形成され、かつ、網膜色素上皮細胞への分化誘導が抑制されるような濃度で存在する、請求項１に記載の製造方法。
　工程（Ｂ）で得られた細胞凝集体が、網膜色素上皮細胞を含む外側構造と、神経網膜を含む内側構造との複層構造を備えるスフェア状細胞凝集体であり、工程（Ｂ）において、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質が、前記複層構造を備えるスフェア状細胞凝集体が形成されるような濃度で存在している、請求項１に記載の製造方法。
　前記ＣＨＫ１シグナル伝達経路阻害物質がＰＤ４０７８２４である、請求項１～３のいずれか一項に記載の製造方法。
　前記ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質が、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ７及びＧＤＦ７からなる群から選択される１以上のタンパク質である、請求項１～４のいずれか一項に記載の製造方法。
　工程（Ｂ）において、工程（Ａ）の浮遊培養開始後２日目から９日目の間に前記ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質が培地に添加される、請求項１～５のいずれか一項に記載の製造方法。
　工程（Ｂ）において、前記ＣＨＫ１シグナル伝達経路阻害物質が、前記ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質と同時に培地に添加される、請求項１～６のいずれか一項に記載の製造方法。
　前記ＣＨＫ１シグナル伝達経路阻害物質の濃度が、０．１μＭから１０μＭのＰＤ４０７８２４と同程度のＣＨＫ１シグナル伝達経路阻害作用を奏する濃度である、請求項１～７のいずれか一項に記載の製造方法。
　工程（Ｂ）で得られた細胞凝集体から、移植に必要な大きさの網膜組織を切り出す工程をさらに含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の製造方法。
　網膜色素上皮細胞を含む外側構造と、神経網膜を含む内側構造との複層構造を備えるスフェア状細胞凝集体であって、
　（１）前記内側構造における前記神経網膜において、少なくとも視細胞層を含む神経網膜層が形成されており、前記視細胞層は少なくとも視細胞、視細胞前駆細胞及び網膜前駆細胞からなる群から選択される１以上の細胞を含み、
　（２）前記内側構造において、前記神経網膜が折り重なって存在しており、
　（３）前記外側構造における前記網膜色素上皮細胞がＲＰＥ６５陽性細胞、ＭＩＴＦ陽性細胞、又は、ＲＰＥ６５陽性かつＭＩＴＦ陽性細胞であり、かつ
　（４）前記細胞凝集体は、水晶体、硝子体、角膜及び血管を含まない
ことを特徴とするスフェア状細胞凝集体。
　前記スフェア状細胞凝集体の少なくとも一部において、前記網膜色素上皮細胞の基底面が前記内側構造に向き、前記神経網膜の基底面が前記外側構造に向いている、請求項１０に記載のスフェア状細胞凝集体。
　さらに、前記網膜色素上皮細胞と前記神経網膜が上皮構造としてつながっており、前記スフェア状細胞凝集体が、前記網膜色素上皮細胞と前記神経網膜との間に毛様体周縁部様構造体をさらに含む、請求項１０又は１１に記載のスフェア状細胞凝集体。
　前記毛様体周縁部様構造体が、Ｒｄｈ１０陽性細胞、Ｏｔｘ１陽性細胞、及び／又はＺｉｃ１陽性細胞を含む、請求項１２に記載のスフェア状細胞凝集体。
　前記内側構造の３０％以上が神経網膜である、請求項１０～１３のいずれか一項に記載のスフェア状細胞凝集体。
　直径が０．２ｍｍ～２ｍｍである、請求項１０～１４のいずれか一項に記載のスフェア状細胞凝集体。
　（Ａ）多能性幹細胞を浮遊培養し、多能性幹細胞の細胞凝集体を形成させる工程と、
　（Ｂ）工程（Ａ）で得られた細胞凝集体を、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質及びＣＨＫ１シグナル伝達経路阻害物質の存在下に浮遊培養し、網膜色素上皮細胞を含む外側構造と、神経網膜を含む内側構造との複層構造を備えるスフェア状細胞凝集体を得る工程と
を含む、請求項１０～１５のいずれか一項に記載のスフェア状細胞凝集体の製造方法。
　請求項１０～１５のいずれか一項に記載のスフェア状細胞凝集体又はその一部を含む、医薬組成物。
　請求項１０～１５のいずれか一項に記載のスフェア状細胞凝集体又はその一部を、移植を必要とする対象に移植することを含む、網膜系細胞若しくは網膜組織の障害又は網膜組織の損傷に基づく疾患の、治療方法。