JP7150281B2 - 連続的な上皮を含む網膜組織の成熟化方法 - Google Patents

連続的な上皮を含む網膜組織の成熟化方法 Download PDF

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Description

本発明は、連続的な上皮構造を維持可能な網膜組織の培養方法に関するものである。
網膜組織は間脳から発生する多層の上皮構造を持つ神経組織であり、光刺激を電気信号へ変換し、脳内へとシグナルを伝達する。近年、多能性幹細胞から多層の網膜組織を製造する方法（特許文献1及び非特許文献1）が報告された。その他にも、均一な多能性幹細胞の凝集体を、Wntシグナル伝達経路阻害物質を含む無血清培地中で形成させ、これを基底膜標品の存在下において浮遊培養した後、血清培地中で浮遊培養することにより、多層の網膜組織を得る方法（特許文献2及び非特許文献2）、均一な多能性幹細胞の凝集体を、BMP4シグナル伝達経路活性化物質を含む培地中で形成させ、多層の網膜組織を得る方法（特許文献3及び非特許文献3）、接着させた多能性幹細胞を自然に分化させ、その一部に含まれる網膜組織を分離して多層の網膜組織を得る方法（非特許文献4）が知られている。
生体内の網膜組織及び上記の方法で製造された多能性幹細胞由来網膜組織は多層の上皮構造を有するが、いずれの網膜組織もインビトロで長期に培養すると、生体内の正常な網膜組織の構造とは異なる、ロゼット様の構造を異形成し得ることが報告されている（非特許文献3、4及び5）。
一方、連続した上皮構造を維持したまま網膜組織を培養できる長期培養方法として、毛様体周辺部（CMZ）に存在する細胞で発現が報告されているWnt2b（Wnt13ともいう）の存在下で培養する方法が用いられ得る。しかしながら、CMZを含む多能性幹細胞由来網膜組織において連続的な上皮構造を維持できる範囲はCMZの近傍に限られることが知られている（非特許文献3）。このため、連続的な上皮構造を維持したまま、網膜組織を安定的に培養できる長期培養方法が求められていた。
国際公開第2011/055855号 国際公開第2013/077425号 国際公開第2015/025967号
Nature, 472, 51-56 (2011) Cell Stem Cell, 10(6), 771-775 (2012) Nature Communications, 6, 6286-6300 (2015) Nature Communications, 5, 4047-4060 (2014) Curr Eye Res, 8(10), 1083-92 (1989)
本発明が解決しようとする課題は、連続的な上皮構造を維持したまま網膜組織を長期に培養する方法、及びそのための培養液を提供することにある。
本発明者らは、上記課題を解決すべく検討を重ねたところ、網膜組織を、以下の（1）及び（2）の少なくとも一つの特徴：
（1）メチル基供与体、メチル基供与体の基質、又は神経突起伸長抑制剤を一定以上の濃度で含有する、
（2）酸性アミノ酸、抗酸化剤（グルタチオン、カタラーゼ、スーパーオキシドディスムターゼ、アルファトコフェロール、システイン等）、及び抗酸化剤以外の網膜神経細胞保護物質（プロゲステロン等）の濃度が低減されている、
を有する培地中で培養することにより、連続上皮構造が維持され、ロゼット様構造の形成を抑制できることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下に関する：
［1］神経網膜前駆細胞の細胞分化を抑制する濃度のメチル基供与体又はメチル基供与体の基質、及び神経突起伸長を抑制する濃度の神経突起伸長抑制剤を含有する培地中で網膜組織を培養することを含む、網膜組織の連続上皮構造を維持する方法。
［2］メチル基供与体又はメチル基供与体の基質がメチオニンである、［1］に記載の方法。
［3］培地中のメチオニンの濃度が25mg/L以上である［2］に記載の方法。
［4］神経突起伸長抑制剤がグルココルチコイドである、［1］～［3］のいずれかに記載の方法。
［5］グルココルチコイドがコルチコステロンである、［4］に記載の方法。
［6］培地中のコルチコステロンの濃度が1 nM以上である、［5］に記載の方法。
［7］培地中のL-グルタミン酸の濃度が50 μM未満である、［1］～［6］のいずれかに記載の方法。
［8］培地中のL-アスパラギン酸の濃度が50 μM未満である、［7］に記載の方法。
［9］グルタチオン、カタラーゼ、スーパーオキシドディスムターゼ、アルファトコフェロール、及びL-システインからなる群から選択される少なくとも1種の抗酸化剤の培地中の濃度が、以下の濃度範囲内である、［1］～［8］のいずれかに記載の方法：
グルタチオン：100 ng/mL以下
カタラーゼ：100 U/mL以下
スーパーオキシドディスムターゼ：100 U/mL以下
アルファトコフェロール：50 nM以下
システイン：0.26 mM以下。
［10］培地中のプロゲステロン濃度が、100 nM以下である、［1］～［9］のいずれかに記載の方法。
［11］ヒポキサンチン、チミジン及びビタミンB12からなる群から選択される少なくとも1種の核酸合成促進剤の培地中の濃度が、以下の濃度範囲内である、［1］～［10］のいずれかに記載の方法：
ヒポキサンチン：15μM未満、
チミジン：1.5 μM未満、
ビタミンB12：0.68 mg/L（0.5 μM）未満。
［12］培地が、B27サプリメントを配合したNeurobasal培地を、容量比で50%以上含む、［1］～［11］のいずれかに記載の方法。
［13］前記網膜組織が、連続上皮構造を有する網膜組織である、［1］～［12］のいずれかに記載の方法。
［14］前記網膜組織が、培養開始時点において、発生初期又はそれより後の段階にある、［1］～［13］のいずれかに記載の方法。
［15］桿体視細胞前駆細胞が出現するまでの期間、網膜組織を培養する、［14］に記載の方法。
［16］以下の工程を含む、網膜組織の連続上皮構造の維持方法：
（1）網膜前駆細胞を含み、かつ神経節細胞が出現していない分化段階にある網膜組織を、細胞増殖用基礎培地中で、最長視細胞前駆細胞が出現するまでの期間培養する工程、
（2）（1）で得られた網膜組織を、細胞増殖用基礎培地及び連続上皮組織維持用培地を容量比1：1～1：3で混合した培地中で、最長錐体視細胞前駆細胞の出現率が極大となる頃まで培養する工程、及び
（3）（2）で得られた網膜組織を、連続上皮組織維持用培地中で、少なくとも桿体視細胞前駆細胞が出現するまでの期間培養する工程。
［17］神経網膜前駆細胞の細胞分化を抑制する濃度のメチル基供与体又はメチル基供与体の基質、及び神経突起伸長を抑制する濃度の神経突起伸長抑制剤を含有する連続上皮組織維持用培地。
［18］ヒポキサンチン、チミジン及びビタミンB12からなる群から選択される少なくとも1種の核酸合成促進剤の培地中の濃度が、以下の濃度範囲内である、［17］に記載の連続上皮組織維持用培地：
ヒポキサンチン：15μM未満、
チミジン：1.5 μM未満、
ビタミンB12：0.68 mg/L（0.5 μM）未満。
［19］B27サプリメントを配合したNeurobasal培地を、容量として50%以上（例、50%超）含む、Neurobasal培地と細胞増殖用基礎培地の混合培地である網膜組織の連続上皮組織維持用培地。
［20］B27サプリメントを配合したNeurobasal培地を、容量として75%以上含む、［19］に記載の網膜組織の連続上皮組織維持用培地。
［21］細胞増殖用基礎培地が、BME培地、BGJb培地、CMRL 1066培地、Glasgow MEM (GMEM)培地、Improved MEM Zinc Option培地、IMDM培地、Medium 199培地、MEM培地、Eagle MEM培地、αMEM培地、DMEM培地、F-12培地、DMEM/F12培地、IMDM/F12培地、ハム培地、RPMI 1640培地、Fischer’s培地、Leibovitz's L-15培地、またはこれらの混合培地からなる群から選択される1の培地である、［19］又は［20］に記載の網膜組織の連続上皮組織維持用培地。
［22］細胞増殖用基礎培地が、DMEM/F12培地、またはDMEM/F12培地と別の細胞増殖用基礎培地との混合培地である、［19］又は［20］に記載の網膜組織の連続上皮組織維持用培地。
［23］以下の工程を含む、網膜組織の連続上皮構造の維持方法：
（1）網膜前駆細胞を含み、かつ神経節細胞が出現していない分化段階にある網膜組織を、細胞増殖用基礎培地中で、30日間以下（好ましくは3～20日、より好ましくは3～15日間）培養する工程、
（2）（1）で得られた網膜組織を、細胞増殖用基礎培地及び連続上皮組織維持用培地を容量比1：1～1：3で混合した培地中で、50日間以下（好ましくは10～50日間、より好ましくは10～40日間、更により好ましくは20～30日間）培養する工程、及び
（3）（2）で得られた網膜組織を、連続上皮組織維持用培地中で（好ましくは10～80日間）培養する工程。
［24］以下の工程を含む、網膜組織の連続上皮構造の維持方法：
（1）網膜前駆細胞を含み、かつ神経節細胞が出現していない分化段階にある網膜組織を、細胞増殖用基礎培地中で、CRXの発現が認められるまでの期間培養する工程、
（2）（1）で得られた網膜組織を、細胞増殖用基礎培地及び連続上皮組織維持用培地を容量比1：1～1：3で混合した混合培地中で、増殖細胞中のCRX陽性かつRXR-γ陽性細胞の出現率が極大となる頃まで培養する工程、及び
（3）（2）で得られた網膜組織を、連続上皮組織維持用培地中で、少なくともNRLの発現が認められるまでの期間培養する工程。
［25］多能性幹細胞由来の網膜組織を含む凝集体の調製物であって、
網膜組織の表面の少なくとも８０％以上において視細胞又はその前駆細胞が連続して存在する網膜組織を含む凝集体、および
[17]～[22]のいずれかに記載の連続上皮組織維持用培地
を含む、前記調製物。
［26］前記網膜組織の表面に存在する頂端面の面積が該網膜組織の表面の面積に対し少なくとも８０％以上である、[25]に記載の網膜組織を含む凝集体の調製物。
[27]前記網膜組織の長軸方向の直径が０．６ｍｍ以上である、[25]または[26]に記載の網膜組織を含む凝集体の調製物。
本発明によれば、連続的な上皮構造を維持した網膜組織を製造することが可能となる。
網膜組織を含む細胞凝集体から切り出した網膜組織の写真である。（a）及び（b）：浮遊培養開始後35日目に細胞凝集体から切り出した網膜組織。（c）及び（d）：浮遊培養開始後42日目の網膜組織。（d）はCRX::Venus発現を示す。 培養方法［A］～［C］により培養した網膜組織における上皮構造の比較を示す。（a）、（e）及び（i）：aPKC、（b）及び（f）：RX、（c）、（g）及び（k）：CRX::Venus、（j）：CHX10、（d）、（h）及び（l）：DAPI。 各条件で培養した際の連続上皮率の比較を示す。添加した物質をグラフ中のバー下側に「＋」で示した。 各条件で培養した際の連続上皮率の比較を示す。添加した物質をグラフ中のバー下側に「＋」で示した。 各条件で培養した際の連続上皮率の比較を示す。添加した物質をグラフ中のバー下側に「＋」で示した。 連続的な上皮を含む網膜組織の成熟化培養方法により浮遊培養され、浮遊培養開始後192日目まで維持された網膜組織中の連続的な上皮構造を示す。 浮遊培養開始後42日目、72日目、100日目および130日目の網膜組織を含む凝集体の写真である。 浮遊培養開始後73日目における網膜組織を含む凝集体の写真である。 各日数培養した後の網膜組織を含む凝集体の画像について、Image Jを用いて測定した網膜組織の長軸方向の直径の平均値を示す。
1．定義
本明細書において、「幹細胞」とは、細胞分裂を経ても同じ分化能を維持する、増殖能（特に自己複製能）を有する未分化な細胞を意味する。幹細胞には、分化能力に応じて、多能性幹細胞（pluripotent stem cell）、複能性幹細胞（multipotent stem cell）、単能性幹細胞（unipotent stem cell）等の亜集団が含まれる。多能性幹細胞とは、インビトロにおいて培養することが可能で、かつ、三胚葉（外胚葉、中胚葉、内胚葉）に属する細胞系列すべてに分化し得る能力（分化多能性（pluripotency））を有する幹細胞をいう。複能性幹細胞とは、全ての種類ではないが、複数種の組織や細胞へ分化し得る能力を有する幹細胞を意味する。単能性幹細胞とは、特定の組織や細胞へ分化し得る能力を有する幹細胞を意味する。
多能性幹細胞は、受精卵、クローン胚、生殖幹細胞、組織内幹細胞等から誘導することができる。多能性幹細胞としては、胚性幹細胞（ES細胞：Embryonic stem cell）、EG細胞(Embryonic germ cell)、人工多能性幹細胞（iPS細胞：induced pluripotent stem cell）等を挙げることが出来る。
胚性幹細胞は、1981年に初めて樹立され、1989年以降ノックアウトマウス作製にも応用されている。1998年にはヒト胚性幹細胞が樹立されており、再生医学にも利用されつつある。ES細胞は、内部細胞塊をフィーダー細胞上又はLIFを含む培地中で培養することにより製造することが出来る。ES細胞の製造方法は、例えば、WO96/22362、WO02/101057、US5,843,780、US6,200,806、US6,280,718等に記載されている。胚性幹細胞は、所定の機関より入手でき、また、市販品を購入することもできる。例えば、ヒト胚性幹細胞であるKhES-1、KhES-2及びKhES-3は、京都大学再生医科学研究所より入手可能である。いずれもマウス胚性幹細胞である、EB5細胞は国立研究開発法人理化学研究所より、D3株はATCCより、入手可能である。
ES細胞の一つである核移植ES細胞（ntES細胞）は、細胞株を取り除いた卵子に体細胞の細胞核を移植して作ったクローン胚から樹立することができる。
本発明における「人工多能性幹細胞」（iPS細胞ともいう）とは、体細胞を、公知の方法等により初期化（reprogramming）することにより、多能性を誘導した細胞である。具体的には、線維芽細胞や末梢血単核球等分化した体細胞をOct3/4、Sox2、Klf4、Myc（c-Myc、N-Myc、L-Myc）、Glis1、Nanog、Sall4、lin28、Esrrb等を含む初期化遺伝子群から選ばれる複数の遺伝子の組合せのいずれかの発現により初期化して多分化能を誘導した細胞が挙げられる。好ましい、初期化因子の組み合わせとしては、（1）Oct3/4、Sox2、Klf4、及びMyc(c-Myc又はL-Myc)、（2）Oct3/4、Sox2、Klf4、Lin28及びL-Myc（Stem Cells,2013;31:458-466）等を挙げることができる。
人工多能性幹細胞は、2006年、山中らによりマウス細胞で樹立された（Cell, 2006, 126(4) pp.663-676）。人工多能性幹細胞は、2007年にヒト線維芽細胞でも樹立され、胚性幹細胞と同様に多能性と自己複製能を有する（Cell, 2007, 131(5) pp.861-872；Science, 2007, 318(5858) pp.1917-1920；Nat. Biotechnol., 2008, 26(1) pp.101-106）。人工多能性幹細胞の誘導方法についてはその後も様々な改良が行われている（例えば、マウスiPS細胞：Cell. 2006 Aug 25;126(4):663-76、ヒトiPS細胞： Cell. 2007 Nov 30;131(5):861-72）。
遺伝子発現による直接初期化で人工多能性幹細胞を製造する方法以外に、化合物の添加などにより体細胞より人工多能性幹細胞を誘導することもできる（Science, 2013, 341 pp. 651-654）。
また、株化された人工多能性幹細胞を入手する事も可能であり、例えば、京都大学で樹立された201B7細胞、201B7-Ff細胞、253G1細胞、253G4細胞、1201C1細胞、1205D1細胞、1210B2細胞、1231A3細胞、Ff-I01細胞、QHJI01細胞等のヒト人工多能性細胞株が、国立大学法人京都大学より入手可能である。
人工多能性幹細胞を製造する際に用いられる体細胞としては、特に限定は無いが、組織由来の線維芽細胞、血球系細胞（例えば、末梢血単核球やT細胞）、肝細胞、膵臓細胞、腸上皮細胞、平滑筋細胞等が挙げられる。線維芽細胞としては、真皮由来のもの等が挙げられる。
人工多能性幹細胞を製造する際に、数種類の遺伝子の発現により初期化する場合、遺伝子を発現させるための手段は特に限定されない。前記手段としては、ウイルスベクター（例えば、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、センダイウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター）を用いた感染法、プラスミドベクター（例えば、プラスミドベクター、エピソーマルベクター）を用いた遺伝子導入法（例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、レトロネクチン法、エレクトロポレーション法）、RNAベクターを用いた遺伝子導入法（例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法）、タンパク質の直接注入法等が挙げられる。
本発明に用いられる多能性幹細胞は、好ましくはES細胞又は人工多能性幹細胞であり、より好ましくは人工多能性幹細胞（iPS細胞）である。
本発明に用いる多能性幹細胞は、好ましくは霊長類（例、ヒト、サル）の多能性幹細胞であり、好ましくはヒト多能性幹細胞である。従って、本発明に用いる多能性幹細胞は、好ましくはヒトES細胞又はヒト人工多能性幹細胞（ヒトiPS細胞）であり、最も好ましくは、ヒト人工多能性幹細胞（ヒトiPS細胞）である。
遺伝子改変された多能性幹細胞は、例えば、相同組換え技術を用いることにより作製できる。改変される染色体上の遺伝子としては、例えば、細胞マーカー遺伝子、組織適合性抗原の遺伝子、網膜細胞の障害に基づく疾患関連遺伝子などがあげられる。染色体上の標的遺伝子の改変は、Manipulating the Mouse Embryo，A Laboratory Manual，Second Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press（1994）；Gene Targeting，A Practical Approach，IRL Press at Oxford University Press（1993）；バイオマニュアルシリーズ8，ジーンターゲッティング，ES細胞を用いた変異マウスの作製，羊土社（1995）；等に記載の方法を用いて行うことができる。
具体的には、例えば、改変する標的遺伝子（例えば、細胞マーカー遺伝子、組織適合性抗原の遺伝子や疾患関連遺伝子など）を含むゲノムDNAを単離し、単離されたゲノムDNAを用いて標的遺伝子を相同組換えするためのターゲットベクターを作製する。作製されたターゲットベクターを幹細胞に導入し、標的遺伝子とターゲットベクターの間で相同組換えを起こした細胞を選択することにより、染色体上の遺伝子が改変された幹細胞を作製することができる。
標的遺伝子を含むゲノムDNAを単離する方法としては、Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Second Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press（1989）やCurrent Protocols in Molecular Biology，John Wiley ＆ Sons（1987－1997）等に記載された公知の方法があげられる。ゲノムDNAライブラリースクリーニングシステム（Genome Systems製）やUniversal GenomeWalker Kits（CLONTECH製）などを用いることにより、標的遺伝子を含むゲノムDNAを単離することもできる。ゲノムDNAの代わりに、標的蛋白質をコードするポリヌクレオチドを用いることもできる。当該ポリヌクレオチドは、PCR法で該当するポリヌクレオチドを増幅することにより取得することができる。
標的遺伝子を相同組換えするためのターゲットベクターの作製、及び相同組換え体の効率的な選別は、Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press(1993)；バイオマニュアルシリーズ8，ジーンターゲッティング，ES細胞を用いた変異マウスの作製，羊土社（1995）；等に記載の方法にしたがって行うことができる。ターゲットベクターは、リプレースメント型又はインサーション型のいずれでも用いることができる。選別方法としては、ポジティブ選択、プロモーター選択、ネガティブ選択、又はポリA選択などの方法を用いることができる。
選別した細胞株の中から目的とする相同組換え体を選択する方法としては、ゲノムDNAに対するサザンハイブリダイゼーション法やPCR法等があげられる。
本発明における「浮遊培養」あるいは「浮遊培養法」とは、細胞または細胞凝集体が培養液に浮遊して存在する状態を維持しつつ培養すること、及び当該培養を行う方法を言う。すなわち浮遊培養は、細胞または細胞凝集体を培養器材等に接着させない条件で行われ、培養器材等に接着させる条件で行われる培養（接着培養、あるいは、接着培養法）は、浮遊培養の範疇に含まれない。この場合、細胞が接着するとは、細胞または細胞凝集体と培養器材の間に、強固な細胞－基質間結合（cell-substratum junction）ができることをいう。より詳細には、浮遊培養とは、細胞または細胞凝集体と培養器材等との間に強固な細胞－基質間結合を作らせない条件での培養をいい、「接着培養」とは、細胞または細胞凝集体と培養器材等との間に強固な細胞－基質間結合を作らせる条件での培養をいう。
浮遊培養中の細胞凝集体では、細胞と細胞が面接着する。浮遊培養中の細胞凝集体では、細胞－基質間結合が培養器材等との間にはほとんど形成されないか、あるいは、形成されていてもその寄与が小さい。一部の態様では、浮遊培養中の細胞凝集体では、内在の細胞－基質間結合が凝集塊の内部に存在するが、細胞－基質間結合が培養器材等との間にはほとんど形成されないか、あるいは、形成されていてもその寄与が小さい。かかる観点から、「浮遊培養」の一形態には、細胞凝集体を、細胞凝集体の足場となる細い針状の器材等に固定し、培養液が満たされた器材の中で培養する培養方法等も挙げられる。当該培養方法としては、日本薬学会 第136年会 29AB-pm009で発表された、株式会社サイフューズ製バイオ3Dプリンタ「レジェノバ(登録商標)」を使用する方法等が挙げられる。
細胞と細胞が面接着(plane attachment）するとは、細胞と細胞が面で接着することをいう。より詳細には、細胞と細胞が面接着するとは、ある細胞の表面積のうち別の細胞の表面と接着している割合が、例えば、1％以上、好ましくは3％以上、より好ましくは5％以上であることをいう。細胞の表面は、膜を染色する試薬（例えばDiI）による染色や、細胞接着因子（例えば、E-cadherinやN-cadherin）の免疫染色により、観察できる。
浮遊培養を行う際に用いられる培養器は、「浮遊培養する」ことが可能なものであれば特に限定されず、当業者であれば適宜決定することが可能である。このような培養器としては、例えば、フラスコ、組織培養用フラスコ、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マイクロポア、マルチプレート、マルチウェルプレート、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、スピナーフラスコ又はローラーボトルが挙げられる。これらの培養器は、浮遊培養を可能とするために、細胞非接着性であることが好ましい。細胞非接着性の培養器としては、培養器の表面が、細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理（例えば、基底膜標品、ラミニン、エンタクチン、コラーゲン、ゼラチン等の細胞外マトリクス等、又は、ポリリジン、ポリオルニチン等の高分子等によるコーティング処理、又は、正電荷処理等の表面加工）されていないものなどを使用できる。細胞非接着性の培養器としては、培養器の表面が、細胞との接着性を低下させる目的で人工的に処理（例えば、MPCポリマー等の超親水性処理、タンパク低吸着処理等）されたものなどを使用できる。スピナーフラスコやローラーボトル等を用いて回転培養してもよい。培養器の培養面は、平底でもよいし、凹凸があってもよい。
一方、接着培養を行う際に用いられる培養器としては、培養器の表面が、細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理（例えば、基底膜標品、ラミニン、エンタクチン、コラーゲン、ゼラチン、マトリゲル、シンセマックス、ビトロネクチン等の細胞外マトリクス等、又は、ポリリジン、ポリオルニチン等の高分子等によるコーティング処理、又は、正電荷処理等の表面加工）されたものが挙げられる。
本明細書において、細胞の凝集体（Aggregate）〔又は細胞凝集体（Cell aggregate）〕とは、複数の細胞同士が接着して塊を形成しているものであれば特に限定はなく、培地中に分散していた細胞が集合して形成された細胞凝集体であっても、細胞培養により形成されたコロニー由来であっても、別の細胞凝集体から新たに出芽、形成される細胞凝集体であってもよい。細胞凝集体には、胚様体（Embryoid body）、スフェア（Sphere）又はスフェロイド（Spheroid）も包含される。好ましくは、細胞凝集体において、細胞同士は面接着している。一部の態様において、凝集体の一部分あるいは全部において、細胞同士が細胞－細胞間結合（cell-cell junction）又は、細胞接着（cell adhesion）、例えば接着結合(adherence junction)、を形成している場合がある。細胞凝集体には、前記細胞凝集体から得られる派生物質としての細胞集団も含まれる。
「均一な凝集体」とは、複数の凝集体を培養する際に各凝集体の大きさが一定であることを意味し、凝集体の大きさを最大径の長さで評価する場合、均一な凝集体とは、最大径の分散が小さいことを意味する。より具体的には、凝集体の集団全体のうちの75％以上の凝集体が、当該凝集体の集団における最大径の平均値±100％、好ましくは平均値±50％の範囲内、より好ましくは平均値±20％の範囲内であることを意味する。
「均一な凝集体を形成させる」とは、細胞を集合させて細胞凝集体を形成させ浮遊培養する際に、「一定数の分散した細胞を迅速に凝集」させることで大きさが均一な細胞凝集体を形成させることをいう。すなわち、多能性幹細胞を迅速に集合させて多能性幹細胞の凝集体を形成させると、形成された凝集体から分化誘導される細胞において上皮様構造を再現性よく形成させることができる。
当該凝集体を形成させる実験的な操作としては、例えば、ウェルの小さなプレート（例えば、ウェルの底面積が平底換算で0.1～2.0 cm2程度のプレート；96ウェルプレート）やマイクロポアなどを用いて小さいスペースに細胞を閉じ込める方法、小さな遠心チューブを用いて短時間遠心することにより細胞を凝集させる方法などが挙げられる。
ウェルの小さなプレートとして、例えば24ウェルプレート（面積が平底換算で1.88 cm2程度）、48ウェルプレート（面積が平底換算で1.0 cm2程度）、96ウェルプレート（面積が平底換算で0.35 cm2程度、内径6～8 mm程度）、384ウェルプレートが挙げられる。好ましくは、96ウェルプレートが挙げられる。ウェルの小さなプレートの形状として、ウェルを上から見たときの底面の形状としては、多角形、長方形、楕円、真円が挙げられ、好ましくは真円が挙げられる。ウェルの小さなプレートの形状として、ウェルを横から見たときの底面の形状としては、外周部が高く内凹部が低くくぼんだ構造が好ましく、例えば、U底、V底、μ底が挙げられ、好ましくはU底またはV底、最も好ましくはV底が挙げられる。ウェルの小さなプレートとして、細胞培養皿（例えば、60 mm～150 mmディッシュ、カルチャーフラスコ）の底面に凹凸、又は、くぼみがあるもの（例えばEZSPHERE（旭テクノグラス））を用いてもよい。ウェルの小さなプレートの底面は、細胞非接着性の底面、好ましくは前記細胞非接着性コートした底面を用いるのが好ましい。
「分散」とは、細胞や組織を酵素処理や物理処理等の分散処理により、小さな細胞片（2細胞以上100細胞以下、好ましくは50細胞以下）又は単一細胞まで分離させることをいう。一定数の分散した細胞とは、細胞片又は単一細胞を一定数集めたもののことをいう。多能性幹細胞を分散させる方法としては、例えば、機械的分散処理、細胞分散液処理、細胞保護剤添加処理が挙げられる。これらの処理を組み合わせて行ってもよい。好ましくは、細胞分散液処理を行い、次いで機械的分散処理をするとよい。機械的分散処理の方法としては、ピペッティング処理又はスクレーパーでの掻き取り操作が挙げられる。
本明細書における「組織」とは、形態や性質が異なる複数種類の細胞が一定のパターンで立体的に配置した構造を有する細胞集団の構造体をさす。
本明細書における「網膜組織」とは、生体網膜において各網膜層を構成する視細胞、水平細胞、双極細胞、アマクリン細胞、網膜神経節細胞、これらの前駆細胞、または網膜前駆細胞などの網膜細胞が、少なくとも複数種類、層状で立体的に配列した組織を意味する。それぞれの細胞がいずれの網膜層を構成する細胞であるかは、公知の方法、例えば細胞マーカーの発現の有無若しくはその程度等により確認できる。
本明細書における「網膜組織」としては、多能性幹細胞を分化誘導することにより得られる網膜組織、又は生体由来網膜組織が挙げられる。具体的には、多能性幹細胞から形成される凝集体を適切な分化誘導条件で浮遊培養することにより得られる、前記凝集体の表面に形成された網膜前駆細胞及び／又は神経網膜前駆細胞等を含む上皮組織を挙げることができる。
本明細書における「網膜組織を含む細胞凝集体」とは、前記網膜組織を含む細胞凝集体であれば特に限定はない。
本明細書における「網膜層」とは、網膜を構成する各層を意味し、具体的には、網膜色素上皮層及び神経網膜層が挙げられ、神経網膜層には外境界膜、視細胞層（外顆粒層）、外網状層、内顆粒層、内網状層、神経節細胞層、神経線維層および内境界膜が含まれる。
本明細書における「網膜前駆細胞（retinal progenitor cell）」とは、視細胞、水平細胞、双極細胞、アマクリン細胞、網膜神経節細胞、網膜色素上皮細胞、ミューラー細胞を含む、網膜組織を構成するいずれの成熟な網膜細胞にも分化しうる前駆細胞をいう。
本明細書における「神経網膜前駆細胞（neural retinal progenitor）」とは、眼杯（optic cup）の内層となる運命の細胞であって、網膜色素上皮を含まない神経網膜層(網膜層特異的神経細胞を含む網膜層)を構成するいずれの成熟な細胞にも分化しうる前駆細胞を挙げることができる。
視細胞前駆細胞、水平細胞前駆細胞、双極細胞前駆細胞、アマクリン細胞前駆細胞、網膜神経節細胞前駆細胞、網膜色素上皮前駆細胞とは、それぞれ、視細胞、水平細胞、双極細胞、アマクリン細胞、網膜神経節細胞、網膜色素上皮細胞への分化が決定付けられている前駆細胞をいう。
本明細書における「網膜層特異的神経細胞」とは、網膜層を構成する細胞であって網膜層に特異的な神経細胞を意味する。網膜層特異的神経細胞としては、双極細胞、網膜神経節細胞、アマクリン細胞、水平細胞、視細胞が挙げられ、視細胞としては、桿体視細胞（Rod cell）及び錐体視細胞（Cone cell）を挙げることができる。
本明細書における「網膜細胞」には、上述の網膜色素上皮細胞、ミューラー細胞、視細胞、水平細胞、双極細胞、アマクリン細胞、網膜神経節細胞及びこれらの前駆細胞、網膜前駆細胞、神経網膜前駆細胞、並びに網膜層特異的神経細胞及び網膜層特異的神経細胞の前駆細胞が包含される。
上述の網膜組織を構成する細胞は、それぞれに発現するもしくは発現しない網膜細胞マーカーを指標として検出もしくは同定することができる。
網膜細胞マーカーとしては、網膜前駆細胞で発現するRx（Raxとも言う）、PAX6及び神経網膜前駆細胞で発現するRx、PAX6、Chx10、視床下部ニューロンの前駆細胞では発現するが網膜前駆細胞では発現しないNkx2.1、視床下部神経上皮で発現し網膜では発現しないSox1、視細胞の前駆細胞で発現するCrx、Blimp1などが挙げられる。
網膜層特異的神経細胞のマーカーとしては、双極細胞で発現するChx10、PKCα、Goα、VSX1及びL7、網膜神経節細胞で発現するTuJ1及びBrn3、アマクリン細胞で発現するCalretinin及びHPC-1、水平細胞で発現するCalbindin、視細胞及び視細胞前駆細胞で発現するRecoverin、桿体細胞で発現するRhodopsin、桿体視細胞及び桿体視細胞前駆細胞で発現するNrl、錐体視細胞で発現するS-opsin及びLM-opsin、錐体細胞、錐体視細胞前駆細胞及び神経節細胞で発現するRXR-γ、錐体視細胞のうち、分化初期に出現する錐体視細胞またはその前駆細胞で発現するTRβ2、OTX2及びOC2、水平細胞、アマクリン細胞及び神経節細胞で共通して発現するPax6、網膜色素上皮細胞で発現するRPE65及びMitf、ミューラー細胞で発現するCRABPなどが挙げられる。
本明細書において、背側マーカーとしては、背側で発現するTBX5、TBX3、TBX2、COUP-TF II、CYP26A1、CYP26C1などが挙げられ、腹側マーカーとしては、腹側で発現するVAX2、COUP-TF Iなどが挙げられる。
本明細書における「無血清培地」とは、無調整又は未精製の血清を含まない培地を意味する。本明細書では、精製された血液由来成分や動物組織由来成分（例えば、増殖因子）が混入している培地も、無調整又は未精製の血清を含まない限り無血清培地に含まれる。
本明細書における「無血清条件」とは、無調整又は未精製の血清を含まない条件、具体的には、無血清培地を使用する条件を意味する。
ここで無血清培地は、血清代替物を含有していてもよい。血清代替物としては、例えば、アルブミン、トランスフェリン、脂肪酸、コラーゲン前駆体、微量元素、2-メルカプトエタノール又は3’チオールグリセロール、あるいはこれらの均等物などを適宜含有するものを挙げることができる。かかる血清代替物は、例えば、WO98/30679に記載の方法により調製することができる。血清代替物として市販品を利用してもよい。かかる市販の血清代替物としては、例えば、KnockoutTM Serum Replacement（Life Technologies社製：以下、KSRと記すこともある。）、Chemically-defined Lipid concentrated（Life Technologies社製）、GlutamaxTM（Life Technologies社製）、B27（Life Technologies社製）、N2（Life Technologies社製）が挙げられる。
また、無血清培地は、適宜、脂肪酸又は脂質、アミノ酸（例えば、非必須アミノ酸）、ビタミン、増殖因子、サイトカイン、抗酸化剤、2-メルカプトエタノール、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類等を含有してもよい。
調製の煩雑さを回避するために、かかる無血清培地として、市販のKSR（ライフテクノロジー（Life Technologies）社製）を適量（例えば、約0.5％から約30％、好ましくは約1％から約20％）添加した無血清培地（例えば、F-12培地とIMDM培地の1：1混合液に10％ KSR及び450μM 1-モノチオグリセロールを添加した培地）を使用してもよい。また、KSR同等品として特表2001-508302に開示された培地が挙げられる。
本明細書における「血清培地」とは、無調整又は未精製の血清を含む培地を意味する。当該培地は、脂肪酸又は脂質、アミノ酸（例えば、非必須アミノ酸）、ビタミン、増殖因子、サイトカイン、抗酸化剤、2-メルカプトエタノール、1-モノチオグリセロール、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類等を含有してもよい。また、本発明により製造された網膜細胞又は網膜組織を維持する工程において、血清培地を使用することができる（Cell Stem Cell, 10(6), 771-775 (2012)）。
前記無血清培地又は血清培地に、既知の増殖因子、タンパク質、増殖を促進する添加剤や化学物質等を添加してもよい。既知の増殖因子、タンパク質としては、EGF、FGF、IGF、insulin等を挙げることができる。増殖を促進する添加剤として、N2 supplement（N2, Invitrogen社）、B27 supplement（Invitrogen社）等を挙げることができる。増殖を促進する化学物質としては、レチノイド類（例えば、レチノイン酸またはその誘導体）、タウリン、グルタミン等を挙げることができる。
本明細書において、「ゼノフリー」とは、培養対象の細胞の生物種とは異なる生物種由来の成分が排除された条件を意味する。
本明細書において、「物質Xを含む培地」及び「物質Xの存在下」とは、外来性（exogenous）の物質Xが添加された培地または外来性の物質Xを含む培地、又は外来性の物質Xの存在下を意味する。すなわち、当該培地中に存在する細胞または組織が当該物質Xを内在的（endogenous）に発現、分泌もしくは産生する場合、内在的な物質Xは外来性の物質Xとは区別され、外来性の物質Xを含んでいない培地は内在的な物質Xを含んでいても「物質Xを含む培地」の範疇には該当しないと解する。
例えば、「メチル基供与体の基質を含む培地」とは、外来性のメチル基供与体の基質が添加された培地または外来性のメチル基供与体の基質を含む培地であり、「メチル基供与体の基質の存在下」とは、外来性のメチル基供与体の基質の存在下を意味する。
従って、本発明の方法について「物質Xを含む培地」又は「物質Xの存在下」と記載する場合、本発明の方法は、培地中又は系内に外来性の物質Xを添加する工程を含み得る。
2．発生初期段階の網膜組織の製造
本明細書において使用する発生初期段階の網膜組織は、特に限定はなく、多層の網膜組織を含む細胞凝集体であり、網膜組織がロゼット様異形成を生じる前のものであればよい。例えば、生体由来網膜組織や以下の原料製造方法で製造可能な多能性幹細胞由来の網膜組織や、生体由来の神経網膜前駆細胞などを分離した後に再凝集させて作製した多層の網膜組織などが挙げられる。
本明細書において、「発生初期段階」とは、網膜前駆細胞は出現しているが、神経節細胞が出現していない段階を意味する。ここで、神経網膜前駆細胞が出現していてもよい。すなわち、当該段階においては、RX（RAX）陽性及びPAX6陽性（更にCHX10陽性細胞であってもよい）の細胞が含まれ、TUJ1陽性細胞及びBRN3陽性細胞は含まれない。「発生初期段階の網膜組織」は網膜前駆細胞及び／又は神経網膜前駆細胞、すなわち視細胞及び神経節細胞に分化し得る細胞が含まれ、神経節細胞が含まれていなければ特に制限はなく、毛様体周縁部構造体を含んでいてもよい。
発生初期段階の網膜組織は、例えば後述する原料製造方法5～7（BMP-揺り戻し法）に準じて製造する場合には浮遊培養開始後22日目（d22）～33日目（d33）に相当し、原料製造方法1～4（BMP法）に準じて製造する場合には、浮遊培養開始後12日目（d12）～27日目（d27）に相当する。
「発生初期段階の網膜組織」は、網膜前駆細胞マーカー、神経網膜前駆細胞マーカー及び神経節細胞マーカーの発現状況を確認することにより同定することができる。
発生初期段階の網膜組織には、「眼胞」に相当するもの、又は眼胞からやや分化が進行した、RX陽性、PAX6陽性及びCHX10陽性である神経網膜前駆細胞を含みかつ神経節細胞が存在しない「眼杯の最初期」の網膜組織が包含される。
本発明で使用される出発物質となる発生初期段階の網膜組織をヒトiPS細胞等の多能性幹細胞から製造する方法について説明する。
ヒトiPS細胞等の多能性幹細胞は、上述のとおり当業者に周知の方法で入手又は製造し、維持培養及び拡大培養に付すことができる。多能性幹細胞の維持培養・拡大培養は浮遊培養でも接着培養でも実施することができるが、好ましくは接着培養で実施される。多能性幹細胞の維持培養・拡大培養は、フィーダー細胞存在下で実施してもよいしフィーダー細胞非存在下で実施してもよいが、好ましくはフィーダー細胞非存在下で実施される。
維持培養された多能性幹細胞を用いて、当業者に周知の方法で、発生初期段階の網膜組織を製造することができる。発生初期段階の網膜組織を製造する方法に特に限定はなく、また、浮遊培養・接着培養のどちらの培養方法であってもよい。当該方法としては、WO2013/077425 (& US2014/341864)、WO2015/025967 (& US2016/251616)、WO2016/063985（& US2017/313976）、WO2016/063986（& US2017/313981）及びWO2017/183732に記載された方法等を挙げることができる。また、当該方法として非特許文献：Proc Natl Acad Sci U S A. 111(23): 8518-8523（2014）、Nat Commun. 5:4047（2014）、Stem Cells. [Epub ahead of print]（2017）；doi: 10.1002/stem.2586.等に記載された方法等を挙げることができる。
2-1. 原料製造方法1
発生初期段階の網膜組織を製造する好ましい一態様として、以下の工程を含む方法が挙げられる：
（1）多能性幹細胞を無血清培地中で浮遊培養することにより細胞凝集体を形成させる第一工程、
（2）第一工程で形成された凝集体を、SHHシグナル伝達経路作用物質を含まずBMPシグナル伝達経路作用物質を含む無血清培地又は血清培地中で浮遊培養し、網膜前駆細胞または神経網膜前駆細胞を含む凝集体を得る第二工程。
当該方法で得られる網膜前駆細胞または神経網膜前駆細胞を含む凝集体は、本発明の方法で使用される出発物質となる発生初期段階の網膜組織として用いることができる。
〔第一工程について〕
第一工程はWO2015/025967 (& US2014/341864)に記載の方法に準じて行うことができる。すなわち、第一工程では、多能性幹細胞を無血清培地中で浮遊培養することにより細胞凝集体を形成させる。
第一工程において用いられる無血清培地は、上述したようなものである限り特に限定されない。例えば、BMPシグナル伝達経路作用物質及びWntシグナル伝達経路阻害物質がいずれも添加されていない無血清培地を使用することができる。調製の煩雑さを回避するには、例えば、市販のKSR等の血清代替物を適量添加した無血清培地（例えば、IMDMとF-12の1:1の混合液に10％KSR、450μM 1-モノチオグリセロール及び1x Chemically Defined Lipid Concentrateが添加された培地）を使用することが好ましい。血清代替物として、無血清培地に、牛血清アルブミン（BSA）を0.1 mg/mL - 20 mg/mL、好ましくは4 mg/mL - 6 mg/mL程度の濃度で添加することもできる。また、無血清培地へのKSRの添加量としては、例えばヒトES細胞もしくはヒトiPS細胞の場合は、通常約1％から約20％であり、好ましくは約2％から約20％である。
第一工程における培養温度、CO2濃度等の培養条件は適宜設定できる。培養温度は、例えば約30℃から約40℃、好ましくは約37℃である。CO2濃度は、例えば約1％から約10％、好ましくは約5％である。
第一工程において用いられ得る多能性幹細胞の濃度は、多能性幹細胞の凝集体をより均一に、効率的に形成させるように適宜設定することができる。例えば96ウェルプレートを用いてヒトES細胞を浮遊培養する場合、1ウェルあたり約1×103～約1×105細胞、好ましくは約3×103～約5×104細胞、より好ましくは約5×103～約3×104細胞、最も好ましくは約0.9×104～1.2×104細胞となるように調製した液をウェルに添加し、プレートを静置して凝集体を形成させる。
凝集体を形成させるために必要な浮遊培養の時間は、用いる多能性幹細胞によって適宜決定可能であるが、均一な凝集体を形成するためにはできる限り短時間であることが望ましい。分散された細胞が、細胞凝集体が形成されるに至るまでの工程は、細胞が集合する工程、及び集合した細胞が細胞凝集体を形成する工程に分けられる。分散された細胞を播種する時点（すなわち浮遊培養開始時）から細胞凝集体が形成されるまでの時間は、例えば、ヒト多能性幹細胞（例、ヒトiPS細胞、ヒトES細胞）の場合には、好ましくは約72時間以内、より好ましくは約48時間以内、更に好ましくは24時間以内、より更に好ましくは12時間以内である。この凝集体形成までの時間は、細胞を凝集させる用具や、遠心条件などを調整することにより適宜調節することが可能である。
細胞凝集体が形成されたことは、凝集体のサイズおよび細胞数、巨視的形態、組織染色解析による微視的形態およびその均一性、分化および未分化マーカーの発現およびその均一性、分化マーカーの発現制御およびその同期性、分化効率の凝集体間の再現性などに基づき判断することが可能である。
〔第二工程について〕
前記第一工程で形成された凝集体を、SHHシグナル伝達経路作用物質を含まずBMPシグナル伝達経路作用物質を含む無血清培地又は血清培地中で浮遊培養し、発生初期段階の網膜組織として網膜前駆細胞または神経網膜前駆細胞を含む凝集体を得る第二工程について説明する。
第二工程において用いられる培地は、例えば、SHHシグナル伝達経路作用物質が添加されておらずBMPシグナル伝達経路作用物質が添加された無血清培地又は血清培地であり、基底膜標品を添加する必要は無い。
かかる培地に用いられる無血清培地又は血清培地は、上述したようなものである限り特に限定されない。調製の煩雑さを回避するには、例えば、市販のKSR等の血清代替物を適量添加した無血清培地（例えば、IMDMとF-12の1:1の混合液に10% KSR、450 μM 1-モノチオグリセロール及び1x Chemically Defined Lipid Concentrateが添加された培地）を使用することが好ましい。血清代替物として、無血清培地に、BSAを0.1 mg/mL - 20mg/mL、好ましくは4 mg/mL - 6 mg/mL程度の濃度で添加することもできる。また、無血清培地へのKSRの添加量としては、例えばヒトES細胞の場合は、通常約1%から約20%であり、好ましくは約2%から約20%である。
第二工程で用いられる無血清培地は、第一工程で用いた無血清培地がSHHシグナル伝達経路作用物質を含まない限り、当該培地をそのまま用いることもできるし、新たな無血清培地に置き換えることもできる。第一工程で用いた、BMPシグナル伝達経路物質を含まない無血清培地をそのまま第二工程に用いる場合、BMPシグナル伝達経路作用物質を培地中に添加すればよい。
「SHHシグナル伝達経路作用物質を含まない」培地には、SHHシグナル伝達経路作用物質を実質的に含まない培地、例えば、網膜前駆細胞及び網膜組織への選択的分化に不利な影響を与える程度の濃度のSHHシグナル伝達経路作用物質を含有しない培地が含まれる。
「SHHシグナル伝達経路作用物質が添加されていない」培地には、SHHシグナル伝達経路作用物質が実質的に添加されていない培地、例えば、網膜前駆細胞及び網膜組織への選択的分化に不利な影響を与える程度の濃度のSHHシグナル伝達経路作用物質が添加されていない培地、も含まれる。
第二工程で用いられるBMPシグナル伝達経路作用物質としては、例えばBMP2、BMP4もしくはBMP7等のBMP蛋白、GDF7等のGDF蛋白、抗BMP受容体抗体、又は、BMP部分ペプチドなどが挙げられる。BMP2、BMP4及びBMP7は例えばR&D Systemsから、GDF7は例えば和光純薬から入手可能である。BMPシグナル伝達経路作用物質として、好ましくはBMP4を挙げることができる。
第二工程で用いられるBMPシグナル伝達経路作用物質の濃度は、前記第一工程で得られた凝集体に含まれる細胞の、網膜細胞への分化を誘導可能な濃度であればよい。例えばBMP4の場合は、約0.01 nM～約1 μM、好ましくは約0.1 nM～約100 nM、より好ましくは約1 nM～約10 nM、更に好ましくは約1.5 nM (55 ng/mL）の濃度となるように培地に添加する。BMP4以外のBMPシグナル伝達経路作用物質を用いる場合には、上記BMP4の濃度と同等のBMPシグナル伝達経路活性化作用を奏する濃度で用いられることが望ましい。
BMPシグナル伝達経路作用物質は、第一工程の浮遊培養開始から約24時間後以降に添加されていればよく、第一工程の浮遊培養開始後数日以内（例えば、15日以内）に培地に添加してもよい。好ましくは、BMPシグナル伝達経路作用物質は、浮遊培養開始後1～15日目、より好ましくは1～9日目、更に好ましくは2～9日目、更に好ましくは3～8日目、より更に好ましくは3～6日目、最も好ましくは6日目に培地に添加する。
BMPシグナル伝達経路作用物質が培地に添加され、第一工程で得られた凝集体に含まれる細胞の網膜細胞への分化誘導が開始された後は、更にBMPシグナル伝達経路作用物質を培地に添加する必要は無く、BMPシグナル伝達経路作用物質を含まない無血清培地又は血清培地を用いて培地交換を行ってよい。
あるいは、培地中のBMPシグナル伝達経路作用物質の濃度は、第二工程の期間中変動させてもよい。例えば、第二工程の開始時において、BMPシグナル伝達経路作用物質を上記範囲とし、2～4日につき、40～60％減の割合で、徐々に又は段階的に該濃度を低下させてもよい。
具体的な態様として、浮遊培養開始後（すなわち前記第一工程の開始後）1～9日目、好ましくは2～9日目、更に好ましくは3～8日目、より更に好ましくは3～6日目に、培地の一部又は全部をBMP4を含む培地に交換し、BMP4の終濃度を約1～10 nMに調整し、BMP4の存在下で例えば1～16日間、好ましくは、2～9日間、更に好ましくは6～9日間培養することができる。また、より長期間、具体的には20日以上、30日以上培養することも可能である。すなわち、第二工程において、BMPシグナル伝達経路作用物質の存在下で行われる培養は、第一工程で得られた凝集体が発生初期段階の網膜組織へと分化誘導されるまでの期間適宜続けられ、具体的には、BMPシグナル伝達経路作用物質を添加後6～12日間で発生初期段階の網膜組織を得ることができる。
ここにおいて、BMP4の濃度を同一濃度に維持すべく、1もしくは2回程度培地の一部又は全部をBMP4を含む培地に交換することができる。又は前述のとおり、BMP4の濃度を段階的に減じることもできる。
一態様において、BMPシグナル伝達経路作用物質を含む培地での培養を開始後、BMPシグナル伝達経路作用物質を含まない無血清培地又は血清培地による培地交換により、培地中のBMPシグナル伝達経路作用物質の濃度を、2～4日につき、40～60％減の割合で、徐々に又は段階的に低下させることができる。
発生初期段階の網膜組織へと分化誘導されたことは、例えば、該組織中の細胞における網膜前駆細胞マーカーや神経網膜前駆細胞マーカーの発現を検出することにより確認することができる。GFP等の蛍光レポータータンパク質遺伝子がRX遺伝子座へノックインされた多能性幹細胞を用いて第一工程により形成された凝集体を、網膜細胞への分化誘導に必要な濃度のBMPシグナル伝達経路作用物質の存在下に浮遊培養し、発現した蛍光レポータータンパク質から発せられる蛍光を検出することにより、網膜細胞への分化誘導が開始された時期を確認することもできる。
第二工程の実施態様の一つとして、第一工程で形成された凝集体を、網膜前駆細胞マーカーや神経網膜前駆細胞マーカー（例、RX、PAX6、CHX10）を発現する細胞が出現し始めるまでの間、網膜細胞への分化誘導に必要な濃度のBMPシグナル伝達経路作用物質を含みSHHシグナル伝達経路作用物質を含まない無血清培地又は血清培地中で浮遊培養し、発生初期段階の網膜組織として網膜前駆細胞または神経網膜前駆細胞を含む凝集体を得る工程、を挙げることができる。
第二工程において、培地交換操作を行う場合、例えば、元ある培地を捨てずに新しい培地を加える操作（培地添加操作）、元ある培地を半量程度（元ある培地の体積量の40～80％程度）捨てて新しい培地を半量程度（元ある培地の体積量の40～80％）加える操作（半量培地交換操作）、元ある培地を全量程度（元ある培地の体積量の90％以上）捨てて新しい培地を全量程度（元ある培地の体積量の90％以上）加える操作（全量培地交換操作）が挙げられる。
ある時点で特定の成分（例えば、BMP4）を添加する場合、例えば、終濃度を計算した上で、元ある培地を半量程度捨てて、特定の成分を終濃度よりも高い濃度（具体的には終濃度の1.5～3.0倍、例えば終濃度の約2倍の濃度）で含む新しい培地を半量程度加える操作（半量培地交換操作、半量培地交換）を行ってもよい。
ある時点で、元の培地に含まれる特定の成分の濃度を維持する場合、例えば元ある培地を半量程度捨てて、元の培地に含まれる濃度と同じ濃度の特定の成分を含む新しい培地を半量程度加える操作を行ってもよい。
ある時点で、元の培地に含まれる成分を希釈して濃度を下げる場合、例えば、培地交換操作を、1日に複数回、好ましくは1時間以内に複数回（例えば2～3回）行ってもよい。また、ある時点で、元の培地に含まれる成分を希釈して濃度を下げる場合、細胞または凝集体を別の培養容器に移してもよい。
培地交換操作に用いる道具は特に限定されないが、例えば、ピペッター、マイクロピペット、マルチチャネルマイクロピペット、連続分注器、などが挙げられる。例えば、培養容器として96ウェルプレートを用いる場合、マルチチャネルマイクロピペットを使ってもよい。
好ましい態様において、第二工程で用いられる培地中のSHHシグナル伝達経路作用物質の濃度は、SAGのSHHシグナル伝達促進活性に換算して700 nM以下、好ましくは300 nM以下、より好ましくは10 nM以下、更に好ましくは0.1 nM以下の濃度である。すなわち、SAGの場合、700 nM以下、好ましくは300 nM以下、より好ましくは10 nM以下、更に好ましくは0.1 nM以下であり、SAG以外のSHHシグナル伝達経路作用物質の場合、上述の濃度のSAGが示すSHHシグナル伝達促進活性と同等のSHHシグナル伝達促進活性を示す濃度以下である。更に好ましくは、SHHシグナル伝達経路作用物質を含まない。「SHHシグナル伝達経路作用物質を含まない」培地には、SHHシグナル伝達経路作用物質を実質的に含まない培地、例えば、網膜前駆細胞及び網膜組織への選択的分化に不利な影響を与える程度の濃度のSHHシグナル伝達経路作用物質を含有しない培地も含まれる。「SHHシグナル伝達経路作用物質が添加されていない」培地には、SHHシグナル伝達経路作用物質が実質的に添加されていない培地、例えば、網膜前駆細胞及び網膜組織への選択的分化に不利な影響を与える程度の濃度のSHHシグナル伝達経路作用物質が添加されていない培地も含まれる。
第二工程における培養温度、CO2濃度等の培養条件は適宜設定できる。培養温度は、例えば約30℃から約40℃、好ましくは約37℃である。またCO2濃度は、例えば約1%から約10%、好ましくは約5%である。
かかる培養により、第一工程で得られた凝集体を形成する細胞から発生初期段階の網膜組織への分化が誘導され得る。発生初期段階の網膜組織として、網膜前駆細胞または神経網膜前駆細胞を含む凝集体が得られたことは、例えば、網膜前駆細胞のマーカーであるRX、PAX6、又は神経網膜前駆細胞のマーカーであるRX、PAX6、CHX10を発現する細胞が凝集体に含まれていることを検出することにより確認することができる。
第二工程の実施態様の一つとして、第一工程で形成された凝集体を、RX遺伝子を発現する細胞が出現し始めるまでの間、網膜細胞への分化誘導に必要な濃度のBMPシグナル伝達経路作用物質を含む無血清培地又は血清培地中で浮遊培養し、網膜前駆細胞または神経網膜前駆細胞を含む凝集体を得る工程、を挙げることができる。一態様において、凝集体に含まれる細胞の20％以上（好ましくは、30％以上、40％以上、50％以上、60％以上、80%以上）が、RXを発現する状態となるまで、第二工程の培養が実施される。
上記の方法で得られた凝集体は、SHHシグナル伝達経路作用物質、BMPシグナル伝達経路作用物質及びWntシグナル伝達経路作用物質のいずれをも含まない無血清培地又は血清培地中で浮遊培養した後に本発明の製造方法の原料となる発生初期段階の網膜組織として使用することができる。該浮遊培養の期間は神経節細胞が出現する迄の期間であれば特に限定されないが、例えば1日～50日間、好ましくは1日～15日間、より好ましくは1日～7日間が挙げられる。 前記浮遊培養において用いられる培地は、例えば、SHHシグナル伝達経路作用物質、BMPシグナル伝達経路作用物質及びWntシグナル伝達経路作用物質のいずれもが添加されていない無血清培地又は血清培地である。
「SHHシグナル伝達経路作用物質、BMPシグナル伝達経路作用物質及びWntシグナル伝達経路作用物質のいずれをも含まない」培地には、SHHシグナル伝達経路作用物質、BMPシグナル伝達経路作用物質及びWntシグナル伝達経路作用物質のいずれをも実質的に含まない培地、例えば、網膜組織への選択的分化に不利な影響を与える程度の濃度のSHHシグナル伝達経路作用物質、BMPシグナル伝達経路作用物質及びWntシグナル伝達経路作用物質を含有しない培地、も含まれる。
「SHHシグナル伝達経路作用物質、BMPシグナル伝達経路作用物質及びWntシグナル伝達経路作用物質のいずれもが添加されていない」培地には、SHHシグナル伝達経路作用物質、BMPシグナル伝達経路作用物質及びWntシグナル伝達経路作用物質のいずれもが実質的に添加されていない培地、例えば、網膜組織への選択的分化に不利な影響を与える程度の濃度のSHHシグナル伝達経路作用物質、BMPシグナル伝達経路作用物質及びWntシグナル伝達経路作用物質が添加されていない培地、も含まれる。
かかる培地に用いられる無血清培地又は血清培地は、上述したようなものである限り特に限定されない。調製の煩雑さを回避するには、例えば、市販のKSR等の血清代替物を適量添加した無血清培地（例えば、IMDMとF-12の1:1の混合液に10%KSR、450 μM 1-モノチオグリセロール及び1x Chemically Defined Lipid Concentrateが添加された培地）を使用することが好ましい。無血清培地には、牛血清アルブミン（BSA）を0.1 mg/mL - 20 mg/mL、好ましくは4 mg/mL - 6 mg/mLで添加することもできる。また、無血清培地へのKSRの添加量としては、例えばヒトES細胞の場合は、通常約1%から約20%であり、好ましくは約2%から約20％である。また、血清培地調製の煩雑さを回避するには、市販の血清を適量添加した血清培地（例えば、DMEMとF-12の1:1の混合液に血清、N2 supplementが添加された培地）を使用することがより好ましい。血清培地への血清の添加量としては、例えばヒトES細胞の場合は、通常約1%から約20%であり、好ましくは約2%から約20%である。上記培地にはいずれもタウリン等を添加して用いてもよい。
培養温度、CO2濃度、O2濃度等の培養条件は適宜設定できる。培養温度は、例えば約30℃から約40℃、好ましくは約37℃である。CO2濃度は、例えば約1%から約10%、好ましくは約5%である。O2濃度は、約5%以上、例えば約20%から約70%、好ましくは約20%から約60%、より好ましくは約20%から約40%、特に好ましくは約20%である。
上記のとおり、原料製造方法1で得られる網膜組織が、発生初期段階、すなわち、網膜前駆細胞又は神経網膜前駆細胞を含み、かつ神経節細胞が出現していない発生初期の分化段階にあることは、RX及びPAX6等の網膜前駆細胞マーカー、CHX10、RX及びPAX6等の神経網膜前駆細胞マーカー、Brn3等の神経節細胞マーカーの少なくとも1つの発現状況を測定することにより同定することができる。すなわち、網膜前駆細胞マーカー及び／又は神経網膜前駆細胞マーカーを発現する細胞が網膜組織に含まれる全細胞のうち30％以上、好ましくは50％以上、より好ましくは80％以上含み、かつ神経節細胞マーカーを発現している細胞が網膜組織に含まれる細胞のうち40％以下、好ましくは20％以下、10％以下、5％以下、1%以下、更に好ましくは0.1％以下、更により好ましくは0.01％以下である分化段階であることを確認することができる。この時、腹側マーカー及び／又は最も背側のマーカー（例：ALDH1A3及び／又はALDH1A1）の発現については問題とならない。
2-2. 原料製造方法2
発生初期段階の網膜組織を製造する好ましい一態様として、以下の工程を含む方法が挙げられる：
（1）多能性幹細胞を、フィーダー細胞非存在下で、1）TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及び／又はSHHシグナル伝達経路作用物質、並びに2）未分化維持因子を含む培地で培養する第一工程、
（2）第一工程で得られた細胞を浮遊培養し、細胞凝集体を形成させる第二工程、及び
（3）第二工程で得られた凝集体を、BMPシグナル伝達経路作用物質の存在下に浮遊培養し、網膜前駆細胞または神経網膜前駆細胞を含む凝集体を得る第三工程。
当該方法で得られる網膜前駆細胞または神経網膜前駆細胞を含む凝集体は、発生初期段階の網膜組織として本発明の方法で使用される出発物質として用いることができる。
〔第一工程について〕
第一工程はWO2016/063985に記載の方法に準じて行うことができる。すなわち、第一工程におけるフィーダー細胞非存在下（以下、フィーダーフリーとも称する）とは、フィーダー細胞を実質的に含まない（例えば、全細胞数に対するフィーダー細胞数の割合が3%以下）の条件を意味する。好ましくは、フィーダー細胞を含まない条件において第一工程が実施される。第一工程において用いられる培地は、フィーダーフリー条件下で、多能性幹細胞の未分化維持培養を可能にする培地（フィーダーフリー培地）であれば、特に限定されないが、好適には、未分化維持培養を可能にするため、未分化維持因子を含む。
未分化維持因子は、多能性幹細胞の分化を抑制する作用を有する物質であれば特に限定はない。当業者に汎用されている未分化維持因子としては、FGFシグナル伝達経路作用物質、TGFβファミリーシグナル伝達経路作用物質、insulin等を挙げることができる。FGFシグナル伝達経路作用物質として具体的には、線維芽細胞増殖因子（例えば、bFGF、FGF4やFGF8）が挙げられる。また、TGFβファミリーシグナル伝達経路作用物質としては、TGFβシグナル伝達経路作用物質、Nodal/Activinシグナル伝達経路作用物質が挙げられる。TGFβシグナル伝達経路作用物質としては、例えばTGFβ1、TGFβ2が挙げられる。Nodal/Activinシグナル伝達経路作用物質としては、例えばNodal、ActivinA、ActivinBが挙げられる。ヒト多能性幹細胞（ヒトES細胞、ヒトiPS細胞）を培養する場合、第一工程における培地は、好ましくは未分化維持因子として、bFGFを含む。
本発明に用いる未分化維持因子は、哺乳動物由来の未分化維持因子であれば特に限定はないが、好適には培養する細胞と同一種の哺乳動物の未分化維持因子が用いられる。例えば、ヒト多能性幹細胞の培養には、ヒト未分化維持因子（例、bFGF、FGF4、FGF8、EGF、Nodal、ActivinA、ActivinB、TGFβ1、TGFβ2等）が用いられ、単離された未分化維持因子を外来性（又は外因性）に添加することができる。あるいは、第一工程に用いる培地に予め未分化維持因子が添加されていてもよい。
第一工程において用いられる培地中の未分化維持因子濃度は、培養する多能性幹細胞の未分化状態を維持可能な濃度であり、当業者であれば、適宜設定することができる。例えば、具体的には、フィーダー細胞非存在下で未分化維持因子としてbFGFを用いる場合、その濃度は、通常4 ng～500 ng/mL程度、好ましくは10 ng～200 ng/mL程度、より好ましくは30 ng～150 ng/mL程度である。
未分化維持因子を含み、多能性幹細胞を培養するために使用可能なフィーダーフリー培地として、多くの合成培地が開発・市販されており、例えばEssential 8培地（Life Technologies社製）が挙げられる。Essential 8培地は、DMEM/F12培地に、添加剤として、L-ascorbic acid-2-phosphate magnesium (64 mg/L), sodium selenium(14 μg/L), insulin(19.4 mg/L), NaHCO3(543 mg/L), transferrin (10.7 mg/L), bFGF (100 ng/mL)、及び、TGFβファミリーシグナル伝達経路作用物質（TGFβ1 (2 ng/mL)またはNodal (100 ng/mL)）を含む（Nature Methods, 8, 424-429 (2011)）。その他市販のフィーダーフリー培地としては、S-medium（DSファーマバイオメディカル社製）、StemPro (Life Technologies社製)、hESF9 （Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2008 Sep 9;105(36):13409-14）、mTeSR1 (STEMCELL Technologies社製)、mTeSR2 (STEMCELL Technologies社製)、TeSR-E8(STEMCELL Technologies社製)、又はStemFit（味の素社製）が挙げられる。上記第一工程ではこれらを用いることにより、簡便に本発明を実施することが出来る。
第一工程における多能性幹細胞の培養は、浮遊培養及び接着培養の何れの条件で行われてもよいが、好ましくは、接着培養により行われる。
接着培養を行う際に用いられる培養器は、「接着培養する」ことが可能なものであれば特に限定されないが、細胞接着性の培養器が好ましい。細胞接着性の培養器としては、培養器の表面が、細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理された培養器が挙げられ、具体的には前述した内部がコーティング剤で被覆された培養器が挙げられる。コーティング剤としては、例えば、ラミニン[ラミニンα5β1γ1（以下、ラミニン511）、ラミニンα1β1γ1（以下、ラミニン111）等及びラミニン断片（ラミニン511E8等）を含む]、エンタクチン、コラーゲン、ゼラチン、ビトロネクチン（Vitronectin）、シンセマックス（コーニング社）、マトリゲル等の細胞外マトリクス等、又は、ポリリジン、ポリオルニチン等の高分子等が挙げられる。また、正電荷処理等の表面加工された培養容器を使用することもできる。好ましくは、ラミニンが挙げられ、より好ましくは、ラミニン511E-8が挙げられる。ラミニン511E-8は、市販品を購入する事ができる(例：iMatrix-511、ニッピ)。
第一工程において用いられる培地は、TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及び／又はSHHシグナル伝達経路作用物質を含む。
TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質とは、TGFβファミリーシグナル伝達経路、すなわちSmadファミリーにより伝達されるシグナル伝達経路を阻害する物質を表し、具体的にはTGFβシグナル伝達経路阻害物質、Nodal/Activinシグナル伝達経路阻害物質及びBMPシグナル伝達経路阻害物質を挙げることができる。
TGFβシグナル伝達経路阻害物質としては、TGFβに起因するシグナル伝達経路を阻害する物質であれば特に限定は無く、核酸、タンパク質、低分子有機化合物のいずれであってもよい。当該物質として例えば、TGFβに直接作用する物質（例えば、タンパク質、抗体、アプタマー等）、TGFβをコードする遺伝子の発現を抑制する物質（例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、siRNA等）、TGFβ受容体とTGFβの結合を阻害する物質、TGFβ受容体によるシグナル伝達に起因する生理活性を阻害する物質（例えば、TGFβ受容体の阻害剤、Smadの阻害剤等）を挙げることができる。TGFβシグナル伝達経路阻害物質として知られているタンパク質として、Lefty等が挙げられる。TGFβシグナル伝達経路阻害物質として、当業者に周知の化合物を使用することができ、具体的には、SB431542、LY-364947、SB-505124、A-83-01等が挙げられる。
Nodal/Activinシグナル伝達経路阻害物質としては、Nodal又はActivinに起因するシグナル伝達経路を阻害する物質であれば特に限定は無く、核酸、タンパク質、低分子有機化合物のいずれであってもよい。当該物質として例えば、NodalもしくはActivinに直接作用する物質（例えば抗体、アプタマー等）、NodalもしくはActivinをコードする遺伝子の発現を抑制する物質（例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、siRNA等）、Nodal/Activin受容体とNodal/Activinの結合を阻害する物質、Nodal/Activin受容体によるシグナル伝達に起因する生理活性を阻害する物質を挙げることができる。Nodal/Activinシグナル伝達経路阻害物質として、当業者に周知の化合物を使用することができ、具体的には、SB431542、A-83-01等が挙げられる。また、Nodal/Activinシグナル伝達経路阻害物質として知られているタンパク質（Lefty、Cerberus等）を使用してもよい。Nodal/Activinシグナル伝達経路阻害物質は、好ましくは、SB431542、A-83-01又はLeftyである。
BMPシグナル伝達経路阻害物質としては、BMPに起因するシグナル伝達経路を阻害する物質であれば特に限定は無く、核酸、タンパク質、低分子有機化合物のいずれであってもよい。ここでBMPとしては、BMP2、BMP4、BMP7及びGDF7が挙げられる。当該物質として例えば、BMPに直接作用する物質（例えば抗体、アプタマー等）、BMPをコードする遺伝子の発現を抑制する物質（例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、siRNA等）、BMP受容体（BMPR）とBMPの結合を阻害する物質、BMP受容体によるシグナル伝達に起因する生理活性を阻害する物質を挙げることができる。BMPRとして、ALK2又はALK3を挙げることができる。BMPシグナル伝達経路阻害物質として、当業者に周知の化合物を使用することができ、具体的には、LDN193189、Dorsomorphin等が挙げられる。また、BMPシグナル伝達経路阻害物質として知られるタンパク質（Chordin、Noggin等）を使用してもよい。BMPシグナル伝達経路阻害物質は、好ましくはLDN193189である。
TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質は、好ましくは、Lefty、SB431542、A-83-01又はLDN193189である。
作用点が異なる複数種類のTGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質を組み合わせて用いても良い。組み合わせることにより、凝集体の質を向上する効果が増強されることが期待される。例えば、TGFβシグナル伝達経路阻害物質とBMPシグナル伝達経路阻害物質との組み合わせ、TGFβシグナル伝達経路阻害物質とNodal/Activinシグナル伝達経路阻害物質との組み合わせ、BMPシグナル伝達経路阻害物質とNodal/Activinシグナル伝達経路阻害物質との組み合わせが挙げられるが、好ましくはTGFβシグナル伝達経路阻害物質がBMPシグナル伝達経路阻害物質と組み合わせて用いられる。具体的な好ましい組み合わせとしては、SB431542とLDN193189との組み合わせが挙げられる。
SHH伝達経路作用物質としては、SHHにより媒介されるシグナル伝達を増強し得る物質であれば特に限定はなく、Hedgehogファミリーに属する蛋白質（例えば、SHHやIhh）、SHH受容体、SHH受容体アゴニスト、PMA又はSAG等が挙げられる。SHHシグナル伝達経路作用物質は、好ましくはSHHタンパク質（Genbankアクセッション番号：NM_000193、NP_000184）、SAG又はPMAである。
TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質とSHHシグナル伝達経路作用物質とを組み合わせて用いても良い。具体的な組み合わせとしては、例えば、Lefty、SB431542、A-83-01及びLDN193189からなる群から選択されるいずれかのTGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質と、SHHタンパク質、SAG及びPMAからなる群から選択されるいずれかのSHHシグナル伝達経路作用物質との組み合わせが挙げられる。TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質とSHHシグナル伝達経路作用物質とを組み合わせて用いる場合、TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質とSHHシグナル伝達経路作用物質の両方を含む培地中で細胞を培養してもよいし、TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及びSHHシグナル伝達経路作用物質のいずれか一方で細胞を処理した後、いずれか一方又は両方で引き続き細胞を処理してもよい。
TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及びSHHシグナル伝達経路作用物質の濃度は、上述の効果を達成可能な範囲で適宜設定することが可能である。例えば、SB431542は、通常0.1 μM～200 μM、好ましくは2 μM ～ 50 μMの濃度で使用される。A-83-01は、通常0.05 μM～50 μM、好ましくは0.5 μM～5 μMの濃度で使用される。LDN193189は、通常1 nM～2000 nM、好ましくは10 nM～300 nMの濃度で使用される。Leftyは、通常5 ng/mL～200 ng/mL、好ましくは10 ng/mL～50 ng/mLの濃度で使用される。SHHタンパク質は、通常20 ng/mL～1000 ng/mL、好ましくは50 ng/mL～300 ng/mLの濃度で使用される。SAGは、通常、1 nM～2000 nM、好ましくは10 nM～700 nM、より好ましくは30～600nMの濃度で使用される。PMAは、通常0.002～20μM、好ましくは0.02μM～2 μMの濃度で使用される。一態様において、TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質は、前記濃度のSB43154と同等のTGFβファミリーシグナル伝達経路阻害活性を有する量で適宜使用することができる。また、一態様において、SHHシグナル伝達経路作用物質は、前記濃度のSAGと同等のSHHシグナル伝達経路活性化作用を奏する濃度で適宜使用することができる。
第一工程において用いられる培地は、血清培地であっても無血清培地であってもよいが、化学的に未決定な成分の混入を回避する観点から、好ましくは、無血清培地である。
第一工程において用いられる培地は、化学的に未決定な成分の混入を回避する観点から、含有成分が化学的に決定された培地であってもよい。
第一工程における多能性幹細胞の培養は、浮遊培養及び接着培養のいずれの条件でおこなわれてもよいが、好ましくは、接着培養により行われる。
第一工程におけるフィーダーフリー条件下での多能性幹細胞の培養においては、フィーダー細胞に代わる足場を多能性幹細胞に提供するため、適切なマトリクスを足場として用いてもよい。足場であるマトリクスにより、表面をコーティングした細胞容器中で、多能性幹細胞を接着培養する。
足場として用いることのできるマトリクスとしては、ラミニン (Nat. Biotechnol. 28,611-615(2010))、ラミニン断片(Nat. Commun. 3, 1236 (2012))、基底膜標品(Nat. Biotechnol. 19, 971-974 (2001))、ゼラチン、コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、エンタクチン又はビトロネクチン（Vitronectin）等が挙げられる。
好ましくは、第一工程におけるフィーダーフリー条件下での多能性幹細胞の培養においては、単離されたラミニン511又はラミニン511のE8フラグメント（更に好ましくは、ラミニン511のE8フラグメント）により、表面をコーティングした細胞容器中で、多能性幹細胞を接着培養する。
第一工程における多能性幹細胞の培養時間は、第二工程において形成される凝集体の質を向上させる効果が達成可能な範囲であれば特に限定されないが、通常0.5～144時間である。第一工程における多能性幹細胞の培養時間は、好ましくは1時間以上、2時間以上、6時間以上、12時間以上、18時間以上、又は24時間以上である。第一工程における多能性幹細胞の培養時間は、好ましくは96時間以内、又は72時間以内である。一態様において、第一工程における多能性幹細胞の培養時間の範囲は、好ましくは2～96時間、より好ましくは6～48時間、更に好ましくは12～48時間、より更に好ましくは18～28時間（例、24時間）である。即ち、第二工程開始の0.5～144時間（好ましくは、18～28時間）前に第一工程を開始し、第一工程を完了した後引き続き第二工程が行われる。更なる態様において、第一工程における多能性幹細胞の培養時間の範囲は、好ましくは18～144時間、24～144時間、24～96時間、又は24～72時間である。TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及びSHHシグナル伝達経路作用物質のいずれか一方で細胞を処理した後、他方で引き続き細胞を処理する場合、それぞれの処理時間が、上述の培養時間の範囲内となるようにすることができる。
第一工程における培養温度、CO2濃度等の培養条件は適宜設定できる。培養温度は、例えば約30℃から約40℃、好ましくは約37℃である。またCO2濃度は、例えば約1％から約10％、好ましくは約5％である。
好ましい態様において、第一工程により得られる細胞は多能性様性質（pluripotent-like state）が維持された細胞であり、第一工程を通じて多能性様性質が維持される。多能性様性質とは、多能性を含む、多能性幹細胞に共通する多能性幹細胞に特有の形質の少なくとも一部を維持している状態を意味する。多能性様性質には厳密な多能性は要求されない。具体的には、多能性性質（pluripotent state）の指標となるマーカーの全て又は一部を発現している状態が、「多能性様性質」に含まれる。多能性様性質のマーカーとしては、Oct3/4陽性、アルカリフォスファターゼ陽性などが挙げられる。一態様において、多能性様性質が維持された細胞は、Oct3/4陽性である。Nanogの発現量がES細胞もしくはiPS細胞に比べて低い場合であっても「多能性様性質を示す細胞」に該当する。
一態様において、第一工程により得られる細胞は、少なくとも網膜組織、網膜細胞、網膜前駆細胞及び網膜層特異的神経細胞へ分化する能力を有する幹細胞である。
好ましい態様において、ヒト多能性幹細胞（例、iPS細胞）を、フィーダー細胞非存在下で、TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及び／又はSHHシグナル伝達経路作用物質、並びにbFGFを含有する無血清培地で、接着培養する。
上記の当該接着培養は、好ましくは、ラミニン511又はラミニン511のE8フラグメントで表面をコーティングした細胞容器中で実施される。TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質は、好ましくはTGFβシグナル伝達経路阻害物質（例、SB431542、A-83-01、Lefty）、Nodal/Activinシグナル伝達経路阻害物質（例、Lefty、SB431542、A-83-01）、BMPシグナル伝達経路阻害物質（例、LDN193189、Chordin、Noggin）、又はこの組み合わせ（例、SB431542及びLDN193189）である。TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質は、更に好ましくはLefty、SB431542、A-83-01、又はLDN193189、又はこの組み合わせ（例、SB431542及びLDN193189）である。SHHシグナル伝達経路作用物質は、好ましくはSHHタンパク質、SAG又はPurmorphamine(PMA)、より好ましくはSAGである。TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質（例、Lefty、SB431542、A-83-01、LDN193189）とSHHシグナル伝達経路作用物質（例、SHHタンパク質、SAG、PMA）とを組み合わせて用いてもよい。培養時間は、0.5～144時間（好ましくは、18～144時間、24～144時間、24～96時間、又は24～72時間（例えば、18～28時間））である。
例えば、ヒト多能性幹細胞（例、ヒトiPS細胞）を、フィーダー細胞不在下で、bFGFを含む無血清培地中で維持培養する。当該維持培養は、好ましくは接着培養により行われる。当該接着培養は、好ましくは、ビトロネクチン、ラミニン511又はラミニン511のE8フラグメントで表面をコーティングした細胞容器中で実施される。そして、この培養中へTGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及び／又はSHHシグナル伝達経路作用物質を添加し、培養を継続する。TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質は、好ましくはTGFβシグナル伝達経路阻害物質（例、SB431542、A-83-01、Lefty）、Nodal/Activinシグナル伝達経路阻害物質（例、SB431542、A-83-01、Lefty）、BMPシグナル伝達経路阻害物質（例、LDN193189）、又はこの組み合わせ（例、SB431542及びLDN193189）である。TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質は、更に好ましくはLefty、SB431542、A-83-01、又はLDN193189、又はこの組み合わせ（例、SB431542及びLDN193189）である。SHHシグナル伝達経路作用物質は、好ましくはSHHタンパク質、SAG又はPMAである。TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質（例、Lefty、SB431542、A-83-01、LDN193189）とSHHシグナル伝達経路作用物質（例、SHHタンパク質、SAG、PMA）とを組み合わせて用いてもよい。添加後、0.5～144時間（好ましくは、18～144時間、24～144時間、24～96時間、又は24～72時間（例えば、18～28時間））培養を継続する。
〔第二工程について〕
第一工程で得られた細胞を培地中で浮遊培養することにより細胞凝集体を形成させる第二工程について説明する。
第二工程において用いられる培地は血清含有培地又は無血清培地であり得る。化学的に未決定な成分の混入を回避する観点から、本明細書においては、無血清培地が好適に用いられる。例えば、BMPシグナル伝達経路作用物質及びWntシグナル伝達経路阻害物質がいずれも添加されていない無血清培地を使用することができる。調製の煩雑さを回避するには、例えば、市販のKSR等の血清代替物を適量添加した無血清培地（例えば、IMDMとF-12の1：1の混合液に10％ KSR、450μM 1-モノチオグリセロール及び1 x Chemically Defined Lipid Concentrateが添加された培地、又は、GMEMに5％～20％KSR、NEAA、ピルビン酸、2-メルカプトエタノールが添加された培地）を使用することが好ましい。無血清培地へのKSRの添加量としては、例えばヒト多能性幹細胞の場合は、通常約1％から約30％であり、好ましくは約2％から約20％である。
凝集体の形成に際しては、まず、第一工程で得られた細胞の分散操作により、分散された細胞を調製する。分散操作により得られた「分散された細胞」とは、例えば7割以上が単一細胞であり2～50細胞の塊が3割以下存在する状態が挙げられる。分散された細胞として、好ましくは、8割以上が単一細胞であり、2～50細胞の塊が2割以下存在する状態が挙げられる。分散された細胞とは、細胞同士の接着（例えば面接着）がほとんどなくなった状態が挙げられる。
第一工程で得られた細胞の分散操作は、前述した、機械的分散処理、細胞分散液処理、細胞保護剤処理を含んでよい。これらの処理を組み合わせて行ってもよい。好ましくは、細胞保護剤処理と同時に、細胞分散液処理を行い、次いで機械的分散処理をするとよい。
細胞保護剤処理に用いられる細胞保護剤としては、FGFシグナル伝達経路作用物質（例、bFGF、FGF4やFGF8等の線維芽細胞増殖因子）、ヘパリン、IGFシグナル伝達経路作用物質（例、インスリン）、血清、又は血清代替物を挙げることができる。また、分散により誘導される多能性幹細胞（特に、ヒト多能性幹細胞）の細胞死を抑制するための細胞保護剤として、Rho-associated coiled-coilキナーゼ（ROCK）の阻害剤又はMyosinの阻害剤を添加してもよい。分散により誘導される多能性幹細胞（特に、ヒト多能性幹細胞）の細胞死を抑制し、細胞を保護するために、ROCKの阻害剤又はMyosinの阻害剤を第二工程培養開始時から添加してもよい。ROCK阻害剤としては、Y-27632、Fasudil（HA1077）、H-1152等を挙げることができる。Myosinの阻害剤としてはBlebbistatinを挙げることができる。
細胞分散液処理に用いられる細胞分散液としては、トリプシン、コラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼ、エラスターゼ、プロナーゼ、DNase又はパパイン等の酵素類や、エチレンジアミン四酢酸等のキレート剤のいずれかを含む溶液を挙げることができる。市販の細胞分散液、例えば、TrypLE Select (Life Technologies社製)やTrypLE Express (Life Technologies社製)を用いることもできる。
機械的分散処理の方法としては、ピペッティング処理又はスクレーパーでの掻き取り操作が挙げられる。
分散された細胞は上記培地中に懸濁される。
そして、分散された細胞の懸濁液を、上記培養器中に播き、分散させた細胞を、培養器に対して、非接着性の条件下で培養することにより、複数の細胞を集合させて凝集体を形成する。この際、分散された細胞を、10 cmディッシュのような、比較的大きな培養器に播種することにより、1つの培養器中に複数の細胞の凝集塊を同時に形成させてもよいが、こうすると凝集塊ごとの大きさにばらつきが生じる。そこで、例えば、96ウェルプレートのようなマルチウェルプレート（U底、V底）の各ウェルに一定数の分散された幹細胞を入れて、これを静置培養すると、細胞が迅速に凝集することにより、各ウェルにおいて1個の凝集体が形成される。この凝集体を複数のウェルから回収することにより、均一な凝集体の集団を得ることができる。
第二工程における細胞の濃度は、細胞凝集体をより均一に、効率的に形成させるように適宜設定することができる。例えば96ウェルプレートを用いてヒト細胞（例、第一工程においてヒトiPS細胞から得られた細胞）を浮遊培養する場合、1ウェルあたり約1 x 103から約1 x 105細胞、好ましくは約3 x 103から約5 x 104細胞、より好ましくは約4 x 103から約2 x 104細胞、更に好ましくは、約4 x 103から約1.6 x 104細胞、より更に好ましくは約8 x 103から約1.2 x 104細胞となるように調製した液をウェルに添加し、プレートを静置して凝集体を形成させる。
第二工程における培養温度、CO2濃度等の培養条件は適宜設定できる。培養温度は、例えば約30℃から約40℃、好ましくは約37℃である。CO2濃度は、例えば約1％から約10％、好ましくは約5％である。
第二工程において、培地交換操作を行う場合、例えば、元ある培地を捨てずに新しい培地を加える操作（培地添加操作）、元ある培地を半量程度（元ある培地の体積量の30～90％程度、例えば40～60％程度）捨てて新しい培地を半量程度（元ある培地の体積量の30～90％、例えば40～60％程度）加える操作（半量培地交換操作）、元ある培地を全量程度（元ある培地の体積量の90％以上）捨てて新しい培地を全量程度（元ある培地の体積量の90％以上）加える操作（全量培地交換操作）が挙げられる。
培地交換操作に用いる道具は特に限定されないが、例えば、ピペッター、マイクロピペット、マルチチャンネルマイクロピペット、連続分注器、などが挙げられる。例えば、培養容器として96ウェルプレートを用いる場合、マルチチャンネルマイクロピペットを使ってもよい。
細胞凝集体を形成させるために必要な浮遊培養の時間は、細胞を均一に凝集させるように、用いる細胞によって適宜決定可能であるが、均一な細胞凝集体を形成するためにはできる限り短時間であることが望ましい。分散された細胞が、細胞凝集体が形成されるに至るまでの工程は、細胞が集合する工程、及び集合した細胞が細胞凝集体を形成する工程にわけられる。分散された細胞を播種する時点（すなわち浮遊培養開始時）から細胞が集合するまでは、例えば、ヒト細胞（例、第一工程においてヒトiPS細胞から得られた幹細胞）の場合には、好ましくは約24時間以内、より好ましくは約12時間以内に集合した細胞を形成させる。分散された細胞を播種する時点（すなわち浮遊培養開始時）から細胞凝集体が形成されるまでの時間は、例えば、ヒト多能性幹細胞（例、ヒトiPS細胞）の場合には、好ましくは約72時間以内、より好ましくは約48時間以内である。この凝集体形成までの時間は、細胞を凝集させる用具や、遠心分離条件などを調整することにより適宜調節することが可能である。
細胞凝集体が形成されたこと、及びその均一性は、凝集体のサイズおよび細胞数、巨視的形態、組織染色解析による微視的形態およびその均一性、分化および未分化マーカーの発現およびその均一性、分化マーカーの発現制御およびその同期性、分化効率の凝集体間の再現性などに基づき判断することが可能である。
凝集体が形成された後、そのまま、凝集体の培養を継続してもよい。第二工程における浮遊培養は、通常BMPシグナル伝達経路作用物質が添加されるまで継続されればよく、具体的には、通常12時間～6日間、好ましくは12時間～48時間程度が挙げられる。
第二工程において用いられる培地の一態様として、SHHシグナル伝達経路作用物質を含む培地が挙げられる。第一工程において、多能性幹細胞をTGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及び／又はSHHシグナル伝達経路作用物質で処理し、第二工程において、第一工程で得られた細胞をSHHシグナル伝達経路作用物質を含む培地（好適には無血清培地）中で浮遊培養に付して凝集体を形成させることにより、凝集体の質が、更に向上し、網膜組織への分化能力が高まる。この質の高い凝集体を用いることにより、網膜前駆細胞または神経網膜前駆細胞を含む凝集体を高効率で誘導することができる。
SHHシグナル伝達経路作用物質としては、上述したものを用いることができる。好ましくはSHHシグナル伝達経路作用物質はSHHタンパク質、SAG又はPMAである。培地中のSHHシグナル伝達経路作用物質の濃度は、上述の効果を達成可能な範囲で適宜設定することが可能である。SAGは、通常、1 nM～2000 nM、好ましくは10 nM～700 nM、より好ましくは30 nM～600 nMの濃度で使用される。PMAは通常0.002 μM～20 μM、好ましくは0.02 μM～2 μMの濃度で使用される。SHHタンパク質は通常20 ng/mL～1000 ng/mL、好ましくは50 ng/mL～300 ng/mLの濃度で使用される。SHHタンパク質、SAG、PMA以外のSHHシグナル伝達経路作用物質を用いる場合には、上記SAGの濃度と同等のSHHシグナル伝達経路活性化作用を奏する濃度で用いられることが望ましい。
培地中のSHHシグナル伝達経路作用物質の濃度は、第二工程の期間中変動させてもよい。例えば、第二工程の開始時において、SHHシグナル伝達経路作用物質を上記範囲とし、2～4日間につき、40～60％減の割合で、徐々に又は段階的に該濃度を低下させてもよい。
SHHシグナル伝達経路作用物質を培地に添加するタイミングは、上記効果を達成できる範囲で特に限定されないが、早ければ早い方が効果が高い。SHHシグナル伝達経路作用物質は、第二工程開始から、通常6日以内、好ましくは3日以内、より好ましくは1日以内、更に好ましくは第二工程開始時に、培地に添加される。
好ましい態様において、第一工程で得られたヒト細胞（例、第一工程においてヒトiPS細胞から得られた細胞）を、SHHシグナル伝達経路作用物質（例、SAG、PMA、SHHタンパク質）を含む無血清培地中で浮遊培養に付し、凝集体を形成する。SHHシグナル伝達経路作用物質は、好ましくは、浮遊培養開始時から培地に含まれる。培地には、ROCK阻害物質（例、Y-27632）を添加してもよい。培養時間は12時間～6日間、好ましくは12時間～48時間である。形成される凝集体は、好ましくは均一な凝集体である。
例えば、第一工程で得られたヒト細胞（例、第一工程においてヒトiPS細胞から得られた細胞）を回収し、これを、単一細胞、又はこれに近い状態にまで分散し、SHHシグナル伝達経路作用物質（例、SAG、PMA）を含む無血清培地中で浮遊培養に付す。該無血清培地は、ROCK阻害剤（例、Y-27632）を含んでいても良い。ヒト幹細胞（例、ヒトiPS細胞に由来する幹細胞）の懸濁液を、上述の培養器中に播き、分散させた細胞を、培養器に対して、非接着性の条件下で培養することにより、複数の細胞を集合させて凝集体を形成する。培養時間は12時間～6日間（好ましくは12時間～48時間）である。形成される凝集体は、好ましくは均一な凝集体である。
このようにして、第二工程を実施することにより、第一工程で得られた細胞、又はこれに由来する細胞凝集体が形成される。第二工程で得られる凝集体は、第一工程において、TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及び／又はSHHシグナル伝達経路作用物質で処理しない場合よりも、高い品質を有している。具体的には、丸く、表面が滑らかで、凝集体の内部が密であり、形が崩れていない凝集体の割合に富んだ、凝集体の集団を得ることが出来る。一態様において、第二工程開始から6日目に無作為的に凝集体（例えば、100個以上）を選出した際に、嚢胞化していない凝集体の割合が、例えば70％以上、好ましくは80％以上である。
第二工程で得られる凝集体は、網膜組織へ分化する能力を有する。
好ましい一態様においては、第一工程において、多能性幹細胞をTGFβシグナル伝達経路阻害物質で処理し、かつ、第二工程において、SHHシグナル伝達経路作用物質（例、SAG、PMA、SHHタンパク質）を含む培地で第一工程において得られた細胞の浮遊培養が実施される。ここで好ましくは、TGFβシグナル伝達経路阻害物質としてSB431542又はA-83-01を使用することができる。
また、好ましい一態様においては、第一工程において、多能性幹細胞をBMPシグナル伝達経路阻害物質で処理し、かつ、第二工程において、SHHシグナル伝達経路作用物質（例、SAG、PMA、SHHタンパク質）を含まない培地で第一工程において得られた細胞の浮遊培養が実施される。ここで好ましくは、BMPシグナル伝達経路阻害物質としてLDN193189を使用することができる。
好ましい一態様において、第一工程において、多能性幹細胞（例、ヒト多能性幹細胞）をTGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質（例えば、TGFβシグナル伝達経路阻害物質（例、Lefty、SB431542、A-83-01）、Nodal/Activinシグナル伝達経路阻害物質（例、Lefty、SB431542、A-83-01）、BMPシグナル伝達経路阻害物質（例、LDN193189）、又はこの組み合わせ（例、SB431542及びLDN193189）等）；SHHシグナル伝達経路作用物質（例、SHHタンパク質、SAG、PMA）；又はTGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質（例、Lefty、SB431542、A-83-01、LDN193189）とSHHシグナル伝達経路作用物質（例、SHHタンパク質、SAG、PMA）との組み合わせで処理し、かつ、第二工程において、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質（例、SAG、PMA、SHHタンパク質）を含む培地で第一工程において得られた細胞の浮遊培養が実施される。
別の態様において、第一工程において、多能性幹細胞（例、ヒト多能性幹細胞）をTGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質（例えば、TGFβシグナル伝達経路阻害物質（例、Lefty、SB431542、A-83-01）、Nodal/Activinシグナル伝達経路阻害物質（例、Lefty、SB431542、A-83-01）、BMPシグナル伝達経路阻害物質（例、LDN193189）、又はこの組み合わせ（例、SB431542及びLDN193189）等）；SHHシグナル伝達経路作用物質（例、SHHタンパク質、SAG、PMA）；又はTGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質（例、Lefty、SB431542、A-83-01、LDN193189）とSHHシグナル伝達経路作用物質（例、SHHタンパク質、SAG、PMA）との組み合わせで処理し、かつ、第二工程において、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質（例、SAG、PMA、SHHタンパク質）を含まない培地で第一工程において得られた細胞の浮遊培養が実施される。
いずれの態様においても、第二工程の培地は、好ましくは、ROCK阻害剤（例、Y-27632）を含む。
〔第三工程について〕
第二工程で形成された凝集体を、BMPシグナル伝達経路作用物質の存在下で浮遊培養することにより、網膜前駆細胞または神経網膜前駆細胞を含む凝集体を得ることができる。当該工程は、上述の原料製造方法1における第二工程に準じて製造することができる。
一態様において、第二工程で培地中に添加するSHHシグナル伝達経路作用物質の濃度が比較的低濃度（例えば、SAGについては700 nM以下、他のSHHシグナル伝達経路作用物質については、前記濃度のSAGと同等以下のSHHシグナル伝達経路活性化作用を奏する濃度）の場合、培地交換を行う必要はなく、第二工程で用いた培地にBMPシグナル伝達経路作用物質（例、BMP4）を添加すればよい。一方、SHHシグナル伝達経路作用物質の濃度が比較的高濃度（例えば、SAGについては700 nM超、又は1000 nM以上、他のSHHシグナル伝達経路作用物質については、前記濃度のSAGと同等のSHHシグナル伝達経路活性化作用を奏する濃度）の場合には、BMPシグナル伝達経路作用物質添加時に残存するSHHシグナル伝達経路作用物質の影響を抑制するために、BMPシグナル伝達経路作用物質（例、BMP4）を含む新鮮な培地に交換することが望ましい。
好ましい態様において、第三工程で用いられる培地中のSHHシグナル伝達経路作用物質の濃度は、SAGのSHHシグナル伝達促進活性に換算して700 nM以下、好ましくは300 nM以下、より好ましくは10 nM以下、更に好ましくは0.1 nM以下の濃度である。すなわち、SAGの場合、700 nM以下、好ましくは300 nM以下、より好ましくは10 nM以下、更に好ましくは0.1 nM以下であり、SAG以外のSHHシグナル伝達経路作用物質の場合、上述の濃度のSAGが示すSHHシグナル伝達促進活性と同等のSHHシグナル伝達促進活性を示す濃度以下である。更に好ましくは、SHHシグナル伝達経路作用物質を含まない。「SHHシグナル伝達経路作用物質を含まない」培地には、SHHシグナル伝達経路作用物質を実質的に含まない培地、例えば、網膜前駆細胞及び網膜組織への選択的分化に不利な影響を与える程度の濃度のSHHシグナル伝達経路作用物質を含有しない培地も含まれる。「SHHシグナル伝達経路作用物質が添加されていない」培地には、SHHシグナル伝達経路作用物質が実質的に添加されていない培地、例えば、網膜前駆細胞及び網膜組織への選択的分化に不利な影響を与える程度の濃度のSHHシグナル伝達経路作用物質が添加されていない培地も含まれる。
発生初期段階の網膜組織を製造する上での好ましい態様において、第一工程にて、ヒト多能性幹細胞（例、ヒトiPS細胞）を、フィーダー細胞非存在下で、TGFβシグナル伝達経路阻害物質（例えばSB431542、A-83-01）並びにbFGFを含有する無血清培地で、接着培養し、第二工程にて、細胞をSHHシグナル伝達経路作用物質（例えばSAG、PMA、SHHタンパク質）を含有する無血清培地で浮遊培養し、第三工程にて、凝集体をBMPシグナル伝達経路作用物質（例えばBMP4）を含有する無血清培地で浮遊培養する。
また、発生初期段階の網膜組織を製造する上での好ましい態様において、第一工程にて、ヒト多能性幹細胞（例、ヒトiPS細胞）を、フィーダー細胞非存在下で、BMPシグナル伝達経路阻害物質（例、LDN193189）及びbFGFを含有する無血清培地で、接着培養し、第二工程にて、細胞をSHHシグナル伝達経路作用物質（例えばSAG、PMA）を含有しない又は含有する無血清培地で浮遊培養し、第三工程にて、凝集体をBMPシグナル伝達経路作用物質（例えばBMP4）を含有する無血清培地で浮遊培養する。
発生初期段階の網膜組織を製造する上での好ましい態様において、第一工程にて、ヒト多能性幹細胞（例、ヒトiPS細胞）を、フィーダー細胞非存在下で、SHHシグナル伝達経路作用物質（例えばSAG、PMA）並びにbFGFを含有する無血清培地で、好ましくは1日間以上6日間以下、さらに好ましくは2日～4日間、接着培養し、第二工程にて、細胞をSHHシグナル伝達経路作用物質（例えばSAG、PMA）を含有する無血清培地で浮遊培養し、第三工程にて、凝集体をBMPシグナル伝達経路作用物質（例えばBMP4）を含有する無血清培地で浮遊培養する。
発生初期段階の網膜組織を製造する上での好ましい態様において、第一工程にて、ヒト多能性幹細胞（例、ヒトiPS細胞）を、フィーダー細胞非存在下で、TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質（例えば、TGFβシグナル伝達経路阻害物質（例、Lefty 、SB431542、A-83-01）、Nodal/Activinシグナル伝達経路阻害物質（例、Lefty、SB431542、A-83-01）、BMPシグナル伝達経路阻害物質（例、LDN193189）、又はこの組み合わせ（例、SB431542及びLDN193189）等）；SHHシグナル伝達経路作用物質（例、SHHタンパク質、SAG、PMA）；又はTGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質（例、Lefty、SB431542、A-83-01、LDN193189）とSHHシグナル伝達経路作用物質（例、SHHタンパク質、SAG、PMA）との組み合わせ；並びにbFGFを含有する無血清培地で、接着培養し、第二工程にて、第一工程で得られた細胞を、SHHシグナル伝達経路作用物質（例、SAG、PMA、SHHタンパク質）を含む無血清培地中で浮遊培養し、細胞凝集体を形成させ、第三工程にて、凝集体をBMPシグナル伝達経路作用物質（例えばBMP4）を含有する無血清培地で浮遊培養し、網膜前駆細胞または神経網膜前駆細胞を含む凝集体を得る。
原料製造方法２の第二工程および第三工程は、WO2017/183732に開示された方法で製造することもできる。すなわち、第二工程及び／又は第三工程において、Wntシグナル伝達経路阻害物質をさらに含む培地で浮遊培養し、細胞の凝集体を形成することができる。
第二工程に用いる、Wntシグナル伝達経路阻害物質としては、Wntにより媒介されるシグナル伝達を抑制し得るものである限り特に限定されず、蛋白質、核酸、低分子化合物等のいずれであってもよい。Wntにより媒介されるシグナルは、Frizzled（Fz）及びLRP5/6（low-density lipoprotein receptor-related protein 5/6）のヘテロ二量体として存在するWnt受容体を介して伝達される。Wntシグナル伝達経路阻害物質としては、例えば、Wnt又はWnt受容体に直接作用する物質（抗Wnt中和抗体、抗Wnt受容体中和抗体等）、Wnt又はWnt受容体をコードする遺伝子の発現を抑制する物質（例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、siRNA等）、Wnt受容体とWntの結合を阻害する物質（可溶型Wnt受容体、ドミナントネガティブWnt受容体等、Wntアンタゴニスト、Dkk1、Cerberus蛋白等）、Wnt受容体によるシグナル伝達に起因する生理活性を阻害する物質[CKI-7（N-(2-アミノエチル)-5-クロロイソキノリン-8-スルホンアミド)、D4476（4-[4-(2,3-ジヒドロ-1,4-ベンゾジオキシン-6-イル)-5-(2-ピリジニル)-1H-イミダゾール-2-イル]ベンズアミド）、IWR-1-endo (IWR1e) （4-[(3aR,4S,7R,7aS)-1,3,3a,4,7,7a-ヘキサヒドロ-1,3-ジオキソ-4,7-メタノ-2H-イソインドール-2-イル]-N-8-キノリニル-ベンズアミド）、並びに、IWP-2（N-(6-メチル-2-ベンゾチアゾリル)-2-[(3,4,6,7-テトラヒドロ-4-オキソ-3-フェニルチエノ[3,2-d]ピリミジン-2-イル)チオ]アセタミド）等の低分子化合物等]等が挙げられるが、これらに限定されない。Wntシグナル伝達経路阻害物質として、これらを一種又は二種以上含んでいてもよい。CKI-7、D4476、IWR-1-endo (IWR1e)、IWP-2等は公知のWntシグナル伝達経路阻害物質であり、市販品等を適宜入手可能である。Wntシグナル伝達経路阻害物質として好ましくはIWR1eが用いられる。
〔第二工程について〕
Wntシグナル伝達経路阻害物質の濃度は、良好な細胞凝集体の形成を誘導可能な濃度であればよい。例えばIWR-1-endoの場合は、約0.1 μM～約100 μM、好ましくは約0.3 μM～約30 μM、より好ましくは約1 μM～約10 μM、更に好ましくは約3 μMの濃度となるように培地に添加する。IWR-1-endo以外のWntシグナル伝達経路阻害物質を用いる場合には、上記IWR-1-endoの濃度と同等のWntシグナル伝達経路阻害活性を示す濃度で用いられることが望ましい。
Wntシグナル伝達経路阻害物質を培地に添加するタイミングは、早い方が好ましい。Wntシグナル伝達経路阻害物質は、第二工程における浮遊培養開始から、通常6日以内、好ましくは3日以内、より好ましくは1日以内、より好ましくは12時間以内、更に好ましくは第二工程における浮遊培養開始時に、培地に添加される。具体的には、例えば、Wntシグナル伝達経路阻害物質を添加した基礎培地の添加や、該基礎培地への一部もしくは全部の培地交換を行う事ができる。第一工程で得られた細胞を、第二工程においてWntシグナル伝達経路阻害物質に作用させる期間は特に限定されないが、好ましくは、第二工程における浮遊培養開始時に培地へ添加した後、第二工程終了時(BMPシグナル伝達経路作用物質添加直前)まで作用させる。更に好ましくは、後述する通り、第二工程終了後（すなわち第三工程の期間中）も、継続してWntシグナル伝達経路阻害物質に曝露させる。一態様としては、後述する通り、第二工程終了後（すなわち第三工程の期間中）も、継続してWntシグナル伝達経路阻害物質に作用させ、網膜組織が形成されるまで作用させても良い。
〔第三工程について〕
Wntシグナル伝達経路阻害物質としては、前述のWntシグナル伝達経路阻害物質のいずれかを用いる事ができるが、好ましくは、第二工程で用いたWntシグナル伝達経路阻害物質と同一の種類のものを第三工程において使用する。
Wntシグナル伝達経路阻害物質の濃度は、網膜前駆細胞及び網膜組織を誘導可能な濃度であればよい。例えばIWR-1-endoの場合は、約0.1 μM～約100 μM、好ましくは約0.3 μM～約30 μM、より好ましくは約1 μM～約10 μM、更に好ましくは約3 μMの濃度となるように培地に添加する。IWR-1-endo以外のWntシグナル伝達経路阻害物質を用いる場合には、上記IWR-1-endoの濃度と同等のWntシグナル伝達経路阻害活性を示す濃度で用いられることが望ましい。第三工程の培地中のWntシグナル伝達経路阻害物質の濃度は、第二工程の培地中のWntシグナル伝達経路阻害物質の濃度を100としたとき、好ましくは50～150、より好ましくは80～120、更に好ましくは90～110であり、第二工程の培地中のWntシグナル伝達経路阻害物質の濃度と同等であることが、より好ましい。
Wntシグナル伝達経路阻害物質の培地への添加時期は、網膜系細胞もしくは網膜組織を含む凝集体形成を達成できる範囲で特に限定されないが、早ければ早い方が好ましい。好ましくは、第三工程開始時にWntシグナル伝達経路阻害物質が培地に添加される。より好ましくは、第二工程においてWntシグナル伝達経路阻害物質が添加された後、第三工程においても継続して（即ち、第三工程の開始時から）培地中に含まれる。更に好ましくは、第二工程の浮遊培養開始時にWntシグナル伝達経路阻害物質が添加された後、第三工程においても継続して培地中に含まれる。例えば、第二工程で得られた培養物（Wntシグナル伝達経路阻害物質を含む培地中の凝集体の懸濁液）にBMPシグナル伝達作用物質（例、BMP4）を添加すればよい。
Wntシグナル伝達経路阻害物質に作用させる期間は、特に限定されないが、好ましくは、第二工程における浮遊培養開始時にWntシグナル伝達経路阻害物質が添加される場合において、第二工程における浮遊培養開始時を起算点として、2日間から30日間、より好ましくは6日間から20日間、8日間から18日間、10日間から18日間、又は10日間から17日間（例えば、10日間）である。別の態様において、Wntシグナル伝達経路阻害物質に作用させる期間は、第二工程における浮遊培養開始時にWntシグナル伝達経路阻害物質が添加される場合において、第二工程における浮遊培養開始時を起算点として、好ましくは3日間から15日間（例えば、5日間、6日間、7日間）であり、より好ましくは6日間から10日間（例えば、6日間）である。
2-3. 原料製造方法3
発生初期段階の網膜組織を製造する好ましい一態様として、以下の工程を含む方法を挙げることもできる：
（1）多能性幹細胞を、フィーダー細胞非存在下で、未分化維持因子を含む培地で培養する第一工程、
（2）第一工程で得られた多能性幹細胞を、SHHシグナル伝達経路作用物質の存在下で浮遊培養し、細胞凝集体を形成させる第二工程、及び
（3）第二工程で得られた凝集体を、BMPシグナル伝達経路作用物質の存在下に浮遊培養し、網膜前駆細胞または神経網膜前駆細胞を含む凝集体を得る第三工程。
〔第一工程について〕
第一工程はWO2016/063986に記載の方法に準じて行うことができる。すなわち、第一工程では、ヒト多能性幹細胞、好ましくはヒト人工多能性幹細胞（iPS細胞）もしくはヒト胚性幹細胞（ES細胞）を、フィーダー細胞非存在下で、未分化維持因子を含む培地で培養する。第一工程におけるフィーダー細胞非存在下（フィーダーフリー）とは、フィーダー細胞を実質的に含まない（例えば、全細胞数に対するフィーダー細胞数の割合が3%以下）の条件を意味する。好ましくは、フィーダー細胞を含まない条件において、第一工程が実施される。
第一工程において用いられる培地は、フィーダーフリー条件下で、多能性幹細胞の未分化維持培養を可能にする培地（フィーダーフリー培地）であれば、特に限定されないが、好適には、未分化維持培養を可能にするため、未分化維持因子を含む。例えば、未分化維持因子を含み、TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及びSHHシグナル伝達経路作用物質を含まない培地が挙げられる。
未分化維持因子及びフィーダーフリー培地としては、前記原料製造方法2に記載のものが挙げられる。
第一工程における多能性幹細胞の培養時間は、第二工程において形成される凝集体の質を向上させる効果が達成可能な範囲で特に限定されないが、通常0.5～144時間、好ましくは2～96時間、より好ましくは6～48時間、更に好ましくは12～48時間、より更に好ましくは18～28時間（例、24時間）である。即ち、第二工程開始の0.5～144時間（好ましくは、18～28時間）前に第一工程を開始し、第一工程を完了した後引き続き第二工程が行われる。
第一工程において、適宜培地交換を行ってもよく、一態様として、具体的には1～2日おきに培地交換を行う方法が挙げられる。ここにおいて、例えば、ROCK阻害剤等の細胞保護剤もしくは細胞死抑制剤を含まない培地に培地交換してもよい。
第一工程における培養温度、CO2濃度等の培養条件は適宜設定できる。培養温度は、例えば約30℃から約40℃、好ましくは約37℃である。またCO2濃度は、例えば約1％から約10％、好ましくは約5％である。
好ましい一態様において、ヒト多能性幹細胞（例、ヒトiPS細胞）を、フィーダー細胞非存在下で、bFGFを含有する無血清培地中で、接着培養する。当該接着培養は、好ましくは、ラミニン511、ラミニン511のE8フラグメント又はビトロネクチンで表面をコーティングした細胞容器中で実施される。当該接着培養は、好ましくは、フィーダーフリー培地としてEssential 8、TeSR培地、mTeSR培地、mTeSR-E8培地、又はStemFit培地、更に好ましくはEssential 8又はStemFit培地を用いて実施される。
〔第二工程について〕
第一工程で得られた多能性幹細胞を、SHHシグナル伝達経路作用物質の存在下で浮遊培養することにより、多能性幹細胞の凝集体を形成させる第二工程は、上記原料製造方法2の第二工程に記載された方法（具体的には、段落[００６１]など）に準じて行えば良い。
〔第三工程について〕
第三工程は、前記原料製造方法1における第二工程、又は前記原料製造方法2における第三工程に準じて行うことができる。
2-4. 原料製造方法4
発生初期段階の網膜組織を製造する好ましい一態様として、以下の工程を含む方法を挙げることもできる：
（1）多能性幹細胞を、Wntシグナル伝達経路阻害物質を含む無血清培地中で浮遊培養することにより多能性幹細胞の凝集体を形成させる第一工程、及び
（2）第一工程で形成された凝集体を、基底膜標品を含む無血清培地中で浮遊培養し、網膜前駆細胞または神経網膜前駆細胞を含む凝集体を得る第二工程。
原料製造方法4は、WO2013/077425 (& US2014/341864)の記載に準じて実施することができる。
〔第一工程について〕
Wntシグナル伝達経路阻害物質としては、上記したものが挙げられる。
ここで用いられるWntシグナル伝達経路阻害物質の濃度は、多能性幹細胞の凝集体が形成される濃度であればよい。例えばIWR1e等の通常のWntシグナル伝達経路阻害物質の場合は、0.1 μM～100 μM、好ましくは1 μM～10 μM、より好ましくは約3 μMの濃度である。
Wntシグナル伝達経路阻害物質は、浮遊培養開始前に無血清培地に添加されていてもよく、また、浮遊培養開始後数日以内（例えば、5日以内）に無血清培地に添加してもよい。好ましくは、Wntシグナル伝達経路阻害物質は、浮遊培養開始後5日以内、より好ましくは3日以内、最も好ましくは浮遊培養開始と同時に無血清培地に添加する。また、Wntシグナル伝達経路阻害物質を添加した状態で、浮遊培養開始後18日目まで、より好ましくは12日目まで浮遊培養する。
培養温度、CO2濃度等の培養条件は適宜設定できる。培養温度は特に限定されるものではないが、例えば約30℃～約40℃、好ましくは約37℃である。またCO2濃度は、例えば約1％～約10%、好ましくは約5%である。
また、多能性幹細胞の濃度は、多能性幹細胞の凝集体をより均一に、効率的に形成させるように当業者であれば適宜設定することができる。凝集体形成時の多能性幹細胞の濃度は、幹細胞の均一な凝集体を形成可能な濃度である限り特に限定されないが、例えば96ウェルプレートを用いてヒトES細胞を浮遊培養する場合、1ウェルあたり約1×103～約5×104細胞、好ましくは約3×103～約3×104細胞、より好ましくは約5×103～約2×104細胞、最も好ましくは9×103細胞前後となるように調製した液を添加し、プレートを静置して凝集体を形成させる。
凝集体を形成させるために必要な浮遊培養の時間は、細胞を迅速に凝集させることができる限り、用いる多能性幹細胞によって適宜決定可能であるが、均一な凝集体を形成するためにはできる限り短時間であることが望ましい。例えば、ヒトES細胞やヒトiPS細胞の場合には、好ましくは24時間以内、より好ましくは12時間以内に凝集体を形成させることが望ましい。この凝集体形成までの時間は、細胞を凝集させる用具や、遠心条件などを調整することで当業者であれば適宜調節することが可能である。
多能性幹細胞の凝集体が形成されたことは、凝集体のサイズおよび細胞数、巨視的形態、組織染色解析による微視的形態およびその均一性、分化および未分化マーカーの発現およびその均一性、分化マーカーの発現制御およびその同期性、分化効率の凝集体間の再現性などに基づき、当業者であれば判断することが可能である。
〔第二工程について〕
第一工程で形成された凝集体を、基底膜標品を含む無血清培地中で浮遊培養し、網膜前駆細胞または神経網膜前駆細胞を含む凝集体を得る第二工程について説明する。
「基底膜標品」としては、その上に基底膜形成能を有する所望の細胞を播腫して培養した場合に、上皮細胞様の細胞形態、分化、増殖、運動、機能発現などを制御する機能を有するような基底膜構成成分を含むものをいう。ここで、「基底膜構成成分」とは、動物の組織において、上皮細胞層と間質細胞層などとの間に存在する薄い膜状をした細胞外マトリックス分子をいう。基底膜標品は、例えば基底膜を介して支持体上に接着している基底膜形成能を有する細胞を、該細胞の脂質溶解能を有する溶液やアルカリ溶液などを用いて除去することで作成することができる。好ましい基底膜標品としては、基底膜成分として市販されている商品（例えばMatrigel（以下、マトリゲルという場合もある））や、基底膜成分として公知の細胞外マトリックス分子（例えばラミニン、IV型コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、エンタクチンなど）を含むものが挙げられる。
Matrigelは、Engelbreth Holm Swarn（EHS）マウス肉腫由来の基底膜調製物である。Matrigelの主成分はIV型コラーゲン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、エンタクチンであるが、これらに加えてTGF-β、線維芽細胞増殖因子（FGF）、組織プラスミノゲン活性化因子、EHS腫瘍が天然に産生する増殖因子が含まれる。Matrigelの「growth factor reduced製品」は、通常のMatrigelよりも増殖因子の濃度が低く、その標準的な濃度はEGFが<0.5 ng/mL、NGFが<0.2 ng/mL、PDGFが<5 pg/mL、IGF-1が5 ng/mL、TGF-βが1.7 ng/mLである。原料製造方法4では、「growth factor reduced製品」の使用が好ましい。
第二工程における浮遊培養で無血清培地に添加される基底膜標品の濃度としては、神経組織（例えば網膜組織）の上皮構造が安定に維持される限り特に限定されないが、例えばMartigelを用いる場合には、好ましくは培養液の1/20～1/200の容量、より好ましくは1/100前後の容量を挙げることができる。基底膜標品は多能性幹細胞の凝集体の培養開始時に既に培地に添加されていてもよいが、好ましくは、浮遊培養開始後5日以内、より好ましくは浮遊培養開始後2日以内に無血清培地に添加される。
第二工程で用いられる無血清培地は、第一工程で用いた無血清培地をそのまま用いることもできるし、新たな無血清培地に置き換えることもできる。
第一工程で用いた無血清培地をそのまま本工程に用いる場合、「基底膜標品」を培地中に添加すればよい。
第一工程及び第二工程における浮遊培養に用いられる無血清培地は、上述したようなものである限り特に限定されない。しかしながら、調製の煩雑さを回避する観点から、かかる無血清培地として、市販のKSRを適量添加した無血清培地（GMEM又はDMEM、0.1mM 2-メルカプトエタノール、0.1mM 非必須アミノ酸Mix、1mM ピルビン酸ナトリウム）を使用することが好ましい。無血清培地へのKSRの投与量としては特に限定されず、例えばヒトES細胞の場合は、通常1～20%であり、好ましくは2～20%である。
第二工程における培養温度、CO2濃度等の培養条件は適宜設定できる。培養温度は特に限定されるものではないが、例えば約30℃から約40℃、好ましくは約37℃である。またCO2濃度は、例えば約1％から約10%、好ましくは約5%である。
第二工程により得られる凝集体は、発生初期段階の網膜組織として使用可能であるが、網膜前駆細胞または神経網膜前駆細胞が含まれる割合が低い。このため、更に、基底膜標品を含む無血清培地中で浮遊培養した後に、以下の第三工程を実施し、得られる凝集体を発生初期段階の網膜組織として使用することもできる：
（3）第二工程で培養された凝集体を、血清培地中で浮遊培養する第三工程。
第三工程で用いられる血清培地は、第二工程で培養に用いた無血清培地に血清を直接添加したものを用いてもよいし、新たな血清培地におきかえたものを用いてもよい。
第三工程で培地に添加される血清として、例えば、牛血清、仔牛血清、牛胎仔血清、馬血清、仔馬血清、馬胎仔血清、ウサギ血清。仔ウサギ血清、ウサギ胎仔血清、ヒト血清など哺乳動物の血清などを用いることが出来る。
血清の添加は、浮遊培養開始後7日目以降、より好ましくは9日目以降、最も好ましくは12日目に行う。血清濃度については、1～30％、好ましくは3～20%、より好ましくは約10%で添加する。
第三工程で用いられる血清培地は、上述したようなものである限り特に限定されないが、前記無血清培地（GMEM又はDMEM、0.1 mM 2-メルカプトエタノール、0.1mM 非必須アミノ酸Mix、1mM ピルビン酸ナトリウム）に血清を添加したものを用いることが好ましい。
また、かかる血清培地の代わりに、市販のKSR等の血清代替物を適量添加した無血清培地用いてもよい。
第三工程において、血清に加えてSHHシグナル伝達経路作用物質を添加することで発生初期段階の網膜組織の製造効率を上昇させることが出来る。
SHHシグナル伝達経路作用物質としては、SHHにより媒介されるシグナル伝達を増強し得るものである限り特に限定されず、上記したものが挙げられる。
本工程に用いられるSHHシグナル伝達経路作用物質の濃度は、例えばSAG等の通常のSHHシグナル伝達経路作用物質の場合は、0.1 nM～10 μM、好ましくは10 nM～1 μM、より好ましくは約100 nMの濃度で添加する。
このようにして得られる凝集体を、発生初期段階の網膜組織として使用することもできる。
また、発生初期段階の網膜組織を製造する好ましい一態様として、前記第三工程を実施した後に、以下の第四工程を実施し、得られる眼杯様構造体を発生初期段階の網膜組織として使用することもできる：
（4）第三工程で培養された凝集体を、SHHシグナル伝達経路作用物質とWntシグナル伝達経路作用物質とを含む無血清培地中又は血清培地中で浮遊培養する第四工程。
ここで、SHHシグナル伝達経路作用物質としては、SHHにより媒介されるシグナル伝達を増強し得るものである限り特に限定されず、上記したものが挙げられる。
ここで用いられるSHHシグナル伝達経路作用物質の濃度は、例えばSAG等の通常のSHHシグナル伝達経路作用物質の場合は、0.1 nM～10 μM、好ましくは10 nM～1 μM、より好ましくは約100 nMの濃度で添加する。
Wntシグナル伝達経路作用物質としては、Wntにより媒介されるシグナル伝達を増強し得るものである限り特に限定されず、上記したものが挙げられる。
ここで用いられるWntシグナル伝達経路作用物質の濃度は、例えばCHIR99021等の通常のWntシグナル伝達経路作用物質の場合には、0.1 μM～100 μM、好ましくは1 μM～30 μM、より好ましくは約3 μMの濃度で添加する。
SHHシグナル伝達経路作用物質及びWntシグナル伝達経路作用物質は、浮遊培養開始後12日目以降25日目以内に添加する。好ましくは、15日目以降18日目以内に添加する。この際、凝集体形成工程で添加されたWntシグナル伝達経路阻害物質を含まない培地を使用することが好ましい。
浮遊培養開始から18日目以降に、凝集体中から、眼杯様構造体が突起状に形成される。上記第四工程により製造される眼杯様構造体もまた、上記2及び上記3の方法で使用される出発物質となる発生初期段階の網膜組織として利用可能である。
上記第四工程で得られる凝集体は、SHHシグナル伝達経路作用物質及びWntシグナル伝達経路作用物質のいずれも含まない無血清培地又は血清培地中で1日～20日間浮遊培養した後に、上記2及び上記3で使用される方法の出発物質となる発生初期段階の網膜組織として使用することもできる。本原料製造方法により、網膜組織以外の神経組織が同時に形成される場合もあり、これらは背側化シグナル伝達物質であるWntシグナル伝達経路作用物質等を発現することがある。このため、好ましくは、過剰な背側化シグナル伝達物質であるWntシグナル伝達経路作用物質等による影響を排除するために、凝集体の表面に存在する当該の眼杯様構造体をピンセット、ハサミ、注射針、カミソリ及びそれに類するもの等を用いて凝集体から物理的に切り出すこともできる。
2-5. 原料製造方法5
発生初期段階の網膜組織は、毛様体周縁部構造体を含んでいてもよく、毛様体周縁部構造体を含む発生初期段階の網膜組織は、WO2015/087614 (& US2016/376554)に記載の方法で製造することができる。
具体的には、網膜組織を含む細胞凝集体であり、前記網膜組織におけるCHX10陽性細胞の存在割合が20%以上100%以下である細胞凝集体を、Wntシグナル伝達経路作用物質及びFGFシグナル伝達経路阻害物質を含む無血清培地又は血清培地中で、RPE65遺伝子を発現する細胞が出現するに至るまでの期間中に限り、培養する工程を経て得られる凝集体、又は、更に得られた「RPE65遺伝子を発現する細胞が出現していない細胞凝集体」を、Wntシグナル伝達経路作用物質を含まない無血清培地又は血清培地中で培養する工程を経て得られる毛様体周縁部様構造体を含む凝集体もまた、本発明の方法の出発物質となる発生初期段階の網膜組織として使用することができる。
具体的には、例えば下記の方法により調製される、毛様体周縁部構造体を含む凝集体もまた、発生初期段階の網膜組織に含まれる：
（1）網膜組織を含む細胞凝集体であり、前記網膜組織におけるCHX10陽性細胞の存在割合が20%以上100%以下である細胞凝集体を、Wntシグナル伝達経路作用物質及びFGFシグナル伝達経路阻害物質を含む無血清培地又は血清培地中で、RPE65遺伝子を発現する細胞が出現するに至るまでの期間中に限り、培養した後、得られた「RPE65遺伝子を発現する細胞が出現していない細胞凝集体」を、Wntシグナル伝達経路作用物質を含まない無血清培地又は血清培地中で培養する工程を含む、毛様体周縁部様構造体を含む凝集体の製造方法。
「網膜組織を含む細胞凝集体であり、前記網膜組織におけるCHX10陽性細胞の存在割合が20%以上100%以下である細胞凝集体」は、上述の原料製造方法1～4に記載された方法で得ることができる。すなわち、当該細胞凝集体は、それ自体発生初期段階の網膜組織を含む凝集体である。例えば、原料製造方法1における第二工程又は原料製造方法2もしくは3における第三工程において、BMP4等のBMPシグナル伝達経路作用物質の存在下で1日間～60日間、好ましくは3日間～40日間、更に好ましくは6日間～20日間浮遊培養して得られる細胞凝集体を、本工程の「網膜組織を含む細胞凝集体であり、前記網膜組織におけるChx10陽性細胞の存在割合が20%以上100%以下である細胞凝集体」として用いることができる。
また、上記「Wntシグナル伝達経路作用物質及びFGFシグナル伝達経路阻害物質を含む無血清培地又は血清培地中で、RPE65遺伝子を発現する細胞が出現するに至るまでの期間中に限り、培養する工程」は、Wntシグナル伝達経路作用物質及びFGFシグナル伝達経路阻害物質を含む無血清培地又は血清培地中で継続して培養することにより（例えば30日間以上）、網膜組織に含まれる細胞のうち50％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、更により好ましくは99％以上がRPE65遺伝子を発現可能な時期まで、すなわち、網膜組織に含まれる細胞のうち上記割合の細胞が網膜色素上皮に分化可能な時期までに開始することが好ましい。具体的には浮遊培養開始後40日、好ましくは30日、より好ましくは20日までに開始する。
このようにして得られる細胞凝集体を、本工程の「網膜組織を含む細胞凝集体であり、前記網膜組織におけるChx10陽性細胞の存在割合が20%以上100%以下である細胞凝集体」として用いることができる。
まず、「網膜組織を含む細胞凝集体であり、前記網膜組織におけるCHX10陽性細胞の存在割合が20%以上100%以下である細胞凝集体」を、Wntシグナル伝達経路作用物質及びFGFシグナル伝達経路阻害物質を含む無血清培地又は血清培地中で、RPE65遺伝子を発現する細胞が出現するに至るまでの期間中に限り、培養する。ここで、好ましい培養としては、浮遊培養を挙げることができる。
無血清培地としては、基礎培地にN2またはKSRが添加された無血清培地を挙げることができ、より具体的には、DMEM/F-12培地にN2 supplement（N2, Invitrogen社）が添加された無血清培地を挙げることができる。血清培地としては、基礎培地に牛胎仔血清が添加された血清培地を挙げることができる。
培養温度、CO2濃度等の培養条件は適宜設定すればよい。培養温度としては、例えば、約30℃から約40℃の範囲を挙げることができる。好ましくは、例えば、約37℃を挙げることができる。また、CO2濃度としては、例えば、約1%から約10%の範囲を挙げることができる。好ましくは、例えば、約5%を挙げることができる。
上記細胞凝集体を、無血清培地又は血清培地中で培養する際、該培地に含められるWntシグナル伝達経路作用物質としては、Wntにより媒介されるシグナル伝達を増強し得るものである限り特に限定されず、上記したものが挙げられる。
無血清培地又は血清培地に含まれるWntシグナル伝達経路作用物質の濃度としては、CHIR99021等の通常のWntシグナル伝達経路作用物質の場合には、例えば、約0.1 μM～約100 μMの範囲を挙げることができる。好ましくは、例えば、約1 μM～約30 μMの範囲を挙げることができる。より好ましくは、例えば、約3 μMの濃度を挙げることができる。
上記「網膜組織を含む細胞凝集体」を、無血清培地又は血清培地中で培養する際、該培地に含められるFGFシグナル伝達経路阻害物質としては、FGFにより媒介されるシグナル伝達を阻害できるものである限り特に限定されない。FGFシグナル伝達経路阻害物質としては、例えば、FGF受容体、FGF受容体阻害剤（例えば、SU-5402、AZD4547、BGJ398）、MAPキナーゼカスケード阻害物質（例えば、MEK阻害剤、MAPK阻害剤、ERK阻害剤）、PI3キナーゼ阻害剤、Akt阻害剤などが挙げられる。
無血清培地又は血清培地に含まれるFGFシグナル伝達経路阻害物質の濃度は、多能性幹細胞の凝集体を形成する細胞の網膜細胞への分化を誘導可能な濃度であればよい。例えばSU-5402の場合、約0.1 μM～約100 μM、好ましくは約1 μM～約30 μM、より好ましくは約5 μMの濃度で添加する。
本明細書において「RPE65遺伝子を発現する細胞が出現するに至るまでの期間中に限り、培養」するとは、RPE65遺伝子を発現する細胞が出現するに至るまでの期間の全部又はその一部に限り培養することを意味する。つまり、培養系内に存在する前記「網膜組織を含む細胞凝集体」が、RPE65遺伝子を実質的に発現しない細胞から構成されている期間の全部又はその一部（任意な期間）に限り培養すればよく、このような培養を採用することにより、RPE65遺伝子を発現する細胞が出現していない細胞凝集体を得ることができる。「RPE65遺伝子を発現する細胞が出現していない細胞凝集体」には、「RPE65遺伝子を発現する細胞が全く出現していない細胞凝集体」及び「RPE65遺伝子を発現する細胞が実質的に出現していない細胞凝集体」が含まれる。「RPE65遺伝子を発現する細胞が実質的に出現していない細胞凝集体」としては、当該細胞凝集体に含まれる網膜組織におけるRPE65陽性細胞の存在割合が約1％以下である細胞凝集体を挙げることができる。
このような特定の期間を設定するには、前記「網膜組織を含む細胞凝集体」を試料として、当該試料中に含まれるRPE65遺伝子の発現有無又はその程度を、通常の遺伝子工学的手法又は生化学的手法を用いて測定すればよい。具体的には例えば、前記「網膜組織を含む細胞凝集体」の凍結切片をRPE65タンパク質に対する抗体を用いて免疫染色する方法を用いてRPE65遺伝子の発現有無又はその程度を調べることができる。
「RPE65遺伝子を発現する細胞が出現するに至るまでの期間」としては、例えば、前記網膜組織におけるCHX10陽性細胞の存在割合が、Wntシグナル伝達経路作用物質及びFGFシグナル伝達経路阻害物質を含む無血清培地又は血清培地中での前記細胞凝集体の培養開始時よりも減少し、30%から0％の範囲内になるまでの期間を挙げることができる。「RPE65遺伝子を発現する細胞が出現していない細胞凝集体」としては、前記網膜組織におけるChx10陽性細胞の存在割合が30%から0％の範囲内である細胞凝集体を挙げることができる。
「RPE65遺伝子を発現する細胞が出現するに至るまでの期間」の日数はWntシグナル伝達経路作用物質及びFGFシグナル伝達経路阻害物質の種類、無血清培地又は血清培地の種類、他の培養条件等に応じて変化するが、例えば、14日間以内を挙げることができる。より具体的には、無血清培地（例えば、基礎培地にN2が添加された無血清培地）が用いられる場合、前記期間として、好ましくは、例えば、10日間以内を挙げることができ、より好ましくは、例えば、3日間から6日間、更に具体的には4日間から5日間を挙げることができる。血清培地（例えば、基礎培地に牛胎仔血清が添加された血清培地）が用いられる場合、前記期間として、好ましくは、例えば、12日間以内を挙げることができ、より好ましくは、例えば、6日間から9日間を挙げることができる。
こうして得られた凝集体を、本発明の方法の出発物質となるとなる発生初期段階の網膜組織として使用することができる。
また、上述のようにして培養して得られた「RPE65遺伝子を発現する細胞が出現していない細胞凝集体」を、更にWntシグナル伝達経路作用物質を含まない無血清培地又は血清培地中で1日間～50日間、好ましくは1日間～15日間、更に好ましくは1日間～7日間培養した後に、本発明の方法の出発物質となる発生初期段階の網膜組織として使用してもよい。
2-6. 原料製造方法6
本発明の方法の出発物質として使用可能な毛様体周縁部構造体を含む発生初期段階の網膜組織は、WO2013/183774 (&US2015/132787)に記載の方法で製造することもできる。
具体的には、網膜組織を含む細胞凝集体であり、前記網膜組織におけるCHX10陽性細胞の存在割合が20%以上100%以下である細胞凝集体を、Wntシグナル伝達経路作用物質を含む無血清培地又は血清培地中で、RPE65遺伝子を発現する細胞が出現するに至るまでの期間中に限り、培養する工程を経て得られる凝集体、又は、更に得られた「RPE65遺伝子を発現する細胞が出現していない細胞凝集体」を、Wntシグナル伝達経路作用物質を含まない無血清培地又は血清培地中で培養する工程を経て得られる毛様体周縁部様構造体を含む凝集体もまた、発生初期段階の網膜組織である。
ここで原料として用いられる「網膜組織を含む細胞凝集体であり、前記網膜組織におけるCHX10陽性細胞の存在割合が20%以上100%以下である細胞凝集体」、または「Wntシグナル伝達経路作用物質」としては、上記原料製造方法5の場合と同じものが挙げられる。
好ましい培養としては、例えば、浮遊培養を挙げることができる。また、好ましい培地としては、例えば、無血清培地を挙げることができる。
培養温度、CO2濃度等の培養条件は適宜設定すればよい。培養温度としては、例えば、約30℃～約40℃の範囲を挙げることができる。好ましくは、例えば、約37℃を挙げることができる。また、CO2濃度としては、例えば、約1%～約10%の範囲を挙げることができる。好ましくは、例えば、約5%を挙げることができる。
該培地に含められるWntシグナル伝達経路作用物質としては、Wntにより媒介されるシグナル伝達を増強し得るものである限り特に限定されず、上記したものが挙げられる。
また、無血清培地又は血清培地に含まれるWntシグナル伝達経路作用物質の濃度としては、CHIR99021等の通常のWntシグナル伝達経路作用物質の場合には、例えば、約0.1 μM～100 μMの範囲を挙げることができる。好ましくは、例えば、約1 μM～30 μMの範囲を挙げることができる。より好ましくは、例えば、約3μMの濃度を挙げることができる。
FGFシグナル伝達経路阻害物質を含まなくてもよいこと以外は上記原料製造方法5と同様にして、当該細胞凝集体を「RPE65遺伝子を発現する細胞が出現するに至るまでの期間中に限り、培養」する。
好ましい「RPE65遺伝子を発現する細胞が出現するに至るまでの期間」としては、例えば、前記網膜組織におけるCHX10陽性細胞の存在割合が50%～1％の範囲内である期間を挙げることができる。この場合には、得られる「RPE65遺伝子を発現する細胞が出現していない細胞凝集体」は、前記網膜組織におけるCHX10陽性細胞の存在割合が50%～1％の範囲内である細胞凝集体となる。
「RPE65遺伝子を発現する細胞が出現するに至るまでの期間」の日数はWntシグナル伝達経路作用物質の種類、無血清培地又は血清培地の種類、他の培養条件等に応じて変化するが、例えば、14日間以内を挙げることができる。前記期間として、好ましくは、例えば、10日間以内を挙げることができ、より好ましくは、例えば、3日間～6日間を挙げることができる。血清培地（例えば、基礎培地に牛胎仔血清が添加された血清培地）が用いられる場合、前記期間として、好ましくは、例えば、12日間以内を挙げることができ、より好ましくは、例えば、6日間～9日間を挙げることができる。
こうして得られた凝集体を、本発明の方法の出発物質となる発生初期段階の網膜組織として使用することができる。上述のようにして培養して得られた「RPE65遺伝子を発現する細胞が出現していない細胞凝集体」を、そのまま発生初期段階の網膜組織として使用してもよいが、更にWntシグナル伝達経路作用物質を含まない無血清培地又は血清培地中で1日間～50日間、好ましくは1日間～15日間、更に好ましくは1日間～7日間培養した後に、本発明の方法の出発物質となる発生初期段階の網膜組織を含む凝集体として使用してもよい。
2-7. 原料製造方法7
発生初期段階の網膜組織は、毛様体周縁部構造体を含んでいてもよく、毛様体周縁部構造体を含む発生初期段階の網膜組織は、WO2015/107738（及び米国特許出願No. 15/112,187）に記載の方法で製造することができる。具体的には、例えば下記の工程を含む方法により調製されるレチノスフェアもまた、本発明の方法の出発物質となる発生初期段階の網膜組織として使用することができる：
（1）多能性幹細胞から分化誘導された毛様体周縁部様構造体を含む細胞凝集体から得られた細胞を浮遊増殖培養し、レチノスフェアを得る工程。
「多能性幹細胞から分化誘導された毛様体周縁部様構造体を含む細胞凝集体」は、上記原料製造方法5又は6に従って、製造することができ、これから得られる細胞を分散し、浮遊培養し、レチノスフェアを得ることができる。
上記工程においては、「多能性幹細胞から分化誘導された毛様体周縁部様構造体を含む細胞凝集体」から得られた細胞を浮遊増殖培養し、レチノスフェアを得る。
「多能性幹細胞から分化誘導された毛様体周縁部様構造体を含む細胞凝集体」から得られた細胞としては、上記の「多能性幹細胞から分化誘導された毛様体周縁部様構造体を含む細胞凝集体」を分散させて得られた細胞、前記細胞凝集体から分離された毛様体周縁部様構造体を分散させて得られた細胞、又は、前記細胞凝集体から分取された細胞を分散させて得られた細胞を挙げることができる。かかる細胞を増殖因子等の存在下で低密度で浮遊培養すると、1細胞、又は、2から10細胞程度の少数の細胞に由来する球状の細胞凝集塊、すなわちレチノスフェアが形成される。該レチノスフェアの製造方法については、WO2015/107738（及び米国特許出願No. 15/112,187）を参照することができる。
具体的には、分散された細胞を神経細胞培養用添加物及び増殖因子を加えた無血清培地又は血清培地中で浮遊培養することができる。培地として、好ましくは、FGFシグナル伝達経路作用物質及びEGFシグナル伝達経路作用物質からなる群から選ばれる一以上の物質を含む無血清培地又は血清培地を挙げることができる。ここで用いられるFGFシグナル伝達経路作用物質としてはFGF1、bFGF、FGF4、FGF7、FGF8、FGF9等のFGFタンパク質及びFGFシグナルの補助剤としてのheparine等が挙げられ、EGFシグナル伝達経路作用物質としてはEGF、TGF-alpha等が挙げられる。
上記のように製造したレチノスフェアは、網膜組織と同様に網膜前駆細胞又は神経網膜前駆細胞を含むので、本発明の製造方法の原料となる発生初期段階の網膜組織として使用することができる。次いで、上述のようにして得られたレチノスフェアを、更にWntシグナル伝達経路作用物質を含まない無血清培地又は血清培地中で1日間～50日間、好ましくは1日間～15日間、更に好ましくは1日間～7日間培養した後に得られる細胞凝集体を発生初期段階の網膜組織として使用してもよい。
3．連続上皮構造
本明細書において、網膜組織における「連続上皮構造」とは、網膜組織が上皮組織に特有の頂端面を持ち、頂端面が神経網膜層を形成する各層のうち、少なくとも視細胞層(外顆粒層)またはニューロブラスティックレイヤー（neuroblastic layer）と概ね平行に、かつ連続的に網膜組織の表面に形成される構造を指す。すなわち、連続上皮構造は、ロゼット様構造でみとめられるような頂端面が分断される構造を持たない。例えば、多能性幹細胞より作製した網膜組織を含む細胞凝集体の場合、凝集体の表面に頂端面が形成され、表面に対して接線方向に10細胞以上、好ましくは30細胞以上、より好ましくは100細胞以上、更に好ましくは400細胞以上の視細胞または視細胞前駆細胞が規則正しく連続して配列する。連続して配列する視細胞または視細胞前駆細胞の数は、細胞凝集体に含まれる神経網膜組織の大きさと相関する。本明細書において、上皮組織に対する接線方向とは、上皮組織において例えば頂端面を形成する一つ一つの細胞が一定方向に並んでいる場合の細胞が並んでいる方向のことをいい、上皮組織（又は上皮シート）に対して平行方向又は横方向のことをいう。
一態様において、神経網膜組織の表面には頂端面が形成され、その頂端面に沿って視細胞または視細胞前駆細胞が規則正しく連続して配列する。
視細胞または視細胞前駆細胞の出現割合が少ない段階の網膜組織（例：発生初期段階の網膜組織）の場合、増殖する神経網膜前駆細胞を含む層は「ニューロブラスティックレイヤー」と呼ばれることが当業者に知られている。また、このような段階の網膜組織の表面には視細胞又は視細胞前駆細胞以外に、極性を持ち、頂端面を形成可能な神経網膜前駆細胞、神経網膜前駆細胞から分裂、増殖する細胞、及び／又は、神経網膜前駆細胞から神経網膜を構成する細胞へと分化する段階の細胞が存在する事がある。この様な状態の網膜組織を、「連続上皮構造」を維持する条件で培養を継続することにより、神経網膜組織の表面に形成される頂端面に沿って、視細胞または視細胞前駆細胞が規則正しく連続して配列する網膜組織が得られる。
一態様において、網膜組織の表面に存在する頂端面の面積は網膜組織の表面の面積に対し、平均で30％以上、好ましくは50％以上、より好ましくは80％以上、更により好ましくは95％以上である。網膜組織の表面に存在する頂端面の面積の割合は、後述する通り、頂端面のマーカーを染色する事で測定可能である。
本明細書において、網膜組織における「ロゼット様構造」とは、中心部の管腔を囲むように放射状又はらせん状に細胞が配列した構造を指す。ロゼット様構造を形成した網膜組織においては、その中心部（管腔）に沿って頂端面及び視細胞、又は視細胞前駆細胞が存在する状態となり、頂端面はロゼット様構造毎に分断されている。
本明細書において、「頂端面」とは、上皮組織において、ムコ多糖に富み（PAS染色陽性）、ラミニンやIV型コラーゲンを多く含む50-100nmの、上皮細胞が産生した層（基底膜）が存在する基底膜側とは反対側に形成される表面（表層面）のことをいう。一態様において、視細胞または視細胞前駆細胞が認められる程度に発生段階が進行した網膜組織においては、外境界膜が形成され、視細胞、視細胞前駆細胞が存在する視細胞層（外顆粒層）に接する面のことをいう。また、このような頂端面は、頂端面のマーカー(例：atypical-PKC（以下aPKCと略す）、E-cadherin、N-cadherin)に対する抗体を用いて、当業者に周知の免疫染色法等で同定することができる。発生初期段階で、視細胞または視細胞前駆細胞が出現していない場合や、視細胞または視細胞前駆細胞が網膜組織の表面を十分に覆うほど出現していない場合でも、上皮組織は極性を持ち、頂端面では上記頂端面のマーカーを発現する。
網膜組織が連続上皮構造を有するかどうかは、網膜組織が有する頂端面の連続性（すなわち、分断されていない形態）により確認する事ができる。頂端面の連続性は、例えば、頂端面のマーカー(例： aPKC、E-cadherin、N-cadherin)、頂端面側に位置する視細胞又は視細胞前駆細胞のマーカー（例：Crxまたはリカバリン）を免疫染色し、取得した画像等について頂端面と視細胞層、および各網膜層の位置関係を解析することにより判定できる。頂端面や視細胞層（外顆粒層）以外の網膜層については、細胞核を染色するDAPI染色、PI染色、Hoechst染色、又は細胞核に局在するマーカータンパク（Rx、Chx10、Ki67、Crx等）等による免疫染色等により同定できる。
ロゼット様構造が生じたか否かについては、細胞凝集体を4％パラホルムアルデヒドで固定するなどした後凍結切片を作製し、頂端面マーカーであるaPKC、E-cadherin、N-cadherinに対する抗体や、核を特異的に染色するDAPIなどを用いて通常実施される免疫染色等によりロゼット様構造の異形成（例：分断された頂端面又は頂端面の細胞凝集体内への侵入）を観察することで決定できる。
4．連続上皮組織維持用培地
本発明は、連続上皮組織維持用培地を提供する。
連続上皮組織維持用培地は、網膜前駆細胞又は神経網膜前駆細胞の細胞分化を抑制し得る濃度のメチル基供与体又はメチル基供与体の基質、及び神経突起伸長を抑制し得る濃度の神経突起伸長抑制剤のうち少なくとも一つを含有する。好ましくは、連続上皮組織維持用培地は、網膜前駆細胞又は神経網膜前駆細胞の細胞分化を抑制する濃度のメチル基供与体又はメチル基供与体の基質、及び神経突起伸長を抑制する濃度の神経突起伸長抑制剤を含有する。
生体内においてはメチルトランスフェラーゼによりメチルドナーからDNAやヒストンを含むタンパク質へメチル基が移転される。本明細書において、メチル基供与体とは、DNA又はヒストンを含むタンパク質に対し、移転するためのメチル基を供与し得る物質 (メチルドナー)である。また、本明細書において、メチル基供与体の基質とは、前記メチルドナーを生合成するのに必要な基質のことである。具体的には、メチル基供与体としてS-アデノシルメチオニン（S-adenosylmethionine、SAMともいう）、メチル基供与体の基質としてメチオニン、S-メチル5’-チオアデノシン(S-methyl-5’-thioadenosine、MTAと略すことがある)、ホモシステイン（homocysteine、Hcyと略すことがある）等が挙げられる。本発明においては、好適には、メチオニンが用いられる。
網膜前駆細胞又は神経網膜前駆細胞の細胞分化を抑制するかどうかは、例えば、網膜前駆細胞又は神経網膜前駆細胞を含む発生初期段階の網膜組織に評価対象の物質を作用させ、一定期間培養した後に、網膜組織内の網膜前駆細胞又は神経網膜前駆細胞の割合を同定するか、網膜組織内の分化細胞、又は分化し増殖を停止した細胞の割合を同定すればよい。具体的には、例えば神経節細胞が出現し始め、一定の期間（例えば5日間～50日間）を経た後、網膜前駆細胞又は神経網膜前駆細胞の減少率；網膜組織内の分化細胞や増殖を停止している細胞又は最終分化に必要なbHLH型転写因子を発現する細胞の増加率；或いはbHLH型転写因子の発現量を、免疫染色、定量的PCR等により同定すればよい。網膜前駆細胞又は神経網膜前駆細胞マーカーとしては、例えば、RX及びPAX6の組み合わせ、RX、PAX6及びCHX10の組み合わせ等が使用できる。また、網膜組織に含まれる分化した細胞のマーカー、分化した前駆細胞のマーカー、又は最終分化に必要なbHLH型転写因子マーカーとしては、例えば、BRN3、CRX、HuNu、Cath5、NeuroM、NGN1、NGN2、ISLET-1（ISL1とも言う）、OLIG2等が使用できる。細胞分化により細胞増殖を停止している細胞のマーカーとしては、例えば、p53、p27、p21等が使用できる。
メチル基供与体の基質としてメチオニンを用いる場合、連続上皮組織維持用培地中のメチオニン濃度は、通常17.24 mg/L 超（好ましくは23.62 mg/L以上、25 mg/L以上、25.75 mg/L以上、26 mg/L以上、26.81 mg/L以上、27 mg/L以上、30mg/L以上）である。連続上皮組織維持用培地中のメチオニン濃度の上限値は、連続上皮組織維持が達成される限り特に制限されないが、通常100 mg/L以下（好ましくは75 mg/L以下）である。連続上皮組織維持用培地中のメチオニン濃度の範囲は、例えば、17.24 mg/L 超100 mg/L以下、好ましくは23.62 mg/L以上75 mg/L以下、25 mg/L以上75 mg/L以下、25.75 mg/L以上75 mg/L以下、26 mg/L以上75 mg/L以下、26.81 mg/L以上75 mg/L以下、27 mg/L以上75 mg/L以下、30 mg/L以上75mg/L以下である。メチオニン以外のメチル基供与体又はその基質を用いる場合には、上記濃度のメチオニンと同等の網膜前駆細胞又は神経網膜前駆細胞の細胞分化を抑制する作用を奏する濃度で用いる事が好ましい。
本明細書において、神経突起伸張抑制剤とは神経節細胞の神経突起伸張を抑制する物質であり、具体的には、グルココルチコイドなど神経突起伸張抑制ホルモン、セマフォリン、Nogo、Mag、OMgpタンパク質、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンなど神経突起伸張抑制タンパク質等が挙げられる。グルココルチコイドとしては、例えば、コルチコステロン、コルチゾール、コルチゾン等が挙げられる。神経突起伸張抑制剤は、好ましくはグルココルチコイドであり、より好ましくはコルチコステロンである。
神経突起伸長抑制作用は、例えば網膜組織、または網膜組織に含まれる神経節細胞を評価対象の物質の存在下で接着培養し、伸張した神経突起の長さを画像解析ソフト（例えばImage J）等により計測することにより評価することができる。
神経突起伸張抑制剤としてコルチコステロンを用いる場合、連続上皮組織維持用培地中のコルチコステロン濃度は、網膜組織に含まれる神経節細胞等の神経突起伸張を抑制する濃度であり、通常0.1nM以上（好ましくは、1 nM以上、5 nM以上、10 nM以上、50nM以上、100 nM以上）である。連続上皮組織維持用培地中のコルチコステロン濃度の上限値は、連続上皮組織維持が達成される限り特に制限されないが、通常10 μM以下（好ましくは5 μM以下、1 μM以下）である。連続上皮組織維持用培地中のコルチコステロン濃度の範囲は、例えば、0.1 nM～10 μM、好ましくは、1 nM～5 μM、コルチコステロン以外の上記神経突起伸張抑制剤を用いる場合には、上記濃度のコルチコステロンと同等の神経突起伸長抑制作用を奏する濃度で用いる事が好ましい。
一態様において、連続上皮組織維持用培地は、上記濃度のメチオニン及びコルチコステロンを含む。一態様において、連続上皮組織維持用培地は、17.24 mg/L 超（好ましくは、23.62 mg/L以上、25 mg/L以上、25.75 mg/L以上、26 mg/L以上、26.81 mg/L以上、27mg/L以上、30mg/L以上）のメチオニン及び0.1 nM以上（好ましくは1 nM以上、より好ましくは5 nM以上、更に好ましくは10 nM以上、更に好ましくは50 nM以上、更に好ましくは100 nM以上）のコルチコステロンを含有する。
連続上皮組織維持用培地中の酸性アミノ酸、抗酸化剤及び網膜神経細胞保護物質の各濃度はより低濃度である事が好ましい。
本明細書において、酸性アミノ酸としては、具体的には、グルタミン酸又はアスパラギン酸が挙げられ、それぞれL体とD体が包含される。本明細書において、L体のグルタミン酸はL-グルタミン酸、L体のアスパラギン酸はL-アスパラギン酸、D体のグルタミン酸はD-グルタミン酸、D体のアスパラギン酸はD-アスパラギン酸と表記する。本明細書において、D体とL体を区別しない場合は、「グルタミン酸」又は「アスパラギン酸」と表記する。
連続上皮組織維持用培地中のL-グルタミン酸の濃度は、好ましくは50 μM未満（より好ましくは25 μM以下、更に好ましくは12.5 μM以下、更により好ましくは1 μM以下、とりわけ好ましくは0.1 μM以下）である。一態様において、連続上皮組織維持用培地中のグルタミン酸の濃度は、好ましくは50 μM未満（より好ましくは25 μM以下、更に好ましくは12.5 μM以下、更により好ましくは1 μM以下、とりわけ好ましくは0.1 μM以下）である。
連続上皮組織維持用培地中のL-アスパラギン酸の濃度は、好ましくは50 μM未満（より好ましくは25 μM以下、更に好ましくは12.5 μM以下、更により好ましくは1 μM以下、とりわけ好ましくは0.1 μM以下）である。一態様において、連続上皮組織維持用培地に含まれるアスパラギン酸の濃度は、好ましくは50 μM未満（より好ましくは25 μM以下、更に好ましくは12.5 μM以下、更に好ましくは10 μM以下、更に好ましくは1 μM以下、更に好ましくは0.1 μM以下）である。
好ましい一態様として、連続上皮組織維持用培地は、17.24 mg/L 超（好ましくは、23.62 mg/L以上、25 mg/L以上、25.75 mg/L以上、26 mg/L以上、26.81 mg/L以上、27 mg/L以上、30mg/L以上）のメチオニン及び0.1 nM以上（好ましくは1 nM以上、より好ましくは5 nM以上、更に好ましくは10 nM以上、更に好ましくは50 nM以上、更に好ましくは100 nM以上）のコルチコステロンのうち少なくとも一方（好ましくは両方）を含有し、かつ、L-グルタミン酸の濃度が50 μM未満（より好ましくは25 μM以下、更に好ましくは12.5 μM以下、更により好ましくは1 μM以下、とりわけ好ましくは0.1 μM以下）である。
さらに好ましい態様として、連続上皮組織維持用培地は、17.24 mg/L 超（好ましくは、23.62 mg/L以上、25 mg/L以上、25.75 mg/L以上、26 mg/L以上、26.81 mg/L以上、27 mg/L以上、30mg/L以上）のメチオニン及び0.1 nM以上（好ましくは1 nM以上、5 nM以上、10 nM以上、50 nM以上、100 nM以上）のコルチコステロンのうち少なくとも一方（好ましくは両方）を含有し、L-グルタミン酸の濃度が50μM未満（より好ましくは25μM以下、更に好ましくは12.5μM以下、更により好ましくは1μM以下、とりわけ好ましくは0.1μM以下）であり、且つL-アスパラギン酸の濃度が50μM未満（より好ましくは25μM以下、更に好ましくは12.5μM以下、更により好ましくは1μM以下、とりわけ好ましくは0.1μM以下）である。
本明細書において、抗酸化剤としては、グルタチオン、カタラーゼ、スーパーオキシドディスムターゼ、アルファトコフェロール、システイン等が挙げられる。一態様において、グルタチオン、カタラーゼ、スーパーオキシドディスムターゼ、アルファトコフェロール、及びシステインからなる群から選択される少なくとも1つ、好ましくは複数、より好ましくは全ての抗酸化剤の連続上皮組織維持用培地中の濃度が、以下の範囲内である：
グルタチオン：100 ng/mL以下（好ましくは10 ng/mL以下、より好ましくは1 ng/mL以下、更に好ましくは0.1 ng/mL以下）；
カタラーゼ：100 U/mL以下（好ましくは10 U/mL以下、より好ましくは1 U/mL以下、更に好ましくは0.1 U/mL以下）；
スーパーオキシドディスムターゼ：100 U/mL以下（好ましくは10 U/mL以下、より好ましくは1 U/mL以下、更に好ましくは0.1 U/mL以下）；
アルファトコフェロール：50 nM以下（好ましくは5 nM以下、より好ましくは0.5 nM以下、更に好ましくは0.05 nM以下）;及び
システイン：0.26 mM以下（好ましくは0.22 mM以下、より好ましくは0.18 mM以下、更に好ましくは0.1 mM以下）。
一態様において、連続上皮組織維持用培地中の、グルタチオン、カタラーゼ、スーパーオキシドディスムターゼ、及びアルファトコフェロールからなる群から選択される少なくとも1つ、好ましくは複数、より好ましくは全ての抗酸化剤の濃度は、連続上皮構造に影響を与える程度の抗酸化作用が認められない濃度であり、システインの濃度が0.26 mM以下 （好ましくは0.22 mM以下、より好ましくは0.18 mM以下、更に好ましくは0.1 mM以下）である。その他の抗酸化剤が含まれる場合、その濃度は、好ましくは、上記濃度における上記抗酸化剤と同等の抗酸化作用を奏する濃度以下、又は抗酸化作用が認められない濃度である。抗酸化作用は、例えば、電子スピン共鳴装置（Electron Spin Resonance、ESRともいう）によってフリーラジカルに類する一部の活性酸素を直接的にスピントラップ剤の存在下で測定し、抗酸化作用を評価することができる。活性酸素を測定するその他の様々な方法（例：活性酸素により生成する過酸化脂質の量や、酸化ストレスマーカーとして利用される8－ヒドロキシデオキシグアノシン、8－ニトログアノシンの量等を測定する等）によっても、抗酸化作用を評価することができる。活性酸素量等の測定には、市販されている測定キット（コスモ・バイオ、同仁化学研究所、サーモフィッシャーサイエンティフィック等）を利用してもよい。
本明細書において、網膜神経細胞保護物質としては、プロゲステロン等が挙げられる。一態様において、連続上皮組織維持用培地中のプロゲステロンの濃度は、100 nM以下、好ましくは50 nM以下、より好ましくは20 nM（または6.3 μg/mL(20.033708 nM)）以下、更に好ましくは10 nM以下、更に好ましくは3 nM以下の濃度である。一態様において、連続上皮組織維持用培地中のプロゲステロンの濃度は神経節細胞保護作用が認められない濃度である。その他の網膜神経細胞保護物質が含まれる場合、上記濃度のプロゲステロンと同等の網膜神経細胞保護作用を奏する濃度以下、又は網膜神経細胞保護作用が認められない濃度であることが好ましい。網膜神経細胞保護作用は、例えば、網膜組織に含まれる神経節細胞の割合や、アポトーシスマーカーとして知られる切断型カスパーゼ3陽性の神経節細胞の割合を同定し、その増減を同定することにより確認することができる。評価対象の物質が神経節細胞保護作用を示す場合、一定期間当該物質を作用させた網膜組織に含まれる神経節細胞の割合は、同物質を作用させなかった場合に比べ増加し、逆に切断型カスパーゼ3陽性神経節細胞の割合は減少する。神経節細胞の割合は上述した神経節細胞マーカー（例えばBRN3）に対する抗体による免疫組織染色、DAPI染色、PI染色、Hoechst染色等を用いて同定すればよい。
好ましい一態様として、連続上皮組織維持用培地は、17.24 mg/L 超（好ましくは、23.62 mg/L以上、25 mg/L以上、25.75 mg/L以上、26 mg/L以上、26.81 mg/L以上、27 mg/L以上、30mg/L以上）のメチオニン及び0.1 nM以上（好ましくは1 nM以上、より好ましくは5 nM以上、更に好ましくは10 nM以上、更に好ましくは50 nM以上、更に好ましくは100 nM以上）のコルチコステロンの少なくとも一方（好ましくは両方）を含有し、L-グルタミン酸の濃度が50μM未満（より好ましくは25μM以下、更に好ましくは12.5μM以下、更により好ましくは1μM以下、とりわけ好ましくは0.1μM以下）であり、更に、L-アスパラギン酸、グルタチオン、カタラーゼ、スーパーオキシドディスムターゼ、アルファトコフェロール、システイン及びプロゲステロンからなる群から選択される少なくとも1つ、好ましくは複数、より好ましくは全ての化合物の濃度が、以下の範囲内である：
L-アスパラギン酸：50μM未満（より好ましくは25μM以下、更に好ましくは12.5μM以下、更により好ましくは1μM以下、とりわけ好ましくは0.1μM以下）；
グルタチオン：100 ng/mL以下（好ましくは10 ng/mL以下、より好ましくは1 ng/mL以下、更に好ましくは0.1 ng/mL以下）；
カタラーゼ：100 U/mL以下（好ましくは10 U/mL以下、より好ましくは1 U/mL以下、更に好ましくは0.1 U/mL以下）；
スーパーオキシドディスムターゼ：100 U/mL以下（好ましくは10 U/mL以下、より好ましくは1 U/mL以下、更に好ましくは0.1 U/mL以下）；
アルファトコフェロール：50 nM以下（好ましくは5 nM以下、より好ましくは0.5 nM以下、更に好ましくは0.05 nM以下）;
システイン：0.26 mM以下（好ましくは0.22 mM以下、より好ましくは0.18 mM以下、更に好ましくは0.1 mM以下）；及び
プロゲステロン：100 nM以下（好ましくは50nM以下、より好ましくは20 nM以下（または6.3 μg/mL(20.033708 nM)）以下、更に好ましくは10 nM以下、更に好ましくは3 nM以下）。
連続上皮組織維持用培地中のヒポキサンチン、チミジン及びビタミンB12の各濃度は、より低い方が好ましい。
一態様において、連続上皮組織維持用培地中のヒポキサンチン濃度は、例えば15μM未満（好ましくは7.5μM以下、より好ましくは3.75μM以下、更に好ましくは1μM以下、更により好ましくは0.1μM以下（例えば、0μM））である。
一態様において、連続上皮組織維持用培地中のチミジン濃度は、1.5μM未満（好ましくは0.75μM以下、より好ましくは0.375μM以下、更に好ましくは0.1μM以下、更により好ましくは0.01μM以下（例えば、0μM））である。
一態様において、連続上皮組織維持用培地中のビタミンB12濃度は、0.5 μM未満（好ましくは0.253μM以下、より好ましくは0.129μM以下、更に好ましくは0.005μM以下）である。
好ましい態様において、連続上皮組織維持用培地中のヒポキサンチン、チミジン及びビタミンB12からなる群から選択される、2又は3の化合物の連続上皮組織維持用培地中の濃度が、上述の範囲内である。
好ましい一態様として、連続上皮組織維持用培地は、17.24 mg/L 超（好ましくは、23.62 mg/L以上、25 mg/L以上、25.75 mg/L以上、26 mg/L以上、26.81 mg/L以上、27 mg/L以上、30mg/L以上）のメチオニン及び0.1 nM以上（好ましくは1 nM以上、より好ましくは5 nM以上、更に好ましくは10 nM以上、更に好ましくは50 nM以上、更に好ましくは100 nM以上）のコルチコステロンのうち少なくとも一方（好ましくは両方）を含有し、かつ、L-グルタミン酸の濃度が50μM未満（より好ましくは25μM以下、更に好ましくは12.5μM以下、更により好ましくは1μM以下、とりわけ好ましくは0.1μM以下）であり、L-アスパラギン酸、グルタチオン、カタラーゼ、スーパーオキシドディスムターゼ、アルファトコフェロール、システイン、プロゲステロン、ヒポキサンチン、チミジン及びビタミンB12からなる群から選択される少なくとも1つ、好ましくは複数、より好ましくは全ての化合物の濃度が、以下の範囲内である：
L-アスパラギン酸：50μM未満（より好ましくは25μM以下、更に好ましくは12.5μM以下、更により好ましくは1μM以下、とりわけ好ましくは0.1μM以下）；
グルタチオン：100 ng/mL以下（好ましくは10 ng/mL以下、より好ましくは1 ng/mL以下、更に好ましくは0.1 ng/mL以下）；
カタラーゼ：100 U/mL以下（好ましくは10 U/mL以下、より好ましくは1 U/mL以下、更に好ましくは0.1 U/mL以下）；
スーパーオキシドディスムターゼ：100 U/mL以下（好ましくは10 U/mL以下、より好ましくは1 U/mL以下、更に好ましくは0.1 U/mL以下）；
アルファトコフェロール：50 nM以下（好ましくは5 nM以下、より好ましくは0.5 nM以下、更に好ましくは0.05 nM以下）;
システイン：0.26 mM以下（好ましくは0.22 mM以下、より好ましくは0.18 mM以下、更に好ましくは0.1 mM以下）；
プロゲステロン：100 nM以下（好ましくは50 nM以下、より好ましくは20 nM以下（または6.3 μg/mL(20.033708 nM)）以下、更に好ましくは10 nM以下、更に好ましくは3 nM以下）；
ヒポキサンチン：15μM未満（好ましくは7.5μM以下、より好ましくは3.75μM以下、更に好ましくは1μM以下、更により好ましくは0.1μM以下（例えば、0μM））；
チミジン：1.5μM未満（好ましくは0.75μM以下、より好ましくは0.375μM以下、更に好ましくは0.1μM以下、更により好ましくは0.01μM以下（例えば、0μM））；及び
ビタミンB12濃度は、0.5 μM未満（好ましくは0.253μM以下、より好ましくは0.129μM以下、更に好ましくは0.005μM以下）。
好ましい一態様として、連続上皮組織維持用培地は、以下の組成を有する：
メチオニン：17.24 mg/L 超（好ましくは、23.62 mg/L以上、25 mg/L以上、25.75 mg/L以上、26 mg/L以上、26.81 mg/L以上、27 mg/L以上、30mg/L以上）；
コルチコステロン：0.1 nM以上（好ましくは1 nM以上、より好ましくは5 nM以上、更に好ましくは10 nM以上、更に好ましくは50 nM以上、更に好ましくは100 nM以上）；
L-グルタミン酸：50μM未満（より好ましくは25μM以下、更に好ましくは12.5μM以下、更により好ましくは1μM以下、とりわけ好ましくは0.1μM以下）；
L-アスパラギン酸：50μM未満（より好ましくは25μM以下、更に好ましくは12.5μM以下、更により好ましくは1μM以下、とりわけ好ましくは0.1μM以下）；
ヒポキサンチン：15μM未満（好ましくは7.5μM以下、より好ましくは3.75μM以下、更に好ましくは1μM以下、更により好ましくは0.1μM以下（例えば、0μM））；
チミジン：1.5μM未満（好ましくは0.75μM以下、より好ましくは0.375μM以下、更に好ましくは0.1μM以下、更により好ましくは0.01μM以下（例えば、0μM））；及び
ビタミンB12濃度は、0.5 μM未満（好ましくは0.253μM以下、より好ましくは0.129μM以下、更に好ましくは0.005μM以下）。
該態様において、グルタチオン、カタラーゼ、スーパーオキシドディスムターゼ、アルファトコフェロール、L-システイン及びプロゲステロンからなる群から選択される少なくとも1つ、好ましくは複数、より好ましくは全ての化合物の濃度が、以下の範囲内である：
グルタチオン：100 ng/mL以下（好ましくは10 ng/mL以下、より好ましくは1 ng/mL以下、更に好ましくは0.1 ng/mL以下）；
カタラーゼ：100 U/mL以下（好ましくは10 U/mL以下、より好ましくは1 U/mL以下、更に好ましくは0.1 U/mL以下）；
スーパーオキシドディスムターゼ：100 U/mL以下（好ましくは10 U/mL以下、より好ましくは1 U/mL以下、更に好ましくは0.1 U/mL以下）；
アルファトコフェロール：50 nM以下（好ましくは5 nM以下、より好ましくは0.5 nM以下、更に好ましくは0.05 nM以下）;
システイン：0.26 mM以下（好ましくは0.22 mM以下、より好ましくは0.18 mM以下、更に好ましくは0.1 mM以下）；及び
プロゲステロン：100 nM以下（好ましくは50nM以下、より好ましくは20 nM（6.3 μg/mL）以下、更に好ましくは10 nM以下、更に好ましくは3 nM以下）。
連続上皮組織維持用培地は、市販されている培地を適宜配合して調製することができる。
連続上皮組織維持用培地の調製に使用可能な基礎培地としては、例えば、上述の酸性アミノ酸、抗酸化剤及びプロゲステロン等の網膜神経細胞保護物質のうち少なくとも1つ（例えば、酸性アミノ酸）、好ましくは2つ以上（例えば、酸性アミノ酸とその他のいずれかの物質）、より好ましくは全てを含まないか、上述した濃度範囲内である培地を挙げることができる。該基礎培地の一態様において、ヒポキサンチン、チミジン及びビタミンB12のうち、1つ、好ましくは2つ、より好ましくは3つが上述した濃度範囲内である。該基礎培地の一態様において、ヒポキサンチン及びチミジンが含まれず、ビタミンB12の濃度が上述した濃度範囲内である。
連続上皮組織維持用培地の調製に使用可能な基礎培地としては、メチル基供与体（例:S-アデノシルメチオニン）、メチル基供与体の基質（例：メチオニン、MTA、Hcy）及び神経突起伸長抑制剤（例；コルチコステロン）のうち少なくとも一つの濃度が上述した濃度範囲にある培地が好ましい。当該基礎培地に必要な物質を上述の濃度範囲となるように適宜補充することにより連続上皮組織維持用培地を調製することができる。
連続上皮組織維持用培地の調製に使用可能な基礎培地は、市販の基礎培地から、メーカー等が公表している成分表に基づき、上記選択基準に従って適宜選択すればよい。連続上皮組織維持用培地に使用可能な基礎培地としては、例えば、市販のNeurobasal培地(Neurobasal-A培地、フェノールレッド不含Neurobasal培地等を含む)、Improved MEM Zinc Option培地、MEM、DMEM、またはLeibovitz's L-15、E-MEM、G-MEM等を例示することができる。また、成分を個別にカスタマイズした培地を培地メーカーに注文し、購入することも可能であり、前述の記載に従って、連続上皮組織維持用培地の調製に使用可能な基礎培地用にカスタマイズした培地を用いてもよい。
コルチコステロンを補充するために補助培地を適宜配合してもよい。当該補助培地として、具体的には、B27サプリメント等を例示することができる。連続上皮組織維持用培地の一態様として、具体的には、Neurobasal培地にB27サプリメントを配合した培地を挙げることができる。該培地は適宜、L-グルタミン、タウリン、血清などを含んでいてもよい。
Neurobasal培地は、神経細胞培養用に開発された公知の基礎培地である（J. Neurosci. Res., vol. 35, p. 567-576, 1993）。Neurobasal培地は、当該報告から一部改変されているが、市販のNeurobasal培地として培地メーカーより入手可能である（例えば、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、21103049）。サーモフィッシャーサイエンティフィックより入手可能であるNeurobasal培地（21103049）の組成は、酸性アミノ酸（L-グルタミン酸及びL-アスパラギン酸）、プロゲステロン、ヒポキサンチン及びチミジンを含まず、DMEM/F12と比較してメチオニン濃度が高く（30 mg/L）、システイン濃度が高く（0.26 mM）、ビタミンB12濃度が低い（0.005μM）という特徴を有し、具体的な組成は以下の通りである。
Figure 0007150281000001
Figure 0007150281000002
B27サプリメントは、神経細胞培養用に開発された公知の補助培地である（J. Neurosci. Res., vol. 35, p. 567-576, 1993）。B27サプリメントはNeurobasal培地等の基礎培地に、通常、容量比率で約2%の割合で添加して使用される。コルチコステロンを含むB27サプリメントを、Neurobasal培地と組み合わせることにより、本発明の連続上皮組織維持用培地として使用可能である。例えば、上述のメチオニン濃度及びコルチコステロン濃度が達成されるように、メチオニンを含有する基礎培地（Neurobasal培地等）に対して、コルチコステロンを含有するB27サプリメントを添加し、本発明の連続上皮組織維持用培地を調製することができる。
B27サプリメント（J. Neurosci. Res., vol. 35, p. 567-576, 1993）は例えば培地メーカー（例：サーモフィッシャーサイエンティフィック、12587010）より購入する事ができ、組成は下記の通りである。
Figure 0007150281000003
また、別の態様において、連続上皮組織維持用培地は、細胞増殖用基礎培地（例：DMEM/F12混合培地（DMEM:F12=1:1））に対して、Neurobasal培地にB27サプリメントを配合した培地を容量比で1以上 (好ましくは2以上、より好ましくは3以上)の割合で含む培地を含む。
ここで、細胞増殖用基礎培地には特に制限は無く、市販の基礎培地を単独で、又は適宜混合して使用することができる。当該細胞増殖用基礎培地は、適宜添加剤（サプリメント）を含んでいても良く、具体的なサプリメントとして、N2サプリメントを例示することができる。
上記市販のNeurobasal培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック社、21103049）にB27サプリメント（サーモフィッシャーサイエンティフィック、12587010）を配合した培地および、Neurobasal培地にB27サプリメントを配合した培地とDMEM/F12混合培地（DMEM:F12=1:1）にN2サプリメントを配合した培地を3：1、2：1又は1：1の割合で混合した培地における、L-メチオニン、L-グルタミン酸、L-アスパラギン酸、L-システイン、ヒポキサンチン、チミジン、及びビタミンB12の濃度は、例えば、以下の通りである。
Figure 0007150281000004
一態様において、表3と同等の濃度のL-メチオニン、L-グルタミン酸、L-アスパラギン酸、L-システイン、ヒポキサンチン、チミジン、及びビタミンB12の組成を有する培地は、連続上皮組織維持用培地として使用し得る。ここで、「同等の濃度」とは、各因子の濃度について、独立して、±20％（好ましくは±10％、より好ましくは±5％、更に好ましくは±2.5％、更により好ましくは±1％）の範囲内を包含することを意味する。
一態様において、表3と同等の濃度のL-メチオニン、L-グルタミン酸、L-アスパラギン酸、ヒポキサンチン、チミジン、及びビタミンB12の組成を有し、コルチコステロン、グルタチオン、カタラーゼ、スーパーオキシドディスムターゼ、アルファトコフェロール、L-システイン及びプロゲステロンからなる群から選択される少なくとも1つ、好ましくは複数、より好ましくは全ての化合物の濃度が、以下の範囲内である培地を、連続上皮組織維持用培地として使用し得る：
コルチコステロン：0.1 nM以上（好ましくは1 nM以上、より好ましくは5 nM以上、更に好ましくは10 nM以上、更に好ましくは50 nM以上、更に好ましくは100 nM以上）；
グルタチオン：100 ng/mL以下（好ましくは10 ng/mL以下、より好ましくは1 ng/mL以下、更に好ましくは0.1 ng/mL以下）；
カタラーゼ：100 U/mL以下（好ましくは10 U/mL以下、より好ましくは1 U/mL以下、更に好ましくは0.1 U/mL以下）；
スーパーオキシドディムスターゼ：100 U/mL以下（好ましくは10 U/mL以下、より好ましくは1 U/mL以下、更に好ましくは0.1 U/mL以下）；
アルファトコフェロール：50 nM以下（好ましくは5 nM以下、より好ましくは0.5 nM以下、更に好ましくは0.05 nM以下）;
システイン：0.26 mM以下（好ましくは0.22 mM以下、より好ましくは0.18 mM以下、更に好ましくは0.1 mM以下）；及び
プロゲステロン：100 nM以下（好ましくは50nM以下、より好ましくは20 nM以下（または6.3 μg/mL(20.033708 nM)）以下、更に好ましくは10 nM以下、更に好ましくは3 nM以下）。
連続上皮組織維持用培地は適宜、L-グルタミン、タウリン、N2等を含んでいても良い。タウリンの濃度は、通常1μM～1000μM、好ましくは10μM～500μMである。また、N2を含む場合はB27を添加せず、代わりにコルチコステロン等のグルココルチコイドを上述の濃度で添加するのがより好ましい。
連続上皮組織維持用培地は、連続上皮組織を維持できる範囲において、培地として通常含まれ得る、緩衝剤（例えば、HEPES）、塩（例えば、塩化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム等の無機塩）もしくは抗酸化剤(例えば、2－メルカプトエタノール、一態様において抗酸化剤は含まない)等の調整剤、アミノ酸（例えば、非必須アミノ酸、一態様において酸性アミノ酸は含まない）、脂肪酸、糖、ビタミン、脂質もしくはピルビン酸等の栄養剤、抗生物質（例えば、ペニシリン、ストレプトマイシン）、細胞外マトリクス（例えば、マトリゲル、ラミニン、ラミニンフラグメント、ラミニン511-E8フラグメント）および色素（例えば、フェノールレッド）等から適宜選択される1以上の添加物が含まれ得るが、これらに限定されない。
連続上皮組織維持用培地は、血清培地、無血清培地いずれでもよい。好ましくは血清培地である。血清培地における血清の濃度は、通常0.1～20％（v/v）、好ましくは0.1～12％（v/v）（例、10％（v/v））である。本明細書において、0.1～20％（v/v）の濃度での血清添加による、培地中に含まれる組成の濃度変化については考慮しないものとする。
5．連続上皮構造の維持方法
本発明は、上述の連続上皮組織維持用培地中で網膜組織を培養することを含む、網膜組織の連続上皮構造を維持する方法を提供する。
連続上皮組織維持用培地は、上述した培地を使用できる。連続上皮組織維持用培地としては、例えば、Neurobasal培地にB27サプリメントを添加した培地が挙げられる。該培地は適宜、L-グルタミン、タウリン、血清などを含んでいてもよい。
本発明の方法で用いる網膜組織は、連続上皮構造を有する網膜組織である。網膜組織全体が連続上皮構造を呈する場合のみならず、網膜組織内の一部の領域のみが連続上皮構造を呈する場合も、該網膜組織を本発明の方法に使用し得る。例えば、ロゼット構造が生じた網膜組織であっても、連続上皮構造を有する領域を含んでいる限り、本発明の方法に使用し得る。網膜組織の一部にロゼット構造が生じていても、本発明の方法により連続上皮構造が維持され、連続上皮構造を含む領域をピンセット等により切り出して医薬用途等に適用し得るからである。好ましくは連続上皮構造を有し、ロゼット構造を有さない網膜組織が本発明の方法に用いられる。網膜組織が連続上皮構造又はロゼット構造を有するか否かは、上述した方法により確認する事ができる。
網膜組織の連続上皮構造が維持される限り、連続上皮組織維持用培地中で網膜組織を培養する期間は限定されず、培養の途中で連続上皮組織維持用培地以外の培地に交換してもよい。
連続上皮組織維持用培地を用いた場合、網膜組織に含まれる細胞の分化に重要な役割を果たすRAX（又はRX）及びCRXの発現が低下し、視細胞又は視細胞前駆細胞の出現率が低下する事がある。従って、視細胞前駆細胞への分化を促進するという観点から、発生初期段階の網膜組織、又は発生初期段階以降錐体視細胞前駆細胞の出現率が極大となるまでの段階にある網膜組織については、細胞増殖用基礎培地、又は、細胞増殖用基礎培地及び連続上皮組織維持用培地の混合培地中で一定期間培養した後に、該培地を連続上皮組織維持用培地に交換する事が好ましい。
例えば、発生初期段階の網膜組織を細胞増殖用基礎培地、又は細胞増殖用基礎培地及び連続上皮組織維持用培地の混合培地で培養する事により、連続上皮を維持しながらRAX及びCRXの発現低下を抑制し、視細胞又は視細胞前駆細胞への分化を促進する事ができる。RAX及びCRXの発現低下を抑制するという観点からは、細胞増殖用基礎培地の方がより好ましい。
一態様において、細胞増殖用基礎培地はメチル基供与体又はメチル基供与体の基質を含み、その濃度は連続上皮組織維持用培地と比較して低い。メチル基供与体の基質としてメチオニンを用いる場合、細胞増殖用基礎培地中のメチオニン濃度は、例えば、17.24 mg/L以下である。なお、メチオニンは必須アミノ酸であるため、細胞増殖用基礎培地はメチオニンを含む。細胞増殖用基礎培地中のメチオニン濃度は、通常5 mg/L以上（例えば、10 mg/L以上）である。
神経突起伸長抑制剤（例、コルチコステロン等のグルココルチコイド）は、細胞増殖用基礎培地中に含んでいてもよい。一態様において、細胞増殖用基礎培地中の神経突起伸長抑制剤の濃度は、神経突起伸長を抑制する濃度を下回る。例えば、細胞増殖用基礎培地中のコルチコステロン濃度は、例えば、1 nM未満、である。
細胞増殖用基礎培地は、好適には酸性アミノ酸を含む。一態様において、細胞増殖用基礎培地中のL-グルタミン酸濃度は50μM以上である。一態様において、細胞増殖用基礎培地中のL-アスパラギン酸濃度は50μM以上である。
細胞増殖用基礎培地は、網膜神経細胞保護物質（プロゲステロン等）を含んでいてもよいし、含まなくてもよい。一態様において、細胞増殖用基礎培地中のプロゲステロン濃度は20 nM以上である。
細胞増殖用基礎培地は、好適には、ヒポキサンチン、チミジン及びビタミンB12からなる群から選択される1、2又は3の化合物を含む。
一態様において、細胞増殖用基礎培地中のヒポキサンチン濃度は、例えば15μM以上である。
一態様において、細胞増殖用基礎培地中のチミジン濃度は、1.5μM以上である。
一態様において、細胞増殖用基礎培地中のビタミンB12濃度は、0.5 μM以上である。
好ましい態様において、ヒポキサンチン、チミジン及びビタミンB12からなる群から選択される、1、2又は3の化合物の細胞増殖用基礎培地中の濃度が、上述の範囲内である。
細胞増殖用基礎培地は、抗酸化物質として、グルタチオン、カタラーゼ、スーパーオキシドディスムターゼ、アルファトコフェロール、システインからなる群から選択される抗酸化物質を含んでいてもよいし、含まなくてもよい。一態様において、グルタチオン、カタラーゼ、スーパーオキシドディスムターゼ、アルファトコフェロール、及びシステインからなる群から選択されるの少なくとも1つ、好ましくは複数、より好ましくは全ての抗酸化物質の細胞増殖用基礎培地中の濃度が、以下の範囲内である：
グルタチオン：0.1 ng/mL以下（例えば0 ng/mL）；
カタラーゼ：0.1 U/mL以下（例えば0 U/mL）；
スーパーオキシドディスムターゼ：0.1 U/mL以下（例えば0 U/mL）；
アルファトコフェロール：0.05 nM以下（例えば、0 nM）;及び
システイン：0.1 mM以下。
一態様において、細胞増殖用基礎培地は、以下の組成を有する：
メチオニン：17.24 mg/L以下；
コルチコステロン：1 nM未満（例えば、0 nM）；
L-グルタミン酸：50μM以上；
L-アスパラギン酸：50μM以上；
ヒポキサンチン：15μM以上；
チミジン：1.5μM以上；及び
ビタミンB12：0.5 μM以上。
該態様において、プロゲステロン濃度が、20 nM以上であり得る。
該態様において、グルタチオン、カタラーゼ、スーパーオキシドディスムターゼ、アルファトコフェロール、及びL-システインからなる群から選択される少なくとも1つ、好ましくは複数、より好ましくは全ての抗酸化物質の濃度が、以下の範囲内であり得る：
グルタチオン：0.1 ng/mL以下（例えば0 ng/mL）；
カタラーゼ：0.1 U/mL以下（例えば0 U/mL）；
スーパーオキシドディスムターゼ：0.1 U/mL以下（例えば0 U/mL）；
アルファトコフェロール：0.05 nM以下（例えば、0 nM）;及び
システイン：0.1 mM以下。
細胞増殖用基礎培地としては、網膜前駆細胞、神経網膜前駆細胞、視細胞等の神経網膜を構成する細胞への分化誘導が可能な培地、例えば細胞におけるRAX及びCRXの発現を維持できる培地であれば特に限定はなく、適宜細胞増殖用培地として市販されている基礎培地を用いることができる。具体的には、例えば、BME培地、BGJb培地、CMRL 1066培地、Glasgow MEM (GMEM)培地、Improved MEM Zinc Option培地、IMDM培地、Medium 199培地、MEM培地、Eagle MEM培地、αMEM培地、DMEM培地、F-12培地、DMEM/F12培地、IMDM/F12培地、ハム培地、RPMI 1640培地、Fischer’s培地、Leibovitz's L-15培地又はこれらの混合培地など、動物細胞の培養に用いることのできる培地を挙げることができる。また、補助培地であるN2培地を添加した培地を用いてもよい。また、RAX及びCRXの発現を維持するために、市販されている上記基礎培地のうち、メチオニンの含有量が17.24mg/L以下の培地を選択することもできる。具体的には、BME培地、CMRL 1066培地、Glasgow MEM (GMEM)培地、Improved MEM Zinc Option培地、Medium 199培地、MEM培地、Eagle MEM培地、αMEM培地、F-12培地、DMEM/F12培地、ハム培地、RPMI 1640培地が挙げられる。また、RAX、CRXの発現を維持し、視細胞又は視細胞前駆細胞の出現率を維持するために、酸性アミノ酸を加えてもよい。
細胞増殖用基礎培地の好ましい態様として、DMEM培地、F12培地及びN2培地の混合物を挙げることができる。例えば、市販のDMEM/F12混合培地（DMEM:F12=1:1、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、10565042）にN2サプリメントを添加した培地等を用いることができ、混合の手間を省くことができる。
DMEM/F12混合培地は、周知の基礎培地であり、上述の通り、市販されている。
N2サプリメントは、インスリン、トランスフェリン、プロゲステロン、プトレスシン、亜セレン酸ナトリウム等を含む、公知の補助培地である。N2サプリメントは、例えば市販のサーモフィッシャーサイエンティフィック社製、17502048を購入して用いることもできる。
100×N2サプリメントの組成は、以下の通りである。
Figure 0007150281000005
DMEM/F12混合培地（DMEM:F12=1:1）にN2サプリメントを配合した培地は、例えば、以下の組成を有する：
Figure 0007150281000006
Figure 0007150281000007
一態様において、表5と同等の濃度のL-メチオニン、L-グルタミン酸、L-アスパラギン酸、L-システイン、プロゲステロン、ヒポキサンチン、チミジン、及びビタミンB12等の組成を有する培地は、細胞増殖用基礎培地として使用し得る。ここで、「同等の濃度」とは、各因子の濃度について、独立して、±20％（好ましくは±10％、より好ましくは±5％、更に好ましくは±2．5％、更により好ましくは±1％）の範囲内を包含することを意味する。
細胞増殖用基礎培地は適宜、L-グルタミン、タウリン等の非酸性アミノ酸類を含んでいても良い。タウリンの濃度は、通常1μM～1000μM、好ましくは10μM～500μMである。
細胞増殖用基礎培地は、血清培地、無血清培地いずれでもよい。好ましくは無血清培地である。血清培地における血清の濃度は、通常0.1～20％（v/v）、好ましくは0.1～12％（v/v）（例、10％（v/v））である。
細胞増殖用基礎培地として具体的には、DMEM/F12混合培地（DMEM:F12=1:1、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、10565042）にN2サプリメントを添加した培地等が挙げられる。連続上皮組織維持用培地として具体的には、例えば、Neurobasal培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、21103049）にB27サプリメント培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、12587010）を添加した培地を用いる事ができる。
細胞増殖用基礎培地及び連続上皮組織維持用培地の混合培地中に含まれる連続上皮組織維持用培地の割合（体積％）は、通常10％～90％、好ましくは40％～80％、より好ましくは50％～75％である。例えば、１体積部の細胞増殖用基礎培地（例、N2サプリメントを配合したDMEM/F12混合培地）と、１体積部以上（例、１～３体積部）の連続上皮組織維持用培地（例、B27サプリメントを配合したNeurobasal培地）とを混合し、混合培地を得る。これにより、例えば、連続上皮組織維持用培地を容量として50％以上（例えば、50～75％）含む、連続上皮組織維持用培地（例、B27サプリメントを配合したNeurobasal培地）と細胞増殖用基礎培地（例、N2サプリメントを配合したDMEM/F12混合培地）との混合培地を得ることができる。別の態様として、連続上皮組織維持用培地を容量として75％以上含む、連続上皮組織維持用培地（例、B27サプリメントを配合したNeurobasal培地）と細胞増殖用基礎培地（例、N2サプリメントを配合したDMEM/F12混合培地）との混合培地を挙げることができる。
細胞増殖用基礎培地及び連続上皮組織維持用培地の混合培地中で培養する期間、すなわち連続上皮組織維持用培地に交換する時期は、当業者であれば容易に決定する事ができる。例えば、免疫染色等の手法により、網膜組織の分化状態及び連続上皮構造の維持状態を確認する事で、使用する目的に適した培養期間を決定する事ができる。
本発明の一態様は、連続上皮組織維持用培地中で「発生初期段階の網膜組織」、「発生初期段階以降錐体視細胞前駆細胞の出現率が極大となる段階までの網膜組織」を培養することを含む、網膜組織の連続上皮構造を維持する方法である。「発生初期段階の網膜組織」及び「発生初期段階以降錐体視細胞前駆細胞の出現率が極大となる段階までの網膜組織」は、連続上皮構造を有する網膜組織であればどの分化段階でもよく、好ましくはロゼット様構造を有さない網膜組織である。
網膜組織の状態や培養条件等により異なるが、発生初期段階の網膜組織を連続上皮組織維持用培地以外の培地（例：細胞増殖用基礎培地）で培養すると、5日～70日程度でロゼット様構造が形成され、連続上皮構造が崩れる場合がある。上述した通り、細胞増殖用基礎培地及び連続上皮組織維持用培地の混合培地を用いる事により、ロゼット様構造が形成されて連続上皮構造が崩れることを一定期間防ぐことができる。
従って、本発明の一態様は、発生初期段階の網膜組織を連続上皮組織維持用培地以外の培地（例：細胞増殖用基礎培地、細胞増殖用基礎培地及び連続上皮組織維持用培地の混合培地）中で、80日以内（好ましくは50日以内など）の任意の期間培養した後、連続上皮組織維持用培地中で培養することを含む、網膜組織の連続上皮構造を維持する方法である。
発生初期段階の網膜組織を、任意の培地（例：細胞増殖用基礎培地、細胞増殖用基礎培地及び連続上皮組織維持用培地の混合培地、連続上皮組織維持用培地）で培養すると、網膜組織の分化が進み、上述した各種網膜細胞が分化する。例えば視細胞に着目すると、培養を継続することにより網膜組織中に視細胞前駆細胞が出現し、更に培養を継続すると錐体視細胞前駆細胞の出現率が極大となる段階を迎えた後、桿体視細胞前駆細胞へ分化する視細胞前駆細胞が出現する。実際に視細胞前駆細胞から桿体視細胞前駆細胞へ分化する培養条件として、例えば、10%-20%程度の血清、又は、0.1nMから1000nM程度のレチノイン酸またはその誘導体などを含む上記連続上皮組織維持用培地、細胞増殖用基礎培地または細胞増殖用基礎培地及び連続上皮組織維持用培地の混合培地を用いた場合、桿体視細胞前駆細胞が出現したことを観察できる。一方で、培養条件によっては、実際に桿体視細胞前駆細胞が出現しない場合もあり得るが、上記桿体視細胞前駆細胞が出現する条件で当該桿体視細胞前駆細胞が出現するために要する期間培養することにより、当該桿体視細胞前駆細胞が出現する網膜組織と同程度の段階の網膜組織を得ることができる。尚、上述の通り連続上皮組織維持用培地を用いた場合は、連続上皮組織維持用培地以外の培地（例：細胞増殖用基礎培地、又は、細胞増殖用基礎培地及び連続上皮組織維持用培地の混合培地）を用いた時に比べ、視細胞前駆細胞の出現が抑制される。
発生初期段階以降錐体視細胞前駆細胞の出現率が極大となる段階までの網膜組織の一態様として、視細胞前駆細胞が出現し始める段階の網膜組織が挙げられる。
「視細胞前駆細胞が出現し始める段階」は、当業者であれば、視細胞前駆細胞のマーカーの発現を指標に特定する事ができる。例えば、免疫染色等の手法により、網膜組織を視細胞前駆細胞のマーカーで染色する事ができる。ここで視細胞前駆細胞マーカーとしては、例えばCRXが挙げられる。すなわち、一態様において、「視細胞前駆細胞が出現し始める段階」は、「CRXの発現が検出され始める段階」である。
網膜組織の状態や培養条件等により異なるが、「発生初期段階の網膜組織」を細胞増殖用基礎培地、又は、細胞増殖用基礎培地及び連続上皮組織維持用培地の混合培地で1～30日間（好ましくは3日間～20日、より好ましくは3～15日間）培養する事により、視細胞前駆細胞が出現する。視細胞前駆細胞が出現し始める段階までは、細胞増殖用基礎培地（添加剤を含んでいてもよい）により培養することが好ましい。上述の通りRAX及びCRXの発現を維持し、視細胞前駆細胞への分化を促進するという観点からは、細胞増殖用基礎培地及び連続上皮組織維持用培地の混合培地より、細胞増殖用基礎培地で培養することがより好ましい。
一方、発生初期段階の網膜組織を、連続上皮組織維持用培地を含まない細胞増殖用基礎培地で培養し続けると、視細胞前駆細胞の出現後、1日～50日程度でロゼット様構造が認められ、連続上皮構造が崩れはじめる。このため、本発明の一態様として、視細胞前駆細胞が出現し始める段階以降は細胞増殖用基礎培地及び連続上皮組織維持用培地の混合培地、又は連続上皮組織維持用培地で培養することが好ましい。上述の通り、連続上皮組織維持用培地を用いることにより網膜組織に含まれる細胞の分化に重要な役割を果たすRAX、CRXの発現低下を伴う事がある。従って、本発明の一態様として、視細胞前駆細胞への分化を促進するという観点からは、視細胞前駆細胞が出現し始める段階以降は、細胞増殖用基礎培地及び連続上皮組織維持用培地の混合培地で培養することがより好ましい。すなわち、細胞増殖用基礎培地及び連続上皮組織維持用培地の混合培地で一定期間培養することにより、連続上皮構造を維持しつつ、網膜組織に含まれる視細胞等の分化・成熟を進める事ができる。従って、細胞増殖用基礎培地及び連続上皮組織維持用培地の混合培地で培養する事を含む、連続上皮構造が維持された網膜組織の製造方法もまた本発明の範疇である。
本発明の一態様において、発生初期段階以降錐体視細胞前駆細胞の出現率が極大となる段階までの任意の段階の網膜組織が得られるまで、好ましくは錐体視細胞前駆細胞の出現率が極大となる段階の網膜組織が得られるまで、細胞増殖用基礎培地及び連続上皮組織維持用培地の混合培地で培養する方法が挙げられる。
「錐体視細胞前駆細胞の出現率が極大となる段階」は、当業者であれば、視細胞前駆細胞マーカー、及び／又は錐体視細胞前駆細胞マーカーによる免疫染色及びDAPIによる核染色等により同定できる。
具体的には、例えば、分化が進行している網膜組織を一定期間（例えば1-20日）おきに回収し（例えば培養開始から40日後、50日後、60日後、70日後、80日後）、パラホルムアルデヒドなどで固定した後、凍結切片を作製する。当該凍結切片について例えばCRX抗体、TRβ2抗体、RXR-γ抗体等で染色し、同時にDAPIなどを用いて細胞核を染色した後、神経網膜組織中に含まれる全細胞数に対する錐体視細胞前駆細胞数（即ちCRX陽性かつRXR-γ陽性、又は、CRXおよびTRβ2を発現する細胞数）の割合を同定する。この時、上記一定期間中に出現する錐体視細胞前駆細胞マーカー陽性細胞の全細胞数に対する割合、すなわち出現率を、複数の時期（タイミング）で求めることにより、錐体視細胞前駆細胞マーカー陽性細胞の出現する割合が最も高い時期を「錐体視細胞前駆細胞の出現率が極大となる段階」として特定できる。
また、特定の期間(例えば1～7日間)、細胞増殖期にある細胞（ここでは増殖能を持つ網膜前駆細胞又は神経網膜前駆細胞）へ取り込まれるBrdU、又はEdU等を培養液中へ添加し、BrdU、又はEdU等を取り込んだ細胞が上述の錐体視細胞前駆細胞マーカーを発現する細胞として分化した割合を当業者に周知の免疫染色等によって測定し、当該割合が最も高い時期を判定することにより、「錐体視細胞前駆細胞の出現率が極大となる段階」を同定することができる。具体的には、例えばBrdUまたはEdUを任意の分化段階の網膜組織を培養する培養液中にBrdU又はEdu等を任意の1日間添加して培養し、その翌日回収した網膜組織についてBrdUまたはEdU陽性細胞のうちCRX及びRXR-γ陽性細胞の数および/または割合、又はCRX及びTRβ2陽性細胞の数および/または割合を測定する。神経網膜組織中の当該数および/または割合が最も高くなる、BrdUまたはEdUの添加日を「錐体視細胞前駆細胞の出現率が極大となる段階」と同定することができる。
具体的には、「錐体視細胞前駆細胞の出現率が極大となる段階」は、錐体視細胞前駆細胞の出現が認められてから30～50日後、好ましくは30～40日後に相当する。
網膜組織の状態や培養条件等により異なるが、発生初期段階以降の網膜組織であって、錐体視細胞前駆細胞の出現率が極大となる（ピークを迎える）段階までの網膜組織を連続上皮組織維持用培地以外の培地（例：細胞増殖用基礎培地及び連続上皮組織維持用培地の混合培地）で培養すると、錐体視細胞前駆細胞の出現率が極大となる（ピークを迎える）段階を越えた後、1日～50日程度でロゼット様構造が形成され、連続上皮構造が崩れていく。このため、また、本発明の一態様として、錐体視細胞前駆細胞の出現率が極大となる段階までに、培地を連続上皮組織維持用培地に交換し、連続上皮組織維持用培地中で網膜組織を培養する方法が挙げられる。
網膜組織の状態や培養条件等により異なるが、本発明の一態様において、新たな神経節細胞が出現しなくなる段階以降は、細胞増殖用基礎培地を含まない連続上皮組織維持用培地中で網膜組織を培養することが好ましい。
ここで、「新たな神経節細胞が出現しなくなる段階」は、当業者であれば容易に特定できる。例えば、特定の期間(例えば1-7日間)、細胞増殖期にある細胞（ここでは増殖能を持つ神経網膜前駆細胞）へ取り込まれるBrdU、又はEdU等を培養液中へ添加し、BrdU、又はEdU等を取り込んだ細胞が神経節細胞マーカーを発現する細胞として分化する割合をモニターすることにより特定できる。具体的には、「新たな神経節細胞が出現しなくなる段階」は、例えばBrdU陽性細胞のうち、新たなBRN3陽性細胞等が出現しなくなる段階として同定できる。
網膜組織の状態や培養条件等により異なるが、本発明の一態様として、発生初期段階の網膜組織を30～70日間（好ましくは40日間～60日間）培養する事により、錐体視細胞前駆細胞の出現率が極大となる段階の連続上皮構造を維持した網膜組織、又は、新たな神経節細胞が出現しなくなる段階の連続上皮構造を維持した網膜組織を得る事ができる。
網膜組織の状態や培養条件等により異なるが、本発明の一態様として、視細胞前駆細胞が出現し始めた段階の連続上皮構造を有する網膜組織を、例えば細胞増殖用基礎培地及び連続上皮組織維持用培地の混合培地で30～50日間（好ましくは30日間～40日間）培養する事により、錐体視細胞前駆細胞の出現率が極大となる段階の連続上皮構造を維持した網膜組織、又は、新たな神経節細胞が出現しなくなる段階の連続上皮構造を維持した網膜組織を得る事ができる。
上述した分化段階（例えば、発生初期段階の網膜組織、視細胞前駆細胞が出現し始める段階の網膜組織、錐体視細胞前駆細胞の出現率が極大となる段階の網膜組織、又は新たな神経節細胞が出現しなくなる段階の網膜組織）の網膜組織を連続上皮組織維持用培地中で培養する期間は、特に限定されない。例えば、特定の目的（例：移植）に用いるまで、連続上皮組織維持用培地中で培養することができる。すなわち、錐体視細胞前駆細胞の出現率が極大となる段階を越えて分化が進行した段階の網膜組織、又は新たな神経節細胞が出現しなくなる段階を越えて分化が進行した段階の網膜組織については、連続上皮組織維持用培地中で連続上皮構造を高効率に維持したまま培養できる。また、連続上皮構造が維持される限りにおいて、連続上皮組織維持用培地とそれ以外の培地を交換しながら培養する事も可能である。
桿体視細胞前駆細胞が出現し始める時期またはこれに相当する時期まで網膜組織の分化段階が進むと、それ以降は連続上皮組織維持用培地で培養しなくとも連続上皮構造が維持され得る。従って、桿体視細胞前駆細胞が出現し始めた後は、連続上皮組織維持用培地以外の培地（例：細胞増殖用基礎培地、細胞増殖用基礎培地及び連続上皮組織維持用培地の混合培地）に交換して培養を継続する事も可能であるし、連続上皮組織維持用培地のまま培養を継続してもよい。
「桿体視細胞前駆細胞が出現するまでの期間」は、桿体視細胞前駆細胞のマーカーであるNRLの発現を指標に、当業者であれば適宜設定する事ができる。具体的には、免疫染色等の手法により、NRLの発現を確認すればよい。本発明の一態様として、「桿体視細胞前駆細胞が出現するまでの期間」は、「網膜組織中に含まれる視細胞前駆細胞のうち、NRL陽性である桿体視細胞前駆細胞の割合が0.01%～10％、好ましくは0.1～5％、更に好ましくは1～3％に達するまでの期間」である。
網膜組織の状態や培養条件等により異なるが、「発生初期段階の網膜組織」の培養を開始した後、桿体視細胞前駆細胞が出現するまでの期間は、例えば、40日間～100日間、好ましくは50日間～80日間である。
網膜組織の状態や培養条件等により異なるが、視細胞前駆細胞が出現し始める段階の網膜組織の培養を開始した後、桿体視細胞前駆細胞が出現するまでの期間は、例えば、30日間～100日間、好ましくは40日間～70日間である。
網膜組織の状態や培養条件等により異なるが、錐体視細胞前駆細胞の出現率が極大となる段階の網膜組織、又は、新たな神経節細胞が出現しなくなる段階の網膜組織の培養を開始した後、桿体視細胞前駆細胞が出現するまでの期間は、例えば、10日間～80日間、好ましくは10日間～40日間である。
本発明の一態様として、発生初期段階以降の網膜組織（例：発生初期段階の網膜組織又は発生初期段階以降の網膜組織であって、錐体視細胞前駆細胞の出現率が極大となる段階までの網膜組織）を、桿体視細胞前駆細胞が出現するまでの期間またはこれに相当する期間、連続上皮組織維持用培地中で培養することを含む、網膜組織の連続上皮構造を維持する方法が挙げられる。
桿体視細胞前駆細胞が出現するまでの期間に相当する期間とは、（１）「発生初期段階の網膜組織」の培養を開始した後、例えば、40日間～100日間、好ましくは50日間～80日間、（２）視細胞前駆細胞が出現し始める段階の網膜組織の培養を開始した後、例えば、30日間～100日間、好ましくは40日間～70日間、（３）錐体視細胞前駆細胞の出現率が極大となる段階の網膜組織、又は、新たな神経節細胞が出現しなくなる段階の網膜組織の培養を開始した後、例えば、10日間～80日間、好ましくは10日間～40日間である。
網膜組織の連続上皮構造を維持する方法として、細胞増殖用基礎培地から段階的に連続上皮組織維持用培地に交換する方が好ましい。すなわち、発生初期段階以降の網膜組織を細胞増殖用基礎培地及び連続上皮組織維持用培地の混合培地中で一定期間培養した後、該培地を連続上皮組織維持用培地に交換する。
また、網膜組織を連続上皮組織維持用培地で一定期間培養することにより、連続上皮構造を維持しつつ、網膜組織に含まれる視細胞等の分化・成熟を更に進める事ができる。従って、網膜組織を連続上皮組織維持用培地で培養する事を含む、連続上皮構造が維持された網膜組織の製造方法もまた本発明の範疇である。
細胞増殖用基礎培地、又は、細胞増殖用基礎培地及び連続上皮組織維持用培地の混合培地中で培養する期間は、連続上皮構造が維持される限りにおいて特に限定しない。当業者であれば、目的とする細胞の分化段階および連続上皮構造の維持状態を確認しながら、適宜設定する事ができる。
本発明の方法において、網膜組織の培養は、好適には浮遊培養により行われる。浮遊培養を行う際に用いられる培養器としては、上述のものを用いることができる。
本発明の方法において、網膜組織の培養を行う際の培養温度、CO2濃度等の培養条件は適宜設定できる。培養温度は、例えば約30℃から約40℃、好ましくは約37℃である。CO2濃度は、例えば約1％から約10％、好ましくは約5％である。酸素濃度については過剰な神経節細胞の保護を抑制するという観点から40％ O2でなく、一般的な大気中の酸素濃度(20±2％)で培養する方が好ましい。高酸素濃度条件では、神経節細胞が過剰に生存し、ロゼット形成を起こしやすくなるからである。本発明の一態様において、一般的な大気中の酸素濃度(20±2％)より低い酸素濃度で培養することにより、神経節細胞等の過剰な神経突起伸長を抑制させ、網膜組織の連続上皮を維持することもできる。
本発明の好ましい一態様として下記方法を提供する。
下記（1）～（3）の工程を含む連続上皮構造を維持する方法、又は、連続上皮構造が維持された網膜組織の製造方法：
（1）「発生初期段階の網膜組織」を、細胞増殖用基礎培地で、（最長で）視細胞前駆細胞が出現し始めるまでの期間培養する工程、
（2）（1）で得られた網膜組織を、細胞増殖用基礎培地及び連続上皮組織維持用培地の混合培地中で、（最長で）新たな神経節細胞が出現しなくなる段階（神経節細胞の分化が完了する段階）までの期間、又は、錐体視細胞前駆細胞の出現率が極大となる段階までの期間培養する工程、及び
（3）（2）で得られた網膜組織を、連続上皮組織維持用培地で少なくとも桿体視細胞前駆細胞が出現するまでの期間培養する工程。
上記方法により製造される網膜組織は、連続上皮構造が維持され、かつ、網膜細胞（特に視細胞）の分化・成熟化が認められる。網膜細胞（特に視細胞）の分化・成熟化は、当業者であれば、網膜組織の分化段階に応じて、視細胞及び視細胞前駆細胞で発現するRecoverin、桿体細胞で発現するRhodopsin、桿体視細胞及び桿体視細胞前駆細胞で発現するNRL、錐体視細胞で発現するS-opsin及びLM-opsin等のマーカーで染色する事により確認する事ができる。
工程（1）について
細胞増殖用基礎培地としては、上述した培地であれば特に限定はない。細胞増殖用基礎培地の好ましい態様として、DMEM培地、F12培地及びN2培地の混合物を挙げることができる。例えば、市販のDMEM/F12混合培地（DMEM:F12=1:1、thermofisher scientific社製、10565042）等を用いることができる。
「視細胞前駆細胞が出現し始めるまでの期間」は、当業者であれば、視細胞前駆細胞マーカーの発現を指標に適宜設定する事ができる。例えば、免疫染色等の手法により、培養組織を視細胞前駆細胞のマーカーで染色する事ができる。ここで視細胞前駆細胞マーカーとしては、例えばCRXが挙げられる。すなわち、一態様において、「視細胞前駆細胞が出現し始めるまでの期間」とは、「CRXの発現が検出され始めるまでの期間」である。
培養条件等により異なるが、「発生初期段階の網膜組織」の培養を開始してから「視細胞前駆細胞が出現し始めるまでの期間」は、例えば、1日～30日(好ましくは3日～20日、より好ましくは3～15日間)である。
連続した上皮構造を維持した網膜組織においてロゼット様構造が生じる前であれば、視細胞前駆細胞が出現し始めるまでの期間を超えて培養してもよい。ロゼット様構造は上述した方法により確認することができる。網膜組織の状態や培養条件等により異なるが、具体的には、網膜組織中に視細胞前駆細胞が出現し始める段階から20日以内、好ましくは15日以内、より好ましくは10日以内、より好ましくは5日以内に工程（2）の培養液に切り替えればよい。
すなわち、視細胞前駆細胞が出現し始めるが、ロゼット様構造が生じる前までの期間は、網膜組織の状態や培養条件等により異なるが、具体的には工程(1)の培養開始から、1日間～40日間(好ましくは、1日間～30日間、より好ましくは3～20日、更に好ましくは3～15日間)である。
工程（2）について
細胞増殖用基礎培地及び連続上皮組織維持用培地は、上述した培地であれば特に限定しない。細胞増殖用基礎培地及び連続上皮組織維持用培地の混合培地中に含まれる連続上皮組織維持用培地の割合は、具体的には10％～90％、好ましくは40％～80％、より好ましくは50％～75％である。例えば、１体積部の細胞増殖用基礎培地（例、N2サプリメントを配合したDMEM/F12混合培地）と、１体積部以上（例、１～３体積部）の連続上皮組織維持用培地（例、B27サプリメントを配合したNeurobasal培地）とを混合し、混合培地を得る。
さらに、新たな神経節細胞が出現しなくなる段階（神経節細胞の分化が完了する段階）、好ましくは錐体視細胞前駆細胞の出現率が極大となる段階までに100％の連続上皮組織維持用培地へ切り替えることが好ましい。
ここで、「新たな神経節細胞が出現しなくなる段階（神経節細胞の分化が完了する段階）」および「錐体視細胞前駆細胞の出現率が極大となる段階」は、上述の通り、当業者であれば同定可能である。
工程（2）開始後、新たな神経節細胞が出現しなくなる段階（神経節細胞の分化が完了する段階）、又は、錐体視細胞前駆細胞の出現率が極大となる段階までのまでの期間は、例えば、50 日以下、（好ましくは10～50日間、より好ましくは10～40日間、更により好ましくは20～30日間）である。
工程（3）について
本工程で用いる連続上皮組織維持用培地は、上記3に記載の連続上皮組織維持用培地であれば特に限定されない。例えば、NeurobasalにB27サプリメントを配合（添加）した培地を用いる事ができる。
「桿体視細胞前駆細胞が出現するまでの期間」は、上述の通り、桿体視細胞前駆細胞のマーカーであるNRLの発現を指標に、当業者であれば適宜設定する事ができる。
工程（3）開始後、桿体視細胞前駆細胞が出現するまでの期間は、細胞の状態や培養条件等により異なるが、例えば、80日以下、（例、10日間～80日間、好ましくは20～50日間）である。
上述の通り、培養条件（例：無血清など）によっては、桿体視細胞前駆細胞の出現が認められない場合がある。その場合、工程（3）開始後、少なくとも10日以上（例、20日以上、30日以上、50日以上、80日以上）連続上皮組織維持用培地で培養することにより、網膜組織の連続上皮構造を維持することが可能である。
桿体視細胞前駆細胞が出現する時期まで網膜組織の分化が進むと、それ以降は連続上皮組織維持用培地で培養しなくとも連続上皮構造を維持できる。従って、桿体視細胞前駆細胞が出現する時期には、別培地（例：細胞増殖用基礎培地）に変えて培養を継続する事も可能であるし、連続上皮組織維持用培地のまま培養を継続してもよい。網膜組織をさらに分化・成熟させたい場合には、細胞増殖用基礎培地に変えて培養を継続する事が好ましい。
前記（1）～（3）の工程を含む方法により製造された網膜組織は、前記（1）～（3）の全工程又は前記（2）及び（3）の工程を連続上皮組織維持用培地で培養した場合に比べ、RAX、CRXの発現低下を伴うことがなく、網膜細胞（例：視細胞）の分化・成熟は進み、連続上皮構造は維持されたままである。
一態様において、前記（1）～（3）の工程を含む方法により製造された網膜組織は、前記（1）～（3）の全工程又は前記（2）及び（3）の工程を連続上皮組織維持用培地で培養した場合に比べ、網膜組織に含まれる視細胞前駆細胞又は視細胞の割合が1.1倍以上、好ましくは1.3倍以上、より好ましくは1.5倍以上である。又は、一態様において、前記（1）～（3）の工程を含む方法により製造された網膜組織は、視細胞前駆細胞又は視細胞が出現し始めた段階から15～20日後の網膜組織において、網膜組織の表面（即ち頂端面側）の50%以上、好ましくは60%以上、70%以上、80%以上において、視細胞又はその前駆細胞が存在し、前記（1）～（3）の全工程又は前記（2）及び（3）の工程を連続上皮組織維持用培地で培養した場合に比べて視細胞又はその前駆細胞が存在する割合が高い。
本発明の好ましい一態様として、下記方法を提供する。
下記（1）～（3）の工程を含む網膜組織の連続上皮構造を維持する方法、又は、連続上皮構造が維持された網膜組織の製造方法：
（1）発生初期段階の網膜組織（例、網膜前駆細胞を含み、かつ神経節細胞が出現していない分化段階にある網膜組織）を、細胞増殖用基礎培地(例：DMEM/F12培地及びN12培地を含む培地、N2サプリメントを配合したDMEM/F12混合培地)中で、20日間以下（例、3～20日、より好ましくは3～15日間、さらにより好ましくは7日間～15日間）培養する工程、
（2）（1）で得られた網膜組織を、細胞増殖用基礎培地（例：DMEM/F12培地及びN12培地を含む培地、N2サプリメントを配合したDMEM/F12混合培地）及び連続上皮組織維持用培地（例、B27サプリメントを配合したNeurobasal培地）の混合培地（容量比1：1～1：3）中で、10日間～40日間、好ましくは20日間～30日間培養する工程、及び
（3）（2）で得られた網膜組織を、連続上皮組織維持用培地（例、B27サプリメントを配合したNeurobasal培地）中で培養する工程（期間：例えば80日以下、好ましくは10日間～80日間、より好ましくは20～50日間）。
本発明の好ましい一態様として、下記方法を提供する。
下記（1）～（3）の工程を含む網膜組織の連続上皮構造を維持する方法、又は、連続上皮構造が維持された網膜組織の製造方法：
（1）発生初期段階の網膜組織（例、網膜前駆細胞を含み、かつ神経節細胞が出現していない分化段階にある網膜組織）を、細胞増殖用基礎培地(例：DMEM/F12培地及びN12培地を含む培地、N2サプリメントを配合したDMEM/F12混合培地)中で、CRXの発現が認められるまでの期間培養する工程、
（2）（1）で得られた網膜組織を、細胞増殖用基礎培地及(例：DMEM/F12培地及びN12培地を含む培地、N2サプリメントを配合したDMEM/F12混合培地)び連続上皮組織維持用培地（例、B27サプリメントを配合したNeurobasal培地）を容量比１：１～１：３で混合した混合培地中で、増殖細胞中のCRX陽性かつRXR-γ陽性細胞の出現率が極大となる頃まで培養する工程、及び
（3）（2）で得られた網膜組織を、連続上皮組織維持用培地（例、B27サプリメントを配合したNeurobasal培地）中で、少なくともNRLの発現が認められるまでの期間培養する工程。
本発明の一態様として、連続上皮構造を有する網膜組織を含む凝集体の調製物を提供する。この調製物は、連続上皮構造を有する網膜組織、すなわち網膜組織の表面の少なくとも５０％以上（好ましくは６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上）において視細胞又はその前駆細胞が連続して存在する網膜組織を含む凝集体、および連続上皮組織維持用培地を含む。本発明の一態様として、当該調製物は、連続上皮構造を有する網膜組織、すなわち網膜組織の表面に存在する頂端面の面積が、網膜組織の表面の面積に対し、少なくとも５０％以上（好ましくは６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上）である網膜組織を含む凝集体、および連続上皮組織維持用培地を含む。本発明の一態様として、この調製物における網膜組織は、長軸方向の直径が０．５ｍｍ以上（好ましくは０．６ｍｍ以上、０．８ｍｍ以上、１．０ｍｍ以上、１．２ｍｍ以上、１．４ｍｍ以上、１．６ｍｍ以上、１．８ｍｍ以上、２．０ｍｍ以上）である。障害のあるレシピエントの網膜組織の広い範囲を覆うことが可能であるという観点で、移植する網膜組織は大きい方が好ましい。０．５ｍｍ～１．０ｍｍを超える網膜組織は移植する際、ロゼット構造を生じやすい。しかし、本発明により０．５ｍｍ～１．０ｍｍを超える網膜組織でもロゼット構造を生じることなく、連続上皮構造を有する網膜組織を含む凝集体の調製物を効率的に提供することができる。
ここで、網膜組織の長軸方向の直径とは、例えば、実体顕微鏡を用いて撮影された画像に基づいて測定する場合、網膜組織の外周（輪郭、表面）中の任意の２点を結んだ直線の中で最も長い直線の長さを意味する。なお、網膜組織を含む凝集体の中には、複数の網膜組織が重なりあって存在する場合がある（例：クローバー型、図５－１などを参照）。複数の網膜組織を含むかどうかは当業者であれば容易に判断可能である。この場合、網膜組織の長軸方向の直径とは、凝集体中のそれぞれの網膜組織における長軸方向の直径を意味し、少なくとも１つの網膜組織の長軸方向の直径が０．５ｍｍ以上であればよい。好ましくは凝集体中の全ての網膜組織の長軸方向の直径が０．５ｍｍ以上である。より具体的には、形状的に見て２つの円又は楕円が重なった点（より具体的には、網膜組織を含む凝集体の外周の連続的な位置情報を仮定的に定めた場合に、当該位置情報を横軸、当該位置における接線の傾きを縦軸にプロットしたときに得られる曲線において、当該曲線の連続性が失われる点）で区切られた外周中の任意の2点を結んだ直線の中で最も長い直線の長さを測定する。さらに、網膜組織を含む凝集体の中には、網膜色素上皮細胞、及び/又は毛様体周辺部を含む場合がある。この場合も凝集体中に複数の網膜組織が存在する場合と同様に、網膜色素上皮および/または毛様体周辺部と網膜組織の接点で区切られた外周中の任意の2点を結んだ直線の中で最も長い直線の長さを測定する。
当該調製物中の網膜組織におけるRAX、CHX10および／またはCRXが発現する細胞の割合は、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、85%以上、90%以上、95%以上であることが好ましい。
当該調製物中に複数個の網膜組織を含む凝集体を含む場合、全個数に対する上記条件を満たす網膜組織を含む凝集体の個数の割合が、少なくとも５０％以上（好ましくは６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上）であることが好ましい。
当該調製物における連続上皮組織維持用培地は、本明細書で定義した連続上皮組織維持用培地である。連続上皮組織を維持できる限り、例えば、抗生物質、防腐剤、安定化剤、保存剤等が含まれていてもよい。
上記で得られる連続上皮構造を有する網膜組織は、細胞療法に用いられる細胞医薬品の有効成分として使用することができる。
6．医薬組成物
本発明は、本発明の方法により製造又は維持される連続上皮構造を含む網膜組織の有効量を含む医薬組成物を提供する。
該医薬組成物は、本発明の方法により製造又は維持される連続上皮構造を含む網膜組織の有効量、及び医薬として許容される担体を含む。
医薬として許容される担体としては、生理的な水性溶媒（生理食塩水、緩衝液、無血清培地等）を用いることが出来る。必要に応じて、移植医療において、移植する組織や細胞を含む医薬に、通常使用される保存剤、安定剤、還元剤、等張化剤等を配合させてもよい。
本発明の医薬組成物は、本発明の方法により製造又は維持される連続上皮構造を含む網膜組織を、適切な生理的な水性溶媒で懸濁することにより、懸濁液として製造することができる。必要であれば、凍結保存剤を添加して、凍結保存し、使用時に解凍し、緩衝液で洗浄し、移植医療に用いても良い。
本発明の方法で得られる網膜組織を、ピンセット等の器具を用いて適切な大きさに細切し、投与用の網膜組織片を調製することができる。また、シート状に切り出した疎網膜組織片をシート剤とすることもできる。すなわち、本発明の網膜組織から切り出された網膜組織片を含む医薬組成物もまた、本発明の範疇である。
本発明の方法で得られる網膜組織を、パパイン等の細胞分散液を用いて分散し、投与用の網膜細胞懸濁液を調製することができる。また、細胞懸濁液中から特異的抗体、アプタマー、ペプチド、などを用い、セルソーターにより有効成分を含む細胞を分離することもできる。
すなわち、本発明の網膜組織を分散、又は/及び精製して調製した細胞懸濁液を含む医薬組成物もまた、本発明の範疇である。
7．毒性評価方法
本発明の方法により製造又は維持された連続上皮構造を含む網膜組織は、網膜組織の障害に基づく疾患の治療薬のスクリーニングや、毒性評価における、疾患研究材料、創薬材料として有用であるので、被検物質の毒性・薬効評価用試薬とすることができる。例えば、網膜組織の障害に基づく疾患、特に遺伝性の障害に基づく疾患のヒト患者から、iPS細胞を樹立し、このiPS細胞を用いて本発明の方法により、連続上皮構造を含む網膜組織を製造又は維持する。当該網膜組織は、その患者が患っている疾患の原因となる網膜組織の障害をインビトロで再現し得る。そこで、本発明は、本発明の方法により製造される網膜組織に被検物質を接触させ、該物質が該組織に及ぼす影響を検定することを含む、該物質の毒性・薬効評価方法を提供する。
例えば、本発明の方法により製造又は維持された、特定の障害（例、遺伝性の障害）を有する網膜組織を、被検物質の存在下又は非存在下（ネガティブコントロール）で培養する。そして、被検物質で処理した網膜組織における障害の程度を、ネガティブコントロールと比較する。その結果、その障害の程度を軽減した被検物質を、当該障害に基づく疾患の治療薬の候補物質として、選択することができる。例えば、本発明の方法で製造又は維持した網膜組織の生理活性(例えば、生存促進、機能向上又は成熟化)をより向上させる被検物質を、医薬品の候補物質として探索することができる。あるいは、網膜組織の障害を有する疾患等の特定の障害を呈する遺伝子変異を有する体細胞から人工多能性幹細胞を調製し、当該細胞を本発明の方法で製造した網膜組織、またはこれから得られる網膜前駆細胞もしくは網膜層特異的神経細胞に被検物質を添加し、前記障害を呈するか否かを指標として当該障害の治療薬・予防薬として有効な被検物質の候補を探索することができる。
毒性評価においては、本発明の方法により製造又は維持された網膜組織を、被検物質の存在下又は非存在下（ネガティブコントロール）で培養する。そして、被検物質で処理した網膜組織における毒性の程度を、ネガティブコントロールと比較する。その結果、ネガティブコントロールと比較して、毒性を示した被検物質を、網膜組織に対する毒性を有する物質として判定することが出来る。
すなわち、本発明は、以下の工程を含む、毒性評価方法を包含する。
（工程1）本発明の方法により製造又は維持された網膜組織を、生存可能な培養条件で、一定時間、被検物質の存在下で培養した後、細胞の傷害の程度を測定する工程、
（工程2）本発明の方法により製造又は維持された網膜組織を、生存可能な培養条件で、一定時間、被検物質の非存在下又はポジティブコントロールの存在下で培養した後、細胞の傷害の程度を測定する工程、
（工程3）（工程1）及び（工程2）において測定した結果の差異に基づき、工程1における被検物質が有する毒性を評価する工程。
ここで、「被検物質の非存在下」とは、被検物質の代わりに培養液、被検物質を溶解している溶媒のみを添加することを包含する。また、「ポジティブコントロール」とは、毒性を有する既知化合物を意味する。細胞の傷害の程度を測定する方法としては、生存する細胞数を計測する方法、例えば細胞内ATP量を測定する方法、又は、細胞染色（例えば細胞核染色や細胞障害性マーカー）と形態観察により生細胞数を計測する方法等が挙げられる。
工程3において、被検物質が有する毒性を評価する方法としては、例えば、工程1の測定値と工程2におけるネガティブコントロールの測定値を比較し、工程1の細胞の傷害の程度が大きい場合に当該被検物質が毒性を有すると判断できる。また、工程1の測定値と工程2におけるポジティブコントロールの測定値を比較し、工程1の細胞の傷害の程度が同等以上の場合に当該被検物質が毒性を有すると判断できる。
得られた網膜前駆細胞を含む凝集体は、そのまま毒性・薬効評価用試薬として用いてもよい。網膜前駆細胞を含む凝集体を分散処理（例えば、トリプシン／EDTA処理又はパパイン処理）し、得られた細胞をFACS又はMACSを用いて選別することにより、高純度な網膜前駆細胞を得ることも可能である。
8．治療薬及び治療方法
本発明の方法により製造又は維持された連続上皮構造を含む網膜組織は、網膜の障害に基づく（起因する）疾患の移植医療に有用である。そこで、本発明は、本発明の方法により製造又は維持された連続上皮構造を含む網膜組織を含む、当該網膜組織の障害に基づく疾患の治療薬及び当該治療薬を患者に投与することを含む治療方法を提供する。当該網膜組織の障害に基づく疾患の治療薬として、或いは、当該網膜組織の損傷状態において、該当する損傷部位を補充するために、本発明の方法により製造又は維持された連続上皮構造を含む網膜組織を用いることが出来る。移植を必要とする、網膜組織の障害に基づく疾患、又は網膜組織の損傷状態の患者に、本発明の方法により製造又は維持された網膜細胞又はこれを含む網膜組織を移植し、障害を受けた網膜組織自体を補充することにより、網膜組織の障害に基づく疾患、又は網膜組織の損傷状態を治療することが出来る。網膜組織の障害に基づく疾患としては、例えば、網膜変性症、網膜色素変性症、加齢黄斑変性症、有機水銀中毒、クロロキン網膜症、緑内障、糖尿病性網膜症又は新生児網膜症などが挙げられる。
移植医療においては、組織適合性抗原の違いによる拒絶がしばしば問題となるが、移植のレシピエントの体細胞から樹立した多能性幹細胞（例、人工多能性幹細胞）を用いることで当該問題を克服できる。即ち、好ましい一態様において、本発明の方法において、多能性幹細胞として、レシピエントの体細胞から樹立した多能性幹細胞（例、誘導多能性幹細胞）を用いることにより、当該レシピエントについて免疫学的自己の神経組織又は神経系細胞を製造し、これが当該レシピエントに移植される。
また、レシピエントと免疫が適合する（例えば、HLA型やMHC型の一部又は全部が適合する）他者の体細胞から樹立した多能性幹細胞（例、人工多能性幹細胞）から、アロの網膜組織又は網膜細胞を製造し、これが当該レシピエントに移植されてもよい。
以下に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明は何らこれらに限定されるものではない。
実施例1
（ヒトES細胞を用いた網膜組織を含む細胞凝集体の製造例と網膜組織の切り出し方法）
CRX::VenusノックインヒトES細胞（KhES-1由来；Nakano, T. et al. Cell Stem Cell 2012, 10(6), 771-785）を「Ueno, M. et al. PNAS 2006, 103(25), 9554-9559」 「Watanabe, K. et al. Nat Biotech 2007, 25, 681-686」に記載の方法に準じて培養した。ヒトES細胞を培養するための培地にはDMEM/F12 培地（Sigma）に20% KSR（KnockOutTMSerum Replacement ; Invitrogen）、0.1 mM 2－メルカプトエタノール、2 mM L－グルタミン、1x非必須アミノ酸、7.5 ng/mL bFGFを添加した培地を用いた。
網膜組織を含む細胞凝集体は「Kuwahara et al. Nat Commun 2015, 19(6), 6286」に記載の方法を一部改変して調製した。すなわち、培養された前記ES細胞を、TrypLE Express（Invitrogen）を用いて単一分散した後、単一分散されたヒトES細胞を細胞非接着性の96ウェル培養プレート（スミロン スフェロイド プレート、住友ベークライト社）へ1ウェルあたり9x103細胞になるように100μLの無血清培地に浮遊させ、凝集体を速やかに形成させた後、37℃、5％CO2で培養した。その際の無血清培地には、F-12培地とIMDM培地の1：1混合液に10％ KSR、450 μM 1－モノチオグリセロール、1x Chemically defined lipid concentrate、5 mg/mL BSA、20 μM Y27632を添加した無血清培地を用いた。浮遊培養開始後6日目に最終濃度1.5 nMのBMP4を添加して浮遊培養を継続した。ウェル内の培養液の半量を3または4日おきに、BMPシグナル伝達経路作用物質を添加していない上記培地に交換した。浮遊培養開始後18日目の網膜組織を含む細胞凝集体を、3μM CHIR99021及び5μM SU5402を含む無血清培地（DMEM/F12培地に、1% N2 supplementが添加された培地）で4日間、すなわち浮遊培養開始後22日目まで浮遊培養した。その後、血清培地を用いて浮遊培養を継続したが、この時使用した血清培地と培養方法について、下記［A］から［C］に示した。網膜組織を含む細胞凝集体は適宜解析等に使用するまで浮遊培養を続けた。
［A］浮遊培養開始後22日目から56日目まで、DMEM/F12培地に10%牛胎仔血清、1% N2 supplement、および100 μMタウリンが添加された培地を用いて浮遊培養を行った。
［B］浮遊培養開始後22日目から38日目までは、DMEM/F12培地に10%牛胎仔血清、1% N2 supplement、および100μMタウリンが添加された培地を用い、浮遊培養開始後38日目から56日目まではDMEM/F12培地に10%牛胎仔血清、1% N2 supplement、および100 μMタウリンが添加された培地と、Neurobasal培地に、10％牛胎仔血清、2％ B27 supplement、および100μMタウリンが添加された培地を1：3の比率で混合した培地を用いて浮遊培養を行った。
［C］浮遊培養開始後22日目から56日目まで、Neurobasal培地（サーモサイエンティフィック社製、21103049）に、10％牛胎仔血清、2％ B27 supplement、および100 μMタウリンが添加された培地を用いて浮遊培養を行った。
なお、細胞凝集体のうち網膜組織ではない部分を、目視で確認した後適宜ピンセットを用いて切除し、網膜組織を含む細胞凝集体から網膜組織を切り出すことができる。上記培養方法［A］、［B］、及び［C］のいずれにおいても浮遊培養開始後30から40日目までに網膜組織を含む細胞凝集体から網膜組織を切り出した。浮遊培養開始後35日目に網膜組織を含む細胞凝集体から網膜組織を切り出した例を図1-1 a、bに示した。この後、上記［B］の培養方法に従って培養した網膜組織を含む細胞凝集体を蛍光顕微鏡（Biorevo BZ-9000, Keyence）で観察したところ、浮遊培養開始後42日目までにはほとんど全ての網膜組織でノックインされたCRX::Venusが呈する緑色蛍光を観察できた（図1-1 c、d）。
以上の条件で培養された網膜組織を含む細胞凝集体を4％パラホルムアルデヒドで固定した後凍結切片を調製し、抗aPKC抗体、抗RX抗体、抗CHX10抗体、又は抗GFP抗体を用いた免疫染色、または細胞核を染色するDAPI染色に供した。ここで、正常な網膜組織の頂端面に発現しており、正常な上皮構造の維持に関与していることが知られているaPKCを、網膜組織を含む細胞凝集体の頂端面を示すマーカーとして使用した。また、抗RXおよび抗CHX10抗体は網膜組織のマーカーとして使用し、抗GFP抗体はCRX遺伝子座にノックインされたVenusを検出するために使用した。蛍光顕微鏡で観察した結果、培養方法［A］では、aPKCが網膜組織を含む細胞凝集体の表面にはみとめられず、細胞凝集体の内側に巻き込まれてしまっていた（図1-2a）。また、抗RX抗体またはDAPIによる染色像からは、培養方法［A］で培養した網膜組織が、いわゆるロゼット様構造を形成していたことが分かった（図1-2b、d）。また、この時GFP陽性の視細胞前駆細胞は巻き込まれたaPKC陽性の頂端面に沿って出現していた（図1-2c）。一方、培養方法［B］および［C］ではaPKCが細胞凝集体の表面でみとめられ、抗RX抗体または抗CHX10抗体、DAPIによる染色像から、これらの網膜組織はロゼット様構造を形成せず、正常な生体網膜と類似した形態を維持することが分かった（図1-2e、f、h、i、j、l）。また、培養方法［B］に比べ、培養方法［C］では明らかに視細胞前駆細胞の数が少なかった（図1-2g、k）。
これらの結果から、培養方法［B］及び［C］により、連続上皮を維持したまま網膜組織を長期培養できることがわかった。また、培養方法［B］では、培養方法［C］に比べ出現する視細胞前駆細胞数を低下させることなく、連続上皮を維持できることがわかった。さらに、培養方法［A］で使用した培地に比べ、培養方法［B］及び［C］で使用した培地培地には、連続上皮形成を促進する物質が含まれている（あるいは多く含まれている）か、または連続上皮形成を阻害する物質が少ない（あるいは含まれていない）ことが示唆された。
実施例2
実施例1の結果から、実施例1で示した、培養方法［B］において浮遊培養開始38日目から56日目まで使用した培地には、培養方法［A］で使用した培地に比べ、連続上皮形成を促進する物質（あるいは連続上皮を維持する物質）が含まれている（あるいは多く含まれている）か、または連続上皮形成を阻害する物質が少ない（あるいは含まれていない）ことが示唆された。このため、培養方法［B］において浮遊培養開始38日目から56日目まで使用した培地に含まれる物質のうち、網膜組織の細胞分化や細胞保護、細胞死に大きく影響する可能性のある物質を培養方法［A］で使用した培地へ添加し、連続上皮率の向上に寄与するかどうかについて検討を行った。具体的には、神経節細胞等の細胞死を抑制すると考えられる抗酸化剤として最終濃度100 U/mLのスーパーオキシドディスムターゼ、100 U/mLのカタラーゼ、50 nMのアルファトコフェロール、及び100 ng/mLのグルタチオン（図２においてはこれらをまとめて「抗酸化剤」と記載した）を浮遊培養開始後38日目から54、55または56日目まで培養方法［A］で使用した培地へ添加して浮遊培養した。また、視細胞前駆細胞および神経節細胞といった網膜神経細胞の保護剤として知られるプロゲステロン（最終濃度100 nM）、神経節細胞等の神経突起伸張抑制剤として知られるコルチコステロン（最終濃度100 nM）を浮遊培養開始後38日目から54、55または56日目まで培養方法［A］で使用した培地へ添加して浮遊培養した。また、多能性幹細胞の未分化能維持に関与することが知られており、神経網膜前駆細胞などの未分化細胞の細胞分化を抑制する可能性のある物質としてメチオニン、又は抗酸化作用を持つアミノ酸であるシステインを、それぞれ、培養方法［B］において浮遊培養開始38日目から56日目まで使用した培地と同じ最終濃度となるように添加し、浮遊培養開始後38日目から54、55または56日目まで浮遊培養した。具体的な最終濃度は、10%牛胎仔血清、1% N2 supplement、2％B27 supplement、および100 μMタウリン等を添加する前の段階で、メチオニンが26.81 mg/L、システインが0.22 mMであった。培養した網膜組織を含む細胞凝集体を4％パラホルムアルデヒドで固定した後、凍結切片を調製し、抗aPKC抗体、抗RX抗体、又は抗CHX10抗体を用いた免疫染色、または細胞核を染色するDAPI染色を行った。蛍光顕微鏡を用いて、上記方法により調製した切片の網膜組織像を撮影し、画像を取得した。取得した網膜組織の画像について、Image Jを用い、RXまたはCHX10陽性である網膜組織の頂端面を示すaPKCが網膜組織を含む細胞凝集体の表面に連続的につながっている最長の長さと、細胞凝集体の外周の長さについて測定した。aPKCが連続的につながっている最長の長さを細胞凝集体の外周の長さで除することにより、連続した上皮構造を維持している割合、すなわち連続上皮率を求めた。その結果、何も添加しない場合に比べて抗酸化剤を加えた時はかえって連続上皮率が低下した。また、プロゲステロンを添加した場合も同様に連続上皮率が低下した。一方、コルチコステロン、またはメチオニンを添加した場合には、連続上皮率が高まった。抗酸化作用を持つシステインについては抗酸化剤と同様に、連続上皮率が低下した（図2）。なお、有意差検定については記載の通りt検定を用いて実施した。
これらの結果から、抗酸化剤、プロゲステロン、抗酸化作用を持つアミノ酸（システイン）など神経節細胞等を保護する物質はいずれも連続上皮率の低下に寄与し、逆にコルチコステロンなど神経節細胞等の神経突起伸張を抑制する物質は連続上皮率の向上に寄与することがわかった。また、多能性幹細胞の未分化能維持に関わると言われているメチオニンについても、連続上皮率の向上に寄与することがわかった。
実施例3
次に、培養方法［A］で使用する培地に含まれる物質のうち、網膜組織の細胞分化や細胞保護、細胞死に大きく影響する可能性のある物質を培養方法［B］において浮遊培養開始38日目から56日目まで使用する培地へ添加し、連続上皮率の低下に寄与するかどうかについて検討を行った。具体的には、細胞増殖の際合成が亢進することが知られている核酸又はその基質であり、添加により細胞増殖の亢進が期待できるヒポキサンチン、またはチミジン；或いは細胞増殖の際、補酵素として働き核酸合成を促進するビタミンB12を培養方法［A］に記載の培地と同じ最終濃度となるように添加し、浮遊培養開始後38日目から54、55または56日目まで浮遊培養を行った。具体的な最終濃度は、10%牛胎仔血清、1% N2 supplement、2％B27 supplement、および100 μMタウリン等を添加する前の段階で、ヒポキサンチンが15 μM、チミジンが1.5 μM、ビタミンB12が0.68 mg/Lであった。また、網膜組織において神経網膜前駆細胞からの細胞分化を促すことが知られている酸性アミノ酸としてL-グルタミン酸を、同じく酸性アミノ酸としてL-アスパラギン酸を、それぞれ単独または組み合わせて培養方法［A］に記載の培地と同じ最終濃度となるように添加し、浮遊培養開始後38日目から54、55または56日目まで浮遊培養を行った。具体的な最終濃度は、10%牛胎仔血清、1% N2 supplement、2％ B27 supplement、および100 μMタウリン等を添加する前の段階で、L-グルタミン酸が50 μM、L-アスパラギン酸が50μMであった。
実施例2に記載の方法と同様の方法で解析した結果、ヒポキサンチン、チミジン、及びビタミンB12は、いずれも網膜組織の連続上皮率の低下に寄与した（図3-1）。また、L－グルタミン酸は単独で連続上皮率の低下に寄与する一方、L－アスパラギン酸は単独で連続上皮率を若干低下させたが、その差は有意ではなかった。しかしながら、L－アスパラギン酸はL－グルタミン酸と組み合わせて添加する場合は、L-グルタミン酸を単独で添加する場合よりさらに網膜組織の連続上皮率を低下させた。なお、有意差検定については記載の通りt検定またはTukey検定を用いて実施した（図3-1または図3-2）。
これらの結果から、神経網膜前駆細胞の増殖に関与すると考えられる核酸や核酸合成の基質、及び核酸合成を促進するビタミンB12は、連続上皮率の低下に寄与することが分かった。また、細胞分化を促進させるL－グルタミン酸は、未分化細胞の維持に関与するメチオニンとは逆に連続上皮率の低下に寄与することがわかった。さらに、メカニズムは不明であるが、同じ酸性アミノ酸であるL－アスパラギン酸は、L－グルタミン酸と協調して連続上皮率の低下に寄与することが分かった。
実施例4
実施例1に記載の方法で浮遊培養開始後22日目まで培養した網膜組織を含む細胞凝集体を調製した後、下記［1］から［3］に示した血清培地を使用し、5％ CO2条件下で培養した。
［1］浮遊培養開始後22日目から38日目まで：DMEM/F12培地に10%牛胎仔血清、1% N2 supplement、および100 μMタウリンが添加された培地。
［2］浮遊培養開始後38日目から60日目まで：DMEM/F12培地に10%牛胎仔血清、1% N2 supplement、および100 μMタウリンが添加された培地と、Neurobasal培地に、10％牛胎仔血清、2％ B27 supplement、および100 μMタウリンが添加された培地を1：3の比率で混合した培地。
［3］浮遊培養開始後60日目から192日目まで：Neurobasal培地に、10％牛胎仔血清、2％ B27 supplement、および100 μMタウリンが添加された培地。
以上の条件で培養された網膜組織を含む細胞凝集体を4％パラホルムアルデヒドで固定した後凍結切片を調製し、aPKCに対する抗体を用いた免疫染色、または細胞核を染色するDAPI染色を行った。その結果、ほとんど全ての網膜組織において網膜組織の表面のaPKC発現が連続的に認められ、連続的な上皮構造が維持できることが分かった（図4a、図4b）。
これらのことから、培地成分中の成分を調整することにより、連続的な上皮構造を維持した網膜組織の長期培養が可能であることが分かった。また、連続的な上皮構造を維持した網膜組織は長軸方向の直径が少なくとも1.3mm以上であることが分かった。
実施例5
実施例4に記載の方法で調製した培養中の網膜組織を含む凝集体について、蛍光顕微鏡（Biorevo BZ-9000, Keyence）を用いて観察し、画像を取得した(図5-1、図5-2)。また、取得した網膜組織の画像についてImage Jを用いて測定を行い、網膜組織の長軸方向の直径を算出した(図5-3)。その結果、培養開始から100日目(d100)頃までは長軸方向の直径は増加する傾向がみとめられ、培養開始から40日目頃(d40)、55日目頃(d55)、70日目頃(d70)、100日目頃(d100)では、長軸方向の直径はそれぞれ平均で1mm超、1.2mm超、1.3mm超、1.4mmにわずかに足りない程度であることが分かった(図5-3)。また、網膜組織の長軸方向の直径は、大きいもので2mmを超えるものが含まれることが分かった（図5-1、図5-2）。
本発明は、網膜組織の連続上皮構造を維持し、移植に適した網膜組織片を製造するために有用である。
本出願は、日本で出願された特願2017-141381(出願日:2017年7月20日)を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims (17)

  1. 25mg/L以上75mg/L以下の濃度のメチオニン、及び1nM以上1μM以下の濃度のコルチコステロンを含有する培地中で網膜組織を培養することを含む、網膜組織の連続上皮構造を維持する方法。
  2. 培地中のL-グルタミン酸の濃度が50 μM未満である、請求項1に記載の方法。
  3. 培地中のL-アスパラギン酸の濃度が50 μM未満である、請求項2に記載の方法。
  4. グルタチオン、カタラーゼ、スーパーオキシドディスムターゼ、アルファトコフェロール、及びL-システインからなる群から選択される少なくとも1種の抗酸化剤の培地中の濃度が、以下の濃度範囲内である、請求項1～3のいずれか1項に記載の方法：
    グルタチオン：100 ng/mL以下、
    カタラーゼ：100 U/mL以下、
    スーパーオキシドディスムターゼ：100 U/mL以下、
    アルファトコフェロール：50 nM以下、
    システイン：0.26 mM以下。
  5. 培地中のプロゲステロン濃度が、100 nM以下である、請求項1～4のいずれか1項に記載の方法。
  6. ヒポキサンチン、チミジン及びビタミンB12からなる群から選択される少なくとも1種の核酸合成促進剤の培地中の濃度が、以下の濃度範囲内である、請求項1～5のいずれか1項に記載の方法：
    ヒポキサンチン：15μM未満、
    チミジン：1.5 μM未満、
    ビタミンB12：0.68 mg/L（0.5 μM）未満。
  7. 培地が、B27サプリメントを配合したNeurobasal培地を、容量比で50%以上含む、請求項1～6のいずれか1項に記載の方法。
  8. 前記網膜組織が、連続上皮構造を有する網膜組織である、請求項1～7のいずれか1項に記載の方法。
  9. 前記網膜組織が、培養開始時点において、発生初期又はそれより後の段階にある、請求項1～8のいずれか1項に記載の方法。
  10. 桿体視細胞前駆細胞が出現するまでの期間、網膜組織を培養する、請求項9に記載の方法。
  11. 以下の工程を含む、網膜組織の連続上皮構造の維持方法：
    （1）網膜前駆細胞を含み、かつ神経節細胞が出現していない分化段階にある網膜組織を、細胞増殖用基礎培地中で、最長で視細胞前駆細胞が出現するまでの期間培養する工程、
    （2）（1）で得られた網膜組織を、細胞増殖用基礎培地及び25mg/L以上75mg/L以下の濃度のメチオニン、及び1nM以上1μM以下の濃度のコルチコステロンを含有する連続上皮組織維持用培地を容量比1：1～1：3で混合した培地中で、最長で錐体視細胞前駆細胞の出現率が極大となる頃まで培養する工程、及び
    （3）（2）で得られた網膜組織を、25mg/L以上75mg/L以下の濃度のメチオニン、及び1nM以上1μM以下の濃度のコルチコステロンを含有する連続上皮組織維持用培地中で、少なくとも桿体視細胞前駆細胞が出現するまでの期間培養する工程。
  12. 25mg/L以上75mg/L以下の濃度のメチオニン、及び1nM以上1μM以下の濃度のコルチコステロンを含有する連続上皮組織維持用培地。
  13. ヒポキサンチン、チミジン及びビタミンB12からなる群から選択される少なくとも1種の核酸合成促進剤の培地中の濃度が、以下の濃度範囲内である、請求項12に記載の連続上皮組織維持用培地：
    ヒポキサンチン：15μM未満、
    チミジン：1.5 μM未満、
    ビタミンB12：0.68 mg/L（0.5 μM）未満。
  14. B27サプリメントを配合したNeurobasal培地を、容量として50%以上含む、Neurobasal培地と細胞増殖用基礎培地の混合培地である、請求項12または13に記載の網膜組織の連続上皮組織維持用培地。
  15. B27サプリメントを配合したNeurobasal培地を、容量として75%以上含む、請求項14に記載の網膜組織の連続上皮組織維持用培地。
  16. 細胞増殖用基礎培地が、BME培地、BGJb培地、CMRL 1066培地、Glasgow MEM (GMEM)培地、Improved MEM Zinc Option培地、IMDM培地、Medium 199培地、MEM培地、Eagle MEM培地、αMEM培地、DMEM培地、F-12培地、DMEM/F12培地、IMDM/F12培地、ハム培地、RPMI 1640培地、Fischer’s培地、Leibovitz's L-15培地、またはこれらの混合培地からなる群から選択される1の培地である、請求項14又は15に記載の網膜組織の連続上皮組織維持用培地。
  17. 細胞増殖用基礎培地が、DMEM/F12培地、またはDMEM/F12培地と別の細胞増殖用基礎培地との混合培地である、請求項14又は15に記載の網膜組織の連続上皮組織維持用培地。
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