KR102500914B1 - 신경 조직의 제조 방법 - Google Patents

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야스시 히라미네
요시키 사사이
마사요 다카하시
마사요 다카하시
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스미토모 파마 가부시키가이샤
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Abstract

본 발명은, 하기 단계 (1) ~ (3) 을 포함하는, 신경 세포 또는 신경 조직의 제조 방법을 제공한다:
(1) 다능성 줄기 세포를, 피더 세포 부재 하에서, 1) TGF-β 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질 및/또는 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질, 및 2) 미분화 상태를 유지하는 인자를 포함하는 배양 배지에서 배양하는 제 1 단계,
(2) 제 1 단계에서 얻어진 세포를 부유 배양해, 세포 응집체를 형성시키는 제 2 단계, 및
(3) 제 2 단계에서 얻어진 응집체를, 분화 유도 인자의 존재 하에서 또는 부재 하에서 부유 배양해, 신경 세포 또는 신경 조직을 포함하는 응집체를 얻는 제 3 단계.

Description

신경 조직의 제조 방법 {PRODUCTION METHOD FOR NERVE TISSUE}
본 발명은, 다능성 줄기 세포로부터, 망막 조직 등의 신경 조직을 제조하는 방법에 관한 것이다.
다능성 줄기 세포로부터 망막 조직 등과 같은 신경 조직을 제조하는 방법으로서, 균일한 다능성 줄기 세포 응집체를 무혈청 배지 안에서 형성시켜, 이것을 부유 배양하고, 분화 유도용의 배양액 중에서 적절히 분화 유도 인자 등의 존재 하에 부유 배양해, 의도된 신경 세포로의 다능성 줄기 세포의 분화를 유도하는 것을 포함하는, 신경 조직의 제조 방법이 보고되어 있다 (특허문헌 1 및 비특허문헌 1). 예를 들어, 다능성 줄기 세포로부터 다층 망막 조직을 얻는 방법 (비특허문헌 2 및 특허문헌 2), 및 균일한 다능성 줄기 세포 응집체를 Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질을 포함하는 무혈청 배지에서 형성시켜, 이것을 기저 막 표본의 존재 하에서 부유 배양하고, 이를 혈청-함유 배지 안에서 부유 배양하는 것을 포함하는, 다층 망막 조직을 얻는 방법 (비특허문헌 3 및 특허문헌 3) 이 알려져 있다. 또한, 다능성 줄기 세포의 시상하부 조직으로의 분화 유도 방법 (특허문헌 4 및 비특허문헌 4), 및 다능성 줄기 세포의 신경 전구 세포로의 분화 유도 방법 (비특허문헌 5 및 6) 이 또한 보고되어 있다.
이들 제조법의 출발 물질로서 다능성 줄기 세포는, 특히 영장류 다능성 줄기 세포의 경우, 피더 세포 존재 하에 및 미분화 상태를 유지하기 위한 인자의 첨가와 함께 미분화 상태를 유지하면서 배양되고 있었다. 최근, 미분화 상태를 유지하는 배양의 개량이 이루어졌고, 영장류 다능성 줄기 세포를 피더 세포 부재 하에 (피더-프리) 및 미분화 상태를 유지하기 위한 인자의 첨가와 함께 배양하는 방법이 보고되고 있다 (비특허문헌 7, 8 및 9). 이러한 방법으로 피더-프리 배양된 다능성 줄기 세포를 출발 재료로서 사용하는 신경 세포 또는 신경 조직의 안정적 제조 방법이 요망되고 있다.
[문헌 목록]
[특허 문헌]
[특허문헌 1] WO 2009/148170
[특허문헌 2] WO 2011/055855
[특허문헌 3] WO 2013/077425
[특허문헌 4] WO 2013/065763
[비특허 문헌]
[비특허문헌 1] Cell Stem Cell, 3, 519-32 (2008)
[비특허문헌 2] Nature, 472, 51-56 (2011)
[비특허문헌 3] Cell Stem Cell, 10(6), 771-775 (2012)
[비특허문헌 4] Nature, 480, 57-62 (2011)
[비특허문헌 5] Nature Biotechnology, 27(3), 275-80 (2009)
[비특허문헌 6] Proc Natl Acad Sci USA, 110(50), 20284-9 (2013)
[비특허문헌 7] Nature Methods, 8, 424-429 (2011)
[비특허문헌 8] Scientific Reports, 4, 3594 (2014)
[비특허문헌 9] In Vitro Cell Dev Biol Anim., 46, 247-58 (2010)
본 발명이 해결하고자 하는 과제는, 피더 세포 부재 하에서 제조 또는 미분화 상태를 유지하도록 배양된 다능성 줄기 세포로부터 망막 조직 등과 같은 신경 조직 및 신경 세포를 제조하는 방법을 제공하는 것에 있다.
본 발명자들은, 상기 과제를 해결하기 위하여 예의 연구를 수행하였고, 다능성 줄기 세포를 피더 세포 부재 하에 (피더-프리 조건 하에), TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질 및/또는 소닉 헤지호그 (Sonic hedgehog) 시그널 전달 경로 작용 물질을 함유하는 배지에서 배양하고 나서, 세포를 부유 배양에 적용하는 것에 의해, 표면이 매끄럽고 내부가 조밀하고 미분화 상태를 유지하는 구형 세포 응집체를 고효율로 형성할 수 있는 것을 알아냈다. 또한, 본 발명자들은 이러한 고품질의 세포 응집체를 이용하면, 망막 조직 등의 신경 조직 및 신경 세포를 높은 효율로 유도할 수 있다는 것을 밝혀내어, 그 결과 본 발명을 완성했다.
즉, 본 발명은 하기에 관한 것이다.
[1] 하기 단계 (1) ~ (3) 을 포함하는, 신경 세포 또는 신경 조직의 제조 방법:
(1) 다능성 줄기 세포를, 피더 세포 부재 하에서, 1) TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질 및/또는 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질, 및 2) 미분화 상태를 유지하는 인자를 포함하는 배지에서 배양하는 제 1 단계,
(2) 제 1 단계에서 얻어진 세포를 부유 배양해, 세포 응집체를 형성시키는 제 2 단계, 및
(3) 제 2 단계에서 얻어진 응집체를, 분화-유도 인자의 존재 하에 또는 부재 하에서 부유 배양해, 신경 세포 또는 신경 조직을 포함하는 응집체를 얻는 제 3 단계.
[2] [1] 에 있어서, 제 2 단계에서, 제 1 단계에서 얻어진 세포를 분산시키고, 분산된 세포를 부유 배양하는 제조 방법.
[3] [1] 또는 [2] 에 있어서, 미분화 상태를 유지하는 인자가 FGF 시그널 전달 경로 작용 물질인 제조 방법.
[4] [3] 에 있어서, FGF 시그널 전달 경로 작용 물질이 bFGF 인 제조 방법.
[5] [1] 내지 [4] 중 어느 하나에 있어서, 제 2 단계에서, 세포를 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하는 무혈청 배지 중에 부유 배양하는 제조 방법.
[6] [1] 내지 [5] 중 어느 하나에 있어서, 제 3 단계에서, 응집체를 분화-유도 인자의 존재 하에 부유 배양하는 제조 방법.
[7] [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 있어서, TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질이, Nodal/Activin 시그널 전달 경로 저해 물질, TGFβ 시그널 전달 경로 저해 물질, 또는 BMP 시그널 전달 경로 저해 물질인 제조 방법.
[8] [1] 내지 [7] 중 어느 하나에 있어서, TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질이, Lefty, SB431542, A-83-01 또는 LDN193189 인 제조 방법.
[9] [1] 내지 [8] 중 어느 하나에 있어서, 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질이 Shh, SAG 또는 퍼모파민 (Purmorphamine) 인 제조 방법.
[10] [1] 내지 [9] 중 어느 하나에 있어서, 제 3 단계에서의 분화-유도 인자가 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질인 제조 방법.
[11] [10] 에 있어서, BMP 시그널 전달 경로 작용 물질이 BMP2, BMP4, BMP7 및 GDF7 로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질인 제조 방법.
[12] [10] 에 있어서, BMP 시그널 전달 경로 작용 물질이 BMP4 인 제조 방법.
[13] [1] 내지 [12] 중 어느 하나에 있어서, 제 3 단계에서 얻어지는 응집체가 망막 조직을 포함하는 제조 방법.
[14] [1] 내지 [13] 중 어느 하나에 있어서, 제 3 단계에서 얻어지는 응집체가 망막 원세포, 신경 망막 원세포, 광수용체 전구 세포, 광수용체 세포, 막대형 광수용체 세포, 원뿔형 광수용체 세포, 수평 세포, 아마크린 세포, 개재뉴런, 신경절 세포, 망막 색소 표피 세포 및 모양체 주연부 (ciliary marginal zone) 세포로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 세포를 포함하는 제조 방법.
[15] [13] 또는 [14] 에 있어서, 제 3 단계에서의 분화-유도 인자가 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질이며, 제 2 단계에서의 배지가 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하는 제조 방법.
[16] [15] 에 있어서, 다능성 줄기 세포가 인간 다능성 줄기 세포이며, 제 2 단계에서의 배지 중의 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질 농도가 10 nM ~ 700 nM 에서 SAG 의 소닉 헤지호그 시그널 전달 작용에 상응하며, 망막 조직이 인간 망막 조직인 제조 방법.
[17] [15] 또는 [16] 에 있어서, 제 3 단계에서 제 2 단계의 개시 이후 1 일째 내지 9 일째에 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질이 배지에 첨가되는 제조 방법.
[18] [13] 또는 [14] 에 있어서, 제 3 단계에서, 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질의 농도가 700nM 에서 SAG 의 소닉 헤지호그 시그널 전달 작용에 상응하는 농도 이하인 배지에서 응집체를 배양하는 제조 방법.
[19] [1] 내지 [9] 중 어느 하나에 있어서, 제 3 단계에서의 분화-유도 인자가 TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질 및/또는 Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질인 제조 방법.
[20] [19] 에 있어서, TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질이 Lefty, SB431542, A-83-01 또는 LDN193189 인 제조 방법.
[21] [19] 또는 [20] 에 있어서, Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질이 IWR-1-엔도인 제조 방법.
[22] [1] 내지 [9] 또는 [19] 내지 [21] 중 어느 하나에 있어서, 제 3 단계에서 얻어지는 응집체가 대뇌 조직을 포함하는 제조 방법.
[23] [1] 내지 [22] 중 어느 하나에 있어서, 제 1 단계의 배양 기간이 0.5 시간 ~ 144 시간인 제조 방법.
[24] [1] 내지 [23] 중 어느 하나에 있어서, 제 1 단계가 접착 배양법으로 행해지는 제조 방법.
[25] [1] 내지 [24] 중 어느 하나에 있어서, 제 3 단계에서, 제 2 단계 개시 이후 3일째 내지 6일째에 분화-유도 인자가 배지에 첨가되는 제조 방법.
[26] [1] 내지 [15] 또는 [17] 내지 [25] 중 어느 하나에 있어서, 다능성 줄기 세포가 영장류 다능성 줄기 세포인 제조 방법.
[27] [1] 내지 [26] 중 어느 하나에 있어서, 다능성 줄기 세포가 인간 다능성 줄기 세포인 제조 방법.
[28] [1] 내지 [27] 중 어느 하나에 있어서, 다능성 줄기 세포가 유도된 다능성 줄기 세포인 제조 방법.
[29] [1] 내지 [28] 중 어느 하나에 있어서, 제 2 단계에서, 균일한 응집체가 형성되는 제조 방법.
[30] [1] 내지 [29] 중 어느 하나에 있어서, 부유 배양이 기저 막 표본의 부재 하에서 행해지는 제조 방법.
[31] [1] 내지 [30] 중 어느 하나에 따른 방법에 의해 제조된 신경 세포 또는 신경 조직을 함유하는, 시험 물질의 독성 또는 약물 효능 평가용 시약.
[32] [1] 내지 [30] 중 어느 하나에 따른 방법에 의해 제조되는 신경 세포 또는 신경 조직에 시험 물질을 접촉시키고, 물질이 세포 또는 조직에 미치는 영향을 검출하는 것을 포함하는, 시험 물질의 독성 또는 효능 평가 방법.
[33] [1] 내지 [30] 중 어느 하나에 따른 방법에 의해 제조되는 신경 세포 또는 신경 조직을 포함하는, 신경 세포 또는 신경 조직의 장애로 인한 질환의 치료용 약제.
[34] [33] 에 있어서, 신경 세포 또는 신경 조직이 망막 원세포, 망막층-특이적 뉴런, 망막 조직, 대뇌 신경 전구 세포, 대뇌층-특이적 뉴런 또는 대뇌 조직인 약제.
[35] [1] 내지 [30] 중 어느 하나에 따른 방법에 의해 제조되는 신경 세포 또는 신경 조직의 유효량을 이식을 필요로 하는 대상에게 이식하는 것을 포함하는, 신경 세포 또는 신경 조직의 장애로 인한 질환의 치료 방법.
[36] 신경 세포 또는 신경 조직의 장애로 인한 질환의 치료에서 사용하기 위한 [1] 내지 [30] 중 어느 하나에 기재된 방법에 의해 제조되는 신경 세포 또는 신경 조직.
[37] [1] 내지 [30] 중 어느 하나에 따른 방법에 의해 제조되는 신경 세포 또는 신경 조직을 유효 성분으로서 포함하는 약학 조성물.
본 발명에 따르면, 피더 세포 부재 하에서 배양된 다능성 줄기 세포로부터, 고품질의 세포 응집체, 및 망막 조직 등의 신경 조직, 및 신경 세포를 고효율로 제조할 수 있다.
도 1 은 실시예 1 의 배양 조건, 및 배양 후의 인간 iPS 세포의 형태를 나타낸다.
도 2 는 실시예 2 의 배양 조건, 및 배양 후의 세포의 명시야 이미지 (bright field image) 및 Oct3/4 에 관한 면역 조직 염색 이미지 (immunohistochemical staining image) 를 나타낸다.
도 3 은 응집체의 명시야 이미지 (A 및 B), 및 응집체의 형태의 수준을 정량화한 그래프 (C) 를 나타낸다.
도 4 는 응집체의 명시야 이미지를 나타낸다.
도 5 는 응집체의 명시야 이미지 A 및 B, 및 신경 조직 마커 (네스틴 (Nestin), TuJ1, PSA-NCAM) 에 관한 응집체의 면역 조직 염색 이미지 (C-E) 를 나타낸다.
도 6 은 실시예 7 의 배양 조건, 및 망막 조직 마커 (Chx10, Rx) 에 관한 응집체의 면역 조직 염색 이미지 (A-D) 를 나타낸다.
도 7 은 실시예 8 의 배양 조건, 배양 후의 응집체의 명시야 이미지 (A-H), 및 응집체의 형태의 수준을 정량화한 그래프 (I) 을 나타낸다.
도 8 은 신경 조직 마커 (네스틴, TuJ1, PSA-NCAM) 에 관한 응집체의 면역 조직 염색 이미지를 나타낸다.
도 9 는 실시예 9 의 배양 조건, 및 망막 조직 마커 (Chx10, Rx) 에 관한 응집체의 면역 조직 염색 이미지 (A-H) 를 나타낸다.
도 10 은 다양한 조건 하에 형성된 응집체의 명시야 이미지를 나타낸다.
도 11 은 실시예 11 의 배양 조건, 및 신경 조직 마커 (네스틴, TuJ1, PSA-NCAM) 에 관한 응집체의 면역 조직 염색 이미지 (A-F) 을 나타낸다.
도 12 는 실시예 12 의 배양 조건, 및 망막 조직 마커 (Chx10, Rx) 에 관한 응집체의 면역 조직 염색 이미지 (A-D) 을 나타낸다.
도 13 은 실시예 13 의 배양 조건, 및 Chx10 에 관한 응집체의 면역 조직 염색 이미지 (A-D) 을 나타낸다.
도 14 는 실시예 14 의 배양 조건, 응집체의 명시야 이미지, 및 망막 조직 마커 (Chx10, Rx) 에 관한 응집체의 면역 조직 염색 이미지를 나타낸다.
도 15 는 실시예 15 의 배양 조건, 및 배양 후의 세포의 명시야 이미지 (A-D) 를 나타낸다.
도 16 은 실시예 16 의 배양 조건, 배양 후의 세포의 명시야 이미지 (A, B), 및 Chx10 에 관한 응집체의 면역 조직 염색 이미지 (C) 을 나타낸다.
도 17 은 실시예 17 의 배양 조건, 및 배양 후의 세포의 명시야 이미지 (A-F) 를 나타낸다.
도 18 은 실시예 18 의 배양 조건, 배양 후의 세포의 명시야 이미지 (A-E), 및 Chx10 에 관한 응집체의 면역 조직 염색 이미지 (F-I) 를 나타낸다.
도 19 는 실시예 19 의 배양 조건, 배양 후의 세포의 명시야 이미지 (A-D), 및 Chx10 에 관한 응집체의 면역 조직 염색 이미지 (E-H) 를 나타낸다.
도 20 은 실시예 20 의 배양 조건, 및 배양 후의 세포의 명시야 이미지 (A-J) 를 나타낸다.
도 21 은 실시예 21 의 배양 조건, 및 배양 후의 세포의 명시야 이미지 (A-L) 를 나타낸다.
도 22 는 실시예 22 의 배양 조건, 배양 후의 세포의 명시야 이미지 (A-C), 및 Chx10 에 관한 응집체의 면역 조직 염색 이미지 (D-F) 를 나타낸다.
도 23 은 실시예 23 의 배양 조건, 배양 후의 세포의 명시야 이미지 (A, B), 및 Chx10 에 관한 응집체의 면역 조직 염색 이미지 (C, D) 를 나타낸다.
도 24 는 실시예 24 의 배양 조건, 및 배양 후의 세포의 명시야 이미지 (A-D) 를 나타낸다.
도 25 는 실시예 25 의 배양 조건, 배양 후의 세포의 명시야 이미지 (A-D) 를 나타낸다.
도 26 은 실시예 26 의 배양 조건, 배양 후의 세포의 명시야 이미지 (A-E), 및 Chx10 에 관한 응집체의 면역 조직 염색 이미지 (F-I) 를 나타낸다.
도 27 은 실시예 27 의 배양 조건, 인간 ES 세포의 배양 이미지 (A), 배양 후의 세포의 명시야 이미지 (B-D) 및, Rx::GFP 의 형광 이미지 (E, F) 를 나타낸다.
도 28 은 망막 조직 마커 (Rx, Chx10, Crx, Blimp1, Brn3b) 및 Ki67 에 관한 응집체의 면역 조직 염색 이미지 (A-F) 를 나타낸다.
도 29 는 망막 조직 마커 (칼레티닌 (Calretinin), S-옵신 (S-opsin), Rx, Pax6, 레코베린 (Recoverin), 로돕신 (Rhodopsin), NRL, 칼빈딘 (Calbindin)) 에 관한 응집체의 면역 조직 염색 이미지 (A-H) 를 나타낸다.
도 30 은 배양 후의 세포의 명시야 이미지 (A, B), 및 망막 조직 마커 (SSEA1, Mitf, Aqp1) 에 관한 응집체의 면역 조직 염색 이미지 (C-E) 를 나타낸다.
도 31 은 실시예 31 의 배양 조건, 및 배양 후의 세포의 명시야 이미지 (A-C) 를 나타낸다.
도 32 는 대뇌 조직 마커 (Sox2, FoxG1, Pax6, Tbr1, Ctip2) 에 관한 응집체의 면역 조직 염색 이미지 (A-F) 를 나타낸다.
도 33 은 다양한 조건으로 배양한 세포의 명시야 이미지 (A-J) 를 나타낸다.
도 34 는 실시예 33 의 배양 조건, 배양 후의 세포의 명시야 이미지 (A, B), 및 Chx10 에 관한 응집체의 면역 조직 염색 이미지 (C, D) 를 나타낸다.
도 35 는 실시예 34 의 배양 조건, 배양 후의 세포의 명시야 이미지 (A-D), 및 Chx10 에 관한 응집체의 면역 조직 염색 이미지 (E-H) 를 나타낸다.
도 36 은 실시예 35 의 배양 조건, 배양 후의 세포의 명시야 이미지 (A-E), 및 Chx10 에 관한 응집체의 면역 조직 염색 이미지 (F-I) 를 나타낸다.
1. 정의
본 발명에 있어서, "줄기 세포" 는 분화능 및 분화능을 유지한 증식능 (특히 자가-재생산 능력 (self-renewal competence)) 을 갖는 미분화 세포를 의미한다. 줄기 세포에는, 분화능에 따라 다능성 줄기 세포 (pluripotent stem cell), 복능성 줄기 세포 (multipotent stem cell), 단능성 줄기 세포 (unipotent stem cell) 등의 하위집단이 포함된다. 다능성 줄기 세포란, 시험관내 (in vitro) 에서 배양하는 것이 가능하고, 3 배엽층 (외배엽, 중배엽, 내배엽) 및/또는 배체외 조직 (extraembryonic tissue) 에 속하는 임의의 세포 계보로 분화하는 능력 (분화 다능성 (pluripotency)) 을 갖는 줄기 세포를 나타낸다. 복능성 줄기 세포란, 모든 종류는 아니지만, 복수종의 조직 또는 세포로 분화하는 능력을 갖는 줄기 세포를 의미한다. 단능성 줄기 세포란, 특정 조직 또는 세포로 분화하는 능력을 갖는 줄기 세포를 의미한다.
다능성 줄기 세포는, 수정란, 복제 배아, 생식줄기 세포, 조직내줄기 세포, 체세포 등으로부터 유도할 수 있다. 다능성 줄기 세포의 예는, 배아 줄기 세포 (ES 세포), EG 세포 (배아 생식 세포), 유도 다능성 줄기 세포 (iPS 세포: induced pluripotent stem cell) 등을 포함한다. 중간엽 줄기 세포 (MSC: mesenchymal stem cell) 로부터 얻어지는 Muse 세포 (다계통-분화 스트레스 내성 세포 (Multi-lineage differentiating stress enduring cell)), 및 생식 세포 (예를 들어, 정소) 로부터 수득된 GS 세포도 다능성 줄기 세포에 포함된다. 배아 줄기 세포는 1981 년에 처음으로 수립되었고, 1989년 이래로 녹아웃 마우스 (knockout mouse) 제조에도 응용되고 있다. 1998 년에는 인간 배아 줄기 세포가 수립되었고, 이는 재생 의학에도 이용되고 있다. ES 세포는, 내부 세포 덩어리를 피더 세포 상에서 또는 LIF 를 포함하는 배지에서 배양함으로써 제조될 수 있다. ES 세포의 제조 방법은, 예를 들어 WO 96/22362, WO 02/101057, US 5,843,780, US 6,200,806, US 6,280,718 등에 기재되어 있다. 배아 줄기 세포는, 소정의 기관으로부터 입수될 수 있고, 시판품을 구입할 수도 있다. 예를 들어, 인간 배아 줄기 세포, KhES-1, KhES-2 및 KhES-3 은, 쿄토 대학의 Institute for Frontier Medical Sciences 로부터 입수가능하다. 인간 배아 줄기 세포인 Rx::GFP 세포주 (KhES-1 유래) 는 RIKEN 으로부터 입수가능하다. 마우스 배아 줄기 세포인 EB5 세포는 Incorporated Administrative Agency RIKEN 으로부터 입수가능하고, 마우스 배아 줄기 세포인 D3 세포주는 ATCC 로부터 입수가능하다.
ES 세포 중 하나인 핵이식 ES 세포 (ntES 세포) 는, 적출된 난자에 체세포의 핵을 이식해 제조된 복제 배아로부터 수립될 수 있다.
EG 세포는, 원시 생식 세포를 mSCF, LIF 및 bFGF 를 포함하는 배지에서 배양 함으로써 제조할 수 있다 (Cell, 70: 841-847, 1992).
본 발명에서 "유도 다능성 줄기 세포" 는, 체세포를 공지된 방법 등에 의해 리프로그래밍 (reprogramming) 함으로써 다능성을 갖도록 유도된 세포이다. 구체적으로는, 선유아세포, 말초 혈액 단핵 세포 등의 분화 체세포를, Oct3/4, Sox2, Klf4, Myc (c-Myc, N-Myc, L-Myc), Glis1, Nanog, Sall4, lin28, Esrrb 등을 포함하는 리프로그래밍 유전자로 이루어지는 군에서 선택되는 복수의 유전자의 조합의 발현에 의해 리프로그래밍해 다능성을 갖도록 유도된 세포가 언급될 수 있다. 바람직한 리프로그래밍 인자의 조합의 예는, (1) Oct3/4, Sox2, Klf4 및 Myc (c-Myc 또는 L-Myc), 및 (2) Oct3/4, Sox2, Klf4, Lin28 및 L-Myc (Stem Cells, 2013; 31:458-466) 를 포함한다.
유도 다능성 줄기 세포는, 2006 년에 Yamanaka 등에 의해 마우스 세포에서 수립되었다 (Cell, 2006, 126(4), pp.663-676). 유도 다능성 줄기 세포는, 2007 년에 인간 선유아세포로부터도 수립되었고, 배아 줄기 세포와 유사한 다능성 및 자가-재생산 능력을 갖는다 (Cell, 2007, 131(5), pp.861-872; Science, 2007, 318(5858), pp.1917-1920; Nat. Biotechnol., 2008, 26(1), pp.101-106).
유전자 발현에 의한 직접 리프로그래밍을 기초로 하는 제조 방법 이외에, 유도 다능성 줄기 세포는 화합물의 첨가 등에 의해 체세포로부터 수득될 수도 있다 (Science, 2013, 341, pp. 651-654).
수립된 유도 다능성 줄기 세포를 또한 입수할 수 있고, 예를 들어 쿄토 대학에서 수립된 인간 유도 다능성 세포주 예컨대 201B7 세포, 201B7-Ff 세포, 253G1 세포, 253G4 세포, 1201C1 세포, 1205D1 세포, 1210B2 세포 또는 1231A3 세포는 쿄토 대학 및 iPS Academia Japan, Inc. 에서 입수 가능하다. 수립된 유도 다능성 줄기 세포로서, 예를 들어 쿄토 대학에서 수립된 Ff-I01 세포 및 Ff-I14 세포는 쿄토 대학에서 입수 가능하다.
유도 다능성 줄기 세포를 얻는데 사용되는 체세포는 특별히 제한되지는 않지만, 조직 유래의 선유아세포, 혈구계 세포 (예를 들어, 말초 혈액 단핵 세포, T 세포), 간세포, 췌장 세포, 장 표피 세포, 평활근 세포 등이 언급될 수 있다.
여러 유형의 유전자의 발현에 의해 리프로그래밍하여 유도 다능성 줄기 세포를 제조할 때, 유전자 발현을 위한 수단은 특별히 제한되지 않는다. 상기 수단의 예는, 바이러스 벡터 (예를 들어, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 센다이바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터) 를 사용한 감염법, 플라스미드 벡터 (예를 들어, 플라스미드 벡터, 에피소말 벡터) 를 사용한 유전자 도입법 (예를 들어, 인산 칼슘법, 리포펙션법, 레트로넥틴법, 전기 천공법), RNA 벡터를 사용한 유전자 도입법 (예를 들어, 인산 칼슘법, 리포펙션법, 전기 천공법), 단백질의 직접 주입법 등을 포함한다.
유도 다능성 줄기 세포를 제조 할 때, 이는 피더 세포 존재 하에서 또는 피더 세포 부재 하에서 (피더-프리) 제조될 수 있다. 피더 세포 존재 하에서 유도 다능성 줄기 세포를 제조할 때, 공지된 방법에 의해 미분화 상태를 유지하는 인자의 존재 하에서 유도 다능성 줄기 세포를 제조할 수 있다. 피더 세포 부재 하에서 유도 다능성 줄기 세포를 제조하는데 사용되는 배지는 특별히 제한되지는 않으나, 공지된 배아 줄기 세포 및/또는 유도 다능성 줄기 세포의 유지 배지, 및 피더-프리 하에서 유도 다능성 줄기 세포를 수립하기 위한 배지를 사용할 수 있다. 피더-프리 조건 하에서 유도 다능성 줄기 세포를 수립하기 위한 피더-프리 수립용 배지의 예는, Essential 8 배지, TeSR 배지, mTeSR 배지, mTeSR-E8 배지, StemFit 배지 등과 같은 피더-프리 배지를 포함한다. 유도 다능성 줄기 세포를 제조할 때, 예를 들어, 이는 피더 세포 부재 하에서 센다이바이러스 (Sendaivirus) 벡터를 사용하여 체세포에 Oct3/4, Sox2, Klf4 및 Myc 의 4 개의 인자를 유전자 도입함으로써 제조될 수 있다.
본 발명에 사용되는 다능성 줄기 세포는, 바람직하게는 ES 세포 또는 유도 다능성 줄기 세포이며, 보다 바람직하게는 유도 다능성 줄기 세포이다.
복능성 줄기 세포로서, 조혈 줄기 세포, 신경 줄기 세포, 망막 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포 등과 같은 조직 줄기 세포 (또한 소위 조직내 줄기 세포, 조직-특이적 줄기 세포 또는 체성 줄기 세포) 가 언급될 수 있다.
유전자-조작된 다능성 줄기 세포는, 예를 들어 상동 재조합 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 조작되는 염색체 상의 유전자의 예는, 세포 마커 유전자, 조직 적합성 항원 유전자, 신경 세포의 장애로 인한 질환 관련 유전자 등을 포함한다. 염색체 상의 표적 유전자는, Manipulating the Mouse Embryo, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1994); Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993); Biomanual Series 8, Gene Targeting Making of Mutant Mouse using ES cell, YODOSHA CO., LTD. (1995); 등에 기재된 방법을 사용하여 조작될 수 있다.
구체적으로는, 예를 들어, 조작되는 표적 유전자 (예를 들어, 세포 마커 유전자, 조직 적합성 항원 유전자, 질환 관련 유전자 등) 를 포함하는 게놈 DNA 를 단리하고, 단리된 게놈 DNA를 사용하여 표적 유전자의 상동 재조합에 사용된 타겟 벡터를 제조한다. 제조된 타겟 벡터를 줄기 세포에 도입하고, 표적 유전자와 타겟 벡터의 사이의 상동 재조합을 나타내는 세포를 선택하여, 염색체 상의 유전자가 조작된 줄기 세포를 제조할 수 있다.
표적 유전자를 포함하는 게놈 DNA 를 단리하는 방법의 예는, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley ＆ Sons (1987-1997) 등에 기재된 공지된 방법을 포함한다. 게놈 DNA library screening system (Genome Systems 사제), Universal GenomeWalker Kits (CLONTECH 사제) 등을 사용하여, 표적 유전자를 포함하는 게놈 유전자를 단리할 수도 있다. 게놈 DNA 대신에 표적 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 사용할 수도 있다. 폴리뉴클레오티드는 PCR 법에 의해 상응하는 폴리뉴클레오티드를 증폭시킴으로써 수득할 수 있다.
표적 유전자의 상동 재조합에 사용된 타겟 벡터의 제조, 및 상동 재조합의 효율적인 선택은, Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993); Biomanual Series 8, Gene Targeting, Making of Mutant Mouse using ES cell, YODOSHA CO., LTD. (1995); 등에 기재된 방법에 따라 실시할 수 있다. 타겟 벡터로서, 대체형 또는 삽입형 중 임의의 것이 사용될 수 있다. 선택 방법으로서, 포지티브 선택, 프로모터 선택, 네거티브 선택, 또는 polyA 선택 등과 같은 방법을 사용할 수 있다.
선택한 세포주로부터 원하는 상동 재조합체를 선택하는 방법의 예는, 게놈 DNA 에 대한 서던 혼성화법 (Southern hybridization method), PCR 법 등을 포함한다.
본 발명에서 "포유류" 은 설치류, 유제류, 육식류, 영장류 등을 포함한다. 설치류에는 마우스, 래트, 햄스터, 모르모트 등이 포함된다. 유제류에는 돼지, 소, 염소, 말, 양 등이 포함된다. 육식류에는, 개, 고양이 등이 포함된다. 본 발명에서 "영장류" 는 영장류에 속하는 포유류를 칭하고, 영장류는 여우원숭이, 로리스원숭이, 투파이 등과 같은 원원류, 및 원숭이, 유인원, 인간 등과 같은 진원류를 포함한다.
본 발명에 사용되는 다능성 줄기 세포는 포유류의 다능성 줄기 세포, 바람직하게는 설치류 (예를 들어 마우스, 래트) 또는 영장류 (예를 들어 인간, 원숭이) 의 다능성 줄기 세포, 보다 바람직하게는 인간 다능성 줄기 세포, 더욱 바람직하게는 인간 유도 다능성 줄기 세포 (iPS 세포) 또는 인간 배아 줄기 세포 (ES 세포) 이다.
본 발명에서 "부유 배양" 또는 "부유 배양법" 은, 세포 또는 세포 응집체가 배양 배지에 부유하는 상태를 유지하면서 배양하는 것, 및 배양을 실시하는 방법을 나타낸다. 즉, 부유 배양은 세포 또는 세포 응집체를 배양기 등에 접착시키지 않는 조건 하에 행해지고, 배양기 등에 대한 접착을 허용하는 조건 하에 행해지는 배양 (접착 배양 또는 접착 배양법) 은 부유 배양의 카테고리에 포함되지 않는다. 이 경우 세포 접착은, 세포 또는 세포 응집체와 배양기 사이에 강한 세포-기질 결합 (cell-substratum junction) 이 형성되는 것을 의미한다. 보다 특히, 부유 배양은 세포 또는 세포 응집체와 배양기와의 사이에 강한 세포-기질 접착이 형성되지 않는 조건 하에 배양하는 것을 나타내고, 접착 배양은 세포 또는 세포 응집체와 배양기 등과의 사이에 강한 세포-기질 결합이 형성되는 조건 하에 배양하는 것을 나타낸다.
부유 배양되는 세포 응집체에서, 평면 세포-세포 접착이 형성된다. 부유 배양되는 세포 응집체에서, 세포-기질 결합이 배양기 등과의 사이에서 거의 형성되지 않고, 이것이 형성되는 경우에도 그 기여가 작다. 일부의 구현예에서, 내인성 세포-기질 결합이 응집체 내부에 존재 하지만, 세포-기질 결합이 배양기 등과의 사이에서는 거의 형성되지 않고, 이것이 형성되는 경우에도 그 기여가 작다.
평면 세포-세포 접착 (평면 부착 (plane attachment)) 은, 세포가 또다른 세포에 면을 통해 부착되는 것을 의미한다. 보다 특히, 평면 세포-세포 접착은, 세포의 표면적이 또다른 세포의 표면적에 접착하는 비율이, 예를 들어 1% 이상, 바람직하게는 3% 이상, 보다 바람직하게는 5% 이상인 것을 의미한다. 세포의 표면은, 막을 염색하는 시약 (예를 들어 DiI) 에 의한 염색, 세포 접착 분자 (예를 들어, E-카드헤린 및 N-카드헤린) 의 면역염색에 의해 관찰할 수 있다.
부유 배양을 실시할 때에 사용되는 세포 배양기는, 이것이 "부유 배양" 을 가능하게 하는 한 특별히 제한되지 않고, 당업자가 적절히 결정할 수 있다. 상기 세포 배양기의 예는, 플라스크, 조직 배양 플라스크, 배양 디쉬 (디쉬), 페트리 디쉬, 조직 배양 디쉬, 멀티디쉬, 마이크로플레이트, 마이크로웰 플레이트, 미세공극, 멀티플레이트, 멀티웰 플레이트, 챔버 슬라이드, 샬레, 튜브, 트레이, 배양 백 (culture bag), 스피너 플라스크, 삼각 플라스크 또는 롤러 보틀 등을 포함한다. 이러한 배양기는, 부유 배양을 가능하게 하기 위해, 바람직하게는 세포-비접착성이다. 유용한 세포-비접착성 배양기는, 배양기의 표면이 세포 접착성을 향상시키기 위한 인공적 처리 (예를 들어, 기저 막 표본, 라미닌, 엔타크틴, 콜라겐, 젤라틴 등과 같은 세포외 매트릭스에 의한 표면 처리, 또는 폴리라이신, 폴리오르니틴과 같은 중합체 등에 의한 코팅 처리, 또는 양성 정전하 처리 등) 되어 있지 않은 배양기 등을 포함한다. 세포-비접착성 배양기로서, 배양기의 표면이 세포에 대한 접착성을 저하시키도록 인공적으로 처리 (예를 들어, MPC 중합체 등에 의한 초친수성 처리, 단백질 저흡착 처리 등) 된 배양기 등을 사용할 수 있다. 스피너 플라스크, 롤러 보틀 등을 사용한 롤러 배양이 행해질 수 있다. 배양기의 배양 표면은 평저일 수 있거나 요철을 가질 수 있다.
접착 배양에 사용되는 배양기는, "접착 배양" 이 실행될 수 있는 한 특별히 제한되지 않고, 당업자가 적절하게 배양 스케일, 배양 조건 및 배양 기간에 따라 적합한 배양기를 선택할 수 있다. 상기 배양기의 예는, 플라스크, 조직 배양 플라스크, 배양 디쉬 (디쉬), 조직 배양 디쉬, 멀티-디쉬, 마이크로플레이트, 마이크로-웰 플레이트, 멀티-플레이트, 멀티-웰 플레이트, 챔버 슬라이드, 샬레, 튜브, 트레이, 배양 백, 마이크로캐리어, 비이드, 스택 플레이트, 스피너 플라스크 및 롤러 보틀을 포함한다. 이러한 배양기는, 접착 배양을 가능하게 하기 위해, 바람직하게는 세포-접착성이다. 세포-접착 배양기는, 배양기의 표면이 세포 접착성을 향상하기 위해 인공적으로 처리된 배양기를 포함하고, 구체적으로는 표면-가공된 배양기, 또는 내부가 코팅제로 코팅된 배양기가 언급될 수 있다. 코팅제의 예는, 라미닌 [라미닌 α5β1γ1 (이하, 라미닌 511), 라미닌 α1β1γ1 (이하, 라미닌 111) 등 및 라미닌 단편 (라미닌 511E8 등) 을 포함], 엔타크틴, 콜라겐, 젤라틴, 비트로넥틴 (Vitronectin), Synthemax (Corning Incorporated), Matrigel 과 같은 세포외 매트릭스 등, 또는 폴리라이신, 폴리오르니틴과 같은 중합체 등을 포함한다. 표면-가공된 배양기의 예는, 양성 정전하 처리 등에 의해 표면-가공된 배양기를 포함한다.
본 발명에서 세포 배양에 사용되는 배지는, 기초 배지로서 동물 세포의 배양에 통상 사용되는 배지로부터 제조할 수 있다. 기초 배지의 예는, BME 배지, BGJb 배지, CMRL1066 배지, Glasgow MEM (GMEM) 배지, 개선된 MEM 아연 옵션 배지, IMDM 배지, Medium199 배지, Eagle MEM 배지, αMEM 배지, DMEM 배지, F-12 배지, DMEM/F12 배지, IMDM/F12 배지, 햄 배지, RPMI1640 배지, Fischer 배지, 또는 이들의 혼합 배지 등과 같은, 동물 세포의 배양에 사용될 수 있는 배지를 포함한다.
본 발명에서 "무혈청 배지" 는, 무조정 또는 미정제의 혈청을 포함하지 않는 배지를 의미한다. 본 발명에서, 정제된 혈액-유래 성분 및 동물 조직-유래 성분 (예를 들어, 증식 인자) 을 함유하는 배지는, 또한 무조정 또는 미정제 혈청이 그에 함유되지 않는 한 무혈청 배지에 포함된다.
무혈청 배지는, 혈청 대체물을 함유할 수 있다. 혈청 대체물의 예는, 알부민, 트랜스페린, 지방산, 콜라겐 전구체, 미량 원소, 2-메르캅토에탄올 또는 3'티올글리세롤, 또는 이들의 균등물 등을 적절히 함유하는 것을 포함한다. 이러한 혈청 대체물은, 예를 들어 WO98/30679 에 기재된 방법에 의해 제조될 수 있다. 또한, 혈청 대체물은 시판 제품일 수 있다. 상기 시판 혈청 대체물의 예는, KnockoutTM Serum Replacement (Life Technologies 사제; 현재 ThermoFisher: 이하 KSR 로도 나타냄), 농축된 화학적으로 정의된 지질 (Life Technologies 사제), GlutamaxTM (Life Technologies 사제), B27 (Life Technologies 사제), N2 보충물 (Life Technologies 사제) 를 포함한다.
부유 배양에 사용되는 무혈청 배지는, 적절히 지방산 또는 지질, 아미노산 (예를 들어, 비필수 아미노산), 비타민, 증식 인자, 사이토카인, 항산화제, 2-메르캅토에탄올, 피루브산, 완충제, 무기 염 등을 함유할 수 있다.
제조의 번잡함을 회피하기 위해서, 상기 무혈청 배지로서 시판되는 KSR (Life Technologies 사제) 를 적당량 (예를 들어, 약 0.5 % 내지 약 30 %, 바람직하게는 약 1 % 내지 약 20 %) 첨가한 무혈청 배지 (예를 들어, F-12 배지와 IMDM 배지의 1:1 혼합물에 10 % KSR, 농축된 화학적으로 정의된 지질, 및 450 μM 1-모노티오글리세롤을 첨가한 배지) 를 사용할 수 있다. KSR 과 동등한 생성물로서 JP-A-2001-508302 에 개시된 배지가 언급될 수 있다.
본 발명에서 "혈청-함유 배지" 는, 무조정 또는 미정제 혈청을 포함하는 배지를 의미한다. 배지는 지방산 또는 지질, 아미노산 (예를 들어 비필수 아미노산), 비타민, 증식 인자, 사이토카인, 항산화제, 2-메르캅토에탄올, 1-모노티오글리세롤, 피루브산, 완충제, 무기 염 등을 함유할 수 있다. 예를 들어, Matrigel 등과 같은 기저 막 표본을 사용해 다능성 줄기 세포를 망막 조직등으로 분화 유도하는 경우, 혈청 배지를 사용할 수 있다 (Cell Stem Cell, 10(6), 771-775 (2012)). 또한, 본 발명에 의해 제조된 신경 조직 (예를 들어, 망막 조직, 대뇌 조직) 을 유지하는 단계 (또한 성숙 배양으로 칭함) 에서 혈청 배지를 사용할 수 있다.
본 발명에서 배양은 바람직하게는 제노-프리 (xeno-free) 조건 하에 행해진다. "제노-프리" 는, 배양되는 세포의 종과 상이한 종으로부터 유래된 성분이 배제된 조건을 의미한다.
본 발명에서, "물질 X 를 포함하는 배지" 및 "물질 X 의 존재 하" 는, 외인성 (exogenous) 물질 X 가 첨가된 배지 또는 외인성 물질 X 를 포함하는 배지, 또는 외인성의 물질 X 의 존재 하를 나타낸다. 즉, 배지에 존재 하는 세포 또는 조직이 물질 X 를 내재적 (endogenous) 으로 발현, 분비 또는 생성하는 경우, 내인성 물질 X 는 외인성 물질 X 와 구별되고, 외인성 물질 X 를 포함하지 않은 배지는 이것이 내인성 물질 X 를 포함할 때에도 "물질 X 를 포함하는 배지" 의 범주에는 포함되지 않는 것으로 이해된다.
예를 들어, "TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질을 포함하는 배지" 는, 외인성의 TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질이 첨가된 배지 또는 외인성의 TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질을 포함하는 배지이다.
본 발명에서, 피더 세포는 줄기 세포를 배양할 때 공존하는 줄기 세포 이외의 세포를 나타낸다. 미분화 상태를 유지하면서 다능성 줄기 세포를 배양하는데 사용되는 피더 세포의 예는, 마우스 선유아세포 (MEF 등), 인간 선유아세포, SNL 세포 등을 포함한다. 피더 세포로서, 증식 억제 처리한 피더 세포가 바람직하다. 증식 억제 처리의 예는 증식 억제제 (예를 들어, 마이토마이신 C) 에 의한 처리, 감마 조사, UV 조사 등을 포함한다. 미분화 상태를 유지하면서 다능성 줄기 세포를 배양하는데 사용되는 피더 세포는, 체액성 인자 (바람직하게는 미분화 상태를 유지하는 인자) 의 분비, 또는 세포 접착용 스캐폴드 (세포외 기질) 의 제조에 의해, 다능성 줄기 세포의 미분화 유지에 기여한다.
본 발명에서, 피더 세포 부재 (피더-프리) 는, 피더 세포 부재 하의 배양을 의미한다. 피더 세포 부재는, 예를 들어 피더 세포를 실질적으로 첨가하지 않는 조건, 또는 피더 세포를 실질적으로 포함하지 않는 조건 (예를 들어, 총 세포 수에 대한 피더 세포수의 비율은 3 % 이하임) 을 의미한다.
본 발명에서, 세포의 "응집체 (aggregate)" 는 배지에 분산된 세포가 집합해 형성된 덩어리를 나타내고, 여기서 세포는 서로 접착된다. 세포 덩어리, 배양체 (embryoid body), 구체 (sphere), 타원체 (spheroid) 는 또한 세포 응집체에 포함된다. 바람직하게는, 세포 응집체에서 평면 세포-세포 접착이 형성된다. 일부 양태에서, 응집체의 일부 또는 전부에서, 세포는 때때로 세포-세포 결합 (cell-cell junction) 및/또는 세포 접착 (cell adhesion), 예를 들어 접착 결합 (adherence junction) 을 형성한다. 본 발명에서 "응집체" 는 구체적으로는 상기 언급된 본 발명［1］의 제 2 단계에서 생성된, 부유 배양 출발시에 분산된 세포에 의해 형성된 응집체, 및 상기 언급된 본 발명［1］의 제 3 단계에서 생성된, 다능성 줄기 세포로부터 분화된 유도 신경 세포를 포함하는 응집체를 포함하고, "응집체" 는 또한 상기 언급된 본 발명［1］의 제 2 단계의 출발시 (즉 부유 배양 출발시) 에 이미 형성되어 있던 응집체를 포함한다. 제 2 단계에서 형성되는 세포 응집체는 "배양체 (EB)" 를 포함한다.
본 발명에서, "균일한 응집체" 는 복수의 응집체를 배양할 때 각 응집체의 크기가 일정하다는 것, 및 응집체의 크기를 최대 직경의 길이로 평가하는 경우 최대 직경의 길이의 편차가 작다는 것을 의미한다. 보다 구체적으로는, 이는 응집체의 전체 집단 중 75 % 이상은 응집체 집단의 최대 직경의 평균치가 ± 100 %, 바람직하게는 평균치가 ± 50 %, 보다 바람직하게는 평균치가 ± 20 % 이내인 것을 의미한다.
본 발명에서, "균일한 세포 응집체를 형성함" 은 세포를 집합시켜 세포 응집체를 형성하고 응집체를 부유 배양할 때, "주어진 수의 분산된 세포를 신속히 응집" 시켜 크기가 균일한 세포 응집체를 형성하는 것을 의미한다.
분산은, 세포 또는 조직을 효소 처리, 물리적 처리 등과 같은 분산 처리에 의해, 작은 세포편 (2 개 세포 이상 및 100 개 세포 이하, 바람직하게는 50 개 세포 이하) 또는 단일 세포로 나누는 것을 의미한다. 주어진 수의 분산 세포는, 세포편 또는 단일 세포를 특정 갯수 수집한 것이다.
다능성 줄기 세포를 분산시키는 방법의 예는, 기계적 분산 처리, 세포 분산액 처리, 및 세포 보호제 첨가 처리를 포함한다. 이러한 처리를 조합하여 실행할 수 있다. 바람직하게는, 세포 분산 처리를 실시한 후, 기계적 분산 처리를 실시한다.
기계적 분산 처리 방법으로서, 피펫팅 처리 또는 스크레이퍼에 의한 스크레이핑 작업이 언급될 수 있다.
세포 분산액 처리에 사용되는 세포 분산액으로서, 트립신, 콜라게나아제, 히알루로니다아제, 엘라스타아제, 프로나아제, DNase 또는 파파인 등과 같은 효소, 및 에틸렌디아민테트라아세트산 등과 같은 킬레이트제 중 임의의 것을 포함하는 용액이 언급될 수 있다. 시판되는 세포 분산액 예컨대 TrypLE Select (Life Technologies 사제) 및 TrypLE Express (Life Technologies 사제) 가 사용될 수도 있다.
다능성 줄기 세포를 분산할 때에, 세포 보호제로 처리함으로써 다능성 줄기 세포의 세포사를 억제할 수 있다. 세포 보호제 처리에 사용되는 세포 보호제로서, FGF 시그널 전달 경로 작용 물질, 헤파린, IGF 시그널 전달 경로 작용 물질, 혈청, 또는 혈청 대체물이 언급될 수 있다. 분산에 의해 유도되는 세포사 (특히, 인간 다능성 줄기 세포의 세포사) 를 억제하기 위해서, 분산시에, Rho-관련 이중 나선 키나아제 (ROCK) 저해 물질 또는 Myosin 저해 물질을 첨가할 수 있다. ROCK 저해 물질로서, Y-27632, Fasudil (HA1077), H-1152 등이 언급될 수 있다. Myosin 저해 물질로서 Blebbistatin 이 언급될 수 있다. 바람직한 세포 보호제로서, ROCK 저해 물질이 언급될 수 있다.
예를 들어, 다능성 줄기 세포를 분산시키는 방법은 예를 들어 다능성 줄기 세포의 콜로니를, 세포 보호제로서 ROCK 저해 물질의 존재 하에 세포 분산액 (TrypLE Select) 으로 처리하고, 이를 피펫팅에 의해 추가 분산시키는 것을 포함하는 방법을 포함한다.
본 발명의 제조 방법에서, 다능성 줄기 세포를 신속히 집합시켜 다능성 줄기 세포의 응집체를 형성시키는 것이 바람직하다. 상기 방식으로 다능성 줄기 세포의 응집체가 형성될 때, 형성된 응집체로부터 분화 및 유도되는 세포에서 표피형 구조가 양호한 재현성과 함께 형성될 수 있다. 응집체를 형성하는 실험적인 작업의 예는, 작은 웰을 갖는 플레이트 (예를 들어, 웰의 저면적이 평저에 관해 계산될 때 약 0.1 ~ 2.0 ㎠ 인 플레이트), 미세공극 등을 사용하여 작은 공간에 세포를 유지하는 것을 포함하는 방법, 작은 원심 튜브를 사용하여 단시간 동안 원심분리하여 세포를 응집시키는 것을 포함하는 방법을 포함한다. 작은 웰을 갖는 플레이트로서, 예를 들어 24 웰 플레이트 (면적이 평저에 관해 계산될 때 약 1.88 ㎠), 48 웰 플레이트 (면적이 평저에 관해 계산될 때 약 1.0 ㎠), 96 웰 플레이트 (면적이 평저에 관해 계산될 때 약 0.35 ㎠, 내부 직경 약 6 ~ 8 mm), 384 웰 플레이트가 언급될 수 있다. 바람직한 것은 96 웰 플레이트이다. 작은 웰을 갖는 플레이트의 형상으로서, 웰을 위로부터 보았을 때 저면의 형상은 예를 들어 다각형, 장방형, 타원, 진원, 바람직하게는 진원이다. 작은 웰을 갖는 플레이트의 형상으로서, 웰을 옆으로부터 보았을 때 저면의 형상은 평저 구조 또는 외주부가 높고 오목부가 낮게 움푹 들어간 구조일 수 있다. 저면의 형상은 예를 들어, U-바닥, V-바닥, M-바닥, 바람직하게는 U-바닥 또는 V-바닥, 더욱 바람직하게는 V-바닥을 포함한다. 작은 웰을 갖는 플레이트로서 세포 배양 디쉬 (예를 들어, 60 mm ~ 150 mm 디쉬, 배양 플라스크) 의 저면에 요철 또는 움푹한 곳이 있는 것이 또한 사용될 수 있다. 작은 웰을 갖는 플레이트의 저면은, 바람직하게는 세포-비접착성 저면, 바람직하게는 상기 언급된 세포-비접착성 코팅된 저면이다.
다능성 줄기 세포 또는 다능성 줄기 세포를 포함하는 세포 집단을 포함하는 응집체의 형성 및 그 균일성은, 응집체 덩어리의 크기 및 그 안의 세포 수, 거시적 형태, 조직 염색 분석에 의한 미시적 형태 및 그 균일성 등을 기초로 측정될 수 있다. 또한, 응집체에서 표피형 구조의 형성 및 그 균일성은, 응집체의 거시적 형태, 조직 염색 분석에 의한 미시적 형태 및 그 균일성, 분화 및 미분화 마커의 발현 및 그 균일성, 분화 마커의 발현 제어 및 그 동기성, 응집체 사이의 분화 효율의 재현성 등을 기초로 측정될 수 있다.
본 발명에서 "조직" 은, 형태 또는 성질이 균일한 하나의 유형의 세포, 또는 형태 및 성질이 상이한 복수 유형의 세포가 주어진 패턴으로 입체적으로 배열된 구조를 갖는 세포 집단의 구조를 나타낸다.
본 발명에서, "신경 조직" 은 발달기 또는 성체기의 대뇌, 중뇌, 소뇌, 척수, 망막, 말초 신경, 전뇌, 후뇌, 종뇌, 간뇌 등을 포함하는 신경 세포로 구성되는 조직을 나타낸다. 신경 조직은 때때로 층 구조를 가지는 표피 구조 (신경 표피) 를 형성하고, 세포 응집체 내의 신경 표피는 광학 현미경을 사용한 명시야 관찰에 의해 평가할 수 있다.
본 발명에서, "신경 세포" 는, 외배엽 유래 조직에서 표피계 세포 이외의 세포를 나타낸다. 즉, 신경 전구 세포, 뉴런 (신경 세포), 글리아 (glia), 신경 줄기 세포, 뉴런 전구 세포 및 글리아 전구 세포 등과 같은 세포를 포함한다. 신경 세포는 또한 하술하는 망막 조직을 구성하는 세포 (망막 세포), 망막 원세포, 망막층-특이적 뉴런, 신경 망막 세포, 및 망막 색소 표피 세포를 포함한다. 신경 세포는, 네스틴, TuJ1, PSA-NCAM, N-카드헤린 등을 마커로서 사용하여 식별될 수 있다.
뉴런 (또는 뉴런 세포) 은, 신경 회로를 형성하고 시그널 전달에 기여하는 기능성 세포이며, TuJ1, Dcx, HuC/D 등과 같은 미숙 뉴런 세포 마커 및/또는 Map2, NeuN 등과 같은 성숙 뉴런 세포 마커의 발현을 지표로서 사용하여 식별될 수 있다.
글리아로서, 아스트로사이트, 올리고덴드로사이트, Mueller 글리아 등이 언급될 수 있다. 아스트로사이트 마커로서, GFAP 가 언급될 수 있고, 올리고덴드로사이트의 마커로서 O4 가 언급될 수 있고, Mueller 글리아의 마커로서 CRALBP 등이 언급될 수 있다.
신경 줄기 세포는, 신경 세포 및 글리아 세포로의 분화능 (다분화능), 및 다분화능을 유지하는 증식능 (때때로 자가-재생산 능력으로 나타내어짐) 을 가지는 세포이다. 신경 줄기 세포 마커로서, 네스틴, Sox2, Musashi, Hes 패밀리, CD133 등이 언급될 수 있으나; 이들 마커는 일반적으로 원세포/전구 세포의 마커이며 신경 줄기 세포-특이적 마커로 여겨지지 않는다. 신경 줄기 세포의 수는, 신경구 검정, 클론 검정 등에 의해 평가할 수 있다.
뉴런 전구 세포는 증식능을 갖고, 뉴런을 생성하고 글리아 세포를 생성하지 않는 세포이다. 뉴런 전구 세포 마커로서, Tbr2, Tα1 등이 언급될 수 있다. 대안적으로, 미숙 뉴런 마커 (TuJ1, Dcx, HuC/D)-양성 및 증식 마커 (Ki67, pH3, MCM)-양성 세포는 뉴런 전구 세포로서 식별될 수도 있다.
글리아 전구 세포는 증식능을 갖고 글리아 세포를 생성하고 뉴런을 생성하지 않는 세포이다.
신경 전구 세포는, 신경 줄기 세포, 뉴런 전구 세포 및 글리아 전구 세포를 포함하는 전구 세포의 집합이며, 증식능 및 뉴런- 및 글리아-생산성을 가진다. 신경 전구 세포는 네스틴, GLAST, Sox2, Sox1, Musashi, Pax6 등을 마커로서 사용하여 식별될 수 있다. 대안적으로, 신경 세포 마커-양성 및 증식 마커 (Ki67, pH3, MCM)-양성 세포를, 신경 전구 세포로서 식별할 수도 있다.
본 발명에서 "망막 조직" 은 생체내 망막에서 각 망막층을 구성하는 광수용체 세포, 광수용체 전구 세포, 막대형 광수용체 세포, 원뿔형 광수용체 세포, 개재뉴런, 수평 세포, 쌍극성 세포, 아마크린 세포, 망막 신경절 세포 (신경절 세포), 망막 색소 표피 세포 (RPE), 모양체 주연부 세포, 이들의 원세포/전구 세포 및 망막 원세포 등과 같은 세포의 하나의 유형 또는 적어도 둘 이상의 유형이 층으로 입체적 배열된 조직을 의미한다. 각각의 세포에 의해 구성되는 망막 층은 공지된 방법, 예를 들어 세포 마커의 발현 유무 또는 그 수준 등에 의해 확인될 수 있다.
본 발명에서 "망막층" 은, 망막을 구성하는 각각의 층을 의미한다. 이의 구체적 예는, 망막 색소 표피층, 광수용체 층, 외부 한계 막, 외부 핵 층, 외부 망상층, 내부 핵 층, 내부 망상층, 신경절 세포층, 신경 섬유층 및 내부 경계 막을 포함한다.
본 발명에서 "망막 원세포" 는, 광수용체 세포, 수평 세포, 쌍극성 세포, 아마크린 세포, 망막 신경절 세포, 망막 색소 표피 세포 등을 포함하는 임의의 성숙 망막 세포로 분화할 수 있는 원세포를 나타낸다.
본 발명에서 "신경 망막 원세포" 는, 광수용체 세포, 수평 세포, 쌍극성 세포, 아마크린 세포, 망막 신경절 세포 등을 포함하는 어느 하나 또는 복수의 성숙 망막 세포로 분화할 수 있는 원세포를 나타낸다. 일반적으로, 신경 망막 원세포는, 망막 색소 표피 세포로 분화하지 않는다.
광수용체 전구 세포, 수평 세포 전구 세포, 쌍극성 세포 전구 세포, 아마크린 세포 전구 세포, 망막 신경절 세포 전구 세포 및 망막 색소 표피 전구 세포는, 각각 광수용체 세포, 수평 세포, 쌍극성 세포, 아마크린 세포, 망막 신경절 세포, 및 망막 색소 표피 세포로의 분화를 결정짓는 전구 세포를 나타낸다.
본 발명에서 "망막층-특이적 뉴런" 은, 망막층을 구성하는 세포이고, 망막층에 특이적인 뉴런이다. 망막층-특이적 뉴런의 예는, 쌍극성 세포, 망막 신경절 세포, 아마크린 세포, 수평 세포, 광수용체 세포, 망막 색소 표피 세포, 막대형 세포 및 원뿔형 세포를 포함한다.
망막 세포 마커의 예는 망막 원세포에서 발현하는 Rx (또한 Rax 로 칭함), PAX6 및 Chx10, 시상하부 뉴런의 원세포에서는 발현하지만 망막 원세포에서는 발현하지 않는 Nkx2.1, 시상하부 신경 표피에서는 발현하지만 망막에서는 발현하지 않는 Sox1, 광수용체 세포의 전구 세포에서 발현하는 Crx, Blimp1 등을 포함한다. 망막층-특이적 뉴런의 마커의 예는, 쌍극성 세포에서 발현하는 Chx10, PKCα 및L7, 망막 신경절 세포에서 발현하는 TuJ1 및 Brn3, 아마크린 세포에서 발현하는 칼레티닌 (Calretinin), 수평 세포에서 발현하는 칼빈딘 (Calbindin), 성숙 광수용체 세포에서 발현하는 로돕신 (Rhodopsin) 및 레코베린 (Recoverin), 막대형 세포에서 발현하는 Nrl 및 로돕신, 원뿔형 세포에서 발현하는 Rxr-감마 및 S-옵신, 망막 색소 표피 세포에서 발현하는 RPE65 및 Mitf, 모양체 주연부에서 발현하는 Rdh10 및 SSEA1 등을 포함한다.
본 발명에서 "대뇌 조직" 은 태아기 또는 성체의 대뇌를 구성하는 세포 (예를 들어, 대뇌 신경 전구 세포 (cortical neural precursor cell), 배측 대뇌 신경 전구 세포, 복측 대뇌 신경 전구 세포, 대뇌층 구조 특이적 뉴런, 제1층 뉴런, 제2층 뉴런, 제3층 뉴런, 제4층 뉴런, 제5층 뉴런, 제6층 뉴런, 글리아 세포 (아스트로사이트 및 올리고덴드로사이트), 이들의 전구 세포 등) 의 하나의 유형 또는 적어도 복수의 유형이 층상으로 입체적으로 배열한 조직이다. 태아기의 대뇌는 전뇌 또는 종뇌를 칭한다. 각각의 세포의 존재는 공지된 방법, 예를 들어 세포 마커의 발현 유무 또는 그 수준 등에 의해 확인할 수 있다.
본 발명에서 "대뇌층" 은, 성체 대뇌 또는 태아기 대뇌를 구성하는 각각의 층을 의미하고, 구체적으로는 분자층, 외부 과립 층, 외부 피라미드형 층, 내부 과립 층, 신경절 세포층 (내부 피라미드형 층), 다형층, 제1층, 제2층, 제3층, 제4층, 제5층, 제6층, 피질 영역, 중간 영역, 뇌실하대 및 뇌실대 (ventricular zone) 를 포함한다.
본 발명에서 "대뇌 신경 전구 세포" 의 예는, 뉴런 전구 세포, 제1층 뉴런 전구 세포, 제2층 뉴런 전구 세포, 제3층 뉴런 전구 세포, 제4층 뉴런 전구 세포, 제5층 뉴런 전구 세포, 제6층 뉴런 전구 세포, 아스트로사이트 전구 세포, 올리고덴드로사이트 전구 세포 등을 포함한다. 이는 제1층 뉴런, 제2층 뉴런, 제3층 뉴런, 제4층 뉴런, 제5층 뉴런, 제6층 뉴런, 아스트로사이트 및 올리고덴드로사이트 각각으로의 분화를 결정짓는 전구 세포이다.
본 발명에서 "대뇌 신경 전구 세포" 는, 제1층 뉴런, 제2층 뉴런, 제3층 뉴런, 제4층 뉴런, 제5층 뉴런, 제6층 뉴런, 아스트로사이트 및 올리고덴드로사이트로부터의 적어도 복수의 분화 계보로의 분화능 (복능성) 을 가지는 복능성 줄기 세포 (복능성 신경 줄기 세포 (multipotent neural stem cell)) 를 포함한다.
본 발명에서 "대뇌층-특이적 뉴런" 은, 대뇌층을 구성하는 세포이고 대뇌층에 특이적인 뉴런이다. 대뇌층-특이적 뉴런으로서, 제1층 뉴런, 제2층 뉴런, 제3층 뉴런, 제4층 뉴런, 제5층 뉴런, 제6층 뉴런, 대뇌 흥분성 뉴런, 대뇌 억제성 뉴런 등이 언급될 수 있다.
대뇌 세포 마커의 예는, 대뇌 세포에서 발현하는 FoxG1 (별칭 Bf1), 대뇌 신경 전구 세포에서 발현하는 Sox2 및 네스틴, 배측 대뇌 신경 전구 세포에서 발현하는 Pax6 및 Emx2, 복측 대뇌 신경 전구 세포에서 발현하는 Dlx1, Dlx2 및 Nkx2.1, 뉴런 전구 세포에서 발현하는 Tbr2, Nex, Svet1, 제6층 뉴런에서 발현하는 Tbr1, 제5층 뉴런에서 발현하는 Ctip2, 제4층 뉴런에서 발현하는 RORβ, 제3층 뉴런 또는 제2층 뉴런에서 발현하는 Cux1 또는 Brn2, 제1층 뉴런에서 발현하는 Reelen 등을 포함한다.
2. 신경 세포 또는 신경 조직의 제조 방법
본 발명의 제조 방법 1 은 하기 단계 (1) ~ (3) 을 포함하는, 신경 세포 또는 신경 조직의 제조 방법이다:
(1) 다능성 줄기 세포를, 피더 세포 부재 하에서, 및 1) TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질 및/또는 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질, 및 2) 미분화 상태를 유지하기 위한 인자를 포함하는 배지에서 배양하는 제 1 단계,
(2) 제 1 단계에서 얻어진 세포를 부유 배양해, 세포 응집체를 형성시키는 제 2 단계, 및
(3) 제 2 단계에서 얻어진 응집체를, 분화-유도 인자의 존재 하에서 또는 부재 하에서 부유 배양해, 신경 세포 또는 신경 조직을 포함하는 응집체를 얻는 제 3 단계.
단계 (1) 에서, 다능성 줄기 세포를 피더 세포 부재 하에서, 및 1) TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질 및/또는 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질, 및 2) 미분화 상태를 유지하는 인자를 포함하는 배지에서 배양한다.
단계 (1) 에서 바람직한 다능성 줄기 세포로서, 유도 다능성 줄기 세포 또는 배아 줄기 세포 (ES 세포), 보다 바람직하게는 인간 유도 다능성 줄기 세포 또는 인간 배아 줄기 세포 (ES 세포) 가 언급될 수 있다.
유도 다능성 줄기 세포의 제조 방법은 특별히 제한되지는 않고, 상기 언급된 바와 같이 당업자에게 주지된 방법으로 제조할 수 있다. 또한 유도 다능성 줄기 세포의 제조 단계 (즉, 체세포를 리프로그래밍해 다능성 줄기 세포를 수립하는 단계) 를 피더-프리 조건 하에 실시하는 것이 바람직하다.
배아 줄기 세포 (ES 세포) 의 제조 방법은 특별히 제한되지 않지만, 상기 언급된 바와 같이 당업자에게 주지된 방법으로 제조할 수 있고, 또한 배아 줄기 세포 (ES 세포) 의 제조 단계를 피더-프리 하에 실시하는 것이 바람직하다.
단계 (1) 에서 사용되는 다능성 줄기 세포의 유지 배양 또는 확대 배양은, 상기 언급된 당업자에게 주지된 방법으로 실시할 수 있다. 다능성 줄기 세포의 유지 배양 또는 확대 배양은 접착 배양 또는 부유 배양에 의해 실시할 수 있는 한편, 이는 바람직하게는 접착 배양으로 실시된다. 다능성 줄기 세포의 유지 배양 및 확대 배양은, 피더의 존재 하에서 또는 피더-프리 조건 하에 실시될 수 있고, 이는 바람직하게는 피더-프리 조건 하에 실시된다. 다능성 줄기 세포의 유지 배양 및 확대 배양에서 피더 세포 부재 (피더-프리) 는, 피더 세포를 실질적으로 포함하지 않는 (예를 들어, 총 세포 수에 대한 피더 세포의 수의 비율은 3 % 이하임) 조건을 의미한다. 바람직하게는, 피더 세포를 포함하지 않는 조건 하에, 다능성 줄기 세포의 유지 배양 및 확대 배양이 실시된다.
단계 (1) 에서 피더 세포의 부재 (피더-프리) 는, 피더 세포를 실질적으로 포함하지 않는 (예를 들어, 총 세포 수에 대한 피더 세포수의 비율은 3% 이하임) 조건을 의미한다. 바람직하게는, 피더 세포를 포함하지 않는 조건 하에 단계 (1) 이 실시된다. 단계 (1) 에서 사용되는 배지는, 이것이 피더-프리 조건 하에서 다능성 줄기 세포의 미분화 상태를 유지하는 배양을 가능하게 하는 배지 (피더-프리 배지) 인 한, 특별히 제한되지 않는다. 바람직하게는, 미분화 상태를 유지하는 배양을 가능하게 하기 위해, 이는 미분화 상태를 유지하는 인자를 포함한다.
미분화 상태를 유지하는 인자는, 이것이 다능성 줄기 세포의 분화를 억제하는 작용을 갖는 물질인 한 특별히 제한은 없다. 당업자에게 범용되고 있는 미분화 상태를 유지하는 인자의 예는, 준다능성 줄기 세포 (Primed pluripotent stem cells) (예를 들어, 인간 ES 세포, 인간 iPS 세포) 의 경우 FGF 시그널 전달 경로 작용 물질, TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 작용 물질, 인슐린 등을 포함한다. FGF 시그널 전달 경로 작용 물질로서, 선유아세포 증식 인자 (예를 들어, bFGF, FGF4, FGF8) 가 구체적으로 언급될 수 있다. TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 작용 물질로서, TGFβ 시그널 전달 경로 작용 물질, Nodal/Activin 시그널 전달 경로 작용 물질이 언급될 수 있다. TGFβ 시그널 전달 경로 작용 물질로서, TGFβ1, TGFβ2 가 언급될 수 있다. Nodal/Activin 시그널 전달 경로 작용 물질로서, Nodal, Activin A, Activin B 가 언급될 수 있다. 인간 다능성 줄기 세포 (인간 ES 세포, 인간 iPS 세포) 를 배양하는 경우, 단계 (1) 에서 배지는, 바람직하게는 미분화 상태를 유지하는 인자로서 bFGF 를 포함한다.
본 발명에 사용되는 미분화 상태를 유지하는 인자는 통상 포유류의 미분화 상태를 유지하는 인자이다. 포유류는 예를 들어 상기 언급된 것이다. 미분화 상태를 유지하는 인자는 포유류 종 중에서 교차-반응성을 가질 수 있으므로, 배양되는 다능성 줄기 세포의 미분화 상태를 유지할 수 있는 한, 임의의 포유류의 미분화 상태를 유지하는 인자를 또한 사용할 수 있다. 바람직하게는, 배양되는 세포와 동일종의 포유류의 미분화 상태를 유지하는 인자가 사용된다. 예를 들어, 인간 다능성 줄기 세포를 배양하기 위해, 인간 미분화 상태를 유지하는 인자 (예를 들어, bFGF, FGF4, FGF8, EGF, Nodal, ActivinA, ActivinB, TGFβ 1, TGFβ 2 등) 가 사용된다. 여기서 "인간 단백질 X" 는 단백질 X 가 인간 생체내에서 자연적으로 발현하는 단백질 X 의 아미노산 서열을 갖는 것을 의미한다.
본 발명에 사용되는 미분화 상태를 유지하는 인자는 바람직하게는 단리된다. "단리" 는, 의도된 성분 또는 세포 이외의 인자를 제거하는 작업이 행해지고, 성분 또는 세포가 더이상 자연적 발생 상태가 아님을 의미한다. 따라서, "단리 된 단백질 X" 는, 배양되는 세포 또는 조직으로부터 생성되고 세포 또는 조직 또는 배지 안에 포함되어 있는 내인성 단백질 X 를 포함하지 않는다. "단리된 단백질 X" 의 순도 (총 단백질 중량에 대한 단백질 X 의 중량 백분율) 는, 통상 70 % 이상, 바람직하게는 80 % 이상, 보다 바람직하게는 90 % 이상, 더욱 바람직하게는 99 % 이상, 더욱 바람직하게는 100 % 이다. 따라서, 한 구현예에 있어서, 본 발명은 단리된 미분화 상태를 유지하는 인자를 제공하는 단계를 포함한다. 한 구현예에 있어서, 이는 단계 (1) 에 사용되는 배지에 단리된 미분화 상태를 유지하는 인자를 외인성적으로 첨가하는 단계를 포함한다. 대안적으로, 단계 (1) 에 사용되는 배지에 미리 미분화 상태를 유지하는 인자를 첨가할 수 있다.
단계 (1) 에 사용되는 배지 안의 미분화 상태를 유지하는 인자 농도는, 배양되는 다능성 줄기 세포의 미분화 상태를 유지할 수 있는 농도이고, 당업자에 의해 적절히 결정될 수 있다. 예를 들어, 구체적으로, 미분화 상태를 유지하는 인자로서 피더 세포 부재 하에 bFGF 를 사용하는 경우, 그 농도는 통상 약 4 ng ~ 500 ng/mL, 바람직하게는 약 10 ng ~ 200 ng/mL, 보다 바람직하게는 약 30 ng ~ 150 ng/mL 이다.
피더-프리 배지로서, 많은 합성 배지가 개발되어 있고 시판되며, 예를 들어 Essential 8 배지가 언급될 수 있다. Essential 8 배지는, L-아스코르브산-2-포스페이트 마그네슘 (64 mg/l), 나트륨 셀레늄 (14 ㎍/1), 인슐린 (19.4 mg/l), NaHCO3 (543 mg/l), 트랜스페린 (10.7 mg/l), bFGF (100 ng/mL), 및 TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 작용 물질 (TGFβ1 (2 ng/mL) 또는 Nodal (100 ng/mL)) 을 첨가제로서 포함하는 DMEM/F12 배지이다 (Nature Methods, 8, 424-429 (2011)). 시판되는 피더-프리 배지의 예는, Essential 8 (Life Technologies 사제), S-배지 (DS Pharma Biomedical 사제), StemPro (Life Technologies 사제), hESF9 (Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 Sep 9;105(36):13409-14), mTeSR1 (STEMCELL Technologies 사제), mTeSR2 (STEMCELL Technologies 사제) 및 TeSR-E8 (STEMCELL Technologies 사제) 를 포함한다. 이들 외에, 피더-프리 배지로서 StemFit (Ajinomoto Co., Inc. 사제) 를 포함한다. 상기 언급된 단계 (1) 에서 이들을 사용하는 것에 의해, 간편하게 본 발명을 실시할 수 있다.
단계 (1) 에서, 다능성 줄기 세포는 부유 배양 및 접착 배양의 임의의 조건 하에 배양될 수 있는데, 바람직하게는 접착 배양이다.
접착 배양에 사용되는 배양기는 "접착 배양" 이 실시될 수 있는 한 특별히 제한되지 않지만, 세포 접착성 배양기가 바람직하다. 세포-접착성 배양기는, 배양기의 표면이 세포 접착성을 향상시키도록 인공적으로 처리된 배양기를 포함하고, 구체적으로는 상기 언급된 표면-가공된 배양기, 그 내부가 코팅제로 피복된 배양기가 언급될 수 있다. 코팅제의 예는 라미닌 [라미닌 α5β1γ1 (이하, 라미닌 511), 라미닌 α1β1γ1 (이하, 라미닌 111) 등 및 라미닌 단편 (라미닌 511E8 등) 을 포함함], 엔타크틴, 콜라겐, 젤라틴, 비트로넥틴 (vitronectin), Synthemax (Corning Incorporated), Matrigel 과 같은 세포외 매트릭스 등, 또는 폴리라이신, 폴리오르니틴과 같은 중합체 등을 포함한다. 또한, 양성 정전하 처리 등에 의해 표면이 가공된 배양 용기를 사용할 수 있다. 바람직한 것은 라미닌이고, 보다 바람직하게는 라미닌 511E-8 이다. 라미닌 511E-8 은, 시판품일 수 있다 (예를 들어, iMatrix-511, Nippi).
단계 (1) 에서 사용되는 배지는, TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질 및/또는 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함한다. 제 1 단계에서, 다능성 줄기 세포를 TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질 및/또는 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질로 처리하고, 제 2 단계에서 부유 배양에 적용하고, 그 결과 다능성 줄기 세포의 상태가 바뀌고, 응집체의 품질이 향상되고, 표면이 매끄럽고 내부가 조밀하며 미분화 상태를 유지하는 구형 세포 응집체를 고효율로 제조할 수 있다.
TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 (즉 TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로) 는, TGFβ, Nodal/Activin, 또는 BMP 를 리간드로서 갖는 Smad 패밀리에 의해 세포내 전달되는 시그널 전달 경로이다.
TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질은, TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로, 즉 Smad 패밀리에 의해 전달되는 시그널 전달 경로를 저해하는 물질을 나타내고, 구체적 예는 TGFβ 시그널 전달 경로 저해 물질, Nodal/Activin 시그널 전달 경로 저해 물질 및 BMP 시그널 전달 경로 저해 물질을 포함한다.
TGFβ 시그널 전달 경로 저해 물질은 TGFβ 에 의해 기인되는 시그널 전달 경로를 저해하는 물질이면 특별히 제한은 없고, 핵산, 단백질, 저분자량 유기 화합물 중 임의의 것일 수 있다. 물질의 예는, TGFβ 에 직접 작용하는 물질 (예를 들어, 단백질, 항체, 앱타머 등), TGFβ 를 인코딩하는 유전자의 발현을 억제하는 물질 (예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA 등), TGFβ 수용체 및 TGFβ 의 결합을 저해하는 물질, TGFβ 수용체에 의한 시그널 전달에 의해 기인되는 생리적 활성을 저해하는 물질 (예를 들어, TGFβ 수용체 저해제, Smad 저해제 등) 을 포함한다. TGFβ 시그널 전달 경로 저해 물질로서 알려져 있는 단백질, Lefty 등이 언급될 수 있다. TGFβ 시그널 전달 경로 저해 물질로서 당업자에게 주지된 화합물이 사용될 수 있고, 구체적으로 SB431542, LY-364947, SB-505124, A-83-01 등을 포함한다. 여기서, SB431542 (4-(5-벤졸[1,3]디옥솔-5-일-4-피리딘-2-일-1H-이미다졸-2-일)-벤즈아미드) 및 A-83-01 (3-(6-메틸-2-피리디닐)-N-페닐-4-(4-퀴놀리닐)-1H-피라졸-1-카르보티오아미드) 는, TGFβ 수용체 (ALK5) 및 Activin 수용체 (ALK4/7) 의 저해제 (즉 TGFβR 저해제) 로서 공지된 화합물이다. TGFβ 시그널 전달 경로 저해 물질은, 바람직하게는 SB431542 또는 A-83-01 이다.
Nodal/Activin 시그널 전달 경로 저해 물질은, 이것이 Nodal 또는 Activin 에 의해 기인되는 시그널 전달 경로를 저해하는 한 특별히 제한은 없고, 핵산, 단백질, 저분자량 유기 화합물 중 임의의 것일 수 있다. 물질의 예는, Nodal 또는 Activin 에 직접 작용하는 물질 (예를 들어 항체, 앱타머 등), Nodal 또는 Activin 을 인코딩하는 유전자의 발현을 억제하는 물질 (예를 들어 안티센스 올리고 뉴클레오티드, siRNA 등), 및 Nodal/Activin 수용체와 Nodal/Activin 의 결합을 저해하는 물질, 및 Nodal/Activin 수용체에 의한 시그널 전달에 의해 기인되는 생리적 활성을 저해하는 물질을 포함한다. Nodal/Activin 시그널 전달 경로 저해 물질로서, 당업자에게 주지된 화합물을 사용할 수 있고, 구체적으로는 SB431542, A-83-01 등이 언급될 수 있다. 또한, Nodal/Activin 시그널 전달 경로 저해 물질로서 알려져 있는 단백질 (Lefty, Cerberus 등) 이 사용될 수 있다. Nodal/Activin 시그널 전달 경로 저해 물질은, 바람직하게는 SB431542, A-83-01 또는 Lefty 이다.
BMP 시그널 전달 경로 저해 물질은, 이것이 BMP 에 의해 기인되는 시그널 전달 경로를 저해하는 한 특별히 제한은 없고, 핵산, 단백질, 저분자량 유기 화합물중 임의의 것일 수 있다. 여기서 BMP 로서, BMP2, BMP4, BMP7 및 GDF7 가 언급될 수 있다. 물질의 예는, BMP 에 직접 작용하는 물질 (예를 들어 항체, 앱타머 등), BMP 를 인코딩하는 유전자의 발현을 억제하는 물질 (예를 들어 안티센스 올리고 뉴클레오티드, siRNA 등), BMP 수용체 (BMPR) 와 BMP 의 결합을 저해하는 물질, BMP 수용체에 의한 시그널 전달에 의해 기인되는 생리적 활성을 저해하는 물질을 포함한다. BMPR 로서 ALK2 또는 ALK3 이 언급될 수 있다. BMP 시그널 전달 경로 저해 물질로서 당업자에게 주지된 화합물을 사용할 수 있고, 구체적으로는 LDN193189, 도르소모르핀 등이 언급될 수 있다. 여기서 LDN193189 (4-[6-(4-피페라진-1-일페닐)피라졸로[1,5-a]피리미딘-3-일]퀴놀린) 은, 공지된 BMPR (ALK2/3) 저해제 (이하, BMPR 저해제) 이며, 통상 염산염의 형태로 시판되고 있다. 또한, BMP 시그널 전달 경로 저해 물질로서 알려진 단백질 (Chordin, Noggin 등) 을 사용할 수 있다. BMP 시그널 전달 경로 저해 물질은, 바람직하게는 LDN193189 이다.
TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질은, 바람직하게는 Lefty, SB431542, A-83-01 또는 LDN193189 이다.
상이한 작용점을 갖는 복수 유형의 TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질을 조합하여 사용할 수 있다. 이를 조합함으로써, 응집체 품질 향상 효과가 증강되는 것이 기대된다. 예를 들어, TGFβ 시그널 전달 경로 저해 물질과 BMP 시그널 전달 경로 저해 물질과의 조합, TGFβ 시그널 전달 경로 저해 물질과 Nodal/Activin 시그널 전달 경로 저해 물질과의 조합, BMP 시그널 전달 경로 저해 물질과 Nodal/Activin 시그널 전달 경로 저해 물질과의 조합이 언급될 수 있다. 바람직하게는 TGFβ 시그널 전달 경로 저해 물질이 BMP 시그널 전달 경로 저해 물질과 조합하여 사용된다. 구체적인 바람직한 조합은 예를 들어 SB431542 와 LDN193189 의 조합이다.
소닉 헤지호그 (이하, Shh 라고도 나타냄) 시그널 전달 경로 작용 물질은, Shh 에 의해 매개되는 시그널 전달을 증강할 수 있는 물질이다. Shh 시그널 전달 경로 작용 물질의 예는, 헤지호그 패밀리에 속하는 단백질 (예를 들어, Shh 및 Ihh), Shh 수용체, Shh 수용체 아고니스트, PMA (퍼모파민; 9-시클로헥실-N-[4-(4-모르폴리닐)페닐]-2-(1-나프탈레닐옥시)-9H-푸린-6-아민), SAG (Smoothened Agonist: N-메틸-N'-(3-피리디닐벤질)-N'-(3-크로로벤조[b]티오펜-2-카르보닐)-1,4-디아미노시클로헥산) 등을 포함한다. Shh 시그널 전달 경로 작용 물질은, 바람직하게는 Shh 단백질 (Genbank 접근 번호: NM_000193, NP_000184), SAG 또는 PMA 이다.
TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질 및 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질을 조합하여 사용할 수 있다. 이를 조합함으로써, 응집체 품질 향상 효과가 증강되는 것이 기대된다. 구체적인 조합으로서, Lefty, SB431542, A-83-01 및 LDN193189 로 이루어지는 군에서 선택되는 임의의 TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질과 Shh 단백질, SAG 및 PMA 로 이루어지는 군에서 선택되는 임의의 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질과의 조합이 언급될 수 있다. TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질과 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질을 조합하여 사용하는 경우, TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질과 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질 모두를 포함하는 배지에서 세포를 배양할 수 있거나, TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질 및 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질 중 어느 하나로 세포를 처리하고 연속하여 이 중 어느 하나 또는 이들 모두로 처리할 수 있다.
TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질 및 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질의 농도는, 상기 언급한 효과를 달성할 수 있는 범위에 있도록 적절히 결정될 수 있다. 예를 들어, SB431542 는 통상 0.1 ~ 200 μM, 바람직하게는 2 ~ 50 μM 의 농도로 사용된다. A-83-01 은, 통상 0.05~50 μM, 바람직하게는 0.5~5μM 의 농도로 사용된다. LDN193189 는, 통상 1~2000 nM, 바람직하게는 10~300 nM의 농도로 사용된다. Lefty 는, 통상 5~200 ng/ml, 바람직하게는 10~50 ng/ml 의 농도로 사용된다. Shh 단백질은, 통상 20~1000 ng/ml, 바람직하게는 50~300 ng/ml 의 농도로 사용된다. SAG 는, 통상 1~2000 nM, 바람직하게는 10~700 nM, 보다 바람직하게는 30~600 nM의 농도로 사용된다. PMA 는 통상 0.002~20μM, 바람직하게는 0.02~2μM 의 농도로 사용된다. 한 구현예에 있어서, TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질은, 상기 언급된 농도의 SB43154 와 동등한 TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 활성을 부여하는 양으로 적절히 사용할 수 있다. 한 구현예에 있어서, 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질은, 상기 언급된 농도의 SAG 의 것과 동등한 Shh 시그널 전달 촉진 활성을 부여하는 양으로 적절히 사용할 수 있다.
SB431542, LDN193189 등의 TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 활성은, 당업자에게 주지된 방법, 예를 들어 Smad 의 인산화를 웨스턴 블롯팅 방법 (Western blotting mehod) 으로 검출하는 것에 의해 결정할 수 있다 (Mol Cancer Ther. (2004) 3, 737-45.). SAG 등의 소닉 헤지호그 시그널 전달 촉진 활성은, 당업자에게 주지된 방법, 예를 들어 Gli1 유전자의 발현에 주목한 보고서 유전자 검정에 의해 결정할 수 있다 (Oncogene (2007) 26, 5163-5168).
단계 (1) 에 있어서 사용되는 배지는, 혈청-함유 배지 또는 무혈청 배지일 수 있는 한편, 이는 바람직하게는 화학적으로 미정의된 성분에 의한 오염을 회피하도록 무혈청 배지이다.
화학적으로 미정의된 성분에 의한 오염을 회피하기 위해, 단계 (1) 에서 사용되는 배지는 그 함유 성분이 화학적으로 정의된 배지일 수 있다.
단계 (1) 에서, 다능성 줄기 세포는 부유 배양 및 접착 배양 중 임의의 조건 하에 배양될 수 있고, 바람직하게는 접착 배양이다.
단계 (1) 에서 피더-프리 조건에서의 다능성 줄기 세포의 배양을 위해, 배지로서 상기 언급된 피더-프리 배지를 사용할 수 있다. 피더-프리 배지로서 Essential 8, S-배지, StemPro, hESF9, mTeSR1, mTeSR2, TeSR-E8, 또는 StemFit 등이 언급될 수 있고, 바람직하게는 Essential 8 또는 StemFit 이 사용된다.
단계 (1) 에서 피더-프리 조건 하의 다능성 줄기 세포의 배양의 경우, 피더 세포 대신에 스캐폴드를 다능성 줄기 세포에 제공하기 위해 적절한 매트릭스를 스캐폴드로서 사용할 수 있다. 스캐폴드로서 매트릭스에 의해 표면을 코팅한 세포 용기에서 다능성 줄기 세포를 접착 배양한다.
스캐폴드로서 이용될 수 있는 매트릭스로서, 라미닌 (Nat Biotechnol 28, 611-615 (2010)), 라미닌 단편 (Nat Commun 3, 1236 (2012)), 기저 막 표본 (Nat Biotechnol 19, 971-974 (2001)), 젤라틴, 콜라겐, 헤파란 술페이트 프로테오글리칸, 엔타크틴, 비트로넥틴 (Vitronectin) 등이 언급될 수 있다.
"라미닌" 은, α,β,γ 사슬로 이루어지는 헤테로 3량체 분자이며, 서브유닛 사슬 조성이 상이한 아형을 함유하는 세포외 매트릭스 단백질이다. 구체적으로는, 라미닌은 5종의 α 사슬, 4종의 β 사슬 및 3종의 γ 사슬을 갖는 헤테로3량체의 조합을 기반으로 약 15 종류의 아형을 갖는다. α사슬(α1-α5), β사슬 (β1-β4) 및 γ사슬 (γ1-γ3) 의 각각의 숫자를 조합하여, 라미닌의 명칭이 결정된다. 예를 들어, α5 사슬, β1 사슬, γ1 사슬의 조합을 갖는 라미닌은 라미닌 511 로 명명한다. 본 발명에서, 바람직하게는 라미닌 511 이 사용된다 (Nat Biotechnol 28, 611-615 (2010)).
본 발명으로 사용하는 라미닌은 통상 포유류 라미닌이다. 포유류로서, 상기 언급된 것이 나타내어질 수 있다. 제노-프리 조건을 달성하기 위해, 배양되는 세포와 동일 종의 포유류의 라미닌이 바람직하게는 사용된다. 예를 들어, 인간 다능성 줄기 세포의 배양에 인간 라미닌 (바람직하게는, 인간 라미닌 511) 이 사용된다.
본 발명에서 사용되는 라미닌 단편은, 다능성 줄기 세포에 대한 접착성을 가지고 있고 피더-프리 조건 하에서의 다능성 줄기 세포의 유지 배양을 가능하게 하는 한 특별히 제한되지 않지만, 바람직하게는 E8 단편이다. 라미닌 E8 단편은, 라미닌 511 을 엘라스타아제로 소화해 얻어진 단편 중에서 강한 세포 접착 활성을 가지는 단편으로서 식별되었다 (EMBO J., 3:1463-1468, 1984, J. Cell Biol., 105:589-598, 1987). 본 발명에서, 바람직하게는 라미닌 511 의 E8 단편이 사용된다 (Nat Commun 3, 1236 (2012), Scientific Reports 4, 3549 (2014)). 본 발명에 사용되는 라미닌 E8 단편은, 라미닌의 엘라스타아제 소화 생성물인 것을 필요로 하는 것이 아니고, 재조합체일 수 있다. 미식별 성분의 오염을 회피하기 위해, 본 발명에서 바람직하게는 재조합 라미닌 단편이 사용된다. 라미닌 511의 E8 단편은 시판되고, 예를 들어 Nippi, Inc. 등으로부터 구입 가능하다.
본 발명에서 사용되는 라미닌 또는 라미닌 단편은 바람직하게는 단리된다.
본 발명에서 "기저 막 표본" 은, 그 위에 기저 막을 형성할 수 있는 의도된 세포를 플레이팅하고 배양했을 때, 표피 세포의 것과 유사한 세포 형태, 분화, 증식, 운동, 기능 발현 등을 제어하는 기능을 갖는 기저막-구성 성분을 포함하는 것을 나타낸다. 예를 들어, 본 발명에 의해 제조된 신경 세포 및 신경 조직을 분산시키고, 추가 접착 배양을 실시하는 경우 기저 막 표본의 존재 하에서 배양할 수 있다. 여기서, "기저막 구성 성분" 이란, 동물 조직에서, 표피 세포층과 간질 세포층 등과의 사이에 존재 하는 얇은 막의 형태인 세포외 매트릭스 분자를 나타낸다. 기저 막 표본은, 예를 들어 기저막을 통해 지지체 상에 접착하고 있는 기저막을 형성할 수 있는 세포를, 세포의 지질을 용해시킬 수 있는 용액, 알칼리 용액 등을 사용하여 지지체로부터 제거하는 것에 의해 제조할 수 있다. 기저 막 표본의 예는, 기저 막 표본으로서 시판되고 있는 제품 (예를 들어, MatrigelTM (Corning Incorporated 사제: 이하, Matrigel 로 나타내어짐)), GeltrexTM (Life Technologies 사제), 기저 막 성분으로서 공지된 세포외 매트릭스 분자 (예를 들어, 라미닌, IV형 콜라겐, 헤파란 술페이트 프로테오글리칸, 엔타크틴 등) 를 포함한다.
MatrigelTM 는, Engelbreth Holm Swarn (EHS) 마우스 육종으로부터 추출된 기저 막 표본이다. MatrigelTM 의 주성분은 IV형 콜라겐, 라미닌, 헤파란 술페이트 프로테오글리칸 및 엔타크틴이다. 이들 이외에, TGF-β, FGF, 조직 플라스미노겐 활성화제 및 EHS 종양에 의해 자연적 생성되는 증식 인자가 포함된다. MatrigelTM 의 "증식 인자 감소 제품" 은, 통상적인 MatrigelTM 보다 증식 인자 농도가 낮고, 그 표준 농도는 EGF 가 < 0.5 ng/ml, NGF 가 < 0.2 ng/ml, PDGF 가 < 5 pg/ml, IGF1 이 5 ng/ml, TGFβ 가 1.7 ng/ml 이다.
미식별 성분의 혼입을 회피하기 위해, 본 발명에서 바람직하게는 단리된 라미닌 또는 라미닌 단편이 사용된다.
바람직하게는, 단계 (1) 에 있어서의 피더-프리 조건에서의 다능성 줄기 세포의 배양에서, 단리된 라미닌 511 또는 라미닌 511 의 E8 단편 (더욱 바람직하게는, 라미닌 511 의 E8 단편) 에 의해 표면을 코팅한 세포 용기 중에서 다능성 줄기 세포를 접착 배양한다.
단계 (1) 에서 다능성 줄기 세포의 배양 기간은 단계 (2) 에서 형성된 응집체 품질을 향상시키는 효과를 달성할 수 있는 한 특별히 제한되지 않지만, 이는 통상 0.5~144 시간이다. 단계(1) 에서 다능성 줄기 세포의 배양 기간은, 바람직하게는 1시간 이상, 2시간 이상, 6시간 이상, 12시간 이상, 18시간 이상, 또는 24시간 이상이다. 단계(1) 에서 다능성 줄기 세포의 배양 기간은, 바람직하게는 96시간 이내 또는 72시간 이내이다. 한 구현예에서, 단계(1) 에 있어서의 다능성 줄기 세포의 배양 기간은, 바람직하게는 2~96시간, 보다 바람직하게는 6~48시간, 더욱 바람직하게는 12~48시간, 보다 더욱 바람직하게는 18~28시간 (예를 들어, 24시간) 이다. 즉, 단계(2) 개시 0.5~144시간 (바람직하게는, 18~28시간) 전에 제 1 단계를 개시하고, 단계(1) 의 완료시에 계속해서 단계(2) 를 실시한다. 추가적인 구현예에 있어서, 단계(1) 의 다능성 줄기 세포의 배양 기간은, 바람직하게는 18~144 시간, 24~144 시간, 24~96 시간, 또는 24~72 시간이다. TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질 및 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질 중 어느 하나로 세포를 처리하고, 계속해서 다른 하나로 처리하는 경우, 각각의 처리 시간은 상기 언급된 배양 기간의 범위 내에 있도록 설정될 수 있다.
단계(1) 에 있어서의 배양 온도, 및 CO2 농도 등의 배양 조건은 적절히 결정할 수 있다. 배양 온도는 예를 들어 약 30 ℃ 내지 약 40 ℃, 바람직하게는 약 37℃ 이다. 또 CO2 농도는, 예를 들어 약 1% 내지 약 10%, 바람직하게는 약 5% 이다.
바람직한 한 구현예에 있어서, 인간 다능성 줄기 세포 (예를 들어, 인간 iPS 세포) 는 피더 세포 부재 하에서 및 bFGF 를 함유하는 무혈청 배지에서 접착 상태로 배양한다. 접착 배양은 바람직하게는, 라미닌 511, 라미닌 511 의 E8 단편 또는 비트로넥틴으로 표면을 코팅한 세포 용기에서 실시된다. 접착 배양은, 바람직하게는, 피더-프리 배지로서 Essential 8, TeSR 배지, mTeSR 배지, mTeSR-E8 배지, 또는 StemFit 배지, 더욱 바람직하게는 Essential 8 또는 StemFit 배지를 사용하여 실시된다.
바람직한 한 구현예에 있어서, 인간 다능성 줄기 세포 (예를 들어, 인간 iPS 세포) 를 피더 세포 부재 하에서 및 bFGF 를 함유하는 무혈청 배지에서 부유 배양한다. 부유 배양에서, 인간 다능성 줄기 세포는, 인간 다능성 줄기 세포 응집체를 형성할 수 있다.
바람직한 구현예에 있어서, 단계(1) 에서 얻어지는 세포는 다능성-유형 상태 (pluripotent-like state) 를 유지하며, 단계 (1) 전반에 걸쳐 다능성-유형 상태가 유지된다. 다능성-유형 상태는, 다능성을 포함하는, 다능성 줄기 세포에 공통되고 다능성 줄기 세포에 특유한 형질의 적어도 일부를 유지하고 있는 상태를 의미한다. 다능성-유형 상태에는 엄밀한 다능성을 요구하지는 않는다. 구체적으로는, 다능성 상태 (pluripotent state) 의 지표인 마커 모두 또는 일부를 발현하는 상태는 "다능성-유형 상태" 에 포함된다. 다능성-유형 상태의 마커로서, Oct3/4 양성, 알칼리 포스파타아제 양성 등이 언급될 수 있다. 한 구현예에 있어서, 다능성-유형 상태를 유지하는 세포는, Oct3/4 양성이다. 심지어 Nanog 의 발현 수준이 ES 세포 또는 iPS 세포에 비해 낮은 경우에도 이는 "다능성-유형 상태를 나타내는 세포" 에 포함된다.
한 구현예에서, 단계 (1) 에서 얻어지는 세포는, 적어도 신경 세포 또는 신경 조직 (바람직하게는, 망막 조직, 망막 세포, 망막 원세포, 또는 망막층 특이적 뉴런) 으로 분화하는 능력을 갖는 줄기 세포이다. 한 구현예에서, 단계(1) 에서 얻어지는 세포는, 적어도 신경 세포 또는 신경 조직 (바람직하게는, 망막 조직, 망막 세포, 망막 원세포, 또는 망막층-특이적 신경 세포) 로 분화하는 능력을 갖는, Oct3/4 양성의 줄기 세포이다.
바람직한 구현예에 있어서, 인간 다능성 줄기 세포 (예를 들어, iPS 세포) 를 피더 세포 부재 하에서, TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질 및/또는 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질, 및 bFGF 를 함유하는 무혈청 배지에서 접착 배양한다.
상기 언급된 접착 배양은, 바람직하게는 라미닌 511 또는 라미닌 511의 E8 단편으로 표면을 코팅한 세포 용기에서 실시된다. TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질은, 바람직하게는 TGFβ 시그널 전달 경로 저해 물질 (예를 들어, SB431542, A-83-01, Lefty), Nodal/Activin 시그널 전달 경로 저해 물질 (예를 들어, Lefty, SB431542, A-83-01), BMP 시그널 전달 경로 저해 물질 (예를 들어, LDN193189, Chordin, Noggin), 또는 이의 조합 (예를 들어, SB431542 및 LDN193189) 이다. TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질은, 더욱 바람직하게는 Lefty, SB431542, A-83-01, 또는 LDN193189, 또는 이의 조합 (예를 들어, SB431542 및 LDN193189) 이다. 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질은, 바람직하게는 Shh 단백질, SAG 또는 퍼모파민 (PMA), 보다 바람직하게는 SAG 이다. TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질 (예를 들어, Lefty, SB431542, A-83-01, LDN193189) 과 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질 (예를 들어, Shh 단백질, SAG, PMA) 을 조합하여 사용할 수 있다. 배양 기간은, 0.5~144시간 (바람직하게는, 18~144시간, 24~144시간, 24~96시간, 또는 24~72시간 (예를 들어, 18~28시간)) 이다.
단계(1) 은 예를 들어 다능성 줄기 세포를, 피더 세포 부재 하에서 미분화 상태를 유지하는 인자를 포함하는 배지 중에 미분화 상태를 유지하도록 배양하고, 이 배양액에 TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질 및/또는 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질을 첨가하고, 배양을 계속함으로써 실시된다.
예를 들어, 인간 다능성 줄기 세포 (예를 들어, 인간 iPS 세포) 를, 피더 세포 부재 하에 및 bFGF 를 포함하는 무혈청 배지에서 미분화 상태를 유지하도록 배양한다. 유지 배양은, 바람직하게는 접착 배양에 의해 행해진다. 접착 배양은, 바람직하게는 비트로넥틴, 라미닌 511 또는 라미닌 511 의 E8 단편으로 표면을 코팅한 세포 용기에서 실시된다. 이후, 배양액에 TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질 및/또는 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질을 첨가하고, 배양을 계속한다. TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질은, 바람직하게는 TGFβ 시그널 전달 경로 저해 물질 (예를 들어, SB431542, A-83-01, Lefty), Nodal/Activin 시그널 전달 경로 저해 물질 (예를 들어, SB431542, A-83-01, Lefty), BMP 시그널 전달 경로 저해 물질 (예를 들어, LDN193189), 또는 이의 조합 (예를 들어, SB431542 및 LDN193189) 이다. TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질은, 더욱 바람직하게는 Lefty, SB431542, A-83-01, 또는 LDN193189, 또는 이의 조합 (예를 들어, SB431542 및 LDN193189) 이다. 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질은, 바람직하게는 Shh 단백질, SAG 또는 PMA 이다. TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질 (예를 들어, Lefty, SB431542, A-83-01, LDN193189) 및 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질 (예를 들어, Shh 단백질, SAG, PMA) 을 조합하여 사용할 수 있다. 첨가 후, 0.5~144 시간 (바람직하게는, 18~144시간, 24~144시간, 24~96시간, 또는 24~72시간 (예를 들어, 18~28시간)) 동안 배양을 계속한다.
단계 (1) 에서 얻어진 세포를 배지에서 부유 배양하여 세포 응집체를 형성시키는 단계 (2) 에 대해 설명한다.
단계 (2) 에 사용되는 배지는, 상기 언급된 정의 부분에 기재된 바와 같은 한 특별히 제한되지는 않는다. 단계(2) 에 있어서 사용되는 배지는 혈청 함유 배지 또는 무혈청 배지일 수 있다. 화학적으로 미정의된 성분의 오염을 회피하기 위해, 본 발명에서 무혈청 배지가 바람직하게는 사용된다. 예를 들어, BMP 시그널 전달 경로 작용 물질 및 Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질이 모두 첨가되어 있지 않은 무혈청 배지를 사용할 수 있다. 제조의 번잡함을 회피하기 위해, 예를 들어, 시판되는 KSR 과 같은 혈청 대체물을 적당량 첨가한 무혈청 배지 (예를 들어, IMDM 와 F-12의 1:1 혼합물에 10% KSR, 450μM 1-모노티오글리세롤 및 1x 화학적으로 정의된 지질 농축액이 첨가된 배지, 또는 GMEM 에 5%~20% KSR, NEAA, 피루브산, 2-메르캅토에탄올이 첨가된 배지) 를 바람직하게는 사용한다. 무혈청 배지에 첨가된 KSR 의 양은, 인간 다능성 줄기 세포의 경우, 통상 약 1% 내지 약 30% 이며, 바람직하게는 약 2% 내지 약 20%이다.
응집체의 형성의 경우, 먼저 단계(1) 에서 얻어진 세포의 분산 작업에 의해, 분산 세포를 제조한다. 분산 작업에 의해 얻어진 "분산 세포" 는, 예를 들어 70% 이상의 세포가 단일 세포이며 세포의 30% 이하가 2~50 개의 세포의 덩어리인 상태를 나타낸다. 분산 세포로서 바람직하게는, 세포의 80 % 이상이 단일 세포이며, 세포의 20 % 이하가 2~50 개의 세포의 덩어리인 상태가 언급된다. 분산 세포는, 세포들의 상호 접착 (예를 들어 평면 부착) 이 거의 없는 상태를 나타낸다. 일부 구현예에서, 분산 세포는 세포-세포 결합 (예를 들어, 접착 결합) 이 거의 없는 상태를 나타낸다.
단계 (1) 에서 얻어진 세포의 분산 작업은, 상기 언급된 기계적 분산 처리, 세포 분산액 처리, 및 세포 보호제 처리를 포함할 수 있다. 이들 처리는 조합하여 수행될 수 있다. 바람직하게는, 세포 보호제 처리와 동시에 세포 분산액 처리를 실시한 후, 기계적 분산 처리를 실시한다.
세포 보호제 처리에 사용되는 세포 보호제로서, FGF 시그널 전달 경로 작용 물질, 헤파린, IGF 시그널 전달 경로 작용 물질, 혈청, 또는 혈청 대체물이 언급될 수 있다. 분산에 의해 유도되는 다능성 줄기 세포 (특히, 인간 다능성 줄기 세포) 의 세포사를 억제하기 위한 세포 보호제로서, Rho-관련 이중나선 키나아제 (ROCK) 의 저해제 또는 Myosin 의 저해제를 첨가할 수 있다. 분산에 의해 유도되는 다능성 줄기 세포 (특히, 인간 다능성 줄기 세포) 의 세포사를 억제하고, 세포를 보호하기 위해서, Rho-관련 이중나선 키나아제 (ROCK) 의 저해제 또는 Myosin 저해제를 제 2 단계 배양 출발시부터 첨가할 수 있다. ROCK 저해제로서, Y-27632, Fasudil (HA1077), H-1152 등이 언급될 수 있다. Myosin 저해제로서 블레비스타틴 (Blebbistatin) 이 언급될 수 있다.
세포 분산액 처리에 사용되는 세포 분산액으로서, 트립신, 콜라게나아제, 히알루로니다아제, 엘라스타아제, 프로나아제, DNase 또는 파파인 등의 효소, 에틸렌디아민테트라아세트산과 같은 킬레이트제 중 임의의 것을 포함하는 용액이 언급될 수 있다. 시판되는 세포 분산액, 예컨대 TrypLE Select (Life Technologies 사제) 및 TrypLE Express (Life Technologies 사제) 를 또한 사용할 수 있다.
기계적 분산 처리 방법으로서, 피펫팅 처리 또는 스크레이퍼에 의한 스크레이핑이 언급될 수 있다.
분산 세포를 상기 언급된 배지 중에 현탁된다.
이후, 분산 세포의 현탁액을 상기 언급된 배양기에 파종하고, 분산된 세포를 배양기에 대해 비접착성인 조건 하에서 배양하여, 복수의 세포를 집합시켜 응집체를 형성한다.
이 경우, 분산 세포를 10 cm 디쉬와 같이 비교적 큰 배양기에 파종함으로써, 1개의 배양기 중에서 복수의 세포의 응집체를 동시에 형성할 수 있다. 그러나, 이러한 경우 응집체의 크기가 변화한다. 따라서, 예를 들어, 96-웰 마이크로플레이트와 같은 멀티웰 플레이트 (U-바닥, V-바닥) 의 각 웰에 주어진 양의 분산된 줄기 세포를 넣고, 정치 배양을 실시하여, 세포가 신속히 응집되어 각 웰에서 1개의 응집체를 형성한다. 응집체를 복수의 웰로부터 회수하여, 균일한 응집체의 집단을 얻을 수 있다.
단계(2) 에 있어서의 세포의 농도는, 세포 응집체를 보다 균일하게 및 효율적으로 형성시키도록 적절히 설정할 수 있다. 예를 들어 96-웰 마이크로웰 플레이트를 사용하여 인간 세포 (예를 들어, 단계(1) 에 있어서 인간 iPS 세포로부터 얻어진 세포) 를 부유 배양하는 경우, 웰 마다 약 1 x 103 내지 약 1 x 105 개의 세포, 바람직하게는 약 3 x 103 내지 약 5 x 104 개의 세포, 보다 바람직하게는 약 4 x 103 내지 약 2 x 104 개의 세포, 더욱 바람직하게는, 약 4 x 103 내지 약 1.6 x 104 개의 세포, 보다 더욱 바람직하게는 약 8 x 103 내지 약 1.2 x 104 개의 세포를 달성하도록 제조한 액체를 웰에 첨가하고, 플레이트를 정치시켜 응집체를 형성시킨다.
단계(2) 에 있어서의 배양 온도, CO2 농도 등의 배양 조건은 적절히 결정할 수 있다. 배양 온도는, 예를 들어 약 30 ℃ 내지 약 40 ℃, 바람직하게는 약 37 ℃ 이다. CO2 농도는, 예를 들어 약 1% 내지 약 10%, 바람직하게는 약 5% 이다.
단계(2) 에 있어서, 배지 교환 작업을 실시하는 경우, 예를 들어 원래있는 배지를 버리지 않고 새로운 배지를 첨가하는 작업 (배지 첨가 작업), 원래있는 배지를 반량 정도 (원래있는 배지의 부피의 약 30~90%, 예를 들어 약 40~60%) 버리고 새로운 배지를 반량 정도 (원래있는 배지의 부피의 30~90%, 예를 들어 약 40~60%) 첨가하는 작업 (절반-배지 교환 작업), 및 원래있는 배지를 전체량 정도 (원래있는 배지의 부피의 90% 이상) 버리고 새로운 배지를 전체량 정도 (원래있는 배지의 부피의 90% 이상) 첨가하는 작업 (전체-배지 교환 작업) 이 언급될 수 있다.
특정 시점에서 특정 성분(예를 들어, 분화 유도 인자) 을 첨가하는 경우, 예를 들어, 최종 농도를 계산하고, 원래있는 배지를 반량 정도 버리고, 특정 성분을 최종 농도보다 높은, 구체적으로는 최종 농도의 1.5~3배, 예를 들어 최종 농도의 약 2배의 농도로 포함하는 새로운 배지를 반량 정도 첨가하는 작업 (절반-배지 교환 작업, 절반-배지 교환) 을 실시할 수 있다.
특정 시점에서, 원래 있는 배지에 포함되는 특정 성분의 농도를 유지하는 경우, 예를 들어 원래있는 배지를 반량 정도 버리고, 원래있는 배지 중의 농도와 같은 농도로 특정 성분을 포함하는 새로운 배지를 반량 정도 첨가하는 작업을 실시할 수 있다.
특정 시점에서, 원래있는 배지에 포함되는 성분의 농도를 희석에 의해 감소시키는 경우, 예를 들어 배지 교환 작업을 1일마다 복수 회, 바람직하게는 1시간 이내에 복수 회 (예를 들어 2~3회) 실시할 수 있다. 또한, 특정 시점에서 원래있는 배지에 포함되는 성분의 농도를 희석에 의해 감소시키는 경우, 세포 또는 응집체를 다른 배양 용기로 옮길 수 있다.
배지 교환 작업에 사용하는 도구는 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어 피펫터, 마이크로피펫, 멀티채널 마이크로피펫, 연속 디스펜서 등이 언급될 수 있다. 예를 들어, 배양 용기로서 96-웰 플레이트를 사용하는 경우, 멀티채널 마이크로피펫을 사용할 수 있다.
세포 응집체를 형성시키는데 필요한 부유 배양 기간은, 세포를 균일하게 응집시킬 수 있도록 사용되는 세포에 따라 적절히 결정될 수 있다. 균일한 세포 응집체를 형성하기 위해, 이는 가능한 한 단시간인 것이 바람직하다. 분산 세포가 세포 응집체를 형성하는 단계는, 세포가 집합하는 단계, 및 집합한 세포로부터 세포 응집체를 형성하는 단계로 나뉘어진다. 분산된 세포를 파종하여 (즉, 부유 배양 출발시) 세포가 집합하는 단계에서, 예를 들어 인간 세포 (예를 들어, 단계(1) 에서 인간 iPS 세포로부터 얻어진 줄기 세포) 의 경우 바람직하게는 약 24시간 이내, 보다 바람직하게는 약 12시간 이내에 집합된 세포가 형성된다. 분산 세포를 파종하는 시점 (즉 부유 배양 출발시) 으로부터 응집체가 형성될 때까지의 기간은, 인간 다능성 줄기 세포 (예를 들어, 인간 iPS 세포) 의 경우, 예를 들어 바람직하게는 약 72시간 이내, 보다 바람직하게는 약 48시간 이내이다. 세포 응집체 형성 기간은, 세포를 응집시키는 도구, 원심분리 조건 등을 조정함으로써 적절히 조절할 수 있다.
세포 응집체의 형성 및 그 균일성은, 응집체의 크기 및 세포 수, 거시적 형태, 조직 염색 분석에 의한 미시적 형태 및 그 균일성, 분화 및 미분화-마커의 발현 및 그 균일성, 분화 마커의 발현 제어 및 그 동기성, 분화 효율의 응집체간의 재현성 등에 기초를 두어 결정할 수 있다.
응집체 형성 이후, 응집체를 그 자체로 계속 배양할 수 있다. 단계(2) 에 있어서의 부유 배양 기간은, 통상 12시간~6일간, 바람직하게는 약 12시간~48시간이다.
한 구현예에서, 단계(2) 에서 사용되는 배지는 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함한다. 단계(1) 에 있어서, 다능성 줄기 세포를 TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질 및/또는 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질로 처리하고; 제 2 단계에서 제 1 단계에서 얻어진 세포를 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하는 배지 (바람직하게는 무혈청 배지) 에서 부유 배양해 응집체의 품질을 더욱 향상시키며, 둥글고, 표면이 매끄럽고, 형태가 붕괴되지 않고, 내부가 조밀한, 미분화 특성을 유지한 세포 응집체를 고효율로 형성할 수 있다.
소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질로서, 상기 언급된 것을 사용할 수 있다. 바람직하게는, 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질은 SAG, 퍼모파민 (PMA) 또는 Shh 단백질이다. 배지 중의 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질의 농도는, 상기 언급된 효과를 달성 가능한 범위에 있도록 적절히 결정할 수 있다. SAG 는 통상 1~2000 nM, 바람직하게는 10 nM~1000 nM, 보다 바람직하게는 10 nM~700 nM, 더욱 바람직하게는 50 nM~700 nM, 더욱 바람직하게는 100 nM~600 nM, 더욱 바람직하게는 100 nM~500 nM의 농도로 사용된다. PMA는 통상 0.002~20μM, 바람직하게는 0.02~2μM의 농도로 사용된다. Shh 단백질은 통상 20~1000 ng/ml, 바람직하게는 50~300 ng/ml의 농도로 사용된다. SAG, PMA, Shh 단백질 이외의 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질을 사용하는 경우, 상기 언급된 농도의 SAG 의 것과 동등한 소닉 헤지호그 시그널 전달 촉진 활성을 부여하는 농도로 사용되는 것이 바람직하다.
소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질을 배지에 첨가하는 타이밍은, 상기 언급된 효과를 달성할 수 있는 한 특별히 제한되지 않지만, 이것이 더 조기에 첨가되는 경우 더 높은 효과가 얻어질 수 있다. 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질은, 단계(2) 의 출발로부터 통상 6일 이내, 바람직하게는 3일 이내, 보다 바람직하게는 1일 이내, 및 더욱 바람직하게는 단계(2) 의 출발시에, 배지에 첨가된다.
바람직한 구현예에 있어서, 단계(2)에서, 단계(1) 에서 얻어진 인간 세포 (예를 들어, 단계(1) 에서 인간 iPS 세포로부터 얻어진 세포) 를, 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질 (예를 들어, SAG, PMA, Shh 단백질) 을 포함하는 무혈청 배지에서 부유 배양해 응집체를 형성한다. 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질은, 바람직하게는 부유 배양 출발시부터 배지에 포함된다. 배지에는, ROCK 저해제 (예를 들어, Y-27632) 를 첨가할 수 있다. 배양 기간은 12시간~6일, 바람직하게는 12시간~48시간이다. 형성되는 응집체는, 바람직하게는 균일한 응집체이다.
예를 들어, 단계(1) 에서 얻어진 인간 세포 (예를 들어, 단계(1) 에서 인간 iPS 세포로부터 얻어진 세포) 를 회수하고, 단일 세포 또는 이에 가까운 상태로, 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질 (예를 들어, SAG, PMA, Shh 단백질) 을 포함하는 무혈청 배지에 분산시키고, 부유 배양에 적용한다. 무혈청 배지는, ROCK 저해 물질 (예를 들어, Y-27632) 을 포함할 수 있다. 인간 다능성 줄기 세포 (예를 들어, 인간 iPS 세포) 의 현탁액을, 상기 언급된 배양기에 파종하고, 분산된 다능성 줄기 세포를 이들이 배양기에 대해 비접착성인 조건 하에 배양함으로써, 복수의 다능성 줄기 세포를 집합시켜 응집체를 형성한다. 배양 기간은 12시간~6일, 바람직하게는 12시간~48시간이다. 형성되는 응집체는, 바람직하게는 균일한 응집체이다.
한 바람직한 구현예에서, 단계(1) 에서 다능성 줄기 세포를 TGFβ 시그널 전달 경로 저해 물질로 처리하고, 단계(2) 에서 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질 (예를 들어, SAG, PMA, Shh 단백질) 을 포함하는 배지 중에 단계(1) 에서 얻어진 세포를 부유 배양한다. 바람직하게는, 여기서 TGFβ 시그널 전달 경로 저해 물질로서 SB431542 또는 A-83-01 을 사용할 수 있다.
한 바람직한 구현예에서, 단계(1) 에서, 다능성 줄기 세포를 BMP 시그널 전달 경로 저해 물질로 처리하고, 단계(2) 에서 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질 (예를 들어, SAG, PMA, Shh 단백질) 을 포함하지 않는 배지 중에 단계(1) 에서 얻어진 세포를 부유 배양한다. 바람직하게는, 여기서 BMP 시그널 전달 경로 저해 물질로서 LDN193189 를 사용할 수 있다.
바람직한 한 구현예에서, 단계(1) 에서 다능성 줄기 세포 (예를 들어, 인간 다능성 줄기 세포) 를 TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질 (예를 들어, TGFβ 시그널 전달 경로 저해 물질 (예를 들어, Lefty, SB431542, A-83-01), Nodal/Activin 시그널 전달 경로 저해 물질 (예를 들어, Lefty, SB431542, A-83-01), BMP 시그널 전달 경로 저해 물질 (예를 들어, LDN193189), 또는 이의 조합 (예를 들어, SB431542 및 LDN193189) 등); 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질 (예를 들어, Shh 단백질, SAG, PMA); 또는 TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질 (예를 들어, Lefty, SB431542, A-83-01, LDN193189) 과 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질 (예를 들어, Shh 단백질, SAG, PMA) 과의 조합으로 처리하고, 단계(2) 에서 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질 (예를 들어, SAG, PMA, Shh 단백질) 을 포함하는 배지 중에 단계(1) 에서 얻어진 세포의 부유 배양을 실시한다.
다른 구현예에서, 단계(1) 에서 다능성 줄기 세포 (예를 들어, 인간 다능성 줄기 세포) 를 TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질 (예를 들어, TGFβ 시그널 전달 경로 저해 물질 (예를 들어, Lefty, SB431542, A-83-01), Nodal/Activin 시그널 전달 경로 저해 물질 (예를 들어, Lefty, SB431542, A-83-01), BMP 시그널 전달 경로 저해 물질 (예를 들어, LDN193189), 또는 이의 조합 (예를 들어, SB431542 및 LDN193189) 등); 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질 (예를 들어, Shh 단백질, SAG, PMA); 또는 TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질 (예를 들어, Lefty, SB431542, A-83-01, LDN193189) 과 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질 (예를 들어, Shh 단백질, SAG, PMA) 과의 조합으로 처리하고, 단계(2) 에서 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질 (예를 들어, SAG, PMA, Shh 단백질) 을 포함하지 않는 배지 중에 단계(1) 에서 얻어진 세포의 부유 배양을 실시한다.
임의의 구현예에서, 단계(2) 의 배지는 바람직하게는 ROCK 저해제 (예를 들어, Y-27632) 을 포함한다.
이러한 방식으로 단계(2) 을 실시함으로써, 단계(1) 에서 얻어진 세포, 또는 이로부터 유래하는 세포 응집체가 형성된다. 본 발명은 상기 응집체의 제조 방법도 제공한다. 단계(2) 에서 얻어지는 응집체는, 단계(1) 에서 수행되지 않은 TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질 및/또는 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질을 사용한 처리에 의해 형성된 것보다 높은 품질을 가지고 있다. 구체적으로는, 표면이 매끄럽고, 내부가 조밀하고, 형태가 붕괴되지 않는 구형 세포 응집체의 높은 비율을 갖는 응집체 집단을 얻을 수 있다. 한 구현예에서, 제 2 단계의 개시로부터 6일째에 무작위로 응집체 (예를 들어, 100개 이상의 응집체) 를 선택했을 때, 붕괴되지 않은 응집체의 비율 및/또는 포낭화되지 않은 응집체의 비율의 합은 예를 들어 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상이다.
단계(2) 에서 얻어지는 응집체는, 다양한 분화 세포 및 분화 조직으로 분화하는 능력을 갖는다. 한 구현예에서, 단계(2) 에서 얻어지는 응집체는, 신경 세포 및 신경 조직 (바람직하게는, 망막 조직, 망막 세포, 망막 원세포, 또는 망막층-특이적 뉴런) 으로 분화하는 능력을 갖는다.
한 구현예에서, 단계(1) 에서 얻어지고 적어도 신경 세포 또는 신경 조직 (바람직하게는, 망막 조직, 망막 세포, 망막 원세포, 또는 망막층-특이적 뉴런) 으로 분화하는 능력을 갖는 줄기 세포 (바람직하게는, 적어도 신경 세포 또는 신경 조직 (바람직하게는, 망막 조직, 망막 세포, 망막 원세포, 또는 망막층-특이적 뉴런) 으로 분화하는 능력을 갖는, Oct3/4 양성 줄기 세포) 을 단계(2)에서 사용함으로써, 적어도 신경 세포 또는 신경 조직 (바람직하게는, 망막 조직, 망막 세포, 망막 원세포, 또는 망막층-특이적 뉴런) 으로 분화하는 능력을 갖는 줄기 세포 (바람직하게는 Oct3/4 양성 줄기 세포) 를 포함하는 응집체를 얻을 수 있다. 단계(2) 에서 얻어지는 응집체를 적절한 분화 조건 하에 배양함으로써, 다양한 분화 세포 및 분화 조직을 높은 효율로 유도할 수 있다.
한 구현예에서 단계(2) 에서 얻어지는 응집체는, 단계(1) 종료시에 얻어지는 다능성-유형 상태를 유지하는 세포 (구체적으로는, Oct3/4 를 발현함) 와 신경 세포 또는 신경 조직과의 사이의 중간 단계에서의 세포에 상응하는 세포를 포함한다. 이러한 세포는, 다능성 성질 마커 Oct3/4, 외배엽 마커 (Sox1, Sox2, N-카드헤린, TP63), 신경 외배엽 마커 (Sox1, Sox2, 네스틴, N-카드헤린, Otx2), 및 상기 언급된 신경 세포 마커 중 어느 하나를 발현한다. 즉, 한 구현예에서, 단계(2) 에서 얻어지는 응집체는, 다능성 상태 마커 Oct3/4, 외배엽 마커 (Sox1, Sox2, N-카드헤린, TP63), 신경 외배엽 마커 (Sox1, Sox2, 네스틴, N-카드헤린, Otx2), 상기 언급된 신경 세포 마커 중 어느 하나를 발현하는 세포의 혼합물을 포함한다. 즉, 단계(2) 에서 얻어지는 응집체는, 적어도 신경 세포 또는 신경 조직으로 분화하는 능력을 갖는 줄기 세포, 및/또는 신경 세포 또는 신경 조직의 원세포/전구체를 포함한다. 원세포/전구 세포는, 이것이 공지된 적절한 배양 조건 하에 배양될 때, 상기 언급된 신경 세포 마커를 발현하는 능력 (competence) 을 나타내는 것을 특징으로 한다. 따라서, 한 구현예에서, 단계(2) 에서 얻어지는 응집체는 Oct3/4 양성인, 적어도 신경 세포 또는 신경 조직으로 분화하는 능력을 갖는 줄기 세포, 및/또는 신경 세포 또는 신경 조직의 원세포/전구 세포를 포함한다. 단계(2) 에서 얻어지는 응집체에 포함되는 세포의 일부는, 상기 언급된 신경 조직 마커를 발현할 수 있다. 한 구현예에서, 단계(2) 에서 얻어지는 응집체는 전체 세포 중 Oct3/4 양성 세포가 50% 이상, 예를 들어 70% 이상의 비율로 포함될 수 있다.
단계(2) 에서, 배지 교환 작업을 실시하는 경우, 예를 들어 원래있는 배지를 버리지 않고 새로운 배지를 첨가하는 작업 (배지 첨가 작업), 원래있는 배지를 반량 정도 (원래있는 배지의 부피의 약 30~90%, 예를 들어 약 40~60%) 버리고 새로운 배지를 반량 정도 (원래있는 배지의 부피의 약 30~90%, 예를 들어 약 40~60%) 첨가하는 작업 (절반-배지 교환 작업), 원래있는 배지를 전체량 정도 (원래있는 배지의 부피의 90% 이상) 버리고 새로운 배지를 전체량 정도 (원래있는 배지의 부피의 90% 이상) 첨가하는 작업 (전체-배지 교환 작업) 을 포함한다.
특정 시점에 특정 성분 (예를 들어, 분화-유도 인자) 을 첨가하는 경우, 예를 들어 최종 농도를 계산하고, 원래있는 배지를 반량 정도 버리고, 특정 성분을 최종 농도보다 높은 농도 (구체적으로는 최종 농도의 1.5배~3.0배, 예를 들어 최종 농도의 약 2배의 농도) 로 포함하는 새로운 배지를 반량 정도 첨가하는 작업 (절반-배지 교환 작업, 절반-배지 교환) 을 실시할 수 있다.
특정 시점에 원래있는 배지에 포함되는 특정 성분의 농도를 유지하는 경우, 예를 들어 원래있는 배지를 반량 정도 버리고, 원래있는 배지의 농도와 같은 농도로 특정 성분을 포함하는 새로운 배지를 반량 정도 첨가하는 작업을 실시할 수 있다.
특정 시점에 원래있는 배지에 포함되는 성분의 농도를 희석에 의해 감소시키는 경우, 예를 들어 배지 교환 작업을 1일마다 복수 회, 바람직하게는 1시간 이내에 복수 회 (예를 들어 2~3회) 실시할 수 있다. 또한, 특정 시점에 원래있는 배지에 포함되는 성분의 농도를 희석에 의해 감소시키는 경우, 세포 또는 응집체를 다른 배양기로 옮길 수 있다.
배지 교환 작업에 사용되는 도구는 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어 피펫터, 마이크로피펫, 멀티채널 마이크로피펫, 연속 디스펜서 등이 언급될 수 있다. 예를 들어, 배양 용기로서 96-웰 플레이트를 사용하는 경우, 멀티채널 마이크로피펫을 사용할 수 있다.
단계(2) 에서 얻어진 응집체로부터 신경 세포 또는 신경 조직을 포함하는 응집체를 유도하는 단계(3) 을 설명한다.
다능성 줄기 세포 응집체를 부유 배양에 의해, 신경 세포 또는 신경 조직으로 유도하는 방법으로서, 많은 방법이 보고되고 있다. 예를 들어 WO 2005/123902, WO 2009/148170, WO 2008/035110, WO 2011/055855, Cell Stem Cell, 3, 519-32 (2008), Nature, 472, 51-56 (2011), Cell Stem Cell, 10(6), 771-775 (2012), Nature Biotechnology, 27(3), 275-80 (2009), Proc Natl Acad Sci USA, 110(50), 20284-9 (2013) 등에 기재된 방법이 알려져 있지만, 방법이 이들로 제한되지 않는다. 상기 다양한 신경 세포 또는 신경 조직의 유도 방법을 단계(2) 에서 얻어진 응집체에 적용하고, 단계(2) 에서 얻어진 응집체를 적절한 신경 분화 유도 조건 하에서 배양함으로써, 신경 세포 또는 신경 조직을 포함하는 응집체를 제조할 수 있다.
예를 들어, 단계(2) 에서 얻어진 응집체를 분화-유도 인자의 존재 하에 또는 부재 하에 (바람직하게는 존재 하에) 부유 배양해, 신경 세포 또는 신경 조직을 포함하는 응집체를 얻는다.
분화 유도 인자는, 세포 또는 조직의 분화를 유도하는 활성을 가지는 인자이며, 이는 예를 들어 줄기 세포 또는 원세포/전구 세포를 특정 분화 계보로 분화 (또는 운명 결정) 시키는 활성을 가지는 인자이다. 분화 유도 인자의 예는, 증식 인자 등의 생체내 유전자 생성물, 생체내 유전자 생성물의 기능을 제어하는 저분자량 화합물, 호르몬, 비타민 등의 생리적 활성 물질 등을 포함하나, 이에 특별히 제한되지는 않는다. 당업자에게 범용되고 있는 분화 유도 인자의 예는, BMP 시그널 전달 작용 물질, BMP 시그널 전달 경로 저해 물질, Shh 시그널 전달 경로 작용 물질, Shh 시그널 전달 경로 저해 물질, FGF 시그널 전달 경로 작용 물질, FGF 시그널 전달 경로 저해 물질, Wnt 시그널 전달 경로 작용 물질, 및, Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질을 포함한다. 세포의 종류 또는 분화 상태 (분화능, 잠재력) 에 따라 분화-유도 인자에 대한 응답이 상이하고, 심지어 분화 유도 과정에서도 분화 유도 인자의 농도 및 첨가 시기에 따라 분화 유도 인자의 효과가 상이할 수 있다. 또한, 동물종에 따라 유사한 효과를 나타내는 분화 유도 인자의 최적 농도가 상이하다는 것이 알려져 있고, 예를 들어 일반적으로는 마우스 세포와 인간 세포 사이에서 인간 세포가 최적 농도가 높다는 것이 알려져 있다 (특히 외배엽, 내배엽에 있어서). 다능성 줄기 세포의 특정 세포 또는 조직으로의 분화 유도 방법은 다수 보고되어 있고, 의도된 세포 또는 조직에 적합한 분화 유도 인자 또는 분화 유도 방법을 선택할 수 있다.
본 발명에 사용되는 분화-유도 인자는 통상 포유류의 분화-유도 인자이다. 포유류의 예는 상기 언급된 것을 포함한다. 분화-유도 인자는, 포유류 종 간에 교차 반응성을 가질 수 있으므로, 배양된 다능성 줄기 세포의 분화 유도가 달성될 수 있는 한, 임의의 포유류의 미분화-유도 인자를 또한 사용할 수 있다. 바람직하게는 배양되는 세포와 동일 종의 포유류 분화-유도 인자가 사용된다.
본 발명에 사용되는 분화-유도 인자는 바람직하게는 단리된다. 따라서, 한 구현예에서, 본 발명은 단리된 분화-유도 인자를 제공하는 단계를 포함한다. 또한, 한 구현예에서, 단계(3) 에 사용되는 배지에 단리된 분화-유도 인자를 외인 적으로 첨가하는 단계를 포함한다.
한 구현예에서, 본 발명 방법에서 분화-유도 인자로서 뉴런 분화 유도-인자를 사용하여, 신경 세포 또는 신경 조직을 포함하는 응집체를 제조할 수 있다.
한 구현예에서, 단계(3) 에 있어서 사용되는 배지는 예를 들어 분화-유도 인자가 첨가된 무혈청 배지 또는 혈청-함유 배지 (바람직하게는 무혈청 배지) 이다. 상기 배지는, 기저 막 표본을 함유할 수 있거나 함유하지 않을 수 있다. 기저 막 표본으로서, 상기 언급된 것을 사용할 수 있다. 기저 막 표본을 첨가하는 경우, 농도는 예를 들어, Matrigel 을 사용하는 경우 체적으로 0.1~10%, 보다 바람직하게는 0.5%~2% 이다. 화학적 미식별된 물질에 의한 오염을 회피하기 위해 기저 막 표본을 첨가하지 않는다.
이러한 배지에 사용되는 무혈청 배지 또는 혈청-함유 배지는, 상기 언급된 바와 같은 한 특별히 제한되지는 않는다. 제조의 번잡함을 회피하기 위해, 예를 들어 시판되는 KSR 등의 혈청 대체물을 적당량 첨가한 무혈청 배지 (예를 들어, IMDM 와 F-12의 1:1 혼합물에 10% KSR, 450μM 1-모노티오글리세롤 및 1x 화학적으로 정의된 지질 농축물이 첨가된 배지, 또는 GMEM 에 5%~20% KSR, NEAA, 피루브산, 2-메르캅토에탄올이 첨가된 배지) 를 바람직하게는 사용한다. 무혈청 배지 에 대한 KSR의 첨가량은, 인간 ES 세포의 경우 통상 약 1% 내지 약 20% 이며, 바람직하게는 약 2% 내지 약 20% 이다.
단계(3) 에서 사용되는 배지 (바람직하게는 무혈청 배지) 로서, 단계(2) 에서 사용되는 배지 (바람직하게는 무혈청 배지) 를 바로 사용할 수 있거나, 새로운 배지 (바람직하게는 무혈청 배지) 로 대체될 수 있다. 단계(2) 에서 사용된 분화-유도 인자를 포함하지 않는 무혈청 배지를 바로 단계(3) 에 사용하는 경우, 분화-유도 인자를 배지에 첨가할 수 있다.
단계(3) 에서, 배지 교환 작업을 실시하는 경우, 예를 들어 원래있는 배지를 버리지 않고 새로운 배지를 첨가하는 작업 (배지 첨가 작업), 원래있는 배지를 반량 정도 (원래있는 배지의 부피의 40~80%정도) 버리고 새로운 배지를 반량 정도 (원래있는 배지의 부피의 40~80%) 첨가하는 작업 (절반-배지 교환 작업), 원래있는 배지를 전체량 정도 (원래있는 배지의 부피의 90% 이상) 버리고 새로운 배지를 전체량 정도 (원래있는 배지의 부피의 90% 이상) 첨가하는 작업 (전체-배지 교환 작업) 이 언급될 수 있다.
특정 시점에 특정 성분 (예를 들어, 분화-유도 인자) 을 첨가하는 경우, 예를 들어, 최종 농도를 계산하고, 원래있는 배지를 반량 정도 버리고, 특정 성분을 최종 농도보다 높은 농도 (구체적으로는 최종 농도의 1.5배~3.0배, 예를 들어 최종 농도의 약 2배) 로 포함하는 새로운 배지를 반량 정도 첨가하는 작업 (절반-배지 교환 작업, 절반-배지 교환) 을 실시할 수 있다.
특정 시점에 원래있는 배지에 포함되는 특정 성분의 농도를 유지하는 경우, 예를 들어 원래있는 배지를 반량 정도 버리고, 원래있는 배지에서의 농도와 같은 농도로 특정 성분을 포함하는 새로운 배지를 반량 정도 첨가하는 작업을 실시할 수 있다.
특정 시점에 원래있는 배지에 포함되는 성분의 농도를 희석에 의해 감소시키는 경우, 예를 들어 배지 교환 작업을 1일마다 복수 회, 바람직하게는 1시간 이내에 복수 회 (예를 들어 2~3회) 실시할 수 있다. 또한, 특정 시점에 원래있는 배지에 포함되는 성분의 농도를 희석에 의해 감소시키는 경우, 세포 또는 응집체를 다른 배양 용기로 옮길 수 있다.
배지 교환 작업에 사용하는 도구는 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어 피펫터, 마이크로피펫, 멀티채널 마이크로피펫, 연속 디스펜서 등이 언급될 수 있다. 예를 들어, 배양 용기로서 96 웰 플레이트를 사용하는 경우, 멀티채널 마이크로피펫을 사용할 수 있다.
분화-유도 인자는, 단계(2) 의 부유 배양 개시 이후 약 24시간에 또는 그 이후에 첨가될 수 있고, 부유 배양 개시 이후 수 일 이내 (예를 들어, 15일 이내 또는 18일 이내) 에 배지에 첨가할 수 있다. 바람직하게는, 분화-유도 인자는 부유 배양 개시 이후 1일째 내지 18일째, 또는 1일째 내지 15일째, 보다 바람직하게는 1일째 내지 9일째, 더욱 바람직하게는 3일째 내지 8일째 사이, 또는 2일째 내지 9일째 사이, 보다 더욱 바람직하게는 3일째 내지 6일째 사이에 배지에 첨가한다.
추가적인 구현예에 있어서, 분화-유도 인자 (예를 들어, Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질, TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질 등) 를, 단계(2) 에서 부유 배양 개시와 동시에 또는 이로부터 약 24시간 이내에 첨가할 수 있다.
분화-유도 인자가 배지에 첨가되고 응집체의 신경 세포로의 분화 유도가 개시된 이후, 분화-유도 인자를 배지에 반드시 첨가할 필요는 없고, 분화-유도 인자를 포함하지 않는 무혈청 배지 또는 혈청-함유 배지 각각으로 배지를 교환할 수 있다. 한 구현예에서, 응집체의 신경 세포로의 분화 유도의 개시 이후, 각각 분화 유도 인자를 포함하지 않는 무혈청 배지 또는 혈청-함유 배지와의 배지 교환에 의해, 배지 내의 분화-유도 인자 농도를 2~4일 마다 40~60% 의 비율로 서서히 또는 단계적으로 저하시킨다.
구체적인 구현예에서, 부유 배양 개시 이후 (즉 상기 단계(2) 의 개시 이후), 0~18일째, 바람직하게는 1~9일째, 보다 바람직하게는 2~8일째, 더욱 바람직하게는 3 또는 4일째에, 배지를 일부 또는 전부 분화-유도 인자를 포함하는 배지와 교환하고, 세포를 분화-유도 인자의 존재 하에서 약 1~100일 동안 배양할 수 있다. 분화-유도 인자의 농도를 동일 수준으로 유지하기 위하여, 배지를 일부 또는 전부 분화-유도 인자를 포함하는 배지와 교환할 수 있다. 대안적으로, 상기 언급된 바와 같이, 분화-유도 인자의 농도를 단계적으로 감소시킬 수 있다.
신경 세포로의 분화 유도가 개시된 세포는, 예를 들어 세포에서 신경 마커 유전자의 발현을 검출함으로써 확인할 수 있다. 단계(3) 의 한 구현예로서, 단계(2) 에서 형성된 응집체를 신경 마커 유전자를 발현하는 세포가 출현할 때까지, 신경 분화 유도에 필요한 농도로 분화-유도 인자를 포함하는 무혈청 배지 또는 혈청-함유 배지에서 부유 배양해, 신경 세포를 포함하는 응집체를 얻는 단계가 언급될 수 있다.
한 구현예에서, 분화-유도 인자로서 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질이 사용된다. 즉, 제 2 단계에서 얻어진 응집체를, BMP 시그널 전달 경로 작용 물질의 존재 하에 부유 배양해, 신경 세포 또는 신경 조직을 포함하는 응집체를 얻는다.
BMP 시그널 전달 경로 작용 물질은, BMP 에 의해 매개되는 시그널 전달 경로를 증강할 수 있는 물질이다. BMP 시그널 전달 경로 작용 물질의 예는 BMP2, BMP4 또는 BMP7 등의 BMP 단백질, GDF7 등의 GDF 단백질, 항-BMP 수용체 항체, BMP 부분 펩티드 등을 포함한다. BMP2 단백질, BMP4 단백질 및 BMP7 단백질은 예를 들어 R＆D Systems 으로부터 입수가능하고, GDF7 단백은 예를 들어 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 로부터 입수가능하다.
BMP 시그널 전달 경로 작용 물질의 농도는, 다능성 줄기 세포 또는 이로부터 유래하는 줄기 세포 응집체의 신경 세포로의 분화를 유도할 수 있는 농도일 수 있다. 예를 들어 인간 BMP4 의 경우, 이는 약 0.01 nM 내지 약 1μM, 바람직하게는 약 0.1 nM 내지 약 100 nM, 보다 바람직하게는 약 1 nM 내지 약 10 nM, 더욱 바람직하게는 약 1.5 nM (55 ng/mL) 의 농도로 배지에 첨가한다.
한 구현예에서, 각각 상기 언급된 분화-유도 인자를 포함하지 않는 무혈청 배지 또는 혈청-함유 배지 (바람직하게는 무혈청 배지), 및 각각 상기 언급된 미분화 상태를 유지하는 인자를 포함하지 않는 무혈청 배지 또는 혈청-함유 배지 (바람직하게는 무혈청 배지) 에서, 단계(3) 을 실시하는 것에 의해, 신경 세포 또는 신경 조직으로의 분화 (자발 분화) 를 유도할 수 있다. 예를 들어, BMP 시그널 전달 경로 작용 물질 (예를 들어, BMP4) 및 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질 (예를 들어, SAG, PMA) 을 실질적으로 포함하지 않는 (즉, 전혀 함유하지 않거나 생리적 활성 발현 농도 이하의 농도로 함유됨) 무혈청 배지 또는 혈청-함유 배지 (바람직하게는, 무혈청 배지) 에서, 단계(2) 에서 얻어진 응집체를 부유 배양하여, 신경 세포 또는 신경 조직을 포함하는 응집체를 또한 얻을 수 있다.
이러한 배지는, 상기 언급된 바와 같은 한 특별히 제한되지는 않는다. 제조의 번잡함을 회피하기 위해 예를 들어 시판되는 KSR 등의 혈청 대체물을 적당량 첨가한 무혈청 배지 (예를 들어, IMDM 와 F-12의 1:1 혼합물에 10% KSR, 450μM 1-모노티오글리세롤 및 1x 화학적으로 정의된 지질 농축물이 첨가된 배지) 를 바람직하게는 사용한다. 무혈청 배지에 첨가된 KSR 의 양은, 예를 들어 인간 ES 세포의 경우, 통상 약 1% 내지 약 20% 이며, 바람직하게는 약 2% 내지 약 20% 이다.
단계(3) 에서 사용되는 배지 (바람직하게는 무혈청 배지) 는, 단계(2) 에서 사용된 배지 (바람직하게는 무혈청 배지) 를 그대로 사용할 수 있거나, 새로운 배지 (바람직하게는 무혈청 배지) 로 배지를 대체하여 사용할 수 있다.
단계(3) 에서 배양 온도, CO2 농도 등의 배양 조건은 적절히 설정할 수 있다. 배양 온도는, 예를 들어 약 30 내지 약 40 ℃, 바람직하게는 약 37 ℃ 이다. CO2 농도는, 예를 들어 약 1% 내지 약 10%, 바람직하게는 약 5% 이다.
신경 세포를 포함하는 응집체를 얻은 사실은, 예를 들어 신경 세포 마커를 발현하는 세포의 응집체에서의 존재를 검출함으로써 확인할 수 있다. 신경 세포의 마커의 예는, 네스틴, TuJ1, PSA-NCAM 등을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다. 한 구현예에서, 응집체에 포함되는 세포의 20% 이상 (바람직하게는, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상) 은, 네스틴, TuJ1 및 PSA-NCAM 로 이루어지는 군에서 선택되는 임의의 신경 세포 마커를 발현할 때까지, 단계(3) 의 배양이 실시된다.
얻어진 신경 세포를 포함하는 응집체는, 그대로 독성 또는 약물 효능을 평가하기 위한 시약으로서 사용할 수 있다. 신경 세포를 포함하는 응집체를 분산 처리 (예를 들어, 트립신/EDTA 처리 또는 파파인 처리) 에 적용하고, 얻어진 세포를 FACS 또는 MACS 를 사용하여 선택함으로써, 고순도의 신경 세포를 또한 얻을 수 있다.
한 구현예에서, 단계 (3) 에서 얻어지는 신경 세포를 포함하는 응집체는, 신경 표피 구조를 포함하고, 표피 구조에 신경 조직 및/또는 신경 세포가 포함된다. 신경 표피 구조는 응집체의 표면을 덮어 존재 하지만, 그 일부는 응집체의 내부에도 형성될 수 있다. 단계 (2) 에서 얻어지는 응집체를 사용하여, 신경 표피 구조를 포함하는 응집체를 높은 효율로 유도할 수 있다. 신경 표피 구조는, 신경 마커 유전자 (예를 들어, 네스틴, TuJ1, PSA-NCAM)-양성 표피 구조로서 식별될 수 있다. 신경 표피 구조를 신경 조직으로서 얻을 수 있다. 한 구현예에서, 응집체에서 신경 표피 구조가 형성될 때까지, 단계(3) 의 배양이 실시된다. 단계(3) 의 한 구현예로서, 단계(2) 에서 형성된 응집체를 신경 표피 구조가 출현할 때까지 뉴런 분화 유도 조건 하에 (예를 들어, 뉴런 분화 유도에 필요한 농도로 분화-유도 인자를 포함하는 무혈청 배지 또는 혈청-함유 배지에서) 부유 배양하여, 신경 표피 구조를 포함하는 응집체를 얻는 단계가 언급될 수 있다.
한 구현예에서, 단계(2) 또는 단계(3) 에서 얻어진 응집체를 분산시키고 세포 배양 디쉬에 파종하고, 접착 상태로 배양해, 신경 세포 또는 신경 조직을 제조할 수 있다. 대안적으로, 한 구현예에서, 단계(2) 또는 단계(3) 에서 얻어진 응집체를 분산시킬 수 있고, 얻어진 분산 세포를 세포 배양 디쉬에 파종하고, 접착 상태로 배양하여, 신경 세포 또는 신경 조직을 제조할 수 있다. 배지로서, 상기 언급된 배지를 사용할 수 있고, 배지에 분화-유도 인자를 또한 첨가할 수 있다. 세포 배양 디쉬로서, 상기 언급된 접착 배양용 디쉬를 사용할 수 있다. 세포 배양 디쉬는 세포 접착 분자 등으로 코팅될 수 있다 (예를 들어, 라미닌 코트). 신경 세포 또는 신경 조직의 제조는, 신경 세포 또는 신경 조직 마커에 대해 면역 염색하여 확인할 수 있다.
한 구현예에서, 단계(2) 또는 단계(3) 에서의 부유 배양 동안 얻어진 신경 세포를 포함하지 않는 응집체를, 접착 배양용 디쉬에 파종하고, 신경 세포로 분화할 때까지 접착 배양할 수 있다. 접착 배양에 사용하는 배지는 특별히 제한되지 않지만, 상기 언급된 단계(3) 에서 사용하는 배지를 또한 사용할 수 있다.
한 구현예에서, 단계(2) 또는 단계(3) 에서의 접착 배양 동안 얻어진 신경 세포를 포함하지 않는 세포를, 접착 배양용 디쉬로부터 탈착시키고, 부유 배양용 디쉬에 파종하고, 신경 세포로 분화할 때까지 부유 배양할 수 있다. 부유 배양에 사용되는 배지는 특별히 제한되지는 않지만, 단계(3) 에서 사용하는 배지가 또한 사용될 수 있다.
응집체의 표면에 존재 하는 신경 표피 구조는, 현미경 하에서 핀셋 등을 사용하여 응집체로부터 물리적으로 절단될 수 있다.
본 발명의 제조 방법에 의해, 다능성 줄기 세포로부터 고효율로 신경 표피 구조 등의 신경 조직을 얻을 수 있다. 본 발명의 제조 방법에 의해 얻어지는 신경 표피 구조는 다양한 신경 세포를 포함하므로, 각종 신경 세포의 마커에 대한 항체를 사용하여, FACS 등에 의해, 각종 뉴런 및 이의 원세포/전구 세포를 단리할 수도 있다.
얻어진 신경 표피 구조 등의 신경 조직을 포함하는 응집체는, 그 자체로 독성 또는 약물 효능 평가용 시약으로서 사용할 수 있다. 신경 표피 구조 등의 신경 조직을 포함하는 응집체를 분산 처리 (예를 들어, 트립신/EDTA 처리 또는 파파인 처리) 하고, 얻어진 세포를 FACS 또는 MACS 에 의해 선택함으로써, 고순도의 신경 세포를 얻을 수 있다.
3.망막 조직의 제조 방법
본 발명의 제조 방법 2 는, 하기 단계 (1)~(3) 를 포함하는, 망막 조직의 제조 방법이다:
(1) 다능성 줄기 세포를, 피더 세포 부재 하에서 및 1) TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질 및/또는 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질, 및 2) 미분화 상태를 유지하는 인자를 포함하는 배지에서 배양하는 제 1 단계,
(2) 제 1 단계에서 얻어진 세포를 부유 배양해, 세포 응집체를 형성시키는 제 2 단계, 및
(3) 제 2 단계에서 얻어진 응집체를, BMP 시그널 전달 경로 작용 물질의 존재 하에 부유 배양해, 망막 조직을 포함하는 응집체를 얻는 제 3 단계.
본 발명의 제조 방법 2 의 단계 (1) 은, 본 발명의 제조 방법 1 의 단계 (1) 과 동일한 방식으로 실시할 수 있다.
바람직하게는, 단계 (1) 에서 얻어지는 세포는, 적어도 망막 조직, 망막 세포, 망막 원세포, 또는 망막층-특이적 뉴런으로 분화하는 능력을 갖는 줄기 세포를 포함한다. 한 구현예에서, 단계(1) 에 의해 얻어지는 세포는, 적어도 망막 조직, 망막 세포, 망막 원세포, 또는 망막층-특이적 뉴런으로 분화하는 능력을 갖는, Oct3/4 양성 줄기 세포를 포함한다. 한 구현예에서, 단계(1) 에서 얻어지는 세포는, Oct3/4 양성 줄기 세포를 60% 이상, 예를 들어 90% 이상의 비율로 포함한다.
본 발명의 제조 방법 2 의 단계 (2) 는 또한 본 발명의 제조 방법 1 의 단계 (2) 와 동일한 방식으로 실시할 수 있다.
제조 방법 2 의 단계 (2) 에서 사용되는 배지는, 바람직하게는 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함한다. 단계(1) 에서, 다능성 줄기 세포를 TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질 및/또는 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질로 처리하고; 단계(2) 에서, 단계(1) 에서 얻어진 세포를 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하는 배지 (바람직하게는 무혈청 배지) 에서 부유 배양해 응집체를 형성시켜, 응집체 품질을 추가로 향상시키고 망막 조직으로의 분화능을 향상시킨다. 고품질 응집체를 사용하여, 망막 조직을 포함하는 응집체를 고효율로 유도할 수 있다.
소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질로서, 상기 언급된 것을 사용할 수 있다. 바람직하게는 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질은 Shh 단백질, SAG 또는 PMA이다. 배지 중의 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질의 농도는, 상기 언급된 효과를 달성 가능한 범위에 있도록 적절히 결정할 수 있다. SAG 는 통상 1~2000 nM, 바람직하게는 10 nM~700 nM, 보다 바람직하게는 30~600 nM의 농도로 사용된다. PMA 는 통상 0.002~20μM, 바람직하게는 0.02~2μM 의 농도로 사용된다. Shh 단백질은 통상 20~1000 ng/ml, 바람직하게는 50~300 ng/ml의 농도로 사용된다. Shh 단백질, SAG 또는 PMA 이외의 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질을 사용하는 경우, 이는 바람직하게는 상기 언급된 농도로의 SAG 의 것과 동등한 소닉 헤지호그 시그널 전달 촉진 활성을 부여하는 농도로 사용된다.
배지 중의 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질의 농도는, 단계(2) 의 기간 동안 변동될 수 있다. 예를 들어, 단계(2) 의 개시시에, 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질을 상기 언급된 범위 내에 있도록 제공하고, 2~4 일 마다 40~60% 의 비율로 서서히 또는 단계적으로 농도를 저하시킬 수 있다.
소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질을 배지에 첨가하는 타이밍은, 상기 언급된 효과를 달성할 수 있는 한 특별히 제한되지 않지만, 이것이 조기에 첨가되면 더 높은 효과가 얻어질 수 있다. 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질은, 단계(2) 개시부터 통상 6일 이내, 바람직하게는 3일 이내, 보다 바람직하게는 1일 이내, 더욱 바람직하게는 단계(2) 의 개시시에 배지에 첨가된다.
바람직한 구현예에서, 단계(1) 에서 얻어진 인간 세포 (예를 들어, 단계(1) 에 있어서 인간 iPS 세포로부터 얻어진 세포) 를, 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질 (예를 들어, SAG, PMA, Shh 단백질) 을 포함하는 무혈청 배지에서 부유 배양하여, 응집체를 형성한다. 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질은, 바람직하게는 부유 배양 개시시부터 배지에 포함된다. 배지에는, ROCK 저해 물질 (예를 들어, Y-27632) 을 또한 첨가할 수 있다. 배양 기간은 12시간~6일, 바람직하게는 12시간~48시간이다. 형성되는 응집체는, 바람직하게는 균일한 응집체이다.
예를 들어, 단계(1) 에서 얻어진 인간 세포 (예를 들어, 단계(1) 에서 인간 iPS 세포로부터 얻어진 세포) 를 회수하고, 단일 세포 또는 이에 가까운 상태로 분산시키고, 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질 (예를 들어, SAG, PMA) 을 포함하는 무혈청 배지에서 부유 배양한다. 무혈청 배지는, ROCK 저해제 (예를 들어, Y-27632) 를 포함할 수 있다. 인간 줄기 세포 (예를 들어, 인간 iPS 세포로부터 유래하는 줄기 세포) 의 현탁액을, 상기 언급된 배양기 중에 파종하고, 분산시킨 세포를 배양기에 대해 비접착성인 조건 하에 배양함으로써, 복수의 다능성 줄기 세포를 집합시켜 응집체를 형성한다. 배양 기간은 12시간~6일간 (바람직하게는 12시간~48시간) 이다. 형성되는 응집체는, 바람직하게는 균일한 응집체이다.
이러한 방식으로 단계(2) 를 실시함으로써, 단계(1) 에서 얻어진 세포, 또는 이로부터 유래하는 세포 응집체가 형성된다. 본 발명은 또한 상기 응집체의 제조 방법도 제공한다. 단계(2) 에서 얻어지는 응집체는, 단계(1) 에서 TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질 및/또는 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질에 의한 처리가 수행되지 않은 경우에 의해 형성된 것보다 높은 품질을 가지고 있다. 구체적으로는, 표면이 매끄럽고, 응집체의 내부가 조밀하고, 형태가 붕괴되지 않은 구형 세포 응집체의 집단을 얻을 수 있다. 한 구현예에서, 제 2 단계 개시부터 6일째에 무작위로 응집체 (예를 들어, 100 개 이상의 응집체) 를 선택했을 때에, 포낭화하지 않은 응집체의 비율은 예를 들어 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상이다.
단계(2) 에서 얻어지는 응집체는, 망막 조직으로 분화하는 능력을 갖는다. 단계(2) 에서 얻어지는 응집체를 이하의 단계 (3) 의 조건 하에서 배양함으로써, 망막 조직을 포함하는 응집체를 고효율로 제조할 수 있다.
한 구현예에서, 단계(1) 에서 얻어진 적어도 망막 조직, 망막 세포, 망막 원세포, 또는 망막층-특이적 뉴런으로 분화하는 능력을 갖는 줄기 세포 (바람직하게는, 적어도 망막 조직, 망막 세포, 망막 원세포, 또는 망막층-특이적 뉴런으로 분화하는 능력을 갖는, Oct3/4 양성 줄기 세포) 를 단계(2) 에서 사용함으로써, 적어도 망막 조직, 망막 세포, 망막 원세포, 또는 망막층-특이적 뉴런으로 분화하는 능력을 갖는 줄기 세포 (예를 들어, Oct3/4 양성 줄기 세포) 를 포함하는 응집체를 얻을 수 있다.
단계(2) 에서 얻어진 응집체를 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질의 존재 하에서 부유 배양하여, 망막 조직을 포함하는 응집체를 얻는 단계(3) 을 설명한다.
단계(3) 에서 사용되는 배지는 예를 들어 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질이 첨가된 무혈청 배지 또는 혈청-함유 배지 (바람직하게는, 무혈청 배지) 이다.
이러한 배지에 사용되는 무혈청 배지 또는 혈청-함유 배지는 상기 언급된 바와 같은 한 특별히 제한되지는 않는다. 제조의 번잡함을 회피하기 위해, 예를 들어, 시판되는 KSR 등의 혈청 대체물을 적당량 첨가한 무혈청 배지 (예를 들어, IMDM 와 F-12 의 1:1 혼합물에 10% KSR, 450μM 1-모노티오글리세롤 및 1x 화학적으로 정의된 지질 농축물이 첨가된 배지) 를 사용하는 것이 바람직하다. 인간 다능성 줄기 세포 (예를 들어, iPS 세포) 의 경우, 무혈청 배지에 첨가된 KSR 의 양은 통상 약 1% 내지 약 20% 이며, 바람직하게는 약 2% 내지 약 20% 이다.
단계(3) 에서 사용되는 배지 (바람직하게는, 무혈청 배지) 는 단계(2) 에서 사용된 배지 (바람직하게는, 무혈청 배지) 일 수 있거나, 새로운 배지 (바람직하게는, 무혈청 배지) 로 대체될 수 있다. 단계(2) 에서 사용된 BMP 시그널 전달 경로 물질을 포함하지 않는 배지를 바로 단계(3) 에서 사용하는 경우, BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 배지에 첨가할 수 있다.
단계(3) 에 사용하는, BMP 시그널 전달 경로 작용 물질의 예는 BMP2, BMP4 또는 BMP7 등의 BMP 단백질, GDF7 등의 GDF 단백질, 항-BMP 수용체 항체, 또는 BMP 부분 펩티드 등을 포함한다. BMP2 단백질, BMP4 단백질 및 BMP7 단백질은 예를 들어 R＆D Systems 로부터, GDF7 단백질은 예를 들어 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 로부터 입수가능하다. 바람직한 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질로서 BMP4 이 언급될 수 있다.
BMP 시그널 전달 경로 작용 물질의 농도는, 다능성 줄기 세포 응집체를 형성하는 세포의 망막 세포로의 분화를 유도할 수 있는 농도일 수 있다. 예를 들어 인간 BMP4 의 경우, 이는 약 0.01 nM 내지 약 1μM, 바람직하게는 약 0.1 nM 내지 약 100 nM, 보다 바람직하게는 약 1 nM 내지 약 10 nM, 더욱 바람직하게는 약 1.5 nM (55 ng/ml) 의 농도로 배지에 첨가한다. BMP4 이외의 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 사용하는 경우, 이는 바람직하게는 상기 언급된 농도에서 BMP4 의 것과 동등한 BMP 시그널 전달 촉진 활성을 나타내는 농도로 사용된다.
배지 중 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질의 농도는, 단계 (3) 의 기간 동안 변동될 수 있다. 예를 들어, 단계 (3) 의 개시시에 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 상기 언급된 범위 내에 있도록 제공하고, 2~4일 마다 40~60% 의 비율로 서서히 또는 단계적으로 농도를 저하시킬 수 있다.
BMP 시그널 전달 경로 작용 물질은, 단계(2) 의 부유 배양 개시 이후 약 24 시간 또는 그 이후에 첨가될 수 있고, 부유 배양 개시 이후 수 일 이내 (예를 들어, 15 일 이내) 에 배지에 첨가할 수 있다. 바람직하게는, BMP 시그널 전달 경로 작용 물질은, 부유 배양 개시 이후 1일째 내지 15일째, 보다 바람직하게는 1일째 내지 9일째, 더욱 바람직하게는 3일째 내지 8일째 또는 2일째 내지 9일째, 보다 더욱 바람직하게는 3일째 내지 6일째에 배지에 첨가한다.
구체적인 구현예에서, 부유 배양 개시 이후 (즉 상기 언급된 단계(2) 의 개시 이후) 1~9일째, 바람직하게는 2~8일째, 더욱 바람직하게는 3 또는 4일째에, 배지를 일부 또는 전부 BMP4 를 포함하는 배지와 교환해, BMP4 의 최종 농도를 약 1~10 nM 로 조절하고, 세포를 BMP4 의 존재 하에 약 1~12일, 바람직하게는 2~9일, 더욱 바람직하게는 2~5일 동안 배양할 수 있다. BMP4 의 농도를 동일 수준으로 유지하기 위하여, 1 또는 2회 배지를 일부 또는 전부 BMP4 를 포함하는 배지로 교환할 수 있다. 대안적으로 상기 언급된 바와 같이, BMP4 의 농도를 또한 단계적으로 줄일 수 있다.
BMP 시그널 전달 경로 작용 물질의 배지에 대한 첨가 및 응집체를 형성하는 세포의 망막 세포로의 분화 유도 개시 이후, BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 배지에 첨가할 필요는 없고, 배지를 각각 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하지 않는 무혈청 배지 또는 혈청-함유 배지와 교환할 수 있다. 한 구현예에서, 망막 세포로의 분화 유도의 개시 이후, 각각 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하지 않는 무혈청 배지 또는 혈청-함유 배지에 의한 배지의 교환에 의해, 배지 안의 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질 농도를 2~4 일 마다 40~60% 의 비율로 서서히 또는 단계적으로 저하시킨다. 망막 세포로의 분화 유도가 개시된 세포는, 예를 들어 세포에서 망막 원세포 마커 유전자 (예를 들어, Rx유전자 (별칭 Rax), Pax6 유전자, Chx10 유전자) 의 발현을 검출함으로써 확인할 수 있다. GFP 등의 형광 리포터 단백질 유전자가 Rax 유전자 자리에 노크-인된 (knocked-in) 다능성 줄기 세포를 사용하여, 단계(2) 에서 형성된 응집체를, 망막 세포로의 분화 유도에 필요한 농도로의 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질의 존재 하에 부유 배양하고, 발현된 형광 리포터 단백질로부터 발광된 형광을 검출함으로써, 망막 세포로의 분화 유도가 개시된 기간을 확인할 수 있다. 단계(3) 의 한 구현예는, 단계(2) 에서 형성된 응집체를, 망막 원세포 마커 유전자 (예를 들어, Rx 유전자, Pax6 유전자, Chx10 유전자) 를 발현하는 세포가 출현할 때까지, 망막 세포로의 분화 유도에 필요한 농도로 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하는 무혈청 배지 또는 혈청-함유 배지 중에서 부유 배양해, 망막 원세포를 포함하는 응집체를 얻는 단계이다.
단계(3) 에서, 배지 교환 작업을 실시하는 경우, 예를 들어 원래있는 배지를 버리지 않고 새로운 배지를 첨가하는 작업 (배지 첨가 작업), 원래있는 배지를 반량 정도 (원래있는 배지의 부피의 40~80% 정도) 버리고 새로운 배지를 반량 정도 (원래있는 배지의 부피의 40~80%) 첨가하는 작업 (절반-배지 교환 작업), 원래있는 배지를 전체량 정도 (원래있는 배지의 부피의 90% 이상) 버리고 새로운 배지를 전체량 정도 (원래있는 배지의 부피의 90% 이상) 첨가하는 작업 (전체-배지 교환 작업) 이 언급될 수 있다.
특정 시점에 특정 성분 (예를 들어, BMP4) 을 첨가하는 경우, 예를 들어 최종 농도를 계산하고, 원래있는 배지를 반량 정도 버리고, 특정 성분을 최종 농도보다 높은 농도 (구체적으로는 최종 농도의 1.5~3.0 배, 예를 들어 최종 농도의 약 2배의 농도) 로 포함하는 새로운 배지를 반량 정도를 첨가하는 작업 (절반-배지 교환 작업, 절반-배지 교환) 을 실시할 수 있다.
특정 시점에 원래있는 배지에 포함되는 특정 성분의 농도를 유지하는 경우, 예를 들어 원래있는 배지를 반량 정도 버리고, 원래있는 배지에서의 농도와 동일한 농도로 특정 성분을 포함하는 새로운 배지를 반량 정도 첨가하는 작업을 실시할 수 있다.
특정 시점에 원래있는 배지에 포함되는 성분의 농도를 희석에 의해 감소시키는 경우, 예를 들어 배지 교환 작업을 1일 마다 복수 회, 바람직하게는 1시간 이내에 복수 회 (예를 들어 2~3 회) 실시할 수 있다. 또한, 특정 시점에 원래있는 배지에 포함되는 성분의 농도를 희석에 의해 감소시키는 경우, 세포 또는 응집체를 다른 배양 용기로 옮길 수 있다.
배지 교환 작업에 사용하는 도구는 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어 피펫터, 마이크로피펫, 멀티채널 마이크로피펫, 연속 디스펜서 등이 언급될 수 있다. 예를 들어, 배양 용기로서 96 웰 플레이트를 사용하는 경우, 멀티채널 마이크로피펫을 사용할 수 있다.
한 구현예에서, 단계(2) 에서 배지에 첨가되는 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질의 농도가 비교적 낮은 (예를 들어, SAG 에 대해서는 700 nM 이하, 및 다른 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질에 대해서는 SAG 의 것과 동등하거나 그 이하의 Shh 시그널 전달 촉진 활성을 나타내는 농도) 경우, 배지 교환을 실시할 필요는 없고, 단계(2) 에서 사용된 배지에 분화-유도 인자 (예를 들어, BMP4) 를 첨가할 수 있다. 다른 한 편으로는, Shh 시그널 전달 경로 작용 물질의 농도가 비교적 높은 (예를 들어, SAG 에 대해서는 700 nM 초과, 또는 1000 nM 이상, 및 다른 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질에 대해서는 SAG 의 것과 동등한 Shh 시그널 전달 촉진 활성을 나타내는 농도) 경우, 분화-유도 인자 첨가시에 잔존하는 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질의 영향을 억제하기 위해 분화-유도 인자 (예를 들어, BMP4) 를 포함하는 신선한 배지로 배지를 교환하는 것이 바람직하다.
바람직한 구현예에서, 단계(3) 에서 사용되는 배지 중 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질의 농도는, SAG 의 Shh 시그널 전달 촉진 활성에 관해 계산될 때 700 nM이하, 바람직하게는 300 nM 이하, 보다 바람직하게는 10 nM 이하, 더욱 바람직하게는 0.1 nM 이하이고, 더욱 바람직하게는 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하지 않는다. "Shh 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하지 않는" 배지는 또한 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질을 실질적으로 포함하지 않는 배지, 예를 들어 망막 원세포 및 망막 조직으로의 선택적 분화에 불리한 영향을 주는 농도로 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질을 함유하지 않는 배지를 포함한다. "Shh 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하지 않는" 배지는 또한 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질이 실질적으로 첨가되어 있지 않은 배지, 예를 들어 망막 원세포 및 망막 조직으로의 선택적 분화에 불리한 영향을 주는 농도로 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질이 첨가되어 있지 않은 배지를 포함한다.
단계(3) 에서 배양 온도, CO2 농도 등의 배양 조건은 적절히 결정할 수 있다. 배양 온도는, 예를 들어 약 30 ℃ 내지 약 40 ℃, 바람직하게는 약 37 ℃ 이다. CO2 농도는 예를 들어 약 1% 내지 약 10%, 바람직하게는 약 5% 이다.
상기 배양에 의해, 단계 (2) 에서 얻어진 응집체를 형성하는 세포의 망막 원세포로의 분화가 유도되어, 망막 원세포를 포함하는 응집체를 얻을 수 있다. 본 발명은 상기 망막 원세포를 포함하는 응집체의 제조 방법도 제공한다. 망막 원세포를 포함하는 응집체를 얻은 것은, 예를 들어 망막 원세포 마커인 Rx, PAX6 또는 Chx10 를 발현하는 세포의 응집체에서의 존재를 검출함으로써 확인할 수 있다. 단계(3) 의 한 구현예는 단계(2) 에서 형성된 응집체를 Rx 유전자를 발현하는 세포가 출현하기 시작할 때까지, 망막 세포로의 분화 유도에 필요한 농도로 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하는 무혈청 배지 또는 혈청-함유 배지에서 부유 배양하여, 망막 원세포를 포함하는 응집체를 얻는 단계이다. 한 구현예에서, 응집체에 포함되는 세포의 20% 이상 (바람직하게는, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상) 이 Rx 를 발현할 때까지, 단계(3) 의 배양이 실시된다.
망막 세포 및/또는 망막 조직의 제조의 바람직한 구현예에서, 단계(1) 에서, 인간 다능성 줄기 세포 (예를 들어, 인간 iPS 세포) 를 피더 세포 부재 하에서, TGFβ 시그널 전달 경로 저해 물질 (예를 들어 SB431542, A-83-01) 및 bFGF 를 함유하는 무혈청 배지 중에 접착 상태로 배양하고; 단계(2) 에서, 세포를 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질 (예를 들어 SAG, PMA, Shh 단백질) 을 함유하는 무혈청 배지에서 부유 배양하고; 단계(3) 에서, 응집체를 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질 (예를 들어 BMP4) 을 함유하는 무혈청 배지에서 부유 배양한다.
또한, 망막 세포 및/또는 망막 조직의 제조에 바람직한 구현예에서, 단계 (1) 에서 인간 다능성 줄기 세포 (예를 들어, 인간 iPS 세포) 를 피더 세포 부재 하에서, BMP 시그널 전달 경로 저해 물질 (예를 들어, LDN193189) 및 bFGF 를 함유하는 무혈청 배지 중에 접착 상태로 배양하고; 단계(2) 에서, 세포를 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질 (예를 들어 SAG, PMA) 을 함유하지 않는 또는 함유하는 무혈청 배지로 부유 배양하고; 단계(3) 에서, 응집체를 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질 (예를 들어 BMP4) 을 함유하는 무혈청 배지 중에 부유 배양한다.
망막 세포 및/또는 망막 조직을 제조하는 바람직한 구현예에서, 단계(1) 에서, 인간 다능성 줄기 세포 (예를 들어, 인간 iPS 세포) 를 피더 세포 부재 하에서, 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질 (예를 들어 SAG, PMA) 및 bFGF 를 함유하는 무혈청 배지 중에, 바람직하게는 1일 이상 및 6일 이하, 더욱 바람직하게는 2일~4일 동안 접착 배양하고, 단계(2) 에서 세포를 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질 (예를 들어 SAG, PMA) 을 함유하는 무혈청 배지 중에 부유 배양하고, 단계(3) 에서 응집체를 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질 (예를 들어 BMP4) 을 함유하는 무혈청 배지 중에 부유 배양한다.
망막 세포 및/또는 망막 조직을 제조하는 바람직한 구현예에서, 단계(1) 에서 인간 다능성 줄기 세포 (예를 들어, 인간 iPS 세포) 를 피더 세포 부재 하에서,
TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질 (예를 들어, TGFβ 시그널 전달 경로 저해 물질 (예를 들어, Lefty , SB431542, A-83-01), Nodal/Activin 시그널 전달 경로 저해 물질 (예를 들어, Lefty, SB431542, A-83-01), BMP 시그널 전달 경로 저해 물질 (예를 들어, LDN193189), 또는 이의 조합 (예를 들어, SB431542 및 LDN193189) 등);
소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질 (예를 들어, Shh 단백질, SAG, PMA); 또는
TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질 (예를 들어, Lefty, SB431542, A-83-01, LDN193189) 및 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질 (예를 들어, Shh 단백질, SAG, PMA) 의 조합:
bFGF
를 함유하는 무혈청 배지 중에 접착 배양하고;
단계(2) 에서, 단계(1) 에서 얻어진 세포를 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질 (예를 들어, SAG, PMA, Shh 단백질) 을 포함하는 무혈청 배지 중에 부유 배양해, 세포 응집체를 형성하고,
단계(3) 에서, 응집체를 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질 (예를 들어 BMP4) 을 함유하는 무혈청 배지 중에 부유 배양해, 망막 원세포, 망막 세포 또는 망막 조직을 포함하는 응집체를 얻는다.
단계(2) 의 배지는, 바람직하게는 ROCK 저해 물질 (예를 들어, Y-27632) 을 포함한다.
얻어진 망막 원세포를 포함하는 응집체는, 그 자체로 독성 또는 약물 효능 평가용 시약으로서 사용할 수 있다. 망막 원세포를 포함하는 응집체를 분산 처리 (예를 들어, 트립신/EDTA 처리 또는 파파인 처리) 하고, 얻어진 세포를 FACS 또는 MACS 를 사용하여 선택함으로써, 고순도의 망막 원세포를 또한 얻을 수 있다.
또한, 망막 원세포를 포함하는 응집체를 무혈청 배지 또는 혈청-함유 배지에서 계속 배양하여, 망막 원세포를 보다 분화시켜, 신경 표피 구조-유형 망막 조직을 제조할 수 있다.
이러한 배지에 사용되는 무혈청 배지 또는 혈청-함유 배지는, 상기 언급된 바와 같은 한 특별히 제한되지는 않는다. 예를 들어, DMEM-F12 배지에 10% 소 태아 혈청, N2 보충물, 100μM 타우린, 및 500 nM 레티노산을 첨가한 혈청 배지, 또는 시판되는 KSR 등의 혈청 대체물을 적당량 첨가한 무혈청 배지 (예를 들어, IMDM 와 F-12 의 1:1 의 혼합물에 10% KSR, 450 μM 1-모노티오글리세롤 및 1x 화학적으로 정의된 지질 농축물을 첨가한 배지) 등이 언급될 수 있다.
망막 원세포로부터 망막 조직을 유도하는 배양 기간은 의도된 망막층-특이적 뉴런에 따라 상이한데, 이는 예를 들어 약 7일 내지 약 200일이다.
망막 조직은 응집체의 표면을 덮게 존재한다. 부유 배양 종료 이후, 응집체를 파라-알데히드 용액 등의 고정액을 사용하여 고정하고, 동결 절편을 제조한 후, 층 구조를 갖는 망막 조직의 형성은 면역 염색법 등에 의해 확인될 수 있다. 망막 조직의 각 층은 상이한 망막 원세포 (광수용체 세포, 수평 세포, 쌍극성 세포, 아마크린 세포, 망막 신경절 세포) 로 구성되므로, 층 구조의 형성은 이러한 세포에서 발현된 상기 언급된 마커에 대해 항체를 사용하여 면역 염색법에 의해 확인될 수 있다. 한 구현예에서, 망막 조직은 Rx 또는 Chx10-양성 신경 표피 구조이다.
응집체의 표면에 존재 하는 망막 조직을 핀셋 등을 사용하여 응집체로부터 물리적으로 절단할 수 있다. 이 경우, 각 응집체의 표면에서 망막 조직 이외의 신경 조직이 형성될 수 있으므로, 응집체로부터 절단한 신경 조직의 일부를 후술의 면역 염색법 등에 의해 확인함으로써, 조직이 망막 조직임을 확인할 수 있다.
한 구현예에서, 단계(3) 에서 얻어지는 응집체는 망막 조직을 포함하고, 두부 비신경 외배엽을 실질적으로 포함하지 않는다. 망막 조직을 포함하고 두부 비신경 외배엽을 실질적으로 포함하지 않는 응집체에서, 예를 들어 상기 언급된 응집체 동결 절편의 면역 염색 이미지에서, Rx-양성 조직이 관찰되고 그 외측에서 Rx-음성 조직이 관찰되지 않는다.
단계(3) 의 한 구현예는, 단계(2) 에서 형성된 응집체를 Rx 유전자 및/또는 Chx10 유전자를 발현하는 세포가 출현하기 시작할 때까지, 망막 세포로의 분화 유도에 필요한 농도로 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하는 무혈청 배지 또는 혈청-함유 배지 중에서 부유 배양하여, 망막 원세포를 포함하는 응집체를 생성하고, 망막 원세포를 포함하는 응집체를 망막 조직이 형성될 때까지 계속해서 무혈청 배지 또는 혈청-함유 배지 중에 부유 배양하여, 망막 조직을 포함하는 응집체를 얻는 단계이다. 망막 원세포를 포함하는 응집체를 망막 조직이 형성될 때까지, 계속해서 무혈청 배지 또는 혈청-함유 배지 중에 부유 배양하는 경우, 각각 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하지 않는 무혈청 배지 또는 혈청-함유 배지에 의한 배지 교환에 의해, 망막 원세포를 유도하기 위해서 배지 중의 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질 농도를 2~4 일 마다 40~60% 의 비율로 서서히 또는 단계적으로 저하시킬 수 있다. 한 구현예에서, 응집체에 포함되는 세포의 20% 이상 (바람직하게는, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상) 이 Chx10 를 발현할 때까지, 망막 원세포를 포함하는 응집체의 부유 배양이 실시된다.
단계(3) 의 한 구현예에서, 단계(2) 에서 얻어진 응집체, 또는 단계(2) 에서 얻어진 응집체를 상기 언급된 방법에 의해 부유 배양한 응집체를 접착 배양하여, 접착 응집체를 형성할 수 있다. 접착 응집체를, Rx 유전자 및/또는 Chx10 유전자를 발현하는 세포가 출현할 때까지, 망막 세포로의 분화 유도에 필요한 농도로 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하는 무혈청 배지 또는 혈청-함유 배지 중에 접착 배양해, 망막 원세포를 포함하는 응집체를 얻는다. 망막 원세포를 포함하는 응집체를 망막 조직이 형성될 때까지, 계속해서 무혈청 배지 또는 혈청-함유 배지 중에 접착 배양해, 망막 조직을 포함하는 응집체를 얻는다. 한 구현예에서, 세포의 10% 이상 (바람직하게는, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상)이 Chx10 를 발현할 때까지, 망막 원세포를 포함하는 응집체의 접착 배양이 실시된다.
본 발명의 제조 방법 2 에 의해, 다능성 줄기 세포로부터 고효율로 망막 조직을 얻을 수 있다. 본 발명의 제조 방법 2 에 의해 얻어지는 망막 조직은, 망막층의 각각에 특이적인 뉴런을 포함하고, 또한 광수용체 세포, 수평 세포, 쌍극성 세포, 아마크린 세포, 망막 신경절 세포 또는 이의 원세포/전구 세포 등의 망막 조직을 구성하는 세포를 수득할 수 있다. 얻어진 망막 조직으로부터 어느 세포가 얻어졌는지는, 공지된 방법 자체, 예를 들어 세포 마커의 발현에 의해 확인할 수 있다.
얻어진 망막 조직을 포함하는 응집체는 바로 독성 또는 약물 효능 평가용 시약으로서 사용할 수 있다. 망막 조직을 포함하는 응집체를 분산 처리 (예를 들어, 트립신/EDTA 처리) 하고, 얻어진 세포를 FACS 또는 MACS 를 사용하여 선택함으로써, 고순도의 망막 조직-구성 세포, 예를 들어 고순도의 광수용체 세포를 얻을 수 있다.
본 발명의 제조 방법 2 등에 의해 얻어진 망막 조직을 포함하는 세포 응집체로부터, 하기 단계 (A) 및 단계 (B) 에 의해, 모양체 주연부-유형 구조를 제조할 수 있다.
본 발명에서 모양체 주연부-유형 구조란, 모양체 주연부와 유사한 구조이다. "모양체 주연부 (CMZ)" 의 예는, 생체내 망막에서 망막 조직 (구체적으로는, 신경 망막) 및 망막 색소 표피의 경계 영역에 존재 하는 조직을 포하고, 이는 망막의 조직 줄기 세포 (망막 줄기 세포) 를 포함하는 영역이다. 모양체 주연부는, 모양체 주연 (ciliary margin) 또는 망막 주연 (retinal margin) 으로도 칭하고, 모양체 주연부, 모양체 주연 및 망막 주연은 동등한 조직이다. 모양체 주연부는, 망막 조직에 대한 망막 원세포 또는 분화 세포의 공급, 망막 조직 구조의 유지 등에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 모양체 주연부의 마커 유전자의 예는, Rdh10 유전자 (양성) 및 Otx1 유전자 (양성) 및 Zic1 (양성) 등을 포함한다.
단계(A) 는 본 발명의 제조 방법 2 로 얻어진 망막 조직을 포함하는 세포 응집체로서, Chx10-양성 세포가 망막 조직의 20% 이상 및 100% 이하의 비율로 존재 하는 세포 응집체를, Wnt 시그널 전달 경로 작용 물질 및/또는 FGF 시그널 전달 경로 저해 물질을 포함하는 무혈청 배지 또는 혈청-함유 배지 중에, RPE65 유전자- 발현 세포의 출현 이전의 기간 동안만 배양하는 것을 포함한다.
여기서, 단계(A) 의 바람직한 배양으로서, 부유 배양이 언급될 수 있다.
단계(A) 에서 사용되는 무혈청 배지로서, 기초 배지에 N2 또는 KSR 가 첨가된 무혈청 배지가 언급될 수 있다. 더 구체적으로는, DMEM/F12 배지에 N2 보충제 (Life Technologies) 가 첨가된 무혈청 배지가 언급될 수 있다. 혈청-함유 배지로서, 기초 배지에 소 태아 혈청이 첨가된 혈청 배지가 언급될 수 있다.
단계(A) 의 배양 온도, CO2 농도 등의 배양 조건은 적절히 설정할 수 있다. 배양 온도는, 예를 들어 약 30 ℃ 내지 약 40 ℃ 의 범위, 예를 들어 약 37 ℃ 정도이다. CO2 농도는 예를 들어 약 1% 내지 약 10% 범위, 바람직하게는 예를 들어 약 5% 정도이다.
단계(A) 에서, 상기 언급된 "망막 조직을 포함하는 세포 응집체" 를 배지에서 배양할 때 무혈청 배지 또는 혈청-함유 배지에 포함되는 Wnt 시그널 전달 경로 작용 물질은, Wnt 에 의해 매개되는 시그널 전달을 증강할 수 있는 한 특별히 제한되지는 않는다. 구체적인 Wnt 시그널 전달 경로 작용 물질의 예는, Wnt 패밀리에 속하는 단백질 (예를 들어, Wnt1, Wnt3a, Wnt7a), Wnt 수용체, Wnt 수용체 아고니스트, GSK3β 저해제 (예를 들어, 6-브로모인디루빈-3'-옥심 (BIO), CHIR99021, Kenpaullone) 등을 포함한다.
단계(A) 의 무혈청 배지 또는 혈청-함유 배지에 포함되는 Wnt 시그널 전달 경로 작용 물질의 농도는, CHIR99021 등의 통상적인 Wnt 시그널 전달 경로 작용 물질의 경우, 예를 들어 약 0.1μM 내지 약 100μM 의 범위, 바람직하게는 예를 들어 약 1μM 내지 약 30μM 의 범위, 보다 바람직하게는 예를 들어 약 3μM 이다.
단계(A) 에서 상기 언급된 "망막 조직을 포함하는 세포 응집체" 를 배지에서 배양할 때 무혈청 배지 또는 혈청-함유 배지에 포함되는 FGF 시그널 전달 경로 저해 물질은, FGF 에 의해 매개되는 시그널 전달을 저해할 수 있는 한 특별히 제한되지는 않는다. FGF 시그널 전달 경로 저해 물질의 예는, FGF 수용체, FGF 수용체 저해제 (예를 들어, SU-5402, AZD4547, BGJ398), MAP 키나아제 캐스캐이드 저해 물질 (예를 들어, MEK 저해제, MAPK 저해제, ERK 저해제), PI3 키나아제 저해제, Akt 저해제 등을 포함한다.
단계(A) 에서 무혈청 배지 또는 혈청-함유 배지에 포함되는 FGF 시그널 전달 경로 저해 물질의 농도는, 응집체의 모양체 주연부-유형 구조로의 분화를 유도할 수 있는 농도이면 된다. 예를 들어 SU-5402의 경우, 이는 매질에 약 0.1μM 내지 약 100μM, 바람직하게는 약 1μM 내지 약 30μM, 보다 바람직하게는 약 5μM의 농도로 첨가한다.
단계(A) 에서 "RPE65 유전자-발현 세포의 출현 이전의 기간 동안만 배양" 은, RPE65 유전자-발현 세포의 출현 이전의 기간의 전부 또는 일부에서의 배양을 의미한다. 즉, 배양 시스템에서 상기 언급된 "망막 조직을 포함하는 세포 응집체" 가 RPE65 유전자를 실질적으로 발현하지 않는 세포로 구성되는 기간의 전부 또는 일부 (임의인 기간) 에서 배양하는 것이 충분하다. 상기 배양을 사용하는 것에 의해, RPE65 유전자-발현 세포가 출현하지 않는 세포 응집체를 얻을 수 있다.
상기 특정 기간을 결정하기 위해, 상기 언급된 "망막 조직을 포함하는 세포 응집체" 를 시료로서 사용하고, 시료 중에 포함되는 RPE65 유전자의 발현 유무 또는 그 수준을 통상적인 유전 공학적 방법 또는 생화학적 방법을 사용하여 측정할 수 있다. 구체적으로는 예를 들어 상기 언급된 "망막 조직을 포함하는 세포 응집체" 의 동결 절편을 RPE65 단백질에 대한 항체를 사용하여 면역 염색하는 방법에 적용하여 RPE65 유전자의 발현 유무 또는 그 수준을 조사할 수 있다.
단계(A) 의 "RPE65 유전자-발현 세포의 출현 이전의 기간" 으로서, 예를 들어 상기 언급된 망막 조직에 존재 하는 Chx10-양성 세포의 비율이 Wnt 시그널 전달 경로 작용 물질 및/또는 FGF 시그널 전달 경로 저해 물질을 포함하는 무혈청 배지 또는 혈청-함유 배지 중의 상기 언급된 세포 응집체의 배양 개시시보다 감소하고, 30% 내지 0% 의 범위 이내에 있는 기간이 언급될 수 있다. "RPE65 유전자-발현 세포가 출현하고 있지 않는 세포 응집체" 로서, 상기 언급된 망막 조직에 Chx10-양성 세포가 조직의 30% 내지 0% 의 비율로 존재하는 세포 응집체가 언급될 수 있다.
단계(A) 에서 "RPE65 유전자-발현 세포의 출현 이전의 기간" 의 날짜는, Wnt 시그널 전달 경로 작용 물질 및/또는 FGF 시그널 전달 경로 저해 물질의 종류, 무혈청 배지 또는 혈청-함유 배지의 종류, 기타 배양 조건 등에 따라 변화하지만, 이는 예를 들어 14일 이내이다. 보다 구체적으로는, 무혈청 배지 (예를 들어, 기초 배지에 N2 가 첨가된 무혈청 배지) 가 사용되는 경우, 상기 언급된 기간은 바람직하게는 예를 들어, 10일 이내, 더 바람직하게는 예를 들어 3일 내지 6일이다. 혈청-함유 배지 (예를 들어, 기초 배지에 소 태아 혈청이 첨가된 혈청 배지) 가 사용되는 경우, 상기 언급된 기간은 바람직하게는 예를 들어 12일 이내, 보다 바람직하게는 예를 들어 6일 내지 9일이다.
이후 단계(B) 에서, 상기 언급된 바와 같이 배양해 얻어진 "RPE65 유전자-발현 세포가 출현하고 있지 않는 세포 응집체" 를, Wnt 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하지 않는 무혈청 배지 또는 혈청-함유 배지에서 배양한다.
단계(B) 에서 바람직한 배양으로서, 부유 배양이 언급될 수 있다.
단계(B) 의 무혈청 배지는, 바람직하게는 FGF 시그널 전달 경로 저해 물질을 포함하지 않는다.
단계(B) 의 무혈청 배지로서, 기초 배지에 N2 또는 KSR 가 첨가된 배지가 언급될 수 있다. 혈청-함유 배지로서, 기초 배지에 소 태아 혈청이 첨가된 배지가 언급될 수 있다. 보다 구체적으로는, DMEM/F12 배지에 소 태아 혈청이 첨가된 혈청 배지가 언급될 수 있다.
단계(B) 에서 상기 무혈청 배지 또는 혈청-함유 배지는, 알려진 증식 인자, 증식을 촉진하는 첨가제 및 화학 물질 등을 포함할 수 있다. 이미 알려진 증식 인자의 예는 EGF, FGF, IGF, 인슐린 등을 포함한다. 증식을 촉진하는 첨가제의 예는 N2 보충제 (Life Technologies), B27 보충제 (Life Technologies), KSR (Life Technologies) 등을 포함한다. 증식을 촉진하는 화학 물질의 예는 레티노이드 (예를 들어, 레티노산), 및 타우린을 포함한다.
단계(B) 의 바람직한 배양 기간은 예를 들어 상기 언급된 망막 조직에 존재 하는 Chx10-양성 세포의 비율이, Wnt 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하지 않는 무혈청 배지 또는 혈청-함유 배지 중의 상기 언급된 세포 응집체의 배양 개시시보다 증가하고, 30% 이상을 달성하는 배양 기간이다.
단계(B) 에서 배양 온도, CO2 농도 등의 배양 조건은 적절히 설정할 수 있다. 배양 온도는, 예를 들어 약 30 ℃ 내지 약 40 ℃, 바람직하게는 예를 들어 약 37 ℃ 이다. CO2 농도는 예를 들어 약 1% 내지 약 10% 범위, 바람직하게는 예를 들어 약 5% 이다.
단계(B) 에서 "모양체 주연부-유형 구조를 포함하는 세포 응집체" 를 얻을 때까지 상기 언급된 배양 날짜는 무혈청 배지 또는 혈청-함유 배지의 종류, 기타 배양 조건 등에 따라 변화하지만, 이는 예를 들어 100 일 이내이다. 상기 언급된 배양 날짜는 바람직하게는 예를 들어 20일 내지 70일, 바람직하게는 예를 들어 30일 내지 60일이다.
상기 언급된 단계 (A), (B) 에 의해 제조된 "모양체 주연부-유형 구조를 포함하는 세포 응집체" 에서, 동일한 세포 응집체에서 모양체 주연부-유형 구조에 인접하여 망막 색소 표피 및 망막 조직 (구체적으로는, 신경 망막) 이 존재한다. 구조는 현미경 관찰 등에 의해 확인할 수 있다. 구체적으로는 예를 들어, 현미경 관찰에 의해, 투명도가 높은 망막 조직과 색소 침착을 나타내는 망막 색소 표피와의 사이에 형성되는, 망막측이 두껍고 망막 색소 표피측이 얇은 표피 구조로서 모양체 주연부-유형 구조의 존재를 확인할 수 있다. 또한, 응집체의 동결 절편의 면역 염색에 의해, Rdh10 양성, Otx1 양성, 또는 Zic1 양성에 의해 모양체 주연부-유형 구조의 존재를 확인할 수 있다.
추가적인 구현예에 있어서, 상기 언급된 단계 (A), (B) 에 의해 응집체에 포함되는 망막 조직 (신경 표피) 의 분화가 진행되고, 광수용체 전구 세포, 광수용체 세포, 원뿔형 광수용체 세포, 막대형 광수용체 세포, 수평 세포, 개재뉴런 (아마크린 세포, 신경절 세포 등) 으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1개, 바람직하게는 복수 개, 보다 바람직하게는 모든 세포를 포함하는, 성숙 망막 조직 및 상기 언급된 세포를 제조할 수 있다.
본 발명의 제조 방법 2 등에 의해 얻어진 망막 조직을 포함하는 세포 응집체로부터, 하기 단계 (C) 에 의해 망막 색소 표피 세포를 제조할 수 있다. 하기 단계(C) 에 의해 얻어진 망막 색소 표피 세포로부터, 하기 단계 (D) 에 의해 망막 색소 표피 시트를 제조할 수 있다.
본 발명에서 "망막 색소 표피 세포" 는, 생체내 망막에서 신경 망막 조직의 외측에 존재 하는 표피 세포를 의미한다. 이것이 망막 색소 표피 세포인지는, 당업자에 의해 예를 들어 세포 마커 (RPE65 (성숙한 망막 색소 표피 세포), Mitf (미숙 또는 성숙 망막 색소 표피 세포) 등) 의 발현, 멜라닌 과립의 존재, 다각형의 특징적인 세포 형태 등에 의해 확인할 수 있다.
먼저, 단계(C) 에서 본 발명의 제조 방법 2 에 의해 얻어진 망막 조직을 포함하는 세포 응집체를, BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하지 않고 Wnt 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하는 무혈청 배지 또는 혈청-함유 배지 안에서 부유 배양해, 망막 색소 표피 세포를 포함하는 응집체를 생성한다.
단계(C) 에서 사용하는 무혈청 배지로서, 기초 배지에 N2 또는 KSR 가 첨가된 무혈청 배지가 언급될 수 있다. 더 구체적으로는, DMEM/F12 배지에 N2 보충제 (Life Technologies) 가 첨가된 무혈청 배지가 언급될 수 있다. 혈청-함유 배지로서, 기초 배지에 소 태아 혈청이 첨가된 혈청 배지가 언급될 수 있다.
단계(C) 에서 사용하는 무혈청 배지는 상기 언급된 Wnt 시그널 전달 경로 작용 물질 이외에, 상기 언급된 Nodal/Activin 시그널 전달 경로 작용 물질, 및/또는 상기 언급된 FGF 시그널 전달 경로 저해 물질을 포함할 수 있다.
여기서, 단계(C) 의 바람직한 배양의 예는 부유 배양이다.
본 발명의 단계(C) 에서 얻어진 응집체를 분산하고, 얻어진 세포를 접착 배양하는 단계(D) 를 설명한다.
단계(D) 는 단계(C) 의 실시 개시 이후 60일 이내, 바람직하게는 30일 이내, 보다 바람직하게는 3일에 실시한다.
단계(D) 에서 접착 배양에 사용되는 무혈청 배지 또는 혈청-함유 배지로서, 상기 언급된 같은 배지가 언급될 수 있다. 제조의 번잡함을 회피하기 위해, 시판되는 KSR 등의 혈청 대체물을 적당량 첨가한 무혈청 배지 (예를 들어, DMEM/F-12 및 Neurobasal 의 1:1 혼합물에 1/2 x N2 보충물, 1/2 x B27 보충물 및 100μM 2-메르캅토에탄올이 첨가된 배지) 를 바람직하게는 사용한다. 무혈청 배지에 첨가되는 KSR 의 양은, 예를 들어 인간 iPS 세포 유래 세포의 경우, 통상 약 1% 내지 약 20%, 바람직하게는 약 2% 내지 약 20%이다.
단계(D) 에서, 상기 언급된 ROCK 저해 물질을 포함하는 무혈청 배지 또는 혈청-함유 배지에서 세포를 배양하는 것이 바람직하다.
단계(D) 에서, Wnt 시그널 전달 경로 작용 물질, FGF 시그널 전달 경로 저해 물질, Activin 시그널 전달 경로 작용 물질 및 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 물질을 추가로 포함하는 무혈청 배지 또는 혈청-함유 배지에서 세포를 배양하는 것이 보다 바람직하다.
Activin 시그널 전달 경로 작용 물질은, Activin 에 의해 매개되는 시그널을 증강시킬 수 있는 물질이다. Activin 시그널 전달 경로 작용 물질의 예는, Activin 패밀리에 속하는 단백질 (예를 들어, Activin A, Activin B, Activin C, Activin AB 등), Activin 수용체, Activin 수용체 아고니스트를 포함한다.
단계(D) 에서 사용되는 Activin 시그널 전달 경로 작용 물질의 농도는, 망막 색소 표피 세포의 균일한 시트를 효율적으로 형성시킬 수 있는 한 임의의 것일 수 있다. 예를 들어 재조합 인간/마우스/래트 Activin A (R&D systems, #338-AC) 는, 약 1 ng/ml 내지 약 10 μg/ml, 바람직하게는 약 10 ng/ml 내지 약 1 μg/ml, 보다 바람직하게는 약 100 ng/ml 의 농도로 첨가한다.
Activin 시그널 전달 경로 작용 물질은, 단계(D) 의 개시로부터 예를 들어 18일 이내, 바람직하게는 6일째에 첨가한다.
단계(D) 에서, 배양기질로 표면 처리된 배양기 상에서 접착 배양을 실시하는 것이 바람직하다. 단계(D) 에서 배양기의 처리에 사용되는 배양 기질로서, 응집체 유래 세포의 접착 배양 및 망막 색소 표피 시트의 형성을 가능하게 하는 세포 배양 기질이 언급될 수 있다.
4. 대뇌 조직의 제조 방법
본 발명의 제조 방법 3 은, 하기 단계 (1)~(3) 를 포함하는, 대뇌 조직의 제조 방법이다:
(1) 다능성 줄기 세포를, 피더 세포 부재 하에서, 및 1) TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질 및/또는 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질, 및 2) 미분화 상태를 유지하는 인자를 포함하는 배지에서 배양하는 제 1 단계,
(2) 제 1 단계에서 얻어진 세포를 부유 배양해 세포 응집체를 형성하는 제 2 단계, 및
(3) 제 2 단계에서 얻어진 응집체를, TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질 및/또는 Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질의 존재 하에 부유 배양해, 대뇌 조직을 포함하는 응집체를 얻는 제 3 단계.
본 발명의 제조 방법 3 의 단계(1) 은, 본 발명의 제조 방법 1 의 단계 (1) 과 동일한 방식으로 실시할 수 있다.
본 발명의 제조 방법 3 의 단계(2) 은, 본 발명의 제조 방법 1 의 단계(2) 와 동일한 방식으로 실시할 수 있다.
제조 방법 3 의 단계 (2) 에서 사용되는 배지는, 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.
단계(2) 에서 사용되는 배지는, TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질 및/또는 Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질을 포함할 수 있다. 단계(2)에서, TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질 또는 Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질은 단독으로 배지에 첨가할 수 있고, 바람직하게는 둘 다 조합하여 첨가할 수 있다.
단계(3) 에서, 분화-유도 인자로서 TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질 또는 Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질을 단독으로 배지에 첨가할 수 있고, 둘 다 바람직하게는 조합하여 첨가할 수 있다.
단계(3) 에서 사용되는 배지는, 예를 들어 TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질 및/또는 Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질이 첨가된 무혈청 배지 또는 혈청-함유 배지 (바람직하게는, 무혈청 배지) 이다.
상기 배지에 사용되는 무혈청 배지 또는 혈청-함유 배지는, 이것이 상기 언급된 바와 같은 한 특별히 제한되지는 않는다. 제조의 번잡함을 회피하기 위해 , 예를 들어 시판되는 KSR 등의 혈청 대체물을 적당량 첨가한 무혈청 배지 (예를 들어, GMEM 배지에 20% KSR, 0.1 mM 2-메르캅토에탄올, 비필수 아미노산, 1 mM 피루브산) 를 바람직하게는 사용한다. 무혈청 배지에 첨가되는 KSR 의 양은, 예를 들어 인간 다능성 줄기 세포 (예를 들어, iPS 세포) 의 경우, 통상 약 1% 내지 약 30%, 바람직하게는 약 2% 내지 약 20% 이다.
단계(3) 에서 사용되는 배지 (바람직하게는, 무혈청 배지) 는, 단계(2) 에서 사용된 배지 (바람직하게는, 무혈청 배지) 일 수 있거나, 새로운 배지 (바람직하게는, 무혈청 배지) 로 대체될 수 있다. 단계(2) 에서 사용된, TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질 및/또는 Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질을 포함하지 않는 배지를 바로 단계(3) 에서 사용하는 경우, TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질 및/또는 Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질을 배지에 첨가할 수 있다. TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질 및/또는 Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질을 포함하는 단계(2) 에서 사용된 배지를 바로 단계(3) 에 사용하는 경우, 동일한 배지로 배지의 반량을 교환할 수 있다.
단계(2) 및 (3) 에 사용되는 TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질의 예는, TGFβ 시그널 전달 경로 저해 물질, Nodal/Activin 시그널 전달 경로 저해 물질 및 BMP 시그널 전달 경로 저해 물질을 포함한다.
TGFβ 시그널 전달 경로 저해 물질은, TGFβ 에 의해 기인되는 시그널 전달 경로를 저해하는 한 특별히 제한은 없고, 핵산, 단백질, 저분자량 유기 화합물 중 임의의 것일 수 있다. 물질의 예는, TGFβ 에 직접 작용하는 물질 (예를 들어, 단백질, 항체, 앱타머 등), TGFβ 를 인코딩하는 유전자의 발현을 억제하는 물질 (예를 들어 안티센스 올리고 뉴클레오티드, siRNA 등), TGFβ 수용체 및 TGFβ 의 결합을 저해하는 물질, TGFβ 수용체에 의한 시그널 전달에 의해 기인되는 생리적 활성을 저해하는 물질 (예를 들어, TGFβ 수용체 저해제, Smad 저해제 등) 을 포함한다. TGFβ 시그널 전달 경로 저해 물질로서 알려져 있는 단백질, Lefty 등이 언급될 수 있다. TGFβ 시그널 전달 경로 저해 물질로서, 당업자에게 주지된 화합물을 사용할 수 있고, 구체적으로는 SB431542, LY-364947, SB-505, A-83-01 등이 언급될 수 있다. 여기서 SB431542 (4-(5-벤졸[1,3]디옥솔-루5-일-4-피리딘-2-일-1H-이미다졸-2-일)-벤즈아미드) 및 A-83-01(3-(6-메틸-2-피리디닐)-N-페닐-4-(4-퀴놀리닐)-1H-피라졸-1-카르보티오아미드)] 는, TGFβ 수용체 (ALK5) 및 Activin 수용체 (ALK4/7) 의 저해제 (즉 TGFβ 저해제) 로서 공지된 화합물이다. TGFβ 시그널 전달 경로 저해 물질은, 바람직하게는 SB431542 또는 A-83-01 이다.
Nodal/Activin 시그널 전달 경로 저해 물질은 이것이 Nodal 또는 Activin 에 의해 기인되는 시그널 전달 경로를 저해하는 한 특별히 제한은 없고, 핵산, 단백질, 저분자량 유기 화합물 중 임의의 것일 수 있다. 물질의 예는, Nodal 또는 Activin 에 직접 작용하는 물질 (예를 들어 항체, 앱타머 등), Nodal 또는 Activin을 인코딩하는 유전자의 발현을 억제하는 물질 (예를 들어 안티센스 올리고 뉴클레오티드, siRNA 등), Nodal/Activin 수용체와 Nodal/Activin 의 결합을 저해하는 물질, Nodal/Activin 수용체에 의한 시그널 전달에 의해 야기되는 생리적 활성을 저해하는 물질을 포함한다. Nodal/Activin 시그널 전달 경로 저해 물질로서 당업자에게 주지된 화합물을 사용할 수 있고, 구체적으로는 SB431542, A-83-01 등을 포함한다. 또한, Nodal/Activin 시그널 전달 경로 저해 물질로서 알려져 있는 단백질 (Lefty, Cerberus 등) 을 사용할 수 있다.
BMP 시그널 전달 경로 저해 물질은, BMP 에 의해 기인되는 시그널 전달 경로를 저해하는 한 특별히 제한은 없고, 핵산, 단백질, 저분자량 유기 화합물 중 임의의 것일 수 있다. 여기서 BMP 로서, BMP2, BMP4, BMP7 및 GDF7 이 언급될 수 있다. 물질의 예는, BMP 에 직접 작용하는 물질 (예를 들어 항체, 앱타머 등), BMP 를 인코딩하는 유전자의 발현을 억제하는 물질 (예를 들어 안티센스 올리고 뉴클레오티드, siRNA 등), BMP 수용체 (BMPR) 와 BMP 의 결합을 저해하는 물질, BMP 수용체에 의한 시그널 전달에 의해 기인되는 생리적 활성을 저해하는 물질을 포함한다. BMPR 로서, ALK2 또는 ALK3 이 언급될 수 있다. BMP 시그널 전달 경로 저해 물질로서, 당업자에게 주지된 화합물을 사용할 수 있고, 구체적으로는 LDN193189, 도르소모르핀 등을 포함한다. 여기서 LDN193189 (4-[6-(4-피페라진-1-일페닐)피라졸로[1,5-a]피리미딘-3-일]퀴놀린) 는 공지된 BMPR(ALK2/3) 저해제이며, 통상 염산염의 형태로 시판되고 있다. 또한, BMP 시그널 전달 경로 저해 물질로서 알려진 단백질 (Chordin, Noggin 등) 을 사용할 수 있다. BMP 시그널 전달 경로 저해 물질은 바람직하게는 LDN193189 이다.
TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질은, 바람직하게는, SB431542, A-83-01 또는 LDN193189 이다.
단계(2) 및(3) 에서 사용되는 Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질은, Wnt 에 의해 매개되는 시그널 전달을 억제할 수 있는 한 특별히 제한되지 않고, 단백질, 핵산, 저분자량 화합물 등 중 임의의 것일 수 있다. Wnt 에 의해 매개되는 시그널은, Frizzled (Fz) 및 LRP5/6 (저밀도 지질단백질 수용체-관련 단백질 5/6) 의 헤테로 2량체로서 존재 하는 Wnt 수용체를 통해 전달된다. Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질의 예는, Wnt 또는 Wnt 수용체에 직접 작용하는 물질 (항-Wnt 항체, 항-Wnt 수용체 항체 등), Wnt 또는 Wnt 수용체를 인코딩하는 유전자의 발현을 억제하는 물질 (예를 들어 안티센스 올리고 뉴클레오티드, siRNA 등), Wnt 수용체와 Wnt 의 결합을 저해하는 물질 (가용형 Wnt 수용체, 우성 음성 Wnt 수용체 등, Wnt 안타고니스트, Dkk1, Cerberus 단백 등), Wnt 수용체에 의한 시그널 전달에 의해 기인되는 생리적 활성을 저해하는 물질 [CKI-7(N-(2-아미노 에틸)-5-클로로이소퀴놀린-8-술폰아미드), D4476 (4-[4-(2,3-디히드로-1,4-벤조디옥신-6-일)-5-(2-피리디닐)-1 H-이미다졸-2-일]벤즈아미드), IWR-1-엔도 (IWR1e) (4-[(3aR,4S,7R,7aS)-1,3,3a,4,7,7a-헥사히드로-1,3-디옥소-4,7-메타노-2H-이소인돌-2-일]-N-8-퀴놀리닐-벤즈아미드), IWP-2 (N-(6-메틸-2-벤조치아조릴)-2-[(3,4,6,7-테트라히드로-4-옥소-3-페닐티에노[3,2-d]피리미딘-2-일)티오]아세타미드) 등의 저분자량 화합물등] 등을 포함하나, 이로 제한되지는 않는다. CKI-7, D4476, IWR-1-엔도 (IWR1e), IWP-2 등은 공지된 Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질이며, 시판 제품 등을 적절히 입수가능하다. 바람직한 Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질은 예를 들어 IWR1e 이다.
Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질의 농도는, 다능성 줄기 세포 응집체를 형성하는 세포의 대뇌 세포로의 분화를 유도할 수 있는 농도인 것만을 필요로 한다. 예를 들어 IWR-1-엔도의 경우, 약 0.1μM 내지 약 100μM, 바람직하게는 약 0.3μM 내지 약 30μM, 보다 바람직하게는 약 1μM 내지 약 10μM, 더욱 바람직하게는 약 3μM 의 농도로 배지에 첨가한다. IWR-1-엔도 이외의 Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질을 사용하는 경우, 이는 IWR1e 의 것과 동등한 시그널 전달 경로 저해 활성을 나타내는 농도로 바람직하게는 사용된다.
TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질 및/또는 Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질은, 단계 (2) 에서 부유 배양 개시와 동시에, 또는 단계 (2) 의 부유 배양 개시 이후 특정 시간의 경과 후에 (예를 들어, 약 24시간 이후 또는 그 이후) 에 배지에 첨가할 수 있다.
단계(3) 에서, 배지 교환 작업을 실시하는 경우, 이는 예를 들어 원래있는 배지를 버리지 않고 새로운 배지를 첨가하는 작업 (배지 첨가 작업), 원래있는 배지를 반량 정도 (원래있는 배지의 부피의 40~80% 정도) 버리고 새로운 배지를 반량 정도 (원래있는 배지의 부피의 40~80%) 첨가하는 작업 (절반-배지 교환 작업), 원래있는 배지를 전체량 정도 (원래있는 배지의 부피의 90% 이상) 버리고 새로운 배지를 전체량 정도 (원래있는 배지의 부피의 90% 이상) 첨가하는 작업 (전체-배지 교환 작업) 등에 의해 배지 교환을 실시할 수 있다.
특정 시점에 특정 성분 (예를 들어, IWR-1-엔도) 을 첨가하는 경우, 예를 들어 최종 농도를 계산하고, 원래있는 배지를 반량 정도 버리고, 특정 성분을 최종 농도보다 높은 농도 (구체적으로는 최종 농도의 1.5~3.0 배, 예를 들어 최종 농도의 약 2 배) 로 포함하는 새로운 배지를 반량 정도 첨가하는 작업 (절반-배지 교환 작업, 절반-배지 교환) 을 실시할 수 있다.
특정 시점에 원래있는 배지에 포함된 특정 성분의 농도를 유지하는 경우, 예를 들어 원래있는 배지를 반량 정도 버리고, 원래있는 배지에 포함되는 농도와 동일한 농도로 특정 성분을 포함하는 새로운 배지를 반량 정도 첨가하는 작업을 실시할 수 있다.
특정 시점에 원래있는 배지에 포함되는 성분의 농도를 희석에 의해 감소시키는 경우, 예를 들어 배지 교환 작업을 1일마다 복수 회, 바람직하게는 1시간 이내에 복수 회 (예를 들어 2~3회) 실행할 수 있다. 또한, 특정 시점에 원래있는 배지에 포함되는 성분의 농도를 희석에 의해 감소시키는 경우, 세포 또는 응집체를 다른 배양 용기로 옮길 수 있다.
배지 교환 작업에 사용하는 도구는 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어, 피펫터, 마이크로피펫, 멀티채널 마이크로피펫, 연속 디스펜서 등이 언급될 수 있다. 예를 들어, 배양 용기로서 96 웰 플레이트를 사용하는 경우, 멀티채널 마이크로피펫을 사용할 수 있다.
단계(3) 에서 배양 온도, CO2 농도 등의 배양 조건은 적절히 결정할 수 있다. 배양 온도는, 예를 들어 약 30 ℃ 내지 약 40 ℃, 바람직하게는 약 37 ℃ 이다. 또 CO2 농도는, 예를 들어 약 1% 내지 약 10%, 바람직하게는 약 5% 이다.
상기 배양에 의해, 단계(2) 에서 얻어진 응집체를 형성하는 세포의 대뇌 신경 전구 세포로의 분화가 유도되어, 대뇌 신경 전구 세포를 포함하는 응집체를 얻을 수 있다. 본 발명은 또한 상기 대뇌 신경 전구 세포를 포함하는 응집체의 제조 방법을 제공한다. 대뇌 신경 전구 세포를 포함하는 응집체를 얻은 것은, 예를 들어 대뇌 신경 전구 세포 마커인 FoxG1, Lhx2, PAX6, Emx2 등을 발현하는 세포의 응집체에서의 존재를 검출함으로써 확인할 수 있다. 단계(3) 의 한 구현예에서 단계(2) 에서 형성된 응집체를, FoxG1 유전자를 발현하는 세포가 출현할 때까지, 무혈청 배지 또는 혈청-함유 배지에서 부유 배양하는 단계이다. 한 구현예에서, 응집체에 포함되는 세포의 20% 이상 (바람직하게는, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상) 이 FoxG1 를 발현할 때까지, 단계(3) 의 배양이 실시된다.
대뇌 세포 및/또는 대뇌 조직을 제조하는데 있어서의 바람직한 구현예에서, 단계(1) 에서, 인간 다능성 줄기 세포 (예를 들어, 인간 iPS 세포) 를, 피더 세포 부재 하에서, TGFβ 시그널 전달 경로 저해 물질 (예를 들어 SB431542) 및 bFGF 를 함유하는 무혈청 배지에서 접착 배양하고; 단계(2) 에서, 단계(1) 에서 얻어진 세포를 무혈청 배지에서 부유 배양하고; 단계(3) 에서, 단계(2) 에서 얻어진 응집체를 Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질 (IWR-1-엔도) 및 TGFβ 시그널 전달 경로 저해 물질 (예를 들어 SB431542) 을 함유하는 무혈청 배지에서 부유 배양한다.
또한, 대뇌 세포 및/또는 대뇌 조직을 제조하는데 있어서의 바람직한 구현예에서, 단계(1) 에서, 인간 다능성 줄기 세포 (예를 들어, 인간 iPS 세포) 를 피더 세포 부재 하에, BMP 시그널 전달 경로 저해 물질 (예를 들어, LDN193189) 및 bFGF 를 함유하는 무혈청 배지에서 접착 배양하고; 단계(2) 에서, 단계(1) 에서 얻어진 세포를 무혈청 배지에서 부유 배양하고; 단계(3) 에서, 단계(2) 에서 얻어진 응집체를 Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질 (IWR-1-엔도) 및 TGFβ 시그널 전달 경로 저해 물질 (예를 들어 SB431542) 을 함유하는 무혈청 배지에서 부유 배양한다.
대뇌 세포 및/또는 대뇌 조직을 제조하는데 있어서의 바람직한 구현예에서, 단계(1) 에서 인간 다능성 줄기 세포 (예를 들어, 인간 iPS 세포) 를 피더 세포 부재 하에서,
TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질 (예를 들어, TGFβ 시그널 전달 경로 저해 물질 (예를 들어, SB431542, A-83-01), Nodal/Activin 시그널 전달 경로 저해 물질 (예를 들어, Lefty), BMP 시그널 전달 경로 저해 물질 (예를 들어, LDN193189), 또는 이의 조합 (예를 들어, SB431542 및 LDN193189) 등);
소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질 (예를 들어, Shh 단백질, SAG, PMA); 또는
TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질 (예를 들어, Lefty, SB431542, A-83-01, LDN193189) 및 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질 (예를 들어, Shh 단백질, SAG, PMA) 의 조합; 및
bFGF 를 함유하는 무혈청 배지에서 접착 배양하고,
단계(2) 에서, 단계(1) 에서 얻어진 세포를,
TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질 (예를 들어, TGFβ 시그널 전달 경로 저해 물질 (예를 들어, SB431542, A-83-01), Nodal/Activin 시그널 전달 경로 저해 물질 (예를 들어, Lefty), BMP 시그널 전달 경로 저해 물질 (예를 들어, LDN193189), 또는 이의 조합 (예를 들어, SB431542 및 LDN193189) 등); 및
Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질 (IWR-1-엔도) 를 포함하는 무혈청 배지에서 부유 배양해 세포 응집체를 형성시키고,
단계(3) 에서, 단계(2) 에서 얻어진 응집체를
TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질 (예를 들어, TGFβ 시그널 전달 경로 저해 물질 (예를 들어, SB431542, A-83-01), Nodal/Activin 시그널 전달 경로 저해 물질 (예를 들어, Lefty), BMP 시그널 전달 경로 저해 물질 (예를 들어, LDN193189), 또는 이의 조합 (예를 들어, SB431542 및 LDN193189) 등); 및
Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질 (IWR-1-엔도)
를 포함하는 무혈청 배지에서 부유 배양해, 대뇌 신경 전구 세포, 대뇌 세포 또는 대뇌 조직을 포함하는 응집체를 얻는다.
단계(2) 의 배지는 바람직하게는 ROCK 저해 물질 (예를 들어, Y-27632) 을 포함한다.
더욱 바람직하게는, 단계(2) 에서, 단계(1) 에서 얻어진 세포를,
TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질 (예를 들어, TGFβ 시그널 전달 경로 저해 물질 (예를 들어, SB431542, A-83-01), Nodal/Activin 시그널 전달 경로 저해 물질 (예를 들어, Lefty);
Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질 (IWR-1-엔도); 및
ROCK 저해 물질 (예를 들어, Y-27632)
을 포함하는 무혈청 배지에서 부유 배양해, 세포 응집체를 형성시키고,
단계(3) 에서, 단계(2) 에서 얻어진 응집체를
TGFβ 시그널 전달 경로 저해 물질 (예를 들어, SB431542, A-83-01) 또는 Nodal/Activin 시그널 전달 경로 저해 물질 (예를 들어, Lefty); 및
Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질 (IWR-1-엔도)
을 포함하는 무혈청 배지에서 부유 배양해, 대뇌 신경 전구 세포, 대뇌 세포 또는 대뇌 조직을 포함하는 응집체를 얻는다.
얻어진 대뇌 신경 전구 세포를 포함하는 응집체는 그 자체로 독성 또는 약물 효능 평가용 시약으로서 사용할 수 있다. 대뇌 신경 전구 세포를 포함하는 응집체를 분산 처리 (예를 들어, 트립신/EDTA 처리 또는 파파인 처리) 하고, 얻어진 세포를 FACS 또는 MACS 를 사용하여 선택함으로써, 고순도의 대뇌 신경 전구 세포를 얻을 수 있다.
또한, 대뇌 신경 전구 세포를 포함하는 응집체를 무혈청 배지 또는 혈청-함유 배지에서 계속해서 배양해 대뇌 신경 전구 세포 또는 대뇌 세포를 더욱 분화시켜, 층 구조를 가지는 대뇌 조직을 제조할 수 있다.
상기 배지에 사용되는 무혈청 배지 또는 혈청-함유 배지는, 상기 언급된 바와 같은 한 특별히 제한되지는 않는다. 예를 들어, DMEM-F12 배지에 10% 소 태아 혈청, N2 보충물, 및 레티노산을 첨가한 혈청 배지, 또는, 시판되는 N2 보충물 등의 혈청 대체물을 적당량 첨가한 무혈청 배지 (예를 들어, DMEM-F12 배지에 N2 보충물을 첨가한 배지) 등이 언급될 수 있다.
대뇌 신경 전구 세포로부터 대뇌 조직을 유도하는 배양 기간은 의도된 대뇌층-특이적 뉴런에 따라 상이한데, 이는 예를 들어 약 7일 내지 약 200일이다.
대뇌 조직은 응집체에 신경 표피 구조를 형성해 존재한다. 부유 배양 종료 이후, 응집체를 파라-포름알데히드 용액 등의 고정액을 사용하여 고정하고, 동결 절편을 제조한 후, 층 구조를 갖는 대뇌 조직의 형성을 면역 염색법 등에 의해 확인할 수 있다. 대뇌 조직의 각 층은 상이한 대뇌 신경 전구 세포, 뇌실대 원세포, 대뇌층 구조 특이적 뉴런으로 구성되므로, 층 구조의 형성은 이러한 세포에서 발현된 상기 언급된 마커에 대한 항체를 사용하여 면역 염색법에 의해 확인할 수 있다. 한 구현예에서, 대뇌 조직은 FoxG1-양성 신경 표피 구조이다.
응집체의 표면에 존재 하는 대뇌 조직을 핀셋 등을 사용하여 응집체로부터 물리적으로 절단할 수 있다. 이 경우, 각 응집체의 표면 상의 대뇌 조직 이외의 신경 조직이 형성될 수 있으므로, 응집체로부터 절단한 신경 조직의 일부를 후술되는 면역 염색법 등에 의해 확인함으로써, 조직이 대뇌 조직임을 확인할 수 있다.
단계(3) 의 한 구현예는 단계(2) 에서 형성된 응집체를, FoxG1 유전자를 발현하는 세포가 출현하기 시작할 때까지, 대뇌 세포로의 분화 유도에 필요한 농도로 TGFβ 시그널 전달 경로 저해 물질 및/또는 Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질을 포함하는 무혈청 배지 또는 혈청-함유 배지에서 부유 배양해, 대뇌 신경 전구 세포를 포함하는 응집체를 생성하고, 대뇌 신경 전구 세포를 포함하는 응집체를 대뇌 조직이 형성될 수 있을 때까지, 계속해서 무혈청 배지 또는 혈청-함유 배지에서 부유 배양하여, 대뇌 조직을 포함하는 응집체를 얻는 단계이다. 한 구현예에서, 응집체에 포함되는 세포의 20% 이상 (바람직하게는, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상) 이 FoxG1 를 발현할 때까지, 대뇌 신경 전구 세포를 포함하는 응집체의 부유 배양이 실시된다.
단계(3) 의 한 구현예에서, 단계(2) 에서 얻어진 응집체, 또는 단계(2) 에서 얻어진 응집체를 상기 언급된 방법에 의해 부유 배양한 응집체를, 접착 배양에 적용하여 접착 응집체를 형성시킬 수 있다. 접착 응집체를, FoxG1 유전자를 발현하는 세포가 출현할 때까지, 대뇌 세포로의 분화 유도에 필요한 농도로 TGFβ 시그널 전달 경로 저해 물질 및/또는 Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질을 포함하는 무혈청 배지 또는 혈청-함유 배지에서 접착 배양해, 대뇌 신경 전구 세포를 포함하는 응집체를 얻는다. 대뇌 신경 전구 세포를 포함하는 응집체를 대뇌 조직이 형성될 때까지 계속해서 무혈청 배지 또는 혈청-함유 배지에서 접착 배양해, 대뇌 조직을 포함하는 응집체를 얻는다. 한 구현예에서, 세포의 10% 이상 (바람직하게는, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상) 이 FoxG1 를 발현할 때까지, 대뇌 신경 전구 세포를 포함하는 응집체의 접착 배양이 실시된다.
본 발명의 제조 방법 3 에 의해, 다능성 줄기 세포로부터 고효율로 대뇌 조직을 얻을 수 있다. 본 발명의 제조 방법 3 에 의해 얻어지는 대뇌 조직은 대뇌층 각각에 특이적인 뉴런을 포함하므로, 층 구조 특이적 뉴런 또는 이의 전구 세포 등의 대뇌 조직을 구성하는 세포를 입수할 수 있다. 얻어진 대뇌 조직으로부터 어느 세포가 얻어졌는지는, 공지된 방법 자체, 예를 들어 세포 마커의 발현에 의해 확인할 수 있다.
얻어진 대뇌 조직을 포함하는 응집체는, 그 자체로 독성 또는 약물 효능 평가용 시약으로서 사용할 수 있다. 대뇌 조직을 포함하는 응집체를 분산 처리(예를 들어, 트립신/EDTA 처리) 에 적용하고, 얻어진 세포를 FACS 또는 MACS 를 사용해 선택함으로써, 고순도의 대뇌 조직-구성 세포, 예를 들어 고순도의 대뇌층 구조 특이적 뉴런를 또한 얻을 수 있다.
4. 독성 또는 약물 효능 평가 방법
본 발명의 제조 방법 1, 2 또는 3 에 의해 제조된, 신경 조직 또는 신경 세포 (예를 들어, 망막 조직, 망막 원세포, 망막층-특이적 뉴런, 대뇌 조직, 대뇌 신경 전구 세포, 대뇌층-특이적 뉴런) 는, 신경 조직 또는 신경 세포의 장애로 인한 질환 치료용 약제의 스크리닝, 또는 독성 평가에 있어서, 질환 연구 또는 약물 탐색을 위한 물질로서 유용하고, 이는 시험 물질의 독성 또는 약물 효능 평가용 시약으로서 사용할 수 있다. 예를 들어, 신경 조직 (예를 들어, 망막 조직, 대뇌 조직) 의 장애로 인한 질환, 특히 유전 질환을 갖는 인간 환자로부터 iPS 세포를 제조하고, iPS 세포를 사용하여, 본 발명의 방법에 의해 신경 조직 또는 신경 세포 (예를 들어, 망막 조직, 망막 원세포, 망막 층-특이적 뉴런, 대뇌 조직, 대뇌 신경 전구 세포, 대뇌층-특이적 뉴런) 를 제조한다. 신경 조직 또는 신경 세포는, 환자의 질환을 야기하는 신경 조직의 장애를 시험관내에서 재현할 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 제조 방법 1, 2 또는 3 에 의해 제조되는 신경 조직 또는 신경 세포 (예를 들어, 망막 조직, 망막 원세포, 망막 층-특이적 뉴런, 대뇌 조직, 대뇌 신경 전구 세포, 대뇌층-특이적 뉴런) 에 시험 물질을 접촉시키고, 물질의 세포 또는 조직에 대한 영향을 검출하는 것을 포함하는, 물질의 독성 또는 약물 효능 평가 방법을 제공한다.
예를 들어, 본 발명의 제조 방법 1, 2 또는 3 에 의해 제조된, 특정 장애 (예를 들어, 유전성 장애) 를 갖는 신경 조직 또는 신경 세포 (예를 들어, 망막 조직, 망막 원세포, 망막층-특이적 뉴런, 대뇌 조직, 대뇌 신경 전구 세포, 대뇌층-특이적 뉴런) 를, 시험 물질의 존재 하에 또는 부재 하에 (음성 대조군) 배양한다. 이후, 시험 물질로 처리한 신경 조직 또는 신경 세포의 장애의 심각성을 음성 대조군과 비교한다. 그 결과, 장애의 심각성을 경감시킨 시험 물질을 장애로부터 야기된 질환의 치료용 약제의 후보 물질로서 선택할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 제조 방법에 의해 제조한 신경 세포의 생리적 활성 (예를 들어, 생존 촉진 또는 성숙화) 을 향상시키는 시험 물질을, 의약품의 후보 물질로서 탐색할 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 제조 방법에 따라 신경 질환 등의 특정 장애를 야기하는 유전자 변이를 갖는 체세포로부터 제조되는 유도 다능성 줄기 세포의 분화를 유도하여 신경 세포를 제조한다.
상기 장애용 치료약 또는 예방약으로서 유효한 시험 물질의 후보를, 시험 물질이 첨가된 신경 세포가 상기 언급된 장애를 나타내는지 여부를 기초로 탐색할 수 있다.
독성 평가의 경우, 본 발명의 제조 방법 1, 2 또는 3 에 의해 제조된 신경 조직 또는 신경 세포 (예를 들어, 망막 조직, 망막 원세포, 망막층-특이적 뉴런, 대뇌 조직, 대뇌 신경 전구 세포, 대뇌층-특이적 뉴런) 를, 시험 물질의 존재 하에서 또는 부재 하에 (음성 대조군) 에서 배양한다. 이후, 시험 물질로 처리한 신경 조직 또는 신경 세포에 대한 독성의 심각성을 음성 대조군과 비교한다. 그 결과, 음성 대조군에 비해 독성을 나타낸 시험 물질을 신경 조직 또는 신경 세포 (예를 들어, 망막 조직, 망막 원세포, 망막층-특이적 뉴런) 에 대한 독성을 갖는 물질로서 판정할 수 있다.
즉, 본 발명은, 이하의 단계를 포함하는 독성 평가 방법을 포함한다:
(단계 1) 본 발명의 제조 방법 1, 2 또는 3 에 의해 제조된 신경 조직 또는 신경 세포를, 생존 가능한 배양 조건 하에 일정 시간, 시험 물질의 존재 하에서 배양하고, 세포 상해의 심각성을 측정하는 단계,
(단계 2) 본 발명의 제조 방법 1, 2 또는 3 에 의해 제조된 신경 조직 또는 신경 세포를, 생존 가능한 배양 조건 하에 일정 시간, 시험 물질의 부재 하에서 또는 양성 대조군의 존재 하에서 배양하고, 세포 상해의 심각성을 측정하는 단계,
(단계 3) (단계 1) 및 (단계 2) 에서 측정한 결과의 차이에 근거해, 단계 1 에서의 시험 물질의 독성을 평가하는 단계.
여기서 사용된 "시험 물질의 부재 하에" 는, 시험 물질의 첨가 대신에 배양 배지, 시험 물질을 용해시키는데 사용된 용매만을 첨가하는 것을 포함한다. 또한, "양성 대조군" 은, 독성을 갖는 이미 알려진 화합물을 의미한다. 세포 상해의 심각성을 측정하는 방법의 예는, 생존하는 세포수를 측정하는 방법, 예를 들어 세포내 ATP 양을 측정하는 방법, 세포 염색 (예를 들어 핵 염색) 및 형태 관찰에 의해 생존하는 세포수를 측정하는 방법 등을 포함한다.
단계 3 에서, 시험 물질의 독성을 평가하는 방법으로서, 단계 1 의 측정치 및 단계 2 의 음성 대조군의 측정치를 비교하고, 단계 1 의 세포 상해의 심각성이 큰 경우에 시험 물질이 독성을 갖는다고 판단할 수 있다. 또한, 단계 1 의 측정치와 단계 2 의 양성 대조군의 측정치를 비교하고, 단계 1 의 세포 상해의 심각성이 동등하거나 그 초과인 경우, 시험 물질이 독성을 갖는다고 판단할 수 있다.
5. 약학 조성물
본 발명은, 본 발명의 제조 방법 1, 2 또는 3 에 의해 제조되는 신경 조직 또는 신경 세포 (예를 들어, 망막 조직, 망막 원세포, 망막층-특이적 뉴런, 대뇌 조직, 대뇌 신경 전구 세포, 대뇌층-특이적 뉴런) 의 유효량을 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
약학 조성물은, 본 발명의 제조 방법 1, 2 또는 3 에 의해 제조되는 신경 조직 또는 신경 세포 (예를 들어, 망막 조직, 망막 원세포, 망막층-특이적 뉴런, 대뇌 조직, 대뇌 신경 전구 세포, 대뇌층-특이적 뉴런) 의 유효량 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다.
약학적으로 허용가능한 담체로서, 생리학적 수성 용매 (생리 식염수, 완충액, 무혈청 배지 등) 를 사용할 수 있다. 필요에 따라, 이식 요법에서 이식하는 조직 또는 세포를 포함하는 의약은 통상 사용되는 보존제, 안정화제, 환원제, 등장화제 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은, 제조 방법 1, 2 또는 3 에 의해 제조되는 신경 조직 또는 신경 세포를, 적절한 생리적 수성 용매에 현탁함으로써 현탁액으로서 제조될 수 있다. 필요하면, 조성물에 동결 보존제를 첨가하고, 동결 보존하고, 사용시에 해동하고, 완충액으로 세척하고, 이식 요법에 사용할 수 있다.
본 발명의 제조 방법에 의해 얻어지는 신경 조직을, 핀셋 등을 사용하여 적절한 크기로 절단하여, 시트제를 생성할 수 있다.
또한 본 발명의 제조 방법에 의해 얻어지는 세포는, 분화 유도를 위한 단계(3) 에서 접착 배양을 실시해 시트형 세포를 형성하여, 시트 표본을 생성할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은, 신경 조직 또는 신경 세포 (예를 들어, 망막 조직, 망막 원세포, 망막층-특이적 뉴런, 대뇌 조직, 대뇌 신경 전구 세포, 대뇌층-특이적 뉴런) 의 장애로 인한 질환 치료용 약제로서 유용하다.
6. 치료 약물
본 발명의 제조 방법 1, 2 또는 3 에 의해 제조되는 신경 조직 또는 신경 세포 (예를 들어, 망막 조직, 망막 원세포, 망막층-특이적 뉴런, 대뇌 조직, 대뇌 신경 전구 세포, 대뇌층-특이적 뉴런) 는, 신경 조직 또는 신경 세포의 장애로 인한 질환의 이식 요법에 유용하다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 제조 방법 1, 2 또는 3 에 의해 제조되는 신경 조직 또는 신경 세포 (예를 들어, 망막 조직, 망막 원세포, 망막층-특이적 뉴런, 대뇌 조직, 대뇌 신경 전구 세포, 대뇌층-특이적 뉴런) 를 포함하는, 신경 조직 또는 신경 세포의 장애로 인한 질환 치료용 약제를 제공한다. 신경 조직 또는 신경 세포의 장애로 인한 질환의 치료용 약제로서 또는 신경 조직의 손상 상태에 있어서 해당 손상 부위를 보충하기 위하여, 본 발명의 제조 방법 1, 2 또는 3 에 의해 제조된 신경 조직 또는 신경 세포 (예를 들어, 망막 조직, 망막 원세포, 망막층-특이적 뉴런, 대뇌 조직, 대뇌 신경 전구 세포, 대뇌층-특이적 뉴런) 를 사용할 수 있다. 이식을 필요로 하는, 신경 조직 또는 신경 세포의 장애로 인한 질환, 또는 신경 조직의 손상 상태를 갖는 환자에게 본 발명의 제조 방법 1, 2 또는 3 에 의해 제조된 신경 조직 또는 신경 세포를 이식해, 신경 세포 또는 장애를 입은 신경 조직 자체를 보충함으로써, 신경 조직 또는 신경 세포의 장애로 인한 질환, 및 신경 조직의 손상 상태를 치료할 수 있다. 신경 조직 또는 신경 관련 세포의 장애로 인한 질환의 예는, 신경변성 질환 (예를 들어, 뇌허혈 장애, 뇌경색, 파킨슨씨병, 척수 손상, 뇌혈관 장애 또는 뇌/척수 외상성 장애 (예를 들어, 뇌경색, 두부 외상 뇌좌상 (TBI) 또는 척수 손상 다계통 위축증), 전형적인 신경변성 질환 (근위축성 측색 경화증 (ALS), 파킨슨씨병 (PD), 파킨슨씨 병, 알츠하이머형 치매, 진행성 핵상성 마비 (PSP), 헌팅톤 병, 다계통 위축증 (MSA), 척수 소뇌 변성증 (SCD)), 탈골수 질환 또는 신경근 질환 (다발성 경화증 (MS), 급성 산재성뇌척수염 (ADEM), 염증성 광범성 경화증 (쉴더 병), 아급성 경화 증 범뇌염, 진행성 다초점 백질뇌증, 저산소뇌증, 중심 다리 척수막 파괴증, 빈스방거 (Binswanger) 병, 길라인-바 (Guillain-Barre) 증후군, 피셔 증후군, 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경병증, 척수 공동증, 척수소뇌 변성증, 선조체 흑질 변성증 (SND), 올리브교 소뇌 위축증 (OPCA), 샤이-드라거 증후군 (Shy-Drager syndrome)), 안과 질환 (황반변성증, 가령 황반변성, 망막 색소 변성, 백내장, 녹내장, 각막 질환, 망막증), 내화성 간질, 진행성 핵상성 마비, 척수 공동증, 척수성 근위축증 (SMA), 척수연수 근위축증 (SBMA), 원발성 측색 경화증 (PLS), 진행성핵상성 마비 (PSP), 대뇌피질 기저핵 변성증 (CBD), 헌팅톤 병 (HD), 유극 적혈구 무도병, 척수 공동증, 전측두엽 변성증, 샤르코-마리-투드 병 (Charcot-Marie-Tooth disease), 근긴장이상증, 판토테네이트 키나아제-결합 신경 퇴화 (Pantothenate kinase-associated neurodegeneration), 가족성 치매, 파킨슨씨 병, 노인성 치매, 강직 하반신 마비, 루이체 치매 (Lewy body dementia) 등을 포함한다. 대뇌 조직 또는 대뇌-관련 세포의 장애로 인한 질환의 예는, 신경변성 질환 (예를 들어, 뇌허혈 장애, 뇌경색, 운동 뉴런 질환, ALS, 알츠하이머 병, 폴리글루타민 질환, 대뇌피질 기저핵변성증) 을 포함한다. 망막 조직 또는 망막-관련 세포의 장애로 인한 질환의 예는, 망막 변성증, 망막 색소 변성증, 가령황반변성증, 유기 수은 중독, 클로로퀸 망막증, 녹내장, 당뇨병성 망막증, 신생아 망막증 등을 포함한다. 신경 조직의 손상 상태의 예는, 신경 조직 적출 이후의 환자, 신경 조직내 종양에 대한 방사선 조사 이후의 환자 및 외상을 포함한다.
이식 요법에서, 조직 적합성 항원의 차이로 인한 거부가 자주 문제가 된다. 그러나, 이식의 수취인의 체세포로부터 수립한 다능성 줄기 세포 (예를 들어, 유도 다능성 줄기 세포) 를 사용함으로써 상기 문제를 해결할 수 있다. 즉, 바람직한 구현예에서, 본 발명의 방법에서 다능성 줄기 세포로서 수취인의 체세포로부터 수립한 다능성 줄기 세포 (예를 들어, 유도 다능성 줄기 세포) 를 사용하고, 수취인에 대해 면역학적으로 자기인 신경 조직 또는 신경 세포를 제조하고, 수취인에 이식한다.
또한, 수취인과 면역학적으로 적합한 (예를 들어, HLA 유형 및 MHC 유형이 적합함) 다른 사람의 체세포로부터 수립한 다능성 줄기 세포 (예를 들어, 유도 다능성 줄기 세포) 로부터, 타생성 신경 조직 또는 신경 세포를 제조하고, 수취인에 이식할 수 있다.
[실시예]
이하에 실시예를 나타내어 본 발명을 상세하게 설명하나, 본 발명이 이에 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 단계 1 에서 TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질을 사용한, 인간 iPS 세포의 프리컨디셔닝의 실시예
인간 iPS 세포 (1231A3 주, 쿄토 대학에서 입수) 를, "Scientific Reports, 4, 3594 (2014)" 에 기재된 방법에 따라 피더-프리 배양했다. 피더-프리 배지로서, StemFit 배지 (AK03, Ajinomoto Co., Inc. 사제) 를 사용했고, 피더-프리 스캐폴드로서 Laminin 511-E8 (Nippi, Inc. 사제) 를 사용했다.
구체적인 유지 배양 작업으로서, 먼저 충만 상태 (subconfluent) 의 인간 iPS 세포 (1231A3 주) 를 PBS 로 세정하고, TrypLE Select (Life Technologies 사제) 를 사용하여 단일 세포에 분산시켰다. 그 후, 상기 단일 세포에 분산된 인간 iPS 세포를, Laminin 511-E8 로 코팅된 플라스틱 배양 디쉬에 파종하고, Y27632 (ROCK 저해 물질, 10 μM) 의 존재 하에, StemFit 배지에서 피더-프리 배양했다. 상기 플라스틱 배양 디쉬로서 6-웰 플레이트 (Iwaki 사제, 세포 배양용, 배양 면적 9.4 ㎠) 를 사용한 경우, 상기 단일 세포에 분산된 인간 iPS 세포의 플레이팅된 세포 수는 6 x 103 으로 설정되었다. 파종 1일 후에, Y27632 를 포함하지 않는 StemFit 배지로 배지를 교환했다. 이후, 1일 ~ 2일에 1회 Y27632 를 포함하지 않는 StemFit 배지로 배지를 교환했다. 그 후, 파종 6일 후에, 충만 상태 (배양 면적의 60% 가 세포로 덮임) 가 될 때까지 세포를 배양했다.
본원 제조 방법의 단계 1 의 프리컨디셔닝의 구체예로서, 이하의 작업을 실시했다. 먼저 충만 상태의 인간 iPS 세포 (1231A3 주) 를 PBS 로 세정하고, TrypLE Select (Life Technologies 사제) 를 사용하여 단일 세포에 분산시켰다. 그 후, 상기 단일 세포에 분산된 인간 iPS 세포를 Laminin 511-E8 로 코팅된 플라스틱 배양 디쉬 (Iwaki 사제) 에 파종하고, Y27632 (ROCK 저해 물질, 10 μM) 의 존재 하에 StemFit 배지에서 피더-프리 배양했다. 상기 플라스틱 배양 디쉬로서 6-웰 플레이트 (Iwaki 사제, 배양 면적 9.4 ㎠) 를 사용한 경우, 상기 단일 세포에 분산된 인간 iPS 세포의 플레이팅된 세포 수는 6 x 103 으로 설정했다. 상기 플라스틱 배양 디쉬로서 60 mm 디쉬 (Iwaki 사제, 배양 면적 21 ㎠) 를 사용한 경우, 상기 단일 세포에 분산된 인간 iPS 세포의 플레이팅된 세포 수는 13 x 103 으로 설정했다. 파종 1일 후에, Y27632 를 포함하지 않는 StemFit 배지로 배지를 교환했다. 이후, 1~2일 마다 1회 Y27632 를 포함하지 않는 StemFit 배지로 배지를 교환했다. 그 후, 파종 5일 이후, 즉 충만 상태 1일 이전 (배양 면적의 50% 가 세포로 덮임) 까지 배양했다. 심지어 파종 후 6일 동안 배양했을 경우, 유사한 결과를 나타냈다. 상기 피더-프리 배양한 충만 상태 1일 이전의 인간 iPS 세포를, SB431542 (TGFβR 저해제 (TGFβRi), 5μM) 의 존재 하에 (단계 1: 프리컨디셔닝 처리, 도 1 "프리컨디션 TGFβRi 24 hr"), 또는 이의 부재 하에 (단계 1: 프리컨디셔닝 처리하지 않음, 도 1 "대조군"), 1일 동안 피더-프리 배양했다. 배양한 세포를 도립 현미경 (KEYENCE) 하에 명시야 관찰을 실시했다. 그 결과, 피더-프리 배양 동안 TGFβR 저해제 (SB431542) 에 의한 처리에 의해 인간 iPS 세포의 형태에 큰 영향은 주지 않음이 밝혀졌다 (도 1).
실시예 2: 단계 1 에서 TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질 또는 Shh 작용 물질을 사용한, 인간 iPS 세포의 프리컨디셔닝의 실시예-2
실시예 1 에 기재된 방법에 따라 인간 iPS 세포 (1231A3 주) 를 StemFit 배지에서 충만 상태 1일 이전까지 피더-프리 배양했다. 충만 상태 1일 이전의 인간 iPS 세포를, SB431542 (TGFβR 저해제, 5μM), LDN193189 (BMPR 저해제, 100 nM), SAG (Shh 작용 물질, 300 nM), 또는 TGFβR 저해제 및 BMPR 저해제 (SB431542 5μM, 및 LDN193189 100 nM) 의 존재 하에 (단계 1: 프리컨디셔닝 처리), 또는 부재 하에 (단계 1: 프리컨디셔닝하지 않음), 1일 동안 피더-프리 배양했다. 얻어진 세포를 각각 4% 파라-포름알데히드로 고정하고, 다능성 줄기 세포 마커 중 하나인 Oct3/4 의 면역 염색을 실시하고, 면역 염색한 세포를, 도립 형광 현미경 (BIOREVO, KEYENCE) 하에 명시야 관찰 및 형광 이미지 관찰을 실시했다. 면역 염색 분석에서 상기 마커가 양성인지의 판정에 있어서, 백그라운드보다 휘도치가 2배 이상 높으면 양성으로 결정했다. 그 결과, 임의의 화합물로 프리컨디셔닝 처리한 세포는 프리컨디셔닝하지 않은 세포와 유사한 Oct3/4 양성임이 밝혀졌다 (도 2). 즉, 이들 조건 하에 프리컨디셔닝한 세포는, 다능성-유형 상태를 유지함을 밝혀냈다.
실시예 3: 단계 1 에서 TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질을 사용하는 것에 의한, 인간 iPS 세포로부터의 세포 응집체 형성의 실시예
실시예 1 에 기재된 방법에 따라, 인간 iPS 세포 (1231A3 주) 를 StemFit 배지에서 충만 상태 1일 이전까지 피더-프리 배양했다. 충만 상태 1일 이전의 인간 iPS 세포를, SB431542 (TGFβR 저해제, 5μM) 의 존재 하에 (단계 1, 프리컨디셔닝: TGFβRi 처리) 또는 부재 하에 (단계 1: 프리컨디셔닝하지 않음), 1일 동안 피더-프리 배양했다.
상기 인간 iPS 세포를, TrypLE Select (Life Technologies) 를 사용하여 세포 분산액으로 처리하고, 피펫팅 작업에 의해 단일 세포에 추가로 분산시킨 후, 상기 단일 세포에 분산된 인간 iPS 세포를 비세포-접착성 96-웰 배양 플레이트 (PrimeSurface 96V-바닥 플레이트, SUMITOMO BAKELITE 사제) 의 웰 마다 1.2 x 104 개의 세포로 100㎕ 의 무혈청 배지에 부유시키고, 37 ℃, 5% CO2 로 부유 배양했다. 이를 위한 무혈청 배지 (gfCDM+KSR) 로서, F-12 배지와 IMDM 배지의 1:1 혼합물에 10% KSR, 450μM 1-모노티오글리세롤 및 1 x 화학적으로 정의된 지질 농축물을 첨가한 무혈청 배지를 사용했다. 부유 배양 개시시 (부유 배양 개시 이후 0일째, 단계 2 개시) 에, 상기 무혈청 배지에 Y27632 (최종 농도 20μM) 를 첨가했다. 부유 배양 개시 이후 2일째까지, 프리컨디셔닝 조건 및 프리컨디셔닝 하지 않는 조건 모두 하에서 세포 응집체가 형성되었다 (단계 2 종료, 단계 3 개시). 부유 배양 개시 이후 3일째에, Y27632 를 포함하지 않는 무혈청 배지 (50㎕) 를 첨가했다.
이에 따라 제조된 부유 배양 개시 이후 6일째의 세포를 도립 현미경 (KEYENCE) 하에 명시야 관찰했다 (도 3). 그 결과, TGFβR 저해제 (SB431542) 의 존재 하에서 프리컨디셔닝 처리를 실시한 세포 응집물 (도 3B) 은, 프리컨디셔닝 처리를 실시하지 않았던 세포의 응집물보다 (도 3A) 더 양호한 형상을 가졌다.
또한, 부유 배양 개시 이후 6일째의 세포 응집체의 형태를 도립 현미경 하에 명시야 관찰하고, 형태를 양호한 형태 (도 3C 흑색 막대, 둥글고, 매끄러운 표면, 조밀한 내부), 보통의 형태 (도 3 회색 막대, 둥글고, 포낭을 형성함), 및 불량한 형태 (도 3C 백색 막대, 둥글지 않고, 붕괴됨) 로 분류했다. 그 결과, 프리컨디셔닝하지 않은 조건 하에, 형태가 불량한 세포 응집체가 약 90%, 형태가 보통인 세포 응집체가 약 10%, 형태가 양호한 세포 응집체가 약 0% 인 것을 밝혀냈다 (도 3C "대조군", 왼쪽으로부터 첫번째 막대 그래프). 대조적으로, 프리컨디셔닝 처리한 조건 하에, 형태가 불량한 세포 응집체가 약 0%, 형태가 보통인 세포 응집체가 약 0%, 형태가 양호한 세포 응집체가 약 100% 인 것을 밝혀냈다 (도 3C "프리컨디션 (TGFβRi)", 왼쪽으로부터 3번째의 막대 그래프). 즉, 단계 1 에서 TGFβR 저해제 (SB431542, 5μM) 를 사용한 프리컨디셔닝 처리는 단계 2 및 3 에서의 세포 응집체의 양호한 형태를 야기함을 밝혀냈다.
실시예 4: 단계 1 또는 단계 2 에서, TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질을 사용한, 인간 iPS 세포로부터의 세포 응집체의 형성 실시예
실시예 1 에 기재된 방법에 따라, 인간 iPS 세포 (1231A3 주) 를 StemFit 배지를 사용하여 충만 상태 1일 이전까지 피더-프리 배양했다. 충만 상태 1일 이전의 인간 iPS 세포를, SB431542 (TGFβR 저해제, 5μM) 의 존재 하에 (단계 1, 프리컨디셔닝: TGFβRi 처리) 또는 부재 하에 (단계 1: 프리컨디셔닝하지 않음), 1일 동안 피더-프리 배양했다.
상기 인간 iPS 세포를, TrypLE Select (Life Technologies) 를 사용하여 세포 분산액으로 처리하고, 피펫팅 작업에 의해 단일 세포에 추가 분산시키고, 상기 단일 세포에 분산된 인간 iPS 세포를 비세포-접착성 96-웰 배양 플레이트 (PrimeSurface 96V-바닥 플레이트, SUMITOMO BAKELITE 사제) 의 웰 마다 1.2 x 104 개의 세포로 100㎕ 의 무혈청 배지에 부유시키고, 37℃, 5% CO2 에서 부유 배양했다. 이를 위한 무혈청 배지 (gfCDM+KSR) 로서, F-12 배지와 IMDM 배지의 1:1 혼합물에 10% KSR, 450μM 1-모노티오글리세롤, 1 x 화학적으로 정의된 지질 농축물을 첨가한 무혈청 배지를 사용했다. 부유 배양 개시시 (부유 배양 개시 이후 0일째, 단계 2 개시) 에, 상기 무혈청 배지에 Y27632 (최종 농도 20μM) 및 TGFβR 저해제 (SB431542, 5μM) 를 첨가했다. 부유 배양 개시 이후 2일째까지, 프리컨디셔닝 조건 및 프리컨디셔닝하지 않은 조건 모두 하에서, 세포 응집체가 형성되었다 (단계 2 종료, 단계 3 개시). 부유 배양 개시 이후 3일째에, Y27632 를 포함하지 않고 TGFβR 저해제 (SB431542, 5μM) 를 첨가한 무혈청 배지 (50 ㎕) 를 첨가했다.
이에 따라 제조된 부유 배양 개시 이후 6일째의 세포 응집체의 형태를 실시예 3 에 기재된 방법에 따라 관찰했다. 그 결과, 단계 1 에서 프리컨디셔닝 처리를 실시하지 않고 단계 2 에서 TGFβR 저해제 (SB431542) 를 첨가한 조건 하에, 형태가 불량한 세포 응집체가 약 30%, 형태가 보통인 세포 응집체가 약 60%, 형태가 양호한 세포 응집체가 약 10% 임을 밝혀냈다 (도 3C, '대조군 +SB', 왼쪽으로부터 2번째의 막대 그래프). 대조적으로, 단계 1 에서 프리컨디셔닝 처리하고 단계 2 에서 TGFβR 저해제 (SB431542) 를 첨가한 조건 하에서, 형태가 불량한 세포 응집체가 약 0%, 형태가 보통인 세포 응집체가 약 0%, 및 형태가 양호한 세포 응집체가 약 100% 임을 밝혀냈다 (도 3C, '프리컨디션 (TGFβRi) +SB', 왼쪽으로부터 4번째의 막대 그래프). 즉, 심지어 단계 2 및 단계 3 에서 TGFβR 저해제 (SB431542) 를 첨가한 조건 하에서도, 단계 1 에서 TGFβR 저해제 (SB431542, 5μM) 를 사용한 프리컨디셔닝 처리는 단계 1 에서의 프리컨디셔닝 처리 부재에 비해 세포 응집체의 양호한 형태를 야기한다는 것이 밝혀졌다.
또한, 실시예 3 및 실시예 4 의 비교는, 단계 1 에서 TGFβR 저해제 (SB431542) 로 프리컨디셔닝 처리를 실시하고 단계 2 및 단계 3 에서 TGFβR 저해제 (SB431542) 를 첨가하지 않은 조건 (도 3C "프리컨디션 (TGFβRi)", 왼쪽으로부터 3번째의 막대 그래프) 은, 단계 1 에서 프리컨디셔닝 처리를 실시하지 않고 단계 2 및 단계 3 에서 TGFβR 저해제 (SB431542) 를 첨가한 조건보다 (도 3C "대조군 +SB", 왼쪽으로부터 2번째의 막대 그래프), 양호한 형상을 갖는 세포 응집체의 높은 비율을 야기함이 밝혀졌다. 즉, TGFβR 저해제 (SB431542) 의 바람직한 첨가 타이밍은 단계 1 (프리컨디셔닝) 에서 임을 밝혀냈다.
실시예 5: 단계 1 에서 TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질을 사용한, 인간 iPS 세포로부터의 세포 응집체의 형성 실시예
실시예 1 에 기재된 방법에 따라, 인간 iPS 세포 (1231A3 주) 를 StemFit 배지를 사용하여 충만 상태 1일 이전까지 피더-프리 배양했다. 충만 상태 1일 이전의 인간 iPS 세포를, SB431542 (TGFβR 저해제, 5μM), 또는 LDN193189 (BMPR 저해제, 100 nM) 의 존재 하에 (단계 1: 프리컨디셔닝 처리) 또는 부재 하에 (단계 1: 프리컨디셔닝하지 않음), 1일 동안 피더-프리 배양했다.
상기 인간 iPS 세포를, TrypLE Select (Life Technologies) 를 사용하여 세포 분산액으로 처리하고, 피펫팅 작업에 의해 단일 세포로 추가 분산시키고, 상기 단일 세포에 분산된 인간 iPS 세포를 비세포-접착성 96-웰 배양 플레이트 (PrimeSurface 96V-바닥 플레이트, SUMITOMO BAKELITE 사제) 의 웰 마다 1.2 x 104 개의 세포로 100㎕ 의 무혈청 배지에 부유시켜, 37℃, 5% CO2 에서 부유 배양했다. 이를 위한 무혈청 배지 (gfCDM+KSR) 로서, F-12 배지와 IMDM 배지의 1:1 혼합물에 10% KSR, 450μM 1-모노티오글리세롤, 1 x 화학적으로 정의된 지질 농축물을 첨가한 무혈청 배지를 사용했다. 부유 배양 개시시 (부유 배양 개시 이후 0일째, 단계 2 개시) 에, 상기 무혈청 배지에 Y27632 (최종 농도 20μM) 를 첨가했다. 부유 배양 개시 이후 2일째까지, 프리컨디셔닝 조건 및 프리컨디셔닝하지 않는 조건 모두 하에서 세포 응집체가 형성되었다 (단계 2 종료, 단계 3 개시). 부유 배양 개시 이후 3일째에, Y27632 를 포함하지 않는 무혈청 배지 (50㎕) 를 첨가했다. 부유 배양 개시 이후 6일째 또는 그 이후, 2~4일 마다 1회 Y27632 를 포함하지 않는 상기 무혈청 배지로 배지의 50~70 % 부피를 교환했다.
이에 따라 제조된 부유 배양 개시 이후 9일째의 세포 응집체를 도립 현미경 (KEYENCE) 하에 명시야 관찰하였다 (도 4). 그 결과, 실시예 3 과 유사하게, 단계 1 에서 TGFβR 저해제 (SB431542) 의 존재 하에서 프리컨디셔닝 처리를 실시한 세포는 (도 4B) 미처리군에 비해 (도 4 A), 단계 3 에서의 세포 응집체의 양호한 형상을 나타냄이 밝혀졌다. 또한, 심지어 단계 1 에서 BMPR 저해제 (SB431542) 의 존재 하에 프리컨디셔닝 처리를 실시한 세포에서도 (도 4C) 미처리군에 비해 (도 4A) 단계 3 에서의 세포 응집체의 양호한 형상을 나타냄이 밝혀졌다. 즉, 프리컨디셔닝 처리 (단계 1) 에서, TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로의 저해 물질인 TGFβR 저해제 (SB431542) 및 BMPR 저해제 (LDN193189) 중 어느 하나의 사용은, 세포 응집체의 양호한 형상을 달성하는 효과를 제공함이 밝혀졌다.
실시예 6: 단계 1 에서 TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질을 사용하여 프리컨디셔닝한, 인간 iPS 세포로부터의 신경 조직의 형성 실시예
실시예 1 에 기재된 방법에 따라, 인간 iPS 세포 (1231A3 주) 를 StemFit 배지를 사용하여 충만 상태 1일 이전까지 피더-프리 배양했다. 충만 상태 1일 이전의 인간 iPS 세포를, LDN193189 (BMPR 저해제, 100 nM) 의 존재 하에 (단계 1: 프리컨디셔닝) 또는 부재 하에 (단계 1: 프리컨디셔닝하지 않음), 1일 동안 피더-프리 배양했다.
상기 인간 iPS 세포를, TrypLE Select (Life Technologies) 를 사용하여 세포 분산액으로 처리하고, 피펫팅 작업에 의해 단일 세포로 추가 분산시키고, 상기 단일 세포에 분산된 인간 iPS 세포를 비세포-접착성 96-웰 배양 플레이트 (PrimeSurface 96V-바닥 플레이트, SUMITOMO BAKELITE 사제) 의 웰 마다 1.2 x 104 개의 세포로 100㎕ 의 무혈청 배지에 부유시키고, 37℃, 5% CO2 에서 부유 배양했다. 이를 위한 무혈청 배지 (gfCDM+KSR) 로서, F-12 배지와 IMDM 배지의 1:1 혼합물에 10% KSR, 450μM 1-모노티오글리세롤, 1 x 화학적으로 정의된 지질 농축물을 첨가한 무혈청 배지를 사용했다. 부유 배양 개시시 (부유 배양 개시 이후 0일째, 단계 2 개시) 에, 상기 무혈청 배지에 Y27632 (최종 농도 20μM) 를 첨가했다. 부유 배양 개시 이후 2일째까지, 프리컨디셔닝하는 조건 및 프리컨디셔닝하지 않은 조건 모두 하에서, 세포 응집체가 형성되었다 (단계 2 종료, 단계 3 개시). 부유 배양 개시 이후 3일째에, Y27632 를 포함하지 않는 무혈청 배지 (50㎕) 를 첨가했다. 부유 배양 개시 이후 6일째 또는 그 이후, 2~4일 마다 1회 Y27632 를 포함하지 않는 상기 무혈청 배지로 배지의 반량을 교환했다. 절반-배지 교환 작업으로서, 배양기중의 배지 부피의 절반, 즉 75㎕ 를 버리고, 상기 새로운 무혈청 배지 (75㎕) 를 첨가해 총 배지 양 150㎕ 을 만들었다.
이에 따라 제조된 부유 배양 개시 이후 23일째의 세포를, 도립 현미경 (KEYENCE) 하에, 명시야 관찰했다 (도 5A, B). 그 결과, 단계 1 에서 프리컨디셔닝 처리하지 않는 조건 하에, 단계 3 에서 세포 응집체가 붕괴하고, 신경 조직은 전혀 형성되지 않았음을 밝혀냈다 (도 5A). 다른 한편으로는, 단계 1 에서 BMPR 저해제 (LDN193189) 의 존재 하에서 프리컨디셔닝 처리를 실시한 세포는, 단계 3 에서 양호한 형상을 갖는 세포 응집체가 형성되었고, 신경 표피 구조를 가지는 신경 조직이 형성되었음이 밝혀졌다 (도 5B). 또한 부유 배양 개시 이후 23일째의 세포를 도립 현미경 (KEYENCE) 하에 명시야 관찰하고, "신경 조직이 3% 이하인 붕괴된 세포 응집체 (형태가 불량한 세포 응집체)", "신경 조직이 10% 이하인 유지된 세포 응집체 (형태가 보통 수준인 세포 응집체)" "신경 조직이 10% 이상인 유지된 세포 응집체 (신경 조직을 포함하는 세포 응집체)" 를 각각 정량화했다. 그 결과, 단계 1 에서 프리컨디셔닝하지 않은 조건 하에, 불량한 형태를 갖는 세포 응집체가 약 100%, 보통 수준 형태를 갖는 세포 응집체가 약 0%, 및 신경 조직을 포함하는 세포 응집체가 약 0% 임을 밝혀냈다. 대조적으로, 단계 1 에서 프리컨디셔닝한 조건 하에, 불량한 형태를 갖는 세포 응집체가 약 0%, 보통 수준의 형태를 갖는 세포 응집체가 약 0%, 및 신경 조직을 포함하는 세포 응집체가 약 100% 임을 밝혀냈다.
또한, 출발 물질로서 상기 프리컨디셔닝 처리를 실시한 iPS 세포로부터 제조한 부유 배양 개시 이후 23일째의 세포 응집체 (도 5B의 조건) 를, 4% 파라-포름알데히드로 고정해, 동결 절편을 제조했다. 이러한 동결 절편을, 신경 조직 마커 (신경 전구 세포) 의 하나인 네스틴 (항네스틴 항체, Millipore K.K., 마우스), 신경 조직 마커 (뉴런) 의 하나인 TuJ1 (항-βIII-튜블린 항체, Promega K.K., 마우스), 또는 신경 조직 마커의 하나인 PSA-NCAM (항-PSA-NCAM 항체, Millipore K.K., 마우스 IgM) 에 대해 면역 염색했다. 이들의 면역 염색된 절편을, 도립 형광 현미경 하에 관찰했다. 그 결과, BMPR 저해제 (LDN193189) 로 프리컨디셔닝한 조건 하에 제조한 세포 응집체에서, 전체 세포 중의 네스틴-양성 세포의 비율이 약 20%, 전체 세포 중 TuJ1-양성 세포의 비율은 약 70%, 및 PSA-NCAM-양성 세포의 비율은 약 70% 임이 밝혀졌다 (도 5C-E). 또한 연속 절편의 분석으로부터, 도립 현미경 하에 명시야에서의 형태 관찰에 의해 신경 조직인 것으로 결정될 수 있는 영역은, 네스틴-양성, TuJ1-양성, 및 PSA-NCAM-양성이었음을 확인할 수 있었다 (도 5C-E). 이 결과로부터, 피더-프리 배양한 인간 iPS 세포를 출발 물질로서 및 단계 1 에서 TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질을 사용한 프리컨디셔닝에 의해, 단계 3 에서 효율적으로 신경 조직을 제조할 수 있음이 밝혀졌다.
실시예 7: 단계 1 에서 TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질을 사용하여 프리컨디셔닝하고, 단계 3 에서 분화-유도 인자로서 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 사용하는 것을 포함하는, 인간 iPS 세포로부터의 망막 조직의 형성 실시예
실시예 1 에 기재된 방법에 따라, 인간 iPS 세포 (1231A3 주) 를 StemFit 배지에서 충만 상태 1일 이전까지 피더-프리 배양했다. 충만 상태 1일 이전의 인간 iPS 세포를 LDN193189 (BMPR 저해제, 100 nM) 의 존재 하에 (단계 1: 프리컨디셔닝) 1일 동안 피더-프리 배양했다.
상기 인간 iPS 세포를, TrypLE Select (Life Technologies 사제) 를 사용하여 세포 분산액으로 처리하고, 피펫팅 작업에 의해 단일 세포에 추가 분산시키고, 상기 단일 세포에 분산된 인간 iPS 세포를 비세포-접착성 96-웰 배양 플레이트 (PrimeSurface 96V-바닥 플레이트, SUMITOMO BAKELITE 사제) 의 웰 마다 1.2 x 104 개의 세포로 100㎕ 의 무혈청 배지에 부유시키고, 37℃, 5% CO2 에서 부유 배양했다. 이를 위한 무혈청 배지 (gfCDM+KSR) 로서, F-12 배지와 IMDM 배지의 1:1 혼합물에 10% KSR, 450μM 1-모노티오글리세롤, 1 x 화학적으로 정의된 지질 농축물을 첨가한 무혈청 배지를 사용했다. 부유 배양 개시시 (부유 배양 개시 이후 0일째, 단계 2 개시) 에, 상기 무혈청 배지에 Y27632 (최종 농도 20μM) 를 첨가했다. 부유 배양 개시 이후 2일째까지, 프리컨디셔닝하는 조건 하에 세포 응집체가 형성되었다 (단계 2 종료, 단계 3 개시). 부유 배양 개시 이후 3일째에, Y27632 를 포함하지 않는 무혈청 배지 (50㎕) 를 첨가했다.
여기서 단계 3 으로서, 이하의 조건 1 및 조건 2 하에 배양을 실시했다: 조건 1 (+BMP) 하에, 부유 배양 개시 이후 6일째에, 외인성 인간 재조합 BMP4 의 최종 농도가 1.5 nM (55 ng/ml) 이도록, Y27632 를 포함하지 않고 인간 재조합 BMP4 (R&D 사제) 를 포함하는 배지로 배지를 교환했다 (도 6B, D). 조건 2(-BMP) 하에, 부유 배양 개시 이후 6일째에, 외인성 인간 재조합 BMP4 를 첨가하지 않는 조건 하에 Y27632 를 포함하지 않고 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하지 않는 배지로 배지의 절반을 교환했다 (도 6A, C).
부유 배양 개시 이후 6일째 또는 그 이후에, 2~4일 마다 1회 Y27632 및 인간 재조합 BMP4 를 포함하지 않는 상기 무혈청 배지로 배지의 절반을 교환했다. 부유 배양 개시 이후 23일째에, 도립 현미경으로 형태를 관찰했다. 그 결과, 프리컨디셔닝한 iPS 세포를 출발 물질로서 사용하는 본 실시예에서 세포 응집체가 유지되고 신경 조직이 형성되었음이 밝혀졌다.
출발 물질로서 이에 따라 제조된, 단계 1 에서 프리컨디셔닝 처리를 실시한 상기 iPS 세포로부터 제조한 부유 배양 개시 이후 23일째의 세포 응집체를, 4% 파라-포름알데히드로 고정하고, 동결 절편을 제조했다. 이러한 동결 절편을 망막 조직 마커의 하나인 Chx10 (항-Chx10 항체, Exalpha, 양), 또는 망막 조직 마커의 하나인 Rx (항-Rx 항체, Takara, 기니피그) 에 대해 면역 염색했다. 이들 면역 염색된 절편을 도립 형광 현미경 하에 관찰했다. 그 결과, 단계 1 에서 BMPR 저해제 (LDN193189) 로 프리컨디션하고 단계 3 에서 BMP4 를 첨가하지 않은 조건 하에 제조한 세포 응집체에서, 전체 세포 중 Rx-양성 세포의 비율이 10% 미만 (Rx-강한 양성 (망막에 상응) 은 3% 미만, Rx-약한 양성 (망막 이외의 신경 조직에 상응) 은 7% 미만) 이고, Chx10-양성 세포의 비율은 또한 3% 미만임이 확인되었다 (도 6A, C). 다른 한편으로는, 단계 1 에서 BMPR 저해제 (LDN193189) 로 프리컨디셔닝하고 단계 3 에서 BMP4 를 첨가한 조건 하에 제조한 세포 응집체에서, 전체 세포 중의 Rx-양성 세포의 비율이 약 60%, 전체 세포 중의 Chx10-양성 세포의 비율이 또한 약 60% 인 것이 밝혀졌다 (도 6B, D). 또한, 연속 절편의 분석으로부터, Chx10-양성 세포의 비율이 높은 (약 95%) 신경 조직에서, Rx 가 또한 강한 양성임이 제안되었다 (도 6B, D). 결과로부터, 단계 1 에서 프리컨디셔닝하는 것을 포함하는 조건 하에 신경 조직이 형성되고, 또한 단계 3 에서 부유 배양 동안 분화-유도 물질로서 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 부유 배양에 첨가함으로써, 피더-프리 배양한 인간 iPS 세포 (이하, 피더-프리 인간 iPS 세포로도 칭함) 로부터 효율적으로 망막 조직을 제조할 수 있음이 밝혀졌다.
실시예 8: 단계 1 에서 TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질 또는 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질, 및 단계 2 에서 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질을 사용하는, 피더-프리 인간 iPS 세포로부터의 신경 조직의 형성 실시예
실시예 1 에 기재된 방법에 따라, 인간 iPS 세포 (1231A3 주) 를 StemFit 배지에서 충만 상태 1일 이전까지 피더-프리 배양했다. 충만 상태 1일 이전의 인간 iPS 세포를, SB431542 (TGFβR 저해제, 5μM), LDN193189 (BMPR 저해제, 100 nM) 또는 SAG (Shh 시그널 전달 경로 작용 물질, 300 nM) 의 존재 하에 또는 부재 하에 (단계 1: 프리컨디셔닝하지 않음), 1일 동안 피더-프리 배양했다.
상기 인간 iPS 세포를, TrypLE Select (Life Technologies) 를 사용하여 세포 분산액으로 처리하고, 피펫팅 작업에 의해 단일 세포로 추가 분산시키고, 상기 단일 세포에 분산된 인간 iPS 세포를 비세포-접착성 96-웰 배양 플레이트 (PrimeSurface 96V-바닥 플레이트, SUMITOMO BAKELITE 사제) 의 웰 마다 1.2 x 104 개의 세포로 100㎕ 의 무혈청 배지에 부유시키고, 37℃, 5% CO2 에서 부유 배양했다. 이를 위한 무혈청 배지 (gfCDM+KSR) 로서, F-12 배지와 IMDM 배지의 1:1 혼합물에 10% KSR, 450μM 1-모노티오글리세롤, 1 x 화학적으로 정의된 지질 농축물을 첨가한 무혈청 배지를 사용했다.
부유 배양 개시시 (부유 배양 개시 이후 0일째, 단계 2 개시) 에, 하기의 조건 1 및 2 하에 세포를 배양했다. 조건 1 (+SAG) 에서, 부유 배양 개시시에 상기 무혈청 배지에 Y27632 (최종 농도 20μM) 및 SAG (Shh 시그널 전달 경로 작용 물질, 300 nM) 를 첨가했다 (도 7B-D, F-H, '+SAG'). 조건 2 (-SAG) 에서, 부유 배양 개시시에 상기 무혈청 배지에 Y27632 (최종 농도 20μM) 를 첨가하고, SAG 는 첨가하지 않았다 (도 7 A, E, '-'). 부유 배양 개시 이후 2일째까지, 모든 조건 하에서 세포 응집체가 형성되었다 (단계 2 종료, 단계 3 개시). 부유 배양 개시 이후 3일째에, Y27632 및 SAG 를 포함하지 않는 무혈청 배지 (50㎕) 를 첨가했다.
부유 배양 개시 이후 6일째에, Y27632 및 SAG 를 포함하지 않고 인간 재조합 BMP4 (R&D 사제) 를 포함하거나 포함하지 않는 배지로 배지를 교환하여, 외인성 인간 재조합 BMP4 를 최종 농도 1.5 nM 로 포함하는 배지 (도 7E-H), 또는 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 첨가하지 않은 배지 (도 7A-D) 를 생성했다. 부유 배양 개시 이후 6일째 또는 그 이후, 2~4일 마다 1회 Y27632, SAG, 및 인간 재조합 BMP4 를 포함하지 않는 상기 무혈청 배지로 배지의 반량을 교환했다.
이에 따라 제조된 세포를 부유 배양 개시 이후 23일째에, 도립 현미경 (KEYENCE) 하에 명시야 관찰했다 (도 7). 또한, 부유 배양 개시 이후 23일째의 세포 응집체의 형태를 실시예 6 기재된 방법에 따라 정량화했다 (도 7I). 그 결과, 단계 1 에서 프리컨디셔닝하지 않고 단계 2 에서 SAG 를 첨가하지 않은 조건 하에서 세포 응집체가 붕괴하고 신경 조직이 형성되지 않음이 밝혀졌다 (도 7A, E). 다른 한편으로는, 단계 1 에서 TGFβR 저해제 (SB431542), BMPR 저해제 (LDN193189), 또는 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질로 프리컨디셔닝하고, 단계 2 에서 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질을 첨가한 조건 하에, 세포 응집체가 형성되고 효율적으로 신경 조직이 형성될 수 있음이 밝혀졌다 (도 7B-D, F-I).
또한, 출발 물질로서 상기 TGFβR 저해제 (SB431542) 또는 BMPR 저해제 (LDN193189) 로 프리컨디셔닝 처리를 실시한 iPS 세포로부터 제조된 부유 배양 개시 이후 23일째의 세포 응집체를 4% 파라-포름알데히드로 고정해, 동결 절편을 제조했다. 이들 동결 절편을, 신경 조직 마커 (신경 전구 세포) 의 하나인 네스틴 (항-네스틴 항체, Nihon Millipore K.K., 마우스), 신경 조직 마커 (뉴런) 의 하나인 TuJ1 (항-βIII-튜블린 항체, Promega KK, 마우스), 또는 신경 조직 마커의 하나인 PSA-NCAM (항-PSA-NCAM 항체, Millipore K.K., 마우스 IgM) 에 대해 면역 염색했다. 이들 면역 염색된 절편을 도립 형광 현미경 하에 관찰했다. 그 결과, TGFβR 저해제 (SB431542) 또는 BMPR 저해제 (LDN193189) 로 프리컨디셔닝한 조건 하에 제조한 세포 응집체에서, 전체 세포 중의 네스틴-양성 세포의 비율이 약 20%, 전체 세포 중의 TuJ1-양성 세포의 비율이 약 70%, 및 PSA-NCAM-양성 세포의 비율이 약 70% 임이 밝혀졌다 (도 8A-F). 또한 연속 절편의 분석으로부터, 명시야 이미지에서의 형태 관찰에 의해 신경 조직인 것으로 판별할 수 있는 영역은 네스틴-양성, TuJ1-양성 및 PSA-NCAM-양성임을 확인할 수 있었다 (도 8A-F).
이들 결과로부터, 단계 1 에서 TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질 또는 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질로 프리컨디셔닝하는 것을 포함하고, 또한 단계 2 에서 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질을 첨가하는 것을 포함하는 조건 하에서, 심지어 단계 3 에서 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 첨가하거나 첨가하지 않은 경우에도, 피더-프리 인간 iPS 세포로부터 효율적으로 신경 조직을 제조할 수 있음이 밝혀졌다.
실시예 9: 단계 1 에서 TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질, 단계 2 에서 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질, 단계 3 에서 분화-유도 인자로서 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 사용한, 피더-프리 인간 iPS 세포로부터의 망막 조직의 형성 실시예
실시예 8 에 기재된 방법에 따라, 피더-프리 배지로서 StemFit 배지를 사용한 인간 iPS 세포를 출발 물질로서 사용하고, 단계 1 에서 TGFβR 저해 물질 (SB431542) 또는 BMPR 저해 물질 (LDN193189) 을 사용하고, 단계 2 에서 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질을 사용하고, 단계 3 에서 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 첨가하거나 첨가하지 않은 조건 하에, 세포 응집체를 제조했다. 모든 이러한 조건 하에 형성된 부유 배양 개시 이후 23일째의 모든 세포 응집체에서, 신경 조직이 형성되었다. 상기 세포 응집체를, 4% 파라-포름알데히드로 고정하여, 동결 절편을 제조했다. 이들 동결 절편을, 망막 조직 마커의 하나인 Chx10 (항-Chx10 항체, Exalpha, 양), 또는 망막 조직 마커의 하나인 Rx (항-Rx 항체, Takara, 기니피그) 에 대해 면역 염색했다. 이러한 면역 염색된 절편을 형광 현미경 하에 관찰했다. 그 결과, 단계 1 에서 TGFβR 저해제 (SB431542) 또는 BMPR 저해제 (LDN193189) 로 프리컨디셔닝하고, 단계 2 에서 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질을 첨가하고, 단계 3 에서 BMP4 를 첨가하지 않은 것을 포함하는 조건 하에 제조한 세포 응집체에서, 전체 세포 중 Rx-양성 세포의 비율이 10% 미만 (Rx-강한 양성 (망막에 상응) 은 3% 미만, Rx-약한 양성 (망막 이외의 신경 조직에 상응) 은 7% 미만) 이고, Chx10-양성 세포의 비율도 3% 미만임이 밝혀졌다 (도 9A, C, E, G). 다른 한편으로는, 단계 1 에서 TGFβR 저해제 (SB431542) 로 프리컨디셔닝하고, 단계 2 에서 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질을 첨가하고, 단계 3 에서 BMP4 를 첨가하는 것을 포함하는 조건 하에 제조한 세포 응집체에서, 전체 세포 중의 Rx-양성 세포의 비율이 80% 이상이고, 전체 세포 중의 Chx10-양성 세포의 비율도 70% 이상임이 밝혀졌다 (도 9B, F). 또한, 단계 1 에서 BMPR 저해제 (LDN193189) 로 프리컨디셔닝하고, 단계 2 에서 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질을 첨가하고, 단계 3 에서 BMP4 를 첨가하는 것을 포함하는 조건 하에 제조한 세포 응집체에서, 전체 세포 중의 Rx-양성 세포의 비율이 50% 이상이고, 전체 세포 중의 Chx10-양성 세포의 비율도 40% 이상임이 밝혀졌다 (도 9D, H). 또한 연속 절편의 분석으로부터, Chx10-양성 세포의 비율이 높은 (95% 이상) 신경 조직에서, Rx 가 강한 양성임이 밝혀졌다 (도 9B, D, F, H).
이들 결과로부터, 단계 1 에서 TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질로 프리컨디셔닝하고, 단계 2 에서 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질을 첨가하고, 단계 3 에서 부유 배양에 분화-유도 물질로서 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 첨가함으로써, 피더-프리 인간 iPS 세포로부터 효율적으로 망막 조직을 제조할 수 있음이 밝혀졌다.
실시예 10: 피더-프리 배지로서 Essential 8 배지에서 인간 iPS 세포를 출발 물질로서 사용하고, 단계 1 에서 TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질을 사용한, 세포 응집체의 형성 실시예
인간 iPS 세포 (1231A3 주, 쿄토 대학에서 입수) 를, "Scientific Reports, 4, 3594 (2014)" 에 기재된 방법에 따라 피더-프리 배양했다. 피더-프리 배지로서, Essential 8 배지 (Life technologies 사제, Nature Methods, 8, 424-429 (2011)) 를 사용하고, 피더-프리 스캐폴드로서 Laminin 511-E8 (Nippi, Inc. 사제) 를 사용했다.
구체적인 유지 배양 작업으로서, 먼저 충만 상태의 (배양 면적의 60% 가 세포로 덮임) 인간 iPS 세포 (1231A3 주) 를 PBS 로 세정하고, TrypLE Select (Life Technologies) 를 사용하여 단일 세포에 분산시켰다. 그 후, 상기 단일 세포에 분산된 인간 iPS 세포를, Laminin 511-E8 로 코팅된 플라스틱 배양 디쉬 (Iwaki 사제) 에 파종하고, Y27632 (10 μM, ROCK 저해 물질) 의 존재 하에 Essential 8 배지에서 피더-프리 배양했다. 상기 플라스틱 배양 디쉬로서 6-웰 플레이트 (Iwaki 사제, 배양 면적 9.4 ㎠) 를 사용한 경우, 상기 단일 세포에 분산된 인간 iPS 세포의 플레이팅된 세포 수는 6 x 103 으로 설정했다. 파종 1일 후에, Y27632 를 포함하지 않는 Essential 8 배지로 배지를 교환했다. 그 후, 파종 6일 이후, 즉 충만 상태 (배양 면적의 60% 가 세포로 덮임) 가 될 때까지 세포를 배양했다.
프리컨디셔닝 작업으로서, 먼저 충만 상태의 인간 iPS 세포 (1231A3 주) 를 PBS 로 세정하고, TrypLE Select (Life Technologies) 를 사용하여 단일 세포에 분산시켰다. 그 후, 상기 단일 세포에 분산된 인간 iPS 세포를, Laminin 511-E8 로 코팅된 플라스틱 배양 디쉬 (Iwaki 사제) 에 파종하고, Y27632 (10 μM, ROCK 경로 저해 물질) 의 존재 하에 Essential 8 배지에서 피더-프리 배양했다. 상기 플라스틱 배양 디쉬로서 6-웰 플레이트 (Iwaki 사제, 세포 배양용, 배양 면적 9.4 ㎠) 를 사용한 경우, 상기 단일 세포에 분산된 인간 iPS 세포의 파종 세포 수는 6 x 103 으로 설정했다. 파종 1일 후에, Y27632 를 포함하지 않는 Essential 8 배지로 배지를 교환했다. 그 후, 파종 5일 이후, 즉 충만 상태 1일 이전까지 (배양 면적의 50% 가 세포로 덮임) 세포를 배양했다. 상기 피더-프리 배양한 충만 상태 1일 이전의 인간 iPS 세포를, SB431542 (TGFβR 저해제, 5μM), LDN193189 (BMPR 저해제, 100 nM), 또는 TGFβR 및 BMPR 이중 저해제 (5μM SB431542 및 100 nM LDN193189) 의 존재 하에 (단계 1: 프리컨디셔닝) 또는 이의 부재 하에 (단계 1: 프리컨디셔닝 없음, 대조군), 1일 동안 피더-프리 배양했다. 배양한 세포의 명시야 관찰을, 도립 현미경 (KEYENCE) 하에 실시했다. 그 결과, 피더-프리 배양 동안 TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해제를 사용한 처리에 의해 인간 iPS 세포의 형태는 크게 영향을 받지 않음이 밝혀졌다.
상기 인간 iPS 세포를, TrypLE Select (Life Technologies) 를 사용하여 세포 분산액으로 처리하고, 피펫팅 작업에 의해 단일 세포에 추가 분산시키고, 상기 단일 세포에 분산된 인간 iPS 세포를 비세포-접착성 96-웰 배양 플레이트 (PrimeSurface 96V-바닥 플레이트, SUMITOMO BAKELITE 사제) 의 웰 마다 1.2 x 104 개의 세포로 100㎕ 의 무혈청 배지에 부유시키고, 37℃, 5% CO2 에서 부유 배양했다. 이를 위한 무혈청 배지 (gfCDM+KSR) 로서, F-12 배지와 IMDM 배지의 1:1 혼합물에 10% KSR, 450μM 1-모노티오글리세롤, 1 x 화학적으로 정의된 지질 농축물을 첨가한 무혈청 배지를 사용했다.
부유 배양 개시시 (부유 배양 개시 이후 0일째, 단계 2 개시) 에, 하기의 조건 1 및 조건 2 를 포함한 2 가지 조건 하에 세포를 배양했다. 조건 1 (+SAG)에서, 부유 배양 개시시에 상기 무혈청 배지에 Y27632 (최종 농도 20μM) 및 SAG (Shh 시그널 전달 경로 작용 물질, 300 nM) 를 첨가했다 (도 10C, F, H, J, L, N "+SAG"). 조건 2 (-SAG) 에서, 부유 배양 개시시에 상기 무혈청 배지에 Y27632 (최종 농도 20μM) 를 첨가하고, SAG 는 첨가하지 않았다 (도 10A, B, D, E, G, I, K, M "-"). 부유 배양 개시 이후 2일째까지, 모든 조건 하에 세포 응집체가 형성되었다 (단계 2 종료, 단계 3 개시). 부유 배양 개시 이후 3일째에, Y27632 및 SAG 를 포함하지 않는 무혈청 배지 (50㎕) 를 첨가했다.
부유 배양 개시 이후 6일째에, Y27632 및 SAG 를 포함하지 않고 인간 재조합 BMP4 (R&D 사제) 를 포함하는 배지 또는 포함하지 않는 배지로 배지를 교환하여, 배지가 외인성 인간 재조합 BMP4 를 최종 농도 1.5 nM 로 포함 (도 10D-F) 하거나, 배지가 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하지 않았다 (도 10K-N). 부유 배양 개시 이후 6일째 또는 그 이후, 2~4일 마다 1회 Y27632, SAG, 및 인간 재조합 BMP4 를 포함하지 않는 상기 무혈청 배지로 배지의 절반을 교환했다.
이에 따라 제조된 세포를 부유 배양 개시 이후 7일째에, 도립 현미경 (KEYENCE) 하에 명시야 관찰했다 (도 10). 그 결과, 단계 1 에서 프리컨디셔닝하지 않고 단계 2 에서 SAG 를 첨가하지 않은 조건 하에, 세포 응집체가 붕괴하고 신경 조직이 형성되지 않음이 밝혀졌다 (도 10A). 단계 1 에서 프리컨디셔닝한 조건 하에서는, 심지어 단계 2 에서 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질을 첨가하지 않았거나 단계 2 에서 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질을 첨가한 경우에도, 세포 응집체가 형성될 수 있음이 관찰되었다 (도 10). 즉, 심지어 피더-프리 배지로서 Essential 8 배지를 사용한 경우에도, 단계 1 에서의 TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질을 사용한 프리컨디셔닝 처리에 의해, 인간 iPS 세포로부터 형성되는 세포 응집체의 형태가 양호해진다는 것이 밝혀졌다.
실시예 11: 피더-프리 배지로서 Essential 8 배지에서 인간 iPS 세포를 출발 물질로서 사용하고, 단계 1 에서 TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질을 사용하고, 단계 2 에서 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질을 사용한, 신경 조직의 형성 실시예
실시예 10 에 기재된 방법에 따라, 피더-프리 배양으로서 Essential 8 배지를 사용한 인간 iPS 세포를 출발 물질로서, 단계 1 에서 TGFβR 저해 물질 (SB431542), 및 단계 2 에서 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질을 사용하여 세포 응집체를 제조했다. 부유 배양 개시 이후 18일째의 상기 세포 응집체를, 4% 파라-포름알데히드로 고정해, 동결 절편을 제조했다. 이들 동결 절편을, 신경 조직 마커 (신경 전구 세포) 의 하나인 네스틴 (항-네스틴 항체, Nihon Millipore K.K., 마우스), 신경 조직 마커 (뉴런) 의 하나인 TuJ1 (항-βIII-튜블린 항체, Promega KK, 마우스), 또는 신경 조직 마커의 하나인 PSA-NCAM (항-PSA-NCAM 항체, Millipore K.K., 마우스 IgM) 에 대해 면역 염색을 실시하고, 형광 현미경 하에 관찰했다. 그 결과, 상기 세포 응집체에서, 전체 세포 중의 네스틴-양성 세포의 비율이 약 30%, 전체 세포 중의 TuJ1-양성 세포의 비율이 약 70%, 및 PSA-NCAM-양성 세포의 비율이 약 70% 인 것이 밝혀졌다 (도 11). 또한 연속 절편의 분석으로부터, 명시야 이미지에서의 형태 관찰에 의해 신경 조직인 것으로 판별할 수 있는 영역은 네스틴-양성, TuJ1-양성, 및 PSA-NCAM-양성임을 확인할 수 있었다 (도 11). 즉, 단계 1 에서 TGFβR 저해 물질로 프리컨디셔닝하고, 단계 2 에서 SAG 를 첨가하는 것을 포함하는 조건 하에 제조된 세포 응집체에서, 신경 조직이 효율적으로 형성됨이 밝혀졌다.
실시예 12: 피더-프리 배양으로서 Essential 8 배지에서 인간 iPS 세포를 출발 물질로서, 단계 1 에서 TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질, 단계 2 에서 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질, 단계 3 에서 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 사용한, 망막 조직의 형성 실시예
실시예 10 에 기재된 방법에 따라, 피더-프리 배양으로서 Essential 8 배지를 사용한 인간 iPS 세포를 출발 물질로서, 단계 1 에서 TGFβR 저해 물질 (SB431542) 을 사용하고, 단계 2 에서 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질을 사용하고, 단계 3 에서 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 첨가하거나 첨가하지 않은 조건 하에, 세포 응집체를 제조했다. 부유 배양 개시 이후 18일째의 상기 세포 응집체를 각각 4% 파라-포름알데히드로 고정해, 동결 절편을 제조했다. 이들 동결 절편을, 망막 조직 마커의 하나인 Chx10 (항-Chx10 항체, Exalpha, 양), 또는, 망막 조직 마커의 하나인 Rx (항-Rx항체, Takara, 기니피그) 에 대해 면역 염색하고, 형광 현미경 하에 관찰했다. 그 결과, 단계 1 에서 TGFβR 저해제 (SB431542) 로 프리컨디셔닝하고, 단계 2 에서 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질을 첨가하고, 단계 3 에서 BMP4 를 첨가하지 않은 조건 하에 제조한 세포 응집체에서, 전체 세포 중 Rx-양성 세포의 비율이 10% 미만 (Rx-강한 양성 (망막에 상응) 은 3% 미만, Rx-약한 양성 (망막 이외의 신경 조직에 상응) 은 7% 미만) 이고, Chx10-양성 세포의 비율도 3% 미만임이 밝혀졌다 (도 12). 다른 한편으로는, 단계 1 에서 TGFβR 저해제 (SB431542) 로 프리컨디셔닝하고, 단계 2 에서 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질을 첨가하고, 단계 3 에서 BMP4 를 첨가한 조건 하에 제조한 세포 응집체에서, 전체 세포 중의 Rx-강한 양성 세포의 비율이 30% 이상, 전체 세포 중의 Chx10-양성 세포의 비율도 20% 이상임이 관찰되었다 (도 12). 또한 연속 절편의 분석으로부터, Chx10-양성 세포의 비율이 높은 (95% 이상) 신경 조직에서, Rx 는 강한 양성인 것이 밝혀졌다. 그 결과로부터, Essential 8 배지를 사용하여 피더-프리 배양된 인간 iPS 세포를 출발 물질로서, 단계 1 에서 TGFβR 저해 물질, 단계 2 에서 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질, 및 단계 3 에서 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 사용하여, 망막 조직을 제조할 수 있음이 밝혀졌다.
실시예 13: 피더-프리 배지로서 StemFit 에서 인간 iPS 세포를 출발 물질로서, 단계 1 에서 TGFβ 시그널 전달 경로 저해 물질 및 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질, 단계 3 에서 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 사용한, 망막 조직의 형성 실시예
실시예 1 에 기재된 방법에 따라, 인간 iPS 세포 (1231A3 주) 를 StemFit 배지를 사용하여 충만 상태 1일 이전이 될 때까지 피더-프리 배양했다. 충만 상태 1일 이전의 인간 iPS 세포를, SB431542 (TGFβR 저해제, 5μM) 및 SAG (Shh 시그널 전달 경로 작용 물질, 300 nM) 의 존재 하에서, 1일 동안 피더-프리 배양했다 (단계 1, 프리컨디셔닝: TGFβRi+SAG 처리).
상기 인간 iPS 세포를, TrypLE Select (Life Technologies) 를 사용하여 세포 분산액으로 처리하고, 피펫팅 작업에 의해 단일 세포에 추가 분산시키고, 상기 단일 세포에 분산된 인간 iPS 세포를 비세포-접착성 96-웰 배양 플레이트 (PrimeSurface 96V-바닥 플레이트, SUMITOMO BAKELITE 사제) 의 웰 마다 1.2 x 104 개의 세포로 100㎕ 의 무혈청 배지에 부유시키고, 37℃, 5% CO2 에서 부유 배양했다. 이를 위한 무혈청 배지로서, F-12 배지와 IMDM 배지의 1:1 혼합물에 10% KSR, 450μM 1-모노티오글리세롤, 및 1 x 화학적으로 정의된 지질 농축물을 첨가한 무혈청 배지를 사용했다. 부유 배양 개시시 (부유 배양 개시 이후 0일째, 단계 2 개시) 에, 상기 무혈청 배지에 Y27632 (최종 농도 20μM) 및 SAG (Shh 시그널 전달 경로 작용 물질, 300 nM) 를 첨가했다. 부유 배양 개시 이후 2일째까지 1일 동안에, 세포 응집체가 형성되었고 (단계 2 종료, 단계 3 개시), 그 후 단계 3 에서 하기 조건 1~3 하에 배양했다.
조건 1: 부유 배양 개시 이후 3일째에, Y27632, SAG 및 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하지 않는 무혈청 배지 (50㎕) 첨가했다. 부유 배양 개시 이후 6일째 또는 그 이후, 3일 마다 1회, Y27632, SAG 및 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하지 않는 상기 무혈청 배지로, 배지의 반량 (절반 부피, 즉 75㎕ 의 배지를 버리고, Y27632, SAG 및 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하지 않는 상기 무혈청 배지를 75㎕ 첨가함) 을 교환했다.
조건 2: 부유 배양 개시 이후 3일째에, Y27632 및 SAG 를 포함하지 않고 인간 재조합 BMP4 를 1.5 nM 의 최종 농도로 포함하는 무혈청 배지를 첨가했다. 부유 배양 개시 이후 6일째 또는 그 이후, 3일 마다 1회, Y27632, SAG 및 BMP 작용 물질을 포함하지 않는 상기 무혈청 배지로, 배지의 반량 (절반 부피, 즉 75㎕ 의 배지를 버리고, Y27632, SAG 및 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하지 않는 상기 무혈청 배지를 75㎕ 첨가함) 을 교환했다.
조건 3: 부유 배양 개시 이후 3일째에, Y27632, SAG 및 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하지 않는 무혈청 배지 (50㎕) 를 첨가했다. 부유 배양 개시 이후 6일째에, Y27632 및 SAG 를 포함하지 않고 인간 재조합 BMP4 를 1.5 nM 의 최종 농도로 포함하는 무혈청 배지를 첨가했다. 부유 배양 개시 이후 6일째 또는 그 이후에, Y27632, SAG 및 BMP 작용 물질을 포함하지 않는 상기 무혈청 배지로, 배지의 반량 (절반 부피, 즉 75㎕ 의 배지를 버리고, Y27632, SAG 및 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하지 않는 상기 무혈청 배지를 75㎕ 첨가함) 을 교환했다.
상기 조건 1~3 하에 배양하는 경우, 부유 배양 개시 이후 26일째에 모든 조건 하에 세포 응집체가 형성되었고, 신경 조직이 형성되었다. 상기 부유 배양 개시 이후 26일째의 세포 응집체를 각각 4% 파라-포름알데히드로 고정해, 동결 절편을 제조했다. 이들 동결 절편을, 망막 조직 마커의 하나인 Chx10 (항-Chx10 항체, Exalpha, 양) 에 대해 면역 염색했다. 그 결과, 조건 1 의 세포 응집체에서 전체 세포 중 Chx10-양성 세포의 비율이 3% 미만임이 밝혀졌다 (도 13, 왼쪽). 다른 한편으로는, 조건 2 및 조건 3 의 세포 응집체에서, 전체 세포 중의 Chx10-양성 세포의 비율이 60% 이상임이 밝혀졌다 (도 13, 중간, 오른쪽). 이 결과로부터, 단계 1 에서 TGFβR 저해 물질 (SB431542) 및 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질, 단계 2 에서 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질, 및 단계 3 에서 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 사용하는 조건 하에, 망막 조직을 제조할 수 있음이 밝혀졌다.
실시예 14: 단계 2 에서 플레이팅된 세포 수의 검토 (피더-프리 배지로서 StemFit 에서 인간 iPS 세포를 출발 물질로서 사용하고, 단계 1 에서 TGFβ 시그널 전달 경로 저해 물질 및 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질을 사용함)
실시예 1 에 기재된 방법에 따라, 인간 iPS 세포 (1231A3 주) 를 StemFit 배지에서 충만 상태 1일 이전까지 피더-프리 배양했다. 충만 상태 1일 이전의 인간 iPS 세포를, SB431542 (TGFβR 저해제, 5μM) 및 SAG (Shh 시그널 전달 경로 작용 물질, 300 nM) 의 존재 하에, 1일 동안 피더-프리 배양했다 (단계 1, 프리컨디셔닝: TGFβRi+SAG 처리).
상기 인간 iPS 세포를, TrypLE Select (Life Technologies) 를 사용하여 세포 분산액으로 처리하고, 피펫팅 작업에 의해 단일 세포에 추가 분산시키고, 상기 단일 세포에 분산된 인간 iPS 세포를 비세포-접착성 96-웰 배양 플레이트 (PrimeSurface 96V-바닥 플레이트, SUMITOMO BAKELITE 사제) 의 웰 마다, 하기 4 가지 조건, 즉 0.4 x 104, 0.8 x 104, 1.2 x 104, 또는 1.6 x 104 개의 세포로 100㎕ 의 무혈청 배지에 부유시키고, 37℃, 5% CO2 에서 부유 배양했다. 이를 위한 무혈청 배지 (gfCDM+KSR) 로서, F-12 배지와 IMDM 배지의 1:1 혼합물에 10% KSR, 450μM 1-모노티오글리세롤, 및 1 x 화학적으로 정의된 지질 농축물을 첨가한 무혈청 배지를 사용했다. 부유 배양 개시시 (부유 배양 개시 이후 0일째, 단계 2 개시) 에, 상기 무혈청 배지에 Y27632 (최종 농도 20μM) 및 SAG (Shh 시그널 전달 경로 작용 물질, 300 nM) 를 첨가했다. 부유 배양 개시 이후 2일째까지 1일 동안에, 세포 응집체가 형성되었다 (단계 2 종료, 단계 3 개시). 이 후 단계 3 에서, 부유 배양 개시 이후 3일째에, Y27632 및 SAG 를 포함하지 않고 인간 재조합 BMP4 를 최종 농도 1.5 nM 로 포함하는 무혈청 배지를 첨가했다. 부유 배양 개시 이후 6일째 또는 그 이후, 2~4일 마다 1회, Y27632, SAG 및 BMP 작용 물질을 포함하지 않는 상기 무혈청 배지로 배지의 반량을 교환했다.
부유 배양 개시 이후 18일째에 모든 조건 하에 세포 응집체가 형성되었고, 신경 조직이 형성되었다 (도 14, 상단). 상기 부유 배양 개시 이후 18일째의 세포 응집체를 각각 4% 파라-포름알데히드로 고정해, 동결 절편을 제조했다. 이들 동결 절편을, 망막 조직 마커의 하나인 Chx10 (항-Chx10 항체, Exalpha, 양), 또는 망막 조직 마커의 하나인 Rx (항-Rx항체, Takara, 기니피그) 에 대해 면역 염색하고, 형광 현미경 하에 관찰했다. 그 결과, 임의의 플레이팅된 세포 수 (0.4 x 104, 0.8 x 104, 1.2 x 104, 또는 1.6 x 104 개의 세포) 에서, 전체 세포 중 Chx10-양성 세포의 비율이 20% 이상임이 관찰되었다 (도 14, 중간, 오른쪽). 특히, 플레이팅된 세포 수가 0.8 x 104, 또는 1.2 x 104 개의 세포인 조건은, 특히 Chx10-양성 세포의 비율이 높았다. Rx-양성 세포의 비율의 결과는 Chx10 의 것과 동일하였다. 이 결과로부터, 단계 2 에서 플레이팅된 세포 수가 0.4 x 104 ~ 1.6 x 104 개의 세포인 조건 하에, 망막 조직을 제조할 수 있음이 밝혀졌다.
실시예 15: 단계 1 에서 TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질, Lefty, 단계 2 에서 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질, SAG 를 사용하는 것에 의한, 피더-프리 인간 iPS 세포로부터의 신경 조직의 형성 실시예
인간 iPS 세포 (1231A3 주, 쿄토 대학에서 입수) 를, "Scientific Reports, 4, 3594 (2014)" 에 기재된 방법에 따라 피더-프리 배양했다. 피더-프리 배지로서 StemFit 배지 (AK03, Ajinomoto Co., Inc. 사제) 를 사용하고, 피더-프리 스캐폴드로서 Laminin 511-E8 (Nippi, Inc. 사제) 를 사용했다.
실시예 1 에 기재된 방법에 따라, 인간 iPS 세포 (1231A3 주) 를 StemFit 배지에서 충만 상태 1일 이전까지 피더-프리 배양했다.
그 후, 하기 3 가지 조건 하에 1일 동안 피더-프리 배양했다.
● 조건 1: 인간 재조합 Lefty-A (Nodal/Activin 시그널 전달 경로 저해 물질, R&D 사제, Lefty-A C-terminus, 20㎍/ml)
● 조건 2: 인간 재조합 Lefty-A (Nodal/Activin 시그널 전달 경로 저해 물질, R&D 사제 Lefty-A C-terminus, 20㎍/ml) 및 SAG (Shh 시그널 전달 경로 작용 물질, 300 nM)
● 조건 3: 외인성 TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질 및 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하지 않음 (프리컨디셔닝하지 않음)
이에 따라 제조된 상기 조건 1-3 의 인간 iPS 세포를, TrypLE Select (Life Technologies 사제) 를 사용하여 세포 분산액으로 처리하고, 피펫팅 작업에 의해 단일 세포에 추가 분산시키고, 상기 단일 세포에 분산된 인간 iPS 세포를 비세포-접착성 96-웰 배양 플레이트 (PrimeSurface 96V-바닥 플레이트, SUMITOMO BAKELITE 사제) 의 웰 마다 1.2 x 104 개의 세포로 100㎕ 의 무혈청 배지에 부유시키고, 37℃, 5% CO2 에서 부유 배양했다. 이를 위한 무혈청 배지 (gfCDM+KSR) 로서, F-12 배지와 IMDM 배지의 1:1 혼합물에 10% KSR, 450μM 1-모노티오글리세롤, 1 x 화학적으로 정의된 지질 농축물을 첨가한 무혈청 배지를 사용했다.
부유 배양 개시시 (부유 배양 개시 이후 0일째, 단계 2 개시) 에, 이하 조건 1 및 2 를 포함하는 2 가지 조건 하에 세포를 배양했다. 조건 1 (+SAG) 로서, 부유 배양 개시시에 상기 무혈청 배지에 Y27632 (최종 농도 20μM) 및 SAG (Shh 시그널 전달 경로 작용 물질, 300 nM) 를 첨가했다. 조건 2 (-SAG) 로서, 부유 배양 개시시에, 상기 무혈청 배지에 Y27632 (최종 농도 20μM) 를 첨가하고 SAG는 첨가하지 않았다. 부유 배양 개시 이후 2일째까지, 모든 조건 하에 세포 응집체가 형성되었다 (단계 2 종료, 단계 3 개시). 부유 배양 개시 이후 3일째에, 외인성 인간 재조합 BMP4 의 최종 농도가 1.5 nM (55 ng/ml) 이도록, Y27632, SAG 를 포함하지 않고 인간 재조합 BMP4 (R&D 사제) 를 포함하는 배지 (50㎕) 를 첨가했다. 부유 배양 개시 이후 6일째에, Y27632, SAG 및 인간 재조합 BMP4 를 포함하지 않는 무혈청 배지로 배지의 반량을 교환했다. 그 후, 2~4일 마다 1회 Y27632, SAG, 및 인간 재조합 BMP4 를 포함하지 않는 상기 무혈청 배지로 배지의 반량을 교환했다.
이에 따라 제조된 세포를 부유 배양 개시 이후 18일째에, 도립 현미경 (KEYENCE) 하에 명시야 관찰했다 (도 15). 그 결과, 단계 1 에서 프리컨디셔닝하지 않고 단계 2 에서 SAG 를 첨가하지 않은 조건 하에, 세포 응집체가 붕괴하고, 신경 조직이 형성되지 않음이 밝혀졌다 (도 15, A). 다른 한편으로는, 단계 1 에서 Nodal/Activin 시그널 전달 경로 저해 물질, 또는 Nodal/Activin 시그널 전달 경로 저해 물질 및 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질로 프리컨디셔닝하고, 단계 2 에서 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질을 첨가하거나 첨가하지 않은 조건 하에, 세포 응집체가 형성되고 효율적으로 신경 조직이 형성됨이 밝혀졌다 (도 15, B, C, D).
이들 결과로부터, 심지어 TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질로서 Nodal/Activin 시그널 전달 경로 저해 물질, Lefty 로 프리컨디셔닝하는 것을 포함하는 조건 하에서도, 피더-프리 인간 iPS 세포로부터 고품질 응집체가 형성되고, 신경 표피의 제조 효율이 향상됨이 밝혀졌다.
실시예 16: 단계 1 에서 TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질, A83-01, 및 단계 2 에서 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질, SAG 를 사용한, 피더-프리 인간 iPS 세포로부터의 신경 조직 및 망막 조직의 형성 실시예
인간 iPS 세포 (1231A3 주, 쿄토 대학에서 입수) 를, "Scientific Reports, 4, 3594 (2014)" 에 기재된 방법에 따라 피더-프리 배양했다. 피더-프리 배지로서, StemFit 배지 (AK03, Ajinomoto Co., Inc. 사제) 를 사용하고, 피더-프리 스캐폴드로서 Laminin 511-E8 (Nippi, Inc. 사제) 를 사용했다.
실시예 15 에 기재된 방법에 따라 제조한 충만 상태 1일 이전의 인간 iPS 세포를, A83-01 (Wako 사제, TGFβR 저해제, 0.5μM) 의 존재 하에 (프리컨디셔닝 처리) 또는 부재 하에 (단계 1: 프리컨디셔닝하지 않음), 1일 동안 피더-프리 배양했다.
상기 인간 iPS 세포를, TrypLE Select (Life Technologies 사제) 를 사용하여 세포 분산액으로 처리하고, 피펫팅 작업에 의해 단일 세포로 추가 분산시키고, 상기 단일 세포에 분산된 인간 iPS 세포를 비세포-접착성 96-웰 배양 플레이트 (PrimeSurface 96V-바닥 플레이트, SUMITOMO BAKELITE 사제) 의 웰 마다 1.0 x 104 개의 세포로 100㎕ 의 무혈청 배지에 부유시키고, 37℃, 5% CO2 에서 부유 배양했다. 이를 위한 무혈청 배지 (gfCDM+KSR) 로서, F-12 배지와 IMDM 배지의 1:1 혼합물에10% KSR, 450μM 1-모노티오글리세롤, 1 x 화학적으로 정의된 지질 농축물을 첨가한 무혈청 배지를 사용했다.
부유 배양 개시시 (부유 배양 개시 이후 0일째, 단계 2 개시) 에, 하기 조건 1 및 조건 2 를 포함하는 2 가지 조건 하에 배양했다. 조건 1 (+SAG) 로서 부유 배양 개시시에, 상기 무혈청 배지에 Y27632 (최종 농도 20μM) 및 SAG (Shh 시그널 전달 경로 작용 물질, 최종 농도 30 nM) 를 첨가했다. 조건 2 (-SAG) 로서 부유 배양 개시시에, 상기 무혈청 배지에 Y27632 (최종 농도 20μM) 를 첨가했고, SAG 는 첨가하지 않았다. 부유 배양 개시 이후 2일째까지, 모든 조건 하에 세포 응집체가 형성되었다 (단계 2 종료, 단계 3 개시). 부유 배양 개시 이후 3일째에, 외인성 인간 재조합 BMP4 의 최종 농도가 1.5 nM (55 ng/ml) 이도록, Y27632, SAG 를 포함하지 않고 인간 재조합 BMP4 (R&D 사제) 를 포함하는 배지 (50㎕) 를 첨가했다. 부유 배양 개시 이후 6일째에, Y27632, SAG, 및 인간 재조합 BMP4 를 포함하지 않는 무혈청 배지로, 배지의 반량을 교환했다. 그 후, 2~4일 마다 1회, Y27632, SAG, 및 인간 재조합 BMP4 를 포함하지 않는 상기 무혈청 배지로 배지의 반량을 교환했다.
이에 따라 제조된 세포를 부유 배양 개시 이후 20일째에, 도립 현미경 (KEYENCE) 하에 명시야 관찰했다 (도 16, A-B). 그 결과, 단계 1 에서 프리컨디셔닝하지 않고 단계 2 에서 SAG 를 첨가하지 않은 조건 하에, 세포 응집체가 붕괴하고 신경 조직이 형성되지 않음이 밝혀졌다 (도 16, A). 다른 한편으로는, 단계 1 에서 A83-01 로 프리컨디셔닝하고, 단계 2 에서 SAG 를 첨가한 조건 하에, 세포 응집체가 형성되고 효율적으로 신경 조직이 형성될 수 있음이 밝혀졌다 (도 16, B).
부유 배양 개시 이후 20일째에 세포 응집체를, 4% 파라-포름알데히드로 고정해, 동결 절편을 제조했다. 이들 동결 절편을, 망막 조직 마커의 하나인 Chx10 (항-Chx10 항체, Exalpha 사제, 양) 에 대해 면역 염색하고, 형광 현미경 하에 관찰했다. 그 결과, 단계 1 이 A83-01 로 프리컨디셔닝하는 것을 포함하고, 단계 2 가 SAG 를 첨가하는 것을 포함할 때, 전체 세포 중의 Chx10-양성 세포의 비율이 약 20% 임이 확인되었다 (도 16, C).
이들 결과로부터, 단계 1 에서 TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질로서 TGFβR 저해제, A83-01 로 프리컨디셔닝하고, 단계 2 에서 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질을 첨가하는 것을 포함하는 조건 하에, 망막 조직을 제조할 수 있음이 확인되었다.
실시예 17: 단계 1 에서 TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질, A83-01, 또는 TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질 (A83-01) 및 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질 (SAG, 퍼모파민, 또는 인간 재조합 Shh) 의 조합을 사용하고, 단계 2 에서 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질을 사용한, 피더-프리 인간 iPS 세포로부터의 신경 조직의 형성 실시예
인간 iPS 세포 (1231A3 주, 쿄토 대학에서 입수) 를, "Scientific Reports, 4, 3594 (2014)" 에 기재된 방법에 따라 피더-프리 배양했다. 피더-프리 배지로서 StemFit 배지 (AK03, Ajinomoto Co., Inc. 사제) 를 사용하고, 피더-프리 스캐폴드로서 Laminin 511-E8 (Nippi, Inc. 사제) 를 사용했다.
실시예 15 에 기재된 방법에 따라 제조한 충만 상태 1일 이전의 인간 iPS 세포를, 하기 6 가지 조건 하에 1일 동안 피더-프리 배양했다.
● 조건 1: A83-01 (Wako 사제, TGFβR 저해제, 0.5μM)
● 조건 2: A83-01 (Wako 사제, TGFβR 저해제, 0.5μM) 및 SAG (Enzo 사제, Shh 시그널 전달 경로 작용 물질, 300 nM)
● 조건 3: A83-01 (Wako 사제, TGFβR 저해제, 0.5μM) 및 퍼모파민 (Wako 사제, Shh 시그널 전달 경로 작용 물질, 0.2μM)
● 조건 4: A83-01 (Wako 사제, TGFβR 저해제, 0.5μM) 및 인간 재조합 Shh (R&D 사제, Shh 시그널 전달 경로 작용 물질, 50 ng/ml)
● 조건 5: A83-01 (Wako 사제, TGFβR 저해제 0.5μM) 및 인간 재조합 Shh (R&D 사제, Shh 시그널 전달 경로 작용 물질, 300 ng/ml)
● 조건 6: 외인성 TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질 및 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하지 않음 (프리컨디셔닝하지 않는 조건)
상기 인간 iPS 세포를 TrypLE Select (Life Technologies 사제) 를 사용하여 세포 분산액으로 처리하고, 피펫팅 작업에 의해 단일 세포로 추가 분산시키고, 상기 단일 세포에 분산된 인간 iPS 세포를 비세포-접착성 96-웰 배양 플레이트 (PrimeSurface 96V-바닥 플레이트, SUMITOMO BAKELITE 사제) 의 웰 마다 1.0 x 104 개의 세포로 100㎕ 의 무혈청 배지에 부유시키고, 37℃, 5% CO2 에서 부유 배양했다. 이를 위한 무혈청 배지 (gfCDM+KSR) 로서, F-12 배지와 IMDM 배지의 1:1 혼합물에10% KSR, 450μM 1-모노티오글리세롤, 1 x 화학적으로 정의된 지질 농축물을 첨가한 무혈청 배지를 사용했다.
부유 배양 개시시 (부유 배양 개시 이후 0일째, 단계 2 개시) 에, 하기 조건 (A) 및 조건 (B) 의 2 가지 조건 하에 세포를 배양했다. 조건(A) (+SAG) 로서, 부유 배양 개시시에 상기 무혈청 배지에 Y27632 (최종 농도 20μM) 및 SAG (Shh 시그널 전달 경로 작용 물질, 30 nM) 를 첨가했다. 조건(B) (-SAG) 로서 부유 배양 개시시에, 상기 무혈청 배지에 Y27632 (최종 농도 20μM) 를 첨가했고, SAG 는 첨가하지 않았다.
부유 배양 개시 이후 2일째까지, 모든 조건 하에 세포 응집체가 형성되었다 (단계 2 종료, 단계 3 개시). 부유 배양 개시 이후 3일째에, 외인성 인간 재조합 BMP4 의 최종 농도가 1.5 nM (55 ng/ml) 이도록, Y27632, SAG, 퍼모파민, 인간 재조합 Shh 를 포함하지 않고 인간 재조합 BMP4 (R&D 사제) 를 포함하는 배지 (50㎕) 를 첨가했다. 부유 배양 개시 이후 6일째에, Y27632, SAG, 퍼모파민, 인간 재조합 Shh, 및 인간 재조합 BMP4 를 포함하지 않는 무혈청 배지로, 배지의 반량을 교환했다. 그 후, 2~4일 마다 1회 Y27632, SAG, 퍼모파민, 인간 재조합 Shh, 및 인간 재조합 BMP4 를 포함하지 않는 상기 무혈청 배지로, 배지의 반량을 교환했다.
이에 따라 제조된 세포를 부유 배양 개시 이후 20일째에, 도립 현미경 (KEYENCE) 하에 명시야 관찰했다 (도 17). 그 결과 상기 조건 6, 단계 1 에서 프리컨디셔닝하지 않고 단계 2 에서 SAG 를 첨가하지 않은 조건 하에, 세포 응집체가 붕괴하고 신경 조직이 형성되지 않음이 밝혀졌다 (도 17, A). 다른 한편으로는, 상기 조건 1－5, 단계 1 에서 A83-01 및 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질 (SAG, PMA, 인간 재조합 Shh 50 ng/ml, 인간 재조합 Shh 300 ng/ml) 을 첨가하고, 단계 2 에서 SAG 를 첨가하는 것을 포함하는 조건 (조건(A) (+SAG)) 하에, 세포 응집체가 형성되고 효율적으로 신경 조직이 형성됨이 밝혀졌다 (도 17, B-F).
이들 결과로부터, 단계 1 에서 TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질 (A83-01), 또는 TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질 (A83-01) 및 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질 (SAG, PMA, 인간 재조합 Shh 중 어느 하나) 을 사용하여 프리컨디셔닝하는 조건 하에, 피더-프리-배양한 인간 iPS 세포로부터 효율적으로 신경 조직을 제조할 수 있음이 밝혀졌다.
실시예 18: 단계 1 에서 TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질 및 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질, 단계 2 에서 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질 (SAG, 퍼모파민, 또는 인간 재조합 Shh 중 어느 하나) 을 사용한, 피더-프리 인간 iPS 세포로부터의 망막 조직의 형성 예
인간 iPS 세포 (1231A3 주, 쿄토 대학에서 입수) 를, "Scientific Reports, 4, 3594 (2014)" 에 기재된 방법에 따라 피더-프리 배양했다. 피더-프리 배지로서 StemFit 배지 (AK03, Ajinomoto Co., Inc. 사제) 를 사용하고, 피더-프리 스캐폴드로서 Laminin 511-E8 (Nippi, Inc. 사제) 를 사용했다.
실시예 15 에 기재된 방법에 따라 제조한 충만 상태 1일 이전의 인간 iPS 세포를, A83-01 (Wako 사제, TGFβR 저해제 0.5μM) 및 SAG (Shh 시그널 전달 경로 작용 물질, 300 nM) 의 존재 하에 (프리컨디셔닝 처리) 또는 부재 하에 (단계 1: 프리컨디셔닝하지 않음), 1일 동안 피더-프리 배양했다.
상기 인간 iPS 세포를, TrypLE Select (Life Technologies) 를 사용하여 세포 분산액으로 처리하고, 피펫팅 작업에 의해 단일 세포로 추가 분산시키고, 상기 단일 세포에 분산된 인간 iPS 세포를 비세포-접착성 96-웰 배양 플레이트 (PrimeSurface 96V-바닥 플레이트, SUMITOMO BAKELITE 사제) 의 웰 마다 1.0 x 104 개의 세포로 100㎕ 의 무혈청 배지에 부유시키고, 37℃, 5% CO2 에서 부유 배양했다. 이를 위한 무혈청 배지 (gfCDM+KSR) 로서, F-12 배지와 IMDM 배지의 1:1 혼합물에10% KSR, 450μM 1-모노티오글리세롤, 1 x 화학적으로 정의된 지질 농축물을 첨가한 무혈청 배지를 사용했다.
단계 1 에서 얻어진 세포를 이용해, 단계 2 로서 하기 조건 하에 부유 배양을 개시했다. 임의의 조건에서, Y27632 (최종 농도 20μM) 를 첨가한 상기 무혈청 배지를 사용했다.
● 조건 1: SAG (Enzo 사제, Shh 시그널 전달 경로 작용 물질, 30 nM) 를 첨가했다.
● 조건 2: 퍼모파민 (Wako 사제, Shh 시그널 전달 경로 작용 물질, 0.2μM) 를 첨가했다.
● 조건 3: 인간 재조합 Shh (R&D 사제, Shh 시그널 전달 경로 작용 물질, 300 ng/ml) 를 첨가했다.
● 조건 4: 부유 배양 개시시에 외인성 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질은 첨가하지 않았다.
부유 배양 개시 이후 2일째까지, 임의의 조건 하에 세포 응집체가 형성되었다 (단계 2 종료, 단계 3 개시). 부유 배양 개시 이후 3일째에, 외인성 인간 재조합 BMP4 의 최종 농도가 1.5 nM (55 ng/ml) 이도록, Y27632, SAG, 퍼모파민 및 인간 재조합 Shh 를 포함하지 않고 인간 재조합 BMP4 (R&D 사제) 를 포함하는 배지 (50㎕) 를 첨가했다. 부유 배양 개시 이후 6일째에, Y27632, SAG, 퍼모파민, 인간 재조합 Shh 및 인간 재조합 BMP4 를 포함하지 않는 무혈청 배지로, 배지의 반량을 교환했다. 그 후, 2~4일 마다 1회 Y27632, SAG, 및 인간 재조합 BMP4 를 포함하지 않는 상기 무혈청 배지로 배지의 반량을 교환했다.
이에 따라 제조된 세포를 부유 배양 개시 이후 20일째에, 도립 현미경 (KEYENCE) 하에 명시야 관찰했다 (도 18, A-E). 그 결과, 단계 1 에서 프리컨디셔닝하지 않고 단계 2 에서 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질을 첨가하지 않은 조건 (상기 조건 4) 하에, 세포 응집체가 붕괴하고 신경 조직이 형성되지 않음이 밝혀졌다 (도 18, A). 다른 한편으로는, 단계 1 에서 A83-01 및 SAG 로 프리컨디셔닝하고, 단계 2 에서 외인성 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질을 첨가하지 않거나 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질로서 SAG, 퍼모파민 (PMA) 또는 인간 재조합 Shh 중 어느 하나를 첨가하는 것을 포함하는 조건 하에, 세포 응집체가 형성되고 효율적으로 신경 조직이 형성됨이 확인되었다 (도 18, B-E).
이들 결과로부터, 단계 1 에서 TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질 및 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질로 프리컨디셔닝하고, 부유 배양 개시시에 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질로서 SAG, 퍼모파민, 또는 인간 재조합 Shh 중 어느 하나를 첨가하는 것을 포함하는 조건 하에, 피더-프리 인간 iPS 세포로부터 효율적으로 신경 조직을 제조할 수 있음이 밝혀졌다.
부유 배양 개시 이후 20일째의 세포 응집체를 4% 파라-포름알데히드로 고정하여, 동결 절편을 제조했다. 이들 동결 절편을, 망막 조직 마커의 하나인 Chx10 (항-Chx10 항체, Exalpha 사제, 양) 에 대해 면역 염색하고, 형광 현미경 하에 관찰했다. 그 결과, 단계 1 이 A83-01 및 SAG 로 프리컨디셔닝하는 것을 포함하고, 단계 2 가 외인성 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질을 첨가하지 않는 것을 포함하는 조건 하에, 전체 세포 중의 Chx10-양성 세포의 비율은 약 40% 였음이 밝혀졌다 (도 18, F). 다른 한편으로는, 단계 1 에서 A83-01 및 SAG 로 프리컨디셔닝하고, 부유 배양 개시시에 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질로서 SAG, 퍼모파민, 또는 인간 재조합 Shh 중 어느 하나를 첨가하는 것을 포함하는 조건 하에, 전체 세포 중 Chx10-양성 세포의 비율은 약 90% 임이 확인되었다 (도 18, G-I).
이들 결과로부터, 단계 1 에서 TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질 및 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질로 프리컨디셔닝하고, 단계 2 에서 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질로서 SAG, 퍼모파민, 또는 인간 재조합 Shh 중 어느 하나를 첨가하는 것을 포함하는 조건 하에, 피더-프리 인간 iPS 세포로부터 효율적으로 망막 조직을 제조할 수 있음이 밝혀졌다.
실시예 19: 단계 1 에서 TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질, SB431542 및 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질, 퍼모파민, 및 단계 2 에서 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질, 퍼모파민을 사용한, 피더-프리 인간 iPS 세포로부터의 망막 조직의 형성 실시예
인간 iPS 세포 (1231A3 주, 쿄토 대학에서 입수) 를, "Scientific Reports, 4, 3594 (2014)" 에 기재된 방법에 따라 피더-프리 배양했다. 피더-프리 배지로서 StemFit 배지 (AK03, Ajinomoto Co., Inc. 사제) 를 사용하고, 피더-프리 스캐폴드로서 Laminin 511-E8 (Nippi, Inc. 사제) 를 사용했다.
실시예 15 에 기재된 방법에 따라 제조한 충만 상태 1일 이전의 인간 iPS 세포를, SB431542 (TGFβR 저해제, 5μM) 및 퍼모파민 (PMA; Shh 시그널 전달 경로 작용 물질, 0.02μM 또는 0.2μM) 의 존재 하에, 1일 동안 피더-프리 배양했다.
상기 인간 iPS 세포를, TrypLE Select (Life Technologies) 를 사용하여 세포 분산액으로 처리하고, 피펫팅 작업에 의해 단일 세포로 추가 분산시키고, 상기 단일 세포에 분산된 인간 iPS 세포를 비세포-접착성 96-웰 배양 플레이트 (PrimeSurface 96V-바닥 플레이트, SUMITOMO BAKELITE 사제) 의 웰 마다 1.0 x 104 개의 세포로 100㎕ 의 무혈청 배지에 부유시키고, 37℃, 5% CO2 에서 부유 배양했다. 이를 위한 무혈청 배지 (gfCDM+KSR) 로서, F-12 배지와 IMDM 배지의 1:1 혼합물에10% KSR, 450μM 1-모노티오글리세롤 및 1 x 화학적으로 정의된 지질 농축물을 첨가한 무혈청 배지를 사용했다.
부유 배양 개시시 (부유 배양 개시 이후 0일째, 단계 2 개시) 에, 상기 무혈청 배지에 Y27632 (20μM) 및 퍼모파민 (Wako 사제, Shh 시그널 전달 경로 작용 물질, 0.2μM 또는 2μM) 을 첨가했다 (도 19). 부유 배양 개시 이후 2일째까지, 세포 응집체가 형성되었다 (단계 2 종료, 단계 3 개시). 부유 배양 개시 이후 3일째에, 외인성 인간 재조합 BMP4 의 최종 농도가 1.5 nM (55 ng/ml) 이도록, Y27632 및 퍼모파민을 포함하지 않고 인간 재조합 BMP4 (R&D 사제) 를 포함하는 배지 (50㎕) 를 첨가했다. 부유 배양 개시 이후 6일째에, Y27632, 퍼모파민, 및 인간 재조합 BMP4 를 포함하지 않는 무혈청 배지로, 배지의 반량을 교환했다. 그 후, 2~4일 마다 1회, Y27632, 퍼모파민, 및 인간 재조합 BMP4 를 포함하지 않는 상기 무혈청 배지로, 배지의 반량을 교환했다.
이에 따라 제조된 세포를 부유 배양 개시 이후 17일째에, 도립 현미경 (KEYENCE 사제) 하에 명시야 관찰했다 (도 19, A-D). 그 결과, 단계 1 에서 SB431542 및 퍼모파민 (0.02μM 또는 0.2μM) 에서 프리컨디셔닝하고, 단계 2 에서 퍼모파민 (0.2μM 또는 2μM) 을 첨가하는 것을 포함하는 조건 하에, 임의의 퍼모파민 농도에서 세포 응집체가 형성되고 효율적으로 신경 조직이 형성될 수 있음이 확인되었다 (도 19, A-D).
부유 배양 개시 이후 17일째의 세포 응집체를, 4% 파라-포름알데히드로 고정해, 동결 절편을 제조했다. 이들 동결 절편을, 망막 조직 마커의 하나인 Chx10 (항-Chx10 항체, Exalpha 사제, 양) 에 대해 면역 염색했다. 이들 면역 염색된 절편을 도립 형광 현미경 하에 관찰했다. 그 결과, 단계 1 에서 SB431542 및 퍼모파민 (0.02μM 또는 0.2μM) 으로 프리컨디셔닝하고, 단계 2 에서 퍼모파민 (0.2μM 또는 2μM) 을 첨가하는 것을 포함하는 조건 하에, 임의의 퍼모파민 농도 에서 전체 세포 중 Chx10-양성 세포의 비율이 약 60% 임이 밝혀졌다 (도 19, E-H).
이들 결과로부터, 단계 1 에서 TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질, SB431542 및 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질, 퍼모파민을 사용하여 프리컨디셔닝하고, 부유 배양 개시시에 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질 (퍼모파민) 을 첨가하는 것을 포함하는 조건 하에, 피더-프리 인간 iPS 세포로부터 효율적으로 망막 조직을 제조할 수 있음이 밝혀졌다.
실시예 20: 단계 1 에서 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질, 또는 TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질 및 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질의 조합으로, 1, 2 또는 3일 동안 프리컨디셔닝함에 의한, 피더-프리 인간 iPS 세포로부터의 신경 조직의 형성 실시예
인간 iPS 세포 (1231A3 주, 쿄토 대학에서 입수) 를, "Scientific Reports, 4, 3594 (2014)" 에 기재된 방법에 따라 피더-프리 배양했다. 피더-프리 배지로서 StemFit 배지 (AK03, Ajinomoto Co., Inc. 사제) 을 사용했고, 피더-프리 스캐폴드로서 Laminin 511-E8(Nippi, Inc. 사제) 를 사용했다.
상기 인간 iPS 세포를, 하기 6 가지 조건 하에 피더-프리 배양했다.
● 조건 1: SAG (Enzo 사제, Shh 시그널 전달 경로 작용 물질, 300 nM), 48시간
● 조건 2: SAG (Enzo 사제, Shh 시그널 전달 경로 작용 물질, 300 nM), 72시간
● 조건 3: A83-01 (Wako 사제, TGFβR 저해제, 0.5μM) 및 SAG (Enzo 사제, Shh 시그널 전달 경로 작용 물질, 300 nM), 24시간
● 조건 4: A83-01 (Wako 사제, TGFβR 저해제, 0.5μM) 및 SAG (Enzo 사제, Shh 시그널 전달 경로 작용 물질, 300 nM), 48시간
● 조건 5: A83-01 (Wako 사제, TGFβR 저해제, 0.5μM) 및 SAG (Enzo 사제, Shh 시그널 전달 경로 작용 물질, 300 nM), 72시간
● 조건 6: 외인성의 TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질 및 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하지 않음 (프리컨디셔닝하지 않음)
상기 인간 iPS 세포를, TrypLE Select (Life Technologies) 를 사용하여 세포 분산액으로 처리하고, 피펫팅 작업에 의해 단일 세포로 추가 분산시키고, 상기 단일 세포에 분산된 인간 iPS 세포를 비세포-접착성 96-웰 배양 플레이트 (PrimeSurface 96V-바닥 플레이트, SUMITOMO BAKELITE 사제) 의 웰 마다 1.0 x 104 개의 세포로 100㎕ 의 무혈청 배지에 부유시키고, 37℃, 5% CO2 에서 부유 배양했다. 이를 위한 무혈청 배지 (gfCDM+KSR) 로서, F-12 배지와 IMDM 배지의 1:1 혼합물에10% KSR, 450μM 1-모노티오글리세롤, 및 1 x 화학적으로 정의된 지질 농축물을 첨가한 무혈청 배지를 사용했다.
부유 배양 개시시 (부유 배양 개시 이후 0일째, 단계 2 개시) 에, 하기 조건 (A) 및 조건 (B) 를 포함하는 2 가지 조건 하에 배양했다. 조건(A) 로서, 부유 배양 개시시에 상기 무혈청 배지에 Y27632 (최종 농도 20μM) 및 SAG (Shh 시그널 전달 경로 작용 물질, 30 nM) 를 첨가했다. 조건(B) 로서, 부유 배양 개시시에 상기 무혈청 배지에 Y27632 (최종 농도 20μM) 를 첨가하고 SAG는 첨가하지 않았다. 부유 배양 개시 이후 2일째까지, 모든 조건 하에 세포 응집체가 형성되었다 (단계 2 종료, 단계 3 개시). 부유 배양 개시 이후 3일째에, 외인성 인간 재조합 BMP4 의 최종 농도가 1.5 nM (55 ng/ml) 이도록, Y27632 및 SAG 를 포함하지 않고 인간 재조합 BMP4 (R&D 사제) 를 포함하는 배지 (50㎕) 를 첨가했다. 부유 배양 개시 이후 6일째에, Y27632, SAG, 및 인간 재조합 BMP4 를 포함하지 않는 무혈청 배지로, 배지의 반량을 교환했다. 그 후, 2~4일 마다 1회, Y27632, SAG 및 인간 재조합 BMP4 를 포함하지 않는 상기 무혈청 배지로, 배지의 반량을 교환했다.
이에 따라 제조된 세포를 부유 배양 개시 이후 17일째에, 도립 현미경 (KEYENCE) 하에, 명시야 관찰했다 (도 20, A-J). 그 결과, 단계 1 에서 프리컨디셔닝하지 않고, 단계 2 에서 SAG 를 첨가하지 않은 조건 하에, 세포 응집체가 붕괴하고 신경 조직이 형성되지 않음이 밝혀졌다 (도 20, A). 다른 한편으로는, 단계 1 에서 SAG 로 48 또는 72 시간 동안 프리컨디셔닝하고, 단계 2 에서 SAG 를 첨가한 경우 (조건 (A)) 및 첨가하지 않은 경우 (조건(B)), 세포 응집체가 형성되고, 효율적으로 신경 조직이 형성될 수 있음이 관찰되었다 (도 20, B-D). 또한, 단계 1 에서 A83-01 및 SAG 로 24, 48 또는 72 시간 동안 프리컨디셔닝하고, 단계 2 에서 SAG 를 첨가한 경우 (조건 (A)) 및 첨가하지 않은 경우 (조건 (B)), 세포 응집체가 형성되고 효율적으로 신경 조직이 형성됨이 확인되었다 (도 20, E-J).
이들 결과로부터, 단계 1 에서 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질로 48 또는 72 시간 동안 프리컨디셔닝하는 것을 포함하는 조건, 및 단계 1 에서 TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질 및 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질로 24, 48 또는 72시간 동안 프리컨디셔닝하는 것을 포함하는 조건 하에, 피더-프리 인간 iPS 세포로부터 효율적으로 신경 조직을 제조할 수 있음이 밝혀졌다.
실시예 21: 단계 1 에서 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질로 24, 48, 72, 96, 120 또는 144 시간 동안, 그리고 마지막 24 시간 동안은 TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질 및 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질의 공존 하에서 프리컨디셔닝함에 의한, 피더-프리 인간 iPS 세포로부터의 신경 조직의 형성 실시예
인간 iPS 세포 (1231A3 주, 쿄토 대학에서 입수) 를, "Scientific Reports, 4, 3594 (2014)" 에 기재된 방법에 따라 피더-프리 배양했다. 피더-프리 배지로서 StemFit 배지 (AK03, Ajinomoto Co., Inc. 사제) 를 사용하고, 피더-프리 스캐폴드로서 Laminin 511-E8 (Nippi, Inc. 사제) 를 사용했다.
SAG (Shh 시그널 전달 경로 작용 물질, 300 nM) 의 존재 하에 (프리컨디셔닝 처리), 인간 iPS 세포의 피더-프리 배양을 개시했다. SAG 존재 하에서의 배양을 24, 48, 72, 96, 120 또는 144 시간 동안 계속하고, 마지막 24시간 동안은 A83-01 (Wako 사제, TGFβR 저해제, 0.5μM) 및 SAG 의 공존 하에 실시했다.
상기 인간 iPS 세포를, TrypLE Select (Life Technologies) 를 사용하여 세포 분산액으로 처리하고, 피펫팅 작업에 의해 단일 세포로 추가 분산시키고, 상기 단일 세포에 분산된 인간 iPS 세포를 비세포-접착성 96-웰 배양 플레이트 (PrimeSurface 96V-바닥 플레이트, SUMITOMO BAKELITE 사제) 의 웰 마다 1.0 x 104 개의 세포로 100㎕ 의 무혈청 배지에 부유시키고, 37℃, 5% CO2 에서 부유 배양했다. 이를 위한 무혈청 배지 (gfCDM+KSR) 로서, F-12 배지와 IMDM 배지의 1:1 혼합물에10% KSR, 450μM 1-모노티오글리세롤, 및 1 x 화학적으로 정의된 지질 농축물을 첨가한 무혈청 배지를 사용했다.
부유 배양 개시시 (부유 배양 개시 이후 0일째, 단계 2 개시) 에, 하기 조건 (A) 및 조건 (B) 를 포함하는 2 가지 조건으로 배양했다. 조건(A) 로서, 부유 배양 개시시에 상기 무혈청 배지에 Y27632 (최종 농도 20μM) 및 SAG (Shh 시그널 전달 경로 작용 물질, 30 nM) 를 첨가했다. 조건(B) 로서, 부유 배양 개시시에 상기 무혈청 배지에 Y27632 (최종 농도 20μM) 를 첨가하고, SAG 는 첨가하지 않았다. 부유 배양 개시 이후 2일째까지, 모든 조건 하에 세포 응집체가 형성되었다 (단계 2 종료, 단계 3 개시). 부유 배양 개시 이후, 3일째에 Y27632 및 SAG 를 포함하지 않는 무혈청 배지 (50㎕) 를 첨가했다.
부유 배양 개시 이후 6일째 또는 그 이후, 2~4일 마다 1회 Y27632, SAG, 및 인간 재조합 BMP4 를 포함하지 않는 상기 무혈청 배지로, 배지의 반량을 교환했다.
이에 따라 제조된 세포를 부유 배양 개시 이후 16일째에, 도립 현미경 (KEYENCE) 하에 명시야 관찰했다. 그 결과, 단계 1 에서 SAG 로 24~144 시간 동안, 그리고 마지막 24 시간 동안은 A83-01 및 SAG 의 공존 하에서 프리컨디셔닝하는 것을 포함하는 임의의 조건 하에, 세포 응집체가 성장하고 효율적으로 신경 조직이 형성됨이 밝혀졌다 (도 21, A-L).
이들 결과로부터, 단계 1 에서의 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질로 24~144 시간 동안 프리컨디셔닝하는 것을 포함하는 임의의 조건 하에, 피더-프리 인간 iPS 세포로부터 효율적으로 신경 조직을 제조할 수 있음이 밝혀졌다.
실시예 22: 단계 1 에서 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질로 2일 동안 프리컨디셔닝하고, 단계 2 에서 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질을 이용하고, 단계 3 에서 BMP 작용 물질을 1 회 또는 복수 회 첨가함에 의한, 피더-프리 인간 iPS 세포로부터의 망막 조직의 형성 실시예
인간 iPS 세포 (Ff-I01 주, 쿄토 대학에서 입수) 를, "Scientific Reports, 4, 3594 (2014)" 에 기재된 방법에 따라 피더-프리 배양했다. 피더-프리 배지로서 StemFit 배지 (AK03, Ajinomoto Co., Inc. 사제) 를 사용했고, 피더-프리 스캐폴드로서 Laminin 511-E8 (Nippi, Inc. 사제) 를 사용했다.
충만 상태 2일전의 인간 iPS 세포를, SAG (Shh 시그널 전달 경로 작용 물질, 300 nM) 의 존재 하에 (프리컨디셔닝 처리), 2일 동안 피더-프리 배양했다.
상기 인간 iPS 세포를, TrypLE Select (Life Technologies) 를 사용하여 세포 분산액으로 처리하고, 피펫팅 작업에 의해 단일 세포로 추가 분산시키고, 상기 단일 세포에 분산된 인간 iPS 세포를 비세포-접착성 96-웰 배양 플레이트 (PrimeSurface 96V-바닥 플레이트, SUMITOMO BAKELITE 사제) 의 웰 마다 1.0 x 104 개의 세포로 100㎕ 의 무혈청 배지에 부유시키고, 37℃, 5% CO2 에서 부유 배양했다. 이를 위한 무혈청 배지 (gfCDM+KSR) 로서, F-12 배지와 IMDM 배지의 1:1 혼합물에10% KSR, 450μM 1-모노티오글리세롤, 및 1 x 화학적으로 정의된 지질 농축물을 첨가한 무혈청 배지를 사용했다.
부유 배양 개시시 (부유 배양 개시 이후 0일째, 단계 2 개시) 에, 상기 무혈청 배지에 Y27632 (최종 농도 20μM) 및 SAG (Shh 시그널 전달 경로 작용 물질, 300 nM) 를 첨가했다 (도 22). 부유 배양 개시 이후 2일째까지, 임의의 조건 하에 세포 응집체가 형성되었다 (단계 2 종료, 단계 3 개시). 부유 배양 개시 이후 3일째 또는 그 이후, 하기의 조건 1-3 을 포함하는 3 가지 조건 하에 BMP4 를 첨가했다.
● 조건 1: (+BMP4 1회 첨가) 부유 배양 3일째에, 외인성 인간 재조합 BMP4 의 최종 농도가 1.5 nM (55 ng/ml) 이도록, Y27632 및 SAG 를 포함하지 않고 인간 재조합 BMP4 (R&D 사제) 를 포함하는 배지 (50㎕) 를 첨가했다. 부유 배양 개시 6일째 또는 그 이후, Y27632, SAG 및 인간 재조합 BMP4 를 포함하지 않는 무혈청 배지로, 배지의 반량을 교환했다.
● 조건 2: (+BMP4 2회 첨가) 부유 배양 3일째에, 외인성 인간 재조합 BMP4 의 최종 농도가 1.5 nM (55 ng/ml) 이도록, Y27632, SAG 를 포함하지 않고 인간 재조합 BMP4 (R&D 사제) 를 포함하는 배지 (50㎕) 를 첨가했다. 부유 배양 개시 6일째에, 배지 50㎕ 를 버리고, 외인성 인간 재조합 BMP4 의 최종 농도를 1.5 nM (55 ng/ml) 로 유지하기 위해, Y27632 및 SAG 를 포함하지 않고 인간 재조합 BMP4 (R&D 사제) 를 포함하는 배지 50㎕ 를 첨가했다. 부유 배양 개시 9일째 또는 그 이후, Y27632, SAG 및 인간 재조합 BMP4 를 포함하지 않는 무혈청 배지로, 배지의 반량을 교환했다.
● 조건 3: (+BMP4 3회 첨가) 부유 배양 3일째에, 외인성 인간 재조합 BMP4 의 최종 농도가 1.5 nM (55 ng/ml) 이도록, Y27632 및 SAG 를 포함하지 않고 인간 재조합 BMP4 (R&D 사제) 를 포함하는 배지 (50㎕) 를 첨가했다. 부유 배양 개시 6일째 및 9일째에 배지 50㎕ 를 버리고, 외인성 인간 재조합 BMP4 의 최종 농도를 1.5 nM (55 ng/ml) 로 유지하기 위해, Y27632 및 SAG 를 포함하지 않고 인간 재조합 BMP4 (R&D 사제) 를 포함하는 배지 50㎕ 를 첨가했다. 부유 배양 개시 12일째 또는 그 이후, Y27632, SAG 및 인간 재조합 BMP4 를 포함하지 않는 무혈청 배지로, 배지의 반량을 교환했다.
그 후, 2~4일 마다 1회, Y27632, SAG 및 인간 재조합 BMP4 를 포함하지 않는 상기 무혈청 배지로, 배지의 반량을 교환했다.
이에 따라 제조된 세포를 부유 배양 개시 이후 16일째에, 도립 현미경 (KEYENCE) 하에 명시야 관찰했다 (도 22, A-C). 그 결과, BMP4 를 1, 2 및 3 회 첨가하는 것을 포함하는 각각의 조건 하에, 세포 응집체가 성장하고, 효율적으로 신경 조직이 형성됨이 관찰되었다 (도 22, A-C).
이들 결과로부터, 단계 1 에서 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질 (SAG) 로 2일 동안 프리컨디셔닝하고, 단계 3 에서 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 1, 2 또는 3 회 첨가하는 것을 포함하는 조건 하에, 피더-프리 인간 iPS 세포로부터 효율적으로 신경 조직을 제조할 수 있음이 밝혀졌다.
부유 배양 개시 이후 16일째의 세포 응집체를 4% 파라-포름알데히드로 고정해, 동결 절편을 제조했다. 이들의 동결 절편을, 망막 조직 마커의 하나인 Chx10 (항-Chx10 항체, Exalpha 사제, 양) 에 대해 면역 염색했다. 이러한 면역 염색된 절편을, 형광 현미경 하에 관찰했다. 그 결과, BMP4 를 1회 첨가한 조건 하에서는 전체 세포 중 Chx10-양성 세포의 비율이 약 60% 이었고, 2회 또는 3회 첨가한 조건 하에서는 약 80% 인 것이 밝혀졌다 (도 22, D-F).
이들 결과로부터, 단계 1 에서 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질 (SAG) 을 사용해 2일 동안 프리컨디셔닝하고, 단계 3 에서 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 1, 2 또는 3 회 첨가하는 것을 포함하는 조건 (즉, BMP 시그널 전달 경로 작용 물질의 농도 (1.5 nM) 를 3, 6, 9 일 동안 유지하는 조건) 하에, 피더-프리 인간 iPS 세포로부터 효율적으로 망막 조직을 제조할 수 있음이 밝혀졌다.
실시예 23: 단계 1 에서 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질로 2일 동안 프리컨디셔닝하고, 단계 2 에서 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질을 사용하고, 단계 3 에서 BMP4 (1.5 nM 또는 5 nM) 를 첨가하는 것에 의한, 피더-프리 인간 iPS 세포로부터의 망막 조직의 형성 실시예
인간 iPS 세포 (Ff-I01 주, 쿄토 대학에서 입수) 를, "Scientific Reports, 4, 3594 (2014)" 에 기재된 방법에 따라 피더-프리 배양했다. 피더-프리 배지로서 StemFit 배지 (AK03; Ajinomoto Co., Inc. 사제) 를 사용하고, 피더-프리 스캐폴드로서 Laminin 511-E8(Nippi, Inc. 사제) 를 사용했다.
충만 상태의 2일 이전의 인간 iPS 세포를, SAG (Shh 시그널 전달 경로 작용 물질, 300 nM) 의 존재 하에 (프리컨디셔닝 처리), 2일 동안 피더-프리 배양했다.
상기 인간 iPS 세포를, TrypLE Select (Life Technologies) 를 사용하여 세포 분산액으로 처리하고, 피펫팅 작업에 의해 단일 세포로 추가 분산시키고, 상기 단일 세포에 분산된 인간 iPS 세포를 비세포-접착성 96-웰 배양 플레이트 (PrimeSurface 96V-바닥 플레이트, SUMITOMO BAKELITE 사제) 의 웰 마다 1.0 x 104 개의 세포로 100㎕ 의 무혈청 배지에 부유시키고, 37℃, 5% CO2 에서 부유 배양했다. 이를 위한 무혈청 배지 (gfCDM+KSR) 로서, F-12 배지와 IMDM 배지의 1:1 혼합물에10% KSR, 450μM 1-모노티오글리세롤, 및 1 x 화학적으로 정의된 지질 농축물을 첨가한 무혈청 배지를 사용했다.
부유 배양 개시시 (부유 배양 개시 이후 0일째, 단계 2 개시) 에, 상기 무혈청 배지에 Y27632 (최종 농도 20μM) 및 SAG (Shh 시그널 전달 경로 작용 물질, 1000 nM) 를 첨가했다. 부유 배양 개시 이후 2일째까지, 임의의 조건 하에 세포 응집체가 형성되었다 (단계 2 종료, 단계 3 개시).
부유 배양 개시 이후 3일째에, 외인성 인간 재조합 BMP4 의 최종 농도가 1.5 nM (55 ng/ml) 또는 5 nM (183 ng/ml) 이도록, Y27632 및 SAG 를 포함하지 않고 인간 재조합 BMP4 (R&D 사제) 를 포함하는 배지 (50㎕) 를 첨가했다. 부유 배양 개시 이후 6일째에 배지 50㎕ 를 버리고, 외인성 인간 재조합 BMP4 의 최종 농도를 1.5 nM (55 ng/ml) 또는 5 nM (183 ng/ml) 에서 유지하기 위해, Y27632 및 SAG 를 포함하지 않고 인간 재조합 BMP4 (R&D 사제) 를 포함하는 배지 50㎕ 를 첨가했다. 그 후, 2~4일 마다 1회 Y27632, SAG 및 인간 재조합 BMP4 를 포함하지 않는 상기 무혈청 배지로, 배지의 반량을 교환했다.
이에 따라 제조된 세포를 부유 배양 개시 이후 16일째에, 도립 현미경 (KEYENCE 사제) 하에 명시야 관찰했다. 그 결과, BMP4 를 1.5 nM 및 5 nM 로 첨가하는 것을 포함하는 각각의 조건 하에, 세포 응집체가 형성되고 효율적으로 신경 조직이 형성될 수 있음이 밝혀졌다 (도 23, A, B).
부유 배양 개시 이후 16일째의 세포 응집체를 4% 파라-포름알데히드로 고정해, 동결 절편을 제조했다. 이러한 동결 절편을, 망막 조직 마커의 하나인 Chx10 (항-Chx10 항체, Exalpha 사제, 양) 에 대해 면역 염색하고, 형광 현미경 하에 관찰했다. 그 결과, BMP4 를 최종 농도 1.5 nM 를 유지하기 위해 2 회 첨가한 조건 하에, 전체 세포 중 Chx10-양성 세포의 비율은 약 70% 임이 밝혀졌다 (도 23, C). 또한, BMP4 를 최종 농도 5 nM 를 유지하기 위해 2회 첨가한 조건 하에 전체 세포 중 Chx10-양성 세포의 비율은 약 80% 임이 밝혀졌다 (도 23, D)
이들 결과로부터, 단계 1 에서 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질로 2일 동안 프리컨디셔닝하고, 단계 2 에서 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질을 첨가하고, 단계 3 에서 BMP4 를 1.5 nM 또는 5 nM 로 2회 첨가하는 것을 포함하는 조건 (즉, BMP 시그널 전달 경로 작용 물질의 농도 (1.5 nM 또는 5 nM) 를 6일 동안 유지함) 하에, 효율적으로 망막 조직을 제조할 수 있음이 밝혀졌다.
실시예 24: 단계 1 에서 TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질 (A83-01) 및 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질 (SAG, 30 nM, 300 nM, 500 nM, 또는 1000 nM)로 1일 동안 프리컨디셔닝하고, 단계 2 에서 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질 (SAG) 을 사용한, 피더-프리 인간 iPS 세포로부터의 신경 조직의 형성 실시예
인간 iPS 세포 (Ff-I01 주, 쿄토 대학에서 입수) 를, "Scientific Reports, 4, 3594 (2014)" 에 기재된 방법에 따라 피더-프리 배양했다. 피더-프리 배지로서 StemFit 배지 (AK03, Ajinomoto Co., Inc. 사제) 를 사용하고, 피더-프리 스캐폴드로서 Laminin 511-E8(Nippi, Inc. 사제) 를 사용했다.
충만 상태 1일 이전의 인간 iPS 세포를, A83-01 (Wako 사제, TGFβR 저해제 0.5μM) 및 SAG (Shh 시그널 전달 경로 작용 물질, 30 nM, 300 nM, 500 nM, 또는 1000 nM) 의 존재 하에 (프리컨디셔닝 처리), 1일 동안 피더-프리 배양했다.
상기 인간 iPS 세포를, TrypLE Select (Life Technologies 사제) 를 사용하여 세포 분산액으로 처리하고, 피펫팅 작업에 의해 단일 세포로 추가 분산시키고, 상기 단일 세포에 분산된 인간 iPS 세포를 비세포-접착성 96-웰 배양 플레이트 (PrimeSurface 96V-바닥 플레이트, SUMITOMO BAKELITE 사제) 의 웰 마다 1.0 x 104 개의 세포로 100㎕ 의 무혈청 배지에 부유시키고, 37℃, 5% CO2 에서 부유 배양했다. 이를 위한 무혈청 배지 (gfCDM+KSR) 로서, F-12 배지와 IMDM 배지의 1:1 혼합물에10% KSR, 450μM 1-모노티오글리세롤, 및 1 x 화학적으로 정의된 지질 농축물을 첨가한 무혈청 배지를 사용했다.
부유 배양 개시시 (부유 배양 개시 이후 0일째, 단계 2 개시) 에, 상기 무혈청 배지에 Y27632 (최종 농도 20μM) 및 SAG (Shh 시그널 전달 경로 작용 물질, 300 nM) 를 첨가했다. 부유 배양 개시 이후 2일째까지, 모든 조건 하에 세포 응집체가 형성되었다 (단계 2 종료, 단계 3 개시). 부유 배양 개시 이후 3일째에, 외인성 인간 재조합 BMP4 의 최종 농도가 1.5 nM (55 ng/ml) 이도록, Y27632 및 SAG 를 포함하지 않고 인간 재조합 BMP4 (R&D 사제) 를 포함하는 배지 (50㎕) 를 첨가했다. 부유 배양 개시 이후 6일째에 배지 50㎕ 를 버리고, 외인성 인간 재조합 BMP4 의 최종 농도를 1.5 nM (55 ng/ml) 로 유지하기 위해, Y27632 및 SAG 를 포함하지 않고 인간 재조합 BMP4 (R&D 사제) 를 포함하는 배지 (50㎕) 를 첨가했다. 그 후, 2~4일 마다 1회 Y27632, SAG, 인간 재조합 BMP4 를 포함하지 않는 상기 무혈청 배지로 배지의 반량을 교환했다.
이에 따라 제조된 세포를 부유 배양 개시 이후 17일째에, 도립 현미경 (KEYENCE) 하에 명시야 관찰했다 (도 24). 그 결과, 단계 1 에서 A83-01 및 SAG (30~1000 nM의 농도 범위) 로 프리컨디셔닝하고, 단계 2 에서 SAG 를 첨가한 조건 하에, 세포 응집체가 형성되고 효율적으로 신경 조직이 형성됨이 밝혀졌다 (도 24, A-D).
이들 결과로부터, 단계 1 에서 TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질 (A83－01) 및 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질 (SAG, 30 nM~1000 nM 의 농도 범위)로 프리컨디셔닝하는 것을 포함하는 조건 하에, 피더-프리 인간 iPS 세포로부터 효율적으로 신경 조직을 제조할 수 있음이 밝혀졌다.
실시예 25: 단계 1 에서 TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질 (A83-01) 및 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질 (SAG) 로 1일 동안 프리컨디셔닝하고, 단계 2 에서 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질 (SAG) 을 30 nM, 300 nM, 500 nM, 또는 1000 nM 의 농도로 사용한, 피더-프리 인간 iPS 세포로부터의 신경 조직의 형성 실시예
인간 iPS 세포 (Ff-I01 주, 쿄토 대학에서 입수) 를, "Scientific Reports, 4, 3594 (2014)" 에 기재된 방법에 따라 피더-프리 배양했다. 피더-프리 배지로서 StemFit 배지 (AK03, Ajinomoto Co., Inc. 사제) 를 사용하고, 피더-프리 스캐폴드로서 Laminin 511-E8(Nippi, Inc. 사제) 를 사용했다.
충만 상태 1일 이전의 인간 iPS 세포를, A83-01 (Wako 사제, TGFβR 저해제 0.5μM) 및 SAG (Shh 시그널 전달 경로 작용 물질, 1000 nM) 의 존재 하에 (프리컨디셔닝 처리), 1일 동안 피더-프리 배양했다.
상기 인간 iPS 세포를, TrypLE Select (Life Technologies) 를 사용하여 세포 분산액으로 처리하고, 피펫팅 작업에 의해 단일 세포로 추가 분산시키고, 상기 단일 세포에 분산된 인간 iPS 세포를 비세포-접착성 96-웰 배양 플레이트 (PrimeSurface 96V-바닥 플레이트, SUMITOMO BAKELITE 사제) 의 웰 마다 1.0 x 104 개의 세포로 100㎕ 의 무혈청 배지에 부유시키고, 37℃, 5% CO2 에서 부유 배양했다. 이를 위한 무혈청 배지 (gfCDM+KSR) 로서, F-12 배지와 IMDM 배지의 1:1 혼합물에 10% KSR, 450μM 1-모노티오글리세롤, 및 1 x 화학적으로 정의된 지질 농축물을 첨가한 무혈청 배지를 사용했다.
부유 배양 개시시 (부유 배양 개시 이후 0일째, 단계 2 개시) 에, 상기 무혈청 배지에 Y27632 (최종 농도 20μM) 및 SAG (Shh 시그널 전달 경로 작용 물질, 30 nM, 300 nM, 500 nM, 1000 nM) 를 첨가했다 (도 25). 부유 배양 개시 이후 2일째까지, 모든 조건 하에 세포 응집체가 형성되었다 (단계 2 종료, 단계 3 개시).
부유 배양 개시 이후 3일째에, 외인성 인간 재조합 BMP4 (R&D 사제) 의 최종 농도가 1.5 nM (55 ng/ml) 이도록, Y27632 및 SAG 를 포함하지 않고 인간 재조합 BMP4 (R&D 사제) 를 포함하는 배지 (50㎕) 를 첨가했다.
부유 배양 개시 이후 6일째에, Y27632, SAG 및 인간 재조합 BMP4 를 포함하지 않는 무혈청 배지로 배지의 반량을 교환했다. 그 후, 2~4일 마다 1회 Y27632, SAG 및 인간 재조합 BMP4 를 포함하지 않는 상기 무혈청 배지로 배지의 반량을 절반-배지 교환했다.
이에 따라 제조된 세포를 부유 배양 개시 이후 17일째에, 도립 현미경 (KEYENCE) 하에 명시야 관찰했다. 그 결과, 단계 1 에서 A83-01 및 SAG 로 프리컨디셔닝하고, 단계 2 에서 SAG 를 30 nM, 300 nM, 500 nM, 또는 1000 nM 의 농도로 첨가한 조건 하에, 세포 응집체가 형성되고 효율적으로 신경 조직이 형성됨이 밝혀졌다 (도 25, A-D).
이들 결과로부터, 단계 1 에서 TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질 (A83-01) 및 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질 (SAG) 로 프리컨디셔닝하고, 분화 유도 개시시에 SAG 를 30 내지 1000 nM 의 농도 범위로 첨가하는 것을 포함하는 조건 하에, 피더-프리 인간 iPS 세포로부터 효율적으로 신경 조직을 제조할 수 있음이 밝혀졌다.
실시예 26: 센다이바이러스 (Sendaivirus) 를 사용하여 수립되고 피더-프리 배양한 인간 iPS 세포를 출발 물질로서 이용하고, 단계 1 에서 TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질을 이용하고, 단계 3 에서 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 사용한, 인간 iPS 세포로부터 망막 조직의 제조 예
인간 iPS 세포 (DSPC-3 주, Sumitomo Dainippon Pharma Co., Ltd. 에 의해 입수) 는, 시판되고 있는 센다이바이러스 벡터 (Oct3/4, Sox2, KLF4, c-Myc 를 포함하는 4 가지 인자, DNAVEC (현재, ID Pharma) 사제의 CytoTune 키트), 및 StemFit 배지 (AK03; Ajinomoto Co., Inc. 사제), Laminin 511-E8 (Nippi, Inc. 사제) 를 사용하여, Life Technologies 사의 공개된 프로토콜 (iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit, Publication Number MAN0009378, Revision 1.0), 및 쿄토 대학의 공개된 프로토콜 (인간 iPS 세포의 수립·유지 배양, CiRA_Ff-iPSC_protocol_JP_v140310, http://www.cira.kyoto-u.ac.jp/j/research/protocol.html) 에 기재된 방법에 따라 수립했다.
인간 iPS 세포 (DSPC-3 주) 를, "Scientific Reports, 4, 3594 (2014)" 에 기재된 방법에 따라 피더-프리 배양했다. 피더-프리 배지로서 StemFit 배지 (AK03, Ajinomoto Co., Inc. 사제) 를 사용하고, 피더-프리 스캐폴드, Laminin 511-E8 (Nippi, Inc. 사제) 를 사용했다.
실시예 1 에 기재된 방법에 따라, 인간 iPS 세포 (DSPC-3 주) 를 StemFit 배지를 사용하여, 충만 상태 1일 이전까지 피더-프리 배양했다. 충만 상태 1일 이전의 인간 iPS 세포를, 하기 3 가지 조건 하에 1일 동안 피더-프리 배양했다.
● 조건 1: SB431542 (TGFβR 저해제, 5μM) 및 SAG (Shh 시그널 전달 경로 작용 물질, 300 nM) (도 26, B, C, F, G)
● 조건 2: LDN193189 (BMP 시그널 전달 경로 저해 물질, 100 nM) 및 SAG (Shh 시그널 전달 경로 작용 물질, 300 nM) (도 26, D, E, H, I)
● 조건 3: 외인성 TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질 및 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하지 않음 (도 26, A)
이에 따라 제조된 조건 1-3의 인간 iPS 세포를 TrypLE Select (Life Technologies 사제) 를 사용하여 세포 분산액으로 처리하고, 피펫팅 작업에 의해 단일 세포에 추가 분산시켰다. 그 후, 상기 단일 세포에 분산된 인간 iPS 세포를 비세포-접착성 96-웰 배양 플레이트 (SUMILON Spheroid V-바닥 플레이트 PrimeSurface 96V-바닥 플레이트, SUMITOMO BAKELITE) 의 웰 마다 1.2 x 104 개의 세포로 100㎕ 의 무혈청 배지에 부유시키고, 37℃, 5% CO2 에서 부유 배양했다. 이를 위한 무혈청 배지로서, F-12 배지와 IMDM 배지의 1:1 혼합물에 10% KSR, 450μM 1-모노티오글리세롤, 및 1 x 화학적으로 정의된 지질 농축물을 첨가한 무혈청 배지를 사용했다. 부유 배양 개시시 (부유 배양 개시 이후 0일째, 단계 2 개시) 에 상기 무혈청 배지에 Y27632 (20μM) 를 첨가하고, SAG 외인성 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질을 추가로 첨가하는 조건 (최종 농도 30 nM), 또는 SAG 를 첨가하지 않는 조건 하에 무혈청 배지를 사용했다. 부유 배양 개시 이후 2일째에, 세포 응집체가 형성되었다. 부유 배양 개시 이후 3일째에, 외인성 인간 재조합 BMP4 의 최종 농도가 1.5 nM (55 ng/ml) 이도록, Y27632 와 SAG 를 포함하지 않고 인간 재조합 BMP4 (R&D 사제) 를 포함하는 배지 (50㎕) 를 첨가했다. 부유 배양 개시 이후 6일째에, Y27632, SAG 및 인간 재조합 BMP4 를 포함하지 않는 무혈청 배지로 배지의 반량을 교환했다. 그 후, 2~4일 마다 1회 Y27632, SAG, 및 인간 재조합 BMP4 를 포함하지 않는 상기 무혈청 배지로 배지의 반량을 교환했다.
이에 따라 제조된 세포 응집체를, 부유 배양 개시 이후 22일째에, 도립 현미경 (KEYENCE 사제, BIOREVO) 하에 명시야 관찰했다 (도 26, A-E). 그 결과, 프리컨디셔닝하지 않으면 (조건 3) 세포 응집체가 성장하지 않았고 신경 표피가 형성되지 않았음이 밝혀졌다 (도 26, A). 다른 한편으로는, 단계 1 에서 SB431542 및 SAG, 또는 LDN193189 및 SAG 로 프리컨디셔닝하는 조건 (조건 1, 2) 하에서 세포 응집체가 성장하고 신경 표피가 형성됨이 밝혀졌다 (도 26, B-E).
이에 따라 제조된 세포 응집체를, 부유 배양 개시 이후 22일째에 각각 4% 파라-포름알데히드로 고정해, 동결 절편을 제조했다. 이들 동결 절편을, 망막 조직 마커의 하나인 Chx10 (항-Chx10 항체, Exalpha, 양) 에 대해 면역 염색을 실시하고, 형광 현미경 (KEYENCE 사제, BIOREVO) 하에 관찰했다.
그 결과, 먼저 단계 1 에서 SB431542 및 SAG 로 프리컨디셔닝하고, 단계 2 에서 SAG 를 첨가하지 않고, 단계 3 에서 BMP4 를 첨가하는 것을 포함하는 조건 하에 제조한 세포 응집체에서, 전체 세포 중의 Chx10-양성 세포의 비율은 약 90% 임이 밝혀졌다 (도 26, F). 즉, 단계 1 에서 SB431542 및 SAG 로 프리컨디셔닝하고, 단계 2 에서 SAG 를 첨가하고, 단계 3 에서 BMP4 를 첨가하는 것을 포함하는 조건 하에 제조한 세포 응집체에서, 전체 세포 중 Chx10-양성 세포의 비율이 약 70% 임이 밝혀졌다 (도 26, G). 즉, 단계 1 에서 TGFβR 저해제 (SB431542) 및 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질로 프리컨디셔닝하고, 단계 3 에서 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 첨가한 조건 하에서는, 심지어 단계 2 에서 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질을 첨가하거나 첨가하지 않은 경우에도, 망막 조직을 제조할 수 있음이 밝혀졌다.
또한, 단계 1 에서 LDN193189 및 SAG 로 프리컨디셔닝하고, 단계 2 에서 SAG 를 첨가하지 않고, 단계 3 에서 BMP4 를 첨가하는 것을 포함하는 조건 하에 제조한 세포 응집체에서는, 전체 세포 중 Chx10-양성 세포의 비율은 약 90% 임이 밝혀졌다 (도 26, I). 또한, 단계 1 에서 LDN193189 및 SAG 로 프리컨디셔닝하고, 단계 2 에서 SAG 를 첨가하고, 단계 3 에서 BMP4 를 첨가하는 것을 포함하는 조건 하에 제조한 세포 응집체에서는, 전체 세포 중 Chx10-양성 세포의 비율이 약 60% 임이 밝혀졌다 (도 26, H). 즉, 단계 1 에서 BMPR 저해제 (LDN193189) 및 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질로 프리컨디셔닝하고, 단계 3 에서 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 첨가하는 것을 포함하는 조건 하에서는, 심지어 단계 2 에서 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질을 첨가하거나 첨가하지 않은 경우에도, 망막 조직을 제조할 수 있음이 밝혀졌다.
이들 결과로부터, 단계 1 에서 TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질 및 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질을 첨가하고, 단계 3 에서 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 첨가함으로써, 출발 물질로서 센다이바이러스에 의해 제조되고 피더-프리배양한 인간 iPS 세포로부터 망막 조직을 제조할 수 있음이 밝혀졌다.
실시예 27: 피더-프리 배양한 인간 ES 세포를 출발 물질로서, 단계 1 에서 TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질, 단계 2 에서 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질, 및 단계 3 에서 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 사용한, 인간 iPS 세포로부터의 망막 조직의 제조 실시예
Rx::GFP 노크-인 인간 ES 세포 (KhES-1 주로부터 유래됨; Cell Stem Cell, 2012, 10(6) 771-785) 을, Scientific Reports, 4, 3594 (2014) 에 기재된 방법에 따라 피더-프리 배양했다 (도 27, A). 피더-프리 배지로서 StemFit 배지 (AK03, Ajinomoto Co., Inc. 사제) 를 사용하고, 피더-프리 스캐폴드로서 Laminin 511-E8 (Nippi, Inc. 사제) 를 사용했다.
StemFit 배지를 사용하여 그리고 실시예 1 에 기재된 방법에 따라, 인간 ES 세포 (Rx::GFP 세포주) 를, 충만 상태 1일 이전이 될 때까지 피더-프리 배양했다. 충만 상태 1일 이전의 인간 iPS 세포를, 하기 3 가지 조건 하에 1일 동안 피더-프리 배양했다.
● 조건 1: SB431542 (TGFβR 저해제, 5μM) 및 SAG (Shh 시그널 전달 경로 작용 물질, 30 nM) (도 27, C, E)
● 조건 2: LDN193189 (BMPR 저해제, 100 nM) 및 SAG (Shh 시그널 전달 경로 작용 물질, 30 nM) (도 27, D, F)
● 조건 3: 외인성 TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질 및 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하지 않음 (도 27, B)
이에 따라 제조된 조건 1-3 의 인간 ES 세포를, TrypLE Select (Life Technologies 사제) 를 사용하여 세포 분산액으로 처리하고, 피펫팅 작업에 의해 단일 세포에 추가 분산시켰다. 그 후, 상기 단일 세포에 분산된 인간 ES 세포를 비세포-접착성 96-웰 배양 플레이트 (SUMILON Spheroid V-바닥 플레이트 PrimeSurface 96V-바닥 플레이트, SUMITOMO BAKELITE) 의 웰 마다 1.2 x 104 개의 세포로 100㎕ 의 무혈청 배지에 부유시키고, 37℃, 5% CO2 에서 부유 배양했다. 이를 위한 무혈청 배지로서, F-12 배지와 IMDM 배지의 1:1 혼합물에 10% KSR, 450μM 1-모노티오글리세롤, 및 1 x 화학적으로 정의된 지질 농축물을 첨가한 무혈청 배지를 사용했다.
프리컨디셔닝하지 않는 조건 3 하에, 부유 배양 개시시 (부유 배양 개시 이후 0일째, 단계 2 개시) 에, 상기 무혈청 배지에 Y27632 (20μM) 를 첨가하고, 외인성 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질을 추가로 첨가하지 않는 조건 하에 무혈청 배지를 사용했다.
조건 1 및 2 하에, 부유 배양 개시시 (부유 배양 개시 이후 0일째, 단계 2 개시) 에, 상기 무혈청 배지에 Y27632 (20μM) 를 첨가하고, SAG, 외인성 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질을 추가 첨가하는 조건 (최종 농도 30 nM) 하에 무혈청 배지를 사용했다 (도 27). 조건 1-3 중 어느 하나 하에, 부유 배양 개시 이후 2일째에 세포 응집체가 형성되었다. 부유 배양 개시 이후 3일째에, 외인성 인간 재조합 BMP4 의 최종 농도가 1.5 nM (55 ng/ml) 이도록, Y27632 와 SAG 를 포함하지 않고 인간 재조합 BMP4 (R&D 사제) 를 포함하는 배지 (50㎕) 를 첨가했다. 부유 배양 개시 이후 6일째에, Y27632, SAG, 및 인간 재조합 BMP4 를 포함하지 않는 무혈청 배지로 배지의 절반을 교환했다. 그 후, 3일 마다 1회 Y27632, SAG, 및, 인간 재조합 BMP4 를 포함하지 않는 상기 무혈청 배지로, 배지의 절반을 교환했다.
이에 따라 제조된 세포 응집체를, 부유 배양 개시 이후 18일째에, 도립 현미경 (KEYENCE 사제, BIOREVO) 하에 명시야 관찰했다. 그 결과, 프리컨디셔닝하지 않으면 (조건 3), 세포 응집체의 신경 표피 형성의 효율이 불량했음이 밝혀졌다 (도 27, B). 다른 한편으로는, 단계 1 에서 SB431542 와 SAG, 또는 LDN193189 와 SAG 로 프리컨디셔닝하는 것을 포함하는 조건 (조건 1, 2) 하에, 세포 응집체가 성장하고 신경 표피가 형성되었음이 밝혀졌다 (도 27, C, D). 즉, 단계 1 에서의 프리컨디션 작업은 신경 표피의 제조 효율을 향상시킴이 밝혀졌다.
이에 따라 제조된 세포 응집체 (인간 ES 세포 Rx::GFP 세포주 유래) 에서, Rx 유전자 프로모터의 제어 하에서의 GFP 의 발현을, 형광 현미경 (KEYENCE 사제, BIOREVO) 하에 관찰했다. 그 결과, 단계 1 에서 SB431542 와 SAG 의 조합, 또는 LDN193189 와 SAG 의 조합으로 프리컨디셔닝하고, 단계 2 에서 SAG 를 첨가하고, 단계 3 에서 BMP4 를 첨가하는 것을 포함하는 조건 하에, 전체 세포 중 약 90% 가 GFP-강한 양성임이 밝혀졌다 (도 27, E, F).
이들 결과로부터, 단계 1 에서 TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질 및 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질을 첨가하고, 단계 3 에서 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 첨가함으로써, 피더-프리 배양한 인간 ES 세포를 출발 물질로서 망막 조직을 제조할 수 있음이 밝혀졌다.
실시예 28: 피더-프리 배양한 인간 iPS 세포를 출발 물질로서, 단계 1 에서 TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질, 단계 2 에서 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질, 및 단계 3 에서 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 사용한, 인간 iPS 세포로부터 망막 조직의 제조 실시예
실시예 1 에 기재된 방법에 따라, StemFit 배지를 사용하여 인간 iPS 세포 (1231A3 주) 를 충만 상태 1일 이전까지 피더-프리 배양했다. 충만 상태 1일 이전의 인간 iPS 세포를, TGFβR 저해제 (SB431542, 5μM) 및 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질 (SAG, 300 nM) 로 1일 동안 피더-프리 배양했다 (프리컨디션).
상기 인간 iPS 세포를, TrypLE Select (Life Technologies) 를 사용하여 세포 분산액으로 처리하고, 피펫팅 작업에 의해 단일 세포로 추가 분산켰다. 이후, 상기 단일 세포에 분산된 인간 iPS 세포를 비세포-접착성 96-웰 배양 플레이트의 웰 마다 1.2 x 104 개의 세포로 100㎕ 의 무혈청 배지에 부유시키고, 37℃, 5% CO2 에서 부유 배양했다. 이를 위한 무혈청 배지로서, F-12 배지와 IMDM 배지의 1:1 혼합물에 10% KSR, 450μM 1-모노티오글리세롤, 1 x 화학적으로 정의된 지질 농축물을 첨가한 무혈청 배지를 사용했다. 부유 배양 개시시 (부유 배양 개시 이후 0일째, 단계 2 개시) 에, 부유 배양 개시시에, 상기 무혈청 배지에 Y27632 (최종 농도 20μM) 및 Shh 시그널 작용 물질 (SAG, 30 nM) 을 첨가했다. 부유 배양 개시 이후 2일째까지, 세포 응집체가 형성되었다 (단계 2 종료, 단계 3 개시).
부유 배양 개시 이후 3일째에, 외인성 인간 재조합 BMP4 의 최종 농도를 1.5 nM 로 설정하기 위해, Y27632 및 SAG 를 포함하지 않고 인간 재조합 BMP4 (R&D 사제) 를 포함하는 상기 무혈청 배지로 배지를 교환했다. 부유 배양 개시 이후 3일째 또는 그 이후, 2~4일 마다 1회 Y27632, SAG, 및 인간 재조합 BMP4 를 포함하지 않는 상기 무혈청 배지로, 배지의 반량을 교환했다. 부유 배양 개시 이후 17일째에는, 세포 응집체가 성장하고 신경 표피가 형성되었다.
부유 배양 개시 이후 17일째의 세포 응집체를, 90 mm 의 저접착 배양 디쉬 (SUMITOMO BAKELITE 사제) 로 옮기고, Wnt 시그널 전달 경로 작용 물질 (CHIR99021, 3μM) 및 FGF 시그널 전달 경로 저해 물질 (SU5402, 5μM) 을 포함하는 무혈청 배지 (1% N2 보충제가 첨가된 DMEM/F12 배지) 중에서, 37℃, 5% CO2 에서 3일 동안, 즉 부유 배양 개시 이후 20일째까지 배양했다. 이 기간 동안 하나의 90 mm 저접착 배양 디쉬 마다 약 50개의 응집체를, 10 ml의 상기 CHIR99021 및 SU5402를 포함하는 무혈청 배지에서 부유 배양했다. 부유 배양 개시 이후 20일째에, 얇은 신경 표피가 형성되고 망막 색소 표피 (RPE)-유형 조직이 형성되었다.
또한, 부유 배양 개시 이후 20일째의 세포 응집체를, 90 mm 의 저접착 배양 디쉬 (SUMITOMO BAKELITE 사제) 에서, Wnt 시그널 전달 경로 작용 물질 및 FGF 시그널 전달 경로 저해 물질을 포함하지 않는 혈청-함유 배지 (10% 소 태아 혈청, 1% N2 보충제, 0.5μM 레티노산, 및 100μM 타우린이 첨가된 DMEM/F12 배지) 중에서, 37℃, 5% CO2, 주변 산소 농도 (약 20%) 에서 81일 동안, 즉 부유 배양 개시 이후 101일째까지 부유 배양했다. 부유 배양 개시 이후 20일째부터 101일째까지의 사이에, 2~4일 마다 1회 상기 혈청-함유 배지로 배지의 반량을 교환했다. 이 기간 동안, 하나의 90 mm 의 저접착 배양 디쉬 마다 약 30 개의 응집체를, 15 ml 의 상기 혈청 배지에서 부유 배양했다. 부유 배양 개시 이후 30일째에는, 신경 망막-유형 조직이 존재했다.
이에 따라 제조된 부유 배양 개시 이후 101일째의 세포 응집물을 각각 4% 파라-포름알데히드로 고정해, 동결 절편을 제조했다. 이들 동결 절편을, 망막 조직 마커의 하나인 Rx (항-Rax/Rx항체, Takara 사제, 기니피그), 증식 세포 마커의 하나인 Ki67 (항-Ki67 항체, Leica 사제, 토끼), 신경 망막 원세포 마커의 하나인 Chx10 (항-Chx10 항체, Exalpha, 양), 광수용체 전구 세포 마커의 하나인 CRx (항-Crx 항체, Takara 사제, 토끼), 광수용체 전구 세포 마커의 하나인 Blimp1 (항-Blimp1 항체, Santa Cruz 사제, 래트), 신경절 세포 마커의 하나인 Brn3b (항-Brn3b 항체, Santa Cruz 사제, 염소) 에 대해 면역 염색하고, 형광 현미경 (KEYENCE 사제, BIOREVO) 하에 관찰했다.
그 결과, 이에 따라 제조된 세포 응집체에서 전체 세포 중 Rx-양성 세포의 비율이 약 90% 임이 밝혀졌다 (도 28, A). 연속 절편의 분석으로부터, Rx-강한 양성 세포에 Ki67-양성 및 Chx10-양성 신경 망막 원세포가 포함되어 있음이 밝혀졌다 (도 28, B, C). 또한, 세포 응집체는 CRx-강한 양성 광수용체 전구 세포를 포함함이 밝혀졌다 (도 28, D). 연속 절편의 분석으로부터, CRx-강한 양성 세포의 일부가 Blimp1-양성 광수용체 전구 세포임이 밝혀졌다 (도 28, E). 또한, 세포 응집체는 Brn3b-양성 신경절 세포를 포함함이 밝혀졌다 (도 28, F).
이들 결과로부터, 본 발명의 제조 방법에 의해 제조한 망막 조직은, 배양을 계속함으로써, 신경 망막 원세포, 광수용체 전구 세포 및 신경절 세포를 포함하는 망막 조직으로 분화 및 성숙함이 밝혀졌다.
실시예 29: 피더-프리 배양한 인간 iPS 세포를 출발 물질로서, 단계 1 에서 TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질, 단계 2 에서 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질, 및 단계 3 에서 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 사용한, 인간 iPS 세포로부터 망막 조직의 제조 실시예
실시예 28 에 기재된 방법에 따라, 피더-프리 배지로서 StemFit 배지에서 인간 iPS 세포 (1231A3 주) 를 출발 물질로서, 단계 1 에서 TGFβR 저해제 (SB431542, 5μM) 및 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질 (SAG, 300 nM) 로 1일 동안 프리컨디셔닝하고, 단계 2 에서 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질 (SAG, 30 nM) 을 이용하고, 단계 3 에서 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질 (BMP4, 최종 농도 1.5 nM) 을 첨가한 조건 하에, 세포 응집체를 제조했다. 부유 배양 개시 이후 18일째에, 신경 표피가 형성되었다.
당해 부유 배양 개시 이후 18일째의 세포 응집체를, 90 mm 저접착 배양 디쉬 (SUMITOMO BAKELITE 사제) 로 옮기고, Wnt 시그널 전달 경로 작용 물질 (CHIR99021, 3μM) 및 FGF 시그널 전달 경로 저해 물질 (SU5402, 5μM) 을 포함하는 무혈청 배지 (1% N2 보충제가 첨가된 DMEM/F12 배지) 로, 37℃, 5% CO2 에서 5일 동안, 즉 부유 배양 개시 이후 23일째까지 배양했다. 이 기간 동안, 하나의 90 mm 의 저접착 배양 디쉬 마다 약 50 개의 응집체를, 10 ml 의 상기 CHIR99021 및 SU5402 를 포함하는 무혈청 배지에서 부유 배양했다. 부유 배양 개시 이후 23일째에, 얇은 신경 표피가 형성되고 망막 색소 표피 (RPE)-유형 조직이 형성되었다.
또한, 당해 부유 배양 개시 이후 23일째의 세포 응집체를, 90 mm 의 저접착 배양 디쉬 (SUMITOMO BAKELITE 사제) 에서, Wnt 시그널 전달 경로 작용 물질 및 FGF 시그널 전달 경로 저해 물질을 포함하지 않는 혈청 배지 (10% 소 태아 혈청, 1% N2 보충제, 0.5μM 레티노산, 및 100μM 타우린이 첨가된 DMEM/F12 배지) 중에서, 37℃, 5% CO2, 주변 산소 농도 (약 20%) 에서, 부유 배양 개시 이후 130일째까지 (107일 동안), 부유 배양 개시 이후 137일째 (114일 동안) 까지, 또는 부유 배양 개시 이후 178일째 (155일 동안) 까지 부유 배양했다. 부유 배양 개시 이후 23일째부터 부유 배양 종료시까지 동안, 2~4일 마다 1회, 상기 혈청-함유 배지로 배지의 반량을 교환했다. 이 기간 동안, 하나의 90 mm 의 저접착 배양 디쉬 마다 약 30 개의 응집체를, 15 ml의 상기 혈청-함유 배지에서 부유 배양했다. 부유 배양 개시 이후 35일째 또는 그 이후에는, 신경 망막-유형 조직이 존재했다.
이에 따라 제조된 부유 배양 개시 이후 130일째, 137일째, 및 178일째의 세포 응집체를 각각 4% 파라-포름알데히드로 고정해, 동결 절편을 제조했다. 이들 동결 절편을, 개재뉴런 마커 (신경절 세포 및 아마크린 세포) 의 하나인 칼레티닌 (항-칼레티닌 항체, Millipore 사제, 토끼), 원뿔형 광수용체 세포 마커의 하나인 S-옵신 (항-S-옵신 항체, Millipore 사제, 토끼), 망막 조직 마커의 하나인 Rx (항-Rax/Rx항체, Takara 사제, 기니피그), 개재뉴런 마커 (신경절 세포 및 아마크린 세포) 의 하나인 Pax6 (항-Pax6 항체, BD 사제, 마우스), 광수용체 세포 마커의 하나인 레코베린 (항-레코베린 항체, Millipore 사제, 토끼), 막대형 광수용체 세포 마커의 하나인 로돕신 (항-로돕신 항체 Ret-P1, Sigma 사제, 마우스), 막대형 광수용체 전구 세포 마커의 하나인 NRL (항-NRL 항체, R and D 사제, 염소), 개재뉴런 마커 (수평 세포) 의 하나인 칼빈딘 (항-칼빈딘 항체, Millipore 사제, 토끼) 에 대해 면역 염색하고, 공초점 레이저 현미경 (Zeiss 사제, LSM780) 하에 관찰했다.
부유 배양 개시 이후 130일째의 세포 응집체의 분석으로부터, 전체 세포 중의 Rx-양성 세포의 비율이 약 90% 인 것이 밝혀졌다. 또한 Rx-강한 양성 망막 조직은 내부에 칼레티닌-양성 개재뉴런을 포함함을 밝혀냈다 (도 29, A).
부유 배양 개시 이후 137일째의 세포 응집체의 분석으로부터, 전체 세포 중의 Rx-양성 세포의 비율이 약 90% 인 것이 밝혀졌다. 또한, Rx-강한 양성 망막 조직은 Crx -양성 광수용체 전구 세포 및 레코베린-양성 광수용체 세포를 포함함이 밝혀졌다. 또한 Rx-강한 양성 망막 조직은 S-옵신-양성 원뿔형 광수용체 세포를 포함함이 밝혀졌다 (도 29, B).
부유 배양 개시 이후 178일째의 세포 응집체의 분석으로부터, 전체 세포 중 Rx-양성 세포의 비율이 약 90% 인 것이 밝혀졌다 (도 29, C). 연속 절편의 분석으로부터, Rx-강한 양성 망막 조직은 내부에 Pax6-양성 개재뉴런 (아마크린 세포 및 신경절 세포) 을 포함함이 밝혀졌다 (도 29, D). Rx-강한 양성 망막 조직은, 외부에 레코베린-양성 광수용체 세포, 로돕신-양성 막대형 광수용체 세포, NRL-양성 막대형 광수용체 전구 세포, 칼빈딘-양성 수평 세포를 포함함을 밝혀냈다 (도 29, E-H).
이들 결과로부터, 본원 제조법에 의해 제조한 망막 조직은 배양을 계속함으로써, 광수용체 전구 세포, 광수용체 세포, 원뿔형 광수용체 세포, 막대형 광수용체 세포, 수평 세포, 다른 개재뉴런을 포함하는 망막 조직으로 분화 및 성숙함이 밝혀졌다.
실시예 30: 피더-프리 배양한 인간 iPS 세포를 출발 물질로서, 단계 1 에서 TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질, 단계 2 에서 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질, 및 단계 3 에서 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 사용한, 인간 iPS 세포로부터 망막 조직의 제조 실시예
실시예 29 에 기재된 방법에 따라, 출발 물질로서 피더-프리 배지로서 StemFit 배지에서 인간 iPS 세포 (1231A3 주) 로부터, 단계 1 에서 TGFβR 저해제 (SB431542, 5μM) 및 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질 (SAG, 300 nM) 로 1일 동안 프리컨디셔닝하고, 단계 2 에서 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질 (SAG, 30 nM) 을 이용하고, 단계 3 에서 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질 (BMP4, 최종 농도 1.5 nM) 을 첨가한 조건 하에, 세포 응집체를 제조했다. 부유 배양 개시 이후 18일째에는, 신경 표피가 형성되었다.
부유 배양 개시 이후 18일째의 세포 응집체를, 90 mm 의 저접착 배양 디쉬 (SUMITOMO BAKELITE 사제) 로 옮기고, Wnt 시그널 전달 경로 작용 물질 (CHIR99021, 3μM) 및 FGF 시그널 전달 경로 저해 물질 (SU5402, 5μM) 을 포함하는 무혈청 배지 (1% N2 보충제가 첨가된 DMEM/F12 배지) 중에서, 37℃, 5% CO2 에서 5 동안, 즉 부유 배양 개시 이후 23일째까지 배양했다. 이 기간 동안, 하나의 90 mm 저접착 배양 디쉬 마다 약 50 개의 응집체를, 10 ml 의 상기 CHIR99021 및 SU5402 를 포함하는 무혈청 배지에서 부유 배양했다. 부유 배양 개시 이후 23일째에는, 얇은 신경 표피가 형성되고, 망막 색소 표피 (RPE)-유형 조직이 형성되었다.
또한, 당해 부유 배양 개시 이후 23일째의 세포 응집체를, 90 mm 저접착 배양 디쉬 (SUMITOMO BAKELITE 사제) 에서, Wnt 시그널 전달 경로 작용 물질 및 FGF 시그널 전달 경로 저해 물질을 포함하지 않는 혈청-함유 배지 (10% 소 태아 혈청, 1% N2 보충제, 0.5μM 레티노산, 및 100μM 타우린이 첨가된 DMEM/F12 배지) 에서, 37℃, 5% CO2, 주변 산소 농도 (약 20%) 에서, 부유 배양 개시 이후 63일째까지 (41일 동안) 부유 배양했다. 부유 배양 개시 이후 23일째부터 부유 배양 종료시까지, 2~4일 마다 1회, 상기 혈청-함유 배지로 배지의 반량을 교환했다. 이 기간 동안, 하나의 90 mm 저접착 배양 디쉬 마다 약 30개의 응집체를, 15 ml 의 상기 혈청-함유 배지에서 부유 배양했다. 부유 배양 개시 이후 35일째 또는 그 이후, 신경 망막-유형 조직이 존재했다.
도립 현미경 (Nicon 사제) 하에서의 이에 따라 제조된 부유 배양 개시 이후 63일째의 세포 응집체의 명시야 관찰은, 신경 망막 조직 및 색소 침착 RPE-유형 조직의 존재를 드러냈다. 얻어진 100 개의 세포 응집체를 상세하게 분석하면, 세포 응집체 40 개에서 전체 세포 중 90% 이상은 신경 망막으로 구성되었고, 40개의 세포 응집체에서 신경 망막 및 망막 색소 표피 (RPE, 색소 침착에 의해 판별가능) 가 공존하는 복합 망막 조직이 발견되었고 (도 30, A), 세포 응집체 20 개에서 전체 세포 중 90% 이상이 망막 색소 표피 (RPE, 색소 침착에 의해 판별가능) 로 구성되었다 (도 30, B).
또한, 상기 부유 배양 개시 이후 63일째의 세포 응집체를 Wnt 시그널 전달 경로 작용 물질 및 FGF 시그널 전달 경로 저해 물질을 포함하지 않는 혈청-함유 배지 (10% 소 태아 혈청,1% N2 보충제, 0.5μM 레티노산, 및 100μM 타우린이 첨가된 DMEM/F12 배지) 에서, 부유 배양 개시 이후 130일째까지 (107일 동안) 부유 배양했다. 이들 세포 응집체를 4% 파라-포름알데히드로 고정해, 동결 절편을 제조했다. 이들 동결 절편을, 모양체 주연부 (CMZ) 마커의 하나인 SSEA1 (항-SSEA1 항체, Millipore 사제, 마우스), RPE 마커의 하나인 Mitf (항-Mitf 항체, Exalpha, 마우스), RPE 및 모양체 마커의 하나인 Aqp1 (항-Aqp1 항체, Millipore 사제, 토끼) 에 대해 면역 염색하고, 공초점 레이저 현미경 (Zeiss 사제, LSM780) 하에 관찰했다.
부유 배양 개시 이후 130일째에 전체 응집체 현탁액 배양이 색소 침착된 RPE-유형 조직의 분석은, 전체 세포의 약 80% 가 Rx-약한 양성임을 드러냈다. 또한, 연속 절편의 분석은 Rx-약한 양성 세포가 Mitf-양성 RPE 임을 밝혀냈다 (도 30, D). 또한, 상기 RPE-유형 조직은 Aqp1-양성인 것으로 드러났다 (도 30, E). 이들 결과로부터, 본 발명의 제조 방법에 의해 제조한 망막 조직은 RPE 로 분화 및 성숙할 수 있음이 밝혀졌다.
부유 배양 개시 이후 130일째에, 신경 망막 및 RPE-유형 조직을 모두 포함하는 복합 망막 조직의 분석에 의해, 전체 세포 중 Rx-양성 세포의 비율은 약 90% 이며, Rx-강한 양성 신경 망막 및 Rx-약한 양성 RPE-유형 조직이 포함됨이 확인되었다. 또한, 신경 망막 (도 30, C, 우측) 과 RPE (도 30, C) 의 경계에서, SSEA1-양성 모양체 주연부가 형성되어 있음을 밝혀냈다. 이 결과로부터, 본 발명의 제조 방법에 의해 제조한 망막 조직은 모양체 주연부로 분화 및 성숙할 수 있음이 밝혀졌다.
실시예 31: 피더-프리 배양한 인간 iPS 세포를 출발 물질로서, 단계 1 에서 TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질을 사용한, 인간 iPS 세포로부터 대뇌 조직의 제조 실시예
실시예 1 에 기재된 방법에 따라, 인간 iPS 세포 (1231A3 주) 를, Scientific Reports, 4, 3594 (2014) 에 기재된 방법에 따라 피더-프리 배양했다. 피더-프리 배지로서 StemFit 배지 (AK03, Ajinomoto Co., Inc. 사제) 를 사용하고, 피더-프리 스캐폴드로서 Laminin 511-E8(Nippi, Inc. 사제) 를 사용했다.
실시예 1 에 기재된 방법에 따라, 인간 iPS 세포 (1231A3 주) 를 StemFit 배지를 사용하여 충만 상태 1일 이전까지 피더-프리 배양했다. 충만 상태 1일 이전의 인간 iPS 세포를, 하기 3 가지 조건 하에 1일 동안 피더-프리 배양했다.
● 조건 1: SB431542 (TGFβR 저해제, 5μM) 및 SAG (Shh 시그널 전달 경로 작용 물질, 300 nM)
● 조건 2: LDN193189 (BMPR 저해제, 100 nM) 및 SAG (Shh 시그널 전달 경로 작용 물질, 300 nM)
● 조건 3: 외인성의 TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질 및 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하지 않음 (프리컨디셔닝하지 않는 조건)
이에 따라 제조된 상기 조건 1-3 의 인간 iPS 세포를, TrypLE Select (Life Technologies 사제) 를 사용하여 세포 분산액으로 처리하고, 피펫팅 작업에 의해 단일 세포에 추가 분산시켰다. 그 후, 상기 단일 세포에 분산된 인간 iPS 세포를 비세포-접착성 96-웰 배양 플레이트 (SUMILON Spheroid V-바닥 플레이트 PrimeSurface 96V-바닥 플레이트, SUMITOMO BAKELITE) 의 웰 마다 0.9 x 104 개의 세포로 100㎕ 의 무혈청 배지에 부유시키고, 37 ℃, 5% CO2 에서 부유 배양했다. 이를 위한 무혈청 배지 (GMEM+KSR) 로서, GMEM 배지 (Life Technologies 사제) 에 20% KSR(Life Technologies 사제), 0.1 mM 2-메르캅토에탄올, 1 x 비필수 아미노산 (Life Technologies 사제), 및 1 mM 피루브산 (Life Technologies 사제) 을 첨가한 무혈청 배지를 사용했다.
부유 배양 개시시 (부유 배양 개시 이후 0일째, 단계 2 개시) 에, 상기 무혈청 배지에, Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질 (IWR-1-엔도, 3μM), TGFβR 저해제 (SB431542, 5μM), 및 Y27632 (20μM) 를 상기 무혈청 배지에 첨가하고, SAG 를 포함하는 조건 (A) (Shh 시그널 작용 물질, 100 nM) 또는 포함하지 않는 조건(B) 하에 세포를 배양했다. 부유 배양 개시 이후 2일째에, 임의의 조건 하에 세포 응집체가 형성되었다.
부유 배양 개시 이후 3일째에, Y27632 및 SAG 를 포함하지 않고 Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질 (IWR-1-엔도, 3μM) 및 TGFβR 저해제 (SB431542, 5μM) 를 포함하는 무혈청 배지로 배지의 반량을 교환했다. 그 후, 부유 배양 개시 이후 25일째 또는 27일째까지, 2~4일 마다 1회 Y27632 및 SAG 를 포함하지 않고 Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질 (IWR-1-엔도, 3μM) 및 TGFβR 저해제 (SB431542, 5μM) 를 포함하는 상기 무혈청 배지로 배지의 반량을 교환했다.
부유 배양 개시 이후 25일째의 세포 응집체를, 도립 현미경 (KEYENCE 사제, BIOREVO) 하에 명시야 관찰했다. 그 결과, 프리컨디셔닝하지 않는 조건 하에 (조건 3), 세포 응집체가 성장하지 않았고, 신경 표피가 거의 형성되지 않았다 (도 31, A). 다른 한편으로는, 단계 1 에서 SB431542 와 SAG, 또는 LDN193189 와 SAG 로 프리컨디셔닝하는 조건 (조건 1, 2) 하에 세포 응집체가 성장하고, 심지어 단계 2 에서 SAG 를 더하지 않는 조건 (B) 하에서도 신경 표피가 형성되었음이 밝혀졌다 (도 31, B, C). 유사하게, 단계 1 에서 SB431542 와 SAG, 또는 LDN193189 와 SAG 로 프리컨디셔닝 (조건 1, 2) 하는 조건, 및 단계 2 에서 SAG 를 첨가한 조건(A) 하에, 세포 응집체가 성장하고 신경 표피가 형성되었음이 밝혀졌다. 즉, 단계 1 에서 TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질 및/또는 Shh 시그널 작용 물질을 첨가하는 한, 단계 2 에서 Shh 시그널 작용 물질을 첨가하든지 첨가하지 않든지 상관 없이, 신경 표피의 제조 효율이 향상됨이 밝혀졌다.
이에 따라 제조된 부유 배양 개시 이후 27일째의 세포 응집체를 각각 4% 파라-포름알데히드로 고정해, 동결 절편을 제조했다. 이들 동결 절편을, 신경 전구 세포 마커의 하나인 Sox2 (항-Sox2 항체, Santa Cruz 사제, 염소), 및 대뇌의 마커의 하나인 FoxG1 (항-FoxG1 항체, RIKEN 사제, As3514, 토끼) 에 대해 면역 염색을 실시하고, 공초점 레이저 현미경 (Olympus 사제) 하에 관찰했다.
그 결과, 단계 1 에서 조건 1 하에 배양한 부유 배양 개시 이후 27일째의 세포 응집체에서는, 세포 응집체의 표면에 Sox2-양성 신경 전구 세포가 존재함이 밝혀졌다 (도 32, A). 또한 공염색 분석은 Sox2-양성 신경 전구 세포의 약 98% 가 Sox2-양성 및 FoxG1-양성 대뇌 신경 전구 세포임이 밝혀졌다 (도 32, B). 또한, 단계 1 에서 조건 2 하에 배양한 부유 배양 개시 이후 27일째의 세포 응집체는, 조건 1 과 마찬가지로, 세포 응집체의 표면에 Sox2-양성 신경 전구 세포를 또한 갖고, Sox2-양성 신경 전구 세포의 약 98% 는 Sox2-양성 및 FoxG1-양성 대뇌 신경 전구 세포임이 밝혀졌다.
이 결과로부터, 단계 1 에서 TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질 및/또는 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질을 첨가하고, 단계 3 에서 TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질 및 Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질을 첨가함으로써, 출발 물질로서 피더-프리 배양한 인간 iPS 세포로부터 대뇌 조직을 제조할 수 있음이 밝혀졌다.
실시예 32: 피더-프리 배양한 인간 iPS 세포를 출발 물질로서, 및 단계 1 에서 TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질을 사용한, 인간 iPS 세포로부터 대뇌 조직의 제조 실시예
실시예 31 에 기재된 방법에 따라 제조된 부유 배양 개시 이후 27일째의 세포 응집체를, 90 mm 의 저접착 배양 디쉬 (SUMITOMO BAKELITE 사제) 로 옮기고, 1% N2 보충제 (Life Technologies 사제) 를 첨가한 무혈청 배지 (DMEM/F12 배지 (Life Technologies 사제)) 중에서, 37℃, 5% CO2 에서 부유 배양했다. 그 기간 동안, 하나의 90 mm 저접착 배양 디쉬 마다 약 30 개의 응집체를 10 ml 의 무혈청 배지에서 부유 배양했다. 그 후, 부유 배양 개시 이후 40일째까지, 2~4일 마다 1회, 1% N2 보충제 (Life Technologies 사제) 를 첨가한 무혈청 배지 (DMEM/F12 배지 (Life Technologies 사제)) 로, 배지의 반량을 교환했다.
얻어진 부유 배양 개시 이후 40일째의 세포 응집체를, 90 mm 의 저접착 배양 디쉬 (SUMITOMO BAKELITE 사제) 에서, 10% 소 태아 혈청, 1% N2 보충제, 및 0.5μM 레티노산을 첨가한 혈청 배지 (DMEM/F12 배지 (Life Technologies 사제)) 중에서, 37℃, 5% CO2 에서 부유 배양했다. 그 기간 동안, 하나의 90 mm 저접착 배양 디쉬 마다 약 30개의 응집체를, 10 ml의 무혈청 배지에서 부유 배양했다. 그 후, 부유 배양 개시 이후 60일째까지, 2~4일 마다 1회 상기 혈청 배지로 배지의 반량을 교환했다.
이에 따라 제조된 부유 배양 개시 이후 60일째의 세포 응집체를 각각 4% 파라-포름알데히드로 고정해, 동결 절편을 제조했다. 이들 동결 절편을, 대뇌의 마커의 하나인 FoxG1 (항-FoxG1 항체, RIKEN 사제, As3514, 토끼), 배측 대뇌 신경 전구 세포의 마커의 하나인 Pax6 (항-Pax6 항체, BD 사제, 마우스), 대뇌의 제6층 뉴런의 마커의 하나인 Tbr1 (항-Tbr1 항체, Abcam 사제, 토끼), 및 대뇌의 제5층 뉴런의 마커의 하나인 Ctip2 (항-Ctip2 항체, Abcam 사제, 래트) 에 대해 면역 염색하고, 공초점 레이저 현미경 (Olympus 사제) 하에 관찰했다.
그 결과, 단계 1 에서 SB431542 및 SAG 로 프리컨디셔닝하는 조건 (조건 1) 하에 배양한 부유 배양 개시 이후 60일째의 세포 응집체에서, 세포 응집체의 전체 세포 중 약 40% 가 FoxG1-양성 대뇌 세포인 것이 밝혀졌다 (도 32, C). 연속 절편의 분석은, FoxG1 양성 세포를 포함하는 세포 응집체는 Pax6-양성 배측 대뇌 신경 전구 세포를 전체 세포 중 약 30% 로 포함하고 (도 32, D), Tbr1-양성 제6층 뉴런을 전체 세포 중 약 5% 로 포함하고, Ctip2-양성 제5층 뉴런을 약 15% 로 포함한다는 것이 밝혀졌다.
또한, 단계 1 에서 LDN193189 및 SAG 로 프리컨디셔닝하는 것을 포함하는 조건 (조건 2) 하에 배양한 부유 배양 개시 이후 60일째의 세포 응집체는, 조건 1 과 마찬가지로 FoxG1-양성 대뇌 세포를 또한 포함함이 확인되었다. 연속 절편의 분석은, FoxG1-양성 세포를 포함하는 세포 응집체가 Pax6-양성 배측 대뇌 신경 전구 세포를 전체 세포 중 약 30% 로 포함하고, Tbr1-양성 제6층 뉴런을 전체 세포 중 약 5% 로 포함하고, Ctip2-양성 제5층 뉴런을 약 15% 로 포함한다는 것이 밝혀졌다.
또한 단계 1 에서 조건 1 또는 조건 2, 단계 2 에서 SAG 를 첨가하는 조건 (조건(A)) 또는 SAG 를 첨가하지 않는 조건 (조건(B)) 의 4 가지 조건 중 어느 하나 하에서 배양된 부유 배양 개시 이후 60일째의 세포 응집체는, FoxG1-양성 대뇌 세포를 포함함이 밝혀졌다.
결과로부터, 단계 1 에서 TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질 및/또는 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질을 첨가하고, 단계 3 에서 TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질 및 Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질을 첨가함으로써, 출발 물질로서 피더-프리 배양한 인간 iPS 세포로부터, 대뇌 조직, 대뇌 신경 전구 세포, 대뇌층 특이적 뉴런 (예를 들어, 제6층 뉴런, 제5층 뉴런) 을 제조할 수 있음이 밝혀졌다.
실시예 33: 출발 물질로서 피더-프리 배양한 인간 iPS 세포, 및 단계 1 에서 TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질을 사용한, 신경 조직의 제조 실시예
실시예 8 에 기재된 방법에 따라, 피더-프리 배양한 충만 상태 1일 이전의 인간 iPS 세포 (1231A3 주) 를 하기 2 가지 조건 하에 1일 동안 피더-프리 배양했다.
● 조건 1: SB431542 (TGFβR 저해제, 5μM)
● 조건 2: LDN193189 (BMPR 저해제, 100 nM)
● 조건 3: 외인성 TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질 및 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하지 않음 (프리컨디셔닝하지 않음)
이에 따라 제조된 조건 1-3 하의 인간 iPS TrypLE Select (Life Technologies 사제) 를 세포 분산액으로 처리하고, 피펫팅 작업에 의해 단일 세포에 추가 분산시켰다. 이를 위한 무혈청 배지로서, F-12 배지와 IMDM 배지의 1:1 혼합물에 10% KSR, 450μM 1-모노티오글리세롤, 및 1 x 화학적으로 정의된 지질 농축물을 첨가한 무혈청 배지를 사용했다.
그 후, 하기 2 가지 유형의 배양 디쉬에 세포를 파종했다.
● 조건(A). 상기 단일 세포에 분산된 인간 iPS 세포를 비세포-접착성 U-바닥의 96-웰 배양 플레이트 (SUMILON Spheroid U-바닥 플레이트 PrimeSurface 96U-바닥 플레이트, SUMITOMO BAKELITE사) 의 웰 마다 1.2 x 104 개의 세포로 100㎕ 의 상기 무혈청 배지에 부유시키고, 37℃, 5% CO2 에서 부유 배양했다.
● 조건(B). 상기 단일 세포에 분산된 인간 iPS 세포를 비세포 접착성의 60 mm 의 F-바닥 세포 배양 디쉬 (부유 배양용 페트리 디쉬, SUMITOMO BAKELITE) 의 웰 마다 2.4 x 105 세포로 4 ml 의 상기 무혈청 배지에 부유시키고, 37℃, 5% CO2 에서 부유 배양했다.
프리컨디셔닝하지 않는 조건 3 하에서, 부유 배양 개시시 (부유 배양 개시 이후 0일째, 단계 2 개시) 에, 상기 무혈청 배지에 Y27632 (20μM) 를 첨가하고, 외인성 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질을 첨가하지 않는 조건 하에 무혈청 배지를 사용했다.
조건 1 및 2 하에, 부유 배양 개시시 (부유 배양 개시 이후 0일째, 단계 2 개시) 에, 상기 무혈청 배지에 Y27632 (20μM) 를 첨가하고, 외인성 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질, SAG 를 추가로 첨가하는 조건 (최종 농도 300 nM) 하에 무혈청 배지를 사용했다 (도 33). 조건 1-3 중 어느 하나 하에, 부유 배양 개시 이후 2일째에 세포 응집체가 형성되었다. 부유 배양 개시 이후 4일째에, Y27632 및 SAG 를 포함하지 않는 상기 무혈청 배지를 첨가했다. 그 후, 2~4일 마다 1회 Y27632 및 SAG 를 포함하지 않는 상기 무혈청 배지로, 배지의 반량을 교환했다.
이에 따라 제조된 세포 응집체를, 부유 배양 개시 이후 19일째에 도립 현미경 (KEYENCE 사제, BIOREVO) 하에 명시야 관찰했다. 그 결과, 프리컨디셔닝하지 않으면 (조건 3), U-바닥 플레이트 (조건 A) 및 F-바닥 배양 디쉬 (조건 B) 모두에서, 세포 응집체가 성장하지 않고 신경 표피가 거의 형성되지 않음이 밝혀졌다 (도 33, A, F). 다른 한편으로는, 단계 1 에서 TGFβR 저해제 (SB431542) 또는 BMPR 저해제 (LDN193189) 로 프리컨디셔닝하는 조건 (조건 1 및 2) 하에, U-바닥 플레이트 (조건 A) 및 F-바닥 배양 디쉬 (조건 B) 모두에서, 세포 응집체가 성장하고 신경 표피가 형성됨이 밝혀졌다 (도 33, B-E, G-J). 즉, 단계 1 에서의 프리컨디셔닝 작업에 의해, U-바닥 플레이트 (조건 A) 에 및 F-바닥 배양 디쉬 (조건 B) 모두에서, 신경 표피의 제조 효율이 향상됨이 밝혀졌다.
실시예 34: 피더-프리 배지 StemFit(AK03N) 를 사용하여 배양한 인간 iPS 세포를, 단계 1 에서 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질로 프리컨디셔닝 작업하고, 단계 2 에서 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질을 첨가하고, 단계 3 에서 BMP4 를 첨가하는 것에 의한, 망막 조직의 형성 실시예
인간 iPS 세포 (Ff-I01 주, 쿄토 대학에서 입수) 를, "Scientific Reports, 4, 3594 (2014)" 에 기재된 방법에 따라 피더-프리 배양했다. 피더-프리 배지로서 StemFit 배지 (AK03N, Ajinomoto Co., Inc. 사제) 를 사용하고, 피더-프리 스캐폴드로서 Laminin 511-E8 (Nippi, Inc. 사제) 를 사용했다.
실시예 8 에 기재된 방법에 따라, 피더-프리 배양한 충만 상태 2일전의 인간 iPS 세포를, SAG (Shh 시그널 전달 경로 작용 물질, 300 nM) 의 존재 하에서, 2일 동안 피더-프리 배양했다 (단계 1, 프리컨디셔닝 처리).
상기 인간 iPS 세포를, TrypLE Select (Life Technologies) 를 사용하여 세포 분산액으로 처리하고, 피펫팅 작업에 의해 단일 세포로 추가 분산시키고, 상기 단일 세포에 분산된 인간 iPS 세포를 비세포-접착성 96-웰 배양 플레이트 (PrimeSurface 96V-바닥 플레이트, SUMITOMO BAKELITE 사제) 의 웰 마다 1.0 x 104 개의 세포로 100㎕ 의 무혈청 배지에 부유시키고, 37℃, 5% CO2 에서 부유 배양했다. 이를 위한 무혈청 배지로서, F-12 배지와 IMDM 배지의 1:1 혼합물에 10% KSR, 450μM 1-모노티오글리세롤, 및 1 x 화학적으로 정의된 지질 농축물을 첨가한 무혈청 배지를 사용했다.
부유 배양 개시시 (부유 배양 개시 이후 0일째, 단계 2 개시) 에, 상기 무혈청 배지에 Y27632 (최종 농도 20μM) 및 SAG (Shh 시그널 전달 경로 작용 물질, 500 nM) 를 첨가했다. 부유 배양 개시 이후 2일째까지, 세포 응집체가 형성되었다 (단계 2 종료, 단계 3 개시).
부유 배양 개시 이후 3일째에, 외인성 인간 재조합 BMP4 의 최종 농도가 1.5 nM (55 ng/ml) 또는 5 nM (183 ng/ml) 이도록, Y27632 및 SAG 를 포함하지 않고 인간 재조합 BMP4 (R&D 사제) 를 포함하는 배지 (50㎕) 를 첨가했다. 부유 배양 개시 이후 6일째에, 배지 50㎕ 를 버리고, 외인성 인간 재조합 BMP4 의 최종 농도를 1.5 nM (55 ng/ml) 또는 5 nM (183 ng/ml) 에서 유지하기 위해, Y27632 및 SAG 를 포함하지 않고 인간 재조합 BMP4 (R&D 사제) 를 포함하는 배지 50㎕ 를 첨가했다. 그 후, 2~4일 마다 1회 Y27632, SAG 및 인간 재조합 BMP4 를 포함하지 않는 상기 무혈청 배지로 배지의 반량을 교환했다.
이에 따라 제조된 세포를 부유 배양 개시 이후 19일째에, 도립 현미경 (KEYENCE) 하에 명시야 관찰했다. 그 결과, BMP4 를 1.5 nM 또는 5 nM 로 첨가한 조건 하에, 세포 응집체가 성장하고 신경 조직이 효율적으로 형성됨이 밝혀졌다 (도 34, A-B).
이들 결과로부터, 단계 1 에서 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질 (SAG) 로 2일 동안 프리컨디셔닝하고, 단계 2 에서 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질을 첨가하고, 단계 3 에서 BMP4 를 1.5 nM 또는 5 nM 로 첨가한 조건 하에, 피더-프리 배양한 인간 iPS 세포로부터 효율적으로 신경 조직을 제조할 수 있음이 밝혀졌다.
부유 배양 개시 이후 19일째의 세포 응집체를, 4% 파라-포름알데히드로 고정해, 동결 절편을 제조했다. 이들 동결 절편을, 망막 조직 마커의 하나인 Chx10 (항-Chx10 항체, Exalpha, 양) 에 대해 면역 염색을 실시했다. 이들 면역 염색된 절편을, 도립 형광 현미경 하에 관찰했다. 그 결과, BMP4 를 최종 농도 1.5 nM 를 유지하기 위해 2회 첨가한 조건 하에, 전체 세포 중 Chx10-양성 세포의 비율은 약 70% 였다 (도 34, C). 또한, BMP4 를 최종 농도 5 nM 를 유지하기 위해 2회 첨가한 조건 하에, 전체 세포 중 Chx10-양성 세포의 비율은 약 90% 였다 (도 34, D).
이들 결과로부터, 피더-프리 배지 StemFit (AK03N) 에서 배양한 인간 iPS 세포를 단계 1 에서 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질 (SAG) 로 2일 동안 프리컨디셔닝하고, 단계 2 에서 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질을 첨가하고, 단계 3 에서 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 5 nM 로 2회 첨가 (즉, BMP 시그널 전달 경로 작용 물질 농도를 6일 동안 5 nM 에서 유지하는 조건) 하는 것을 포함하는 조건 하에, 효율적으로 망막 조직을 제조할 수 있음이 밝혀졌다.
실시예 35: 단계 1 에서 Shh 시그널 작용 물질로 1~4일 동안 프리컨디셔닝하고, 단계 2 에서 Shh 시그널 작용 물질을 이용하고, 단계 3 에서 BMP 시그널 작용 물질을 첨가하는 것에 의한, 피더-프리 인간 iPS 세포로부터의 망막 조직의 형성 실시예
인간 iPS 세포 (Ff-I01 주, 쿄토 대학에서 입수) 를, "Scientific Reports, 4, 3594 (2014)" 에 기재된 방법에 따라 피더-프리 배양했다. 피더-프리 배지로서 StemFit 배지 (AK03N, Ajinomoto Co., Inc. 사제) 를 사용하고, 피더-프리 스캐폴드로서 Laminin 511-E8 (Nippi, Inc. 사제) 를 사용했다.
하기 4 가지 조건 하에 프리컨디셔닝 처리를 실시했다.
● 조건 1: 충만 상태 24시간 이전의 인간 iPS 세포를, SAG (Shh 시그널 전달 경로 작용 물질, 300 nM) 를 첨가한 StemFit 배지 (AK03N) 에서, 24시간 동안 피더-프리 배양했다.
● 조건 2: 충만 상태 48시간 이전의 인간 iPS 세포를, SAG (Shh 시그널 전달 경로 작용 물질, 300 nM) 를 첨가한 StemFit 배지 (AK03N) 에서, 48시간 동안 피더-프리 배양했다.
● 조건 3: 충만 상태 72시간 이전의 인간 iPS 세포를, ?SAG (Shh 시그널 전달 경로 작용 물질, 300 nM) 를 첨가한 StemFit 배지 (AK03N) 에서, 72시간 동안 피더-프리 배양했다.
● 조건 4: 충만 상태 96시간 이전의 인간 iPS 세포를, SAG (Shh 시그널 전달 경로 작용 물질, 300 nM) 를 첨가한 StemFit 배지 (AK03N) 에서, 96시간 동안 피더-프리 배양했다.
상기 4 가지 조건 하에 배양한 인간 iPS 세포를, 각각 TrypLE Select (Life Technologies) 를 사용하여 세포 분산액으로 처리하고, 피펫팅 작업에 의해 단일 세포에 추가 분산시키고, 그 후 상기 단일 세포에 분산된 인간 iPS 세포를 비세포-접착성 96-웰 배양 플레이트 (PrimeSurface 96V-바닥 플레이트, SUMITOMO BAKELITE 사제) 의 웰 마다 1.0 x 104 개의 세포로 100㎕ 의 무혈청 배지에 부유시키고, 37℃, 5% CO2 에서 부유 배양했다. 이를 위한 무혈청 배지 (gfCDM+KSR) 로서, F-12 배지와 IMDM 배지의 1:1 혼합물에 10% KSR, 450μM 1-모노티오글리세롤 및 1 x 화학적으로 정의된 지질 농축물을 첨가한 무혈청 배지를 사용했다.
부유 배양 개시시 (부유 배양 개시 이후 0일째, 단계 2 개시) 에, 상기 무혈청 배지에 Y27632 (최종 농도 20μM) 및 SAG (Shh 시그널 전달 경로 작용 물질, 500 nM) 를 첨가했다 (도 35). 부유 배양 개시 이후 2일째까지, 모든 조건 하에 세포 응집체가 형성되었다 (단계 2 종료, 단계 3 개시).
부유 배양 개시 이후 3일째에, 외인성 인간 재조합 BMP4 의 최종 농도가 1.5 nM (55 ng/ml) 이도록, Y27632 및 SAG 를 포함하지 않고 인간 재조합 BMP4 (R&D 사제) 를 포함하는 배지 (50㎕) 를 첨가했다. 부유 배양 개시 이후 6일째에 배지 50㎕ 를 버리고, 외인성 인간 재조합 BMP4 의 최종 농도를 1.5 nM (55 ng/ml) 에서 유지하기 위해, Y27632 및 SAG 를 포함하지 않고 인간 재조합 BMP4 (R&D 사제) 를 포함하는 배지 50㎕ 를 첨가했다. 그 후, 2~4일 마다 1회 Y27632, SAG 및 인간 재조합 BMP4 를 포함하지 않는 상기 무혈청 배지로, 배지의 반량을 교환했다.
이에 따라 제조된 세포 응집체를 부유 배양 개시 이후 19일째에, 도립 현미경 (KEYENCE) 하에 명시야 관찰했다. 그 결과, 상기 조건 1~4 중 어느 하나의 프리컨디셔닝을 포함하는 조건 하에서, 세포 응집체가 성장하고 효율적으로 신경 표피가 형성됨이 밝혀졌다 (도 35, A-D).
이들 결과로부터, 단계 1 에서 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질로 1~4일 동안 프리컨디셔닝하고, 단계 2 에서 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질을 첨가하고, 단계 3 에서 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 첨가하는 것을 포함하는 조건 하에, 피더-프리 배양한 인간 iPS 세포로부터 효율적으로 신경 조직을 제조할 수 있음이 밝혀졌다.
이에 따라 제조된 부유 배양 개시 이후 19일째의 세포 응집체를 4% 파라-포름알데히드로 고정해, 동결 절편을 제조했다. 이들 동결 절편을, 망막 조직 마커의 하나인 Chx10 (항-Chx10 항체, Exalpha 사제, 양) 에 대해 면역 염색하고, 형광 현미경 하에 관찰했다. 그 결과, SAG 로 24시간 동안 프리컨디셔닝하는 것을 포함하는 조건 (조건 1) 에 의해, 전체 세포 중 Chx10-양성 세포의 비율이 약 10% 임이 밝혀졌다 (도 35, E). 다른 한편으로는, SAG 로 48, 72, 또는 96시간 동안 프리컨디셔닝하는 조건 (조건 2, 3, 4) 하에 전체 세포 중 Chx10-양성 세포의 비율은 약 80% 임이 밝혀졌다 (도 35, F-H).
이들 결과로부터, 단계 1 에서 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질로 1~4일 동안 프리컨디셔닝하고, 단계 2 에서 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질을 첨가하고, BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 첨가하는 것을 포함하는 임의의 조건 하에, 효율적으로 망막 조직을 제조할 수 있음이 밝혀졌다.
실시예 36: 단계 1 에서 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질 및 BMP 시그널 전달 경로 저해 물질로 30분~2일 동안 프리컨디셔닝하고, 단계 3 에서 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 첨가하는, 피더-프리 인간 iPS 세포로부터의 망막 조직의 형성 실시예
인간 iPS 세포 (1231A3 주, 쿄토 대학에서 입수) 를, "Scientific Reports, 4, 3594 (2014)" 에 기재된 방법에 따라 피더-프리 배양했다. 피더-프리 배지로서 StemFit 배지 (AK03, Ajinomoto Co., Inc. 사제) 를 사용하고, 피더-프리 스캐폴드로서 Laminin 511-E8 (Nippi, Inc. 사제) 를 사용했다.
하기 5 가지 조건 하에 프리컨디셔닝 처리를 실시했다.
● 조건 1: 충만 상태의 직전의 인간 iPS 세포를, LDN193189 (BMPR 저해제, 100 nM) 및 SAG (Shh 시그널 전달 경로 작용 물질, 300 nM) 를 첨가한 StemFit 배지 (AK03) 에서, 30분 동안 피더-프리 배양했다.
● 조건 2: 충만 상태의 직전의 인간 iPS 세포를, LDN193189 (BMPR 저해제, 100 nM) 및 SAG (Shh 시그널 전달 경로 작용 물질, 300 nM) 를 첨가한 StemFit 배지 (AK03) 에서, 6시간 동안 피더-프리 배양했다.
● 조건 3: 충만 상태 1일 이전의 인간 iPS 세포를, LDN193189 (BMPR 저해제, 100 nM) 및 SAG (Shh 시그널 전달 경로 작용 물질, 300 nM) 를 첨가한 StemFit 배지 (AK03) 에서, 24시간 동안 피더-프리 배양했다.
● 조건 4: 충만 상태의 2일전의 인간 iPS 세포를, LDN193189 (BMPR 저해제, 100 nM) 및 SAG (Shh 시그널 전달 경로 작용 물질, 300 nM) 를 첨가한 StemFit 배지 (AK03) 에서, 48시간 동안 피더-프리 배양했다.
● 조건 5: TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질 및/또는 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질을 첨가하지 않는 조건 하에 피더-프리 배양한 충만 상태의 인간 iPS 세포.
상기 5 가지 조건 하에 배양한 인간 iPS 세포를, 각각 TrypLE Select (Life Technologies) 를 사용하여 세포 분산액으로 처리하고, 피펫팅 작업에 의해 단일 세포에 추가 분산시키고, 그 후 상기 단일 세포에 분산된 인간 iPS 세포를 비세포-접착성 96-웰 배양 플레이트 (PrimeSurface 96V-바닥 플레이트, SUMITOMO BAKELITE 사제) 의 웰 마다 1.2 x 104 개의 세포로 100㎕ 의 무혈청 배지에 부유시키고, 37℃, 5% CO2 에서 부유 배양했다. 이를 위한 무혈청 배지 (gfCDM+KSR) 로서, F-12 배지와 IMDM 배지의 1:1 혼합물에 10% KSR, 450μM 1-모노티오글리세롤 및 1 x 화학적으로 정의된 지질 농축물을 첨가한 무혈청 배지를 사용했다.
부유 배양 개시시 (부유 배양 개시 이후 0일째, 단계 2 개시) 에, 상기 무혈청 배지에 Y27632 (최종 농도 20μM) 를 첨가했다. 부유 배양 개시 이후 2일째까지, 임의의 조건 하에 세포 응집체가 형성되었다 (단계 2 종료, 단계 3 개시).
부유 배양 개시 이후 3일째에, 외인성 인간 재조합 BMP4 의 최종 농도가 1.5 nM (55 ng/ml) 이도록, Y27632 및 SAG 를 포함하지 않고 인간 재조합 BMP4 (R&D 사제) 를 포함하는 배지 (50㎕) 를 첨가했다. 그 후, 2~4일 마다 1회 Y27632, SAG, 인간 재조합 BMP4 를 포함하지 않는 상기 무혈청 배지로, 배지의 반량을 교환했다.
이에 따라 제조된 세포를 부유 배양 개시 이후 19일째에, 도립 현미경 (KEYENCE 사제) 을 사용하여 명시야 관찰했다. 그 결과, 프리컨디셔닝작업을 하지 않는 조건 (조건 5) 하에서, 응집체는 파괴되고 신경 표피가 거의 형성될 수 없었다 (도 36, A). 다른 한편으로는, LDN193189 및 SAG 로 30분, 6시간, 24시간 및 48시간의 임의의 기간 동안 프리컨디셔닝 처리하는 것을 포함하는 조건 (조건 1－4) 하에, 응집체가 성장하고 신경 표피가 효율적으로 형성됨이 밝혀졌다 (도 36, B-E).
이들 결과로부터, 단계 1 에서 Shh 시그널 작용 물질로 30분~2일 동안 프리컨디셔닝하고, 단계 3 에서 BMP 시그널 작용 물질을 첨가하는 것을 포함하는 조건 하에, 피더-프리 배양한 인간 iPS 세포로부터 효율적으로 신경 조직을 제조할 수 있음이 밝혀졌다.
이에 따라 제조된 부유 배양 개시 이후 22일째의 세포 응집체를 4% 파라-포름알데히드로 고정해, 동결 절편을 제조했다. 이들 동결 절편을, 망막 조직 마커의 하나인 Chx10 (항-Chx10 항체, Exalpha 사제, 양) 에 대해 면역 염색했다. 이들 면역 염색된 절편을, 도립 형광 현미경 하에 관찰했다. 그 결과, LDN193189 및 SAG 로, 30분, 6시간, 24시간 및 48시간의 임의의 기간 동안 프리컨디셔닝하는 것을 포함하는 조건 (조건 1－4) 하에, 전체 세포 중 Chx10-양성 세포의 비율이 약 80% 임이 밝혀졌다 (도 36, F-I).
이들 결과로부터, 단계 1 에서 Shh 시그널 전달 경로 작용 물질 및 BMP 시그널 전달 경로 저해 물질로 30분~2일 동안 프리컨디셔닝하고, 단계 3 에서 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 첨가하는 것을 포함하는 조건 하에, 피더-프리 인간 iPS 세포로부터 효율적으로 망막 조직을 제조할 수 있음이 밝혀졌다.
본 발명의 제조 방법에 따라, 피더 세포 부재 하에서 다능성 줄기 세포의 신경 세포로의 분화 유도를 실시하고, 신경 조직을 제조하는 것이 가능하게 된다. 본 발명의 제조 방법은, 의약품 후보 화합물 및 기타 화학 물질의 독성 또는 효능 평가, 신경 조직 이식 치료용 이식 재료에 대한 응용을 위한 시험, 또는 치료에 사용하기 위한 물질로서 사용되는 신경 조직을 제조할 수 있기 때문에 유용하다.
여기서 언급된 특허, 특허 출원 명세서 및 과학 문헌을 포함하는 임의의 문헌에 개시된 내용은 본원에서 그 전체가, 이들이 본원에 개시된 정도로 참조 인용된다.
본 출원은, 일본에서 출원된 일본 특허출원 제 2014-217867 호 (출원일: 2014년 10월 24일) 을 기초로 하고, 그 내용은 본 명세서에 모두 포함된다.

Claims (37)

  1. 하기 단계 (1) ~ (3) 을 포함하는, 망막 세포 또는 망막 조직의 제조 방법:
    (1) 다능성 줄기 세포를, 피더 세포 부재 하에서, 및 1) TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질 및/또는 소닉 헤지호그 (sonic hedgehog) 시그널 전달 경로 작용 물질, 및 2) 미분화 상태를 유지하는 인자를 포함하는 배지에서 배양하는 제 1 단계,
    (2) 제 1 단계에서 얻어진 세포를 부유 배양해, 세포 응집체를 형성시키는 제 2 단계, 및
    (3) 제 2 단계에서 얻어진 응집체를, 분화-유도 인자로서 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질의 존재 하에 부유 배양해, 망막 세포 또는 망막 조직을 포함하는 응집체를 얻는 제 3 단계.
  2. 제 1 항에 있어서, 제 2 단계에서, 제 1 단계에서 얻어진 세포를 분산시키고, 분산된 세포를 부유 배양하는 제조 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 미분화 상태를 유지하는 인자가 FGF 시그널 전달 경로 작용 물질인 제조 방법.
  4. 제 3 항에 있어서, FGF 시그널 전달 경로 작용 물질이 bFGF 인 제조 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 제 2 단계에서, 세포를 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하는 무혈청 배지 중에 부유 배양하는 제조 방법.
  6. 제 1 항에 있어서, TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질이, Nodal/Activin 시그널 전달 경로 저해 물질, TGFβ 시그널 전달 경로 저해 물질, 또는 BMP 시그널 전달 경로 저해 물질인 제조 방법.
  7. 제 1 항에 있어서, TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질이 Lefty, SB431542, A-83-01 또는 LDN193189 인 제조 방법.
  8. 제 5 항에 있어서, 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질이 Shh, SAG 또는 퍼모파민 (Purmorphamine) 인 제조 방법.
  9. 제 1 항에 있어서, BMP 시그널 전달 경로 작용 물질이 BMP2, BMP4, BMP7 및 GDF7 로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질인 제조 방법.
  10. 제 1 항에 있어서, BMP 시그널 전달 경로 작용 물질이 BMP4 인 제조 방법.
  11. 제 1 항에 있어서, 제 3 단계에서 얻어지는 응집체가 망막 원세포, 신경 망막 원세포, 광수용체 전구 세포, 광수용체 세포, 막대형 광수용체 세포, 원뿔형 광수용체 세포, 수평 세포, 아마크린 세포, 개재뉴런, 신경절 세포, 망막 색소 표피 세포 및 모양체 주연부 세포 (ciliary marginal zone cell) 로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 세포를 포함하는 제조 방법.
  12. 제 5 항에 있어서, 다능성 줄기 세포가 인간 다능성 줄기 세포이며, 제 2 단계에서의 배지 중의 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질의 농도가, 10 nM ~ 700 nM 인 SAG 와 동등한 소닉 헤지호그 시그널 전달 촉진 활성을 나타내는 농도이며, 망막 조직이 인간 망막 조직인 제조 방법.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 3 단계에서, 제 2 단계의 개시 이후 1 일째 내지 9 일째에 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질이 배지에 첨가되는 제조 방법.
  14. 제 5 항, 제 8 항 및 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 3 단계에서, 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질을, 700 nM 인 SAG 와 동등하거나 그 이하인 소닉 헤지호그 시그널 전달 촉진 활성을 나타내는 농도로 포함하는 배지에서 응집체를 배양하는 제조 방법.
  15. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 단계에서의 배양 기간이 0.5 시간 ~ 144 시간인 제조 방법.
  16. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 단계가 접착 배양법으로 행해지는 제조 방법.
  17. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 3 단계에서, 제 2 단계 개시 이후 3일째 내지 6일째에 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질이 배지에 첨가되는 제조 방법.
  18. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 다능성 줄기 세포가 영장류 다능성 줄기 세포인 제조 방법.
  19. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 다능성 줄기 세포가 인간 다능성 줄기 세포인 제조 방법.
  20. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 다능성 줄기 세포가 유도된 다능성 줄기 세포인 제조 방법.
  21. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 2 단계에서 균일한 응집체가 형성되는 제조 방법.
  22. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 부유 배양이 기저 막 표본의 부재 하에서 행해지는 제조 방법.
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  30. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 다능성 줄기 세포의 다능성-유형 상태가 단계 (1) 전반에 걸쳐 유지되는 제조 방법.
  31. 제 30 항에 있어서, 다능성 줄기 세포의 다능성-유형 상태는 Oct3/4 양성인 제조 방법.
  32. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 단계에서 얻어진 세포는 Oct3/4 양성 줄기 세포를 60 % 이상의 비율로 포함하는 제조 방법.
  33. 하기를 포함하는 신경 망막의 제조 방법:
    제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 따른 제조 방법에 의해 망막 조직을 포함하는 세포 응집체를 제조하는 것, 및
    세포 응집체로부터 신경 망막을 절단해내는 것.
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