KR20240034191A - 인간 다능성 줄기세포 유래 대뇌 피질 세포 제제의 제조 방법 - Google Patents

인간 다능성 줄기세포 유래 대뇌 피질 세포 제제의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 재생 의료에 유용한 인간 다능성 줄기세포 유래의 대뇌 오가노이드, 대뇌 피질 세포를 포함하는 세포괴 및 이들 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 본 발명의 대뇌 오가노이드의 제조 방법은, 배양보조세포의 비존재 하, 다능성 줄기세포로부터 대뇌 오가노이드를 제조하는 방법이며, (1) 다능성 줄기세포를, bFGF가 실질적으로 포함되지 않으며, 또한 TGFβ 시그널을 실질적으로 야기하지 않는 배양액 중에서 배양하는 공정과, (2) 공정 (1)에서 얻어진 세포를, 신경세포로 분화 유도하는 공정을 포함한다.

Description

인간 다능성 줄기세포 유래 대뇌 피질 세포 제제의 제조 방법
본 발명은 다능성 줄기세포 유래의 대뇌 오가노이드, 또는 대뇌 피질 세포괴 및 그들의 제조 방법 등에 관한 것이다.
뇌혈관 장애에 의한 운동 마비 등의 증상 개선을 목적으로 하여, 인간 다능성 줄기세포, 특히 인간 인공 다능성 줄기세포(induced pluripotent stem cell; iPS 세포)로부터 분화 유도한 신경세포를 이식하는 세포 이식 치료가 기대되고 있다.
마우스 태아 유래 섬유아세포(Mouse embryonic fibroblast; MEF) 등의 배양보조세포(피더 세포라고 칭하는 경우가 있음)의 존재 하에 유지된 인간 배아 줄기세포(embryonic stem cell; ES 세포)로부터 대뇌 오가노이드를 분화 유도하는 방법(Serum-free Floating culture of Embryoid Bodies-like aggregates with quick reaggregation: SFEBq법)이 확립되어, 운동 신경을 포함하는 대뇌 피질 V, IV층의 신경세포(심층 뉴런(deep layer neuron))가 얻어질 수 있게 되었다.
한편, 임상에 사용하는 이식용 세포는 이종(異種) 세포의 비존재 하(피더-프리(feeder-free))에서 제조하는 것이 바람직하다. 그러나 배양보조세포의 비존재 하에 유지된 인간 다능성 줄기세포를 SFEBq법에 의해 분화 유도를 행하면, 대뇌 오가노이드를 발생시키는 효율이 낮은 것이 문제였다(비특허문헌 3).
특허문헌 1: WO 2015/076388 특허문헌 2: WO 2016/167372 특허문헌 3: WO 2016/063985
비특허문헌 1: Kitahara, et al., Stem Cell Reports 2020 Vol. 15, 467-481 비특허문헌 2: Kuwahara, et. al., Scientific Reports 2019, 9:18936 비특허문헌 3: Eiraku, M et al., Cell Stem Cell, 3, 519-532(2008)
본 발명은 재생 의료에 유용한, 인간 다능성 줄기세포 유래의 대뇌 오가노이드, 대뇌 피질 세포를 포함하는 세포괴 및 이들의 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 더욱 상세하게는, 배양보조세포의 비존재 하에, 다능성 줄기세포로부터 대뇌 오가노이드를 제조하는 방법 및 해당 방법에 의해 얻어지는 산물의 제공을 목적으로 한다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명자들은 배양보조세포의 비존재 하, 다능성 줄기세포를, bFGF가 실질적으로 포함되지 않고 또한 TGFβ 시그널을 실질적으로 야기하지 않는 배양액 중에서 배양하고 나서, 신경세포로 분화 유도하면, 대뇌 오가노이드를 효율 좋게 제조할 수 있는 것을 발견하고, 또한 Notch 시그널 저해제를 포함하는 배양액 중에서 대뇌 오가노이드를 배양하면 이식에 적합한 품질의 대뇌 피질 세포괴를 효율 좋게 제조할 수 있음을 발견하였다.
즉, 본 발명은 이하와 같은 것을 제공한다.
[1] 배양보조세포의 비존재 하, 다능성 줄기세포로부터 대뇌 오가노이드를 제조하는 방법으로서,
(1) 다능성 줄기세포를, bFGF가 실질적으로 포함되지 않고 또한 TGFβ 시그널을 실질적으로 야기하지 않는 배양액 중에서 배양하는 공정과,
(2) 공정 (1)에서 얻어진 세포를, 신경세포로 분화 유도하는 공정을 포함하는, 방법.
[2] 공정 (2)가,
(2a) 공정 (1)에서 얻어진 세포를, TGFβ 시그널 저해제 및 Wnt 시그널 전달 저해제를 포함하는 배양액 중에서 부유 배양하여 세포괴를 얻는 공정과,
(2b) 공정 (2a)에서 얻어진 세포괴를, TGFβ 시그널 저해제 및 Wnt 시그널 전달 저해제를 실질적으로 포함하지 않는 배양액 중에서 부유 배양하여, 대뇌 오가노이드를 얻는 공정
을 포함하는, [1]에 기재된 방법.
[3] 공정 (2a)의 부유 배양이 정치 배양인, [2]에 기재된 방법.
[4] 공정 (2b)의 부유 배양이 진동 배양인, [2] 또는 [3]에 기재된 방법.
[5] 공정 (1)의 배양 기간이 3일간 미만인, [1] 내지 [4] 중 어느 하나에 기재된 방법.
[6] 공정 (1)의 배양 기간이 12시간 이상 2일간 이하인, [1] 내지 [5] 중 어느 하나에 기재된 방법.
[7] 공정 (1)의 배양액이 SB431542, A-83-01 및 XAV-939로 이루어지는 군으로부터 선택되는 TGFβ 시그널 저해제를 포함하는, [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 기재된 방법.
[8] 공정 (1), 공정 (2a) 및 공정 (2b)에서의 배양액이 무혈청 배양액인, [2] 내지 [7] 중 어느 하나에 기재된 방법.
[9] 상기 다능성 줄기세포가 인간 인공 다능성 줄기세포 또는 인간 배아 줄기세포인, [1] 내지 [8] 중 어느 하나에 기재된 방법.
[10] (3) 공정 (2)에서 얻어진 복수의 세포괴로부터, 세포괴의 형상, 내부 구조, 사이즈, 표면의 색채 또는 모양 및 유전자 발현으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 이상을 지표로 하여, 대뇌 오가노이드를 선별하는 공정을 더 포함하는, [1] 내지 [9] 중 어느 하나에 기재된 방법.
[11] [1] 내지 [9] 중 어느 하나에 기재된 방법을 이용하여 제조되는 세포 배양물로서,
복수의 구(球)상의 세포괴를 포함하고,
상기 복수의 구상의 세포괴에서 차지하는 대뇌 오가노이드의 비율이 40% 이상인 세포 배양물.
[12] 상기 대뇌 오가노이드에서 차지하는 대뇌 피질 유사 구조물의 비율이 40% 이상인, [11]에 기재된 세포 배양물.
[13] 대뇌 오가노이드가, 또한 이하의 (1)~(5):
(1) 구상의 세포괴인 것,
(2) 세포괴의 내부에 대뇌 피질 유사 구조물을 갖는 것,
(3) 표면에 색소 침착을 갖지 않는 것,
(4) 세포괴의 일부에 낭포상 형상, 돌기 형상 및 풍선상 형상의 어느 것도 갖지 않는 것 및
(5) NEUROD6, NEUROD2, SSTR2, TBR1, ZBTB18, NHLH1, IGFBPL1, NRN1, RTN1, THSD7A, NRXN1, BHLHE22, CALB2, KHDRBS3, CCSAP, PDE1A, NEUROD1, NPTX1, NXPH4, NTS, NEUROG2, OLFM1, PRDM8, CORO2B, TP53I11, ZFPM2, PCDH9, NELL2, SRRM4, SCG3, DCC, EPB41L3, SLC17A7, ST18, NSG2, EMX1, CAP2, SYT4, NSMF, ANK3, MYT1L, FSTL5, CELF4, B3GAT1, EPHA5, NHLH2 및 DLL3으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1개의 마커를 발현하고 있는 것
으로부터 선택되는 1 이상의 특징을 갖는 세포괴인, [12]에 기재된 세포 배양물.
[14] (a) 증식성 마커 양성 세포 수가 전(全) 세포 수의 10% 이하이고,
(b) 신경세포 마커, 피질 V/VI층 마커 및 전뇌 마커로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커가 양성인 세포 수가 전 세포 수의 70% 이상이며, 또한
(c) 신경 상피 또는 대뇌 피질 유사 구조를 실질적으로 포함하지 않는 것을 특징으로 하는, 대뇌 피질 세포괴.
[15] 상기 (a)의 증식성 마커가 Ki67이고,
상기 (b)의 신경세포 마커가 βIII-튜불린이며, 피질 V/VI층 마커가 Ctip2이고, 전뇌 마커가 FOXG1인,
[14]에 기재된 대뇌 피질 세포괴.
[16] (d) NEUROD6, NEUROD2, SSTR2, TBR1, ZBTB18, NHLH1, IGFBPL1, NRN1, RTN1, THSD7A, NRXN1, BHLHE22, CALB2, KHDRBS3, CCSAP, PDE1A, NEUROD1, NPTX1, NXPH4, NTS, NEUROG2, OLFM1, PRDM8, CORO2B, TP53I11, ZFPM2, PCDH9, NELL2, SRRM4, SCG3, DCC, EPB41L3, SLC17A7, ST18, NSG2, EMX1, CAP2, SYT4, NSMF, ANK3, MYT1L, FSTL5, CELF4, B3GAT1, EPHA5, NHLH2 및 DLL3으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개의 마커를 더욱 발현하고 있는 [14] 또는 [15]에 기재된 대뇌 피질 세포괴.
[17] SLC17A7을 발현하고 있는 [16]에 기재된 대뇌 피질 세포괴.
[18] GAD2, COL1A1, TYR, TTR 및 HOXA2로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 이상의 유전자를 실질적으로 발현하지 않은 [15] 내지 [17] 중 어느 하나에 기재된 대뇌 피질 세포괴.
[19] 배양보조세포의 비존재 하에 다능성 줄기세포로부터 대뇌 피질 세포괴를 제조하는 방법으로서,
(i) 다능성 줄기세포로부터 대뇌 오가노이드를 얻는 공정과,
(ii) 공정 (i)에서 얻어진 대뇌 오가노이드를, Notch 시그널 저해제를 포함하는 배양액 중에서 배양하여 대뇌 피질 세포괴를 얻는 공정
을 포함하는, 방법.
[20] 상기 공정 (i)에서, [1] 내지 [10] 중 어느 하나에 기재된 방법에 의해 다능성 줄기세포로부터 대뇌 오가노이드를 얻는, [19]에 기재된 방법.
[21] (A) 증식성 마커 양성 세포 수가 전 세포 수의 5% 이하이고,
(B) 신경세포 마커, 피질 V/VI층 마커 및 전뇌 마커로부터 선택되는 하나 이상의 마커 양성 세포 수가 전 세포 수의 70% 이상이며, 또한
(C) 신경 상피 또는 대뇌 피질 유사 구조를 실질적으로 포함하지 않는
것을 특징으로 하는, 고순도 대뇌 피질 세포괴.
[22] 상기 (A)의 증식성 마커가 Ki67이고,
상기 (B)의 신경세포 마커가 βIII-튜불린이며, 피질 V/VI층 마커가 Ctip2이고, 전뇌 마커가 FOXG1인,
[21]에 기재된 고순도 대뇌 피질 세포괴.
[23] (D) NEUROD6, NEUROD2, SSTR2, TBR1, ZBTB18, NHLH1, IGFBPL1, NRN1, RTN1, THSD7A, NRXN1, BHLHE22, CALB2, KHDRBS3, CCSAP, PDE1A, NEUROD1, NPTX1, NXPH4, NTS, NEUROG2, OLFM1, PRDM8, CORO2B, TP53I11, ZFPM2, PCDH9, NELL2, SRRM4, SCG3, DCC, EPB41L3, SLC17A7, ST18, NSG2, EMX1, CAP2, SYT4, NSMF, ANK3, MYT1L, FSTL5, CELF4, B3GAT1, EPHA5, NHLH2 및 DLL3으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개의 유전자를 발현하고 있는, [21] 또는 [22]에 기재된 고순도 대뇌 피질 세포괴.
[24] SLC17A7, NEUROD6 및 EMX1로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 이상의 유전자를 발현하고 있는, [23]에 기재된 고순도 대뇌 피질 세포괴.
[25] GAD2, COL1A1, TYR, TTR 및 HOXA2로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 이상의 유전자를 실질적으로 발현하지 않은, [21] 내지 [24] 중 어느 하나에 기재된 고순도 대뇌 피질 세포괴.
[26] 배양보조세포의 비존재 하에, 다능성 줄기세포로부터 고순도 대뇌 피질 세포괴를 제조하는 방법으로서,
(i) 다능성 줄기세포로부터 대뇌 오가노이드를 얻는 공정과,
(ii) 공정 (i)에서 얻어진 대뇌 오가노이드를, 배양액 중에서 배양하는 공정과,
(iii) 공정 (ii)에서 얻어진 세포 배양물을, 단세포 또는 2~5개의 세포 집합체(Cell clump)로까지 분산시키는 공정과,
(iv) 공정 (ii)에서 얻어진 세포 배양물 또는 공정 (iii)에서 얻어진 세포 집단을 1 이상의 신경 영양 인자, 아스코브산 및 cAMP 활성화제를 포함하는 배양액 중에서 배양하여 세포괴를 얻는 공정
을 포함하며, 상기 공정 (ii)의 배양액 및/또는 상기 공정 (iv)의 배양액은 Notch 시그널 저해제를 포함하는, 방법.
[27] 상기 공정 (i)에서, [1] 내지 [10] 중 어느 하나에 기재된 방법에 의해 다능성 줄기세포로부터 대뇌 오가노이드를 얻는, [26]에 기재된 방법.
[28] 공정 (ii)에 부여하는 대뇌 오가노이드가 신경세포로의 분화 유도 개시로부터 28일 후~44일 후의 대뇌 오가노이드인, [19], [20], [26] 및 [27] 중 어느 하나에 기재된 방법.
[29] 공정 (ii)의 배양 기간이 2~6일간인, [19], [20] 및 [26] 내지 [28] 중 어느 하나에 기재된 방법.
[30] 공정 (iv)의 배양 기간이 2~14일간인 [19], [20] 및 [26] 내지 [29] 중 어느 하나에 기재된 방법.
[31] 상기 Notch 시그널 저해제는 γ-세크레타제 저해제인 [19], [20] 및 [26] 내지 [30] 중 어느 하나에 기재된 방법.
[32] 상기 γ-세크레타제 저해제가 N-[N-(3,5-디플루오로펜아세틸)-L-알라닐]-S-페닐글리신 t-부틸 에스테르(DAPT) 또는 화합물 E인, [31]에 기재된 방법.
[33] [21] 내지 [25] 중 어느 하나에 기재된 고순도 대뇌 피질 세포괴를 포함하는 세포 집단으로서, 상기 고순도 대뇌 피질 세포괴의 사이즈, 형상 또는 구성 세포 조성이 균일한, 세포 집단.
[34] [14] 내지 [18] 중 어느 하나에 기재된 대뇌 피질 세포괴, [21] 내지 [25] 중 어느 하나에 기재된 고순도 대뇌 피질 세포괴, 또는 [33]에 기재된 세포 집단 또는 그들을 구성 세포로까지 분산시켜 얻어지는 세포 집단을 유효 성분으로서 포함하는 의학 조성물.
[35] [14] 내지 [18] 중 어느 하나에 기재된 대뇌 피질 세포괴, [21] 내지 [25] 중 어느 하나에 기재된 고순도 대뇌 피질 세포괴, 또는 [33]에 기재된 세포 집단 또는 그들을 구성 세포로까지 분산시켜 얻어지는 세포 집단을 포함하는, 이식용 조직.
[36] [14] 내지 [18] 중 어느 하나에 기재된 대뇌 피질 세포괴, [21] 내지 [25] 중 어느 하나에 기재된 고순도 대뇌 피질 세포괴, 또는 [33]에 기재된 세포 집단 또는 그들을 구성 세포로까지 분산시켜 얻어지는 세포 집단을 유효 성분으로서 포함하는, 뇌혈관 장애 치료약.
[37] [14] 내지 [18] 중 어느 하나에 기재된 대뇌 피질 세포괴, [21] 내지 [25] 중 어느 하나에 기재된 고순도 대뇌 피질 세포괴, 또는 [33]에 기재된 세포 집단 또는 그들을 구성 세포로까지 분산시켜 얻어지는 세포 집단을, 이를 필요로 하는 대상의 대뇌 피질 또는 대뇌 기저핵에 투여 또는 이식하는 것을 포함하는, 뇌혈관 장애의 치료 방법.
[38] (aa) 대뇌 오가노이드 또는 대뇌 피질 세포괴에서의, GAD2, COL1A1, TYR, TTR 및 HOXA2로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개의 유전자 또는 해당 유전자에 의해 코드되는 단백질 또는 그의 단편의 발현량을 측정하는 공정 및
(bb) 공정 (aa)의 측정 결과에 기초하여, 상기 유전자의 발현량이 기준치 이하인 경우에, 상기 대뇌 오가노이드 또는 상기 대뇌 피질 세포괴에 포함되는 목적 외 세포의 양이 기준 이하라고 평가하는 공정
을 포함하는, 대뇌 오가노이드 또는 대뇌 피질 세포괴의 품질 평가 방법.
[39] (AA) 대뇌 오가노이드 또는 대뇌 피질 세포괴에서의 NEUROD6, NEUROD2, SSTR2, TBR1, ZBTB18, NHLH1, IGFBPL1, NRN1, RTN1, THSD7A, NRXN1, BHLHE22, CALB2, KHDRBS3, CCSAP, PDE1A, NEUROD1, NPTX1, NXPH4, NTS, NEUROG2, OLFM1, PRDM8, CORO2B, TP53I11, ZFPM2, PCDH9, NELL2, SRRM4, SCG3, DCC, EPB41L3, SLC17A7, ST18, NSG2, EMX1, CAP2, SYT4, NSMF, ANK3, MYT1L, FSTL5, CELF4, B3GAT1, EPHA5, NHLH2 및 DLL3으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개의 유전자의 발현량을 측정하는 공정, 및
(BB) 공정 (AA)의 측정 결과에 기초하여, 상기 유전자의 발현량이 기준치 이상인 경우에, 상기 대뇌 오가노이드 또는 상기 대뇌 피질 세포괴에 포함되는 목적 세포의 양이 기준 이상이라고 평가하는 공정
을 포함하는, 대뇌 오가노이드 또는 대뇌 피질 세포괴의 품질 평가 방법.
본 발명에 따라 대뇌 피질 세포 제제의 재료로서 이용할 수 있는 대뇌 오가노이드가 인간 다능성 줄기세포로부터 고효율로 제조할 수 있게 된다. 본 발명의 대뇌 오가노이드 유래의 대뇌 피질 세포괴 등은, 뇌 혈관 장애 등을 치료하기 위한 치료약 또는 이식용 재료로서 유용하다.
도 1은, 예비시험 1에서의, 신경세포로의 분화 유도 후의 세포 응집체의 형태의 화상을 나타낸다.
도 2는, 예비시험 2에서의, 마이크로어레이에 의한 FGF2 및 TGFβ 경로 관련 유전자의 발현 해석 결과를 나타낸다.
도 3은, 실시예 1에서의 분화 유도 스킴(scheme)의 일례를 나타낸다.
도 4는, 실시예 1의 1-1에서의 분화 유도 후의 세포 응집체의 명시 야상(A) 및 공초점 형광 현미경 화상 (B)를 나타낸다.
도 5는, 실시예 1에서의 분화 유도 스킴의 일례를 나타낸다.
도 6은, 실시예 1의 1-1에서의 분화 유도 후의 대뇌 피질 세포괴의 공초점 형광 현미경 화상을 나타낸다.
도 7은, 실시예 1의 1-2에서의 분화 유도 후 35일차의 대뇌 오가노이드의 공초점 형광 현미경 화상을 나타낸다.
도 8은, 실시예 2에서의 분화 유도 후 18일차, 27일차, 34일차의 배양물의 대표적인 명시 야상을 나타낸다.
도 9는. 실시예 2에서의 분화 유도 후의 각 조건에서의 대뇌 오가노이드의 형성 효율(%)을 나타낸다.
도 10은, 실시예 3에서의 공정 (1) 후(0일차)의 각종 마커 유전자의 발현 해석 결과를 나타낸다.
도 11은, 실시예 4의 4-1에서의 분화 유도 스킴(A) 및 대뇌 오가노이드(DAPT-, 36일차), 대뇌 피질 세포괴(DAPT+, 36일차), 고순도 대뇌 피질 세포괴(40일차)의 명시 야상 (B)를 나타낸다.
도 12는, 실시예 4의 4-1에서의 면역 염색의 대표적인 공초점 형광 현미경 화상을 나타낸다.
도 13은, 실시예 4의 4-2에서의 분화 유도 스킴을 나타낸다.
도 14는, 실시예 4의 4-2에서의, 플로우 사이토메트리에 의한 마커 유전자 발현의 해석 결과를 나타낸다.
도 15는, 실시예 4의 4-2에서,의 플로우 사이토메트리에 의한 마커 유전자 발현의 해석 결과를 나타낸다.
도 16은, 실시예 4의 4-3에서의 DAPT법의 스킴 (A), 및 얻어진 세포괴의 유전자 발현의 변화를 RT-qPCR로 해석한 결과 (B)를 나타낸다.
도 17은, 실시예 5에서의 분화 유도 스킴 (A), 및 28일차(4wk), 42일차(6wk) 및 75일차(10wk)의 대뇌 오가노이드의 면역 염색의 결과 (B)를 나타낸다.
도 18은, 실시예 5에서의 28일차(4wk), 35일차(5wk), 42일차(6wk) 및 75일차(10wk)의 대뇌 오가노이드의 각종 마커의 상대 발현량의 해석 결과를 나타낸다.
도 19는, 실시예 6에서의 면역 염색한 이식편의 대표적인 공초점 형광 현미경 화상을 나타낸다.
도 20은, 실시예 6에서의 면역 염색한 이식편의 체적의 해석 결과를 나타낸다.
도 21은, 바람직한 실시형태의 방법의 스킴을 나타낸다.
도 22는, 실시예 7에서의 면역 염색의 대표적인 공초점 형광 현미경 화상을 나타낸다.
도 23은, 실시예 7에서의 플로우 사이토메트리의 해석 결과를 나타낸다.
도 24는, 실시예 8의 8-1에서의 2개의 방법의 스킴을 나타낸다.
도 25는 실시예 8의 8-1에서의 싱글 셀 DAPT법으로 얻어진 세포괴의 각 마커의 경시적 유전자 발현량의 RT-qPCR 해석 결과를 나타낸다.
도 26은, 실시예 8의 8-1에서의 싱글 셀 DAPT법 및 오가노이드법으로 얻어진 세포괴의 각 마커의 경시적 유전자 발현량의 RT-qPCR 해석 결과를 나타낸다.
도 27은, 실시예 8의 8-1에서의 싱글 셀 DAPT법 및 오가노이드법으로 얻어진 세포괴의 각 마커의 10일째의 유전자 발현량의 플로우 사이토메트리 해석 결과를 나타낸다.
도 28은, 실시예 8의 8-2에서의 싱글 셀 DAPT법의 스킴을 나타낸다.
도 29는, 실시예 8의 8-2에서의 싱글 셀 DAPT법으로 얻어진 세포괴의 유전자 발현을 플로우 사이토메트리로 해석한 결과를 나타낸다.
도 30은, 실시예 9의 9-1에서의 오가노이드의 형태의 대표적인 명시 야상을 나타낸다.
도 31은, 실시예 9의 9-1에서의 7개의 형태학적인 그룹의 대표적인 명시 야상을 나타낸다.
도 32는, 실시예 9의 9-1에서의 각 형태의 오가노이드의 비율의 봉 그래프를 나타낸다.
도 33은, 실시예 9의 9-2에서의 3회의 분화 유도회로 얻어진 9개의 오가노이드의 명시 야상을 나타낸다.
도 34는, 실시예 9의 9-2에서의 9개의 오가노이드에 대하여 싱글 셀 RNA-seq 해석의 데이터를 UMAP로 표시한 결과를 나타낸다.
도 35는, 실시예 9의 9-2에서의 9개의 오가노이드에 대하여 싱글 셀 RNA-seq 해석의 데이터를 UMAP로 표시한 결과를 나타낸다.
도 36은, 실시예 9의 9-2에서의 각 클러스터의 유전자 발현에 기초하여 각 클러스터의 세포종을 동정(同定)한 결과를 나타낸다.
도 37은, 실시예 9의 9-2에서의 싱글 셀 유전자 발현 데이터에서 각 클러스터에 특징적인 유전자, 기지의 마커 유전자의 발현 프로파일을 도트 플롯으로 나타낸다.
도 38은, 실시예 9의 9-2에서의 싱글 셀 유전자 발현 데이터에서 각 클러스터에 특징적인 유전자, 기지의 마커 유전자의 발현 프로파일을 도트 플롯으로 나타낸다.
도 39는, 실시예 9의 9-2에서의 9개의 오가노이드에서의 각 세포종의 비율 (A) 및 각 분화 스테이지에서의 신경제세포의 비율 (B)를 나타낸다.
도 40은, 실시예 9의 9-3에서의 각 그룹의 오가노이드에 대하여, 대표적인 마커 단백질의 면역 염색 결과를 나타낸다.
도 41은, 실시예 9의 9-4에서의 각 그룹에 대하여 3개의 오가노이드의 명시 야상을 나타낸다.
도 42는, 실시예 9의 9-4에서의 각 오가노이드에 대하여 RT-qPCR법으로 마커 유전자의 발현을 해석한 결과를 나타낸다.
도 43은 실시예 9의 9-4에서의 각 오가노이드에 대하여 RT-qPCR법으로 마커 유전자의 발현을 해석한 결과를 나타낸다.
도 44는 실시예 9의 9-5에서의 Lot1, Lot2, Lot3의 로제트(Rosettes)의 오가노이드의 명시 야상(A) 및 싱글 셀 유전자 발현 해석의 UMAP의 플롯(B)을 나타낸다.
도 45는, 실시예 9의 9-5에서의 오가노이드에 대하여 마커 유전자의 발현을 해석하여 UMAP로 표시한 결과를 나타낸다.
1. 정의
[줄기세포]
본 명세서에서 '줄기세포'란, 분화능 및 분화능을 유지한 증식능(특히 자기복제능)을 갖는 미분화 세포를 의미한다. 줄기세포에는, 분화능력에 따라 다능성 줄기세포(pluripotent stem cell), 복능성 줄기세포(multipotent stem cell), 단능성 줄기세포(unipotent stem cell) 등의 아집단이 포함된다.
다능성 줄기세포란, 시험관 내(in vitro)에서 배양하는 것이 가능하며, 또한 삼배엽(외배엽, 중배엽, 내배엽) 및/또는 배체 외 조직에 속하는 세포 계보 모두로 분화할 수 있는 능력(분화 다능성(Pluripotency))을 갖는 줄기세포를 말한다. 복능성 줄기세포란, 모든 종류는 아니지만, 복수종의 조직이나 세포로 분화할 수 있는 능력을 갖는 줄기세포를 의미한다. 단능성 줄기세포란, 특정한 조직이나 세포로 분화할 수 있는 능력을 갖는 줄기세포를 의미한다.
다능성 줄기세포는 수정란, 클론 배아, 생식 줄기세포, 조직 내 줄기세포, 체세포 등으로부터 유도할 수 있다. 다능성 줄기세포로서는 배아 줄기세포(ES 세포: Embryonic Stem cell), EG 세포(Embryonic Germ cell), 인공 다능성 줄기세포(iPS 세포: induced Pluripotent Stem cell) 등을 들 수 있다. 간엽계 줄기세포(Mesenchymal Stem Cell; MSC)로부터 얻어지는 Muse 세포(Multi-lineage differentiating stress enduring cell) 및 생식세포(예컨대 정소)로부터 제작된 mGS 세포도 다능성 줄기세포에 포함된다.
1998년에 인간 배아 줄기세포가 수립되어 있어, 재생 의학에도 이용되고 있다. 배아 줄기세포는 배반포기, 즉 수정 후 14일 이내의 내부 세포괴를 배양보조세포 위 또는 FGF2를 포함하는 배지 중에서 배양함으로써 제조할 수 있다. 배아 줄기세포의 제조 방법은, 예컨대 WO96/22362, WO02/101057, US5,843,780, US6,200,806, US6,280,718 등에 기재되어 있다. 배아 줄기세포는 소정의 기관으로부터 입수할 수 있고, 또한 시판품을 구입할 수도 있다. 예컨대, 인간 배아 줄기세포인 KhES-1, KhES-2 및 KhES-3은 교토대학 재생의과학연구소로부터 입수 가능하다.
본 명세서에서 '인공 다능성 줄기세포'란, 체세포를, 공지의 방법 등에 의해 초기화(reprogramming)함으로써, 다능성을 유도한 세포이다.
인공 다능성 줄기세포는 2006년, 야마나카 등에 의해 마우스 세포에서 수립되었다(Cell, 2006, 126(4), pp.663-676). 인공 다능성 줄기세포는 2007년에 인간 섬유아세포에서도 수립되어, 배아 줄기세포와 마찬가지로 다능성과 자기복제능을 갖는다(Cell, 2007, 131(5), pp.861-872; Science, 2007, 318(5858), pp.1917-1920; Nat. Biotechnol., 2008,26(1), pp.101-106).
인공 다능성 줄기세포는, 구체적으로는 섬유아세포나 말초혈 단핵구 등 분화한 체세포에 OCT3/4, SOX2, KLF4, MYC(c-MYC, N-MYC, L-MYC), GLIS1, NANOG, SALL4, LIN28, ESRRB 등을 포함하는 초기화 유전자군으로부터 선택되는 복수의 유전자의 조합 중 어느 하나를 강제 발현함으로써 초기화하여 다분화능을 유도한 세포를 들 수 있다. 바람직한 초기화 인자의 조합으로서는 (1) OCT3/4, SOX2, KLF4 및 MYC(c-MYC 또는 L-MYC), (2) OCT3/4, SOX2, KLF4, LIN28 및 L-MYC(Stem Cells, 2013; 31: 458-466)를 들 수 있다.
인공 다능성 줄기세포로서, 유전자 발현에 의한 초기화 유도로 제조하는 방법 이외에, 체세포로의 화합물의 첨가 등에 의해 인공 다능성 줄기세포를 유도할 수도 있다(Science, 2013, 341, pp.651-654; Nature, 2022, 605, pp.325-331).
또한, 주화된 인공 다능성 줄기세포를 입수하는 것도 가능하며, 예컨대 교토대학에서 수립된 201B7 세포, 201B7-Ff 세포, 253G1 세포, 253G4 세포, 1201C1 세포, 1205D1 세포, 1210B2 세포, 1231A3 세포 등의 인간 인공 다능성 세포주가, 교토 대학 및 iPS 아카데미아 재팬 주식회사로부터 입수 가능하다. 주화된 임상용의 iPS 세포로서, 예컨대 교토 대학에서 수립된 Ff-I01, Ff-I14, QHJI01 및 QHJI14가 교토 대학으로부터 입수 가능하다. 또한, iPS 세포는 예컨대 말초혈·제대혈 유래의 조혈 전구세포, 섬유아세포 등의 체세포로부터 초기화 인자를 이용하여 리프로그래밍함으로써 제조하는 것이 가능하다. 본 명세서에서 사용하는 S2WCB1, S2WCB3는 성인 말초 혈액 단핵구로부터 CytoTune(상표)-2.0(ID 파마)을 이용하여 수립하였다.
본 명세서에서 다능성 줄기세포는, 바람직하게는 배아 줄기세포 또는 인공 다능성 줄기세포이고, 보다 바람직하게는 인공 다능성 줄기세포이다.
본 명세서에서 다능성 줄기세포는 포유 동물의 다능성 줄기세포이고, 바람직하게는 설치류(예컨대, 마우스, 래트) 또는 영장류(예컨대, 인간, 원숭이)의 다능성 줄기세포이며, 보다 바람직하게는 인간 다능성 줄기세포, 더욱 바람직하게는 인간 인공 다능성 줄기세포(iPS 세포) 또는 인간 배아 줄기세포(ES 세포)이다.
인간 iPS 세포 등의 다능성 줄기세포는, 당업자에게 주지의 방법으로 유지 배양 및 확대 배양을 할 수 있다.
[마커]
본 명세서에서 '마커'란, 세포에 존재하는 물질이며, 그의 존재 또는 존재량에 기초하여, 당해 세포의 종류 또는 성질 등을 동정 또는 판별할 수 있는 물질을 의미한다. 마커로서, 구체적으로는, mRNA, 당해 mRNA에 의해 코드되는 단백질 및 당쇄 및 이들 단편을 들 수 있다.
[신경세포]
본 명세서에서 신경세포란, 세포체, 수상 돌기 및 축삭으로부터 구성되는 신경 단위를 말하며, 뉴런이라고도 불린다. 신경세포는 다른 신경세포 또는 자극수용 세포로부터의 자극을 다른 신경세포, 근육 또는 선세포에 자극을 전달하는 기능을 갖고, 신경세포가 생산하는 신경 전달 물질의 차이에 의해, 도파민 작동성 신경, 세로토닌 작동성 신경, GABA 작동성 신경, 글루탐산 작동성 신경 등과 같이 분류되는데, 본 명세서에서는 신경 전달 물질의 종류에 대해서는 특별히 한정하지 않는다. 신경세포는, 유의하게 발현하는 마커에 의해 동정할 수 있으며, 당해 마커로서는, 예컨대 βIII-튜불린, MAP2 등을 들 수 있다.
[신경 줄기세포]
본 명세서에서 '신경 줄기세포'란, 신경계 세포로의 분화가 운명지어 있지만, 복수의 신경계 세포로 분화하는 능력을 갖고 증식성을 유지하고 있는 줄기세포를 의미하며, 신경 전구 세포로의 분화능 및 대뇌 피질 세포로의 분화능을 함께 갖는 세포이다. 중간체 필라멘트 단백질(네스틴, 비멘틴 등), 전사 인자 SOX1, SOX2, PAX6 등의 원시적 신경 외배엽 및 신경 줄기세포의 마커 등에 의해 동정될 수 있다. 본 명세서에서의 신경 줄기세포에는 방사상 글리어(Radial Glia)가 포함된다.
또한, 신경 줄기세포로부터 생기는, 복수의 신경세포로 분화 가능하고 또한 미성숙한 세포를 신경 전구 세포라고도 한다.
[대뇌 오가노이드]
본 명세서에서, '세포 배양물'은, 특정의 조성을 갖는 것에 한정하지 않고, 세포를 배양함으로써 얻어지는 산물을 가리키는 용어이다. 세포 배양물은, 복수의 세포괴의 집합체일 수 있고, 또한 단세포 및 후술하는 2~5개의 세포 집합체를 포함하여도 된다. 세포 배양물은 배지 또는 현탁 매체를 포함하고 있어도 포함하지 않아도 되고, 본 명세서에서, 특별히 명기하지 않는 한, 배지 또는 현탁 매체를 포함하지 않는 것을 가리킨다.
본 명세서에서, '대뇌 오가노이드'는, 신경 상피의 외측에 신경세포층을 구비한 대뇌 피질 유사 구조물을 하나 이상, 바람직하게는 복수 포함하는, 구상의 세포 응집체(세포괴)를 의미한다. 여기에서, 대뇌 피질 유사 구조물은 신경 상피의 외측에 신경세포층을 구비한, 로제트 유사 구조이다. 따라서, 대뇌 피질 유사 구조물은 신경 상피 유사 구조를 포함할 가능성이 있으며, 본원의 대뇌 오가노이드는 신경 상피 유사 구조를 포함하고 있어도 된다.
여기에서, '신경 상피'란, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구 세포를 주된 구성 세포로 하는 층상의 구조물이며, 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구 세포의 국재화 영역이라고도 할 수 있다.
여기에서, '신경세포층'이란, 신경세포를 포함하는 층상의 구조물이다. 당해 신경세포는 대뇌 오가노이드의 분화 단계에서 생성될 수 있는 신경세포이면 특별히 한정은 없지만, 신경세포 마커, 전뇌 마커 및 대뇌 피질 신경세포 마커 중 적어도 하나가 양성인 세포를 들 수 있다. 당해 신경세포층은, 바람직하게는 신경세포 마커 양성 세포, 전뇌 마커 양성 세포 및 대뇌 피질 신경세포 또는 그의 전구 세포 마커 양성 세포의 2 이상 또는 전부를 포함한다. 신경세포층은 신경 상피로부터 생긴 신경세포(대뇌 피질 신경세포)의 국재화 영역이라고도 할 수 있다.
본 명세서에서의 대뇌 오가노이드의 일 양태로서, 다능성 줄기세포를 분화 유도하여 얻어지는 대뇌 오가노이드를 들 수 있다.
여기서, '구상'은 봉상(롯드상)이나 평판상(플레이트상)이 아닌 것을 가리키며, 바람직하게는 '구에 가까운 3차원 구조체'를 의미한다. 예컨대, 2차원 면에 투영하였을 때에, 예컨대 원형 또는 타원형을 나타내는 것을 들 수 있다. 단, 매끄러운 곡선을 나타낼 필요는 없고, 부분적으로 요철이 인정되는 경우라도 세포괴 전체에서 구에 가까운 형상이라고 인식할 수 있으면 '구상'에 해당한다. 본 명세서에서의 '구상'으로서, 반드시 높은 진구율이 요구되는 것은 아니지만, 일례로서 진구율이 0.7 이상, 0.8 이상, 바람직하게는 0.9 이상의 구조체를 들 수 있다.
본 명세서에서, 신경 줄기세포 또는 신경 전구 세포의 마커 유전자로서는, 예컨대, SOX1, SOX2, PAX6 등을 들 수 있다.
신경세포 마커 유전자로서는, 예컨대 βIII-튜불린, MAP2 등을 들 수 있다.
전뇌의 마커 유전자로서는 예컨대 FOXG1(BF1이라고도 함), SIX3, EMX1 등을 들 수 있다.
대뇌 피질 신경세포 마커 유전자로서는, 후술하는 제I층~제VI층의 마커를 들 수 있다.
또한, 각종 세포의 마커 유전자로서, 후술하는 바와 같이, 하기의 표 6에 기재된 유전자를 들 수 있다.
[대뇌 피질 세포]
본 명세서에서, '대뇌 피질 세포'는, 대뇌 피질 뉴런 또는 대뇌 피질 신경세포라고도 하며, 대뇌 피질을 구성하는 신경세포를 가리킨다.
대뇌 오가노이드에서, 신경세포층은 1층이어도 되고, 또한 복수의 세포층으로 나뉘어 있어도 된다. 예컨대, 신경 상피에 가까운 측으로부터 오가노이드의 외측을 향하여, 대뇌피질 제VI층(Tbr1, Tbr2), 제V층(Ctip2, Er81, Fezf2), 제IV층(Rorb), 제III/II층(Foxp1, Mef2c, Satb2), 제I층(릴린)에 특징적인 신경세포가 각각 국재화된 층이 포함되어 있어도 된다. 괄호 안에 각 층의 식별에 다용되는 마커 유전자를 나타낸다.
본 명세서에서, 대뇌 피질 세포는, 바람직하게는 전뇌 마커인 FOXG1이 양성인 세포이다. 본 발명에서 FOXG1로서는, NCBI 억세션 번호 NM_005249로 나타내는 폴리뉴클레오타이드 및 이들이 코드하는 단백질을 들 수 있다.
본 명세서에서, 대뇌 피질 세포는, 대뇌 피질의 운동영역의 신경세포 또는 상위 운동 뉴런, 즉 대뇌 피질의 전방의 신경세포를 포함하여도 되고, 더욱 상세하게는 대뇌 피질의 운동영역의 제V층 및/또는 제VI층의 신경세포를 포함하고 있어도 된다.
본 명세서에서, 제V층 또는 제VI층(합하여 제V/VI층이라고도 함)의 신경세포는 Ctip2가 양성인 것을 특징으로 하는 세포 집단이다. 본 발명에서, Ctip2로서는, NCBI 억세션 번호 NM_001282237, NM_001282238, NM_022898 또는 NM_138576으로 나타내는 폴리뉴클레오타이드 및 이들이 코드하는 단백질을 들 수 있다. 또한, 대뇌 피질 세포는 제I층, 제II/III층, 제IV층의 신경세포를 포함하고 있어도 된다.
본 명세서에서의 대뇌 피질 세포는, 다른 세포종이 포함되는 세포 집단으로서 제조되어도 되고, 대뇌 피질 세포를 포함하는 세포 집단은, 예컨대, 제조된 세포 집단에서 15% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상 또는 50% 이상의 대뇌 피질 세포를 포함하고 있어도 된다.
본 명세서에서, '대뇌 피질 세포'는 '대뇌 피질 전구 세포'를 포함하는 개념이며, 본 발명의 '대뇌 오가노이드'의 목적 세포로서는, 대뇌 피질 전구 세포가 포함된다. 한편, 보다 진행된 분화 단계에 있는, 본 발명의 '대뇌 피질 세포괴(고순도 대뇌 피질 세포괴를 포함함)'의 목적 세포에는 대뇌 피질 전구 세포는 거의 포함되지 않거나, 또는 최소한의 수 정도 포함될 수 있다.
[세포괴 및 세포 집단]
본 명세서에서 '세포괴'(Cell Aggregate; 세포 응집체라고도 함)란, 복수의 세포끼리가 접착하여 입체 구조를 형성하고 있는 것이면 특별히 한정되지 않고, 예컨대, 배지 등의 매체 중에 분산되어 있던 세포가 집합하여 형성하는 덩어리, 또는 세포 분열을 거쳐 형성되는 세포의 덩어리 등을 말한다. 세포괴에는 특정의 조직을 형성하고 있는 경우도 포함된다. 배아체(Embryoid body), 스피어(Sphere), 스페로이드(Spheroid)는 세포괴에 포함된다. 세포괴는 임의의 형상을 가져도 되고, 구상의 세포괴, 층상의 세포괴 등을 들 수 있다.
본 명세서에서 '세포 집단'은 복수의 세포를 포함하는 집단이며, 세포괴(스피어상 세포괴, 층상의 세포괴), 또는 2~5개의 세포 집합체이어도 된다. '세포 집단'은, 또한 복수의 세포괴의 집단, 복수의 분산 된 단세포의 집단, 또는 복수의 2~5개의 세포 집합체의 집단, 또는 이들 임의의 조합의 집단이어도 된다.
본 명세서에서 세포괴가 고순도인 것이란, 세포괴에 포함되는 목적 세포의 함유율이 높은 것을 의미한다. 구체적인 함유율은 세포의 종류에도 달렸지만, 예컨대 목적 세포의 함유율이 세포괴의 전 세포 수에 대하여 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 90% 이상인 경우 고순도라고 할 수 있다.
또한, 본 명세서에서 세포괴가 고순도인 것이란, 목적 외 세포의 함유율이 세포괴의 전 세포 수에 대하여 30% 이하, 바람직하게는 20% 이하, 10% 이하라고 할 수 있다. 더욱 바람직하게는, 세포괴에서의 증식성의 세포의 함유율이 세포괴의 전 세포 수에 대하여 10% 이하, 5% 이하, 바람직하게는 3% 이하, 더욱 바람직하게는 2% 이하라고 할 수 있다.
본 명세서에서, '재응집 세포괴'란, 세포괴를 단세포 또는 2~5개의 세포 집합체로 분산한 후, 분산된 단세포 및 세포 집합체가 다시 집합하여 형성한 세포괴(예컨대: 재응집 대뇌 피질 세포괴)를 말한다. 재응집 대뇌 피질 세포괴는 고순도 대뇌 피질 세포괴를 적어도 포함한다.
[배양액]
본 명세서에서 '배양액(배지라고도 칭함)'은, 동물 세포의 배양에 통상적으로 이용되는 배양액(배지)이면 되고, 동물 세포가 생명을 유지할 수 있으면 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 목적 세포에 증식 가능한 환경을 제공하는 것이다. 배양액(배지)은 스스로 조제하여도 되고, 시판 배지를 구입하여 이용하여도 된다.
기초 배지로서는, 예컨대, BME 배지, BGJb 배지, CMRL 1066 배지, Glasgow MEM(GMEM) 배지, 개선된 MEM 아연 옵션 배지, IMDM 배지, Medium 199 배지, Eagle MEM 배지, αMEM 배지, DMEM 배지, F-12 배지, DMEM/F-12 배지, IMDM/F12 배지, 햄 배지, RPMI 1640 배지, Fischer's 배지, 또는 이들 혼합 배지 등, 동물 세포의 배양에 이용할 수 있는 배지를 들 수 있다. 이들 기초 배지에는, 글루코스 등의 당질, 아미노산 등의 탄소원, 비타민, 무기 염류 등이 포함된다.
기초 배지에는, 적의 목적으로 하는 분화 유도에 악영향을 미치지 않는 범위에서 동물 세포의 배양에 통상적으로 이용되는 임의의 성분을 첨가하여도 된다.
본 발명에서 사용되는 배지는, 이식에 적합한 세포괴를 제조하기 위하여 사용한다는 관점에서, 무혈청 배양액인 것이 바람직하다.
본 발명에서의 '무혈청 배양액'이란, 무조정 또는 미정제의 혈청을 실질적으로 포함하지 않는 배지를 의미한다. 본 명세서에서, 정제된 혈액 유래 성분 또는 동물 조직 유래 성분(예컨대, 증식 인자)이 혼입되어 있는 배지이어도, 무조정 또는 미정제의 혈청을 포함하지 않는 한, 무혈청 배양액에 포함된다. 무혈청 배양액은, 적절히, 지방산 또는 지질, 아미노산(예컨대, 비필수 아미노산), 비타민, 증식 인자, 사이토카인, 항산화제, 2-머캅토에탄올, 피루브산, 완충제, 무기염류 등을 함유하여도 된다.
본 발명에서 사용되는 배지는 바람직하게는 제노-프리 배지이다. 여기서 '제노-프리'란, 배양 대상의 세포의 생물종과는 상이한 생물종 유래의 성분(이종 유래 성분, 이종 인자(Xenogenic factor)라고도 함)이 배제된 조건을 의미한다. 무혈청 배양액의 일부는 제노-프리 배지일 수 있다.
[혈청 대체물]
본 발명에서 사용되는 배지에는, 혈청 대체물이 포함되어 있어도 된다. 혈청 대체물로서, 예컨대, 알부민, 트랜스페린, 지방산, 콜라겐 전구체, 미량 원소, 2-머캅토에탄올 또는 1-티오글리세롤, 또는 이들 균등물 등을 적절히 함유하는 것을 들 수 있다. 이와 같은 혈청 대체물은, 예컨대 WO 98/30679에 기재된 방법에 의해 제조할 수 있다. 혈청 대체물로서는 시판품을 이용하여도 된다. 이와 같은 시판의 혈청 대체물로는, 예컨대 Knockout 혈청 대체물(서모피셔 사이언티픽사 제조; 이하, KSR로 기재하는 경우가 있음.), 'StemSure(등록상표) 혈청 대체물(SSR)' Chemically-defined Lipid concentrate(서모피셔 사이언티픽사 제조), B27 서플리먼트(서모피셔 사이언티픽사 제조), N2 서플리먼트(서모피셔 사이언티픽사 제조), ITS 서플리먼트(서모피셔 사이언티픽사 제조)를 들 수 있고, 바람직하게는 N2 서플리먼트 또는 B27 서플리먼트를 들 수 있다.
[배양보조세포]
본 명세서에서, 배양보조세포란, 피더 세포라고도 하며 다능성 줄기세포 등의 줄기세포를 배양할 때에 공존시키는 당해 줄기세포 이외의 세포를 말한다. 배양보조세포로서는, 예컨대 마우스 섬유아세포(MEF 등), 인간 섬유아세포, SNL 세포, STO 세포 등을 들 수 있다. 배양보조세포는 증식 억제 처리된 배양보조세포이어도 된다. 여기서, 증식 억제 처리로서는, 증식 억제제(예컨대, 미토마이신 C) 처리 또는 감마선 조사 또는 UV 조사 등에 의한 처리를 들 수 있다.
본 명세서에서 '배양보조세포의 비존재 하(피더-프리라고도 함)'란, 배양보조세포 비존재 하에 배양하는 것이다. 배양보조세포 비존재 하란, 예컨대 배양보조세포를 첨가하고 있지 않은 조건, 또는 배양보조세포를 실질적으로 포함하지 않는(예컨대, 전 세포 수에 대한 배양보조세포 수의 비율이 3% 이하, 바람직하게는 1% 이하)의 조건을 들 수 있다.
[부유 배양]
본 발명에서 '부유 배양'이란, 세포를 배지 중에 부유시킨 상태에서 생존시키는 것, 또는 세포를 배양 용기에 비접착의 상태로 응집체(스페어라고도 함)를 형성시켜 배양하는 것을 의미한다. 본 명세서 중에서는, 세포는 단세포 또는 복수의 세포가 모인 덩어리(세포괴 또는 세포 집단)의 상태에서 부유 배양된다.
부유 배양에 이용되는 배양 용기로서는, 특별히 한정되지 않지만, 예컨대, 플라스크, 조직 배양용 플라스크, 디쉬, 페트리 디쉬, 조직 배양용 디쉬, 멀티 디쉬, 마이크로 플레이트, 마이크로웰 플레이트, 마이크로 포어, 멀티 플레이트, 멀티 웰 플레이트, 챔버 슬라이드, 샬레, 튜브, 트레이, 배양 백, 바이오 리액터, 롤러 보틀 등을 들 수 있다.
비접착성의 조건 하에서의 배양을 가능하게 하기 위하여, 배양기는 세포 비접착성인 것이 바람직하다. 세포 비접착성의 배양기로서, 배양기의 표면이 세포와의 접착성을 향상시킬 목적으로 인공적으로 처리(예컨대, 세포 외 매트릭스 등에 의한 코팅 처리)되어 있지 않은 배양 용기, 또는 인공적으로 접착을 억제하는 처리(예컨대, 폴리히드록시에틸메타크릴산(poly-HEMA), 비이온성의 계면 활성 폴리올(Pluronic F-127 등) 또는 인지질 유사 구조물(예컨대, 2-메타크릴로일옥시에틸포스포릴콜린을 구성 단위로 하는 수용성 폴리머(Lipidure(등록 상표)))에 의해 코팅 처리한 배양 용기를 사용할 수 있다. 부유 배양, 특히 SFEBq법에서 이용되는 배양 용기로서, PrimeSurface(등록 상표)(단백질 저흡착 처리 96웰 플레이트, 스미토모 베이클라이트 제조)를 들 수 있다.
본 명세서에서, 부유 배양은 정치 배양이어도 되고, 진동 배양, 선회 배양 또는 교반 배양이어도 된다.
본 명세서에서 정치 배양이란, 세포괴를 의식적으로 이동시키지 않는 상태에서 배양하는 배양법을 말한다. 즉, 예컨대 국소적인 배지 온도의 변화에 따라 배지가 대류하고, 그의 흐름에 의해 세포괴가 이동하는 경우가 있는데, 의식적으로 세포괴를 이동시키지 않기 때문에, 이와 같은 경우도 포함하여 본 발명에서는 정치 배양이라고 한다.
진동 배양, 선회 배양 또는 교반 배양에는, 당업자에게 주지의 기기를 적절히 이용할 수 있다.
<bFGF>
본 명세서에서, bFGF는 염기성 섬유아세포 성장 인자(basic fibroblast growth factor)를 의미하며, FGF2라고도 칭해지는 단백질이다.
<TGFβ 시그널 저해제>
본 명세서에서 TGFβ 시그널 저해제란, TGFβ의 수용체로의 결합으로부터 SMAD로 이어지는 시그널 전달을 저해하는 물질이며, 수용체인 ALK 패밀리로의 결합을 저해하는 물질 또는 ALK 패밀리에 의한 SMAD의 인산화를 저해하는 물질을 들 수 있다.
본 명세서에서 TGFβ 시그널 저해제는 TGFβ에 의해 매개되는 시그널 전달을 억제할 수 있는 한 특별히 한정되지 않고, 핵산, 단백질, 저분자 유기 화합물 중 어느 것이어도 된다.
TGFβ 시그널 저해제로서, 예컨대 TGFβ에 직접 작용하는 물질(예컨대, 단백질, 항체, 압타머 등), TGFβ를 코드하는 유전자의 발현을 억제하는 물질(예컨대 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA 등), TGFβ 수용체와 TGFβ의 결합을 저해하는 물질, TGFβ 수용체에 의한 시그널 전달에 기인하는 생리 활성을 저해하는 물질(예컨대, TGFβ 수용체의 저해제 등)을 들 수 있다. 또한, TGFβ 시그널 저해제로서, 수용체인 ALK 패밀리로의 결합을 저해하는 물질, 또는 ALK 패밀리에 의한 SMAD의 인산화를 저해하는 물질을 들 수 있다. 당해 ALK 패밀리로서 구체적으로는, ALK4, ALK5 및 ALK7을 들 수 있다.
TGFβ 시그널 저해제로서는, 예컨대 Lefty-1(NCBI 억세션 번호로서, 마우스: NM_010094, 인간: NM_020997이 예시된다), Lefty-2(NCBI 억세션 번호로서 마우스: NM_177099, 인간: NM_003240 및 NM_001172425가 예시된다), SB431542(4-[4-(1,3-벤조디옥솔-5-일)-5-(2-피리디닐)-1H-이미다졸-2-일]-벤즈아미드), SB202190(이상, R.K.Lindemann et al.,Mol.Cancer,2003,2:20), SB505124(글락소스미스클라인(GlaxoSmithKline)), NPC30345, SD093, SD908, SD208(사이오스(Scios)), LY2109761, LY364947, LY580276(릴리 리서치 래보러토리즈(Lilly Research Laboratories)), A-83-01(WO 2009146408), 갈루니세르팁(Galunisertib)(LY2157299), LY3200882, SB525334, GW788388, RepSox 및 이들 유도체 등이 예시된다. 본 발명에서 사용되는 TGFβ 시그널 저해제는, 바람직하게는 SB431542 또는 A-83-01이다.
<Wnt 시그널 전달 저해제>
본 명세서에서, Wnt 시그널 전달 저해제란, Wnt(예컨대 Wnt3)의 생산을 억제하는 물질, 또는 Wnt의 수용체로의 결합으로부터 β카테닌의 축적으로 이어지는 시그널 전달을 저해하는 물질이며, 수용체인 Frizzled 패밀리로의 결합을 저해하는 물질 또는 β카테닌의 분해를 촉진하는 물질 등을 들 수 있다.
이와 같은 Wnt 시그널 전달 저해제로서는, 예컨대, Wnt 단백질의 프로세싱에 관여하는 PORCN(인간의 경우, NCBI의 억세션 번호: NP_001269096, NP_073736, NP_982299, NP_982300 또는 NP_982301로 나타내는 단백질이 예시된다)를 저해하는 물질, DKK1 단백질(예컨대, 인간의 경우, NCBI의 억세션 번호: NM_012242), 스클레로스틴(예컨대, 인간의 경우, NCBI의 억세션 번호: NM_025237), 세르베루스(Cerberus) 단백질, Wnt 수용체 저해제, 가용형 Wnt 수용체, 항Wnt 항체, 카제인 키나제 저해제, 도미넌트 네거티브 Wnt 단백질 등을 들 수 있지만, 이들로 한정되지 않고 1 또는 복수의 물질을 조합하여 사용하여도 된다.
구체적인 Wnt 시그널 전달 저해제로서, IWR-1-엔도((4-[(3aR,4S,7R,7aS)-1,3,3a,4,7,7a-헥사하이드로-1,3-디옥소-4,7-메타노-2H-이소인돌-2-일]-N-8-퀴놀리닐-벤즈아미드), 머크 밀리포어(Merck Millipore)), IWP-2(시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)), IWP-3(시그마-알드리치), IWP-4(시그마-알드리치), IWP-L6(EMD 밀리포어), C59(또는 Wnt-C59)(셀라젠 테크놀로지(Cellagen technology)), ICG-001(셀라젠 테크놀로지), LGK-974(또는 NVP-LGK-974)(셀라젠 테크놀로지), FH535(시그마-알드리치), WIKI4(시그마-알드리치), KYO2111(Minami I,et al,Cell Rep.2:1448-1460,2012), PNU-74654(시그마-알드리치), XAV939(스템젠트(Stemgent)) 및 이들 유도체 등이 예시된다. 그 중에서도 IWR-1-endo, C59, LGK-974 등이 바람직하다.
<Notch 시그널 저해제>
Notch 시그널 저해제는 Notch에 의한 시그널 전달을 억제할 수 있는 물질인 한 한정되지 않는다. Notch 시그널 저해제로서는 γ-세크레타제 저해제, Notch 전사 복합체 저해제, 예컨대 MAML-1 저해제 등을 들 수 있다.
γ-세크레타제 저해제는 γ-세크레타제의 효소 활성을 저해할 수 있는 물질인 한 한정되지 않는다. 구체적으로는, DAPT(N-[N-(3,5-디플루오로펜아세틸)-1-알라닐]-S-페닐글리신 t-부틸 에스테르), DBZ(디벤즈아제핀), MDL28170(칼파인 억제제(Calpain Inhibitor) III), 화합물 E(N-[(1S)-2-[[(3S)-2,3-디하이드로-1-메틸-2-옥소-5-페닐-1H-1,4-벤조디아제핀-3-일]아미노]-1-메틸-2-옥소에틸]-3,5-디플로오로벤젠아세트아미드), 화합물 34((2S,3R)-3-(3,4-디플로오로페닐)-2-(4-플루오로페닐)-4-하이드록시-N-((3S)-2-옥소-5-페닐-2,3-1H-벤조[e][1,4]디아제핀-3-일)부티르아미드), γ-세크레타제 저해제 XI, γ-세크레타제 저해제 III 등을 들 수 있다. Notch 전사 복합체 저해제로서는 CB-103(6-[4-(1,1-디메틸에틸)페녹시]-3-피리딘아민), IMR-1(2-메톡시-4-(4-옥소-2-티옥소-티아졸리딘-5-일리덴메틸)-페녹시]-아세트산 에틸 에스테르) 등을 들 수 있다.
<ROCK 저해제>
ROCK 저해제는 Rho-연관 코일드-코일(Rho-associated coiled-coil) 키나제(ROCK)의 저해제이며, ROCK의 기능을 억제하는 물질인 한 특별히 한정되지 않는다. ROCK 저해제로서는, Y-27632((+)-(R)-트랜스-4-(1-아미노에틸)-N-(4-피리딜)사이클로헥산카복스아미드 디하이드로클로라이드), H-1152((S)-4-메틸-5-((2-메틸-1,4-디아제판-1-일)설포닐)이소퀴놀린 디하이드로클로라이드), 파수딜(Fasudil)(HA-1077;1-(5-이소퀴놀린설포닐)호모피페라진 하이드로클로라이드), Wf-536(4-[(1R)-1-아미노에틸]-N-(피리딘-4-일)벤즈아미드), 티아조비빈(Thiazovivin)(N-벤질-2-(피리미딘-4-일아미노)티아졸-4-카복스아미드), 리파수딜(Ripasudil)(4-플루오로-5-[[(2S)-헥사하이드로-2-메틸-1H-1,4-디아제핀-1-일]설포닐]이소퀴놀린), GSK429286(4-[4-(트리플루오로메틸)페닐]-N-(6-플루오로-1H-인다졸-5-일)-2-메틸-6-옥소-1,4,5,6-테트라하이드로-3-피리딘카복스아미드), RKI-1447(N-[(3-하이드록시페닐)메틸]-N'-[4-(4-피리디닐)-2-티아졸릴]우레아), 아자인돌 1(6-클로로-N4-[3,5-디플로오로-4-[(3-메틸-1H-피롤로[2,3-b]피리딘-4-일)옥시]페닐]피리미딘-2,4-디아민), HA-1100(1-[(1,2-디하이드로-1-옥소-5-이소퀴놀리닐)설포닐]헥사하이드로-1H-1,4-디아제핀), Y-39983(4-[(1R)-1-아미노에틸]-N-1H-피롤로[2,3-b]피리딘-4-일벤즈아미드) 등을 들 수 있다. ROCK 저해제로서, 바람직하게는 Y-27632를 들 수 있다.
<신경 영양 인자>
본 명세서에서 신경 영양 인자(Neurotrophic Factor)란, 신경세포의 생존, 신경 돌기나 축삭의 신전, 시냅스 형성 등을 촉진하는 활성을 갖는 분비 단백질의 총칭이다. 신경 영양 인자로서, 신경 성장 인자(Nerve Growth Factor; NGF), 뇌-유래 신경영양 인자(Brain-derived Neurotrophic Factor; BDNF), 신경트로핀(Neurotrophin 3; NT-3), 신경트로핀 4/5(NT-4/5), 신경트로핀 6(NT-6), 신경교세포 유래 신경영양 인자(Glia cell line-derived Neurotrophic Factor; GDNF) 및섬모 신경영양 인자(Ciliary Neurotrophic Factor; CNTF) 등을 들 수 있다. 본 발명에서 바람직한 신경 영양 인자는 GDNF 및 BDNF로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 인자이다. 신경 영양 인자는, 예컨대 와코(Wako)사나 알앤디 시스템즈(R&D systems)사 등으로부터 시판되고 있어 용이하게 이용하는 것이 가능하지만, 당업자에게 공지의 방법에 의해 세포로 강제 발현시킴으로써 얻어도 된다.
<cAMP 활성화제>
본 명세서에서 cAMP 활성화제로서는 cAMP, 디부티릴-cAMP 또는 포스콜린 등을 들 수 있다.
2. 대뇌 오가노이드의 제조 방법
본 발명의 대뇌 오가노이드의 제조 방법의 일 양태로서는, 하기 공정 (1) 및 공정 (2)를 포함하는, 배양보조세포의 비존재 하, 다능성 줄기세포로부터 대뇌 오가노이드를 제조하는 방법을 들 수 있다. '배양보조세포의 비존재 하'는 상술한 바와 같으며, 공정 (1) 및 공정 (2)는 모두 '배양보조세포의 비존재 하'에 행하여진다.
(1) 다능성 줄기세포를, bFGF가 실질적으로 포함되지 않고 또한 TGFβ 시그널을 실질적으로 야기하지 않는 배양액 중에서 배양하는 공정
(2) 공정 (1)에서 얻어진 세포를, 신경세포로 분화 유도하는 공정
<공정 (1)>
본 명세서에서, '물질 X의 존재 하'에서의 배양이란, '물질 X를 포함하는 배지' 중에서 배양하는 것을 의미하고, 상기 물질 X는 상기 배지에 본래의 성분으로서 포함되어 있는 것이어도 되고, 외래성(exogenous)에 첨가된 것이어도 된다. 즉, 당해 배양 중에 세포 또는 조직에 의해 발현, 분비 또는 생산될 수 있는 내재성(endogenous)의 물질 X는 외래성의 물질 X와는 구별되며, 외래성의 물질 X를 포함하고 있지 않은 배지는 내재성의 물질 X를 포함하고 있어도 '물질 X를 포함하는 배지'의 범주에는 해당하지 않는다고 해석한다.
예컨대, 'TGFβ 시그널 저해제를 포함하는 배지'란, TGFβ 시그널 저해제가 첨가된 배지 또는 TGFβ 시그널 저해제를 본래의 성분으로서 포함하는 배지이다.
또한, 'bFGF가 실질적으로 포함되지 않는' 배양액이란, 세포 자체가 발현하는 bFGF의 존재를 부정하는 것이 아니라, 본래 bFGF를 포함하지 않거나, 또는 외래성에 bFGF가 첨가되어 있지 않은 배양액을 의미한다.
또는, 이용하는 세포 및 배지 교환 조작에 따라서는, 검출 한계 이하의 잔존하는 bFGF의 존재는 부정하지 않고, 이와 같은 경우도 본원의 범위에 포함한다. 또한, 본 발명에서의 신경 분화의 효율에 영향을 주지 않는 정도로 bFGF를 저용량 함유하는 배지를 이용하여 배양하는 것도 본원은 포함한다.
또한, 'TGFβ 시그널을 실질적으로 야기하지 않는' 배양액이란, 세포 자체가 발현하는 TGFβ의 존재를 부정하는 것이 아니라, 배양액이 본래 TGFβ를 포함하지 않거나, 또는 TGFβ가 외래성에 첨가되어 있지 않은 배양액인 것을 의미한다. 또는, 외래성에 첨가된 TGFβ를 포함하는 배양액 또는 외래성에 첨가된 TGFβ를 포함하지 않는 배양액에, 유효량의 TGFβ 시그널 저해제가 첨가된 배양액도 또한 'TGFβ 시그널을 실질적으로 야기하지 않는 배양액'의 범주이다.
TGFβ 시그널을 실질적으로 야기하지 않기 위하여 TGFβ 시그널 저해제를 사용하는 경우, 상기의 TGFβ 시그널 저해제를 적절히 선택할 수 있다. TGFβ 시그널 저해제의 농도는 배양액에서의 TGFβ 시그널 활성의 강도에 따라 적절히 조정할 수 있다. 즉, 배양액 중에서의 TGFβ 시그널 저해제의 농도는, ALK4, ALK5 또는 ALK7 시그널의 활성을 저해하는 농도이면 특별히 한정되지 않는다.
공정 (1)의 배양액에 첨가되는 TGFβ 시그널 저해제로서는, 상기의 TGFβ 시그널 저해제이면 되고, 바람직하게는 SB431542 및 A-83-01로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 공정 (1)의 배양액으로서 예컨대, ES 세포 또는 iPS 세포 등의 다능성 줄기세포의 다능성을 유지하면서 배양하는 목적으로 시판되고 있는 배지로서, bFGF를 포함하지 않는 배지를 사용하는 경우, TGFβ 시그널 저해제의 농도로서는, TGFβ 시그널 저해제로서 SB431542를 사용한 경우에서의 100nM~1mM, 100nM~500μM, 100nM~100μM, 100nM~50μM, 100nM~40μM, 100nM~30μM, 100nM~25μM, 100nM~20μM, 100nM~15μM, 100nM~10μM, 500nM~30μM, 500nM~10μM, 100nM~7μM, 1μM~20μM, 1μM~10μM, 500nM~7μM, 1μM~7μM, 100nM~3μM, 100nM~2μM, 100nM~1μM, 100nM~750nM 등에 상당하는 농도이지만, 이들로 한정되지 않는다. 바람직하게는, 1μM에서 10μM에 상당하는 농도를 들 수 있다. 다른 TGFβ 시그널 저해제의 경우, 전술한 농도의 SB431542에 상당하는 ALK 저해 활성 또는 TGFβ 저해 활성을 나타내는 농도를, 적절히 설정할 수 있다. 여기서, SB431542를 사용하는 경우에서의 농도에 상당하는 농도란, 당해 SB431542 농도와 같은 정도의 TGFβ 시그널 전달 경로의 저해 작용(예컨대, ALK4, ALK5 또는 ALK7 시그널의 활성을 저해하는 작용)을 갖는 농도 의미한다. 당해 농도는 당업자라면 용이하게 설정할 수 있다.
공정 (1)에서 이용되는 배양액으로서, 예컨대, 다능성 줄기세포 배양용 배지로부터 bFGF 불함유의 상태로 시판되고 있는 배지에, TGFβ 시그널 저해제를 첨가하여 이용할 수 있다.
또한, bFGF가 실질적으로 포함되지 않고, 또한 TGFβ 시그널을 실질적으로 야기하지 않는 배양액으로서, 예컨대 다능성 줄기세포를 유지·증식할 수 있는 배지(예컨대, Essential 8)로부터 bFGF 및 TGFβ를 제거한 배지로서 시판되어 있는 배양액(예컨대, Essential 6)을 이용할 수도 있다.
공정 (1)에서 사용되는 배양액은, 배양에 영향을 주지 않는 정도, 즉 공정 (1) 및 공정 (2)에 의해 얻어지는 대뇌 오가노이드의 형성에 실질적인 영향을 주지 않는 정도이면, 다른 물질을 포함하고 있어도 되지만, 바람직하게는 BMP 시그널, 소닉 헷지 호그 시그널 등 다능성 줄기세포의 분화 유도에 영향을 미치는 시그널 전달을 항진 또는 저해하는 물질이, 외적으로 첨가되어 있지 않은 것이 바람직하다. 또한, 공정 (1)에서 사용되는 배양액은 Wnt 시그널 전달 저해제를 포함하고 있어도 되지만, Wnt 시그널 전달을 항진하는 물질이 외적으로 첨가되어 있지 않은 것이 바람직하다.
공정 (1)에 제공되는 다능성 줄기세포는, 바람직하게는 인간 인공 다능성 줄기세포(iPS 세포) 또는 인간 배아 줄기세포(ES 세포)이며, 더욱 바람직하게는 인간 인공 다능성 줄기세포이다.
공정 (1)에서, 다능성 줄기세포는 배양보조세포 비존재 하에 배양된다. 배양보조세포 비존재 하는, 피더-프리라고도 하며, 배지 중에 배양보조세포가 존재하지 않는 상태를 말한다. 여기서 말하는 배양보조세포 비존재 하의 배양 조건으로서는, 구체적으로는 섬유아세포, SNL 세포, STO 세포 등의 배양보조세포를 첨가하지 않은 배양 조건을 들 수 있다.
공정 (1)에서 이용되는 배양액은, 바람직하게는 혈청을 실질적으로 포함하지 않는 무혈청 배양액이며, 필요에 따라 혈청 대체물을 첨가한 무혈청 배양액을 이용하여도 된다. 혈청 대체물로서는, 상술한 것을 들 수 있지만, 바람직하게는 KSR, 바람직하게는 1~30%의 KSR 등을 이용할 수 있다.
공정 (1)에서 이용되는 배양액은, bFGF가 실질적으로 포함되지 않고, 또한 TGFβ 시그널을 실질적으로 야기하지 않는 배양액, 바람직하게는 무혈청 배양액이면 특별히 한정은 없지만, bFGF 및 TGFβ 시그널을 야기하는 물질 이외에 대해서는 다능성 줄기세포의 다능성을 유지하면서 배양하기 위하여 필요한 성분을 포함하는 배지인 것이 바람직하다.
다능성 줄기세포의 다능성을 유지하면서 배양하기 위한 배지, 즉 다능성 줄기세포용 배지는 다수 시판되어 있으며, Essential 8(서모피셔 사이언티픽사 제조), S-medium(DS 파머 바이오메디컬사 제조), StemPro(서모피셔 사이언티픽사 제조), hESF9(Proc Natl Acad Sci USA. 2008 Sep 9; 105(36):13409-14), mTeSR1(스템셀 테크놀로지스사 제조), mTeSR2(스템셀 테크놀로지스사 제조), TeSR-E8(스템셀 테크놀로지스사 제조), Cellartis DEF-CS 500 Xeno-Free Culture Medium(타카라바이오사 제조) 또는 StemFit(아지노모토 헬시 서플라이사 제조) 등을 들 수 있다.
공정 (1)에 제공되는 다능성 줄기세포는, 동결 보존된 다능성 줄기세포를 해동한 직후이어도 되지만, 바람직하게는, 다능성 줄기세포의 다능성을 유지하면서 확대 배양하기에 적합한 배지에서 미리 배양·계대할 수 있다. 공정 (1)에 제공되는 다능성 줄기세포의 계대 수는 특별히 한정은 없지만, 2~8 계대되는 것이 바람직하다.
공정 (1)의 배양 기간은 5일간 미만, 4일간 미만, 바람직하게는 3일간 미만, 더욱 바람직하게는 12시간 이상 48시간 이하, 18시간 이상 48시간 이하, 더욱 바람직하게는 24시간 이상 48시간 이하, 24시간 이상 36시간 이하, 또는 18시간 이상 36시간 이하이며, 가장 바람직하게는 1일간 정도이다. 또한, 당해 배양 기간에는 준비 단계로서의 다능성 줄기세포의 계대 배양의 기간은 포함되지 않는다.
공정 (1)의 배양은, 부유 배양 및 접착 배양 중 어느 조건에서 행하여져도 되지만, 바람직하게는 접착 배양에 의해 행하여진다.
접착 배양을 행할 때에 이용되는 배양기는, '접착 배양하는' 것이 가능한 것이면 특별히 한정되지 않지만, 세포 접착성의 배양기가 바람직하다. 세포 접착성의 배양기로서는 배양기의 표면이 세포와의 접착성을 향상시킬 목적으로 인공적으로 처리된 배양기를 들 수 있고, 구체적으로는 전술한 내부가 코팅제로 피복된 배양기를 들 수 있다. 코팅제로서는, 예컨대 라미닌[라미닌 α5β1γ1(이하, 라미닌 511), 라미닌 α1β1γ1(이하, 라미닌 111), 라미닌 α1β1γ2(라미닌 112), 라미닌 α2β1γ1(라미닌 211), 라미닌 α2β1γ2(라미닌 212), 라미닌 α2β2γ2(라미닌 222), 라미닌 α5β1γ2(라미닌 512) 등 및 라미닌 단편(라미닌 511E8 등)을 포함함], 엔탁틴, 콜라겐, 젤라틴, 비트로넥틴(Vitronectin), 신세맥스(코닝사), 마트리겔 등의 세포 외 매트릭스 등, 또는 폴리리신, 폴리오르니틴 등의 고분자 등을 들 수 있다. 또한, 양전하 처리 등의 표면 가공된 배양 용기를 사용할 수도 있다. 바람직하게는 라미닌을 들 수 있고, 보다 바람직하게는 라미닌 511E8을 들 수 있다. 라미닌 511E8은 시판품을 구입할 수 있다(예: iMatrix-511, 닛피).
공정 (1)에서의 배양 온도, CO2 농도 등의 배양 조건은 적절히 설정할 수 있다. 배양 온도는 예컨대 약 30℃에서 약 40℃, 바람직하게는 약 37℃이다. 또한 CO2 농도는, 예컨대 약 1%에서 약 10%, 바람직하게는 약 5%이다.
공정 (1)은, 배양보조세포의 비존재 하, 다능성 줄기세포의 다분화능을 유지한 채로 배양하는 유지 배양 공정이며, 공정 (2)(분화 유도 공정)의 전에 행하여지는, 신경 분화 준비 공정(Neural-differentiation preparation step)이다. 이 신경 분화 준비 공정은 신경 분화의 유도의 전 또는 신경 분화의 도입의 전까지의 기간에 준비를 하는 공정이며, 공정 (1)에서 배양한 다능성 줄기세포는 TGFβ 관련 유전자의 발현이 억제되어, 그로 인해 당해 다능성 줄기세포를 신경세포로 분화 유도하면 대뇌 오가노이드의 형성 효율이 높다.
<공정 (2)>
공정 (1)에서 얻어지는 세포는, 당업자에게 주지의 방법으로 신경세포로 분화 유도할 수 있어, 이로 인해 대뇌 오가노이드를 얻을 수 있다.
분화 유도 방법은, 다능성 줄기세포를 대뇌 오가노이드를 구성하는 세포 집단으로 분화할 수 있는 분화 유도 방법을 적절히 선택할 수 있다. 당해 방법은, 주지이며, 예컨대 WO 2015/076388, WO 2016/167372, Sakaguchi et al., Stem Cell Reports 2019 Vol 13 458-473, Kitahara, et al., Stem Cell Reports 2020 Vol. 15, 467-481(비특허문헌 1) 및 Kadoshima et al., 2013, PNAS, vol.110, No.50, 20284-20289 등에 기재된 방법을 이용할 수 있다.
즉, 공정 (2)에서 행하여지는 분화 유도법으로서는, 이하의 공정 (2a) 및 공정 (2b)를 들 수 있다:
(2a) 공정 (1)에서 얻어진 세포를, TGFβ 시그널 저해제 및 Wnt 시그널 전달 저해제를 포함하는 배양액 중에서 부유 배양, 바람직하게는 정치 배양하여 세포괴를 얻는 공정
(2b) 공정 (2a)에서 얻어진 세포괴를, TGFβ 시그널 저해제 또는 Wnt 시그널 전달 저해제를 실질적으로 포함하지 않는 배양액 중, 바람직하게는 TGFβ 시그널 저해제 및 Wnt 시그널 전달 저해제 중 어느 것도 포함하지 않는 배양액 중에서 부유 배양하여 대뇌 오가노이드를 얻는 공정.
<공정 (2a)>
공정 (1)에서 얻어지는 세포는, 배양액 중, 바람직하게는 혈청(무조정 또는 미정제의 혈청)을 실질적으로 포함하지 않는 무혈청 배양액 중에 분산되고, 비접착성의 조건 하에서 배양(즉, 부유 배양)하여, 복수의 세포를 집합시켜 세포괴를 형성시킨다. 응집 시에 이용되는 배양액으로서는, 혈청 대체물을 포함하는 무혈청 배양액을 이용하여도 된다.
이 세포괴 형성에 이용하는 배양기로서는 특별히 한정되지 않지만, 예컨대 플라스크, 조직 배양용 플라스크, 디쉬, 페트리 디쉬, 조직 배양용 디쉬, 멀티 디쉬, 마이크로 플레이트, 마이크로웰 플레이트, 마이크로 포어, 멀티 플레이트, 멀티 웰 플레이트, 챔버 슬라이드, 샬레, 튜브, 트레이, 배양 백, 바이오 리액터, 롤러 보틀을 들 수 있다. 또한, 알긴산 하이드로겔 등 겔 포매에 의해 세포괴 형성하는 방법도 들 수 있다. 비접착성의 조건 하에서의 배양을 가능하게 하기 위하여, 배양기는 세포 비접착성인 것이 바람직하다. 세포 비접착성의 배양기로서는, 배양기의 표면이, 세포 비접착성이 되도록 인공적으로 처리되어 있는 것, 세포와의 접착성을 향상시킬 목적으로 인공적으로 처리(예컨대, 세포 외 매트릭스 등에 의한 코팅 처리)되어 있지 않은 것 등을 사용할 수 있다.
세포괴의 형성 시에는, 우선 공정 (1)에서 얻어지는 세포를 계대 배양으로부터 회수하고, 이것을 단세포 또는 이것에 가까운 상태로까지 분산한다. 이 분산은 적절한 세포 해리액을 이용하여 행하여진다. 세포 해리액으로서는, 예컨대 EDTA 등의 킬레이트제; 트립신, 콜라게나제 IV, 메탈로프로테아제 등의 단백질 분해 효소 등을 단독으로 또는 적절히 조합하여 이용할 수 있다. 그 중에서도 세포 장애성이 적은 것이 바람직하고, 이와 같은 세포 해리액으로서, 예컨대 디스파제(에디아), TrypLE(집코(Gibco)사 제조) 또는 아큐타제(MILIPORE) 등의 시판품이 입수 가능하다. 분산된 세포는 상기 배지(무혈청 배양액, 즉, 후술하는 공정 (2a)에서 사용되는 기초 배지)에 Y-27632를 첨가한 배지 중에 현탁된다.
여기서 분산에 의해 유도되는 다능성 줄기세포(특히, 인간 다능성 줄기세포)의 세포사를 억제하기 위하여, Rho-associated coiled-coil 키나제의 저해제(ROCK 저해제)를 배양 개시 시부터 첨가하는 것이 바람직하다(WO 2008/035110, Watanabe, K. et al., Nature Biotechnology, 2007, vol.25, No.6, page 681-686).
ROCK 저해제로서는 상기의 것을 들 수 있으며, 바람직하게는 Y-27632 등을 들 수 있다.
ROCK 저해제는 배양 개시로부터, 예컨대 20일 이내, 15일 이내, 바람직하게는 10일 이내, 보다 바람직하게는 6일 이내 첨가한다. ROCK 저해제의 농도는 일정하여도, 점차 감소시켜도 된다. 일 양태로서, ROCK 저해제의 존재 하에 10일~20일간, 바람직하게는 15일간~20일간, 더욱 보다 바람직하게는 약 17일간에서 19일간 배양하고, 또한 그의 사이에 ROCK 저해제의 농도를 점차 감소시킬 수 있다. 일 양태로서, ROCK 저해제의 존재 하에 10~25일간, 바람직하게는 12~25일간, 10~20일간, 더욱 보다 바람직하게는 약 15일간에서 20일간, 또는 약 17일간에서 19일간 배양하고, 또한 그의 사이에 ROCK 저해제의 농도를 점차 감소시켜도 된다.
부유 배양에 이용되는 ROCK 저해제의 농도는 분산에 의해 유도되는 다능성 줄기세포의 세포사를 억제할 수 있는 농도이다. 예컨대, ROCK 저해제로서 Y-27632를 이용한 경우에서의, 약 0.1~200μM, 바람직하게는 약 2~100μM, 더욱 바람직하게는 약 30~100μM에 상당하는 농도를 들 수 있다.
상술한 바와 같이 ROCK 저해제의 농도를, 첨가하는 기간 내에서 변동시켜도 되고, 예컨대 기간의 후반에 농도를 반감시키거나, 공정 (2a)를 개시한 시점으로부터 서서히 농도를 저감시킬 수 있다.
공정 (1)에서 얻어지는 세포를 분산시킨 현탁액을, 상기 배양기 중에 뿌려 비접착성의 조건 하에서 배양함으로써, 복수의 세포를 집합시켜 세포괴를 형성한다.
일 양태로서, 분산된 세포를 신속하게 응집시켜, 1개의 배양 컴파트먼트 중에 1개의 세포괴를 형성하는 것이 바람직하다(SFEBq법). 분산된 세포를 신속하게 응집시키는 방법으로서는, 예컨대 이하의 방법을 들 수 있다:
1) 비교적 작은 체적(예컨대, 1ml 이하, 500μl 이하, 200μl 이하, 100μl 이하)의 배양 컴파트먼트 중에, 분산된 세포를 가두어, 해당 컴파트먼트 중에 1개의 세포괴를 형성하는 방법, 또는
2) 원심 튜브에 분산된 세포를 넣고, 이를 원심하여 1개소에 세포를 침전시킴으로써 해당 튜브 중에 1개의 세포괴를 형성하는 방법.
상기 1)에서, 바람직하게는 분산된 세포를 가둔 후, 배양 컴파트먼트를 정치한다. 배양 컴파트먼트로서는, 멀티 웰 플레이트(384웰, 192웰, 96웰, 48웰, 24웰 등), 마이크로 포어, 챔버 슬라이드 등에서의 웰이나, 튜브, 행잉 드롭법에서의 배지의 액적 등을 들 수 있지만, 이들로 한정되지 않는다. 해당 컴파트먼트에 가둬진 분산된 세포가, 중력에 의해 1개소에 침전되거나, 또는 세포끼리가 접착함으로써 1개의 배양 컴파트먼트에 대하여 1개의 세포괴가 형성된다. 멀티 웰 플레이트, 마이크로 포어, 챔버 슬라이드, 튜브 등의 바닥의 형상은 분산된 세포가 1개소로 침전하는 것이 용이하도록 U 바닥 또는 V 바닥으로 하는 것이 바람직하다.
1개의 배양 컴파트먼트 중에 뿌리는 세포의 수는, 1개의 배양 컴파트먼트에 대하여 1개의 세포괴가 형성되고, 또한 본 발명의 방법에 의해, 해당 세포괴에서 전뇌 세포로의 분화 유도가 가능하면, 특별히 한정되지 않지만, 1개의 배양 컴파트먼트에 대하여, 공정 (1)에서 얻어지는 세포를, 통상적으로 약 1×103∼약 5×104개, 바람직하게는 약 1×103~약 2×104개, 보다 바람직하게는 약 2×103~약 1.2×104개 뿌린다. 또한, 세포를 신속하게 응집시킴으로써. 1개의 배양 컴파트먼트에 대하여, 통상적으로 세포수가 약 1×103∼약 5×104개, 바람직하게는 약 1×103~약 2×104개 , 보다 바람직하게는 약 2×103~약 1.2×104개인 세포괴가 1개 형성된다.
또는, 1개의 배양 컴파트먼트에 대하여, 공정 (1)에서 얻어지는 세포를, 통상적으로 약 1×103∼약 5×105개, 바람직하게는 약 1×103~약 2×105개, 보다 바람직하게는 약 2×103~약 1×105개 뿌린다. 또한, 세포를 신속하게 응집시킴으로써, 1개의 배양 컴파트먼트에 대하여, 통상적으로 5×102∼약 5×105개, 바람직하게는 약 5×102~약 2×105개, 보다 바람직하게는 약 1×103∼약 1×105개의 세포괴가 1개 형성된다.
세포괴 형성까지의 시간은, 1개의 컴파트먼트에 대하여 1개의 세포괴가 형성되고, 또한, 해당 세포괴에서, 대뇌 오가노이드로의 분화 유도가 가능한 범위에서 적절히 결정 가능하지만, 바람직하게는, 24시간 이내, 보다 바람직하게는 12시간 이내에 세포괴를 형성한다. 또는, 세포괴 형성까지의 시간은 바람직하게는 48시간 이내, 보다 바람직하게는 24시간 이내에서 세포괴를 형성한다.
또한, 응집괴 형성 시의 배양 온도, CO2 농도 등의 다른 배양 조건은 적절히 설정할 수 있다. 배양 온도는, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예컨대 약 30~40℃, 바람직하게는 약 37℃이다. 또한, CO2 농도는, 예컨대 약 1~10%, 바람직하게는 약 5%이다.
또한, 동일 배양 조건의 배양 컴파트먼트를 복수 준비하고, 각 배양 컴파트먼트에서, 1개의 세포괴를 형성시킴으로써, 질적으로 균일한 세포괴의 집단을 얻을 수 있다. 세포괴가 질적으로 균일하다는 것은 세포괴의 사이즈 및 세포 수, 거시적 형태, 조직 염색 해석에 의한 미시적 형태 및 그의 균일성, 분화 및 미분화 마커의 발현 및 그의 균일성, 분화 마커의 발현 제어 및 그의 동기성, 분화 효율의 세포괴 사이의 재현성 등에 기초하여 평가하는 것이 가능하다. 여기서 세포괴의 집단이 '균일'이란, 세포괴의 집단 전체 중의 80% 이상의 세포괴가, 당해 세포괴의 집단에서의 당해 파라미터의 평균값 ±20%의 범위 내, 바람직하게는, 평균값 ±10%, 더욱 바람직하게는 평균값 ±5%의 범위 내에 있는 것을 의미한다.
공정 (2a)에서 이용되는 배양액에는, TGFβ 시그널 저해제 및 Wnt 시그널 전달 저해제가 포함된다. TGFβ 시그널 저해제로서 상술한 것이 이용 가능하며, 바람직하게는 SB431542, A-83-01 또는 XAV-939를 들 수 있다. Wnt 시그널 전달 저해제로서 상술한 것이 이용 가능하며, 바람직하게는 IWR-1-end, C59, LGK-974, DKK-1(단백질)을 들 수 있다.
바람직한 Wnt 시그널 전달 저해제와 TGFβ 시그널 저해제의 조합은 IWR-1-endo 및 SB431542이다.
배지 중의 Wnt 시그널 전달 저해제의 농도는, 세포괴가 전뇌 세포로의 분화 유도 가능한 범위에서 적절히 설정할 수 있지만, Wnt 시그널 전달 저해제로서 IWR-1-endo를 이용하는 경우에서의, 0.1~50μM, 바람직하게는 0.3~10μM, 더욱 바람직하게는 0.3~5μM에 상당하는 Wnt 시그널 전달 저해 활성을 나타내는 농도를 들 수 있다.
배지 중의 TGFβ 시그널 저해제의 농도는, 세포괴가 전뇌 세포로의 분화 유도 가능한 범위에서 적절히 설정할 수 있지만, TGFβ 시그널 저해제로서 SB431542를 이용하는 경우에서의, 0.1~100μM, 바람직하게는 1~50μM, 더욱 바람직하게는 1~100μM에 상당하는 TGFβ 시그널 저해 활성을 나타내는 농도를 들 수 있다.
공정 (2a)에서 이용되는 배양액, 즉 세포괴의 형성 시 및 세포괴의 부유 배양에 이용되는 배지는, 동물 세포의 배양에 이용할 수 있는 배지이면 특별히 한정되지 않고, 상술한 정의에서의 동물 세포의 배양에 이용되는 배지를 기초 배지로서 조제할 수 있다.
공정 (2a)에서 이용되는 기초 배지로서, 예컨대, Glasgow MEM 배지, DMEM 배지, F-12 배지(F12 배지라고도 함) 및 DMEM/F12 배지 등을 들 수 있다. 바람직하게는 Glasgow MEM 배지가 이용된다.
세포괴의 형성 시에 이용되는 배지는 혈청 대체물을 함유하고 있어도 된다. 혈청 대체물은 상술한 것을 사용할 수 있지만, 예컨대 KSR(Knockout 혈청 대체물)(인비트로젠(Invitrogen)사 제조), 화학적으로 결정된 지질 농축물(집코사 제조), Glutamax(집코사 제조)를 들 수 있다.
구체적으로는, 약 10~30%의 혈청 대체물(예컨대, KSR)을 포함하는 배지를 이용할 수 있다.
또는, 세포괴의 형성 시에 이용되는 배지는 혈청 대체물을 함유하고 있어도 된다. 혈청 대체물은 상술한 것을 사용할 수 있지만, 예컨대 KSR(집코사 제조), 화학적으로 결정된 지질 농축물(집코사 제조), Glutamax(집코사 제조)를 들 수 있다. 구체적으로는, 각각의 제품의 사용 매뉴얼에 따라 적량의 혈청 대체물(예컨대: 1~30%의 KSR)을 포함하는 배지를 이용할 수 있다.
세포괴의 부유 배양에 이용되는 배지는 전뇌 세포로의 분화 유도에 악영향을 미치지 않는 범위에서 다른 첨가물을 포함할 수 있다. 첨가제로서는, 예컨대, 인슐린, 철 공급원(예컨대 트랜스페린 등), 미네랄(예컨대 셀렌산 나트륨 등), 당류(예컨대 글루코스 등), 유기산(예컨대 피루브산, 젖산 등), 혈청 단백질(예컨대 알부민 등), 아미노산(예컨대 L-글루타민 등), 환원제(예컨대 2-머캅토에탄올 등), 비타민류(예컨대 아스코브산, d-비오틴 등), 항생물질(예컨대 스트렙토마이신, 페니실린, 겐타마이신 등), 완충제(예컨대 HEPES 등) 등을 들 수 있지만, 이들로 한정되지 않는다.
일 양태에서, 세포괴의 부유 배양에 이용되는 배지는, 전뇌 세포로의 분화 유도에 악영향을 미치지 않는 관점에서, Fgf, Wnt, Nodal, Notch, Shh 등의 패턴 형성 인자; 인슐린 및 지질-풍부 알부민 등의 성장 인자를 포함하지 않는 것이 바람직하다.
응집괴의 부유 배양에서의 배양 온도, CO2 농도, O2 농도 등의 다른 배양 조건은 적절히 설정할 수 있다. 배양 온도는, 예컨대 약 30~40℃, 바람직하게는 약 37℃이다. CO2 농도는, 예컨대 약 1~10%, 바람직하게는 약 5%이다. O2 농도는, 예컨대 약 20%이다.
공정 (2a)에서의 부유 배양은, 정치 배양 또는 진동 배양 또는 선회 배양 또는 교반 배양 중 어느 것이어도 되지만, 바람직하게는 정치 배양이다. 또는, 공정 (2a)의 일부의 기간만 정치 배양을 실시하여도 된다.
공정 (2a)는, 전뇌 영역으로의 분화 방향이 결정되고 전뇌 마커 양성 세포괴(예컨대, Foxg1 양성 세포괴)가 유도되기에 충분한 기간 실시된다. 즉, 공정 (2a)에 의해, 전뇌 마커 양성 세포를 포함하는 세포괴를 얻을 수 있다.
일 양태로서, 공정 (2a)는, 적어도 1개의 전뇌 마커 양성 세포가 생성하는 단계까지 행하여진다. 바람직하게는, 공정 (2a)는, 예컨대 배양 중의 세포괴 중 50% 이상, 바람직하게는 70% 이상의 세포괴가 전뇌 마커 양성이 될 때까지 실시된다.
일 양태로서, 공정 (2a)는 세포괴에 포함되는 세포의 30% 이상, 바람직하게는 50% 이상, 보다 바람직하게는 70% 이상이, 전뇌 마커 양성인 세포괴가 생성하는 단계까지 행하여진다.
공정 (2a)의 배양 기간은, Wnt 시그널 전달 저해제 및 TGFβ 시그널 저해제의 종류나 배양 조건에 따라 변동될 수 있으므로, 일괄적으로 특정할 수는 없지만, 예컨대 인간 다능성 줄기세포를 이용한 경우, 7일간~30일간, 바람직하게는 15일간~20일간(예, 18일간)이다.
<공정 (2b)>
공정 (2b)에서는, 공정 (2a)에서 얻어진 세포괴를 추가로 TGFβ 시그널 저해제 및 Wnt 시그널 전달 저해제를 실질적으로 포함하지 않는 배양액 중에서 부유 배양함으로써, 대뇌 오가노이드를 얻는다.
일 양태로서, 공정 (2b)에서의 부유 배양은, 고산소 분압 조건 하에서 행하여져도 된다. 고산소 분압 조건이란, 공기 중의 산소 분압(20%)을 상회하는 산소 분압 조건을 의미한다. 일 양태로서, 공정 (2b)에서의 산소 분압은, 예컨대, 30~60%, 바람직하게는 35~60%, 보다 바람직하게는 38~60%이다.
공정 (2b)에 이용되는 배지는, 공정 (2a)에 이용되는 배지와 마찬가지로, 동물 세포의 배양에 이용되는 배지이면 특별히 한정은 없고, 상기의 정의에 기재된 배지를 기초 배지로서 조제할 수 있다.
기초 배지로서는, 예컨대, Glasgow MEM 배지, DMEM 배지, F-12 배지 및 DMEM/F12 배지 등을 들 수 있다. 바람직하게는 DMEM/F12 배지가 이용된다.
공정 (2b)에 이용되는 배지는, 바람직하게는 무혈청 배지이며, 필요에 따라 혈청 대체물을 함유하고 있어도 된다. 혈청 대체물은 상술한 것을 사용할 수 있는데, 예컨대, N2 서플리먼트, B27 서플리먼트, Neurocult SM1 Neuronal supplement, KSR 등을 들 수 있다.
혈청 대체물의 농도는 적절히 조정하면 되지만, 구체적으로는, 예컨대 N2 서플리먼트이면 약 0.1~3%, 바람직하게는 약 1%, B27 서플리먼트이면 약 0.1~10%, 바람직하게는 2%, KSR이면, 바람직하게는 약 1~30%의 혈청 대체물을 포함하는 배양액을 이용할 수 있다.
공정 (2b)에서는, 공정 (2a)에 이용된 Wnt 시그널 전달 저해제 및 TGFβ 시그널 저해제는 불요하다. 일 양태에서, 공정 (2b)에 이용되는 배지에는, Wnt 시그널 전달 저해제 및 TGFβ 시그널 저해제가 포함되지 않는다.
일 양태에서, 공정 (2b)에서의 배양액은, 바람직하게는 혈청을 실질적으로 포함하지 않는 무혈청 배양액이고, 더욱 바람직하게는 혈청 대체물을 포함하는 무혈청 배양액이다.
공정 (2b)에 이용되는 배지는, 대뇌 피질 세포로의 분화 유도를 촉진하기 위하여 혈청 대체물로서 N2 서플리먼트를 함유하는 것이 바람직하다. N2 서플리먼트는 인슐린, 트랜스페린, 프로게스테론, 푸트레스신 및 아셀렌산 나트륨을 포함하는, 공지의 혈청 대체용 조성물이며, 집코/서모피셔 사이언티픽(Gibco/Thermo Fisher Scientific)사 등으로부터 구입 가능하다. N2 서플리먼트의 첨가량은 전뇌 조직 또는 그의 전구 조직으로의 분화 유도 또는 신경세포로의 분화 유도 및/또는 대뇌 피질을 구성하는 세포 또는 그의 전구 세포로의 분화 유도가 촉진되도록 적절히 설정할 수 있다.
또한, 공정 (2b)에 이용되는 배지는, 뇌실대의 장기간의 유지 배양을 위하여, 화학적으로 결정된 지질 농축물(Chemically Defined Lipid Concentrate)을 함유하는 것이 바람직하다. 화학적으로 결정된 지질 농축물은 각각 정제된 콜레스테롤, DL-α-토코페롤, 아라키돈산, 리놀렌산, 리놀레산, 미리스틴산, 올레산, 팔미트산, 팔미톨레산 및 스테아린산을 포함하는 지질 혼합물이다. 화학적으로 결정된 지질 농축물은 시판되는 것을 사용할 수 있으며, 예컨대 집코/서모피셔 사이언티픽사 등에서 구입 가능하다.
세포괴의 부유 배양에 이용되는 배지는 대뇌 피질 세포로의 분화 유도에 악영향을 미치지 않는 범위에서 다른 첨가물을 포함할 수 있다. 첨가제로서는, 예컨대, 인슐린, 철 공급원(예컨대 트랜스페린 등), 미네랄(예컨대 셀렌산 나트륨 등), 당류(예컨대 글루코스 등), 유기산(예컨대 피루브산, 젖산 등), 혈청 단백질(예컨대 알부민 등), 아미노산(예컨대 L-글루타민 등), 환원제(예컨대 2-머캅토에탄올 등), 비타민류(예컨대 아스코브산, d-비오틴 등), 항생 물질(예컨대 스트렙토마이신, 페니실린, 겐타마이신 등), 완충제(예컨대 HEPES 등)를 들 수 있지만, 이들로 한정되지 않는다.
일 양태에서, 공정 (2b)에서의 배지는 혈청을 포함하고 있어도 된다. 혈청은 뇌실대의 장기간의 유지 배양에 기여할 수 있다. 혈청으로서는 FBS 등을 들 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 혈청은 비동화되어 있는 것이 바람직하다. 배지 중의 혈청 농도는, 뇌실대의 장기간의 유지 배양에 기여할 수 있는 범위에서 적절히 조정할 수 있는데, 통상적으로 1∼20%(v/v)이다.
일 양태에서, 공정 (2b)에서의 배지는, 헤파린을 포함하고 있어도 된다. 헤파린은 뇌실대의 장기간의 유지 배양에 기여할 수 있다. 배지 중의 헤파린 농도는, 뇌실대의 장기간의 유지 배양에 기여할 수 있는 범위에서 적절히 조정할 수 있지만, 통상적으로 0.5~50㎍/ml, 바람직하게는 1~10㎍/ml(예컨대 5㎍/ml)이다.
일 양태에서, 공정 (2b)에서의 배지는 세포 외 매트릭스 성분을 포함하고 있어도 된다. 세포 외 매트릭스는 뇌실대의 장기간의 유지 배양에 기여할 수 있다. '세포 외 매트릭스 성분'이란, 세포 외 매트릭스 중에 통상적으로 발견되는 각종 성분을 말한다. 본 발명의 방법에서는 기저막 성분을 이용하는 것이 바람직하다. 기저막의 주성분으로서는, 예컨대 IV형 콜라겐, 라미닌, 헤파란황산프로테오글리칸, 엔탁틴을 들 수 있다. 배지에 첨가하는 세포 외 매트릭스 성분으로서는 시판하는 것을 이용할 수 있으며, 예컨대, Matrigel(BD 바이오사이언스(BD Bioscience)), 인간형 라미닌(시그마-알드리치) 등을 들 수 있다. Matrigel은 Engelbreth Holm Swarn(EHS) 마우스 육종 유래의 기저막 조제물이다. Matrigel의 주성분은 IV형 콜라겐, 라미닌, 헤파란황산푸로테오글리칸, 엔탁틴이지만, 이들에 더하여 TGFβ, 섬유아세포 증식 인자(FGF), 조직 플라스미노겐 활성화 인자, EHS 종양이 천연으로 생산하는 증식 인자가 포함된다. Matrigel의 성장 인자 감소 제품은 통상의 Matrigel보다도 증식 인자의 농도가 낮으며, 그의 표준적인 농도는 EGF가 <0.5ng/ml, NGF가 <0.2ng/ml, PDGF가 <5pg/ml, IGF-1이 5ng/ml, TGFβ가 1.7ng/ml이다. 본 발명의 방법에서는 성장 인자 감소 제품의 사용이 바람직하다.
배지 중의 세포 외 매트릭스 성분의 농도는, 뇌실대의 장기간의 유지 배양에 기여할 수 있는 범위에서 적절히 조정할 수 있지만, Matrigel을 이용하는 경우에는 배양액의 1/500~1/20의 용량, 더욱 바람직하게는 1/100의 용적으로 첨가하는 것이 바람직하다.
일 양태에서, 공정 (2b)에서의 배지는 N2 서플리먼트 및 화학적으로 결정된 지질 농축물에 더하여, 혈청 및 헤파린을 함유한다. 해당 양태에서는, 해당 배지에 세포 외 매트릭스를 추가로 포함하고 있어도 된다. 본 양태의 배지는 장기간에 걸친 종뇌 또는 그의 부분 조직 또는 그의 전구 조직의 분화 유도를 관찰하는데 적합하다.
이 경우, 공정 (2b)의 전 범위에 걸쳐 N2 서플리먼트, 화학적으로 결정된 지질 농축물, 혈청 및 헤파린(임의로 추가로 세포 외 매트릭스)을 함유하는 배지를 이용하여도 되지만, 일부의 기간에만 당해 양태의 배지를 이용하여도 된다. 일 양태에서, 공정 (2b)에서, 우선 N2 서플리먼트 및 화학적으로 결정된 지질 농축물을 포함하고, 혈청, 헤파린 및 세포 외 매트릭스를 함유하지 않는 배지를 이용하여 도중에서부터(예컨대, Foxg1 양성 응집괴 중에 뇌실 유사의 공동을 가진 신경 상피 유사 구조(다열 원주 상피), 예컨대 반(半)구상 또는 구상의 공동을 복수 갖는 다열 원주 상피가 형성된 단계 이후에서), N2 서플리먼트, 화학적으로 결정된 지질 농축물, 혈청, 헤파린(임의로, 세포 외 매트릭스)을 함유하는 배지로 전환하여도 된다.
공정 (2b)에서의 배양 온도, CO2 농도 등의 다른 배양 조건은 적절히 설정할 수 있다. 배양 온도는 예컨대 약 30~40℃, 바람직하게는 약 37℃이다. CO2 농도는, 예컨대 약 1~10%, 바람직하게는 약 5%이다.
공정 (2b)는 적어도 전뇌 마커(예컨대, Foxg1) 양성 세포가 생성되고, 대뇌 피질 유사 구조물이 형성되기에 충분한 기간 실시된다. 당해 대뇌 피질 유사 구조물은 현미경 관찰에 의해 확인하는 것이 가능하다.
공정 (2b)의 배양 기간은, 공정 (2a)의 Wnt 시그널 전달 저해제 및 TGFβ 시그널 저해제의 종류 등에 따라 변동할 수 있으므로, 일괄적으로 특정할 수 없지만, 예컨대 인간 다능성 줄기세포를 이용한 경우, 적어도 10일간 또는 10~40일간, 바람직하게는 10~31일간, 더욱 바람직하게는 15~24일간이다.
본 명세서에서, 공정 (2b) 배양 공정을 장기간(예, 20일 이상, 바람직하게는 50일 이상, 보다 바람직하게는 70일 이상)에 걸쳐 실시함으로써, 세포괴 내에서 안정적인 대뇌 피질 유사 구조물의 자기 조직화를 유발하는 것이 가능하며, 공정 (2b)를 계속하여 실시하면, 시간의 경과와 함께, 세포 응집괴 내에 포함되는 대뇌 조직의 분화 단계가 진행되어 간다. 따라서, 소망하는 분화 단계, 즉 복수의 대뇌 피질 유사 구조물을 포함하는 대뇌 오가노이드의 형성에 도달할 때까지, 공정 (2b)를 계속하여 실시하는 것이 바람직하다.
공정 (2b)에서, 세포괴의 부유 배양에 이용하는 배양기로서는, 특별히 한정되지 않지만, 예컨대, 플라스크, 조직 배양용 플라스크, 디쉬, 페트리 디쉬, 조직 배양용 디쉬, 멀티 디쉬, 마이크로 플레이트, 마이크로웰 플레이트, 마이크로 포어, 멀티 플레이트, 멀티 웰 플레이트, 챔버 슬라이드, 샬레, 튜브, 트레이, 배양 백, 바이오 리액터, 롤러 보틀을 들 수 있다. 비접착성의 조건 하에서의 배양을 가능하게 하기 위하여, 배양기는 세포 비접착성인 것이 바람직하다. 세포 비접착성의 배양기로서는, 배양기의 표면이 세포 비접착성이 되도록 인공적으로 처리되어 있는 것이나, 세포와의 접착성을 향상시킬 목적으로 인공적으로 처리(예컨대, 세포 외 매트릭스 등에 의한 코팅 처리)되어 있지 않은 것 등을 사용할 수 있다.
일 양태로서, 공정 (2b)에서 세포괴의 부유 배양에 이용하는 배양기로서, 산소 투과성인 것을 이용하여도 된다. 산소 투과성의 배양기를 이용함으로써, 세포괴로의 산소의 공급이 향상된다. 공정 (2b)에서는, 세포 응집괴가 크게 성장하여 세포괴의 가운데의 세포로까지 충분한 산소가 공급되지 않게 되는 리스크를 피하기 위하여, 산소 투과성의 배양기를 이용하여도 된다.
공정 (2b)의 부유 배양 시에는, 세포괴의 배양기에 대한 비접착 상태를 유지할 수 있는 한, 세포괴를 정치 배양하여도 되고, 선회 배양이나 진동 배양에 의해 응집괴를 의식적으로 움직여도 된다. 공정 (2b)의 전 기간을 통하여 정치 배양을 실시하여도 되고, 일부의 기간만 정치 배양을 실시하여도 된다.
일 양태로서, 공정 (2b)의 부유 배양은 정치 배양이다. 이 때, 상술한 고산소 분압 조건 하에 배양하는 것이 바람직하다.
일 양태로서, 공정 (2b)의 부유 배양은 진동 배양이다. 이 때, 고산소 분압 조건 하에서의 배양은 불요하다.
공정 (2b)에 의해 세포괴 중에 전뇌 마커 양성의 대뇌 피질 유사 구조물이 형성된다. 일 양태에서, 대뇌 피질 유사 구조물을 포함하는 세포괴에 포함되는 세포의 70% 이상이 전뇌 마커 양성(예컨대, Foxg1 양성)이다.
일 양태에서, 공정 (2b)에 의해 세포괴 중에 형성된 대뇌 피질 유사 구조물은 신경 상피의 외측에 신경세포층을 구비한 로제트 유사 구조물이다. 일 양태에서, 해당 대뇌 피질 유사 구조물은, 내강 측에 신경 줄기세포 마커 양성, 구체적으로는 PAX6 및/또는 SOX2 양성의 세포층을 가지며, 가장 내강의 부분에 인산화 Histone H3 양성의 유사(有絲) 분열 세포를 포함한다. 일 양태에서, 신경 상피 유사의 세포층의 외측에는, 유사 분열 후의 신경세포의 마커인 βIII-튜불린(βTubIII, TUBB3 또는 TUJ1)을 발현하고 대뇌 피질의 초기 피질판 마커인 Ctip2 또는 Tbr1을 발현하는 세포가 포함된다. 이들은 대뇌 피질의 제1층의 신경세포인 릴린(Reelin) 양성 카할레티우스 세포를 포함하고, 표층 근처에는 라미닌(Laminin)을 많이 포함한 층을 가질 수 있다. 즉, 바람직한 양태에서, 본 발명의 제조 방법에 의해 얻어지는 응집괴에는 대뇌 피질 전구 조직이 포함된다.
<공정 (3)>
본 발명의 대뇌 오가노이드의 제조 방법은 추가로 대뇌 오가노이드를 선별하는 공정인 공정 (3)을 포함하여도 된다. 공정 (3)은, 공정 (2)에서 얻어진 복수의 세포괴로부터, 세포괴의 형상, 내부 구조, 사이즈, 표면의 색채 또는 모양 및 유전자 발현으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 이상을 지표로 하여, 소망하는 대뇌 오가노이드를 선별하는 공정이다. 이들 지표 중 2 이상, 3 이상 또는 4 이상을 채용하는 것이 바람직하고, 또한 지표로서 세포괴의 형상, 내부 구조, 표면의 색채 또는 모양 및/또는 유전자 발현인 것이 바람직하며, 세포괴의 형상, 내부 구조 및/또는 유전자 발현인 것이 보다 바람직하고, 세포괴의 형상인 것이 특히 바람직하다. 예컨대 세포괴의 형상이 구상(스피어상)인 경우, 소망하는 대뇌 오가노이드로서 선별할 수 있다.
대뇌 오가노이드를 선별하기 위한 각 지표는 일반적인 대뇌 오가노이드의 정의에 따르는 것이 바람직하고, 예컨대 이하의 (1)~(5) 중 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개 또는 4개를 충족하는 세포괴를 대뇌 오가노이드로 판정하여도 된다.
(1) 구상의 세포괴인 것,
(2) 세포괴의 내부에 대뇌 피질 유사 구조물을 갖는 것,
(3) 세포괴의 표면에 색소 침착을 갖지 않는 것,
(4) 세포괴의 일부에 낭포상 형상, 돌기 형상, 풍선상 형상을 갖지 않는 것 및,
(5) 세포괴가 NEUROD6, NEUROD2, SSTR2, TBR1, ZBTB18, NHLH1, IGFBPL1, NRN1, RTN1, THSD7A, NRXN1, BHLHE22, CALB2, KHDRBS3, CCSAP, PDE1A, NEUROD1, NPTX1, NXPH4, NTS, NEUROG2, OLFM1, PRDM8, CORO2B, TP53I11, ZFPM2, PCDH9, NELL2, SRRM4, SCG3, DCC, EPB41L3, SLC17A7, ST18, NSG2, EMX1, CAP2, SYT4, NSMF, ANK3, MYT1L, FSTL5, CELF4, B3GAT1, EPHA5, NHLH2 및 DLL3으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개 또는 적어도 5개의 유전자를 발현하고 있는 것.
상기 (5)에 대하여 대뇌 오가노이드가 SLC17A7, NEUROD6 및 EMX1로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 이상의 유전자, 바람직하게는 모든 유전자를 발현하고 있는 것이 바람직하다.
또한, 후술하는 표 6에 기재된 목적 외 세포에 발현하는 유전자 중 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개 이상 또는 적어도 5개 이상을 실질적으로 발현하지 않은 것이 바람직하다. 또한, GAD2, COL1A1, TYR, TTR 및 HOXA2로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 이상의 유전자를 실질적으로 발현하지 않은 것이 바람직하고, 이들 마커 중 2 이상, 3 이상, 4 이상 또는 전부를 발현하지 않는 것이 보다 바람직하다.
본 명세서에서, 유전자가 '실질적으로 발현하지 않은'이란, 유전자의 발현 산물인 단백질이, 생리 기능을 발휘하는 정도의 발현량을 충족하지 않는 것을 의미한다.
본 명세서에서 '실질적으로 발현하지 않은' 상태로서, 구체적으로는, 세포에 항상적으로 발현하고 있는 임의의 컨트롤 유전자(예컨대, 항상적으로 발현하고 있는 유전자로서 GAPDH, ACTB, B2M, 18S 리보솜 RNA 등을 들 수 있다.)의 발현량을 기준으로서, 컨트롤 유전자의 발현량의 1/10 이하인 상태를 들 수 있다.
상기 (1)에서의 구상 및 상기 (2)에서의 대뇌 피질 유사 구조물은 상기와 같다. 여기에서, 구상이기는 하지만 대뇌 피질 유사 구조물을 갖지 않는 세포괴의 대표예는, 도 31에서 '감자상(Potato-like)' 또는 '젤리상(Jelly-like)'이라고 칭해지는 세포괴이다.
상기 (3)에서의 색소 침착이란, 세포괴 중 일부에 흑색 또는 갈색의 영역을 갖는 것을 의미한다. 여기에서, 색소 침착을 갖는 세포괴의 대표예는 도 28에서 '색소(Pigment)'라고 칭해지는 세포괴이다.
상기 (4)에서의 세포괴의 일부에 낭포상 형상, 돌기 형상 또는 풍선상 형SOX10TFAP2A상을 갖지 않는 것이란, 각각 세포괴 중에 투명도가 높은 봉지상의 구조, 섬유상의 상피 구조 또는 돌기상의 구조가 존재하지 않는 것을 의미한다.
여기에서, 낭포상 형상의 대표예는, 도 31에서 '투명'이라고 칭해지는 형상이다. 여기에서, 돌기 형상의 대표예는, 도 31에서 '면상(Cotton-like)'라고 칭해지는 형상이다. 여기에서, 풍선상 형상의 대표예는, 도 31에서 '풍선상(Balloon)'이라고 칭해지는 형상이다. 상기 (1)~(4)의 특징은 세포괴를 경우에 따라 확대한 다음, 육안으로 판별하여 제외할 수 있다. 또는, 현미경의 확대 화상을 기초로, 화상 해석이 가능한 소프트웨어를 이용하여 장치에 의해 형상을 판별하여도 된다. 이 경우, 심층 학습 등의 방법을 이용하여 형상의 판별의 정밀도를 향상시켜도 된다.
또한, 대뇌 오가노이드는 직경(원 상당 직경)이 약 100㎛~10000㎛, 바람직하게는 약 500㎛~5000㎛의 구상 유사의 세포괴이어도 된다. 세포괴의 내부에 포함되는 대뇌 피질 유사 구조물은 직경(원 상당 직경)이 약 10㎛~1000㎛, 바람직하게는 약 50㎛~500㎛이어도 된다.
유전자(마커)의 발현은 그의 발현량에 의해 판정할 수 있다. 유전자의 발현량은, 당해 유전자의 발현 산물(mRNA 또는 단백질 또는 그의 단편)의 양, 바람직하게는 mRNA의 발현량으로 평가할 수 있다. 구체적으로는, 정량적 RT-PCR법, RT-PCR법, 차세대 시퀀스 해석, 마이크로 어레이 해석, 웨스턴 블롯팅법, ELISA법, 면역 염색법, 플로우 사이토메트리 등에 의해 판정할 수 있다.
판정은, 세포괴마다 행하여도 되고, 동일 로트의 경우는, 일정 수의 세포괴(예컨대, 1개 이상, 3개 이상, 5개 이상)를 샘플링하여 판정하여도 된다. 세포괴의 형상, 내부 구조, 사이즈, 및 표면의 색채 또는 모양의 경우는, 도립 현미경 관찰에서 육안으로 확인함으로써 판정할 수 있고, 세포괴마다 판정하는 것이 바람직하다. 유전자 발현에 관해서는 세포괴마다가 아니라, 샘플링함에 의해 판정하는 것이 바람직하다. 구체적으로는, 예컨대 형상 및/또는 내부 구조로 선별한 세포괴에 대하여, 정량적 RT-PCR법, RT-PCR법, 차세대 시퀀스 해석, 마이크로 어레이 해석, 웨스턴 블롯팅법, ELISA법, 면역 염색법, 플로우 사이토메트리 등으로 판정하는 것을 들 수 있다.
공정 (3)에서, 상기 판정 방법에 의해 대뇌 오가노이드로 판정된 세포괴를 회수하여, 대뇌 오가노이드로서 선별한다. 공정 (3)에서 선별된 대뇌 오가노이드는 선별하지 않는 경우에 비하여 대뇌 오가노이드가 농축된다. 즉, 공정 (3)을 거침으로써, 세포괴의 집단에서의 대뇌 오가노이드의 비율을 더욱 향상시킬 수 있다.
3. 대뇌 오가노이드
본 발명의 세포 배양물은, 상기한 공정 (1) 및 공정 (2)를 포함하는 대뇌 오가노이드의 제조 방법을 이용하여 제조되는 세포 배양물로서, 복수의 구상의 세포 응집체를 포함하고, 해당 복수의 구상의 세포 응집체에서 차지하는 대뇌 오가노이드의 비율이 40% 이상, 바람직하게는 50% 이상, 더욱 바람직하게는 60% 이상인 세포 배양물이다. 여기서, 당해 비율은 세포 배양물을 샘플링하여, 해당 샘플에서의 구상의 세포 응집체의 전체 수에서 차지하는 대뇌 오가노이드의 수로 산출할 수 있다.
대뇌 오가노이드는 신경 상피의 외측에 신경세포층을 구비한 대뇌 피질 유사 구조물을 1 이상, 바람직하게는 복수 내포하는 구상의 세포괴를 의미한다. 대뇌 오가노이드의 판정 방법은, 상기 공정 (3)의 방법에 준한다.
개개의 대뇌 오가노이드에서 차지하는 대뇌 피질 유사 구조물의 비율은 20% 이상, 바람직하게는 40% 이상, 더욱 바람직하게는 50% 이상이어도 된다. 여기서, 대뇌 오가노이드에서 차지하는 대뇌 피질 유사 구조물의 비율은, 대뇌 오가노이드 전체의 면적 또는 체적에서 차지하는 대뇌 피질 유사 구조물의 비율이며, 평가하기 쉬운 관점에서, 면적의 비율인 것이 바람직하다. 또한, 당해 비율은 복수(예컨대 2~20개, 바람직하게는 5개 또는 10개)의 대뇌 오가노이드의 평균값이어도 된다. 당해 비율은 예컨대, 대뇌 오가노이드의 중심부를 포함하는 절편의 단면적에서 차지하는 대뇌 피질 유사 구조물의 비율로 평가하여도 된다. 여기서 중심부란, 대뇌 오가노이드의 최대 직경을 갖는 단면의 중심 개소를 의미한다. 상기 평가는, 예컨대 대뇌 오가노이드 절편에 대하여 면역 염색을 행하고, 신경 줄기세포 마커 및/또는 신경 전구 세포 마커, 및 신경세포 마커가 양성인 세포는 대뇌 피질 유사 구조물로 판정하고, 대뇌 피질 유사 구조물의 면적이 당해 절편의 면적에서 차지하는 비율을 산출함으로써 행하여도 된다. 또는 당해 대뇌 오가노이드의 체적에서 차지하는 당해 대뇌 피질 유사 구조물의 체적의 비율로서 산출하여도 된다.
여기서 상기 신경 줄기세포 및/또는 신경 전구 세포 마커로서는 Pax6을 들 수 있고, 상기 신경세포 마커로서는 전뇌 마커인 Foxg1, 대뇌 피질 마커인 Ctip2 등을 들 수 있다.
또한, 당해 대뇌 오가노이드의 바람직한 양태에서, 전 세포 수의 20% 이상, 바람직하게는 40% 이상, 바람직하게는 70% 이상이 Foxg1 양성 세포이다.
일 양태에서, 대뇌 피질 유사 구조물은 내강 측에 신경 줄기세포 마커: PAX6 및/또는 SOX2 양성의 세포층을 포함하며, 가장 내강의 부분에 인산화 Histone H3 양성의 유사 분열 세포를 포함한다.
일 양태에서, 대뇌 피질 유사 구조물의 신경 상피 유사 세포층 외측에는 유사 분열 후의 신경세포의 마커인 βIII-튜불린(βTubIII, TUBB3 또는 TUJ1)이 발현하여, 대뇌 피질의 초기 피질판 마커인 Ctip2 및/또는 Tbr1을 발현하는 세포가 포함된다. 이들은 대뇌 피질의 제1층의 신경세포인 릴린 양성 카할레티우스 세포를 포함하며 표층 근처에는 라미닌을 많이 포함하는 층을 가질 수 있다.
일 양태에서, 대뇌 오가노이드는 상기 공정 (1) 및 공정 (2)를 포함하는 대뇌 오가노이드의 제조 방법을 이용하여 제조되는 대뇌 오가노이드이어도 된다. 일 양태의 대뇌 오가노이드는 상기 공정 (3)에 의해 선별된 대뇌 오가노이드이어도 되고, 또한, 하기 (1)~(5)의 특징을 갖는 세포괴이어도 된다.
(1) 구상의 세포괴인 것,
(2) 세포괴의 내부에 대뇌 피질 유사 구조물을 갖는 것,
(3) 표면에 색소 침착을 갖지 않는 것,
(4) 세포괴의 일부에 낭포상 형상, 돌기 형상, 풍선상 형상을 갖지 않는 것, 및,
(5) NEUROD6, NEUROD2, SSTR2, TBR1, ZBTB18, NHLH1, IGFBPL1, NRN1, RTN1, THSD7A, NRXN1, BHLHE22, CALB2, KHDRBS3, CCSAP, PDE1A, NEUROD1, NPTX1, NXPH4, NTS, NEUROG2, OLFM1, PRDM8, CORO2B, TP53I11, ZFPM2, PCDH9, NELL2, SRRM4, SCG3, DCC, EPB41L3, SLC17A7, ST18, NSG2, EMX1, CAP2, SYT4, NSMF, ANK3, MYT1L, FSTL5, CELF4, B3GAT1, EPHA5, NHLH2 및 DLL3으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 또는 적어도 5개의 유전자를 발현하고 있는 것.
상기 (5)에 대하여, 대뇌 오가노이드가 SLC17A7, NEUROD6 및 EMX1로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 이상, 2 이상 또는 전부를 발현하고 있는 것이 바람직하다. 또한, GAD2, COL1A1, TYR, TTR 및 HOXA2로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 이상의 유전자를 실질적으로 발현하지 않는 것이 바람직하고, 이들 마커 중 2 이상, 3 이상, 4 이상 또는 전부를 발현하지 않는 것이 보다 바람직하다.
일 양태에서, 대뇌 오가노이드는 상기한 바와 같으며, 또한 세포괴 1개당 세포 수는 약 5×103~5×106개, 바람직하게는 약 1×104~3×106개이어도 된다.
4. 대뇌 피질 세포괴의 제조 방법 1
본 발명의 일 양태로서, 하기의 공정 (i) 및 공정 (ii)를 포함하는, 배양보조세포의 비존재 하에, 다능성 줄기세포로부터 대뇌 피질 세포괴를 제조하는 방법을 들 수 있다.
(i) 다능성 줄기세포로부터 대뇌 오가노이드를 얻는 공정,
(ii) 공정 (i)에서 얻어진 대뇌 오가노이드를, Notch 시그널 저해제, 바람직하게는 γ-세크레타제 저해제를 포함하는 배양액 중에서 배양하여, 대뇌 피질 세포괴를 얻는 공정.
상기 공정 (i)에서, 다능성 줄기세포로부터 대뇌 오가노이드를 얻는 방법은 한정되지 않고, 당업자에게 주지의 방법으로 조제할 수 있다. 이와 같은 주지의 방법으로서는, 예컨대 상기 2의 대뇌 오가노이드의 제조 방법에서의 공정 (2)를 들 수 있다.
본 발명의 일 양태로서, 공정 (i)에서, 상기 2에 기재된 대뇌 오가노이드의 제조 방법에 의해 다능성 줄기세포로부터 대뇌 오가노이드를 얻는 것을 포함하는 '대뇌 피질 세포괴의 제조 방법 1'을 들 수 있다. 즉, 대뇌 피질 세포괴의 제조 방법 1은, 상기 2에 기재된 대뇌 오가노이드의 제조 방법으로 얻어지는 대뇌 오가노이드를 이하의 공정 (i) 및 공정 (ii)로 처리하는 것을 포함하는, 배양보조세포의 비존재 하에, 다능성 줄기세포로부터 대뇌 피질 세포괴의 제조 방법이다.
(i) 상기 2에 기재된 대뇌 오가노이드의 제조 방법(즉, 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 기재된 방법을 포함함)에 의해, 대뇌 오가노이드를 얻는 공정,
(ii) 공정 (i)에서 얻어진 대뇌 오가노이드를, Notch 시그널 저해제, 바람직하게는 γ-세크레타제 저해제를 포함하는 배양액 중에서 배양하여 대뇌 피질 세포괴를 얻는 공정.
<공정 (i)>
공정 (i)은 상기 2에서의 공정 (1), 공정 (2a) 및 공정 (2b)에 기재된 바와 같다. 또한, 공정 (i)은 상기 2에서의 공정 (3)을 추가로 포함하여도 된다.
일 양태로서, 공정 (2b)는 약 7~31일간, 바람직하게는 약 7~21일간 행하여진다.
<공정 (ii)>
상술한 공정 (2b)를 행한 후, 경우에 따라서 공정 (3)에 의한 선별을 행하고, Notch 저해제, 바람직하게는 γ-세크레타제 저해제를 포함하는 배지에 배지 교환을 행함으로써, 공정 (ii)를 행할 수 있다. 또는, 상술한 공정 (2b)를 행한 후 공정 (ii)를 실시하고, 이어서 공정 (3)의 선별을 행하여도 된다.
공정 (ii)에서, Notch 시그널 저해제로서는, 정의에 기재된 것을 적절히 선택하여 사용할 수 있다. 공정 (ii)에서 이용되는 Notch 시그널 저해제로서, 바람직하게는 γ-세크레타제 저해제를 들 수 있다. γ-세크레타제 저해제로서는, 정의에 기재된 것을 적절히 선택하여 사용할 수 있다. 바람직한 γ-세크레타제 저해제로서는, N-[N-(3,5-디플루오로펜아세틸)-L-알라닐]-S-페닐글리신 t-부틸 에스테르(DAPT) 또는 화합물 E를 들 수 있다.
공정 (ii)에서, 이용되는 배양액은, Notch 시그널 저해제가 포함되는 것 이외에는, 공정 (i), 즉 2의 제조 방법의 공정 (2b)에서 사용한 배양액과 동일한 것을 사용할 수 있다. 또는, 공정 (2b)에서 사용한 배양액과는 상이한 것을, 상기 2의 제조 방법의 공정 (2b)에 기재되어 있는 배양 조건으로부터 적절히 선택하여도 된다.
또한, 공정 (ii)의 배양 조건은, 적절히 공정 (2b)에 준하면 된다.
배양액 중의 Notch 시그널 저해제, 바람직하게는 γ-세크레타제 저해제의 농도는, 세포괴에 포함될 수 있는 신경 줄기세포 등의 증식성의 세포를 억제 가능한 범위에서, 적절히 설정할 수 있다. 구체적으로는, γ-세크레타제 저해제로서 DAPT를 이용하는 경우에서의, 0.1~1000μM, 1~100μM, 바람직하게는 1~30μM, 더욱 바람직하게는 5~20μM에 상당하는 γ-세크레타제 활성 또는 당해 γ-세크레타제 활성에 기초한 Notch 시그널 저해 활성을 나타내는 농도를 들 수 있다.
공정 (ii)는, 공정 (i)의 부유 배양 개시 시점(신경세포로의 분화 유도 개시)으로부터 약 28일 후~49일 후, 바람직하게는 약 28일 후~44일 후에 행하여진다.
공정 (ii)의 배양 기간은, 1∼7일간, 바람직하게는 2∼6일간, 보다 바람직하게는 2∼4일간이다.
5. 대뇌 피질 세포괴의 제조 방법 2
본 발명의 일 양태로서, 배양보조세포의 비존재 하에, 다능성 줄기세포로부터 대뇌 피질 세포괴를 제조하는 방법을 들 수 있고, 당해 방법이,
(i) 다능성 줄기세포로부터 대뇌 오가노이드를 얻는 공정과,
(ii) 공정 (i)에서 얻어진 대뇌 오가노이드를, 배양액 중에서 배양하는 공정과,
(iii) 공정 (ii)에서 얻어진 세포 배양물을, 단세포 또는 2~5개의 세포 집합체로까지 분산시키는 공정과,
(iv) 공정 (ii)에서 얻어진 세포 배양물 또는 공정 (iii)에서 얻어진 세포 집단을, 1 이상의 신경 영양 인자, 아스코브산 및 cAMP 활성화제를 포함하는 배양액 중에서 배양하는 공정
을 포함하고, 상기 공정 (iii)의 단세포 또는 2~5개의 세포 집합체로의 분산 공정은 임의의 공정이며, 상기 공정 (ii)의 배양액 및/또는 상기 공정 (iv)의 배양액은, Notch 시그널 저해제를 포함한다.
상기 공정 (i)에서, 다능성 줄기세포로부터 대뇌 오가노이드를 얻는 방법은 한정되지 않고, 당업자에게 주지의 방법으로 조제할 수 있다. 바람직하게는, 공정 (i)에서, 상기 2에 기재된 대뇌 오가노이드의 제조 방법, 특히 공정 (1), 공정 (2a) 및 공정 (2b)를 포함하는 제조 방법에 의해 다능성 줄기세포로부터 대뇌 오가노이드를 얻는다.
상기 공정 (ii)의 배양액 및/또는 상기 공정 (iv)의 배양액은, 당해 공정의 일부 또는 모든 기간에서 Notch 시그널 저해제를 포함하는 양태이어도 된다. Notch 시그널 저해제의 처리 기간이 일부의 기간인 경우는, 상기 공정 (ii)의 배양액 또는 상기 공정 (iv)의 배양액의 교환 시에 Notch 시그널 저해제를 포함하지 않는 배양액을 이용한다. 일부의 기간은, Notch 시그널 저해제에 의한 처리의 효과가 얻어지는 한, 특별히 한정되지 않고, 상기 공정 (ii) 또는 상기 공정 (iv)의 배양 기간 중의 수시간~수일, 구체적으로는 1~7일간, 바람직하게는 2~6일간, 보다 바람직하게는 2~4일간이어도 된다. 또한, 극히 짧은 처리 기간(예컨대, 4시간, 12시간, 24시간, 2일간)의 반복이어도 된다. 또한, Notch 시그널 저해제를 포함하는 기간과 Notch 시그널 저해제를 포함하지 않는 기간을 번갈아 행하거나 농도를 바꾼 Notch 시그널 저해제를 이용한 조합도 본원의 범주이다. 여기서 이용되는 Notch 시그널 저해제 및 그의 농도는 대뇌 피질 응집괴의 제조 방법 1에서의 공정 (ii)의 기재를 참조하면 된다.
본 발명의 일 양태로서, 공정 (i)은 상기 2에 기재된 대뇌 오가노이드의 제조 방법에 따라 행하고, 또한 공정 (iii)을 포함하는, '대뇌 피질 세포괴의 제조 방법 2-1'을 들 수 있다. 즉, 대뇌 피질 세포괴의 제조 방법 2-1은, 상기 4에 기재된 대뇌 피질 세포괴의 제조 방법 1에서의 공정 (i) 및 공정 (ii)에 더하여, 이하의 공정 (iii) 및 공정 (iv-1)로 처리하는 것을 포함하는 고순도 대뇌 피질 세포괴의 제조 방법이다. 이는 분산 재응집된 고순도 대뇌 피질 세포괴이다. 여기서, 공정 (ii)에서, 공정 (i)에서 얻어진 대뇌 오가노이드를 Notch 시그널 저해제, 바람직하게는 γ-세크레타제 저해제를 포함하는 배양액 중에서 배양한다. 당해 공정 (ii)는, 상기 4의 대뇌 피질 세포괴의 제조 방법 1에서의 공정 (ii)와 마찬가지로 행하면 된다.
(iii) 공정 (ii)에서 얻어진 대뇌 오가노이드를, 단세포 또는 2~5개의 세포 집합체로까지 분산하는 공정,
(iv-1) 공정 (iii)에서 얻어진 세포 집단을 1 이상의 신경 영양 인자, 아스코브산 및 cAMP 활성화제(예컨대, 디부티릴 cAMP(dbcAMP))를 포함하는 무혈청 배양액 중에서 배양하여, (예컨대, 20세포 이상의 세포를 포함하는) 세포괴를 얻는 공정.
<공정 (iii)>
공정 (ii)에서 얻어진 대뇌 오가노이드는, 당업자에게 주지의 방법, 예컨대 피펫팅등에 의해 물리적으로, 또는 효소 처리에 의해, 단세포 또는 2~5개의 세포 집합체로까지 분산시킬 수 있다. 여기서, 분산되어 얻어진 세포 집단은 단일 세포 및/또는 2~5개의 세포 집합체의 집단일 수 있다. 즉, 공정 (iii)에서, 당업자에게 주지의 방법에 의해, 공정 (ii)에서 얻어진 대뇌 오가노이드를 단세포, 또는 2~5개의 세포 집합체로까지 분산되어도 된다.
<공정 (iv-1)>
공정 (iii)에서 얻어지는 세포 집단을 부유 배양함으로써 재응집시켜, 고순도의 대뇌 피질 세포를 포함하는 세포괴(고순도 대뇌 피질 세포괴)를 얻을 수 있다.
공정 (iv-1)에서 사용하는 배양액은, 1 이상의 신경 영양 인자, 아스코브산 또는 그의 유도체, 및 cAMP 활성화제를 포함하는 배양액이다.
신경 영양 인자로서는 상기 정의에 기재된 것으로부터 적절히 1~4, 1~3, 바람직하게는 1 또는 2 인자를 선택하면 된다. 신경 영양 인자로서, 바람직하게는 BDNF 및/또는 GDNF를 들 수 있다. BDNF의 농도로서는 1~100ng/mL, 바람직하게는 10~30ng/mL를 들 수 있다. GDNF의 농도로서는 1~100ng/mL, 바람직하게는 5~20ng/mL를 들 수 있다.
아스코브산 또는 그의 유도체(예컨대 아스코브산-2-인산)의 농도로서는, 아스코브산의 경우, 10~500μM, 바람직하게는 50~300μM에 상당하는 농도를 들 수 있으며, 유도체에서도 마찬가지의 농도를 들 수 있다.
cAMP 활성화제의 농도로서는, 예컨대 dbcAMP를 이용한 경우에서의, 10~1000μM, 바람직하게는 100~600μM, 더욱 바람직하게는 300~500μM에 상당하는 cAMP 활성화가 가능한 농도를 들 수 있다.
공정 (iv-1)의 배양 기간은, 1~21일간, 바람직하게는 2~15일간, 2~10일간, 2~8일간, 2~6일간, 더욱 바람직하게는 약 4일간이다. 또는, 공정 (iv-1)의 배양 기간은 1~40일간, 바람직하게는 2~28일간, 더욱 바람직하게는 2~14일간이다.
공정 (iv-1)에서의 부유 배양은 상기 2의 공정 (2b)에 기재된 방법을 참조하여 행할 수 있다. 예컨대, 상기 2의 공정 (2b)와 동일한 배지에, 1 이상의 신경 영양 인자, 아스코브산 또는 그의 유도체, 및 cAMP 활성화제를 첨가한 배지를 조제하여 이용할 수 있다.
공정 (iv-1)에서 사용하는 배양액은, 경우에 따라 ROCK 저해제를 포함하고 있어도 된다. ROCK 저해제는 상술한 정의에 기재된 것을 적절히 사용할 수 있고, 바람직하게는 Y-27632 등을 들 수 있다.
여기에서 이용되는 ROCK 저해제의 농도는 예컨대 ROCK 저해제로서 Y-27632를 이용한 경우에서의 약 0.1~200μM, 바람직하게는 약 2~100μM, 더욱 바람직하게는 약 30~100μM에 상당하는 농도를 들 수 있다. 여기서 공정 (iii)을 거쳐 얻어지는 대뇌 피질 세포괴는, 분산-재응집의 공정을 거침으로써 고순도 대뇌 피질 세포 응집괴이다.
6. 대뇌 피질 세포괴의 제조 방법 2-2
본 발명의 일 양태로서, 상기 5에 기재된 대뇌 피질 세포괴의 제조 방법 2-1에서, 공정 (iii)을 포함하지 않는 양태를 들 수 있다. 즉, 상기 4에 기재된 대뇌 피질 세포괴의 제조 방법 1에서, 공정 (i) 및 공정 (ii)에 더하여, 이하의 공정 (iv-2)으로 처리하는 것을 포함하는 대뇌 피질 세포괴의 제조 방법을 들 수 있다. 여기서, 공정 (ii)에서, 공정 (i)에서 얻어진 대뇌 오가노이드를, Notch 시그널 저해제, 바람직하게는 γ-세크레타제 저해제를 포함하는 배양액 중에서 배양한다.
(iv-2) 공정 (ii)에서 얻어진 대뇌 오가노이드를 포함하는 세포 배양물을 1 이상의 신경 영양 인자, 아스코브산 또는 그의 유도체(예컨대, 아스코브산-2-인산) 및 cAMP 활성화제(예컨대, 디부티릴 cAMP(dbcAMP))를 포함하는 배양액 중에서 부유 배양하여 대뇌 피질 세포괴를 얻는 공정.
<공정 (iv-2)>
공정 (ii)에서 얻어지는 대뇌 오가노이드를 포함하는 세포 배양물을 부유 배양함으로써, 대뇌 피질 세포를 포함하는 세포괴(대뇌 피질 세포괴)를 얻을 수 있다.
공정 (iv-2)에서 사용하는 배양액은, 상기 5의 공정 (iv-1)에 기재된 배양액을 들 수 있으며, 부유 배양의 조건, 배양 기간에 대해서도, 상기 5의 공정 (iv-1)에 기재된 것을 들 수 있다.
7. 대뇌 피질 세포괴의 제조방법 3-1~3-7
본 발명의 일 양태로서, 공정 (ii)의 배양액이, Notch 시그널 저해제를 포함하는 '대뇌 피질 세포괴의 제조 방법 3-1'을 들 수 있다. 즉, 대뇌 피질 세포괴의 제조 방법 3-1로서는 이하의 공정 (Ｉ)을 포함하는, 대뇌 피질 세포괴의 제조 방법을 들 수 있다.
(I) 다능성 줄기세포 유래의 대뇌 오가노이드를 Notch 저해제, 바람직하게는 γ-세크레타제 저해제를 포함하는 배양액 중에서 배양하는 공정.
여기서, 공정 (I)은 대뇌 피질 세포괴의 제조 방법 1에서의 공정 (ii)와 마찬가지로 행하면 된다.
본 발명의 일 양태로서, 상기 공정 (I)에 더하여, 이하의 공정으로 처리하는 것을 포함하는 '대뇌 피질 세포괴의 제조 방법 3-2'를 들 수 있다.
(II) 공정 (I)에서 얻어진 대뇌 오가노이드를 포함하는 세포 배양물을, 단세포 또는 2~5개의 세포 집합체로까지 분산하는 공정, 및
(III) 공정 (II)에서 얻어진 세포 집단을, 1 이상의 신경 영양 인자, 아스코브산 또는 그의 유도체, 및 cAMP 활성화제를 포함하는 배양액 중에서 배양하여 대뇌 피질 세포괴를 얻는 공정.
여기서, 공정 (I)은 대뇌 피질 세포괴의 제조 방법 1에서의 공정 (ii)와 마찬가지로 행하면 되고, 공정 (II) 및 공정 (III)은 대뇌 피질 세포괴의 제조 방법 2에서의 공정 (iii) 및 공정 (iv-1)과 마찬가지로 행하면 된다. 또한, 공정 (III)을 거쳐 얻어지는 대뇌 피질 세포괴는 분산-재응집의 공정을 거치며, 고순도 대뇌 피질 세포 응집괴이다.
본 발명의 일 양태로서, 상기 공정 (II)를 포함하지 않는 양태를 들 수 있다. 즉, 공정 (I)에 더하여, 이하의 공정으로 처리하는 것을 포함하는 '대뇌 피질 세포괴의 제조 방법 3-3'을 들 수 있다.
(III-2) 공정 (i)에서 얻어진 대뇌 오가노이드를 포함하는 세포 배양물을, 1 이상의 신경 영양 인자, 아스코브산 또는 그의 유도체(예컨대, 아스코브산-2-인산) 및 cAMP 활성화제(예컨대, 디부티릴 cAMP(dbcAMP))를 포함하는 배양액 중에서 부유 배양하여 대뇌 피질 세포괴를 얻는 공정.
여기서, 공정 (I)은 대뇌 피질 세포괴의 제조 방법 1에서의 공정 (ii)와 마찬가지로 행하면 되고, 공정 (III-2)는 대뇌 피질 세포괴의 제조 방법 2에서의 공정 (iv-1)와 마찬가지로 행하면 된다.
본 발명의 일 양태로서, 이하의 공정 (I-2), 공정 (II) 및 공정 (III-3)을 포함하는 '대뇌 피질 세포괴의 제조 방법 3-4'를 들 수 있다.
(I-2) 다능성 줄기세포 유래의 대뇌 오가노이드를 배양액 중에서 배양하는 공정,
(II) 공정 (I-2)에서 얻어진 대뇌 오가노이드를 포함하는 세포 배양물을 단세포 또는 2~5개의 세포 집합체로까지 분산하는 공정, 및
(III-3) 공정 (II)에서 얻어진 세포 집단을, 1 이상의 신경 영양 인자, 아스코브산 또는 그의 유도체, 및 cAMP 활성화제를 포함하는 배양액 중에서 배양하여, 대뇌 피질 세포괴를 얻는 공정를 포함하며, 여기서 공정 (I-2)의 배양액은 Notch 시그널 저해제를 포함하지 않고, 상기 공정 (III-3)의 배양액은 Notch 시그널 저해제를 포함한다. 여기서, 공정 (I-2)는 상기 2에 기재된 대뇌 오가노이드의 제조 방법에서의 공정 (2b)와 마찬가지로 행하면 된다. 공정 (I-2)는 다능성 줄기세포 유래의 대뇌 오가노이드를 제조하는 공정의 일부에 상당하는 배양이어도 되고, 배양 기간에 특별히 한정은 없다. 공정 (II)는 상기 5에 기재된 대뇌 피질 세포괴의 제조 방법 2-1에서의 공정 (iii)과 마찬가지로 행하면 된다.
공정 (III-3)의 배양액은 당해 공정의 일부 또는 전부의 기간에서 Notch 시그널 저해제를 포함하는 양태이어도 된다. Notch 시그널 저해제의 처리 기간이 일부의 기간인 경우는, 상기 공정 (III-3)의 배양액의 교환 시에 Notch 시그널 저해제를 포함하지 않는 배양액을 이용한다. 일부의 기간은 Notch 시그널 저해제에 의한 처리의 효과가 얻어지는 한, 특별히 한정되지 않고, 상기 공정 (III-3)의 배양 기간 중의 수시간~수일, 구체적으로는 1~7일간, 바람직하게는 2~6일간, 보다 바람직하게는 2~4일간이어도 된다. 또한, 극히 짧은 처리 기간(예컨대, 4시간, 12시간, 24시간, 2일간)의 반복이어도 된다. 또한, Notch 시그널 저해제를 포함하는 기간과, Notch 시그널 저해제를 포함하지 않는 기간을 번갈아 행하거나, 농도를 바꾼 Notch 시그널 저해제를 이용한 조합도 본원의 범주이다. 하기 공정 (III-4) 및 공정 (III-5)의 배양액도 공정 (III-3)의 배양액과 마찬가지로 당해 공정의 일부 또는 모든 기간에서 Notch 시그널 저해제를 포함하는 양태이어도 된다.
<공정 (III-3)>
공정 (II)에서 얻어지는 세포 집단을 부유 배양함으로써 재응집시켜, 고순도의 대뇌 피질 세포를 포함하는 세포괴(고순도 대뇌 피질 세포괴)를 얻을 수 있다.
공정 (III-3)에서 사용하는 배양액으로서는, 상기 5에 기재된 대뇌 피질 세포괴의 제조 방법 2의 공정 (iv-1)에 기재된 배양액을 들 수 있으며, 부유 배양의 조건, 배양 기간에 대해서도, 상기 5의 공정 (iv-1)에 기재된 것을 들 수 있다.
공정 (III-3)에서, 당해 부유 배양의 기간 중의 일부 또는 전부의 기간에서, 배양액은 Notch 시그널 저해제, 바람직하게는 γ-세크레타제 저해제를 포함한다.
여기서 이용되는 Notch 시그널 저해제로서는, 정의에 기재된 것을 적절히 선택하여 사용할 수 있지만, Notch 시그널 저해제로서, 바람직하게는 γ-세크레타제 저해제를 들 수 있다. γ-세크레타제 저해제로서는 정의에 기재된 것을 적절히 선택하여 사용할 수 있지만, 바람직한 γ-세크레타제 저해제로서는 N-[N-(3,5-디플루오로펜아세틸)-L-알라닐]-S-페닐글리신 t-부틸 에스테르(DAPT) 또는 화합물 E를 들 수 있다.
배양액 중의 Notch 시그널 저해제, 바람직하게는 γ-세크레타제 저해제의 농도는, 생성하는 세포괴에 포함될 수 있는 증식성의 세포를 억제 가능한 범위로 적절히 설정할 수 있다. 구체적으로는, γ-세크레타제 저해제로서 DAPT를 이용하는 경우에서의, 0.1~1000μM, 1~100μM, 바람직하게는 1~30μM, 더욱 바람직하게는 5~20μM에 상당하는 γ-세크레타제 활성 또는 당해 γ-세크레타제 활성에 기초한 Notch 시그널 저해 활성을 나타내는 농도를 들 수 있다.
공정 (III-3)에서, Notch 시그널 저해제, 바람직하게는 γ-세크레타제 저해제의 존재 하에서의 배양을 개시하는 시기에 특별히 한정은 없지만 예컨대, 분화 개시로부터 28∼42일째를 들 수 있다. 또한, 당해 배양의 기간은, 바람직하게는 약 1일간~약 20일간, 더욱 바람직하게는 2일간~8일간이다. 또한, 공정 (III-3)을 거쳐 얻어지는 대뇌 피질 세포괴는 분산-재응집의 공정을 거치며, 고순도 대뇌 피질 세포 응집괴이다.
본 발명의 일 양태로서, 상기 공정 (I), 상기 공정 (II) 및 공정 (III-4)를 포함하고, 상기 공정 (I)의 배양액 및 상기 공정 (III-4)의 배양액 모두 Notch 시그널 저해제를 포함하는 양태(대뇌 피질 세포괴의 제조 방법 3-5)를 들 수 있다. 여기서, 공정 (I)은 상기 4에 기재된 대뇌 피질 세포괴의 제조 방법 1에서의 공정 (ii)와 마찬가지로 행하면 되고, 공정 (II)는 상기 5에 기재된 대뇌 피질 세포괴의 제조 방법 2의 공정 (iii)과 마찬가지로 행하면 되며, 공정 (III-4)는 상기 대뇌 피질 세포괴의 제조 방법 3-4의 공정 (III-3)과 마찬가지로 행하면 된다. 또한, 공정 (III-4)를 거쳐 얻어지는 대뇌 피질 세포괴는, 분산-재응집의 공정을 거치며, 고순도 대뇌 피질 세포 응집괴이다.
본 발명의 일 양태로서, 상기 공정 (I) 및 공정 (III-5)를 포함하고, 상기 공정 (III)의 배양액은 Notch 시그널 저해제를 포함하는 양태(대뇌 피질 세포괴의 제조 방법 3-6)을 들 수 있다. 여기서, 공정 (I)은 상기 4에 기재된 대뇌 피질 세포괴의 제조 방법 1에서의 공정 (ii)와 마찬가지로 행하면 되고, 공정 (III-5)는 상기 대뇌 피질 세포괴의 제조 방법 3-4에서의 공정 (III-3)과 마찬가지로 행하면 된다.
여기서, 공정 (I) 및/또는 공정 (III-5)에서, Notch 시그널 저해제를 포함하는 배양액에서 배양하는 것이란, 공정 (I) 및/또는 공정 (III-5)의 일부의 배양 기간 또는 전 배양 기간에서 사용되는 배양액은, Notch 시그널 저해제를 포함하는 것을 의미한다.
여기서, Notch 시그널 저해제의 처리 기간이 일부의 기간인 경우는, 상기 공정 (I)의 배양액 또는 상기 공정 (III-5)의 배양액의 교환 시에 Notch 시그널 저해제를 포함하지 않는 배양액을 이용한다. 이 일부의 기간은, Notch 시그널 저해제에 의한 처리의 효과가 얻어지는 한, 특별히 한정되지 않고, 상기 공정 (I) 또는 상기 공정 (III-5)의 배양 기간 중의 수시간~수일, 구체적으로는 1∼7일간, 바람직하게는 2∼6일간, 보다 바람직하게는 2∼4일간이어도 된다. 또한, 짧은 처리 기간(예컨대, 4시간, 12시간, 24시간, 2일간)의 반복이어도 된다. 또한, Notch 시그널 저해제를 포함하는 기간과, Notch 시그널 저해제를 포함하지 않는 기간을 번갈아 행하거나 농도를 바꾼 Notch 시그널 저해제를 이용한 조합도 본원의 범주이다.
본 발명의 일 양태로서, 대뇌 피질 세포괴의 제조 방법 3-6의 상기 공정 (I)을 상기 공정 (I-2)로 변경한 양태(대뇌 피질 세포괴의 제조 방법 3-7)를 들 수 있다. 상기 공정 (I)을 상기 공정 (I-2)로 변경한 것 이외에는, 상기 대뇌 피질 세포괴의 제조 방법 3-6에 준하여 행한다. 공정 (III-5)의 배양액은, 1 이상의 신경 영양 인자, 아스코브산 또는 그의 유도체 및 cAMP 활성화제를 포함하는 배양액에, Notch 시그널 저해제를 더 포함한다.
대뇌 피질 세포괴의 제조 방법 3-1~3-7에서, 공정 (I) 또는 (I-2)에서 이용하는 대뇌 오가노이드의 제조 방법에는 특별히 한정은 없으며, 당업자에게 주지의 방법으로 조제할 수 있다. 예컨대, 상기 2에 기재된 대뇌 오가노이드의 제조 방법에 따라 제조할 수 있다. 또는, 상기 2에 기재된 대뇌 오가노이드의 제조 방법의 공정 (1)을 실시하지 않고, 공정 (2)의 '공정 (1)에서 얻어지는 세포' 대신에 다능성 줄기세포를 이용하여 공정 (2)를 실시하면 된다.
또한, 대뇌 피질 세포괴의 제조 방법 3-1~3-7에서, (III)~(III-5)의 공정에 의한 처리에 대신하여 상기 2의 공정 (2b)에 기재된 방법 또는 신경세포를 생존시키는 배지에서 배양하여도 된다. 이 경우, Notch 시그널 저해제를 첨가하는 경우, 첨가하지 않는 경우도 선택할 수 있다.
본 명세서에서는 대표적인 대뇌 피질 세포괴의 제조 방법의 실시양태를 나타내었지만, 이용하는 대뇌 오가노이드의 성질(유전형, 조직 형상, 함유하는 세포종 비율, 성숙도 등)이나 공정을 행하는 장치, 기구, 장소에 따라 대뇌 피질 세포괴의 형성 효율이 변화하는 것이 상정된다. 따라서, 약제(예컨대 Notch 시그널 저해제)에 의한 처리의 농도, 개시 시기, 기간, 처리 전후의 약제 비함유 배지에서의 배양 기간은, 소망하는 대뇌 피질 세포괴가 얻어지는 한, 적절히 조정할 수 있다.
본 발명의 일 양태로서, 상기 4의 대뇌 피질 세포괴의 제조 방법 1, 상기 5의 대뇌 피질 세포괴의 제조 방법 2, 상기 6의 대뇌 피질 세포괴의 제조 방법 2-2 및 상기 7의 대뇌 피질 세포괴의 제조 방법 3-1~3-7에 의해 얻어진 대뇌 피질 세포괴를 회수하고, 당해 세포괴 및 매체를 포함하는 대뇌 피질 세포 제제를 조제하는 공정을 포함하는, 배양보조세포의 비존재 하에 다능성 줄기세포로부터 대뇌 피질 세포 제제를 제조하는 방법을 들 수 있다.
특별히 제한되지 않지만, 대뇌 피질 세포 제제를 조제하는 매체로서는, 비동결인 경우, 예컨대 생리식염수, 인산 완충액(PBS(-)), Hank 평형 염류 용액(HBSS), Earl 평형 염류 용액, 아트셀레브 등의 용액을 들 수 있다.
또한, 특별히 제한되지 않지만, 대뇌 피질 세포 제제를 조제하는 매체로서는, 동결인 경우, 매체로서는, 동결 보호제, 예컨대 DMSO, 글리세롤, 폴리에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 글리세린, 폴리비닐피롤리돈, 소르비톨, 덱스트란, 트레할로스 등을 포함하는 용액이나, 시판되는 동결 보존액, 예컨대 Cell banker, Stem cell banker, 뱅뱅커 등을 들 수 있다.
8. 대뇌 피질 세포괴
본 발명의 일 양태로서, 이하의 성질을 갖는 대뇌 피질 세포괴를 들 수 있다. 당해 대뇌 피질 세포괴는 상기 4에 기재된 대뇌 피질 세포괴의 제조 방법 1에 의해 제조할 수 있다.
즉, 본 발명의 일 양태로서, 하기 (a)~(c)의 특징을 갖는, 대뇌 피질 세포괴를 들 수 있다.
(a) 증식성 마커 양성 세포 수가 전 세포 수의 10% 이하인 것,
(b) 신경세포 마커, 피질 V/VI층 마커 및 전뇌 마커로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1개 이상의 마커가 양성인 세포 수가 전 세포 수의 60% 이상, 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상인 것,
(c) 신경 상피 또는 대뇌 피질 유사 구조를 실질적으로 포함하지 않는 것.
상기 증식성 마커로서는 Ki67을 들 수 있다. 상기 신경세포 마커로서는 βIII-튜불린(βTubIII)을 들 수 있다. 상기 피질 V/VI층 마커로서는 Ctip2를 들 수 있다. 상기 전뇌 마커로서는 Foxg1을 들 수 있다.
일 양태로서, 하기의 특징을 갖는 대뇌 피질 세포괴를 들 수 있다:
(a') Ki67 양성 세포 수가 전 세포 수의 5% 이하인 것,
(b') βIII-튜불린(βTubIII), Ctip2 및 Foxg1이 어느 것도 양성인 세포 수가 전 세포 수의 60% 이상, 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상인 것,
(c) 신경 상피 또는 대뇌 피질 유사 구조를 실질적으로 포함하지 않는 것.
대뇌 오가노이드에서의 신경 상피 및 대뇌 피질 유사 구조는 도립 현미경 관찰에서 육안으로 확인 가능하다.
일 양태로서, 신경 상피 또는 대뇌 피질 유사 구조를 실질적으로 포함하지 않는 것은, 상술한 신경 상피나 대뇌 피질 유사 구조가, 도립 현미경 관찰 등에서 육안으로 동정할 수 없는 것을 들 수 있다.
일 양태로서, 상기 대뇌 피질 세포괴는, 또한
(d) NEUROD6, NEUROD2, SSTR2, TBR1, ZBTB18, NHLH1, IGFBPL1, NRN1, RTN1, THSD7A, NRXN1, BHLHE22, CALB2, KHDRBS3, CCSAP, PDE1A, NEUROD1, NPTX1, NXPH4, NTS, NEUROG2, OLFM1, PRDM8, CORO2B, TP53I11, ZFPM2, PCDH9, NELL2, SRRM4, SCG3, DCC, EPB41L3, SLC17A7, ST18, NSG2, EMX1, CAP2, SYT4, NSMF, ANK3, MYT1L, FSTL5, CELF4, B3GAT1, EPHA5, NHLH2 및 DLL3으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1개의 유전자를 추가로 발현하고 있다. 상기 대뇌 피질 세포괴는, 바람직하게는 SLC17A7, NEUROD6 및 EMX1로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 이상의 유전자를 발현하고 있으며, 보다 바람직하게는 GAD2, COL1A1, TYR, TTR 및 HOXA2로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 이상의 유전자를 실질적으로 발현하고 있지 않다.
일 양태로서, 상기 대뇌 피질 세포괴는, 또한
(e) 신경 줄기세포 마커 양성 세포가 전 세포 수의 10% 이하이며,
상기 신경 줄기세포 마커로서는 Pax6, Sox1 또는 Sox2를 들 수 있다.
일 양태로서, 상기 대뇌 피질 세포괴는, 또한
(f) 다능성 마커 음성이다.
다능성 마커 음성이란, 다능성 줄기세포가 실질적으로 검출되지 않는 것, 구체적으로 다능성 마커 양성 세포가 전 세포 수의 1% 이하인 것을 들 수 있다. 상기 다능성 마커로서는 Oct4 등을 들 수 있다.
일 양태로서, 상기 대뇌 피질 세포괴는, 추가로 경우에 따라, (g) 피질 II 내지 IV층 마커(SATB2) 양성 세포가 존재하고 있어도 된다.
본 발명의 일 양태로서, 상기 대뇌 피질 세포괴를 전 세포괴의 10% 이상, 바람직하게는 20% 이상, 보다 바람직하게는 40% 이상, 더욱 바람직하게는 50% 이상 포함하는 세포 집단을 들 수 있다.
본 발명의 일 양태로서, 대뇌 피질 세포괴는 직경(원 상당 직경)이 약 100㎛~1000㎛, 바람직하게는 약 300㎛~600㎛의 구상 유사의 세포괴여도 된다. 세포괴 1개당의 세포 수는 약 1×103~5×104개, 바람직하게는 약 5×103~2×104개이어도 된다. 또는, 본 발명의 일 양태로서, 대뇌 피질 세포괴는 직경(원 상당 직경)이 약 100㎛~5000㎛, 바람직하게는 약 300㎛~2000㎛의 구상의 세포괴여도 된다. 세포괴 1개당의 세포 수는 약 5×103~5×106개, 바람직하게는 약 1×104~3×106개이어도 된다.
본 발명의 일 양태로서, 대뇌 피질 세포괴의 세포 집단에서 직경(원 상당 직경)의 평균값은 약 300㎛~2000㎛이다.
본 발명의 일 양태로서, 상기 대뇌 피질 세포괴 및 그의 세포 집단은 생체 내에서 뇌로 이식한 경우에 이식 부위에 생착하고 또한 이식편 유래의 세포의 증식이 억제되어 있는 것을 특징으로 한다. 예컨대, 마우스 뇌에 이식된 경우, 분화 유도 5주째의 대뇌 피질 세포괴의 이식 3개월 후의 이식편의 체적은, 동시기의 대뇌 오가노이드의 이식편에 비하여 2%~50%로 억제되었다.
상기 대뇌 피질 세포괴 및 그의 세포 집단은 후술하는 바와 같이 뇌 혈관 장애를 앓는 환자 또는 두부 외상을 입은 환자로의 세포 이식 치료에 유용하다.
9. 고순도 대뇌 피질 세포괴
본 발명의 일 양태로서, 이하의 성질을 갖는 고순도 대뇌 피질 세포괴를 들 수 있다. 이하의 성질을 갖고, 증식성 마커 양성 세포가 억제되어, 목적으로 하는 신경세포의 함유율이 향상된 고순도 대뇌 피질 세포괴는, 상기 5에 기재된 대뇌 피질 세포괴의 제조 방법 2-1, 상기 6에 기재된 대뇌 피질 세포괴의 제조 방법 2-2, 또는 상기 7에 기재된 대뇌 피질 세포괴의 제조 방법 3-1 내지 3-6에 의해 제조할 수 있다.
즉, 본 발명의 일 양태로서, 하기의 특징을 갖는, 고순도 대뇌 피질 세포괴를 들 수 있다.
(A) 증식성 마커 양성 세포 수가 전 세포 수의 5% 이하, 바람직하게는 3% 이하, 더욱 바람직하게는 1% 이하인 것,
(B) 신경세포 마커, 피질 V/VI층 마커 및 전뇌 마커로부터 선택되는 1개 이상의 마커 양성 세포 수가 전 세포 수의 60% 이상, 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상인 것,
(C) 신경 상피 또는 대뇌 피질 유사 구조를 실질적으로 포함하지 않는 것.
상기 증식성 마커로서는 Ki67을 들 수 있다. 상기 신경세포 마커로서는 βIII-튜불린(βTubIII)을 들 수 있다. 피질 V/VI층 마커로서는 Ctip2를 들 수 있다. 상기 전뇌 마커로서는 Foxg1을 들 수 있다.
일 양태로서, 하기의 특징을 갖는, 고순도 대뇌 피질 세포괴를 들 수 있다:
(A) Ki67 양성 세포 수가 전 세포 수의 5% 이하인 것,
(B) βIII-튜불린(βTubIII), Ctip2 및 Foxg1이 모두 양성인 세포 수가 전 세포 수의 60% 이상, 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상인 것,
(C) 신경 상피 또는 대뇌 피질 유사 구조를 실질적으로 포함하지 않는 것.
일 양태로서, 신경 상피 또는 대뇌 피질 유사 구조를 실질적으로 포함하지 않는다는 것은, 상술한 신경 상피나 대뇌 피질 유사 구조가, 도립 현미경 관찰 등에서 육안으로 동정할 수 없는 것을 들 수 있다.
본 발명에서, 고순도 대뇌 피질 세포괴를 얻는 방법, 즉, 대뇌 피질 세포괴에서의 대뇌 피질 세포의 함유율을 높이고, 증식성 세포 등의 목적 외 세포의 함유율을 낮추기 위하여 유효한 공정으로서는, 상술한 공정 (iv) 또는 공정 (III)에 기재된 공정(Notch 시그널 저해제가 존재하고 있어도 되지만 필수는 아니다)을 들 수 있고, 더욱 바람직하게는, 이것에 더하여 상술한 공정 (iii) 또는 공정 (II)에 기재된 대뇌 피질 세포괴를 분산시켜 재응집시키는 공정을 포함하는 공정을 들 수 있다.
일 양태로서, 상기 고순도 대뇌 피질 세포괴는, 또한
(D) NEUROD6, NEUROD2, SSTR2, TBR1, ZBTB18, NHLH1, IGFBPL1, NRN1, RTN1, THSD7A, NRXN1, BHLHE22, CALB2, KHDRBS3, CCSAP, PDE1A, NEUROD1, NPTX1, NXPH4, NTS, NEUROG2, OLFM1, PRDM8, CORO2B, TP53I11, ZFPM2, PCDH9, NELL2, SRRM4, SCG3, DCC, EPB41L3, SLC17A7, ST18, NSG2, EMX1, CAP2, SYT4, NSMF, ANK3, MYT1L, FSTL5, CELF4, B3GAT1, EPHA5, NHLH2 및 DLL3으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개 또는 적어도 5개의 유전자를 추가로 발현하고 있다. 상기 대뇌 피질 세포괴는, 바람직하게는 SLC17A7, NEUROD6 및 EMX1로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 이상의 유전자, 또는 모든 유전자를 발현하고 있으며, 보다 바람직하게는 GAD2, COL1A1, TYR, TTR 및 HOXA2로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 유전자를 실질적으로 발현하고 있지 않다.
일 양태로서, 상기 고순도 대뇌 피질 세포괴는, 또한
(E) 신경 줄기세포 마커 양성 세포가 전 세포 수의 10% 이하, 바람직하게는 5% 이하, 더욱 바람직하게는 3% 이하이고,
상기 신경 줄기세포 마커로서는 Pax6, Sox1 또는 Sox2를 들 수 있다.
일 양태로서, 상기 고순도 대뇌 피질 세포괴는, 또한
(F) 다능성 마커 음성이다.
다능성 마커 음성이란, 다능성 줄기세포가 실질적으로 검출되지 않는 것, 구체적으로 다능성 마커 양성 세포가 전 세포 수의 1% 이하인 것을 들 수 있다.
상기 다능성 마커로서는, Oct4 등을 들 수 있다.
일 양태로서, 상기 대뇌 피질 세포괴는, 추가로, 경우에 따라, (G) 피질 II 내지 IV층 마커(SATB2) 양성 세포가 존재하고 있어도 된다.
본 발명의 일 양태로서, 상기 대뇌 피질 세포괴를, 전 세포괴의 10% 이상, 바람직하게는 20% 이상, 보다 바람직하게는 40% 이상, 더욱 바람직하게는 50% 이상 포함하는 세포 집단을 들 수 있다.
본 발명의 일 양태로서, 고순도 대뇌 피질 세포괴는 직경(원 상당 직경)이 약 100㎛~10000㎛, 바람직하게는 약 200㎛~3000㎛의 구상 유사의 세포괴이어도 된다. 세포괴 1개당의 세포 수는 약 1×103~5×106개, 바람직하게는 약 5×103~3×106개이어도 된다.
본 발명의 일 양태로서, 고순도 대뇌 피질 세포괴의 세포 집단에서, 직경(원 상당 직경)의 평균값은, 약 300㎛~500㎛이다.
본 발명의 일 양태로서, 상기 고순도 대뇌 피질 세포괴 및 그로부터 얻어지는 세포 집단은, 생체 내에서(in vivo) 뇌에 이식한 경우에, 이식 부위에 생착하고 또한 이식편 유래의 세포의 증식이 억제되는 것을 특징으로 한다. 예컨대, 마우스의 뇌에 이식된 경우, 이식 후 5주에서의 이식편의 체적은 이식 직후에 비하여 2%~50%일 수 있다.
상기 고순도 대뇌 피질 세포괴 및 그로부터 얻어지는 세포 집단은 후술하는 바와 같이 뇌 혈관 장애를 앓는 환자로의 세포 이식 치료에 유용하다.
본 발명의 일 양태로서, 상기의 성질에 더하여, 추가로 고순도 대뇌 피질 세포괴의 사이즈, 구성 세포 조성, 또는 형상이 균일한 고순도 대뇌 피질 세포괴의 세포 집단을 들 수 있다. 당해 세포 집단은 상기 5~7에 기재된 대뇌 피질 세포괴의 제조 방법 2-1, 2-2 및 3-1~3-6에 의해 제조할 수 있다. 즉, 당해 제조 방법에 따라, 대뇌 오가노이드를 분산시키고, 재응집에 의해 크기, 구성 세포 조성 또는 형상이 균일한 고순도 대뇌 피질 세포괴의 세포 집단을 제조할 수 있다.
여기서 균일성은, 예컨대, 고순도 대뇌 피질 세포괴의 각종 세포의 마커 발현량, 크기, 1개의 세포괴에 포함되는 세포 수 등의 수치의 불균일이 ±20% 이하, 바람직하게는 ±10% 이하, 더욱 바람직하게는 ±5% 이하인 것을 지표로서 동정할 수 있다.
상기 고순도 대뇌 피질 세포괴 및 그의 세포 집단은 후술하는 바와 같이 뇌 혈관 장애를 앓는 환자 또는 두부 외상을 입은 환자로의 세포 이식 치료에 유용하다.
10. 의약 조성물
본 발명의 일 양태로서, 상기 2에 기재된 대뇌 오가노이드의 제조 방법에 의해 얻어지는 대뇌 오가노이드, 또는 상기 3에 기재된 대뇌 오가노이드, 이들 대뇌 오가노이드로부터 얻어지는 대뇌 피질 세포를 포함하는 세포 집단, 상기 4~7에 기재된 대뇌 피질 세포괴의 제조 방법으로 얻어지는 대뇌 피질 세포괴, 상기 8 또는 9에 기재된 대뇌 피질 세포괴, 또는 이들 세포괴로부터 얻어지는 대뇌 피질 세포를 포함하는 세포 집단을 유효 성분으로 하는 의약 조성물을 들 수 있다. 즉, 상기 2에 기재된 대뇌 오가노이드의 제조 방법에 의해 얻어지는 대뇌 오가노이드, 또는 상기 3에 기재된 대뇌 오가노이드, 이들 대뇌 오가노이드로부터 얻어지는 대뇌 피질 세포를 포함하는 세포 집단, 상기 4~7에 기재된 대뇌 피질 세포괴의 제조 방법으로 얻어지는 대뇌 피질 세포괴, 상기 8 또는 9에 기재된 대뇌 피질 세포괴, 또는 이들 세포괴로부터 얻어지는 대뇌 피질 세포를 포함하는 세포 집단은, 이식용 세포괴(이식편이라고도 함) 또는 이식용 세포·이식용 조직으로서, 세포 이식 치료를 위한 유효 성분으로서 이용할 수 있다.
당해 유효성분의 유효량은 투여 목적, 투여 방법 및 투여 대상의 상황(성별, 연령, 체중, 병상 등)에 따라 상이하지만, 예컨대 세포 수로서 1×104개~1×1010개, 1×105개~1×109개, 1×106개~1×107개, 3×106~3×107개, 또는 1×106개~1×109개로 할 수 있다.
본 명세서에서의 의약 조성물, 또는 이식용 세포괴·이식용 세포·이식용 조직(이하 의약 조성물 등)은, 상기 유효 성분의 유효량 외에, 약학적으로 허용되는 담체를 포함하여도 된다. 약학적으로 허용되는 담체로서는 생리적인 수성 용매(생리식염수, 완충액, 무혈청 배양액 등)를 이용할 수 있다. 의약 조성물 등은 필요에 따라 이식 의료에서 이식용 세포괴 또는 이식용 세포를 포함하는 의약에 통상적으로 사용되는 보존제, 안정제, 환원제, 등장화제 등을 포함하여도 된다.
이식용 세포괴, 이식용 세포 또는 이식용 조직을, 적절한 생리적인 수성 용매로 현탁시킴으로써 세포 현탁액으로서 제조할 수 있다. 필요하다면, 동결 보존제를 첨가하여 상기 이식용 세포 집단을 동결 보존하고, 사용 시에 해동하여, 완충액으로 세정하거나 저온 조건 하에서 보존하고, 사용 시에 완충액으로 세정하여 이식 의료에 이용하여도 된다.
구체적으로는, 상기 2의 대뇌 오가노이드의 제조 방법 또는 상기 4~7의 대뇌 피질 세포괴의 제조 방법을 실시한 후에, 모든 대뇌 오가노이드 또는 세포괴를 회수하여, 필요에 따라, 이용되고 있던 배지, 그 밖의 배지 또는 인산 완충액 등으로 회수한 세포괴를 세정한 후, 의약 조성물에서 이용되는 매체에 현탁시킬 수 있다.
본 발명의 의약 조성물 등은 세포괴를 분산·현탁시킨 현탁액이어도 되고, 당해 세포괴를, 세포괴로부터 세포를 분산시키거나 한 현탁액, 시트제이어도 된다.
또한, 본 발명의 제조 방법으로 얻어진 의약 조성물 등은, 상기 2의 대뇌 오가노이드의 제조 방법, 또는 상기 4~7의 대뇌 피질 세포괴의 제조 방법을 실시한 후에, 플레이트 위에서 배양함으로써 시트상으로 성형하여 2차원 조직의 세포 조직 구조체로 하거나, 스캐폴드 위에서 배양을 행함으로써, 입체상으로 성형하여 3차원 조직인 세포 조직 구조체로 하거나 할 수도 있다.
하기에 기재하는 바와 같이, 본 발명의 대뇌 피질 세포를 포함하는 세포괴 또는 세포 집단을 포함하는 의약 조성물 등은, 뇌 혈관 장애 모델 동물(예컨대 마우스)의 대뇌 피질로의 투여에서, 손상 부위에서의 손상 신경계의 수복 및 운동 기능의 회복(예컨대 운동 마비 등의 증상의 개선)이라는 현저한 효과를 초래하는 것이다. 따라서, 본 발명의 의약 조성물 등은 뇌혈관 장애 또는 두부 외상의 치료제로서 유용하다. 또한, 본 발명의 의약 조성물 등은, 뇌혈관 장애를 앓는 환자의 운동 기능의 개선약으로서 유용하다.
또한, 본 명세서에 기재하는 의약 조성물 등에 포함되는 대뇌 피질 세포를 포함하는 세포괴 또는 세포 집단은, 주화된 다능성 줄기세포로부터 제조되고 마커 등에 의해 특정되어 품질 관리된다. 따라서, 안정된 품질의 이식용 세포 집단을 대량으로 제조하여 이식에 이용할 수 있다. 또한, 이식용 세포 집단을 보존할 수 있기 때문에 환자의 이식의 시기에 맞추어 이식용 세포 집단을 준비할 수 있다.
11. 치료 방법
본 발명의 일 양태로서, 본 발명의 상기 2에 기재된 대뇌 오가노이드의 제조 방법으로 얻어지는 대뇌 오가노이드, 또는 상기 3에 기재된 대뇌 오가노이드, 이들 대뇌 오가노이드로부터 얻어지는 대뇌 피질 세포를 포함하는 세포 집단, 상기 4~7에 기재된 대뇌 피질 세포괴의 제조 방법으로 얻어지는 대뇌 피질 세포괴, 상기 8 또는 9에 기재된 대뇌 피질 세포괴, 이들 세포괴로부터 얻어지는 대뇌 피질 세포를 포함하는 세포 집단, 또는 상기 10에 기재된 의약 조성물의 유효량을, 이식을 필요로 하는 대상에 이식(투여)하는 것을 포함하는 대뇌 피질 세포의 보충 또는 기능 개선이 필요한 질환, 구체적으로는 뇌혈관 장애의 치료 방법을 들 수 있다. 여기서, 투여(이식) 부위는 대뇌 피질 또는 대뇌 기저핵이어도 된다. 대상은 포유동물이어도 되고, 바람직하게는 설치류(예, 마우스, 래트) 또는 영장류(예, 인간, 원숭이)이며, 보다 바람직하게는 인간이다. 또한, 뇌혈관 장애는 두부 외상이어도 된다. 또한, 당해 치료 방법은 뇌혈관 장애의 환자에서의 운동 기능(예컨대 운동 마비 등의 증상의 개선)의 개선 방법, 뇌혈관 장애의 환자에서의 대뇌 피질 세포의 보충 방법 등을 포함하는 개념이다.
이식 의료에서는 조직 적합성 항원의 차이에 의한 거절 반응이 종종 문제가 되지만, 이식의 수혜자의 체세포로부터 수립한 자가의 다능성 줄기세포(예, 인공 다능성 줄기세포)를 이용함으로써 당해 문제를 극복할 수 있다. 즉, 본 발명의 바람직한 일 양태에서, 다능성 줄기세포로서, 수혜자의 체세포로부터 수립한 다능성 줄기세포(예컨대, 인공 다능성 줄기세포)를 이용함으로써, 당해 수혜자에 대하여 면역학적 자기의 세포괴(세포 집단)를 제조하고, 당해 세포괴(세포 집단) 또는 당해 세포괴(세포 집단)로부터 얻어지는 세포를 포함하는 이식용 세포 집단이 당해 수혜자에 이식된다.
또한, 수혜자와 면역이 적합한(예컨대, HLA형 또는 MHC형이 적합하다) 타자의 체세포로부터 수립한 다능성 줄기세포(예: 인공 다능성 줄기세포)로부터, 알로(타가(他家))의 세포괴(세포 집단)를 제조하고, 당해 세포괴(세포 집단) 또는 당해 세포괴(세포 집단)로부터 얻어지는 세포를 포함하는 이식용 세포 집단을 당해 수혜자에게 이식하여도 된다.
또한, 조직 적합성 항원(예컨대, HLA Class I, HLA Class II를 구성하는 항원 단백질) 또는 당해 항원의 발현에 필요한 인자의 발현이 억제된 iPS 세포를 이용하여 본 발명의 세포괴(세포 집단)를 제조함으로써, 타가의 세포 이식이더라도 거절 반응을 회피할 수 있다.
본 발명의 치료 방법에서 환자 또는 수혜자에게 투여 또는 이식되는 치료약으로서, 전술한 의약 조성물을 사용할 수 있다.
본 발명의 일 양태로서, 뇌혈관 장애의 치료에서의 사용을 위한, 본 발명의 대뇌 피질 세포를 포함하는 세포괴 또는 세포 집단의 사용을 들 수 있다.
12. 독성·약효 평가 방법
본 발명의 일 양태로서, 상기 2에 기재된 대뇌 오가노이드의 제조 방법으로 얻어지는 대뇌 오가노이드, 또는 상기 3에 기재된 대뇌 오가노이드, 또는 이들 대뇌 오가노이드로부터 얻어지는 대뇌 피질 세포를 포함하는 세포 집단, 상기 4~7에 기재된 대뇌 피질 세포괴의 제조 방법으로 얻어지는 대뇌 피질 세포괴, 상기 8 또는 9에 기재된 대뇌 피질 세포괴, 또는, 이들 세포괴를 분산시켜 얻어지는 세포 집단에 피험 물질을 접촉시켜, 피검 물질이 해당 세포괴 또는 해당 세포 집단에 미치는 영향을 검출 또는 정량하는 것을 포함하는, 피험 물질의 독성 또는 약효를 평가하기 위한 방법을 들 수 있다.
상기 2에 기재된 대뇌 오가노이드의 제조 방법으로 얻어지는 대뇌 오가노이드, 또는 상기 3에 기재된 대뇌 오가노이드, 또는 이들 대뇌 오가노이드로부터 얻어지는 대뇌 피질 세포를 포함하는 세포 집단, 상기 4~7에 기재된 대뇌 피질 세포괴의 제조 방법으로 얻어지는 대뇌 피질 세포괴, 상기 8 또는 9에 기재된 대뇌 피질 세포괴, 또는 이들 세포괴를 분산시켜 얻어지는 세포 집단은, 질환의 모델 세포로서, 뇌혈관 장애를 수반하는 질환의 치료약, 또는 그의 예방약의 스크리닝, 약효 평가에 이용할 수 있다.
또한, 상기 2에 기재된 대뇌 오가노이드의 제조 방법으로 얻어지는 대뇌 오가노이드, 또는 상기 3에 기재된 대뇌 오가노이드, 또는 이들 대뇌 오가노이드로부터 얻어지는 대뇌 피질 세포를 포함하는 세포 집단, 상기 4~7에 기재된 대뇌 피질 세포괴의 제조 방법으로 얻어지는 대뇌 피질 세포괴, 상기 8 또는 9에 기재된 대뇌 피질 세포괴, 또는 이들 세포괴를 분산시켜 얻어지는 세포 집단은 건강한 모델 세포로서 화학 물질 등의 안전성 시험, 스트레스 시험, 독성 시험, 부작용 시험, 감염 또는 혼입 시험에 이용할 수 있다. 또한, 본 발명의 세포괴 또는 세포 집단은 피질 V/VI층 조직의 세포를 포함하기 때문에, 이들 세포를 포함하는 신경 조직(예컨대, 대뇌 피질)의 기능 시험, 구체적으로는 글루탐산 작동성 신경 등의 기능 평가나, 대뇌 피질 세포의 증식능이나 분화능 평가에 이용하는 것도 가능하다.
그의 평가 방법으로서는, 아포토시스 평가 등의 자극·독성 시험 외에, 화학물질이 대뇌 피질 세포의 분화, 축삭 신장능, 발화능에 미치는 영향을 평가하는 시험(각종 유전자 마커의 RT-PCR, 사이토카인의 ELISA 등에 의한 발현 단백질 해석, 탐식능 시험, 패치 클램프법, 멀티 전극 어레이(MEA) 등을 이용한 전기 생리학적 해석) 등을 들 수 있다. 예컨대, 신경 분화나 축삭 신장능, 발화능을 촉진 또는 저해하는 화합물의 탐색이나, 뇌혈관 장애를 앓는 환자 유래 iPS 세포로부터 분화시킨 세포에 대하여 질환 특이적인 표현형을 레스큐시키는 것과 같은 화합물, 단백질 등의 탐색 등에 사용할 수 있다.
또한, 이들 시험을 위한 세포 재료로서는, 예컨대, 본 발명의 세포괴의 세포를 분산하여 파종 접착한 플레이트, 세포 현탁액, 그의 시트 또는 성형체를 제공할 수 있다.
본 발명의 상기 2에 기재된 대뇌 오가노이드의 제조 방법으로 얻어지는 대뇌 오가노이드, 또는 상기 3에 기재된 대뇌 오가노이드 또는 이들 대뇌 오가노이드로부터 얻어지는 대뇌 피질 세포를 포함하는 세포 집단, 상기 4~7에 기재된 대뇌 피질 세포괴의 제조 방법으로 얻어지는 대뇌 피질 세포괴, 상기 8 또는 9에 기재된 대뇌 피질 세포괴, 또는 이들 세포괴를 분산시켜 얻어지는 세포 집단은 인간 및 동물 시험의 외삽 시험으로서 이용할 수 있다.
13. 대뇌 오가노이드 또는 대뇌 피질 세포괴(고순도 대뇌 피질 세포괴를 포함함)의 품질 평가 방법
본 발명의 일 양태로서, 이하의 공정 (aa) 및 공정 (bb)를 포함하는 대뇌 오가노이드 또는 대뇌 피질 세포괴의 품질 평가 방법을 들 수 있다. 여기서, 대뇌 피질 세포괴에는 본 발명의 고순도 대뇌 피질 세포괴가 포함된다.
(aa) 대뇌 오가노이드 또는 대뇌 피질 세포괴에서의, GAD2, COL1A1, TYR, TTR 및 HOXA2로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개, 또는 모든 유전자의 발현량을 측정하는 공정,
(bb) 공정 (aa)의 측정 결과에 기초하여, 상기 유전자의 발현량이 기준값 이하인 경우에, 상기 대뇌 오가노이드 또는 상기 대뇌 피질 세포괴에 포함되는 목적 외 세포의 양이 기준 이하라고 평가하는 공정.
또한, 본 발명의 일 양태로서, 이하의 공정 (AA) 및 공정 (BB)를 포함하는 대뇌 오가노이드 또는 대뇌 피질 세포괴의 품질 평가 방법을 들 수 있다.
(AA) 대뇌 오가노이드 또는 대뇌 피질 세포괴에서의 NEUROD6, NEUROD2, SSTR2, TBR1, ZBTB18, NHLH1, IGFBPL1, NRN1, RTN1, THSD7A, NRXN1, BHLHE22, CALB2, KHDRBS3, CCSAP, PDE1A, NEUROD1, NPTX1, NXPH4, NTS, NEUROG2, OLFM1, PRDM8, CORO2B, TP53I11, ZFPM2, PCDH9, NELL2, SRRM4, SCG3, DCC, EPB41L3, SLC17A7, ST18, NSG2, EMX1, CAP2, SYT4, NSMF, ANK3, MYT1L, FSTL5, CELF4, B3GAT1, EPHA5, NHLH2 및 DLL3으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개 또는 적어도 5개의 유전자의 발현량을 측정하는 공정,
(BB) 공정 (AA)의 측정 결과에 기초하여 상기 유전자의 발현량이 기준값 이상인 경우에, 상기 대뇌 오가노이드 또는 상기 대뇌 피질 세포괴에 포함되는 목적 세포의 양이 기준 이상이라고 평가하는 공정.
유전자의 발현량(즉, mRNA 또는 단백질의 발현량) 및 그의 측정 방법에 대하여 상기와 같다. 상기 (aa)에 기재된 유전자 등의, 목적 외 세포의 마커가 되는 각 유전자의 발현량의 기준값으로서는, 예컨대, 표품이 되는 대뇌 오가노이드 또는 대뇌 피질 응집괴에서 측정된 값을 들 수 있으며, 기준값과 동등 이하인 것을 지표로서 평가할 수 있다. 또한, 상기 (AA)에 기재된 유전자 등의, 목적 세포의 마커가 되는 각 유전자의 기준값으로서는, 예컨대 표품이 되는 대뇌 오가노이드 또는 대뇌 피질 응집괴에서 측정된 값을 들 수 있고, 기준값과 동등 이상인 것을 지표로서 평가할 수 있다.
본 발명의 일 양태로서, 상기 4~7에 기재된 대뇌 피질 세포괴의 제조 방법으로 얻어지는 대뇌 피질 세포괴에 대하여, 대뇌 피질 세포괴의 세포 집단의 일부를 샘플링하고 상기 대뇌 오가노이드 또는 대뇌 피질 세포괴의 품질 평가 방법으로 평가하여, 당해 평가 결과에 기초하여 목적 외 세포가 기준 이하이고/이거나, 목적 세포가 기준값 이상인 대뇌 피질 세포괴의 집단을, 이식에 이용 가능한 집단으로서 선택(동정)할 수 있다.
본 발명의 일 양태로서, 상기 4~7에 기재된 대뇌 피질 세포괴의 제조 방법으로서, 추가로 상기 대뇌 오가노이드 또는 대뇌 피질 세포괴의 품질 평가 방법을 포함하는 대뇌 피질 세포괴의 제조 방법을 들 수 있다.
즉, 이하의 공정을 포함하는 대뇌 피질 세포괴의 제조 방법을 들 수 있다:
(1) 4~7에 기재된 제조 방법으로, 대뇌 피질 세포괴를 제조하는 공정,
(2) 상기 품질 평가 방법에 의해, 목적 세포의 양이 기준 이상인 것 및/또는, 목적 외 세포의 양이 기준 이하인 것을 평가하는 공정,
(3) (2)의 평가 결과에 기초하여 이식에 이용하는 것이 가능한 대뇌 피질 세포괴를 선택 또는 동정하는 공정.
실시예
(인간 인공 다능성 줄기세포(hiPSC)의 유지 배양)
hiPSC는 라미닌 511의 E8 프래그먼트인 iMatrix-511(주식회사 닛피)을 0.5㎍/㎠가 되도록 6웰 플레이트에 첨가하여 코딩한 플레이트 위에서 StemFit(등록상표) AK02N 배지 또는 AK03N 배지(이하, ' StemFit'이라고 하는 경우가 있음; 아지노모토 헬시서플라이사 제조)를 이용하여 유지 배양하였다. 계대는, hiPSC를 0.5×Tryple Select를 이용하여, 세포를 37℃에서 8분간 처리하고, 단세포로 분리 후, 1~1.5×104 세포의 세포 밀도로 6웰 플레이트에 파종하였다. 계대는 7일마다 행하였다.
(면역 염색 해석)
오가노이드를 4% 파라포름알데히드로 30분간 고정하고, PBS 중의 30%(w/v) 수크로스로 탈수 반응을 행하고, O.C.T. 컴파운드(Sakura Finetek)를 이용하여 포매하였다. 냉동 절편은 크리오스텟(CM1850, 라이카 바이오시스템즈)을 이용하여 16㎛의 두께로 작성하였다. 0.3% 또는 2%(v/v) Triton-X100으로 투과 처리하고, 필요에 따라 항원 부활화 반응을 실시하였다. 블록 ACE(KAC)로 블로킹을 실시한 후, 이중 또는 삼중 표식 염색을 행하였다. 면역 염색에 사용한 1차 항체 및 2차 항체는 권장 희석 농도로 사용하였다.
면역 염색에 사용된 1차 항체 및 2차 항체를 이하에 나타낸다.
L1CAM: 554273 (BD)
Ctip2: ab18465 (아브캄(Abcam))
Pax6: EPR15858 (아브캄),561482 (BD)
Foxg1: M227 (타카라)
Ki67: NCL (레이카(Leica))
Emx1: M196 (타카라)
Gad65: 559931 (BD)
Col1a1: AF6220(R&D)
TTR: A0002(DAKO)
TYR: MA5-14177(서모피셔)
Alexa Fluor(등록 상표) 488 donkey anti-mouse IgG (H+L): A21202 (서모피셔)
Alexa Fluor(등록 상표) 647 donkey anti-mouse IgG (H+L): 1900251 (서모피셔)
Alexa Fluor(등록 상표) 594 donkey anti-rat IgG (H+L): 1979379 (서모피셔)
Alexa Fluor(등록 상표) 488 donkey anti-rabbit IgG (H+L): A21206 (서모피셔)
Alexa Fluor(등록 상표) 647 donkey anti-rabbit IgG (H+L): A32795 (서모피셔)
Alexa Fluor(등록 상표) 594 donkey anti-sheep IgG (H+L): A11016 (서모피셔)
(현미경 및 화상 분석)
배양 중의 오가노이드의 화상(명시 야상)을 디지털 도립 현미경(레이카 바이오시스템(Leica Biosystems), DMS1000)으로 촬영하였다. 공초점 형광 현미경 화상은 LSM800 공초점 현미경(Zeiss)으로 촬영하고 ZENBlue 화상 처리 소프트웨어로 해석하였다.
(플로우 사이토메트리)
대뇌 오가노이드, 대뇌 피질 세포괴 및 고순도 대뇌 피질 세포괴는 신경세포용 분산액(후지필름 와코쥰야쿠)을 이용하여 단세포로 분산시키고, Fixation Buffer(BD 바이오사이언스)를 이용하여 4℃에서 30분간 고정한 후, Perm/Wash buffer(BD 바이오사이언스)로 실온 15분간 처리하여 이중 또는 삼중 염색을 행하고, AriaIII을 이용하여 해석하였다. 해석 소프트웨어는 FACSDiva software(BD)를 이용하였다. 사용한 1차 항체, 2차 항체는 하기에 나타낸다.
PerCP-Cy5.5 Mouse IgG1 k isotype control: 550795 (BD 바이오사이언스)
Alexa 647 Mouse Anti-human Oct3/4 antigen: 560329 (BD 바이오사이언스)
Tra-2-49/6E-FITC antibody: FCMAB133F (머크(Merck))
Alexa647 mouse anti β-tubulin Class III: 560394 (BD)
PerCP-Cy5.5 Mouse anti-Human Sox1: 561549 (BD)
Alexa647 mouse anti-Human Pax6: 561165(BD)
Alexa488 mouse anti-Ki67: 562249 (BD)
Alexa488 rat anti-Ctip2 antibody: ab123449 (아브캄)
(정량적 역전사 PCR(RT-qPCR)에 의한 유전자 발현 해석)
전 RNA는 RNeasyMicroKit(QIAGEN)에 의해 취득하고 SuperScript III First-Strand Synthesis System(QIAGEN)에 의해 메이커의 프로토콜에 따라 역전사 반응을 행하였다. 정량적 PCR은 TaqMan(상표) 유전자 발현 마스터 믹스(Gene Expression Master Mix)(서모피셔) 또는 SYBR 그린 마스터 믹스(Green Master Mix)(서모피셔)를 사용하여 제조원의 지시에 따라 실행하였다. 유전자의 발현량은 ΔΔCt법을 사용하여 GAPDH로 표준화하였다.
사용된 프라이머 세트 및 Taqman 프로브를 이하에 나타낸다.
올리고 DNA 프라이머
POU5F1:
Forward: AGACCATCTGCCGCTTTGAG (배열 번호 1)
Reverse: GCAAGGGCCGCAGCTT (배열 번호 2)
NANOG:
Forward: GGCTCTGTTTTGCTATATCCCCTAA (배열 번호 3)
Reverse: CATTACGATGCAGCAAATACGAGA (배열 번호 4)
BMP4:
Forward: ATGATTCCTGGTAACCGAATGC (배열 번호 5)
Reverse: CCCCGTCTCAGGTATCAAACT (배열 번호 6)
NODAL:
Forward: TGAGCCAACAAGAGGATCTG (배열 번호 7)
Reverse: TGGAAAATCTCAATGGCAAG (배열 번호 8)
TGFB1:
Forward: TACCTGAACCCGTGTTGCTCTC (배열 번호 9)
Reverse: GTTGCTGAGGTATCGCCAGGAA (배열 번호 10)
SOX1:
Forward: GCGGAGCTCGTCGCATT (배열 번호 11)
Reverse: GCGGTAACAACTACAAAAAACTTGTAA (배열 번호 12)
PAX6:
Forward: CTGGCTAGCGAAAAGCAACAG (배열 번호 13)
Reverse: CCCGTTCAACATCCTTAGTTTATCA (배열 번호 14)
T (TBXT):
Forward: ATGGAGGAACCCGGAGACA (배열 번호 15)
Reverse: TGAGGATTTGCAGGTGGACA (배열 번호 16)
SOX17:
Forward: CGCTTTCATGGTGTGGGCTAAGGACG (배열 번호 17)
Reverse: TAGTTGGGGTGGTCCTGCATGTGCTG (배열 번호 18)
hCGalpha:
Forward: ACCGCCCTGAACACATCCTGC (배열 번호 19)
Reverse: GCGTGCATTCTGGGCAATCCTGC (배열 번호 20)
SOX2:
Forward: GCCGAGTGGAAACTTTTGTCG (배열 번호 21)
Reverse: GGCAGCGTGTACTTATCCTTCT (배열 번호 22)
Taqman probe
SLC17A7: Hs01574213
EMX1: Hs00417957
GAD2: Hs00609536
DLX2: Hs00269993
TTR: Hs00174914
COL1A1: Hs00164004
TYR: Hs00165976
HOXA2: Hs00534579
<예비시험 1> 배양보조세포의 존재 하 또는 비존재 하에 유지 배양한 다능성 줄기세포의 신경세포로의 분화 유도
인간 배아 줄기세포(hESC) 또는 인간 iPS 세포주(hiPSC)를, 배양보조세포의 존재 하(온 피더(on feeder)) 또는 비존재 하(피더-프리)에서 신경세포로 분화 유도하여, 생긴 구상의 세포 응집체를 해석하여, 대뇌 오가노이드로의 분화 유도의 효율을 비교하였다.
인간 ES인 KhES-1 및 KhES-2는 교토대학 재생의과학연구소로부터 입수하고, 인간 iPS 세포주인 201B7세포, 1231A3세포 및 Ff-I01s04세포는 교토대학으로부터 입수하였다.
온 피더의 경우, 배양보조세포로서, 마우스 태아 유래 섬유아세포(Mouse embryonic fibroblast; MEF, 오리엔탈 효모)를 이용하였다. KhES-1 등의 각종 줄기세포주를, 90mm 디쉬 1매당 1.2x106 세포의 밀도로 파종하고 MEF의 존재 하에서 1%(v/v) NEAA, 1%(v/v) L-글루타민, 1%(v/v)2-머캅토에탄올, 20%(v/v) KSR을 포함하는 DMEM/F12 배지에, 5ng/ml의 bFGF를 첨가한 배지에서, 37℃, 5% CO2로 3~7일간 배양하였다. 피더-프리의 경우, 각종 줄기세포주를 매트릭스로서 iMatrix-511(닛피사 제조)로 코딩한 6웰 플레이트 위에서 StemFit(아지노모토 헬시서플라이사 제조)에서 37℃, 5% CO2로 7일간 유지 배양하였다.
유지 배양 후의 세포는, 비특허문헌 1에 기재된 방법으로 일부 변경을 더한 방법으로 대뇌 오가노이드로 분화 유도하였다. 분화 개시 시에는, 각종 다능성 줄기세포를 0.5×TrypLE Select로 처리하여 단세포로 분산시켰다. 그 후, 50μM의 Y-27632(후지필름 와코쥰야쿠)를 첨가한 분화 배지(후술)로 치환하고, 비세포 흡착성의 V저 96웰 플레이트(스미토모 베이클라이트)에 9,000세포/웰이 되도록 파종하였다. 분화 배지는, 20%(v/v) KSR, 5μM SB431542(TGFβ 저해제; TOCRIS) 및 3μM IWR1e(Wnt 저해제; 칼바이오켐(Calbiochem))를 첨가한 DMEM/F-12 GlutaMAX 배지(집코)이었다. 분화 3일째부터 15일째까지는, 분화 배지를 이용하여, 3일 간격으로 반량 배지 교환을 실시하였다. 18일째에, 응집한 세포를 90mm의 부유 배양용 디쉬(스미토모 베이클라이트)로 옮기고, 분화 유도 개시 후 35일째(35일차)까지 1%(v/v) N2-서플리먼트(집코), 1%(v/v) 화학적으로 결정된 지질 농축물(CDLC; 집코), 0.25μg/ml 암포테리신 B(집코), 100U/ml 페니실린, 및 100μg/ml 스트렙토마이신을 첨가한 DMEM/F-12 12 GlutaMAX(집코)에서 추가로 배양하였다. 35일차까지, 3일 간격으로 전량 배지 교환을 실시하였다.
분화 유도 후 33~35일째(33일차~35일차)에 얻어진 구상 세포 응집체 중, 대뇌 오가노이드의 수 비율이 약 5% 이상인 경우에 “대뇌 오가노이드를 형성(우수 오가노이드(good organoid))”, 5% 미만인 경우에 “대뇌 오가노이드 미형성(불량 오가노이드(bad organoid))”이라고 판정하였다. 우수 오가노이드의 예는 도 1의 (A)(201B7 균주)에 나타내어 있으며, 불량 오가노이드의 예는 도 1의 (B)(Ff-I01s04 균주)에 나타내었다. (A) 중의 화살표는 로제트 구조를 나타낸다. 각 세포주의 결과를 하기 표 1에 정리하였다.
매트릭스 세포주 MEF iMatrix-511(LM511E8)
배지 hESC StemFit
hESC KhES-1 3/3 1/3
KhES-2 3/5 0/3
hiPSC 201B7 3/3 1/3
1231A3 0/3 0/4
Ff-I01s04 3/3 0/4
표 중의 숫자는, 분모는 분화 유도를 행한 실험 횟수를 나타내고, 분자는 대뇌 오가노이드를 형성한 횟수를 나타낸다. 예컨대, '1/3'은 3회 분화 유도를 행하여, 대뇌 오가노이드를 형성한 것이 1회였다는 것을 나타낸다. 어느 ES 또는 iPS 세포주에서도, 피더-프리인 경우는, 온 피더의 경우보다도 대뇌 오가노이드의 형성 효율이 저하된 것을 확인하였다.
<예비시험 2> 유전자 발현의 해석
예비시험 1과 마찬가지로 KhES-1, 201B7, Ff-I01s04 및 1231A3 세포주를 온 피더, 피더-프리, 및 feeder conditioned medium의 3 조건으로 배양하고, 분화 유도하였다. 피더 컨디션드 미디엄(feeder conditioned medium)의 조건은, MEF를 1%(v/v) NEAA, 1%(v/v) L-글루타민, 1%(v/v) 2-머캅토에탄올, 20%(v/v) KSR을 포함하는 DMEM/F12 배지에서 24시간 배양하여 배지 상청을 회수하고 필트레이션하여 피더-프리의 세포의 배양에 이용하였다. 얻어진 이들 세포에서의 배양 후 분화 유도 전 및 분화 유도 후의 FGF2 및 TGFβ 경로 관련 유전자(FGF2, LEFTY, NODAL, TGFβ1, Activin)의 발현을 마이크로 어레이로 해석하였다.
마이크로어레이 해석은 온 피더, 피더-프리, MEF conditioned medium의 3 조건에서 배양한 4종류의 iPS 세포주(KhES1, 201B7, 1231A3, Ff-I01s04)로부터, 타카라의 NucleoSpin RNA Plus XS를 이용하여 기정의 프로토콜에 따라 RNA를 추출하고 Clariom S(Applied Biosystems) 마이크로어레이를 이용하여 유전자 발현 해석을 행하였다. 유전자 발현량의 해석은 전사체 뷰어(transcriptome viewer)(쿠라보)를 이용하여 실시하였다.
해석 결과는 도 2에 나타낸다. 도 2의 (A)는 배양 후 분화 유도 전의 결과이며, 4종의 세포주에 대하여, 온 피더로 배양한 군(횡축) 또는 피더-프리로 배양한 군(종축)에 대하여, 유전자 발현을 마이크로어레이를 이용하여 비교 해석한 결과를 나타낸다(n은 세포주의 종류를 의미함). 온 피더 배양군은 피더-프리 배양군과 비교하여 FGF2와 TGFβ 경로 관련 유전자(FGF2, LEFTY, NODAL, TGFβ1, Activin)의 발현이 2배 이상 높은 값이었다.
도 2의 (B)는 이들 세포주를 예비시험 1에 따라, 4종류의 세포주를 이용하여 온 피더, 피더-프리 및 피더 컨디션드 미디엄의 3 조건의 iPS 세포를 분화 유도하여, 대뇌 오가노이드를 형성한 조건(우수 오가노이드; 횡축)과 형성하지 않은 조건(불량 오가노이드; 종축)으로 나누어, 2군간의 유전자 발현을 비교 해석한 결과를 나타낸다(n은, 대뇌 오가노이드의 형성 효율이 높았던 조건 수를 의미함). 대뇌 오가노이드를 형성한 군에서는, 형성하지 않은 군과 비교하여, FGF2 및 TGFβ 경로 관련 유전자(FGF2, LEFTY, NODAL, TGFβ1, Activin)의 발현이 높은 값이었다. 온 피더로 유지 배양, 및 대뇌 오가노이드의 형성 효율이 높았던 미분화 줄기세포에서는, 내재성인 bFGF, TGFβ 관련 유전자의 발현이 높은 것을 알 수 있었다. 즉, 대뇌 오가노이드를 형성하기 쉬운 ES/iPS 세포 및 배양 조건에서는, 다능성 줄기세포 내의 bFGF 및 TGFβ 관련 유전자의 발현 레벨이 높은 것이 밝혀졌다.
알려져 있는 인간 다능성 줄기세포용 유지 배지의 조성을 하기 표 2에 나타낸다. 피더-프리용의 유지 배지에는 통상적으로 고농도의 bFGF와 TGFβ가 첨가되는 것을 알 수 있다. 이들 배지에서 배양한 ES/iPS 세포에서는, 온 피더에서 배양한 경우와 비교하여 bFGF 및 TGFβ 관련 유전자의 발현이 낮아지는 것이 시사되었다. 따라서, bFGF 및 TGFβ 관련 유전자의 발현량의 차가 대뇌 오가노이드 형성 효율의 차의 원인이 되어 있을 가능성이 생각되었다.
온 피더 피더-프리
DMEM/F-12 GlutaMAX
(집코)		 Essential 8
(써모)		 mTeSR1
(스템셀)		 StemFit
(아지노모토)
첨가제 20% KSR NEAA
L-글루타민
2-ME		 2ng/mL
TGFβ		 23.5pM TGFβ 비공개
bFGF 5ng/mL 10ng/mL 100ng/mL 비공개
매트릭스 MEF Matrigel Geltrex
Matrigel
Vitronectin		 iMatrix-511
(LM511-E8)
따라서, 본 발명자들은 ES/iPS 세포를 다양한 화합물의 존재 하에 배양하고, 그 후 신경세포로의 분화 유도를 행하여, 대뇌 오가노이드의 형성 효율을 해석함으로써, 형성 효율에 영향을 줄 수 있는 화합물을 탐색하였다. 그 결과, 의외로 iPS 세포를 'bFGF를 포함하지 않으며, 또한 TGFβ를 포함하지 않거나 또는 TGFβ 시그널 전달 저해제를 첨가한 배지'에서 배양하여 (공정 (1))로부터 신경세포로 분화 유도하면(공정 (2)), 대뇌 오가노이드의 형성 효율이 현저하게 올라가는 것을 발견하였다.
<실시예 1> 공정 (1)의 오가노이드 형성 효율로의 영향
1-1. 공정 (1)의 유지 배지에 대하여
도 3 또는 도 5에 나타내는 스킴에 따라, 공정 (1) 및 공정 (2)를 행하였다. 인간 iPS 세포(S2WCB1 균주, S2WCB3 균주)의 유지 배양은 iMatrix-511로 코팅한 6웰 플레이트 위(피더-프리), StemFit 배지 중에서 행하였다.
배지를,
(1) StemFit의 C액 비첨가 배지(즉, bFGF 불함유 배지)에 5μM SB431542를 첨가한 것(도 3), 또는,
(2) Essential 6 배지(즉, bFGF 불함유, TGFβ 불함유 배지)(도 5)
로 교환하여, 1일간 접착 배양하였다.
공정 (2a) Sakaguchi팀(Stem Cell Reports, 13:458-473, 2019. doi: 10.1016/j.stemcr.2019.05.029)의 방법을 이용하여 무혈청 배지 중에서 신경세포로 분화 유도하였다. 구체적으로는, 공정 (1)로 배양한 인간 iPS 세포를 효소 처리에 의해 단세포로 분산시켰다. 단세포로 분산된 인간 iPS 세포를, 비세포 접착성의 96웰 배양 플레이트(PrimeSurface 96V 바닥 플레이트, 스미토모 베이클라이트사 제조)에 파종하고(9,000 세포/웰/100μL), 0.1mM 비-필수 아미노산, 1mM 피루베이트, 0.1mM 2-머캅토에탄올, 20%(v/v) KnockOut(상표) 혈청 대체물, 100U/mL 페니실린 및 100μ/ml 스트렙토마이신을 첨가한 Glasgow MEM(GMEM; 서모피셔) 배지(이하, 20GMK라고도 칭함)에, 추가로 5μM SB431542(TGFβ 시그널 저해제; 토크리스(Tocris)), 3μM IWR1e(Wnt 시그널 전달 저해제; 칼바이오켐)를 첨가한 배지 중에서, 37℃, 5% CO2에서 18일간 부유 배양하였다. 배지 교환은 3일마다 행하였다. 0일차에서 Y-27632를 50μM가 되도록 첨가하고, 이후의 배지 교환 시에는 첨가하지 않았다. 배양 후에 세포괴가 얻어졌다.
공정 (2b) 18일차에, 얻어진 세포괴를 90mm 디쉬로 옮기고 1×N2 대체물(서모피셔), 화학적으로 결정된 지질 농축물(인비트로젠), 0.25mg/mL fungizone(집코), 1% 페니실린/스트렙토마이신, 0.1% 암포테리신 B를 첨가한 DMEM/F12/GlutaMAX 배지 중에서, 37℃, 20% O2, 5% CO2로 35일차~42일차까지 오비탈 쉐이커(Orbital Shaker)에 의해 진동 배양을 행하였다. 배지 교환은 3~4일마다 실시하였다.
35일차의 세포 배양물에 대하여, 도립 현미경으로 관찰하여, 대표적인 화상을 도 4의 (A)에 나타낸다. 또한, 세포 배양물에 대하여, 각 마커(L1CAM, CTIP2, PAX6)에 대하여 형광 면역 염색을 행하였다. 형광 면역 염색은 상기의 1차 항체 및 그들에 대응하는 형광 표식된 2차 항체를 사용하였다. 또한, DAPI로 핵 염색을 행하였다. 대표적인 형광 염색 화상(공초점 형광 현미경 화상)을 도 4의 (B)에 나타낸다.
또한, 대뇌 오가노이드의 형성 효율(%)은 이하의 식으로 계산하였다.
[수 1]
공정 (1)에서, SB431542(이하 SB라고 칭하는 경우가 있다.)를 첨가한 bFGF 불함유 StemFit 배지에서의 유지 배양(StemFit -bFGF + SB)인 경우, 복수의 명확한 로제트 구조를 갖는 세포괴((B)의 가장 오른쪽)를 확인할 수 있었다. 대뇌 피질 유사 구조의 내측에는 Pax6 양성의 신경 전구 세포층(방사상 글리아 세포)이 국재하고, 외측에는 Ctip2와 L1CAM을 발현하는 신경세포층이 보였다. 또한, bFGF 불함유 배지('StemFit - bFGF' 또는 'StemFit - bFGF + SB')에서의 유지 배양(공정 (1))을 행하면, 대뇌 오가노이드의 형성 효율('StemFit - bFGF'의 경우는 <10%, 'StemFit - bFGF + SB'의 경우는 약 40%~50%)이 bFGF 함유 배지에서의 유지 배양(StemFit, <1%)에 비하여 현저히 상승하였다.
공정 (1)에서, 배지로서, SB431542 첨가한 Essential 6(E6) 배지를 이용하여 유지 배양하고, 상기와 마찬가지로 분화 유도하였다. 상기와 마찬가지로 면역 염색하여, 대표적인 세포괴의 공초점 형광 현미경 화상을 도 6에 나타낸다. 도 6으로부터 알 수 있듯이, SB431542를 첨가한 E6 배지를 이용한 경우에서, SB431542를 첨가한 StemFit 배지와 마찬가지로 대뇌 오가노이드가 얻어졌다. 또한, 대뇌 오가노이드의 형성 효율(%)=(22/39)×100%=56.9%이었다.
1-2. 공정 (1)의 유지 배지의 첨가제에 대하여
도 3의 스킴의 공정 (1)에서, -1일차~0일차의 기간에 하기 첨가제를 첨가한 배지에서 배양하고, 0일차에 신경세포로 분화 유도하여, 35일차에 대뇌 오가노이드의 형성 효율을 평가하였다. 면역 염색의 결과를 도 7에 나타내고, 대뇌 오가노이드의 형성 효율을 표 3에 나타낸다. 또한 도 7 중의 '없음'은 첨가제 없음을 의미한다.
실험군
(Exp.)		 조건 결과
공정 (1) 대뇌 오가노이드의 형성 효율
(%)
bFGF 첨가제
대조군 + - <1%
A - <10%
B - LDN-193189 <5%
C + SB-431542 <5%
D - 약 40%~50%
E + IWR1e <1%
F - <5%
G - LDN+SAG <1%
H - BMP4, TGFβ,
Nodal, Activin		 <1%
I + <1%
대조군, Exp. C, E, I: StemFit의 C액 첨가 배지(=bFGF 함유 배지)에 첨가제를 첨가한 배지
Exp. A-B, D, F-H: StemFit의 C액 비첨가 배지(=bFGF 불함유 배지)에 첨가제를 첨가한 배지
bFGF 함유 배지를 사용한 실험군에서는, 첨가제의 종류에 관계없이 대뇌 오가노이드 형성 효율이 낮았다. SB431542를 첨가한 군에서도 5% 미만이라는 낮은 값이었다(Exp.C). 이에 대하여, bFGF 불함유 배지를 사용한 군에서는 SB431542를 첨가한 군에서만 로제트 구조를 다수 갖는 대뇌 오가노이드가 고효율로 얻어졌다(Exp.D). IWR1e를 첨가한 군에서는, 신경 상피와 신경세포는 생겨있지만, 대뇌 피질 유사 구조를 형성하고 있지 않은 비정상적인 세포 배양(Exp.F)이 인정되었다. Exp.D에서 관찰된 대뇌 피질 유사 구조의 내측에는, Pax6 양성의 신경 전구 세포층(방사상 글리아 세포)이 국재하고, 외측에는 Ctip2와 L1CAM을 발현하는 신경세포층이 보였다.
실시예 1의 결과로부터, 인간 다능성 줄기세포를 'bFGF를 포함하지 않고, 또한 TGFβ를 포함하지 않거나 또는 TGFβ 시그널 전달 저해제를 첨가한 배지'에서 배양하고 나서 신경세포로 분화 유도하면, 대뇌 오가노이드의 형성 효율이 현저히 올라가는 것이 나타났다. 따라서, 다능성 줄기세포를 'bFGF를 실질적으로 포함되지 않고 또한 TGFβ 시그널을 실질적으로 야기하지 않는 배양액' 중에서 배양하고 나서 신경세포로 분화 유도하면, 대뇌 오가노이드의 형성 효율이 현저히 올라가는 것이 밝혀졌다.
<실시예 2> 공정 (1)의 배양 기간
실시예 1에서 (1) StemFit의 C액 비첨가 배지에 5μM SB431542를 첨가한 'bFGF 불함유·SB431542 첨가 배지'를 사용하는 실험계에서, 'bFGF 불함유·SB431542 첨가 배지'에서 iPS 세포를 배양하는 기간을 하기 표와 같이 행하였다. 도 8은 18일차, 27일차, 34일차의 배양물의 대표적인 명시 야상을 나타낸다. 도 9는 35일차에서의 대뇌 오가노이드의 형성 효율을 해석한 결과를 나타낸다.
조건 -6일차 -5일차 -4일차 -3일차 -2일차 -1일차 0일차 3-18일차 18-35일차
pre 1d StemFit StemFit
w/o C
SB 5μM		 20GMK
SB 5μM
IWR1e
3μM
Y		 20GMK
SB 5μM
IWR1e
3μM		 DMEM/F
12
N2
pre 2d StemFit StemFit w/o
C
SB 5μM
pre 3d StemFit StemFit w/o C
SB 5μM
pre 4d StemFit StemFit w/o C
SB 5μM
pre 5d StemFit StemFit w/o C
SB 5μM
pre 6d StemFit w/o C
SB 5μM
StemFit w/o C: StemFit의 C액 비첨가 배지(=bFGF 불함유 배지)
도 8 및 도 9에 나타내는 바와 같이 'bFGF 불함유·SB431542 첨가 배지'에서의 처리는, 1일간 또는 2일간인 경우는 대뇌 오가노이드의 형성 효율이 30%∼40% 정도였지만, 3일간 이상인 경우는 대뇌 오가노이드의 형성이 거의 보이지 않았다. 'bFGF 불함유·SB431542 첨가 배지'로 6일간 처리한 조건에서는, iPS 세포의 증식이 현저히 저하되어, 분화 유도에 충분한 세포 수를 얻을 수 없었다. 따라서, 공정 (1)의 배양 기간은, 바람직하게는 3일간 미만이고, 더욱 바람직하게는 12시간 이상 2일간 이하, 가장 바람직하게는 1일간 정도인 것이 밝혀졌다.
<실시예 3> 공정 (1)의 유전자 발현으로의 영향
실시예 1에서 (1) StemFit의 C액 비첨가 배지에 5μM SB431542를 첨가한 'bFGF 불함유·SB431542 첨가 배지'를 사용하는 실험계에서, 0일차에서의 인간 iPS 세포(S2WCB1)의 유전자 발현 해석을 행하였다. 대조군은 통상적인 유지 배지인 StemFit 배지(bFGF 함유 배지)에서 배양한 iPS 세포였다.
3회의 분화 유도로 얻어진 오가노이드에서 각종 마커 유전자의 발현을 RT-qPCR로 해석하였다. 유전자 해석의 결과를 도 10에 나타낸다. 각 점은, 각 회의 샘플을 나타내고, 통상적인 유지 배지인 StemFit 배지(bFGF 함유 배지)로 배양한 iPS 세포로부터 분화 유도한 오가노이드(대조군)를 흑환으로, StemFit(-bFGF, +TGFβ 저해제)에서 배양한 후에 분화 유도한 오가노이드를 백환으로 나타낸다. 종축은 ΔΔCt법에 의해, GAPDH와, 대조군 중 1로트에 대하여 보정한 상대 발현량을 나타낸다. 도 중의 'TGFβi'는 TGFβ 저해제(TGFβ inhibitor)를 의미한다.
도 10으로부터, 공정 (1)(1일간)을 거친 iPS 세포(백환)에서는, 대조군(흑환)에 비하여 미분화 마커(POU5F1, NANOG)의 발현량은 낮고, 신경 외 배엽 마커(SOX1, PAX6), 중배엽 마커(TBXT), 및 내배엽 마커(SOX17)의 발현량은 높았던 것을 알 수 있었다. 도 중 'T'는 TBXT(별명 BRACHYURY)를 나타낸다.
따라서, 공정 (1)에 의해 iPS 세포가 삼배엽으로 분화하기 쉬운 상태로 변화할 가능성이 시사되었다. 즉, 다능성 줄기세포를, 'bFGF를 실질적으로 포함되지 않고 또한 TGFβ 시그널을 실질적으로 야기하지 않는 배양액' 중에서 적절한 기간 배양하면, 삼배엽으로 분화하기 쉬운 상태로 향하는 것이 시사되었다.
<실시예 4> 공정 (2)의 공정 (ii)-(iv)의 효과 1: V/VI층의 신경세포의 증가와 증식성 세포의 감소
4-1. 분산 및 재응집 있음
-7일차~35일차까지는 실시예 1과 마찬가지의 방법으로 배양하였다. 공정 (1)에는 (1) StemFit의 C액 비첨가 배지(bFGF 불함유 배지)에 5μM SB431542를 첨가한 것을 사용하였다.
도 11의 (A)에 나타내는 스킴과 같이, 공정 (ii)에서 분화 유도 개시 후 33일째(33일차)에 대뇌 오가노이드를 선별하고, 배지를 공정 (2b)의 배지에 10μM DAPT를 첨가한 것으로 치환하여 37℃, 5% CO2 하에서 3일간 부유 배양하였다. 이로 인해 대뇌 피질 세포괴가 얻어졌다.
공정 (iii)에서, 상기 공정 (ii)에서 얻어진 대뇌 피질 세포괴를, 0.5×TrypLE Select, 0.25mM EDTA 용액 중에서 37℃, 20분간 인큐베이트하고, 추가로 공정 (2b)의 배지에 25U/mL DNase I을 첨가한 용액 중에서 37℃, 10분간 인큐베이트하였다. 그 후, 피펫팅을 행하여 단세포에 분산시킨 후, 분산된 세포를 공정 (2b)의 배지에 10ng/mL GDNF, 20ng/mL BDNF, 200μM 아스코브산, 400μM 디부티릴-cAMP, 50μM Y-27632를 첨가한 배지에 현탁시켰다.
공정 (iv)에서, 공정 (iii)에서 얻어진 세포 현탁액을, 비세포 접착 96웰 플레이트에 3만 세포/웰로 분주하여 37℃, 5% CO2 하에서 4일간 부유 배양하였다. 이로 인해 고순도 대뇌 피질 세포괴가 얻어졌다. 대뇌 피질 세포괴(36일차), 고순도 대뇌 피질 세포괴(40일차)의 명시 야상을 도 11의 (B)에 나타낸다.
대뇌 피질 세포괴(36일차) 및 고순도 대뇌 피질 세포괴(40일차)에 대해서는, 추가로 피질 V/VI층 전구 세포(Deep Layer) 마커인 Ctip2, 종뇌 마커인 Foxg1, 신경 줄기세포(방사상 글리어) 마커인 Pax6/Ki67 및 증식성 세포 마커인 Ki67에 대하여 면역 염색을 행하였다.
면역 염색의 대표적인 공초점 형광 현미경 화상을 도 12에 나타낸다. 도 12의 (A)의 상단은 DAPT 없는 36일차의 대뇌 피질 세포괴, 하단은 DAPT 있는 36일차의 대뇌 피질 세포괴(모두 공정 (i)-(ii)를 거쳐 얻어진 것)의 면역 염색 화상을 나타내고, 도 12의 (B)는 40일차의 고순도 대뇌 피질 세포괴의(공정 (i)-(iv)를 거쳐 얻어진 것) 면역 염색 화상을 나타낸다.
DAPT 처리를 행하지 않고 36일차까지 배양한 군((A)의 상단)에서는 대뇌 오가노이드의 특징인 Pax6·Ki67 양성의 신경 줄기세포(방사상 글리어)층과 그의 외측에 Ctip2·Foxg1 이중 양성의 피질 제V/VI층의 신경세포층을 구비한 대뇌 피질 유사의 층 구조가 다수 확인되어, 이에 대하여, DAPT 처리를 행한 군((A)의 하단)에서는 Pax6 양성 세포는 인정되지만 Ki67의 발현은 거의 인정되지 않고, 대뇌 피질 유사의 층 구조는 인정되지 않았다. 한편, Ctip2·Foxg1 양성 세포는 세포괴 전체에서 인정되었다. 따라서, 대뇌 피질 세포괴에서는, 대뇌 피질 유사의 층 구조가 소실되어, Ctip2·Foxg1 이중양성의 피질 제V/VI층의 신경세포가 내부에 널리 분포하고 있는 것이 밝혀졌다.
또한, 대뇌 피질 세포괴를 단세포로 분산하여 재응집시켜 얻어지는 고순도 대뇌 피질 세포괴(도 12의 (B))에서는, Ctip2·Foxg1 이중 양성의 피질 제V/VI층의 신경세포가 내부 전체에서 인정되고, Pax6 양성 세포는 한층 적었다.
4-2. 분산 및 재응집 없음
다음으로, DAPT 처리 직후(공정 (ii)를 거친 직후)의 세포 배양물에 대하여, 플로우 사이토메트리를 이용하여 구성 세포의 비율을 해석하였다. 분화 유도 스킴을 도 13에 나타낸다. 40일차의 대뇌 오가노이드에 대하여 DAPT 처리를 3일간 행한 후, 플로우 사이토메트리로 마커 유전자의 발현을 해석하였다.
플로우 사이토메트리에 의한 피질 V/VI층 전구 세포(Deep Layer) 마커인 Ctip2, 신경세포 마커인 βIII-튜불린(βTubIII), 신경 줄기세포(방사상 글리어) 마커인 Pax6/Sox1/Ki67, 증식성 세포 마커인 Ki67의 발현 해석 결과를 도 14에 나타낸다.
도 14 중의 각 점은 세포를 나타낸다. 왼쪽과 중심의 패널은 생세포 전체를 표시한 결과, 오른쪽의 패널은 Ki67 양성의 세포만을 표시한 결과이다. Ctip2·βIII-튜불린 이중 양성 세포의 비율(왼쪽 패널)은, DAPT 비처리군(상단)에서는 36.4%이었지만, DAPT 처리군(하단)에서는 86.1%로까지 증가하고 있었다. 이에 대하여, Pax6·Ki67 이중 양성의 신경 줄기세포(방사상 글리어)의 비율(가운데 패널)은, DAPT 비처리군(상단)에서는 46.7%이었지만, DAPT 처리군(하단)에서는 1.5%로까지 감소하고 있었다. 또한, 증식성 세포인 Pax6 양성/Sox1 양성/Ki67 양성 세포(오른쪽 패널)의 비율은, DAPT 비처리군(상단)은 0.68%이었지만 DAPT 처리군(하단)에서는 0.01%로까지 감소하였다.
따라서, 대뇌 오가노이드를 Notch 시그널 저해제인 DAPT의 존재 하에서 배양하면, 대뇌 피질 유사 구조가 소실되어, 증식성 세포가 대폭으로 감소하는 한편으로, 신경세포(특히, 피질 제V/VI층의 신경세포)가 증가하는 것이 밝혀졌다.
또한, 0일차의 iPS 세포(미분화한 iPS 세포), DAPT 처리 미실시의 오가노이드(Ctrl, 공정 (ii) 없음), DAPT 처리를 3일간(40일차-43일차) 실시한 오가노이드(DAPT3d, 공정 (ii) 있음), 및 DAPT 처리를 3일간 실시 후에 세포를 분산시키지 않고, 세포괴 그대로 DAPT를 제외한 배지에서 4일간 배양을 계속한 오가노이드(DAPT3d + Release4d, 공정 (ii) 및 (iv) 있음, 공정 (iii) 없음)에 대하여, 각각을 플로우 사이토메트리로 해석하여 그의 결과를 도 15에 나타낸다.
도 15 중, 왼쪽으로부터 1~4열째의 패널은 생세포 모두를 표시한 결과이며, 가장 오른쪽의 패널은 Ki67 양성의 세포만을 표시한 결과이다. 미분화 iPS 세포의 지표인 Tra2-49/6E와 Oct4의 공-발현 세포는, 오가노이드에서는 어느 조건에서도 검출되지 않았다(왼쪽으로부터 1열째). Ctip2와 βIII-튜불린 공-양성의 세포는 'Ctrl'(위로부터 2단째)에서는 36.4%이었던 것에 대하여, 'DAPT3d'(위로부터 3단째)에서는 86.1%로, 'DAPT3d+Release4d'(최하단)에서는 87.4%로 상승하였다(왼쪽으로부터 2열째). 또한, Ki67, Sox1, Pax6 삼중 양성 세포는 'Ctrl'에서는 0.68%이었던 것에 대하여, 'DAPT3d'에서는 0.01%로, 'DAPT3d+Release4d'에서는 0%로 감소하였다(오른쪽으로부터 1열째). 'DAPT 3d+Release 4d'에서는 'DAPT 3d'보다도 더욱 Pax6 양성·Sox1 양성·Ki67 삼중 양성 세포의 비율이 감소하고 있어, DAPT 처리 후에 세포 응집체 그대로 배양하는 것만으로도 증식성 세포를 감소시킬 수 있다는것을 알 수 있었다.
4-3. 오가노이드 DAPT법 및 싱글셀 DAPT법 (2)
DAPT 처리 기간이 분화에 미치는 영향을 해석하기 위하여, 도 16 (A)가 나타내는 방법 스킴(오가노이드 DAPT법)에 따라, 분화 유도 7주째의 대뇌 오가노이드를 10μM의 DAPT로 3~7일간 처리하고, 유전자 발현의 변화를 RT-qPCR로 해석하여, 그의 결과를 도 16 (B)에 나타낸다. 종축은 GAPDH에 대한 상대 발현량을 나타낸다.
도 16 (B)로부터, DAPT 처리 기간이 길어질수록 성숙이 진행되어, 증식성 세포가 감소하고 있었던 것을 알 수 있었다. DAPT 처리 기간에 따라, 피질 V/VI층 전구 세포의 마커인 Ctip2의 발현은 상승하였다. 한편, 신경 전구 세포(방사형 글리어 세포)의 마커인 Pax6, Sox2, Ki67의 발현은 DAPT 처리 기간에 따라 저하하였다. 이상으로부터, DAPT 처리에 따른 신경의 분화 성숙이 진행되어, 증식성 세포의 비율이 저하되는 것이 밝혀졌다.
<실시예 5> 공정 (ii)를 행하는 시기의 검토
도 17의 (A)는 분화 유도의 스킴을 나타낸다. 25일차, 32일차, 39일차 및 72일차(각각의 분화 유도 기간은 대략 4주간, 5주간, 6주간, 10주간)의 오가노이드를 3일간 DAPT 존재 하·비존재 하에서 배양하고, 28일차(4wk), 42일차(6wk) 및 75일차(10wk)의 오가노이드를 각종 마커에 대하여 면역 염색으로 해석하였다. 면역 염색의 결과(공초점 형광 현미경 화상)를 도 17의 (B)에 나타낸다. 또한, Satb2는 피질 II-IV층 전구 세포(Upper Layer) 마커이다. 도 17의 (B)로부터, 4주간에서 6주간의 오가노이드에서, DAPT 비존재 하에서는 Ctip2, Bf1 공-양성 세포와 Ki67 양성 세포를 포함하는 로제트 구조가 인정되지만, DAPT 처리 후에는 로제트 구조가 보이지 않게 되어, Ctip2, Bf1 공-양성의 세포가 증가하고 Ki67 양성의 세포가 감소하는 것을 알 수 있었다. 10주의 오가노이드에서는, DAPT 처리 후에 로제트 구조는 불명료하게 되었지만, Ctip2 양성 세포, Satb2 양성 세포의 비율에 현저한 변화는 보이지 않았다.
또한, 25일차, 32일차, 39일차 및 72일차(각각의 분화 유도 기간은 대략 4주간, 5주간, 6주간, 10주간)의 오가노이드를 3일간 DAPT 존재 하·비존재 하에 배양하고, 28일차(4wk), 35일차(5wk), 42일차(6wk) 및 75일차(10wk)의 대뇌 오가노이드에 대하여 RT-qPCR로 마커 유전자의 발현량을 해석하고, 각각의 마커의 상대 발현량의 해석 결과를 도 18에 나타낸다. 도 18로부터, 4주간~6주간의 오가노이드에서는 DAPT 처리 후에 Ctip2의 발현 상승 경향 및 Pax6, Ki67의 발현 저하가 보이는 것을 알 수 있다. 10주간의 오가노이드에서는 Ki67의 발현 저하는 보이지 않으며 Satb2의 발현에도 영향이 보이지 않았다.
상기의 결과로부터, 공정 (ii)의 개시 시기는, 분화 유도 개시로부터 약 20~44일 후(20일차~44일차)가 바람직하고, 더욱 바람직하게는 25일차~39일차인 것이 밝혀졌다. 또한, 공정 (ii)의 기간은 약 2일간~4일간이 바람직하고, 또한 약 3일간 전후(예컨대, 60~84시간)가 바람직하다는 것도 밝혀졌다.
<실시예 6> 공정 (2)의 공정 (ii)-(iv)의 효과 2: 이식편의 증대 억제 효과
도 17의 (A)의 분화 유도 스킴으로 얻어진 대뇌 피질 세포괴를 Scid 마우스(일본 클레어)의 뇌로 정위 뇌 이식법에 의해 1.5×105 세포를 이식하고, 이식 3개월 후에, 4% 파라포름알데히드에 의해 뇌를 관류 고정하여 35㎛ 두께의 동결 절편을 작성하였다. 작성한 뇌 절편을 이용하여, Ku80의 면역 염색으로 인간 세포의 생착을 평가하였다. 면역 염색한 이식편의 대표적인 공초점 형광 현미경 화상을 도 19에 나타낸다.
또한, 염색한 이식편의 체적의 해석 결과를 도 20에 나타낸다. 이식편의 체적은, 면역 염색한 뇌 절편을 350㎛에 1매의 간격으로 관찰하고, 각 절편에 대하여 Ku80의 염색상으로부터 이식편의 면적을 산출하여 면적과 절편의 간격을 적산함으로써 산출하였다. One-way ANOVA(Tukey Multiple Test)에 의해 검정을 실시하였다(****p<0.0001, **p<0.01).
도 19 및 도 20으로부터, 분화 유도 개시로부터 약 5주간 후 또는 6주간 후에 공정 (ii)를 행하여 얻어진 대뇌 피질 세포괴는, 공정 (ii)를 실시하지 않고 얻어진 대뇌 피질 세포괴와 비교하여, 뇌 내에 이식 후의 생착률이 높으며, 또한 체적의 증가도 매우 적은 것으로 나타났다.
따라서, 다능성 줄기세포로부터 분화 유도한 대뇌 오가노이드를 DAPT의 존재 하에 배양한 후, 1 이상의 신경 영양 인자, 아스코브산 및 cAMP 활성화제를 포함하는 배양액 중에서 배양함으로써 형성되는 대뇌 피질 세포괴는 뇌 내에 이식 후의 생착율이 높고, 더욱 증대하기 어려운(세포 증식하기 어려움) 것이 밝혀졌다.
실시예 1~6에 기초하여 본 발명의 바람직한 실시형태의 방법을 도 21에 나타낸다.
바람직한 배양보조세포의 비존재 하에, 다능성 줄기세포로부터 대뇌 오가노이드를 제조하는 방법은 하기의 공정를 포함한다.
공정 (1): 다능성 줄기세포를, bFGF가 실질적으로 포함되지 않고 또한 TGFβ 시그널을 실질적으로 야기하지 않는 배양액 중에서 배양하는 공정,
공정 (2): 공정 (1)에서 얻어진 세포를, 대뇌 오가노이드로 분화 유도하는 공정.
공정 (2)는 이하의 공정을 포함한다.
공정 (2a): 공정 (1)에서 얻어진 세포를, TGFβ 시그널 저해제 및 Wnt 시그널 전달 저해제를 포함하는 배양액 중에서 부유 배양하여 세포괴를 얻는 공정,
공정 (2b): 공정 (2a)에서 얻어진 세포괴를, TGFβ 시그널 저해제 또는 Wnt 시그널 전달 저해제를 실질적으로 포함하지 않는 배양액 중에서 부유 배양하여 대뇌 오가노이드를 얻는 공정.
바람직한 배양보조세포의 비존재 하에, 다능성 줄기세포로부터 대뇌 피질 세포괴, 또한 고순도 대뇌 피질 세포괴를 제조하는 방법은 하기의 공정을 포함한다.
공정 (i): 공정 (2)를 포함하는 방법 또는 공정 (1) 및 공정 (2)를 포함하는 방법에 의해 대뇌 오가노이드를 얻는 공정,
공정 (ii): 공정 (i)에서 얻어진 대뇌 오가노이드를, Notch 시그널 저해제(DAPT 등)를 포함하는 배양액 중에서 배양하여 대뇌 피질 세포괴를 얻는 공정,
공정 (iii): 공정 (ii)를 거친 세포 배양물을, 단세포 또는 2~5개의 세포 집합체로까지 분산시키는 공정,
공정 (iv): 공정 (iii)에서 얻어진 세포를, 1 이상의 신경 영양 인자, 아스코브산 및 cAMP 활성화제를 포함하는 배양액 중에서 배양하여, 고순도 대뇌 피질 세포괴를 얻는 공정.
또한, 공정 (iii)을 스킵하고 공정 (ii)를 거친 세포 배양물을 공정 (iv)의 배양액 중에서 배양하여도 고순도 대뇌 피질 세포괴를 얻을 수 있다.
<실시예 7> 신경 분화 준비 있음으로 유도한 오가노이드에 대한 DAPT의 효과의 검토
-7일차~35일차까지는, 실시예 1의 도 3의 스킴과 동일한 방법으로 배양하였다. '신경 분화 준비 있음'(공정 (1) 있음)에서는, 공정 (1)에 StemFit의 C액 비첨가 배지(=bFGF 불함유 배지)에 5μM SB431542를 첨가한 것을 사용하고, '신경 분화 준비 없음(공정 (1) 없음)에서는 StemFit 배지를 이용하였다. 그 후, 실시예 4의 공정 (ii)에 기재된 방법으로 대뇌 피질 세포괴를 유도하고, 면역 염색으로 평가를 행하였다. 또한, 실시예 4의 공정 (iii), 공정 (iv)에 기재된 방법으로 단세포로 분산 후, 재응집하여, 고밀도 대뇌 피질 세포괴를 유도하고, 플로우 사이토메트리로 해석을 행하였다.
면역 염색의 대표적인 공초점 형광 현미경 화상을 도 22에 나타낸다. 신경 분화 준비를 행하지 않은 경우에도, 저효율이었지만, Pax6 양성의 신경 상피와 그의 외측에 Ctip2 양성의 피질 제V/VI층의 신경세포층을 구비한 대뇌 피질 유사 구조가 형성되었다. 이 오가노이드를 DAPT 처리한 바, 신경 분화 준비 시와 마찬가지로 Ctip2 양성의 세포가 세포괴 전체에서 보이게 되었다.
플로우 사이토메트리의 해석 결과를 도 23에 나타낸다. 도 23으로부터, 신경 분화 준비 없음의 경우에도, Ctip2·βTubIII 이중 양성 세포의 비율(왼쪽 패널)은 DAPT 처리에 의해 22.5%에서 85.9%로까지 증가하였다. 또한 Pax6·Ki67 이중 양성의 신경 줄기세포(방사상 글리어)의 비율(가운데 패널)은 DAPT 처리에 의해 59.5%에서 1.9%로까지 감소하였다. 또한, 증식성 세포인 Pax6 양성/Sox1 양성/Ki67 양성 세포의 비율(오른쪽 패널)은, DAPT 처리에 의해 14.5%에서 0%로까지 감소하였다.
따라서, 신경 분화 준비의 유무에 관계없이, 대뇌 피질 세포괴에서는 대뇌 피질 유사 구조뿐만 아니라 신경 상피가 소실되어, Ctip2·βTubIII 이중 양성의 피질 제V/VI층의 신경세포가 내부에 넓게 분포하는 것, 증식성 세포는 감소하는 것이 밝혀졌다. 즉, 실시예 7에 기초하여, 배양보조세포의 비존재 하에, 다능성 줄기세포로부터 대뇌 오가노이드를 제조하는 방법의 상기 공정 (1)을 생략하여도, 대뇌 피질 세포괴 및 고밀도 대뇌 피질 세포괴를 제작할 수 있는 것을 알 수 있었다.
<실시예 8> DAPT 처리의 시기 및 방법의 최적화 검토
8-1. 오가노이드 DAPT법 및 싱글셀 DAPT법 (1)
-7일차~35일차까지는 실시예 1과 동일한 방법으로 배양하였다. 공정 (1)에는, StemFit의 C액 비첨가 배지(=bFGF 불함유 배지)에 5μM SB431542를 첨가한 것을 사용하였다.
도 24의 (A) '오가노이드 DAPT법(공정 (ii)에서 DAPT 처리를 행하는 경우)'에서는, 분화 유도 개시 후 35일째에 대뇌 오가노이드를 선별하고, 배지를 공정 (2b)의 배지에 10μM DAPT를 첨가한 것으로 치환하여 37℃, 5% CO2 하에서 3일간 부유 배양하였다. 이로 인해 얻어진 대뇌 피질 세포괴를 실시예 4에서의 공정 (iii), 공정 (iv)에 기재된 방법으로 단세포로 분산 후, 재응집하여, 고순도 대뇌 피질 세포괴가 얻어졌다.
도 24의 (B) '싱글 셀 DAPT법(공정 (iv)에서 DAPT 처리를 행하는 경우)'에서는 분화 유도 개시 후 38일째에 대뇌 오가노이드를 선별하고, 실시예 4의 공정 (iii)에 기재된 방법으로 단세포로 분산시킨 후, 당해 세포를 공정 (2b)의 배지에 10ng/mL GDNF, 20ng/mL BDNF, 200μM Ascorbic Acid, 400μM 디부티릴-cAMP, 30μM Y-27632를 첨가한 배지에, DAPT를 0μM, 0.1μM, 1μM 또는 10μM의 농도로 첨가하여 현탁시켰다. 다음으로, DAPT 존재 하에서, 실시예 4의 공정 (iv)에 기재된 방법으로 재응집하여 1일간, 2일간 또는 3일간 배양하였다. 그 후, 배지를, 공정 (2b)의 배지에 10ng/mL GDNF, 20ng/mL BDNF, 200μM 아스코브산, 400μM 디부티릴-cAMP를 첨가한 배지로 전환하고, 재응집 개시로부터 10일째까지 배양을 계속하였다. 재응집 개시로부터 3일째, 4일째 또는 10일째의 세포를 RT-qPCR에 의해, 10일째의 세포를 플로우 사이토메트리에 의해 각각 해석하여 결과를 도 25∼27에 나타낸다.
싱글 셀 DAPT법(공정 (iv)에서 DAPT 처리를 행하는 방법)에서, DAPT 농도를 10μM, DAPT 처리 기간을 1일간, 2일간, 3일간으로 하였을 때의 각 마커의 경시적 유전자 발현량을 RT-qPCR로 해석하였을 때의 결과를 도 25에 나타낸다. 도 25 중, '일'은 공정 (iv)의 일수를, '농도'는 DAPT의 농도를, '처리'는 DAPT 처리의 일수를 나타낸다.
도 25로부터, Notch 시그널 하류에서 발현이 활성화되는 Hes1은, DAPT 처리 직후에는 DAPT 처리 기간에 관계없이 발현 저하하였지만, DAPT 처리 1일간, 2일간의 경우에는 공정 (iv)의 배양에 따라 발현이 다시 상승한 것을 알 수 있었다. 한편, DAPT 처리 3일간의 경우에는, Hes1의 발현은 10일간에 걸쳐 억제되어 있었다. 이 때, 증식성의 마커인 Ki67의 발현, 신경 줄기세포의 마커인 Pax6의 발현도 낮게 억제되어 있었다. 한편, 신경 성숙의 마커인 Map2의 발현이나, 피질 제V/VI층의 신경세포층의 마커인 Ctip2의 발현은, 공정 (iv)의 배양에 따라 상승하였다. 따라서, 적어도 3일간 DAPT 처리를 행함으로써, 증식성의 신경 줄기세포의 증식을 억제할 수 있으며 피질 제V/VI층의 신경의 비율이 상승하는 것을 알 수 있었다.
싱글 셀 DAPT법(공정 (iv)에서 DAPT 처리를 행하는 방법)에서, DAPT 농도를 0μM, 0.1μM, 1μM, 10μM, DAPT 처리 기간을 3일간으로 하였을 때의, 각 마커의 경시적 유전자 발현량 RT-qPCR로 해석한 때의 결과를 도 26에 나타낸다. 비교 대상으로서, 공정 (ii)에서, DAPT 농도 10μM, DAPT 처리 기간 3일간 처리를 행한 경우도 나타낸다(오가노이드 DAPT법). 도 26 중, '일'은 공정 (iv)의 일수를, '농도'는 DAPT의 농도를 나타낸다.
도 26으로부터, Notch 시그널 하류에서 발현이 활성화되는 Hes1은, DAPT 처리 농도가 0.1∼1μM에서는 충분히 억제되지 않았던 것에 비해, 10μM에서는 10일간에 걸쳐 억제된 것을 알 수 있었다. 이때, 증식성 마커인 Ki67, 신경 줄기세포 마커 Pax6의 발현도, 10일간에 걸쳐 억제되었다. 한편, 신경 성숙의 마커인 Map2의 발현, 피질 제V/VI층의 신경세포층의 마커인 Ctip2의 발현은, 공정 (iv)의 배양에 따라 상승하였다. 따라서, 공정 (iv)에서 DAPT 처리를 행한 경우에는, 10μM에서 3일간 DAPT 처리를 행함으로써, 증식성의 신경 줄기세포의 증식을 억제할 수 있어, 피질 제V/VI층의 신경의 비율이 상승하는 것, 공정 (ii)에서, DAPT 처리를 행한 경우에 비하여 동등하거나, 그것 이상의 효과를 얻을 수 있는 것을 알 수 있었다.
공정 (iv)에서 DAPT 처리를 행하는 경우에서, DAPT 농도를 0μM, 0.1μM, 1μM, 10μM, DAPT 처리 기간을 3일간으로 하고, 공정 (iv)에서 10일간 배양을 행하였을 때의 각 마커의 발현량을 플로우 사이토메트리로 해석한 때의 결과를 도 27에 나타낸다. 비교 대상으로서, 공정 (ii)에서 DAPT 농도 10μM, DAPT 처리 기간 3일간 처리를 행한 경우도 나타낸다(오가노이드 DAPT법).
도 27로부터, 공정 (iv)에서 DAPT 처리를 행한 경우의, Ctip2·βTubIII(Tuj1) 이중 양성 세포의 비율(상단 패널)은, DAPT 처리 농도의 상승에 따라, 32.2%에서 89.6%로까지 증가한 것을 알 수 있었다. 또한, 증식성 세포인 Pax6 양성/Sox1 양성/Ki67 양성 세포의 비율(하단 패널)은, DAPT 처리에 의해 35.0%에서 0.8%로까지 감소하였다. 따라서, 공정 (iv)에서 DAPT 처리를 행한 경우에도, 공정 (ii)에서 행한 경우와 마찬가지로, DAPT 처리 농도의 상승에 따라 Ctip2·βTubIII 이중 양성의 피질 제V/VI층의 신경세포의 비율이 상승하여, 증식성 세포는 감소하는 것이 밝혀졌다.
8-2. 싱글 셀 DAPT법(2)
도 28에 나타내는 방법 스킴에 따라, 분화 유도 5주째의 대뇌 오가노이드를 공정 (ii)에서 단세포로 분산 후, 공정 (iii)에서 10μM의 DAPT로 3일간 처리를 행하였다. 그 후, DAPT를 포함하지 않는 배지 조건 하에서, 4일간(DAPT 제거 후 1일) 및 14일간(DAPT 제거 후 11일) 배양을 계속하여, 얻어진 세포괴에 대하여 플로우 사이토메트리로 마커 발현을 해석하였다. 해석의 결과를 도 29에 나타낸다.
DAPT 처리 후의 배양 기간을 연장하면, Ctip2/Tuj1 공-양성 세포의 비율은 상승하였다(4단째의 왼쪽 패널). 한편, 증식성 신경 전구 세포의 마커인 Pax6, Ki67 이중 양성 세포의 비율(4단째의 가운데 패널) 및 Pax6, Ki67, Sox1 삼중 양성 세포의 비율(4단째의 오른쪽 패널)은, DAPT 처리 후의 배양 기간에 따라 저하되었다. 도 16의 (B) 및 도 29로부터, DAPT 처리 후의 배양 기간에 따라 신경의 분화 성숙이 진행되어, 증식성 세포의 비율이 저하되는 것이 밝혀졌다.
<실시예 9> 오가노이드의 형태 및 발현 프로파일의 해석
9-1. 오가노이드의 형태 해석
-7일차~35일차까지 실시예 1과 동일한 방법으로 배양하였다. 12회의 유도 분화 로트(Lot1~Lot12)에서 얻어진 대뇌 오가노이드의 명시 야상을 도립 현미경(레이카 DMS1000)을 이용하여 촬영하고, 대표적인 명시 야상을 도 30에 나타낸다(스케일 바: 5mm). 도 30으로부터, 로트에 따라 유도되는 오가노이드의 형태에 차이가 있는 것을 알 수 있었다.
상기 12회의 분화 유도로 얻어진 대뇌 오가노이드를 관찰한 결과, 7개의 형태학적인 그룹, 즉 로제트 구조를 세포괴 전체에 포함하는 대뇌 오가노이드(로제트 구조; Rosette), 투명도가 낮고 명료한 구조가 인정되지 않는 오가노이드(감자상 조직; Potato-like), 풍선상의 구조가 부수된 오가노이드(풍선상 조직; Balloon), 섬유상의 구조가 부수된 오가노이드(면상 조직; cotton-like), 투명도가 높고 내부에 낭포상의 구조가 보이는 오가노이드(투명성 조직; transparent), 흑색 또는 갈색의 색소 침착이 보이는 오가노이드(색소; pigment), 투명도가 높고 명료한 구조가 보이지 않는 오가노이드(젤리상 조직; Jelly-like)으로 분류할 수 있다고 생각되었다(도 31). 상기 형태 분류에 따라 통계낸 결과를 도 32, 표 5에 나타낸다.
[표 5]
표 5에는 각 형태의 오가노이드의 비율을 표로 나타낸다. 1개의 오가노이드 중에 포함되는 형태의 종류에 의해 오가노이드를 분류하였다. 위로부터 1~7행째에, 각 열은 개개의 오가노이드에 포함되는 형태를 나타낸다. 아래로부터 1~12행째는, 12 회의 분화 유도 로트로 유도된 오가노이드를 형태에 따라 분류한 결과를 나타낸다. 표 5 중의 수치는, 로트 내의 전 오가노이드 중에서 각 형태의 오가노이드가 차지하는 비율을 백분율로 나타낸 것이며, 색의 농담은 수치의 크기에 대응한다. 도 32에는 각 형태의 오가노이드의 비율을 봉 그래프로 나타낸다.
발생하는 오가노이드 그룹의 비율은 분화 로트에 따라 크게 상이하며, '로제트 구조', '풍선상 조직 또는 면상 조직', '투명성 조직'이 함께 포함되는 로트, 대부분이 '풍선상 조직 또는 면상 조직'인 로트, 대부분이 '감자상 조직'인 로트가 보였다(도 32, 표 5). 이와 같이, 분화 유도회에 의해 발생하는 오가노이드 타입의 비율은 로트에 따라 변화하는 것을 알 수 있었다. 또한, 오가노이드에 따라서는 상술한 7개의 형태 분류의 복수에 속하는 특징을 함께 갖고 있었다. 또한, 이들 오가노이드는 확대하여 관찰함으로써 육안으로 선별 가능하다.
9-2. 각 형태 그룹의 오가노이드의 싱글 셀 유전자 발현 해석
각 형태 그룹의 오가노이드에 포함되는 세포종을 동정하기 위하여, 싱글 셀 유전자 발현 해석을 행하였다. 해석에는, 3회의 분화 유도회에서 얻어진 9개의 오가노이드(도 33)를 이용하였다. 각 오가노이드에 포함되는 조직의 형태를 각 사진의 상부에 나타낸다. 싱글 셀 유전자 발현 해석은, 이하와 같이 행하였다.
우선, 오가노이드로부터 싱글 셀의 현탁액을 조제하기 위하여, 신경세포용 분산액(후지필름 와코쥰야쿠 주식회사)을 이용하여, 추천 조건에 따라 오가노이드를 단세포로 분리하였다. 분산된 세포를, 10%(v/v) KSR 및 10μM Y-27632(후지필름 와코쥰야쿠)를 첨가한 HBSS로, 1,000세포/μL의 밀도로 재현탁시켰다. 채널당 약 4,670개의 세포를 ChromiumNextGEM Chip G(2000177 10X 제노믹스(Genomics))에 로드하고, 크롬 컨트롤러로 처리하여 에멀젼 내 겔 비즈(Gel Beads-in-Emulsion(GEM))를 취득하였다. 라이브러리는 Chromium Next GEM Single Cell 3'Reagent Kits v3.1(1000121; 10x 제노믹스)을 사용하여 제조원의 프로토콜(CG000204 Rev C)에 따라 제작하였다. 라이브러리의 배열은 Novaseq 6000(일루미나(Illumina)에 따라 분석하였다.
싱글 셀 RNA-seq의 배열의 맵팅에는 셀 랭거 파이프라인(Ｃｅｌｌ　Ｒａｎｇｅｒ　ｐｉｐｅｌｉｎｅ)을 이용하였다. 참조 게놈 배열로서는, GRCh38 인간 게놈 배열을 이용하였다. 차세대 시퀀서에서의 해석으로 얻어진 UMI 카운트 값은, 세우래쓰 알 패키지(Ｓｅｕｒａｔ　Ｒ　ｐａｃｋａｇｅ)를 이용하여 해석하였다. 우선 각각의 오가노이드의 데이터를 로그-정규화(Log-Normalise)법으로 표준화한 후, 모든 오가노이드의 데이터를 통합하였다. 다음으로 세포간의 변화가 큰 상위 2000 유전자를 추출하고, 이들 유전자의 데이터를 이용하여 주성분 분석(Principal component analysis(PCA))를 행하여 상위 50개의 주성분(제1 주성분~제50 주성분)을 취득하였다. 또한, 3회의 분화 유도 로트의 오가노이드를 동시에 해석하기 위하여, 하모니(Harmony)법을 이용하여 배치 효과 보정을 실시한 후, UMAP(Uniform Manifold Approximation and Projection)법에 의한 차원 삭감을 행하고 2차원의 데이터로 변환하였다. 그 후, 공유된 최근접 이웃 그래프(Shared nearest neighbor graph)에 기초한 클러스터링을 행하고, 모든 세포를 클러스터로 분류하였다. 또한 각 클러스터에 특징적으로 발현하는 유전자군을 기초로 각 클러스터를 구성하는 세포종을 동정하였다.
개개의 세포의 유전자 발현의 유사성이나 상이성을 UMAP법에 의해 얻어진 2차원 데이터를 시각화함으로써 평가하였다. 구체적으로는, 상기 PCA에 의해, 수만개의 세포는 각각 그의 유전자 발현 데이터에 기초한 50차원의 데이터(주성분)에 의해 표현되어 있지만, UMAP법에 의해 유사성이나 상이성을 유지하면서 2차원의 데이터로 압축되어 평면 위의 플롯으로 변환된다. UMAP법에 의해 얻어진 플롯에서는, 각각의 점은 개개의 세포를 나타내며, 유전자 발현 패턴이 유사한 세포일수록 가까운 위치에 플롯된다. 유사성이 특히 큰 세포가 다수 존재하면 그들의 점이 매우 가까이 모인 덩어리상의 구조가 나타난다. 이와 같은 구조를 구성하는 세포군은 매우 유사한 유전자 발현을 나타내는 세포, 즉 동종 또는 매우 근연의 세포종으로 해석된다(Nature Biotechnology volume 37, pages 38-44(2019)).
도 34 및 35에는, 해석한 9개의 오가노이드에 포함되는 세포를 싱글 셀 RNA-seq 해석의 데이터를 UMAP법에 의해 표시한 결과를 나타낸다. 도 34로부터, 9개의 오가노이드에 포함되는 세포는 10개 이상의 상이한 클러스터로 나누어지고, 10종 이상의 특징적인 유전자 발현 패턴을 나타내는 세포 집단이 포함되어 있는 것으로 생각되었다. 또한, 오가노이드에 의해 플롯의 패턴이 상이하여(도 35), 오가노이드에 의해 포함되는 세포종이 상이하다고 생각되었다.
각 클러스터에 포함되는 세포종을 동정하기 위하여 최근접 이웃(Nearest Neighbours)법에 의해 통계학적으로 14개의 클러스터로 분류하였다. 각 클러스터에 특징적으로 발현하는 유전자를 발현 세포의 비율과 평균 발현량을 기초로 추출하여 표 6에 나타낸다. 표 6의 각 세포에서의 유전자는, 위에서부터 순서대로 상위 50개를 기재하고 있다. 또한, 문헌 정보를 기초로, 세포종의 어노테이션을 행하고, 각 클러스터의 유전자 발현에 기초하여 각 클러스터의 세포종을 동정하였다(도 36). 각 점은 개개의 세포를 나타내고, 점의 농담은 클러스터를 나타낸다. 각각의 세포종은, 대뇌 피질 뉴런(Cortical Neuron(방사상 글리어(RG))): 대뇌 피질 신경 전구 세포(방사상 글리아), 대뇌 피질 뉴런(CR): 카할 레티우스 세포(Cajal Retzius cell(CR)), 대뇌 피질 뉴런(글루타메이트성 뉴런(Glutamatergic neuron(GN))): 대뇌 피질 신경세포(글루탐산 작동성 신경(글루타메이트성 뉴런(GN))), GABA 작동성 뉴런(GABAergic neuron): GABA 작동성 신경세포, 맥락총(Choroid plexus(ChP)): 맥락총, CNS 섬유아세포: 중추신경계 섬유아세포, 신경제세포(Neural Crest): 신경제세포, 혈관 내피 세포(Vascular Endothelial cells): 혈관 내피 세포, 미측 신경세포(Caudal Neuron): 미측 신경세포인 것으로 생각된다.
[표 6]
□ 도 37 및 38은 싱글 셀 유전자 발현 데이터에서 각 클러스터에 특징적인 유전자, 기지의 마커 유전자의 발현 프로파일을 도트 플롯으로 나타낸다. 종축은 클러스터를, 횡축은 유전자를 나타낸다. 원의 크기는 클러스터 내의 모든 세포에 대한 발현 세포의 비율을 백분율로 나타낸다. 색의 농담은 클러스터 내의 세포의 유전자 발현량의 평균값을 나타낸다.
MAP2와 TUBB3은 신경세포의 마커로서 해석하였다. KRT19와 KRT8은 상피계 세포의 마커로서 해석하였다. MKI67과 TOP2A는 증식성 세포의 마커로서 해석하였다. PAX6, SOX2, HES1은 방사상 글리어(Radial Glia(RG))의 마커로서 해석하였다. EMX1은 전뇌 배측 영역의 마커로서 해석하였다. NEUROD6과 SLC17A7은 글루탐산 작동성 신경의 마커로서 해석하였다. SSTR3은 소마토스타틴 수용체이며 글루탐산 작동성 신경에서도 발현이 보이는 것이 알려져 있다. TBR1과 BCL11B는 대뇌 피질 제V층과 제6층의 전구체인 Deep Layer의 마커로서 해석하였다. RELN은 카할 레티우스 세포의 마커로서 해석하였다. ASCL1, DLX1, DLX2, DLX5, DLX6은 GABA 작동성 신경의 분화 과정에서 발현이 보이는 마커로서 해석하였다. GAD2는 GABA 작동성 신경의 마커로서 해석하였다. SST와 TAC1은 GABA 작동성 신경의 서브 타입에서 발현이 보이는 마커로 해석하였다. TTR, RSPO3, CLIC6, HTR2C, TRPM3은 맥락총의 발생 과정에서 발현이 보이는 마커로서 해석하였다. COL1A1은 CNS 섬유아세포의 마커로서 해석하였다. DCN, LUM, DLK1은 스트로마 세포에서 발현하는 유전자이다. AQP1은 맥락총이나 지주막 과립에서 발현하는 것이 보고되어 있다. OTX2, EMX2는 영역 특이적인 마커로, 종뇌형의 맥락총에서 발현하는 것이 알려져 있다. HOXA5, HOXB5는 미측의 신경 마커로서 해석하였다. ZIC1, MSX1, LGALS1, TWIST1, PRRX1, GPC3, SOX10, TFAP2A는 신경제세포(Neural Crest)의 분화 과정에서 발현이 보이는 마커로서 해석하였다. 그 중 LGALS1, TWIST1, PRRX1, GPC3은 상피간엽이행(Epithelial-Mesenchymal transition(EMT))에 관여하는 유전자이며, SOX10, TFAP2A는 성숙한 신경제세포(Neural Crest)으로 발현하는 마커이다. PECAM1, KDR, FLT1, ICAM2는 혈관 내피 세포의 마커로서 해석하였다.
해석 대상으로 하는 유전자의 선출에서는, 우선, "피질 뉴런(GN)"의 클러스터에서 다른 클러스터에 비해, 발현하는 세포의 비율이 2배 이상 높은 유전자를 선출하였다. 다음으로, "피질 뉴런(GN)"의 클러스터에서 다른 클러스터에 비해 발현량의 평균값의 폴드 체인지(Fold Change)가 큰 것으로부터 50 유전자를 선출하였다. 마지막으로, DAPT 처리 전의 대뇌 오가노이드와 DAPT 처리 후의 대뇌 피질 세포괴, 각각 3로트의 싱글 셀 유전자 발현 해석에서, 모든 로트에서 발현이 검출되는 46 유전자를 해석의 대상으로 하였다.
대뇌 피질 신경세포(피질 뉴런)의 클러스터는 전뇌의 마커인 EMX1을 발현하고 있었다. 그 중, '방사상 글리어(RG)'는 LHX2, 방사상 글리어의 제어에 필수 유전자인 SOX2, PAX6을 발현하고 있었다. "글루타메이트성 뉴런(GN)"은 심층 뉴런(deep layer neuron), 피라미드성 뉴런(pyramidal neuron)에 특징적인 전사 인자인 TBR1(Robert F. Hevner, Tbr1 Regulates Differentiation of the Preplate and Layer 6, Neuron, 2001), NEUROD6(Tutukova S et al., The Role of Neurod Genes in Brain Development, Function, and Disease, Frontiers in Molecular Neuroscience, 2021), 글루탐산 트랜스포터의 SLC17A7(VGluT1), BCL11B(Ctip2)를 발현하고 있었다. 또한 "카할 레티우스 세포(CR)"는 카할 레티우스 세포의 마커 유전자인 RELN, TBR1 등을 발현하고 있었다.
GABA 작동성 신경세포의 클러스터는 글루타메이트 디카복실라제(Glutamate decarboxylase)의 GAD2를 공통적으로 발현하고 있었다. 그 중, 'GABA 작동성 신경세포-1,2'의 클러스터에서는 증식성 마커인 MKI67(Ki67), 분화 조기(VZ)에서 발현이 보이는 ASCL1의 발현이 높게 인정되었다. 'GABA 작동성 신경세포-3'의 클러스터에서는 분화 중반 이후(SVZ)에서 발현이 보이는 DLX5, DLX6이 발현하고 있었다.
맥락총의 클러스터에서는 맥락총 상피의 마커인 TTR(트랜스티레틴)을 높게 발현하고 있었다. 맥락총에는 종뇌형과 후뇌형이 존재하는데, EMX2, BMP7과도 공발현하고 있으므로, 대뇌 피질에 부수되는 종뇌형 맥락총이라고 생각되었다.
CNS 섬유아세포의 클러스터에서는 중추 신경에 부수되는 섬유아세포의 마커인 COL1A1이 높게 발현하고 있었다. 동시에, AQP1 등의 발현도 인정되었기 때문에, 이들 세포의 일부는 맥락총에 부수되는 섬유아세포일 가능성이 생각된다.
신경제세포(Neural Crest)의 클러스터에서는 신경제세포(Neural crest cell)(NCC)의 분화 과정에서 발현이 인정되는 다양한 유전자의 발현이 인정되었다(Simoes-Costa M et al., Establishing neural crest identity: a gene regulatory recipe, Development, 2015). "신경제세포-1"의 클러스터에서는 NCC의 기원인 신경판 경계(Neural Plate Border)에서 발현이 보이는 ZIC 유전자군, Msx1 등의 발현이 인정되었다. "신경제세포(Neural crest)-2"의 클러스터에서는, NCC로의 분화 초기에 발현이 보이는 Smad 시그널 하류의 ID 유전자군이나 상피간엽이행(EMT) 관련 유전자(LGALS1, TWIST1, PRRX1, GPC3(Fazilaty H et al.., A gene regulatory network to control EMT programs in development and disease, 2019)의 발현이 보였다. "신경제세포(Neural crest)-3"에서는 NCC의 이주(Migration)기에 발현하는 SOX10, TFAP2A 등의 발현이 보였다.
내피 세포의 클러스터에서는 KDR(VEGFR-2), PECAM1, FLT1, ICAM2를 비롯한 다수의 vascular endothelial cell의 마커가 발현하고 있었다(Gonchalov et al., Markers and Biomarkers of Endothelium: When Something Is Rotten in the State, Oxidative Medicine and Cellular Longevity, 2017).
미측 신경세포의 클러스터에서는 뉴런의 마커인 TUBB3 외에, 미측의 영역화를 제어하는 HOXA5, HOXB5를 비롯한 다수의 HOX 유전자의 발현이 인정되었다.
9개의 오가노이드에서의 각 세포종의 비율을 도 39의 (A)에 나타내고, 또한, 신경제세포(Neural crest) 중, 각 분화 스테이지에서의 신경제세포의 비율을 도 39의 (B)에 나타낸다. 색소 세포를 포함하는 Organoid 9는 다른 오가노이드에 비하여 신경제세포(Neural Crest)의 비율이 높았다. 그 중에서도, EMT와 관련된 유전자군을 발현하는 세포 집단인 "신경과(Neural Crest)-2"의 비율이 높으며, 활발하게 이동하는 신경제세포(Neural Crest)가 많이 포함되는 것을 알 수 있었다.
9-3. 면역 염색에 의한 각 마커의 발현 해석
각 그룹의 오가노이드에 대하여, 대표적인 마커 단백질의 면역 염색을 행하였다. 결과를 도 40에 나타낸다.
전뇌의 마커인 EMX1은 로제트 구조가 보이는 영역(로제트)에서 특이적으로 발현이 보였다. GABA 작동성 신경세포의 마커인 GAD65(GAD2)는 '감자상 조직'의 영역에서 발현이 인정되었다. ECM 섬유아세포의 마커인 COL1A1은 풍선상 조직, 면상 조직, 색소의 주변 영역에서 발현이 인정되었다. 맥락총 특이적인 마커는 투명성 조직에서 발현하고 있었다. 멜라노사이트(Melanocyte) 마커인 TYR은 색소 침착이 보이는 오가노이드 '색소'에서 발현이 보였다. 이들 결과로부터, 싱글 셀 유전자 발현 해석에서 동정한 마커는 각각 특징적인 구조를 갖는 영역에 확실히 발현하는 것이 확인되었다.
9-4. RT-qPCR에 의한 각 마커 유전자의 발현 해석
-7일차~35일차까지 실시예 1과 동일한 방법으로 배양하였다. 각 그룹에 대하여 3개의 오가노이드를 취득하고, 도립 현미경(레이카 DMS1000)을 이용하여 명시 야상을 촬영하였다(도 41). 각 오가노이드에 대하여 RT-qPCR법으로 마커 유전자의 발현을 해석하였다. 해석 결과를 도 42 및 도 43에 나타낸다.
대뇌 피질 신경세포(피질 뉴런)의 마커로서 동정한 VGluT1, EMX1은 로제트의 오가노이드에서 발현이 인정되었다. GABA 작동성 신경세포의 마커로서 동정한 DLX2, GAD2는 감자상(Potato-like)의 오가노이드에서 높은 발현이 인정되었다. 멜라노사이트의 마커인 TYR은 색소의 오가노이드에서 높은 발현이 보였다. CNS 섬유아세포의 마커인 COL1A1은 풍선상 조직과 면상 조직에서 발현이 보였다. 미측 뉴런의 마커인 HOXA2는 젤리상 조직에서 발현이 보였다.
9-5. 싱글 셀 유전자 발현 해석에 의한 대뇌 오가노이드 및 대뇌 피질 세포괴의 해석
-7일차~35일차까지 실시예 1과 동일한 방법으로 배양하였다. 3회의 분화 유도회에서 얻어진 오가노이드로부터, 로제트의 오가노이드를 육안으로 선별하였다. 그 후, 실시예 4의 공정 (ii)에 기재된 방법으로, 대뇌 오가노이드를 DAPT로 3일간 처리하여 대뇌 피질 세포괴를 유도하였다("DAPT+"). 대조군으로서, 공정 (ii)에서 DAPT 비첨가의 군을 작성하였다(대뇌 오가노이드: "DAPT-").
이들 세포를 이용하여, 9-2와 동일한 방법으로 싱글 셀 유전자 발현 해석을 행하였다.
각 분화 유도회(Lot1, Lot2, Lot3)의 로제트의 오가노이드의 형태를 도립 현미경으로 관찰하여 대표적인 명시 야상을 도 44의 (A)에 나타낸다. 싱글 셀 유전자 발현 해석의 UMAP의 플롯을 도 44의 (B)에 나타낸다.(로제트 Lot1, 로제트 Lot2, 로제트 Lot3)
DAPT 조건에서 얻어지는 오가노이드(대뇌 오가노이드)는 2개의 클러스터로 나뉘어, 2종류의 세포 집단이 포함되어 있는 것을 알 수 있었다(도 44의 (B)). DAPT+ 조건에서 얻어지는 오가노이드(대뇌 피질 세포괴)는 1개의 클러스터로 집약되어, 1종류의 세포 집단에 의해 구성되는 것을 알 수 있었다. 3회의 제조 로트의 세포는, 분포가 겹쳐져있었기 때문에, 제조 횟수에 의한 차는 작고, 재현성 좋으며, 동양(同樣)의 세포 집단이 얻어져 있는 것을 알 수 있었다.
또한, 상기의 오가노이드에 대하여, 추가로 상기 동정한 마커 유전자의 발현을 해석하였다(도 45). 대뇌 오가노이드(DAPT-)는 2개의 클러스터로 나뉘어, 우측의 클러스터에서는 글루탐산 작동성 뉴런의 마커인, SLC17A7 및 NEUROD6, 및 심층 뉴런(Deep Layer Neuron)의 마커인 Ctip2가 높게 발현하고 있어, 글루타메이트성 뉴런이나 그의 전구 세포가 포함되어 있다고 생각되었다. 좌측의 클러스터에서는, 방사상 글리어의 마커인 PAX6이나 MKI67이 높게 발현하고 있어, 증식성이 높은 방사상 글리어인 것으로 생각되었다. 상위 뉴런(Upper Neuron)의 마커인 Satb2는 거의 발현이 보이지 않으며 대부분이 대뇌 피질 제V층, VI층의 전구 세포인 것으로 생각되었다. 또한, 금회 동정한 목적 외 세포의 마커인 TTR, COL1A1, TYR 및 PECAM1은 거의 검출되지 않았다. 이로 인해, 형태에서 로제트 구조를 전체로 갖는 오가노이드를 선별, 또는 다른 형태의 오가노이드를 배제함으로써 대뇌 피질의 세포를 얻을 수 있어, 목적 외 세포의 혼입을 저감할 수 있는 것을 알 수 있었다.
또한 대뇌 피질 세포괴(DAPT+)에서는, 1개의 클러스터에 집약되어 SLC17A7(VGluT1), NEUROD6 및 Ctip2는 발현하고 있지만, 목적 외 세포의 마커인 Pax6 및 MKI67을 발현하는 세포 집단이 대폭으로 감소하였다. 또한, TTR, COL1A1, TYR 및 PECAM1은 거의 검출되지 않았다. 이로 인해, DAPT 처리를 행함으로써 순도가 높은 글루타민 작동성 신경세포를 포함하는 대뇌 피질 세포괴가 얻어지는 것을 알 수 있었다.
표 6에 기재된 각각의 유전자는, 대뇌 피질 신경 전구 세포(넓은 의미로는 대뇌 피질 신경세포에 포함되지만, 방사상 글리어, 방사상 글리어(RG)에 상당함), 대뇌 피질 신경세포(글루탐산 작동성 신경(GN) 및 카할 레티우스 세포(CR)를 포함함), GABA 작동성 신경세포, 맥락총(ChP), 중추 신경계 섬유아세포, 신경제세포, 혈관 내피 세포 또는 미측 신경세포 중 어느 하나의 마커로서도 이용할 수 있다.
또한, 대뇌 피질 신경 전구 세포, 대뇌 피질 신경세포(글루탐산 작동성 신경 및 카할 레티우스 세포를 포함함)의 마커는, 이들 세포가 대뇌 오가노이드에 포함되어 있기 때문에 대뇌 오가노이드의 마커로서 이용할 수 있다.
특히, 대뇌 피질 신경세포에 발현하는 유전자, 구체적으로는 글루탐산 작동성 신경 또는 카할 레티우스 세포에 발현하는 유전자는 본 발명의 대뇌 피질 세포괴나 본 발명의 고순도 대뇌 피질 세포괴의 마커로서 이용할 수 있다.
대뇌 피질 신경세포(방사상 글리어를 제외함)의 클러스터에 속하는 50개의 유전자(표 6) 중, 3 유전자(EOMES, SPINK5, EBF2)는 DAPT 처리 후의 오가노이드에서의 발현량이 적었기 때문에 나머지의 47개의 유전자가 본 발명의 대뇌 피질 세포괴 또는 본 발명의 고순도 대뇌 피질 세포괴의 마커로서 적합하다는 것을 알 수 있었다. 또한 이들 유전자 리스트 중, NEUROD6, NEUROD2, SSTR2, TBR1, NRXN1, BHLHE22, NEUROD1, NEUROG2, SLC17A7 및 EMX1은, 대뇌 피질이 발생하는 영역인 전뇌 배측 영역이나, 대뇌 피질의 제II층~제VI층의 예정 영역(피질판(Cortical Plate)), 글루탐산 작동성 신경세포에서 발현이 보이는 것이 알려져 있지만, 그밖의 37개의 유전자는 새롭게 대뇌 피질 신경세포의 마커로서 동정된 것이다.
즉, 본원에 규정하는 상기 대뇌 피질 세포괴나 고순도 대뇌 피질 세포괴가 목적 세포인 대뇌 피질 신경세포를 포함하는 것은, NEUROD6, NEUROD2, SSTR2, TBR1, ZBTB18, NHLH1, IGFBPL1, NRN1, RTN1, THSD7A, NRXN1, BHLHE22, CALB2, KHDRBS3, CCSAP, PDE1A, NEUROD1, NPTX1, NXPH4, NTS, NEUROG2, OLFM1, PRDM8, CORO2B, TP53I11, ZFPM2, PCDH9, NELL2, SRRM4, SCG3, DCC, EPB41L3, SLC17A7, ST18, NSG2, EMX1, CAP2, SYT4, NSMF, ANK3, MYT1L, FSTL5, CELF4, B3GAT1, EPHA5, NHLH2 및 DLL3으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개 또는 적어도 5개의 유전자를 발현하는지 여부, 또는 그의 발현량을 조사함으로써 평가할 수 있다. 보다 바람직하게는 SLC17A7, NEUROD6, EMX1을 발현하는지 여부, 또는 그의 발현량을 조사함으로써 평가할 수 있다.
또한, 표 6에 기재된 대뇌 피질 신경 전구 세포(방사상 글리어)(RG), GABA 작동성 신경세포(GABAergic neuron), 맥락총(Choroid plexus(ChP)), 중추 신경계 섬유아세포(CNS fibroblast), 신경제세포(Neural Crest), 혈관 내피 세포(Vascular Endothelial cells) 또는 미측 신경세포(Caudal Neuron)에 발현하는 유전자군(이하 목적 외 세포 유전자군이라고 함)은 본 발명의 대뇌 피질 세포괴 또는 고순도 대뇌 피질 세포괴에서의 목적 외 세포의 마커로서, 목적 외 세포가 기준 이하인 것을 조사하기 위하여 이용할 수 있는 것을 알 수 있었다.
즉, 본원에서 규정하는 상기 대뇌 피질 세포괴나 고순도 대뇌 피질 세포괴가 목적 외 세포를 포함하지 않거나 또는 목적 외 세포가 기준 이하인 것을 표 6에서의 목적 외 세포 유전자군으로부터 선택되는 적어도 1개, 적어도 2개 또는 적어도 3개의 유전자의 발현량이 실질적으로 발현하지 않거나 또는 기준 이하인 것을 지표로서 평가할 수 있다.
구체적으로는, 방사상 글리어의 마커로서 동정된 LHX2, SOX2 및 PAX6, GABA 작동성 신경세포의 마커로서 동정된 GAD2, DLX1, DLX2, DLX5 및 DLX6, 맥락총의 마커로서 동정된 TTR, TRPM3, 중추 신경계 섬유아세포의 마커로서 동정된 COL1A1, 신경제세포의 마커로서 동정된 ZIC 유전자군, Msx1, Smad 시그널 하류의 ID 유전자군, 상피간엽이행(Epithelial Mesenchymal Transition(EMT)) 관련 유전자(TWIST1, PRRX1, GPC3, Sox10 및 TFAP2), 혈관 내피 세포의 마커로서 동정된 KDR(VEGFR-2), PECAM1 및 CDH5(VE-카테린(Cadherin))를 비롯한 다수의 혈관 내피 세포의 마커, 및 미측 신경세포의 마커로서 동정된 TUBB3 외에, 미측의 영역화를 제어하는 다수의 HOX 유전자로부터 선택되는, 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 적어도 3개의 유전자의 발현량이 실질적으로 발현하지 않거나, 또는 기준 이하인 것을 지표로서 평가할 수 있다. 또한, 표 6에 기재된 마커의 사용 방법은 이들로 한정되지 않고, 용도에 따라 적절히 마커를 선택하여 발현을 측정함으로써, 다양한 목적으로 사용할 수 있다.
보다 바람직하게는 표 6에서의 GAD2, COL1A1, TYR, TTR 및 HOXA2로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 이상의 유전자를 실질적으로 발현하고 있지 않거나, 또는 기준값 이하이다.
본 발명에 규정하는 제조 방법에 의해 제작한 대뇌 오가노이드는, 반드시 용도가 한정되지는 않으며 이하와 같은 목적으로 이용하여도 된다.
<대뇌 용도(물질 스크리닝)>
저분자 화합물, 항체, 핵산, 그밖의 물질을 본 발명의 제조 방법으로 제작한 대뇌 오가노이드에 첨가하여 그의 영향을 조사하여도 된다. 즉, 저분자 화합물, 항체, 그밖의 물질의 영향, 독성 및 유용성을 밝힐 목적으로 대뇌 오가노이드를 이용할 수 있다. 이 경우, 대뇌 오가노이드에서 형성된 조직화된 신경세포, 조직화된 신경 네트워크의 영향을 조사할 수 있다. 특히 본 발명에 규정하는 대뇌 오가노이드의 제조 방법 및 선별 방법에 의해, 발현 프로파일 또는 형상 등 또는 조직 구성이 비교적 균일한 대뇌 오가노이드를 대량으로 작성하는 것이 가능하다. 이 때에, 대뇌 오가노이드의 품질을 객관적으로 평가하기 위하여, 상기 13에 기재된 대뇌 오가노이드의 품질 평가 방법을 이용하여도 된다. 이들 발현 프로파일 또는 형상 등 또는 조직 구성이 비교적 균일한 대뇌 오가노이드를 이용함으로써 용이하게 복수회의 시험을 행할 수 있어, 종래는 곤란했던 재현성을 용이하게 달성할 수 있다.
<대뇌 용도(질환 대뇌 오가노이드)>
또한, 특정의 유전자형 세포 유래의 다능성 줄기세포로부터 유도한 대뇌 오가노이드를 제작하고, 특정의 질환에 대하여 상기 물질 스크리닝을 적용하여도 된다. 이 경우, 상기 2에 기재된 대뇌 오가노이드의 제조 방법을 이용하여 대뇌 오가노이드를 제작할 때에, 유래하는 다능성 줄기세포의 성질에 따라 최적의 공정은 적절히 조정할 수 있다. 특히 통합 실조증, 양극성 장애, 자폐증 스펙트럼 장애, 알츠하이머병, 인지증, 소두증 등의 환자로부터 채취한 세포 유래의 다능성 줄기세포로부터 유도한 대뇌 오가노이드를 제작하여(정신 질환 대뇌 오가노이드), 약제의 효과를 조사하는 것 외에, 질환의 메카니즘의 해명에 이용하여도 된다. 보다 구체적으로는, 흥분성 신경세포인 글루탐산 작동성 신경 등, 억제성 신경세포인 GABA 작동성 신경 등, 클리어 세포 등을 건강한 사람과 비교하는 것이나 유전자 발현, 단백질 발현, 대사 상태, 전기 생리학적 성질 등의 세포 특성을 해석하는 것이 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> Kyoto University Sumitomo Pharma Co., Ltd. SUMITOMO CHEMICAL COMPANY, LIMITED <120> Method for Producing Cerebral Cortex Cell Preparation Derived from Human Pluripotent Stem Cell <130> FP22-0352-00 <150> US 63/211622 <151> 2021-06-17 <160> 22 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for POU5F1 <400> 1 agaccatctg ccgctttgag 20 <210> 2 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for POU5F1 <400> 2 gcaagggccg cagctt 16 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for NANOG <400> 3 ggctctgttt tgctatatcc cctaa 25 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for NANOG <400> 4 cattacgatg cagcaaatac gaga 24 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for BMP4 <400> 5 atgattcctg gtaaccgaat gc 22 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for BMP4 <400> 6 ccccgtctca ggtatcaaac t 21 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for NODAL <400> 7 tgagccaaca agaggatctg 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for NODAL <400> 8 tggaaaatct caatggcaag 20 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for TGFB1 <400> 9 tacctgaacc cgtgttgctc tc 22 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for TGFB1 <400> 10 gttgctgagg tatcgccagg aa 22 <210> 11 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for SOX1 <400> 11 gcggagctcg tcgcatt 17 <210> 12 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for SOX1 <400> 12 gcggtaacaa ctacaaaaaa cttgtaa 27 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for PAX6 <400> 13 ctggctagcg aaaagcaaca g 21 <210> 14 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for PAX6 <400> 14 cccgttcaac atccttagtt tatca 25 <210> 15 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for T (TBXT) <400> 15 atggaggaac ccggagaca 19 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for T (TBXT) <400> 16 tgaggatttg caggtggaca 20 <210> 17 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for SOX17 <400> 17 cgctttcatg gtgtgggcta aggacg 26 <210> 18 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for SOX17 <400> 18 tagttggggt ggtcctgcat gtgctg 26 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for hCGalpha <400> 19 accgccctga acacatcctg c 21 <210> 20 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for hCGalpha <400> 20 gcgtgcattc tgggcaatcc tgc 23 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for SOX2 <400> 21 gccgagtgga aacttttgtc g 21 <210> 22 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for SOX2 <400> 22 ggcagcgtgt acttatcctt ct 22

Claims (39)

  1. 배양보조세포의 비존재 하, 다능성 줄기세포로부터 대뇌 오가노이드를 제조하는 방법으로서,
    (1) 다능성 줄기세포를, bFGF가 실질적으로 포함되지 않고, 또한 TGFβ 시그널을 실질적으로 야기하지 않는 배양액 중에서 배양하는 공정과,
    (2) 공정 (1)에서 얻어진 세포를, 신경세포로 분화 유도하는 공정
    을 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    공정 (2)가,
    (2a) 공정 (1)에서 얻어진 세포를, TGFβ 시그널 저해제 및 Wnt 시그널 전달 저해제를 포함하는 배양액 중에서 부유 배양하여 세포괴를 얻는 공정과,
    (2b) 공정 (2a)에서 얻어진 세포괴를, TGFβ 시그널 저해제 및 Wnt 시그널 전달 저해제를 실질적으로 포함하지 않는 배양액 중에서 부유 배양하여, 대뇌 오가노이드를 얻는 공정
    을 포함하는, 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    공정 (2a)의 부유 배양이 정치 배양인, 방법.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서,
    공정 (2b)의 부유 배양이 진동 배양인, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    공정 (1)의 배양 기간이 3일간 미만인, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    공정 (1)의 배양 기간이 12시간 이상 2일간 이하인, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    공정 (1)의 배양액이, SB431542, A-83-01 및 XAV-939로 이루어지는 군으로부터 선택되는 TGFβ 시그널 저해제를 포함하는, 방법.
  8. 제2항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    공정 (1), 공정 (2a) 및 공정 (2b)에서의 배양액이, 무혈청 배양액인, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 다능성 줄기세포가, 인간 인공 다능성 줄기세포 또는 인간 배아 줄기세포인, 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    (3) 공정 (2)에서 얻어진 복수의 세포괴로부터, 세포괴의 형상, 내부 구조, 사이즈, 표면의 색채 또는 모양, 및 유전자 발현으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 이상을 지표로 하여, 대뇌 오가노이드를 선별하는 공정을 더 포함하는, 방법.
  11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 기재된 방법을 이용하여 제조되는 세포 배양물로서,
    복수의 구상의 세포괴를 포함하고,
    상기 복수의 구상의 세포괴에서 차지하는 대뇌 오가노이드의 비율이 40% 이상인, 세포 배양물.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 대뇌 오가노이드에서 차지하는 대뇌 피질 유사 구조물의 비율이 40% 이상인, 세포 배양물.
  13. 제12항에 있어서,
    대뇌 오가노이드가, 또한 이하의 (1)~(5):
    (1) 구상의 세포괴인 것,
    (2) 세포괴의 내부에, 대뇌 피질 유사 구조물을 갖는 것,
    (3) 표면에 색소 침착을 갖지 않는 것,
    (4) 세포괴의 일부에 낭포상 형상, 돌기 형상 및 풍선상 형상의 어느 것도 갖지 않는 것, 및,
    (5) NEUROD6, NEUROD2, SSTR2, TBR1, ZBTB18, NHLH1, IGFBPL1, NRN1, RTN1, THSD7A, NRXN1, BHLHE22, CALB2, KHDRBS3, CCSAP, PDE1A, NEUROD1, NPTX1, NXPH4, NTS, NEUROG2, OLFM1, PRDM8, CORO2B, TP53I11, ZFPM2, PCDH9, NELL2, SRRM4, SCG3, DCC, EPB41L3, SLC17A7, ST18, NSG2, EMX1, CAP2, SYT4, NSMF, ANK3, MYT1L, FSTL5, CELF4, B3GAT1, EPHA5, NHLH2 및 DLL3으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개의 마커를 발현하는 것
    으로부터 선택되는, 1 이상의 특징을 갖는 세포괴인, 세포 배양물.
  14. (a) 증식성 마커 양성 세포 수가 전 세포 수의 10% 이하이고,
    (b) 신경세포 마커, 피질 V/VI층 마커 및 전뇌 마커로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1개 이상의 마커가 양성인 세포 수가 전 세포 수의 70% 이상이며, 또한
    (c) 신경 상피 또는 대뇌 피질 유사 구조를 실질적으로 포함하지 않는 것을 특징으로 하는, 대뇌 피질 세포괴.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 (a)의 증식성 마커가 Ki67이고,
    상기 (b)의 신경세포 마커가 βIII-튜불린이며, 피질 V/VI층 마커가 Ctip2이고, 전뇌 마커가 FOXG1인,
    대뇌 피질 세포괴.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서,
    (d) NEUROD6, NEUROD2, SSTR2, TBR1, ZBTB18, NHLH1, IGFBPL1, NRN1, RTN1, THSD7A, NRXN1, BHLHE22, CALB2, KHDRBS3, CCSAP, PDE1A, NEUROD1, NPTX1, NXPH4, NTS, NEUROG2, OLFM1, PRDM8, CORO2B, TP53I11, ZFPM2, PCDH9, NELL2, SRRM4, SCG3, DCC, EPB41L3, SLC17A7, ST18, NSG2, EMX1, CAP2, SYT4, NSMF, ANK3, MYT1L, FSTL5, CELF4, B3GAT1, EPHA5, NHLH2 및 DLL3으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개의 마커를 추가로 발현하는, 대뇌 피질 세포괴.
  17. 제16항에 있어서,
    SLC17A7을 발현하는, 대뇌 피질 세포괴.
  18. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    GAD2, COL1A1, TYR, TTR 및 HOXA2로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 이상의 유전자를 실질적으로 발현하지 않은, 대뇌 피질 세포괴.
  19. 배양보조세포의 비존재 하에, 다능성 줄기세포로부터 대뇌 피질 세포괴를 제조하는 방법으로서,
    (i) 다능성 줄기세포로부터 대뇌 오가노이드를 얻는 공정과,
    (ii) 공정 (i)에서 얻어진 대뇌 오가노이드를, Notch 시그널 저해제를 포함하는 배양액 중에서 배양하여 대뇌 피질 세포괴를 얻는 공정
    을 포함하는, 방법.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 공정 (i)에서, 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 다능성 줄기세포로부터 대뇌 오가노이드를 얻는, 방법.
  21. (A) 증식성 마커 양성 세포 수가 전 세포 수의 5% 이하이고,
    (B) 신경세포 마커, 피질 V/VI층 마커 및 전뇌 마커로부터 선택되는 1개 이상의 마커 양성 세포 수가 전 세포 수의 70% 이상이며, 또한
    (C) 신경 상피 또는 대뇌 피질 유사 구조를 실질적으로 포함하지 않는
    것을 특징으로 하는, 고순도 대뇌 피질 세포괴.
  22. 제21항에 있어서,
    상기 (A)의 증식성 마커가 Ki67이고,
    상기 (B)의 신경세포 마커가 βIII-튜불린이며, 피질 V/VI층 마커가 Ctip2이고, 전뇌 마커가 FOXG1인,
    고순도 대뇌 피질 세포괴.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서,
    (D) NEUROD6, NEUROD2, SSTR2, TBR1, ZBTB18, NHLH1, IGFBPL1, NRN1, RTN1, THSD7A, NRXN1, BHLHE22, CALB2, KHDRBS3, CCSAP, PDE1A, NEUROD1, NPTX1, NXPH4, NTS, NEUROG2, OLFM1, PRDM8, CORO2B, TP53I11, ZFPM2, PCDH9, NELL2, SRRM4, SCG3, DCC, EPB41L3, SLC17A7, ST18, NSG2, EMX1, CAP2, SYT4, NSMF, ANK3, MYT1L, FSTL5, CELF4, B3GAT1, EPHA5, NHLH2 및 DLL3으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개의 유전자를 발현하는, 고순도 대뇌 피질 세포괴.
  24. 제23항에 있어서,
    SLC17A7, NEUROD6 및 EMX1로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 이상의 유전자를 발현하는, 고순도 대뇌 피질 세포괴.
  25. 제21항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
    GAD2, COL1A1, TYR, TTR 및 HOXA2로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 이상의 유전자를 실질적으로 발현하지 않은, 고순도 대뇌 피질 세포괴.
  26. 배양보조세포의 비존재 하에, 다능성 줄기세포로부터 고순도 대뇌 피질 세포괴를 제조하는 방법으로서,
    (i) 다능성 줄기세포로부터 대뇌 오가노이드를 얻는 공정과,
    (ii) 공정 (i)에서 얻어진 대뇌 오가노이드를, 배양액 중에서 배양하는 공정과,
    (iii) 공정 (ii)에서 얻어진 세포 배양물을, 단세포 또는 2~5개의 세포 집합체로까지 분산시키는 공정과,
    (iv) 공정 (ii)에서 얻어진 세포 배양물 또는 공정 (iii)에서 얻어진 세포 집단을 1 이상의 신경 영양 인자, 아스코브산 및 cAMP 활성화제를 포함하는 배양액 중에서 배양하여, 세포괴를 얻는 공정
    을 포함하고, 상기 공정 (ii)의 배양액 및/또는 상기 공정 (iv)의 배양액은, Notch 시그널 저해제를 포함하는, 방법.
  27. 제26항에 있어서,
    상기 공정 (i)에서, 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 다능성 줄기세포로부터 대뇌 오가노이드를 얻는, 방법.
  28. 제19항, 제20항, 제26항 및 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
    공정 (ii)에 부여하는 대뇌 오가노이드가, 신경세포로의 분화 유도 개시로부터 28일 후~44일 후의 대뇌 오가노이드인, 방법.
  29. 제19항, 제20항 및 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
    공정 (ii)의 배양 기간이 2~6일간인, 방법.
  30. 제19항, 제20항 및 제26항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서,
    공정 (iv)의 배양 기간이 2~14일간인, 방법.
  31. 제19항, 제20항 및 제26항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 Notch 시그널 저해제는, γ세크레타제 저해제인, 방법.
  32. 제31항에 있어서,
    상기 γ세크레타제 저해제가 N-[N-(3,5-디플루오로펜아세틸)-L-알라닐]-S-페닐글리신 t-부틸 에스테르 (DAPT) 또는 화합물 E인, 방법.
  33. 제21항 내지 제25항 중 어느 한 항에 기재된 고순도 대뇌 피질 세포괴를 포함하는 세포 집단으로서, 상기 고순도 대뇌 피질 세포괴의 사이즈, 형상 또는 구성 세포 조성이 균일한, 세포 집단.
  34. 제14항 내지 제18항 중 어느 한 항에 기재된 대뇌 피질 세포괴, 제21항 내지 제25항 중 어느 한 항에 기재된 고순도 대뇌 피질 세포괴, 또는 제33항에 기재된 세포 집단, 또는 그들을 구성 세포로까지 분산시켜 얻어지는 세포 집단을 유효 성분으로서 포함하는 의약 조성물.
  35. 제14항 내지 제18항 중 어느 한 항에 기재된 대뇌 피질 세포괴, 제21항 내지 제25항 중 어느 한 항에 기재된 고순도 대뇌 피질 세포괴, 또는 제33항에 기재된 세포 집단, 또는 그들을 구성 세포로까지 분산시켜 얻어지는 세포 집단을 포함하는, 이식용 조직.
  36. 제14항 내지 제18항 중 어느 한 항에 기재된 대뇌 피질 세포괴, 제21항 내지 제25항 중 어느 한 항에 기재된 고순도 대뇌 피질 세포괴, 또는 제33항에 기재된 세포 집단, 또는 그들을 구성 세포로까지 분산시켜 얻어지는 세포 집단을 유효 성분으로서 포함하는, 뇌혈관 장애 치료약.
  37. 제14항 내지 제18항 중 어느 한 항에 기재된 대뇌 피질 세포괴, 제21항 내지 제25항 중 어느 한 항에 기재된 고순도 대뇌 피질 세포괴, 또는 제33항에 기재된 세포 집단, 또는 그들을 구성 세포로까지 분산시켜 얻어지는 세포 집단을, 이를 필요로 하는 대상의 대뇌 피질 또는 대뇌 기저핵에 투여 또는 이식하는 것을 포함하는, 뇌혈관 장애의 치료 방법.
  38. (aa) 대뇌 오가노이드 또는 대뇌 피질 세포괴에서의, GAD2, COL1A1, TYR, TTR 및 HOXA2로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개의 유전자 또는 상기 유전자에 의해 코드되는 단백질 또는 그의 단편의 발현량을 측정하는 공정, 및
    (bb) 공정 (aa)의 측정 결과에 기초하여, 상기 유전자의 발현량이 기준값 이하인 경우에, 상기 대뇌 오가노이드 또는 상기 대뇌 피질 세포괴에 포함되는 목적 외 세포의 양이 기준 이하라고 평가하는 공정
    을 포함하는, 대뇌 오가노이드 또는 대뇌 피질 세포괴의 품질 평가 방법.
  39. (AA) 대뇌 오가노이드 또는 대뇌 피질 세포괴에서의 NEUROD6, NEUROD2, SSTR2, TBR1, ZBTB18, NHLH1, IGFBPL1, NRN1, RTN1, THSD7A, NRXN1, BHLHE22, CALB2, KHDRBS3, CCSAP, PDE1A, NEUROD1, NPTX1, NXPH4, NTS, NEUROG2, OLFM1, PRDM8, CORO2B, TP53I11, ZFPM2, PCDH9, NELL2, SRRM4, SCG3, DCC, EPB41L3, SLC17A7, ST18, NSG2, EMX1, CAP2, SYT4, NSMF, ANK3, MYT1L, FSTL5, CELF4, B3GAT1, EPHA5, NHLH2 및 DLL3으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개의 유전자의 발현량을 측정하는 공정, 및
    (BB) 공정 (AA)의 측정 결과에 기초하여, 상기 유전자의 발현량이 기준값 이상인 경우에, 상기 대뇌 오가노이드 또는 상기 대뇌 피질 세포괴에 포함되는 목적 세포의 양이 기준 이상이라고 평가하는 공정
    을 포함하는, 대뇌 오가노이드 또는 대뇌 피질 세포괴의 품질 평가 방법.
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IL (1) IL309344A (ko)
WO (1) WO2022265086A1 (ko)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015076388A1 (ja) 2013-11-22 2015-05-28 国立研究開発法人理化学研究所 終脳又はその前駆組織の製造方法
WO2016063985A1 (ja) 2014-10-24 2016-04-28 大日本住友製薬株式会社 神経組織の製造方法
WO2016167372A1 (ja) 2015-04-14 2016-10-20 国立大学法人京都大学 大脳皮質ニューロンの誘導方法

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5843780A (en) 1995-01-20 1998-12-01 Wisconsin Alumni Research Foundation Primate embryonic stem cells
JP2001508302A (ja) 1997-01-10 2001-06-26 ライフ テクノロジーズ，インコーポレイテッド 胚性幹細胞血清置換
US6280718B1 (en) 1999-11-08 2001-08-28 Wisconsin Alumni Reasearch Foundation Hematopoietic differentiation of human pluripotent embryonic stem cells
WO2002101057A1 (fr) 2001-06-08 2002-12-19 Dnavec Research Inc. Transfert genique dans des cellules souches embryonnaires de primate a l'aide d'un virus de l'immunodeficience simienne de pseudo type vsv-g utilise comme vecteur
JP2008099662A (ja) 2006-09-22 2008-05-01 Institute Of Physical & Chemical Research 幹細胞の培養方法
WO2009146408A1 (en) 2008-05-30 2009-12-03 Summa Health Systems Llc Methods for using tgf-b receptor inhibitors or activin-like kinase (alk) 5 inhibitors a-83-01 and sb-431542 to treat eye disease and wound healing conditions
US10597623B2 (en) * 2015-11-13 2020-03-24 The Johns Hopkins University Multiwell cell culture system having rotating shafts for mixing culture media and method of use thereof

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015076388A1 (ja) 2013-11-22 2015-05-28 国立研究開発法人理化学研究所 終脳又はその前駆組織の製造方法
WO2016063985A1 (ja) 2014-10-24 2016-04-28 大日本住友製薬株式会社 神経組織の製造方法
WO2016167372A1 (ja) 2015-04-14 2016-10-20 国立大学法人京都大学 大脳皮質ニューロンの誘導方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
비특허문헌 1: Kitahara, et al., Stem Cell Reports 2020 Vol. 15, 467-481
비특허문헌 2: Kuwahara, et. al., Scientific Reports 2019, 9:18936
비특허문헌 3: Eiraku, M et al., Cell Stem Cell, 3, 519-532(2008)

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