WO2022265086A1 - ヒト多能性幹細胞由来大脳皮質細胞製剤の製造方法 - Google Patents

ヒト多能性幹細胞由来大脳皮質細胞製剤の製造方法 Download PDF

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淳 ▲高▼橋
大輔 土井
愛 池田
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住友化学株式会社
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2513/00—3D culture

Definitions

  • the present invention relates to cerebral organoids or cerebral cortical cell clusters derived from pluripotent stem cells, methods for producing them, and the like.
  • cell transplantation therapy is expected by transplanting nerve cells differentiated from human pluripotent stem cells, especially human induced pluripotent stem cells (iPS cells). It is possible to transplanting nerve cells differentiated from human pluripotent stem cells, especially human induced pluripotent stem cells (iPS cells). It is possible to transplanting nerve cells differentiated from human pluripotent stem cells, especially human induced pluripotent stem cells (iPS cells). It is possible to transplanting nerve cells differentiated from human pluripotent stem cells, especially human induced pluripotent stem cells (iPS cells). It is
  • ES cells human embryonic stem cells
  • support cells sometimes referred to as feeder cells
  • MEFs mouse embryonic fibroblasts
  • Non-Patent Document 3 When human pluripotent stem cells maintained in the absence of support cells are induced to differentiate by the SFEBq method, there is a problem that the efficiency of producing cerebral organoids is low (Non-Patent Document 3).
  • the purpose of the present invention is to provide human pluripotent stem cell-derived cerebral organoids, cell aggregates containing cerebral cortical cells, and methods for producing these, which are useful for regenerative medicine. More specifically, the object is to provide a method for producing cerebral organoids from pluripotent stem cells in the absence of support cells and products obtained by the method.
  • the present inventors cultured pluripotent stem cells in a culture medium that does not substantially contain bFGF and does not substantially induce TGF ⁇ signals in the absence of feeder cells. It was found that cerebral organoids can be produced efficiently by inducing the differentiation of cells from cerebral cortex into neurons. I found that it can be manufactured well.
  • Step (2) is (2a) a step of suspension culture of the cells obtained in step (1) in a culture medium containing a TGF ⁇ signaling inhibitor and a Wnt signaling inhibitor to obtain a cell mass; [ 1].
  • [4] The method according to [2] or [3], wherein the suspension culture in step (2b) is shaking culture.
  • [5] The method according to any one of [1] to [4], wherein the culture period in step (1) is less than 3 days.
  • [6] The method according to any one of [1] to [5], wherein the culture period in step (1) is 12 hours or more and 2 days or less.
  • the culture medium of step (1) contains a TGF ⁇ signal inhibitor selected from the group consisting of SB431542, A-83-01, and XAV-939, according to any one of [1] to [6].
  • Method. [8] The method according to any one of [2] to [7], wherein the culture medium in steps (1), (2a), and (2b) is a serum-free culture medium.
  • the pluripotent stem cells are human induced pluripotent stem cells or human embryonic stem cells.
  • the method according to any one of [1] to [9] further comprising the step of selecting cerebral organoids.
  • the cerebral organoid further comprises the following (1) to (5): (1) be a spherical cell mass, (2) having a cerebral cortex-like structure inside the cell mass; (3) having no pigmentation on the surface; (4) having neither a cyst-like shape, a protrusion shape, or a balloon-like shape in a part of the cell mass, and (5) NEUROD6, NEUROD2, SSTR2, TBR1, ZBTB18, NHLH1, IGFBPL1, NRN1, RTN1, THSD7A, NRXN1, BHLHE22, CALB2, KHDRBS3, CCSAP, PDE1A, NEUROD1, NPTX1, NXPH4, NTS, NEUROD2, COROMOG2, , TP53I11, ZFPM2, PCDH9, NELL2, SRRM4, SCG3, DCC, EPB41L3, SLC17A7, ST18, NSG2,
  • the number of proliferative marker-positive cells is 10% or less of the total number of cells
  • the number of cells positive for one or more markers selected from the group consisting of neuronal markers, cortical V/VI layer markers, and forebrain markers is 70% or more of the total number of cells
  • a cerebral cortex cell mass characterized by being substantially free of neuroepithelial or cerebral cortex-like structures.
  • the proliferative marker of (a) is Ki67
  • the neuronal marker of (b) is ⁇ III-Tubulin
  • the cortical V/VI layer marker is Ctip2
  • the forebrain marker is FOXG1
  • a method for producing a cerebral cortical cell mass from pluripotent stem cells in the absence of supporting cells comprising: (i) obtaining cerebral organoids from pluripotent stem cells; (ii) culturing the cerebral organoid obtained in step (i) in a culture medium containing a Notch signal inhibitor to obtain a cerebral cortex cell mass. [20] The method of [19], wherein in step (i), cerebral organoids are obtained from pluripotent stem cells by the method of any one of [1] to [10].
  • (A) the number of proliferative marker-positive cells is 5% or less of the total number of cells
  • (B) One or more marker-positive cells selected from neuronal markers, cortical V/VI layer markers, and forebrain markers are 70% or more of the total number of cells
  • the proliferative marker of (A) is Ki67
  • the neuronal marker of (B) is ⁇ III-Tubulin
  • the cortical V/VI layer marker is Ctip2
  • the forebrain marker is FOXG1
  • the highly purified cerebral cortex cell mass according to [21].
  • a method for producing highly purified cerebral cortical cell clusters from pluripotent stem cells in the absence of supporting cells comprising: (i) obtaining cerebral organoids from pluripotent stem cells; (ii) culturing the cerebral organoids obtained in step (i) in a culture medium; (iii) dispersing the cell culture obtained in step (ii) into a single cell or a cell clump of 2 to 5 cells; (iv) culturing the cell culture obtained in step (ii) or the cell population obtained in step (iii) in a medium comprising one or more neurotrophic factors, ascorbic acid, and a cAMP activator; and obtaining a cell mass, wherein the culture medium in step (ii) and/or the culture
  • step (i) The method of [26], wherein in step (i), cerebral organoids are obtained from pluripotent stem cells by the method of any one of [1] to [10].
  • step (i) Any of [19], [20], [26] and [27], wherein the cerebral organoids given in step (ii) are cerebral organoids 28 to 44 days after initiation of induction of differentiation into neurons. The method described in Crab.
  • step (ii) The method according to any one of [19], [20], and [26] to [28], wherein the culture period in step (ii) is 2 to 6 days.
  • the culture period in step (iv) is 2 to 14 days.
  • [31] The method according to any one of [19], [20], and [26] to [30], wherein the Notch signaling inhibitor is a ⁇ -secretase inhibitor.
  • the ⁇ -secretase inhibitor is N-[N-(3,5-difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester (DAPT) or Compound E. .
  • DAPT N-[N-(3,5-difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester
  • Compound E. Compound E.
  • a cell population comprising the highly purified cerebral cortical cell clusters according to any one of [21] to [25], wherein the highly purified cerebral cortical cell clusters are uniform in size, shape or constituent cell composition. cell population.
  • step (aa) measuring the expression level of at least one gene selected from the group consisting of GAD2, COL1A1, TYR, TTR and HOXA2 or a protein encoded by the gene or a fragment thereof in a cerebral organoid or cerebral cortex cell mass and (bb) based on the measurement result of step (aa), when the expression level of the gene is below the reference value, the amount of non-target cells contained in the cerebral organoid or the cerebral cortical cell mass is the reference.
  • evaluating to be A method for evaluating the quality of cerebral organoids or cerebral cortical cell masses comprising: [39] (AA) NEUROD6, NEUROD2, SSTR2, TBR1, ZBTB18, NHLH1, IGFBPL1, NRN1, RTN1, THSD7A, NRXN1, BHLHE22, CALB2, KHDRBS3, CCSAP, PDE1A, NEUROD1, NPTX1 in cerebral organoids or cerebral cortical cell masses , NXPH4, NTS, NEUROG2, OLFM1, PRDM8, CORO2B, TP53I11, ZFPM2, PCDH9, NELL2, SRRM4, SCG3, DCC, EPB41L3, SLC17A7, ST18, NSG2, EMX1, CAP2, SYT4, NSMF, ANK3, MYT1L, FSTL4, , B3GAT1, EPHA5, NHLH2, and a step of measuring the expression level of at least one gene selected from the group consisting of DLL3; A step of
  • cerebral organoids that can be used as materials for cerebral cortex cell preparations can be produced from human pluripotent stem cells with high efficiency.
  • the cerebral cortical cell mass or the like derived from the cerebral organoid of the present invention is useful as a therapeutic agent or a transplant material for treating cerebrovascular disorders and the like.
  • FIG. 10 shows images of the morphology of cell aggregates after induction of differentiation into neurons in preliminary test 1.
  • FIG. 2 shows the results of microarray expression analysis of FGF2 and TGF ⁇ pathway-related genes in preliminary test 2.
  • FIG. An example of a differentiation induction scheme in Example 1 is shown. 1 shows a bright field image (A) and a confocal fluorescence microscope image (B) of cell aggregates after induction of differentiation in 1-1 of Example 1.
  • FIG. An example of a differentiation induction scheme in Example 1 is shown. 1 shows a confocal fluorescence microscopy image of a cerebral cortex cell mass after differentiation induction in 1-1 of Example 1.
  • FIG. FIG. 2 shows confocal fluorescence microscope images of cerebral organoids on Day 35 after induction of differentiation in 1-2 of Example 1.
  • FIG. 2 shows representative bright-field images of cultures on Day 18, Day 27, and Day 34 after induction of differentiation in Example 2.
  • FIG. 2 shows the formation efficiency (%) of cerebral organoids under each condition after induction of differentiation in Example 2.
  • FIG. 4 shows the results of expression analysis of various marker genes after step (1) (Day 0) in Example 3.
  • Representative confocal fluorescence microscope images of immunostaining in 4-1 of Example 4 are shown.
  • the differentiation induction scheme in 4-2 of Example 4 is shown.
  • 4 shows the analysis results of marker gene expression by flow cytometry in 4-2 of Example 4.
  • FIG. 4 shows the analysis results of marker gene expression by flow cytometry in 4-2 of Example 4.
  • Example 4 The scheme of the DAPT method in 4-3 of Example 4 (A) and the results of RT-qPCR analysis of changes in gene expression in the obtained cell mass (B) are shown.
  • the differentiation induction scheme (A) in Example 5 and the results (B) of immunostaining of cerebral organoids on Day 28 (4wk), Day 42 (6wk), and Day 75 (10wk) are shown.
  • 4 shows the analysis results of relative expression levels of various markers of cerebral organoids on Day 28 (4wk), Day 35 (5wk), Day 42 (6wk), and Day 75 (10wk) in Example 5.
  • FIG. Representative confocal fluorescence microscopy images of immunostained grafts in Example 6 are shown.
  • FIG. 10 shows the volumetric analysis results of immunostained grafts in Example 6.
  • FIG. 1 shows a scheme of the method of the preferred embodiment; Representative confocal fluorescence microscope images of immunostaining in Example 7 are shown.
  • 2 shows the analysis results of flow cytometry in Example 7.
  • FIG. The schemes of the two methods in 8-1 of Example 8 are shown.
  • FIG. 10 shows the results of RT-qPCR analysis of gene expression levels over time for each marker in cell masses obtained by the single-cell DAPT method in 8-1 of Example 8.
  • FIG. 10 shows the results of RT-qPCR analysis of gene expression levels over time for each marker of cell clusters obtained by the single-cell DAPT method and the organoid method in 8-1 of Example 8.
  • FIG. 10 shows flow cytometry analysis results of gene expression levels on day 10 for each marker of cell aggregates obtained by the single-cell DAPT method and the organoid method in 8-1 of Example 8.
  • FIG. The scheme of the single-cell DAPT method in 8-2 of Example 8 is shown. 8 shows the results of flow cytometry analysis of gene expression in cell masses obtained by the single-cell DAPT method in 8-2 of Example 8.
  • FIG. A representative bright-field image of the organoid morphology in 9-1 of Example 9 is shown. Representative bright field images of the seven morphological groups in 9-1 of Example 9 are shown. 10 shows a bar graph of the ratio of organoids of each form in 9-1 of Example 9.
  • FIG. 10 shows bright-field images of nine organoids obtained by three rounds of differentiation induction in 9-2 of Example 9.
  • FIG. 9 shows the results of UMAP display of data of single-cell RNA-seq analysis for nine organoids in 9-2 of Example 9.
  • FIG. 9 shows the results of UMAP display of data of single-cell RNA-seq analysis for nine organoids in 9-2 of Example 9.
  • FIG. The result of identifying the cell type of each cluster based on the gene expression of each cluster in 9-2 of Example 9 is shown.
  • the characteristic gene for each cluster and the expression profile of known marker genes are shown by dot plots.
  • the characteristic gene for each cluster and the expression profile of known marker genes are shown by dot plots.
  • the percentage of each cell type in nine organoids in 9-2 of Example 9 (A) and the percentage of neural crest cells at each differentiation stage (B) are shown.
  • Immunostaining results of representative marker proteins for each group of organoids in 9-3 of Example 9 are shown.
  • Bright field images of three organoids for each group in 9-4 of Example 9 are shown.
  • FIG. 10 shows the result of analysis of marker gene expression by RT-qPCR method for each organoid in 9-4 of Example 9.
  • FIG. FIG. 10 shows the result of analysis of marker gene expression by RT-qPCR method for each organoid in 9-4 of Example 9.
  • stem cell means an undifferentiated cell having differentiation potential and proliferation potential (especially self-renewal potential) while maintaining differentiation potential.
  • Stem cells include subpopulations such as pluripotent stem cells, multipotent stem cells, and unipotent stem cells, depending on their differentiation potential.
  • Pluripotent stem cells are capable of being cultured in vitro and capable of differentiating into all cell lineages belonging to the three germ layers (ectoderm, mesoderm, endoderm) and/or extra-embryonic tissues (pluripotent stem cells).
  • stem cells with pluripotency refer to stem cells that have the ability to differentiate into multiple, but not all, types of tissues and cells.
  • a unipotent stem cell means a stem cell that has the ability to differentiate into a specific tissue or cell.
  • Pluripotent stem cells can be derived from fertilized eggs, cloned embryos, germ stem cells, tissue stem cells, somatic cells, etc.
  • pluripotent stem cells include embryonic stem cells (ES cells: Embryonic Stem cells), EG cells (Embryonic Germ cells), induced pluripotent stem cells (iPS cells: induced Pluripotent Stem cells), and the like.
  • Muse cells Multi-lineage differentiating stress enduring cells obtained from mesenchymal stem cells (MSCs), and mGS cells produced from germ cells (e.g., testis) are also included in pluripotent stem cells.
  • Embryonic stem cells Human embryonic stem cells were established in 1998 and are being used in regenerative medicine. Embryonic stem cells can be produced by culturing the inner cell mass at the blastocyst stage, ie within 14 days after fertilization, on feeder cells or in a medium containing FGF2. Methods for producing embryonic stem cells are described, for example, in WO96/22362, WO02/101057, US5,843,780, US6,200,806, US6,280,718 and the like. Embryonic stem cells can be obtained from designated institutions or can be purchased commercially. For example, human embryonic stem cells KhES-1, KhES-2 and KhES-3 are available from Institute for Frontier Medical Sciences, Kyoto University.
  • induced pluripotent stem cells refers to cells in which pluripotency is induced by reprogramming somatic cells by a known method or the like.
  • Induced pluripotent stem cells were established in mouse cells by Yamanaka et al. in 2006 (Cell, 2006, 126(4), pp.663-676). Induced pluripotent stem cells were also established in human fibroblasts in 2007, and have pluripotency and self-renewal ability like embryonic stem cells (Cell, 2007, 131(5), pp.861-872; Science , 2007, 318(5858), pp.1917-1920; Nat. Biotechnol., 2008, 26(1), pp.101-106).
  • induced pluripotent stem cells are OCT3/4, SOX2, KLF4, MYC (c-MYC, N-MYC, L-MYC), fibroblasts, peripheral blood mononuclear cells, and other differentiated somatic cells.
  • Cells in which pluripotency is induced by reprogramming by forcibly expressing any combination of a plurality of genes selected from the reprogramming gene group including GLIS1, NANOG, SALL4, LIN28, ESRRB, etc., can be mentioned.
  • Preferred combinations of reprogramming factors include (1) OCT3/4, SOX2, KLF4 and MYC (c-MYC or L-MYC), (2) OCT3/4, SOX2, KLF4, LIN28 and L-MYC (Stem Cells, 2013; 31: 458-466).
  • induced pluripotent stem cells in addition to the method of producing by reprogramming induction by gene expression, induced pluripotent stem cells can also be induced by adding compounds to somatic cells (Science, 2013, 341, pp.651 -654; Nature, 2022, 605, pp.325-331).
  • iPS cells can be produced by reprogramming somatic cells such as peripheral blood/cord blood-derived hematopoietic progenitor cells and fibroblasts using reprogramming factors.
  • S2WCB1, S2WCB3 used herein were established from adult peripheral blood mononuclear cells using CytoTuneTM-2.0 (ID Pharma).
  • pluripotent stem cells are preferably embryonic stem cells or induced pluripotent stem cells, more preferably induced pluripotent stem cells.
  • pluripotent stem cells are mammalian pluripotent stem cells, preferably rodent (e.g., mouse, rat) or primate (e.g., human, monkey) pluripotent stem cells, Human pluripotent stem cells are more preferred, and human induced pluripotent stem cells (iPS cells) or human embryonic stem cells (ES cells) are even more preferred.
  • rodent e.g., mouse, rat
  • primate e.g., human, monkey
  • iPS cells human induced pluripotent stem cells
  • ES cells human embryonic stem cells
  • Pluripotent stem cells such as human iPS cells can be subjected to maintenance culture and expansion culture by methods well known to those skilled in the art.
  • markers means a substance present in a cell and capable of identifying or distinguishing the type or property of the cell based on its presence or amount. Specific examples of markers include mRNAs, proteins encoded by the mRNAs, sugar chains, and fragments thereof.
  • nerve cells refer to nerve units composed of cell bodies, dendrites and axons, and are also called neurons. Nerve cells have the function of transmitting stimuli from other nerve cells or stimuli-receiving cells to other nerve cells, muscles or gland cells. Although classified into serotonergic nerves, GABAergic nerves, glutamatergic nerves, etc., the type of neurotransmitter is not particularly limited in the present specification. Neurons can be identified by significantly expressed markers, such as ⁇ III-Tubulin, MAP2, and the like.
  • neural stem cell refers to a stem cell that is destined to differentiate into neural cells but has the ability to differentiate into multiple neural cells and maintains proliferative properties, and neural progenitor cells. It is a cell that has both the ability to differentiate into cerebral cortex cells and the ability to differentiate into cerebral cortical cells. They can be identified by markers of primitive neuroectoderm and neural stem cells such as intermediate filament proteins (nestin, vimentin, etc.), transcription factors SOX1, SOX2, PAX6, and the like. Neural stem cells herein include radial glia.
  • immature cells that are generated from neural stem cells and are capable of differentiating into multiple nerve cells are also called neural progenitor cells.
  • cell culture refers to products obtained by culturing cells, regardless of specific composition. Cell cultures can be aggregates of multiple cell masses, and may further include single cells and aggregates of 2 to 5 cells as described below.
  • a cell culture may or may not contain a medium or suspending medium and, as used herein, refers to one that does not contain a medium or suspending medium unless otherwise specified.
  • Cerebral organoid means a spherical cell aggregate (cell mass) containing one or more, preferably multiple, cerebral cortex-like structures with a neuronal cell layer on the outside of the neuroepithelium.
  • cortex-like structures are rosette-like structures with neuronal layers outside the neuroepithelium.
  • cortex-like structures may include neuroepithelial-like structures
  • cerebral organoids of the present application may include neuroepithelial-like structures.
  • neural epithelium is a layered structure whose main constituent cells are neural stem cells and/or neural progenitor cells, and can also be said to be a localized area of neural stem cells and/or neural progenitor cells.
  • the "neuronal layer” is a layered structure containing neurons.
  • the nerve cells are not particularly limited as long as they are nerve cells that can be generated at the differentiation stage of cerebral organoids.
  • the neuronal cell layer preferably contains two or more of neuronal marker-positive cells, forebrain marker-positive cells, and cerebral cortical neuronal cells or their progenitor cell marker-positive cells, or all of them.
  • the neuronal layer can also be said to be a localized area of neurons (cerebral cortical neurons) generated from the neuroepithelium.
  • One aspect of the cerebral organoid in the present specification is a cerebral organoid obtained by inducing differentiation of pluripotent stem cells.
  • spherical refers to neither a rod-like shape nor a flat plate-like shape (plate-like), and preferably means "a three-dimensional structure close to a sphere". Examples include those that exhibit, for example, a circular or elliptical shape when projected onto a two-dimensional surface. However, it is not necessary to show a smooth curve, and even if unevenness is partially observed, if the entire cell mass can be recognized as having a shape close to a sphere, it corresponds to "spherical”.
  • the term “spherical” in the present specification does not necessarily require a high sphericity, but an example is a structure having a sphericity of 0.7 or more, 0.8 or more, preferably 0.9 or more. be done.
  • marker genes for neural stem cells or neural progenitor cells include, for example, SOX1, SOX2, PAX6, and the like.
  • neuronal marker genes examples include ⁇ III-Tubulin, MAP2, and the like.
  • Forebrain marker genes include, for example, FOXG1 (also called BF1), SIX3, and EMX1.
  • the cerebral cortex neuron marker genes include markers for layers I to VI, which will be described later.
  • marker genes for various cells include the genes listed in Table 6 below, as described later.
  • Cerebral cortical cell is also referred to as cerebral cortical neuron or cerebral cortical nerve cell, and refers to nerve cells that constitute the cerebral cortex.
  • the nerve cell layer may be a single layer, or may be divided into multiple cell layers.
  • the cerebral cortex VI Tbr1, Tbr2
  • V Ctip2, Er81, Fezf2
  • IV Rorb
  • III/II Foxp1, Mef2c, Satb2
  • Marker genes frequently used for identification of each layer are shown in parentheses.
  • cerebral cortical cells are preferably cells positive for the forebrain marker FOXG1.
  • FOXG1 includes polynucleotides represented by NCBI Accession No. NM_005249 and proteins encoded by these.
  • cerebral cortical cells may include neurons in the motor area of the cerebral cortex or upper motor neurons, i.e., neurons anterior to the cerebral cortex; and/or layer VI neurons.
  • neurons in layer V or layer VI are cell populations characterized by being positive for Ctip2.
  • Ctip2 includes polynucleotides represented by NCBI accession numbers NM_001282237, NM_001282238, NM_022898 or NM_138576 and proteins encoded by these.
  • the cerebral cortical cells may also include layer I, layer II/III, and layer IV neurons.
  • the cerebral cortical cells herein may be produced as a cell population containing other cell types, and the cell population containing cerebral cortical cells is, for example, 15% or more, 20% or more, It may contain 30% or more, 40% or more, or 50% or more cerebral cortical cells.
  • Cerebral cortical cells is a concept including “cerebral cortical progenitor cells”
  • the target cells of the “cerebral organoid” of the present invention include cerebral cortical progenitor cells.
  • the target cells of the "cerebral cortical cell mass (including highly purified cerebral cortical cell mass)" of the present invention which are at a more advanced stage of differentiation, contain almost no cerebral progenitor cells, or contain only a minimal number of cerebral progenitor cells. can be included to some extent.
  • cell aggregate As used herein, the term "cell aggregate” (also referred to as cell aggregate) is not particularly limited as long as a plurality of cells adhere to each other to form a three-dimensional structure. It refers to a mass formed by aggregation of cells dispersed in a medium, a mass of cells formed through cell division, or the like. A cell mass also includes a case where a specific tissue is formed. Embryoid bodies, spheres, and spheroids are included in the cell mass.
  • the cell aggregates may have any shape, and examples thereof include spherical cell aggregates and layered cell aggregates.
  • a "cell population” is a population containing a plurality of cells, and is a cell cluster (spherical cell cluster, layered cell cluster), or a cluster of 2 to 5 cells (Cell clump) good too.
  • a “cell population” may also refer to a population of multiple cell clumps, a population of multiple dispersed single cells, or a population of multiple cell clumps of 2-5 cells, or a population of any combination thereof. may be
  • the high purity of the cell mass means that the content of the target cells contained in the cell mass is high.
  • the specific content rate depends on the type of cells, for example, when the content rate of the target cells is 70% or more, preferably 80% or more, and 90% or more with respect to the total number of cells in the cell cluster, the purity is high. It can be said that there is
  • the high-purity cell mass means that the content of non-target cells is 30% or less, preferably 20% or less, 10% or less with respect to the total number of cells in the cell mass. be able to. More preferably, the content of proliferative cells in the cell mass is 10% or less, 5% or less, preferably 3% or less, and more preferably 2% or less relative to the total number of cells in the cell mass. .
  • reaggregated cell cluster refers to a cell cluster that is dispersed into single cells or aggregates of 2 to 5 cells, and then the dispersed single cells and aggregates of cells are reassembled and formed. Refers to cell clusters (eg, reaggregated cerebral cortical cell clusters).
  • the reaggregated cerebral cortex cell mass contains at least a highly purified cerebral cortex cell mass.
  • the "culture medium may be any culture medium (medium) that is commonly used for culturing animal cells, and is not particularly limited as long as animal cells can sustain life, but is preferably It provides an environment in which target cells can proliferate.
  • the culture solution (medium) may be prepared by the patient or a commercially available medium may be purchased and used.
  • basal media examples include BME medium, BGJb medium, CMRL 1066 medium, Glasgow MEM (GMEM) medium, Improved MEM Zinc Option medium, IMDM medium, Medium 199 medium, Eagle MEM medium, ⁇ MEM medium, DMEM medium, F-12 Medium, DMEM/F-12 medium, IMDM/F12 medium, Ham's medium, RPMI 1640 medium, Fischer's medium, or a mixed medium of these mediums, which can be used for culturing animal cells.
  • These basal media contain carbohydrates such as glucose, carbon sources such as amino acids, vitamins, inorganic salts and the like.
  • Any component normally used for culturing animal cells may be added to the basal medium as long as it does not adversely affect the desired induction of differentiation.
  • the medium used in the present invention is preferably a serum-free culture medium from the viewpoint of producing cell clusters suitable for transplantation.
  • serum-free culture medium in the present invention means a medium substantially free of unadjusted or unpurified serum.
  • serum-free culture even if the medium is contaminated with purified blood-derived components or animal tissue-derived components (e.g., growth factors), as long as it does not contain unadjusted or unpurified serum. contained in the liquid.
  • the serum-free culture medium optionally contains fatty acids or lipids, amino acids (e.g., non-essential amino acids), vitamins, growth factors, cytokines, antioxidants, 2-mercaptoethanol, pyruvic acid, buffers, inorganic salts, and the like. good too.
  • the medium used in the present invention is preferably a xeno-free medium.
  • xeno-free means conditions under which components derived from a biological species different from the biological species of cells to be cultured (heterologous components, also referred to as Xenogenic factors) are eliminated.
  • a portion of the serum-free medium may be xeno-free medium.
  • the medium used in the present invention may contain serum replacement.
  • serum substitutes include those containing albumin, transferrin, fatty acids, collagen precursors, trace elements, 2-mercaptoethanol, 3' thiol glycerol, or equivalents thereof as appropriate.
  • serum substitutes can be prepared, for example, by the method described in WO98/30679. Commercially available products may be used as serum substitutes.
  • Such commercially available serum replacements include, for example, Knockout Serum Replacement (manufactured by Thermo Fisher Scientific; hereinafter sometimes referred to as KSR), “StemSure (registered trademark) Serum Replacement (SSR)" Chemically-defined Lipid concentrated (manufactured by Thermo Fisher Scientific), B27 supplement (manufactured by Thermo Fisher Scientific), N2 supplement (manufactured by Thermo Fisher Scientific), ITS supplement (manufactured by Thermo Fisher Scientific), N2 supplements or B27 supplements are preferred.
  • support cells are also referred to as feeder cells, and refer to cells other than stem cells that coexist when stem cells such as pluripotent stem cells are cultured.
  • Supporting cells include, for example, mouse fibroblasts (MEFs, etc.), human fibroblasts, SNL cells, STO cells, and the like.
  • the feeder cells may be antiproliferatively treated feeder cells.
  • the growth inhibitory treatment includes growth inhibitor (eg, mitomycin C) treatment, gamma ray irradiation, UV irradiation, or the like.
  • feeder-free means culturing in the absence of feeder cells.
  • the absence of feeder cells means, for example, conditions in which feeder cells are not added, or substantially free of feeder cells (e.g., the ratio of feeder cells to the total number of cells is 3% or less, preferably 1% below).
  • the term "suspension culture” refers to allowing cells to survive while suspended in a medium, or culturing cells by forming aggregates (also referred to as spheres) in a non-adherent state to a culture vessel. means In the present specification, cells are cultured in suspension in the state of a single cell or a cluster of a plurality of cells (cell mass or cell population).
  • Culture vessels used for suspension culture are not particularly limited, but examples include flasks, tissue culture flasks, dishes, petri dishes, tissue culture dishes, multidishes, microplates, microwell plates, micropores, multiplates, Examples include multiwell plates, chamber slides, petri dishes, tubes, trays, culture bags, bioreactors, and roller bottles.
  • the incubator is preferably cell non-adhesive in order to allow culture under non-adhesive conditions.
  • the cell non-adhesive culture vessel is a culture vessel whose surface is not artificially treated (for example, coating treatment with extracellular matrix etc.) for the purpose of improving adhesion to cells, or an artificial A treatment that effectively inhibits adhesion (e.g., polyhydroxyethyl methacrylic acid (poly-HEMA), a nonionic surfactant polyol (Pluronic F-127, etc.) or a phospholipid-like structure (e.g., 2-methacryloyloxyethylphosphorylcholine) It can be carried out by using a culture vessel coated with a water-soluble polymer (Lipidure (registered trademark)) having a constituent unit PrimeSurface (registered trademark) as a culture vessel used in suspension culture, especially in the SFEBq method. (low protein adsorption treatment 96-well plate, manufactured by Sumito
  • suspension culture may be static culture, shaking culture, orbital culture, or agitation culture.
  • static culture refers to a culture method in which cell clusters are cultured in a state in which they are not intentionally moved. That is, for example, the medium convects with a change in local medium temperature, and the flow may move the cell aggregates. In the present invention, it is referred to as static culture, including the case.
  • bFGF means basic fibroblast growth factor and is a protein also called FGF2.
  • TGF ⁇ signal inhibitor refers to a substance that inhibits signal transduction from binding of TGF ⁇ to a receptor to SMAD, and a substance that inhibits binding to the ALK family of receptors, or an inhibitor of the ALK family and substances that inhibit the phosphorylation of SMAD by .
  • the TGF ⁇ signal inhibitor is not particularly limited as long as it can suppress signal transduction mediated by TGF ⁇ , and may be any of nucleic acids, proteins, and low-molecular-weight organic compounds.
  • TGF ⁇ signal inhibitors include substances that act directly on TGF ⁇ (e.g., proteins, antibodies, aptamers, etc.), substances that suppress the expression of genes encoding TGF ⁇ (e.g., antisense oligonucleotides, siRNA, etc.), and TGF ⁇ receptors. Substances that inhibit binding of TGF ⁇ and substances that inhibit physiological activity caused by signal transduction by TGF ⁇ receptors (for example, inhibitors of TGF ⁇ receptors, etc.) can be mentioned.
  • the TGF ⁇ signal inhibitor includes a substance that inhibits the binding to the ALK family receptor, or a substance that inhibits the phosphorylation of SMAD by the ALK family.
  • the ALK family specifically includes ALK4, ALK5 and ALK7.
  • TGF ⁇ signal inhibitors examples include Lefty-1 (as NCBI Accession No., mouse: NM_010094, human: NM_020997), Lefty-2 (as NCBI Accession No., mouse: NM_177099, human: NM_003240 and NM_001172425 is exemplified), SB431542 (4-[4-(1,3-benzodioxol-5-yl)-5-(2-pyridinyl)-1H-imidazol-2-yl]-benzamide), SB202190 (above, R.K.
  • the TGF ⁇ signaling inhibitor used in the present invention is preferably SB431542 or A-83-01.
  • a Wnt signaling inhibitor is a substance that suppresses the production of Wnt (e.g., Wnt3), or a substance that inhibits signal transduction from binding of Wnt to its receptor to accumulation of ⁇ -catenin, Examples thereof include substances that inhibit binding to Frizzled family receptors, and substances that promote degradation of ⁇ -catenin.
  • Wnt signaling inhibitors examples include PORCN involved in Wnt protein processing (in humans, proteins represented by NCBI accession numbers: NP_001269096, NP_073736, NP_982299, NP_982300, or NP_982301). ), DKK1 protein (for example, NCBI accession number for humans: NM_012242), sclerostin (for example, for humans, NCBI accession number: NM_025237), Cerberus protein, Wnt receptor inhibitor , soluble Wnt receptors, anti-Wnt antibodies, casein kinase inhibitors, dominant-negative Wnt proteins and the like, but are not limited to these, and one or more substances may be used in combination.
  • PORCN involved in Wnt protein processing
  • DKK1 protein for example, NCBI accession number for humans: NM_012242
  • sclerostin for example, for humans, NCBI accession number: NM_025237
  • Cerberus protein for example
  • IWR-1-endo ((4-[(3aR,4S,7R,7aS)-1,3,3a,4,7,7a-hexahydro-1,3-dioxo- 4,7-methano-2H-isoindol-2-yl]-N-8-quinolinyl-benzamide), Merck Millipore), IWP-2 (Sigma-Aldrich), IWP-3 (Sigma-Aldrich), IWP-4 ( Sigma-Aldrich), IWP-L6 (EMD Millipore), C59 (or Wnt-C59) (Cellagen technology), ICG-001 (Cellagen Technology), LGK-974 (or NVP-LGK-974) (Cellagen Technology) , FH535 (Sigma-Aldrich), WIKI4 (Sigma-Aldrich), KYO2111 (Minami I, et al, Cell Rep.2:1448-1460, 2012), P
  • Notch signal inhibitors are not limited as long as they are substances capable of suppressing signal transduction by Notch.
  • Notch signal inhibitors include ⁇ -secretase inhibitors, Notch transcription complex inhibitors such as MAML-1 inhibitors, and the like.
  • the ⁇ -secretase inhibitor is not limited as long as it is a substance capable of inhibiting the enzymatic activity of ⁇ -secretase.
  • DAPT N-[N-(3,5-difluorophenacetyl)-l-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester
  • DBZ dibenzazepine
  • MDL28170 Calpain Inhibitor III
  • Compound E N -[(1S)-2-[[(3S)-2,3-Dihydro-1-methyl-2-oxo-5-phenyl-1H-1,4-benzodiazepin-3-yl]amino]-1-methyl -2-oxoethyl]-3,5-difluorobenzeneacetamide
  • Compound 34 ((2S,3R)-3-(3,4-Difluorophenyl)-2-(4-fluorophenyl)-4-hydroxy-N-((3
  • Notch transcription complex inhibitors include CB-103 (6-[4-(1,1-dimethylethyl)phenoxy]-3-pyridinamine), IMR-1 (2-Methoxy-4-(4-oxo-2-thioxo -thiazolidin-5-ylidenemethyl)-phenoxy]-acetic acid ethyl ester) and the like.
  • ROCK inhibitor is an inhibitor of Rho-associated coiled-coil kinase (ROCK), and is not particularly limited as long as it is a substance that suppresses the function of ROCK.
  • ROCK inhibitors include Y-27632 ((+)-(R)-trans-4-(1-aminoethyl)-N-(4-pyridyl)cyclohexanecarboxamide dihydrochloride), H-1152 ((S)-4-Methyl -5-((2-methyl-1,4-diazepan-1-yl)sulfonyl)isoquinoline dihydrochloride), Fasudil (HA-1077; 1-(5-Isoquinolinesulfonyl)homopiperazine Hydrochloride), Wf-536 (4-[( 1R)-1-aminoethyl]-N-(pyridin-4-yl)benzamide), Thiazovivin (N-Benzyl-2-(pyrimidin-4-
  • neurotrophic factor is a general term for secretory proteins having activities to promote survival of nerve cells, extension of neurites and axons, formation of synapses, and the like.
  • neurotrophic factors Nerve Growth Factor (NGF), Brain-derived Neurotrophic Factor (BDNF), Neurotrophin 3 (NT-3), Neurotrophin 4/5 (NT-4/5), Neurotrophin 6 (NT-6), Glia Cell line-derived Neurotrophic Factor (GDNF), Ciliary Neurotrophic Factor (CNTF) and the like.
  • a preferred neurotrophic factor in the present invention is a factor selected from the group consisting of GDNF and BDNF.
  • Neurotrophic factors are commercially available from, for example, Wako, R&D Systems, etc. and can be easily used, but may be obtained by forced expression in cells by methods known to those skilled in the art.
  • cAMP activators include cAMP, dibutyryl-cAMP, forskolin, and the like.
  • One embodiment of the method for producing cerebral organoids of the present invention is a method for producing cerebral organoids from pluripotent stem cells in the absence of support cells, including the following steps (1) and (2). are mentioned. “In the absence of feeder cells” is as described above, and both step (1) and step (2) are performed “in the absence of feeder cells”.
  • Step of culturing pluripotent stem cells in a culture medium that is substantially free of bFGF and does not substantially induce TGF ⁇ signals (2) Cells obtained in step (1) are transformed into nerve cells and the step of inducing differentiation ⁇ Step (1)>
  • culturing "in the presence of substance X” means culturing in "a medium containing substance X", and the substance X is contained as an original component in the medium. or may be added exogenously.
  • an endogenous substance X that can be expressed, secreted or produced by a cell or tissue during the culture is distinguished from exogenous substance X, and a medium that does not contain exogenous substance X is endogenous Even if it contains substance X, it is understood that it does not fall under the category of "medium containing substance X".
  • a "medium containing a TGF ⁇ signal inhibitor” is a medium supplemented with a TGF ⁇ signal inhibitor or a medium containing a TGF ⁇ signal inhibitor as an original component.
  • the culture medium "substantially free of bFGF” does not deny the existence of bFGF expressed by the cells themselves, but does not originally contain bFGF, or does not exogenously add bFGF. Means culture medium.
  • the present application also encompasses culturing using a medium containing a low dose of bFGF to the extent that the efficiency of neuronal differentiation in the present invention is not affected.
  • the culture medium that "substantially does not induce TGF ⁇ signals” does not deny the existence of TGF ⁇ expressed by the cells themselves. It means that the culture medium is not Alternatively, a culture solution containing an exogenously added TGF ⁇ or a culture solution containing no exogenously added TGF ⁇ , to which an effective amount of a TGF ⁇ signal inhibitor is added, is also referred to as “substantially inhibiting the TGF ⁇ signal. It is in the category of "culture solution that does not induce
  • the above-mentioned TGF ⁇ signal inhibitor can be appropriately selected so as not to substantially induce TGF ⁇ signals.
  • the concentration of the TGF ⁇ signal inhibitor can be appropriately adjusted according to the intensity of TGF ⁇ signal activity in the culture medium. That is, the concentration of the TGF ⁇ signal inhibitor in the culture medium is not particularly limited as long as it inhibits the activity of ALK4, ALK5 or ALK7 signaling.
  • the TGF ⁇ signal inhibitor added to the culture medium in step (1) may be any of the above TGF ⁇ signal inhibitors, preferably selected from the group consisting of SB431542 and A-83-01.
  • As the culture solution in step (1) for example, a commercially available medium for the purpose of culturing pluripotent stem cells such as ES cells or iPS cells while maintaining their pluripotency, and which does not contain bFGF is used.
  • the concentration of the TGF ⁇ signal inhibitor is 100 nM to 1 mM, 100 nM to 500 ⁇ M, 100 nM to 100 ⁇ M, 100 nM to 50 ⁇ M, 100 nM to 40 ⁇ M, 100 nM to 30 ⁇ M, 100 nM to 25 ⁇ M when SB431542 is used as the TGF ⁇ signal inhibitor. .
  • the concentration that exhibits ALK inhibitory activity or TGF ⁇ inhibitory activity equivalent to that of SB431542 at the concentration described above can be appropriately set.
  • the concentration equivalent to the concentration when SB431542 is used means a concentration that has an inhibitory effect on the TGF ⁇ signaling pathway equivalent to the concentration of SB431542 (e.g., an effect of inhibiting the activity of ALK4, ALK5 or ALK7 signaling). means The concentration can be easily set by those skilled in the art.
  • a TGF ⁇ signal inhibitor can be added to a commercially available pluripotent stem cell culture medium that does not contain bFGF.
  • a medium that can maintain and grow pluripotent stem cells e.g., Essential 8
  • a commercially available culture medium eg, Essential 6 can also be used.
  • the culture solution used in step (1) is to the extent that it does not affect the culture, that is, to the extent that it does not substantially affect the formation of cerebral organoids obtained in steps (1) and (2).
  • other substances may be contained, preferably a substance that enhances or inhibits signal transduction that affects differentiation induction of pluripotent stem cells, such as BMP signal, Sonic hedge hog signal, etc., is added externally. preferably not.
  • the culture medium used in step (1) may contain a Wnt signaling inhibitor, but desirably no substances that enhance Wnt signaling are externally added.
  • the pluripotent stem cells to be subjected to step (1) are preferably human induced pluripotent stem cells (iPS cells) or human embryonic stem cells (ES cells), more preferably human induced pluripotent stem cells.
  • iPS cells human induced pluripotent stem cells
  • ES cells human embryonic stem cells
  • pluripotent stem cells are cultured in the absence of feeder cells.
  • the absence of feeder cells is also referred to as feeder-free, and refers to a state in which no feeder cells are present in the medium.
  • the culture conditions in the absence of feeder cells herein specifically include culture conditions in which feeder cells such as fibroblasts, SNL cells, and STO cells are not added.
  • the culture medium used in step (1) is preferably a serum-free culture medium that does not substantially contain serum, and if necessary, a serum-free culture medium supplemented with a serum substitute may be used.
  • serum substitutes include those described above, preferably KSR, preferably 1 to 30% KSR, or the like can be used.
  • the culture medium used in step (1) is not particularly limited as long as it is substantially free of bFGF and does not substantially induce TGF ⁇ signals, preferably serum-free. It is desirable that the medium contains components necessary for culturing pluripotent stem cells while maintaining their pluripotency, except for substances that induce signals.
  • pluripotent stem cell media including Essential 8 (manufactured by Thermo Fisher Scientific), S-medium (DS Pharma Biomedical Co.), StemPro (Thermo Fisher Scientific), hESF9 (Proc Natl Acad Sci USA.
  • the pluripotent stem cells to be subjected to step (1) may be cryopreserved pluripotent stem cells immediately after thawing, but are preferably expanded while maintaining the pluripotency of the pluripotent stem cells. It can be cultured and subcultured in advance in a medium suitable for The passage number of the pluripotent stem cells to be subjected to step (1) is not particularly limited, but it is desirable to pass 2 to 8 passages.
  • the culture period in step (1) is less than 5 days, less than 4 days, preferably less than 3 days, more preferably 12 hours or more and 48 hours or less, 18 hours or more and 48 hours or less, more preferably 24 hours or more and 48 hours or less, 24 hours or more and 36 hours or less, or 18 hours or more and 36 hours or less, most preferably about one day. Note that the culture period does not include a period of subculture of pluripotent stem cells as a preparatory stage.
  • the culture in step (1) may be performed under either suspension culture or adherent culture, but is preferably performed by adherent culture.
  • the incubator used for adherent culture is not particularly limited as long as it is capable of "adherent culture", but cell-adhesive incubators are preferred.
  • Examples of cell-adhesive incubators include those in which the surface of the incubator is artificially treated for the purpose of improving adhesion to cells. Specifically, the interior is coated with the aforementioned coating agent. and an incubator.
  • Coating agents include, for example, laminin [laminin ⁇ 5 ⁇ 1 ⁇ 1 (hereinafter, laminin 511), laminin ⁇ 1 ⁇ 1 ⁇ 1 (hereinafter, laminin 111), laminin ⁇ 1 ⁇ 1 ⁇ 2 (laminin 112), laminin ⁇ 2 ⁇ 1 ⁇ 1 (laminin 211), laminin ⁇ 2 ⁇ 1 ⁇ 2 (laminin 212), laminin ⁇ 2 ⁇ 2 ⁇ 1 (laminin 221), laminin ⁇ 2 ⁇ 2 ⁇ 2 (laminin 222), laminin ⁇ 5 ⁇ 1 ⁇ 2 (laminin 512), etc., and laminin fragments (laminin 511E8, etc.)], entactin, collagen, gelatin, vitronectin, synthmax (Corning), Examples include extracellular matrices such as matrigel, and polymers such as polylysine and polyornithine.
  • a culture vessel that has been surface-treated such as a positive charge treatment, can also be used.
  • Laminin is preferred, and laminin 511E8 is more preferred.
  • Laminin 511E8 can be purchased commercially (eg iMatrix-511, Nippi).
  • Culture conditions such as culture temperature and CO 2 concentration in step (1) can be appropriately set.
  • the culture temperature is, for example, about 30°C to about 40°C, preferably about 37°C.
  • the CO 2 concentration is, for example, about 1% to about 10%, preferably about 5%.
  • Step (1) is a maintenance culture step of culturing pluripotent stem cells while maintaining their pluripotency in the absence of support cells, and is performed before step (2) (differentiation induction step).
  • This is the neural-differentiation preparation step.
  • This neural differentiation preparatory step is a step of preparation before induction of neural differentiation or before introduction of neural differentiation, and the pluripotent stem cells cultured in step (1) are TGF ⁇ -related When gene expression is suppressed and the pluripotent stem cells are thereby induced to differentiate into nerve cells, the formation efficiency of cerebral organoids is high.
  • Step (2)> The cells obtained in step (1) can be induced to differentiate into nerve cells by methods well known to those skilled in the art, thereby obtaining cerebral organoids.
  • a differentiation induction method capable of differentiating pluripotent stem cells into cell populations constituting cerebral organoids can be appropriately selected.
  • the method is well known, for example, WO2015/076388, WO2016/167372, Sakaguchi et al., Stem Cell Reports 2019 Vol 13 458-473, Kitahara, et al., Stem Cell Reports 2020 Vol. 15, 467-481 (Non-Patent Document 1) and Kadoshima et al., 2013, PNAS, vol.110, No. 50, 20284-20289, etc. can be used.
  • the differentiation induction method performed in step (2) includes the following steps (2a) and (2b): (2a) the cells obtained in step (1) are subjected to suspension culture, preferably stationary culture, in a culture medium containing a TGF ⁇ signal inhibitor and a Wnt signal transduction inhibitor to obtain a cell mass (2b) The cell mass obtained in step (2a) is placed in a culture medium substantially free of TGF ⁇ signal inhibitors or Wnt signal transduction inhibitors, preferably neither TGF ⁇ signal inhibitors nor Wnt signal transduction inhibitors. A step of obtaining cerebral organoids by floating culture in a culture medium.
  • the cells obtained in step (1) are dispersed in a culture medium, preferably in a serum-free medium substantially free of serum (unadjusted or unpurified serum), and cultured under non-adhesive conditions ( (i.e., suspension culture), and aggregate a plurality of cells to form a cell cluster.
  • a serum-free culture medium containing a serum substitute may be used as the culture medium used for agglutination.
  • the incubator used for this cell cluster formation is not particularly limited, but examples include flasks, tissue culture flasks, dishes, Petri dishes, tissue culture dishes, multidishes, microplates, microwell plates, micropores, and multiplates. , multiwell plates, chamber slides, Petri dishes, tubes, trays, culture bags, bioreactors, and roller bottles.
  • a method of forming a cell mass by embedding in a gel such as alginic acid hydrogel can also be used.
  • the incubator is preferably cell non-adherent so as to allow culture under non-adherent conditions.
  • Non-cell-adhesive culture vessels include those in which the surface of the culture vessel is artificially treated to make it non-adhesive to cells, and those artificially treated for the purpose of improving adhesion to cells (e.g., Those that have not been coated with an extracellular matrix or the like) can be used.
  • the cells obtained in step (1) are recovered from the subculture and dispersed to a single cell or a state close to it. This dispersal is performed using a suitable cell dissociation solution.
  • a suitable cell dissociation solution for example, a chelating agent such as EDTA, a proteolytic enzyme such as trypsin, collagenase IV, metalloprotease, and the like can be used alone or in appropriate combination. Among them, those with low cytotoxicity are preferred, and commercially available products such as dispase (Edia), TrypLE (manufactured by Gibco) and Accutase (MILLIPORE) are available as such cell dissociation solutions.
  • the dispersed cells are suspended in a medium obtained by adding Y-27632 to the above medium (serum-free medium, ie, basal medium used in step (2a) described below).
  • an inhibitor of Rho-associated coiled-coil kinase was added from the start of culture. It is preferably added (WO2008/035110, Watanabe, K. et al., Nature Biotechnology, 2007, vol.25, No.6, page 681-686).
  • ROCK inhibitors examples include those mentioned above, preferably Y-27632 and the like.
  • the ROCK inhibitor is added, for example, within 20 days, within 15 days, preferably within 10 days, more preferably within 6 days from the start of culture.
  • the concentration of ROCK inhibitor may be constant or tapered.
  • culturing in the presence of the ROCK inhibitor for 10 to 20 days, preferably 15 to 20 days, even more preferably about 17 to 19 days, during which the concentration of the ROCK inhibitor is gradually decreased. can be done.
  • culturing in the presence of a ROCK inhibitor for 10 to 25 days, preferably 12 to 25 days, 10 to 20 days, even more preferably about 15 to 20 days, or about 17 to 19 days, and the concentration of the ROCK inhibitor may be tapered in the meantime.
  • the concentration of the ROCK inhibitor used for suspension culture is a concentration that can suppress cell death of pluripotent stem cells induced by dispersion.
  • the concentration corresponds to about 0.1 to 200 ⁇ M, preferably about 2 to 100 ⁇ M, more preferably about 30 to 100 ⁇ M.
  • the concentration of the ROCK inhibitor may be varied during the period of addition.
  • the concentration may be halved in the second half of the period, or the concentration may be gradually reduced from the start of step (2a).
  • the cell suspension obtained in step (1) is sown in the culture vessel and cultured under non-adhesive conditions to aggregate a plurality of cells to form a cell mass.
  • SFEBq method it is preferable to rapidly aggregate dispersed cells to form one cell cluster in one culture compartment.
  • Methods for rapidly aggregating dispersed cells include, for example, the following methods: 1) A method in which dispersed cells are confined in a culture compartment of relatively small volume (e.g., 1 ml or less, 500 ⁇ l or less, 200 ⁇ l or less, 100 ⁇ l or less) to form a single cell cluster in the compartment, or 2). A method of placing dispersed cells in a centrifugation tube, centrifuging it, and depositing the cells in one place to form a single cell mass in the tube.
  • the culture compartment is allowed to stand after the dispersed cells are confined.
  • culture compartments include wells in multiwell plates (384 wells, 192 wells, 96 wells, 48 wells, 24 wells, etc.), micropores, chamber slides, tubes, medium droplets in the hanging drop method, and the like. can be, but are not limited to: Dispersed cells confined in the compartments are sedimented in one place by gravity, or the cells adhere to each other to form one cell mass per culture compartment.
  • the shape of the bottom of multiwell plates, micropores, chamber slides, tubes, etc. is preferably U-bottom or V-bottom so that dispersed cells can easily settle in one place.
  • the number of cells to be seeded in one culture compartment is such that one cell cluster is formed per culture compartment, and if the cell cluster can be induced to differentiate into forebrain cells by the method of the present invention,
  • the number of cells obtained in step (1) is usually about 1 ⁇ 10 3 to about 5 ⁇ 10 4 , preferably about 1 ⁇ 10 3 to about 2 ⁇ 10 4 per culture compartment, More preferably, about 2 ⁇ 10 3 to about 1.2 ⁇ 10 4 seeds are sown.
  • the cells usually about 1 ⁇ 10 3 to about 5 ⁇ 10 4 cells, preferably about 1 ⁇ 10 3 to about 2 ⁇ 10 4 cells, more preferably about 1 ⁇ 10 3 to about 5 ⁇ 10 4 cells per culture compartment A single cluster of 2 ⁇ 10 3 to about 1.2 ⁇ 10 4 cells is formed.
  • the cells obtained in step (1) are usually about 1 ⁇ 10 3 to about 5 ⁇ 10 5 , preferably about 1 ⁇ 10 3 to about 2 ⁇ 10 5 , more preferably about 1 ⁇ 10 3 to about 2 ⁇ 10 5 cells per culture compartment. About 2 ⁇ 10 3 to about 1 ⁇ 10 5 seeds are sown. Then, by rapidly agglutinating the cells, usually 5 ⁇ 10 2 to about 5 ⁇ 10 5 cells, preferably about 5 ⁇ 10 2 to about 2 ⁇ 10 5 cells, more preferably about 1 ⁇ 10 5 cells per culture compartment are obtained. A single cell cluster of ⁇ 10 3 to about 1 ⁇ 10 5 cells is formed.
  • the time to cell cluster formation can be determined as appropriate as long as one cell cluster is formed per compartment and the cell cluster can be induced to differentiate into cerebral organoids, but is preferably 24 hours.
  • Cell clusters are formed within, more preferably within 12 hours.
  • the time to form cell clusters is preferably within 48 hours, more preferably within 24 hours.
  • culture temperature is not particularly limited, but is, for example, about 30 to 40°C, preferably about 37°C.
  • the CO 2 concentration is, for example, about 1-10%, preferably about 5%.
  • a qualitatively uniform population of cell masses can be obtained.
  • the qualitative uniformity of the cell aggregates is determined by the size and number of cells, macroscopic morphology, microscopic morphology and uniformity thereof by tissue staining analysis, expression of differentiation and undifferentiated markers and their uniformity, differentiation It can be evaluated based on the regulation of marker expression and its synchrony, reproducibility of differentiation efficiency between cell clusters, and the like.
  • the term "homogeneous" cell mass population means that 80% or more of the cell mass population is within the range of the average value of the parameter ⁇ 20% in the cell mass population, preferably It means within the range of mean value ⁇ 10%, more preferably mean value ⁇ 5%.
  • the culture medium used in step (2a) contains a TGF ⁇ signal inhibitor and a Wnt signaling inhibitor.
  • TGF ⁇ signal inhibitors can be used, preferably SB431542, A-83-01, or XAV-939.
  • Wnt signaling inhibitors those described above can be used, and preferred examples include IWR-1-end, C59, LGK-974, and DKK-1 (protein).
  • Wnt signaling inhibitor and TGF ⁇ signaling inhibitor is IWR-1-endo and SB431542.
  • the concentration of the Wnt signaling inhibitor in the medium can be appropriately set within a range in which cell masses can be induced to differentiate into forebrain cells. , 0.1 to 50 ⁇ M, preferably 0.3 to 10 ⁇ M, more preferably 0.3 to 5 ⁇ M.
  • the concentration of the TGF ⁇ signal inhibitor in the medium can be appropriately set within a range in which cell masses can be induced to differentiate into forebrain cells. , preferably 1 to 50 ⁇ M, more preferably 1 to 10 ⁇ M, which exhibits TGF ⁇ signal inhibitory activity.
  • the culture solution used in step (2a), i.e., the medium used for forming the cell mass and for suspension culture of the cell mass, is not particularly limited as long as it can be used for culturing animal cells, and is defined as above.
  • the medium used for culturing animal cells can be prepared from the basal medium.
  • basal medium used in step (2a) examples include Glasgow MEM medium, DMEM medium, F-12 medium (also referred to as F12 medium) and DMEM/F12 medium. Glasgow MEM medium is preferably used.
  • the medium used for cell cluster formation may contain a serum substitute.
  • the above-mentioned serum substitutes can be used, and examples thereof include KSR (knockout serum replacement) (manufactured by Invitrogen), Chemically-defined Lipid concentrated (manufactured by Gibco), and Glutamax (manufactured by Gibco).
  • a medium containing about 10-30% serum replacement eg, KSR
  • KSR serum replacement
  • the medium used during cell cluster formation may contain a serum replacement.
  • the above-mentioned serum substitutes can be used, and examples thereof include KSR (manufactured by Gibco), Chemically-defined Lipid concentrated (manufactured by Gibco), and Glutamax (manufactured by Gibco).
  • a medium containing an appropriate amount of serum replacement eg, 1-30% KSR
  • an appropriate amount of serum replacement eg, 1-30% KSR
  • the medium used for suspension culture of cell masses can contain other additives to the extent that they do not adversely affect the induction of differentiation into forebrain cells.
  • Additives include, for example, insulin, iron sources (e.g., transferrin), minerals (e.g., sodium selenate, etc.), sugars (e.g., glucose, etc.), organic acids (e.g., pyruvic acid, lactic acid, etc.), serum proteins (e.g., albumin, etc.). ), amino acids (e.g. L-glutamine etc.), reducing agents (e.g. 2-mercaptoethanol etc.), vitamins (e.g. ascorbic acid, d-biotin etc.), antibiotics (e.g. streptomycin, penicillin, gentamicin etc.), buffers ( For example, HEPES, etc.) and the like, but are not limited to these.
  • iron sources e.g., transferrin
  • minerals e.g., sodium selenate, etc.
  • the medium used for the suspension culture of the cell mass contains patterning factors such as Fgf, Wnt, Nodal, Notch, and Shh; It preferably does not contain growth factors such as albumin.
  • culture temperature is, for example, about 30-40°C, preferably about 37°C.
  • the CO 2 concentration is for example about 1-10%, preferably about 5%.
  • the O2 concentration is for example about 20%.
  • the suspension culture in step (2a) may be static culture, shaking culture, orbital culture, or stirring culture, but static culture is preferred. Alternatively, static culture may be performed only for a part of the period of step (2a).
  • Step (2a) is carried out for a period of time sufficient for the differentiation direction to the forebrain region to be determined and forebrain marker-positive cell clusters (eg, Foxg1-positive cell clusters) to be induced. That is, a cell mass containing forebrain marker-positive cells can be obtained by step (2a).
  • forebrain marker-positive cell clusters eg, Foxg1-positive cell clusters
  • step (2a) is performed until at least one forebrain marker-positive cell is generated.
  • step (2a) is performed, for example, until 50% or more, preferably 70% or more of the cell masses in culture become positive for the forebrain marker.
  • step (2a) is performed until 30% or more, preferably 50% or more, more preferably 70% or more of the cells contained in the cell mass generate a forebrain marker-positive cell mass. .
  • the culture period in step (2a) may vary depending on the type of Wnt signaling inhibitor and TGF ⁇ signaling inhibitor, and the culture conditions. is used, it is 7 to 30 days, preferably 15 to 20 days (eg, 18 days).
  • step (2b) the cell mass obtained in step (2a) is subjected to suspension culture in a culture medium substantially free of TGF ⁇ signal inhibitors and Wnt signal transduction inhibitors to obtain cerebral organoids.
  • the suspension culture in step (2b) may be performed under high oxygen partial pressure conditions.
  • a high oxygen partial pressure condition means an oxygen partial pressure condition exceeding the oxygen partial pressure in air (20%).
  • the oxygen partial pressure in step (2b) is, for example, 30-60%, preferably 35-60%, more preferably 38-60%.
  • the medium used in step (2b) is not particularly limited as long as it is a medium used for culturing animal cells, and the medium defined above is prepared as a basal medium. can do.
  • basal media examples include Glasgow MEM medium, DMEM medium, F-12 medium, and DMEM/F12 medium.
  • DMEM/F12 medium is used.
  • the medium used in step (2b) is preferably a serum-free medium, and may contain serum replacement if necessary.
  • the above-mentioned serum substitutes can be used, and examples thereof include N2 supplement, B27 supplement, Neurocult SM1 Neuronal supplement, KSR and the like.
  • the concentration of the serum substitute may be adjusted as appropriate. Specifically, for example, N2 supplements are about 0.1 to 3%, preferably about 1%, and B27 supplements are about 0.1%. A medium containing ⁇ 10%, preferably 2%, and for KSR, preferably about 1-30% serum replacement can be used.
  • step (2b) the Wnt signaling inhibitor and TGF ⁇ signaling inhibitor used in step (2a) are unnecessary.
  • the medium used in step (2b) is free of Wnt signaling inhibitors and TGF ⁇ signaling inhibitors.
  • the culture medium in step (2b) is preferably a serum-free culture medium substantially free of serum, more preferably a serum-free culture medium containing a serum substitute.
  • the medium used in step (2b) preferably contains an N2 supplement as a serum substitute in order to promote differentiation induction into cerebral cortical cells.
  • N2 supplement is a known serum-replacement composition containing insulin, transferrin, progesterone, putrescine and sodium selenite, available from Gibco/Thermo Fisher Scientific and others.
  • the amount of the N2 supplement added is such that differentiation induction into forebrain tissue or its progenitor tissue, or differentiation induction into nerve cells, and/or differentiation induction into cells constituting the cerebral cortex or their progenitor cells is promoted. can be set as appropriate.
  • the medium used in step (2b) preferably contains a chemically defined lipid concentrate for long-term maintenance and culture of the ventricular zone.
  • Chemically Defined Lipid Concentrate is a lipid mixture containing cholesterol, DL- ⁇ -tocopherol, arachidonic acid, linolenic acid, linoleic acid, myristic acid, oleic acid, palmitic acid, palmitoleic acid, and stearic acid, each purified.
  • a commercially available chemically defined lipid concentrate can be used, for example, it can be purchased from Gibco/Thermo Fisher Scientific.
  • the medium used for suspension culture of cell clusters can contain other additives to the extent that they do not adversely affect differentiation induction into cerebral cortical cells.
  • Additives include, for example, insulin, iron sources (e.g., transferrin), minerals (e.g., sodium selenate, etc.), sugars (e.g., glucose, etc.), organic acids (e.g., pyruvic acid, lactic acid, etc.), serum proteins (e.g., albumin, etc.). ), amino acids (e.g. L-glutamine etc.), reducing agents (e.g. 2-mercaptoethanol etc.), vitamins (e.g. ascorbic acid, d-biotin etc.), antibiotics (e.g. streptomycin, penicillin, gentamicin etc.), buffers ( For example, HEPES, etc.) and the like, but are not limited to these.
  • iron sources e.g., transferrin
  • minerals e.g., sodium selenate, etc.
  • the medium in step (2b) may contain serum.
  • Serum can contribute to long-term maintenance culture of the ventricular zone.
  • Serum includes, but is not limited to, FBS and the like.
  • the serum is inactivated.
  • the serum concentration in the medium can be appropriately adjusted within a range that can contribute to long-term maintenance culture of the ventricular zone, but is usually 1-20% (v/v).
  • the medium in step (2b) may contain heparin.
  • Heparin may contribute to long-term maintenance of the ventricular zone.
  • the heparin concentration in the medium can be appropriately adjusted within a range that can contribute to long-term maintenance culture of the ventricular zone, but is usually 0.5 to 50 ⁇ g/ml, preferably 1 to 10 ⁇ g/ml (eg, 5 ⁇ g/ml). /ml).
  • the medium in step (2b) may contain extracellular matrix components.
  • Extracellular matrix may contribute to long-term maintenance culture of the ventricular zone.
  • Extracellular matrix components refer to various components normally found in extracellular matrices.
  • basement membrane components are used in the methods of the present invention. Main components of the basement membrane include, for example, type IV collagen, laminin, heparan sulfate proteoglycan, and entactin.
  • Commercially available extracellular matrix components to be added to the medium include, for example, Matrigel (BD Bioscience) and human laminin (Sigma-Aldrich). Matrigel is a basement membrane preparation from Engelbreth Holm Swarn (EHS) mouse sarcoma.
  • EHS Engelbreth Holm Swarn
  • Matrigel The main components of Matrigel are type IV collagen, laminin, heparan sulfate proteoglycans, and entactin, in addition to TGF ⁇ , fibroblast growth factor (FGF), tissue plasminogen activator, a growth factor naturally produced by EHS tumors. is included.
  • FGF fibroblast growth factor
  • Matrigel's growth factor reduced products have lower concentrations of growth factors than regular Matrigel, with typical concentrations of ⁇ 0.5 ng/ml EGF, ⁇ 0.2 ng/ml NGF, and ⁇ 5 pg/ml PDGF. , IGF-1 at 5 ng/ml and TGF ⁇ at 1.7 ng/ml.
  • the use of growth factor reduced products is preferred in the method of the present invention.
  • the concentration of extracellular matrix components in the medium can be appropriately adjusted within a range that can contribute to long-term maintenance and culture of the ventricular zone. volume, more preferably 1/100 volume.
  • the medium in step (2b) contains serum and heparin in addition to N2 supplement and Chemically Defined Lipid Concentrate.
  • the medium may further contain an extracellular matrix.
  • the culture medium of this embodiment is suitable for observing long-term differentiation induction of the telencephalon or its partial tissue, or its progenitor tissue.
  • a medium containing N2 supplement, Chemically Defined Lipid Concentrate, serum and heparin (optionally further extracellular matrix) may be used over the entire extent of step (2b), but only for a part of the period medium may be used.
  • a medium containing N2 supplement and Chemically Defined Lipid Concentrate and containing no serum, heparin and extracellular matrix is used, and from the middle (for example, in Foxg1 positive aggregates, brain ventricle Neuroepithelial-like structure with similar cavities (multi-columnar columnar epithelium), for example, after the stage of formation of multi-columnar columnar epithelium with multiple hemispherical or spherical cavities), N2 supplement, Chemically Defined Lipid Concentrate, serum, Media may be switched to containing heparin (optionally extracellular matrix).
  • culture temperature and CO 2 concentration in step (2b) can be appropriately set.
  • the culture temperature is, for example, about 30-40°C, preferably about 37°C.
  • the CO 2 concentration is for example about 1-10%, preferably about 5%.
  • Step (2b) is carried out for at least a period of time sufficient for forebrain marker (eg, Foxg1)-positive cells to be generated and a cerebral cortex-like structure to be formed.
  • forebrain marker eg, Foxg1
  • the cerebral cortex-like structure can be confirmed by microscopic observation.
  • the culture period in step (2b) may vary depending on the types of Wnt signaling inhibitor and TGF ⁇ signaling inhibitor in step (2a), etc., and thus cannot be specified unconditionally.
  • sex stem cells it is at least 10 days, or 10 to 40 days, preferably 10 to 31 days, more preferably 15 to 24 days.
  • step (2b) is preferably continued until reaching the desired stage of differentiation, ie, the formation of cerebral organoids comprising a plurality of cerebral cortex-like structures.
  • the culture vessel used for suspension culture of the cell mass is not particularly limited, but examples include flasks, tissue culture flasks, dishes, petri dishes, tissue culture dishes, multidishes, microplates, and microwells. Plates, micropores, multiplates, multiwell plates, chamber slides, petri dishes, tubes, trays, culture bags, bioreactors, and roller bottles.
  • the incubator is preferably cell non-adherent so as to allow culture under non-adherent conditions.
  • Non-cell-adhesive incubators include those whose surface has been artificially treated to make it non-adhesive to cells, and those that have been artificially treated for the purpose of improving adhesion to cells (e.g. , coating treatment with an extracellular matrix, etc.) can be used.
  • an oxygen-permeable culture vessel may be used as the culture vessel used for floating culture of the cell mass in step (2b).
  • Oxygen supply to the cell mass is improved by using an oxygen permeable incubator.
  • an oxygen-permeable incubator may be used in order to avoid the risk that the cell aggregates grow large and the cells in the cell aggregates are not supplied with sufficient oxygen.
  • the cell mass may be statically cultured, or the aggregate may be intentionally moved by rotating culture or shaking culture.
  • Static culture may be performed throughout the entire period of step (2b), or static culture may be performed only for a part of the period.
  • the suspension culture in step (2b) is stationary culture. At this time, it is preferable to culture under the high oxygen partial pressure conditions described above.
  • the suspension culture in step (2b) is shaking culture. At this time, culture under high oxygen partial pressure conditions is unnecessary.
  • a forebrain marker-positive cerebral cortex-like structure is formed in the cell mass by step (2b).
  • 70% or more of the cells contained in the cell mass containing cerebral cortex-like structures are forebrain marker-positive (eg, Foxg1-positive).
  • the cerebral cortex-like structure formed in the cell mass in step (2b) is a rosette-like structure with a neuronal layer outside the neuroepithelium.
  • the cerebral cortex-like structure has a neural stem cell marker-positive, specifically PAX6 and/or SOX2-positive cell layer on the luminal side, and a phosphorylated Histone H3-positive cell layer on the luminal side. Contains mitotic cells.
  • ⁇ III-Tubulin ⁇ TubIII, TUBB3 or TUJ1
  • Ctip2 an early cortical plate marker for the cerebral cortex
  • the aggregate obtained by the production method of the present invention contains cerebral cortex precursor tissue.
  • the method for producing cerebral organoids of the present invention may further include step (3), which is a step of selecting cerebral organoids.
  • step (3) from the plurality of cell clusters obtained in step (2), one or more selected from the group consisting of cell cluster shape, internal structure, size, surface color or pattern, and gene expression are used as indicators. , the process of selecting the desired cerebral organoids.
  • the indicators it is preferable to adopt 2 or more, 3 or more, or 4 or more, and the indicators are preferably the shape of the cell mass, the internal structure, the surface color or pattern, and/or gene expression.
  • cell mass shape, internal structure and/or gene expression are more preferred, and cell mass shape is particularly preferred.
  • the shape of the cell mass is spherical (spherical), it can be selected as a desired cerebral organoid.
  • Each index for selecting cerebral organoids preferably conforms to the general definition of cerebral organoids, for example, at least one, at least two, at least three of the following (1) to (5), or Cell clusters that fill four may be determined to be cerebral organoids.
  • the cerebral organoid preferably expresses one or more genes selected from the group consisting of SLC17A7, NEUROD6, and EMX1, preferably all genes.
  • At least one, at least two, at least three or more, or at least five or more of the genes expressed in the non-target cells listed in Table 6 below are not substantially expressed. Furthermore, it is preferable that one or more genes selected from the group consisting of GAD2, COL1A1, TYR, TTR and HOXA2 are not substantially expressed, and 2 or more, 3 or more, 4 or more or all of these markers are It is more preferable not to express.
  • the term "substantially not expressed" of a gene means that the expression level of the protein, which is the expression product of the gene, is below the level at which physiological functions are exhibited.
  • the state of "substantially not expressed” specifically refers to any control gene that is constantly expressed in cells (e.g., GAPDH, ACTB as a constantly expressed gene). , B2M, 18S ribosomal RNA, etc.) is 1/10 or less of the expression level of the control gene.
  • the spherical structure in (1) above and the cerebral cortex-like structure in (2) above are as described above.
  • representative examples of cell clusters that are spherical but do not have cerebral cortex-like structures are the cell clusters called “Potato-like” or “Jelly-like” in FIG. is.
  • Pigmentation in (3) above means that a part of the cell mass has a black or brown area.
  • a representative example of the cell mass with pigmentation is the cell mass called "Pigment" in FIG.
  • a projection shape, or a balloon-like shape in part of the cell mass in (4) above means that the cell mass has a highly transparent bag-like structure, a fibrous epithelial structure, Or it means that there is no protrusion-like structure.
  • a representative example of the cystic shape is the shape called "Transparent” in FIG.
  • a representative example of the projection shape is a shape called "Cotton-like” in FIG.
  • a representative example of the balloon-like shape is the shape called "Balloon” in FIG.
  • the features (1) to (4) above can be determined and removed by visual observation after the cell mass is enlarged as the case may be.
  • the shape may be determined by an apparatus using software capable of image analysis based on an enlarged image of a microscope. In this case, a method such as deep learning may be used to improve the accuracy of shape discrimination.
  • the cerebral organoid may be a spherical cell mass with a diameter (equivalent circle diameter) of about 100 ⁇ m to 10000 ⁇ m, preferably about 500 ⁇ m to 5000 ⁇ m.
  • the cerebral cortex-like structure contained inside the cell mass may have a diameter (equivalent circle diameter) of about 10 ⁇ m to 1000 ⁇ m, preferably about 50 ⁇ m to 500 ⁇ m.
  • the expression of a gene can be determined by its expression level.
  • the expression level of a gene can be evaluated by the amount of expression product (mRNA or protein or fragment thereof) of the gene, preferably the expression level of mRNA. Specifically, it can be determined by quantitative RT-PCR, RT-PCR, next-generation sequence analysis, microarray analysis, Western blotting, ELISA, immunostaining, flow cytometry, and the like.
  • the determination may be made for each cell mass, or in the case of the same lot, a certain number of cell masses (eg, 1 or more, 3 or more, 5 or more) may be sampled for determination.
  • the shape, internal structure, size, and surface color or pattern of a cell mass can be determined by visual observation under an inverted microscope, preferably for each cell mass.
  • Gene expression is preferably determined by sampling rather than by cell mass.
  • quantitative RT-PCR method, RT-PCR method, next-generation sequence analysis, microarray analysis, Western blotting method, ELISA method, immunostaining method , flow cytometry, and the like are examples of cell masses selected by shape and / or internal structure.
  • step (3) cell clusters determined to be cerebral organoids by the determination method described above are collected and selected as cerebral organoids.
  • the cerebral organoids sorted in step (3) are enriched in cerebral organoids compared to when they are not sorted. That is, through step (3), the ratio of cerebral organoids in the population of cell masses can be further increased.
  • the cell culture of the present invention is a cell culture produced using the method for producing a cerebral organoid comprising steps (1) and (2) described above, and contains a plurality of spherical cell aggregates.
  • the ratio can be calculated by sampling a cell culture and calculating the number of cerebral organoids in the total number of spherical cell aggregates in the sample.
  • a cerebral organoid is a spherical cell mass that encloses one or more, preferably multiple, cerebral cortex-like structures with a neuronal layer on the outside of the neuroepithelium.
  • the determination method of cerebral organoids conforms to the method of step (3) above.
  • the proportion of cerebral cortex-like structures in individual cerebral organoids may be 20% or more, preferably 40% or more, and more preferably 50% or more.
  • the ratio of cerebral cortex-like structures to the cerebral organoid is the ratio of the cerebral cortex-like structures to the area or volume of the entire cerebral organoid, and from the viewpoint of easy evaluation, it is preferably the ratio of the area.
  • the ratio may be the average value of a plurality (eg, 2 to 20, preferably 5 or 10) of cerebral organoids.
  • the ratio may be evaluated, for example, by the ratio of cerebral cortex-like structures to the cross-sectional area of a section containing the central part of the cerebral organoid.
  • the central part means the central part of the cross section having the maximum diameter of the cerebral organoid.
  • immunostaining is performed on cerebral organoid sections, and cells that are positive for neural stem cell markers and / or neural progenitor cell markers, and neuronal markers are determined as cerebral cortex-like structures, and cerebral cortex-like It may be performed by calculating the ratio of the area of the structure to the area of the section. Alternatively, it may be calculated as the ratio of the volume of the cerebral cortex-like structure to the volume of the cerebral organoid.
  • the neural stem cell and/or neural progenitor cell marker includes Pax6, and the neuronal cell marker includes the forebrain marker Foxg1, the cerebral cortex marker Ctip2, and the like.
  • 20% or more, preferably 40% or more, preferably 70% or more of the total number of cells are Foxg1-positive cells.
  • the cerebral cortex-like structure has a neural stem cell marker: PAX6 and/or SOX2-positive cell layer on the luminal side, and contains phosphorylated Histone H3-positive mitotic cells in the most luminal part. .
  • ⁇ III-Tubulin a marker for postmitotic neurons
  • ⁇ TubIII, TUBB3 or TUJ1 a marker for postmitotic neurons
  • ⁇ TubIII, TUBB3 or TUJ1 a marker for postmitotic neurons
  • ⁇ TubIII, TUBB3 or TUJ1 a marker for postmitotic neurons
  • Ctip2 and/or Tbr1 are included. They contain Reelin-positive Cajal-Retius cells, the first layer of neurons in the cerebral cortex, and may have a Laminin-rich layer near the surface.
  • the cerebral organoid may be a cerebral organoid produced using the method for producing a cerebral organoid, which includes steps (1) and (2) above.
  • a cerebral organoid of one embodiment may be a cerebral organoid selected by the above step (3), or may be a cell mass having the following characteristics (1) to (5).
  • the cerebral organoids express one or more, two or more selected from the group consisting of SLC17A7, NEUROD6, and EMX1, or all of them. Furthermore, it is preferable that one or more genes selected from the group consisting of GAD2, COL1A1, TYR, TTR and HOXA2 are not substantially expressed, and 2 or more, 3 or more, 4 or more or all of these markers are It is more preferable not to express.
  • the cerebral organoid is as described above, and the number of cells per cell mass is about 5 ⁇ 10 3 to 5 ⁇ 10 6 , preferably about 1 ⁇ 10 4 to 3 ⁇ 10 6 .
  • Method 1 for producing cerebral cortical cell mass includes a method for producing a cerebral cortex cell mass from pluripotent stem cells in the absence of feeder cells, including the following steps (i) and (ii). (i) obtaining cerebral organoids from pluripotent stem cells; (ii) culturing the cerebral organoids obtained in step (i) in a culture medium containing a Notch signal inhibitor, preferably a ⁇ -secretase inhibitor, to obtain a cerebral cortex cell mass;
  • a Notch signal inhibitor preferably a ⁇ -secretase inhibitor
  • the method for obtaining cerebral organoids from pluripotent stem cells is not limited, and they can be prepared by methods well known to those skilled in the art. Examples of such a well-known method include step (2) in the method for producing cerebral organoids in 2 above.
  • Method 1 for producing cerebral cortical cell mass comprises obtaining cerebral organoids from pluripotent stem cells by the method for producing cerebral organoids described in 2 above in step (i). That is, Method 1 for producing a cerebral cortical cell mass includes treating the cerebral organoids obtained by the method for producing a cerebral organoid described in 2 above in the following steps (i) and (ii). A method for producing cerebral cortical cell masses from pluripotent stem cells in the presence.
  • step (i) obtaining cerebral organoids by the method for producing cerebral organoids according to 2 above (that is, including the method according to any one of claims 1 to 10); (ii) culturing the cerebral organoids obtained in step (i) in a culture medium containing a Notch signal inhibitor, preferably a ⁇ -secretase inhibitor, to obtain a cerebral cortex cell mass;
  • a Notch signal inhibitor preferably a ⁇ -secretase inhibitor
  • Step (i) is as described in step (1), step (2a) and step (2b) in 2 above.
  • Step (i) may further include step (3) in 2 above.
  • step (2b) is performed for about 7-31 days, preferably about 7-21 days.
  • step (ii) is performed by optionally performing selection according to step (3) and replacing the medium with a medium containing a Notch inhibitor, preferably a ⁇ -secretase inhibitor. be able to.
  • step (ii) may be performed after step (2b) described above, followed by screening in step (3).
  • Notch signal inhibitors used in step (ii) preferably include ⁇ -secretase inhibitors.
  • ⁇ -secretase inhibitors include N-[N-(3,5-difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester (DAPT) or Compound E.
  • the culture medium used may be the same as the culture medium used in step (i), that is, step (2b) of the production method of 2, except that it contains a Notch signal inhibitor. can.
  • a culture medium different from the culture medium used in step (2b) may be appropriately selected from the culture conditions described in step (2b) of the production method in 2 above.
  • step (ii) may conform to step (2b) as appropriate.
  • the concentration of the Notch signal inhibitor, preferably the ⁇ -secretase inhibitor, in the culture medium can be appropriately set within a range where proliferative cells such as neural stem cells that may be contained in the cell mass can be suppressed.
  • DAPT a ⁇ -secretase inhibitor
  • ⁇ -secretase activity corresponding to 0.1 to 1000 ⁇ M, 1 to 100 ⁇ M, preferably 1 to 30 ⁇ M, more preferably 5 to 20 ⁇ M or the ⁇ - Concentrations exhibiting Notch signaling inhibitory activity based on secretase activity can be mentioned.
  • Step (ii) is performed about 28 to 49 days, preferably about 28 to 44 days after the start of suspension culture in step (i) (start of induction of differentiation into nerve cells).
  • the culture period of step (ii) is 1 to 7 days, preferably 2 to 6 days, more preferably 2 to 4 days.
  • Method 2 for producing cerebral cortical cell mass includes a method for producing cerebral cortical cell clusters from pluripotent stem cells in the absence of supporting cells, the method comprising (i) obtaining cerebral organoids from pluripotent stem cells; (ii) culturing the cerebral organoids obtained in step (i) in a culture medium; (iii) dispersing the cell culture obtained in step (ii) into a single cell or a cell clump of 2 to 5 cells; (iv) culturing the cell culture obtained in step (ii) or the cell population obtained in step (iii) in a medium containing one or more neurotrophic factors, ascorbic acid, and a cAMP activator;
  • the step of dispersing into a single cell or a cell clump of 2 to 5 cells in the step (iii) is an optional step, and the culture medium and / or the step in the step (ii)
  • the culture solution (iv) contains a Notch signal inhibitor.
  • step (i) the method for obtaining cerebral organoids from pluripotent stem cells is not limited, and they can be prepared by methods well known to those skilled in the art.
  • cerebral organoids are obtained from pluripotent stem cells by the method for producing cerebral organoids described in 2 above, particularly the production method including steps (1), (2a) and (2b).
  • the culture solution in step (ii) and/or the culture solution in step (iv) may contain a Notch signal inhibitor during part or all of the steps.
  • a culture medium not containing the Notch signal inhibitor is used when exchanging the culture medium in step (ii) or the culture medium in step (iv).
  • Part of the period is not particularly limited as long as the effect of treatment with a Notch signal inhibitor is obtained, and specifically several hours to several days during the culture period of the step (ii) or the step (iv) may be 1-7 days, preferably 2-6 days, more preferably 2-4 days. It may also be repeated for very short treatment periods (eg, 4 hours, 12 hours, 24 hours, 2 days).
  • a period containing a Notch signal inhibitor and a period not containing a Notch signal inhibitor are alternately performed, or combinations using Notch signal inhibitors at different concentrations are also within the scope of the present application.
  • the description of step (ii) in Method 1 for producing cerebral cortical aggregates can be referred to.
  • One aspect of the present invention includes “Method 2-1 for producing cerebral cortical cell mass”, in which step (i) is performed according to the method for producing cerebral organoids described in 2 above, and step (iii) is included. That is, the method 2-1 for producing a cerebral cortex cell mass includes the following step (iii) and step ( A method for producing a highly purified cerebral cortical cell mass, comprising treatment with iv-1). This is a highly purified cerebral cortical cell mass that has been dispersed and reaggregated.
  • the cerebral organoids obtained in step (i) are cultured in a medium containing a Notch signal inhibitor, preferably a ⁇ -secretase inhibitor.
  • the step (ii) may be performed in the same manner as the step (ii) in the method 1 for producing a cerebral cortical cell cluster in 4 above.
  • (iii) dispersing the cerebral organoids obtained in step (ii) into single cells or cell clumps of 2 to 5 cells;
  • the cell population obtained in step (iii) is cultured in a serum-free medium containing one or more neurotrophic factors, ascorbic acid and a cAMP activator (eg, dibutyryl cAMP (dbcAMP)). to obtain a cell mass (consisting of, for example, 20 or more cells).
  • a cAMP activator eg, dibutyryl cAMP (dbcAMP)
  • the cerebral organoids obtained in step (ii) can be divided into single cells or clusters of 2 to 5 cells (cell clumps) by methods well known to those skilled in the art, such as physically by pipetting or by enzymatic treatment. can be dispersed.
  • the cell population obtained by dispersion may be a single cell and/or a population of 2 to 5 cell clumps. That is, in step (iii), the cerebral organoids obtained in step (ii) may be dispersed into single cells or clusters of 2 to 5 cells (cell clumps) by methods well known to those skilled in the art.
  • the culture medium used in step (iv-1) is a culture medium containing one or more neurotrophic factors, ascorbic acid or a derivative thereof, and a cAMP activator.
  • neurotrophic factor 1 to 4, 1 to 3, preferably 1 or 2 factors may be selected from those defined above.
  • neurotrophic factors preferably BDNF and/or GDNF can be mentioned.
  • the concentration of BDNF includes 1-100 ng/mL, preferably 10-30 ng/mL.
  • the concentration of GDNF includes 1-100 ng/mL, preferably 5-20 ng/mL.
  • the concentration of ascorbic acid or a derivative thereof includes, in the case of ascorbic acid, a concentration corresponding to 10 to 500 ⁇ M, preferably 50 to 300 ⁇ M, and similar concentrations for derivatives. be done.
  • the concentration of the cAMP activator includes, for example, a concentration capable of activating cAMP equivalent to 10 to 1000 ⁇ M, preferably 100 to 600 ⁇ M, more preferably 300 to 500 ⁇ M when dbcAMP is used.
  • the culture period of step (iv-1) is 1 to 21 days, preferably 2 to 15 days, 2 to 10 days, 2 to 8 days, 2 to 6 days, more preferably about 4 days.
  • the culture period in step (iv-1) is 1 to 40 days, preferably 2 to 28 days, more preferably 2 to 14 days.
  • the suspension culture in step (iv-1) can be performed by referring to the method described in step (2b) of 2 above.
  • the same medium as in step (2b) of 2 above may be added with one or more neurotrophic factors, ascorbic acid or a derivative thereof, and a cAMP activator to prepare and use the medium.
  • the culture medium used in step (iv-1) may optionally contain a ROCK inhibitor.
  • a ROCK inhibitor those defined above can be appropriately used, preferably Y-27632 and the like.
  • the concentration of the ROCK inhibitor used here corresponds to, for example, about 0.1 to 200 ⁇ M, preferably about 2 to 100 ⁇ M, more preferably about 30 to 100 ⁇ M when Y-27632 is used as the ROCK inhibitor. concentration.
  • the cerebral cortical cell aggregates obtained through step (iii) are highly purified cerebral cortical cell aggregates through the steps of dispersion-reaggregation.
  • step (iii) is not included in the method 2-1 for producing a cerebral cortex cell mass described in 5 above. That is, in the method 1 for producing a cerebral cortex cell mass described in 4 above, in addition to the steps (i) and (ii), the following step (iv-2) is performed to produce a cerebral cortex cell mass. manufacturing methods.
  • step (ii) the cerebral organoids obtained in step (i) are cultured in a medium containing a Notch signal inhibitor, preferably a ⁇ -secretase inhibitor.
  • step (iv-2) The cell culture containing the cerebral organoids obtained in step (ii) is treated with one or more neurotrophic factors, ascorbic acid or a derivative thereof (eg, ascorbic acid-2-phosphate), and cAMP activation.
  • a step of obtaining a cerebral cortex cell mass by suspension culture in a culture medium containing an agent for example, dibutyryl cAMP (dbcAMP)).
  • a cell mass containing cerebral cortical cells (cerebral cortical cell mass) can be obtained by culturing the cell culture containing the cerebral organoids obtained in step (ii) in a suspension culture.
  • the culture medium used in step (iv-2) includes the culture medium described in step (iv-1) of 5 above. ).
  • Methods for producing cerebral cortical cell clusters 3-1 to 3-7 includes “Method 3-1 for producing cerebral cortex cell mass”, wherein the culture medium in step (ii) contains a Notch signal inhibitor. That is, the method 3-1 for producing a cerebral cortex cell mass includes a method for producing a cerebral cortex cell mass including the following step (I).
  • step (I) A step of culturing pluripotent stem cell-derived cerebral organoids in a medium containing a Notch inhibitor, preferably a ⁇ -secretase inhibitor.
  • step (I) may be performed in the same manner as step (ii) in method 1 for producing a cerebral cortex cell mass.
  • An aspect of the present invention includes “Method 3-2 for producing cerebral cortical cell clusters”, which includes the following steps in addition to the above step (I).
  • (II) a step of dispersing the cell culture containing the cerebral organoids obtained in step (I) into a single cell or a cell clump of 2 to 5 cells, and (III) in step (II) A step of culturing the resulting cell population in a culture medium containing one or more neurotrophic factors, ascorbic acid or a derivative thereof, and a cAMP activator to obtain a cerebral cortical cell mass.
  • step (I) may be performed in the same manner as step (ii) in method 1 for producing a cerebral cortex cell mass
  • step (II) and step (III) are the steps ( iii) and step (iv-1) may be performed in the same manner.
  • the cerebral cortex cell aggregates obtained through step (III) have undergone the dispersion-reaggregation process, and are high-purity cerebral cortex cell aggregates.
  • One aspect of the present invention includes an aspect that does not include the step (II). That is, in addition to the step (I), there is a “Method 3-3 for producing a cerebral cortex cell mass” including the following steps. (III-2) The cell culture containing the cerebral organoids obtained in step (I) was treated with one or more neurotrophic factors, ascorbic acid or a derivative thereof (eg, ascorbic acid-2-phosphate), and cAMP activation. A step of obtaining a cerebral cortex cell mass by suspension culture in a culture medium containing an agent (for example, dibutyryl cAMP (dbcAMP)).
  • an agent for example, dibutyryl cAMP (dbcAMP)
  • step (I) may be performed in the same manner as step (ii) in method 1 for producing a cerebral cortex cell mass
  • step (III-2) is step (iv-1) in method 2 for producing a cerebral cortex cell mass. can be done in the same way as
  • One aspect of the present invention includes “Method 3-4 for producing cerebral cortical cell mass”, which includes the following steps (I-2), (II) and (III-3).
  • (I-2) a step of culturing cerebral organoids derived from pluripotent stem cells in a culture medium;
  • (II) a step of dispersing the cell culture containing the cerebral organoids obtained in step (I-2) into a single cell or a cell clump of 2 to 5 cells, and
  • the culture medium in step (I-2) does not contain a Notch signal inhibitor, and the culture medium in step (III-3) contains a Notch signal inhibitor.
  • step (I-2) may be performed in the same manner as step (2b) in the method for producing cerebral organoids described in 2 above.
  • the step (I-2) may be a culture corresponding to a part of the steps for producing pluripotent stem cell-derived cerebral organoids, and the culture period is not particularly limited.
  • Step (II) may be performed in the same manner as step (iii) in method 2-1 for producing a cerebral cortex cell mass described in 5 above.
  • the culture medium in step (III-3) may contain a Notch signal inhibitor during part or all of the step. If the treatment period with the Notch signal inhibitor is only part of the period, a culture medium that does not contain the Notch signal inhibitor is used when exchanging the culture medium in step (III-3).
  • Part of the period is not particularly limited as long as the effect of treatment with a Notch signal inhibitor is obtained, and several hours to several days in the culture period of the above step (III-3), specifically 1 to It may be 7 days, preferably 2-6 days, more preferably 2-4 days. It may also be repeated for very short treatment periods (eg, 4 hours, 12 hours, 24 hours, 2 days).
  • a period containing a Notch signal inhibitor and a period not containing a Notch signal inhibitor are alternately performed, or combinations using Notch signal inhibitors at different concentrations are also within the scope of the present application.
  • the culture medium of steps (III-4) and (III-5) below may also contain a Notch signal inhibitor during part or all of the steps, like the culture medium of step (III-3).
  • Step (III-3)> The cell population obtained in step (II) is reaggregated by suspension culture to obtain a cell mass containing highly purified cerebral cortical cells (highly purified cerebral cortical cell mass).
  • Examples of the culture medium used in step (III-3) include the culture medium described in step (iv-1) of method 2 for producing a cerebral cortical cell mass described in 5 above.
  • the period also includes those described in step (iv-1) of 5 above.
  • the culture solution contains a Notch signal inhibitor, preferably a ⁇ -secretase inhibitor, during part or all of the suspension culture period.
  • a Notch signal inhibitor preferably a ⁇ -secretase inhibitor
  • the Notch signal inhibitor used here those described in the definition can be appropriately selected and used, but the Notch signal inhibitor preferably includes a ⁇ -secretase inhibitor.
  • the ⁇ -secretase inhibitor those described in the definition can be appropriately selected and used.
  • DAPT ⁇ -S-phenylglycine t-butylester
  • the concentration of the Notch signal inhibitor, preferably the ⁇ -secretase inhibitor, in the culture medium can be appropriately set within a range that can suppress proliferating cells that may be contained in the generated cell mass.
  • ⁇ -secretase activity corresponding to 0.1 to 1000 ⁇ M, 1 to 100 ⁇ M, preferably 1 to 30 ⁇ M, more preferably 5 to 20 ⁇ M or the ⁇ - Concentrations exhibiting Notch signaling inhibitory activity based on secretase activity can be mentioned.
  • step (III-3) there is no particular limitation on the time to start culturing in the presence of a Notch signal inhibitor, preferably a ⁇ -secretase inhibitor, but for example, 28 to 42 days after initiation of differentiation can be mentioned.
  • the culture period is preferably about 1 day to about 20 days, more preferably 2 days to 8 days.
  • the cerebral cortical cell aggregates obtained through step (III-3) have undergone the steps of dispersion-reaggregation, and are high-purity cerebral cortical cell aggregates.
  • step (I), the step (II) and the step (III-4) are included, and both the culture solution of the step (I) and the culture solution of the step (III-4) Examples include an embodiment containing a Notch signal inhibitor (Method 3-5 for producing cerebral cortex cell mass).
  • step (I) may be performed in the same manner as step (ii) in method 1 for producing a cerebral cortex cell mass described in 4 above
  • step (II) is the method for producing a cerebral cortex cell mass described in 5 above.
  • step (III-4) may be performed in the same manner as step (III-3) in method 3-4 for producing a cerebral cortical cell mass.
  • the cerebral cortex cell mass obtained through step (III-4) has undergone the steps of dispersion-reaggregation and is a highly purified cerebral cortex cell aggregate.
  • step (I) and step (III-5) are included, and the culture medium in step (III) contains a Notch signal inhibitor (Method 3-6 for producing cerebral cortical cell mass ).
  • step (I) may be performed in the same manner as step (ii) in method 1 for producing a cerebral cortex cell mass described in 4 above
  • step (III-5) is the method for producing a cerebral cortex cell mass 3- It may be carried out in the same manner as the step (III-3) in 4.
  • step (I) and/or step (III-5) culturing in a culture medium containing a Notch signal inhibitor means part of step (I) and/or step (III-5)
  • the medium used during the culture period or the entire culture period is meant to contain a Notch signaling inhibitor.
  • the culture medium not containing the Notch signal inhibitor at the time of exchanging the culture medium in step (I) or the culture medium in step (III-5) Use This partial period is not particularly limited as long as the effect of treatment with the Notch signal inhibitor is obtained, and several hours to several days during the culture period of the step (I) or the step (III-5), Specifically, it may be 1 to 7 days, preferably 2 to 6 days, more preferably 2 to 4 days. Alternatively, short treatment periods (eg, 4 hours, 12 hours, 24 hours, 2 days) may be repeated. In addition, a period containing a Notch signal inhibitor and a period not containing a Notch signal inhibitor are alternately performed, or combinations using Notch signal inhibitors at different concentrations are also within the scope of the present application.
  • One aspect of the present invention includes an aspect (method 3-7 for producing a cerebral cortex cell mass) in which the step (I) of the method 3-6 for producing a cerebral cortex cell mass is changed to the step (I-2). .
  • the production method 3-6 of the cerebral cortex cell mass is followed except that the step (I) is changed to the step (I-2).
  • the culture medium of step (III-5) further contains a Notch signaling inhibitor in the medium containing one or more neurotrophic factors, ascorbic acid or a derivative thereof, and a cAMP activator.
  • the method for producing the cerebral organoids used in step (I) or (I-2) is not particularly limited, and can be prepared by methods well known to those skilled in the art. can be done. For example, it can be produced according to the method for producing cerebral organoids described in 2 above. Alternatively, without performing step (1) of the method for producing cerebral organoids described in 2 above, using pluripotent stem cells instead of "cells obtained in step (1)" in step (2) (2) ) should be implemented.
  • step 2 (2b) instead of the treatment in steps (III) to (III-5), or nerve cells may be cultured in a medium that allows them to survive.
  • addition or non-addition of a Notch signal inhibitor can be selected.
  • the above 4 method 1 for producing a cerebral cortex cell mass the above 5 method 2 for producing a cerebral cortex cell mass, the above 6 method 2-2 for producing a cerebral cortex cell mass, and the above 7 cerebral cortex
  • the above 4 method 1 for producing a cerebral cortex cell mass the above 5 method 2 for producing a cerebral cortex cell mass
  • the above 6 method 2-2 for producing a cerebral cortex cell mass
  • the above 7 cerebral cortex In the absence of supporting cells, including the step of collecting the cerebral cortex cell mass obtained by cell mass production methods 3-1 to 3-7 and preparing a cerebral cortex cell preparation containing the cell mass and medium, A method of producing a cerebral cortex cell preparation from pluripotent stem cells is included.
  • media for preparing cerebral cortex cell preparations include non-frozen media such as physiological saline, phosphate buffer (PBS(-)), Hank's balanced salt solution (HBSS), Earl's balanced salt solution, Solutions such as art celebrities can be mentioned.
  • non-frozen media such as physiological saline, phosphate buffer (PBS(-)), Hank's balanced salt solution (HBSS), Earl's balanced salt solution, Solutions such as art celebrities can be mentioned.
  • media for preparing cerebral cortex cell preparations include, in the case of freezing, cryoprotective agents such as DMSO, glycerol, polyethylene glycol, propylene glycol, glycerin, polyvinylpyrrolidone, sorbitol, dextran, Solutions containing trehalose and the like, and commercially available cryopreservation solutions such as Cell banker, Stem cell banker, Bum banker and the like can be mentioned.
  • cryoprotective agents such as DMSO, glycerol, polyethylene glycol, propylene glycol, glycerin, polyvinylpyrrolidone, sorbitol, dextran, Solutions containing trehalose and the like
  • cryoprotective agents such as DMSO, glycerol, polyethylene glycol, propylene glycol, glycerin, polyvinylpyrrolidone, sorbitol, dextran, Solutions containing trehalose and the like
  • Cerebral Cortex Cell Clusters One aspect of the present invention includes cerebral cortex cell clusters having the following properties.
  • the cerebral cortex cell mass can be produced by the method 1 for producing a cerebral cortex cell mass described in 4 above.
  • one aspect of the present invention includes a cerebral cortical cell cluster having the following characteristics (a) to (c).
  • the number of proliferative marker-positive cells is 10% or less of the total number of cells;
  • the number of cells positive for one or more markers selected from the group consisting of neuronal markers, cortical V/VI layer markers, and forebrain markers is 60% or more, preferably 70% or more of the total number of cells; more preferably 80% or more,
  • Ki67 is an example of the proliferative marker.
  • the neuronal cell marker includes ⁇ III-Tubulin ( ⁇ TubIII).
  • the cortical layer V/VI markers include Ctip2.
  • the forebrain markers include Foxg1.
  • One aspect includes a cerebral cortical cell mass having the following characteristics: (a') the number of Ki67-positive cells is 5% or less of the total number of cells; (b') ⁇ III-Tubulin ( ⁇ TubIII), Ctip2, and Foxg1-positive cells account for 60% or more, preferably 70% or more, and more preferably 80% or more of the total number of cells; (c) substantially free of neuroepithelial or cerebral cortex-like structures;
  • Neuroepithelial and cerebral cortex-like structures in cerebral organoids can be visually confirmed under an inverted microscope.
  • substantially no neuroepithelium- or cerebral cortex-like structures include the fact that the above-mentioned neuroepithelium- or cerebral cortex-like structures cannot be visually identified by observation with an inverted microscope or the like.
  • the cerebral cortical cell mass further comprises (d) NEUROD6, NEUROD2, SSTR2, TBR1, ZBTB18, NHLH1, IGFBPL1, NRN1, RTN1, THSD7A, NRXN1, BHLHE22, CALB2, KHDRBS3, CCSAP, PDE1A, NEUROD1, NPTX1 , NXPH4, NTS, NEUROG2, OLFM1, PRDM8, CORO2B, TP53I11, ZFPM2, PCDH9, NELL2, SRRM4, SCG3, DCC, EPB41L3, SLC17A7, ST18, NSG2, EMX1, CAP2, SYT4, NSMF, ANK3, MYT1L, FSTL5, , B3GAT1, EPHA5, NHLH2, and DLL3.
  • the cerebral cortex cell mass preferably expresses one or more genes selected from the group consisting of SLC17A7, NEUROD6, and EMX1, and more preferably one or more selected from the group consisting of GAD2, COL1A1, TYR, TTR, and HOXA2. gene is not substantially expressed.
  • the cerebral cortex cell mass further includes (e) neural stem cell marker-positive cells of 10% or less of the total number of cells,
  • the neural stem cell markers include Pax6, Sox1 or Sox2.
  • the cerebral cortical cell mass is further (f) negative for pluripotency markers.
  • Pluripotent marker-negative means that pluripotent stem cells are not substantially detected, specifically pluripotent marker-positive cells are 1% or less of the total number of cells. Oct4 etc. are mentioned as said pluripotency marker.
  • the cerebral cortex cell mass may further contain (g) cortex II to IV layer marker (SATB2)-positive cells in some cases.
  • SATB2 cortex II to IV layer marker
  • One aspect of the present invention includes a cell population containing 10% or more, preferably 20% or more, more preferably 40% or more, and even more preferably 50% or more of the total cell mass, the cerebral cortex cell mass.
  • the cerebral cortical cell mass is: It may be a globular-like cell mass with a diameter (equivalent circle diameter) of about 100 ⁇ m to 1000 ⁇ m, preferably about 300 ⁇ m to 600 ⁇ m.
  • the number of cells per cell clump may be about 1 ⁇ 10 3 to 5 ⁇ 10 4 , preferably about 5 ⁇ 10 3 to 2 ⁇ 10 4 .
  • the cerebral cortex cell mass may be a spherical cell mass with a diameter (equivalent circle diameter) of about 100 ⁇ m to 5000 ⁇ m, preferably about 300 ⁇ m to 2000 ⁇ m.
  • the number of cells per cell clump may be about 5 ⁇ 10 3 to 5 ⁇ 10 6 , preferably about 1 ⁇ 10 4 to 3 ⁇ 10 6 .
  • the cell population of the cerebral cortical cell mass has an average diameter (equivalent circle diameter) of about 300 ⁇ m to 2000 ⁇ m.
  • the cerebral cortex cell mass and the cell population thereof are characterized in that, when transplanted into the brain in vivo, they engraft to the transplant site and suppress proliferation of the transplant-derived cells. and
  • the volume of the graft 3 months after transplantation of the cerebral cortical cell mass at 5 weeks of differentiation induction is 2% to 50% compared to the cerebral organoid graft at the same time. Suppressed.
  • cerebral cortical cell clusters and cell populations thereof are useful for cell transplantation therapy for patients suffering from cerebrovascular disease or head injuries, as described later.
  • a high-purity cerebral cortical cell cluster having the following properties, in which proliferative marker-positive cells are suppressed and the target nerve cell content is improved, is the method for producing a cerebral cortical cell cluster according to 5 above, 2-1. , method 2-2 for producing a cerebral cortex cell mass described in 6 above, or method 3-1 to 3-6 for producing a cerebral cortex cell mass described in 7 above.
  • one aspect of the present invention includes a highly purified cerebral cortical cell mass having the following characteristics.
  • the number of proliferative marker-positive cells is 5% or less, preferably 3% or less, more preferably 1% or less of the total number of cells;
  • One or more marker-positive cells selected from neuronal markers, cortical V/VI layer markers, and forebrain markers account for 60% or more, preferably 70% or more, more preferably 80% or more of the total number of cells to be
  • C be substantially free of neuroepithelial or cerebral cortex-like structures;
  • Ki67 is an example of the proliferative marker.
  • the neuronal cell marker includes ⁇ III-Tubulin ( ⁇ TubIII).
  • the cortical layer V/VI markers include Ctip2.
  • the forebrain markers include Foxg1.
  • One embodiment includes highly purified cerebral cortical cell clusters having the following characteristics: (A) the number of Ki67-positive cells is 5% or less of the total number of cells; (B) ⁇ III-Tubulin ( ⁇ TubIII), Ctip2, and Foxg1-positive cells account for 60% or more, preferably 70% or more, and more preferably 80% or more of the total number of cells; (C) be substantially free of neuroepithelial or cerebral cortex-like structures;
  • substantially no neuroepithelium- or cerebral cortex-like structures include the fact that the above-mentioned neuroepithelium- or cerebral cortex-like structures cannot be visually identified by observation with an inverted microscope or the like.
  • a method for obtaining a highly purified cerebral cortical cell mass that is, an effective step for increasing the content of cerebral cortical cells in the cerebral cortical cell mass and decreasing the content of unintended cells such as proliferative cells is , the steps described in step (iv) or step (III) above (the Notch signal inhibitor may be present but not essential), more preferably in addition to the steps described above ( iii) or a step comprising dispersing and reaggregating the cerebral cortical cell clusters described in step (II).
  • the highly purified cerebral cortical cell mass further includes (D) NEUROD6, NEUROD2, SSTR2, TBR1, ZBTB18, NHLH1, IGFBPL1, NRN1, RTN1, THSD7A, NRXN1, BHLHE22, CALB2, KHDRBS3, CCSAP, PDE1A, NEUROD1 , NPTX1, NXPH4, NTS, NEUROG2, OLFM1, PRDM8, CORO2B, TP53I11, ZFPM2, PCDH9, NELL2, SRRM4, SCG3, DCC, EPB41L3, SLC17A7, ST18, NSG2, EMX1, CAP2, SYT4, NSMF, ANK3, MYT5L, FSTLT5L , CELF4, B3GAT1, EPHA5, NHLH2, and DLL3.
  • D NEUROD6, NEUROD2, SSTR2, TBR1, ZBTB18, NHLH1, IGFBPL1, NRN1, RTN1, THSD7A, NRXN1,
  • the cerebral cortical cell mass preferably expresses one or more genes selected from the group consisting of SLC17A7, NEUROD6, and EMX1, or all genes, and more preferably the group consisting of GAD2, COL1A1, TYR, TTR, and HOXA2. does not substantially express one or more genes selected from
  • the high-purity cerebral cortical cell mass further includes (E) neural stem cell marker-positive cells of 10% or less, preferably 5% or less, more preferably 3% or less of the total number of cells,
  • the neural stem cell markers include Pax6, Sox1 or Sox2.
  • the high-purity cerebral cortical cell mass is further (F) negative for pluripotent markers.
  • Pluripotent marker-negative means that pluripotent stem cells are not substantially detected, specifically pluripotent marker-positive cells are 1% or less of the total number of cells.
  • the above pluripotency markers include Oct4 and the like.
  • the cerebral cortex cell mass may further contain (G) cortex II to IV layer marker (SATB2)-positive cells in some cases.
  • G cortex II to IV layer marker
  • One aspect of the present invention includes a cell population containing 10% or more, preferably 20% or more, more preferably 40% or more, and even more preferably 50% or more of the total cell mass, the cerebral cortex cell mass.
  • the highly purified cerebral cortical cell mass may be a spherical cell mass with a diameter (equivalent circle diameter) of about 100 ⁇ m to 10000 ⁇ m, preferably about 200 ⁇ m to 3000 ⁇ m.
  • the number of cells per cell clump may be about 1 ⁇ 10 3 to 5 ⁇ 10 6 , preferably about 5 ⁇ 10 3 to 3 ⁇ 10 6 .
  • the cell population of the high-purity cerebral cortical cell mass has an average diameter (equivalent circle diameter) of about 300 ⁇ m to 500 ⁇ m.
  • the highly purified cerebral cortex cell mass and the cell population obtained therefrom when transplanted into the brain in vivo, engraft to the transplant site and suppress proliferation of the transplant-derived cells.
  • the volume of the implant at 5 weeks post-implantation can be 2% to 50% of that immediately after implantation.
  • the high-purity cerebral cortex cell mass and the cell population obtained therefrom are useful for cell transplantation therapy for patients suffering from cerebrovascular disorders, as described later.
  • one aspect of the present invention includes a cell population of highly purified cerebral cortex cell clusters that are uniform in size, constituent cell composition, or shape.
  • the cell population can be produced by methods 2-1, 2-2, and 3-1 to 3-6 for producing a cerebral cortical cell mass described in 5 to 7 above. That is, according to the production method, cerebral organoids can be dispersed and reaggregated to produce a highly purified cerebral cortical cell mass uniform in size, cell composition, or shape.
  • homogeneity is defined as, for example, variations in numerical values such as marker expression levels, sizes, and the number of cells contained in one cell mass of highly purified cerebral cortex cell masses of ⁇ 20% or less, preferably ⁇ 10%. % or less, more preferably ⁇ 5% or less, can be used as an index for identification.
  • the high-purity cerebral cortex cell mass and its cell population are useful for cell transplantation therapy for patients suffering from cerebrovascular disease or head injuries, as described later.
  • compositions As an aspect of the present invention, a cerebral organoid obtained by the method for producing a cerebral organoid described in 2 above, or the cerebral organoid described in 3 above, a cell population containing cerebral cortical cells obtained from these cerebral organoids, a cerebral cortical cell mass obtained by the method for producing a cerebral cortical cell mass according to 4 to 7 above, a cerebral cortical cell mass according to 8 or 9 above, or a cell population containing cerebral cortical cells obtained from these cell masses
  • a pharmaceutical composition is included as an active ingredient.
  • the cerebral cortical cell mass obtained by the method for producing a cortical cell mass, the cerebral cortical cell mass according to 8 or 9 above, or the cell mass containing cerebral cortical cells obtained from these cell masses is a cell mass for transplantation (implant It can be used as an active ingredient for cell transplantation therapy as a cell/tissue for transplantation.
  • the effective amount of the active ingredient varies depending on the purpose of administration, administration method, and conditions of the administration subject (sex, age, body weight, medical condition, etc.), but for example, the number of cells is 1 ⁇ 10 4 to 1 ⁇ 10 10 . , 1 ⁇ 10 5 to 1 ⁇ 10 9 , 1 ⁇ 10 6 to 1 ⁇ 10 7 , 3 ⁇ 10 6 to 3 ⁇ 10 7 , or 1 ⁇ 10 6 to 1 ⁇ 10 9 be able to.
  • the pharmaceutical composition, cell mass for transplantation, cell for transplantation, tissue for transplantation may contain a pharmaceutically acceptable carrier in addition to an effective amount of the above-mentioned active ingredients.
  • a pharmaceutically acceptable carrier a physiological aqueous solvent (physiological saline, buffer solution, serum-free culture medium, etc.) can be used.
  • the pharmaceutical composition and the like may contain preservatives, stabilizers, reducing agents, tonicity agents, etc., which are commonly used in medicines containing cell aggregates or cells for transplantation, if necessary.
  • a cell suspension for transplantation can be produced by suspending a cell mass for transplantation, a cell for transplantation, or a tissue for transplantation in an appropriate physiological aqueous solvent. If necessary, the cell population for transplantation is cryopreserved by adding a cryopreservation agent, thawed at the time of use, washed with a buffer solution, or stored under low temperature conditions, washed with a buffer solution at the time of use, It may be used for transplantation medicine.
  • all cerebral organoids or cell clusters are collected and, if necessary, used.
  • the collected cell mass can be washed with the medium, other medium, phosphate buffer, or the like, and then suspended in the medium used in the pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition, etc. of the present invention may be a suspension obtained by dispersing or suspending cell aggregates, or may be a suspension or sheet preparation obtained by dispersing cells from the cell aggregates.
  • the pharmaceutical composition or the like obtained by the production method of the present invention is cultured on a plate after carrying out the above 2 production method for cerebral organoids or the above 4 to 7 production methods for cerebral cortical cell clusters. It is also possible to form a cell tissue structure that is a two-dimensional tissue by molding it into a sheet, or to form a cell tissue structure that is a three-dimensional tissue by culturing it on a scaffold.
  • the pharmaceutical composition or the like containing a cell mass or cell population containing cerebral cortical cells of the present invention is administered to the cerebral cortex of an animal model of cerebrovascular disease (e.g., a mouse), and the damaged nerves at the site of injury. It brings about remarkable effects such as restoration of the system and recovery of motor function (for example, improvement of symptoms such as motor paralysis). Therefore, the pharmaceutical composition, etc. of the present invention is useful as a therapeutic agent for cerebrovascular disorders or head trauma. In addition, the pharmaceutical composition, etc. of the present invention is useful as a motor function-improving drug for patients suffering from cerebrovascular disorders.
  • an animal model of cerebrovascular disease e.g., a mouse
  • the cell clusters or cell populations containing cerebral cortical cells which are contained in the pharmaceutical compositions and the like described herein, are produced from established pluripotent stem cells, identified by markers and the like, and subjected to quality control. Therefore, a large amount of cell population for transplantation with stable quality can be produced and used for transplantation. In addition, since the cell population for transplantation can be preserved, the cell population for transplantation can be prepared according to the time of transplantation for the patient.
  • the cerebral organoid obtained by the method for producing a cerebral organoid described in 2 above, or the cerebral organoid described in 3 above, and cells containing cerebral cortical cells obtained from these cerebral organoids A population, a cerebral cortical cell mass obtained by the method for producing a cerebral cortical cell mass according to 4 to 7 above, a cerebral cortical cell mass according to 8 or 9 above, a cell mass containing cerebral cortical cells obtained from these cell masses , or diseases requiring supplementation or functional improvement of cerebral cortical cells, including transplantation (administration) of an effective amount of the pharmaceutical composition according to 10 above to a subject in need of transplantation, specifically cerebrovascular Methods of treating disorders are included.
  • the administration (implantation) site may be the cerebral cortex or the basal ganglia.
  • the subject may be a mammal, preferably a rodent (eg mouse, rat) or a primate (eg human, monkey), more preferably a human.
  • the cerebrovascular accident may also be a head injury.
  • the treatment method is a concept that includes a method for improving motor function (for example, improvement of symptoms such as motor paralysis) in patients with cerebrovascular disease, a method for replenishing cerebral cortical cells in patients with cerebrovascular disease, and the like.
  • pluripotent stem cells eg, induced pluripotent stem cells
  • pluripotent stem cells eg, induced pluripotent stem cells
  • pluripotent stem cells e.g., induced pluripotent stem cells
  • somatic cells of others whose immunity is compatible with the recipient (e.g., HLA type or MHC type is compatible)
  • allo (allogeneic) A cell mass (cell population) may be produced, and the cell mass (cell population) or a cell mass for transplantation containing cells obtained from the cell mass (cell population) may be transplanted into the recipient.
  • iPS cells in which the expression of histocompatibility antigens (e.g., antigen proteins constituting HLA Class I and HLA Class II) or factors required for the expression of the antigens are suppressed are used to obtain the cell clusters of the present invention. ), rejection can be avoided even in allogeneic cell transplantation.
  • histocompatibility antigens e.g., antigen proteins constituting HLA Class I and HLA Class II
  • factors required for the expression of the antigens are suppressed are used to obtain the cell clusters of the present invention.
  • the aforementioned pharmaceutical composition can be used as a therapeutic agent to be administered or transplanted to a patient or recipient in the therapeutic method of the present invention.
  • One aspect of the present invention includes use of cell masses or cell populations comprising the cerebral cortical cells of the present invention for use in treating cerebrovascular disorders.
  • the cerebral organoid obtained by the method for producing a cerebral organoid described in 2 above, or the cerebral organoid described in 3 above, or cerebral cortical cells obtained from these cerebral organoids is included.
  • a cell population, a cerebral cortex cell mass obtained by the method for producing a cerebral cortex cell mass according to 4 to 7 above, a cerebral cortex cell mass according to 8 or 9 above, or cells obtained by dispersing these cell masses Examples include methods for evaluating toxicity or efficacy of a test substance, including contacting a population with a test substance and detecting or quantifying the effect of the test substance on the cell mass or cell population.
  • Cerebral organoid obtained by the method for producing a cerebral organoid described in 2 above, or the cerebral organoid described in 3 above, or a cell population containing cerebral cortical cells obtained from these cerebral organoids, and the cerebral cortex described in 4 to 7 above The cerebral cortex cell mass obtained by the method for producing a cell mass, the cerebral cortex cell mass according to 8 or 9 above, or the cell mass obtained by dispersing these cell masses are used as disease model cells for cerebrovascular disease. It can be used for screening and efficacy evaluation of therapeutic agents for diseases associated with or preventive agents thereof.
  • the cerebral cortex cell mass obtained by the method for producing a cerebral cortex cell mass, the cerebral cortex cell mass described in 8 or 9 above, or the cell mass obtained by dispersing these cell masses are used as healthy model cells, chemically It can be used for safety tests, stress tests, toxicity tests, side effect tests, infection or contamination tests of substances, etc.
  • the cell mass or cell population of the present invention contains cells of cortical layer V/VI tissue, functional tests of nerve tissue (e.g., cerebral cortex) containing these cells, specifically glutamatergic nerves It is also possible to use it for functional evaluation such as cerebral cortical cell proliferative ability and differentiation ability evaluation.
  • nerve tissue e.g., cerebral cortex
  • glutamatergic nerves it is also possible to use it for functional evaluation such as cerebral cortical cell proliferative ability and differentiation ability evaluation.
  • test to evaluate the effects of chemical substances on differentiation, axonal outgrowth ability, and firing ability of cerebral cortical cells RT-PCR of various gene markers, Cytokine expression protein analysis by ELISA or the like, phagocytosis test, patch clamp method, electrophysiological analysis using multi-electrode array (MEA) or the like), and the like.
  • RT-PCR of various gene markers
  • Cytokine expression protein analysis by ELISA or the like phagocytosis test
  • patch clamp method electrophysiological analysis using multi-electrode array (MEA) or the like
  • search for compounds that promote or inhibit neural differentiation, axonal outgrowth ability, and firing ability, and rescue disease-specific phenotypes of cells differentiated from patient-derived iPS cells suffering from cerebrovascular disease It can be used for searching for compounds, proteins, and the like.
  • the cells of the cell mass of the present invention are dispersed, seeded and adhered to a plate, a cell suspension, or a sheet or molded body thereof can be provided.
  • the cerebral cortex cell mass obtained by the method for producing a cerebral cortex cell mass, the cerebral cortex cell mass described in 8 or 9 above, or the cell mass obtained by dispersing these cell masses are outside human and animal tests. It can be used as an insertion test.
  • a method for evaluating the quality of a cerebral organoid or a cerebral cortical cell mass comprising the following steps (aa) and (bb): A quality evaluation method can be mentioned.
  • the cerebral cortex cell mass includes the highly purified cerebral cortex cell mass of the present invention.
  • step (aa) measuring the expression levels of at least one or all genes selected from the group consisting of GAD2, COL1A1, TYR, TTR and HOXA2 in cerebral organoids or cerebral cortical cell masses; (bb) based on the measurement result of step (aa), when the expression level of the gene is below the reference value, the amount of non-target cells contained in the cerebral organoid or the cerebral cortex cell mass is below the reference value; process to evaluate.
  • Another aspect of the present invention includes a method for evaluating the quality of cerebral organoids or cerebral cortex cell clusters, including the following steps (AA) and (BB).
  • (AA) NEUROD6, NEUROD2, SSTR2, TBR1, ZBTB18, NHLH1, IGFBPL1, NRN1, RTN1, THSD7A, NRXN1, BHLHE22, CALB2, KHDRBS3, CCSAP, PDE1A, NEUROD1, NPTX41, NXPHH in cerebral organoids or cerebral cortical cell masses NTS, NEUROG2, OLFM1, PRDM8, CORO2B, TP53I11, ZFPM2, PCDH9, NELL2, SRRM4, SCG3, DCC, EPB41L3, SLC17A7, ST18, NSG2, EMX1, CAP2, SYT4, NSMF, ANK3, MYT1L, FSTL5, CATELF14, B3G measuring the expression levels of at least one, at least two, at least three, or at least five genes selected
  • the amount of gene expression (that is, the amount of mRNA or protein expression) and its measurement method are as described above.
  • Examples of the reference value for the expression level of each gene that serves as a marker for non-target cells, such as the gene described in (aa) above, include values measured in cerebral organoids or cerebral cortical aggregates that serve as samples. , equal to or lower than the reference value can be used as an index for evaluation.
  • the reference value of each gene that serves as a target cell marker such as the gene described in (AA) above, includes, for example, the value measured in a cerebral organoid or cerebral cortex aggregate that serves as a standard. It can be evaluated as an index that it is equal to or higher than the value.
  • the cerebral cortex cell mass obtained by the method for producing a cerebral cortex cell mass described in 4 to 7 above a part of the cell population of the cerebral cortex cell mass is sampled, and the cerebral organoid or cerebral cortex is obtained.
  • a population of cerebral cortical cell clusters with non-target cells below the reference value and/or target cells above the reference value based on the evaluation results evaluated by the cell cluster quality evaluation method can be used for transplantation. It can be selected (identified) as a possible population.
  • One aspect of the present invention includes a method for producing a cerebral cortex cell mass, which includes the method for producing a cerebral cortex cell mass described in 4 to 7 above, and a method for evaluating the quality of the cerebral organoid or cerebral cortex cell mass.
  • a method for producing a cerebral cortex cell mass comprising the following steps: (1) a step of producing a cerebral cortex cell mass by the production method according to 4 to 7; (2) a step of evaluating that the amount of target cells is equal to or greater than the standard and/or that the amount of non-target cells is equal to or less than the standard, by the above quality evaluation method; (3) A step of selecting or identifying a cerebral cortex cell cluster that can be used for transplantation based on the evaluation result of (2).
  • hiPSCs Maintenance culture of human induced pluripotent stem cells (hiPSC)
  • hiPSC human induced pluripotent stem cells
  • hiPSCs were added to a 6-well plate with iMatrix-511 (Nippi Co., Ltd.), an E8 fragment of laminin 511, at 0.5 ⁇ g/cm 2 and grown in StemFit (registered trademark) AK02N medium or AK03N on a coded plate.
  • a medium hereinafter sometimes referred to as “StemFit”; manufactured by Ajinomoto Healthy Supply Co., Ltd.
  • TransFit manufactured by Ajinomoto Healthy Supply Co., Ltd.
  • Passaging was performed every 7 days.
  • Organoids were fixed with 4% paraformaldehyde for 30 minutes, dehydrated with 30% (w/v) sucrose in PBS, and O.D. C. T. It was embedded using a compound (Sakura Finetek). Cryosections were made with a cryostat (CM1850, Leica Biosystems) at a thickness of 16 ⁇ m. Cells were permeabilized with 0.3% or 2% (v/v) Triton-X100 and antigen retrieval reactions were performed as needed. Blocking was performed with Block ACE (KAC) followed by double or triple label staining. The primary and secondary antibodies used for immunostaining were used at recommended dilution concentrations.
  • KAC Block ACE
  • L1CAM 554273 (BD) Ctip2: ab18465 (Abcam)
  • Pax6 EPR15858 (Abcam), 561482 (BD)
  • Foxg1 M227 (Takara) Ki67: NCL (Leica) Emx1: M196 (Takara) Gad65: 559931 (BD)
  • Col1a1 AF6220 (R&D) TTR: A0002 (DAKO)
  • TYR MA5-14177 (Thermo Fisher) Alexa Fluor® 488 donkey anti-mouse IgG (H+L): A21202 (Thermo Fisher) Alexa Fluor® 647 donkey anti-mouse IgG (H+L): 1900251 (Thermo Fisher) Alexa Fluor® 594 donkey anti-rat IgG (H+L): 1979379 (Thermo Fisher) Alexa Fluor® 488 donkey anti-rabbit IgG (H+L)
  • Oligo DNA primer POU5F1 Forward: AGACCATCTGCCGCTTTGAG (sequence number 1) Reverse: GCAAGGGCCGCAGCTT (SEQ ID NO: 2)
  • NANOG Forward: GGCTCTGTTTTGCTATATCCCCTAA (sequence number 3) Reverse: CATTACGATGCAGCAAATACGAGA (SEQ ID NO: 4)
  • BMP4 Forward: ATGATTCCTGGTAACCGAATGC (sequence number 5) Reverse: CCCCGTCTCAGGTATCAAAACT (SEQ ID NO: 6)
  • NODAL Forward: TGAGCCAACAAGAGGATCTG (sequence number 7) Reverse: TGGAAAATCTCAATGGCAAG (SEQ ID NO: 8)
  • TGFB1 Forward: TACCTGAACCCGTGTTGCTCTCTC (SEQ ID NO: 9) Reverse: GTTGCTGAGGTATCGCCAGGAA (SEQ ID NO: 10) SOX
  • hESC Human embryonic stem cells
  • hiPSC human iPS cell lines
  • Human ES KhES-1 and KhES-2 were obtained from the Institute for Frontier Medical Sciences, Kyoto University, and human iPS cell lines 201B7 cells, 1231A3 cells and Ff-I01s04 cells were obtained from Kyoto University.
  • mouse embryonic fibroblasts (MEF, Oriental Yeast) were used as feeder cells.
  • Various stem cell lines such as KhES-1, were seeded at a density of 1.2 ⁇ 10 6 cells per 90 mm dish and treated with 1% (v/v) NEAA, 1% (v/v) in the presence of MEFs.
  • the cells after maintenance culture were induced to differentiate into cerebral organoids by a method partially modified from the method described in Non-Patent Document 1.
  • various pluripotent stem cells were treated with 0.5 ⁇ TrypLE Select and dispersed into single cells. After that, replace with a differentiation medium (described later) supplemented with 50 ⁇ M Y-27632 (Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), and transfer to a non-cell-adsorbing V-bottom 96-well plate (Sumitomo Bakelite) at 9,000 cells/well. sown.
  • Differentiation medium was DMEM/F-12 GlutaMAX medium (Gibco) supplemented with 20% (v/v) KSR, 5 ⁇ M SB431542 (TGF ⁇ inhibitor; TOCRIS), and 3 ⁇ M IWR1e (Wnt inhibitor; Calbiochem). From the 3rd day to the 15th day of differentiation, the differentiation medium was used, and half the medium was replaced every 3 days.
  • the aggregated cells were transferred to a 90 mm suspension culture dish (Sumitomo Bakelite), and 1% (v/v) N2-supplement (Gibco) until 35 days after the initiation of differentiation induction (Day35), 1% (v/v) DMEM/F-12 GlutaMAX (Gibco) supplemented with Chemically defined lipid concentrate (CDLC; Gibco), 0.25 ⁇ g/ml Amphotericin B (Gibco), 100 U/ml penicillin, and 100 ⁇ g/ml streptomycin cultured. Up to Day35, the medium was replaced every 3 days.
  • the denominator represents the number of experiments in which differentiation was performed, and the numerator represents the number of times cerebral organoids were formed. For example, "1/3" indicates that differentiation was induced three times and cerebral organoids were formed once. In any ES or iPS cell line, it was confirmed that the formation efficiency of cerebral organoids was lower in the case of feeder-free than in the case of on-feeder.
  • KhES-1, 201B7, Ff-I01s04 and 1231A3 cell lines were cultured under three conditions, on feeder, feeder-free, and feeder conditioned medium, and differentiated. induced.
  • Feeder conditioned medium conditions are MEF, 1% (v / v) NEAA, 1% (v / v) L-glutamine, 1% (v / v) 2-Mercaptoethanol, 20% (v / v) KSR
  • the expression of FGF2 and TGF ⁇ pathway-related genes (FGF2, LEFTY, NODAL, TGF ⁇ 1, Activin) in these obtained cells before and after induction of differentiation after culture was analyzed by microarray.
  • Microarray analysis was performed using TaKaRa's NucleoSpin RNA Plus XS from four types of iPS cell lines (KhES1, 201B7, 1231A3, Ff-I01s04) cultured under three conditions: on-feeder, feeder-free, and MEF conditioned medium. According to the protocol, RNA was extracted and gene expression analysis was performed using a Clariom S (Applied Biosystems) microarray. Analysis of gene expression levels was performed using Transcriptome viewer (Kurabo).
  • FIG. 2 shows the results after culture and before induction of differentiation.
  • gene expression are comparatively analyzed using a microarray (n means the type of cell line).
  • n means the type of cell line.
  • FGF2 and TGF ⁇ pathway-related genes FGF2, LEFTY, NODAL, TGF ⁇ 1, Activin was more than twice as high in the on-feeder culture group as compared to the feeder-free culture group.
  • FIG. 2 shows that these cell lines were differentiated into iPS cells under three conditions: on feeder, feeder-free, and feeder conditioned medium, using four types of cell lines according to preliminary test 1.
  • n is the number of cerebral organoids means the number of conditions in which the formation efficiency was high.
  • FGF2 and TGF ⁇ pathway-related genes FGF2, LEFTY, NODAL, TGF ⁇ 1, Activin
  • bFGF- and TGF ⁇ -related genes were found to be expressed at high levels.
  • compositions of known human pluripotent stem cell maintenance media are shown in Table 2 below. It can be seen that the feeder-free maintenance medium is usually supplemented with high concentrations of bFGF and TGF ⁇ . It was suggested that ES/iPS cells cultured in these media show lower expression of bFGF- and TGF ⁇ -related genes compared to cultured on feeder. Therefore, it was considered possible that the difference in the expression levels of bFGF- and TGF ⁇ -related genes causes the difference in cerebral organoid formation efficiency.
  • the present inventors cultured ES/iPS cells in the presence of various compounds, then induced differentiation into neurons, and analyzed the formation efficiency of cerebral organoids, which may affect the formation efficiency. searched for compounds.
  • iPS cells are cultured in "bFGF-free and TGF ⁇ -free medium or supplemented with a TGF ⁇ signaling inhibitor" (step (1)) to induce differentiation into nerve cells.
  • Step (2) the formation efficiency of cerebral organoids was found to be significantly increased.
  • Step (1) Effect of step (1) on organoid formation efficiency 1-1.
  • Maintenance Medium in Step (1) Steps (1) and (2) were carried out according to the scheme shown in FIG. 3 or FIG.
  • Human iPS cells S2WCB1 strain, S2WCB3 strain
  • StemFit medium iMatrix-511-coated 6-well plates (feeder-free).
  • StemFit C solution-free medium i.e., bFGF-free medium
  • 5 ⁇ M SB431542 FGF-free medium
  • Essential 6 medium i.e., bFGF-free, TGF ⁇ -free medium
  • the human iPS cells cultured in step (1) were dispersed into single cells by enzymatic treatment.
  • Human iPS cells dispersed into single cells were seeded in a non-cell-adhesive 96-well culture plate (PrimeSurface 96V bottom plate, manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd.) (9,000 cells/well/100 ⁇ L), and 0.1 mM non-essential Glasgow MEM (GMEM; Thermo (Fisher) medium supplemented with amino acids, 1 mM pyruvate, 0.1 mM 2-mercaptoethanol, 20% (v/v) KnockOutTM serum replacement, 100 U/mL penicillin, and 100 ⁇ g/ml streptomycin) hereinafter also referred to as 20GMK), 5 ⁇ M SB431542 (TGF ⁇ signal inhibitor; Tocris), 3 ⁇
  • Step (2b) On Day18, transfer the obtained cell mass to a 90 mm dish, add 1 ⁇ N2 supplement (Thermo Fisher), Chemically Defined Lipid Concentrate (Invitro-gen), 0.25 mg/mL fungizone (Gibco), 1% penicillin In DMEM/F12/GlutaMAX medium supplemented with /streptomycin and 0.1% amphotericin B, shaking culture was performed by Orbital Shaker from Day 35 to Day 42 at 37° C., 20% O 2 , 5% CO 2 . Medium changes were performed every 3-4 days.
  • Fig. 4 (A) The cell culture on Day 35 was observed with an inverted microscope, and a representative image is shown in Fig. 4 (A).
  • the cell culture was subjected to fluorescent immunostaining for each marker (L1CAM, CTIP2, PAX6). Fluorescent immunostaining used the primary antibodies described above and their corresponding fluorescently labeled secondary antibodies.
  • nuclear staining was performed with DAPI.
  • a representative fluorescence-stained image is shown in FIG. 4(B).
  • step (1) in the case of maintenance culture (StemFit-bFGF+SB) in StemFit medium containing no bFGF to which SB431542 (hereinafter sometimes referred to as SB) is added, cell clusters having a plurality of distinct rosette structures ( Rightmost of (B)) was confirmed.
  • a Pax6-positive neural progenitor cell layer radial glial cells
  • a neuronal cell layer expressing Ctip2 and L1CAM was seen outside.
  • step (1) maintenance culture (step (1)) in a bFGF-free medium (“StemFit-bFGF” or “StemFit-bFGF + SB”) showed a formation efficiency of cerebral organoids ( ⁇ 10% for “StemFit-bFGF”). %, about 40%-50% for “StemFit ⁇ bFGF +SB”) was significantly elevated compared to maintenance cultures (StemFit, ⁇ 1%) on bFGF-containing medium.
  • essential 6 (E6) medium supplemented with SB431542 was used as a medium for maintenance culture, and differentiation was induced in the same manner as described above. Immunostaining was performed in the same manner as above, and confocal fluorescence microscope images of representative cell clusters are shown in FIG.
  • cerebral organoids were obtained in the case of using the E6 medium supplemented with SB431542, similarly to the StemFit medium supplemented with SB431542.
  • step (1) of the scheme in FIG. to evaluate the formation efficiency of cerebral organoids The results of immunostaining are shown in FIG. 7, and the formation efficiency of cerebral organoids is shown in Table 3. "None" in FIG. 7 means no additive.
  • Example 1 From the results of Example 1, when human pluripotent stem cells were cultured in "a medium containing no bFGF and no TGF ⁇ or supplemented with a TGF ⁇ signaling inhibitor" and then induced to differentiate into neurons, cerebral organoids It was shown that the formation efficiency of Therefore, when pluripotent stem cells are cultured in a “culture medium that does not substantially contain bFGF and do not substantially induce TGF ⁇ signals” and then induce differentiation into neurons, the formation efficiency of cerebral organoids is remarkable. was found to rise to
  • Example 2 Culture period of step (1) The period for culturing the iPS cells in the SB431542-free/SB431542-added medium was as shown in the table below.
  • FIG. 8 shows representative bright field images of cultures on Day 18, Day 27 and Day 34.
  • FIG. 9 shows the results of analyzing the formation efficiency of cerebral organoids on Day 35.
  • the formation efficiency of cerebral organoids was about 30% to 40% when treated with the “bFGF-free/SB431542-added medium” for 1 day or 2 days. In the above cases, almost no formation of cerebral organoids was observed. Under the conditions of treatment with the "bFGF-free, SB431542-added medium” for 6 days, the proliferation of iPS cells was remarkably reduced, and a sufficient number of cells could not be obtained for induction of differentiation. Therefore, it was clarified that the culture period in step (1) is preferably less than 3 days, more preferably 12 hours or more and 2 days or less, and most preferably about 1 day.
  • Example 3 Influence of step (1) on gene expression
  • S2WCB1 human iPS cells
  • FIG. 10 shows the results of gene analysis.
  • Each point represents a sample of each time, the organoids (Control) differentiated from iPS cells cultured in StemFit medium (bFGF-containing medium), which is a normal maintenance medium, are indicated by black circles, and StemFit (-bFGF, + TGF ⁇ inhibitor) is indicated by black circles.
  • StemFit -bFGF, + TGF ⁇ inhibitor
  • Organoids induced to differentiate after culturing are indicated by open circles.
  • the vertical axis represents the relative expression level corrected for one lot of GAPDH and Control by the ⁇ Ct method.
  • TGF ⁇ i in the figure means TGF ⁇ inhibitor.
  • step (1) may change iPS cells into a state that facilitates differentiation into three germ layers. That is, it is suggested that pluripotent stem cells, when cultured for an appropriate period of time in a “culture medium that does not substantially contain bFGF and do not substantially induce TGF ⁇ signals”, tend to differentiate into trigerm layers. was done.
  • Step (2) Effect 1 of Steps (ii)-(iv) of Step (2): Increase in Nerve Cells and Decrease in Proliferative Cells in Layer V/VI 4-1. With dispersion and reaggregation -Cultivation was performed in the same manner as in Example 1 from Day 7 to Day 35.
  • step (1) (1) StemFit C solution-free medium (bFGF-free medium) to which 5 ⁇ M SB431542 was added was used.
  • step (ii) cerebral organoids were selected on day 33 (Day33) after the initiation of differentiation induction, and the medium was the medium in step (2b) with 10 ⁇ M DAPT added. , and suspended culture was carried out at 37° C. under 5% CO 2 for 3 days. Cerebral cortical cell clusters were thus obtained.
  • step (iii) the cerebral cortex cell mass obtained in step (ii) above is incubated in a 0.5 ⁇ TrypLE Select, 0.25 mM EDTA solution at 37° C. for 20 minutes, and further step (2b) The medium was incubated at 37°C for 10 minutes in a solution containing 25 U/mL DNase I. Then, after pipetting to disperse into single cells, the dispersed cells were added to the medium of step (2b) with 10 ng/mL GDNF, 20 ng/mL BDNF, 200 ⁇ M ascorbic acid, 400 ⁇ M dibutyryl-cAMP, 50 ⁇ M Y-27632. was suspended in medium supplemented with
  • step (iv) the cell suspension obtained in step (iii) was dispensed into a non-cell-adhesive 96-well plate at 30,000 cells/well and suspended for 4 days at 37°C under 5% CO2 . did. This yielded a highly pure cerebral cortical cell mass. Bright-field images of the cerebral cortical cell mass (Day 36) and the highly purified cerebral cortical cell mass (Day 40) are shown in FIG. 11(B).
  • cortical V/VI layer progenitor cell (Deep Layer) marker Ctip2, telencephalic marker Foxg1, neural stem cell (Radial Glia) Immunostaining was performed for the marker Pax6/Ki67 and the proliferative cell marker Ki67.
  • FIG. Fig. 12 shows immunization of cerebral cortical cell clusters on Day 36 without DAPT in the upper row, and cerebral cortical cell clusters on Day 36 with DAPT in the lower row (both obtained through steps (i)-(ii)).
  • FIG. 12B shows an immunostained image of Day 40 highly purified cerebral cortical cell clusters (obtained through steps (i)-(iv)).
  • the Pax6/Ki67-positive neural stem cell (Radial Glia) layer which is characteristic of cerebral organoids
  • the Ctip2/Foxg1 double-positive cortex outside it.
  • a large number of cerebral cortex-like layered structures with neuronal layers of layers V/VI were confirmed. Almost no expression was observed, and no cerebral cortex-like layered structure was observed.
  • Ctip2/Foxg1-positive cells were observed throughout the cell mass. Therefore, it was revealed that the cerebral cortex-like layered structure disappeared in the cerebral cortex cell mass, and Ctip2/Foxg1 double-positive cortical layer V/VI neurons were widely distributed inside.
  • step (ii) the cell culture immediately after DAPT treatment (immediately after step (ii)) was analyzed for the proportion of constituent cells using flow cytometry.
  • a differentiation induction scheme is shown in FIG. Cerebral organoids on Day 40 were subjected to DAPT treatment for 3 days, and then the expression of marker genes was analyzed by flow cytometry.
  • FIG. 14 shows the results of expression analysis of the marker Ki67.
  • Each point in FIG. 14 represents a cell.
  • the left and center panels show the results of displaying all viable cells, and the right panel shows the results of displaying only Ki67-positive cells.
  • the percentage of Ctip2/ ⁇ III-Tubulin double-positive cells (left panel) was 36.4% in the DAPT-untreated group (top), but increased to 86.1% in the DAPT-treated group (bottom).
  • the ratio of Pax6/Ki67 double-positive neural stem cells (Radial Glia) (middle panel) was 46.7% in the DAPT-untreated group (upper row), but 1.0% in the DAPT-treated group (lower row). It was down to 5%.
  • the ratio of Pax6-positive/Sox1-positive/Ki67-positive cells was 0.68% in the DAPT-untreated group (upper), but 0.01% in the DAPT-treated group (lower). decreased to
  • Ki67, Sox1, Pax6 triple positive cells were 0.68% in “Ctrl”, but decreased to 0.01% in “DAPT3d” and 0% in “DAPT3d + Release4d” (from right 1st column). In ⁇ DAPT 3d + Release 4d'', the ratio of Pax6-positive, Sox1-positive, and Ki67 triple-positive cells is even lower than in ⁇ DAPT 3d''. I found out.
  • Organoid DAPT method and single-cell DAPT method (2) In order to analyze the effect of the DAPT treatment period on differentiation, according to the method scheme (organoid DAPT method) shown in FIG. Changes in expression were analyzed by RT-qPCR and the results are shown in FIG. 16(B). The vertical axis represents the relative expression level to GAPDH.
  • Fig. 17(A) shows a scheme of induction of differentiation.
  • Organoids on Day25, Day32, Day39, and Day72 (differentiation induction periods are approximately 4 weeks, 5 weeks, 6 weeks, 10 weeks) were cultured for 3 days in the presence or absence of DAPT, Day28 (4wk), Organoids on Day 42 (6 wk) and Day 75 (10 wk) were analyzed by immunostaining for various markers.
  • the results of immunostaining (confocal fluorescence microscope image) are shown in FIG. 17(B).
  • Satb2 is a cortical II-IV layer progenitor cell (Upper Layer) marker. From FIG.
  • step (ii) is preferably about 20 to 44 days (Day 20 to Day 44) after the initiation of differentiation induction, more preferably Day 25 to Day 39. It was also found that the period of step (ii) is preferably about 2 to 4 days, more preferably about 3 days (for example, 60 to 84 hours).
  • Fig. 20 shows the analysis results of the volume of the stained graft.
  • the volume of the graft was calculated by observing the immunostained brain sections at intervals of 350 ⁇ m, calculating the area of the graft from the Ku80-stained image for each section, and integrating the area and the section interval. did. Tests were performed by one-way ANOVA (Tukey Multiple Test) (***p ⁇ 0.0001, **p ⁇ 0.01).
  • the cerebral cortical cell clusters obtained by performing step (ii) about 5 weeks or 6 weeks after the initiation of differentiation induction are the same as those obtained without performing step (ii). Compared to , the engraftment rate after transplantation into the brain was high, and the increase in volume was very small.
  • cerebral organoids differentiated from pluripotent stem cells are cultured in the presence of DAPT, and then cultured in a culture medium containing one or more neurotrophic factors, ascorbic acid, and a cAMP activator. It was revealed that the cerebral cortical cell clusters in the brain have a high engraftment rate after transplantation into the brain and are difficult to increase (cell proliferation is difficult).
  • a preferred method of producing cerebral organoids from pluripotent stem cells in the absence of feeder cells comprises the following steps. Step (1): culturing pluripotent stem cells in a culture medium that is substantially free of bFGF and does not substantially induce TGF ⁇ signals; Step (2): A step of inducing differentiation of the cells obtained in step (1) into cerebral organoids.
  • Step (2) includes the following steps.
  • Step (2a) A step of suspension culture of the cells obtained in step (1) in a culture medium containing a TGF ⁇ signaling inhibitor and a Wnt signaling inhibitor to obtain a cell mass
  • Step (2b) A step of suspension culture of the cell mass obtained in step (2a) in a culture medium substantially free of TGF ⁇ signal inhibitors or Wnt signal transduction inhibitors to obtain cerebral organoids.
  • a preferred method for producing a cerebral cortex cell mass and a highly purified cerebral cortex cell mass from pluripotent stem cells in the absence of feeder cells includes the following steps.
  • DAPT Notch signal inhibitor
  • a high-purity cerebral cortex cell mass can be obtained by skipping step (iii) and culturing the cell culture that has undergone step (ii) in the culture medium of step (iv).
  • Example 7 Investigation of the effect of DAPT on organoids induced with preparation for neural differentiation - From Day 7 to Day 35, culture was performed by the same method as in the scheme of Fig. 3 of Example 1.
  • cerebral cortical cell clusters were induced by the method described in step (ii) of Example 4, and evaluated by immunostaining.
  • dispersing into single cells by the method described in steps (iii) and (iv) of Example 4 they were reaggregated to induce high-density cerebral cortical cell clusters, which were analyzed by flow cytometry.
  • FIG. 1 A representative confocal fluorescence microscope image of immunostaining is shown in FIG.
  • a cerebral cortex-like structure with a Pax6-positive neuroepithelium and an outer Ctip2-positive cortical V/VI neuronal layer was formed, albeit at a lower efficiency. rice field.
  • this organoid was treated with DAPT, Ctip2-positive cells were found throughout the cell mass, as in the preparation for neural differentiation.
  • Fig. 23 shows the analysis results of flow cytometry. From FIG. 23 , the percentage of Ctip2 ⁇ TubIII double-positive cells (left panel) increased from 22.5% to 85.9% with DAPT treatment even without neural differentiation preparation. In addition, the ratio of Pax6/Ki67 double-positive neural stem cells (Radial Glia) (middle panel) decreased from 59.5% to 1.9% by DAPT treatment. Furthermore, the percentage of proliferating cells, Pax6-positive/Sox1-positive/Ki67-positive cells (right panel), was reduced from 14.5% to 0% by DAPT treatment.
  • Organoid DAPT method and single-cell DAPT method (1) Cultured in the same manner as in Example 1 from Day 7 to Day 35.
  • step (ii) "Organoid DAPT method (when DAPT treatment is performed in step (ii))" cerebral organoids were selected 35 days after the start of differentiation induction, and the medium was added to the medium in step (2b) with 10 ⁇ M DAPT. was added, and suspension culture was carried out for 3 days at 37° C. under 5% CO 2 .
  • the resulting cerebral cortex cell mass was dispersed into single cells by the method described in steps (iii) and (iv) in Example 4, and then reaggregated to obtain a highly purified cerebral cortex cell mass.
  • step (B) Single-cell DAPT method (when DAPT treatment is performed in step (iv))
  • cerebral organoids were selected 38 days after the start of differentiation induction, and described in step (iii) of Example 4.
  • the cells are added to the medium of step (2b) with 10 ng/mL GDNF, 20 ng/mL BDNF, 200 ⁇ M Ascorbic Acid, 400 ⁇ M dibutyl-cAMP, and 30 ⁇ M Y-27632, DAPT was added at concentrations of 0 ⁇ M, 0.1 ⁇ M, 1 ⁇ M, or 10 ⁇ M and suspended.
  • the cells were reaggregated by the method described in step (iv) of Example 4, and cultured for 1, 2, or 3 days.
  • the medium was switched to the medium in step (2b) supplemented with 10 ng/mL GDNF, 20 ng/mL BDNF, 200 ⁇ M ascorbic acid, and 400 ⁇ M dibutylyl-cAMP, and culture was continued until day 10 from the start of reaggregation.
  • Cells on day 3, 4, or 10 after the start of reaggregation were analyzed by RT-qPCR, and cells on day 10 were analyzed by flow cytometry, and the results are shown in FIGS.
  • the DAPT concentration was 10 ⁇ M, and the DAPT treatment period was 1 day, 2 days, and 3 days.
  • the results when analyzed by qPCR are shown in FIG. In FIG. 25, “day” represents the number of days of step (iv), “Conc.” represents the concentration of DAPT, and “Treatment” represents the number of days of DAPT treatment.
  • Hes1 whose expression is activated downstream of the Notch signal, decreased in expression immediately after DAPT treatment regardless of the DAPT treatment period. It was found that the expression increased again with culture. On the other hand, in the case of DAPT treatment for 3 days, Hes1 expression was suppressed for 10 days. At this time, the expression of the proliferative marker Ki67 and the expression of the neural stem cell marker Pax6 were also suppressed. On the other hand, the expression of Map2, which is a neuromaturation marker, and the expression of Ctip2, which is a neuronal layer marker of cortical layer V/VI, increased with the culture in step (iv). Therefore, it was found that DAPT treatment for at least 3 days can suppress proliferation of proliferative neural stem cells and increase the ratio of neurons in cortical layers V/VI.
  • DAPT treatment at 10 ⁇ M for 3 days could suppress the proliferation of proliferative neural stem cells, and the ratio of neurons in cortical layers V/VI could be reduced. is increased, and the same or better effect can be obtained as compared with the case where the DAPT treatment is performed in the step (ii).
  • step (iv) When DAPT treatment is performed in step (iv), the DAPT concentration is 0 ⁇ M, 0.1 ⁇ M, 1 ⁇ M, 10 ⁇ M, the DAPT treatment period is 3 days, and each marker is cultured for 10 days in step (iv).
  • FIG. 27 shows the results of analyzing the expression levels by flow cytometry. For comparison, the case where the DAPT concentration was 10 ⁇ M and the DAPT treatment period was 3 days in step (ii) is also shown (organoid DAPT method).
  • step (iv) when DAPT treatment was performed in step (iv), the percentage of Ctip2/ ⁇ TubIII (Tuj1) double-positive cells (upper panel) increased from 32.2% to 89% as the concentration of DAPT treatment increased. It was found to have increased to .6%. In addition, the ratio of Pax6-positive/Sox1-positive/Ki67-positive cells (bottom panel), which are proliferative cells, decreased from 35.0% to 0.8% by DAPT treatment. Therefore, even when DAPT treatment was performed in step (iv), as in the case of step (ii), the Ctip2/ ⁇ TubIII double-positive cortical layers V/VI increased with an increase in the DAPT treatment concentration. It was found that the percentage of nerve cells increased and the number of proliferating cells decreased.
  • Example 9 Organoid morphology and expression profile analysis 9-1. Morphological analysis of organoids - Cultured in the same manner as in Example 1 from Day 7 to Day 35. Bright-field images of cerebral organoids obtained from 12 induction differentiation lots (Lot1 to Lot12) were taken using an inverted microscope (Leica DMS1000), and representative bright-field images are shown in FIG. 30 (scale bar: 5 mm). ). From FIG. 30, it was found that there was a difference in the morphology of the induced organoids depending on the lot.
  • Table 5 shows the percentage of organoids in each form. Organoids were classified according to the type of morphology contained within one organoid. In rows 1-7 from the top, each column indicates the morphology contained in individual organoids. The 1st to 12th rows from the bottom show the results of morphological classification of the organoids induced in the 12 differentiation induction lots.
  • the numerical values in Table 5 indicate the ratio of the organoids of each form to the total organoids in the lot as a percentage, and the shade of color corresponds to the magnitude of the numerical value.
  • FIG. 32 shows a bar graph of the proportion of organoids in each form.
  • organoid groups that develop varies greatly among differentiation lots, with lots containing both “rosette structures,” “balloon or flocculent tissue,” and “transparent tissue,” Lots of "cotton-like tissue” and mostly “potato-like tissue” were found ( Figure 32, Table 5). In this way, it was found that the ratio of organoid types generated by differentiation-inducing rounds varied from lot to lot. Some organoids had characteristics belonging to more than one of the above seven morphological classifications. In addition, these organoids can be visually selected by observing them under magnification.
  • the organoids were separated into single cells using a nerve cell dispersion (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) according to the recommended conditions.
  • the dispersed cells were resuspended in HBSS supplemented with 10% (v/v) KSR and 10 ⁇ M Y-27632 (Fuji Film Wako Pure Chemical Industries) at a density of 1,000 cells/ ⁇ L.
  • Approximately 4,670 cells per channel were loaded onto the ChromiumNextGEM Chip G (2000177 10X Genomics) and processed with the Chromium controller to acquire Gel Beads-in-Emulsion (GEM).
  • Libraries were generated using Chromium Next GEM Single Cell 3' Reagent Kits v3.1 (1000121; 10x Genomics) according to the manufacturer's protocol (CG000204 RevC). Library sequences were analyzed by Novaseq 6000 (Illumina).
  • the Cell Ranger pipeline was used for single-cell RNA-seq sequence mapping.
  • the GRCh38 human genome sequence was used as the reference genome sequence.
  • the UMI count value obtained by analysis with the next-generation sequencer was analyzed using the Seurat R package.
  • PCA principal component analysis
  • Figures 34 and 35 show the results of single-cell RNA-seq analysis data displayed by the UMAP method for the cells contained in the nine analyzed organoids. From FIG. 34, it was considered that the cells contained in the nine organoids were divided into 10 or more different clusters, and contained cell populations exhibiting 10 or more characteristic gene expression patterns. In addition, the plot patterns differed depending on the organoid (Fig. 35), suggesting that the cell types contained differed depending on the organoid.
  • each cluster In order to identify the cell types contained in each cluster, they were statistically classified into 14 clusters by the Nearest Neighbors method. Genes characteristically expressed in each cluster were extracted based on the percentage of expressing cells and the average expression level, and are shown in Table 6. The top 50 genes in each cell in Table 6 are listed in order from the top. In addition, based on literature information, annotation of cell types was performed, and the cell type of each cluster was identified based on the gene expression of each cluster (Fig. 36). Each dot represents an individual cell and the shade of dots represents a cluster.
  • Cortical Neuron (Radial Glia (RG): cerebral cortical neural progenitor cells (Radial Glia (RG)), Cortical neuron (CR): Cajal Retzius cell (CR), Cortical Neuron (Glutamatergic neuron (GN)): Cerebral cortical neuron (Glutamatergic Neuron (GN)), GABAergic neuron: GABAergic neuron, Choroid plexus (ChP): Choroid plexus, CNS fibroblast: Center Neural fibroblasts, Neural Crest: neural crest cells, Vascular Endothelial cells: vascular endothelial cells, Caudal Neurons: considered to be caudal nerve cells.
  • Figures 37 and 38 show in dot plots the expression profile of the known marker genes, the genes characteristic of each cluster, in the single-cell gene expression data.
  • the vertical axis represents clusters, and the horizontal axis represents genes.
  • the circle size represents the percentage of expressing cells to all cells in the cluster.
  • the shade of color represents the average gene expression level of the cells within the cluster.
  • MAP2 and TUBB3 were analyzed as neuronal markers.
  • KRT19 and KRT8 were analyzed as markers of epithelial cells.
  • MKI67 and TOP2A were analyzed as markers of proliferating cells.
  • PAX6, SOX2, and HES1 were analyzed as markers of radial glia (RG).
  • EMX1 was analyzed as a marker for the dorsal forebrain area.
  • NEUROD6 and SLC17A7 were analyzed as markers of glutamatergic neurons.
  • SSTR3 is a somatostatin receptor and is known to be expressed in glutamatergic neurons.
  • TBR1 and BCL11B were analyzed as markers of Deep Layer, which is a precursor of layers V and VI of the cerebral cortex.
  • RELN was analyzed as a marker for Cajal Retzius cells.
  • ASCL1, DLX1, DLX2, DLX5, and DLX6 were analyzed as markers whose expression is observed during the differentiation process of GABAergic neurons.
  • GAD2 was analyzed as a marker of GABAergic neurons.
  • SST and TAC1 were analyzed as markers expressed in subtypes of GABAergic neurons.
  • TTR, RSPO3, CLIC6, HTR2C, and TRPM3 were analyzed as markers whose expression is observed during the developmental process of the choroid plexus.
  • COL1A1 was analyzed as a CNS Fibroblast marker.
  • DCN, LUM, and DLK1 are genes expressed in stromal cells.
  • AQP1 has been reported to be expressed in the choroid plexus and arachnoid granules.
  • OTX2 and EMX2 are region-specific markers and are known to be expressed in the telencephalic choroid plexus.
  • HOXA5 and HOXB5 were analyzed as caudal neural markers.
  • ZIC1, MSX1, LGALS1, TWIST1, PRRX1, GPC3, SOX10, and TFAP2A were analyzed as markers whose expression is observed during the differentiation process of Neural Crest.
  • LGALS1, TWIST1, PRRX1, and GPC3 are genes involved in epithelial-mesenchymal transition (EMT), and SOX10 and TFAP2A are markers expressed in mature neural crest.
  • PECAM1, KDR, FLT1 and ICAM2 were analyzed as markers of vascular endothelial cells.
  • EMX1 Clusters of cortical neurons expressed EMX1, a forebrain marker.
  • “Radial Glia (RG)” expressed SOX2 and PAX6, which are essential genes for the regulation of LHX2 and Radial Glia.
  • Glutamatergic neuron (GN) is a transcription factor characteristic of deep layer neuron and pyramidal neuron TBR1 (Robert F. Hevner, Tbr1 Regulates Differentiation of the Preplate and Layer 6, Neuron, 2001), NEUROD6 (Tukova al., The Role of Neurod Genes in Brain Development, Function, and Disease, Frontiers in Molecular Neuroscience, 2021), glutamate transporters SLC17A7 (VGluT1) and BCL11B (Ctip2).
  • Cajal Retzius cell (CR) expressed Cajal Retzius cell marker genes such as RELN and TBR1.
  • the GABAergic neuron cluster commonly expressed the glutamate decarboxylase GAD2.
  • GAD2 glutamate decarboxylase 2
  • high expression of MKI67 (Ki67) which is a proliferative marker, and ASCL1, whose expression is observed in the early stage of differentiation (VZ)
  • ASCL1 a proliferative marker
  • ASCL1 whose expression is observed in the early stage of differentiation (VZ)
  • DLX5 and DLX6 which are expressed after the middle stage of differentiation (SVZ) were expressed.
  • TTR Transthyretin
  • COL1A1 a marker for fibroblasts associated with the central nervous system, was highly expressed.
  • expression of AQP1 and the like was also observed, suggesting the possibility that some of these cells are fibroblasts associated with the choroid plexus.
  • Neural Crest cluster expression of various genes observed during the differentiation process of Neural Crest Cell (NCC) was observed (Simoes-Costa M et al., Establishing neural crest identity: a gene regulatory recipe, Development, 2015).
  • NCC Neural Crest Cell
  • HOX genes In the Caudal Neuron cluster, expression of numerous HOX genes was observed, including TUBB3, a neuronal marker, and HOXA5 and HOXB5, which control caudal regionalization.
  • Fig. 39 (A) shows the proportion of each cell type in the nine organoids
  • Fig. 39 (B) shows the proportion of neural crest cells in each differentiation stage in the neural crest.
  • Organoid9 containing pigment cells had a higher percentage of Neural Crest than other organoids.
  • Neural Crest-2 which is a cell population that expresses a group of genes involved in EMT, has a high proportion, and contains many actively migrating Neural Crests.
  • the forebrain marker EMX1 was specifically expressed in the area where the rosette structure was seen (rosette).
  • GABAergic neuron marker GAD65 GAD65 (GAD2) was found to be expressed in the region of "potato-like tissue".
  • GAD65 GABAergic neuron marker
  • COL1A1 an ECM Fibroblast marker, was observed in balloon-like tissue, cotton-like tissue, and areas surrounding the pigment. Choroid plexus-specific markers were expressed in transparent tissue.
  • TYR a melanocyte marker, was found to be expressed in the organoid "pigment” where pigmentation was observed.
  • VGluT1 and EMX1 which were identified as markers of cortical neurons, was observed in Rosettes organoids.
  • DLX2 and GAD2 which were identified as GABAergic neuron markers, were highly expressed in potato-like organoids.
  • TYR which is a melanocyte marker, was highly expressed in Pigment organoids.
  • COL1A1 a CNS Fibroblast marker, was found to be expressed in balloon-like tissue and cotton-like tissue.
  • HOXA2 a marker of Caural Neuron, was found to be expressed in the jelly-like tissue.
  • organoids Cerebral organoids obtained under the DAPT-condition were divided into two clusters and contained two types of cell populations (Fig. 44 (B)). It was found that the organoids (cerebral cortical cell clusters) obtained under the DAPT+ condition aggregated into one cluster and consisted of one type of cell population. Since the distribution of the cells in the three manufacturing lots overlapped, it was found that the difference due to the manufacturing lot was small, the reproducibility was good, and similar cell populations were obtained.
  • Cerebral organoids are divided into two clusters. In the right cluster, SLC17A7 and NEUROD6, which are markers of glutamatergic neurons, and Ctip2, which is a marker of deep layer neurons, are highly expressed. It was thought to contain its progenitor cells. In the cluster on the left, PAX6 and MKI67, markers of radial glia, were highly expressed, suggesting that the cluster was highly proliferative radial glia. Almost no expression of Satb2, a marker of Upper Neuron, was observed, and most of them were thought to be progenitor cells of cerebral cortex layers V and VI.
  • TTR, COL1A1, TYR, and PECAM1 which are markers of non-target cells identified this time, were hardly detected. From this, it was found that cerebral cortical cells can be obtained by selecting organoids having a rosette structure as a whole or by excluding organoids of other morphologies, and contamination with unintended cells can be reduced. .
  • DAPT+ cerebral cortical cell mass
  • SLC17A7 VGluT1
  • NEUROD6 NEUROD6
  • Ctip2 the cell population expressing Pax6 and MKI67, which are markers of non-target cells, is significantly increased. decreased to Moreover, TTR, COL1A1, TYR and PECAM1 were hardly detected. From this, it was found that DAPT treatment yields highly pure cerebral cortical cell clusters containing glutaminergic neurons.
  • Each of the genes listed in Table 6 corresponds to cerebral cortical neural progenitor cells (in a broad sense, it is included in cerebral cortical neurons, but corresponds to radial glia, radial Glia (RG)), cerebral cortical neurons (glutamatergic neurons (GN), and Cajal-Retius cells (CR)), GABAergic neurons, choroid plexus (ChP), central nervous system fibroblasts, neural crest cells, vascular endothelial cells, or caudal neurons It can also be used as a marker.
  • markers for cerebral cortical neural progenitor cells and cerebral cortical neurons can be used as markers for cerebral organoids because these cells are contained in cerebral organoids.
  • genes expressed in cerebral cortical neurons can be used as markers for the cerebral cortical cell clusters of the present invention and the highly purified cerebral cortical cell clusters of the present invention. can.
  • NEUROD6, NEUROD2, SSTR2, TBR1, NRXN1, BHLHE22, NEUROD1, NEUROG2, SLC17A7, and EMX1 are located in the dorsal forebrain region, which is the region where the cerebral cortex is generated, and layer II of the cerebral cortex. ⁇ Planned region of layer VI) (Cortical Plate), and glutamatergic neurons are known to be expressed, but the other 37 genes were newly identified as markers of cerebral cortical neurons. It is a thing.
  • cerebral cortical neurons which are target cells
  • highly purified cerebral cortical cell clusters defined in the present application means that NEUROD6, NEUROD2, SSTR2, TBR1, ZBTB18, NHLH1, IGFBPL1, NRN1, RTN1, THSD7A, NRXN1, BHLHE22, CALB2, KHDRBS3, CCSAP, PDE1A, NEUROD1, NPTX1, NXPH4, NTS, NEUROG2, OLFM1, PRDM8, CORO2B, TP53I11, ZFPM2, PCDH9, NELL2, SRRM4, SCG3, DCC1CA7, STB41L3, SCB41L3, DCC1, STB41L3 at least 1, at least 2, at least 3, or at least 5 genes selected from the group consisting of NSG2, EMX1, CAP2, SYT4, NSMF, ANK3, MYT1L, FSTL5, CELF4, B3GAT1, EPHA5, NHLH2,
  • cerebral cortical neural progenitor cells radial glia (RG)
  • GABAergic neurons choroid plexus (ChP)
  • central nervous system fibers described in Table 6
  • CNS fibroblast central nervous system fibroblast
  • neural crest cells Neurovascular Endothelial cells
  • Vascular Endothelial cells vascular endothelial cells
  • Caudal nerve cells Cerudal Neuron
  • the expression level of one, at least two, or at least three genes is substantially not expressed, or is below the reference level, and can be evaluated as an index.
  • LHX2, SOX2, and PAX6 identified as markers of radial glia, GAD2DLX1, DLX2, DLX5, and DLX6 identified as markers of GABAergic neurons, TTR identified as a marker of the choroid plexus, TRPM3, COL1A1 identified as a marker for central nervous system fibroblasts, ZIC gene group identified as a marker for neural crest cells, Msx1, ID gene group downstream of Smad signal, Epithelial-Mesenchymal Transition (EMT)-related gene (TWIST1 , PRRX1, GPC3, Sox10, and TFAP2, KDR (VEGFR-2) identified as a marker for vascular endothelial cells, PECAM1 and CDH5 (VE-Cadherin), as well as numerous vascular endothelial cell markers, and caudal nerve
  • TUBB3 which has been identified as a cell marker, at least one, at least two, or at least three genes selected from a
  • one or more genes selected from the group consisting of GAD2, COL1A1, TYR, TTR and HOXA2 in Table 6 are not substantially expressed, or are below the standard value.
  • the cerebral organoids produced by the production method specified in the present invention are not necessarily limited in use, and may be used for the following purposes.
  • ⁇ Cerebral application (substance screening)>
  • Low-molecular-weight compounds, antibodies, nucleic acids, and other substances may be added to the cerebral organoids produced by the production method of the present invention, and their effects may be examined. That is, cerebral organoids can be used for the purpose of clarifying the effects, toxicity, and usefulness of low-molecular-weight compounds, antibodies, and other substances. In this case, the effects of organized neurons, organized neural networks formed in cerebral organoids can be investigated.
  • the method for producing cerebral organoids and the method for selecting cerebral organoids defined in the present invention make it possible to produce a large amount of cerebral organoids having relatively uniform expression profiles, shapes, etc., or tissue structures.
  • the method for evaluating the quality of the cerebral organoids described in 13 above may be used.
  • cerebral organoids with relatively uniform expression profiles, shapes, etc., or tissue structures By using cerebral organoids with relatively uniform expression profiles, shapes, etc., or tissue structures, multiple tests can be easily performed, and reproducibility, which has been difficult in the past, can be easily achieved. .
  • cerebral organoids induced from pluripotent stem cells derived from specific genotype cells may be produced, and the above substance screening may be applied to specific diseases.
  • the optimum process can be appropriately adjusted according to the properties of the derived pluripotent stem cells.

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Abstract

本発明は、再生医療に有用な、ヒト多能性幹細胞由来の大脳オルガノイド、大脳皮質細胞を含む細胞塊、及び、これらの製造方法を提供することを目的とする。本発明の大脳オルガノイドの製造方法は、支持細胞の非存在下、多能性幹細胞から大脳オルガノイドを製造する方法であり、（１）多能性幹細胞を、ｂＦＧＦが実質的に含まれず、かつＴＧＦβシグナルを実質的に惹起しない培養液中で培養する工程と、（２）工程（１）で得られた細胞を、神経細胞へと分化誘導する工程とを含む。

Description

ヒト多能性幹細胞由来大脳皮質細胞製剤の製造方法
　本発明は、多能性幹細胞由来の大脳オルガノイド、又は大脳皮質細胞塊、及びそれらの製造方法等に関する。
　脳血管障害による運動麻痺などの症状改善を目的として、ヒト多能性幹細胞、特にヒト人工多能性幹細胞（induced pluripotent stem cell；ｉＰＳ細胞）から分化誘導した神経細胞を移植する細胞移植治療が期待されている。
　マウス胎児由来線維芽細胞（Mouse embryonic fibroblast；ＭＥＦ）等の支持細胞（フィーダー細胞と称する場合がある）の存在下で維持されたヒト胚性幹細胞(embryonic stem cell；ＥＳ細胞）から大脳オルガノイドを分化誘導する方法（Serum-free Floating culture of Embryoid Bodies-like aggregates with quick reaggregation :ＳＦＥＢｑ法）が確立され、運動神経を含む大脳皮質Ｖ、ＩＶ層の神経細胞（deep layer neuron）が得られるようになった。
　一方、臨床に使用する移植用細胞は、異種細胞の非存在下（フィーダーフリー）で製造することが望ましい。しかしながら、支持細胞の非存在下で維持されたヒト多能性幹細胞をＳＦＥＢｑ法により分化誘導を行うと、大脳オルガノイドを生じる効率が低いことが問題であった（非特許文献３）。
ＷＯ２０１５／０７６３８８ ＷＯ２０１６／１６７３７２ ＷＯ２０１６／０６３９８５
Kitahara, et al., Stem Cell Reports 2020 Vol. 15, 467-481 Kuwahara, et. al., Scientific Reports 2019, 9:18936 Eiraku, M et al., Cell Stem Cell, 3, 519-532 (2008)
　本発明は、再生医療に有用な、ヒト多能性幹細胞由来の大脳オルガノイド、大脳皮質細胞を含む細胞塊、及び、これらの製造方法を提供することを目的とする。さらに詳細には、支持細胞の非存在下で、多能性幹細胞から大脳オルガノイドを製造する方法及び該方法によって得られる産物の提供を目的とする。
　上記課題を解決するため、本発明者らは、支持細胞の非存在下、多能性幹細胞を、ｂＦＧＦが実質的に含まれず、かつＴＧＦβシグナルを実質的に惹起しない培養液中で培養してから、神経細胞へと分化誘導すると、大脳オルガノイドを効率よく製造できることを見出し、また、Ｎｏｔｃｈシグナル阻害剤を含む培養液中で大脳オルガノイドを培養すると、移植に適した品質の大脳皮質細胞塊を効率よく製造できることを見出した。
　すなわち、本発明は以下のとおりのものを提供する。
［１］　支持細胞の非存在下、多能性幹細胞から大脳オルガノイドを製造する方法であって、
（１）多能性幹細胞を、ｂＦＧＦが実質的に含まれず、かつＴＧＦβシグナルを実質的に惹起しない培養液中で培養する工程と、
（２）工程（１）で得られた細胞を、神経細胞へと分化誘導する工程と
を含む、方法。
［２］　工程（２）が、
（２ａ）工程（１）で得られた細胞を、ＴＧＦβシグナル阻害剤、及びＷｎｔシグナル伝達阻害剤を含む培養液中で浮遊培養して、細胞塊を得る工程と、
（２ｂ）工程（２ａ）で得られた細胞塊を、ＴＧＦβシグナル阻害剤及びＷｎｔシグナル伝達阻害剤を実質的に含まない培養液中で浮遊培養して、大脳オルガノイドを得る工程と
を含む、［１］に記載の方法。
［３］　工程（２ａ）の浮遊培養が静置培養である、［２］に記載の方法。
［４］　工程（２ｂ）の浮遊培養が振とう培養である、［２］又は［３］に記載の方法。
［５］　工程（１）の培養期間が３日間未満である、［１］～［４］のいずれかに記載の方法。
［６］　工程（１）の培養期間が１２時間以上２日間以下である、［１］～［５］のいずれかに記載の方法。
［７］　工程（１）の培養液が、ＳＢ４３１５４２、Ａ－８３－０１、及びＸＡＶ－９３９からなる群から選ばれるＴＧＦβシグナル阻害剤を含む、［１］～［６］のいずれかに記載の方法。
［８］　工程（１）、工程（２ａ）、及び工程（２ｂ）における培養液が、無血清培養液である、［２］～［７］のいずれかに記載の方法。
［９］　前記多能性幹細胞が、ヒト人工多能性幹細胞又はヒト胚性幹細胞である、［１］～［８］のいずれかに記載の方法。
［１０］　（３）工程（２）で得られた複数の細胞塊から、細胞塊の形状、内部構造、サイズ、表面の色彩若しくは模様、及び遺伝子発現からなる群から選ばれる１以上を指標とし、大脳オルガノイドを選別する工程をさらに含む、［１］～［９］のいずれかに記載の方法。
［１１］　［１］～［９］のいずれかに記載の方法を用いて製造される細胞培養物であって、
　複数の球状の細胞塊を含み、
　前記複数の球状の細胞塊に占める大脳オルガノイドの割合が４０％以上である、細胞培養物。
［１２］　前記大脳オルガノイドに占める大脳皮質様構造物の割合が４０％以上である、［１１］に記載の細胞培養物。
［１３］　大脳オルガノイドが、更に以下の（１）～（５）：
（１）球状の細胞塊であること、
（２）細胞塊の内部に、大脳皮質様構造物を有すること、
（３）表面に色素沈着を有さないこと、
（４）細胞塊の一部に嚢胞状形状、突起形状、及びバルーン状形状のいずれも有さないこと、並びに、
（５）ＮＥＵＲＯＤ６、ＮＥＵＲＯＤ２、ＳＳＴＲ２、ＴＢＲ１、ＺＢＴＢ１８、ＮＨＬＨ１、ＩＧＦＢＰＬ１、ＮＲＮ１、ＲＴＮ１、ＴＨＳＤ７Ａ、ＮＲＸＮ１、ＢＨＬＨＥ２２、ＣＡＬＢ２、ＫＨＤＲＢＳ３、ＣＣＳＡＰ、ＰＤＥ１Ａ、ＮＥＵＲＯＤ１、ＮＰＴＸ１、ＮＸＰＨ４、ＮＴＳ、ＮＥＵＲＯＧ２、ＯＬＦＭ１、ＰＲＤＭ８、ＣＯＲＯ２Ｂ、ＴＰ５３Ｉ１１、ＺＦＰＭ２、ＰＣＤＨ９、ＮＥＬＬ２、ＳＲＲＭ４、ＳＣＧ３、ＤＣＣ、ＥＰＢ４１Ｌ３、ＳＬＣ１７Ａ７、ＳＴ１８、ＮＳＧ２、ＥＭＸ１、ＣＡＰ２、ＳＹＴ４、ＮＳＭＦ、ＡＮＫ３、ＭＹＴ１Ｌ、ＦＳＴＬ５、ＣＥＬＦ４、Ｂ３ＧＡＴ１、ＥＰＨＡ５、ＮＨＬＨ２、及びＤＬＬ３からなる群から選ばれる少なくとも１つのマーカーを発現していること
から選択される、１以上の特徴を有する細胞塊である、［１２］に記載の細胞培養物。
［１４］　（ａ）増殖性マーカー陽性細胞数が全細胞数の１０％以下であり、
（ｂ）神経細胞マーカー、皮質Ｖ／ＶＩ層マーカー、及び前脳マーカーからなる群から選ばれる１つ以上のマーカーが陽性である細胞数が全細胞数の７０％以上であり、且つ
（ｃ）神経上皮又は大脳皮質様構造を実質的に含まないことを特徴とする、大脳皮質細胞塊。
［１５］　前記（ａ）の増殖性マーカーがＫｉ６７であり、
　前記（ｂ）の神経細胞マーカーがβＩＩＩ－Ｔｕｂｕｌｉｎであり、皮質Ｖ／ＶＩ層マーカーがＣｔｉｐ２であり、前脳マーカーがＦＯＸＧ１である、
［１４］に記載の大脳皮質細胞塊。
［１６］　（ｄ）ＮＥＵＲＯＤ６、ＮＥＵＲＯＤ２、ＳＳＴＲ２、ＴＢＲ１、ＺＢＴＢ１８、ＮＨＬＨ１、ＩＧＦＢＰＬ１、ＮＲＮ１、ＲＴＮ１、ＴＨＳＤ７Ａ、ＮＲＸＮ１、ＢＨＬＨＥ２２、ＣＡＬＢ２、ＫＨＤＲＢＳ３、ＣＣＳＡＰ、ＰＤＥ１Ａ、ＮＥＵＲＯＤ１、ＮＰＴＸ１、ＮＸＰＨ４、ＮＴＳ、ＮＥＵＲＯＧ２、ＯＬＦＭ１、ＰＲＤＭ８、ＣＯＲＯ２Ｂ、ＴＰ５３Ｉ１１、ＺＦＰＭ２、ＰＣＤＨ９、ＮＥＬＬ２、ＳＲＲＭ４、ＳＣＧ３、ＤＣＣ、ＥＰＢ４１Ｌ３、ＳＬＣ１７Ａ７、ＳＴ１８、ＮＳＧ２、ＥＭＸ１、ＣＡＰ２、ＳＹＴ４、ＮＳＭＦ、ＡＮＫ３、ＭＹＴ１Ｌ、ＦＳＴＬ５、ＣＥＬＦ４、Ｂ３ＧＡＴ１、ＥＰＨＡ５、ＮＨＬＨ２、及びＤＬＬ３からなる群から選ばれる少なくとも１つのマーカーをさらに発現している、［１４］又は［１５］に記載の大脳皮質細胞塊。
［１７］　ＳＬＣ１７Ａ７を発現している、［１６］に記載の大脳皮質細胞塊。
［１８］　ＧＡＤ２、ＣＯＬ１Ａ１、ＴＹＲ、ＴＴＲ及びＨＯＸＡ２からなる群から選ばれる１以上の遺伝子を実質的に発現していない、［１５］～［１７］のいずれかに記載の大脳皮質細胞塊。
［１９］　支持細胞の非存在下で、多能性幹細胞から大脳皮質細胞塊を製造する方法であって、
（ｉ）多能性幹細胞から大脳オルガノイドを得る工程と、
（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた大脳オルガノイドを、Ｎｏｔｃｈシグナル阻害剤を含む培養液中で培養して、大脳皮質細胞塊を得る工程と
を含む、方法。
［２０］　前記工程（ｉ）において、［１］～［１０］のいずれかに記載の方法により多能性幹細胞から大脳オルガノイドを得る、［１９］に記載の方法。
［２１］　（Ａ）増殖性マーカー陽性細胞数が全細胞数の５％以下であり、
（Ｂ）神経細胞マーカー、皮質Ｖ／ＶＩ層マーカー、及び前脳マーカーから選ばれる１つ以上のマーカー陽性細胞数が全細胞数の７０％以上であり、且つ
（Ｃ）神経上皮又は大脳皮質様構造を実質的に含まない
ことを特徴とする、高純度大脳皮質細胞塊。
［２２］　前記（Ａ）の増殖性マーカーがＫｉ６７であり、
　前記（Ｂ）の神経細胞マーカーがβＩＩＩ－Ｔｕｂｕｌｉｎであり、皮質Ｖ／ＶＩ層マーカーがＣｔｉｐ２であり、前脳マーカーがＦＯＸＧ１である、
［２１］に記載の高純度大脳皮質細胞塊。
［２３］　（Ｄ）ＮＥＵＲＯＤ６、ＮＥＵＲＯＤ２、ＳＳＴＲ２、ＴＢＲ１、ＺＢＴＢ１８、ＮＨＬＨ１、ＩＧＦＢＰＬ１、ＮＲＮ１、ＲＴＮ１、ＴＨＳＤ７Ａ、ＮＲＸＮ１、ＢＨＬＨＥ２２、ＣＡＬＢ２、ＫＨＤＲＢＳ３、ＣＣＳＡＰ、ＰＤＥ１Ａ、ＮＥＵＲＯＤ１、ＮＰＴＸ１、ＮＸＰＨ４、ＮＴＳ、ＮＥＵＲＯＧ２、ＯＬＦＭ１、ＰＲＤＭ８、ＣＯＲＯ２Ｂ、ＴＰ５３Ｉ１１、ＺＦＰＭ２、ＰＣＤＨ９、ＮＥＬＬ２、ＳＲＲＭ４、ＳＣＧ３、ＤＣＣ、ＥＰＢ４１Ｌ３、ＳＬＣ１７Ａ７、ＳＴ１８、ＮＳＧ２、ＥＭＸ１、ＣＡＰ２、ＳＹＴ４、ＮＳＭＦ、ＡＮＫ３、ＭＹＴ１Ｌ、ＦＳＴＬ５、ＣＥＬＦ４、Ｂ３ＧＡＴ１、ＥＰＨＡ５、ＮＨＬＨ２、及びＤＬＬ３からなる群から選ばれる少なくとも１つの遺伝子を発現している、［２１］又は［２２］に記載の高純度大脳皮質細胞塊。
［２４］　ＳＬＣ１７Ａ７、ＮＥＵＲＯＤ６、及びＥＭＸ１からなる群から選ばれる１以上の遺伝子を発現している、［２３］に記載の高純度大脳皮質細胞塊。
［２５］　ＧＡＤ２、ＣＯＬ１Ａ１、ＴＹＲ、ＴＴＲ及びＨＯＸＡ２からなる群から選ばれる１以上の遺伝子を実質的に発現していない、［２１］～［２４］のいずれかに記載の高純度大脳皮質細胞塊。
［２６］　支持細胞の非存在下で、多能性幹細胞から高純度大脳皮質細胞塊を製造する方法であって、
（ｉ）多能性幹細胞から大脳オルガノイドを得る工程と、
（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた大脳オルガノイドを、培養液中で培養する工程と、
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で得られた細胞培養物を、単細胞又は２～５個の細胞の集合体（Cell clump）にまで分散させる工程と、
（ｉｖ）工程（ｉｉ）で得られた細胞培養物又は工程（ｉｉｉ）で得られた細胞集団を、１以上の神経栄養因子、アスコルビン酸、及びｃＡＭＰ活性化剤を含む培養液中で培養して、細胞塊を得る工程と
を含み、前記工程（ｉｉ）の培養液及び／又は前記工程（ｉｖ）の培養液は、Ｎｏｔｃｈシグナル阻害剤を含む、方法。
［２７］　前記工程（ｉ）において、［１］～［１０］のいずれかに記載の方法により多能性幹細胞から大脳オルガノイドを得る、［２６］に記載の方法。
［２８］　工程（ｉｉ）に付与する大脳オルガノイドが、神経細胞への分化誘導開始から２８日後～４４日後の大脳オルガノイドである、［１９］、［２０］、［２６］及び［２７］のいずれかに記載の方法。
［２９］　工程（ｉｉ）の培養期間が２～６日間である、［１９］、［２０］、及び［２６］～［２８］のいずれかに記載の方法。
［３０］　工程（ｉｖ）の培養期間が２～１４日間である、［１９］、［２０］、及び［２６］～［２９］のいずれかに記載の方法。
［３１］　前記Ｎｏｔｃｈシグナル阻害剤は、γセクレターゼ阻害剤である、［１９］、［２０］、及び［２６］～［３０］のいずれかに記載の方法。
［３２］　前記γセクレターゼ阻害剤がＮ－［Ｎ－（３，５－ｄｉｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎａｃｅｔｙｌ）－Ｌ－ａｌａｎｙｌ］－Ｓ－ｐｈｅｎｙｌｇｌｙｃｉｎｅ　ｔ－ｂｕｔｙｌ　ｅｓｔｅｒ（ＤＡＰＴ）又はＣｏｍｐｏｕｎｄ　Ｅである、［３１］に記載の方法。
［３３］　［２１］～［２５］のいずれかに記載の高純度大脳皮質細胞塊を含む細胞集団であって、前記高純度大脳皮質細胞塊のサイズ、形状又は構成細胞組成が均一である、細胞集団。
［３４］　［１４］～［１８］のいずれかに記載の大脳皮質細胞塊、［２１］～［２５］のいずれかに記載の高純度大脳皮質細胞塊、若しくは［３３］に記載の細胞集団、又はそれらを構成細胞にまで分散させて得られる細胞集団を有効成分として含む医薬組成物。
［３５］　［１４］～［１８］のいずれかに記載の大脳皮質細胞塊、［２１］～［２５］のいずれかに記載の高純度大脳皮質細胞塊、若しくは［３３］に記載の細胞集団、又はそれらを構成細胞にまで分散させて得られる細胞集団を含む、移植用組織。
［３６］　［１４］～［１８］のいずれかに記載の大脳皮質細胞塊、［２１］～［２５］のいずれかに記載の高純度大脳皮質細胞塊、若しくは［３３］に記載の細胞集団、又はそれらを構成細胞にまで分散させて得られる細胞集団を有効成分として含む、脳血管障害治療薬。
［３７］　［１４］～［１８］のいずれかに記載の大脳皮質細胞塊、［２１］～［２５］のいずれかに記載の高純度大脳皮質細胞塊、若しくは［３３］に記載の細胞集団、又はそれらを構成細胞にまで分散させて得られる細胞集団を、これを必要とする対象の大脳皮質又は大脳基底核に投与又は移植することを含む、脳血管障害の治療方法。
［３８］　（ａａ）大脳オルガノイド又は大脳皮質細胞塊における、ＧＡＤ２、ＣＯＬ１Ａ１、ＴＹＲ、ＴＴＲ及びＨＯＸＡ２からなる群から選ばれる少なくとも１つの遺伝子又は該遺伝子によりコードされるタンパク質もしくはその断片の発現量を測定する工程、及び
　（ｂｂ）工程（ａａ）の測定結果に基づき、上記遺伝子の発現量が基準値以下である場合に、上記大脳オルガノイド又は上記大脳皮質細胞塊に含まれる目的外細胞の量が基準以下であると評価する工程、
を含む、大脳オルガノイド又は大脳皮質細胞塊の品質評価方法。
［３９］　（ＡＡ）大脳オルガノイド又は大脳皮質細胞塊における、ＮＥＵＲＯＤ６、ＮＥＵＲＯＤ２、ＳＳＴＲ２、ＴＢＲ１、ＺＢＴＢ１８、ＮＨＬＨ１、ＩＧＦＢＰＬ１、ＮＲＮ１、ＲＴＮ１、ＴＨＳＤ７Ａ、ＮＲＸＮ１、ＢＨＬＨＥ２２、ＣＡＬＢ２、ＫＨＤＲＢＳ３、ＣＣＳＡＰ、ＰＤＥ１Ａ、ＮＥＵＲＯＤ１、ＮＰＴＸ１、ＮＸＰＨ４、ＮＴＳ、ＮＥＵＲＯＧ２、ＯＬＦＭ１、ＰＲＤＭ８、ＣＯＲＯ２Ｂ、ＴＰ５３Ｉ１１、ＺＦＰＭ２、ＰＣＤＨ９、ＮＥＬＬ２、ＳＲＲＭ４、ＳＣＧ３、ＤＣＣ、ＥＰＢ４１Ｌ３、ＳＬＣ１７Ａ７、ＳＴ１８、ＮＳＧ２、ＥＭＸ１、ＣＡＰ２、ＳＹＴ４、ＮＳＭＦ、ＡＮＫ３、ＭＹＴ１Ｌ、ＦＳＴＬ５、ＣＥＬＦ４、Ｂ３ＧＡＴ１、ＥＰＨＡ５、ＮＨＬＨ２、及びＤＬＬ３からなる群から選ばれる少なくとも１つの遺伝子の発現量を測定する工程、及び
　（ＢＢ）工程（ＡＡ）の測定結果に基づき、上記遺伝子の発現量が基準値以上である場合に、上記大脳オルガノイド又は上記大脳皮質細胞塊に含まれる目的細胞の量が基準以上であると評価する工程、
を含む、大脳オルガノイド又は大脳皮質細胞塊の品質評価方法。
　本発明により、大脳皮質細胞製剤の材料として用いることができる大脳オルガノイドが、ヒト多能性幹細胞から高効率で製造できるようになる。本発明の大脳オルガノイド由来の大脳皮質細胞塊等は、脳血管障害等を治療するための治療薬又は移植用材料として有用である。
予備試験１における、神経細胞への分化誘導後の細胞凝集体の形態の画像を示す。 予備試験２における、マイクロアレイによるＦＧＦ２及びＴＧＦβ経路関連遺伝子の発現解析結果を示す。 実施例１における分化誘導スキームの一例を示す。 実施例１の１－１における分化誘導後の細胞凝集体の明視野像（Ａ）及び共焦点蛍光顕微鏡画像（Ｂ）を示す。 実施例１における分化誘導スキームの一例を示す。 実施例１の１－１における分化誘導後の大脳皮質細胞塊の共焦点蛍光顕微鏡画像を示す。 実施例１の１－２における分化誘導後Ｄａｙ３５の大脳オルガノイドの共焦点蛍光顕微鏡画像を示す。 実施例２における分化誘導後Ｄａｙ１８、Ｄａｙ２７、Ｄａｙ３４の培養物の代表的な明視野像を示す。 実施例２における分化誘導後の各条件での大脳オルガノイドの形成効率（％）を示す。 実施例３における工程（１）後（Ｄａｙ０）の各種マーカー遺伝子の発現解析結果を示す。 実施例４の４－１における分化誘導スキーム（Ａ）、及び大脳オルガノイド（ＤＡＰＴ－、Ｄａｙ３６）、大脳皮質細胞塊（ＤＡＰＴ＋、Ｄａｙ３６）、高純度大脳皮質細胞塊（Ｄａｙ４０）の明視野像（Ｂ）を示す。 実施例４の４－１における免疫染色の代表的な共焦点蛍光顕微鏡画像を示す。 実施例４の４－２における分化誘導スキームを示す。 実施例４の４－２における、フローサイトメトリーによるマーカー遺伝子発現の解析結果を示す。 実施例４の４－２における、フローサイトメトリーによるマーカー遺伝子発現の解析結果を示す。 実施例４の４－３におけるＤＡＰＴ法のスキーム（Ａ）、及び得られた細胞塊の遺伝子発現の変化をＲＴ－ｑＰＣＲで解析した結果（Ｂ）を示す。 実施例５における分化誘導スキーム（Ａ）、及びＤａｙ２８（４ｗｋ）、Ｄａｙ４２（６ｗｋ）、及びＤａｙ７５（１０ｗｋ）の大脳オルガノイドの免疫染色の結果（Ｂ）を示す。 実施例５における、Ｄａｙ２８（４ｗｋ）、Ｄａｙ３５（５ｗｋ）、Ｄａｙ４２（６ｗｋ）、及びＤａｙ７５（１０ｗｋ）の大脳オルガノイドの各種マーカーの相対発現量の解析結果を示す。 実施例６における免疫染色した移植片の代表的な共焦点蛍光顕微鏡画像を示す。 実施例６における免疫染色した移植片の体積の解析結果を示す。 好ましい実施形態の方法のスキームを示す。 実施例７における免疫染色の代表的な共焦点蛍光顕微鏡画像を示す。 実施例７におけるフローサイトメトリーの解析結果を示す。 実施例８の８－１における２つの方法のスキームを示す。 実施例８の８－１におけるシングルセルＤＡＰＴ法で得られた細胞塊の各マーカーの経時的遺伝子発現量のＲＴ－ｑＰＣＲ解析結果を示す。 実施例８の８－１におけるシングルセルＤＡＰＴ法及びオルガノイド法で得られた細胞塊の各マーカーの経時的遺伝子発現量のＲＴ－ｑＰＣＲ解析結果を示す。 実施例８の８－１におけるシングルセルＤＡＰＴ法及びオルガノイド法で得られた細胞塊の各マーカーの１０日目の遺伝子発現量のフローサイトメトリー解析結果を示す。 実施例８の８－２におけるシングルセルＤＡＰＴ法のスキームを示す。 実施例８の８－２におけるシングルセルＤＡＰＴ法で得られた細胞塊の遺伝子発現をフローサイトメトリーで解析した結果を示す。 実施例９の９－１におけるオルガノイドの形態の代表的な明視野像を示す。 実施例９の９－１における７つの形態学的なグループの代表的な明視野像を示す。 実施例９の９－１における各形態のオルガノイドの割合の棒グラフを示す。 実施例９の９－２における３回の分化誘導回で得られた９つのオルガノイドの明視野像を示す。 実施例９の９－２における９つのオルガノイドに対してシングルセルＲＮＡ－ｓｅｑ解析のデータをＵＭＡＰで表示した結果を示す。 実施例９の９－２における９つのオルガノイドに対してシングルセルＲＮＡ－ｓｅｑ解析のデータをＵＭＡＰで表示した結果を示す。 実施例９の９－２における各クラスターの遺伝子発現に基づき、各クラスターの細胞種を同定した結果を示す。 実施例９の９－２におけるシングルセル遺伝子発現データにおいて、各クラスターに特徴的な遺伝子、既知のマーカー遺伝子の発現プロファイルをドットプロットで示す。 実施例９の９－２におけるシングルセル遺伝子発現データにおいて、各クラスターに特徴的な遺伝子、既知のマーカー遺伝子の発現プロファイルをドットプロットで示す。 実施例９の９－２における９つのオルガノイドにおける各細胞種の割合（Ａ）、及び、各分化ステージにおける神経堤細胞の割合（Ｂ）を示す。 実施例９の９－３における各グループのオルガノイドに対し、代表的なマーカータンパク質の免疫染色結果を示す。 実施例９の９－４における各グループにつき３個のオルガノイドの明視野像を示す。 実施例９の９－４における各オルガノイドに対してＲＴ－ｑＰＣＲ法でマーカー遺伝子の発現を解析した結果を示す。 実施例９の９－４における各オルガノイドに対してＲＴ－ｑＰＣＲ法でマーカー遺伝子の発現を解析した結果を示す。 実施例９の９－５におけるＬｏｔ１、Ｌｏｔ２、Ｌｏｔ３のＲｏｓｅｔｔｅｓのオルガノイドの明視野像（Ａ）、及び、シングルセル遺伝子発現解析のＵＭＡＰのプロット（Ｂ）を示す。 実施例９の９－５におけるオルガノイドに対してマーカー遺伝子の発現を解析し、ＵＭＡＰで表示した結果を示す。
１．定義
〔幹細胞〕
　本明細書において「幹細胞」とは、分化能及び分化能を維持した増殖能（特に自己複製能）を有する未分化細胞を意味する。幹細胞には、分化能力に応じて、多能性幹細胞（pluripotent stem cell）、複能性幹細胞（multipotent stem cell）、単能性幹細胞（unipotent stem cell）等の亜集団が含まれる。
　多能性幹細胞とは、インビトロにおいて培養することが可能で、かつ、三胚葉（外胚葉、中胚葉、内胚葉）及び／又は胚体外組織に属する細胞系譜すべてに分化しうる能力（分化多能性（Pluripotency））を有する幹細胞をいう。複能性幹細胞とは、全ての種類ではないが、複数種の組織や細胞へ分化し得る能力を有する幹細胞を意味する。単能性幹細胞とは、特定の組織や細胞へ分化し得る能力を有する幹細胞を意味する。
　多能性幹細胞は、受精卵、クローン胚、生殖幹細胞、組織内幹細胞、体細胞等から誘導することができる。多能性幹細胞としては、胚性幹細胞（ＥＳ細胞：Embryonic Stem cell）、ＥＧ細胞（Embryonic Germ cell）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞：induced Pluripotent Stem cell）等を挙げることが出来る。間葉系幹細胞(Mesenchymal Stem Cell;MSC)から得られるＭｕｓｅ細胞（Multi-lineage differentiating stress enduring cell）、及び、生殖細胞（例えば精巣）から作製されたｍＧＳ細胞も多能性幹細胞に包含される。
　１９９８年にヒト胚性幹細胞が樹立されており、再生医学にも利用されつつある。胚性幹細胞は、胚盤胞期、すなわち受精後１４日以内の内部細胞塊を支持細胞上又はＦＧＦ２を含む培地中で培養することにより製造することが出来る。胚性幹細胞の製造方法は、例えば、ＷＯ９６／２２３６２、ＷＯ０２／１０１０５７、ＵＳ５，８４３，７８０、ＵＳ６，２００，８０６、ＵＳ６，２８０，７１８等に記載されている。胚性幹細胞は、所定の機関より入手でき、また、市販品を購入することもできる。例えば、ヒト胚性幹細胞であるＫｈＥＳ－１、ＫｈＥＳ－２及びＫｈＥＳ－３は、京都大学再生医科学研究所より入手可能である。
　本明細書において「人工多能性幹細胞」とは、体細胞を、公知の方法等により初期化（reprogramming）することにより、多能性を誘導した細胞である。
　人工多能性幹細胞は、２００６年、山中らによりマウス細胞で樹立された（Cell,2006,126(4),pp.663-676）。人工多能性幹細胞は、２００７年にヒト線維芽細胞でも樹立され、胚性幹細胞と同様に多能性と自己複製能を有する（Cell, 2007, 131(5), pp.861-872; Science, 2007, 318(5858), pp.1917-1920; Nat. Biotechnol., 2008,26(1), pp.101-106）。
　人工多能性幹細胞は、具体的には、線維芽細胞や末梢血単核球等分化した体細胞にＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ＭＹＣ（ｃ－ＭＹＣ、Ｎ－ＭＹＣ、Ｌ－ＭＹＣ）、ＧＬＩＳ１、ＮＡＮＯＧ、ＳＡＬＬ４、ＬＩＮ２８、ＥＳＲＲＢ等を含む初期化遺伝子群から選ばれる複数の遺伝子の組合せのいずれかを強制発現することにより初期化して多分化能を誘導した細胞が挙げられる。好ましい初期化因子の組み合わせとしては、（１）ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、及びＭＹＣ（ｃ－ＭＹＣ又はＬ－ＭＹＣ）、（２）ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８及びＬ－ＭＹＣ（Stem Cells, 2013; 31: 458-466）を挙げることが出来る。
　人工多能性幹細胞として、遺伝子発現による初期化誘導で製造する方法以外に、体細胞への化合物の添加等により人工多能性幹細胞を誘導することもできる（Science, 2013, 341, pp.651-654；Nature,2022, 605, pp.325-331）。
　また、株化された人工多能性幹細胞を入手する事も可能であり、例えば、京都大学で樹立された２０１Ｂ７細胞、２０１Ｂ７－Ｆｆ細胞、２５３Ｇ１細胞、２５３Ｇ４細胞、１２０１Ｃ１細胞、１２０５Ｄ１細胞、１２１０Ｂ２細胞、１２３１Ａ３細胞等のヒト人工多能性細胞株が、京都大学及びｉＰＳアカデミアジャパン株式会社より入手可能である。株化された臨床用のｉＰＳ細胞として、例えば、京都大学で樹立されたＦｆ－Ｉ０１、Ｆｆ－Ｉ１４、ＱＨＪＩ０１及びＱＨＪＩ１４が京都大学から入手可能である。また、ｉＰＳ細胞は例えば末梢血・臍帯血由来の造血前駆細胞、線維芽細胞等の体細胞から初期化因子を用いてリプログラミングすることにより製造することが可能である。本明細書で使用のＳ２ＷＣＢ１、Ｓ２ＷＣＢ３は、成人末梢血単核球から、ＣｙｔｏＴｕｎｅ（商標）－２．０（ＩＤファーマ）を用いて樹立した。
　本明細書において多能性幹細胞は、好ましくは胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞であり、より好ましくは人工多能性幹細胞である。
　本明細書において多能性幹細胞は、哺乳動物の多能性幹細胞であり、好ましくはげっ歯類（例、マウス、ラット）又は霊長類（例、ヒト、サル）の多能性幹細胞であり、より好ましくはヒト多能性幹細胞、更に好ましくはヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）又はヒト胚性幹細胞（ＥＳ細胞）である。
　ヒトｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞は、当業者に周知の方法で維持培養及び拡大培養に付すことができる。
〔マーカー〕
　本明細書において「マーカー」は、細胞に存在する物質であって、その存在又は存在量に基づいて、当該細胞の種類若しくは性質等を同定若しくは判別することができる物質を意味する。マーカーとして、具体的には、ｍＲＮＡ、当該ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質、及び糖鎖、並びにこれらの断片が挙げられる。
〔神経細胞〕
　本明細書において神経細胞とは、細胞体、樹状突起及び軸索から構成される神経単位のことを言い、ニューロンとも呼ばれる。神経細胞は、他の神経細胞又は刺激受容細胞からの刺激を別の神経細胞、筋又は腺細胞に刺激を伝える機能を有し、神経細胞が産生する神経伝達物質の違いにより、ドパミン作動性神経、セロトニン作動性神経、ＧＡＢＡ作動性神経、グルタミン酸作動性神経等のように分類されるが、本明細書においては神経伝達物質の種類については特に限定しない。神経細胞は、有意に発現するマーカーによって同定することができ、当該マーカーとしては、例えばβＩＩＩ－Ｔｕｂｕｌｉｎ、ＭＡＰ２等が挙げられる。
〔神経幹細胞〕
　本明細書において「神経幹細胞」は、神経系細胞への分化が運命づけられているが、複数の神経系細胞へ分化する能力を有し増殖性を保っている幹細胞を意味し、神経前駆細胞への分化能、及び大脳皮質細胞への分化能を共に有する細胞である。中間体フィラメントタンパク質（ネスチン、ビメンチン等）、転写因子ＳＯＸ１，ＳＯＸ２、ＰＡＸ６等の原始的神経外胚葉及び神経幹細胞のマーカー等によって同定されうる。本明細書における神経幹細胞には、放射状グリア（Radial Gila）が含まれる。
　また、神経幹細胞から生じる、複数の神経細胞へ分化可能であってかつ未成熟な細胞を神経前駆細胞とも言う。
〔大脳オルガノイド〕
　本明細書において、「細胞培養物」は、特定の組成を有するものに限らず、細胞を培養することで得られる産物をさす用語である。細胞培養物は、複数の細胞塊の集合体であり得、さらに単細胞及び後述の２～５個の細胞の集合体を含んでもよい。細胞培養物は、培地又は懸濁媒体を含んでいても含まなくてもよく、本明細書において、特に明記しない限り、培地又は懸濁媒体を含まないものを指す。
　本明細書において、「大脳オルガノイド」は、神経上皮の外側に神経細胞層を備えた大脳皮質様構造物を１つ以上、好ましくは複数含む、球状の細胞凝集体（細胞塊）を意味する。ここにおいて、大脳皮質様構造物は、神経上皮の外側に神経細胞層を備えた、ロゼット様構造物である。したがって、大脳皮質様構造物は、神経上皮様構造を含む可能性があり、本願の大脳オルガノイドは神経上皮様構造を含んでいてもよい。
　ここにおいて、「神経上皮」とは、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を主たる構成細胞とする層状の構造物であり、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の局在化領域ということもできる。
　ここにおいて、「神経細胞層」とは、神経細胞を含む層状の構造物である。当該神経細胞は、大脳オルガノイドの分化段階で生成し得る神経細胞であれば特に限定はないが、神経細胞マーカー、前脳マーカー、及び大脳皮質神経細胞マーカーの少なくとも１つが陽性の細胞が挙げられる。当該神経細胞層は、好ましくは、神経細胞マーカー陽性細胞、前脳マーカー陽性細胞、及び大脳皮質神経細胞若しくはその前駆細胞マーカー陽性細胞の２以上、又は全てを含む。神経細胞層は、神経上皮から生じた神経細胞（大脳皮質神経細胞）の局在化領域ということもできる。
　本明細書における大脳オルガノイドの一態様として、多能性幹細胞を分化誘導して得られる大脳オルガノイドが挙げられる。
　ここで「球状」は、棒状（ロッド状）や平板状（プレート状）でないことを指し、好ましくは「球に近い三次元構造体」を意味する。例えば、二次元面に投影したときに、例えば円形又は楕円形を示すものが挙げられる。但し、滑らかな曲線を示す必要はなく、部分的に凹凸が認められる場合であっても細胞塊全体で球に近い形状であると認識できれば、「球状」に該当する。本明細書における「球状」として、必ずしも高い真球率が求められるものではないが、一例として真球率が、０．７以上、０．８以上、好ましくは０．９以上の構造体が挙げられる。
　本明細書において、神経幹細胞又は神経前駆細胞のマーカー遺伝子としては、例えば、ＳＯＸ１、ＳＯＸ２、ＰＡＸ６等が挙げられる。
　神経細胞マーカー遺伝子としては、例えば、βＩＩＩ－Ｔｕｂｕｌｉｎ、ＭＡＰ２等が挙げられる。
　前脳のマーカー遺伝子としては例えば、ＦＯＸＧ１（ＢＦ１ともいう）、ＳＩＸ３、ＥＭＸ１等が挙げられる。
　大脳皮質神経細胞マーカー遺伝子としては、後述する第Ｉ層～第ＶＩ層のマーカーが挙げられる。
　また、各種細胞のマーカー遺伝子として、後述するとおり、下記の表６に記載の遺伝子が挙げられる。
〔大脳皮質細胞〕
　本明細書において、「大脳皮質細胞」は、大脳皮質ニューロン又は大脳皮質神経細胞ともいい、大脳皮質を構成する神経細胞を指す。
　大脳オルガノイドにおいて、神経細胞層は１層であってもよく、さらに、複数の細胞層に分かれていてもよい。例えば、神経上皮に近い側からオルガノイドの外側に向かって、大脳皮質第ＶＩ層（Ｔｂｒ１、Ｔｂｒ２）、第Ｖ層（Ｃｔｉｐ２、Ｅｒ８１，　Ｆｅｚｆ２）、第ＩＶ層（Ｒｏｒｂ）、第ＩＩＩ／ＩＩ層（Ｆｏｘｐ１，　Ｍｅｆ２ｃ，　Ｓａｔｂ２）第Ｉ層（Ｒｅｅｌｉｎ）に特徴的な神経細胞がそれぞれ局在化した層が含まれていてもよい。括弧内に、各層の識別に多用されるマーカー遺伝子を表す。
　本明細書において、大脳皮質細胞は、好ましくは、前脳マーカーであるＦＯＸＧ１が陽性である細胞である。本発明において、ＦＯＸＧ１としては、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００５２４９で示されるポリヌクレオチド及びこれらがコードするタンパク質が挙げられる。
　本明細書において、大脳皮質細胞は、大脳皮質の運動野の神経細胞又は上位運動ニューロン、すなわち、大脳皮質の前方の神経細胞を含んでもよく、さらに詳しくは、大脳皮質の運動野の第Ｖ層及び／又は第ＶＩ層の神経細胞を含んでいてもよい。
　本明細書において、第Ｖ層又は第ＶＩ層（併せて第Ｖ／ＶＩ層ともいう）の神経細胞は、Ｃｔｉｐ２が陽性であることを特徴とする細胞集団である。本発明において、Ｃｔｉｐ２としては、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００１２８２２３７、ＮＭ＿００１２８２２３８、ＮＭ＿０２２８９８又はＮＭ＿１３８５７６で示されるポリヌクレオチド及びこれらがコードするタンパク質が挙げられる。また、大脳皮質細胞は、第Ｉ層、第ＩＩ／ＩＩＩ層、第ＩＶ層の神経細胞を含んでいてもよい。
　本明細書における大脳皮質細胞は、他の細胞種が含まれる細胞集団として製造されてもよく、大脳皮質細胞を含む細胞集団は、例えば、製造された細胞集団において１５％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上又は５０％以上の大脳皮質細胞を含んでいてもよい。
　本明細書において、「大脳皮質細胞」は「大脳皮質前駆細胞」を含む概念であり、本発明の「大脳オルガノイド」の目的細胞としては、大脳皮質前駆細胞が含まれる。一方、より進んだ分化段階にある、本発明の「大脳皮質細胞塊（高純度大脳皮質細胞塊を含む）」の目的細胞には、大脳皮質前駆細胞は、殆ど含まれない、又は最小限数程度含まれうる。
〔細胞塊及び細胞集団〕
　本明細書において「細胞塊」（Cell Aggregate；細胞凝集体ともいう）とは、複数の細胞同士が接着して立体構造を形成しているものであれば特に限定されず、例えば、培地等の媒体中に分散していた細胞が集合して形成する塊、又は細胞分裂を経て形成される細胞の塊等をいう。細胞塊には、特定の組織を形成している場合も含まれる。胚様体（Ｅｍｂｒｙｏｉｄ　ｂｏｄｙ）、スフェア（Ｓｐｈｅｒｅ）、スフェロイド（Ｓｐｈｅｒｏｉｄ）は、細胞塊に包含される。細胞塊は、任意の形状を有してよく、球状の細胞塊、層状の細胞塊などが挙げられる。
　本明細書において「細胞集団」は、複数の細胞を含む集団であり、細胞塊（スフェア状細胞塊、層状の細胞塊）、又は２～５個の細胞の集合体（Cell clump）であってもよい。「細胞集団」はまた、複数の細胞塊の集団、複数の分散された単細胞の集団、若しくは複数の２～５個の細胞の集合体（Cell clump）の集団、又はこれらの任意の組合せの集団であってもよい。
　本明細書において、細胞塊が高純度であることとは、細胞塊に含まれる目的細胞の含有率が高いことを意味する。具体的な含有率は細胞の種類にもよるが、例えば、目的細胞の含有率が細胞塊の全細胞数に対して７０％以上、好ましくは８０％以上、９０％以上である場合高純度であるということができる。
　また、本明細書において、細胞塊が高純度であることとは、目的外細胞の含有率が細胞塊の全細胞数に対して３０％以下、好ましくは２０％以下、１０％以下であるということができる。更に好ましくは、細胞塊における増殖性の細胞の含有率が細胞塊の全細胞数に対して１０％以下、５％以下、好ましくは３％以下、更に好ましくは２％以下であるということができる。
　本明細書において、「再凝集細胞塊」とは、細胞塊を、単細胞若しくは２～５個の細胞の集合体に分散したのち、分散された単細胞及び細胞の集合体が再度集合して形成した細胞塊（例：再凝集大脳皮質細胞塊）をいう。再凝集大脳皮質細胞塊は、高純度大脳皮質細胞塊を少なくとも含む。
〔培養液〕
　本明細書において「培養液（培地とも称する）」は、動物細胞の培養に通常用いられる培養液（培地）であればよく、動物細胞が生命を維持することができれば特に限定されないが、好ましくは目的細胞に増殖可能な環境を提供するものである。培養液（培地）は自ら調製してもよく市販培地を購入して用いてもよい。
　基礎培地としては、例えば、ＢＭＥ培地、ＢＧＪｂ培地、ＣＭＲＬ　１０６６培地、Ｇｌａｓｇｏｗ　ＭＥＭ　（ＧＭＥＭ）培地、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ＭＥＭ　Ｚｉｎｃ　Ｏｐｔｉｏｎ培地、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ　１９９培地、Ｅａｇｌｅ　ＭＥＭ培地、αＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、Ｆ－１２培地、ＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地、ＩＭＤＭ／Ｆ１２培地、ハム培地、ＲＰＭＩ　１６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、又はこれらの混合培地等、動物細胞の培養に用いることのできる培地を挙げることができる。これらの基礎培地には、グルコース等の糖質、アミノ酸等の炭素源、ビタミン、無機塩類等が含まれる。
　基礎培地には、適宜目的とする分化誘導に悪影響を及ぼさない範囲で、動物細胞の培養に通常用いられる任意の成分を添加してもよい。
　本発明で使用される培地は、移植に適した細胞塊を製造するために使用するという観点から、無血清培養液であることが好ましい。
　本発明における「無血清培養液」とは、無調整又は未精製の血清を実質的に含まない培地を意味する。本明細書において、精製された血液由来成分、又は、動物組織由来成分（例えば、増殖因子）が混入している培地であっても、無調整又は未精製の血清を含まない限り、無血清培養液に含まれる。無血清培養液は、適宜、脂肪酸又は脂質、アミノ酸（例えば、非必須アミノ酸）、ビタミン、増殖因子、サイトカイン、抗酸化剤、２－メルカプトエタノール、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類等を含有してもよい。
　本発明で使用される培地は、好ましくはゼノフリー培地である。ここで「ゼノフリー」とは、培養対象の細胞の生物種とは異なる生物種由来の成分（異種由来成分、Xenogenic factorともいう）が排除された条件を意味する。無血清培養液の一部は、ゼノフリー培地であり得る。
〔血清代替物〕
　本発明で使用される培地には、血清代替物が含まれていてもよい。血清代替物として、例えば、アルブミン、トランスフェリン、脂肪酸、コラーゲン前駆体、微量元素、２－メルカプトエタノール又は３’チオールグリセロール、或いはこれらの均等物等を適宜含有するものを挙げることができる。かかる血清代替物は、例えば、ＷＯ９８／３０６７９に記載の方法により調製することができる。血清代替物としては市販品を利用してもよい。かかる市販の血清代替物としては、例えば、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ　Ｓｅｒｕｍ　Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製；以下、ＫＳＲと記す場合がある。）、「ＳｔｅｍＳｕｒｅ（登録商標）Ｓｅｒｕｍ　Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＳＳＲ）」Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ－ｄｅｆｉｎｅｄ　Ｌｉｐｉｄ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）、Ｂ２７サプリメント（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）、Ｎ２サプリメント（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）、ＩＴＳサプリメント（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）が挙げられ、好ましくはＮ２サプリメント又はＢ２７サプリメントが挙げられる。
〔支持細胞〕
　本明細書において、支持細胞とは、フィーダー細胞ともいい、多能性幹細胞等の幹細胞を培養するときに共存させる当該幹細胞以外の細胞をいう。支持細胞としては、例えば、マウス線維芽細胞（ＭＥＦ等）、ヒト線維芽細胞、ＳＮＬ細胞、ＳＴＯ細胞等が挙げられる。支持細胞は、増殖抑制処理された支持細胞であってもよい。ここで、増殖抑制処理としては、増殖抑制剤（例えば、マイトマイシンＣ）処理又はガンマ線照射若しくはＵＶ照射等による処理が挙げられる。
　本明細書において「支持細胞の非存在下（フィーダーフリーともいう）」とは、支持細胞非存在下にて培養することである。支持細胞非存在下とは、例えば、支持細胞を添加していない条件、又は、支持細胞を実質的に含まない（例えば、全細胞数に対する支持細胞数の割合が３％以下、好ましくは１％以下）の条件が挙げられる。
〔浮遊培養〕
　本発明において「浮遊培養」とは、細胞を培地中に浮遊させた状態で生存させること、又は、細胞を培養容器へ非接着の状態で凝集体（スフェアとも言う）を形成させて培養することを意味する。本明細書中では、細胞は、単細胞又は複数の細胞が集まった塊（細胞塊又は細胞集団）の状態で浮遊培養される。
　浮遊培養に用いられる培養容器としては、特に限定されないが、例えば、フラスコ、組織培養用フラスコ、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マイクロポア、マルチプレート、マルチウェルプレート、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、バイオリアクター、ローラーボトルが挙げられる。
　非接着性の条件下での培養を可能とするため、培養器は、細胞非接着性であることが好ましい。細胞非接着性の培養器としては、培養器の表面が、細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理（例えば、細胞外マトリックス等によるコーティング処理）されていない培養容器、若しくは、人工的に接着を抑制する処理（例えば、ポリヒドロキシエチルメタクリル酸（ｐｏｌｙ－ＨＥＭＡ）、非イオン性の界面活性ポリオール（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－１２７等）又はリン脂質類似構造物（例えば、２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンを構成単位とする水溶性ポリマー（Ｌｉｐｉｄｕｒｅ（登録商標）））によるコーティング処理した培養容器を使用することによって行うことができる。浮遊培養、とくにＳＦＥＢｑ法において用いられる培養容器として、ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ（登録商標）（タンパク質低吸着処理９６穴プレート、住友ベークライト製）が挙げられる。
　本明細書において、浮遊培養は、静置培養であってもよいし、振とう培養、旋回培養又は攪拌培養であってもよい。
　本明細書において静置培養とは、細胞塊を意識的に移動させない状態で培養する培養法のことをいう。すなわち、例えば、局所的な培地温度の変化に伴って、培地が対流し、その流れによって、細胞塊が移動することがあるが、意識的に細胞塊を移動させていないことから、この様な場合も含めて、本発明では静置培養という。
　振とう培養、旋回培養又は攪拌培養には、当業者に周知の機器を適宜用いることができる。
＜ｂＦＧＦ＞
　本明細書において、ｂＦＧＦは、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）を意味し、ＦＧＦ２とも称されるタンパク質である。
＜ＴＧＦβシグナル阻害剤＞
　本明細書において、ＴＧＦβシグナル阻害剤とは、ＴＧＦβの受容体への結合からＳＭＡＤへと続くシグナル伝達を阻害する物質であり、受容体であるＡＬＫファミリーへの結合を阻害する物質、又はＡＬＫファミリーによるＳＭＡＤのリン酸化を阻害する物質が挙げられる。
　本明細書において、ＴＧＦβシグナル阻害剤は、ＴＧＦβにより媒介されるシグナル伝達を抑制し得るものである限り特に限定されず、核酸、タンパク質、低分子有機化合物のいずれであってもよい。
　ＴＧＦβシグナル阻害剤として、例えばＴＧＦβに直接作用する物質（例えば、タンパク質、抗体、アプタマー等）、ＴＧＦβをコードする遺伝子の発現を抑制する物質（例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ等）、ＴＧＦβ受容体とＴＧＦβの結合を阻害する物質、ＴＧＦβ受容体によるシグナル伝達に起因する生理活性を阻害する物質（例えば、ＴＧＦβ受容体の阻害剤等）を挙げることができる。また、ＴＧＦβシグナル阻害剤として、受容体であるＡＬＫファミリーへの結合を阻害する物質、又はＡＬＫファミリーによるＳＭＡＤのリン酸化を阻害する物質が挙げられる。当該ＡＬＫファミリーとして具体的には、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５及びＡＬＫ７が挙げられる。
　ＴＧＦβシグナル阻害剤としては、例えば、Ｌｅｆｔｙ－１（ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．として、マウス：ＮＭ＿０１００９４、ヒト：ＮＭ＿０２０９９７が例示される）、Ｌｅｆｔｙ－２（ＮＣＢＩ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．として、マウス：ＮＭ＿１７７０９９、ヒト：ＮＭ＿００３２４０及びＮＭ＿００１１７２４２５が例示される）、ＳＢ４３１５４２（4-[4-(1,3-benzodioxol-5-yl)-5-(2-pyridinyl)-1H-imidazol-2-yl]-benzamide）、ＳＢ２０２１９０（以上、R.K.Lindemann et al.,Mol.Cancer,2003,2:20）、ＳＢ５０５１２４（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、ＮＰＣ３０３４５、ＳＤ０９３、ＳＤ９０８、ＳＤ２０８（Ｓｃｉｏｓ）、ＬＹ２１０９７６１、ＬＹ３６４９４７、ＬＹ５８０２７６（Ｌｉｌｌｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、Ａ－８３－０１（ＷＯ ２００９１４６４０８）、Ｇａｌｕｎｉｓｅｒｔｉｂ（ＬＹ２１５７２９９）、ＬＹ３２００８８２、ＳＢ５２５３３４、ＧＷ７８８３８８、ＲｅｐＳｏｘ、及びこれらの誘導体などが例示される。本発明で使用されるＴＧＦβシグナル阻害剤は、好ましくは、ＳＢ４３１５４２又はＡ－８３－０１である。
＜Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤＞
　本明細書において、Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤とは、Ｗｎｔ（例えばＷｎｔ３）の産生を抑制する物質、又はＷｎｔの受容体への結合からβカテニンの蓄積へと続くシグナル伝達を阻害する物質であり、受容体であるＦｒｉｚｚｌｅｄファミリーへの結合を阻害する物質、又はβカテニンの分解を促進する物質などが挙げられる。
　このようなＷｎｔシグナル伝達阻害剤としては、例えば、Ｗｎｔタンパク質のプロセシングに関与するＰＯＲＣＮ（ヒトの場合、ＮＣＢＩのアクセション番号：ＮＰ＿００１２６９０９６、ＮＰ＿０７３７３６、ＮＰ＿９８２２９９、ＮＰ＿９８２３００、又はＮＰ＿９８２３０１で表されるタンパク質が例示される）を阻害する物質、ＤＫＫ１タンパク質（例えば、ヒトの場合、ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＮＭ＿０１２２４２）、スクレロスチン（例えば、ヒトの場合、ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＮＭ＿０２５２３７）、Ｃｅｒｂｅｒｕｓタンパク質、Ｗｎｔ受容体阻害剤、可溶型Ｗｎｔ受容体、抗Ｗｎｔ抗体、カゼインキナーゼ阻害剤、ドミナントネガティブＷｎｔタンパク質等が挙げられるがこれらに限定されず、１又は複数の物質を組合せて使用してもよい。
　具体的なＷｎｔシグナル伝達阻害剤として、ＩＷＲ－１－ｅｎｄｏ（(4-[(3aR,4S,7R,7aS)-1,3,3a,4,7,7a-hexahydro-1,3-dioxo-4,7-methano-2H-isoindol-2-yl]-N-8-quinolinyl-benzamide）、Ｍｅｒｃｋ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ＩＷＰ－２（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＩＷＰ－３（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＩＷＰ－４（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＩＷＰ－Ｌ６（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、Ｃ５９（又は、Ｗｎｔ－Ｃ５９）（Ｃｅｌｌａｇｅｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ＩＣＧ－００１（Ｃｅｌｌａｇｅｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ＬＧＫ－９７４（又は、ＮＶＰ－ＬＧＫ－９７４）（Ｃｅｌｌａｇｅｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ＦＨ５３５（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＷＩＫＩ４（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＫＹＯ２１１１（Minami I,et al,Cell Rep.2:1448-1460,2012）、ＰＮＵ－７４６５４（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＸＡＶ９３９（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）、及びこれらの誘導体などが例示される。なかでも、ＩＷＲ－１－ｅｎｄｏ、Ｃ５９、ＬＧＫ－９７４等が好ましい。
＜Ｎｏｔｃｈシグナル阻害剤＞
　Ｎｏｔｃｈシグナル阻害剤は、Ｎｏｔｃｈによるシグナル伝達を抑制し得る物質である限り限定されない。Ｎｏｔｃｈシグナル阻害剤としては、γ－セクレターゼ阻害剤、Ｎｏｔｃｈ転写複合体阻害剤、例えばＭＡＭＬ－１阻害剤等が挙げられる。
　γ－セクレターゼ阻害剤は、γ－セクレターゼの酵素活性を阻害し得る物質である限り限定されない。具体的には、ＤＡＰＴ（N-[N-(3,5-difluorophenacetyl)-l-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester）、ＤＢＺ（dibenzazepine）、ＭＤＬ２８１７０（Calpain Inhibitor III）、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ　Ｅ（N-[(1S)-2-[[(3S)-2,3-Dihydro-1-methyl-2-oxo-5-phenyl-1H-1,4-benzodiazepin-3-yl]amino]-1-methyl-2-oxoethyl]-3,5-difluorobenzeneacetamide）、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ　３４（(2S,3R)-3-(3,4-Difluorophenyl)-2-(4-fluorophenyl)-4-hydroxy-N-((3S)-2-oxo-5-phenyl-2,3-1H-benzo[e][1,4]diazepin-3-yl)butyramide）、γ－セクレターゼ阻害剤ＸＩ、γ－セクレターゼ阻害剤ＩＩＩ等が挙げられる。Ｎｏｔｃｈ転写複合体阻害剤としてはＣＢ－１０３（6-[4-(1,1-dimethylethyl)phenoxy]-3-pyridinamine）、ＩＭＲ－１（2-Methoxy-4-(4-oxo-2-thioxo-thiazolidin-5-ylidenemethyl)-phenoxy]-acetic acid ethyl ester）等が挙げられる。
＜ＲＯＣＫ阻害剤＞
　ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｒｈｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｃｏｉｌｅｄ－ｃｏｉｌキナーゼ（ＲＯＣＫ）の阻害剤であり、ＲＯＣＫの機能を抑制する物質である限り特に限定されない。ＲＯＣＫ阻害剤としては、Ｙ－２７６３２（(+)-(R)-trans-4-(1-aminoethyl)-N-(4-pyridyl)cyclohexanecarboxamide dihydrochloride）、Ｈ－１１５２（(S)-4-Methyl-5-((2-methyl-1,4-diazepan-1-yl)sulfonyl)isoquinoline dihydrochloride）、Ｆａｓｕｄｉｌ（ＨＡ－１０７７；1-(5-Isoquinolinesulfonyl)homopiperazine Hydrochloride）、Ｗｆ－５３６(4-[(1R)-1-aminoethyl]-N-(pyridin-4-yl)benzamide)、Ｔｈｉａｚｏｖｉｖｉｎ（N-Benzyl-2-(pyrimidin-4-ylamino)thiazole-4-carboxamide）、Ｒｉｐａｓｕｄｉｌ(4-Fluoro-5-[[(2S)-hexahydro-2-methyl-1H-1,4-diazepin-1-yl]sulfonyl]isoquinoline)、ＧＳＫ４２９２８（4-[4-(Trifluoromethyl)phenyl]-N-(6-Fluoro-1H-indazol-5-yl)-2-methyl-6-oxo-1,4,5,6-tetrahydro-3-pyridinecarboxamide）６、ＲＫＩ－１４４７（N-[(3-Hydroxyphenyl)methyl]-N'-[4-(4-pyridinyl)-2-thiazolyl]urea）、Ａｚａｉｎｄｏｌｅ１（6-chloro-N4-[3,5-difluoro-4-[(3-methyl-1H-pyrrolo[2,3-b]pyridin-4-yl)oxy]phenyl]pyrimidine-2,4-diamine）、ＨＡ－１１００（1-[(1,2-Dihydro-1-oxo-5-isoquinolinyl)sulfonyl]hexahydro-1H-1,4-diazepine）、Ｙ－３９９８３（4-[(1R)-1-Aminoethyl]-N-1H-pyrrolo[2,3-b]pyridin-4-ylbenzamide)等が挙げられる。ＲＯＣＫ阻害剤として、好ましくはＹ－２７６３２が挙げられる。
＜神経栄養因子＞
　本明細書において、神経栄養因子（Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ　Ｆａｃｔｏｒ）とは、神経細胞の生存、神経突起や軸索の伸展、シナプス形成等を促進する活性を有する分泌タンパク質の総称である。神経栄養因子として、Ｎｅｒｖｅ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ（ＮＧＦ）、Ｂｒａｉｎ－ｄｅｒｉｖｅｄ　Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ　Ｆａｃｔｏｒ（ＢＤＮＦ）、Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ　３（ＮＴ－３）、Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ　４／５（ＮＴ－４／５）、Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ　６（ＮＴ－６）、Ｇｌｉａ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ　Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ　Ｆａｃｔｏｒ（ＧＤＮＦ）、及びＣｉｌｉａｒｙ　Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ　Ｆａｃｔｏｒ（ＣＮＴＦ）などが挙げられる。本発明において好ましい神経栄養因子は、ＧＤＮＦ、及びＢＤＮＦから成るグループより選択される因子である。神経栄養因子は、例えばＷａｋｏ社やＲ＆Ｄ　ｓｙｓｔｅｍｓ社等から市販されており容易に利用することが可能であるが、当業者に公知の方法によって細胞へ強制発現させることによって得てもよい。
＜ｃＡＭＰ活性化剤＞
　本明細書において、ｃＡＭＰ活性化剤としては、ｃＡＭＰ、ｄｉｂｕｔｙｒｙｌ－ｃＡＭＰ又はフォルスコリン等が挙げられる。
２．大脳オルガノイドの製造方法
　本発明の大脳オルガノイドの製造方法の一態様としては、下記工程（１）及び工程（２）を含む、支持細胞の非存在下、多能性幹細胞から大脳オルガノイドを製造する方法が挙げられる。「支持細胞の非存在下」は、上述のとおりであり、工程（１）及び工程（２）は共に、「支持細胞の非存在下」で行われる。
（１）多能性幹細胞を、ｂＦＧＦが実質的に含まれず、かつＴＧＦβシグナルを実質的に惹起しない培養液中で培養する工程
（２）工程（１）で得られた細胞を、神経細胞へと分化誘導する工程
＜工程（１）＞
　本明細書において、「物質Ｘの存在下」での培養とは、「物質Ｘを含む培地」中で培養することを意味し、上記物質Ｘは上記培地に本来の成分として含まれているものであってもよく、外来性（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ）に添加されたものであってもよい。すなわち、当該培養中に細胞又は組織によって発現、分泌若しくは産生され得る内在性（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ）の物質Ｘは外来性の物質Ｘとは区別され、外来性の物質Ｘを含んでいない培地は内在性の物質Ｘを含んでいても「物質Ｘを含む培地」の範疇には該当しないと解する。
　例えば、「ＴＧＦβシグナル阻害剤を含む培地」とは、ＴＧＦβシグナル阻害剤が添加された培地又はＴＧＦβシグナル阻害剤を本来の成分として含む培地である。
　また、「ｂＦＧＦが実質的に含まれない」培養液とは、細胞自体が発現するｂＦＧＦの存在を否定するものではなく、本来ｂＦＧＦを含んでいない、又は、外来性にｂＦＧＦが添加されていない培養液を意味する。
　または、用いる細胞及び培地交換操作によっては、検出限界以下の残存するｂＦＧＦの存在は否定せず、このような場合も本願の範囲に含める。また、本発明における神経分化の効率に影響を与えない程度にｂＦＧＦを低用量含有する培地を用いて培養することも本願は包含する。
　また、「ＴＧＦβシグナルを実質的に惹起しない」培養液とは、細胞自体が発現するＴＧＦβの存在を否定するものではなく、培養液が本来ＴＧＦβを含んでいない、又はＴＧＦβが外来性に添加されていない培養液であることを意味する。または、外来性に添加されたＴＧＦβを含む培養液若しくは外来性に添加されたＴＧＦβを含まない培養液に、有効量のＴＧＦβシグナル阻害剤が添加された培養液もまた、「ＴＧＦβシグナルを実質的に惹起しない培養液」の範疇である。
　ＴＧＦβシグナルを実質的に惹起しないために、ＴＧＦβシグナル阻害剤を使用する場合、上記のＴＧＦβシグナル阻害剤を適宜選択することができる。ＴＧＦβシグナル阻害剤の濃度は、培養液におけるＴＧＦβシグナル活性の強度に応じて、適宜調整することができる。すなわち、培養液中におけるＴＧＦβシグナル阻害剤の濃度は、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５又はＡＬＫ７シグナルの活性を阻害する濃度であれば特に限定されない。
　工程（１）の培養液に添加されるＴＧＦβシグナル阻害剤としては、上記のＴＧＦβシグナル阻害剤であればよく、好ましくはＳＢ４３１５４２及びＡ－８３－０１からなる群から選ばれる。工程（１）の培養液として例えば、ＥＳ細胞若しくはｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞の多能性を維持しつつ培養する目的で市販されている培地であって、ｂＦＧＦを含まない培地を使用する場合、ＴＧＦβシグナル阻害剤の濃度としては、ＴＧＦβシグナル阻害剤としてＳＢ４３１５４２を使用した場合における、１００ｎＭ～１ｍＭ、１００ｎＭ～５００μＭ、１００ｎＭ～１００μＭ、１００ｎＭ～５０μＭ、１００ｎＭ～４０μＭ、１００ｎＭ～３０μＭ、１００ｎＭ～２５μＭ、１００ｎＭ～２０μＭ、１００ｎＭ～１５μＭ、１００ｎＭ～１０μＭ、５００ｎＭ～３０μＭ、５００ｎＭ～１０μＭ、１００ｎＭ～７μＭ、１μＭ～２０μＭ、１μＭ～１０μＭ、５００ｎＭ～７μＭ、１μＭ～７μＭ、１００ｎＭ～３μＭ、１００ｎＭ～２μＭ、１００ｎＭ～１μＭ、１００ｎＭ～７５０ｎＭ等に相当する濃度であるが、これらに限定されない。好ましくは、１μＭから１０μＭに相当する濃度が挙げられる。他のＴＧＦβシグナル阻害剤の場合、前述の濃度のＳＢ４３１５４２に相当するＡＬＫ阻害活性若しくはＴＧＦβ阻害活性を示す濃度を、適宜設定することができる。ここで、ＳＢ４３１５４２を使用する場合における濃度に相当する濃度とは、当該ＳＢ４３１５４２濃度と同程度のＴＧＦβシグナル伝達経路の阻害作用（例えば、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５又はＡＬＫ７シグナルの活性を阻害する作用）を有する濃度を意味する。当該濃度は、当業者であれば容易に設定することができる。
　工程（１）で用いられる培養液として、例えば、多能性幹細胞培養用培地からｂＦＧＦ不含の状態で市販されている培地に、ＴＧＦβシグナル阻害剤を添加して用いることができる。
　また、ｂＦＧＦが実質的に含まれず、かつＴＧＦβシグナルを実質的に惹起しない培養液として、例えば、多能性幹細胞を維持・増殖できる培地（例えば、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　８）からｂＦＧＦ及びＴＧＦβを除去した培地として市販されている培養液（例えば、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　６）を用いることもできる。
　工程（１）で使用される培養液は、培養に影響を与えない程度、すなわち工程（１）及び工程（２）により得られる大脳オルガノイドの形成に実質的な影響を与えない程度であれば、他の物質を含んでいてもよいが、好ましくは、ＢＭＰシグナル、ソニック・ヘッジ・ホッグシグナル等、多能性幹細胞の分化誘導に影響を与えるシグナル伝達を亢進又は阻害する物質が、外的に添加されていないことが望ましい。また、工程（１）で使用される培養液は、Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤を含んでいてもよいが、Ｗｎｔシグナル伝達を亢進する物質が外的に添加されていないことが望ましい。
　工程（１）に供される多能性幹細胞は、好ましくはヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）又はヒト胚性幹細胞（ＥＳ細胞）であり、更に好ましくはヒト人工多能性幹細胞である。
　工程（１）において、多能性幹細胞は支持細胞非存在下で培養される。支持細胞非存在下は、フィーダーフリーともいい、培地中に支持細胞が存在しない状態をいう。ここでいう支持細胞非存在下の培養条件としては、具体的には線維芽細胞、ＳＮＬ細胞、ＳＴＯ細胞等の支持細胞を添加していない培養条件が挙げられる。
　工程（１）で用いられる培養液は、好ましくは血清を実質的に含まない無血清培養液であり、必要に応じ血清代替物を添加した無血清培養液を用いてもよい。血清代替物としては、上述のものが挙げられるが、好ましくは、ＫＳＲ、好ましくは１～３０％のＫＳＲ等を用いることができる。
　工程（１）で用いられる培養液は、ｂＦＧＦが実質的に含まれず、かつＴＧＦβシグナルを実質的に惹起しない培養液、好ましくは無血清培養液であれば、特に限定はないが、ｂＦＧＦ及びＴＧＦβシグナルを惹起する物質以外については、多能性幹細胞の多能性を維持しつつ培養するために必要な成分を含む培地であることが望ましい。
　多能性幹細胞の多能性を維持しつつ培養するための培地、すなわち多能性幹細胞用培地は多数市販されており、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　８（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）、Ｓ－ｍｅｄｉｕｍ（ＤＳファーマバイオメディカル社製）、ＳｔｅｍＰｒｏ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）、ｈＥＳＦ９（Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　Ｕ　Ｓ　Ａ．　２００８　Ｓｅｐ　９；１０５（３６）：１３４０９－１４）、ｍＴｅＳＲ１（ＳＴＥＭＣＥＬＬ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ｍＴｅＳＲ２（ＳＴＥＭＣＥＬＬ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ＴｅＳＲ－Ｅ８（ＳＴＥＭＣＥＬＬ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ　ＤＥＦ－ＣＳ　５００　Ｘｅｎｏ－Ｆｒｅｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｍｅｄｉｕｍ（タカラバイオ社製）又はＳｔｅｍＦｉｔ（味の素ヘルシーサプライ社製）等が挙げられる。
　工程（１）に供される多能性幹細胞は、凍結保存された多能性幹細胞を解凍した直後であってもよいが、好ましくは、多能性幹細胞の多能性を維持しつつ拡大培養するのに適した培地で予め培養・継代することができる。工程（１）に供される多能性幹細胞の継代数は特に限定はないが、２～８継代されることが望ましい。
　工程（１）の培養期間は、５日間未満、４日間未満、好ましくは３日間未満、更に好ましくは１２時間以上４８時間以下、１８時間以上４８時間以下、更に好ましくは２４時間以上４８時間以下、２４時間以上３６時間以下、又は１８時間以上３６時間以下であり、最も好ましくは１日間程度である。尚、当該培養期間には、準備段階としての多能性幹細胞の継代培養の期間は含まれない。
　工程（１）の培養は、浮遊培養及び接着培養のいずれの条件で行われてもよいが、好ましくは、接着培養により行われる。
　接着培養を行う際に用いられる培養器は、「接着培養する」ことが可能なものであれば特に限定されないが、細胞接着性の培養器が好ましい。細胞接着性の培養器としては、培養器の表面が、細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理された培養器が挙げられ、具体的には前述した内部がコーティング剤で被覆された培養器が挙げられる。コーティング剤としては、例えば、ラミニン［ラミニンα５β１γ１（以下、ラミニン５１１）、ラミニンα１β１γ１（以下、ラミニン１１１）、ラミニンα１β１γ２（ラミニン１１２）、ラミニンα２β１γ１（ラミニン２１１）、ラミニンα２β１γ２（ラミニン２１２）、ラミニンα２β２γ１（ラミニン２２１）、ラミニンα２β２γ２（ラミニン２２２）、ラミニンα５β１γ２（ラミニン５１２）等、及びラミニン断片（ラミニン５１１Ｅ８等）を含む］、エンタクチン、コラーゲン、ゼラチン、ビトロネクチン（Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ）、シンセマックス（コーニング社）、マトリゲル等の細胞外マトリクス等、又は、ポリリジン、ポリオルニチン等の高分子等が挙げられる。また、正電荷処理等の表面加工された培養容器を使用することもできる。好ましくは、ラミニンが挙げられ、より好ましくは、ラミニン５１１Ｅ８が挙げられる。ラミニン５１１Ｅ８は、市販品を購入する事ができる（例：ｉＭａｔｒｉｘ－５１１、ニッピ）。
　工程（１）における培養温度、ＣＯ２濃度等の培養条件は適宜設定できる。培養温度は、例えば約３０℃から約４０℃、好ましくは約３７℃である。またＣＯ２濃度は、例えば約１％から約１０％、好ましくは約５％である。
　工程（１）は、支持細胞の非存在下、多能性幹細胞の多分化能を維持したまま、培養する維持培養工程であり、工程（２）（分化誘導工程）の前に行われる、神経分化準備工程（Neural-differentiation preparation step）である。この神経分化準備工程は、神経分化の誘導の前、または、神経分化の導入の前、までの期間に準備をする工程であり、工程（１）にて培養した多能性幹細胞は、ＴＧＦβ関連遺伝子の発現が抑えられ、それによって、当該多能性幹細胞を神経細胞へと分化誘導すると、大脳オルガノイドの形成効率が高い。
＜工程（２）＞
　工程（１）で得られる細胞は、当業者に周知の方法で、神経細胞へ分化誘導することができ、これにより、大脳オルガノイドを得ることができる。
　分化誘導方法は、多能性幹細胞を、大脳オルガノイドを構成する細胞集団へ分化し得る分化誘導方法を、適宜選択することができる。当該方法は、周知であり、例えば、ＷＯ２０１５／０７６３８８、ＷＯ２０１６／１６７３７２、 Sakaguchi et al., Stem Cell Reports 2019 Vol 13 458-473、Kitahara, et al., Stem Cell Reports 2020 Vol. 15, 467-481（非特許文献１）及びKadoshima et al., 2013, PNAS, vol.110, No. 50, 20284-20289等に記載された方法を用いることができる。
　すなわち、工程（２）で行われる分化誘導法としては、以下の工程（２ａ）及び工程（２ｂ）が挙げられる：
（２ａ）工程（１）で得られた細胞を、ＴＧＦβシグナル阻害剤、及びＷｎｔシグナル伝達阻害剤を含む培養液中で浮遊培養、好ましくは静置培養して、細胞塊を得る工程
（２ｂ）工程（２ａ）で得られた細胞塊を、ＴＧＦβシグナル阻害剤又はＷｎｔシグナル伝達阻害剤を実質的に含まない培養液中、好ましくは、ＴＧＦβシグナル阻害剤及びＷｎｔシグナル伝達阻害剤のいずれも含まない培養液中で浮遊培養して、大脳オルガノイドを得る工程。
＜工程（２ａ）＞
　工程（１）で得られる細胞は、培養液中、好ましくは血清（無調整又は未精製の血清）を実質的に含まない無血清培養液中に分散され、非接着性の条件下で培養（即ち浮遊培養）し、複数の細胞を集合させて細胞塊を形成させる。凝集時に用いられる培養液としては、血清代替物を含む無血清培養液を用いてもよい。
　この細胞塊形成に用いる培養器としては、特に限定されないが、例えば、フラスコ、組織培養用フラスコ、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マイクロポア、マルチプレート、マルチウェルプレート、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、バイオリアクター、ローラーボトルが挙げられる。また、アルギン酸ハイドロゲル等ゲル包埋により細胞塊形成する方法も挙げられる。非接着性の条件下での培養を可能とするため、培養器は、細胞非接着性であることが好ましい。細胞非接着性の培養器としては、培養器の表面が、細胞非接着性となるように人工的に処理されているもの、細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理（例えば、細胞外マトリクス等によるコーティング処理）されていないもの等を使用することができる。
　細胞塊の形成に際しては、まず、工程（１）で得られる細胞を継代培養から回収し、これを、単細胞、又はこれに近い状態にまで分散する。この分散は、適切な細胞解離液を用いて行われる。細胞解離液としては、例えば、ＥＤＴＡ等のキレート剤；トリプシン、コラゲナーゼＩＶ、メタロプロテアーゼ等のタンパク分解酵素等を単独で又は適宜組み合わせて用いることができる。なかでも細胞障害性が少ないものが好ましく、このような細胞解離液として、例えば、ディスパーゼ（エーディア）、ＴｒｙｐＬＥ（Ｇｉｂｃｏ社製）又はアキュターゼ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）等の市販品が入手可能である。分散された細胞は上記培地（無血清培養液、すなわち、後述の工程（２ａ）で使用される基礎培地）にＹ－２７６３２を添加した培地中に懸濁される。
　ここで、分散により誘導される多能性幹細胞（特に、ヒト多能性幹細胞）の細胞死を抑制するために、Ｒｈｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｃｏｉｌｅｄ－ｃｏｉｌキナーゼの阻害剤（ＲＯＣＫ阻害剤）を培養開始時から添加することが好ましい（ＷＯ２００８／０３５１１０、Watanabe, K. et al., Nature Biotechnology, 2007, vol.25, No.6, page 681-686）。
　ＲＯＣＫ阻害剤としては、上記のものが挙げられ、好ましくは、Ｙ－２７６３２等を挙げることができる。
　ＲＯＣＫ阻害剤は培養開始から、例えば２０日以内、１５日以内、好ましくは１０日以内、より好ましくは６日以内添加する。ＲＯＣＫ阻害剤の濃度は一定であっても、漸減させてもよい。一態様として、ＲＯＣＫ阻害剤の存在下で１０日～２０日間、好ましくは１５日間～２０日間、更により好ましくは約１７日間から１９日間培養し、かつその間にＲＯＣＫ阻害剤の濃度を漸減させることができる。一態様として、ＲＯＣＫ阻害剤の存在下で１０～２５日間、好ましくは１２～２５日間、１０～２０日間、更により好ましくは約１５日間から２０日間、又は約１７日間から１９日間、培養し、かつその間にＲＯＣＫ阻害剤の濃度を漸減させてもよい。
　浮遊培養に用いられるＲＯＣＫ阻害剤の濃度は、分散により誘導される多能性幹細胞の細胞死を抑制し得る濃度である。例えば、ＲＯＣＫ阻害剤としてＹ－２７６３２を用いた場合における、約０．１～２００μＭ、好ましくは約２～１００μＭ、更に好ましくは約３０～１００μＭに相当する濃度が挙げられる。
　上述のとおりＲＯＣＫ阻害剤の濃度を添加する期間内で変動させてもよく、例えば期間の後半で濃度を半減させたり、工程（２ａ）を開始した時点から徐々に濃度を低減させたりできる。
　工程（１）で得られる細胞を分散させた懸濁液を、上記培養器中に播き、非接着性の条件下で培養することにより、複数の細胞を集合させて細胞塊を形成する。
　一態様として、分散した細胞を迅速に凝集させて、１つの培養コンパートメント中に１つの細胞塊を形成することが好ましい（ＳＦＥＢｑ法）。分散した細胞を迅速に凝集させる方法としては、例えば、以下の方法を挙げることができる：
１）比較的小さな体積（例えば、１ｍｌ以下、５００μｌ以下、２００μｌ以下、１００μｌ以下）の培養コンパートメント中に、分散した細胞を閉じ込め、該コンパートメント中に１個の細胞塊を形成する方法、又は
２）遠心チューブに分散した細胞を入れ、これを遠心し、１箇所に細胞を沈殿させることにより、該チューブ中に１個の細胞塊を形成する方法。
　上記１）において、好ましくは分散した細胞を閉じ込めた後、培養コンパートメントを静置する。培養コンパートメントとしては、マルチウェルプレート（３８４ウェル、１９２ウェル、９６ウェル、４８ウェル、２４ウェル等）、マイクロポア、チャンバースライド等におけるウェルや、チューブ、ハンギングドロップ法における培地の液滴等を挙げることができるが、これらに限定されない。該コンパートメントに閉じ込められた分散した細胞が、重力により１箇所に沈殿し、或いは細胞同士が接着することにより、１つの培養コンパートメントにつき、１つ細胞塊が形成される。マルチウェルプレート、マイクロポア、チャンバースライド、チューブ等の底の形状は、分散した細胞が１箇所へ沈殿するのが容易となるように、Ｕ底又はＶ底とすることが好ましい。
　１つの培養コンパートメント中に播く細胞の数は、１つの培養コンパートメントにつき１つの細胞塊が形成され、且つ本発明の方法によって、該細胞塊において、前脳細胞への分化誘導が可能であれば、特に限定されないが、１つの培養コンパートメントにつき、工程（１）で得られる細胞を、通常約１×１０３～約５×１０４個、好ましくは約１×１０３～約２×１０４個、より好ましくは約２×１０３～約１．２×１０４個播く。そして、細胞を迅速に凝集させることにより、１つの培養コンパートメントにつき、通常約１×１０３～約５×１０４個、好ましくは約１×１０３～約２×１０４個、より好ましくは約２×１０３～約１．２×１０４個の細胞塊が１個形成される。
　または、１つの培養コンパートメントにつき、工程（１）で得られる細胞を、通常約１×１０３～約５×１０５個、好ましくは約１×１０３～約２×１０５個、より好ましくは約２×１０３～約１×１０５個播く。そして、細胞を迅速に凝集させることにより、１つの培養コンパートメントにつき、通常５×１０２～約５×１０５個、好ましくは約５×１０２～約２×１０５個、より好ましくは約１×１０３～約１×１０５個の細胞塊が１個形成される。
　細胞塊形成までの時間は、１つのコンパートメントにつき１つの細胞塊が形成され、且つ、該細胞塊において、大脳オルガノイドへの分化誘導が可能な範囲で適宜決定可能であるが、好ましくは、２４時間以内、より好ましくは１２時間以内で、細胞塊を形成する。または、細胞塊形成までの時間は、好ましくは、４８時間以内、より好ましくは２４時間以内で細胞塊を形成する。
　また凝集塊形成時の培養温度、ＣＯ２濃度等の他の培養条件は適宜設定できる。培養温度は、特に限定されるものではないが、例えば約３０～４０℃、好ましくは約３７℃である。また、ＣＯ２濃度は、例えば約１～１０％、好ましくは約５％である。
　更に、同一培養条件の培養コンパートメントを複数用意し、各培養コンパートメントにおいて、１個の細胞塊を形成させることにより、質的に均一な、細胞塊の集団を得ることができる。細胞塊が質的に均一であることは、細胞塊のサイズ及び細胞数、巨視的形態、組織染色解析による微視的形態及びその均一性、分化及び未分化マーカーの発現及びその均一性、分化マーカーの発現制御及びその同期性、分化効率の細胞塊間の再現性などに基づき、評価することが可能である。ここで細胞塊の集団が「均一」とは、細胞塊の集団全体のうちの８０％以上の細胞塊が、当該細胞塊の集団における当該パラメーターの平均値±２０％の範囲内、好ましくは、平均値±１０％、更に好ましくは、平均値±５％の範囲内であることを意味する。
　工程（２ａ）で用いられる培養液には、ＴＧＦβシグナル阻害剤及びＷｎｔシグナル伝達阻害剤が含まれる。ＴＧＦβシグナル阻害剤として上述のものが利用可能であり、好ましくは、ＳＢ４３１５４２、Ａ－８３－０１、又はＸＡＶ－９３９が挙げられる。Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤として上述のものが利用可能であり、好ましくは、ＩＷＲ－１－ｅｎｄ、Ｃ５９、ＬＧＫ－９７４、ＤＫＫ－１（タンパク質）が挙げられる。
　好ましいＷｎｔシグナル伝達阻害剤とＴＧＦβシグナル阻害剤の組み合わせは、ＩＷＲ－１－ｅｎｄｏ及びＳＢ４３１５４２である。
　培地中のＷｎｔシグナル伝達阻害剤の濃度は、細胞塊が前脳細胞への分化誘導可能な範囲で、適宜設定することができるが、Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤としてＩＷＲ－１－ｅｎｄｏを用いる場合における、０．１～５０μＭ、好ましくは０．３～１０μＭ、更に好ましくは０．３～５μＭに相当するＷｎｔシグナル伝達阻害活性を呈する濃度が挙げられる。
　培地中のＴＧＦβシグナル阻害剤の濃度は、細胞塊が前脳細胞への分化誘導可能な範囲で、適宜設定することができるが、ＴＧＦβシグナル阻害剤としてＳＢ４３１５４２を用いる場合における、０．１～１００μＭ、好ましくは１～５０μＭ、更に好ましくは１～１０μＭに相当するＴＧＦβシグナル阻害活性を呈する濃度が挙げられる。
　工程（２ａ）で用いられる培養液、すなわち、細胞塊の形成時及び細胞塊の浮遊培養に用いられる培地は、動物細胞の培養に用いることのできる培地であれば特に限定されず、上述の定義における、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地からとして調製することができる。
　工程（２ａ）において用いられる基礎培地として、例えば、Ｇｌａｓｇｏｗ ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、Ｆ－１２培地（Ｆ１２培地ともいう）及びＤＭＥＭ／Ｆ１２培地等が挙げられる。好ましくは、Ｇｌａｓｇｏｗ　ＭＥＭ培地が用いられる。
　細胞塊の形成時に用いられる培地は、血清代替物を含有していてもよい。血清代替物は、上述のものを使用できるが、例えば、ＫＳＲ（ｋｎｏｃｋｏｕｔ　ｓｅｒｕｍ　ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ－ｄｅｆｉｎｅｄ　Ｌｉｐｉｄ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ（Ｇｉｂｃｏ社製）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ社製）が挙げられる。
　具体的には、約１０～３０％の血清代替物（例えば、ＫＳＲ）を含む培地を用いることができる。
　または、細胞塊の形成時に用いられる培地は、血清代替物を含有していてもよい。血清代替物は、上述のものを使用できるが、例えば、ＫＳＲ（Ｇｉｂｃｏ社製）、Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ－ｄｅｆｉｎｅｄ　Ｌｉｐｉｄ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ（Ｇｉｂｃｏ社製）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ社製）が挙げられる。具体的には、それぞれの製品の使用マニュアルに従った適量の血清代替物（例えば、１～３０％のＫＳＲ）を含む培地を用いることができる。
　細胞塊の浮遊培養に用いられる培地は、前脳細胞への分化誘導に、悪影響を与えない範囲で、他の添加物を含むことができる。添加物としては、例えば、インスリン、鉄源（例えばトランスフェリン等）、ミネラル（例えばセレン酸ナトリウム等）、糖類（例えばグルコース等）、有機酸（例えばピルビン酸、乳酸等）、血清蛋白質（例えばアルブミン等）、アミノ酸（例えばＬ－グルタミン等）、還元剤（例えば２－メルカプトエタノール等）、ビタミン類（例えばアスコルビン酸、ｄ－ビオチン等）、抗生物質（例えばストレプトマイシン、ペニシリン、ゲンタマイシン等）、緩衝剤（例えばＨＥＰＥＳ等）等が挙げられるが、これらに限定されない。
　一態様において、細胞塊の浮遊培養に用いられる培地は、前脳細胞への分化誘導に悪影響を与えない観点から、Ｆｇｆ、Ｗｎｔ、Ｎｏｄａｌ、Ｎｏｔｃｈ、Ｓｈｈ等のパターン形成因子；インスリン及びＬｉｐｉｄ－ｒｉｃｈ　ａｌｂｕｍｉｎ等の成長因子を含まないことが好ましい。
　凝集塊の浮遊培養における培養温度、ＣＯ２濃度、Ｏ２濃度等の他の培養条件は適宜設定できる。培養温度は、例えば約３０～４０℃、好ましくは約３７℃である。ＣＯ２濃度は、例えば約１～１０％、好ましくは約５％である。Ｏ２濃度は、例えば約２０％である。
　工程（２ａ）における浮遊培養は、静置培養、又は振とう培養若しくは旋回培養若しくは攪拌培養のいずれであってもよいが、好ましくは静置培養である。又は、工程（２ａ）の一部の期間のみ静置培養を実施してもよい。
　工程（２ａ）は、前脳領域への分化方向が定まり、前脳マーカー陽性細胞塊（例、Ｆｏｘｇ１陽性細胞塊）が誘導されるのに十分な期間実施される。すなわち、工程（２ａ）により、前脳マーカー陽性細胞を含む細胞塊を得ることができる。
　一態様として、工程（２ａ）は、少なくとも１つの前脳マーカー陽性細胞が生成する段階まで行われる。好ましくは、工程（２ａ）は、例えば、培養中の細胞塊のうち５０％以上、好ましくは７０％以上の細胞塊が前脳マーカー陽性となるまで実施される。
　一態様として、工程（２ａ）は、細胞塊に含まれる細胞の３０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは７０％以上が、前脳マーカー陽性である細胞塊が生成する段階まで行われる。
　工程（２ａ）の培養期間は、Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤及びＴＧＦβシグナル阻害剤の種類や、培養条件に応じて変動し得るので、一概に特定することは出来ないが、例えば、ヒト多能性幹細胞を用いた場合、７日間～３０日間、好ましくは、１５日間～２０日間（例、１８日間）である。
＜工程（２ｂ）＞
　工程（２ｂ）においては、工程（２ａ）で得られた細胞塊を、更にＴＧＦβシグナル阻害剤及びＷｎｔシグナル伝達阻害剤を実質的に含まない培養液中で浮遊培養することにより、大脳オルガノイドを得る。
　一態様として、工程（２ｂ）における浮遊培養は、高酸素分圧条件下で行われてもよい。高酸素分圧条件とは、空気中の酸素分圧（２０％）を上回る酸素分圧条件を意味する。一態様として、工程（２ｂ）における酸素分圧は、例えば、３０～６０％、好ましくは３５～６０％、より好ましくは３８～６０％である。
　工程（２ｂ）に用いられる培地は、工程（２ａ）に用いられる培地と同様に、動物細胞の培養に用いられる培地であれば特に限定はなく、上述の定義に記載の培地を基礎培地として調製することができる。
　基礎培地としては、例えば、Ｇｌａｓｇｏｗ　ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、　Ｆ－１２培地、及びＤＭＥＭ／Ｆ１２培地などが挙げられる。好ましくは、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地が用いられる。
　工程（２ｂ）に用いられる培地は、好ましくは無血清培地であり、必要に応じ、血清代替物を含有していてもよい。血清代替物は、上述のものを使用できるが、例えば、Ｎ２サプリメント、Ｂ２７サプリメント、Ｎｅｕｒｏｃｕｌｔ　ＳＭ１　Ｎｅｕｒｏｎａｌ　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、ＫＳＲ等が挙げられる。
　血清代替物の濃度は、適宜調整すればよいが、具体的には、例えばＮ２サプリメントであれば、約０．１～３％、好ましくは約１％、Ｂ２７サプリメントであれば、約０．１～１０％、好ましくは２％、ＫＳＲであれば、好ましくは約１～３０％の血清代替物を含む培養液を用いることができる。
　工程（２ｂ）においては、工程（２ａ）に用いられた、Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤及びＴＧＦβシグナル阻害剤は不要である。一態様において、工程（２ｂ）に用いられる培地には、Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤及びＴＧＦβシグナル阻害剤が含まれない。
　一態様において、工程（２ｂ）における培養液は、好ましくは血清を実質的に含まない無血清培養液であり、更に好ましくは血清代替物を含む無血清培養液である。
　工程（２ｂ）に用いられる培地は、大脳皮質細胞への分化誘導を促進するために、血清代替物としてＮ２サプリメントを含有することが好ましい。Ｎ２サプリメントは、インスリン、トランスフェリン、プロゲステロン、プトレスシン及び亜セレン酸ナトリウムを含む、公知の血清代替用組成物であり、Ｇｉｂｃｏ／Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社等から購入可能である。Ｎ２サプリメントの添加量は、前脳組織、又はその前駆組織への分化誘導、又は神経細胞への分化誘導、及び/又は大脳皮質を構成する細胞又はその前駆細胞への分化誘導が促進されるように、適宜設定することができる。
　また、工程（２ｂ）に用いられる培地は、脳室帯の長期間の維持培養のため、化学的に決定された脂質濃縮物（Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ　Ｄｅｆｉｎｅｄ　Ｌｉｐｉｄ　Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ）を含有することが好ましい。Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ　Ｄｅｆｉｎｅｄ　Ｌｉｐｉｄ　Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅは、それぞれ精製された、コレステロール、ＤＬ－α－トコフェロール、アラキドン酸、リノレン酸、リノール酸、ミリスチン酸、オレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、及びステアリン酸を含む脂質混合物である。　Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ　Ｄｅｆｉｎｅｄ　Ｌｉｐｉｄ　Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅは市販のものを使用することができ、例えば、Ｇｉｂｃｏ／Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社等から購入可能である。
　細胞塊の浮遊培養に用いられる培地は、大脳皮質細胞への分化誘導に、悪影響を与えない範囲で、他の添加物を含むことができる。添加物としては、例えば、インスリン、鉄源（例えばトランスフェリン等）、ミネラル（例えばセレン酸ナトリウム等）、糖類（例えばグルコース等）、有機酸（例えばピルビン酸、乳酸等）、血清蛋白質（例えばアルブミン等）、アミノ酸（例えばＬ－グルタミン等）、還元剤（例えば２－メルカプトエタノール等）、ビタミン類（例えばアスコルビン酸、ｄ－ビオチン等）、抗生物質（例えばストレプトマイシン、ペニシリン、ゲンタマイシン等）、緩衝剤（例えばＨＥＰＥＳ等）等が挙げられるが、これらに限定されない。
　一態様において、工程（２ｂ）における培地は、血清を含んでいてもよい。血清は、脳室帯の長期間の維持培養に寄与し得る。血清としては、ＦＢＳ等が挙げられるが、これに限定されない。血清は非動化されていることが好ましい。培地中の血清濃度は、脳室帯の長期間の維持培養に寄与しうる範囲で適宜調整することができるが、通常１～２０％（ｖ／ｖ）である。
　一態様において、工程（２ｂ）における培地は、ヘパリンを含んでいてもよい。ヘパリンは、脳室帯の長期間の維持培養に寄与し得る。培地中のヘパリン濃度は、脳室帯の長期間の維持培養に寄与しうる範囲で適宜調整することができるが、通常０．５～５０μｇ／ｍｌ、好ましくは１～１０μｇ／ｍｌ（例、５μｇ／ｍｌ）である。
　一態様において、工程（２ｂ）における培地は、細胞外マトリクス成分を含んでいてもよい。細胞外マトリクスは、脳室帯の長期間の維持培養に寄与し得る。「細胞外マトリクス成分」とは、細胞外マトリクス中に通常見出される各種成分をいう。本発明の方法では、基底膜成分を用いることが好ましい。基底膜の主成分としては、例えばＩＶ型コラーゲン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、エンタクチンが挙げられる。培地に添加する細胞外マトリクス成分としては市販のものが利用でき、例えば、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ヒト型ラミニン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）などが挙げられる。Ｍａｔｒｉｇｅｌは、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ　Ｈｏｌｍ　Ｓｗａｒｎ（ＥＨＳ）マウス肉腫由来の基底膜調製物である。Ｍａｔｒｉｇｅｌの主成分はＩＶ型コラーゲン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、エンタクチンであるが、これらに加えてＴＧＦβ、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、組織プラスミノゲン活性化因子、ＥＨＳ腫瘍が天然に産生する増殖因子が含まれる。Ｍａｔｒｉｇｅｌのｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　ｒｅｄｕｃｅｄ製品は、通常のＭａｔｒｉｇｅｌよりも増殖因子の濃度が低く、その標準的な濃度はＥＧＦが＜０．５ｎｇ／ｍｌ、ＮＧＦが＜０．２ｎｇ／ｍｌ、ＰＤＧＦが＜５ｐｇ／ｍｌ、ＩＧＦ－１が５ｎｇ／ｍｌ、ＴＧＦβが１．７ｎｇ／ｍｌである。本発明の方法では、ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　ｒｅｄｕｃｅｄ製品の使用が好ましい。
　培地中の細胞外マトリクス成分の濃度は、脳室帯の長期間の維持培養に寄与しうる範囲で適宜調整することができるが、Ｍａｒｔｉｇｅｌを用いる場合には培養液の１／５００～１／２０の容量、さらに好ましくは１／１００の容積で添加することが好ましい。
　一態様において、工程（２ｂ）における培地は、Ｎ２サプリメント及びＣｈｅｍｉｃａｌｌｙ　Ｄｅｆｉｎｅｄ　Ｌｉｐｉｄ　Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅに加えて、血清及びヘパリンを含有する。該態様においては、該培地に細胞外マトリクスを更に含んでいてもよい。本態様の培地は、長期間にわたる終脳若しくはその部分組織、又はその前駆組織の分化誘導を観察するのに適している。
　この場合、工程（２ｂ）の全範囲にわたり、Ｎ２サプリメント、Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ　Ｄｅｆｉｎｅｄ　Ｌｉｐｉｄ　Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ、血清及びヘパリン（任意で更に細胞外マトリクス）を含有する培地を用いてもよいが、一部の期間のみ、当該態様の培地を用いてもよい。一態様において、工程（２ｂ）において、まず、Ｎ２サプリメント及びＣｈｅｍｉｃａｌｌｙ　Ｄｅｆｉｎｅｄ　Ｌｉｐｉｄ　Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅを含み、血清、ヘパリン及び細胞外マトリクスを含有しない培地を用い、途中から（例えば、Ｆｏｘｇ１陽性凝集塊中に、脳室様の空洞を有した神経上皮様構造（多列円柱上皮）、例えば半球状もしくは球状の空洞を複数有する多列円柱上皮が形成された段階以降において）、Ｎ２サプリメント、Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ　Ｄｅｆｉｎｅｄ　Ｌｉｐｉｄ　Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ、血清、ヘパリン（任意で、細胞外マトリクス）を含有する培地へ切り替えてもよい。
　工程（２ｂ）における培養温度、ＣＯ２濃度等の他の培養条件は適宜設定できる。培養温度は、例えば約３０～４０℃、好ましくは約３７℃である。ＣＯ２濃度は、例えば約１～１０％、好ましくは約５％である。
　工程（２ｂ）は、少なくとも、前脳マーカー（例えば、Ｆｏｘｇ１）陽性細胞が生成し、大脳皮質様構造物が形成されるのに十分な期間実施される。当該大脳皮質様構造物は、顕微鏡観察により確認することが可能である。
　工程（２ｂ）の培養期間は、工程（２ａ）のＷｎｔシグナル伝達阻害剤及びＴＧＦβシグナル阻害剤の種類等に応じて変動し得るので、一概に特定することは出来ないが、例えば、ヒト多能性幹細胞を用いた場合、少なくとも１０日間、又は１０～４０日間、好ましくは１０～３１日間、更に好ましくは１５～２４日間である。
　本明細書において、工程（２ｂ）培養工程を長期間（例、２０日以上、好ましくは５０日以上、より好ましくは７０日以上）に亘り実施することにより、細胞塊内において、安定的な大脳皮質様構造物の自己組織化を誘発することが可能であり、工程（２ｂ）を継続して実施すると、時間の経過とともに、細胞凝集塊内に含まれる大脳組織の分化段階が進んでゆく。そのため、所望の分化段階、すなわち複数の大脳皮質様構造物を含む大脳オルガノイドの形成に到達するまで、工程（２ｂ）を継続して実施するのが好ましい。
　工程（２ｂ）において、細胞塊の浮遊培養に用いる培養器としては、特に限定されないが、例えば、フラスコ、組織培養用フラスコ、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マイクロポア、マルチプレート、マルチウェルプレート、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、バイオリアクター、ローラーボトルが挙げられる。非接着性の条件下での培養を可能とするため、培養器は、細胞非接着性であることが好ましい。細胞非接着性の培養器としては、培養器の表面が、細胞非接着性となるように人工的に処理されているものや、細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理（例えば、細胞外マトリクス等によるコーティング処理）されていないもの等を使用することができる。
　一態様として、工程（２ｂ）において細胞塊の浮遊培養に用いる培養器として、酸素透過性のものを用いてもよい。酸素透過性の培養器を用いることにより、細胞塊への酸素の供給が向上する。工程（２ｂ）においては、細胞凝集塊が大きく成長し、細胞塊の中の細胞にまで、十分な酸素が供給されなくなるリスクを避けるために、酸素透過性の培養器を利用してもよい。
　工程（２ｂ）の浮遊培養に際しては、細胞塊の培養器に対する非接着状態を維持できる限り、細胞塊を静置培養してもよいし、旋回培養や振とう培養により凝集塊を意識的に動かしてもよい。工程（２ｂ）の全期間を通じて静置培養を実施してもよいし、一部の期間のみ静置培養を実施してもよい。
　一態様として、工程（２ｂ）の浮遊培養は、静置培養である。この時、上述の高酸素分圧条件下で培養することが好ましい。
　一態様として、工程（２ｂ）の浮遊培養は、振とう培養である。この時、高酸素分圧条件下での培養は不要である。
　工程（２ｂ）により、細胞塊中に、前脳マーカー陽性の大脳皮質様構造物が形成される。一態様において、大脳皮質様構造物を含む細胞塊に含まれる細胞の７０％以上が前脳マーカー陽性（例、Ｆｏｘｇ１陽性）である。
　一態様において、工程（２ｂ）により、細胞塊中に形成された、大脳皮質様構造物は、神経上皮の外側に神経細胞層を備えたロゼット様構造物である。一態様において、該大脳皮質様構造物は、内腔側に神経幹細胞マーカー陽性、具体的にはＰＡＸ６及び／又はＳＯＸ２陽性の細胞層を有し、最も内腔の部分にリン酸化Ｈｉｓｔｏｎｅ　Ｈ３陽性の有糸分裂細胞を含む。一態様において、神経上皮様の細胞層の外側には、有糸分裂後の神経細胞のマーカーであるβＩＩＩ－Ｔｕｂｕｌｉｎ（βＴｕｂＩＩＩ、ＴＵＢＢ３又はＴＵＪ１）を発現し、大脳皮質の初期皮質板マーカーであるＣｔｉｐ２、又はＴｂｒ１を発現する細胞が含まれる。これらは、大脳皮質の第１層の神経細胞であるＲｅｅｌｉｎ陽性カハールレチウス細胞を含み、表層近くにはＬａｍｉｎｉｎを多く含んだ層を有し得る。つまり、好ましい態様において、本発明の製造方法により得られる凝集塊には、大脳皮質前駆組織が含まれる。
＜工程（３）＞
　本発明の大脳オルガノイドの製造方法は、さらに大脳オルガノイドを選別する工程である工程（３）を含んでよい。工程（３）は、工程（２）で得られた複数の細胞塊から、細胞塊の形状、内部構造、サイズ、表面の色彩若しくは模様、及び遺伝子発現からなる群から選ばれる１以上を指標として、所望の大脳オルガノイドを選別する工程である。これらの指標のうち、２以上、３以上又は４以上を採用することが好ましく、また、指標として、細胞塊の形状、内部構造、表面の色彩若しくは模様、及び／又は遺伝子発現であることが好ましく、細胞塊の形状、内部構造、及び／又は遺伝子発現であることがより好ましく、細胞塊の形状であることが特に好ましい。例えば、細胞塊の形状が球状（スフェア状）である場合、所望の大脳オルガノイドとして選別することができる。
　大脳オルガノイドを選別するための各指標は、一般的な大脳オルガノイドの定義に従うものであることが好ましく、例えば、以下の（１）～（５）の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ又は４つを満たす細胞塊を大脳オルガノイドと判定してもよい。
（１）球状の細胞塊であること、
（２）細胞塊の内部に、大脳皮質様構造物を有すること、
（３）細胞塊の表面に色素沈着を有しないこと、
（４）細胞塊の一部に嚢胞状形状、突起形状、バルーン状形状を有しないこと、並びに、
（５）細胞塊が、ＮＥＵＲＯＤ６、ＮＥＵＲＯＤ２、ＳＳＴＲ２、ＴＢＲ１、ＺＢＴＢ１８、ＮＨＬＨ１、ＩＧＦＢＰＬ１、ＮＲＮ１、ＲＴＮ１、ＴＨＳＤ７Ａ、ＮＲＸＮ１、ＢＨＬＨＥ２２、ＣＡＬＢ２、ＫＨＤＲＢＳ３、ＣＣＳＡＰ、ＰＤＥ１Ａ、ＮＥＵＲＯＤ１、ＮＰＴＸ１、ＮＸＰＨ４、ＮＴＳ、ＮＥＵＲＯＧ２、ＯＬＦＭ１、ＰＲＤＭ８、ＣＯＲＯ２Ｂ、ＴＰ５３Ｉ１１、ＺＦＰＭ２、ＰＣＤＨ９、ＮＥＬＬ２、ＳＲＲＭ４、ＳＣＧ３、ＤＣＣ、ＥＰＢ４１Ｌ３、ＳＬＣ１７Ａ７、ＳＴ１８、ＮＳＧ２、ＥＭＸ１、ＣＡＰ２、ＳＹＴ４、ＮＳＭＦ、ＡＮＫ３、ＭＹＴ１Ｌ、ＦＳＴＬ５、ＣＥＬＦ４、Ｂ３ＧＡＴ１、ＥＰＨＡ５、ＮＨＬＨ２、及びＤＬＬ３からなる群から選ばれる少なくとも少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、又は少なくとも５つの遺伝子を発現していること。
　上記（５）について、大脳オルガノイドが、ＳＬＣ１７Ａ７、ＮＥＵＲＯＤ６、及びＥＭＸ１からなる群から選ばれる１以上の遺伝子、好ましくは全ての遺伝子を発現していることが好ましい。
　さらに、後述する表６に記載の目的外細胞に発現する遺伝子の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ以上、又は少なくとも５つ以上を実質的に発現していないことが好ましい。さらに、ＧＡＤ２、ＣＯＬ１Ａ１、ＴＹＲ、ＴＴＲ及びＨＯＸＡ２からなる群から選ばれる１以上の遺伝子を実質的に発現していないことが好ましく、これらのマーカーのうち、２以上、３以上、４以上又は全部を発現しないことがより好ましい。
　本明細書において、遺伝子が「実質的に発現していない」とは、遺伝子の発現産物であるタンパク質が、生理機能を発揮する程度の発現量に満たないことを意味する。
　本明細書において、「実質的に発現していない」状態として、具体的には、細胞に恒常的に発現している任意のコントロール遺伝子（例えば、恒常的に発現している遺伝子としてＧＡＰＤＨ、ＡＣＴＢ、Ｂ２Ｍ、１８ＳリボソームＲＮＡなどが挙げられる。）の発現量を基準として、コントロール遺伝子の発現量の１／１０以下である状態が挙げられる。
　上記（１）における球状及び上記（２）における大脳皮質様構造物は上記のとおりである。ここにおいて、球状ではあるが大脳皮質様構造物を持たない細胞塊の代表例は、図３１において、「Ｐｏｔａｔｏ－ｌｉｋｅ」、又は「Ｊｅｌｌｙ－ｌｉｋｅ」と称される細胞塊と称される細胞塊である。
　上記（３）における色素沈着とは、細胞塊のうち一部に黒色又は茶色の領域を有することを意味する。ここにおいて、色素沈着を有する細胞塊の代表例は、図２８において「Ｐｉｇｍｅｎｔ」と称される細胞塊である。
　上記（４）における細胞塊の一部に嚢胞状形状、突起形状、又はバルーン状形状を有しないこととは、それぞれ細胞塊の中に、透明度が高い袋状の構造、繊維状の上皮構造、又は突起状の構造が存在しないことを意味する。
　ここにおいて、嚢胞状形状の代表例は、図３１において、「Ｔｒａｎｓｐａｒｅｎｔ」と称される形状である。ここにおいて、突起形状の代表例は、図３１において「Ｃｏｔｔｏｎ－ｌｉｋｅ」と称される形状である。ここにおいて、バルーン状形状の代表例は、図３１において「Ｂａｌｌｏｏｎ」と称される形状である。上記（１）～（４）の特徴は、細胞塊を場合により拡大した上で、目視により判別し、除くことができる。または、顕微鏡の拡大画像を元に、画像解析が可能なソフトウエアを用いて装置により形状を判別してもよい。この場合、深層学習等の方法を用いて形状の判別の精度を向上させてもよい。
　また、大脳オルガノイドは直径（円相当径）が約１００μｍ～１００００μｍ、好ましくは約５００μｍ～５０００μｍの球状様の細胞塊であってよい。細胞塊の内部に含まれる大脳皮質様構造物は直径（円相当径）が約１０μｍ～１０００μｍ、好ましくは約５０μｍ～５００μｍのであってよい。
　遺伝子（マーカー）の発現はその発現量によって判定することができる。遺伝子の発現量は、当該遺伝子の発現産物（ｍＲＮＡ又はタンパク質若しくはその断片）の量、好ましくはｍＲＮＡの発現量で評価することができる。具体的には、定量的ＲＴ－ＰＣＲ法、ＲＴ－ＰＣＲ法、次世代シーケンス解析、マイクロアレイ解析、ウエスタンブロッティング法、ＥＬＩＳＡ法、免疫染色法、フローサイトメトリーなどによって判定することができる。
　判定は、細胞塊毎に行ってもよく、同一ロットの場合は、一定数の細胞塊（例えば、１個以上、３個以上、５個以上）をサンプリングして判定してもよい。細胞塊の形状、内部構造、サイズ、及び表面の色彩若しくは模様の場合は、倒立顕微鏡観察において目視で確認することによって判定でき、細胞塊毎で判定することが好ましい。遺伝子発現に関しては細胞塊毎ではなく、サンプリングすることによって判定することが好ましい。具体的には、例えば、形状及び／又は内部構造で選別した細胞塊について、定量的ＲＴ－ＰＣＲ法、ＲＴ－ＰＣＲ法、次世代シーケンス解析、マイクロアレイ解析、ウエスタンブロッティング法、ＥＬＩＳＡ法、免疫染色法、フローサイトメトリーなどで判定することが挙げられる。
　工程（３）において、上記判定方法によって大脳オルガノイドと判定された細胞塊を回収して、大脳オルガノイドとして選別する。工程（３）で選別された大脳オルガノイドは、選別しない場合に比べて、大脳オルガノイドが濃縮される
。すなわち、工程（３）を経ることにより、細胞塊の集団における大脳オルガノイドの割合を更に向上させることができる。
３．大脳オルガノイド
　本発明の細胞培養物は、上述の工程（１）及び工程（２）を含む大脳オルガノイドの製造方法を用いて製造される細胞培養物であって、複数の球状の細胞凝集体を含み、該複数の球状の細胞凝集体に占める大脳オルガノイドの割合が４０％以上、好ましくは５０％以上、更に好ましくは６０％以上である細胞培養物である。ここで当該割合は、細胞培養物をサンプリングして、該サンプルにおける、球状の細胞凝集体の全数に占める大脳オルガノイドの数で算出することができる。
　大脳オルガノイドは神経上皮の外側に神経細胞層を備えた大脳皮質様構造物を１以上、好ましくは複数内包する、球状の細胞塊を意味する。大脳オルガノイドの判定方法は、上記工程（３）の方法に準ずる。
　個々の大脳オルガノイドに占める大脳皮質様構造物の割合は、２０%以上、好ましくは４０％以上、更に好ましくは５０％以上であってもよい。ここで、大脳オルガノイドに占める大脳皮質様構造物の割合は、大脳オルガノイド全体の面積又は体積に占める大脳皮質様構造物の割合であり、評価しやすい観点から、面積の割合であることが好ましい。また、当該割合は、複数（例えば２～２０個、好ましくは５個又は１０個）の大脳オルガノイドの平均値であってよい。当該割合は、例えば、大脳オルガノイドの中心部を含む切片の断面積に占める大脳皮質様構造物の割合で評価してもよい。ここで、中心部とは、大脳オルガノイドの最大径を有する断面の中心箇所を意味する。上記評価は、例えば大脳オルガノイド切片に対して免疫染色を行い、神経幹細胞マーカー及び／又は神経前駆細胞マーカー、並びに神経細胞マーカーが陽性である細胞は、大脳皮質様構造物と判定し、大脳皮質様構造物の面積が、当該切片の面積に占める割合を算出することによって行ってもよい。又は、当該大脳オルガノイドの体積に占める、当該大脳皮質様構造物の体積の割合として算出してもよい。
　ここで上記神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞マーカーとしては、Ｐａｘ６が挙げられ、上記神経細胞マーカーとしては、前脳マーカーであるＦｏｘｇ１、大脳皮質マーカーであるＣｔｉｐ２等が挙げられる。
　また、当該大脳オルガノイドの好ましい態様において、全細胞数の２０%以上、好ましくは４０％以上、好ましくは７０％以上がＦｏｘｇ１陽性細胞である。
　一態様において、大脳皮質様構造物は、内腔側に神経幹細胞マーカー：ＰＡＸ６及び／又はＳＯＸ２陽性の細胞層を有し、最も内腔の部分にリン酸化Ｈｉｓｔｏｎｅ　Ｈ３陽性の有糸分裂細胞を含む。
　一態様において、大脳皮質様構造物の神経上皮様細胞層の外側には、有糸分裂後の神経細胞のマーカーであるβＩＩＩ－Ｔｕｂｕｌｉｎ（βＴｕｂＩＩＩ、ＴＵＢＢ３又はＴＵＪ１）を発現し、大脳皮質の初期皮質板マーカーであるＣｔｉｐ２、及び／又はＴｂｒ１を発現する細胞が含まれる。これらは、大脳皮質の第１層の神経細胞であるＲｅｅｌｉｎ陽性カハールレチウス細胞を含み、表層近くにはＬａｍｉｎｉｎを多く含んだ層を有し得る。
　一態様において、大脳オルガノイドは、上記工程（１）及び工程（２）を含む大脳オルガノイドの製造方法を用いて製造される大脳オルガノイドであってよい。一態様の大脳オルガノイドは、上記工程（３）によって選別された大脳オルガノイドであってよく、また、下記（１）～（５）の特徴を有する細胞塊であってよい。
（１）球状の細胞塊であること、
（２）細胞塊の内部に、大脳皮質様構造物を有すること、
（３）表面に色素沈着を有しないこと、
（４）細胞塊の一部に嚢胞状形状、突起形状、バルーン状形状を有しないこと、並びに、
（５）ＮＥＵＲＯＤ６、ＮＥＵＲＯＤ２、ＳＳＴＲ２、ＴＢＲ１、ＺＢＴＢ１８、ＮＨＬＨ１、ＩＧＦＢＰＬ１、ＮＲＮ１、ＲＴＮ１、ＴＨＳＤ７Ａ、ＮＲＸＮ１、ＢＨＬＨＥ２２、ＣＡＬＢ２、ＫＨＤＲＢＳ３、ＣＣＳＡＰ、ＰＤＥ１Ａ、ＮＥＵＲＯＤ１、ＮＰＴＸ１、ＮＸＰＨ４、ＮＴＳ、ＮＥＵＲＯＧ２、ＯＬＦＭ１、ＰＲＤＭ８、ＣＯＲＯ２Ｂ、ＴＰ５３Ｉ１１、ＺＦＰＭ２、ＰＣＤＨ９、ＮＥＬＬ２、ＳＲＲＭ４、ＳＣＧ３、ＤＣＣ、ＥＰＢ４１Ｌ３、ＳＬＣ１７Ａ７、ＳＴ１８、ＮＳＧ２、ＥＭＸ１、ＣＡＰ２、ＳＹＴ４、ＮＳＭＦ、ＡＮＫ３、ＭＹＴ１Ｌ、ＦＳＴＬ５、ＣＥＬＦ４、Ｂ３ＧＡＴ１、ＥＰＨＡ５、ＮＨＬＨ２、及びＤＬＬ３からなる群から選ばれる少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、又は少なくとも５つの遺伝子を発現していること。
　上記（５）について、大脳オルガノイドが、ＳＬＣ１７Ａ７、ＮＥＵＲＯＤ６、及びＥＭＸ１からなる群から選ばれる１以上、２以上又は全部を発現していることが好ましい。さらに、ＧＡＤ２、ＣＯＬ１Ａ１、ＴＹＲ、ＴＴＲ及びＨＯＸＡ２からなる群から選ばれる１以上の遺伝子を実質的に発現していないことが好ましく、これらのマーカーのうち、２以上、３以上、４以上又は全部を発現しないことがより好ましい。
　一態様において、大脳オルガノイドは上記のとおりであり、また、細胞塊１つ当たりの細胞数は、約５×１０３～５×１０6個、好ましくは約１×１０４～３×１０６個であってよい。
４．大脳皮質細胞塊の製造方法１
　本発明の一態様として、下記の工程（ｉ）及び工程（ｉｉ）を含む、支持細胞の非存在下で、多能性幹細胞から大脳皮質細胞塊を製造する方法が挙げられる。
（ｉ）多能性幹細胞から大脳オルガノイドを得る工程、
（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた大脳オルガノイドを、Ｎｏｔｃｈシグナル阻害剤、好ましくはγ－セクレターゼ阻害剤を含む培養液中で培養して、大脳皮質細胞塊を得る工程。
　上記工程（ｉ）において、多能性幹細胞から大脳オルガノイドを得る方法は限定されず、当業者に周知の方法で調製することができる。このような周知の方法としては、例えば上記２の大脳オルガノイドの製造方法における工程（２）が挙げられる。
　本発明の一態様として、工程（ｉ）において、上記２に記載の大脳オルガノイドの製造方法により多能性幹細胞から大脳オルガノイドを得ることを含む「大脳皮質細胞塊の製造方法１」が挙げられる。すなわち、大脳皮質細胞塊の製造方法１は、上記２に記載の大脳オルガノイドの製造方法で得られる大脳オルガノイドを以下の工程（ｉ）及び工程（ｉｉ）で処理することを含む、支持細胞の非存在下で、多能性幹細胞から大脳皮質細胞塊の製造方法である。
（ｉ）上記２に記載の大脳オルガノイドの製造方法（即ち、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法を含む）により、大脳オルガノイドを得る工程、
（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた大脳オルガノイドを、Ｎｏｔｃｈシグナル阻害剤、好ましくはγ－セクレターゼ阻害剤を含む培養液中で培養して、大脳皮質細胞塊を得る工程。
＜工程（ｉ）＞
　工程（ｉ）は上記２における工程（１）、工程（２ａ）及び工程（２ｂ）に記載のとおりである。また、工程（ｉ）は上記２における工程（３）をさらに含んでもよい。
　一態様として、工程（２ｂ）は、約７～３１日間、好ましくは約７～２１日間行われる。
＜工程（ｉｉ）＞
　上述の工程（２ｂ）を行った後、場合により工程（３）による選別を行い、Ｎｏｔｃｈ阻害剤、好ましくはγ－セクレターゼ阻害剤を含む培地に培地交換を行うことにより、工程（ｉｉ）を行うことができる。あるいは、上述の工程（２ｂ）を行った後工程（ｉｉ）を実施し、次いで工程（３）の選別を行ってもよい。
　工程（ｉｉ）において、Ｎｏｔｃｈシグナル阻害剤としては、定義に記載のものを適宜選択して使用することができる。工程（ｉｉ）において用いられるＮｏｔｃｈシグナル阻害剤として、好ましくはγ－セクレターゼ阻害剤が挙げられる。γ－セクレターゼ阻害剤としては、定義に記載のものを適宜選択して使用することができる。好ましいγ－セクレターゼ阻害剤としては、N-[N-(3,5-difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester （DAPT）又はCompound Eが挙げられる。
　工程（ｉｉ）において、用いられる培養液は、Ｎｏｔｃｈシグナル阻害剤が含まれる以外は、工程（ｉ）、すなわち２の製造方法の工程（２ｂ）で使用した培養液と同じものを使用することができる。又は、工程（２ｂ）で使用した培養液とは異なるものを、上記２の製造方法の工程（２ｂ）に記載されている培養条件から適宜選択してもよい。
　また、工程（ｉｉ）の培養条件は、適宜工程（２ｂ）に準じればよい。
　培養液中のＮｏｔｃｈシグナル阻害剤、好ましくはγ－セクレターゼ阻害剤の濃度は、細胞塊に含まれ得る神経幹細胞等の増殖性の細胞を抑制可能な範囲で、適宜設定することができる。具体的には、γ－セクレターゼ阻害剤としてＤＡＰＴを用いる場合における、０．１～１０００μＭ、１～１００μＭ、好ましくは１～３０μＭ、更に好ましくは５～２０μＭに相当するγ－セクレターゼ活性又は当該γ－セクレターゼ活性に基づくＮｏｔｃｈシグナル阻害活性を呈する濃度が挙げられる。
　工程（ｉｉ）は、工程（ｉ）の浮遊培養開始時点（神経細胞への分化誘導開始）から、約２８日後～４９日後、好ましくは約２８日後～４４日後に行われる。
　工程（ｉｉ）の培養期間は、１～７日間、好ましくは２～６日間、より好ましくは２～４日間である。
５．大脳皮質細胞塊の製造方法２
　本発明の一態様として、支持細胞の非存在下で、多能性幹細胞から大脳皮質細胞塊を製造する方法が挙げられ、当該方法が、
（ｉ）多能性幹細胞から大脳オルガノイドを得る工程と、
（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた大脳オルガノイドを、培養液中で培養する工程と、
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で得られた細胞培養物を、単細胞又は２～５個の細胞の集合体（Cell clump）にまで分散させる工程と、
（ｉｖ）工程（ｉｉ）で得られた細胞培養物又は工程（ｉｉｉ）で得られた細胞集団を、１以上の神経栄養因子、アスコルビン酸、及びｃＡＭＰ活性化剤を含む培養液中で培養する工程と
を含み、上記工程（ｉｉｉ）の単細胞又は２～５個の細胞の集合体（Cell clump）への分散工程は任意の工程であり、上記工程（ｉｉ）の培養液及び／又は上記工程（ｉｖ）の培養液は、Ｎｏｔｃｈシグナル阻害剤を含む。
　上記工程（ｉ）において、多能性幹細胞から大脳オルガノイドを得る方法は限定されず、当業者に周知の方法で調製することができる。好ましくは、工程（ｉ）において、上記２に記載の大脳オルガノイドの製造方法、特に工程（１）、工程（２ａ）及び工程（２ｂ）を含む製造方法により多能性幹細胞から大脳オルガノイドを得る。
　上記工程（ｉｉ）の培養液及び／又は上記工程（ｉｖ）の培養液は、当該工程の一部又は全ての期間においてＮｏｔｃｈシグナル阻害剤を含む態様でもよい。Ｎｏｔｃｈシグナル阻害剤の処理期間が一部の期間の場合は、上記工程（ｉｉ）の培養液又は上記工程（ｉｖ）の培養液の交換時にＮｏｔｃｈシグナル阻害剤を含まない培養液を用いる。一部の期間は、Ｎｏｔｃｈシグナル阻害剤による処理の効果が得られる限り、特に限定されず、上記工程（ｉｉ）又は上記工程（ｉｖ）の培養期間のうちの数時間～数日、具体的には１～７日間、好ましくは２～６日間、より好ましくは２～４日間でもよい。また、極めて短い処理期間（例えば、４時間、１２時間、２４時間、２日間）の繰り返しでもよい。また、Ｎｏｔｃｈシグナル阻害剤を含む期間と、Ｎｏｔｃｈシグナル阻害剤を含まない期間を交互に行ったり、濃度を変えたＮｏｔｃｈシグナル阻害剤を用いた組み合わせも本願の範疇である。ここで用いられるＮｏｔｃｈシグナル阻害剤、及びその濃度は、大脳皮質凝集塊の製造方法１における工程（ｉｉ）の記載を参照すればよい。
　本発明の一態様として、工程（ｉ）は上記２に記載の大脳オルガノイドの製造方法に従って行い、且つ、工程（ｉｉｉ）を含む、「大脳皮質細胞塊の製造方法２－１」が挙げられる。すなわち、大脳皮質細胞塊の製造方法２－１は、上記４に記載の大脳皮質細胞塊の製造方法１における工程（ｉ）及び工程（ｉｉ）に加えて、以下の工程（ｉｉｉ）及び工程（ｉｖ－１）で処理することを含む、高純度大脳皮質細胞塊の製造方法である。これは、分散再凝集された高純度大脳皮質細胞塊である。ここで、工程（ｉｉ）において、工程（ｉ）で得られた大脳オルガノイドを、Ｎｏｔｃｈシグナル阻害剤、好ましくはγ－セクレターゼ阻害剤を含む培養液中で培養する。当該工程（ｉｉ）は、上記４の大脳皮質細胞塊の製造方法１における工程（ｉｉ）と同様に行えばよい。
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で得られた大脳オルガノイドを、単細胞又は２～５個の細胞の集合体（Ｃｅｌｌ　ｃｌｕｍｐ）にまで分散する工程、
（ｉｖ－１）工程（ｉｉｉ）で得られた細胞集団を、１以上の神経栄養因子、アスコルビン酸及びｃＡＭＰ活性化剤（例えば、dibutyryl cAMP（dbcAMP））を含む無血清培養液中で培養して、（例えば２０細胞以上の細胞からなる）細胞塊を得る工程。
＜工程（ｉｉｉ）＞
　工程（ｉｉ）で得られた大脳オルガノイドは、当業者に周知の方法、例えばピペッティング等により物理的に、又は酵素処理により、単細胞又は２～５個の細胞の集合体（Cell clump）にまで分散させることができる。ここで、分散して得られた細胞集団は、単細胞及び／又は２～５個の細胞の集合体（Cell Clump）の集団であり得る。すなわち、工程（ｉｉｉ）において、当業者に周知の方法によって、工程（ｉｉ）で得られた大脳オルガノイドを単細胞、又は２～５個の細胞の集合体（Cell Clump）にまで分散してよい。
＜工程（ｉｖ－１）＞
　工程（ｉｉｉ）で得られる細胞集団を浮遊培養することにより再凝集させ、高純度の、大脳皮質細胞を含む細胞塊（高純度大脳皮質細胞塊）を得ることができる。
　工程（ｉｖ－１）で使用する培養液は、１以上の神経栄養因子、アスコルビン酸若しくはその誘導体、及びｃＡＭＰ活性化剤を含む培養液である。
　神経栄養因子としては上記定義に記載のものから適宜１～４、１～３、好ましくは１若しくは２因子を選択すればよい。神経栄養因子として、好ましくはＢＤＮＦ及び／又はＧＤＮＦを挙げることができる。ＢＤＮＦの濃度としては、１～１００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは１０～３０ｎｇ／ｍＬが挙げられる。ＧＤＮＦの濃度としては、１～１００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは５～２０ｎｇ／ｍＬが挙げられる。
　アスコルビン酸若しくはその誘導体（例えばアスコルビン酸－２－リン酸）の濃度としては、アスコルビン酸の場合、１０～５００μＭ、好ましくは５０～３００μＭに相当する濃度が挙げられ、誘導体においても同様な濃度が挙げられる。
　ｃＡＭＰ活性化剤の濃度としては、例えばｄｂｃＡＭＰを用いた場合における、１０～１０００μＭ、好ましくは１００～６００μＭ、更に好ましくは３００～５００μＭに相当するｃＡＭＰ活性化が可能な濃度が挙げられる。
　工程（ｉｖ－１）の培養期間は、１～２１日間、好ましくは２～１５日間、２～１０日間、２～８日間、２～６日間、更に好ましくは約４日間である。または、工程（ｉｖ－１）の培養期間は、１～４０日間、好ましくは２～２８日間、更に好ましくは２～１４日間である。
　工程（ｉｖ－１）における浮遊培養は、上記２の工程（２ｂ）に記載の方法を参照して行うことができる。例えば、上記２の工程（２ｂ）と同じ培地に、１以上の神経栄養因子、アスコルビン酸若しくはその誘導体、及びｃＡＭＰ活性化剤を添加した培地を調製して用いることができる。
　工程（ｉｖ－１）で使用する培養液は、場合により、ＲＯＣＫ阻害剤を含んでいてもよい。ＲＯＣＫ阻害剤は、上述の定義に記載のものを適宜使用することができ、好ましくは、Ｙ－２７６３２等を挙げることができる。
　ここで用いられるＲＯＣＫ阻害剤の濃度は、例えば、ＲＯＣＫ阻害剤としてＹ－２７６３２を用いた場合における、約０．１～２００μＭ、好ましくは約２～１００μＭ、更に好ましくは約３０～１００μＭに相当する濃度が挙げられる。ここで工程（ｉｉｉ）を経て得られる大脳皮質細胞塊は、分散－再凝集の工程を経ることにより、高純度大脳皮質細胞凝集塊である。
６．大脳皮質細胞塊の製造方法２－２
　本発明の一態様として、上記５に記載の大脳皮質細胞塊の製造方法２－１において、工程（ｉｉｉ）を含まない態様が挙げられる。すなわち、上記４に記載の大脳皮質細胞塊の製造方法１において、工程（ｉ）及び工程（ｉｉ）に加えて、以下の工程（ｉｖ－２）で処理することを含む、大脳皮質細胞塊の製造方法が挙げられる。ここで、工程（ｉｉ）において、工程（ｉ）で得られた大脳オルガノイドを、Ｎｏｔｃｈシグナル阻害剤、好ましくはγ－セクレターゼ阻害剤を含む培養液中で培養する。
（ｉｖ－２）工程（ｉｉ）で得られた大脳オルガノイドを含む細胞培養物を、１以上の神経栄養因子、アスコルビン酸若しくはその誘導体（例えば、アスコルビン酸－２－リン酸）、及びｃＡＭＰ活性化剤（例えば、ｄｉｂｕｔｙｒｙｌ　ｃＡＭＰ（ｄｂｃＡＭＰ））を含む培養液中で浮遊培養して、大脳皮質細胞塊を得る工程。
＜工程（ｉｖ－２）＞
　工程（ｉｉ）で得られる大脳オルガノイドを含む細胞培養物を浮遊培養することにより、大脳皮質細胞を含む細胞塊（大脳皮質細胞塊）を得ることができる。
　工程（ｉｖ－２）で使用する培養液は、上記５の工程（ｉｖ－１）に記載された培養液が挙げられ、浮遊培養の条件、培養期間についても、上記５の工程（ｉｖ－１）に記載されたものが挙げられる。
７．大脳皮質細胞塊の製造方法３－１～３－７
　本発明の一態様として、工程（ｉｉ）の培養液が、Ｎｏｔｃｈシグナル阻害剤を含む、「大脳皮質細胞塊の製造方法３－１」が挙げられる。すなわち、大脳皮質細胞塊の製造方法３－１としては、以下の工程（Ｉ）を含む、大脳皮質細胞塊の製造方法が挙げられる。
（Ｉ）多能性幹細胞由来の大脳オルガノイドを、Ｎｏｔｃｈ阻害剤、好ましくはγ－セクレターゼ阻害剤を含む培養液中で培養する工程。
　ここで、工程（Ｉ）は大脳皮質細胞塊の製造方法１における工程（ｉｉ）と同様に行えばよい。
　本発明の一態様として、上記工程（Ｉ）に加えて、以下の工程で処理することを含む、「大脳皮質細胞塊の製造方法３－２」が挙げられる。
（ＩＩ）工程（Ｉ）で得られた大脳オルガノイドを含む細胞培養物を、単細胞又は２～５個の細胞の集合体（Cell clump）にまで分散する工程、及び
（ＩＩＩ）工程（ＩＩ）で得られた細胞集団を、１以上の神経栄養因子、アスコルビン酸若しくはその誘導体、及びｃＡＭＰ活性化剤を含む培養液中で培養して、大脳皮質細胞塊を得る工程。
　ここで、工程（Ｉ）は大脳皮質細胞塊の製造方法１における工程（ｉｉ）と同様に行えばよく、工程（ＩＩ）及び工程（ＩＩＩ）は、大脳皮質細胞塊の製造方法２における工程（ｉｉｉ）及び工程（ｉｖ－１）と同様に行えばよい。また、工程（ＩＩＩ）を経て得られる大脳皮質細胞塊は、分散－再凝集の工程を経ており、高純度大脳皮質細胞凝集塊である。
　本発明の一態様として、上記工程（ＩＩ）を含まない態様が挙げられる。すなわち、工程（Ｉ）に加えて、以下の工程で処理することを含む、「大脳皮質細胞塊の製造方法３－３」が挙げられる。
（ＩＩＩ－２）工程（Ｉ）で得られた大脳オルガノイドを含む細胞培養物を、１以上の神経栄養因子、アスコルビン酸若しくはその誘導体（例えば、アスコルビン酸－２－リン酸）、及びｃＡＭＰ活性化剤（例えば、ｄｉｂｕｔｙｒｙｌ　ｃＡＭＰ（ｄｂｃＡＭＰ））を含む培養液中で浮遊培養して、大脳皮質細胞塊を得る工程。
　ここで、工程（Ｉ）は大脳皮質細胞塊の製造方法１における工程（ｉｉ）と同様に行えばよく、工程（ＩＩＩ－２）は大脳皮質細胞塊の製造方法２における工程（ｉｖ－１）と同様に行えばよい。
　本発明の一態様として、以下の工程（Ｉ－２）、工程（ＩＩ）及び工程（ＩＩＩ－３）を含む、「大脳皮質細胞塊の製造方法３－４」が挙げられる。
（Ｉ－２）多能性幹細胞由来の大脳オルガノイドを培養液中で培養する工程、
（ＩＩ）工程（Ｉ―２）で得られた大脳オルガノイドを含む細胞培養物を、単細胞又は２～５個の細胞の集合体（Ｃｅｌｌ　ｃｌｕｍｐ）にまで分散する工程、及び
（ＩＩＩ－３）工程（ＩＩ）で得られた細胞集団を、１以上の神経栄養因子、アスコルビン酸若しくはその誘導体、及びｃＡＭＰ活性化剤を含む培養液中で培養して、大脳皮質細胞塊を得る工程を含み、ここで、工程（Ｉ－２）の培養液はＮｏｔｃｈシグナル阻害剤を含まず、上記工程（ＩＩＩ－３）の培養液はＮｏｔｃｈシグナル阻害剤を含む。ここで、工程（Ｉ－２）は上記２に記載の大脳オルガノイドの製造方法における工程（２ｂ）と同様に行えばよい。工程（Ｉ－２）は多能性幹細胞由来の大脳オルガノイドを製造する工程の一部に相当する培養であってもよく、培養期間に特に限定はない。工程（ＩＩ）は上記５に記載の大脳皮質細胞塊の製造方法２－１における工程（ｉｉｉ）と同様に行えばよい。
　工程（ＩＩＩ－３）の培養液は、当該工程の一部又は全ての期間においてＮｏｔｃｈシグナル阻害剤を含む態様でもよい。Ｎｏｔｃｈシグナル阻害剤の処理期間が一部の期間の場合は、上記工程（ＩＩＩ－３）の培養液の交換時にＮｏｔｃｈシグナル阻害剤を含まない培養液を用いる。一部の期間は、Ｎｏｔｃｈシグナル阻害剤による処理の効果が得られる限り、特に限定されず、上記工程（ＩＩＩ－３）のの培養期間のうちの数時間～数日、具体的には１～７日間、好ましくは２～６日間、より好ましくは２～４日間でもよい。また、極めて短い処理期間（例えば、４時間、１２時間、２４時間、２日間）の繰り返しでもよい。また、Ｎｏｔｃｈシグナル阻害剤を含む期間と、Ｎｏｔｃｈシグナル阻害剤を含まない期間を交互に行ったり、濃度を変えたＮｏｔｃｈシグナル阻害剤を用いた組み合わせも本願の範疇である。下記工程（ＩＩＩ－４）及び工程（ＩＩＩ－５）の培養液も工程（ＩＩＩ－３）の培養液と同様に当該工程の一部又は全ての期間においてＮｏｔｃｈシグナル阻害剤を含む態様でもよい。
＜工程（ＩＩＩ－３）＞
　工程（ＩＩ）で得られる細胞集団を浮遊培養することにより再凝集させ、高純度の大脳皮質細胞を含む細胞塊（高純度大脳皮質細胞塊）を得ることができる。
　工程（ＩＩＩ－３）で使用する培養液としては、上記５に記載の大脳皮質細胞塊の製造方法２の工程（ｉｖ－１）に記載された培養液が挙げられ、浮遊培養の条件、培養期間についても、上記５の工程（ｉｖ－１）に記載されたものが挙げられる。
　工程（ＩＩＩ－３）において、当該浮遊培養の期間中の一部又は全部の期間において、培養液はＮｏｔｃｈシグナル阻害剤、好ましくはγ―セクレターゼ阻害剤を含む。
　ここで用いられるＮｏｔｃｈシグナル阻害剤としては、定義に記載のものを適宜選択して使用することができるが、Ｎｏｔｃｈシグナル阻害剤として、好ましくはγ－セクレターゼ阻害剤が挙げられる。γ－セクレターゼ阻害剤としては、定義に記載のものを適宜選択して使用することができるが、好ましいγ－セクレターゼ阻害剤としては、Ｎ－［Ｎ－（３，５－ｄｉｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎａｃｅｔｙｌ）－Ｌ－ａｌａｎｙｌ］－Ｓ－ｐｈｅｎｙｌｇｌｙｃｉｎｅ　ｔ－ｂｕｔｙｌ　ｅｓｔｅｒ　（ＤＡＰＴ）又はＣｏｍｐｏｕｎｄ　Ｅが挙げられる。
　培養液中のＮｏｔｃｈシグナル阻害剤、好ましくはγ－セクレターゼ阻害剤の濃度は、生成する細胞塊に含まれ得る増殖性の細胞を抑制可能な範囲で、適宜設定することができる。具体的には、γ－セクレターゼ阻害剤としてＤＡＰＴを用いる場合における、０．１～１０００μＭ、１～１００μＭ、好ましくは１～３０μＭ、更に好ましくは５～２０μＭに相当するγ－セクレターゼ活性又は当該γ－セクレターゼ活性に基づくＮｏｔｃｈシグナル阻害活性を呈する濃度が挙げられる。
　工程（ＩＩＩ－３）において、Ｎｏｔｃｈシグナル阻害剤、好ましくはγ－セクレターゼ阻害剤の存在下での培養を開始する時期に特に限定は無いが例えば、分化開始から２８～４２日目が挙げられる。また、当該培養の期間は、好ましくは約１日間～約２０日間、さらに好ましくは２日間～８日間である。また、工程（ＩＩＩ－３）を経て得られる大脳皮質細胞塊は、分散－再凝集の工程を経ており、高純度大脳皮質細胞凝集塊である。
　本発明の一態様として、上記工程（Ｉ）、上記工程（ＩＩ）及び工程（ＩＩＩ－４）を含み、上記工程（Ｉ）の培養液及び上記工程（ＩＩＩ－４）の培養液のいずれもＮｏｔｃｈシグナル阻害剤を含む態様（大脳皮質細胞塊の製造方法３－５）が挙げられる。ここで、工程（Ｉ）は上記４に記載の大脳皮質細胞塊の製造方法１における工程（ｉｉ）と同様に行えばよく、工程（ＩＩ）は上記５に記載の大脳皮質細胞塊の製造方法２の工程（ｉｉｉ）と同様におこなえばよく、工程（ＩＩＩ－４）は上記大脳皮質細胞塊の製造方法３－４の工程（ＩＩＩ－３）と同様に行えばよい。また、工程（ＩＩＩ－４）を経て得られる大脳皮質細胞塊は、分散－再凝集の工程を経ており、高純度大脳皮質細胞凝集塊である。
　本発明の一態様として、上記工程（Ｉ）、及び工程（ＩＩＩ－５）を含み、上記工程（ＩＩＩ）の培養液はＮｏｔｃｈシグナル阻害剤を含む態様（大脳皮質細胞塊の製造方法３－６）が挙げられる。ここで、工程（Ｉ）は上記４に記載の大脳皮質細胞塊の製造方法１における工程（ｉｉ）と同様に行えばよく、工程（ＩＩＩ－５）は上記大脳皮質細胞塊の製造方法３－４における工程（ＩＩＩ―３）と同様に行えばよい。
　ここで、工程（Ｉ）及び／又は工程（ＩＩＩ－５）において、Ｎｏｔｃｈシグナル阻害剤を含む培養液で培養することとは、工程（Ｉ）及び／又は工程（ＩＩＩ－５）の一部の培養期間又は全培養期間において使用される培養液は、Ｎｏｔｃｈシグナル阻害剤を含むことを意味する。
　ここで、Ｎｏｔｃｈシグナル阻害剤の処理期間が一部の期間の場合は、上記工程（Ｉ）の培養液又は上記工程（ＩＩＩ－５）の培養液の交換時にＮｏｔｃｈシグナル阻害剤を含まない培養液を用いる。この一部の期間は、Ｎｏｔｃｈシグナル阻害剤による処理の効果が得られる限り、特に限定されず、上記工程（Ｉ）又は上記工程（ＩＩＩ－５）の培養期間のうちの数時間～数日、具体的には１～７日間、好ましくは２～６日間、より好ましくは２～４日間でもよい。また、短い処理期間（例えば、４時間、１２時間、２４時間、２日間）の繰り返しでもよい。また、Ｎｏｔｃｈシグナル阻害剤を含む期間と、Ｎｏｔｃｈシグナル阻害剤を含まない期間を交互に行ったり、濃度を変えたＮｏｔｃｈシグナル阻害剤を用いた組み合わせも本願の範疇である。
　本発明の一態様として、大脳皮質細胞塊の製造方法３－６の上記工程（Ｉ）を上記工程（Ｉ－２）に変更した態様（大脳皮質細胞塊の製造方法３－７）が挙げられる。上記工程（Ｉ）を上記工程（Ｉ－２）に変更した以外は、上記大脳皮質細胞塊の製造方法３－６に準じて行う。工程（ＩＩＩ－５）の培養液は、１以上の神経栄養因子、アスコルビン酸若しくはその誘導体、及びｃＡＭＰ活性化剤を含む培養液に、Ｎｏｔｃｈシグナル阻害剤をさらに含む。
　大脳皮質細胞塊の製造方法３－１～３－７において、工程（Ｉ）又は（Ｉ－２）で用いる大脳オルガノイドの製造方法には特に限定はなく、当業者に周知の方法で調製することができる。例えば、上記２に記載の大脳オルガノイドの製造方法に従って製造することができる。又は、上記２に記載の大脳オルガノイドの製造方法の工程（１）を実施せず、工程（２）の「工程（１）で得られる細胞」の代わりに多能性幹細胞を用いて工程（２）を実施すればよい。
　また、大脳皮質細胞塊の製造方法３－１～３－７において、（ＩＩＩ）～（ＩＩＩ－５）の工程による処理に替えて上記２の工程（２ｂ）に記載の方法、又は、神経細胞を生存させる培地で培養してもよい。この場合、Ｎｏｔｃｈシグナル阻害剤を添加する場合、添加しない場合も選択できる。
　本明細書では、代表的な大脳皮質細胞塊の製造方法の実施態様を示したが、用いる大脳オルガノイドの性質（遺伝型、組織形状、含有する細胞種割合、成熟度、等）や工程を行う装置、器具、場所、に応じて大脳皮質細胞塊の形成効率に変化することが想定される。このため、薬剤（例えばＮｏｔｃｈシグナル阻害剤）による処理の濃度、開始時期、期間、処理前後の薬剤非含有培地での培養期間、は所望の大脳皮質細胞塊が得られる限り、適宜調整できる。
　本発明の一態様として、上記４の大脳皮質細胞塊の製造方法１、上記５の大脳皮質細胞塊の製造方法２、上記６の大脳皮質細胞塊の製造方法２－２及び上記７の大脳皮質細胞塊の製造方法３－１～３－７により得られた大脳皮質細胞塊を回収し、当該細胞塊及び媒体を含む大脳皮質細胞製剤を調製する工程を含む、支持細胞の非存在下で、多能性幹細胞から大脳皮質細胞製剤を製造する方法が挙げられる。
　特に制限されないが、大脳皮質細胞製剤を調製する媒体としては、非凍結の場合、例えば生理食塩水、リン酸緩衝液（ＰＢＳ（－））、Ｈａｎｋ平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）、Ｅａｒｌ平衡塩類溶液、アートセレブなどの溶液が挙げられる。
　また、特に制限されないが、大脳皮質細胞製剤を調製する媒体としては、凍結の場合、媒体としては、凍結保護剤、例えばＤＭＳＯ、グリセロール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン、ポリビニルピロリドン、ソルビトール、デキストラン、トレハロースなどを含む溶液や、市販の凍結保存液、例えばＣｅｌｌ　ｂａｎｋｅｒ、Ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ　ｂａｎｋｅｒ、バンバンカーなどが挙げられる。
８．大脳皮質細胞塊
　本発明の一態様として、以下の性質を有する大脳皮質細胞塊が挙げられる。当該大脳皮質細胞塊は、上記４に記載の大脳皮質細胞塊の製造方法１により製造できる。
　すなわち、本発明の一態様として、下記（ａ）～（ｃ）の特徴を有する、大脳皮質細胞塊が挙げられる。
（ａ）増殖性マーカー陽性細胞数が全細胞数の１０％以下であること、
（ｂ）神経細胞マーカー、皮質Ｖ／ＶＩ層マーカー、及び前脳マーカーからなる群から選ばれる１つ以上のマーカーが陽性である細胞数が全細胞数の６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上であること、
（ｃ）神経上皮又は大脳皮質様構造を実質的に含まないこと。
　上記増殖性マーカーとしては、Ｋｉ６７が挙げられる。上記神経細胞マーカーとしては、βＩＩＩ－Ｔｕｂｕｌｉｎ（βＴｕｂＩＩＩ）が挙げられる。上記皮質Ｖ／ＶＩ層マーカーとしては、Ｃｔｉｐ２が挙げられる。上記前脳マーカーとしては、Ｆｏｘｇ１が挙げられる。
　一態様として、下記の特徴を有する大脳皮質細胞塊が挙げられる：
（ａ’）Ｋｉ６７陽性細胞数が全細胞数の５％以下であること、
（ｂ’）βＩＩＩ－Ｔｕｂｕｌｉｎ（βＴｕｂＩＩＩ）、Ｃｔｉｐ２、及びＦｏｘｇ１がいずれも陽性の細胞数が全細胞数の６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上であること、
（ｃ）神経上皮又は大脳皮質様構造を実質的に含まないこと。
　大脳オルガノイドにおける神経上皮及び大脳皮質様構造は、倒立顕微鏡観察において目視で確認可能である。
　一態様として、神経上皮又は大脳皮質様構造を実質的に含まないとは、上述の神経上皮や大脳皮質様構造が、倒立顕微鏡観察等において目視で同定できないことが挙げられる。
　一態様として、上記大脳皮質細胞塊は、更に
（ｄ）ＮＥＵＲＯＤ６、ＮＥＵＲＯＤ２、ＳＳＴＲ２、ＴＢＲ１、ＺＢＴＢ１８、ＮＨＬＨ１、ＩＧＦＢＰＬ１、ＮＲＮ１、ＲＴＮ１、ＴＨＳＤ７Ａ、ＮＲＸＮ１、ＢＨＬＨＥ２２、ＣＡＬＢ２、ＫＨＤＲＢＳ３、ＣＣＳＡＰ、ＰＤＥ１Ａ、ＮＥＵＲＯＤ１、ＮＰＴＸ１、ＮＸＰＨ４、ＮＴＳ、ＮＥＵＲＯＧ２、ＯＬＦＭ１、ＰＲＤＭ８、ＣＯＲＯ２Ｂ、ＴＰ５３Ｉ１１、ＺＦＰＭ２、ＰＣＤＨ９、ＮＥＬＬ２、ＳＲＲＭ４、ＳＣＧ３、ＤＣＣ、ＥＰＢ４１Ｌ３、ＳＬＣ１７Ａ７、ＳＴ１８、ＮＳＧ２、ＥＭＸ１、ＣＡＰ２、ＳＹＴ４、ＮＳＭＦ、ＡＮＫ３、ＭＹＴ１Ｌ、ＦＳＴＬ５、ＣＥＬＦ４、Ｂ３ＧＡＴ１、ＥＰＨＡ５、ＮＨＬＨ２、及びＤＬＬ３からなる群から選ばれる少なくとも１つの遺伝子をさらに発現している。上記大脳皮質細胞塊は好ましくはＳＬＣ１７Ａ７、ＮＥＵＲＯＤ６、及びＥＭＸ１からなる群から選ばれる１以上の遺伝子を発現しており、より好ましくはＧＡＤ２、ＣＯＬ１Ａ１、ＴＹＲ、ＴＴＲ及びＨＯＸＡ２からなる群から選ばれる１以上の遺伝子を実質的に発現していない。
　一態様として、上記大脳皮質細胞塊は、更に
（ｅ）神経幹細胞マーカー陽性細胞が全細胞数の１０％以下であり、
上記神経幹細胞マーカーとしては、Ｐａｘ６、Ｓｏｘ１又はＳｏｘ２が挙げられる。
　一態様として、上記大脳皮質細胞塊は、更に
（ｆ）多能性マーカー陰性である。
　多能性マーカー陰性とは、多能性幹細胞が実質的に検出されないこと、具体的に多能性マーカー陽性細胞が全細胞数の１％以下であることが挙げられる。上記多能性マーカーとしては、Ｏｃｔ４等が挙げられる。
　一態様として、上記大脳皮質細胞塊は、更に、場合によって、（ｇ）皮質ＩＩ乃至ＩＶ層マーカー（ＳＡＴＢ２）陽性細胞が存在していてもよい。
　本発明の一態様として、上記大脳皮質細胞塊を、全細胞塊の１０％以上、好ましくは２０％以上、より好ましくは、４０％以上、更に好ましくは５０％以上含む細胞集団が挙げられる。
　本発明の一態様として、大脳皮質細胞塊は。直径（円相当径）が約１００μｍ～１０００μｍ、好ましくは約３００μｍ～６００μｍの球状様の細胞塊であってよい。細胞塊１つ当たりの細胞数は、約１×１０３～５×１０４個、好ましくは約５×１０３～２×１０４個であってよい。または、本発明の一態様として、大脳皮質細胞塊は、直径（円相当径）が約１００μｍ～５０００μｍ、好ましくは約３００μｍ～２０００μｍの球状の細胞塊であってよい。細胞塊１つ当たりの細胞数は、約５×１０３～５×１０６個、好ましくは約１×１０４～３×１０６個であってよい。
　本発明の一態様として、大脳皮質細胞塊の細胞集団において、直径（円相当径）の平均値は、約３００μｍ～２０００μｍである。
本発明の一態様として、上記大脳皮質細胞塊、及びその細胞集団は、インビボで脳へ移植した場合に、移植部位へ生着しかつ移植片由来の細胞の増殖が抑えられていることを特徴とする。例えば、マウス脳に移植された場合、分化誘導５週目の大脳皮質細胞塊の移植３か月後の移植片の体積は、同時期の大脳オルガノイドの移植片に比べ、２％～５０％に抑制された。
　上記大脳皮質細胞塊、及びその細胞集団は、後述するように脳血管障害に罹患した患者、又は頭部外傷を負っている患者への細胞移植治療に有用である。
９．高純度大脳皮質細胞塊
　本発明の一態様として、以下の性質を有する高純度大脳皮質細胞塊が挙げられる。以下の性質を有し、増殖性マーカー陽性細胞が抑制され、目的とする神経細胞の含有率が向上した高純度大脳皮質細胞塊は、上記５に記載の大脳皮質細胞塊の製造方法２－１、上記６に記載の大脳皮質細胞塊の製造方法２－２、又は、上記７に記載の大脳皮質細胞塊の製造方法３－１乃至３－６により製造できる。
　すなわち、本発明の一態様として、下記の特徴を有する、高純度大脳皮質細胞塊が挙げられる。
（Ａ）増殖性マーカー陽性細胞数が全細胞数の５％以下、好ましくは３％以下、更に好ましくは１％以下であること、
（Ｂ）神経細胞マーカー、皮質Ｖ／ＶＩ層マーカー、及び前脳マーカーから選ばれる１つ以上のマーカー陽性細胞数が全細胞数の６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上であること、
（Ｃ）神経上皮又は大脳皮質様構造を実質的に含まないこと。
　上記増殖性マーカーとしては、Ｋｉ６７が挙げられる。上記神経細胞マーカーとしては、βＩＩＩ－Ｔｕｂｕｌｉｎ（βＴｕｂＩＩＩ）が挙げられる。上記皮質Ｖ／ＶＩ層マーカーとしては、Ｃｔｉｐ２が挙げられる。上記前脳マーカーとしては、Ｆｏｘｇ１が挙げられる。
　一態様として、下記の特徴を有する高純度大脳皮質細胞塊が挙げられる：
（Ａ）Ｋｉ６７陽性細胞数が全細胞数の５％以下であること、
（Ｂ）βＩＩＩ－Ｔｕｂｕｌｉｎ（βＴｕｂＩＩＩ）、Ｃｔｉｐ２、及びＦｏｘｇ１がいずれも陽性の細胞数が全細胞数の６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上であること、
（Ｃ）神経上皮又は大脳皮質様構造を実質的に含まないこと。
　一態様として、神経上皮又は大脳皮質様構造を実質的に含まないとは、上述の神経上皮や大脳皮質様構造が、倒立顕微鏡観察等において目視で同定できないことが挙げられる。
　本発明において、高純度大脳皮質細胞塊を得る方法、すなわち、大脳皮質細胞塊における大脳皮質細胞の含有率を上げ、増殖性細胞等の目的外細胞の含有率を下げるために有効な工程としては、上述の工程（ｉｖ）もしくは工程（ＩＩＩ）に記載の工程（Ｎｏｔｃｈシグナル阻害剤が存在していてもよいが必須ではない）が挙げられ、さらにに好ましくは、これに加えて上述の工程（ｉｉｉ）もしくは工程（ＩＩ）に記載の大脳皮質細胞塊を分散させ、再凝集させる工程を含む工程が挙げられる。
　一態様として、上記高純度大脳皮質細胞塊は、更に
（Ｄ）ＮＥＵＲＯＤ６、ＮＥＵＲＯＤ２、ＳＳＴＲ２、ＴＢＲ１、ＺＢＴＢ１８、ＮＨＬＨ１、ＩＧＦＢＰＬ１、ＮＲＮ１、ＲＴＮ１、ＴＨＳＤ７Ａ、ＮＲＸＮ１、ＢＨＬＨＥ２２、ＣＡＬＢ２、ＫＨＤＲＢＳ３、ＣＣＳＡＰ、ＰＤＥ１Ａ、ＮＥＵＲＯＤ１、ＮＰＴＸ１、ＮＸＰＨ４、ＮＴＳ、ＮＥＵＲＯＧ２、ＯＬＦＭ１、ＰＲＤＭ８、ＣＯＲＯ２Ｂ、ＴＰ５３Ｉ１１、ＺＦＰＭ２、ＰＣＤＨ９、ＮＥＬＬ２、ＳＲＲＭ４、ＳＣＧ３、ＤＣＣ、ＥＰＢ４１Ｌ３、ＳＬＣ１７Ａ７、ＳＴ１８、ＮＳＧ２、ＥＭＸ１、ＣＡＰ２、ＳＹＴ４、ＮＳＭＦ、ＡＮＫ３、ＭＹＴ１Ｌ、ＦＳＴＬ５、ＣＥＬＦ４、Ｂ３ＧＡＴ１、ＥＰＨＡ５、ＮＨＬＨ２、及びＤＬＬ３からなる群から選ばれる少なくとも少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、又は少なくとも５つの遺伝子をさらに発現している。上記大脳皮質細胞塊は好ましくはＳＬＣ１７Ａ７、ＮＥＵＲＯＤ６、及びＥＭＸ１からなる群から選ばれる１以上の遺伝子、又は全ての遺伝子を発現しており、より好ましくはＧＡＤ２、ＣＯＬ１Ａ１、ＴＹＲ、ＴＴＲ及びＨＯＸＡ２からなる群から選ばれる１以上の遺伝子を実質的に発現していない。
　一態様として、上記高純度大脳皮質細胞塊は、更に
（Ｅ）神経幹細胞マーカー陽性細胞が全細胞数の１０％以下、好ましくは５％以下、更に好ましくは３％以下であり、
　上記神経幹細胞マーカーとしては、Ｐａｘ６、Ｓｏｘ１又はＳｏｘ２が挙げられる。
　一態様として、上記高純度大脳皮質細胞塊は、更に
（Ｆ）多能性マーカー陰性である。
　多能性マーカー陰性とは、多能性幹細胞が実質的に検出されないこと、具体的に多能性マーカー陽性細胞が全細胞数の１％以下であることが挙げられる。
　上記多能性マーカーとしては、Ｏｃｔ４等が挙げられる。
　一態様として、上記大脳皮質細胞塊は、更に、場合によって、（Ｇ）皮質ＩＩ乃至ＩＶ層マーカー（ＳＡＴＢ２）陽性細胞が存在していてもよい。
　本発明の一態様として、上記大脳皮質細胞塊を、全細胞塊の１０％以上、好ましくは２０％以上、より好ましくは、４０％以上、更に好ましくは５０％以上含む細胞集団が挙げられる。
　本発明の一態様として、高純度大脳皮質細胞塊は、直径（円相当径）が約１００μｍ～１００００μｍ、好ましくは約２００μｍ～３０００μｍの球状様の細胞塊であってよい。細胞塊１つ当たりの細胞数は、約１×１０３～５×１０６個、好ましくは約５×１０３～３×１０６個であってよい。
　本発明の一態様として、高純度大脳皮質細胞塊の細胞集団において、直径（円相当径）の平均値は、約３００μｍ～５００μｍである。
　本発明の一態様として、上記高純度大脳皮質細胞塊、及びそれから得られる細胞集団は、インビボで脳へ移植した場合に、移植部位へ生着しかつ移植片由来の細胞の増殖が抑えられることを特徴とする。例えば、マウスの脳に移植された場合、移植後５週における移植片の体積は、移植直後に比べて２％～５０％であり得る。
　上記高純度大脳皮質細胞塊、及びそれから得られる細胞集団は、後述するように脳血管障害に罹患した患者への細胞移植治療に有用である。
　本発明の一態様として、上記の性質に加えて、更に高純度大脳皮質細胞塊のサイズ、構成細胞組成、又は形状が均一な高純度大脳皮質細胞塊の細胞集団が挙げられる。当該細胞集団は、上記５～７に記載の大脳皮質細胞塊の製造方法２－１、２－２及び３－１～３－６により製造することができる。すなわち、当該製造方法に従って、大脳オルガノイドを分散し、再凝集により大きさ、構成細胞組成、又は形状が均一な高純度大脳皮質細胞塊の細胞集団を製造することができる。
　ここで、均一性は、例えば、高純度大脳皮質細胞塊の各種細胞のマーカー発現量、大きさ、１つの細胞塊に含まれる細胞数等の数値のバラツキが±２０％以下、好ましくは±１０％以下、更に好ましくは±５％以下であることを指標として同定できる。
　上記高純度大脳皮質細胞塊、及びその細胞集団は、後述するように脳血管障害に罹患した患者、又は頭部外傷を負っている患者への細胞移植治療に有用である。
１０．医薬組成物
　本発明の一態様として、上記２に記載の大脳オルガノイドの製造方法により得られる大脳オルガノイド、若しくは上記３に記載の大脳オルガノイド、これらの大脳オルガノイドから得られる大脳皮質細胞を含む細胞集団、上記４～７に記載の大脳皮質細胞塊の製造方法で得られる大脳皮質細胞塊、上記８若しくは９に記載の大脳皮質細胞塊、又はこれらの細胞塊から得られる大脳皮質細胞を含む細胞集団を有効成分とする、医薬組成物が挙げられる。すなわち、上記２に記載の大脳オルガノイドの製造方法により得られる大脳オルガノイド、若しくは上記３に記載の大脳オルガノイド、これらの大脳オルガノイドから得られる大脳皮質細胞を含む細胞集団、上記４～７に記載の大脳皮質細胞塊の製造方法で得られる大脳皮質細胞塊、上記８若しくは９に記載の大脳皮質細胞塊、又はこれらの細胞塊から得られる大脳皮質細胞を含む細胞集団は、移植用細胞塊（移植片ともいう）又は移植用細胞・移植用組織として、細胞移植治療のための有効成分として利用できる。
　当該有効成分の有効量は、投与目的、投与方法、及び投与対象の状況（性別、年齢、体重、病状等）によって異なるが、例えば、細胞数として、１×１０４個～１×１０１０個、１×１０５個～１×１０９個、１×１０６個～１×１０７個、３×１０６～３×１０７個、又は１×１０６個～１×１０９個とすることができる。
　本明細書における医薬組成物、又は移植用細胞塊・移植用細胞・移植用組織（以下医薬組成物等）は、上記有効成分の有効量のほか、薬学的に許容される担体を含んでもよい。薬学的に許容される担体としては、生理的な水性溶媒（生理食塩水、緩衝液、無血清培養液等）を用いることができる。医薬組成物等は、必要に応じて移植医療において、移植用細胞塊又は移植用細胞を含む医薬に、通常使用される保存剤、安定剤、還元剤、等張化剤等を含んでもよい。
　移植用細胞塊、移植用細胞又は移植用組織を、適切な生理的な水性溶媒で懸濁することによって、細胞懸濁液として製造することができる。必要であれば、凍結保存剤を添加して上記移植用細胞集団を凍結保存し、使用時に解凍し、緩衝液で洗浄したり、低温条件下で保存し、使用時に緩衝液で洗浄して、移植医療に用いてもよい。
　具体的には、上記２の大脳オルガノイドの製造方法、又は、上記４～７の大脳皮質細胞塊の製造方法を実施した後に、すべての大脳オルガノイド又は細胞塊を回収し、必要に応じて、用いられていた培地、その他の培地又はリン酸緩衝液等で回収した細胞塊を洗浄したのち、医薬組成物において用いられる媒体に懸濁することができる。
　本発明の医薬組成物等は、細胞塊を分散・懸濁させた懸濁液であってもよいし、当該細胞塊を、細胞塊から細胞を分散させたりした懸濁液、シート剤であってもよい。
　また、本発明の製造方法で得られた医薬組成物等は、上記２の大脳オルガノイドの製造方法、又は、上記４～７の大脳皮質細胞塊の製造方法を実施した後に、プレート上で培養することによってシート状に成型し二次元組織の細胞組織構造体としたり、スキャフォールド上で培養を行うことによって、立体状に成型し、三次元組織である細胞組織構造体としたりすることもできる。
　下記に記載するように、本発明の大脳皮質細胞を含む細胞塊又は細胞集団を含む医薬組成物等は、脳血管障害モデル動物（例えばマウス）の大脳皮質への投与において、損傷部位における損傷神経系の修復そして運動機能の回復（例えば運動麻痺等の症状の改善）という顕著な効果をもたらすものである。したがって、本発明の医薬組成物等は、脳血管障害、又は頭部外傷の治療薬として有用である。また、本発明の医薬組成物等は、脳血管障害に罹患した患者の運動機能の改善薬として有用である。
　しかも本明細書に記載する医薬組成物等に含まれる、大脳皮質細胞を含む細胞塊又は細胞集団は、株化された多能性幹細胞から製造され、マーカー等により特定され品質管理される。従って、安定した品質の移植用細胞集団を大量に製造し、移植に用いることができる。また、移植用細胞集団を保存することができるため、患者の移植の時期にあわせて移植用細胞集団を準備することができる。
１１．治療方法
　本発明の一態様として、本発明の上記２に記載の大脳オルガノイドの製造方法で得られる大脳オルガノイド、若しくは上記３に記載の大脳オルガノイド、これらの大脳オルガノイドから得られる大脳皮質細胞を含む細胞集団、上記４～７に記載の大脳皮質細胞塊の製造方法で得られる大脳皮質細胞塊、上記８若しくは９に記載の大脳皮質細胞塊、これらの細胞塊から得られる大脳皮質細胞を含む細胞集団、又は上記１０に記載の医薬組成物の有効量を、移植を必要とする対象に移植（投与）することを含む、大脳皮質細胞の補充又は機能改善が必要な疾患、具体的には脳血管障害の治療方法が挙げられる。ここで、投与（移植）部位は大脳皮質又は大脳基底核であってよい。対象は、哺乳動物あってよく、好ましくはげっ歯類（例、マウス、ラット）又は霊長類（例、ヒト、サル）であり、より好ましくはヒトである。また、脳血管障害は、頭部外傷であってもよい。また、当該治療方法は、脳血管障害の患者における運動機能（例えば運動麻痺等の症状の改善）の改善方法、脳血管障害の患者における大脳皮質細胞の補充方法等を含む概念である。
　移植医療においては、組織適合性抗原の違いによる拒絶反応がしばしば問題となるが、移植のレシピエントの体細胞から樹立した自家の多能性幹細胞（例、人工多能性幹細胞）を用いることで当該問題を克服できる。すなわち、本発明の好ましい一態様において、多能性幹細胞として、レシピエントの体細胞から樹立した多能性幹細胞（例、人工多能性幹細胞）を用いることによって、当該レシピエントについて免疫学的自己の細胞塊（細胞集団）を製造し、当該細胞塊（細胞集団）又は当該細胞塊（細胞集団）から得られる細胞を含む移植用細胞集団が当該レシピエントに移植される。
　また、レシピエントと免疫が適合する（例えば、ＨＬＡ型又はＭＨＣ型が適合する）他者の体細胞から樹立した多能性幹細胞（例、人工多能性幹細胞）から、アロ（他家）の細胞塊（細胞集団）を製造し、当該細胞塊（細胞集団）又は当該細胞塊（細胞集団）から得られる細胞を含む移植用細胞集団を当該レシピエントに移植してもよい。
　また、組織適合性抗原（例えば、ＨＬＡ　Ｃｌａｓｓ　Ｉ、ＨＬＡ　Ｃｌａｓｓ　ＩＩを構成する抗原タンパク質）又は当該抗原の発現に必要な因子の発現が抑制されたｉＰＳ細胞を用いて本発明の細胞塊（細胞集団）を製造することによって、他家の細胞移植であっても拒絶反応を回避することができる。
　本発明の治療方法において患者若しくはレシピエントに投与若しくは移植される治療薬として、前述の医薬組成物を使用することができる。
　本発明の一態様として、脳血管障害の治療における使用のための、本発明の大脳皮質細胞を含む細胞塊又は細胞集団の使用が挙げられる。
１２．毒性・薬効評価方法
　本発明の一態様として、上記２に記載の大脳オルガノイドの製造方法で得られる大脳オルガノイド、若しくは上記３に記載の大脳オルガノイド、又はこれらの大脳オルガノイドから得られる大脳皮質細胞を含む細胞集団、上記４～７に記載の大脳皮質細胞塊の製造方法で得られる大脳皮質細胞塊、上記８若しくは９に記載の大脳皮質細胞塊、又は、これらの細胞塊を分散させて得られる細胞集団に被験物質を接触させ、被検物質が該細胞塊又は該細胞集団に及ぼす影響を検出又は定量することを含む、被験物質の毒性又は薬効を評価するための方法が挙げられる。
　上記２に記載の大脳オルガノイドの製造方法で得られる大脳オルガノイド、若しくは上記３に記載の大脳オルガノイド、又はこれらの大脳オルガノイドから得られる大脳皮質細胞を含む細胞集団、上記４～７に記載の大脳皮質細胞塊の製造方法で得られる大脳皮質細胞塊、上記８若しくは９に記載の大脳皮質細胞塊、又は、これらの細胞塊を分散させて得られる細胞集団は、疾患のモデル細胞として、脳血管障害を伴う疾患の治療薬、又はその予防薬のスクリーニング、薬効評価に利用することができる。
　また、上記２に記載の大脳オルガノイドの製造方法で得られる大脳オルガノイド、若しくは上記３に記載の大脳オルガノイド、又はこれらの大脳オルガノイドから得られる大脳皮質細胞を含む細胞集団、上記４～７に記載の大脳皮質細胞塊の製造方法で得られる大脳皮質細胞塊、上記８若しくは９に記載の大脳皮質細胞塊、又は、これらの細胞塊を分散させて得られる細胞集団は、健常のモデル細胞として、化学物質等の安全性試験、ストレス試験、毒性試験、副作用試験、感染又は混入試験に利用することができる。また、本発明の細胞塊又は細胞集団は、皮質Ｖ／ＶＩ層組織の細胞を含むため、これらの細胞を含む神経組織（例えば、大脳皮質）の機能試験、具体的には、グルタミン酸作動性神経等の機能評価や、大脳皮質細胞の増殖能や分化能評価に利用することも可能である。
　その評価方法としては、アポトーシス評価等の刺激・毒性試験のほか、化学物質が、大脳皮質細胞の分化、軸索伸長能、発火能に及ぼす影響を評価する試験（各種遺伝子マーカーのＲＴ－ＰＣＲ、サイトカインのＥＬＩＳＡ等による発現タンパク質解析、貪食能試験、パッチクランプ法、マルチ電極アレイ（ＭＥＡ）などを用いた電気生理学的解析）等が挙げられる。例えば、神経分化や軸索伸長能、発火能を促進又は阻害する化合物の探索や、脳血管障害に罹患した患者由来ｉＰＳ細胞から分化させた細胞について、疾患特異的な表現型をレスキューさせるような化合物、タンパク質等の探索等に使用できる。
　また、これらの試験の為の細胞材料としては、例えば、本発明の細胞塊の細胞を分散し、播種接着したプレート、細胞懸濁液、そのシート又は成形体を提供することができる。
　本発明の上記２に記載の大脳オルガノイドの製造方法で得られる大脳オルガノイド、若しくは上記３に記載の大脳オルガノイド、又はこれらの大脳オルガノイドから得られる大脳皮質細胞を含む細胞集団、上記４～７に記載の大脳皮質細胞塊の製造方法で得られる大脳皮質細胞塊、上記８若しくは９に記載の大脳皮質細胞塊、又は、これらの細胞塊を分散させて得られる細胞集団は、ヒト及び動物試験の外挿試験として用いることができる。
１３．大脳オルガノイド又は大脳皮質細胞塊（高純度大脳皮質細胞塊を含む）の品質評価方法
　本発明の一態様として、以下の工程（ａａ）及び工程（ｂｂ）を含む、大脳オルガノイド又は大脳皮質細胞塊の品質評価方法が挙げられる。ここにおいて大脳皮質細胞塊には、本発明の高純度大脳皮質細胞塊が包含される。
（ａａ）大脳オルガノイド又は大脳皮質細胞塊における、ＧＡＤ２、ＣＯＬ１Ａ１、ＴＹＲ、ＴＴＲ及びＨＯＸＡ２からなる群から選ばれる少なくとも１つ、又は全ての遺伝子の発現量を測定する工程、
（ｂｂ）工程（ａａ）の測定結果に基づき、上記遺伝子の発現量が基準値以下である場合に、上記大脳オルガノイド又は上記大脳皮質細胞塊に含まれる目的外細胞の量が基準以下であると評価する工程。
　また、本発明の一態様として、以下の工程（ＡＡ）及び工程（ＢＢ）を含む、大脳オルガノイド又は大脳皮質細胞塊の品質評価方法が挙げられる。
（ＡＡ）大脳オルガノイド又は大脳皮質細胞塊における、ＮＥＵＲＯＤ６、ＮＥＵＲＯＤ２、ＳＳＴＲ２、ＴＢＲ１、ＺＢＴＢ１８、ＮＨＬＨ１、ＩＧＦＢＰＬ１、ＮＲＮ１、ＲＴＮ１、ＴＨＳＤ７Ａ、ＮＲＸＮ１、ＢＨＬＨＥ２２、ＣＡＬＢ２、ＫＨＤＲＢＳ３、ＣＣＳＡＰ、ＰＤＥ１Ａ、ＮＥＵＲＯＤ１、ＮＰＴＸ１、ＮＸＰＨ４、ＮＴＳ、ＮＥＵＲＯＧ２、ＯＬＦＭ１、ＰＲＤＭ８、ＣＯＲＯ２Ｂ、ＴＰ５３Ｉ１１、ＺＦＰＭ２、ＰＣＤＨ９、ＮＥＬＬ２、ＳＲＲＭ４、ＳＣＧ３、ＤＣＣ、ＥＰＢ４１Ｌ３、ＳＬＣ１７Ａ７、ＳＴ１８、ＮＳＧ２、ＥＭＸ１、ＣＡＰ２、ＳＹＴ４、ＮＳＭＦ、ＡＮＫ３、ＭＹＴ１Ｌ、ＦＳＴＬ５、ＣＥＬＦ４、Ｂ３ＧＡＴ１、ＥＰＨＡ５、ＮＨＬＨ２、及びＤＬＬ３からなる群から選ばれる少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、又は少なくとも５つの遺伝子の発現量を測定する工程、
（ＢＢ）工程（ＡＡ）の測定結果に基づき、上記遺伝子の発現量が基準値以上である場合に、上記大脳オルガノイド又は上記大脳皮質細胞塊に含まれる目的細胞の量が基準以上であると評価する工程。
　遺伝子の発現量（すなわち、ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現量）及びその測定方法について上記のとおりである。上記（ａａ）に記載の遺伝子等の、目的外細胞のマーカーとなる各遺伝子の発現量の基準値としては、例えば、標品となる大脳オルガノイド又は大脳皮質凝集塊において測定された値が挙げられ、基準値と同等以下であることを指標として評価することができる。また、上記（ＡＡ）に記載の遺伝子等の、目的細胞のマーカーとなる各遺伝子の基準値としては、例えば、標品となる大脳オルガノイド又は大脳皮質凝集塊において測定された値が挙げられ、基準値と同等以上であることを指標として評価することができる。
　本発明の一態様として、上記４～７に記載の大脳皮質細胞塊の製造方法で得られる大脳皮質細胞塊について、大脳皮質細胞塊の細胞集団の一部をサンプリングし、上記大脳オルガノイド又は大脳皮質細胞塊の品質評価方法で評価し、当該評価結果に基づき、目的外細胞が基準以下である、及び／又は、目的細胞が基準値以上である大脳皮質細胞塊の集団を、移植に用いることが可能な集団として選択（同定）することができる。
　本発明の一態様として、上記４～７に記載の大脳皮質細胞塊の製造方法として、さらに上記大脳オルガノイド又は大脳皮質細胞塊の品質評価方法を含む、大脳皮質細胞塊の製造方法が挙げられる。
　すなわち、以下の工程を含む大脳皮質細胞塊の製造方法が挙げられる：
（１）４～７に記載の製造方法で、大脳皮質細胞塊を製造する工程、
（２）上記品質評価方法により、目的細胞の量が基準以上であること、及び／又は、目的外細胞の量が基準以下であることを評価する工程、
（３）（２）の評価結果に基づき、移植に用いることが可能な大脳皮質細胞塊を選択又は同定する工程。
（ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）の維持培養）
　ｈｉＰＳＣは、ラミニン５１１のＥ８フラグメントであるｉＭａｔｒｉｘ－５１１（株式会社ニッピ）を０．５μｇ／ｃｍ２になるように６ウェルプレートに添加しコーディングしたプレート上にてＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ培地又はＡＫ０３Ｎ培地で（以下、「ＳｔｅｍＦｉｔ」という場合がある；味の素ヘルシーサプライ社製）を用いて維持培養した。継代は、ｈｉＰＳＣを０．５×Ｔｒｙｐｌｅ　Ｓｅｌｅｃｔを用いて、細胞を３７℃で８分間処理し、単細胞に分離後、１～１．５×１０４細胞の細胞密度で６ウェルプレートに播種した。継代は７日ごとに行った。
（免疫染色解析）
　オルガノイドを４％パラホルムアルデヒドで３０分間固定し、ＰＢＳ中の３０％（ｗ／ｖ）スクロースで脱水反応を行い、Ｏ．Ｃ．Ｔ．コンパウンド（Ｓａｋｕｒａ　Ｆｉｎｅｔｅｋ）を用いて包埋した。凍結切片は、クリオスタット（ＣＭ１８５０、ライカバイオシステムズ）を用いて１６μｍの厚さで作成した。０．３％又は２％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００で透過処理し、必要に応じて抗原賦活化反応を実施した。ブロックＡＣＥ（ＫＡＣ）でブロッキングを実施した後、二重又は三重標識染色を行った。免疫染色に使用した一次抗体及び二次抗体は、推奨希釈濃度にて使用した。
　免疫染色に使用された一次抗体及び二次抗体を以下に示す。
L1CAM：554273 (BD)
Ctip2：ab18465 (Abcam)
Pax6：EPR15858 (Abcam),561482 (BD)
Foxg1：M227 (Takara)
Ki67：NCL (Leica)
Emx1：M196 (Takara)
Gad65：559931 (BD)
Col1a1：AF6220（R&D）
TTR：A0002（DAKO）
TYR：MA5-14177（Thermo Fisher）
Alexa Fluor（登録商標） 488 donkey anti-mouse IgG (H+L)：A21202 (Thermo Fisher)
Alexa Fluor（登録商標） 647 donkey anti-mouse IgG (H+L)：1900251 (Thermo Fisher)
Alexa Fluor（登録商標） 594 donkey anti-rat IgG (H+L)：1979379 (Thermo Fisher)
Alexa Fluor（登録商標） 488 donkey anti-rabbit IgG (H+L)：A21206 (Thermo Fisher)
Alexa Fluor（登録商標） 647 donkey anti-rabbit IgG (H+L)：A32795 (Thermo Fisher)
Alexa Fluor（登録商標） 594 donkey anti-sheep IgG (H+L)：A11016 (Thermo Fisher)
（顕微鏡及び画像分析）
　培養中のオルガノイドの画像（明視野像）は、デジタル倒立顕微鏡（Ｌｅｉｃａ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＤＭＳ１０００）で撮影した。共焦点蛍光顕微鏡画像はＬＳＭ８００共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）で撮影し、ＺＥＮＢｌｕｅ画像処理ソフトウェアで解析した。
（フローサイトメトリー）
　大脳オルガノイド、大脳皮質細胞塊、及び高純度大脳皮質細胞塊は、神経細胞用分散液（富士フィルム和光純薬）を用いて単細胞に分散し、Ｆｉｘａｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて４℃で３０分間固定した後、Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ　ｂｕｆｆｅｒ（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で室温１５分間処理し、二重又は三重染色を行い、ＡｒｉａＩＩＩを用いて解析した。解析ソフトウェアは、ＦＡＣＳＤｉｖａ　ｓｏｆｔｗａｒｅ (ＢＤ)を用いた。使用した一次抗体、二次抗体は下記に示す。
PerCP-Cy5.5 Mouse IgG1 k isotype control: 550795 (BD Biosciences)
Alexa 647 Mouse Anti-human Oct3/4 antigen: 560329 (BD Biosciences)
Tra-2-49/6E-FITC antibody : FCMAB133F (Merck)
Alexa647 mouse anti β-tubulin Class III: 560394 (BD)
PerCP-Cy5.5 Mouse anti-Human Sox1: 561549 (BD)
Alexa647 mouse anti-Human Pax6: 561165(BD)
Alexa488 mouse anti-Ki67: 562249 (BD)
Alexa488 rat anti-Ctip2 antibody: ab123449 (Abcam)
（定量的逆転写ＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）による遺伝子発現解析）
　全ＲＮＡはＲＮｅａｓｙＭｉｃｒｏＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）によって取得し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　ＩＩＩ　Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｓｙｓｔｅｍ（ＱＩＡＧＥＮ）によってメーカーのプロトコルに従って逆転写反応を行った。定量的ＰＣＲは、ＴａｑＭａｎ（商標）Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ）、若しくはＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して、製造元の指示に従って実行した。遺伝子の発現量は、ΔΔＣｔ法を使用してＧＡＰＤＨで標準化した。
　使用されたプライマーセット及びＴａｑｍａｎ　Ｐｒｏｂｅを以下に示す。
オリゴＤＮＡプライマー
POU5F1: 
Forward: AGACCATCTGCCGCTTTGAG　（配列番号１）
Reverse: GCAAGGGCCGCAGCTT　（配列番号２）
NANOG:
Forward: GGCTCTGTTTTGCTATATCCCCTAA　（配列番号３）
Reverse: CATTACGATGCAGCAAATACGAGA　（配列番号４）
BMP4: 
Forward: ATGATTCCTGGTAACCGAATGC　（配列番号５）
Reverse: CCCCGTCTCAGGTATCAAACT　（配列番号６）
NODAL: 
Forward: TGAGCCAACAAGAGGATCTG　（配列番号７）
Reverse: TGGAAAATCTCAATGGCAAG　（配列番号８）
TGFB1: 
Forward: TACCTGAACCCGTGTTGCTCTC　（配列番号９）
Reverse: GTTGCTGAGGTATCGCCAGGAA　（配列番号１０）
SOX1: 
Forward: GCGGAGCTCGTCGCATT　（配列番号１１）
Reverse: GCGGTAACAACTACAAAAAACTTGTAA　（配列番号１２）
PAX6: 
Forward: CTGGCTAGCGAAAAGCAACAG　（配列番号１３）
Reverse: CCCGTTCAACATCCTTAGTTTATCA　（配列番号１４）
T (TBXT):
Forward: ATGGAGGAACCCGGAGACA　（配列番号１５）
Reverse: TGAGGATTTGCAGGTGGACA　（配列番号１６）
SOX17:
Forward: CGCTTTCATGGTGTGGGCTAAGGACG　（配列番号１７）
Reverse: TAGTTGGGGTGGTCCTGCATGTGCTG　（配列番号１８）
hCGalpha:
Forward: ACCGCCCTGAACACATCCTGC　（配列番号１９）
Reverse: GCGTGCATTCTGGGCAATCCTGC　（配列番号２０）
SOX2: 
Forward: GCCGAGTGGAAACTTTTGTCG　（配列番号２１）
Reverse: GGCAGCGTGTACTTATCCTTCT　（配列番号２２）
Taqman probe
SLC17A7: Hs01574213
EMX1: Hs00417957
GAD2: Hs00609536
DLX2: Hs00269993
TTR: Hs00174914
COL1A1: Hs00164004
TYR: Hs00165976
HOXA2: Hs00534579
＜予備試験１＞　支持細胞の存在下又は非存在下で維持培養した多能性幹細胞の神経細胞への分化誘導
　ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）又はヒトｉＰＳ細胞株（ｈｉＰＳＣ）を、支持細胞の存在下（ｏｎ　ｆｅｅｄｅｒ）又は非存在下（ｆｅｅｄｅｒ－ｆｒｅｅ）で神経細胞へ分化誘導し、生じた球状の細胞凝集体を解析し、大脳オルガノイドへの分化誘導の効率を比較した。
　ヒトＥＳであるＫｈＥＳ－１及びＫｈＥＳ－２は、京都大学再生医科学研究所より入手し、ヒトｉＰＳ細胞株である２０１Ｂ７細胞、１２３１Ａ３細胞及びＦｆ－Ｉ０１ｓ０４細胞は京都大学より入手した。
　ｏｎ　ｆｅｅｄｅｒの場合、支持細胞として、マウス胎児由来線維芽細胞（Mouse embryonic fibroblast；ＭＥＦ、オリエンタル酵母）を用いた。ＫｈＥＳ－１などの各種幹細胞株を、９０ｍｍディッシュ１枚当たり１．２×１０６細胞の密度で播種し、ＭＥＦの存在下において、１％（ｖ／ｖ）ＮＥＡＡ、１％（ｖ／ｖ）Ｌ－Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、１％（ｖ／ｖ）２－Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、２０％（ｖ／ｖ）ＫＳＲを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に、５ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを添加した培地で、３７℃、５％ＣＯ２で３～７日間培養した。ｆｅｅｄｅｒ－ｆｒｅｅの場合、各種幹細胞株を、マトリクスとしてｉＭａｔｒｉｘ－５１１（ニッピ社製）でコーディングした６ウェルプレート上でＳｔｅｍＦｉｔ（味の素ヘルシーサプライ社製）にて３７℃、５％ＣＯ２で７日間維持培養した。
　維持培養後の細胞は、非特許文献１に記載の方法に一部変更を加えた方法にて大脳オルガノイドへ分化誘導した。分化開始時には、各種多能性幹細胞を０．５×ＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔで処理し、単細胞に分散した。その後、５０μＭのＹ－２７６３２（富士フィルム和光純薬）を添加した分化培地（後述）に置換し、非細胞吸着性のＶ底９６ウェルプレート（住友ベークライト）に９，０００細胞／ウェルになるよう播種した。分化培地は、２０％（ｖ／ｖ）ＫＳＲ、５μＭ　ＳＢ４３１５４２（ＴＧＦβ阻害剤；ＴＯＣＲＩＳ）、及び３μＭ　ＩＷＲ１ｅ（Ｗｎｔ阻害剤；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ－１２　ＧｌｕｔａＭＡＸ培地（Ｇｉｂｃｏ）であった。分化３日目から１５日目までは、分化培地を用いて、３日おきに半量培地交換を実施した。１８日目に、凝集した細胞を９０ｍｍの浮遊培養用ディッシュ（住友ベークライト）に移し、分化誘導開始後３５日目（Ｄａｙ３５）まで、１％（ｖ／ｖ）Ｎ２－ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ）、１％（ｖ／ｖ）Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ　ｄｅｆｉｎｅｄ　ｌｉｐｉｄ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ（ＣＤＬＣ；　Ｇｉｂｃｏ）、０．２５μｇ／ｍｌ　Ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ　Ｂ（Ｇｉｂｃｏ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ／Ｆ－１２　ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｇｉｂｃｏ）でさらに培養した。Ｄａｙ３５まで、３日おきに全量培地交換を実施した。
　分化誘導後３３～３５日目（Ｄａｙ３３～３５）に得られた球状細胞凝集体中、大脳オルガノイドの数割合が約５％以上の場合に“大脳オルガノイドを形成（ｇｏｏｄ　ｏｒｇａｎｏｉｄ）”、５％未満の場合に“大脳オルガノイド未形成（ｂａｄ　ｏｒｇａｎｏｉｄ）”と判定した。ｇｏｏｄ　ｏｒｇａｎｏｉｄの例は図１の（Ａ）（２０１Ｂ７株）に示しており、ｂａｄ　ｏｒｇａｎｏｉｄの例は図１の（Ｂ）（Ｆｆ－Ｉ０１ｓ０４株）に示した。（Ａ）中の矢印は、ロゼット構造を示す。各細胞株の結果を下記表１に纏めた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表中の数字は、分母は分化誘導を行った実験回数を表し、分子は大脳オルガノイドを形成した回数を表す。例えば、“１／３”は、３回分化誘導を行い、大脳オルガノイドを形成したのが１回だったことを表す。いずれのＥＳ又はｉＰＳ細胞株でも、ｆｅｅｄｅｒ－ｆｒｅｅの場合は、ｏｎ　ｆｅｅｄｅｒの場合よりも大脳オルガノイドの形成効率が低下したことを確認した。
＜予備試験２＞　遺伝子発現の解析
　予備試験１と同様にＫｈＥＳ－１、２０１Ｂ７、Ｆｆ－Ｉ０１ｓ０４及び１２３１Ａ３細胞株を、ｏｎ　ｆｅｅｄｅｒ、ｆｅｅｄｅｒ－ｆｒｅｅ、及び、ｆｅｅｄｅｒ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ　ｍｅｄｉｕｍの３条件で培養し、分化誘導した。ｆｅｅｄｅｒ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ　ｍｅｄｉｕｍの条件は、ＭＥＦを、１％（ｖ／ｖ）ＮＥＡＡ、１％（ｖ／ｖ）Ｌ－Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、１％（ｖ／ｖ）２－Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、２０％（ｖ／ｖ）ＫＳＲを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で２４時間培養して培地上清を回収し、フィルトレーションして、フィーダーフリーの細胞の培養に用いた。得られたこれらの細胞における、培養後分化誘導前及び分化誘導後の、ＦＧＦ２及びＴＧＦβ経路関連遺伝子（ＦＧＦ２、ＬＥＦＴＹ、ＮＯＤＡＬ、ＴＧＦβ１、Ａｃｔｉｖｉｎ）の発現をマイクロアレイで解析した。
　マイクロアレイ解析は、ｏｎ　ｆｅｅｄｅｒ、ｆｅｅｄｅｒ－ｆｒｅｅ、ＭＥＦ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ　ｍｅｄｉｕｍの３条件で培養した４種類のｉＰＳ細胞株（ＫｈＥＳ１、２０１Ｂ７、１２３１Ａ３、Ｆｆ－Ｉ０１ｓ０４）から、ＴａＫａＲａのＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ　ＲＮＡ　Ｐｌｕｓ　ＸＳを用いて、既定のプロトコルに従い、ＲＮＡを抽出し、Ｃｌａｒｉｏｍ　Ｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）マイクロアレイを用いて遺伝子発現解析を行った。遺伝子発現量の解析は、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ　ｖｉｅｗｅｒ（クラボウ）を用いて実施した。
　解析結果は図２に示す。図２の（Ａ）は培養後分化誘導前の結果であり、４種の細胞株について、ｏｎ　ｆｅｅｄｅｒで培養した群（横軸）又はｆｅｅｄｅｒ－ｆｒｅｅで培養した群（縦軸）について、遺伝子発現をマイクロアレイを用いて比較解析した結果を示す（ｎは、細胞株の種類を意味する）。ｏｎ　ｆｅｅｄｅｒ培養群はｆｅｅｄｅｒ－ｆｒｅｅ培養群と比べて、ＦＧＦ２とＴＧＦβ経路関連遺伝子（ＦＧＦ２、ＬＥＦＴＹ、ＮＯＤＡＬ、ＴＧＦβ１、Ａｃｔｉｖｉｎ）の発現が２倍以上高値であった。
　図２の（Ｂ）は、これらの細胞株を予備試験１にしたがって、４種類の細胞株を用いて、ｏｎ　ｆｅｅｄｅｒ、ｆｅｅｄｅｒ－ｆｒｅｅ、及び、ｆｅｅｄｅｒ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ　ｍｅｄｉｕｍの３条件のｉＰＳ細胞を分化誘導し、大脳オルガノイドを形成した条件（ｇｏｏｄ　ｏｒｇａｎｏｉｄ；横軸）と形成しなかった条件（ｂａｄ　ｏｒｇａｎｏｉｄ；縦軸）に分け、２群間の遺伝子発現を比較解析した結果を示す（ｎは、大脳オルガノイドの形成効率が高かった条件数を意味する）。大脳オルガノイドを形成した群では、形成しなかった群と比べて、ＦＧＦ２及びＴＧＦβ経路関連遺伝子（ＦＧＦ２、ＬＥＦＴＹ、ＮＯＤＡＬ、ＴＧＦβ１、Ａｃｔｉｖｉｎの発現が高値であった。ｏｎ　ｆｅｅｄｅｒで維持培養、及び大脳オルガノイドの形成効率が高かった未分化幹細胞では、内在性のｂＦＧＦ、ＴＧＦβ関連遺伝子の発現が高いことが分かった。すなわち、大脳オルガノイドを形成しやすいＥＳ／ｉＰＳ細胞及び培養条件では、多能性幹細胞内のｂＦＧＦ及びＴＧＦβ関連遺伝子の発現レベルが高いことが明らかになった。
　知られているヒト多能性幹細胞用維持培地の組成を下記表２に示す。ｆｅｅｄｅｒ－ｆｒｅｅ用の維持培地には通常、高濃度のｂＦＧＦとＴＧＦβが添加されることがわかる。これらの培地で培養したＥＳ／ｉＰＳ細胞では、ｏｎ　ｆｅｅｄｅｒで培養した場合と比べて、ｂＦＧＦ及びＴＧＦβ関連遺伝子の発現が低くなることが示唆された。よって、ｂＦＧＦ及びＴＧＦβ関連遺伝子の発現量の差が大脳オルガノイド形成効率の差の原因となっている可能性が考えられた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　そこで、本発明者らは、ＥＳ／ｉＰＳ細胞をさまざまな化合物の存在下で培養し、その後神経細胞への分化誘導を行い、大脳オルガノイドの形成効率を解析することで、形成効率に影響し得る化合物を探索した。その結果、意外にも、ｉＰＳ細胞を「ｂＦＧＦを含まず、かつ、ＴＧＦβを含まない又はＴＧＦβシグナル伝達阻害剤を添加した培地」で培養して（工程（１））から神経細胞へ分化誘導する（工程（２））と、大脳オルガノイドの形成効率が顕著に上がることを見出した。
＜実施例１＞　工程（１）のオルガノイド形成効率への影響
１－１．工程（１）の維持培地について
　図３又は図５に示すスキームにしたがって、工程（１）及び工程（２）を行った。ヒトｉＰＳ細胞（Ｓ２ＷＣＢ１株、Ｓ２ＷＣＢ３株）の維持培養は、ｉＭａｔｒｉｘ－５１１でコーティングした６ウェルプレート上（フィーダーフリー）、ＳｔｅｍＦｉｔ培地中で行った。
　培地を、
（１）ＳｔｅｍＦｉｔのＣ液非添加培地（すなわち、ｂＦＧＦ不含培地）に５μＭ　ＳＢ４３１５４２を添加したもの（図３）、又は、
（２）Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　６培地（すなわち、ｂＦＧＦ不含、ＴＧＦβ不含培地）（図５）
に交換し、１日間接着培養した。
　工程（２ａ）Sakaguchiら（Stem Cell Reports, 13:458-473, 2019. doi: 10.1016/j.stemcr.2019.05.029.）の方法を用いて、無血清培地中で神経細胞へ分化誘導した。具体的には、工程（１）で培養したヒトｉＰＳ細胞を酵素処理により単細胞に分散させた。単細胞に分散されたヒトｉＰＳ細胞を、非細胞接着性の９６穴培養プレート（ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ　９６Ｖ底プレート、住友ベークライト社製）に播種し（９，０００細胞／ウェル／１００μＬ）、０．１ｍＭ　ｎｏｎ－ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ、１ｍＭ　ｐｙｒｕｖａｔｅ、０．１ｍＭ　２－ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、２０％（ｖ／ｖ）ＫｎｏｃｋＯｕｔ（商標）ｓｅｒｕｍ　ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加したＧｌａｓｇｏｗ　ＭＥＭ（ＧＭＥＭ；Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ）培地（以下、２０ＧＭＫとも呼ぶ）に、さらに、５μＭ　ＳＢ４３１５４２（ＴＧＦβシグナル阻害剤；Ｔｏｃｒｉｓ）、３μＭ　ＩＷＲ１ｅ（Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を添加した培地中で、３７℃、５％ＣＯ２で１８日間、浮遊培養した。培地交換は３日ごとに行った。Ｄａｙ０でＹ－２７６３２を５０μＭとなるように添加し、以降の培地交換の際には添加しなかった。培養後に細胞塊が得られた。
　工程（２ｂ）Ｄａｙ１８に、得られた細胞塊を９０ｍｍディッシュに移し、１×Ｎ２　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ）、Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ　Ｄｅｆｉｎｅｄ　Ｌｉｐｉｄ　Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏ－ｇｅｎ）、０．２５ｍｇ／ｍＬ　ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ（Ｇｉｂｃｏ）、１％ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ、０．１％Ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ　Ｂを添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２／ＧｌｕｔａＭＡＸ培地中で、３７℃、２０％Ｏ２、５％ＣＯ２で、Ｄａｙ３５～Ｄａｙ４２までＯｒｂｉｔａｌ　Ｓｈａｋｅｒによる振とう培養を行った。培地交換は３～４日ごとに実施した。
　Ｄａｙ３５の細胞培養物について、倒立顕微鏡にて観察し、代表的な画像を図４の（Ａ）に示す。また、細胞培養物について、各マーカー（Ｌ１ＣＡＭ、ＣＴＩＰ２、ＰＡＸ６）に対して蛍光免疫染色を行った。蛍光免疫染色は、上記の１次抗体及びそれらに対応する蛍光標識された２次抗体を使用した。また、ＤＡＰＩにて核染色を行った。代表的な蛍光染色画像（共焦点蛍光顕微鏡画像）は、図４の（Ｂ）に示す。
　また、大脳オルガノイドの形成効率（％）は、以下の式で計算した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000003
　工程（１）において、ＳＢ４３１５４２（以下ＳＢと称する場合がある。）を添加した、ｂＦＧＦ不含有ＳｔｅｍＦｉｔ培地での維持培養（ＳｔｅｍＦｉｔ　－ｂＦＧＦ　＋ＳＢ）の場合、複数の明確なロゼット構造を有する細胞塊（（Ｂ）の一番右）を確認できた。大脳皮質様構造の内側にはＰａｘ６陽性の神経前駆細胞層（放射状グリア細胞）が局在し、外側にはＣｔｉｐ２とＬ１ＣＡＭを発現する神経細胞層が見られた。また、ｂＦＧＦ不含有培地（「ＳｔｅｍＦｉｔ　－ｂＦＧＦ」又は「ＳｔｅｍＦｉｔ　－ｂＦＧＦ　＋ＳＢ」）での維持培養（工程（１））を行うと、大脳オルガノイドの形成効率（「ＳｔｅｍＦｉｔ　－ｂＦＧＦ」の場合は＜１０％、「ＳｔｅｍＦｉｔ　－ｂＦＧＦ　＋ＳＢ」の場合は約４０％～５０％）が、ｂＦＧＦ含有培地での維持培養（ＳｔｅｍＦｉｔ、＜１％）に比べて顕著に上昇した。
　工程（１）において、培地として、ＳＢ４３１５４２添加したＥｓｓｅｎｔｉａｌ　６（Ｅ６）培地を用いて維持培養して、上記と同様に分化誘導した。上記と同様に免疫染色し、代表的な細胞塊の共焦点蛍光顕微鏡画像を図６に示す。図６から分かるように、ＳＢ４３１５４２を添加したＥ６培地を用いた場合において、ＳＢ４３１５４２を添加したＳｔｅｍＦｉｔ培地と同様に、大脳オルガノイドが得られた。また、大脳オルガノイドの形成効率（％）＝（２２／３９）×１００％＝５６．９％であった。
１－２．工程（１）の維持培地の添加剤について
　図３のスキームの工程（１）において、－Ｄａｙ１～Ｄａｙ０の期間に下記添加剤を添加した培地で培養し、Ｄａｙ０で神経細胞に分化誘導し、Ｄａｙ３５で大脳オルガノイドの形成効率を評価した。免疫染色の結果を図７に示し、大脳オルガノイドの形成効率を表３に示す。なお、図７中の「無し」は添加剤なしを意味する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　ｂＦＧＦ含有培地を使用した実験群では、添加剤の種類に依らず、大脳オルガノイド形成効率が低かった。ＳＢ４３１５４２を添加した群でも、５％未満という低値だった（Ｅｘｐ．Ｃ）。これに対し、ｂＦＧＦ不含有培地を使用した群では、ＳＢ４３１５４２を添加した群でのみ、ロゼット構造を多数有する大脳オルガノイドが高効率で得られた（Ｅｘｐ．Ｄ）。ＩＷＲ１ｅを添加した群では、神経上皮と神経細胞は生じているものの大脳皮質様構造を形成していない、異常な細胞培養物（Ｅｘｐ．Ｆ）が認められた。Ｅｘｐ．Ｄで観察された大脳皮質様構造の内側には、Ｐａｘ６陽性の神経前駆細胞層（放射状グリア細胞）が局在し、外側にはＣｔｉｐ２とＬ１ＣＡＭを発現する神経細胞層が見られた。
　実施例１の結果より、ヒト多能性幹細胞を「ｂＦＧＦを含まず、かつ、ＴＧＦβを含まない又はＴＧＦβシグナル伝達阻害剤を添加した培地」で培養してから神経細胞に分化誘導すると、大脳オルガノイドの形成効率が顕著に上がることが示された。よって、多能性幹細胞を、「ｂＦＧＦを実質的に含まず、かつ、ＴＧＦβシグナルを実質的に惹起しない培養液」中で培養してから神経細胞に分化誘導すると、大脳オルガノイドの形成効率が顕著に上がることが明らかになった。
＜実施例２＞　工程（１）の培養期間
　実施例１で（１）ＳｔｅｍＦｉｔのＣ液非添加培地に５μＭ　ＳＢ４３１５４２を添加した「ｂＦＧＦ不含・ＳＢ４３１５４２添加培地」を使用する実験系において、「ｂＦＧＦ不含・ＳＢ４３１５４２添加培地」でｉＰＳ細胞を培養する期間を下表の通りに行った。図８はＤａｙ１８、Ｄａｙ２７、Ｄａｙ３４の培養物の代表的な明視野像を示す。図９はＤａｙ３５における大脳オルガノイドの形成効率を解析した結果を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　図８及び図９に示す通り、「ｂＦＧＦ不含・ＳＢ４３１５４２添加培地」での処理は１日間若しくは２日間の場合は、大脳オルガノイドの形成効率が３０％～４０％程度であったが、３日間以上の場合は大脳オルガノイドの形成がほとんど見られなかった。「ｂＦＧＦ不含・ＳＢ４３１５４２添加培地」で６日間処理した条件では、ｉＰＳ細胞の増殖が著しく低下し、分化誘導に十分な細胞数を得ることができなかった。したがって、工程（１）の培養期間は、好ましくは３日間未満であり、さらに好ましくは１２時間以上２日間以下、最も好ましくは１日間程度であることが明らかになった。
＜実施例３＞　工程（１）の遺伝子発現への影響
　実施例１で（１）ＳｔｅｍＦｉｔのＣ液非添加培地に５μＭ　ＳＢ４３１５４２を添加した「ｂＦＧＦ不含・ＳＢ４３１５４２添加培地」を使用する実験系において、Ｄａｙ０におけるヒトｉＰＳ細胞（Ｓ２ＷＣＢ１）の遺伝子発現解析を行った。Ｃｏｎｔｒｏｌは、通常の維持培地であるＳｔｅｍＦｉｔ培地（ｂＦＧＦ含有培地）で培養したｉＰＳ細胞であった。
　３回の分化誘導で得られたオルガノイドにおいて、各種マーカー遺伝子の発現をＲＴ－ｑＰＣＲで解析した。遺伝子解析の結果を図１０に示す。各点は、各回のサンプルを表し、通常の維持培地であるＳｔｅｍＦｉｔ培地（ｂＦＧＦ含有培地）で培養したｉＰＳ細胞から分化誘導したオルガノイド（Ｃｏｎｔｒｏｌ）を黒丸で、ＳｔｅｍＦｉｔ（－ｂＦＧＦ、＋ＴＧＦβ阻害剤）で培養した後に分化誘導したオルガノイドを白丸で示す。縦軸は、ΔΔＣｔ法により、ＧＡＰＤＨと、Ｃｏｎｔｒｏｌのうち１ロットに対し補正した相対発現量を表す。図中の「TGFβi」は、ＴＧＦβ阻害剤（ＴＧＦβinhibitor）を意味する。
　図１０から、工程（１）（１日間）を経たｉＰＳ細胞（白丸）では、Ｃｏｎｔｒｏｌ（黒丸）と比べて、未分化マーカー（ＰＯＵ５Ｆ１、ＮＡＮＯＧ）の発現量は低く、神経外胚葉マーカー（ＳＯＸ１、ＰＡＸ６）、中胚葉マーカー（ＴＢＸＴ）、及び、内胚葉マーカー（ＳＯＸ１７）の発現量は高かったことが分かった。図中「Ｔ」はＴＢＸＴ（別名ＢＲＡＣＨＹＵＲＹ）を表す。
　よって、工程（１）により、ｉＰＳ細胞が、三胚葉に分化しやすい状態に変化する可能性が示唆された。すなわち、多能性幹細胞を、「ｂＦＧＦを実質的に含まず、かつ、ＴＧＦβシグナルを実質的に惹起しない培養液」中で適切な期間培養すると、三胚葉に分化しやすい状態に向かうことが示唆された。
＜実施例４＞工程（２）の工程（ｉｉ）－（ｉｖ）の効果１：Ｖ／ＶＩ層の神経細胞の増加と増殖性細胞の減少
４－１．分散及び再凝集あり
　－Ｄａｙ７～Ｄａｙ３５までは、実施例１と同じ方法で培養した。工程（１）には、（１）ＳｔｅｍＦｉｔのＣ液非添加培地（ｂＦＧＦ不含培地）に５μＭ　ＳＢ４３１５４２を添加したものを使用した。
　図１１の（Ａ）に示すスキームのとおり、工程（ｉｉ）において、分化誘導開始後３３日目（Ｄａｙ３３）に大脳オルガノイドを選別し、培地を工程（２ｂ）の培地に１０μＭ　ＤＡＰＴを添加したものに置換して、３７℃、５％ＣＯ２下で３日間浮遊培養した。これにより、大脳皮質細胞塊が得られた。
　工程（ｉｉｉ）において、上記工程工程（ｉｉ）で得られた大脳皮質細胞塊を、０．５×ＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔ、０．２５ｍＭ　ＥＤＴＡ溶液中で３７℃、２０分間インキュベートし、さらに、工程（２ｂ）の培地に２５Ｕ／ｍＬ　ＤＮａｓｅ　Ｉを添加した溶液中で３７℃、１０分間インキュベートした。その後、ピペッティングを行って単細胞に分散させたのち、分散された細胞を、工程（２ｂ）の培地に１０ｎｇ／ｍＬ　ＧＤＮＦ、２０ｎｇ／ｍＬ　ＢＤＮＦ、２００μＭ　アスコルビン酸、４００μＭ　ｄｉｂｕｔｙｒｙｌ－ｃＡＭＰ、５０μＭ　Ｙ－２７６３２を添加した培地に懸濁した。
　工程（ｉｖ）において、工程（ｉｉｉ）で得られた細胞懸濁液を、非細胞接着９６ウェルプレートに３万細胞／ウェルで分注し、３７℃、５％ＣＯ２下で４日間浮遊培養した。これにより、高純度大脳皮質細胞塊が得られた。大脳皮質細胞塊（Ｄａｙ３６）、高純度大脳皮質細胞塊（Ｄａｙ４０）の明視野像を図１１の（Ｂ）に示す。
　大脳皮質細胞塊（Ｄａｙ３６）及び高純度大脳皮質細胞塊（Ｄａｙ４０）については、さらに皮質Ｖ／ＶＩ層前駆細胞（Ｄｅｅｐ　Ｌａｙｅｒ）マーカーであるＣｔｉｐ２、終脳マーカーであるＦｏｘｇ１、神経幹細胞（Ｒａｄｉａｌ　Ｇｌｉａ）マーカーであるＰａｘ６／Ｋｉ６７、及び、増殖性細胞マーカーであるＫｉ６７に対して免疫染色を行った。
　免疫染色の代表的な共焦点蛍光顕微鏡画像を図１２に示す。図１２の（Ａ）の上段はＤＡＰＴなしのＤａｙ３６の大脳皮質細胞塊、下段はＤＡＰＴありのＤａｙ３６の大脳皮質細胞塊（いずれも工程（ｉ）－（ｉｉ）を経て得られたもの）の免疫染色画像を示し、図１２の（Ｂ）は、Ｄａｙ４０の高純度大脳皮質細胞塊の（工程（ｉ）－（ｉｖ）を経て得られたもの）免疫染色画像を示す。
　ＤＡＰＴ処理を行わずにＤａｙ３６まで培養した群（（Ａ）の上段）では、大脳オルガノイドの特徴であるＰａｘ６・Ｋｉ６７陽性の神経幹細胞（Ｒａｄｉａｌ　Ｇｌｉａ）層とその外側にＣｔｉｐ２・Ｆｏｘｇ１二重陽性の皮質第Ｖ／ＶＩ層の神経細胞層を備えた大脳皮質様の層構造が多数確認されこれに対し、ＤＡＰＴ処理を行った群（（Ａ）の下段）では、Ｐａｘ６陽性細胞は認められるもののＫｉ６７の発現は殆ど認められず、大脳皮質様の層構造は認められなかった。一方、Ｃｔｉｐ２・Ｆｏｘｇ１陽性細胞は細胞塊全体に認められた。よって、大脳皮質細胞塊では、大脳皮質様の層構造が消失し、Ｃｔｉｐ２・Ｆｏｘｇ１二重陽性の皮質第Ｖ／ＶＩ層の神経細胞が内部に広く分布していることが明らかになった。
　さらに、大脳皮質細胞塊を単細胞に分散して再凝集させて得られる高純度大脳皮質細胞塊（図１２の（Ｂ））では、Ｃｔｉｐ２・Ｆｏｘｇ１二重陽性の皮質第Ｖ／ＶＩ層の神経細胞が内部全体に認められ、Ｐａｘ６陽性細胞は一段と少なかった。
４－２．分散及び再凝集なし
　次に、ＤＡＰＴ処理直後（工程（ｉｉ）を経た直後）の細胞培養物について、フローサイトメトリーを用いて構成細胞の割合を解析した。分化誘導スキームを図１３に示す。Ｄａｙ４０の大脳オルガノイドに対してＤＡＰＴ処理を３日間行った後、フローサイトメトリーでマーカー遺伝子の発現を解析した。
　フローサイトメトリーによる皮質Ｖ／ＶＩ層前駆細胞（Ｄｅｅｐ　Ｌａｙｅｒ）マーカーであるＣｔｉｐ２、神経細胞マーカーであるβＩＩＩ－Ｔｕｂｕｌｉｎ(βＴｕｂＩＩＩ)、神経幹細胞（Ｒａｄｉａｌ　Ｇｌｉａ）マーカーであるＰａｘ６／Ｓｏｘ１／Ｋｉ６７、増殖性細胞マーカーであるＫｉ６７の発現解析結果を図１４に示す。
　図１４中の各点は細胞を表す。左と中心のパネルは、生細胞全てを表示した結果、右のパネルはＫｉ６７陽性の細胞のみを表示した結果である。Ｃｔｉｐ２・βＩＩＩ－Ｔｕｂｕｌｉｎ二重陽性細胞の割合（左パネル）は、ＤＡＰＴ非処理群（上段）では３６．４％だったが、ＤＡＰＴ処理群（下段）では８６．１％にまで増加していた。これに対し、Ｐａｘ６・Ｋｉ６７二重陽性の神経幹細胞（Ｒａｄｉａｌ　Ｇｌｉａ）の割合（中パネル）は、ＤＡＰＴ非処理群（上段）では４６．７％だったが、ＤＡＰＴ処理群（下段）では１．５％にまで減少していた。さらに、増殖性細胞であるＰａｘ６陽性／Ｓｏｘ１陽性／Ｋｉ６７陽性細胞（右パネル）の割合は、ＤＡＰＴ非処理群（上段）は０．６８％だったがＤＡＰＴ処理群（下段）では０．０１％にまで減少した。
　よって、大脳オルガノイドをＮｏｔｃｈシグナル阻害剤であるＤＡＰＴの存在下で培養すると、大脳皮質様構造が消失し、増殖性細胞が大幅に減少する一方で、神経細胞（特に、皮質第Ｖ／ＶＩ層の神経細胞）が増加することが明らかになった。
　さらに、Ｄａｙ０のｉＰＳ細胞（未分化のｉＰＳ細胞）、ＤＡＰＴ処理未実施のオルガノイド（Ｃｔｒｌ、工程（ｉｉ）なし）、ＤＡＰＴ処理を３日間（Ｄａｙ４０－４３）実施したオルガノイド（ＤＡＰＴ３ｄ、工程（ｉｉ）あり）、及び、ＤＡＰＴ処理を３日間実施後に細胞を分散させることなく、細胞塊のままＤＡＰＴを除いた培地で４日間培養を継続したオルガノイド（ＤＡＰＴ３ｄ＋Ｒｅｌｅａｓｅ４ｄ、工程（ｉｉ）及び（ｉｖ）あり、工程（ｉｉｉ）なし）について、それぞれをフローサイトメトリーで解析し、その結果を図１５に示す。
　図１５中、左から１～４列目のパネルは生細胞全てを表示した結果であり、一番右のパネルはＫｉ６７陽性の細胞のみを表示した結果である。未分化ｉＰＳ細胞の指標であるＴｒａ２－４９／６ＥとＯｃｔ４の共発現細胞は、オルガノイドではいずれの条件でも検出されなかった（左から１列目）。Ｃｔｉｐ２とβＩＩＩ－Ｔｕｂｕｌｉｎ共陽性の細胞は、「Ｃｔｒｌ」（上から２段目）では３６．４％であったのに対し、「ＤＡＰＴ３ｄ」（上から３段目）では８６．１％に、「ＤＡＰＴ３ｄ＋Ｒｅｌｅａｓｅ４ｄ」（最下段）では８７．４％に上昇した（左から２列目）。また、Ｋｉ６７、Ｓｏｘ１、Ｐａｘ６三重陽性細胞は、「Ｃｔｒｌ」では０．６８％であったのに対し、「ＤＡＰＴ３ｄ」では０．０１％に、「ＤＡＰＴ３ｄ＋Ｒｅｌｅａｓｅ４ｄ」では、０％に減少した（右から１列目）。「ＤＡＰＴ　３ｄ＋Ｒｅｌｅａｓｅ　４ｄ」では「ＤＡＰＴ　３ｄ」よりもさらにＰａｘ６陽性・Ｓｏｘ１陽性・Ｋｉ６７三重陽性細胞の割合が減少しており、ＤＡＰＴ処理後に細胞凝集体のまま培養するだけでも増殖性細胞を減少させられることが分かった。
　４－３．オルガノイドＤＡＰＴ法及びシングルセルＤＡＰＴ法（２）
　ＤＡＰＴ処理期間が分化に与える影響を解析するため、図１６（Ａ）の示す方法スキーム（オルガノイドＤＡＰＴ法）に従って、分化誘導７週目の大脳オルガノイドを１０μＭのＤＡＰＴで３～７日間処理し、遺伝子発現の変化をＲＴ－ｑＰＣＲで解析し、その結果を図１６（Ｂ）に示す。縦軸は、ＧＡＰＤＨに対する相対発現量を表す。
　図１６（Ｂ）から、ＤＡＰＴ処理期間が長くなるほど成熟が進み、増殖性細胞が減少していたことが分かった。ＤＡＰＴ処理期間に従い、皮質Ｖ／ＶＩ層前駆細胞のマーカーである、Ｃｔｉｐ２の発現は上昇した。一方、神経前駆細胞（放射状グリア細胞）のマーカーである、Ｐａｘ６、Ｓｏｘ２、Ｋｉ６７の発現は、ＤＡＰＴ処理期間に伴って低下した。以上より、ＤＡＰＴ処理に伴って神経の分化成熟が進み、増殖性細胞の割合が低下することが明らかとなった。
＜実施例５＞工程（ｉｉ）を行う時期の検討
　図１７の（Ａ）は分化誘導のスキームを示す。Ｄａｙ２５、Ｄａｙ３２、Ｄａｙ３９、及びＤａｙ７２（それぞれの分化誘導期間は、凡そ４週間、５週間、６週間、１０週間）のオルガノイドを３日間ＤＡＰＴ存在下・非存在下で培養し、Ｄａｙ２８（４ｗｋ）、Ｄａｙ４２（６ｗｋ）、及びＤａｙ７５（１０ｗｋ）のオルガノイドを各種マーカーに対して免疫染色で解析した。免疫染色の結果（共焦点蛍光顕微鏡画像）を図１７の（Ｂ）に示す。なお、Ｓａｔｂ２は、皮質ＩＩ－ＩＶ層前駆細胞（Ｕｐｐｅｒ　Ｌａｙｅｒ）マーカーである。図１７の（Ｂ）から、４週間から６週間のオルガノイドにおいて、ＤＡＰＴ非存在下では、Ｃｔｉｐ２、Ｂｆ１共陽性細胞とＫｉ６７陽性細胞からなるロゼット構造が認められるが、ＤＡＰＴ処理後にはロゼット構造が見られなくなり、Ｃｔｉｐ２、Ｂｆ１共陽性の細胞が増加し、Ｋｉ６７陽性の細胞が減少することが分かった。１０週のオルガノイドでは、ＤＡＰＴ処理後にロゼット構造は不明瞭になったが、Ｃｔｉｐ２陽性細胞、Ｓａｔｂ２陽性細胞の割合に顕著な変化は見られなかった。
　さらに、Ｄａｙ２５、Ｄａｙ３２、Ｄａｙ３９、及びＤａｙ７２（それぞれの分化誘導期間は、凡そ４週間、５週間、６週間、１０週間）のオルガノイドを３日間ＤＡＰＴ存在下・非存在下で培養し、Ｄａｙ２８（４ｗｋ）、Ｄａｙ３５（５ｗｋ）、Ｄａｙ４２（６ｗｋ）、及びＤａｙ７５（１０ｗｋ）の大脳オルガノイドに対してＲＴ－ｑＰＣＲでマーカー遺伝子の発現量を解析し、それぞれのマーカーの相対発現量の解析結果を図１８に示す。図１８から、４週間～６週間のオルガノイドではＤＡＰＴ処理後にＣｔｉｐ２の発現上昇傾向、及び、Ｐａｘ６、Ｋｉ６７の発現低下が見られることが分かった。１０週間のオルガノイドでは、Ｋｉ６７の発現低下は見られず、Ｓａｔｂ２の発現にも影響が見られなかった。
　上記の結果から、工程（ｉｉ）の開始時期は、分化誘導開始から約２０～４４日後（Ｄａｙ２０～Ｄａｙ４４）が好ましく、さらに好ましくはＤａｙ２５～Ｄａｙ３９であることが明らかになった。また、工程（ｉｉ）の期間は、約２日間～４日間が好ましく、さらに約３日間前後（例えば、６０～８４時間）が好ましいことも明らかになった。
＜実施例６＞　工程（２）の工程（ｉｉ）－（ｉｖ）の効果２：移植片の増大抑制効果
　図１７の（Ａ）の分化誘導スキームで得られた大脳皮質細胞塊をＳｃｉｄマウス（日本クレア）の脳へ定位脳移植法によって１．５×１０５細胞を移植し、移植３か月後に、４％パラホルムアルデヒドによって脳を還流固定し、３５μｍ厚の凍結切片を作成した。作成した脳切片を用いて、Ｋｕ８０の免疫染色でヒト細胞の生着を評価した。免疫染色した移植片の代表的な共焦点蛍光顕微鏡画像を図１９に示す。
　さらに、染色した移植片の体積の解析結果を図２０に示す。移植片の体積は、免疫染色した脳切片を３５０μｍに１枚の間隔で観察し、各切片につき、Ｋｕ８０の染色像から移植片の面積を算出し、面積と切片の間隔を積算することによって算出した。Ｏｎｅ－ｗａｙ　ＡＮＯＶＡ　（Ｔｕｋｅｙ　Ｍｕｌｔｉｐｌｅ　Ｔｅｓｔ）により検定を実施した（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊ｐ＜０．０１）。
　図１９及び図２０から、分化誘導開始から約５週間後又は６週間後に工程（ｉｉ）を行って得られた大脳皮質細胞塊は、工程（ｉｉ）を行わずに得られた大脳皮質細胞塊と比べて、脳内に移植後の生着率が高く、さらに、体積の増加も非常に少ないことが示された。
　よって、多能性幹細胞から分化誘導した大脳オルガノイドを、ＤＡＰＴの存在下で培養した後、１以上の神経栄養因子、アスコルビン酸、及びｃＡＭＰ活性化剤を含む培養液中で培養することで形成される大脳皮質細胞塊は、脳内に移植後の生着率が高く、さらに増大しにくい（細胞増殖しにくい）ことが明らかになった。
　実施例１～６に基づき、本発明の好ましい実施形態の方法を図２１に示す。
　好ましい、支持細胞の非存在下で、多能性幹細胞から大脳オルガノイドを製造する方法は、下記の工程を含む。
工程（１）：多能性幹細胞を、ｂＦＧＦが実質的に含まれず、かつＴＧＦβシグナルを実質的に惹起しない培養液中で培養する工程、
工程（２）：工程（１）で得られた細胞を、大脳オルガノイドへと分化誘導する工程。
　工程（２）は以下の工程を含む。
工程（２ａ）：工程（１）で得られた細胞を、ＴＧＦβシグナル阻害剤、及びＷｎｔシグナル伝達阻害剤を含む培養液中で浮遊培養して、細胞塊を得る工程、
工程（２ｂ）：工程（２ａ）で得られた細胞塊を、ＴＧＦβシグナル阻害剤又はＷｎｔシグナル伝達阻害剤を実質的に含まない培養液中で浮遊培養して、大脳オルガノイドを得る工程。
　好ましい、支持細胞の非存在下で、多能性幹細胞から大脳皮質細胞塊、さらに高純度大脳皮質細胞塊を製造する方法は、下記の工程を含む。
工程（ｉ）：工程（２）を含む方法、又は、工程（１）及び工程（２）を含む方法により、大脳オルガノイドを得る工程、
工程（ｉｉ）：工程（ｉ）で得られた大脳オルガノイドを、Ｎｏｔｃｈシグナル阻害剤（ＤＡＰＴ等）を含む培養液中で培養して、大脳皮質細胞塊を得る工程、
工程（ｉｉｉ）：工程（ｉｉ）を経た細胞培養物を、単細胞又は２～５個の細胞の集合体（Ｃｅｌｌ　ｃｌｕｍｐ）にまで分散させる工程、
工程（ｉｖ）：工程（ｉｉｉ）で得られた細胞を、１以上の神経栄養因子、アスコルビン酸、及びｃＡＭＰ活性化剤を含む培養液中で培養して、高純度大脳皮質細胞塊を得る工程。
　なお、工程（ｉｉｉ）をスキップして、工程（ｉｉ）を経た細胞培養物を工程（ｉｖ）の培養液中で培養しても、高純度大脳皮質細胞塊を得ることができる。
＜実施例７＞　神経分化準備ありで誘導したオルガノイドに対するＤＡＰＴの効果の検討
　－Ｄａｙ７～Ｄａｙ３５までは、実施例１の図３のスキームと同じ方法で培養した。「神経分化準備あり」（工程（１）あり）では、工程（１）にＳｔｅｍＦｉｔのＣ液非添加培地（＝ｂＦＧＦ不含培地）に５μＭＳＢ４３１５４２を添加したものを使用し、「神経分化準備入なし」（工程（１）なし）では、ＳｔｅｍＦｉｔ培地を用いた。その後、実施例４の工程（ｉｉ）に記載の方法で大脳皮質細胞塊を誘導し、免疫染色で評価を行った。また、実施例４の工程（ｉｉｉ）、工程（ｉｖ）に記載の方法で単細胞に分散後、再凝集して、高密度大脳皮質細胞塊を誘導し、フローサイトメトリーで解析を行った。
　免疫染色の代表的な共焦点蛍光顕微鏡画像を図２２に示す。神経分化準備を行わなかった場合にも、低効率ではあったが、Ｐａｘ６陽性の神経上皮とその外側にＣｔｉｐ２陽性の皮質第Ｖ／ＶＩ層の神経細胞層を備えた大脳皮質様構造が形成された。このオルガノイドをＤＡＰＴ処理したところ、神経分化準備時と同様、Ｃｔｉｐ２陽性の細胞が細胞塊全体に見られるようになった。
　フローサイトメトリーの解析結果を図２３に示す。図２３から、神経分化準備なしの場合でも、Ｃｔｉｐ２・βＴｕｂＩＩＩ二重陽性細胞の割合（左パネル）は、ＤＡＰＴ処理により２２．５％から８５．９％にまで増加した。また、Ｐａｘ６・Ｋｉ６７二重陽性の神経幹細胞（Ｒａｄｉａｌ　Ｇｌｉａ）の割合（中パネル）は、ＤＡＰＴ処理により５９．５％から１．９％にまで減少した。さらに、増殖性細胞であるＰａｘ６陽性／Ｓｏｘ１陽性／Ｋｉ６７陽性細胞の割合（右パネル）は、ＤＡＰＴ処理により１４．５％から０％にまで減少した。
　よって、神経分化準備の有無にかかわらず、大脳皮質細胞塊では、大脳皮質様構造だけでなく神経上皮が消失し、Ｃｔｉｐ２・βＴｕｂＩＩＩ二重陽性の皮質第Ｖ／ＶＩ層の神経細胞が内部に広く分布すること、増殖性細胞は減少することが明らかとなった。すなわち、実施例７に基づいて、支持細胞の非存在下で、多能性幹細胞から大脳オルガノイドを製造する方法の上記工程（１）を省略しても、大脳皮質細胞塊及び高密度大脳皮質細胞塊を作製できることがわかった。
＜実施例８＞ＤＡＰＴ処理の時期及び方法の最適化検討
８－１．オルガノイドＤＡＰＴ法及びシングルセルＤＡＰＴ法（１）
　－Ｄａｙ７～Ｄａｙ３５までは、実施例１と同じ方法で培養した。工程（１）には、ＳｔｅｍＦｉｔのＣ液非添加培地（＝ｂＦＧＦ不含培地）に５μＭＳＢ４３１５４２を添加したものを使用した。
　図２４の（Ａ）「オルガノイドＤＡＰＴ法（工程（ｉｉ）でＤＡＰＴ処理を行う場合）」では、分化誘導開始後３５日目に大脳オルガノイドを選別し、培地を工程（２ｂ）の培地に１０μＭ　ＤＡＰＴを添加したものに置換して、３７℃、５％ＣＯ２下で３日間浮遊培養した。これにより得られた大脳皮質細胞塊を、実施例４における工程（ｉｉｉ）、工程（ｉｖ）に記載の方法で単細胞に分散後、再凝集して、高純度大脳皮質細胞塊が得られた。
　図２４の（Ｂ）「シングルセルＤＡＰＴ法（工程（ｉｖ）でＤＡＰＴ処理を行う場合）」では、分化誘導開始後３８日目に大脳オルガノイドを選別し、実施例４の工程（ｉｉｉ）に記載の方法で単細胞に分散させたのち、当該細胞を、工程（２ｂ）の培地に１０ｎｇ／ｍＬ　ＧＤＮＦ、２０ｎｇ／ｍＬ　ＢＤＮＦ、２００μＭ　Ａｓｃｏｒｂｉｃ　Ａｃｉｄ、４００μＭ　ｄｉｂｕｔｙｒｙｌ－ｃＡＭＰ、３０μＭ　Ｙ－２７６３２を添加した培地に、ＤＡＰＴを０μＭ、０．１μＭ、１μＭ、又は１０μＭの濃度で添加して懸濁した。次に、ＤＡＰＴ存在下において、実施例４の工程（ｉｖ）に記載の方法で再凝集して、１日間、２日間、又は３日間培養した。その後、培地を工程（２ｂ）の培地に１０ｎｇ／ｍＬ　ＧＤＮＦ、２０ｎｇ／ｍＬ　ＢＤＮＦ、２００μＭアスコルビン酸、４００μＭ　ｄｉｂｕｔｙｒｙｌ－ｃＡＭＰを添加した培地に切り替えて、再凝集開始から１０日目まで培養を継続した。再凝集開始から３日目、４日目、又は１０日目の細胞をＲＴ－ｑＰＣＲにより、１０日目の細胞をフローサイトメトリーにより、それぞれ解析し、結果を図２５～２７に示す。
　シングルセルＤＡＰＴ法（工程（ｉｖ）でＤＡＰＴ処理を行う方法）において、ＤＡＰＴ濃度を１０μＭ、ＤＡＰＴ処理期間を１日間、２日間、３日間としたときの、各マーカーの経時的遺伝子発現量をＲＴ－ｑＰＣＲで解析した際の結果を図２５に示す。図２５中、「ｄａｙ」は工程（ｉｖ）の日数を、「Ｃｏｎｃ．」はＤＡＰＴの濃度を、「Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ」はＤＡＰＴ処理の日数を表す。
　図２５から、Ｎｏｔｃｈシグナル下流で発現が活性化するＨｅｓ１は、ＤＡＰＴ処理直後には、ＤＡＰＴ処理期間にかかわらず発現低下したが、ＤＡＰＴ処理１日間、２日間の場合には、工程（ｉｖ）の培養に伴って発現が再度上昇したことが分かった。一方、ＤＡＰＴ処理３日間の場合には、Ｈｅｓ１の発現は１０日間にわたって抑制されていた。このとき、増殖性のマーカーであるＫｉ６７の発現、神経幹細胞のマーカーであるＰａｘ６の発現も低く抑えられていた。一方、神経成熟のマーカーであるＭａｐ２の発現や、皮質第Ｖ／ＶＩ層の神経細胞層のマーカーであるＣｔｉｐ２の発現は、工程（ｉｖ）の培養に伴って上昇した。したがって、少なくとも３日間ＤＡＰＴ処理を行うことにより、増殖性の神経幹細胞の増殖を抑えることができ、皮質第Ｖ／ＶＩ層の神経の割合が上昇することが分かった。
　シングルセルＤＡＰＴ法（工程（ｉｖ）でＤＡＰＴ処理を行う方法）において、ＤＡＰＴ濃度を０μＭ、０．１μＭ、１μＭ、１０μＭ、ＤＡＰＴ処理期間を３日間としたときの、各マーカーの経時的遺伝子発現量をＲＴ－ｑＰＣＲで解析した際の結果を図２６に示す。比較対象として、工程（ｉｉ）で、ＤＡＰＴ濃度１０μＭ、ＤＡＰＴ処理期間３日間で処理を行った場合も示す（オルガノイドＤＡＰＴ法）。図２６中、「ｄａｙ」は工程（ｉｖ）の日数を、「Ｃｏｎｃ．」はＤＡＰＴの濃度を表す。
　図２６から、Ｎｏｔｃｈシグナル下流で発現が活性化するＨｅｓ１は、ＤＡＰＴ処理濃度が０．１～１μＭでは十分に抑えられなかったのに対し、１０μＭでは１０日間にわたり抑制されたことが分かった。このとき、増殖性マーカーのＫｉ６７、神経幹細胞マーカーＰａｘ６の発現も、１０日間にわたり抑制された。一方、神経成熟のマーカーであるＭａｐ２の発現、皮質第Ｖ／ＶＩ層の神経細胞層のマーカーであるＣｔｉｐ２の発現は、工程（ｉｖ）の培養に伴って上昇した。したがって、工程（ｉｖ）でＤＡＰＴ処理を行った場合には、１０μＭで３日間ＤＡＰＴ処理を行うことにより、増殖性の神経幹細胞の増殖を抑えることができ、皮質第Ｖ／ＶＩ層の神経の割合が上昇すること、工程（ｉｉ）でＤＡＰＴ処理を行った場合に比べ、同等か、それ以上の効果を得られることが分かった。
　工程（ｉｖ）でＤＡＰＴ処理を行う場合において、ＤＡＰＴ濃度を０μＭ、０．１μＭ、１μＭ、１０μＭ、ＤＡＰＴ処理期間を３日間とし、工程（ｉｖ）で１０日間培養を行った際の、各マーカーの発現量をフローサイトメトリーで解析した際の結果を図２７示す。比較対象として、工程（ｉｉ）で、ＤＡＰＴ濃度１０μＭ、ＤＡＰＴ処理期間３日間で処理を行った場合も示す（オルガノイドＤＡＰＴ法）。
　図２７から、工程（ｉｖ）でＤＡＰＴ処理を行った場合の、Ｃｔｉｐ２・βＴｕｂＩＩＩ（Ｔｕｊ１）二重陽性細胞の割合（上段パネル）は、ＤＡＰＴ処理濃度の上昇に伴って、３２．２％から８９．６％にまで増加したことが分かった。また、増殖性細胞であるＰａｘ６陽性／Ｓｏｘ１陽性／Ｋｉ６７陽性細胞の割合（下段パネル）は、ＤＡＰＴ処理により、３５．０％から０．８％にまで減少した。よって、工程（ｉｖ）でＤＡＰＴ処理を行った場合にも、工程（ｉｉ）で行った場合と同様、ＤＡＰＴ処理濃度の上昇に伴って、Ｃｔｉｐ２・βＴｕｂＩＩＩ二重陽性の皮質第Ｖ／ＶＩ層の神経細胞の割合が上昇し、増殖性細胞は減少することが明らかとなった。
８－２．シングルセルＤＡＰＴ法（２）
　図２８に示す方法スキームに従って、分化誘導５週目の大脳オルガノイドを、工程（ＩＩ）で単細胞に分散後、工程（ＩＩＩ）で１０μＭのＤＡＰＴで３日間処理を行った。その後、ＤＡＰＴを含まない培地条件下において、４日間（ＤＡＰＴ除去後１日）及び１４日間（ＤＡＰＴ除去後１１日）培養を継続し、得られた細胞塊に対してフローサイトメトリーでマーカー発現を解析した。解析の結果を図２９に示す。
　ＤＡＰＴ処理後の培養期間を延長すると、Ｃｔｉｐ２／Ｔｕｊ１共陽性細胞の割合は上昇した（４段目の左パネル）。一方、増殖性神経前駆細胞のマーカーである、Ｐａｘ６、Ｋｉ６７二重陽性細胞の割合（４段目の中パネル）、及び、Ｐａｘ６、Ｋｉ６７、Ｓｏｘ１三重陽性細胞の割合（４段目の右パネル）は、ＤＡＰＴ処理後の培養期間に伴って低下した。図１６（Ｂ）及び図２９より、ＤＡＰＴ処理後の培養期間に伴って、神経の分化成熟が進み、増殖性細胞の割合が低下することが明らかとなった。
＜実施例９＞オルガノイドの形態及び発現プロファイルの解析
９－１．オルガノイドの形態解析
　－Ｄａｙ７～Ｄａｙ３５まで実施例１と同じ方法で培養した。１２回の誘導分化ロット（Ｌｏｔ１～Ｌｏｔ１２）で得られた大脳オルガノイドの明視野像を倒立顕微鏡（Ｌｅｉｃａ　ＤＭＳ１０００）を用いて撮影し、代表的な明視野像を図３０に示す（スケールバー：５ｍｍ）。図３０から、ロットによって、誘導されるオルガノイドの形態に違いがあったことが分かった。
　上記１２回の分化誘導で得られた大脳オルガノイドを観察した結果、７つの形態学的なグループ、すなわち、ロゼット構造を細胞塊全体に含む大脳オルガノイド（ロゼット構造；Ｒｏｓｅｔｔｅ）、透明度が低く明瞭な構造が認められないオルガノイド（じゃがいも状組織；Ｐｏｔａｔｏ－ｌｉｋｅ）、風船状の構造が付随したオルガノイド（風船状組織；Ｂａｌｌｏｏｎ）、繊維状の構造が付随したオルガノイド（綿状組織；Ｃｏｔｔｏｎ－ｌｉｋｅ）、透明度が高く、内部に嚢胞状の構造が見られるオルガノイド（透明性組織；Ｔｒａｎｓｐａｒｅｎｔ）、黒色又は茶色の色素沈着が見られるオルガノイド（色素；Ｐｉｇｍｅｎｔ）、透明度が高く、明瞭な構造が見られないオルガノイド（ゼリー状組織；　Ｊｅｌｌｙ－ｌｉｋｅ）に分類できると考えられた（図３１）。上記形態分類に従って、統計した結果を図３２、表５）に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　表５には、各形態のオルガノイドの割合を表で示す。１つのオルガノイドの中に含まれる形態の種類によってオルガノイドを分類した。上から１～７行目において、各列は個々のオルガノイドに含まれる形態を示す。下から１～１２行目は、１２回の分化誘導ロットで誘導されたオルガノイドを形態によって分類した結果を示す。表５中の数値は、ロット内の全オルガノイドの中で各形態のオルガノイドが占める割合を百分率で示したものであり、色の濃淡は数値の大きさに対応する。図３２には、各形態のオルガノイドの割合を棒グラフで示す。
　発生するオルガノイドグループの割合は、分化ロットによって大きく異なっており、「ロゼット構造」、「風船状組織又は綿状組織」、「透明性組織」が共に含まれるロット、大半が「風船状組織又は綿状組織」のロット、大半が「じゃがいも状組織」のロットが見られた（図３２、表５）。このように、分化誘導回によって発生するオルガノイドタイプの割合は、ロットによって変化することが分かった。尚、オルガノイドによっては上述の７つの形態分類の複数に属する特徴を併せ持っていた。また、これらのオルガノイドは、拡大して観察することにより、目視で選別可能である。
９－２．各形態グループのオルガノイドのシングルセル遺伝子発現解析
　各形態グループのオルガノイドに含まれる細胞種を同定するため、シングルセル遺伝子発現解析を行った。解析には、３回の分化誘導回で得られた９つのオルガノイド（図３３）を用いた。各オルガノイドに含まれる組織の形態を各写真の上部に示す。シングルセル遺伝子発現解析は、以下のとおりに行った。
　まず、オルガノイドからシングルセルの懸濁液を調製するため、神経細胞用分散液（富士フィルム和光純薬株式会社）を用いて、推奨条件に従い、オルガノイドを単細胞に分離した。分散した細胞を、１０％（ｖ／ｖ）ＫＳＲ及び１０μＭ　Ｙ－２７６３２（富士フィルム和光純薬）を添加したＨＢＳＳで１，０００細胞／μＬの密度で再懸濁した。チャネルあたり約４，６７０個の細胞をＣｈｒｏｍｉｕｍＮｅｘｔＧＥＭ　Ｃｈｉｐ　Ｇ（２０００１７７　１０Ｘ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）にロードし、Ｃｈｒｏｍｉｕｍコントローラーで処理してＧｅｌ　Ｂｅａｄｓ－ｉｎ－Ｅｍｕｌｓｉｏｎ（ＧＥＭ）を取得した。ライブラリは、Ｃｈｒｏｍｉｕｍ　Ｎｅｘｔ　ＧＥＭ　Ｓｉｎｇｌｅ　Ｃｅｌｌ　３’Ｒｅａｇｅｎｔ　Ｋｉｔｓ　ｖ３．１（１０００１２１；１０ｘ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）を使用して、製造元のプロトコル（ＣＧ０００２０４　Ｒｅｖ　Ｃ）に従って作製した。ライブラリの配列は、Ｎｏｖａｓｅｑ　６０００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）によって分析した。
　シングルセルＲＮＡ－ｓｅｑの配列のマッピングには、Ｃｅｌｌ　Ｒａｎｇｅｒ　ｐｉｐｅｌｉｎｅを用いた。参照ゲノム配列としては、ＧＲＣｈ３８ヒトゲノム配列を用いた。次世代シーケンサーでの解析で得られたＵＭＩカウント値は、Ｓｅｕｒａｔ　Ｒ　ｐａｃｋａｇｅを用いて解析した。まず、それぞれのオルガノイドのデータをＬｏｇ－Ｎｏｒｍａｌｉｚｅ法で標準化した後、全てのオルガノイドのデータを統合した。次に細胞間の変化の大きい上位２０００遺伝子を抽出し、これらの遺伝子のデータを用いてＰｒｉｎｃｉｐａｌ　ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ　ａｎａｌｙｓｉｓ（ＰＣＡ）を行い、上位５０個の主成分（第１主成分～第５０主成分）を取得した。さらに３回の分化誘導ロットのオルガノイドを同時に解析するため、Ｈａｒｍｏｎｙ法を用いてバッチ効果補正を実施した後、ＵＭＡＰ（Ｕｎｉｆｏｒｍ　Ｍａｎｉｆｏｌｄ　Ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ）法による次元削減を行い２次元のデータに変換した。その後、Ｓｈａｒｅｄ　ｎｅａｒｅｓｔ　ｎｅｉｇｈｂｏｒ　ｇｒａｐｈに基づくクラスタリングを行い、全ての細胞をクラスターに分類した。さらに各クラスターに特徴的に発現する遺伝子群をもとに、各クラスターを構成する細胞種を同定した。
　個々の細胞の遺伝子発現の類似性や相違性をＵＭＡＰ法により得られた２次元データを視覚化することにより評価した。具体的には、上記ＰＣＡにより、数万個の細胞はそれぞれその遺伝子発現データに基づく５０次元のデータ（主成分）によって表現されているが、ＵＭＡＰ法により類似性や相違性を維持しながら２次元のデータに圧縮され、平面上のプロットに変換される。ＵＭＡＰ法により得られたプロットでは、それぞれの点は、個々の細胞を示し、遺伝子発現パターンが類似した細胞ほど近い位置にプロットされる。類似性が特に大きな細胞が多数存在するとそれらの点がごく近くに集まった塊状の構造が現れる。このような構造を構成する細胞群は、酷似した遺伝子発現を示す細胞、すなわち同種又はごく近縁の細胞種であると解釈される（Nature Biotechnology volume 37, pages 38-44 (2019))
　図３４及び３５には、解析した９つのオルガノイドに含まれる細胞を、シングルセルＲＮＡ－ｓｅｑ解析のデータをＵＭＡＰ法によって表示した結果を示す。図３４から、９つのオルガノイドに含まれる細胞は１０個以上の異なるクラスターに分かれ、１０種類以上の特徴的な遺伝子発現パターンを示す細胞集団が含まれていると考えられた。また、オルガノイドによってプロットのパターンが異なっており（図３５）、オルガノイドによって含まれる細胞種が異なると考えられた。
　各クラスターに含まれる細胞種を同定するため、Ｎｅａｒｅｓｔ　Ｎｅｉｇｈｂｏｕｒｓ法により、統計学的に１４個のクラスターに分類した。各クラスターに特徴的に発現する遺伝子を発現細胞の割合と平均発現量をもとに抽出し、表６に示す。表６の各細胞における遺伝子は、上から順に上位５０個を記載している。また、文献情報をもとに、細胞種のアノテーションを行い、各クラスターの遺伝子発現に基づき、各クラスターの細胞種を同定した（図３６）。各点は個々の細胞を表し、点の濃淡はクラスターを表す。それぞれの細胞種は、Cortical Neuron (Radial Glia (RG))：大脳皮質神経前駆細胞（放射状グリア（Radial Glia(RG))）、Cortical neuron (CR)：カハールレチウス細胞（Cajal Retzius cell(CR)）、Cortical Neuron (Glutamatergic neuron (GN))：大脳皮質神経細胞（グルタミン酸作動性神経（Glutamatergic Neuron(GN))）、GABAergic neuron：ＧＡＢＡ作動性神経細胞、Choroid plexus (ChP)：脈絡叢、CNS fibroblast：中枢神経系線維芽細胞、Neural Crest：神経堤細胞、Vascular Endothelial cells：血管内皮細胞、Caudal Neuron：尾側神経細胞であると考えられる。
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□図３７及び３８は、シングルセル遺伝子発現データにおいて、各クラスターに特徴的な遺伝子、既知のマーカー遺伝子の発現プロファイルをドットプロットで示す。縦軸はクラスターを、横軸は遺伝子を表す。円の大きさは、クラスター内の全ての細胞に対する発現細胞の割合を百分率で表す。色の濃淡は、クラスター内の細胞の遺伝子発現量の平均値を表す。
　ＭＡＰ２とＴＵＢＢ３は、神経細胞のマーカーとして解析した。ＫＲＴ１９とＫＲＴ８は、上皮系細胞のマーカーとして解析した。ＭＫＩ６７とＴＯＰ２Ａは、増殖性細胞のマーカーとして解析した。ＰＡＸ６、ＳＯＸ２、ＨＥＳ１は放射状グリア（Ｒａｄｉａｌ　Ｇｌｉａ（ＲＧ））のマーカーとして解析した。ＥＭＸ１は前脳背側領域のマーカーとして解析した。ＮＥＵＲＯＤ６とＳＬＣ１７Ａ７は、グルタミン酸作動性神経のマーカーとして解析した。ＳＳＴＲ３は、ソマトスタチン受容体で、グルタミン酸作動性神経でも発現が見られることが知られる。ＴＢＲ１とＢＣＬ１１Ｂは、大脳皮質第Ｖ層と第六層の前駆体であるＤｅｅｐ　Ｌａｙｅｒのマーカーとして解析した。ＲＥＬＮは、Ｃａｊａｌ　Ｒｅｔｚｉｕｓ細胞のマーカーとして解析した。ＡＳＣＬ１、ＤＬＸ１、ＤＬＸ２、ＤＬＸ５、ＤＬＸ６は、ＧＡＢＡ作動性神経の分化過程で発現が見られるマーカーとして解析した。ＧＡＤ２は、ＧＡＢＡ作動性神経のマーカーとして解析した。ＳＳＴとＴＡＣ１はＧＡＢＡ作動性神経のサブタイプで発現が見られるマーカーとして解析した。ＴＴＲ、ＲＳＰＯ３、ＣＬＩＣ６、ＨＴＲ２Ｃ、ＴＲＰＭ３は、脈絡叢の発生過程で発現が見られるマーカーとして解析した。ＣＯＬ１Ａ１は、ＣＮＳ　Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔのマーカーとして解析した。ＤＣＮ、ＬＵＭ、ＤＬＫ１はストローマ細胞で発現する遺伝子である。ＡＱＰ１は、脈絡叢やくも膜顆粒で発現することが報告されている。ＯＴＸ２、ＥＭＸ２は領域特異的なマーカーで、終脳型の脈絡叢で発現することが知られる。ＨＯＸＡ５、ＨＯＸＢ５は尾側の神経マーカーとし解析した。ＺＩＣ１、ＭＳＸ１、ＬＧＡＬＳ１、ＴＷＩＳＴ１、ＰＲＲＸ１、ＧＰＣ３、ＳＯＸ１０、ＴＦＡＰ２Ａは、Ｎｅｕｒａｌ　Ｃｒｅｓｔの分化過程で発現が見られるマーカーとして解析した。そのうち、ＬＧＡＬＳ１、ＴＷＩＳＴ１、ＰＲＲＸ１、ＧＰＣ３は、Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ－Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ（ＥＭＴ）に関与する遺伝子であり、ＳＯＸ１０、ＴＦＡＰ２Ａは、成熟したＮｅｕｒａｌ　Ｃｒｅｓｔで発現するマーカーである。ＰＥＣＡＭ１、ＫＤＲ、ＦＬＴ１、ＩＣＡＭ２は、血管内皮細胞のマーカーとして解析した。
　解析対象とする遺伝子の選出においては、まず、“Ｃｏｒｔｉｃａｌ　Ｎｅｕｒｏｎ（ＧＮ）”のクラスターにおいて他のクラスターに対し、発現している細胞の割合が２倍以上高い遺伝子を選出した。次に、“Ｃｏｒｔｉｃａｌ　Ｎｅｕｒｏｎ　（ＧＮ）”のクラスターにおいて他のクラスターに対し、発現量の平均値のＦｏｌｄ　Ｃｈａｎｇｅが大きいものから５０遺伝子を選出した。最後に、ＤＡＰＴ処理前の大脳オルガノイドと、ＤＡＰＴ処理後の大脳皮質細胞塊、それぞれ３ロットのシングルセル遺伝子発現解析において、全てのロットで発現が検出される４６遺伝子を解析の対象とした。
　大脳皮質神経細胞（Ｃｏｒｔｉｃａｌ　Ｎｅｕｒｏｎ）のクラスターは、前脳のマーカーであるＥＭＸ１を発現していた。そのうち、“Ｒａｄｉａｌ　Ｇｌｉａ（ＲＧ）”は、ＬＨＸ２、Ｒａｄｉａｌ　Ｇｌｉａの制御に必須の遺伝子であるＳＯＸ２、ＰＡＸ６を発現していた。“Ｇｌｕｔａｍａｔｅｒｇｉｃ　ｎｅｕｒｏｎ（ＧＮ）”は、ｄｅｅｐ　ｌａｙｅｒ　ｎｅｕｒｏｎ、ｐｙｒａｍｉｄａｌ　ｎｅｕｒｏｎに特徴的な転写因子であるＴＢＲ１（Robert F. Hevner, Tbr1 Regulates Differentiation of the Preplate and Layer 6, Neuron, 2001）、ＮＥＵＲＯＤ６（Tutukova S et al., The Role of Neurod Genes in Brain Development, Function, and Disease, Frontiers in Molecular Neuroscience, 2021）、グルタミン酸トランスポーターのＳＬＣ１７Ａ７（ＶＧｌｕＴ１）、ＢＣＬ１１Ｂ（Ｃｔｉｐ２）を発現していた。また、“Ｃａｊａｌ　Ｒｅｔｚｉｕｓ　ｃｅｌｌ（ＣＲ）”は、カハールレチウス細胞のマーカー遺伝子であるＲＥＬＮ、ＴＢＲ１などを発現していた。
　ＧＡＢＡｅｒｇｉｃ　ｎｅｕｒｏｎのクラスターは、Ｇｌｕｔａｍａｔｅ　ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅのＧＡＤ２を共通して発現していた。そのうち、“ＧＡＢＡｅｒｇｉｃ　ｎｅｕｒｏｎ―１、２”のクラスターでは増殖性マーカーであるＭＫＩ６７（Ｋｉ６７）、分化早期（ＶＺ）に発現が見られるＡＳＣＬ１の発現が高く認められた。“ＧＡＢＡｅｒｇｉｃ　ｎｅｕｒｏｎ―３”のクラスターでは、分化中盤以降（ＳＶＺ）に発現が見られるＤＬＸ５、ＤＬＸ６が発現していた。
　Ｃｈｏｒｏｉｄ　Ｐｌｅｘｕｓのクラスターでは、脈絡叢上皮のマーカーである、ＴＴＲ（Ｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎ）を高く発現していた。脈絡叢には、Ｔｅｌｅｎｃｅｐｈａｌｉｃ型とＨｉｎｄｂｒａｉｎ型が存在するが、ＥＭＸ２、ＢＭＰ７とも共発現していたことから、大脳皮質に付随する、Ｔｅｌｅｎｃｅｐｈａｌｉｃな脈絡叢であると考えられた。
　ＣＮＳ　Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔのクラスターでは、中枢神経に付随する線維芽細胞のマーカーであるＣＯＬ１Ａ１が高く発現していた。同時に、ＡＱＰ１などの発現も認められたため、これらの細胞の一部は脈絡叢に付随する線維芽細胞である可能性が考えられる。
　Ｎｅｕｒａｌ　Ｃｒｅｓｔのクラスターでは、Ｎｅｕｒａｌ　ｃｒｅｓｔ　ｃｅｌｌ（ＮＣＣ）の分化過程で発現が認められる様々な遺伝子の発現が認められた（Simoes-Costa M et al., Establishing neural crest identity: a gene regulatory recipe, Development, 2015）。“Ｎｅｕｒａｌ　ｃｒｅｓｔ－１”のクラスターでは、ＮＣＣの起源である、Ｎｅｕｒａｌ　Ｐｌａｔｅ　Ｂｏｒｄｅｒで発現が見られるＺＩＣ遺伝子群、Ｍｓｘ１などの発現が認められた。“Ｎｅｕｒａｌ　ｃｒｅｓｔ－２”のクラスターでは、ＮＣＣへの分化初期で発現が見られる、Ｓｍａｄシグナル下流のＩＤ遺伝子群やＥｐｉｔｈｅｌｉａｌ－Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ（ＥＭＴ）関連遺伝子（ＬＧＡＬＳ１、ＴＷＩＳＴ１、ＰＲＲＸ１、ＧＰＣ３（Fazilaty H et al.., A gene regulatory network to control EMT programs in development and disease, 2019）の発現が見られた。“Neural crest－３”では、ＮＣＣのＭｉｇｒａｔｉｏｎ期に発現する、ＳＯＸ１０ＴＦＡＰ２Ａなどの発現が見られた。
　Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌｓのクラスターでは、ＫＤＲ（ＶＥＧＦＲ－２）、ＰＥＣＡＭ１、ＦＬＴ１、ＩＣＡＭ２をはじめとする、多数のｖａｓｃｕｌａｒ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌのマーカーが発現していた（Gonchalov et al., Markers and Biomarkers of Endothelium: When Something Is Rotten in the State, Oxidative Medicine and Cellular Longevity, 2017）。
　Ｃａｕｄａｌ　Ｎｅｕｒｏｎのクラスターでは、ニューロンのマーカーであるＴＵＢＢ３の他、尾側の領域化を制御するＨＯＸＡ５、ＨＯＸＢ５をはじめとする、多数のＨＯＸ遺伝子の発現が認められた。
　９つのオルガノイドにおける各細胞種の割合を図３９の（Ａ）に示し、また、Ｎｅｕｒａｌ　ｃｒｅｓｔのうち、各分化ステージにおける神経堤細胞の割合を図３９の（Ｂ）に示す。色素細胞を含むＯｒｇａｎｏｉｄ９は、他のオルガノイドに比べ、Ｎｅｕｒａｌ　Ｃｒｅｓｔの割合が高かった。中でも、ＥＭＴに関わる遺伝子群を発現する細胞集団である“Ｎｅｕｒａｌ　Ｃｒｅｓｔ－２”の割合が高く、活発に移動するＮｅｕｒａｌ　Ｃｒｅｓｔが多く含まれることが分かった。
９－３．免疫染色による各マーカーの発現解析
　各グループのオルガノイドに対し、代表的なマーカータンパク質の免疫染色を行った。結果を図４０に示す。
　前脳のマーカーのＥＭＸ１は、ロゼット構造が見られる領域（ロゼット）で特異的に発現が見られた。ＧＡＢＡｅｒｇｉｃ　ｎｅｕｒｏｎのマーカーのＧＡＤ６５（ＧＡＤ２）は、「じゃがいも状組織」の領域で発現が認められた。ＥＣＭ　ＦｉｂｒｏｂｌａｓｔのマーカーのＣＯＬ１Ａ１は風船状組織、綿状組織、色素の周辺領域で発現が認められた。脈絡叢特異的なマーカーは、透明性組織で発現していた。ＭｅｌａｎｏｃｙｔｅマーカーのＴＹＲは、色素沈着が見られるオルガノイド「色素」で発現が見られた。これらの結果より、シングルセル遺伝子発現解析で同定したマーカーはそれぞれ特徴的な構造を持つ領域に確かに発現していることが確認された。
９－４．ＲＴ－ｑＰＣＲによる各マーカー遺伝子の発現解析
　－Ｄａｙ７～Ｄａｙ３５まで実施例１と同じ方法で培養した。各グループにつき３個のオルガノイドを取得し、倒立顕微鏡（Ｌｅｉｃａ　ＤＭＳ１０００）を用いて明視野像を撮影した（図４１）。各オルガノイドに対し、ＲＴ－ｑＰＣＲ法でマーカー遺伝子の発現を解析した。解析結果を図４２及び４３に示す。
　大脳皮質神経細胞（Ｃｏｒｔｉｃａｌ　Ｎｅｕｒｏｎ）のマーカーとして同定した、ＶＧｌｕＴ１、ＥＭＸ１は、Ｒｏｓｅｔｔｅｓのオルガノイドで発現が認められた。ＧＡＢＡｅｒｇｉｃ　ｎｅｕｒｏｎのマーカーとして同定したＤＬＸ２、ＧＡＤ２は、じゃがいも状（Ｐｏｔａｔｏ－ｌｉｋｅ）のオルガノイドで高く発現が認められた。ＭｅｌａｎｏｃｙｔｅのマーカーであるＴＹＲは、Ｐｉｇｍｅｎｔのオルガノイドで高く発現が見られた。ＣＮＳ　ＦｉｂｒｏｂｌａｓｔのマーカーであるＣＯＬ１Ａ１は、風船状組織と綿状組織で発現が見られた。Ｃａｕｒａｌ　ＮｅｕｒｏｎのマーカーのＨＯＸＡ２はゼリー状組織で発現が見られた。
９－５．シングルセル遺伝子発現解析による、大脳オルガノイド及び大脳皮質細胞塊の解析
　－Ｄａｙ７～Ｄａｙ３５まで実施例１と同じ方法で培養した３回の分化誘導回で得られたオルガノイドから、Ｒｏｓｅｔｔｅｓのオルガノイドを目視で選別した。その後、実施例４の工程（ｉｉ）に記載の方法で、大脳オルガノイドをＤＡＰＴで３日間処理し、大脳皮質細胞塊を誘導した（“ＤＡＰＴ＋”）。対照群として、工程（ｉｉ）でＤＡＰＴ非添加の群を作成した（大脳オルガノイド：“ＤＡＰＴ－”）。
これらの細胞を用いて、９－２と同じ方法でシングルセル遺伝子発現解析を行った。
　各分化誘導回（Ｌｏｔ１、Ｌｏｔ２、Ｌｏｔ３）のＲｏｓｅｔｔｅｓのオルガノイドの形態を倒立顕微鏡にて観察し、代表的な明視野像を図４４の（Ａ）に示す。シングルセル遺伝子発現解析のＵＭＡＰのプロットを図４４の（Ｂ）に示す。（Ｒｏｓｅｔｔｅｓ　Ｌｏｔ１、Ｒｏｓｅｔｔｅｓ　Ｌｏｔ２、Ｒｏｓｅｔｔｅｓ　Ｌｏｔ３）
　ＤＡＰＴ－条件で得られるオルガノイド（大脳オルガノイド）は２つのクラスターに分かれ、２種類の細胞集団が含まれていることが分かった（図４４の（Ｂ））。ＤＡＰＴ＋条件で得られるオルガノイド（大脳皮質細胞塊）は１つのクラスターに集約し、１種類の細胞集団によって構成されることが分かった。３回の製造ロットの細胞は、分布が重なっていたことから、製造回による差は小さく、再現性良く、同様の細胞集団が得られていることが分かった。
　また、上記のオルガノイドについて、さらに上記同定したマーカー遺伝子の発現を解析した（図４５）。大脳オルガノイド（ＤＡＰＴ－）は２つのクラスターに分かれ、右側のクラスターでは、グルタミン酸作動性ニューロンのマーカーである、ＳＬＣ１７Ａ７及びＮＥＵＲＯＤ６、並びにＤｅｅｐ　Ｌａｙｅｒ　ＮｅｕｒｏｎのマーカーであるＣｔｉｐ２が高く発現しており、Ｇｌｕｔａｍａｔｅｒｇｉｃ　Ｎｅｕｒｏｎやその前駆細胞が含まれていると考えられた。左側のクラスターでは、放射状グリアのマーカーであるＰＡＸ６やＭＫＩ６７が高く発現しており、増殖性の高い放射状グリアであると考えられた。Ｕｐｐｅｒ　ＮｅｕｒｏｎのマーカーであるＳａｔｂ２はほとんど発現がみられず、ほとんどが大脳皮質第Ｖ層、ＶＩ層の前駆細胞であると考えられた。また、今回同定した目的外細胞のマーカーである、ＴＴＲ、ＣＯＬ１Ａ１、ＴＹＲ及びＰＥＣＡＭ１はほとんど検出されなかった。このことから、形態でロゼット構造を全体に持つオルガノイドを選別、又は、他の形態のオルガノイドを排除することにより、大脳皮質の細胞を得ることができ、目的外細胞の混入を低減できることが分かった。
　また、大脳皮質細胞塊（ＤＡＰＴ＋）では、１つのクラスターに集約され、ＳＬＣ１７Ａ７（ＶＧｌｕＴ１）、ＮＥＵＲＯＤ６及びＣｔｉｐ２は発現しているが、目的外細胞のマーカーであるＰａｘ６及びＭＫＩ６７を発現する細胞集団が大幅に減少した。また、ＴＴＲ、ＣＯＬ１Ａ１、ＴＹＲ及びＰＥＣＡＭ１はほとんど検出されなかった。このことから、ＤＡＰＴ処理を行うことにより、純度の高い、グルタミン作動性ニューロンを含む大脳皮質細胞塊が得られることが分かった。
　表６に記載のそれぞれの遺伝子は、大脳皮質神経前駆細胞（広義には大脳皮質神経細胞に含まれるが、放射状グリア、Ｒａｄｉａｌ　Ｇｌｉａ（ＲＧ）に相当する）、大脳皮質神経細胞（グルタミン酸作動性神経（ＧＮ）、及びカハールレチウス細胞（ＣＲ）を含む）、ＧＡＢＡ作動性神経細胞、脈絡叢（ＣｈＰ）、中枢神経系線維芽細胞、神経堤細胞、血管内皮細胞、又は尾側神経細胞のいずれかのマーカーとしても利用できる。
　また、大脳皮質神経前駆細胞、大脳皮質神経細胞（グルタミン酸作動性神経、及びカハールレチウス細胞を含む）のマーカーは、これらの細胞が大脳オルガノイドに含まれていることから、大脳オルガノイドのマーカーとして利用できる。
　特に、大脳皮質神経細胞に発現する遺伝子、具体的には、グルタミン酸作動性神経又はカハールレチウス細胞に発現する遺伝子は、本発明の大脳皮質細胞塊や本発明の高純度大脳皮質細胞塊のマーカーとして利用できる。
　大脳皮質神経細胞（放射状グリアを除く）のクラスターに属する５０個の遺伝子（表６）のうち、３遺伝子（ＥＯＭＥＳ、ＳＰＩＮＫ５、ＥＢＦ２）は、ＤＡＰＴ処理後のオルガノイドでの発現量が少なかったことから、残りの４７個の遺伝子が本発明の大脳皮質細胞塊又は本発明の高純度大脳皮質細胞塊のマーカーとして適していることがわかった。またこれらの遺伝子リストのうち、ＮＥＵＲＯＤ６、ＮＥＵＲＯＤ２、ＳＳＴＲ２、ＴＢＲ１、ＮＲＸＮ１、ＢＨＬＨＥ２２、ＮＥＵＲＯＤ１、ＮＥＵＲＯＧ２、ＳＬＣ１７Ａ７及びＥＭＸ１は、大脳皮質が発生する領域である前脳背側領域や、大脳皮質の第ＩＩ層～第ＶＩ層の予定領域）（Ｃｏｒｔｉｃａｌ　Ｐｌａｔｅ）、グルタミン酸作動性神経細胞で発現が見られることが知られているが、その他の３７個の遺伝子は、新たに大脳皮質神経細胞のマーカーとして同定されたものである。
　すなわち、本願に規定する上記大脳皮質細胞塊や高純度大脳皮質細胞塊が目的細胞である大脳皮質神経細胞を含むことは、ＮＥＵＲＯＤ６、ＮＥＵＲＯＤ２、ＳＳＴＲ２、ＴＢＲ１、ＺＢＴＢ１８、ＮＨＬＨ１、ＩＧＦＢＰＬ１、ＮＲＮ１、ＲＴＮ１、ＴＨＳＤ７Ａ、ＮＲＸＮ１、ＢＨＬＨＥ２２、ＣＡＬＢ２、ＫＨＤＲＢＳ３、ＣＣＳＡＰ、ＰＤＥ１Ａ、ＮＥＵＲＯＤ１、ＮＰＴＸ１、ＮＸＰＨ４、ＮＴＳ、ＮＥＵＲＯＧ２、ＯＬＦＭ１、ＰＲＤＭ８、ＣＯＲＯ２Ｂ、ＴＰ５３Ｉ１１、ＺＦＰＭ２、ＰＣＤＨ９、ＮＥＬＬ２、ＳＲＲＭ４、ＳＣＧ３、ＤＣＣ、ＥＰＢ４１Ｌ３、ＳＬＣ１７Ａ７、ＳＴ１８、ＮＳＧ２、ＥＭＸ１、ＣＡＰ２、ＳＹＴ４、ＮＳＭＦ、ＡＮＫ３、ＭＹＴ１Ｌ、ＦＳＴＬ５、ＣＥＬＦ４、Ｂ３ＧＡＴ１、ＥＰＨＡ５、ＮＨＬＨ２、及びＤＬＬ３からなる群から選ばれる少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、又は少なくとも５つの遺伝子を発現しているか否か、又はその発現量を調べることによって評価することができる。より好ましくはＳＬＣ１７Ａ７、ＮＥＵＲＯＤ６、ＥＭＸ１を発現しているか否か、又はその発現量を調べることによって評価することができる。
　また、表６に記載の、大脳皮質神経前駆細胞(放射状グリア）（Ｒａｄｉａｌ　Ｇｌｉａ（ＲＧ）））、ＧＡＢＡ作動性神経細胞（ＧＡＢＡｅｒｇｉｃ　ｎｅｕｒｏｎ）、脈絡叢（Ｃｈｏｒｏｉｄ　ｐｌｅｘｕｓ　（ＣｈＰ））、中枢神経系線維芽細胞（ＣＮＳ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）、神経堤細胞（Ｎｅｕｒａｌ　Ｃｒｅｓｔ）、血管内皮細胞（Ｖａｓｃｕｌａｒ　Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌｓ）又は尾側神経細胞（Ｃａｕｄａｌ　Ｎｅｕｒｏｎ）に発現する遺伝子群（以下目的外細胞遺伝子群という）は、本発明の大脳皮質細胞塊又は高純度大脳皮質細胞塊における目的外細胞のマーカーとして、目的外細胞が基準以下であることを調べるために利用できることがわかった。
　すなわち、本願に規定する上記大脳皮質細胞塊や高純度大脳皮質細胞塊が目的外細胞を含まない又は目的外細胞が基準以下であることを、表６における目的外細胞遺伝子群から選ばれる少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つつの遺伝子の発現量が実質的に発現していないか、又は基準以下であることを指標として評価することができる。
　具体的には、放射状グリアのマーカーとして同定されたＬＨＸ２、ＳＯＸ２、及びＰＡＸ６、ＧＡＢＡ作動性神経細胞のマーカーとして同定されたＧＡＤ２ＤＬＸ１、ＤＬＸ２、ＤＬＸ５、及びＤＬＸ６、脈絡叢のマーカーとして同定されたＴＴＲ、ＴＲＰＭ３、中枢神経系線維芽細胞のマーカーとして同定されたＣＯＬ１Ａ１、神経堤細胞のマーカーとして同定されたＺＩＣ遺伝子群、Ｍｓｘ１、Ｓｍａｄシグナル下流のＩＤ遺伝子群、Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ－Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ（ＥＭＴ）関連遺伝子（ＴＷＩＳＴ１、ＰＲＲＸ１、ＧＰＣ３、Ｓｏｘ１０、及びＴＦＡＰ２、血管内皮細胞のマーカーとして同定されたＫＤＲ（ＶＥＧＦＲ－２）、ＰＥＣＡＭ１及びＣＤＨ５（ＶＥ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ）をはじめとする多数のｖａｓｃｕｌａｒ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌのマーカー、並びに尾側神経細胞のマーカーとして同定されたＴＵＢＢ３の他、尾側の領域化を制御する多数のＨＯＸ遺伝子から選ばれる、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの遺伝子の発現量が実質的に発現していないか、又は基準以下であることを指標として評価することができる。また、表６に記載のマーカーの使用方法はこれらに限られず、用途に応じて適宜マーカーを選択し発現を測定することにより、様々な目的に使用することができる。
　より好ましくは表６におけるＧＡＤ２、ＣＯＬ１Ａ１、ＴＹＲ、ＴＴＲ及びＨＯＸＡ２からなる群から選ばれる１以上の遺伝子を実質的に発現していないか、又は基準値以下である。
　本発明に規定する製造方法により作製した大脳オルガノイドは、必ずしも用途が限定されず、以下のような目的に用いてもよい。
　＜大脳用途（物質スクリーニング）＞
　低分子化合物、抗体、核酸、その他の物質を、本発明の製造方法で作製した大脳オルガノイドに添加し、その影響を調べてもよい。すなわち、低分子化合物、抗体、その他の物質の影響、毒性、及び有用性を明らかにする目的で、大脳オルガノイドを用いることができる。この場合、大脳オルガノイドにおいて形成された、組織化された神経細胞、組織化された神経ネットワークの影響を調べることができる。特に本発明に規定する大脳オルガノイドの製造方法、及び、選別方法により、発現プロファイル又は形状等又は組織構成が比較的均一な大脳オルガノイドを大量に作成することが可能である。この際に、大脳オルガノイドの品質を客観的に評価するために、上記１３に記載の大脳オルガノイドの品質評価方法を用いてもよい。これらの発現プロファイル又は形状等又は組織構成が比較的均一な大脳オルガノイドを用いることにより、容易に複数回の試験を行うことができ、従来は困難であった再現性を容易に達成することができる。
＜大脳用途（疾患大脳オルガノイド）＞
　また、特定の遺伝子型細胞由来の多能性幹細胞から誘導した大脳オルガノイドを作製し、特定の疾患に対して上記物質スクリーニングを適用してもよい。この場合、上記２に記載の大脳オルガノイドの製造方法を用いて大脳オルガノイドを作製する際に、由来する多能性幹細胞の性質に応じて最適な工程は適宜調整できる。特に、統合失調症、双極性障害、自閉症スペクトラム障害、アルツハイマー病、認知症、小頭症、等の患者から採取した細胞由来の多能性幹細胞から誘導した大脳オルガノイドを作製し（精神疾患大脳オルガノイド）、薬剤の効果を調べる他、疾患のメカニズムの解明に用いてもよい。より具体的には、興奮性神経細胞のグルタミン酸作動性神経等、抑制性神経細胞のＧＡＢＡ作動性神経等、グリア細胞等を健常者と比較することや、遺伝子発現、タンパク質発現、代謝状態、電気生理学的性質等の細胞特性を解析することが含まれる。

Claims (39)

  1. 　支持細胞の非存在下、多能性幹細胞から大脳オルガノイドを製造する方法であって、
    （１）多能性幹細胞を、ｂＦＧＦが実質的に含まれず、かつＴＧＦβシグナルを実質的に惹起しない培養液中で培養する工程と、
    （２）工程（１）で得られた細胞を、神経細胞へと分化誘導する工程と
    を含む、方法。
  2. 　工程（２）が、
    （２ａ）工程（１）で得られた細胞を、ＴＧＦβシグナル阻害剤、及びＷｎｔシグナル伝達阻害剤を含む培養液中で浮遊培養して、細胞塊を得る工程と、
    （２ｂ）工程（２ａ）で得られた細胞塊を、ＴＧＦβシグナル阻害剤及びＷｎｔシグナル伝達阻害剤を実質的に含まない培養液中で浮遊培養して、大脳オルガノイドを得る工程と
    を含む、請求項１に記載の方法。
  3. 　工程（２ａ）の浮遊培養が静置培養である、請求項２に記載の方法。
  4. 　工程（２ｂ）の浮遊培養が振とう培養である、請求項２又は３に記載の方法。
  5. 　工程（１）の培養期間が３日間未満である、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 　工程（１）の培養期間が１２時間以上２日間以下である、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 　工程（１）の培養液が、ＳＢ４３１５４２、Ａ－８３－０１、及びＸＡＶ－９３９からなる群から選ばれるＴＧＦβシグナル阻害剤を含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 　工程（１）、工程（２ａ）、及び工程（２ｂ）における培養液が、無血清培養液である、請求項２～７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 　前記多能性幹細胞が、ヒト人工多能性幹細胞又はヒト胚性幹細胞である、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 　（３）工程（２）で得られた複数の細胞塊から、細胞塊の形状、内部構造、サイズ、表面の色彩若しくは模様、及び遺伝子発現からなる群から選ばれる１以上を指標とし、大脳オルガノイドを選別する工程をさらに含む、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 　請求項１～９のいずれか１項に記載の方法を用いて製造される細胞培養物であって、
    　複数の球状の細胞塊を含み、
    　前記複数の球状の細胞塊に占める大脳オルガノイドの割合が４０％以上である、細胞培養物。
  12. 　前記大脳オルガノイドに占める大脳皮質様構造物の割合が４０％以上である、請求項１１に記載の細胞培養物。
  13. 　大脳オルガノイドが、更に以下の（１）～（５）：
    （１）球状の細胞塊であること、
    （２）細胞塊の内部に、大脳皮質様構造物を有すること、
    （３）表面に色素沈着を有さないこと、
    （４）細胞塊の一部に嚢胞状形状、突起形状、及びバルーン状形状のいずれも有さないこと、並びに、
    （５）ＮＥＵＲＯＤ６、ＮＥＵＲＯＤ２、ＳＳＴＲ２、ＴＢＲ１、ＺＢＴＢ１８、ＮＨＬＨ１、ＩＧＦＢＰＬ１、ＮＲＮ１、ＲＴＮ１、ＴＨＳＤ７Ａ、ＮＲＸＮ１、ＢＨＬＨＥ２２、ＣＡＬＢ２、ＫＨＤＲＢＳ３、ＣＣＳＡＰ、ＰＤＥ１Ａ、ＮＥＵＲＯＤ１、ＮＰＴＸ１、ＮＸＰＨ４、ＮＴＳ、ＮＥＵＲＯＧ２、ＯＬＦＭ１、ＰＲＤＭ８、ＣＯＲＯ２Ｂ、ＴＰ５３Ｉ１１、ＺＦＰＭ２、ＰＣＤＨ９、ＮＥＬＬ２、ＳＲＲＭ４、ＳＣＧ３、ＤＣＣ、ＥＰＢ４１Ｌ３、ＳＬＣ１７Ａ７、ＳＴ１８、ＮＳＧ２、ＥＭＸ１、ＣＡＰ２、ＳＹＴ４、ＮＳＭＦ、ＡＮＫ３、ＭＹＴ１Ｌ、ＦＳＴＬ５、ＣＥＬＦ４、Ｂ３ＧＡＴ１、ＥＰＨＡ５、ＮＨＬＨ２、及びＤＬＬ３からなる群から選ばれる少なくとも１つのマーカーを発現していること
    から選択される、１以上の特徴を有する細胞塊である、請求項１２に記載の細胞培養物。
  14. 　（ａ）増殖性マーカー陽性細胞数が全細胞数の１０％以下であり、
    （ｂ）神経細胞マーカー、皮質Ｖ／ＶＩ層マーカー、及び前脳マーカーからなる群から選ばれる１つ以上のマーカーが陽性である細胞数が全細胞数の７０％以上であり、且つ
    （ｃ）神経上皮又は大脳皮質様構造を実質的に含まないことを特徴とする、大脳皮質細胞塊。
  15. 　前記（ａ）の増殖性マーカーがＫｉ６７であり、
    　前記（ｂ）の神経細胞マーカーがβＩＩＩ－Ｔｕｂｕｌｉｎであり、皮質Ｖ／ＶＩ層マーカーがＣｔｉｐ２であり、前脳マーカーがＦＯＸＧ１である、
    請求項１４に記載の大脳皮質細胞塊。
  16. 　（ｄ）ＮＥＵＲＯＤ６、ＮＥＵＲＯＤ２、ＳＳＴＲ２、ＴＢＲ１、ＺＢＴＢ１８、ＮＨＬＨ１、ＩＧＦＢＰＬ１、ＮＲＮ１、ＲＴＮ１、ＴＨＳＤ７Ａ、ＮＲＸＮ１、ＢＨＬＨＥ２２、ＣＡＬＢ２、ＫＨＤＲＢＳ３、ＣＣＳＡＰ、ＰＤＥ１Ａ、ＮＥＵＲＯＤ１、ＮＰＴＸ１、ＮＸＰＨ４、ＮＴＳ、ＮＥＵＲＯＧ２、ＯＬＦＭ１、ＰＲＤＭ８、ＣＯＲＯ２Ｂ、ＴＰ５３Ｉ１１、ＺＦＰＭ２、ＰＣＤＨ９、ＮＥＬＬ２、ＳＲＲＭ４、ＳＣＧ３、ＤＣＣ、ＥＰＢ４１Ｌ３、ＳＬＣ１７Ａ７、ＳＴ１８、ＮＳＧ２、ＥＭＸ１、ＣＡＰ２、ＳＹＴ４、ＮＳＭＦ、ＡＮＫ３、ＭＹＴ１Ｌ、ＦＳＴＬ５、ＣＥＬＦ４、Ｂ３ＧＡＴ１、ＥＰＨＡ５、ＮＨＬＨ２、及びＤＬＬ３からなる群から選ばれる少なくとも１つのマーカーをさらに発現している、請求項１４又は１５に記載の大脳皮質細胞塊。
  17. 　ＳＬＣ１７Ａ７を発現している、請求項１６に記載の大脳皮質細胞塊。
  18. 　ＧＡＤ２、ＣＯＬ１Ａ１、ＴＹＲ、ＴＴＲ及びＨＯＸＡ２からなる群から選ばれる１以上の遺伝子を実質的に発現していない、請求項１５～１７のいずれか１項に記載の大脳皮質細胞塊。
  19. 　支持細胞の非存在下で、多能性幹細胞から大脳皮質細胞塊を製造する方法であって、
    （ｉ）多能性幹細胞から大脳オルガノイドを得る工程と、
    （ｉｉ）工程（ｉ）で得られた大脳オルガノイドを、Ｎｏｔｃｈシグナル阻害剤を含む培養液中で培養して、大脳皮質細胞塊を得る工程と
    を含む、方法。
  20. 　前記工程（ｉ）において、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法により多能性幹細胞から大脳オルガノイドを得る、請求項１９に記載の方法。
  21. 　（Ａ）増殖性マーカー陽性細胞数が全細胞数の５％以下であり、
    （Ｂ）神経細胞マーカー、皮質Ｖ／ＶＩ層マーカー、及び前脳マーカーから選ばれる１つ以上のマーカー陽性細胞数が全細胞数の７０％以上であり、且つ
    （Ｃ）神経上皮又は大脳皮質様構造を実質的に含まない
    ことを特徴とする、高純度大脳皮質細胞塊。
  22. 　前記（Ａ）の増殖性マーカーがＫｉ６７であり、
    　前記（Ｂ）の神経細胞マーカーがβＩＩＩ－Ｔｕｂｕｌｉｎであり、皮質Ｖ／ＶＩ層マーカーがＣｔｉｐ２であり、前脳マーカーがＦＯＸＧ１である、
    請求項２１に記載の高純度大脳皮質細胞塊。
  23. 　（Ｄ）ＮＥＵＲＯＤ６、ＮＥＵＲＯＤ２、ＳＳＴＲ２、ＴＢＲ１、ＺＢＴＢ１８、ＮＨＬＨ１、ＩＧＦＢＰＬ１、ＮＲＮ１、ＲＴＮ１、ＴＨＳＤ７Ａ、ＮＲＸＮ１、ＢＨＬＨＥ２２、ＣＡＬＢ２、ＫＨＤＲＢＳ３、ＣＣＳＡＰ、ＰＤＥ１Ａ、ＮＥＵＲＯＤ１、ＮＰＴＸ１、ＮＸＰＨ４、ＮＴＳ、ＮＥＵＲＯＧ２、ＯＬＦＭ１、ＰＲＤＭ８、ＣＯＲＯ２Ｂ、ＴＰ５３Ｉ１１、ＺＦＰＭ２、ＰＣＤＨ９、ＮＥＬＬ２、ＳＲＲＭ４、ＳＣＧ３、ＤＣＣ、ＥＰＢ４１Ｌ３、ＳＬＣ１７Ａ７、ＳＴ１８、ＮＳＧ２、ＥＭＸ１、ＣＡＰ２、ＳＹＴ４、ＮＳＭＦ、ＡＮＫ３、ＭＹＴ１Ｌ、ＦＳＴＬ５、ＣＥＬＦ４、Ｂ３ＧＡＴ１、ＥＰＨＡ５、ＮＨＬＨ２、及びＤＬＬ３からなる群から選ばれる少なくとも１つの遺伝子を発現している、請求項２１又は２２に記載の高純度大脳皮質細胞塊。
  24. 　ＳＬＣ１７Ａ７、ＮＥＵＲＯＤ６、及びＥＭＸ１からなる群から選ばれる１以上の遺伝子を発現している、請求項２３に記載の高純度大脳皮質細胞塊。
  25. 　ＧＡＤ２、ＣＯＬ１Ａ１、ＴＹＲ、ＴＴＲ及びＨＯＸＡ２からなる群から選ばれる１以上の遺伝子を実質的に発現していない、請求項２１～２４のいずれか１項に記載の高純度大脳皮質細胞塊。
  26. 　支持細胞の非存在下で、多能性幹細胞から高純度大脳皮質細胞塊を製造する方法であって、
    （ｉ）多能性幹細胞から大脳オルガノイドを得る工程と、
    （ｉｉ）工程（ｉ）で得られた大脳オルガノイドを、培養液中で培養する工程と、
    （ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で得られた細胞培養物を、単細胞又は２～５個の細胞の集合体（Cell clump）にまで分散させる工程と、
    （ｉｖ）工程（ｉｉ）で得られた細胞培養物又は工程（ｉｉｉ）で得られた細胞集団を、１以上の神経栄養因子、アスコルビン酸、及びｃＡＭＰ活性化剤を含む培養液中で培養して、細胞塊を得る工程と
    を含み、前記工程（ｉｉ）の培養液及び／又は前記工程（ｉｖ）の培養液は、Ｎｏｔｃｈシグナル阻害剤を含む、方法。
  27. 　前記工程（ｉ）において、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法により多能性幹細胞から大脳オルガノイドを得る、請求項２６に記載の方法。
  28. 　工程（ｉｉ）に付与する大脳オルガノイドが、神経細胞への分化誘導開始から２８日後～４４日後の大脳オルガノイドである、請求項１９、２０、２６及び２７のいずれか１項に記載の方法。
  29. 　工程（ｉｉ）の培養期間が２～６日間である、請求項１９、２０、及び２６～２８のいずれか１項に記載の方法。
  30. 　工程（ｉｖ）の培養期間が２～１４日間である、請求項１９、２０、及び２６～２９のいずれか１項に記載の方法。
  31. 　前記Ｎｏｔｃｈシグナル阻害剤は、γセクレターゼ阻害剤である、請求項１９、２０、及び２６～３０のいずれか１項に記載の方法。
  32. 　前記γセクレターゼ阻害剤がN-[N-(3,5-difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester （DAPT）又はCompound Eである、請求項３１に記載の方法。
  33. 　請求項２１～２５のいずれか１項に記載の高純度大脳皮質細胞塊を含む細胞集団であって、前記高純度大脳皮質細胞塊のサイズ、形状又は構成細胞組成が均一である、細胞集団。
  34. 　請求項１４～１８のいずれか１項に記載の大脳皮質細胞塊、請求項２１～２５のいずれか１項に記載の高純度大脳皮質細胞塊、若しくは請求項３３に記載の細胞集団、又はそれらを構成細胞にまで分散させて得られる細胞集団を有効成分として含む医薬組成物。
  35. 　請求項１４～１８のいずれか１項に記載の大脳皮質細胞塊、請求項２１～２５のいずれか１項に記載の高純度大脳皮質細胞塊、若しくは請求項３３に記載の細胞集団、又はそれらを構成細胞にまで分散させて得られる細胞集団を含む、移植用組織。
  36. 　請求項１４～１８のいずれか１項に記載の大脳皮質細胞塊、請求項２１～２５のいずれか１項に記載の高純度大脳皮質細胞塊、若しくは請求項３３に記載の細胞集団、又はそれらを構成細胞にまで分散させて得られる細胞集団を有効成分として含む、脳血管障害治療薬。
  37. 　請求項１４～１８のいずれか１項に記載の大脳皮質細胞塊、請求項２１～２５のいずれか１項に記載の高純度大脳皮質細胞塊、若しくは請求項３３に記載の細胞集団、又はそれらを構成細胞にまで分散させて得られる細胞集団を、これを必要とする対象の大脳皮質又は大脳基底核に投与又は移植することを含む、脳血管障害の治療方法。
  38. 　（ａａ）大脳オルガノイド又は大脳皮質細胞塊における、ＧＡＤ２、ＣＯＬ１Ａ１、ＴＹＲ、ＴＴＲ及びＨＯＸＡ２からなる群から選ばれる少なくとも１つの遺伝子又は該遺伝子によりコードされるタンパク質もしくはその断片の発現量を測定する工程、及び
    　（ｂｂ）工程（ａａ）の測定結果に基づき、前記遺伝子の発現量が基準値以下である場合に、前記大脳オルガノイド又は前記大脳皮質細胞塊に含まれる目的外細胞の量が基準以下であると評価する工程、
    を含む、大脳オルガノイド又は大脳皮質細胞塊の品質評価方法。
  39. 　（ＡＡ）大脳オルガノイド又は大脳皮質細胞塊における、ＮＥＵＲＯＤ６、ＮＥＵＲＯＤ２、ＳＳＴＲ２、ＴＢＲ１、ＺＢＴＢ１８、ＮＨＬＨ１、ＩＧＦＢＰＬ１、ＮＲＮ１、ＲＴＮ１、ＴＨＳＤ７Ａ、ＮＲＸＮ１、ＢＨＬＨＥ２２、ＣＡＬＢ２、ＫＨＤＲＢＳ３、ＣＣＳＡＰ、ＰＤＥ１Ａ、ＮＥＵＲＯＤ１、ＮＰＴＸ１、ＮＸＰＨ４、ＮＴＳ、ＮＥＵＲＯＧ２、ＯＬＦＭ１、ＰＲＤＭ８、ＣＯＲＯ２Ｂ、ＴＰ５３Ｉ１１、ＺＦＰＭ２、ＰＣＤＨ９、ＮＥＬＬ２、ＳＲＲＭ４、ＳＣＧ３、ＤＣＣ、ＥＰＢ４１Ｌ３、ＳＬＣ１７Ａ７、ＳＴ１８、ＮＳＧ２、ＥＭＸ１、ＣＡＰ２、ＳＹＴ４、ＮＳＭＦ、ＡＮＫ３、ＭＹＴ１Ｌ、ＦＳＴＬ５、ＣＥＬＦ４、Ｂ３ＧＡＴ１、ＥＰＨＡ５、ＮＨＬＨ２、及びＤＬＬ３からなる群から選ばれる少なくとも１つの遺伝子の発現量を測定する工程、及び
    　（ＢＢ）工程（ＡＡ）の測定結果に基づき、前記遺伝子の発現量が基準値以上である場合に、前記大脳オルガノイド又は前記大脳皮質細胞塊に含まれる目的細胞の量が基準以上であると評価する工程、
    を含む、大脳オルガノイド又は大脳皮質細胞塊の品質評価方法。
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