CN115485364A - 分离垂体激素产生细胞及其祖细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种从来自多能干细胞的分化组织中有效地分离、纯化功能性垂体激素产生细胞和/或其祖细胞的方法。

Description

分离垂体激素产生细胞及其祖细胞的方法

技术领域

本发明涉及一种在体外分离、纯化从多能干细胞分化诱导的垂体激素产生细胞及其祖细胞的方法。

背景技术

垂体是与间脑下部相接的小型内分泌器官，作为各种激素的控制中枢发挥着重要作用。产生例如以促肾上腺皮质激素(ACTH)、生长激素为代表的多种垂体激素，促肾上腺皮质激素(ACTH)促进产生维持生命所必需的肾上腺皮质激素，生长激素促进儿童生长。因此，垂体功能障碍会引起严重的全身性疾病。

近年来，开发了从人ES/iPS细胞诱导分化为含有功能性垂体激素产生细胞的腺垂体的方法，并有望应用于垂体再生医学(专利文献1，非专利文献1和2)。在这些方法中，通过三维培养在一个细胞团块中形成下丘脑-垂体的复合组织。在该复合组织中，腺垂体及其祖组织主要位于细胞团块的表层，通过将其剥离并移植到垂体切除小鼠的肾被膜(renalcapsule)下，已确认活动性、生存和体重减少的改善等治疗效果(专利文献1、非专利文献1)。然而，完全不知道用于从上述复合组织分离出腺垂体及其祖组织的细胞表面标记物，识别剥离的腺垂体及其祖组织依赖于实验者基于形态的主观判断。

现有技术文献

专利文献

专利文献1国际公开第2016/013669号

非专利文献

非专利文献1Nature Communications,7:10351,2016

非专利文献2Cell Reports,30,18-24,January 7,2020

发明内容

发明解决的问题

本申请发明人的课题在于提供一种利用细胞表面抗原分离目的细胞的方法，以客观、可靠地分离垂体激素产生细胞及其祖细胞。

解决问题的手段

本申请发明人首先从332种人细胞表面抗原谱(antigen panel)进行筛选，以取得对腺垂体细胞谱系特异性的表面抗原。结果，鉴定出对几种垂体激素产生细胞和/或其祖细胞具有高特异性的表面抗原，其含有上皮细胞粘附分子(epithelial cell adhesionmolecule，以下简称为EpCAM)。经过深入研究，结果发现该鉴定出的表面抗原EpCAM能够承受在分散多能干细胞的细胞团块时的酶等的处理，而且通过使用抗EpCAM抗体进行分选，能从多能干细胞的细胞团块中有效地分离、纯化垂体激素产生细胞及其祖细胞。另外，发现该分离、纯化的细胞能够重新聚集进行维持培养，进而即使经过该维持培养，依然显示出比生理性的垂体激素分泌刺激优异的垂体激素分泌能力，发挥出与体内的垂体激素产生细胞相同的功能，从而完成了本发明。

即，本发明如下所示。

[1]一种分离垂体激素产生细胞和/或其祖细胞的方法，包括从含有腺垂体和/或其祖组织的细胞聚集体中分离表达EpCAM的细胞的步骤。

[2]根据[1]所述的方法，其中，上述细胞聚集体包括下丘脑神经上皮组织。

[3]根据[1]或[2]所述的方法，其中，在分离表达EpCAM的细胞的步骤之前，还包括分散细胞聚集体得到单一细胞的群体的步骤。

[4]根据[1]～[3]中任一项所述的方法，其中，在分离表达EpCAM的细胞的步骤之前，还包括切碎含有腺垂体和/或其祖组织的细胞聚集体，或物理切割含有腺垂体和/或其祖组织的细胞聚集体的步骤。

[5]根据[1]～[4]中任一项所述的方法，其中，含有腺垂体和/或其祖组织的细胞聚集体是通过分化诱导多能干细胞所得到的细胞聚集体。

[6]根据[5]所述的方法，其中，上述多能干细胞是人诱导性多能干细胞。

[7]根据[1]～[6]中任一项所述的方法，其中，上述祖组织是垂体基板(placode)和/或拉特克囊(Rathke's pouch)。

[8]一种垂体激素产生细胞和/或其祖细胞的制造方法，包括从含有腺垂体和/或其祖组织的细胞聚集体中分离表达EpCAM的细胞的步骤。

[9]根据[8]所述的制造方法，其中，包括以下步骤：

(A)分散含有腺垂体和/或其祖组织的细胞聚集体得到单一细胞的群体的步骤；

(B)从上述群体中分离出表达EpCAM的细胞的群体；和

(C)使上述(B)所得到的群体重新聚集的步骤。

[10]根据[8]或[9]所述的制备方法，其中，上述垂体激素产生细胞和/或其祖细胞是细胞聚集体或细胞片层(cell sheet)。

[11]根据[9]或[10]所述的制造方法，其中，在分离表达EpCAM的细胞的步骤(B)之前，还包括切碎含有腺垂体和/或其祖组织的细胞聚集体，或物理切割含有腺垂体和/或其祖组织的细胞聚集体的步骤。

[12]根据[8]～[11]中任一项所述的方法，其中，上述垂体激素产生细胞选自生长激素(GH)产生细胞、催乳素(PRL)产生细胞、促肾上腺皮质激素(ACTH)产生细胞、促甲状腺激素(TSH)产生细胞、卵泡刺激素(FSH)产生细胞、促黄体生成素(LH)产生细胞中的至少一种。

发明的效果

通过本发明，能够利用EpCAM从来自多能干细胞的分化组织中有效地分离、纯化功能性垂体激素产生细胞和/或其祖细胞。另外，由于分离、纯化的垂体激素产生细胞显示出比生理性的垂体激素分泌刺激优异的垂体激素分泌能力，因此，能够使用该细胞进行垂体相关疾病的治疗等。

附图说明

图1显示了来自人iPS细胞的垂体祖细胞中EpCAM的表达。左图是分散分化诱导第44天的人iPS细胞团块后，用细胞角蛋白(cytokeratin，垂体祖细胞标记物)和EpCAM进行荧光免疫染色的示例(A)。右图显示了在诱导分化的第44～51天定量细胞角蛋白(cytokeratin，CK)和EpCAM在所有细胞中所占的表达率的结果(B)。在结果中，数值显示4次实验的平均值(B)。

图2显示来自人iPS细胞的分化组织中EpCAM的免疫组织化学分析。上图显示诱导分化第48天人iPS细胞团块的免疫组织染色(A)。图中，EpCAM在细胞角蛋白(cytokeratin)阳性垂体祖细胞中表达(A)。中图显示了诱导分化第51天人iPS细胞团块的免疫组织染色(B)。图中，EpCAM在Pitx1阳性垂体祖细胞中表达(B)。下图显示了诱导分化第147天人iPS细胞团块的免疫组织染色(C)。图中，EpCAM在ACTH阳性的ACTH产生细胞和Lhx3阳性的垂体祖细胞中表达(C)。

图3显示了使用EpCAM作为标记物通过MACS纯化ACTH产生细胞和垂体祖细胞。上图显示了MACS步骤(A)。左下图是MACS后重新聚集的细胞团块的明场图像(左)和ACTH/Lhx3(B)的免疫染色图像(右)。右下图显示了在MACS后重新聚集的细胞团块的ACTH分量(C)。在实验中，测量在添加CRH前后培养上清液中的ACTH浓度(C)。

具体实施方式

(1)多能干细胞

“多能干细胞”是指兼具能够分化成构成生物体所有细胞的能力(分化多能性)和经过细胞分裂产生与自己具有相同分化能力的子细胞的能力(自我复制能力)的细胞。

分化多能性可以通过将待评价细胞移植到裸鼠(nude mouse)中并检验是否形成含有三胚层(外胚层、中胚层和内胚层)的各个细胞的畸胎瘤进行评价。

作为多能干细胞，可列举例如胚胎干细胞(ES细胞)、胚胎生殖细胞(EG细胞)、诱导性多能干细胞(iPS细胞)、胚胎肿瘤细胞(EC细胞)等，但是，不限于此，只要是兼具分化多能性和自我复制能力的细胞即可。本发明中，优选使用ES细胞或iPS细胞(更优选人iPS细胞)。当上述多能干细胞是ES细胞或任何来自人胚胎的细胞时，该细胞可以是通过破坏胚胎制作的细胞，也可以是不破坏胚胎制作的细胞，但优选为不破坏胚胎制作的细胞。

ES细胞例如可以通过培养着床以前的早期胚胎、构成该早期胚胎的内部细胞团块、单一卵裂球(blastomere)建立(Manipulating the Mouse Embryo A LaboratoryManual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1994)、Thomson,J.A.et al.,Science,282,1145-1147(1998))。作为早期胚胎，也可以使用核移植体细胞的核来制作早期胚胎(Wilmut et al.,(Nature,385,810(1997))、Cibelli et al.(Science,280,1256(1998))、入谷明等(蛋白质核酸酶,44,892(1999))、Baguisi et al.,(NatureBiotechnology,17,456(1999))、Wakayama et al.,(Nature,394,369(1998)；NatureGenetics,22,127(1999)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA,96,14984(1999))、Rideout III etal.,(Nature Genetics,24,109(2000))、Tachibana et al.,(Human Embryonic StemCells Derived by Somatic Cell Nuclear Transfer,Cell(2013)in press))。作为早期胚胎，也可以使用孤雌胚胎(Kim et al.,(Science,315,482-486(2007))、Nakajima etal.,(Stem Cells,25,983-985(2007))、Kim et al.,(Cell Stem Cell,1,346-352(2007))、Revazova et al.,(Cloning Stem Cells,9,432-449(2007))、Revazova et al.,(Cloning Stem Cells,10,11-24(2008)))。

本发明的方法中使用的ES细胞也包括通过ES细胞和体细胞的细胞融合获得的融合ES细胞。

ES细胞可从指定机构获得或购买市售产品。例如，可以从京都大学再生医科研究所获得人ES细胞KhES-1、KhES-2和KhES-3。

EG细胞可以通过在LIF、bFGF、SCF存在的情况下培养原始生殖细胞(primordialgerm cell)来建立(Matsui et al.,Cell,70,841-847(1992)、Shamblott et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95(23),13726-13731(1998)、Turnpenny et al.,Stem Cells,21(5),598-609,(2003))。

iPS细胞是指通过使核重编程因子接触体细胞(例如成纤维细胞、皮肤细胞、淋巴细胞等)，人为获得多能性和自我复制能力的细胞。iPS细胞最初是通过将由Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc组成的核重编程因子导入体细胞而发现的(Cell,126:p.663-676,2006)。之后，许多研究人员对重编程因子的组合和导入因子的方法进行了各种改进，并报道了多种iPS细胞制备方法。

核重编程因子只要是能够从成纤维细胞等体细胞诱导具有分化多能性和自我复制能力的细胞的物质(群)即可，其可以由蛋白质因子或编码其的核酸(包括整合到载体的形态)、或者低分子化合物等任何物质构成。当核重编程因子是蛋白质因子或编码其的核酸时，优选以下示例的组合(以下仅记载蛋白质因子的名称)。

(1)Oct3/4、Klf4、Sox2、c-Myc(这里，可以用Sox1、Sox3、Sox15、Sox17或Sox18替代Sox2。另外，可以用Klf1、Klf2或Klf5替代Klf4。此外，可以用T58A(活性突变体)、N-Myc、L-Myc替代c-Myc。)

(2)Oct3/4、Klf4、Sox2

(3)Oct3/4、Klf4、c-Myc

(4)Oct3/4、Sox2、Nanog、Lin28

(5)Oct3/4、Klf4、c-Myc、Sox2、Nanog、Lin28

(6)Oct3/4、Klf4、Sox2、bFGF

(7)Oct3/4、Klf4、Sox2、SCF

(8)Oct3/4、Klf4、c-Myc、Sox2、bFGF

(9)Oct3/4、Klf4、c-Myc、Sox2、SCF

这些组合中，当要将所得iPS细胞用于治疗用途时，优选Oct3/4、Sox2和Klf4三因子的组合。另一方面，当不想将iPS细胞用于治疗用途时(例如，用作药物研发筛选的研究工具时等)，优选Oct3/4、Klf4、Sox2和c-Myc四因子，或者在其中增加了Lin28或Nanog的五因子。

在自体移植用途中优选使用iPS细胞。

使用公知的遗传工程学技术改变染色体上的基因的多能干细胞也可以用于本发明。多能干细胞是可以通过使用公知的方法将标记基因(例如，GFP等荧光蛋白)框内敲入(in-frame knock-in)编码分化标记物的基因中，并以标记基因的表达作为指标能够识别达到对应的分化阶段的细胞。

作为多能干细胞，例如，可以使用温血动物、优选哺乳动物的多能干细胞。作为哺乳动物，可以列举例如小鼠、大鼠、仓鼠(hamster)、豚鼠(marmotte)等齿类或兔等实验动物；猪、牛、山羊、马、绵羊等家畜；狗、猫等宠物；人、猴、猩猩(orangutan)、黑猩猩(chimpanzee)等灵长类动物。多能干细胞优选啮齿类(小鼠、大鼠等)或灵长类(人等)的多能干细胞，最优选人多能干细胞。

多能干细胞可以通过本身公知的方法来维持培养。例如，从临床应用的观点，多能干细胞优选通过使用Knockout^TM Serum Replacement(Knockout^TM血清替代物，KSR)等血清替代物的无血清培养、或无饲养细胞培养来维持。

本发明中所使用的多能干细胞优选是分离的。“分离”是指进行去除作为目标的细胞或成分以外的因子的操作，脱离天然存在状态。“被分离的人多能干细胞”的纯度(人多能干细胞占细胞总数的百分比)通常为70％以上，优选为80％以上，更优选为90％以上，进一步优选为99％以上，最优选100％。

(2)多能干细胞聚集体的形成

制备多能干细胞聚集体的方法没有特别限制，相对于培养容器，被分散的多能干细胞可以非粘附条件培养(即，悬浮培养)，也可以粘附条件培养(即，贴壁培养)。

在一个优选的实施方式中，多能干细胞聚集体可以通过将分散的多能干细胞相对于培养容器在非贴壁条件下培养(即悬浮培养)，使多个多能干细胞聚集形成聚集体而得到。

作为用于形成这种聚集体的培养容器没有特别限制，可列举例如烧瓶、用于组织培养的烧瓶、培养皿(dish)、皮氏培养皿(petri dish)、用于组织培养的培养皿、多孔培养皿(multi dish)、微量培养板(microplate)、微孔板(micro well plate)、微孔(micropore)和多板(multi plate)、多孔板(multi well plate)、腔室载玻片(chamberslide)、陪替氏平皿(Petri plate)、试管(tube)、托盘(tray)、培养袋和滚瓶。为了能够在不粘附条件下培养，优选细胞不粘附的培养容器。作为细胞不粘附的培养容器可以使用表面经过人工处理使细胞不粘附的培养容器或不进行以提高与细胞的粘附性为目的的人工处理(例如，用细胞外基质进行涂层处理等)的培养容器等。

形成聚集体时所使用的培养基可以将培养哺乳动物细胞的培养基作为基础培养基来制备。作为基础培养基没有特别限制，只要能够用于培养哺乳动物细胞即可，例如，BME培养基、BGJb培养基、CMRL 1066培养基、Glasgow MEM培养基、改良MEM Zinc Option培养基、IMDM培养基、Medium 199培养基、Eagle MEM培养基、αMEM培养基、DMEM培养基、Ham培养基、Ham's F-12培养基、RPMI1640培养基、Fischer's培养基、Neurobasal培养基以及它们的混合培养基(例如DMEM/F-12培养基(DMEM培养基：Ham's F-12培养基＝1:1混合培养基)等)。在一个方案中，使用IMDM培养基与Ham's F-12培养基的混合培养基。混合比例如为IMDM:Ham's F-12＝0.8～1.2:1.2～0.8的体积比。

用于培养的培养基可以是含血清培养基或无血清培养基。无血清培养基是指不含未调制或未纯化血清的培养基，混入来自被纯化血液的成分或来自动物组织的成分(例如，生长因子)的培养基符合无血清培养基。从避免化学上未确定的成分混入的观点来看，本发明优选使用无血清培养基。

聚集体形成时使用的培养基可以含有血清替代物。血清替代物可以适当含有例如白蛋白、转铁蛋白(transferrin)、脂肪酸、胶原蛋白前体、微量元素、2-巯基乙醇或3'硫醇甘油、或者它们的等价物等。这样的血清替代物可以例如通过WO98/30679记载的方法来制备。此外，为了更方便地实施本发明的方法，可以使用市售的血清替代物。作为这样的市售血清替代物，可列举例如KSR(knockout serum replacement，敲除血清替代物)(Invitrogen公司)、Chemically-defined Lipid concentrated(Gibco公司)和Glutamax(Gibco公司)。

在不会对从多能干细胞诱导分化为垂体或其部分组织或者其祖组织产生不利影响的范围内，用于形成聚集体的培养基可以含有其他添加剂。作为添加剂，可列举但不限于胰岛素、铁源(例如转铁蛋白)、矿物质(例如硒酸钠等)、糖类(例如葡萄糖等)、有机酸(例如丙酮酸、乳酸等)、血清蛋白(例如白蛋白等)、氨基酸(例如L-谷氨酰胺等)、还原剂(例如2-巯基乙醇等)、维生素类(例如抗坏血酸、d-生物素等)、抗生素(例如链霉素、青霉素、庆大霉素等)、缓冲剂(例如HEPES等)等。

另外，用于形成聚集体的培养基可以是下述第一培养步骤中所用的培养基。

在形成多能干细胞的聚集体时，首先，从传代培养中回收多能干细胞，并将其分散至单一细胞状态或相近状态。使用合适的细胞解离液分散多能干细胞。作为细胞解离液，例如可以单独或组合使用EDTA、胰蛋白酶、胶原蛋白酶IV、金属蛋白酶等蛋白水解酶等。其中，尤其优选细胞毒性低的物质，作为这样的细胞解离液，可以使用分散酶(dispase)(艾迪亚公司，Edia公司)、胰酶替代物(TrypLE)(英杰公司,Invitrogen公司)、细胞消化液(Accutase)(密理博公司，MILLIPORE公司)等市售品。被分散的多能干细胞能在上述培养基中悬浮。

为了抑制由于分散使诱导的多能干细胞(特别是人多能干细胞)的细胞死亡，优选从培养开始时添加Rho关联卷曲螺旋(Rho-associated coiled-coil)激酶(ROCK)的抑制剂(特开2008-99662)。ROCK抑制剂在培养开始后例如15天内、优选10天内、更优选6天内添加。作为ROCK抑制剂，可列举Y-27632((+)-(R)-反式-4-(1-氨基乙基)-N-(4-吡啶基)环己甲酰胺二盐酸盐)等。用于悬浮培养的ROCK抑制剂的浓度是能够抑制分散导致诱导的多能干细胞的细胞死亡的浓度。例如，对于Y-27632，这种浓度通常约为0.1～200μM，优选约为2～50μM。ROCK抑制剂的浓度可以在添加期间变化，例如，在期间后半期可以使浓度减半。

将分散的多能干细胞的悬浮液接种在上述培养容器中，通过在相对于培养容器不粘附的条件下培养被分散的多能干细胞，使多个多能干细胞聚集形成聚集体。此时，通过将分散的多能干细胞接种到10cm的培养皿这样比较大的培养容器中，可以在1个培养隔室中同时形成多个多能干细胞聚集体，但是，这样的话，每个聚集体的大小、其中所含多能干细胞的数量会产生很大的偏差，该偏差导致聚集体之间从多能干细胞分化至垂体或其部分组织或者其祖组织的程度出现差异，结果导致分化诱导的效率降低。因此，优选使分散的多能干细胞快速聚集以在一个培养隔室中形成一个聚集体。作为这样的使分散的多能干细胞快速聚集的方法，可列举例如以下方法：

1)将分散的多能干细胞封闭入体积较小(例如，1ml以下、500μl以下、200μl以下、100μl以下)的培养隔室中并在该隔室中形成1个聚集体的方法。优选在封闭入分散的多能干细胞后，静置培养隔室。作为培养隔室可列举但不限于多孔板(384孔、192孔、96孔、48孔、24孔等)、微孔(micropore)、腔室载玻片(chamber slide)等中的孔、和试管(tube)、悬滴法中的培养基液滴等。被封闭入该隔室的分散的多能干细胞通过重力促使沉淀到一处，或者，细胞相互粘附，由此在一个培养隔室中形成一个聚集体。为了使分散的多能干细胞容易沉淀至一处，多孔板、微孔(micropore)、腔室载玻片(chamber slide)、试管(tube)的底部形状优选为U形底或V形底。

2)通过将分散的多能干细胞放入离心管中并离心，使使多能干细胞沉淀至一处，从而在该管中形成一个聚集体的方法。

在一个培养隔室中接种的多能干细胞的数量没有特别限制，只要能在每个培养隔室中形成一个聚集体，且通过本发明的方法，在该聚集体中从多能干细胞分化诱导至垂体或其部分组织或者其祖组织即可。每一个培养隔室通常接种约1×10³～约5×10⁴个，优选约1×10³～约2×10⁴个，更优选约2×10³～约1.2×10⁴个多能干细胞。然后，通过快速聚集多能干细胞，每个培养室中形成一个通常由约1x103～约5x10⁴个、优选约1x10³～约2x1⁰⁴个、更优选约2x10³～约1.2x10⁴个多能干细胞组成的细胞聚集体。

至形成聚集体的时间可以在每个隔室形成一个聚集体，且能够通过本发明的方法在该聚集体中从多能干细胞分化诱导至垂体或其部分组织或者其祖组织的范围内适当确定。由于通过缩短该时间，能够期待高效分化诱导至目的垂体或其部分组织或者其祖组织，所以该时间越短越好。优选为在24小时内，更优选为12小时内，进一步优选为6小时内，最优选为2～3小时内，形成多能干细胞聚集体。本领域技术人员可以通过调整聚集细胞的工具、离心条件等来适当调节形成该聚集体的时间。

另外，可以适当设定聚集体形成时的培养温度、CO₂浓度等其他培养条件。培养温度没有特别限定，例如为约30～40℃，优选为约37℃。另外，CO₂浓度例如为约1～10％，优选为约5％。

此外，通过准备多个相同培养条件下的培养隔室，在各培养隔室中形成一个多能干细胞聚集体，从而能够得到质量均一的多能干细胞的聚集体的群体。多能干细胞聚集体的质量均一可以基于聚集体的尺寸和数量、宏观形态、组织染色的微观形态及其均一性、分化和未分化标记物的表达及其均一性、分化标记物的表达控制及其同步性、聚集体之间分化效率的再现性进行评价。在一个实施方式中，本发明方法中使用的多能干细胞聚集体的群体在聚集体中所含的多能干细胞的数量是均一的。关于特定的参数，多能干细胞聚集体的群体“均一”是指多能干细胞聚集体的群体全体中90％以上的聚集体在该聚集体的群体中该参数的平均值±10％的范围内，优选为在该平均值的±5％的范围内。

(3)腺垂体和/或其祖组织的诱导

在本发明中，含有腺垂体和/或其祖组织的细胞聚集体可以通过包括将多能干细胞的聚集体在含有成骨因子信号通路活化物质和音猬因子(Sonic hedgehog，Shh)信号通路作用物质的培养基中悬浮培养的步骤的方法得到。

在本发明中，腺垂体是指含有至少一种垂体前叶或中叶的垂体激素产生细胞的组织。作为垂体激素产生细胞，可列举生长激素(GH)产生细胞、催乳素(PRL)产生细胞、促肾上腺皮质激素(ACTH)产生细胞、促甲状腺激素(TSH)产生细胞和卵泡刺激素(FSH)产生细胞、促黄体生成素(LH)产生细胞等构成前叶的细胞；促黑素细胞激素(MSH)产生细胞等构成中叶的细胞。除了表达对于每种细胞特异性的垂体激素之外，这些垂体激素产生细胞还可以将EpCAM作为标记物进行表达。在一个实施方式中，腺垂体含有选自GH产生细胞、PRL产生细胞、ACTH产生细胞、TSH产生细胞、FSH产生细胞和LH产生细胞中的至少一种，优选含有两种以上(2、3、4、5或6种)的垂体激素产生细胞。在进一步的实施方式中，腺垂体含有选自GH产生细胞、PRL产生细胞和ACTH产生细胞的至少一种垂体激素产生细胞，优选含有两种，更优选含有三种。

在本发明中，组织是指具有形态、性质不同的多种细胞以一定的形式立体配置的结构的细胞群体的结构体。

作为腺垂体的祖组织，可列举垂体基板(placode)、拉特克囊(Rathke's pouch)。垂体基板是胚胎发生过程中在表皮外胚层区域(口腔外胚层)所形成的肥厚结构，至少可以表达垂体祖细胞标记物EpCAM和Lhx3或Pitx1，优选可以全部表达EpCAM、Lhx3和Pitx1。拉特克囊是指垂体基板内陷形成的袋状结构。拉特克囊与垂体基板一样，至少可以表达垂体祖细胞标记物EpCAM和Lhx3或Pitx1，优选可以全部表达EpCAM、Lhx3和Pitx1。另外，作为垂体祖细胞标记物，还可以进一步确认上述之外的Isl1/2、细胞角蛋白(cytokeratin)等的表达。本说明书中，将至少能够表达垂体祖细胞标记物EpCAM和Lhx3或Pitx1的细胞称为垂体祖细胞，该垂体祖细胞优选可以全部表达EpCAM、Lhx3和Pitx1。另外，本说明书中也将垂体祖细胞称为垂体激素产生细胞的祖细胞。

作为说明书中的“含有垂体腺体和/或其祖组织的细胞聚集体”，可列举例如对选自LHX3、NKX2.1、PITX1和ACTH中的至少一种标记物呈阳性的细胞聚集体。

此外，作为“含有腺垂体和/或其祖组织的细胞聚集体”，可列举例如对LHX3、NKX2.1、PITX1和ACTH呈阳性的细胞聚集体。

本发明的分离方法和制造方法中使用的含有腺垂体和/或其祖组织的细胞聚集体可以通过以下方法制造。具体地，该方法包括通过将多能干细胞的聚集体在含有成骨因子信号通路活化物质和Shh信号通路作用物质的培养基中悬浮培养，得到含有下丘脑神经上皮组织和表皮外胚层(包含口腔外胚层)(以下存在简称为表皮外胚层的情况)的细胞聚集体(第一培养步骤)，以及通过将得到的含有下丘脑神经上皮组织和表皮外胚层(包含口腔外胚层)的细胞聚集体在含有成骨因子信号通路活化物质和Shh信号通路作用物质的培养基中进一步进行悬浮培养，得到1)下丘脑神经上皮组织、和2)含有垂体基板和/或拉特克囊的细胞聚集体(第二培养步骤)。通过第一培养步骤诱导从多能干细胞分化至下丘脑神经上皮组织和表皮外胚层(包含口腔外胚层)，通过将所得到的含有下丘脑神经上皮组织和表皮外胚层(包括口腔外胚层)的细胞聚集体进行第二培养步骤，诱导从表皮外胚层区域(口腔外胚层)进一步分化至垂体基板和/或拉特克囊。

在本发明的分离方法和制造方法中，含有腺垂体和/或其祖组织的细胞聚集体可以是通过第二培养步骤所得到的细胞聚集体。

(3.1)第一培养步骤

在第一培养步骤中，将多能干细胞的聚集体在含有成骨因子信号通路活化物质和Shh信号通路作用物质的培养基中悬浮培养。

多能干细胞聚集体的“悬浮培养”是指将多能干细胞聚集体在培养基中相对于培养容器在非粘附条件下的培养。这样使得能够有效地诱导腺垂体或其祖组织，这在以前是困难的。

用于悬浮培养的培养基含有成骨因子信号通路活化物质和Shh信号通路作用物质。通过成骨因子信号通路活化物质和Shh信号通路作用物质的作用，诱导从多能干细胞分化至下丘脑神经上皮组织和表皮外胚层。

在本发明中，成骨因子信号通路活化物质是指通过成骨因子和受体的结合来活化传递信号的通路的任何物质。作为成骨因子信号通路活化物质的示例可列举例如BMP2、BMP4、BMP7、GDF5等。优选地，成骨因子信号通路活化物质为BMP4。以下主要记载BMP4，但是本发明中所使用的成骨因子信号通路活化物质不限于BMP4。BMP4是一种公知的细胞因子(cytokine)，其氨基酸序列也是公知的。本发明中使用的BMP4是哺乳动物BMP4。作为哺乳动物，可列举例如小鼠、大鼠、仓鼠(hamster)、豚鼠(marmotte)等齿类或兔等实验动物；猪、牛、山羊、马、绵羊等家畜；狗、猫等宠物；人、猴、猩猩(orangutan)、黑猩猩(chimpanzee)等灵长类动物。BMP4优选为啮齿(小鼠、大鼠等)或灵长类(人等)的BMP4，最优选为人BMP4。人BMP4是指具有人在体内天然表达的BMP4的氨基酸序列的BMP4。作为人BMP4代表性氨基酸序列，可示例如分别从NCBI的登记号NP_001193.2(2013年6月15日更新)、NP_570911.2(2013年6月15日更新)、NP_570912.2(2013年6月15日更新)这些氨基酸序列的去除了N末端信号序列(1-24)的氨基酸序列(成熟型人BMP4氨基酸序列)等。

在本发明中，作为Shh信号通路作用物质没有特别限制，只要其能够增强通过Shh介导的信号传递即可。作为Shh信号通路作用物质可列举但不限于属于Hedgehog家族的蛋白或其片段(例如Sh、Ihh、Sh(C24 II)N-Terminus、Sh(C25 II)N-Terminus)、Sh受体、Sh受体激动剂、Purmorphamine、Smoothened激动剂(SAG)(3-氯-N-[反式-4-(甲氨基)环己基]-N-[[3-(4-吡啶基)苯基]甲基]-苯并[b]噻吩-2-甲酰胺)等。其中，优选SAG。

成骨因子信号通路活化物质和Shh信号通路作用物质的优选组合是BMP4和SAG。

培养基中成骨因子信号通路活化物质的浓度在细胞聚集体中能够诱导从多能干细胞分化至下丘脑神经上皮组织和表皮外胚层的范围内可以适当设置，但是，使用BMP4作为成骨因子信号通路活化物质时，其浓度通常为0.01nM以上，优选0.1nM以上，更优选1nM以上。上限值没有特别限制，只要不对分化至下丘脑神经上皮组织和表皮外胚层产生不利影响即可，从培养成本的观点看，通常为1000nM以下，优选为100nM以下，更优选为10nM以下。在一个实施方式中，培养基中的BMP4浓度通常为0.01～1000nM，优选0.1～100nM，更优选1～10nM(例如，5nM)。由于尤其是有助于1)积极形成表皮外胚层、2)在细胞聚集体内分化诱导非大脑的下丘脑的神经上皮组织，所以培养基中以可以实现这些效果的浓度含有外源性成骨因子信号通路活化物质。

在整个第一培养步骤期间，培养基中可以不含成骨因子信号通路活化物质。例如，可以从开始悬浮培养多能干细胞聚集体的2～4天(例如，3天)，培养基中不添加成骨因子信号通路活化物质，之后，向培养基中添加成骨因子信号通路活化物质。

培养基中Shh信号通路作用物质的浓度在细胞聚集体中能够诱导从多能干细胞分化至下丘脑神经上皮组织和表皮外胚层的范围内可以适当设置，但是，使用SAG作为Shh信号通路作用物质时，其浓度通常为1nM以上，优选10nM以上，更优选100nM以上。上限值没有特别限制，只要不对分化为下丘脑神经上皮组织和表皮外胚层产生不利影响即可，从培养成本的观点看，通常为1000μM以下，优选为100μM以下，更优选为10μM以下。在一个实施方式中，培养基中的SAG浓度通常为1nM～1000μM，优选10nM～100μM，更优选100nM～10μM(例如，2μM)。由于尤其可以实现在细胞聚集体内分化诱导非神经视网膜的下丘脑(优选腹侧下丘脑)的神经上皮组织的作用，所以培养基中含有可以实现该效果的浓度的外源性Shh信号通路作用物质。

在整个第一培养步骤期间，培养基中可以不含Shh信号通路作用物质。例如，从开始悬浮培养多能干细胞聚集体的5～7天(例如，6天)，培养基中不添加Shh信号通路作用物质，之后，可以向培养基中添加Shh信号通路作用物质。

在一个实施方式中，将多能干细胞聚集体在不含成骨因子信号通路活化物质和Shh信号通路作用物质的培养基中悬浮培养2～4天，然后将得到的聚集体在含有成骨因子信号通路活化物质但不含Shh信号通路作用物质的培养基中悬浮培养2～4天，接着在含有成骨因子信号通路活化物质和Shh信号通路作用物质的培养基中培养所得到的聚集体直至被诱导为下丘脑神经上皮组织和表皮外胚层。

本发明中所使用的BMP4等成骨因子信号通路活化物质优选为被分离。“分离”是指进行去除目的成分或细胞以外的因子的操作，脱离天然存在的状态的意思。从而，在“被分离的蛋白质X”中，不包含由待培养的细胞或组织所产生的内源性蛋白质X。“被分离的蛋白质X”的纯度(蛋白质X占总蛋白质重量的重量百分比)通常为70％以上，优选为80％以上，更优选为90％以上，进一步优选为99％以上，最优选为100％。悬浮培养所用的培养基中所含的被分离的成骨因子信号通路活化物质为向培养基中外源性添加的。从而，在一个实施方式中，包括向第一培养步骤使用的培养基中外源性添加成骨因子信号通路活化物质的步骤。

为了抑制由分散造成所诱导的多能干细胞(尤其是人多能干细胞)的细胞死亡，第一培养步骤中使用的培养基优选从培养开始时添加Rho关联卷曲螺旋(Rho-associatedcoiled-coil)激酶(ROCK)的抑制剂(日本特开2008-99662)。从培养开始时例如15天内、优选10天内、更优选6天内添加ROCK抑制剂。作为ROCK抑制剂，可列举Y-27632((+)-(R)-反式-4-(1-氨基乙基)-N-(4-吡啶基)环己甲酰胺二盐酸盐)等。用于悬浮培养的ROCK抑制剂的浓度是能够抑制分散导致诱导的多能干细胞的细胞死亡的浓度。例如，对于Y-27632，这样的浓度通常为约0.1～200μM，优选为约2～50μM。ROCK抑制剂的浓度可以在添加期间变化，例如，在期间后半期可以使浓度减半。

悬浮培养细胞聚集体所使用的培养基可以将培养哺乳动物细胞的培养基作为基础培养基来制备。作为基础培养基没有特别限制，只要能够用于培养哺乳动物细胞即可，例如，BME培养基、BGJb培养基、CMRL 1066培养基、Glasgow MEM培养基、改良MEM Zinc Option培养基、IMDM培养基、Medium 199培养基、Eagle MEM培养基、αMEM培养基、DMEM培养基、Ham培养基、Ham's F-12培养基、RPMI1640培养基、Fischer's培养基、Neurobasal培养基以及它们的混合培养基(例如DMEM/F-12培养基(DMEM培养基：Ham's F-12培养基＝1:1混合培养基)等)。在一个方案中，使用IMDM培养基与Ham's F-12培养基的混合培养基。混合比例如为IMDM:Ham's F-12＝0.8～1.2:1.2～0.8的体积比。

用于培养的培养基可以是含血清培养基或无血清培养基。从避免化学上未确定的成分混入的观点来看，用于细胞聚集体的悬浮培养的培养基优选为无血清培养基。

悬浮培养细胞聚集体所使用的培养基可以含有血清替代物。血清替代物可以适当含有例如白蛋白、转铁蛋白(transferrin)、脂肪酸、胶原蛋白前体、微量元素、2-巯基乙醇或3'硫醇甘油、或者它们的等价物等。这样的血清替代物可以例如通过WO98/30679记载的方法来制备。此外，为了更方便地实施本发明的方法，可以使用市售的血清替代品。作为这样的市售血清替代物，可列举例如KSR(knockout serum replacement，敲除血清替代物)(Invitrogen公司制)、Chemically-defined Lipid concentrated(Gibco公司制)和Glutamax(Gibco公司制)。

在不会对从多能干细胞分化诱导为下丘脑神经上皮组织和表皮外胚层产生不利影响的范围内，悬浮培养细胞聚集体所使用的培养基可以含有其他添加剂。作为添加剂，可列举但不限于胰岛素、铁源(例如转铁蛋白)、矿物质(例如硒酸钠等)、糖类(例如葡萄糖等)、有机酸(例如丙酮酸、乳酸等)、血清蛋白(例如白蛋白等)、氨基酸(例如L-谷氨酰胺等)、还原剂(例如2-巯基乙醇等)、维生素类(例如抗坏血酸、d-生物素等)、抗生素(例如链霉素、青霉素、庆大霉素等)、缓冲剂(例如HEPES等)等。

在一个实施方式中，在不会对分化诱导为下丘脑神经上皮组织和表皮外胚层产生不利影响的观点看，悬浮培养细胞聚集体所用的培养基为在不含本说明书中特别记载在培养基中含有的物质以外的生长因子(growth factor)的化学合成培养基(growth-factor-free Chemically Defined Medium；gfCDM)中添加血清替代物(KSR等)的培养基。在这里所称的“生长因子”中包含Fgf；BMP；Wnt、Nodal、Notch和Shh等模式形成因子；胰岛素和富含脂质的白蛋白(Lipid-rich albumin)。作为不含生长因子的化学合成培养基包括可列举例如在Wataya et al,Proc Natl Acad Sci USA,105(33):11796-11801,2008中公开的gfCDM。

可以适当设定悬浮培养细胞聚集体中的培养温度、CO₂浓度、O₂浓度等其他培养条件。培养温度例如为约30～40℃，优选为约37℃。CO₂浓度例如为约1～10％，优选为约5％。O₂浓度例如为约20％。

在一个优选的实施方式中，在含有成骨因子信号通路活化物质和Shh信号通路作用物质的培养基中悬浮培养质量均一的多能干细胞聚集体群体。通过使用质量均一的多能干细胞聚集体群体，可以将聚集体之间分化到腺垂体或其祖组织的程度差异抑制到最小限度，提高作为目的的分化诱导的效率。在悬浮培养质量均一的多能干细胞聚集体群体中，包括以下方案：

1)准备多个培养隔室，接种质量均一的多能干细胞聚集体的群体，以使一个培养隔室中含有一个多能干细胞聚集体。(例如，在96孔板的各孔中各放入一个多能干细胞聚集体。)从而，各培养隔室中，用含有成骨因子信号通路活化物质和Shh信号通路作用物质的培养基悬浮培养一个多能干细胞聚集体。

2)将质量均一的多能干细胞聚集体接种到一个培养隔室，以使一个培养隔室中含有多个多能干细胞聚集体。(例如，将多个多能干细胞聚集体放入10cm的培养皿中。)从而，在该隔室中，用含有成骨因子信号通路活化物质和Shh信号通路作用物质的培养基悬浮培养多个多能干细胞聚集体。

通过本发明的方法，可以采用上述1)和2)的任一方案，另外，在培养过程中可以改变方案<1)方案变成2)方案，或2)方案变成1)方案>。在一个方案中，在第一培养步骤中采用1)的方案，在第二培养步骤中采用2)的方案。

第一培养步骤在充分的时间内实施诱导从多能干细胞分化至下丘脑神经上皮组织和表皮外胚层。分化至下丘脑神经上皮组织和表皮外胚层例如可以通过RT-PCR、或使用下丘脑神经上皮组织或表皮外胚层标记物特异性抗体的免疫组织化学进行检测。例如，实施至培养中的细胞聚集体中10％以上、优选30％以上、更优选50％的细胞聚集体含有下丘脑神经上皮组织和表皮外胚层。由于培养时间可以根据多能干细胞的动物种类、成骨因子信号通路活化物质和Shh信号通路作用物质的种类而变动，因此不能一概而论，例如使用人多能干细胞时，第一培养步骤通常为15～20天(例如，18天)。

通过进行第一培养步骤，可以得到含有下丘脑神经上皮组织和表皮外胚层(包括口腔外胚层)的细胞聚集体。

下丘脑神经上皮组织是指表达下丘脑标记物的神经上皮组织，是包括可分化至构成下丘脑的细胞(例如神经元、神经胶质细胞等)而且具有自我复制能力的下丘脑祖细胞、和通过分化失去自我复制能力的神经元、神经胶质细胞等的组织。下丘脑神经上皮组织中下丘脑祖细胞和其分化细胞的比例因分化程度变化，但是，已经证实，通过长期培养多能干细胞直至腺垂体分化的细胞团中，许多下丘脑祖细胞分化为下丘脑神经元(Cell Reports,30,18-24,January 7,2020)。在下丘脑中，包括腹侧下丘脑和背侧下丘脑。作为下丘脑标记物，可列举NKx2.1(腹侧下丘脑标记物)和Pax6(背侧下丘脑标记物)等。在一个实施方式中，腹侧下丘脑神经上皮组织是Rx阳性、Chx10阴性、Pax6阴性且Nkx2.1阳性神经上皮组织。在一个实施方式中，背侧下丘脑神经上皮组织是Rx阳性、Chx10阴性、Nkx2.1阴性和Pax6阳性的神经上皮组织。在第一培养步骤中所得到的细胞聚集体中所含的下丘脑神经上皮组织，优选为腹侧下丘脑神经上皮组织。上述任一种丘脑神经上皮组织中，不表达EpCAM，这显示构成下丘脑神经上皮组织的全部细胞(不仅是丘脑祖细胞，而且失去自我复制能力的神经元、神经胶质细胞等)中不表达EpCAM。

表皮外胚层是胚胎发生中在胚胎表面所形成的外胚层细胞层。作为表皮外胚层标记物，可列举广谱细胞角蛋白(pan-cytokeratin)。表皮外胚层通常可分化为垂体前叶、皮肤、口腔上皮、牙釉质(enamel)、皮肤腺等。在一个实施方式中，表皮外胚层是E-钙粘蛋白阳性且广谱细胞角蛋白阳性的细胞层。

优选地，在第一培养步骤中所得到的细胞聚集体中，构成下丘脑神经上皮组织占据细胞聚集体的内部，单层表皮外胚层细胞构成细胞聚集体的表面。表皮外胚层可以在其一部分中包括肥厚的表皮基板。

(3.2)第二培养步骤

在第二培养步骤中，通过将第一培养步骤所得到的含有下丘脑神经上皮组织和表皮外胚层(包括口腔外胚层)的细胞聚集体在含有成骨因子信号通路活化物质和Shh信号通路作用物质的培养基中进一步悬浮培养，得到含有1)下丘脑神经上皮组织及2)垂体基板和/或拉特克囊的细胞聚集体。通过成骨因子信号通路活化物质和Shh信号通路作用物质的作用，诱导从表皮外胚层分化成垂体基板和/或拉特克囊。

成骨因子信号通路活化物质和Shh信号通路作用物质的定义如在第一培养步骤的说明中的描述。

优选地，在第二培养步骤中使用的成骨因子信号通路活化物质与第一培养步骤相同，为BMP4。优选地，在第二培养步骤中使用的Shh信号通路作用物质与第一培养步骤相同，为SAG。

优选地，成骨因子信号通路活化物质和Shh信号通路作用物质的组合为BMP4和SAG。

培养基中成骨因子信号通路活化物质的浓度可以在细胞聚集体中能够诱导从表皮外胚层分化至垂体基板和/或拉特克囊的范围内适当设置，但是，使用BMP4作为成骨因子信号通路活化物质时，其浓度通常为0.01nM以上，优选0.1nM以上，更优选1nM以上。上限值没有特别限制，只要不对从表皮外胚层分化至垂体基板和/或拉特克囊产生不利影响即可，从培养成本的观点看，通常为1000nM以下，优选为100nM以下，更优选为10nM以下。在一个实施方式中，培养基中的BMP4浓度通常为0.01～1000nM，优选0.1～100nM，更优选1～10nM(例如，5nM)。成骨因子信号通路活化物质的浓度在添加期间内可以变化，例如在第二培养步骤开始时的上述浓度，每2～4天将比例减半，可以逐步降低浓度。

培养基中Shh信号通路作用物质的浓度可以在细胞聚集体中能够诱导从表皮外胚层分化至垂体基板和/或拉特克囊的范围内适当设置，但是，使用SAG作为Shh信号通路作用物质时，其浓度通常为1nM以上，优选10nM以上，更优选100nM以上。上限值没有特别限制，只要不对从表皮外胚层分化至垂体基板和/或拉特克囊产生不利影响即可，从培养成本的观点看，通常为1000μM以下，优选为100μM以下，更优选为10μM以下。在一个实施方式中，培养基中的SAG浓度通常为1nM～1000μM，优选为10nM～100μM，更优选为100nM～10μM(例如，2μM)。

在一个优选的实施方式中，用于第二培养步骤的培养基含有FGF2。FGF2促进从表皮外胚层分化为垂体基板。

FGF2也称为碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，是一种公知的细胞因子，其氨基酸序列也是公知的。本发明中使用的FGF2是通常的哺乳动物的FGF2。作为哺乳动物，可列举上述的哺乳动物。FGF2由于在许多哺乳动物物种之间具有交叉反应性，所以只要实现本发明的目的，可以使用任何哺乳动物FGF2，优选使用与培养细胞同种哺乳动物的FGF2。例如，使用啮齿类(小鼠、大鼠等)或灵长类(人等)FGF2。这里，小鼠FGF2是指FGF2具有在小鼠体内天然表达的FGF2的氨基酸序列。在本说明书中，对其他蛋白质等也进行同样的解释。作为小鼠FGF2的代表性氨基酸序列，可示例如NCBI登记号NP_032032.1(2014年2月18日更新)、从该氨基酸序列去除N末端信号序列(1-9)后的氨基酸序列(成熟型小鼠FGF2氨基酸序列)等。作为人FGF2的代表性氨基酸序列，可示例如NCBI登记号NP_001997.5(2014年2月18日更新)等。

培养基中的FGF2浓度没有特别限制，只要可以促进从表皮外胚层向垂体基板的分化即可，通常为1ng/ml以上，优选为10ng/ml以上。FGF2浓度的上限值没有特别限定，只要不对垂体基板和/或拉特克囊的分化产生不利影响即可，但从培养成本的观点看，通常为1000ng/ml以下，优选为500ng/ml以下。在一个实施方式中，培养基中FGF2的浓度通常为1～1000ng/ml，优选10～100ng/ml。

本发明中所使用的BMP4等成骨因子信号通路活化物质和FGF2优选是被分离的。第二培养步骤中所使用的培养基中所含被分离的成骨因子信号通路活化物质和被分离的FGF2可以外源性地向培养基中添加。从而，在一个实施方式中，本发明将被分离的成骨因子信号通路活化物质(以及任意被分离的FGF2)外源地添加到用于第二培养步骤的培养基中。

第二培养步骤所用的培养基与第一培养步骤所用的培养基相同，可以以培养哺乳动物细胞中所用的培养基为基础培养基来制备。作为基础培养基没有特别限制，只要是能够用于培养哺乳动物细胞的培养基即可，例如，BME培养基、BGJb培养基、CMRL 1066培养基、Glasgow MEM培养基、改良MEM Zinc Option培养基、IMDM培养基、Medium 199培养基、EagleMEM培养基、αMEM培养基、DMEM培养基、Ham培养基、Ham's F-12培养基、RPMI1640培养基、Fischer's培养基、Neurobasal培养基以及它们的混合培养基(例如DMEM/F-12培养基(DMEM培养基：Ham's F-12培养基＝1:1混合培养基)等)。在一个方案中，使用IMDM培养基与Ham'sF-12培养基的混合培养基。混合比例如为IMDM:Ham's F-12＝0.8～1.2:1.2～0.8的体积比。

用于培养的培养基可以是含血清培养基或无血清培养基。从避免化学上未确定的成分混入的观点来看，悬浮培养细胞聚集体所用的培养基优选为无血清培养基。

悬浮培养细胞聚集体所使用的培养基可以含有血清替代物。血清替代物可以适当含有例如白蛋白、转铁蛋白(transferrin)、脂肪酸、胶原蛋白前体、微量元素、2-巯基乙醇或3'硫醇甘油、或者它们的等价物等。这样的血清替代物可以例如通过WO98/30679记载的方法来制备。此外，为了更方便地实施本发明的方法，可以使用市售的血清替代物。作为这样的市售血清替代物，可列举例如KSR(knockout serum replacement，敲除血清替代物)(Invitrogen公司制)、Chemically-defined Lipid concentrated(Gibco公司制)和Glutamax(Gibco公司制)。

在不会对从表皮外胚层分化诱导为垂体基板和拉特克囊产生不利影响的范围内，悬浮培养细胞聚集体所使用的培养基可以含有其他添加剂。作为添加剂，可列举但不限于胰岛素、铁源(例如转铁蛋白)、矿物质(例如硒酸钠等)、糖类(例如葡萄糖等)、有机酸(例如丙酮酸、乳酸等)、血清蛋白(例如白蛋白等)、氨基酸(例如L-谷氨酰胺等)、还原剂(例如2-巯基乙醇等)、维生素类(例如抗坏血酸、d-生物素等)、抗生素(例如链霉素、青霉素、庆大霉素等)、缓冲剂(例如HEPES等)等。

在一个实施方式中，从不会对分化诱导为垂体基板和/或拉特克囊产生不利影响的观点看，悬浮培养细胞聚集体所用的培养基为在不含本说明书中特别记载在培养基含有的物质以外的生长因子(growth factor)的化学合成培养基(growth-factor-freeChemically Defined Medium；gfCDM)中添加血清替代物(KSR等)的培养基。在这里所称的“生长因子”中包含Fgf；BMP；Wnt、Nodal、Notch、Shh等模式形成因子；胰岛素和富含脂质的白蛋白(Lipid-rich albumin)。作为不含生长因子的化学合成培养基可列举例如在Watayaet al,Proc Natl Acad Sci USA,105(33):11796-11801,2008中公开的gfCDM。

第二培养步骤中的悬浮培养优选在高氧分压条件下进行。通过在高氧分压条件下，进一步悬浮培养含有下丘脑神经上皮组织和表皮外胚层的细胞聚集体，实现氧到达细胞聚集体内部以及使细胞聚集体长时间的维持培养，从而能够高效分化诱导为垂体基板和/或拉特克囊。

高氧分压条件是指高于空气中的氧分压(20％)的氧分压条件。第二培养步骤中的氧分压例如为30～60％，优选为35～60％，更优选为38～60％。

可以适当设定第二培养步骤中的培养温度、CO₂浓度等其他培养条件。培养温度例如为约30～40℃，优选为约37℃。另外，CO₂浓度例如为约1～10％，优选为约5％。

第二培养步骤在充分的时间内实施诱导从表皮外胚层分化为垂体基板和/或拉特克囊。通过实施第二培养步骤，在表皮外胚层(更具体地，在口腔外胚层)中形成垂体基板。此外，一部分或全部的垂体基板可以向细胞聚集体内部(即相邻的下丘脑神经上皮)内陷以形成拉特克囊。从表皮外胚层向垂体基板和/或拉特克囊的分化中，表皮外胚层和下丘脑神经上皮组织(优选为下丘脑腹侧神经上皮组织)的相互作用是必不可少的，在本发明中，通过第一培养步骤，在细胞细胞聚集体中同时形成下丘脑神经上皮组织和表皮外胚层，在一个优选的实施方式中，下丘脑神经上皮组织占据细胞聚集体的内部，单层表皮外胚层细胞构成细胞聚集体的表面。结果，在细胞聚集体内，使相邻的表皮外胚层和下丘脑神经上皮组织之间的良好相互作用成为可能，能够在体外(in vitro)再现表皮外胚层中垂体基板的形成、垂体基板内陷、拉特克囊的形成等胚胎发生中垂体自组织化的过程。分化为垂体基板和/或拉特克囊可以通过例如通过使用对垂体祖细胞标记物(例如，EpCAM、Pitx1、Lhx3等)的特异性抗体的免疫组织化学、通过检测垂体祖细胞标记物阳性的基本或袋状结构来确认。例如，实施第二培养步骤直至培养的细胞聚集体中10％以上、优选30％以上、更优选50％以上的细胞聚集体包含垂体基板和/或拉特克囊。由于培养时间可以根据多能干细胞的动物种类、成骨因子信号通路活化物质和Shh信号通路作用物质的种类而变动，因此不能一概而论，例如使用人多能干细胞时，第二培养步骤通常为6天以上，例如为6～12天。

通过进行第二培养步骤，可以得到含有1)下丘脑神经上皮组织、和2)垂体基板和/或拉特克囊的细胞聚集体。在本发明的分离方法和制造方法中，含有腺垂体和/或其祖组织的细胞聚集体可以是通过第二培养步骤所得到的细胞聚集体。

(3.3)第三培养步骤

通过将第二培养步骤所得到的含有1)下丘脑神经上皮组织、和2)垂体基板和/或拉特克囊的细胞聚集体在含有Shh信号通路作用物质的培养基中进一步进行悬浮培养，能够得到含有腺垂体的细胞聚集体(第三培养步骤)。通过第三培养步骤，诱导从垂体基板和/或拉特克囊分化为垂体激素产生细胞，在垂体基板和/或拉特克囊中产生垂体激素产生细胞，形成腺垂体。

在本发明的分离方法和制造方法中，含有腺垂体和/或其祖组织的细胞聚集体可以是通过第三培养步骤所得到的细胞聚集体。

Shh信号通路作用物质的定义如第一个培养步骤说明中所述。

优选地，在第三培养步骤中使用的Shh信号通路作用物质与第一和第二培养步骤中相同，为SAG。

培养基中Shh信号通路作用物质的浓度可以在细胞聚集体中能够诱导从垂体基板和/或拉特克囊分化至垂体激素产生细胞的范围内适当设置，但是，使用SAG作为Shh信号通路作用物质时，其浓度通常为1nM以上，优选10nM以上，更优选100nM以上。上限值没有特别限制，只要不对分化至垂体激素产生细胞产生不利影响即可，从培养成本的观点看，通常为1000μM以下，优选为100μM以下，更优选为10μM以下。在一个实施方式中，培养基中的SAG浓度通常为1nM～1000μM，优选为10nM～100μM，更优选为100nM～10μM(例如，2μM)。

在一个优选的实施方式中，用于第三培养步骤的培养基含有FGF2。FGF2促进从垂体基板和/或拉特克囊分化为垂体激素产生细胞。

FGF2的定义如第二培养步骤的说明所述。

培养基中的FGF2浓度没有特别限制，只要可以促进从垂体基板和/或拉特克囊向垂体激素产生细胞的分化即可，通常为1ng/ml以上，优选为10ng/ml以上。FGF2浓度的上限值没有特别限定，只要不对向垂体激素产生细胞的分化产生不利影响即可，但从培养成本的观点看，通常为1000ng/ml以下，优选为500ng/ml以下。在一个实施方式中，培养基中FGF2的浓度通常为1～1000ng/ml，优选为10～100ng/ml。

在一个优选的实施方式中，第三培养步骤中使用的培养基含有Notch信号抑制剂。Notch信号抑制剂促进从垂体基板和/或拉特克囊分化为垂体激素产生细胞(尤其是ACTH产生细胞)。通过Notch信号抑制剂提高上游调节ACTH产生的转录因子Tbx19的表达。

Notch信号抑制剂没有特别限制，只要能够抑制Notch介导的信号传递即可。作为Notch信号抑制剂，可列举例如DAPT(N-[N-(3,5-二氟苯乙酰)-l-丙氨酰]-S-苯基甘氨酸叔丁酯)、DBZ、MDL28170等γ分泌酶抑制剂(γ-Secretase Inhibitor)，其中优选DAPT。

培养基中的Notch信号抑制剂的浓度没有特别限制，只要能够促进从垂体基板和/或拉特克囊分化为垂体激素产生细胞(尤其是ACTH产生细胞)的浓度即可，例如，为DAPT时，通常为0.1μM以上，优选为1μM以上。DAPT浓度的上限值没有特别限制，只要不对向垂体激素产生细胞的分化产生不利影响即可，从培养成本的观点看，通常为1000μM以下，优选为100μM以下。在一个实施方式中，培养基中的DAPT浓度通常为0.1～1000μM，优选1～100μM(例如，10μM)。

在第三培养步骤中，不需要向培养基中添加成骨因子信号通路活化物质。在一个实施方式中，第三培养步骤中使用的培养基不含成骨因子信号通路活化物质。

本发明中所使用的FGF2优选是被分离的。第三培养步骤中所使用的培养基中所含的被分离的FGF2为外源性地添加到培养基中。因此，在一个实施方式中，本发明包括将被分离的FGF2外源性地添加到第二培养步骤使用培养基中的步骤。

在第三培养步骤中，可以通过向培养基中添加肾上腺皮质激素(corticosteroid)类，来用肾上腺皮质激素类处理细胞聚集体。通过肾上腺皮质激素类处理，促进从垂体基板和/或拉特克囊分化为垂体激素产生细胞(即，GH产生细胞、PRL产生细胞、TSH产生细胞、LH产生细胞、FSH产生细胞等)。作为肾上腺皮质激素类，可列举但不限于如氢化可的松(hydrocortisone)、醋酸可的松(cortisone acetate)和醋酸氟氢可的松等天然糖皮质激素；地塞米松(dexamethasone)、倍他米松(betamethasone)、氢化泼尼松(prednisolone)、甲基泼尼松龙(methylprednisolone)和曲安西龙(triamcinolone)等人工合成的糖皮质激素等。

培养基中的肾上腺皮质激素类的浓度没有特别限制，只要能够促进从垂体基板和/或拉特克囊向垂体激素产生细胞(但是，ACTH产生细胞除外)的分化即可，另外，可以根据肾上腺皮质激素类的种类适当设定，例如为氢化可的松时，通常为100ng/ml以上，优选为1μg/ml以上。氢化可的松的浓度的上限值没有特别限制，只要不对向垂体激素产生细胞(但是，ACTH产生细胞除外)的分化产生不利影响即可，但从培养成本的观点看，通常为1000μg/ml以下，优选100μg./ml以下。在一个实施方式中，培养基中氢化可的松的浓度通常为100ng/ml～1000μg/ml，优选为1～100μg/ml。使用地塞米松作为肾上腺皮质激素类时，其培养基浓度可以为氢化可的松的1/25左右。

在第三培养步骤中，向培养基中添加肾上腺皮质激素类的时间没有特别限定，只要能够促进从垂体基板和/或拉特克囊向垂体激素产生细胞(ACTH产生细胞除外)的分化即可。可以从第三培养步骤开始时向培养基中添加肾上腺皮质激素类，也可以在第三培养步骤开始后，在不添加肾上腺皮质激素类的培养基中培养一定时间后，向培养基中添加肾上腺皮质激素类。优选地，在第三培养步骤开始后，当在细胞聚集体中确认出现ACTH产生细胞的阶段，添加肾上腺皮质激素类到培养基中。即，在未添加肾上腺皮质激素类的培养基中培养细胞聚集体，直到在细胞聚集体中确认出现ACTH产生细胞，在确认ACTH产生细胞出现后，在含有肾上腺皮质激素类的培养基中继续进行第三培养步骤。ACTH产生细胞的出现可以通过使用对ACTH的抗体的免疫组织学染色来确认。当使用人多能干细胞时，通常可以在第三培养步骤开始后37天以后有望出现ACTH产生细胞。在一个实施方式中，第三培养步骤开始37天以后向培养基中添加肾上腺皮质激素类。

用肾上腺皮质激素类处理细胞聚集体的时间没有特别限制，只要可以促进从垂体基板和/或拉斯克囊向垂体激素产生细胞(除ACTH产生细胞之外)的分化即可，通常，与非肾上腺皮质激素类处理组比较，在肾上腺皮质激素类处理组中，用肾上腺皮质激素类处理细胞聚集体至确认促进向垂体激素产生细胞(除ACTH产生细胞之外)分化。处理时间通常为7天以上，优选12天以上。处理时间的上限值没有特别限制，与非肾上腺皮质激素类处理组比较，在确认肾上腺皮质激素类处理组中促进向垂体激素产生细胞(除ACTH产生细胞之外)的分化的阶段，从培养基中除去肾上腺皮质激素类。

需要说明的是，向培养基中添加肾上腺皮质激素类通过反馈抑制而对ACTH产生细胞的分化诱导起到抑制作用。

第三培养步骤所使用的培养基与第一和第二培养步骤所用的培养基相同，可以以培养哺乳动物细胞所用的培养基为基础培养基来制备。作为基础培养基没有特别限制，只要能够用于培养哺乳动物细胞即可，例如，BME培养基、BGJb培养基、CMRL 1066培养基、Glasgow MEM培养基、改良MEM Zinc Option培养基、IMDM培养基、Medium 199培养基、EagleMEM培养基、αMEM培养基、DMEM培养基、Ham培养基、Ham's F-12培养基、RPMI1640培养基、Fischer's培养基、Neurobasal培养基以及它们的混合培养基(例如DMEM/F-12培养基(DMEM培养基：Ham's F-12培养基＝1:1混合培养基)等)。在一个方案中，使用IMDM培养基与Ham'sF-12培养基的混合培养基。混合比例如为IMDM:Ham's F-12＝0.8～1.2:1.2～0.8的体积比。

用于培养的培养基可以是含血清培养基或无血清培养基。从避免化学上未确定的成分混入的观点来看，悬浮培养细胞聚集体所用的培养基优选为无血清培养基。

悬浮培养细胞聚集体所使用的培养基可以含有血清替代物。血清替代物可以适当含有例如白蛋白、转铁蛋白(transferrin)、脂肪酸、胶原蛋白前体、微量元素、2-巯基乙醇或3'硫醇甘油、或者它们的等价物等。这样的血清替代物可以例如通过WO98/30679记载的方法来制备。此外，为了更方便地实施本发明的方法，可以使用市售的血清替代物。作为这样的市售血清替代物，可列举例如KSR(knockout serum replacement，敲除血清替代物)(Invitrogen公司制)、Chemically-defined Lipid concentrated(Gibco公司制)和Glutamax(Gibco公司制)。

在不会对从多能干细胞诱导分化为垂体基板和/拉特克囊及垂体激素产生细胞产生不利影响的范围内，悬浮培养细胞聚集体所使用的培养基可以含有其他添加剂。作为添加剂，可列举但不限于胰岛素、铁源(例如转铁蛋白)、矿物质(例如硒酸钠等)、糖类(例如葡萄糖等)、有机酸(例如丙酮酸、乳酸等)、血清蛋白(例如白蛋白等)、氨基酸(例如L-谷氨酰胺等)、还原剂(例如2-巯基乙醇等)、维生素类(例如抗坏血酸、d-生物素等)、抗生素(例如链霉素、青霉素、庆大霉素等)、缓冲剂(例如HEPES等)等。

在一个实施方式中，在不会对分化诱导为垂体激素产生细胞产生不利影响的观点看，悬浮培养细胞聚集体所用的培养基为在不含本说明书中特别记载培养基所含有的物质以外的生长因子(growth factor)的化学合成培养基(growth-factor-free ChemicallyDefined Medium；gfCDM)中添加血清替代物(KSR等)。在这里所称的“生长因子”中包含Fgf；BMP；Wnt、Nodal、Notch、Shh等模式形成因子；胰岛素和富含脂质的白蛋白(Lipid-richalbumin)。作为不含生长因子的化学合成培养基可列举例如在Wataya et al,Proc NatlAcad Sci USA,105(33):11796-11801,2008中公开的gfCDM。

第三培养步骤中的悬浮培养优选在高氧分压条件下进行。通过在高氧分压条件下，进一步悬浮培养含1)下丘脑神经上皮组织、以及2)垂体基板和/或拉特克囊的细胞聚集体，实现氧到达细胞聚集体内部以及使细胞聚集体长时间的维持培养，从而能够高效诱导分化为垂体激素产生细胞。

高氧分压条件是指高于空气中的氧分压(20％)的氧分压条件。第三培养步骤中的氧分压例如为30～60％，优选为35～60％，更优选为38～60％。

可以适当设定第三培养步骤中的培养温度、CO₂浓度等其他培养条件。培养温度例如为约30～40℃，优选为约37℃。CO₂浓度例如为约1～10％，优选为约5％。

第三个培养步骤以充分的时间来实施诱导从垂体基板和/或拉特克囊分化为垂体激素产生细胞。通过实施第三培养步骤，诱导从垂体基板和/或拉特克囊分化为垂体激素产生细胞，通过在垂体基板和/或拉特克囊中产生垂体激素产生细胞，来形成腺垂体。作为从垂体基板和/或拉特克囊诱导得到的垂体激素产生细胞，可以列举生长激素(GH)产生细胞、催乳素(PRL)产生细胞、促肾上腺皮质激素(ACTH)产生细胞。在一个优选的实施方式中，该促肾上腺皮质激素(ACTH)产生细胞响应CRH刺激而分泌ACTH，该ACTH分泌被糖皮质激素反馈抑制。在一个实施方式中，诱导从垂体基板和/或拉特克囊分化为选自生长激素(GH)产生细胞、催乳素(PRL)产生细胞和促肾上腺皮质激素(ACTH)产生细胞中的至少一种、优选两种、更优选三种垂体激素产生细胞，形成含有选自生长激素(GH)产生细胞、和催乳素(PRL)产生细胞、促肾上腺皮质激素(ACTH)产生细胞中的至少一种、优选两种、更优选三种垂体激素产生细胞的腺垂体。从垂体基板和/或拉特克囊除了诱导得到的生长激素(GH)产生细胞、催乳素(PRL)产生细胞、和促肾上腺皮质激素(ACTH)之外，还诱导得到促甲状腺激素(TSH)生成细胞、卵泡刺激素(FSH)产生细胞、促黄体生成素(LH)生成细胞、促黑素细胞激素(MSH)生成细胞等其他垂体激素产生细胞。即，通过第三培养步骤形成的腺垂体除含有选自生长激素(GH)产生细胞、和催乳素(PRL)产生细胞、促肾上腺皮质激素(ACTH)产生细胞中的至少一种，优选为两种，更优选为三种之外，还可以含有促甲状腺激素(TSH)生成细胞、卵泡刺激素(FSH)产生细胞、促黄体生成素(LH)生成细胞、促黑素细胞激素(MSH)生成细胞等其他垂体激素产生细胞。向垂体激素产生细胞的分化例如可以通过使用对垂体激素特异性的抗体的免疫组织化学，检测垂体激素阳性细胞来确认。例如，实施至培养的细胞聚集体中10％以上、优选30％以上、更优选50％以上的细胞聚集体含有垂体激素产生细胞为止。由于培养时间可以根据多能干细胞的动物种类、Shh信号通路作用物质的种类而变动，因此不能一概而论，例如使用人多能干细胞时，第三培养步骤通常为37天以上，例如，37～70天。

通过进行第三培养步骤，可以得到含有腺垂体的细胞聚集体。

通过本发明的制造方法，只要能够从多能干细胞诱导分化至腺垂体或其祖组织，就可以在存在/不存在饲养细胞的任意条件下进行聚集体的悬浮培养。从避免不确定因素的混入的观点看，优选在不存在饲养细胞的条件下进行细胞聚集体的悬浮培养。

在本发明的制造方法中，作为悬浮培养聚集体的培养容器没有特别限制，可列举例如烧瓶、用于组织培养的烧瓶、培养皿(dish)、皮氏培养皿(petri dish)、用于组织培养的培养皿、多孔培养皿(multi dish)、微量培养板(microplate)、微孔板(micro wellplate)、微孔(micropore)和多板(multi plate)、多孔板(multi well plate)、腔室载玻片(chamber slide)、陪替氏平皿(petri plate)、试管(tube)、托盘(tray)、培养袋和滚瓶。为了能够在不粘附的条件下培养，优选细胞不粘附的培养容器。作为细胞不粘附的培养容器可以使用表面经过人工处理使细胞不粘附的培养容器或不进行以提高与细胞的粘附性为目的的人工处理(例如，用细胞外基质等进行涂层处理等)的培养容器等。

作为用于悬浮培养细胞聚集体的培养容器，可以使用透氧(氧透过性)的培养容器。通过使用透氧的培养容器，提高了对细胞聚集体的供氧，有助于细胞聚集体的长期维持培养。

在悬浮培养聚集体时，只要能够使聚集体维持不粘附在培养器上的非粘附状态即可，可以静置培养(static culture)聚集体，也可以通过旋转培养或振荡培养使聚集体有意地移动。但在本发明中，没有必要通过旋转培养或振荡培养来有意地移动聚集体。即，在一个实施方式中，本发明的制造方法中的悬浮培养是通过静置培养进行的。静置培养是指在不有意地使聚集体移动的状态下培养聚集体的培养方法。即，例如，随着局部培养基温度的变化，培养基会产生对流，通过该流动致使聚集体移动，但是，由于不是不有意地移动聚集体，因此，本发明中所称静置培养也包括这样的情况。可以在悬浮培养的整个期间进行静置培养，也可以仅在一部分期间进行静置培养。在一个优选的实施方式中，在悬浮培养的整个期间进行静置培养。静态培养不需要装置，有望对细胞团块损伤较小，并且具有培养液量少的优点。

(4)本发明的通过细胞表面标记物分离垂体激素产生细胞等的方法

本发明提供一种分离垂体激素产生细胞和/或其祖细胞的方法，包括从含有腺垂体和/或其祖组织的细胞聚集体中分离出表达EpCAM的细胞的步骤。在垂体激素产生细胞及其祖细胞表面能够表达EpCAM，但在下丘脑神经上皮组织表面不能表达EpCAM。从而，将EpCAM作为标记物可以将垂体激素产生细胞及其祖细胞与下丘脑神经上皮组织分离。

在本发明的分离方法中使用的含有腺垂体和/或其祖组织的细胞聚集体可以使用通过第二培养步骤所得到的细胞聚集体，以及通过第三培养步骤所得到的细胞聚集体中任意的细胞聚集体。作为从上述多能干细胞开始诱导向垂体或其部分组织或者其祖组织分化后的具体天数，例如为30天～600天，优选为90天～500天，更优选150天～400天，进一步优选200天～350天。本发明的分离方法包括以下步骤。

·本发明分离步骤概述

一种分离垂体激素产生细胞和/或其祖细胞的方法，包括从本发明的含有腺垂体和/或其祖组织的细胞聚集体中分离表达EpCAM的细胞的步骤，该方法在(B)分离表达EpCAM的细胞(群体)的步骤之前，可以包括(A)分散含有腺垂体和/或其祖组织的细胞聚集体以获得单一细胞的群体的步骤。

具体地，分散该细胞聚集体以得到单一细胞的群体的步骤(A)包括(a1)通过酶处理分散含有腺垂体和/或其祖组织的细胞聚集体的步骤(下述的(4.2))。在该通过酶处理的分散步骤之前，还可以包括(a2)切碎含有垂体和/或其祖组织的细胞聚集体，或物理切割含有垂体和/或其祖组织的细胞聚集体的步骤。

分散该细胞聚集体以得到单一细胞的群体的步骤(A)任选地还可以包括(a-1)使用ROCK抑制剂处理含有腺垂体和/或其祖组织的细胞聚集体的步骤。当进行该步骤时，优选在获得单一细胞群体的步骤最开始时进行(下述的(4.1))。

在通过酶处理进行分散的步骤(a2)之后，进行(B)分离表达EpCAM的细胞(群体)的步骤(分离表达EpCAM的细胞(群体)和不表达EpCAM的细胞(群体)的步骤)(下述的(4.3))。

在上述细胞(群体)分离步骤(B)之后，任选地，可以进行使所得到的细胞(群体)重新聚集的步骤(下述的(4.4))，具体地，该重新聚集步骤(C)通过(c1)将所得到的细胞(群体)接种到培养容器中进行贴壁培养，和/或(c2)将所得到的细胞(群体)接种到培养容器中进行悬浮培养来进行。

(4.1)利用ROCK抑制剂的预处理步骤

在本发明的分离方法中，首先，可以对所得到的细胞聚集体进行利用ROCK抑制剂的预处理。为了抑制以后细胞聚集体由于分散引起被诱导的多能干细胞(尤其是人多能干细胞)的细胞死亡，该预处理优选在该预处理开始前添加ROCK抑制剂。ROCK抑制剂例如在该处理开始前的至少24小时前、至少12小时前、至少6小时前、至少3小时前、至少2小时前、至少1小时前添加。作为ROCK抑制剂，可列举Y-27632((+)-(R)-反式-4-(1-氨基乙基)-N-(4-吡啶基)环己甲酰胺二盐酸盐)等。该处理时所用的ROCK抑制剂的浓度是能够抑制以后的细胞聚集体的分散导致所诱导的多能干细胞的细胞死亡的浓度。例如，关于Y-27632，这样的浓度通常约为0.1～200μM，优选约为2～50μM。ROCK抑制剂的浓度可以在添加期间变化，例如，在期间后半期可以使浓度减半。在下述的(4.2)～(4.4)的任意步骤中，关于与细胞接触的溶液优选使用含有与ROCK抑制剂相同浓度的溶液。

用于进行该前处理的培养基，在使用第二培养步骤所得到的细胞聚集体时，可以使用第二培养步骤中使用的培养基，在使用第三培养步骤所得到的细胞聚集体时，可以使用第三培养步骤中使用的培养基。需要说明的是，在上述培养基中已经以所需的浓度添加了ROCK抑制剂时，不需要进行该预处理步骤。

(4.2)细胞聚集体的分散步骤

接着，通过酶处理使进行了上述预处理的细胞聚集体分散。具体地，首先，将进行了上述预处理的细胞聚集体转移至含有第二或第三培养步骤中记载的培养基(例如DMEM/F-12培养基(DMEM培养基：Ham's F-12培养基＝1:1的混合培养基)等)的培养容器(例如试管等)中，并用相同的培养基清洗。作为用于分散的酶没有特别限制，只要能够分散细胞即可，可列举例如EDTA；胰蛋白酶、胶原蛋白酶(胶原蛋白酶I～VII型)、金属蛋白酶(metalloprotease)、透明质酸酶(hyaluronidase)、弹性蛋白酶(elastase)、分散酶(dispase)、脱氧核糖核酸酶等酶或它们的混合物。作为优选的酶，列举为胶原蛋白酶，更优选为胶原蛋白酶I型。酶处理的条件(温度、时间等)可以根据使用的酶等适当设定。另外，为了促进该酶处理，在该处理前，可以进行将细胞聚集体以物理(例如手术刀、剪刀等)方式切碎、或以物理(例如手术刀、剪刀等)方式切割细胞聚集体的步骤。

上述酶处理后，收集悬浮细胞，再次进行上述酶处理。该酶处理也可以用上述的酶等进行，作为优选的酶，可以列举EDTA；胰蛋白酶，更优选为EDTA；胰蛋白酶和脱氧核糖核酸酶。另外，也可以使用TrypLE(Invitrogen公司)等市售品替代EDTA；胰蛋白酶。酶处理的条件(温度、时间等)可以根据使用的酶等适当设定。通过上述一系列酶处理可以制备单细胞悬液。另外，当制备单细胞悬液时，可以通过本身公知的方法去除死细胞。

(4.3)EpCAM阳性细胞的分离步骤

作为从上述制备的单细胞悬液所含的细胞群体中分离所需的表达EpCAM的细胞的方法，可列举使用流式细胞仪(flow cytometry)或质谱流式技术(mass cytometry)的方法、磁性细胞分选方法(Magnet-Activated Cell Sorting，MACS)等，这些方法可以使用自身公知的方法进行。例如，表达EpCAM的细胞可以通过包括使该细胞和与EpCAM分子特异性结合的物质(例如抗体等)接触的步骤的方法进行分离。上述物质中包括其自身附有可检测标记(例如GFP、PE)的物质和其自身未附有标记的物质。在上述物质为其自身未附有标记的物质时，可以进一步使用附有能够直接或间接识别该物质并能够检测出的标记的物质，从而实现上述分离。例如，在上述物质为抗体时，使荧光染料、金属同位素或珠子(例如磁珠)直接或间接地载持该抗体，由此能够标记细胞表面的标记物，根据该标记能够分离细胞。此时使用的抗体可以仅为一种，也可以是两种以上的抗体。

(4.4)分离细胞群体的重新聚集培养步骤

分离的细胞群体可以接种到培养容器中进行贴壁培养，例如可以以细胞片层(cell sheet)的形式，也可以接种到培养容器中进行悬浮培养，重新聚集，以形成细胞聚集体。该细胞群体可以直接维持培养至使用，也可以根据分离的细胞的分化状态进一步诱导分化至所需细胞。进行该维持培养或进一步分化诱导时，可以直接进行上述第三培养步骤中记载的方法，也可以根据需要适当地依据公知方法进行变更。另外，在进行该贴壁培养时，贴壁培养可以通过本身公知的方法进行，也可以适当地使用上述第三培养步骤中记载的内容物(例如培养基组成等)。另外，在贴壁培养的时，优选用细胞外基质等(例如层粘连蛋白、胶原蛋白等)涂覆培养容器。

(5)被分离的垂体激素产生细胞及其祖细胞的用途

通过本发明的分离方法或制造方法所得到的垂体激素产生细胞及其祖细胞可用于移植医疗。例如，可以使用通过本发明的方法所得到的垂体激素产生细胞和/或其祖细胞作为基于腺垂体(前叶或中叶，优选前叶)障碍的疾病治疗药物，或用于在腺垂体(前叶或中叶，优选前叶)的损伤状态中补充相应的损伤部位。通过向基于腺垂体障碍的疾病或腺垂体处于损伤状态的患者移植通过本发明所得到的垂体激素产生细胞和/或其祖细胞，能够治疗基于腺垂体障碍的疾病或腺垂体的损伤状态。移植部位没有特别限制，只要移植的垂体激素产生细胞和/或其祖细胞可以功能性地替代受损的腺垂体即可，可列举例如肾包膜下等。作为基于腺垂体障碍的疾病，可列举例如一般垂体功能减退症、垂体侏儒症、肾上腺皮质功能减退症、部分垂体功能减退症、孤立性垂体前叶激素缺乏症等。另外，作为腺垂体的损伤状态，可列举例如腺垂体切除后的患者、垂体肿瘤放疗后的患者、外伤。

在移植医学中，由于组织相容性抗原(histocompatibility antigen)的不同导致的排斥通常是一个问题，但通过使用从移植的受体(recipient)的体细胞建立的多能干细胞(例如iPS细胞)可以克服该问题。即，在一个优选的实施方式中，在本发明的方法中，通过使用从受体的体细胞建立的多能干细胞(例如，iPS细胞)作为多能干细胞，对该受体制造免疫学上的自身的腺垂体或其祖组织或者垂体激素产生细胞，并将之移植到该受体。

此外，通过本发明的方法所得到的垂体激素产生细胞及其祖细胞可用于药物筛选和评价。具体地，例如，可以应用于抑制或促进垂体激素产生的物质的筛选、药物的副作用、毒性试验等。上述筛选和试验等例如可以包括在受试物质存在或不存在的条件下培养含有垂体激素产生细胞和/或其祖细胞的细胞群体(阴性对照)的步骤；将用受试物质处理后的细胞群体中目标激素的产量与阴性对照比较的步骤；以及将抑制或促进垂体激素产生细胞的受试物质作为候补物质进行选择的步骤。

(6)本发明的垂体激素产生细胞和/或其祖细胞的制造方法

本发明提供一种制造垂体激素产生细胞和/或其祖细胞的方法，包括将表达EpCAM的细胞从含有腺垂体和/或其祖组织的细胞聚集体分离的步骤。在本发明中，垂体激素产生细胞和/或其祖细胞可以是垂体激素产生细胞和/或其祖细胞，也可以是垂体激素产生细胞的群体(细胞群体)和/或其祖细胞的群体(细胞群体)，或者，也可以是以高纯度含有垂体激素产生细胞和/或其祖细胞的细胞群体。在垂体激素产生细胞及其祖细胞表面可以表达EpCAM，但是在下丘脑神经上皮组织表面不能表达EpCAM。从而，将EpCAM作为标记物，能够将垂体激素产生细胞及其祖细胞和下丘脑神经上皮组织分离。通过使用该分离步骤，可以制造垂体激素产生细胞和/或其祖细胞，或者高纯度地含有垂体激素产生细胞和/或其祖细胞的细胞群体(例如，细胞群体的80％以上，优选85％以上，更优选90％以上，进一步优选95％以上，再进一步优选99％以上，最优选100％)。

本发明的制造方法中所包含的从含有腺垂体和/或其祖组织的细胞聚集体分离表达EpCAM的细胞的步骤可以引用上述“·本发明分离步骤概述”中记载的步骤等的全部内容。另外，关于各步骤，可以引用上述(4.1)～(4.4)的全部内容。

通过本发明方法制造的垂体激素产生细胞(群体)和/或其祖细胞(群体)等，可以如上述(4.1)记载的那样，一直维持培养直至使用，也可以根据分离的细胞的分化状态，进行适当培养(例如第三培养步骤)，以进一步分化诱导至所需细胞。具体地，例如，可以将通过本发明的方法制造的垂体激素产生细胞(群体)和/或其祖细胞(群体)根据需要直接移植到需要利用该细胞群体的治疗等的对象，也可以进一步通过本身公知的方法进一步提高纯度(纯化)后，移植到该对象。另外，可以将该纯化后的细胞(群体)按上述(4.4)中记载的方法那样接种到培养容器进行贴壁培养，例如形成细胞片层的形状，也可以接种到培养容器中进行悬浮培养，然后使其重新聚集。可以将经过该贴壁培养或悬浮培养所得到的细胞片层或细胞聚集体移植到上述对象。另外，该贴壁培养或悬浮培养可以进行短时间(例如3～6天)，也可以进行长时间(例如7～30天)。在本发明的制造方法中，可以引用从上述“(1)多能干细胞”到“(5)被分离的垂体激素产生细胞及其祖细胞的用途”涉及的全部内容。

通过以下实施例进一步具体说明本发明，但实施例仅用于说明本发明，并不限制本发明的范围。

实施例

实施例1：细胞表面抗原的筛选

通过在国际公开第2016/013669号或Cell Reports,30,18-24,January 7,2020中记载的本身已知的方法，将人iPS细胞(201B7株)分化诱导成含有腺垂体或其祖细胞组织的细胞聚集体。

将从人iPS细胞(201B7株)进行分化诱导第47天的细胞团块，用Accumax(Innovative Cell Technologies，#AM105)在37℃下处理5～10分钟来进行分散，以制备单细胞悬液。用BioLegend公司制备的用于人表面抗原的PE标记抗体组(LEGENDScreen HumanPE Kit，#700007)将细胞染色后，用IntraStain(Dako，#K2311)进行固定细胞以及膜渗透处理。接着，用FITC标记的抗细胞角蛋白(cytokeratin)抗体(Miltenyi,#130-080-101)进行细胞内细胞角蛋白染色，用Hoechst33342进行核染色，用HCS CellMask Deep Red Stain(Invitrogen,#H32721)进行细胞质染色。使用由ParkinElmer制造的成像分析仪(OperaPhenix)获取和分析染色后的细胞的图像，并寻找在细胞角蛋白阳性细胞中共存率高的表面抗原。结果，表明用EpCAM可以识别垂体祖细胞。

实施例2：EpCAM和细胞角蛋白表达率的定量

与筛选细胞表面抗原同样地制备单细胞悬液后，用PE标记抗EpCAM抗体(Miltenyi，#130-098-115)、FITC标记抗细胞角蛋白抗体、Hoechst33342进行染色，并用荧光显微镜(Leica DMI6000B)获取图像。用Image J的Cell counter工具对EpCAM+/细胞角蛋白+细胞、EpCAM+/细胞角蛋白-细胞、EpCAM-/细胞角蛋白+细胞和EpCAM-/细胞角蛋白-细胞进行计数。并计算在全部细胞中的各自比例。其结果鉴定出上皮细胞粘附分子(Epithelialcell adhesion molecule，EpCAM；也称为CD326)，作为对细胞角蛋白(cytokeratin)阳性细胞具有高度特异性的表面抗原(图1A)。EpCAM在约80％的细胞角蛋白(cytokeratin)阳性细胞中表达，约95％的EpCAM阳性细胞为细胞角蛋白(cytokeratin)阳性(图1B)。

实施例3：通过磁激活细胞分选法(MACS)纯化EpCAM阳性细胞

将分化诱导开始后90～500天的细胞团块进行酶分散，并用于MACS。以下表示步骤。

(1)利用Y27632的预处理

为了抑制分散处理导致的细胞死亡，在操作开始前的1小时以上，以20μM的最终浓度添加Y27632(Wako，#034-24024)到培养基中，以对细胞团块进行预处理。在以后的操作中，细胞被暴露的所有溶液(PBS除外)中添加20μM Y27632。

(2)细胞团块的分散

为了促进由酶处理的分散，用手术刀切碎或切割细胞团块。然后，将细胞团块转移到50ml试管中并用DMEM/F12(Wako,#042-30555)清洗。然后，加入1～3ml胶原蛋白酶溶液并在37℃下进行旋转振荡(140～150rpm)40分钟。胶原蛋白酶溶液的组成是在上述DMEM/F12中添加0.2％胶原酶I型(Wako,#031-17601)和0.1％BSA(Sigma,#A9418)。

胶原酶处理完成后，将含有悬浮细胞的上清液转移到新的15ml试管中，用PBS清洗剩余的细胞团块(清洗液也与上清液一起收集到相同试管中)。将收集了上清液的15ml试管在4℃、1000rpm下离心5分钟以使悬浮的细胞成为细胞团(pellet)。将1ml的0.25％胰蛋白酶/EDTA(Gibco,#25200072)+0.2mg/ml DNase I(Roche,#11284932001)添加到50ml试管的细胞团块中，在37℃下保温5～10分钟后，与15ml试管的细胞团一起用P1000微量移液器吹打约20次，以使细胞团块松散。用10ml gfCDM+20％KSR(用于分化和维持细胞的培养基)悬浮以中和胰蛋白酶，之后，在4℃和1000rpm条件下离心5分钟。在离心后的细胞团中添加1mlgfCDM+20％KSR+10μg/ml DNase I，用P1000微量移液器剧烈吹打约30次以分散细胞团块，并通过70μm细胞筛网(cell strainer)去除聚集体。通过上述操作制备单细胞悬液。

(3)死细胞的去除

通过用死细胞去除试剂盒(Miltenyi,#130-090-101)处理分散的细胞，来去除死细胞和引起细胞凋亡(apoptosis)的细胞。

(4)通过MACS分离EpCAM阳性细胞

将收集的活细胞悬浮在MACS缓冲液(PBS+0.5％BSA+2mM EDTA)中，并用PE标记抗EpCAM抗体进行染色(冷藏10分钟)。随后，通过用抗PE微珠(Miltenyi,#130-105-639)处理，用磁珠标记EpCAM阳性细胞。接着，将细胞通过磁柱(LS柱；Miltenyi，#130-042-401)以分离、收集磁珠标记的细胞(EpCAM阳性细胞)和未标记的细胞(EpCAM阴性细胞)。

实施例4：纯化细胞的重新聚集培养

将纯化的各细胞群体(EpCAM阳性细胞、阴性细胞)接种到低粘附V底96孔板(PrimeSurface plate 96V；Sumitomo Bakelite,#MS-9096V)以进行重新聚集。每孔中以15000细胞、200μl培养基(gfCDM+20％KSR+30μMY27632)进行接种。以后每三天用不含Y27632的培养基更换一半培养基。

实施例5：免疫组织化学

使用分化诱导开始后培养48天以上的细胞团块和MACS纯化后重新聚集并培养6天以上的细胞团块。用4％多聚甲醛(paraformaldehyde)溶液固定细胞团块后，通过逐步浸入10、20和30％蔗糖溶液中进行蔗糖置换。然后用OCT化合物包埋，并用低温恒温器(Cryostatl)制备厚度为4～10μm的冷冻切片，并贴附于抗剥离涂层载玻片(PLATINUM PRO；Matsunami Glass)。用PBS清洗切片后，用封闭溶液(5％正常驴血清+0.1％TritonX-100的PBS溶液)在室温下封闭30～60分钟。接着，用封闭液稀释的一抗在4℃下反应过夜。接着，用荧光标记的二次抗体和DAPI(核染色剂)在室温下进行反应1小时。染色后的切片用Fluoromount(Diagnostic BioSystems，#K024)封片后，并用共聚焦激光扫描显微镜(Confocal Laser Scanning Microscopy，CLSM)LSM-710(Zeiss)进行荧光观察。

结果在聚集体表面观察到EpCAM阳性的肥厚的上皮组织。这种EpCAM阳性的上皮组织在垂直方向为3个以上细胞的厚度。而且可知该EpCAM阳性与细胞角蛋白共阳性(图2A)。此外，可知该EpCAM阳性与Pitx1共阳性(图2B)。

实施例6：ACTH分泌试验(CRH刺激试验)

使用MACS纯化后重新聚集并培养6天以上的细胞团块。将六个细胞团块转移到1.5ml微管(microtube)中，并在250μl HBSS(+)(Wako,#084-08965)中在37℃下保温10分钟，之后回收HBSS。接着，在含有1μg/ml CRH(Peptide Institute，#4136-s)的250μl HBSS中在37℃下保温10分钟，并收集HBSS。通过临床检测所使用的ECLIA法检测所收集的HBSS中的ACTH浓度(委托给SRL株式会社检测)

结果

腺垂体及其祖组织将细胞角蛋白(Cytokeratin)作为标志物进行表达。细胞角蛋白是一种细胞骨架蛋白，可通过免疫染色在短时间内高灵敏度(sensitivity)地检测出来。因此，分散从人iPS细胞诱导分化的细胞团块，将细胞角蛋白阳性细胞作为靶标，通过市售的抗体组进行表面抗原筛选。作为筛选的分化时间，选择培养50天左右，此时垂体祖细胞已经被诱导，而且能够通过温和的酶处理进行组织分散。由此，可以防止表面抗原的降解，同时确保足够的细胞量用于筛选。筛选332种人类表面抗原的结果鉴定出上皮细胞粘附分子(Epithelial cell adhesion molecule，EpCAM；也称为CD326)作为对细胞角蛋白阳性细胞具有高特异性的表面抗原(图1A)。EpCAM在约80％的细胞角蛋白阳性细胞中表达，约95％的EpCAM阳性细胞为细胞角蛋白阳性(图1B)。

通过细胞团块的免疫组织化学分析，显示EpCAM在细胞角蛋白、Pitx1或Lhx3阳性的垂体祖细胞中表达(图2A、B、C)。此外，EpCAM的表达也在由此分化的垂体激素产生细胞(ACTH阳性细胞)中得到维持(图2C)。

使用分化诱导90天以上的细胞团块来尝试将通过MACS分离EpCAM阳性细胞和阴性细胞分离进行重新聚集(图3A)。确认了EpCAM阳性和阴性的任意的细胞群体都形成了聚集体，但是EpCAM阳性细胞团块中包含ACTH阳性细胞和Lhx3阳性细胞，而EpCAM阴性细胞团块中不包含ACTH阳性细胞和Lhx3阳性细胞(图3B)。作为ACTH分泌试验的结果，在EpCAM阳性细胞团块中，通过添加生理分泌刺激因子CRH，ACTH的分泌量平均增加到2.1倍(图3C)。另一方面，EpCAM阴性细胞团块没有确认到通过添加CRH而ACTH的分泌增加，CRH添加前的分泌量也不到EpCAM阳性细胞团块的二分之一(图3C)。

由以上结果可知，以EpCAM作为标记物，可以从来自人多能干细胞的分化组织中纯化功能性垂体激素产生细胞及其祖细胞。

产业上的可利用性

本发明的分离方法和制造方法通过利用EpCAM作为标记物，可以用于从来自多能干细胞的分化组织中有效地分离和纯化功能性垂体激素产生细胞和/或其祖细胞。此外，由于分离、纯化的垂体激素产生细胞等显示出比通过生理垂体激素分泌刺激优异的垂体激素分泌能力，所以该细胞可用于与垂体有关的疾病的治疗等。本申请基于在日本申请的特愿2020-065346号(申请日：2020年3月31日)，其全部内容并入本说明书。

Claims (12)

1.一种分离垂体激素产生细胞和/或其祖细胞的方法，包括从含有腺垂体和/或其祖组织的细胞聚集体中分离表达EpCAM的细胞的步骤。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述细胞聚集体包括下丘脑神经上皮组织。

3.根据权利要求1或2所述的方法，在分离表达EpCAM的细胞的步骤之前，还包括分散细胞聚集体得到单一细胞的群体的步骤。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，在分离表达EpCAM的细胞的步骤之前，还包括切碎含有腺垂体和/或其祖组织的细胞聚集体，或物理切割含有腺垂体和/或其祖组织的细胞聚集体的步骤。

5.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，含有腺垂体和/或其祖组织的细胞聚集体是通过分化诱导多能干细胞所得到的细胞聚集体。

6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述多能干细胞是人诱导性多能干细胞。

7.根据权利要求1～6中任一项所述的方法，其中，所述祖组织为垂体基板和/或拉特克囊。

8.一种垂体激素产生细胞和/或其祖细胞的制造方法，包括从含有腺垂体和/或其祖组织的细胞聚集体中分离表达EpCAM的细胞的步骤。

9.根据权利要求8所述的制造方法，其中，包括以下步骤：

(A)分散含有腺垂体和/或其祖组织的细胞聚集体得到单一细胞的群体的步骤；

(B)从所述群体中分离出表达EpCAM的细胞的群体；和

(C)使所述(B)所得到的群体重新聚集的步骤。

10.根据权利要求8或9所述的制造方法，其中，所述垂体激素产生细胞和/或其祖细胞是细胞聚集体或细胞片层。

11.根据权利要求9或10所述的方法，其中，在分离表达EpCAM的细胞的步骤(B)之前，还包括切碎含有腺垂体和/或其祖组织的细胞聚集体，或物理切割含有腺垂体和/或其祖组织的细胞聚集体的步骤。

12.根据权利要求8～11中任一项所述的方法，其中，所述垂体激素产生细胞选自生长激素(GH)产生细胞、催乳素(PRL)产生细胞、促肾上腺皮质激素(ACTH)产生细胞、促甲状腺激素(TSH)产生细胞、卵泡刺激素(FSH)产生细胞、促黄体生成素(LH)产生细胞中的至少一种。

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