TW202330905A - 包含腦下垂體激素產生細胞之細胞凝集體及其製造方法 - Google Patents

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須賀英隆
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Abstract

本發明提供一種由多能幹細胞效率良好地製造包含腦下垂體激素產生細胞之細胞凝集體之方法。

Description

包含腦下垂體激素產生細胞之細胞凝集體及其製造方法
本發明係關於一種於體外自多能幹細胞分化誘導之包含腦下垂體激素產生細胞之細胞凝集體及其製造方法。
腦下垂體係與間腦下部相接而存在之小型內分泌器官，作為多種激素之控制中樞發揮重要作用。例如，產生以促進維持生命所必須之腎上腺皮質激素之產生的促腎上腺皮質激素(ACTH)、促進兒童生長發育之生長激素等為代表的多種腦下垂體激素。因此，腦下垂體功能障礙會引發嚴重之全身性疾病。
近年來，業界開發出自人ES/iPS細胞分化誘導包含功能性腦下垂體激素產生細胞之腺性腦下垂體之方法，有望應用於腦下垂體再生醫療(專利文獻1、非專利文獻1及2)。該等方法係藉由三維培養，於一個細胞塊中形成下丘腦-腦下垂體之複合組織。於該複合組織中，腺性腦下垂體及其前體組織主要位於細胞塊之表層，將其剝離而移植至腦下垂體摘除小鼠之腎被膜下，藉此確認到活動性、存活、體重減輕之改善等治療效果(專利文獻1、非專利文獻1)。又，據報告，將人ES/iPS細胞於Wnt訊號傳遞路徑抑制物質之存在下懸浮培養，添加BMP(Bone Morphogenetic Protein，骨形態生成蛋白)訊號傳遞路徑作用物質與音蝟因子訊號傳遞路徑作用物質，藉此可效率良好地製造包含腦下垂體組織之細胞塊(專利文獻2)。已知該方法亦係於細胞塊之內側存在腹側間腦、下丘腦之神經上皮組織，於存在於外側之口腔非神經上皮組織之一部分形成拉德凱氏囊(Rathke's pouch)樣結構與腦下垂體基板(placode)。然而，即便已經知曉使人ES/iPS細胞分化成包含功能性腦下垂體激素產生細胞之細胞塊之方法，但關於用以自該細胞塊效率良好地僅分離腦下垂體激素產生細胞之細胞標記物及其分離時機卻完全未知。 [先前技術文獻] [專利文獻]
專利文獻1：國際公開第2016/013669號 專利文獻2：國際公開第2019/103129號 [非專利文獻]
非專利文獻1：《自然-通訊(Nature Communications)》, 7:10351, 2016 非專利文獻2：《細胞報告(Cell Reports)》, 30, 18-24, January 7, 2020
[發明所欲解決之問題]
本發明者等人以如下目的為課題：探索自使多能幹細胞向腦下垂體組織分化之培養中途之細胞塊，分離腦下垂體激素產生細胞及作為其前體細胞之腦下垂體前體細胞的適宜時機，使於該時機分離之細胞再凝集，並進一步培養，藉此提供具有優異之腦下垂體激素分泌能力之腦下垂體激素產生細胞之凝集體。 [解決問題之技術手段]
本發明者等人經過銳意研究，結果鑑定出上皮細胞黏附因子(epithelial cell adhesion molecule)(以下簡記為EpCAM)作為對於腦下垂體激素產生細胞及腦下垂體前體細胞特異的表面抗原，藉由使用抗EpCAM抗體之分選，發現了能夠最有效地自使多能幹細胞向腦下垂體激素產生細胞分化之培養中途之細胞塊分離腦下垂體激素產生細胞及腦下垂體前體細胞並進行純化的時機。又，發現藉由將該經分離、純化之腦下垂體激素產生細胞及腦下垂體前體細胞進一步分化培養，並使之再凝集，該凝集體顯示出優異之腦下垂體激素分泌能力，從而完成本發明。
即，本發明如下所述。 [1]一種細胞凝集體，其特徵在於：其係包含腦下垂體激素產生細胞者，且 (1)該細胞凝集體中之EpCAM及E-鈣黏附蛋白(E-cadherin)之至少一者呈陽性之細胞之存在比率為80%以上； (2)該細胞凝集體中之神經細胞之存在比率為20%以下； (3)該細胞凝集體中之ACTH陽性細胞之存在比率為5%以上； (4)該細胞凝集體之細胞密度為3,000～20,000 cells/mm 2； (5)該細胞凝集體之長徑為200～3,000 μm； (6)於該細胞凝集體之表面，EpCAM及E-鈣黏附蛋白之至少一者呈陽性之細胞相互面附著而形成上皮結構；且 (7)該細胞凝集體形成海綿狀結構。 [2]如[1]記載之細胞凝集體，其中該細胞凝集體中之腦下垂體幹細胞之存在比率為3%以上。 [3]如[1]記載之細胞凝集體，其中該細胞凝集體之ACTH分泌能力為200～1,000,000 pg/mL。 [4]如[1]記載之細胞凝集體，其中該細胞凝集體之GH分泌能力為0.05～100 ng/mL。 [5]一種細胞集群，其包含占細胞凝集體總數40%以上之如[1]至[4]中任一項記載之細胞凝集體。 [6]一種由腦下垂體障礙引起之疾病之治療藥，其包含如[1]至[4]中任一項記載之細胞凝集體。 [7]一種包含腦下垂體激素產生細胞之細胞凝集體之製造方法，其包括以下之步驟： 步驟(1)，其係自源於多能幹細胞之包含下丘腦細胞、腦下垂體前體細胞及腦下垂體激素產生細胞的經分散之細胞集群，分離表現EpCAM之細胞；及 步驟(2)，其係將經分離之EpCAM表現細胞於能夠使腦下垂體前體細胞成熟為腦下垂體激素產生細胞之條件下懸浮培養14天以上。 [8]如[7]記載之製造方法，其中步驟(1)之細胞集群係藉由下述步驟(A)及(B)獲得： 步驟(A)，其係將多能幹細胞或其細胞凝集體，於能夠被分化誘導為包含下丘腦細胞、腦下垂體前體細胞及腦下垂體激素產生細胞之細胞凝集體之條件下進行培養；及 步驟(B)，其係使(A)中獲得之包含下丘腦細胞、腦下垂體前體細胞及腦下垂體激素產生細胞之細胞凝集體分散為細胞集群。 [9]如[8]記載之製造方法，其中步驟(A)包括以下之步驟： 第一步驟(1')，其係將多能幹細胞於存在Wnt訊號傳遞路徑抑制物質之條件下進行培養，形成細胞凝集體； 第二步驟(2)，其係將第一步驟中獲得之細胞凝集體於存在BMP訊號傳遞路徑作用物質及Shh訊號傳遞路徑作用物質之條件下進行培養，獲得包含下丘腦細胞、腦下垂體前體細胞及腦下垂體激素產生細胞之細胞凝集體。 [10]如[8]記載之製造方法，其中步驟(A)包括以下之步驟： 步驟(a)，其係將多能幹細胞於不存在餵養細胞之條件下，於包含1)TGFβ家族訊號傳遞路徑抑制物質及/或Shh訊號傳遞路徑作用物質、以及2)未分化維持因子之培養基中進行培養之a步驟； 第一步驟(1')，其係將a步驟中獲得之多能幹細胞於存在Wnt訊號傳遞路徑抑制物質之條件下懸浮培養，形成細胞凝集體； 第二步驟(2)，其係將第一步驟中獲得之細胞凝集體於存在BMP訊號傳遞路徑作用物質及Shh訊號傳遞路徑作用物質之條件下懸浮培養，獲得包含下丘腦細胞、腦下垂體前體細胞及腦下垂體激素產生細胞之細胞凝集體。 [11]如[8]記載之製造方法，其中步驟(A)包括以下之步驟： 步驟(a)，其係將多能幹細胞於不存在餵養細胞之條件下，於包含1)TGFβ家族訊號傳遞路徑抑制物質及/或Shh訊號傳遞路徑作用物質、以及2)未分化維持因子之培養基中進行培養之a步驟； 第一步驟(1)，其係將a步驟中獲得之多能幹細胞於存在JNK訊號傳遞路徑抑制物質及Wnt訊號傳遞路徑抑制物質之條件下懸浮培養，形成細胞凝集體； 第二步驟(2)，其係將第一步驟中獲得之細胞凝集體於存在BMP訊號傳遞路徑作用物質及Shh訊號傳遞路徑作用物質之條件下懸浮培養，獲得包含下丘腦細胞、腦下垂體前體細胞及腦下垂體激素產生細胞之細胞凝集體。 [12]如[11]記載之製造方法，其中第一步驟中之懸浮培養進而處於存在Shh訊號傳遞路徑作用物質之條件下，且於第一步驟及第二步驟中存在Shh訊號傳遞路徑作用物質之條件下之培養期為30天。 [13]如[9]至[12]中任一項記載之製造方法，其中進而將第二步驟中獲得之細胞凝集體於不存在Shh訊號傳遞路徑作用物質之條件下懸浮培養。 [14]如[8]至[13]中任一項記載之製造方法，其中步驟(A)之培養期係獲得包含分泌ACTH之腦下垂體激素產生細胞、且不含分泌GH或TSH之腦下垂體激素產生細胞的細胞凝集體之期間。 [15]如[8]至[14]中任一項記載之製造方法，其中步驟(A)之培養期為30天以上且100天以下。 [16]如[7]至[15]中任一項記載之製造方法，其中包含腦下垂體激素產生細胞之細胞凝集體包括以下之特徵： (1)該細胞凝集體中之EpCAM及E-鈣黏附蛋白之至少一者呈陽性之細胞之存在比率為80%以上； (2)該細胞凝集體中之神經細胞之存在比率為20%以下； (3)該細胞凝集體中之ACTH陽性細胞之存在比率為5%以上； (4)該細胞凝集體之細胞密度為3,000～20,000 cells/mm 2； (5)該細胞凝集體之長徑為200～3,000 μm； (6)於該細胞凝集體之表面，EpCAM及E-鈣黏附蛋白之至少一者呈陽性之細胞相互面附著而形成上皮結構；且 (7)該細胞凝集體形成海綿狀結構。 [17]如[16]記載之製造方法，其中該細胞凝集體中之腦下垂體幹細胞之存在比率為3%以上。 [18]如[16]記載之製造方法，其中該細胞凝集體之ACTH分泌能力為200～1,000,000 pg/mL。 [19]如[16]記載之製造方法，其中該細胞凝集體之GH分泌能力為0.05～100 ng/mL。 [發明之效果]
根據本發明，利用EpCAM，於特定時機自使多能幹細胞向腦下垂體組織分化之培養中途之細胞塊分離EpCAM陽性細胞集群，藉此能夠有效率地分離功能性腦下垂體激素產生細胞及腦下垂體前體細胞並進行純化。又，使經分離、純化之腦下垂體激素產生細胞及腦下垂體前體細胞再凝集後，進一步分化培養，藉此獲得之腦下垂體激素產生細胞之凝集體於生理性之腦下垂體激素分泌刺激下顯示出優異之腦下垂體激素分泌能力，因此，可使用該細胞進行腦下垂體相關疾病之治療等。
[包含腦下垂體激素產生細胞之細胞凝集體之製造方法] 本說明書中，用語之定義如下所述。所謂「幹細胞」，意指具有分化潛能及增殖潛能(尤其是自我複製潛能)之未分化細胞。幹細胞根據分化能力，包括多能幹細胞(pluripotent stem cell)、多潛能幹細胞(multipotent stem cell)、單能幹細胞(unipotent stem cell)等。所謂「多能幹細胞」，意指能夠體外培養、且具有能夠分化為構成生物體之所有細胞之能力(分化多能性：pluripotency)之幹細胞。所謂所有細胞係源自三個胚層，即外胚層、中胚層及內胚層之細胞。所謂「多潛能幹細胞」，意指具有能夠分化為複數種而非所有種類之組織或細胞之能力之幹細胞。所謂「單能幹細胞」，意指具有能夠分化為特定組織或細胞之能力之幹細胞。
多能幹細胞可自受精卵、複製胚、生殖幹細胞、組織內幹細胞、體細胞等誘導。作為多能幹細胞，可例舉：胚胎幹細胞(ES細胞：Embryonic stem cell)、胚胎生殖細胞(EG細胞：Embryonic germ cell)、人工多能幹細胞(iPS細胞：induced pluripotent stem cell)等。多能幹細胞亦包括由間葉系幹細胞(MSC：mesenchymal stem cell)獲得之多系分化持續應激細胞(Muse細胞：Multi-lineage differentiating Stress Enduring cell)、及由生殖細胞(例如睾丸)製作之生殖幹細胞(GS細胞：Germline stem cell)。再者，人胚胎幹細胞係由受精14天以內之人類胚胎建立所得者。
1981年首次建立出胚胎幹細胞，1989年以後開始用於製作基因剔除小鼠。1998年建立出人胚胎幹細胞，亦正在用於再生醫學。可藉由在餵養細胞上或包含白血病抑制因子(LIF：leukemia inhibitory factor)之培養基中培養內細胞團(inner cell mass)而製造ES細胞。ES細胞之製造方法例如於國際公開第96/22362號、國際公開第02/101057號、美國專利第5843780號說明書、美國專利第6200806號說明書、美國專利第6280718號說明書等中有記載。胚胎幹細胞可自特定機構獲取，亦可購買市售品。例如作為人胚胎幹細胞之KhES-1、KhES-2及KhES-3可自京都大學再生醫科學研究所獲取。
EG細胞可藉由在包含小鼠幹細胞因子(mSCF)、LIF及鹼性纖維母細胞生長因子(bFGF)之培養基中培養原始生殖細胞而製造(Cell, 70:841-847, 1992)。
所謂「人工多能幹細胞」係藉由利用公知方法等將體細胞初始化(重編程(reprogramming))而被誘導出多能性之細胞。作為人工多能幹細胞，具體而言，可例舉：藉由表現選自包含Oct3/4、Sox2、Klf4、Myc(c-Myc、N-Myc、L-Myc)、Glis1、Nanog、Sall4、lin28、Esrrb等之初始化基因組中之多個基因，將已分化為纖維母細胞、周邊血液單核細胞等之體細胞初始化而被誘導出多分化能力之細胞。2006年，山中等人利用小鼠細胞建立出人工多能幹細胞(Cell, 2006, 126(4)pp.663-676)。2007年，亦利用人纖維母細胞建立出人工多能幹細胞，與胚胎幹細胞同樣地具有多能性及自我複製能力(Cell, 2007, 131(5)pp.861-872；Science, 2007, 318(5858)pp.1917-1920；Nat. Biotechnol., 2008, 26(1)pp.101-106)。除藉由利用基因表現進行直接初始化而製造人工多能幹細胞之方法以外，亦可藉由添加化合物等而自體細胞誘導人工多能幹細胞(Science, 2013, 341, pp.651-654)。
作為製造人工多能幹細胞時使用之體細胞，並無特別限定，可例舉：源自組織之纖維母細胞、血球系細胞(例如周邊血液單核細胞、T細胞等)、肝細胞、胰臟細胞、腸上皮細胞、平滑肌細胞等。
於藉由表現數種基因(例如Oct3/4、Sox2、Klf4及Myc四種因子)進行初始化而製造人工多能幹細胞之情形時，用以基因表現之方法並無特別限定。作為用以基因表現之方法，例如可例舉：使用病毒載體(例如反轉錄病毒載體、慢病毒載體、仙台病毒載體、腺病毒載體、腺相關病毒載體)之感染法，使用質粒載體(例如質粒載體、游離型載體(episomal vector))之基因導入法(例如磷酸鈣法、脂轉染法、RetroNectin法、電穿孔法)，使用RNA載體之基因導入法(例如磷酸鈣法、脂轉染法、電穿透法)，直接注射蛋白之方法等。
又，亦可獲取株化之人工多能幹細胞，例如由京都大學建立之201B7細胞、201B7-Ff細胞、253G1細胞、253G4細胞、1201C1細胞、1205D1細胞、1210B2細胞、1231A3細胞等人類人工多能性細胞株可自京都大學及iPS Academia Japan股份有限公司獲取。作為株化之人工多能幹細胞，例如由京都大學建立之Ff-I01細胞、Ff-I14細胞及QHJI01s04細胞可自京都大學獲取。
亦可對多能幹細胞進行基因修飾。基因修飾多能幹細胞例如可藉由採用同源重組技術製作。作為待修飾染色體上之基因，例如可例舉：細胞標記物基因、組織相容性抗原基因、由神經系細胞損傷引起之疾病之相關基因等。染色體上之目標基因之修飾可採用《小鼠胚胎操作實驗室指南(Manipulating the Mouse Embryo : A Laboratory Manual)第二版》(冷泉港實驗室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)(1994))、《基因靶向技術之實用方法(Gene Targeting : A Practical Approach)》(牛津大學出版社(IRL Press at Oxford University Press)(1993))、《生物手冊系列8(Biomanual Series 8)》(基因靶向(Gene Targeting)，使用ES細胞製作突變小鼠(Preparation of Mutant Mice Using ES Cells)，羊土社(1995))等中記載之方法進行。
具體而言，例如單離待修飾之目標基因(例如細胞標記物基因、組織相容性抗原基因或疾病相關基因等)之基因組基因，使用單離出之基因組基因，製作用以對目標基因進行同源重組之靶向載體。將所製作之靶向載體導入至幹細胞中，選擇於目標基因與靶向載體之間發生同源重組之細胞，藉此可製作染色體上之基因經過修飾之幹細胞。
作為目標基因之基因組基因之單離方法，可例舉：《分子選殖實驗室指南(Molecular Cloning : A Laboratory Manual)第二版》(冷泉港實驗室出版社(1989))或《最新分子生物學實驗方法彙編(Current Protocols in Molecular Biology)》(John Wiley&Sons(1987-1997))等中記載之公知方法。可使用基因組DNA基因庫篩選系統(Genome Systems製造)或通用型基因組步移套組(Universal GenomeWalker Kits)(Clontech製造)等。
關於用以對目標基因進行同源重組之靶向載體之製作、及同源重組體之有效篩選，可依據《基因靶向技術之實用方法》(牛津大學出版社(1993))、《生物手冊系列8》(基因靶向，使用ES細胞製作突變小鼠，羊土社(1995))等中記載之方法進行。靶向載體可使用置換型或插入型之任意者。作為篩選方法，可採用正向選擇、啟動子選擇、負向選擇或多聚腺苷酸(PolyA)選擇等方法。作為自篩選之細胞株中選擇目標同源重組體之方法，可例舉：針對基因組DNA之Southern雜交法或PCR法等。
作為多能幹細胞，亦可使用經過基因組編輯之多能幹細胞。所謂「基因組編輯」係指藉由使用核酸酶定點切割基因組DNA鏈、或鹼基之化學轉換等原理，有意圖地改變目標基因或基因組區域之技術。作為定點核酸酶，可例舉：鋅指核酸酶(ZFN)、TALEN、CRISPR/Cas9等。藉由使用基因組編輯技術，可製作特定基因缺失之基因剔除細胞株、於特定基因座人工插入其他序列之基因敲入細胞株等。
作為多能幹細胞，亦可使用疾病特異性多能幹細胞。所謂「疾病特異性多能幹細胞」，表示具有參與疾病發生之基因突變或遺傳背景之多能幹細胞。疾病特異性多能幹細胞可藉由自患有對象疾病之患者或近親屬利用上述方法等建立人工多能幹細胞之方法、或利用鋅指核酸酶(ZFN)、TALEN、CRISPR等基因組編輯技術等改變現已建立完成之多能幹細胞之基因組之方法製作。
「哺乳動物」包括嚙齒類、有蹄類、食肉目、兔形目、靈長類等。嚙齒類包括小鼠、大鼠、倉鼠、豚鼠等。有蹄類包括豬、牛、山羊、馬、綿羊等。食肉目包括狗、貓等。兔形目包括兔等。所謂「靈長類」係指屬於靈長目之哺乳類動物，作為靈長類，包括狐猴、懶猴、樹鼩等原猴亞目、及猴、類人猿、人等類人猿亞目。
本發明中使用之多能幹細胞為哺乳動物之多能幹細胞，較佳為嚙齒類(例如小鼠、大鼠)或靈長類(例如人、猴)之多能幹細胞，最佳為人之多能幹細胞。
所謂「懸浮培養」係指一面維持細胞於培養液中懸浮存在之狀態一面進行培養。即，懸浮培養係在使細胞不黏附於培養器材及培養器材上之餵養細胞等(以下記為「培養器材等」)之條件下進行，區別於在黏附於培養器材等之條件下進行之培養(附著培養)。更詳細而言，所謂懸浮培養係指細胞與培養器材等之間不形成牢固之細胞-基質連接之條件下之培養。若為業者，例如藉由在顯微鏡觀察時搖動培養器材等，可容易地判別所培養之細胞為懸浮培養狀態或附著培養。
於懸浮培養中之細胞凝集體中，細胞與細胞為面附著。於懸浮培養中之細胞凝集體中，細胞與培養器材等之間不形成牢固之細胞-基質連接，或幾乎不形成細胞-基質連接，或即使形成其作用亦較小。於懸浮培養中之細胞凝集體之內部，可存在內在之細胞-基質連接。所謂「細胞與細胞發生面附著(plane attachment)」係指細胞與細胞以面附著。更詳細而言，所謂「細胞與細胞發生面附著」係指某一細胞之表面積中，與另一細胞之表面發生結合之比率例如為1%以上，較佳為3%以上，更佳為5%以上。細胞之表面可藉由利用細胞膜染色試劑(例如DiI)之染色、細胞黏附因子(例如E-鈣黏附蛋白、N-鈣黏附蛋白等)之免疫染色等進行觀察。
進行懸浮培養時使用之培養器材只要為能夠實現懸浮培養者，則無特別限定，可由業者適當決定。作為此種培養器材，例如可例舉：燒瓶、組織培養用燒瓶、培養皿、陪替氏培養皿、組織培養用培養皿、多聯培養皿(multi dish)、微量板(microplate)、微孔板(microwell plate)、微孔(micropore)、多聯板(multi plate)、多孔板、腔室載玻片(Chamber Slide)、淺底培養皿(schale)、管(tube)、托盤(tray)、培養袋、旋轉燒瓶及轉瓶。為了能夠進行懸浮培養，該等培養器材較佳為細胞非黏附性。作為細胞非黏附性之培養器材，可使用培養器材之表面未經上述為了提高與細胞之黏附性而進行之人工處理者等。作為細胞非黏附性之培養器材，亦可使用為了降低與細胞之黏附性而對培養器材之表面進行人工處理者。培養器材之培養面可為平底、U底或V底，亦可具有凹凸。作為降低與細胞之黏附性之處理，例如可例舉：藉由塗覆2-甲基丙烯醯氧乙基磷酸膽鹼(MPC)聚合物、聚(甲基丙烯酸2-羥乙酯)(Poly-HEMA)、聚乙二醇(PEG)等之超親水性處理、蛋白質低吸附處理等。
可將培養動物細胞常用之培養基作為基礎培養基來製備用於培養細胞之培養基。作為基礎培養基，例如可例舉：伊格爾氏基礎培養基(Basal Medium Eagle，BME)、BGJb培養基、CMRL 1066培養基、格拉斯哥氏最低必需培養基(Glasgow Minimum Essential Medium，Glasgow MEM)、改良型MEM含鋅培養基(Improved MEM Zinc Option)、伊斯科夫氏改良型杜貝卡氏培養基(Iscove's Modified Dulbecco's Medium，IMDM)、199培養基(Medium 199)、伊格爾氏最低必需培養基(Eagle Minimum Essential Medium，Eagle MEM)、α改良型伊格爾氏最低必需培養基(Alpha Modified Eagle Minimum Essential Medium，αMEM)、杜貝卡氏改良型伊格爾氏培養基(Dulbecco's Modified Eagle Medium，DMEM)、F-12培養基、DMEM/F12、IMDM/F12、哈姆氏培養基(Ham's Medium)、RPMI 1640、Fischer's培養基、或該等之混合培養基等。
培養多能幹細胞時，可使用以上述基礎培養基作為基質之多能幹細胞培養用培養基，較佳為公知之胚胎幹細胞或人工多能幹細胞用培養基、用於在無餵養細胞之條件下培養多能幹細胞之培養基(無餵養細胞培養基)等。作為無餵養細胞培養基，已開發、市售了眾多之合成培養基，例如可例舉：Essential 8培養基。Essential 8培養基係於DMEM/F12培養基中包含L-抗壞血酸-2-磷酸鎂(L-ascorbic acid-2-phosphate magnesium)(64 mg/l)、硒酸鈉(sodium selenium)(14 μg/l)、胰島素(insulin)(19.4 mg/l)、NaHCO 3(543 mg/l)、運鐵蛋白(transferrin)(10.7 mg/l)、bFGF(100 ng/mL)、及TGFβ家族訊號傳遞路徑作用物質(TGFβ1(2 ng/mL)或Nodal(100 ng/mL))作為添加劑(Nature Methods, 8, 424-429(2011))。作為市售之無餵養細胞培養基，例如可例舉：Essential 8(Thermo Fisher Scientific公司製造)、S-medium(DS Pharma Biomedical公司製造)、StemPro(Thermo Fisher Scientific公司製造)、hESF9、mTeSR1(STEMCELL Technologies公司製造)、mTeSR2(STEMCELL Technologies公司製造)、TeSR-E8(STEMCELL Technologies公司製造)、mTeSR Plus(STEMCELL Technologies公司製造)、StemFit(味之素公司製造)、ReproMed iPSC Medium(ReproCELL公司製造)、NutriStem XF(Biological Industries公司製造)、NutriStem V9(Biological Industries公司製造)、Cellartis DEF-CS Xeno-Free Culture Medium(TAKARA BIO公司製造)、Stem-Partner SF(極東製藥公司製造)、PluriSTEM Human ES/iPS Cell Medium(Merck公司製造)、StemSure hPSC MediumΔ(FUJIFILM Wako Pure Chemical公司製造)等。
無血清培養基可含有血清代替物。作為血清代替物，例如可例舉：適當含有白蛋白、運鐵蛋白、脂肪酸、膠原蛋白前體、微量元素、2-巰基乙醇或3'硫醇甘油、或該等之均等物等者。該血清代替物例如可藉由國際公開第98/30679號中記載之方法製備。作為血清代替物，亦可使用市售品。作為市售之血清代替物，例如可例舉：Knockout血清替代品(Thermo Fisher Scientific公司製造)(以下有時亦記為「KSR」)、化學成分確定之脂質濃縮物(Chemically-defined Lipid concentrated)(Thermo Fisher Scientific公司製造)、Glutamax(Thermo Fisher Scientific公司製造)、B27補充劑(Thermo Fisher Scientific公司製造)、N2補充劑(Thermo Fisher Scientific公司製造)等。
懸浮培養及附著培養時使用之無血清培養基可適當含有脂肪酸或脂質、胺基酸(例如非必需胺基酸)、維生素、生長因子、細胞激素、抗氧化劑、2-巰基乙醇、丙酮酸、緩衝劑、無機鹽類等。
為了避免複雜之製備，作為無血清培養基，亦可使用添加有適量(例如約0.5%～約30%、較佳為約1%～約20%)市售KSR(Thermo Fisher Scientific公司製造)之無血清培養基(例如於F-12培養基與IMDM培養基之1:1混合液中添加有1×化學成分確定之脂質濃縮物、5%KSR及450 μM 1-單硫代甘油之培養基)。又，作為KSR同等品，可例舉日本專利特表2001-508302中揭示之培養基。
所謂「血清培養基」，意指包含無調整或未純化之血清之培養基。該培養基可含有脂肪酸或脂質、胺基酸(例如非必需胺基酸)、維生素、生長因子、細胞激素、抗氧化劑、2-巰基乙醇、1-單硫代甘油、丙酮酸、緩衝劑、無機鹽類等。
本發明中之培養較佳為於Zeno free條件下進行。所謂「Zeno free」，意指已將源自與培養對象之細胞之生物種類不同之生物種類的成分排除之條件。
就避免混入化學上未確定之成分之觀點而言，本發明中使用之培養基較佳為含有化學上確定之成分之培養基(化學成分確定之培養基(CDM：Chemically defined medium)。
本說明書中，所謂「不存在物質X之條件下」，意指未添加外源性(exogenous)物質X之培養基或不含有外源性物質X之培養基、或者不存在外源性物質X之狀態。
本說明書中，所謂「衍生物」，意指針對特定之化合物，藉由將該化合物之分子內之一部分置換為其他官能基或其他原子而產生之化合物群。本說明書中，所謂蛋白質之「改型體」，意指於能夠維持原本之蛋白質之特性之範圍內發生胺基酸殘基缺失、附加、置換等突變之蛋白質。作為突變胺基酸之數量，並無特別限制，可例舉：1～4、1～3、1～2或1個。蛋白質之「改型體」可為具有與原本之蛋白質表現出至少90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上或99.5%以上一致性之胺基酸序列的蛋白質。
本說明書中，所謂「A小時(A天)以後」，意指自A小時(A天)起之後(包含A小時(A天)在內)。所謂「B小時(B天)以內」，意指直至B小時(B天)之前(包含B小時(B天)在內)。
所謂「餵養細胞」，意指培養幹細胞時與之共存的該幹細胞以外之細胞。作為用於維持多能幹細胞之未分化狀態之培養之餵養細胞，例如可例舉：小鼠纖維母細胞(MEF)、人纖維母細胞、SNL細胞等。餵養細胞較佳為經過增殖抑制處理。作為增殖抑制處理，可例舉：增殖抑制劑(例如絲裂黴素C)處理、UV照射等。用於維持多能幹細胞之未分化狀態之培養之餵養細胞藉由分泌液性因子(較佳為未分化維持因子)、製作細胞黏著用支架(細胞外基質)，有助於維持多能幹細胞之未分化。
本說明書中，所謂不存在餵養細胞之條件下(無餵養細胞)，意指於不存在餵養細胞之條件下培養。所謂不存在餵養細胞之條件，例如可例舉：未添加餵養細胞之條件、或實質上不含餵養細胞(例如餵養細胞數相對於總細胞數之比率為3%以下)之條件。
所謂「細胞凝集體」(cell aggregate)，意指細胞彙集並彼此黏著而形成之團塊。細胞凝集體亦包括細胞集群、胚狀體(Embryoid body)、球體(Sphere)、球狀體(Spheroid)、類器官(Organoid)。細胞凝集體較佳為細胞彼此面附著。於一些實施方式中，細胞凝集體一部分或整體中之細胞彼此細胞黏著，例如形成了黏著連接(adherence junction)。於一些實施方式中，亦可進一步藉由人工方式使兩個以上之細胞凝集體彼此黏著或凝集。細胞凝集體亦包括細胞集群彼此黏著或凝集而成之團塊、及類組裝體(assembloid)。
所謂「均一之細胞凝集體」，意指培養複數個細胞凝集體時各細胞凝集體之大小一定，於以最大徑之長度評價細胞凝集體之大小之情形時，所謂均一之細胞凝集體，意指最大徑之長度之方差較小。更具體而言，意指複數個細胞凝集體中之75%以上之細胞凝集體其最大徑為複數個細胞凝集體之最大徑平均值之±100%以內，較佳為最大徑平均值之±50%以內，更佳為最大徑平均值之±20%以內。
所謂「細胞集群」，意指由2個以上之細胞構成之細胞群。細胞集群可由一種細胞構成，亦可由複數種細胞構成。構成細胞集群之細胞可懸浮於培養基中，亦可黏附於培養器材等。又，構成細胞集群之細胞可為單個細胞，亦可細胞集群至少一部分中之細胞彼此細胞黏著而形成細胞集群。此處，所謂「單個細胞」，意指例如細胞彼此幾乎無黏著(例如面附著)之細胞。於一些實施方式中，所謂分散成單個細胞，可例舉幾乎不存在細胞-細胞間連接(例如黏著連接)之狀態。細胞集群可包含細胞凝集體。
所謂「組織」，意指具有以下結構之細胞集群之結構體，於上述結構中，形態或性質不同之複數種細胞按照一定模式進行立體配置。
本說明書中，細胞凝集體、細胞集群及組織為哺乳動物之細胞凝集體、細胞集群及組織，較佳為嚙齒類(例如小鼠、大鼠)或靈長類(例如人、猴)之細胞凝集體、細胞集群及組織，最佳為人之細胞凝集體、細胞集群及組織。
本發明提供一種包含腦下垂體激素產生細胞之細胞凝集體之製造方法(本發明之方法)，該方法包括以下之步驟。 步驟(1)，其係自源於多能幹細胞之包含下丘腦細胞、腦下垂體前體細胞及腦下垂體激素產生細胞的經分散之細胞集群，分離表現EpCAM之細胞；及 步驟(2)，其係將經分離之EpCAM表現細胞於能夠使腦下垂體前體細胞成熟為腦下垂體激素分泌細胞之條件下懸浮培養14天以上。
本發明之方法包括如下步驟：自源於多能幹細胞之包含下丘腦細胞、腦下垂體前體細胞及腦下垂體激素產生細胞的經分散之細胞集群，分離表現EpCAM之細胞(本發明之步驟(1))。
本發明步驟(1)中之源於多能幹細胞之包含下丘腦細胞、腦下垂體前體細胞及腦下垂體激素產生細胞的經分散之細胞集群可為源自生物體之包含下丘腦細胞、腦下垂體前體細胞及腦下垂體激素產生細胞的經分散之細胞集群，亦可為源於多能幹細胞之包含下丘腦細胞、腦下垂體前體細胞及腦下垂體激素產生細胞的經分散之細胞集群，較佳為後者。源於多能幹細胞之包含下丘腦細胞、腦下垂體前體細胞及腦下垂體激素產生細胞的經分散之細胞集群例如藉由下述步驟(A)及(B)獲得。 步驟(A)，其係將多能幹細胞或其細胞凝集體，於能夠被分化誘導為包含下丘腦細胞、腦下垂體前體細胞及腦下垂體激素產生細胞之細胞凝集體之條件下進行培養； 步驟(B)，其係使(A)中獲得之包含下丘腦細胞、腦下垂體前體細胞及腦下垂體激素產生細胞之細胞凝集體分散為細胞集群。
對於步驟(A)中所分化誘導之包含下丘腦細胞、腦下垂體前體細胞及腦下垂體激素產生細胞之細胞凝集體，例如可基於包含腦下垂體前體細胞及/或腦下垂體激素產生細胞之腦下垂體組織之分化階段進行分類。包含下丘腦細胞之下丘腦組織與腦下垂體組織相互影響各自之分化，因此，腦下垂體組織之分化階段與下丘腦組織之分化階段相關。存在複數種分類方式，但於本案說明書中，將自多能幹細胞向腦下垂體組織之分化階段分為以下兩個分化階段：僅包含腦下垂體前體細胞之腦下垂體前體組織、以及包含腦下垂體前體細胞及腦下垂體激素產生細胞之腦下垂體組織，於此基礎上，進而將前者分為前期及後期，將後者分為前期、中期及後期。下文對該等分化階段進行說明。
本案說明書中之所謂「腦下垂體前體組織」，意指存在腦下垂體前體細胞、但不存在腦下垂體激素產生細胞之組織。另一方面，本案說明書中之所謂「腦下垂體組織」，意指包含至少一種腦下垂體激素產生細胞(例如ACTH產生細胞)之組織，亦可包含腦下垂體前體組織。
腦下垂體前體組織進而可分為前期(稱為前期腦下垂體前體組織)及後期(稱為後期腦下垂體前體組織)。於前期腦下垂體前體組織中，為開始誘導(開始檢測出)上述腦下垂體前體細胞之標記物(例如Lhx3或Pitx1)之表現之階段，於後期腦下垂體前體組織中，可觀察到該等之表現持續上調。於一實施方式中，作為前期腦下垂體前體組織、或開始誘導(開始檢測出)腦下垂體前體細胞標記物(例如Lhx3或Pitx1)之表現之階段之組織，可例舉Lhx3陽性細胞或Pitx1陽性細胞相對於總細胞數之比率未達3%之組織。另一方面，作為後期腦下垂體前體組織，可例舉Lhx3及Pitx1之至少一者呈陽性之細胞相對於總細胞數之比率為3%以上之組織。若為業者，可藉由公知方法測定該比率。例如，可使用針對Lhx3或Pitx1之抗體，藉由免疫染色法或流式細胞分析等方法測定。
於誘導腦下垂體前體組織之分化階段，誘導出下丘腦組織。於該情形時，於包含前期腦下垂體前體組織及下丘腦組織之細胞凝集體中之下丘腦組織中，為開始誘導上述下丘腦之標記物(例如Rx或Nkx2.1)之表現之階段。另一方面，於包含後期腦下垂體前體組織及下丘腦組織之細胞凝集體中之下丘腦組織中，可確認到該等之表現持續上調。因此，作為一實施方式，於同一凝集體內包含腦下垂體前體組織及下丘腦組織之細胞凝集體中，作為包含前期腦下垂體前體組織之細胞凝集體，可例舉包含Nkx2.1之表現未達峰值之組織之細胞凝集體，作為包含後期腦下垂體前體組織之細胞凝集體，可例舉包含Nkx2.1之表現為3%以上、10%以上、較佳為20%以上之組織之細胞凝集體。
腦下垂體組織可分為前期、中期及後期。再者，於腦下垂體組織中，腦下垂體前體細胞標記物之表現達到峰值，無論為前期、中期或後期，其表現均基本上保持一定。
本說明書中，將前期腦下垂體組織定義為自開始確認到誘導腦下垂體激素產生細胞之階段開始，僅存在1或2種腦下垂體激素產生細胞(例如促腎上腺皮質激素(ACTH)產生細胞及/或泌乳素(PRL)產生細胞)作為腦下垂體激素產生細胞之階段之組織。
本說明書中，將中期腦下垂體組織定義為存在3～4種腦下垂體激素產生細胞(例如包含ACTH產生細胞及PRL產生細胞，進而包含選自由促黃體激素(LH)產生細胞及卵泡刺激激素(FSH)產生細胞所組成之群中之1～2種細胞)之階段之組織。
本說明書中，將後期腦下垂體組織定義為存在5種以上之腦下垂體激素產生細胞(例如ACTH產生細胞、PRL產生細胞、LH產生細胞及FSH產生細胞，以及生長激素(GH)產生細胞或甲狀腺刺激激素(TSH)產生細胞等細胞)之階段之組織。
本說明書中，可確認到腦下垂體組織於前期、中期及後期，ACTH分泌能力持續增強。作為一實施方式，包含腦下垂體組織之細胞凝集體中之ACTH分泌能力於前期腦下垂體組織中為0.5 pg/mL以上，於中期腦下垂體組織中為2 pg/mL以上，於後期腦下垂體組織中為20 pg/mL以上。作為一實施方式，包含腦下垂體組織之細胞凝集體中之ACTH分泌能力於前期腦下垂體組織中未達2 pg/mL，於中期腦下垂體組織中未達20 pg/mL。
於包含腦下垂體組織及下丘腦組織之細胞凝集體中之下丘腦組織中，Rx之表現於包含前期腦下垂體組織之細胞凝集體中之下丘腦組織中達到峰值，其後趨於下調。於包含中期腦下垂體組織以後之組織之細胞凝集體中之下丘腦組織中，幾乎確認不到Rx之表現。另一方面，於包含腦下垂體組織之細胞凝集體中之下丘腦組織中，Nkx2.1之表現持續下調，作為一實施方式，於包含後期腦下垂體組織之細胞凝集體中之下丘腦組織中，Nkx2.1之表現比率為10%以下、5%以下、4%以下、3%以下、2%以下、1%以下。作為一實施方式，於包含後期腦下垂體組織之細胞凝集體中之下丘腦組織中，Nkx2.1之表現比率可為1%以上、2%以上、3%以上、4%以上、5%以上。
作為一實施方式，包含中期腦下垂體組織及下丘腦組織之細胞凝集體為存在3～4種腦下垂體激素產生細胞、且下丘腦組織中存在Nkx2.1表現細胞之細胞凝集體。細胞凝集體中之Nkx2.1表現細胞相對於全部細胞之存在比率例如可超過2%、5%以上、10%以上、20%以上。細胞凝集體中之Nkx2.1表現細胞相對於全部細胞之存在比率例如可為30%以下、20%以下、10%以下。作為另一實施方式，包含中期腦下垂體組織及下丘腦組織之細胞凝集體為存在3～4種腦下垂體激素產生細胞、且下丘腦組織中實質上不存在Nkx2.1表現細胞之細胞凝集體。
作為一實施方式，包含後期腦下垂體組織及下丘腦組織之細胞凝集體為存在5種以上之腦下垂體激素產生細胞、且實質上不存在Rx表現細胞及Nkx2.1表現細胞之細胞凝集體。
所謂「特定細胞實質上不存在」，意指細胞凝集體中之特定細胞相對於全部細胞之比率為2%以下、1%以下。
若為業者，藉由確認該等標記物之表現之時間過程，可將該等之階段與特定之分化誘導方法中之具體分化天數聯繫起來。例如於後述分化誘導方法中，開始分化後12天～30天左右之細胞凝集體包含後期腦下垂體前體組織，開始分化後30天～60天左右之細胞凝集體包含前期腦下垂體組織，開始分化後60天～100天左右之細胞凝集體包含中期腦下垂體組織。
作為步驟(A)中獲得之源於多能幹細胞之包含下丘腦細胞、腦下垂體前體細胞及腦下垂體激素產生細胞之細胞凝集體之一實施方式，可例舉：包含下丘腦組織(可包含Nkx2.1表現細胞)及存在1種以上4種以下之腦下垂體激素產生細胞之腦下垂體組織之細胞凝集體(開始分化後30天～100天左右之細胞凝集體)。 作為步驟(A)中獲得之源於多能幹細胞之包含下丘腦細胞、腦下垂體前體細胞及腦下垂體激素產生細胞之細胞凝集體之一實施方式，可例舉：包含下丘腦組織(可包含Nkx2.1表現細胞)及前期腦下垂體組織之細胞凝集體(開始分化後30天～60天左右之細胞凝集體)。 作為步驟(A)中獲得之源於多能幹細胞之包含下丘腦細胞、腦下垂體前體細胞及腦下垂體激素產生細胞之細胞凝集體之一實施方式，可例舉：包含下丘腦組織(可包含Nkx2.1表現細胞)及中期腦下垂體組織之細胞凝集體(開始分化後60天～100天左右之細胞凝集體)。
步驟(A)中獲得之包含下丘腦細胞、腦下垂體前體細胞及腦下垂體激素產生細胞之細胞凝集體可藉由將多能幹細胞於能夠被分化誘導為包含下丘腦細胞、腦下垂體前體細胞及腦下垂體激素產生細胞之細胞凝集體之條件下進行培養而獲得。
作為使多能幹細胞分化為包含下丘腦細胞、腦下垂體前體細胞及腦下垂體激素產生細胞之凝集體之方法，例如可例舉國際公開第2019/103129號公報中記載之方法。又，亦可依據例如以下之步驟實施。
使多能幹細胞分化為包含下丘腦細胞、腦下垂體前體細胞及腦下垂體激素產生細胞之凝集體之方法的一實施方式係如下包含腦下垂體組織之細胞集群之製造方法(本發明之製造方法)，該方法包括下述步驟(1')～(2)。 第一步驟(1')，其係將多能幹細胞於存在Wnt訊號傳遞路徑抑制物質之條件下進行培養，形成細胞集群； 第二步驟(2)，其係將第一步驟中獲得之細胞集群於存在BMP訊號傳遞路徑作用物質及音蝟因子(Shh)訊號傳遞路徑作用物質之條件下進行培養，獲得包含腦下垂體組織之細胞集群。 第一步驟較佳為形成細胞之凝集體之步驟，供於第二步驟之第一步驟中獲得之細胞集群可以是細胞之凝集體。 於步驟(1')中，較佳為對Wnt訊號傳遞路徑抑制物質倂用JNK訊號傳遞路徑抑制物質。 步驟(2)中獲得之包含腦下垂體組織之細胞集群根據培養時間之長短，可以是包含下丘腦細胞、腦下垂體前體細胞及腦下垂體激素產生細胞之細胞凝集體。
本發明之製造方法之一更佳實施方式係如下包含腦下垂體組織之細胞集群之製造方法，該方法包括下述步驟(a)及下述步驟(1')～(2)。 步驟(a)，其係將多能幹細胞於不存在餵養細胞之條件下，於包含1)TGFβ家族訊號傳遞路徑抑制物質及/或Shh訊號傳遞路徑作用物質、以及2)未分化維持因子之培養基中進行培養之a步驟； 第一步驟(1')，其係將a步驟中獲得之多能幹細胞於存在Wnt訊號傳遞路徑抑制物質之條件下進行培養(較佳為懸浮培養)，形成細胞集群； 第二步驟(2)，其係將第一步驟中獲得之細胞集群於存在BMP訊號傳遞路徑作用物質及Shh訊號傳遞路徑作用物質之條件下進行培養(較佳為懸浮培養)，獲得包含腦下垂體組織之細胞集群。 第一步驟較佳為形成細胞之凝集體之步驟，供於第二步驟之第一步驟中獲得之細胞集群可以是細胞之凝集體。 於步驟(1')中，較佳為對Wnt訊號傳遞路徑抑制物質倂用JNK訊號傳遞路徑抑制物質。 步驟(2)中獲得之包含腦下垂體組織之細胞集群根據培養時間之長短，可以是包含下丘腦細胞、腦下垂體前體細胞及腦下垂體激素產生細胞之細胞凝集體。
本發明之製造方法之一進而較佳實施方式係如下包含腦下垂體組織之細胞集群之製造方法，該方法包括下述步驟(a)及下述步驟(1)～(2)。 步驟(a)，其係將多能幹細胞於不存在餵養細胞之條件下，於包含1)TGFβ家族訊號傳遞路徑抑制物質及/或Shh訊號傳遞路徑作用物質、以及2)未分化維持因子之培養基中進行培養之a步驟； 第一步驟(1)，其係將a步驟中獲得之多能幹細胞於存在JNK訊號傳遞路徑抑制物質及Wnt訊號傳遞路徑抑制物質之條件下進行培養(較佳為懸浮培養)，形成細胞集群； 第二步驟(2)，其係將第一步驟中獲得之細胞集群於存在BMP訊號傳遞路徑作用物質及Shh訊號傳遞路徑作用物質之條件下進行培養(較佳為懸浮培養)，獲得包含腦下垂體組織之細胞集群。 第一步驟較佳為形成細胞之凝集體之步驟，供於第二步驟之第一步驟中獲得之細胞集群可以是細胞之凝集體。 步驟(2)中獲得之包含腦下垂體組織之細胞集群根據培養時間之長短，可以是包含下丘腦細胞、腦下垂體前體細胞及腦下垂體激素產生細胞之細胞凝集體。
上述記載之製造方法可進而包括下述第三步驟。 第三步驟(3)，其係將第二步驟中獲得之細胞集群於不存在Shh訊號傳遞路徑作用物質之條件下進行培養(較佳為懸浮培養)，獲得包含腦下垂體組織之細胞集群。
＜步驟(a)＞：a步驟 針對將多能幹細胞於不存在餵養細胞之條件下，於包含1)TGFβ家族訊號傳遞路徑抑制物質及/或Shh訊號傳遞路徑作用物質、以及2)未分化維持因子之培養基中進行培養之a步驟進行說明。 於步驟(a)中，利用TGFβ家族訊號傳遞路徑抑制物質及/或Shh訊號傳遞路徑作用物質對多能幹細胞實施處理，其後供於第一步驟中進行培養(較佳為懸浮培養)，藉此改變多能幹細胞之狀態，改善非神經上皮組織之形成效率，獲得之細胞集群(凝集體)之品質提昇，易於分化，不易產生細胞死亡，腦下垂體細胞之製造效率提高。
步驟(a)係於不存在餵養細胞之條件下實施。 本發明中之所謂不存在餵養細胞之條件(無餵養細胞)，意指實質上不含餵養細胞(例如餵養細胞數相對於總細胞數之比率為3%以下)之條件。
於本發明之腦下垂體之製造方法中，多能幹細胞較佳為胚胎幹細胞或人工多能幹細胞。人工多能幹細胞可自特定機構獲取，亦可購買市售品。例如人類人工多能幹細胞株201B7株、201B7-Ff細胞、253G1細胞、253G4細胞、1201C1細胞、1205D1細胞、1210B2細胞、1231A3細胞可自京都大學及iPS Academia Japan股份有限公司獲取。作為株化之人工多能幹細胞，例如由京都大學建立之Ff-I01細胞、Ff-I14細胞及QHJI01s04細胞可自京都大學獲取。又，HC-6 #10株、1231A3株及1383D2株可自國立研究開發法人理化學研究所獲取。
所謂TGFβ家族訊號傳遞路徑(即TGFβ超家族訊號傳遞路徑)係以轉型生長因子β(TGFβ)、Nodal/活化素(Activin)、或BMP作為配體，於細胞內經由Smad家族傳遞之訊號傳遞路徑。
所謂TGFβ家族訊號傳遞路徑抑制物質，表示對TGFβ家族訊號傳遞路徑、即經由Smad家族傳遞之訊號傳遞路徑進行抑制之物質，具體而言，可例舉：TGFβ訊號傳遞路徑抑制物質、Nodal/活化素訊號傳遞路徑抑制物質及BMP訊號傳遞路徑抑制物質。作為TGFβ家族訊號傳遞路徑抑制物質，較佳為TGFβ訊號傳遞路徑抑制物質。
作為TGFβ訊號傳遞路徑抑制物質，只要為對起因於TGFβ之訊號傳遞路徑進行抑制之物質，則無特別限定，可為核酸、蛋白質、低分子有機化合物之任意者。作為該物質，例如可例舉：與TGFβ直接作用之物質(例如蛋白質、抗體、適體等)；抑制編碼TGFβ之基因表現之物質(例如反義寡核苷酸、siRNA等)；抑制TGFβ受體與TGFβ之結合之物質；抑制TGFβ受體介導之訊號傳遞所引起之生理活性之物質(例如TGFβ受體之抑制劑、Smad之抑制劑等)。已知之作為TGFβ訊號傳遞路徑抑制物質之蛋白質可例舉Lefty。
作為TGFβ訊號傳遞路徑抑制物質，可使用業者周知之化合物。具體而言，可例舉：SB431542(有時縮寫為「SB431」)(4-[4-(3,4-亞甲二氧基苯基)-5-(2-吡啶基)-1H-咪唑-2-基]苯甲醯胺)、SB505124(2-[4-(1,3-苯并間二氧雜環戊烯-5-基)-2-(1,1-二甲基乙基)-1H-咪唑-5-基]-6-甲基吡啶)、SB525334(6-[2-(1,1-二甲基乙基)-5-(6-甲基-2-吡啶基)-1H-咪唑-4-基]喹喏啉)、LY2157299(4-[5,6-二氫-2-(6-甲基-2-吡啶基)-4H-吡咯并[1,2-b]吡唑-3-基]-6-喹啉羧醯胺)、LY2109761(4-[5,6-二氫-2-(2-吡啶基)-4H-吡咯并[1,2-b]吡唑-3-基]-7-[2-(4-嗎啉基)乙氧基]-喹啉)、GW788388(4-{4-[3-(吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-基]-吡啶-2-基}-N-(四氫-2H-哌喃-4-基)苯甲醯胺)、LY364947(4-[3-(2-吡啶基)-1H-吡唑-4-基]喹啉)、SD-208(2-(5-氯-2-氟苯基)喋啶-4-基)吡啶-4-基胺)、EW-7197(N-(2-氟苯基)-5-(6-甲基-2-吡啶基)-4-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-6-基-1H-咪唑-2-甲胺)、A83-01(3-(6-甲基吡啶-2-基)-4-(4-喹啉基)-1-苯基胺(硫甲醯)基-1H-吡唑)、RepSox(2-[5-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-基]-1,5-㖠啶)、SM16(4-[4-(1,3-苯并間二氧雜環戊烯-5-基)-5-(6-甲基-2-吡啶基)-1H-咪唑-2-基]雙環[2.2.2]辛烷-1-羧醯胺)、R268712(4-[2-氟-5-[3-(6-甲基-2-吡啶基)-1H-吡唑-4-基]苯基]-1H-吡唑-1-乙醇)、IN1130(3-[[5-(6-甲基-2-吡啶基)-4-(6-喹喏啉基)-1H-咪唑-2-基]甲基]苯甲醯胺)、Galunisertib(4-[5,6-二氫-2-(6-甲基-2-吡啶基)-4H-吡咯并[1,2-b]吡唑-3-基]-6-喹啉羧醯胺)、AZ12799734(4-({4-[(2,6-二甲基吡啶-3-基)氧基]吡啶-2-基}胺基)苯磺醯胺)、A77-01(4-[3-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-基]喹啉)、KRCA 0008(1,1-[(5-氯-2,4-嘧啶二基)雙[亞胺基(3-甲氧基-4,1-伸苯基)-4,1-哌𠯤二基]]雙乙酮)、GSK 1838705(2-[[2-[[1-[(二甲胺基)乙醯基]-5-(甲氧基)-2,3-二氫-1H-吲哚-6-基]胺基]-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基]胺基]-6-氟-N-甲基苯甲醯胺)、克唑替尼(Crizotinib)(3-[(1R)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙氧基]-5-[1-(哌啶-4-基)-1H-吡唑-4-基]-2-胺基吡啶)、色瑞替尼(Ceritinib)(5-氯-N2-[2-異丙氧基-5-甲基-4-(4-哌啶基)苯基]-N4-(2-異丙基磺醯基苯基)嘧啶-2,4-二胺)、ASP 3026(N2-[2-甲氧基-4-[4-(4-甲基-1-哌𠯤基)-1-哌啶基]苯基]-N4-[2-[(1-甲基乙基)碸)、TAE684(5-氯-N2-[2-甲氧基-4-[4-(4-甲基-1-哌𠯤基)-1-哌啶基]苯基]-N4-[2-[(1-甲基乙基)磺醯基]苯基]-2,4-嘧啶二胺)、AZD3463(N-[4-(4-胺基-1-哌啶基)-2-甲氧基苯基]-5-氯-4-(1H-吲哚-3-基)-2-嘧啶胺)、TP0427736(6-[4-(4-甲基-1,3-噻唑-2-基)-1H-咪唑-5-基]-1,3-苯并噻唑)、TGFBR1-IN-1(5-(1,3-苯并噻唑-6-基)-N-(4-羥基苯基)-1-(6-甲基吡啶-2-基)吡唑-3-羧醯胺)、TEW-7197(2-氟-N-[[5-(6-甲基吡啶-2-基)-4-([1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-6-基)-1H-咪唑-2-基]甲基]苯胺)、LY3200882(2-[4-[[4-[1-環丙基-3-(㗁烷-4-基)吡唑-4-基]氧基吡啶-2-基]胺基]吡啶-2-基]丙烷-2-醇)、BIBF-0775((3Z)-N-乙基-2,3-二氫-N-甲基-2-側氧基-3-[苯基[[4-(1-哌啶基甲基)苯基]胺基]亞甲基]-1H-吲哚-6-羧醯胺等Alk5/TGFβR1抑制劑；SIS3(1-(3,4-二氫-6,7-二甲氧基-2(1H)-異喹啉基)-3-(1-甲基-2-苯基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-基)-2-丙烯-1-酮)等SMAD3抑制劑；ITD-1(4-[1,1'-聯苯基]-4-基-1,4,5,6,7,8-六氫-2,7,7-三甲基-5-側氧基-3-喹啉羧酸乙酯)等受體分解促進劑及該等化合物之衍生物等。該等物質可單獨使用或組合使用。SB431542為作為TGFβ受體(ALK5)及活化素受體(ALK4/7)之抑制劑(即TGFβR抑制劑)公知之化合物。SIS3為對處於TGFβ受體控制下之胞內訊號傳遞因子SMAD3之磷酸化進行抑制之TGFβ訊號傳遞路徑抑制物質。ITD-1為TGF-β II型受體之蛋白酶體分解促進劑。
TGFβ訊號傳遞路徑抑制物質較佳為包含Alk5/TGFβR1抑制劑。Alk5/TGFβR1抑制劑較佳為包含選自由SB431542、SB505124、SB525334、LY2157299、GW788388、LY364947、SD-208、EW-7197、A83-01、RepSox、SM16、R268712、IN1130、Galunisertib、AZ12799734、A77-01、KRCA 0008、GSK 1838705、克唑替尼(Crizotinib)、色瑞替尼(Ceritinib)、ASP 3026、TAE684、AZD3463、TP0427736所組成之群中之至少一者，進而較佳為包含SB431542或A83-01。
關於培養基中之TGFβ訊號傳遞路徑抑制物質之濃度，可於能夠達成上述效果之範圍內，根據所使用之物質而適當設定。於使用SB431542作為步驟(a)中之TGFβ傳遞路徑抑制物質之情形時，通常以約1 nM～約100 μM、較佳為約10 nM～約100 μM、更佳為約10 nM～約50 μM、進而較佳為約100 nM～約50 μM、尤佳為約1 μM～約10 μM之濃度使用。又，於使用SB431542以外之TGFβ訊號傳遞路徑抑制物質之情形時，較理想為以顯示出與上述濃度之SB431542同等之TGFβ訊號傳遞路徑抑制活性之濃度使用。
所謂Shh傳遞路徑作用物質係能夠使Shh介導之訊號傳遞增強之物質。作為Shh訊號傳遞路徑作用物質，例如可例舉：屬於Hedgehog家族之蛋白質(例如Shh、Ihh)、Shh受體、Shh受體促效劑、Smo促效劑、嘌嗎啡胺(Purmorphamine)(9-環己基-N-[4-(嗎啉基)苯基]-2-(1-萘氧基)-9H-嘌呤-6-胺)、GSA-10(4-(1-己基-4-羥基-2-側氧基-1,2-二氫喹啉-3-甲醯胺基)苯甲酸丙酯)、Hh-Ag1.5、20(S)-羥膽固醇、SAG(平滑促效劑(Smoothened Agonist)：N-甲基-N'-(3-吡啶基苄基)-N'-(3-氯苯并[b]噻吩-2-羰基)-1,4-二胺基環己烷)、20(S)-羥基膽固醇(3S,8S,9S,10R,13S,14S,17S)-17-[(2R)-2-羥基-6-甲基庚烷-2-基]-10,13-二甲基-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-十二氫-1H-環戊并[a]菲-3-醇)等。該等物質可單獨或組合使用。
Shh訊號傳遞路徑作用物質較佳為包含由SAG、嘌嗎啡胺(Purmorphamine)、GSA-10所組成之群中之至少一者，更佳為包含SAG。關於培養基中之Shh訊號傳遞路徑作用物質之濃度，可於能夠達成上述效果之範圍內，根據所使用之物質而適當設定。於步驟(a)中，通常以約1 nM～約2000 nM、較佳為約10 nM～約1000 nM、更佳為約10 nM～約700 nM、進而較佳為約50 nM～約700 nM、尤佳為約100 nM～約600 nM、最佳為約100 nM～約500 nM之濃度使用SAG。又，於使用SAG以外之Shh訊號傳遞路徑作用物質之情形時，較理想為以顯示出與上述濃度之SAG同等之Shh訊號傳遞促進活性之濃度使用。Shh傳遞促進活性可藉由業者周知之方法，例如著眼於Gli1基因表現之報導基因分析來確定(《致癌基因(Oncogene)》(2007)26, 5163-5168)。
為了能夠維持未分化狀態之培養，步驟(a)中使用之培養基包含未分化維持因子。未分化維持因子只要為具有抑制多能幹細胞分化之作用之物質，則無特別限定。作為業者常用之未分化維持因子，於始發態多能幹細胞(Primed pluripotent stem cells)(例如人ES細胞、人iPS細胞)之情形時，可例舉：FGF訊號傳遞路徑作用物質、TGFβ家族訊號傳遞路徑作用物質、胰島素等。作為FGF訊號傳遞路徑作用物質，具體而言，可例舉：纖維母細胞生長因子(例如bFGF、FGF4或FGF8)。又，作為TGFβ家族訊號傳遞路徑作用物質，可例舉：TGFβ訊號傳遞路徑作用物質、Nodal/活化素訊號傳遞路徑作用物質。作為TGFβ訊號傳遞路徑作用物質，例如可例舉：TGFβ1、TGFβ2。作為Nodal/活化素訊號傳遞路徑作用物質，例如可例舉：Nodal、活化素A、活化素B。該等物質可單獨使用或組合使用。於培養人多能幹細胞(例如人ES細胞、人iPS細胞)之情形時，步驟(a)中之培養基較佳為包含bFGF作為未分化維持因子。
未分化維持因子通常為哺乳動物之未分化維持因子。作為哺乳動物，可例舉上述所記載者。作為未分化維持因子，由於哺乳動物不同物種之間可能存在交叉反應性，故只要能夠維持培養對象之多能幹細胞之未分化狀態，可使用任意哺乳動物之未分化維持因子。未分化維持因子較佳為與所培養細胞源於同一物種之哺乳動物之未分化維持因子。例如培養人多能幹細胞時，使用人類之未分化維持因子(例如bFGF、FGF4、FGF8、EGF、Nodal、活化素A、活化素B、TGFβ1、TGFβ2等)。未分化維持因子較佳為經過單離。
作為未分化維持因子，只要具有維持作為培養對象之多能幹細胞之未分化狀態之能力，可使用藉由任意宿主生產者或人工合成者。本發明中使用之未分化維持因子較佳為經過與生物體內生成者相同之修飾者，進而較佳為於與作為培養對象之多能幹細胞同一種類之細胞中，於不含異種成分之條件下產生者。
本發明之製造方法之一實施方式包括提供經過單離之未分化維持因子之步驟。本發明之製造方法之一實施方式包括於步驟(a)所使用之培養基中外源性(或外因性)地添加經過單離之未分化維持因子之步驟。亦可預先於步驟(a)所要使用之培養基中添加未分化維持因子。
步驟(a)所使用之培養基中之未分化維持因子濃度為能夠維持所培養之多能幹細胞之未分化狀態之濃度，可由業者適當設定。例如於不存在餵養細胞之條件下使用bFGF作為未分化維持因子之情形時，其濃度通常為約4 ng/mL～約500 ng/mL，較佳為約10 ng/mL～約200 ng/mL，更佳為約30 ng/mL～約150 ng/mL。
步驟(a)係於不存在餵養細胞之條件下實施。步驟(a)中之多能幹細胞之培養可於懸浮培養及附著培養之任一條件下進行，較佳為採用附著培養之方式進行。於不存在餵養細胞之條件下培養多能幹細胞之情形時，為了給多能幹細胞提供代替餵養細胞之支架，可使用適宜之基質作為支架。於表面經作為支架之基質塗覆之培養器材中，附著培養多能幹細胞。
作為可用作支架之基質，可例舉：層黏連蛋白(《自然生物技術(Nat Biotechnol.)》28, 611-615(2010))、層黏連蛋白片段(《自然-通訊(Nat Commun)》3, 1236(2012))、基底膜標準品(《自然生物技術》19, 971-974(2001))、明膠、膠原蛋白、硫酸乙醯肝素蛋白多糖、內功素、玻連蛋白(Vitronectin)等。基質較佳為使用層黏連蛋白511(《自然生物技術》28, 611-615(2010))。
層黏連蛋白片段只要具有向多能幹細胞之黏附性，能夠維持無餵養細胞條件下之多能幹細胞之培養，則無特別限定，較佳為E8片段。層黏連蛋白E8片段為層黏連蛋白511被彈性蛋白酶消化所得之片段當中，經鑑定具有較強之細胞黏著活性之片段(《EMBO雜誌(EMBO J.)》, 3:1463-1468, 1984、《細胞生物學雜誌(J. Cell Biol.)》, 105:589-598, 1987)。作為層黏連蛋白片段，較佳為使用層黏連蛋白511之E8片段(《自然-通訊》3, 1236(2012)、《科學報告(Scientific Reports)》4, 3549(2014))。層黏連蛋白E8片段並非必須為層黏連蛋白之彈性蛋白酶消化產物，亦可為重組體。可為由基因重組動物(蠶等)產生者。就避免混入未鑑定成分之觀點而言，較佳為使用重組體之層黏連蛋白片段。層黏連蛋白511之E8片段已有市售，例如可自Nippi股份有限公司等購買。
就避免混入未鑑定成分之觀點而言，本發明中使用之層黏連蛋白或層黏連蛋白片段較佳為經過單離。步驟(a)中之於不存在餵養細胞之條件下培養多能幹細胞之情形時，較佳為於表面經單離之層黏連蛋白511或層黏連蛋白511之E8片段、更佳為層黏連蛋白511之E8片段塗覆之培養器材中，附著培養多能幹細胞。
步驟(a)中使用之培養基只要為能夠於無餵養細胞條件下維持多能幹細胞之未分化狀態之培養之培養基(無餵養細胞培養基)，則無特別限定。 步驟(a)中使用之培養基可為血清培養基，亦可為無血清培養基。就避免混入化學上未確定之成分之觀點而言，步驟(a)中使用之培養基較佳為無血清培養基。培養基可含有血清代替物。
關於步驟(a)中之多能幹細胞之培養時間，於能夠達成提高其次之第一步驟中可形成之細胞集群(凝集體)之品質的效果之範圍內無特別限定，通常為0.5～144小時、較佳為2～96小時、更佳為6～48小時、進而較佳為12～48小時、尤佳為18～28小時，例如24小時。即，於第一步驟開始前之0.5～144小時、較佳為18～28小時，開始實施步驟(a)，步驟(a)完成後，繼續進行第一步驟。
於步驟(a)之一較佳實施方式中，將人多能幹細胞於不存在餵養細胞之條件下，於含有bFGF之無血清培養基中附著培養。該附著培養較佳為於表面經層黏連蛋白511、層黏連蛋白511之E8片段或玻連蛋白塗覆之培養器材中實施。該附著培養較佳為使用StemFit作為無餵養細胞培養基而實施。StemFit培養基含有bFGF作為維持未分化之成分(《科學報告》(2014)4, 3594)。
於步驟(a)之一較佳實施方式中，將人多能幹細胞於不存在餵養細胞之條件下，於含有bFGF之無血清培養基中懸浮培養。於該懸浮培養之情形時，人多能幹細胞亦可形成人多能幹細胞之凝集體。
於步驟(a)及後述步驟中，培養溫度、CO 2濃度等培養條件可適當設定。培養溫度例如為約30℃～約40℃、較佳為約37℃。於使用碳酸氫鹽緩衝系培養基之情形時，CO 2濃度例如為約1%～約10%、較佳為約5%。
＜步驟(1)＞、＜步驟(1')＞：第一步驟 步驟(1')中，將多能幹細胞於存在Wnt訊號傳遞路徑抑制物質之條件下進行培養，獲得細胞集群。
所謂Wnt訊號傳遞路徑係以Wnt家族蛋白作為配體，主要以捲曲蛋白(Frizzled)作為受體之訊號傳遞路徑。作為該訊號路徑，可例舉：典型Wnt路徑(Canonical Wnt pathway)、非典型Wnt路徑(Non-Canonical Wnt pathway)等。典型Wnt路徑係經由β-連環蛋白進行傳遞。作為非典型Wnt路徑，可例舉：平面細胞極性(PCP)路徑、Wnt/JNK路徑、Wnt/鈣路徑、Wnt-RAP1路徑、Wnt-Ror2路徑、Wnt-PKA路徑、Wnt-GSK3MT路徑、Wnt-aPKC路徑、Wnt-RYK路徑、Wnt-mTOR路徑等。於非典型Wnt路徑中，存在亦會於Wnt以外之其他訊號傳遞路徑中活化之共享之訊號傳遞因子，但於本發明中，將上述JNK路徑以外之該等因子亦作為Wnt訊號傳遞路徑之構成因子，針對該等因子之抑制物質亦包含於Wnt訊號傳遞路徑抑制物質之中。
作為Wnt訊號傳遞路徑抑制物質，只要能夠抑制由Wnt家族蛋白引起之訊號傳遞，則無限定。抑制物質可為核酸、蛋白質、低分子有機化合物之任意者。作為該物質，例如可例舉：抑制Wnt之加工及向細胞外分泌之物質、與Wnt直接作用之物質(例如蛋白質、抗體、適體等)、抑制編碼Wnt之基因表現之物質(例如反義寡核苷酸、siRNA等)、抑制Wnt受體與Wnt之結合之物質、抑制Wnt受體介導之訊號傳遞所引起之生理活性之物質。
關於已知之作為Wnt訊號傳遞路徑抑制物質之蛋白質，可例舉：屬於分泌型捲曲相關蛋白(sFRP)類之蛋白質(sFRP1～5、Wnt抑制因子-1(WIF-1)、Cerberus)、屬於Dickkopf(Dkk)類之蛋白質(Dkk1～4、Kremen)、PCDD1、APCDD1L、屬於背側抑制性軸突導向蛋白(Draxin)家族之蛋白質、IGFBP-4、Notum、屬於骨硬化蛋白(SOST/Sclerostin)家族之蛋白質等。
作為Wnt訊號傳遞路徑抑制物質，可使用業者周知之化合物。作為典型Wnt訊號傳遞路徑之抑制物質，例如可例舉：捲曲蛋白(Frizzled)抑制劑、散亂蛋白(Dvl：Dishevelled)抑制劑、端錨聚合酶(TANK：Tankyrase)抑制劑、酪蛋白激酶1抑制劑、連環蛋白應答性轉錄抑制劑、p300抑制劑、CREB-結合蛋白(CBP)抑制劑、BCL-9抑制劑、TCF分解誘導劑(《美國癌症研究雜誌(Am J Cancer Res.)》2015; 5(8):2344-2360)等。作為非典型Wnt路徑之抑制物質，例如可例舉：Porcupine(PORCN)抑制劑、鈣/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶II(CaMKII)抑制劑、TGF-β-活化激酶1(TAK1)抑制劑、Nemo樣激酶(NLK)抑制劑、LIM激酶抑制劑、哺乳動物雷帕黴素靶蛋白(mTOR)抑制劑、Rac抑制劑、c-Jun胺基末端激酶(JNK)抑制劑、蛋白激酶C(PKC)抑制劑、甲硫胺醯胺肽酶2(MetAP2)抑制劑、鈣調神經磷酸酶抑制劑、活化T細胞核因子(NFAT)抑制劑、ROCK抑制劑等。又，雖然作用機制尚無報告，但作為Wnt訊號傳遞路徑抑制物質，可例舉：KY02111(N-(6-氯-2-苯并噻唑基)-3,4-二甲氧基苯丙醯胺)、KY03-I(2-(4-(3,4-二甲氧基苯基)丁醯胺)-6-碘基苯并噻唑)。該等物質可單獨使用或組合使用。
作為PORCN抑制劑，例如可例舉：IWP-2(N-(6-甲基-2-苯并噻唑基)-2-[(3,4,6,7-四氫-4-側氧基-3-苯基噻吩并[3,2-d]嘧啶-2-基)硫基]-乙醯胺)、IWP-3(2-[[3-(4-氟苯基)-3,4,6,7-四氫-4-氧代噻吩并[3,2-d]嘧啶-2-基]硫基]-N-(6-甲基-2-苯并噻唑基)-乙醯胺)、IWP-4(N-(6-甲基-2-苯并噻唑基)-2-[[3,4,6,7-四氫-3-(2-甲氧基苯基)-4-氧代噻吩并[3,2-d]嘧啶-2-基]硫基]-乙醯胺)、IWP-L6(N-(5-苯基-2-吡啶基)-2-[(3,4,6,7-四氫-4-側氧基-3-苯基噻吩并[3,2-d]嘧啶-2-基)硫基]-乙醯胺)、IWP-12(N-(6-甲基-2-苯并噻唑基)-2-[(3,4,6,7-四氫-3,6-二甲基-4-氧代噻吩并[3,2-d]嘧啶-2-基)硫基]乙醯胺)、IWP-O1(1H-1,2,3-三唑-1-乙醯胺,5-苯基-N-(5-苯基-2-吡啶基)-4-(4-吡啶基)-)、LGK-974(2-(2',3-二甲基-2,4'-聯吡啶-5-基)-N-(5-(吡𠯤-2-基)吡啶-2-基)乙醯胺)、Wnt-C59(2-[4-(2-甲基吡啶-4-基)苯基]-N-[4-(吡啶-3-基)苯基]乙醯胺)、ETC-131、ETC-159(1,2,3,6-四氫-1,3-二甲基-2,6-二氧-N-(6-苯基-3-嗒𠯤基)-7H-嘌呤-7-乙醯胺)、GNF-1331(N-(6-甲氧基-1,3-苯并噻唑-2-基)-2-[(4-丙基-5-吡啶-4-基-1,2,4-三唑-3-基)硫基]乙醯胺)、GNF-6231(N-[5-(4-乙醯基-1-哌𠯤基)-2-吡啶基]-2'-氟-3-甲基[2,4'-聯吡啶]-5-乙醯胺)、Porcn-IN-1(N-[[5-氟-6-(2-甲基吡啶-4-基)吡啶-3-基]甲基]-9H-咔唑-2-羧醯胺)、RXC004、CGX1321及該等之衍生物等。該等物質可單獨使用或組合使用。
Wnt訊號傳遞路徑抑制物質較佳為包含選自由PORCN抑制劑、KY02111及KY03-I所組成之群中之至少一者，更佳為包含PORCN抑制劑。Wnt訊號傳遞路徑抑制物質亦較佳為包含具有針對非典型Wnt路徑之抑制活性之物質。Wnt訊號傳遞路徑抑制物質更佳為包含具有針對Wnt/平面細胞極性(PCP)路徑之抑制活性之物質。本發明中使用之PORCN抑制劑較佳為包含選自由IWP-2、IWP-3、IWP-4、IWP-L6、IWP-12、LGK-974、Wnt-C59、ETC-159及GNF-6231所組成之群中之至少一者，更佳為包含IWP-2或Wnt-C59，進而較佳為包含IWP-2。
關於培養基中之Wnt訊號傳遞路徑抑制物質之濃度，可於能夠達成上述效果之範圍內，根據所使用之物質而適當設定。就提高構成腦下垂體之細胞之製造效率之觀點而言，作為Wnt訊號傳遞路徑抑制物質，例如於使用作為一種PORCN抑制劑之IWP-2之情形時，其濃度通常為約10 nM～約50 μM，較佳為約10 nM～約30 μM，進而較佳為約100 nM～約10 μM，最佳為約0.5 μM。於使用作為一種PORCN抑制劑之Wnt-C59之情形時，其濃度通常為約10 nM～約30 μM，較佳為約20 nM～約10 μM，更佳為約500 nM。於使用KY02111之情形時，其濃度通常為約10 nM～約50 μM，較佳為10 nM～約30 μM，更佳為約100 nM～約10 μM，進而較佳為約5 μM。
步驟(1')之培養基中較佳為進而存在c-Jun胺基末端激酶(JNK)訊號傳遞路徑抑制物質。將此種第一步驟記為步驟(1)。即，步驟(1)係將多能幹細胞於存在JNK訊號傳遞路徑抑制物質及Wnt訊號傳遞路徑抑制物質之條件下進行培養之第一步驟。 JNK為屬於MAPK(Mitogen-Activated Protein Kinase，絲裂原活化蛋白激酶)家族之激酶，參與被各種環境應激、炎症性細胞激素、生長因子、GPCR促效劑刺激激活之胞內訊號傳遞。
於本發明中，所謂JNK訊號傳遞路徑抑制物質，只要能夠抑制經由JNK傳遞之訊號傳遞，則無限定。作為JNK訊號傳遞路徑抑制物質，例如存在具有如下活性之物質，該等物質藉由抑制JNK訊號傳遞路徑之上游或下游因子、或者抑制JNK其本身之酶活性、多聚體化、與其他因子或核酸之結合、或者促進分解等機制，抑制訊號傳遞。作為JNK訊號傳遞路徑抑制物質，例如可例舉：JNK抑制劑、Rac抑制劑、MKK抑制劑、MEK抑制劑、Src抑制劑、受體酪胺酸激酶(RTK)抑制劑、ASK抑制劑等，但不限定於此。
作為c-Jun胺基末端激酶(JNK)抑制劑，例如可例舉：JNK-IN-8((E)-3-(4-(二甲基胺基)-2-丁烯醯胺)-N-(3-甲基-4-((4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基)胺基)苯基)苯甲醯胺)、SP600125(蒽[1-9-cd]吡唑-6(2H)-酮)、DB07268(2-[[2-[(3-羥基苯基)胺基]-4-嘧啶基]胺基]苯甲醯胺)、坦茲替布(Tanzisertib)(反式-4-[[9-[(3S)-四氫-3-呋喃基]-8-[(2,4,6-三氟苯基)胺基]-9H-嘌呤-2-基]胺基]環己醇)、貝馬莫德(Bentamapimod)(1,3-苯并噻唑-2-基)[2-[[4-[(嗎啉-4-基)甲基]苄基]氧]嘧啶-4-基]乙腈、TCS JNK 6o(N-(4-胺基-5-氰基-6-乙氧基-2-吡啶基)-2,5-二甲氧基苯乙醯胺)、SU3327(5-[(5-硝基-2-噻唑基)硫基]-1,3,4噻二唑-2-胺)、CEP1347((9S,10R,12R)-5-16-雙[(乙硫基)甲基]-2,3,9,10,11,12-六氫-10-羥基-9-甲基-1-側氧基-9,12-環氧-1H-二吲哚并[1,2,3-fg:3',2',1'-kl]吡咯并[3,4-i][1,6]苯并1,4-二氮㖕-10-羧酸甲酯)、c-JUN肽、AEG3482(6-苯基咪唑并[2,1-b]-1,3,4-噻二唑-2-磺醯胺)、TCS JNK 5a(N-(3-氰基-4,5,6,7-四氫苯并[b]噻吩基-2-基)-1-萘羧醯胺)、BI-78D3(4-(2,3-二氫-1,4-苯并二氧雜環己烯-6-基)-2,4-二氫-5-[(5-硝基-2-噻唑基)硫基]-3H-1,2,4-三唑-3-酮)、IQ-3(11H-茚并[1,2-b]喹喏啉-11-酮-O-(2-呋喃基羰基)肟)、SR 3576(3-[4-[[[(3-甲基苯基)胺基]羰基]胺基]-1H-吡唑-1-基]-N-(3,4,5-三甲氧基苯基)苯甲醯胺)、IQ-1S(11H-茚并[1,2-b]喹喏啉-11-酮肟鈉鹽)、JIP-1(153-163)、CC-401(3-[3-[2-(1-哌啶基)乙氧基]苯基]-5-(1H-1,2,4-三唑-5-基)-1H-吲唑二鹽酸鹽)、BI-87G3(2-(5-硝基噻唑-2-基硫基)苯并[d]噻唑)、AS601245(1,3-苯并噻唑-2-基-(2-{[2-(3-吡啶基)乙基]胺基}-4-嘧啶基)乙腈)、CV-65(3,7-二甲基-1,9-二氫吡啶并[3,2-g]喹啉-2,5,8,10-四酮)、D-JNK1(CAS編號1445179-97-4)、ER-358063、ER-409903、ER-417258、CC-359((4S)-4-(2,4-二氟-5-嘧啶-5-基苯基)-4-甲基-5,6-二氫-1,3-噻𠯤-2-胺)、CC-401(3-[3-(2-哌啶-1-基乙氧基)苯基]-5-(1H-1,2,4-三唑-5-基)-1H-吲唑)、CC-930(4-[[9-[(3S)-氧雜環戊烷-3-基]-8-(2,4,6-三氟苯胺基)嘌呤-2-基]胺基]環己烷-1-醇)、SB203580(4-[4-(4-氟苯基)-2-(4-甲基亞磺醯基苯基)-1H-咪唑-5-基]吡啶)及該等之衍生物等。該等物質可單獨使用或組合使用。
作為Rac抑制劑，例如可例舉：EHT1864(5-(5-(7-(三氟甲基)喹啉-4-基硫基)戊氧基)-2-(嗎啉基甲基)-4H-哌喃-4-酮二鹽酸鹽)、NSC23766(N6-[2-[[4-(二乙基胺基)-1-甲基丁基]胺基]-6-甲基-4-嘧啶基]-2-甲基-4,6-喹啉二胺三鹽酸鹽)、EHop-016(N4-(9-乙基-9H-咔唑-3-基)-N2-[3-(4-嗎啉基)丙基]-2,4-嘧啶二胺)、1A-116(N-(3,5-二甲基苯基)-N'-[2-(三氟甲基)苯基]胍)、ZCL278(2-(4-溴-2-氯苯氧基)-N-(4-(N-(4,6-二甲基嘧啶-2-基)胺磺醯基)苯基胺基甲硫醯基)乙醯胺)、MBQ-167(9-乙基-3-(5-苯基-1H-1,2,3-三唑-1-基)-9H-咔唑)、KRpep-2d(錒;[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(3R,8R,11S,14S,20S,23S,26S,29S,32S,35S,38S)-8-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-胺基-5-甲脒基醯胺-1-氧戊烷-2-基]胺基]-5-甲脒基醯胺-1-氧戊烷-2-基]胺基]-5-甲脒基醯胺-1-氧戊烷-2-基]胺基]-5-甲脒基醯胺-1-氧戊烷-2-基]胺甲醯基]-29-[(2R)-丁烷-2-基]-20-(羧基甲基)-26-(羥基甲基)-23,32-雙[(4-羥基苯基)甲基]-35-(2-甲基丙基)-2,10,13,19,22,25,28,31,34,37-十氧-11-丙烷-2-基-5,6-二噻-1,9,12,18,21,24,27,30,33,36-十氮雜三環[36.3.0.014,18]四十一烷-3-基]胺基]-5-甲脒基醯胺-1-氧戊烷-2-基]胺基]-5-甲脒基醯胺-1-氧戊烷-2-基]胺基]-5-甲脒基醯胺-1-氧戊烷-2-基]胺基]-5-甲脒基醯胺-1-氧戊烷-2-基]胺基負離子)、ARS-853(1-[3-[4-[2-[[4-氯-2-羥基-5-(1-甲基環丙基)苯基]胺基]乙醯基]-1-哌𠯤基]-1-氮雜環丁基]-2-丙烯-1-酮)、塞拉昔布(Salirasib)(2-(((2E,6E)-3,7,11-三甲基十二-2,6,10-三烯-1-基)硫基)苯甲酸)、ML141(4-(5-(4-甲氧基苯基)-3-苯基-4,5-二氫吡唑-1-基)苯磺醯胺)及該等之衍生物等。該等物質可單獨使用或組合使用。
關於本發明中之JNK訊號傳遞路徑抑制物質之添加時期，只要發揮改善由人多能幹細胞製造腦下垂體組織之效率之效果，則無限定，較佳為於後述步驟(2)中添加BMP訊號傳遞路徑作用物質之時已被添加，且處於開始分化誘導後72小時以內。JNK訊號傳遞路徑抑制物質之添加時期更佳為與開始分化誘導之時同時。
第一步驟(步驟(1)或步驟(1'))之培養基中較佳為進而存在TGFβ訊號傳遞路徑抑制物質。作為第一步驟中使用之TGFβ訊號傳遞路徑抑制物質，可使用與步驟(a)中例示之TGFβ訊號傳遞路徑抑制物質相同者。步驟(a)與第一步驟之TGFβ訊號傳遞路徑抑制物質可相同亦可不同，較佳為相同。
關於培養基中之TGFβ訊號傳遞路徑抑制物質之濃度，可於能夠達成上述效果之範圍內，根據所使用之物質而適當設定。於使用SB431542作為TGFβ傳遞路徑抑制物質之情形時，通常以約1 nM～約100 μM、較佳為約10 nM～約100 μM、更佳為約100 nM～約50 μM、進而較佳為約500 nM～約10 μM之濃度使用。又，於使用SB431542以外之TGFβ訊號傳遞路徑抑制物質之情形時，較理想為以顯示出與上述濃度之SB431542同等之TGFβ訊號傳遞路徑抑制活性之濃度使用。
於第一步驟及以後之步驟中，就抑制向中胚層、內胚層之分化，提高外胚層、基板樣組織之製造效率之觀點而言，亦較佳為添加針對轉型生長因子-β-活化激酶1(TAK1)之抑制物質。TAK1係被TGFβ、骨形態生成蛋白(BMP)、介白素1(IL-1)、TNF-α等激活而介導訊號傳遞之MAP激酶之激酶(MAPKKK)家族之絲胺酸/蘇胺酸蛋白激酶。
所謂TAK1抑制物質，只要能夠抑制TAK1介導之訊號傳遞，則無限定。可為核酸、蛋白質、低分子有機化合物之任意者。作為該物質，例如可例舉：抑制TAK1與受質結合之物質、抑制TAK1磷酸化之物質、促進TAK1去磷酸化之物質、抑制TAK1轉錄或轉譯之物質、促進TAK1分解之物質等。
作為TAK1抑制物質，例如可例舉：(5Z)-7-氧雜烯醇(Oxozeaenol)((3S,5Z,8S,9S,11E)-3,4,9,10-四氫-8,9,16-三羥基-14-甲氧基-3-甲基-1H-2-苯并氧雜環十四炔-1,7(8H)-二酮)、N-Des(胺基羰基)AZ-TAK1抑制劑(3-胺基-5-[4-(4-嗎啉基甲基)苯基]-2-噻吩羧醯胺)、Takinib(N1-(1-丙基-1H-苯并咪唑-2-基)-1,3-苯二羧醯胺)、NG25(N-[4-[(4-乙基-1-哌𠯤基)甲基]-3-(三氟甲基)苯基]-4-甲基-3-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基氧基)-苯甲醯胺三鹽酸鹽)、菝葜皂苷元(Sarsasapogenin)以及該等之衍生物、類似物。該等物質可單獨使用或組合使用。
TAK1抑制物質較佳為(5Z)-7-氧雜烯醇。於使用(5Z)-7-氧雜烯醇作為第一步驟中之TAK1抑制物質之情形時，通常以約1 nM～約100 μM、較佳為約10 nM～約50 μM、更佳為約100 nM～約25 μM、進而較佳為約500 nM～約10 μM之濃度使用。又，於使用(5Z)-7-氧雜烯醇以外之TAK1抑制物質之情形時，較佳為以顯示出與上述濃度之(5Z)-7-氧雜烯醇同等之TAK1抑制活性之濃度使用。就控制腦下垂體組織中含有之細胞之比率之觀點而言，上述TAK1抑制物質可於第一步驟及以後之步驟之任意階段添加，其後去除。作為一較佳實施方式，於後述步驟(b)開始時添加上述TAK1抑制物質。
第一步驟中使用之培養基只要為如上述定義所記載者，則無特別限定。第一步驟中使用之培養基可為血清培養基或無血清培養基。就避免混入化學上未確定之成分之觀點而言，本發明中宜使用無血清培養基。為了避免複雜之製備，較佳為使用添加有適量之例如市售KSR等血清代替物之無血清培養基。作為無血清培養基中之KSR添加量，例如人ES細胞之情形時，通常為約1%至～30%，較佳為約2%～約20%。作為無血清培養基，例如可例舉：於IMDM與F-12之1：1混合液中添加有5%KSR、450 μM 1-單硫代甘油及1×化學成分確定之脂質濃縮物之培養基；或於GMEM中添加有5%～20%KSR、NEAA、丙酮酸及2-巰基乙醇之培養基。
於第一步驟開始時，細胞可為黏附狀態或懸浮狀態之任意狀態。作為一較佳實施方式，使多能幹細胞分散成單個細胞後，使之再凝集而形成懸浮狀態之細胞凝集體。因此，於第一步驟開始前，較佳為進行將多能幹細胞(作為一例：步驟(a)中獲得之多能幹細胞)分散成單個細胞之操作。藉由分散操作獲得之「經分散之細胞」較佳為單個細胞，但亦可包含例如由2個以上100個以下之少量細胞構成之細胞團塊，亦可包含由2個以上50個以下之細胞構成之細胞團塊。「經分散之細胞」例如可包含70%以上之單個細胞及30%以下之細胞團塊，較佳為包含80%以上之單個細胞及20%以下之細胞團塊。
作為使多能幹細胞分散之方法，可例舉：機械分散處理、細胞分散液處理、細胞保護劑添加處理，亦可組合實施該等處理。作為使細胞分散之方法，較佳為於細胞保護劑添加處理之同時進行細胞分散液處理，其次進行機械分散處理。
作為用於細胞保護劑添加處理之細胞保護劑，可例舉：FGF訊號傳遞路徑作用物質、肝素、Rho相關蛋白激酶(ROCK)抑制物質、肌球蛋白抑制物質、聚胺類、整合應激反應(ISR)抑制劑、半胱天冬酶抑制劑、血清、或血清代替物等。作為較佳之細胞保護劑，可例舉ROCK抑制物質。為了抑制因分散導致之多能幹細胞(尤其是人多能幹細胞)之細胞死亡，較佳為於第一步驟的培養開始之時添加ROCK抑制物質。作為ROCK抑制物質，可例舉：Y-27632((R)-(+)-反式-4-(1-胺基乙基)-N-(4-吡啶基)環己烷羧醯胺二鹽酸鹽)、法舒地爾(Fasudil)(HA1077)(1-(5-異喹啉基磺醯基)高哌𠯤鹽酸鹽)、H-1152(5-[[(2S)-六氫-2-甲基-1H-1,4-二氮呯-1-基]磺醯基]-4-甲基-異喹啉二鹽酸鹽)、HA-1100(羥基法舒地爾)([1-(1-羥基-5-異喹啉磺醯基)高哌𠯤鹽酸鹽)、𠳭烷(Chroman)1((3S)-N-[2-[2-(二甲基胺基)乙氧基]-4-(1H-吡唑-4-基)苯基]-6-甲氧基-3,4-二氫-2H-𠳭烯-3-羧醯胺)、貝舒地爾(Belumosudil)(KD025、2-[3-[4-[(1H-吲唑-5-基)胺基]喹唑啉-2-基]苯氧基]-N-異丙基乙醯胺)、HSD1590([2-甲氧基-3-(4,5,10-三氮雜四環[7.7.0.02,6.012,16]十六碳-1(9),2(6),3,7,10,12(16)-六烯-11-基)苯基]硼酸)、CRT0066854((S)-3-苯基-N1-(2-吡啶-4-基-5,6,7,8-四氫苯并[4,5]噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基)丙烷-1,2-二胺)、RKI1447(1-(3-羥苄基)-3-(4-(吡啶-4-基)噻唑基-2-基)脲)、瑞舒地爾(Ripasudil)(4-氟-5-[[(2S)-六氫-2-甲基-1H-1,4-二氮呯-1-基]磺醯基]異喹啉)、GSK269962A(N-[3-[2-(4-胺基-1,2,5-㗁二唑-3-基)-1-乙基咪唑并[4,5-c]吡啶-6-基]氧基苯基]-4-(2-嗎啉-4-基乙氧基)苯甲醯胺)、GSK429286A(N-(6-氟-1H-吲唑-5-基)-2-甲基-6-側氧基-4-(4-(三氟甲基)苯基)-1,4,5,6-四氫吡啶-3-羧醯胺)、Y-33075((R)-4-(1-胺基乙基)-N-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基苯甲醯胺)、LX7101(N,N-二甲基胺基甲酸3-[[[4-(胺基甲基)-1-(5-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-4-哌啶基]羰基]胺基]苯酯)、AT13148((αS)-α-(胺基甲基)-α-(4-氯苯基)-4-(1H-吡唑-4-基)苯甲醇)、SAR407899(6-(哌啶-4-基氧基)異喹啉-1(2H)-酮鹽酸鹽)、GSK180736A(4-(4-氟苯基)-N-(1H-吲唑-5-基)-6-甲基-2-側氧基-1,2,3,4-四氫嘧啶-5-羧醯胺)、羥基法舒地爾(1-(1-羥基-5-異喹啉磺醯基)高哌𠯤鹽酸鹽)、bdp5290(4-氯-1-(4-哌啶基)-N-[3-(2-吡啶基)-1H-吡唑-4-基]-1H-吡唑-3-羧醯胺)、sr-3677(N-[2-[2-(二甲胺基)乙氧基]-4-(1H-吡唑-4-基)苯基-2,3-二氫-1,4-苯并二氧雜環己烯-2-羧醯胺鹽酸鹽)、CCG-222740(N-(4-氯苯基)-5,5-二氟-1-(3-(呋喃-2-基)苯甲醯基)哌啶-3-羧醯胺)、ROCK抑制劑-2(N-[(1R)-1-(3-甲氧基苯基)乙基]-4-吡啶-4-基苯甲醯胺)、Rho激酶-IN-1(N-[1-[(4-甲基硫基苯基)甲基]哌啶-3-基]-1H-吲唑-5-胺)、ZINC00881524(N-(4,5-二氫萘并[1,2-d]噻唑基-2-基)-2-(3,4-二甲氧基苯基)乙醯胺)、SB772077B((3S)-1-[[2-(4-胺基-1,2,5-㗁二唑-3-基)-1-乙基-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-7-基]羰基]-3-吡咯啶胺二鹽酸鹽)、維羅舒地爾(Verosudil)(N-(1,2-二氫-1-側氧基-6-異喹啉基)-α-(二甲基胺基)-3-噻吩乙醯胺)、GSK-25(4-(4-氯-2-氟苯基)-2-(2-氯吡啶-4-基)-1-(6-氟-1H-吲唑-5-基)-6-甲基-4H-嘧啶-5-羧醯胺)以及該等之衍生物等。作為細胞保護劑，亦可使用已經製備完成之細胞保護劑。作為已經製備完成之細胞保護劑，例如可例舉：RevitaCell補充劑(Thermo Fisher Scientific公司製造)、CloneR(Stemcell Technologies公司製造)。該等物質可單獨使用或組合使用。於第一步驟中，添加作為ROCK抑制物質之Y-27632用作細胞保護劑之情形時，通常以成為約10 nM～約10 mM、較佳為約100 nM～約1 mM、更佳為約1 μM～約100 μM之濃度之方式添加至培養環境中。於第一步驟中，添加作為ROCK抑制物質之𠳭烷1用作細胞保護劑之情形時，通常以成為約10 pM～約1 mM、較佳為約100 pM～約100 μM、更佳為約1 nM～約10 μM之濃度之方式添加至培養環境中。
作為用於細胞分散液處理之細胞分散液，可例舉：包含胰蛋白酶、膠原酶、玻尿酸酶、彈性蛋白酶、鏈蛋白酶、DNase、木瓜酶等酵素及乙二胺四乙酸等螯合劑之至少一者之溶液。亦可使用市售之細胞分散液，例如TripLE Select(Thermo Fisher Scientific公司製造)或TripLE Express(Thermo Fisher Scientific公司製造)、Accumax(Innovative Cell Technologies公司製造)。步驟(a)之後獲得之多能幹細胞之處理中之細胞分散液較佳為TrypLE Select或添加有5 mM EDTA之磷酸緩衝液(PBS)，但不限定於此。
作為機械分散處理之方法，可例舉：移液處理、或使用刮刀之刮取操作。經分散之細胞懸浮於上述培養基中。
作為使多能幹細胞分散之方法，例如可例舉如下方法：於存在ROCK抑制物質之條件下，利用TrypLE Select、乙二胺四乙酸或Accumax對多能幹細胞之群落進行處理，進而藉由移液使其分散。
於第一步驟中實施懸浮培養之情形時，於細胞非黏附性之培養器材中接種經過分散之多能幹細胞之懸浮液。於培養器材為非黏附性之情形時，細胞得以懸浮培養，複數個多能幹細胞彙聚形成細胞凝集體。
於懸浮培養時，可將經分散之多能幹細胞接種於10 cm培養皿之類的相對較大之培養器材，藉此於一個培養器材中同時形成複數個細胞凝集體，但就不易出現大小各異之細胞凝集體之觀點而言，較佳為例如於細胞非黏附性96孔微孔板之類的多孔板(U底、V底)之各孔中接種一定數量的經分散之多能幹細胞。若將其靜置培養，則細胞迅速凝集，藉此可於各孔中形成1個細胞凝集體。例如藉由在培養器材之表面塗覆超親水性聚合物等加工，可使培養器材成為細胞非黏附性。作為細胞非黏附性多孔板，例如可例舉：PrimeSurface 96V底板(MS-9096V，SUMITOMO BAKELITE公司製造)等。為了更快速地形成細胞凝集體，亦可進行離心操作。藉由自複數個孔回收各孔中形成之細胞凝集體，可獲得大小均勻之細胞凝集體之集群。若細胞凝集體大小均勻，則能夠使其後之步驟中各孔及各重複實驗之製造效率更穩定，再現性更佳地製造構成腦下垂體之細胞。
作為用於由經分散之多能幹細胞形成細胞凝集體之另一實施方式，亦可使用以下之培養器材：使細胞向底面之一個部位沈降而促進凝集體之形成的研缽，形成有複數個向下之四角錐、凹狀等之加工、柵格(grid)、隆起等之培養器材，或者實施有加工使細胞僅可黏附於底面之一部分以易於形成凝集體之培養器材等。作為如上所述之培養器材，例如可例舉：胚狀體形成板AggreWell(StemCell Technologies公司製造)、PAMCELL(ANK公司製造)、球形微孔板(Corning公司製造)、NanoCulture Plate/Dish(Organogenix公司製造)、Cell-able(東洋合成公司製造)、EZSPHERE(AGC TECHNO GLASS公司製造)、SPHERICALPLATE 5D(水戶工業公司製造)、TASCL(Cymss-Bio公司製造)等，但不限定於此。
作為培養器材，亦較佳為使用能夠於各孔內裝有細胞凝集體之狀態下，一次性更換板整體之培養基的三維細胞培養容器。作為此種三維細胞培養容器，例如可例舉：PrimeSurface 96狹縫孔板(SUMITOMO BAKELITE公司製造)等。該板於96孔各自之上部設置可供培養基出入之細小開口部(狹縫)。由於狹縫被設定為細胞凝集體不易通過之寬度，故不僅防止細胞凝集體彼此黏連，且能夠一次性更換板整體之培養基，從而能夠提高操作之效率性及細胞凝集體之品質。
作為第一步驟中之多能幹細胞之濃度，可適當設定以更有效率地形成大小均勻之細胞凝集體。例如於使用96孔微孔板懸浮培養人多能幹細胞(例如自步驟(a)獲得之人iPS細胞)之情形時，以每孔通常約1×10 3～約1×10 5細胞、較佳為約3×10 3～約5×10 4細胞、更佳為約4×10 3～約2×10 4細胞、進而較佳為約4×10 3～約1.6×10 4細胞、尤佳為約8×10 3～約1.2×10 4細胞之方式，於各孔中添加所製備之液體，將板靜置而形成細胞凝集體。細胞數可藉由使用血球計數板進行計數而求出。
形成細胞凝集體所需之懸浮培養之時間可根據所使用之多能幹細胞而適當決定，為了形成大小均勻之細胞凝集體，較理想為儘可能短之時間。自經分散之細胞至形成細胞凝集體所經過之步驟分為：細胞發生彙聚之步驟、及彙聚之細胞形成凝集體之步驟。自接種經分散之細胞之時刻(即懸浮培養開始時)至細胞發生彙聚，例如若為人多能幹細胞(人iPS細胞等)，較佳為約24小時以內、更佳為約12小時以內。自接種經分散之細胞之時刻(即懸浮培養開始時)至形成細胞凝集體，例如若為人多能幹細胞(人iPS細胞等)，較佳為約72小時以內、更佳為約48小時以內。形成細胞凝集體之時間可藉由調整使細胞凝集之工具、或離心條件等進行適當調節。
若使多能幹細胞迅速彙聚形成細胞凝集體，則能夠再現性良好地於自所形成之凝集體分化誘導之細胞中形成上皮樣結構。作為形成細胞之凝集體之實驗操作，例如可例舉：使用小孔板(例如孔之底面積換算成平底為0.1～2.0 cm 2左右之培養板)或微孔等將細胞限制於小空間內之方法；藉由使用小離心管進行短時間離心而使細胞凝集之方法。作為小孔板，例如可例舉：24孔板(底面積換算成平底為1.88 cm 2左右)、48孔板(底面積換算成平底為1.0 cm 2左右)、96孔板(底面積換算成平底為0.35 cm 2左右，內徑6～8 mm左右)、384孔板。較佳為例舉96孔板。關於小孔板之形狀，自上方觀察孔時底面之形狀可例舉：多邊形、長方形、楕圓形、正圓形，較佳為正圓形。關於小孔板之形狀，自側面觀察孔時底面之形狀較佳為外周部較高而內部較低之下凹結構，例如可例舉：U底、V底、M底，較佳為U底或V底，最佳為V底。作為小孔板，亦可使用底面具有凹凸或凹陷之細胞培養皿(例如60 mm～150 mm平皿、培養瓶)。小孔板之底面較佳為採用細胞非黏附性之底面，較佳為具有細胞非黏附性塗層之底面。
作為形成細胞凝集體之其他方法，亦較佳為使用立體印刷機、3D印表機。藉由使經分散之單個細胞、或由複數個細胞構成之球狀體懸浮於具有生物相容性之墨水(生物墨水)中，使用生物3D印表機(例如Cellink公司製造之BIO X等)打印出來，或者用微針陣列串起細胞集群進行堆疊(CYFUSE公司製造之Spike等)等方法，可製備所需形態之細胞集群。
關於細胞凝集體之形成，可基於細胞凝集體之尺寸及細胞數目、宏觀形態、採用組織染色解析之微觀形態及其均一性、分化及未分化標記物之表現及其均一性、分化標記物之表現控制及其同步性、凝集體間之分化效率之再現性等進行判斷。
於第一步驟開始時，作為一較佳實施方式，實施附著培養。可將步驟(a)後之培養器材上之多能幹細胞直接用於第一步驟，亦可將多能幹細胞分散成單個細胞後，再次接種於黏附性之培養器材上。將多能幹細胞分散成單個細胞後實施再接種時，可使用適宜之細胞外基質或合成細胞黏附分子作為支架。可於表面經支架塗覆之培養器材中附著培養多能幹細胞。細胞外基質較佳為基質膠(Matrigel)或層黏連蛋白。作為合成細胞黏附分子，可例舉：含有聚-D-離胺酸、RGD序列等細胞黏附性區域之合成肽等。作為細胞之接種數目，只要發生向腦下垂體之分化，則無特別限定，就再現細胞間之黏著與相互作用之觀點而言，亦較佳為接種於培養器材後72小時以內，細胞密度成為如達到相當於器材之培養空間之60%以上的半融合狀之密度。
作為黏附性之培養器材，亦較佳為使用帶有微圖案之培養器材。培養器材上之微圖案可由細胞黏附性區域與細胞非黏附性區域構成，較佳為於細胞黏附性區域附著培養細胞。關於細胞黏附性區域與細胞非黏附性區域之形狀，只要能夠於培養器材上展開，則無限定。可於一個培養器材上分別形成單一區域之細胞黏附性區域與細胞非黏附性區域，亦可形成複數個。細胞黏附性區域較佳為經過人工處理以提高黏附性。作為帶有微圖案之培養器材，例如可例舉：CYTOOchip(CYTOO公司製造)、ibidi Micropatterning(ibidi公司製造)等。亦可使用PDMS製模型與基質等製備培養器材。或可使用例如細胞處理裝置(Model:CPD-017，片岡製作所公司製造)等，利用雷射等對塗有細胞外基質、促進細胞黏著之基質等之培養器材進行加工，形成任意形狀之細胞黏附性區域與細胞非黏附性區域。於帶有微圖案之培養器材上培養步驟(a)中獲得之多能幹細胞之情形時，例如可參照已報告之方法來實施(《自然-實驗室指南(Nature Protocols)》, 11(11), 2223-2232.)。
培養器材亦較佳為具有用以進行培養基灌流之流路(微流路)，於第一步驟及以後之步驟中，亦可於灌流環境下培養細胞。此種培養器材亦稱為微流體晶片。培養器材(例如微流體晶片)可藉由流路與培養本發明之製造方法所培養之細胞以外之細胞或組織的其他培養器材(例如微流體晶片)連接。藉此，能夠再現腦下垂體與其他細胞或組織之相互作用。作為與腦下垂體共培養之其他細胞或組織，可例舉：受腦下垂體分泌之激素調節之組織、促進腦下垂體之生長、分化、成熟、存活之組織，例如腦、血管、骨、肌肉、脂肪、甲狀腺、肝臟、腎上腺、睾丸、卵巢、乳房之細胞或組織等，但不限定於該等。作為培養基之灌流方法，例如可例舉使用磁力攪拌器、蠕動泵等，但不限定於此。
培養器材可具有能夠使氧或培養基透過之膜。培養器材可以能夠形成化合物、生長因子等之濃度梯度。膜例如為多孔質膜。於具有此種膜之培養器材中，可於經由膜隔開之一側採用本發明之製造方法培養細胞，於另一側培養其以外之細胞或組織、餵養細胞等。藉此，能夠將構成腦下垂體之細胞或其前體細胞及包含該等之細胞集群、與其他細胞或組織互不污染地進行培養。
於第一步驟及以後之步驟中進行培養基更換操作之情形時，例如可例舉：不廢棄舊培養基，再添加新培養基之操作(培養基添加操作)；廢棄半量左右(舊培養基之體積量之30～90%左右、例如40～60%左右)之舊培養基，再添加半量左右(舊培養基之體積量之30～90%、例如40～60%左右)之新培養基之操作(半量培養基更換操作)；廢棄全量左右(舊培養基之體積量之90%以上)之舊培養基，再添加全量左右(舊培養基之體積量之90%以上)之新培養基之操作(全量培養基更換操作)。
於某一時刻添加特定成分之情形時，可進行如下操作(半量培養基更換操作)：例如先計算出最終濃度，廢棄半量左右之舊培養基，再添加半量左右之以高於最終濃度之濃度包含特定成分之新培養基。於某一時刻稀釋舊培養基所含之成分以降低濃度之情形時，例如可1天進行複數次、較佳為1小時以內進行複數次(例如2～3次)培養基更換操作。又，於某一時刻稀釋舊培養基所含之成分以降低濃度之情形時，亦可將細胞或細胞凝集體轉移至其他培養容器。用以進行培養基更換操作之工具並無特別限定，例如可例舉：移液管、PIPETMAN(註冊商標)、多注式吸液管、連續分注器等。例如使用96孔板作為培養器材之情形時，可使用多注式吸液管。
第一步驟中之培養時間通常為8小時～6天左右，較佳為12小時～60小時左右。
於第一步驟及以後之步驟中，就提高腦下垂體之製造效率之觀點而言，亦較佳為添加促進向基板區域分化之化合物。作為具有如上所述作用之化合物，例如可例舉：美國專利US20160326491A1號中記載之BRL-54443、啡啉(Phenanthroline)、小白菊內酯(Parthenolide)等。作為促進向基板區域分化之化合物，於使用BRL-54443之情形時通常以約10 nM～約100 μM之濃度使用，於使用啡啉之情形時通常以約10 nM～約100 μM之濃度使用，於使用小白菊內酯之情形時通常以約10 nM～約100 μM之濃度使用。
於第一步驟中，就改善向腦下垂體之分化誘導效率之觀點而言，亦可於存在Shh訊號傳遞路徑作用物質之條件下實施培養。作為第一步驟中使用之Shh訊號傳遞路徑作用物質，可使用與步驟(a)中例示之Shh訊號傳遞路徑作用物質相同者。步驟(a)與第一步驟之Shh訊號傳遞路徑作用物質可相同亦可不同，較佳為相同，又，較佳為SAG。 關於培養基中之Shh訊號傳遞路徑作用物質之濃度，可於能夠達成上述效果之範圍內，根據所使用之物質而適當設定。於第一步驟中使用SAG作為Shh訊號傳遞路徑作用物質之情形時，通常以約1 nM～約3 μM、較佳為約10 nM～約2 μM、更佳為約30 nM～約1 μM、進而較佳為約50 nM～約500 nM之濃度使用。
＜步驟(2)＞ 步驟(2)係將第一步驟中獲得之細胞集群於存在BMP訊號傳遞路徑作用物質及Shh訊號傳遞路徑作用物質之條件下進行培養。於第一步驟中懸浮培養細胞之情形時，步驟(2)中亦繼續懸浮培養所形成之細胞凝集體即可。於第一步驟中附著培養細胞之情形時，於步驟(2)中亦繼續附著培養細胞即可。亦可於第一步驟中懸浮培養細胞後，於步驟(2)中進行附著培養。
所謂BMP訊號傳遞路徑作用物質係能夠使BMP介導之訊號傳遞路徑增強之物質。作為能夠使BMP介導之訊號傳遞路徑增強之物質，例如可例舉：使培養環境中之BMP配體穩定，提昇力價之物質；與作為I型BMP受體之ALK-1、ALK-2、ALK-3、ALK-6結合，激活、引發受體下游之細胞內訊號傳遞之物質；引起參與細胞內BMP訊號傳遞之Smad-1、Smad-5、Smad-8、Smad-9之磷酸化之物質；誘導、增強Smad-1/5/8/9介導之基因轉錄之激活或抑制等功能之物質等。作為BMP訊號傳遞路徑作用物質，例如可例舉：BMP2、BMP4或BMP7等BMP蛋白，GDF5、6、7等GDF蛋白，抗BMP受體抗體及BMP部分肽等。該等物質可單獨使用或組合使用。作為就生物學活性觀點而言之BMP訊號傳遞路徑作用物質之定義，例如可例舉：具有誘導小鼠軟骨前體細胞株ATDC5、源自小鼠顱頂之細胞株MC3T3-E1、源自小鼠橫紋肌之細胞株C2C12等細胞分化為成骨細胞樣細胞之能力、及誘導上述細胞產生鹼性磷酸酶之能力的物質。作為具有上述活性之物質，例如可例舉：BMP2、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、BMP9、BMP10、BMP13/GDF6、BMP14/GDF5、GDF7等。
BMP2蛋白及BMP4蛋白例如可自R&D Systems獲取，BMP7蛋白例如可自Biolegend公司獲取，GDF5蛋白例如可自PeproTech公司獲取，GDF6蛋白例如可自PrimeGene公司獲得，GDF7蛋白例如可自FUJIFILM Wako Pure Chemical公司獲取。BMP訊號傳遞路徑作用物質較佳為包含選自由BMP2、BMP4、BMP7、BMP13及GDF7所組成之群中之至少1種蛋白質，更佳為包含BMP4。
關於培養基中之BMP訊號傳遞路徑作用物質之濃度，可於能夠達成上述效果之範圍內，根據所使用之物質而適當設定。就提高構成腦下垂體之細胞之製造效率之觀點而言，於使用BMP4作為BMP訊號傳遞路徑作用物質之情形時，通常以約1 pM～約100 nM、較佳為約10 pM～約50 nM、更佳為約25 pM～約25 nM、進而較佳為約25 pM～約5 nM、尤佳為約100 pM～約5 nM、最佳為約500 pM～約2 nM之濃度使用。又，於使用BMP4以外之BMP訊號傳遞路徑作用物質之情形時，較理想為以顯示出與上述濃度之BMP4同等之BMP訊號傳遞路徑促進活性之濃度使用。若為業者，例如使用市售之重組BMP蛋白等作為BMP訊號傳遞路徑作用物質之情形時，藉由將製品隨附說明書中記載之活性、例如誘導小鼠軟骨前體細胞株ATDC5產生鹼性磷酸酶之能力之ED50等值與上述BMP4之濃度及活性進行比較，可容易地決定所添加之BMP訊號傳遞路徑作用物質濃度。
作為BMP訊號傳遞路徑作用物質，亦可使用業者周知之化合物。作為BMP訊號傳遞路徑作用物質，例如可例舉：Smurf1抑制物質、Chk1抑制物質、磷酸化Smad穩定物質等。作為具有如上所述活性之化合物，例如可例舉：A-01([4-[[4-氯-3-(三氟甲基)苯基]磺醯基]-1-哌𠯤基][4-(5-甲基-1H-吡唑-1-基)苯基]甲酮)、PD407824(9-羥基-4-苯基-吡咯并[3,4-c]咔唑-1,3(2H,6H)-二酮)、SB4(2-[[(4-溴苯基)甲基]硫基]苯并㗁唑)、SJ000291942(2-(4-乙基苯氧基)-N-(4-氟-3-硝基苯基)-乙醯胺)以及該等之衍生物等。
作為步驟(2)中使用之Shh訊號傳遞路徑作用物質，可使用與步驟(a)中例示之Shh訊號傳遞路徑作用物質相同者。步驟(a)與步驟(2)之Shh訊號傳遞路徑作用物質可相同亦可不同，較佳為相同，又，較佳為SAG。 關於培養基中之Shh訊號傳遞路徑作用物質之濃度，可於能夠達成上述效果之範圍內，根據所使用之物質而適當設定。於步驟(2)中使用SAG作為Shh訊號傳遞路徑作用物質之情形時，通常以約1 nM～約5 μM、較佳為約10 nM～約4.5 μM、更佳為約50 nM～約4 μM、進而較佳為約100 nM～約3 μM之濃度使用。
步驟(2)中使用之培養基只要包含Shh訊號傳遞路徑作用物質及BMP訊號傳遞路徑作用物質，則並無特別限定。作為步驟(2)中使用之培養基，可例舉第一步驟中例舉之培養基。
就提高腦下垂體之製造效率之觀點而言，步驟(2)之開始時期較佳為距第一步驟中開始培養經過了0.5小時以上6天以內，更佳為0.5小時以上72小時以內，進而較佳為24小時以上60小時以內。於實施懸浮培養之情形時，若於存在Wnt訊號路徑抑制物質之條件下，於上述期間開始步驟(2)，則於細胞凝集體之表面形成非神經上皮樣組織，效率極佳地形成腦下垂體。
於第一步驟中進行懸浮培養之情形時，就提高構成腦下垂體之細胞之製造效率之觀點而言，步驟(2)之開始時期較佳為第一步驟中形成之細胞凝集體之表層中之10%以上、更佳為30%以上、進而較佳為50%以上之細胞相互形成緊密連接的時期。若為業者，例如可藉由顯微鏡觀察、使用抗ZO-1抗體之免疫染色等方法容易地判別細胞凝集體中是否形成緊密連接。
步驟(2)中之於存在BMP訊號傳遞路徑作用物質之條件下之培養開始時，可使用進行過第一步驟之培養容器，進行上述培養基更換操作(例如培養基添加操作、半量培養基更換操作、全量培養基更換操作等)，亦可將細胞移入其他培養容器。
步驟(2)中之包含BMP訊號傳遞路徑作用物質之培養基中之培養期可適當設定。步驟(2)中之培養時間通常為8小時以上、較佳為10小時以上、更佳為12小時以上、進而較佳為14小時以上、最佳為16小時以上。
步驟(2)中之包含Shh訊號傳遞路徑作用物質之培養基中之培養期可適當設定。再者，於步驟(1)中之懸浮培養係進而於存在Shh訊號傳遞路徑作用物質之條件下實施之情形時，步驟(1)及步驟(2)中之於存在Shh訊號傳遞路徑作用物質之條件下之培養期較佳為30天。
於步驟(2)及以後之步驟中，就促進向腦下垂體基板之分化之觀點而言，亦較佳為於培養環境中添加FGF訊號傳遞路徑作用物質。所謂FGF訊號傳遞路徑作用物質，只要為能夠使FGF(纖維母細胞生長因子)介導之訊號傳遞路徑增強之物質，則無特別限定。作為FGF訊號傳遞路徑作用物質，例如可例舉：FGF1、FGF2(有時亦稱為bFGF)、FGF3、FGF8、FGF10等FGF蛋白、抗FGF受體抗體、FGF部分肽等。該等物質可單獨使用或組合使用。
FGF2蛋白及FGF8蛋白例如可自FUJIFILM Wako Pure Chemical股份有限公司獲取。FGF訊號傳遞路徑作用物質較佳為包含選自由FGF2、FGF3、FGF8及FGF10、以及該等之改型體所組成之群中之至少一者，更佳為包含FGF2，進而較佳為包含重組人FGF2。
關於培養基中之FGF訊號傳遞路徑作用物質之濃度，可於能夠達成上述效果之範圍內，根據所使用之物質而適當設定。就促進向構成鼻腔上皮之細胞之分化及細胞之存活與增殖之觀點而言，於使用FGF2作為FGF訊號傳遞路徑作用物質之情形時，通常以約1 pg/ml～約100 μg/ml、較佳為約10pg/ml～約50 μg/ml、更佳為約100pg/ml～約10 μg/ml、進而較佳為約500 pg/ml～約1 μg/ml、最佳為約1 ng/ml～約200 ng/ml之濃度使用。又，於使用FGF2以外之FGF訊號傳遞路徑作用物質之情形時，較理想為以顯示出與上述濃度之FGF2同等之FGF訊號傳遞路徑促進活性之濃度使用。對於所添加之物質之FGF訊號傳遞路徑促進活性，例如可藉由使用3T3細胞之細胞增殖試驗等方法測定。
為了保持培養基中之FGF蛋白之活性，亦較佳為於包含FGF蛋白之培養基中添加肝素、硫酸乙醯肝素。例如可自FUJIFILM Wako Pure Chemical股份有限公司獲取鈉鹽形態之肝素。培養基中之肝素或硫酸乙醯肝素之濃度可於能夠達成上述效果之範圍內適當設定。培養基中之肝素鈉之濃度通常為約1 ng/ml～約100 mg/ml、較佳為約10 ng/ml～約50 mg/ml、更佳為約100 ng/ml～約10 mg/ml、進而較佳為約500 ng/ml～約1 mg/ml、最佳為約1 μg/ml～約200 μg/ml。於使用硫酸乙醯肝素之情形時，較佳為具有與上述濃度之肝素同等之FGF蛋白保護活性之濃度。為了於37℃等之細胞培養環境下保持FGF蛋白之活性，亦較佳為使用例如美國專利US8772460B2號中記載之Thermostable FGF2等FGF之改型體、或使FGF2與生物降解性聚合物結合而成之StemBeads FGF2等FGF2緩釋性珠粒。Thermostable FGF2例如可自HumanZyme公司獲取。StemBeads FGF2例如可自StemCulture公司獲取。
步驟(2)及以後之步驟中之FGF訊號傳遞路徑作用物質之添加時期可適當設定。作為一較佳實施方式，距步驟(2)中添加BMP訊號傳遞路徑作用物質經過6小時以後、更佳為12小時以後、進而較佳為18小時以後添加FGF訊號傳遞路徑作用物質。
於步驟(2)中，亦較佳為繼續添加步驟(a)或第一步驟中使用之添加物，例如JNK訊號傳遞路徑抑制物質、Wnt訊號傳遞路徑抑制物質、TGFβ訊號傳遞路徑抑制物質、TAK1抑制物質等。步驟(2)中添加之JNK訊號傳遞路徑抑制物質、Wnt訊號傳遞路徑抑制物質或TGFβ訊號傳遞路徑抑制物質可與其以前之步驟中使用之物質不同，但較佳為相同。添加物之濃度及種類可適當調整。該等物質之添加時期可與步驟(2)開始之時同時，亦可不同時。
＜步驟(b)＞ 步驟(2)之後亦可進而包括以下之步驟(b)。步驟(b)係將步驟(2)中獲得之細胞集群於添加BMP訊號傳遞路徑抑制物質之條件下進行培養。於步驟(2)中懸浮培養細胞之情形時，步驟(b)中亦繼續懸浮培養所形成之細胞凝集體即可。於步驟(2)中附著培養細胞之情形時，步驟(b)中亦繼續附著培養細胞即可。
所謂BMP訊號傳遞路徑抑制物質，只要能夠抑制BMP家族蛋白引發之訊號傳遞，則無限定。可為核酸、蛋白質、低分子有機化合物之任意者。作為該物質，例如可例舉：抑制BMP之加工及向細胞外分泌之物質、與BMP直接作用之物質(例如蛋白質、抗體、適體等)、抑制編碼BMP之基因表現之物質(例如反義寡核苷酸、siRNA等)、抑制BMP受體與BMP之結合之物質、抑制BMP受體介導之訊號傳遞所引起之生理活性之物質。BMP受體存在I型BMP受體與II型BMP受體，作為I型BMP受體，已知BMPR1A、BMPR1B、ACVR；作為II型BMP受體，已知TGF-β R-II、ActR-II、ActR-IIB、BMPR2、MISR-II。
關於已知之作為BMP訊號傳遞路徑抑制物質之蛋白質，例如可例舉：頭蛋白(Noggin)、Chordin、卵泡抑素(Follistatin)、Gremlin、抑制素(Inhibin)、扭轉原腸胚形成同源物(Twisted Gastrulation)、Coco、屬於DAN家族之分泌蛋白等。由於上述步驟(2)中於培養液中添加BMP訊號傳遞路徑作用物質，故就更有效地抑制以後之BMP訊號傳遞路徑之觀點而言，步驟(b)中之BMP訊號傳遞路徑抑制物質較佳為包含對BMP向細胞外之分泌以後之訊號傳遞路徑進行抑制之物質，例如抑制BMP受體與BMP之結合之物質、抑制BMP受體介導之訊號傳遞所引起之生理活性之物質等，更佳為包含I型BMP受體之抑制劑。
作為BMP訊號傳遞路徑抑制物質，亦可使用業者周知之化合物。作為BMP訊號傳遞路徑抑制物質，例如可例舉I型BMP受體之抑制物質。作為具有如上所述活性之化合物，例如可例舉：K02288(3-[(6-胺基-5-(3,4,5-三甲氧基苯基)-3-吡啶基]苯酚，3-[6-胺基-5-(3,4,5-三甲氧基苯基)-3-吡啶基]-苯酚)、多索啡(Dorsomorphin)(6-[4-[2-(1-哌啶基)乙氧基]苯基]-3-(4-吡啶基)吡唑并[1,5-a]嘧啶)、LDN-193189(4-[6-[4-(1-哌𠯤基)苯基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基]喹啉二鹽酸鹽)、LDN-212854(5-[6-[4-(1-哌𠯤基)苯基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基]喹啉)、LDN-214117(1-(4-(6-甲基-5-(3,4,5-三甲氧基苯基)吡啶-3-基)苯基)哌𠯤)、ML347(5-[6-(4-甲氧基苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基]喹啉))、DMH1(4-(6-(4-異丙氧基苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)喹啉)、DMH2(4-[6-[4-[2-(4-嗎啉基)乙氧基]苯基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基]-喹啉)、化合物1(3-(1,2,3-苯并噻二唑-6-基)-1-[2-(環己-1-烯-1-基)乙基]脲)、VU0465350(7-(4-異丙氧基苯基)-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡啶)、VU0469381(5-(6-(4-甲氧基苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)喹諾酮)、OD36(4-氯-7,10-二氧雜-13,17,18,21-四氮雜四環[12.5.2.12,6.017,20]二十二碳-1(20),2(22),3,5,14(21),15,18-七烯)、OD52、E6201((3S,4R,5Z,8S,9S,11E)-14-(乙基胺基)-8,9,16-三羥基-3,4-二甲基-3,4,9,10-四氫-1H-苯并[c][1]氧雜環十四炔-1,7(8H)-二酮)、塞卡替尼(Saracatinib)(N-(5-氯-1,3-苯并間二氧雜環戊烯-4-基)-7-[2-(4-甲基哌𠯤-1-基)乙氧基]-5-(㗁烷-4-基氧基)喹唑啉-4-胺)、BYL719((2S)-1-N-[4-甲基-5-[2-(1,1,1-三氟-2-甲基丙烷-2-基)吡啶-4-基]-1,3-噻唑-2-基]吡咯啶-1,2-二羧醯胺)等。該等物質可單獨使用或組合使用。
BMP訊號傳遞路徑抑制物質較佳為I型BMP受體抑制劑，更佳為包含選自由K02288、多索啡(Dorsomorphin)、LDN-193189、LDN-212854、LDN-214117、ML347、DMH1及DMH2所組成之群中之至少一者，進而較佳為包含K02288或LDN-193189。
關於培養基中之BMP訊號傳遞路徑抑制物質之濃度，可於能夠達成上述效果之範圍內，根據所使用之物質而適當設定。就腦下垂體組織之形成效率之觀點而言，於使用K02288作為步驟(b)中之BMP訊號傳遞路徑抑制物質之情形時，通常以約1 nM～約100 μM、較佳為約10 nM～約50 μM、更佳為約100 nM～約50 μM、進而較佳為約500 nM～約25 μM之濃度使用。於使用LDN-193189作為BMP訊號傳遞路徑抑制物質之情形時，通常以約1 nM～約100 μM、較佳為約10 nM～約10 μM、更佳為約25 nM～約1 μM、進而較佳為約100 nM～約500 nM之濃度使用。於使用LDN-212854作為BMP訊號傳遞路徑抑制物質之情形時，通常以約1 nM～約100 μM、較佳為約10 nM～約10 μM、更佳為約25 nM～約5 μM、進而較佳為約250 nM～約3 μM之濃度使用。於使用ML-347作為BMP訊號傳遞路徑抑制物質之情形時，通常以約1 nM～約100 μM、較佳為約10 nM～約50 μM、更佳為約100 nM～約50 μM、進而較佳為約1 μM～約25 μM之濃度使用。於使用DMH2作為BMP訊號傳遞路徑抑制物質之情形時，通常以約1 nM～約100 μM、較佳為約10 nM～約10 μM、更佳為約25 nM～約5 μM、進而較佳為約250 nM～約3 μM之濃度使用。又，於使用K02288以外之BMP訊號傳遞路徑抑制物質之情形時，較理想為以顯示出與上述濃度之K02288同等之BMP訊號傳遞路徑抑制活性之濃度使用。
步驟(2)實施之後開始步驟(b)之時期可適當設定。步驟(b)之開始時期通常距步驟(2)開始後8小時以上且15天以內、較佳為10小時以上且12天以內、更佳為12小時以上且9天以內、進而較佳為14小時以上且8天以內、最佳為16小時以上且7天以內。
步驟(2)及以後之步驟中，亦可於培養基中添加腎上腺皮質激素類，藉此利用腎上腺皮質激素類對細胞集群進行處理。藉由腎上腺皮質激素類處理，促進自腦下垂體基板及/或拉德凱氏囊向ACTH產生細胞以外之腦下垂體激素產生細胞(即，GH產生細胞、PRL產生細胞、TSH產生細胞、LH產生細胞、FSH產生細胞等)之分化。作為腎上腺皮質激素類，可例舉：氫化可體松、乙酸可體松、乙酸氟氫可體松等天然之糖皮質激素；地塞米松、倍他米松、潑尼松龍、甲基潑尼松龍、去炎松等人工合成之糖皮質激素等，但並不限定於該等。
關於培養基中之腎上腺皮質激素類之濃度，只要能夠促進自腦下垂體基板及/或拉德凱氏囊向腦下垂體激素產生細胞(其中，ACTH產生細胞除外)之分化，則無特別限定，又，可根據腎上腺皮質激素類之種類而適當設定，例如，於氫化可體松之情形時，通常為100 ng/ml以上、較佳為1 μg/ml以上。只要不對向腦下垂體激素產生細胞(其中，ACTH產生細胞除外)之分化產生不良影響，氫化可體松濃度並無特別之上限值，就培養成本之觀點而言，通常為1000 μg/ml以下、較佳為100 μg/ml以下。於一實施方式中，培養基中之氫化可體松濃度通常為約100 ng/ml～約1000 μg/ml、較佳為約1～約100 μg/ml。於使用地塞米松作為腎上腺皮質激素類之情形時，其於培養基中之濃度可設為氫化可體松之1/25左右。
關於步驟(2)及以後之步驟中於培養基中添加腎上腺皮質激素類之時期，只要能夠促進自腦下垂體基板及/或拉德凱氏囊向腦下垂體激素產生細胞(其中，ACTH產生細胞除外)之分化，則無特別限定，可於第二步驟開始之時於培養基中添加腎上腺皮質激素類；亦可於第二步驟開始後，於不添加腎上腺皮質激素類之培養基中培養一定時間後，再於培養基中添加腎上腺皮質激素類。較佳為於第二步驟開始後，於確認細胞集群中出現ACTH產生細胞之階段，於培養基中添加腎上腺皮質激素類。即，於確認細胞凝集體中出現ACTH產生細胞之前，於不添加腎上腺皮質激素類之培養基中培養細胞凝集體，於確認出現ACTH產生細胞後，於包含腎上腺皮質激素類之培養基中繼續實施第二步驟及以後之步驟。可使用針對ACTH之抗體，藉由免疫組織學染色來確認ACTH產生細胞之出現。於使用人多能幹細胞之情形時，一般而言，若距第一步驟開始經過30天以後，則可期待出現ACTH產生細胞，因此，於一實施方式中，於距第一步驟開始後30天以後，於培養基中添加腎上腺皮質激素類。
關於利用腎上腺皮質激素類對細胞凝集體進行處理之時間，只要能夠促進自腦下垂體基板及/或拉德凱氏囊向腦下垂體激素產生細胞(其中，ACTH產生細胞除外)之分化，則無特別限定，通常情況下，利用腎上腺皮質激素類對細胞凝集體進行處理，直至與腎上腺皮質激素類非處理組相比腎上腺皮質激素類處理組中確認到促進向腦下垂體激素產生細胞(其中，ACTH產生細胞除外)之分化。處理期通常為7天以上、較佳為12天以上。處理期之上限值並無特別限定，可於與腎上腺皮質激素類非處理組相比腎上腺皮質激素類處理組中確認到促進向腦下垂體激素產生細胞(其中，ACTH產生細胞除外)之分化之階段，自培養基中去除腎上腺皮質激素類。
步驟(2)及以後之步驟中，就促進向腦下垂體之分化及向生長激素產生細胞之分化之觀點而言，亦較佳為於存在視黃酸訊號傳遞路徑作用物質之條件下進行。作為視黃酸傳遞路徑作用物質，例如可例舉與視黃酸受體(RAR)或視黃醇類X受體(RXR)結合而激活下游之轉錄之物質等。作為具有如上所述作用之化合物，例如可例舉：全反式視黃酸、異維甲酸、9-順式視黃酸、TTNPB(4-[(E)-2-[(5,5,8,8-四甲基-5,6,7,8-四氫萘)-2-基]-1-丙烯基]苯甲酸)、Ch55(4-[(E)-3-(3,5-二第三丁基苯基)-3-側氧基-1-丙烯基]苯甲酸)、EC19(3-[2-(5,6,7,8-四氫-5,5,8,8-四甲基-2-萘基)乙炔基]苯甲酸)、EC23(4-[2-(5,6,7,8-四氫-5,5,8,8-四甲基-2-萘基)乙炔基)-苯甲酸)、芬瑞替(Fenretinide)(4-羥基苯基視黃醯胺)、阿曲汀(Acitretin)((all-e)-9-(4-甲氧基-2,3,6-三甲基苯基)-3,7-二甲基-2,4,6,8-壬四烯)、曲法羅汀(Trifarotene)、阿達帕林(Adapalene)、AC 261066(4-[4-(2-丁氧基乙氧基-)-5-甲基-2-噻唑基]-2-氟苯甲酸)、AC 55649(4-N-辛基聯苯-4-羧酸)、AM580(4-[(5,6,7,8-四氫-5,5,8,8-四甲基-2-萘基)甲醯胺基]苯甲酸)、AM80(4-[(5,5,8,8-四甲基-6,7-二氫萘-2-基)胺甲醯基]苯甲酸)、BMS753(4-[[(2,3-二氫-1,1,3,3-四甲基-2-側氧基-1H-茚-5-基)羰基]胺基]苯甲酸)、BMS961(3-氟-4-[(r)-2-羥基-2-(5,5,8,8-四甲基-5,6,7,8-四氫-萘-2-基)-乙醯基胺基]-苯甲酸)、CD1530(4-(6-羥基-7-三環[3.3.1.13,7]癸-1-基-2-萘基)苯甲酸)、CD2314(5-(5,6,7,8-四氫-5,5,8,8-四甲基-2-蒽基)-3-噻吩羧酸)、CD437(6-(4-羥基-3-三環(3.3.1.1(3,7))癸-1-基苯基)-2-萘羧酸)、CD271(6-[3-(1-金剛烷基)-4-甲氧基苯基]-2-萘羧酸)及該等之衍生物等。該等物質可單獨使用或組合使用。
步驟(2)及以後之步驟中之視黃酸傳遞路徑作用物質較佳為包含全反式視黃酸或EC23。關於培養基中之視黃酸傳遞路徑作用物質之濃度，只要於能夠達成上述效果之範圍內，則無特別限定，於使用EC23作為視黃酸傳遞路徑作用物質之情形時，EC23之濃度例如為約10 pM～約30 μM，較佳為約100 pM～約20 μM，更佳為約10 nM～約10 μM，進而較佳為約100 nM～約5 μM。於使用EC23以外之視黃酸傳遞路徑作用物質之情形時，較理想為以顯示出與上述濃度之EC23同等之視黃酸傳遞路徑作用活性之濃度使用。
就調節分化傾向之觀點而言，亦較佳為於存在Notch訊號傳遞路徑抑制物質之條件下進行步驟(2)及以後之步驟。於本發明中，所謂Notch訊號傳遞路徑，表示藉由細胞膜上表現之受體即Notch蛋白、與相鄰細胞之細胞膜上表現之Notch配體(Delta、Jagged等)直接相互作用而被激活之訊號傳遞路徑。於傳遞Notch訊號之細胞中，Notch蛋白經過階段性之加工，細胞膜上切割出之胞內域被轉運到細胞核內，從而控制下游基因之表現。
作為Notch訊號傳遞路徑抑制物質，只要能夠抑制Notch介導之訊號傳遞，則無特別限定。可為核酸、蛋白質、低分子有機化合物之任意者。作為該物質，例如可例舉：功能缺失型之Notch受體及配體、抑制Notch之加工(S1切割)之物質、抑制Notch及Notch配體之糖鏈修飾之物質、抑制細胞膜遷移之物質、抑制Notch之胞內域(NICD)之加工(S2切割、S3切割)之物質(γ分泌酵素抑制劑)、分解NICD之物質、抑制NICD依賴性轉錄之物質等。
作為Notch訊號傳遞路徑抑制物質，亦可使用業者周知之化合物。關於具有作為Notch訊號傳遞路徑抑制物質之活性的化合物，例如可例舉：DAPT(N-[N-(3,5-二氟苯乙醯基)-l-丙胺醯基]-S-苯基甘胺酸第三丁酯)、DBZ((2S)-2-[[2-(3,5-二氟苯基)乙醯基]胺基]-N-[(7S)-5-甲基-6-側氧基-7H-苯并[d][1]苯并氮呯-7-基]丙醯胺)、MDL28170(N-[(2S)-3-甲基-1-側氧基-1-[[(2S)-1-側氧基-3-苯基丙烷-2-基]胺基]丁烷-2-基]胺基甲酸苄酯)、FLI-06(2,7,7-三甲基-4-(4-硝基苯基)-5-側氧基-1,4,6,8-四氫喹啉-3-羧酸環己酯)、L-685,458(N-[6-[[1-[(1-胺基-1-側氧基-3-苯基丙烷-2-基)胺基]-4-甲基-1-氧戊烷-2-基]胺基]-5-苄基-3-羥基-6-側氧基-1-苯基己烷-2-基]胺基甲酸第三丁酯)、CB-103(6-(4-第三丁基苯氧基)吡啶-3-胺)及該等之衍生物等、以及《腫瘤靶標及治療(Onco Targets and Therapy)》2013; 6:943-955.中記載之物質等。Notch訊號傳遞路徑抑制物質較佳為包含DAPT。
關於培養基中之Notch訊號傳遞路徑抑制物質之濃度，只要於能夠達成上述效果之範圍內，則無特別限定，例如於使用DAPT作為Notch訊號傳遞路徑抑制物質之情形時，DAPT之濃度例如為約100 pM～約50 μM，較佳為約1 nM～約30 μM，更佳為約100 nM～約20 μM，進而較佳為約1 μM～約10 μM。於使用DAPT以外之Notch訊號傳遞路徑抑制物質之情形時，較理想為以顯示出與上述濃度之DAPT同等之Notch訊號傳遞路徑抑制活性之濃度使用。
＜步驟(3)＞、＜步驟(3')＞：第三步驟 第三步驟係將步驟(2)或步驟(b)中培養之細胞集群於不添加Shh訊號傳遞路徑作用物質之條件下進行培養。將第二步驟中獲得之細胞集群於不存在Shh傳遞路徑作用物質之條件下進行培養而獲得包含腦下垂體組織之細胞集群的第三步驟稱為步驟(3)，將步驟(b)中獲得之細胞集群於不存在Shh訊號傳遞路徑作用物質之條件下進行培養而獲得包含腦下垂體組織之細胞集群的第三步驟稱為步驟(3')。於步驟(2)或步驟(b)中懸浮培養細胞之情形時，第三步驟中亦繼續懸浮培養所形成之細胞凝集體即可。於步驟(2)或步驟(b)中附著培養細胞之情形時，第三步驟中亦繼續附著培養細胞即可。亦可於步驟(2)或步驟(b)中懸浮培養細胞後，於第三步驟中進行附著培養。
第三步驟中使用之培養基只要不含有Shh訊號傳遞路徑作用物質，則並無特別限定。本步驟中之所謂不添加Shh訊號傳遞路徑作用物質之條件，表示不有意地於細胞集群之培養環境中添加Shh訊號傳遞路徑作用物質之條件，由於細胞集群之自我分泌等而無意地使培養環境中包含Shh訊號傳遞路徑作用物質之情形亦屬於不添加Shh訊號傳遞路徑作用物質之條件。作為第三步驟中使用之培養基，可例舉第一步驟中例舉之培養基、或者含有10%或20%之KSR之gfCDM培養基等。
於第三步驟及以後之步驟中，就促進構成腦下垂體之細胞之存活及分化成熟之觀點而言，亦可包括將細胞凝集體包埋於凝膠中進行培養之步驟。作為凝膠，例如可例舉使用瓊脂糖、甲基纖維素、膠原蛋白、基質膠(Matrigel)等之凝膠，較佳為使用基質膠(Matrigel)。
第三步驟及以後之步驟之將細胞包埋於凝膠中培養之步驟中，可直接包埋細胞凝集體，亦可將經分散及單離後之細胞接種於凝膠中。可使用細胞分選儀等分取基底細胞等特定之細胞瘤後進行接種。作為包埋於凝膠中之培養法之另一實施方式，亦可與纖維母細胞、間葉系細胞、血管系細胞等腦下垂體以外之細胞實施共培養。如上所述之凝膠包埋培養可參照例如《自然(Nature)》501, 373-379(2013)、《自然(Nature)》499, 481-484(2013)、《自然-實驗室指南(Nat Protoc.)》14, 518-540(2019)、《基因(Genes)》2020, 11, 603等實施。
於第三步驟及以後之步驟中，為了改善向細胞之營養及氧之供給、改善物質交換，亦較佳為實施對細胞進行物理晃動之培養方法。作為此種培養方法，可例舉：振盪培養、旋轉培養、攪拌培養等靜置培養以外之方法。用以實施振盪培養、旋轉培養、攪拌培養等之方法並無特別限定，例如可藉由將培養細胞之培養器材設置於旋轉器、振盪器等上、或者將細胞置於具備旋轉之攪拌器等之環境下而實施。關於振盪培養、旋轉培養、攪拌培養之速度等參數，若為業者，可於不損傷細胞之範圍內適當設定。例如於使用波動式揺動之3D振盪器(例如Mini-Shaker 3D，Biosan公司製造)實施振盪培養之情形時，例如可於5～60 rpm、較佳為5～40 rpm、更佳為5～20 rpm之範圍內設定振盪速度範圍。於使用往復式振盪器(例如NS-LR，AS ONE公司製造)實施振盪培養之情形時，例如可於15～60 rpm、較佳為15～50 rpm、更佳為15～45 rpm之範圍內設定振盪速度範圍。於使用蹺板式振盪器(例如NS-S，AS ONE公司製造)實施振盪培養之情形時，例如可於5～50 rpm、較佳為5～40 rpm、更佳為5～30 rpm之範圍內設定振盪速度範圍。於採用攪拌培養、旋轉培養方式培養細胞凝集體之情形時，例如亦可將旋轉燒瓶(例如3152，Corning公司製造)設置於磁力攪拌器上，以目視觀察下細胞凝集體無沈降之程度之旋轉數實施培養。亦可使用三維旋轉懸浮培養裝置(例如CellPet CUBE，J-Tech公司製造；Clinostar，Celvivo公司製造)實施培養。就抑制對細胞之摩擦等物理損傷之觀點而言，亦較佳為對上述包埋於凝膠中之細胞凝集體進行振盪培養、旋轉培養或攪拌培養。
於第三步驟(3)及以後之步驟中，就抑制細胞死亡、促進細胞增殖之觀點而言，亦較佳為於高氧環境下培養。培養過程中之高氧條件例如可藉由對培養細胞之培養箱連接氧氣瓶，人工供給氧氣來實現。基於該目的之氧濃度通常為25%～80%，更佳為30%～60%。
於第三步驟及以後之步驟中，就增加向培養細胞凝集體之培養基中之供氧量之觀點而言，亦可使用換氣效率較高之培養器材。作為此種培養器材之例，可例舉：細胞培養皿(培養板)之底面由透氣性膜製成之Lumox Dish(Sarstedt公司製造)、VECELL 96孔板(VESSEL股份有限公司製造)等。亦較佳為與上述高氧濃度條件下之培養組合使用。
於第三步驟及以後之步驟中，就維持細胞凝集體中之上皮組織之結構之觀點而言，亦可於培養基中添加細胞保護劑。作為步驟(3)及以後之步驟中使用之細胞保護劑，可例舉：上述FGF訊號傳遞路徑作用物質、肝素、ROCK抑制物質、基底膜標準品、肌球蛋白抑制物質、聚胺類、ISR抑制劑、半胱天冬酶抑制劑、血清、或血清代替物等。關於肌球蛋白抑制物質，例如可例舉：作為非肌肉型肌球蛋白II ATP酶抑制物質之布雷他汀(Blebbistatin)、作為肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK)抑制物質之ML-7、ML-9、W-7、MLCK抑制肽18以及該等之衍生物等。所添加之細胞保護劑可與第一步驟中添加者不同，但較佳為相同。作為較佳之細胞保護劑，可例舉ROCK抑制物質。於第三步驟及以後之步驟中，關於細胞保護劑，添加作為ROCK抑制物質之Y-27632之情形時，通常以使成為約10 nM～約10 mM、較佳為約100 nM～約1 mM、更佳為約1 μM～約100 μM之濃度之方式添加至培養環境中。於添加作為ROCK抑制物質之𠳭烷1之情形時，通常以使成為約10 pM～約1 mM、較佳為約100 pM～約100 μM、更佳為約1 nM～約10 μM之濃度之方式添加至培養環境中。關於細胞保護劑，於添加作為非肌肉型肌球蛋白II ATP酶抑制物質之布雷他汀(Blebbistatin)之情形時，通常以使成為約10 nM～約10 mM、較佳為約100 nM～約1 mM、更佳為約1 μM～約100 μM之濃度之方式添加至培養環境中。
於第三步驟及以後之步驟中，亦可添加細胞保護劑以外之具有維持上皮組織之結構之作用的物質。作為如上所述之物質，例如可例舉：促進細胞黏著之物質、促進基底膜成分之合成之物質、抑制基底膜成分之分解之物質等。促進細胞黏著之物質可為促進細胞-細胞間之黏著、細胞-基底膜間之黏著、細胞-培養器材間之黏著等任一種黏著者，亦可為促進產生細胞黏著相關因子者。作為促進細胞黏著之物質，例如可例舉：黏接胺(Adhesamine)、黏接胺-RGDS衍生物、Pyrintegrin、生物素三肽-1、乙醯基四肽-3、RGDS肽以及該等之衍生物等。作為促進基底膜成分之合成之物質，例如可例舉抗壞血酸衍生物等。作為抗壞血酸衍生物，例如可例舉：抗壞血酸磷酸鈉、抗壞血酸磷酸鎂、抗壞血酸2-葡萄糖苷、3-O-乙基抗壞血酸、抗壞血酸四己基癸酸酯、抗壞血酸棕櫚酸酯、抗壞血酸硬脂酸酯、抗壞血酸-2磷酸-6棕櫚酸酯、甘油基辛基抗壞血酸等。作為抑制基底膜成分之分解之物質，例如可例舉：基質金屬蛋白酶及絲胺酸蛋白酶之抑制劑等。關於促進基底膜成分之合成之物質，於添加作為抗壞血酸衍生物之一種的抗壞血酸2-磷酸酯之情形時，通常以使成為10 μg/ml以上1000 μg/ml以下、較佳為30 μg/ml以上500 μg/ml以下、進而較佳為50 μg/ml以上300 μg/ml以下之濃度之方式添加至培養環境中。添加其他抗壞血酸及抗壞血酸之衍生物等之情形時，以與上述濃度為同等程度之莫耳當量之方式添加即可。
於第三步驟及以後之步驟中，就促進腦下垂體細胞之存活之觀點而言，亦較佳為添加具有減輕氧化壓力作用之物質。作為具有如上所述活性之物質，例如可例舉：抗氧化物質、具有自由基清除劑作用之物質、NADPH氧化酶抑制物質、環加氧酶抑制物質、脂肪加氧酶(LOX)抑制物質、超氧化物歧化酶(SOD)樣物質、Nrf2活化劑等。作為具有如上所述活性之物質，例如可例舉：抗壞血酸、N-乙醯基-L-半胱胺酸、乙酸(±)-α-生育酚、羅布麻寧(Apocynin)(4'-羥基-3'-甲氧基苯乙酮)、菸鹼醯胺、牛磺酸(2-胺基乙磺酸)、IM-93(1-異丙基-3-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-4-(N,N-二甲基-1,3-丙二胺)-1H-吡咯-2,5H-二酮)、咖啡酸(3,4-二羥基肉桂酸)、雷公藤紅素(Celastrol)(3-羥基-24-去甲基-2-側氧基-1(10),3,5,7-木栓四烯-29-羧酸；Tripterin)、依布硒(Ebselen)(2-苯基-1,2-苯并異硒唑-3(2H)-酮)、(-)-表沒食子兒茶素沒食子酸酯((2R,3R)-2-(3,4,5-三羥基苯基)-3,4-二氫-1[2H]-苯并哌喃-3,5,7-三醇-3-(3,4,5-三羥基苯甲酸酯))、EUK-8(N,N'-雙(亞柳基胺基)乙烷-錳(II))、依達拉奉(Edaravone)(3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮)、MnTBAP(四(4-苯甲酸)卟啉氯化錳(III))、正二氫癒創酸、白藜蘆醇(Resveratrol)(反式-3,4,5-三羥基芪)以及該等之衍生物等，但不限定於該等。亦可使用已經製備完成之細胞培養用試劑(例如抗氧化補充劑，Sigma Aldrich公司製造，A1345)。本發明中使用之具有減輕氧化壓力作用之物質較佳為包含選自由抗壞血酸、N-乙醯基-L-半胱胺酸以及該等之衍生物所組成之群中之至少一者。抗壞血酸例如作為其衍生物之抗壞血酸2-磷酸酯可以約1 nM～約1 M、較佳為約10 nM～約100 mM、更佳為約100 nM～約10 mM、進而較佳為約1 μM～約3 mM之濃度添加至培養基中，N-乙醯基-L-半胱胺酸可以例如約1 nM～約1 M、較佳為約10 nM～約100 mM、更佳為約100 nM～約10 mM、進而較佳為約1 μM～約5 mM之濃度添加至培養基中。
於第三步驟及以後之步驟中，就促進腦下垂體細胞之存活之觀點而言，亦較佳為添加針對壓力應答訊號傳遞路徑之抑制物質(抑制響應壓力之胞內訊號傳遞機制之物質)。壓力應答性MAP激酶路徑(應激活化蛋白激酶(stress-activated protein kinase：SAPK))為主要之響應壓力之胞內訊號傳遞機制之一。作為壓力應答性MAP激酶路徑之抑制劑，例如可例舉：MAP3K抑制劑、MAP2K抑制劑、ASK抑制劑、MEK抑制劑、Akt抑制劑、Rho家族激酶抑制劑、JNK抑制劑、p38抑制劑、MSK抑制劑、STAT抑制劑、NF-κB抑制劑、CAMK抑制劑等。
作為MEK抑制劑，例如可例舉：司美替尼(Selumetinib)(AZD6244、6-(4-溴-2-氯苯胺基)-7-氟-N-(2-羥基乙氧基)-3-甲基苯并咪唑-5-羧醯胺)、Mirdametinib(PD0325901、N-[(2R)-2,3-二羥基丙氧基]-3,4-二氟-2-(2-氟-4-碘苯胺基)苯甲醯胺)、曲美替尼(Trametinib)(GSK1120212、N-[3-[3-環丙基-5-(2-氟-4-碘苯胺基)-6,8-二甲基-2,4,7-三氧代吡啶并[4,3-d]嘧啶-1-基]苯基]乙醯胺)、U0126(1,4-二胺基-2,3-二氰基-1,4-雙(2-胺基苯硫基)丁二烯)、PD184352(CI-1040、2-(2-氯-4-碘苯胺基)-N-(環丙基甲氧基)-3,4-二氟苯甲醯胺)、PD98059(2-(2-胺基-3-甲氧基苯基)𠳭烯-4-酮)、BIX 02189(3-[N-[3-[(二甲基胺基)甲基]苯基]-C-苯基伸亞胺醯基]-2-羥基-N,N-二甲基-1H-吲哚-6-羧醯胺)、匹馬司替(Pimasertib)(AS-703026,N-[(2S)-2,3-二羥基丙基]-3-(2-氟-4-碘苯胺基)吡啶-4-羧醯胺)、培利替尼(Pelitinib)(EKB-569、(E)-N-[4-(3-氯-4-氟苯胺基)-3-氰基-7-乙氧基喹啉-6-基]-4-(二甲基胺基)丁-2-烯醯胺)、BIX 02188(3-[N-[3-[(二甲基胺基)甲基]苯基]-C-苯基伸亞胺醯基]-2-羥基-1H-吲哚-6-羧醯胺)、TAK-733(3-[(2R)-2,3-二羥基丙基]-6-氟-5-(2-氟-4-碘苯胺基)-8-甲基吡啶并[2,3-d]嘧啶-4,7-二酮)、AZD8330(2-(2-氟-4-碘苯胺基)-N-(2-羥基乙氧基)-1,5-二甲基-6-氧代吡啶-3-羧醯胺)、比美替尼(Binimetinib)(MEK162、6-(4-溴-2-氟苯胺基)-7-氟-N-(2-羥基乙氧基)-3-甲基苯并咪唑-5-羧醯胺)、SL-327((Z)-3-胺基-3-(4-胺基苯基)硫基-2-[2-(三氟甲基)苯基]-2-丙烯腈)、瑞法替尼(Refametinib)(RDEA119、N-[3,4-二氟-2-(2-氟-4-碘苯胺基)-6-甲氧基苯基]-1-[(2S)-2,3-二羥基丙基]環丙烷-1-磺醯胺)、GDC-0623(5-(2-氟-4-碘苯胺基)-N-(2-羥基乙氧基)咪唑并[1,5-a]吡啶-6-羧醯胺)、BI-847325(3-[3-[N-[4-[(二甲基胺基)甲基]苯基]-C-苯基伸亞胺醯基]-2-羥基-1H-吲哚-6-基]-N-乙基-2-丙炔醯胺)、RO5126766(CH5126766、3-[[3-氟-2-(甲基胺磺醯基胺基)吡啶-4-基]甲基]-4-甲基-7-嘧啶-2-基氧基𠳭烯-2-酮)、考比替尼(Cobimetinib)(GDC-0973、[3,4-二氟-2-(2-氟-4-碘苯胺基)苯基]-[3-羥基-3-[(2S)-哌啶-2-基]氮雜環丁烷-1-基]甲酮)以及該等之衍生物等。
作為p38抑制劑，例如可例舉：SB203580(4-[4-(4-氟苯基)-2-(4-甲基亞磺醯基苯基)-1H-咪唑-5-基]吡啶)、達馬莫德(Doramapimod)(BIRB 796、1-[5-第三丁基-2-(4-甲基苯基)吡唑-3-基]-3-[4-(2-嗎啉-4-基乙氧基)萘-1-基]脲)、SB202190(FHPI、4-[4-(4-氟苯基)-5-吡啶-4-基-1H-咪唑-2-基]苯酚)、雷洛替尼二甲磺酸鹽(5-[2-第三丁基-4-(4-氟苯基)-1H-咪唑-5-基]-3-(2,2-二甲基丙基)咪唑并[4,5-b]吡啶-2-胺甲磺酸鹽)、VX-702(6-(N-胺甲醯基-2,6-二氟苯胺基)-2-(2,4-二氟苯基)吡啶-3-羧醯胺)、PH-797804(3-[3-溴-4-[(2,4-二氟苯基)甲氧基]-6-甲基-2-氧代吡啶-1-基]-N,4-二甲基苯甲醯胺)、奈夫拉莫德(Neflamapimod)(VX-745、5-(2,6-二氯苯基)-2-(2,4-二氟苯基)硫基嘧啶并[1,6-b]嗒𠯤-6-酮)、TAK-715(N-[4-[2-乙基-4-(3-甲基苯基)-1,3-噻唑-5-基]吡啶-2-基]苯甲醯胺)、PD 169316(4-[4-(4-氟苯基)-2-(4-硝基苯基)-1H-咪唑-5-基]吡啶)、TA-02(4-[2-(2-氟苯基)-4-(4-氟苯基)-1H-咪唑-5-基]吡啶)、SD 0006(1-[4-[3-(4-氯苯基)-4-嘧啶-4-基-1H-吡唑-5-基]哌啶-1-基]-2-羥基乙酮)、帕吡莫德(Pamapimod)(6-(2,4-二氟苯氧基)-2-(1,5-二羥基戊烷-3-基胺基)-8-甲基吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-酮)、BMS-582949(4-[5-(環丙基胺甲醯基)-2-甲基苯胺基]-5-甲基-N-丙基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三𠯤-6-羧醯胺)、SB239063(4-[4-(4-氟苯基)-5-(2-甲氧基嘧啶-4-基)咪唑-1-基]環己烷-1-醇)、Skepinone-L(13-(2,4-二氟苯胺基)-5-[(2R)-2,3-二羥基丙氧基]三環[9.4.0.03,8]十五碳-1(11),3(8),4,6,12,14-六烯-2-酮)、DBM 1285(N-環丙基-4-[4-(4-氟苯基)-2-哌啶-4-基-1,3-噻唑-5-基]嘧啶-2-胺二鹽酸鹽)、SB 706504(1-氰基-2-[2-[[8-(2,6-二氟苯基)-4-(4-氟-2-甲基苯基)-7-氧代吡啶并[2,3-d]嘧啶-2-基]胺基]乙基]胍)、SCIO 469(2-[6-氯-5-[(2R,5S)-4-[(4-氟苯基)甲基]-2,5-二甲基哌𠯤-1-羰基]-1-甲基吲哚-3-基]-N,N-二甲基-2-氧代乙醯胺)、派美替尼(Pexmetinib)(1-[5-第三丁基-2-(4-甲基苯基)吡唑-3-基]-3-[[5-氟-2-[1-(2-羥基乙基)吲唑-5-基]氧基苯基]甲基]脲)、UM-164(2-[[6-[4-(2-羥基乙基)哌𠯤-1-基]-2-甲基嘧啶-4-基]胺基]-N-[2-甲基-5-[[3-(三氟甲基)苯甲醯基]胺基]苯基]-1,3-噻唑-5-羧醯胺)、p38 MAPK抑制劑(4-(2,4-二氟苯基)-8-(2-甲基苯基)-7-氧離子基-1,7-7-㖠啶鎓)、p38 MAP激酶抑制劑III(4-[5-(4-氟苯基)-2-甲基硫基-1H-咪唑-4-基]-N-(1-苯基乙基)吡啶-2-胺)、p38 MAP激酶抑制劑IV(3,4,6-三氯-2-(2,3,5-三氯-6-羥基苯基)磺醯基苯酚)、CAY105571(4-[5-(4-氟苯基)-2-[4-(甲基磺醯基)苯基]-1H-咪唑-4-基]-吡啶)以及該等之衍生物等。
作為JNK抑制劑，可例舉例如與第一步驟中記載之物質相同者。本發明中使用之抑制響應壓力之胞內訊號傳遞機制之物質較佳為選自由MEK抑制劑、p38抑制劑、JNK抑制劑所組成之群中之一種以上。於使用SB203580作為p38抑制劑之情形時，通常可以約1 nM～約1 mM、較佳為約10 nM～約100 μM、更佳為約100 nM～約10 μM、進而較佳為約500 nM～約5 μM之濃度添加至培養基中。於使用PD0325901作為MEK抑制劑之情形時，通常可以約1 nM～約1 mM、較佳為約10 nM～約100 μM、更佳為約100 nM～約10 μM、進而較佳為約500 nM～約5 μM之濃度添加至培養基中。於使用JNK-IN-8作為JNK抑制劑之情形時，可以與第一步驟中記載之濃度相同之濃度添加至培養基中。於使用其他之MEK抑制劑、p38抑制劑、JNK抑制劑之情形時，較佳為以具有與上述抑制劑之添加濃度同等之抑制活性的濃度添加。
步驟(A)中，於能夠被分化誘導為包含下丘腦細胞、腦下垂體前體細胞及腦下垂體激素產生細胞之細胞凝集體之條件下培養之多能幹細胞亦可為多能幹細胞之凝集體。於存在分化誘導劑之條件下培養多能幹細胞之凝集體之情形時，例如可依據國際公開第2016/013669號公報記載之方法進行培養。
步驟(A)之培養期係獲得如下細胞凝集體之期間，即，使步驟(A)中獲得之包含下丘腦細胞、腦下垂體前體細胞及腦下垂體激素產生細胞之細胞凝集體含有分泌ACTH之腦下垂體激素產生細胞、且不含有分泌GH或TSH之腦下垂體激素產生細胞。步驟(A)中獲得之包含下丘腦細胞、腦下垂體前體細胞及腦下垂體激素產生細胞之細胞凝集體只要含有分泌ACTH之腦下垂體激素產生細胞、且不含有分泌GH或TSH之腦下垂體激素產生細胞，亦可進而含有其他之腦下垂體激素產生細胞，並無特別限制，例如可含有選自由分泌PRL之腦下垂體激素產生細胞、分泌LH之腦下垂體激素產生細胞及分泌FSH之腦下垂體激素產生細胞所組成之群中之至少一種腦下垂體激素產生細胞。作為此種細胞凝集體，例如可例舉：(i)含有分泌ACTH之腦下垂體激素產生細胞及分泌PRL之腦下垂體激素產生細胞、且不含有分泌GH或TSH之腦下垂體激素產生細胞的細胞凝集體；(ii)含有分泌ACTH之腦下垂體激素產生細胞、分泌PRL之腦下垂體激素產生細胞及分泌LH之腦下垂體激素產生細胞、且不含有分泌GH或TSH之腦下垂體激素產生細胞的細胞凝集體；(iii)含有分泌ACTH之腦下垂體激素產生細胞、分泌PRL之腦下垂體激素產生細胞及分泌FSH之腦下垂體激素產生細胞、且不含有分泌GH或TSH之腦下垂體激素產生細胞的細胞凝集體；或(iv)含有分泌ACTH之腦下垂體激素產生細胞、分泌PRL之腦下垂體激素產生細胞、分泌LH之腦下垂體激素產生細胞及分泌FSH之腦下垂體激素產生細胞、且不含有分泌GH或TSH之腦下垂體激素產生細胞的細胞凝集體等。因此，步驟(A)之培養期可為獲得上述(i)～(iv)之細胞凝集體之期間。
步驟(A)中獲得之包含下丘腦細胞、腦下垂體前體細胞及腦下垂體激素產生細胞之細胞凝集體是否包含腦下垂體激素產生細胞可藉由公知方法確認，例如可藉由使用GH產生細胞標記物(抗Pit1抗體、抗GH抗體等)、PRL產生細胞標記物(抗Pit1抗體、抗PRL抗體等)、ACTH產生細胞標記物(抗T-Pit抗體、抗NeuroD1抗體、抗ACTH抗體等)、TSH產生細胞標記物(抗GATA2抗體、抗TSH抗體等)、FSH產生細胞及LH產生細胞標記物(抗GATA2抗體、抗SF1抗體、抗FSH抗體、抗LH抗體等)之免疫組織化學及針對所分泌之激素之ELISA等方法檢測。
又，將多能幹細胞或其細胞凝集體於能夠被分化誘導為包含下丘腦細胞、腦下垂體前體細胞及腦下垂體激素產生細胞之細胞凝集體之條件下培養之情形時，於開始分化誘導約第30天開始出現分泌ACTH之腦下垂體激素產生細胞。又，於開始分化誘導約第100天開始出現分泌GH或TSH之腦下垂體激素產生細胞。因此，作為步驟(A)之培養期，可為約30天以上且約100天以下，就促進向分泌ACTH之腦下垂體激素產生細胞之分化之方面而言，較佳為例舉約60天以上且約100天以下。於步驟(A)之培養期約為60天以上且約100天以下之情形時，必定存在包含分泌ACTH之腦下垂體激素產生細胞之細胞凝集體，ACTH分泌能力為0.5 pg/mL以上(前期腦下垂體組織：0.5 pg/mL以上、中期：2 pg/mL以上)，因此較佳。
如上所述，步驟(A)中獲得之包含下丘腦細胞、腦下垂體前體細胞及腦下垂體激素產生細胞之細胞凝集體於步驟(B)中被分散成細胞集群(有時將本步驟統稱為「中間純化」)。
於步驟(B)中，首先，可利用ROCK抑制劑對所獲得之細胞凝集體進行預處理。為了抑制因其後細胞凝集體之分散導致之細胞死亡，該預處理較佳為於該預處理開始之前添加ROCK抑制劑。ROCK抑制劑例如於該處理開始之至少24小時前、至少12小時前、至少6小時前、至少3小時前、至少2小時前、至少1小時前添加。作為ROCK抑制劑，可例舉Y-27632((+)-(R)-反式-4-(1-胺基乙基)-N-(4-吡啶基)環己烷羧醯胺二鹽酸鹽)等。該處理時使用之ROCK抑制劑之濃度為能夠抑制因其後細胞凝集體之分散導致之細胞死亡之濃度。例如關於Y-27632，此種濃度通常為約0.1～200 μM、較佳為約2～50 μM。ROCK抑制劑之濃度於其添加期間內可變動，例如可於後半期間將濃度減半。 用於進行該預處理之培養基可使用步驟(A)之培養步驟中使用之培養基。再者，於上述培養基中已經添加有所需濃度之ROCK抑制劑之情形時，無需進行該預處理步驟。
其次，藉由酶處理使經過上述預處理之細胞凝集體分散。具體而言，首先，將經過上述預處理之細胞凝集體轉移至包含PBS之培養容器內，利用同一培養基洗淨。作為用於分散之酶，只要能夠使細胞分散，則無特別限定，例如可例舉：木瓜酶、EDTA、胰蛋白酶、膠原酶(膠原酶I～VII型)、金屬蛋白酶、玻尿酸酶、彈性蛋白酶、分散酶(Dispase)、去氧核糖核酸酶等酶或者該等之混合物。作為較佳之酶，可例舉木瓜酶。酶處理之條件(溫度、時間等)可根據所使用之酶等適當設定。又，為了促進該酶處理，於該處理前可進行如下步驟：物理性地(例如使用手術刀、剪刀等)將細胞凝集體切碎、或物理性地(例如使用手術刀、剪刀等)於細胞凝集體切開切口。
上述酶處理後，回收懸浮細胞，亦可再次進行上述酶處理。可反覆進行複數次。該酶處理亦可利用上述酶等進行，作為較佳之酶，可例舉：EDTA、胰蛋白酶、膠原酶(膠原酶I～VII型)、金屬蛋白酶、玻尿酸酶、彈性蛋白酶、分散酶(Dispase)、去氧核糖核酸酶等酶或者該等之混合物。作為較佳之酶，可例舉膠原酶，更佳為膠原酶I型。酶處理之條件(溫度、時間等)可根據所使用之酶等適當設定。
上述酶處理後，回收懸浮細胞，再次進行上述酶處理。該酶處理亦可利用上述酶等進行，作為較佳之酶，可例舉：EDTA、胰蛋白酶，更佳為EDTA、胰蛋白酶與去氧核糖核酸酶。又，亦可使用TrypLE(Invitrogen)等市售品代替EDTA、胰蛋白酶。酶處理之條件(溫度、時間等)可根據所使用之酶等適當設定。藉由上述一系列酶處理，可製備單細胞懸浮液。又，製備單細胞懸浮液時，可藉由本身公知之方法去除死細胞。
於本發明之步驟(1)中，自如上所述獲得之源於多能幹細胞之包含下丘腦細胞、腦下垂體前體細胞及腦下垂體激素產生細胞的經分散之細胞集群，分離表現EpCAM之細胞，該EpCAM係對於腦下垂體前體細胞及腦下垂體激素產生細胞特異之細胞表面標記物。作為自經分散之細胞集群分離表現EpCAM之所需細胞之方法，可例舉：採用流式細胞分析或質譜流式細胞技術(Mass Cytometry)之方法、磁性細胞分離法等，該等方法可採用本身公知之方法進行。例如，表現EpCAM之細胞可藉由包括如下步驟之方法分離：使該細胞與特異性地結合於EpCAM分子之物質(例如抗體等)接觸。上述物質包括其本身帶有能夠被檢測出之標記(例如GFP、PE)者、及其本身不帶有標記者。於上述物質為其本身不帶有標記者之情形時，藉由進而使用帶有直接或間接識別該物質之能夠被檢測出之標記的物質，可進行上述分離。例如於上述物質為抗體之情形時，使該抗體直接或間接地載持螢光色素、金屬同位素或珠粒(例如磁珠)，藉此能夠對細胞表面之標記物進行標記，基於該標記而能夠分離細胞。此時使用之抗體可僅為1種，或為2種以上之抗體。
本發明之方法包括將經分離之EpCAM表現細胞(有時將該細胞統稱為「中間純化體」)於能夠使腦下垂體前體細胞成熟為腦下垂體激素產生細胞之條件下懸浮培養14天以上之步驟(本發明之步驟(2))。所謂能夠使腦下垂體前體細胞成熟為腦下垂體激素產生細胞之條件，意指使腦下垂體前體細胞分化為腦下垂體激素產生細胞，並維持或提昇所分化出之腦下垂體激素產生細胞之激素產生能力之培養條件。作為能夠使腦下垂體前體細胞成熟為腦下垂體激素產生細胞之條件之一實施方式，可例舉在能夠用於培養腦下垂體激素產生細胞之培養基(約0.18～約20 mL)，較佳為包含KSR之無血清培養基(例如IMDM、DMEM、EMEM、αMEM、GMEM、F-12培養基、DMEM/F12、IMDM/F12、上皮細胞用培養基(例如CnT-Prime上皮細胞培養基)、或該等之混合培養基等)中進行培養。培養可為附著培養或懸浮培養，較佳為懸浮培養。 於能夠使腦下垂體前體細胞成熟為腦下垂體激素產生細胞之條件下懸浮培養之期間通常為14天以上，較佳為例舉30天以上。
於本發明之方法之一實施方式中，可例舉以下之製造方法。 一種包含腦下垂體激素產生細胞之細胞凝集體之製造方法，其包括以下之步驟： 步驟(1)，其係自源於多能幹細胞之包含1種以上4種以下之腦下垂體激素產生細胞的經分散之細胞集群(例如包含分泌ACTH之腦下垂體激素產生細胞、且不包含分泌GH或TSH之腦下垂體激素產生細胞的細胞集群)分離表現EpCAM之細胞；及 步驟(2)，其係將經分離之EpCAM表現細胞於能夠使腦下垂體前體細胞成熟為腦下垂體激素產生細胞之條件下懸浮培養14天以上。
於本發明之方法之另一實施方式中，可例舉以下之製造方法。 一種包含腦下垂體激素產生細胞之細胞凝集體之製造方法，其包括以下之步驟： 步驟(1)，其係自將源於多能幹細胞之包含腦下垂體前期組織或腦下垂體中期組織之細胞凝集體進行分散而獲得之細胞集群，分離表現EpCAM之細胞；及 步驟(2)，其係將經分離之EpCAM表現細胞於能夠使腦下垂體前體細胞成熟為腦下垂體激素產生細胞之條件下懸浮培養14天以上。
於本發明之方法之又一實施方式中，可例舉以下之製造方法。 一種包含腦下垂體激素產生細胞之細胞凝集體之製造方法，其包括以下之步驟： 步驟(1)，其係自將源於多能幹細胞之包含1種以上4種以下之腦下垂體激素產生細胞之細胞凝集體進行分散而獲得之細胞集群，分離表現EpCAM之細胞；及 步驟(2)，其係將經分離之EpCAM表現細胞於能夠使腦下垂體前體細胞成熟為腦下垂體激素產生細胞之條件下懸浮培養14天以上。
於本發明之方法之進而另一實施方式中，可例舉以下之製造方法。 一種包含腦下垂體激素產生細胞之細胞凝集體之製造方法，其包括以下之步驟： 步驟(1)，其係自將源於多能幹細胞之包含1種以上4種以下之腦下垂體激素產生細胞、且下丘腦組織中包含Nkx2.1表現細胞之細胞凝集體進行分散而獲得之細胞集群，分離表現EpCAM之細胞；及 步驟(2)，其係將經分離之EpCAM表現細胞於能夠使腦下垂體前體細胞成熟為腦下垂體激素產生細胞之條件下懸浮培養14天以上。
[包含腦下垂體激素產生細胞之細胞凝集體] 藉由本發明之方法獲得之包含腦下垂體激素產生細胞之細胞凝集體(本發明之細胞凝集體)包括以下之特徵。 (1)該細胞凝集體中之EpCAM陽性細胞及E-鈣黏附蛋白之至少一者呈陽性之細胞之存在比率為80%以上； (2)該細胞凝集體中之神經細胞之存在比率為20%以下； (3)該細胞凝集體中之ACTH陽性細胞之存在比率為5%以上； (4)該細胞凝集體之細胞密度為3,000～20,000 cells/mm 2； (5)該細胞凝集體之長徑為200～3,000 μm； (6)於該細胞凝集體之表面，EpCAM陽性細胞及E-鈣黏附蛋白之至少一者呈陽性之細胞相互面附著而形成上皮結構；且 (7)該細胞凝集體形成海綿狀結構。
藉由本發明之方法獲得之細胞凝集體經過分離表現EpCAM之細胞之步驟，因此，EpCAM陽性細胞於該細胞凝集體中占多數，又，藉由本發明之方法獲得之細胞凝集體亦包含E-鈣黏附蛋白陽性細胞。EpCAM陽性細胞之一部分或全部可為EpCAM陽性且E-鈣黏附蛋白陽性細胞。該細胞凝集體中存在之EpCAM及E-鈣黏附蛋白之至少一者呈陽性之細胞數相對於總細胞數之比率取決於分離表現EpCAM之細胞之步驟之分離效率，例如可為80%以上，較佳為85%以上、90%以上、95%以上。
構成下丘腦之神經細胞(例如神經元、神經膠細胞等、作為該等之前體細胞的下丘腦前體細胞；有時亦將該等稱為「下丘腦細胞」)中不表現EpCAM及E-鈣黏附蛋白。因此，該等細胞藉由分離表現EpCAM之細胞之步驟而被去除。即，該細胞凝集體中存在之神經細胞(下丘腦細胞)數相對於總細胞數之比率(神經細胞之存在比率)取決於分離表現EpCAM之細胞之步驟之分離效率，例如可為20%以下，較佳為15%以下、10%以下、5%以下。再者，作為構成下丘腦之神經細胞上表現之標記物，可例舉：Rx、NKx2.1、巢蛋白(Nestin)及Pax6。換言之，該細胞凝集體中存在之表現Rx、NKx2.1、巢蛋白(Nestin)及/或Pax6之細胞數相對於總細胞數之比率例如可為20%以下，較佳為15%以下、10%以下、5%以下。
該細胞凝集體包含腦下垂體激素產生細胞。該細胞凝集體中存在之ACTH陽性(產生)細胞數相對於總細胞數之比率(ACTH陽性細胞數之存在比率)可為5%以上，較佳為10%以上。ACTH陽性細胞同時表現NeuroD1及Tbx19。因此，該細胞凝集體中存在之NeuroD1陽性及/或Tbx19陽性細胞數相對於總細胞數之比率亦可為與ACTH陽性細胞數之存在比率同等之比率。
該細胞凝集體之ACTH分泌能力可為200～1,000,000 pg/mL，作為一實施方式，可為1,000～500,000 pg/mL、5,000～300,000 pg/mL、10,000～100,000 pg/mL。
ACTH分泌能力受到ACTH細胞數及培養條件等之影響。本案說明書中之ACTH分泌能力係以特定培養條件下自1個細胞凝集體分泌至培養基中之ACTH之濃度表示。此處，所謂特定培養條件，意指如下條件：(1)使用上述能夠用於培養腦下垂體激素產生細胞之培養基，較佳為包含KSR之無血清培養基(例如IMDM、DMEM、EMEM、αMEM、GMEM、F-12培養基、DMEM/F12、IMDM/F12、上皮細胞用培養基(例如CnT-Prime上皮細胞培養基)、或該等之混合培養基等)；(2)不自外部添加影響ACTH產量之物質(例如提昇ACTH產量之Notch訊號抑制劑)；(3)將培養基量設定為0.18～20 mL；(4)培養3～4天。回收經過該條件下培養後之培養基，測定該培養基中之ACTH之濃度即可。若為業者，可採用ELISA之類的公知方法測定ACTH之濃度。
該細胞凝集體亦可包含ACTH產生細胞以外之腦下垂體激素產生細胞。具體而言，可例舉：PRL產生細胞、FSH產生細胞、LH產生細胞、GH產生細胞、TSH產生細胞等。於一實施方式中，包含ACTH產生細胞及PRL產生細胞該兩種；於另一實施方式中，可包含ACTH產生細胞及PRL產生細胞、以及選自由FSH產生細胞及LH產生細胞所組成之群中之一種或兩種細胞(即，包含三種或四種腦下垂體激素產生細胞)。於又一實施方式中，可包含ACTH產生細胞、PRL產生細胞、FSH產生細胞及LH產生細胞、以及選自由GH產生細胞及TSH產生細胞所組成之群中之一種或兩種細胞(即，包含五種或六種腦下垂體激素產生細胞)。
細胞凝集體所含之腦下垂體激素產生細胞取決於上述分化階段，即，分離表現EpCAM之細胞之時機及其後之培養期。藉由採用ELISA或免疫染色等確認上述激素之產生狀態，可確認各種腦下垂體激素產生細胞之存在。因此，若無業者，可調整分離時機或培養期以獲得包含所需之腦下垂體激素產生細胞之細胞凝集體。
該細胞凝集體可進而包含腦下垂體幹細胞。於本發明中，所謂「腦下垂體幹細胞」係指存在於腦下垂體中之有助於腦下垂體組織再生或腦下垂體激素產生細胞供給之未分化之多潛能幹細胞、前體細胞。
該細胞凝集體中存在之腦下垂體幹細胞數相對於總細胞數之比率(腦下垂體幹細胞數之存在比率)可為1%以上，較佳為3%以上或5%以上。腦下垂體幹細胞同時表現例如Sox2、Sox9、E-鈣黏附蛋白、巢蛋白(Nestin)、S100β、GFRα2、Prop1、CD133、β-連環蛋白、Klf4、Oct4、Pax6、柯薩奇病毒-腺病毒共同受體(CXADR)、PRRX1/2、Ephrin-B2、ACE等腦下垂體幹細胞標記物。因此，腦下垂體幹細胞數之存在比率可藉由測定該細胞凝集體中存在之上述腦下垂體幹細胞標記物(例如CXADR)陽性細胞數相對於總細胞數之比率來確定。
該細胞凝集體之細胞密度可為3,000～20,000 cells/mm 2，較佳為5,000～10,000 cells/mm 2，更佳為6,000～9,000 cells/mm 2。
本案說明書中之該細胞凝集體之細胞密度係以細胞凝集體之切割面例如距中心200 μm以內之位置範圍內之單位面積之細胞數表示。若為業者，可採用公知方法測定細胞凝集體之細胞密度。具體而言，切割細胞凝集體準備切片，藉由使用DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole，4',6-二脒基-2-苯基吲哚)、抗E-鈣黏附蛋白抗體等之免疫染色等方法測定細胞數，除以該切片之面積即可。
於一實施方式中，該細胞凝集體之長徑(或圓相當徑)例如可為200～3,000 μm，較佳為300～2,000 μm，更佳為400～1,500 μm。
測定該細胞凝集體之長徑、短徑及高度之方法並無特別限定，例如根據顯微鏡下拍攝之圖像測定即可。例如可將於96孔板中培養時之細胞凝集體置於KEYENCE倒置顯微鏡10倍透鏡下拍攝，根據拍攝之圖像進行測定。此處，所謂長徑，意指所拍攝圖像中連結該細胞凝集體之2個端點之線段中之最長線段及其長度。所謂圓相當徑，意指與投影至二維面上時獲得之圖形(圓形或楕圓形)面積相等之正圓之直徑。如後所述，該凝集體為球體狀之凝集體，長徑與圓相當徑近似，越近似於真球之球體狀凝集體，長徑與圓相當徑之差越小。
該凝集體為球體狀之凝集體。本說明書中之「球體(sphere)狀細胞凝集體」意指具有近似於球狀之立體形狀之細胞凝集體。所謂近似於球狀之立體形狀，可例舉如下之球狀：具有三維結構之形狀，且於投影至二維面上時呈現例如圓形或楕圓形。
該凝集體較佳為近似於真球之球體狀凝集體。所謂近似於真球之球體狀凝集體，意指具有近似於真球之立體形狀之細胞凝集體。所謂近似於真球之立體形狀，意指如下之球狀：自複數個方向投影至二維面上時獲得之複數個圓形中之自該圓形之中心至外周之長度全部相等，或者最長線段與最短線段之差為10%以下、5%以下、3%以下、2%以下或1%以下。
於該細胞凝集體之表面，EpCAM陽性細胞及E-鈣黏附蛋白之至少一者呈陽性之細胞可相互面附著而形成上皮結構。
所謂「面附著」，意指相鄰之細胞彼此以面發生結合。更詳細而言，所謂面附著，意指某細胞之表面積中，與其他細胞之表面發生結合之比率例如為1%以上、較佳為3%以上、更佳為5%以上、進而較佳為10%以上。於一實施方式中，所謂細胞之表面，意指細胞膜表面。細胞之表面可藉由細胞黏附因子(例如E-鈣黏附蛋白或EpCAM)之免疫染色來觀察。作為並非面附著之狀態，可例舉點結合。所謂點結合，意指細胞與細胞以點發生結合。
所謂「上皮結構」，意指頂端面或基底膜等上皮組織所具有之特徵性結構。可使用後述頂端面及基底膜之標記物，藉由免疫染色進行確認。
上皮組織發生極化而出現「頂端面(apical surface)」與「基底膜」。所謂「基底膜」，意指存在基底(basal)側之層(基底膜)之基底膜，該層中產生有包含大量作為基底膜標記物之層黏連蛋白及IV型膠原蛋白之50～100 nm之上皮細胞。所謂「頂端面」，意指於「基底膜」之相反側形成之表面(表層面)。又，此種頂端面可使用針對頂端面標記物(例如非典型-PKC(以下簡記為「aPKC」)、E-鈣黏附蛋白、N-鈣黏附蛋白)之抗體，藉由業者周知之免疫染色法等鑑定。
所謂「上皮組織」，意指細胞藉由無間隙地覆蓋於體表、內腔(消化道等)、體腔(心包腔等)等之表面而形成之組織。形成上皮組織之細胞稱為上皮細胞。上皮細胞沿細胞頂端(apical)-基底(basal)方向具有極性。上皮細胞藉由黏著連接(adherence junction)及/或緊密連接(tight junction)使上皮細胞彼此間牢固連接而可形成細胞層。由該細胞層一層至十數層重疊形成之組織為上皮組織。
該細胞凝集體具有複數個藉由EpCAM陽性細胞及/或E-鈣黏附蛋白陽性細胞相互面附著而形成之島狀結構。並且，於該細胞凝集體中形成由複數個島狀結構集合而成之海綿狀結構。
所謂「島狀結構(islet-like strucure)」，意指藉由2個～20個左右(例如3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、15個、20個)之EpCAM陽性細胞及/或E-鈣黏附蛋白陽性細胞相互面附著而形成之結構。各島狀結構中包含之該細胞之個數根據各自之島狀結構而可不同。所謂面附著，意指相鄰之細胞彼此以面發生結合。更詳細而言，所謂面附著，意指細胞彼此以面發生結合之比率例如為1%以上、較佳為3%以上、更佳為5%以上、進而較佳為10%以上。島狀結構中存在之細胞之長徑例如可為2～50 μm、較佳為4～30 μm，短徑例如可為0.5～20 μm、較佳為1～10 μm。
該島狀結構中可包含腦下垂體激素產生細胞。具體而言，可例舉：ACTH陽性細胞、PRL陽性細胞、FSH陽性細胞、LH陽性細胞、GH陽性細胞、TSH陽性細胞等。
所謂「海綿狀結構」，意指由複數個島狀結構集合形成、且島狀結構之間存在空隙(voids)之結構。可以並非所有之島狀結構之間均存在空隙。藉由存在空隙，培養液之營養或氧氣能夠到達該細胞凝集體之內部，因此，即便於該細胞凝集體之中心部，壞死(necroptosis)細胞之比率亦較小。
基於EpCAM之分選前，即，於藉由懸浮培養多能幹細胞獲得之細胞凝集體中觀察不到「島狀結構」及「海綿狀結構」。「島狀結構」及「海綿狀結構」係藉由基於EpCAM之分選後之再凝集而開始確認到之結構。
於一實施方式中，該細胞凝集體之GH分泌能力可為0.05～100 ng/mL，作為一實施方式，可為0.1～50 ng/mL、0.3～30 ng/mL、0.5～10 ng/mL。
GH分泌能力受到GH細胞數及培養條件等之影響。本案說明書中之GH分泌能力係以特定培養條件下自1個細胞凝集體分泌至培養基中之GH之濃度表示。此處，所謂特定培養條件，意指如下條件：(1)使用上述能夠用於培養腦下垂體激素產生細胞之培養基，較佳為包含KSR之無血清培養基(例如DMEM、MEM、GMEM、上皮細胞用培養基(例如CnT-Prime上皮細胞培養基)；(2)不自外部添加影響GH產量之物質(例如提昇GH產量之腎上腺皮質激素類(例如地塞米松))；(3)將培養基量設定為0.18～20 mL；(4)培養3～4天。回收經過該條件下培養後之培養基，測定該培養基中之GH之濃度即可。若為業者，可採用ELISA之類的公知方法測定GH之濃度。
根據該細胞凝集體之使用目的，於存在特定物質之條件下培養，藉此能夠增加特定之腦下垂體激素之分泌量。
例如於上述方法中，藉由將條件(2)變更為於包含腎上腺皮質激素類之培養基中進行培養之條件，GH分泌能力提高。作為腎上腺皮質激素類，可例舉：地塞米松、倍他米松、潑尼松龍、甲基潑尼松龍、去炎松等人工合成之糖皮質激素；氫化可體松、乙酸可體松、乙酸氟氫可體松等天然之糖皮質激素等。若為業者，可適當設定腎上腺皮質激素類之濃度，作為一實施方式，地塞米松之濃度可為4 ng/mL～40 μg/mL，較佳為40 ng/mL～4 μg/mL。
作為於存在腎上腺皮質激素類之條件下培養後之包含腦下垂體激素產生細胞之細胞凝集體之GH分泌能力之一實施方式，可為0.1～10,000 ng/mL、0.5～5,000 ng/mL、5～1,000 ng/mL、20～500 ng/mL。於該情形時，ACTH分泌能力為10～500,000 pg/mL、較佳為100～100,000 pg/mL、更佳為500～30,000 pg/mL、進而較佳為1,000～10,000 pg/mL。
如此，於存在腎上腺皮質激素類之條件下培養後之包含腦下垂體激素產生細胞之細胞凝集體比開始分化誘導前包含更多之腦下垂體激素產生細胞。於一實施方式中，於存在腎上腺皮質激素類之條件下培養之情形時，該細胞凝集體中存在之ACTH陽性(產生)細胞數相對於總細胞數之比率(ACTH陽性細胞數之存在比率)可減小。該情形時之ACTH陽性細胞數之存在比率為2%以上，較佳為3%以上，更佳為5%以上。
又，本發明提供一種細胞集群(本發明之細胞集群)，其包含占細胞凝集體總數40%以上之本發明之細胞凝集體。本發明之細胞集群可包含通常占細胞凝集體總數40%以上、較佳為60%以上、更佳為80%以上之本發明之細胞凝集體。作為一實施方式，全部細胞凝集體中之本發明之細胞凝集體之比率可藉由細胞株、分化誘導法、成熟培養來進行一定程度之變動。
本發明之細胞集群可包括以下之特徵。 (1)EpCAM陽性細胞及E-鈣黏附蛋白陽性細胞之存在比率為80%以上； (2)神經細胞之存在比率為20%以下；且 (3)該細胞凝集體之ACTH分泌能力為200～1,000,000 pg/mL。
[醫藥組合物、治療方法及治療藥] 作為本發明之一實施方式，可例舉包含本發明之細胞凝集體或其一部分之醫藥組合物(移植用組合物、移植用組織或移植物(Transplant))。醫藥組合物較佳為除包含本發明之細胞凝集體或其一部分以外，進而包含容許用作醫藥之載體。所謂細胞凝集體之一部分係可用於醫藥組合物中之細胞凝集體之一部分，可藉由自細胞凝集體切出移植所需大小之腦下垂體組織而獲得。
作為容許用作醫藥之載體，可使用水性生理溶劑(生理鹽水、緩衝液、無血清培養基等)。視需要亦可於醫藥組合物中調配移植醫療領域於包含所要移植之組織或細胞之醫藥中通常使用之保存劑、穩定劑、還原劑、等張劑等。
又，本發明可提供一種由腦下垂體障礙引起之疾病之治療藥(本發明之治療藥)，其包含本發明之細胞凝集體或其一部分、或者本發明之細胞集群。 作為由腦下垂體障礙引起之疾病之治療藥，例如可例舉含有包含本發明之細胞集群之懸浮液的移植物。 作為懸浮液，例如可例舉使本發明之細胞集群懸浮於人工淚液或生理鹽水而成之液體。懸浮液可包含自本發明之細胞集群單離之腦下垂體激素產生細胞，亦可包含促進細胞黏著之因子，例如細胞外基質或玻尿酸等。
進而，可提供一種由腦下垂體障礙引起之疾病之治療方法，其包括如下步驟：自本發明之細胞凝集體或其一部分、或者細胞集群移植有效量之腦下垂體激素產生細胞至需要移植之對象。 上述由腦下垂體障礙引起之疾病可為由腦下垂體障礙引起之動物之疾病，亦可為由腦下垂體障礙引起之非人動物之疾病。作為由腦下垂體障礙引起之疾病，具體而言，可例舉：全垂體功能減退症、垂體性侏儒症、腎上腺皮質功能減退症、部分垂體功能減退症、單純垂體前葉激素缺乏症、腦下垂體腺瘤等之手術後之腦下垂體功能不全/激素分泌不足、顱咽管瘤等。
以下揭示實施例來更詳細地說明本發明，但該等並不限定本發明之範圍。又，所使用之試劑及材料只要無特別限定，則可購買獲得。 [實施例]
實施例 1 ：自人 ES 細胞形成包含下丘腦細胞、腦下垂體前體細胞及腦下垂體激素產生細胞之細胞凝集體之例圖1表示自人ES/iPS細胞至製成包含腦下垂體激素產生細胞之細胞凝集體所經過之全部步驟之圖(步驟1：分化、步驟2：中間純化、步驟3：成熟培養)。 以下，關於自人ES細胞分化誘導包含下丘腦細胞、腦下垂體前體細胞及腦下垂體激素產生細胞之細胞凝集體，分化誘導後之各天數時之細胞凝集體之組成及結構進行研究。 按照《科學報告》, 4, 3594 (2014)中記載之方法，將人ES細胞(KhES-1株，自京都大學獲取)於無餵養細胞條件下培養。作為無餵養細胞培養基，使用StemFit培養基(AK03，味之素公司製造)，無餵養細胞支架使用Laminin511-E8(Nippi公司製造)。 作為具體之維持培養操作，首先，將已成為次融合狀態之人ES細胞(KhES-1株)利用PBS洗淨後，使用TrypLE Select(Life Technologies公司製造)分散成單個細胞。其後，將上述分散成單個細胞之人ES細胞接種於經Laminin511-E8塗覆之塑膠培養皿中，於存在Y27632(ROCK抑制物質，10 μM)之條件下，於StemFit培養基中進行無餵養細胞培養。於使用6孔板(IWAKI公司製造，細胞培養用，培養面積9.4 cm 2)作為上述塑膠培養皿之情形時，上述分散成單個細胞之人ES細胞之接種細胞數為2.4×10 4。接種1天後，將培養基全量更換成不含Y27632之StemFit培養基。以後，每1天～2天將培養基全量更換為不含Y27632之StemFit培養基一次。其後，接種7天後，培養至成為次融合(培養面積之60%被細胞覆蓋之程度)。 將用以自人ES細胞分化誘導包含下丘腦細胞、腦下垂體前體細胞及腦下垂體激素產生細胞之細胞凝集體之試驗方案示於圖2。作為分化誘導操作，對於人ES細胞(KhES-1株)，使用StemFit培養基，接種6天後更換StemFit培養基，與此同時添加SB431542(5 μM)與SAG(300 nM)，培養24小時。使用TrypLE Select(Life Technologies公司製造)，對經過調整之次融合人ES細胞進行細胞分散液處理，進而藉由移液操作分散成單個細胞。其後，使上述分散成單個細胞之人ES細胞以細胞非黏附性96孔板(PrimeSurface 96V底板，MS-9096V，SUMITOMO BAKELITE公司製造)每孔1.0×10 4細胞之方式懸浮於100 μL無血清培養基中，於37℃、5%CO 2之條件下懸浮培養。此時之無血清培養基(gfCDM+KSR)使用於F-12培養基與IMDM培養基之1：1混合液中添加有5%KSR、450 μM 1-單硫代甘油、1×化學成分確定之脂質濃縮物之無血清培養基。懸浮培養開始時(開始分化誘導後第0天)，於上述無血清培養基中添加Y27632(最終濃度20 μM)、IWP-2(0.5 μM)、SB431542(1 μM)、SAG(100 nM)。 開始分化誘導後第2天，每孔添加100 μL包含IWP-2、SB431542、BMP4(0.5 nM)、SAG(700 nM)且不含Y27632之無血清培養基。其後，開始分化誘導後第6、9、12、15、19、22、26天，使用包含IWP-2、SB431542及SAG且不含Y27632與BMP4之無血清培養基進行半量培養基更換。第19天以後，將培養時之氧分壓設為40%。 開始分化誘導後第29天，將細胞凝集體以每皿60個細胞凝集體之方式移至10 cm懸浮培養用皿中，使用無血清培養基，於40%O 2、5%CO 2之條件下繼續懸浮培養。開始分化誘導後第29天至第50天使用添加有10%KSR之無血清培養基進行培養，開始分化誘導後第50天以後使用添加有20%KSR之無血清培養基進行培養。 將上述開始分化誘導後第29、61、103天之細胞凝集體分別利用4%多聚甲醛固定，製作冷凍切片。對於該等冷凍切片，使用作為腦下垂體前體標記物之Pitx1(抗Pitx1抗體，自製(非專利文獻1及2)，天竺鼠)及Lhx3(抗Lhx3抗體，自製(非專利文獻1及2)，兔)、作為上皮細胞標記物之E-鈣黏附蛋白(抗E-鈣黏附蛋白抗體，TAKARA公司製造，大鼠)及EpCAM(抗EpCAM抗體，R&D公司製造，山羊)、作為腹側下丘腦標記物之Nkx2.1(抗Nkx2.1抗體，progen公司製造，小鼠)、作為腦下垂體激素產生細胞標記物之促腎上腺皮質激素(ACTH)(抗ACTH抗體，Fitzgerald公司製造，小鼠)、作為神經系細胞標記物之巢蛋白(Nestin)(抗巢蛋白抗體，R&D公司製造，小鼠)，進行免疫染色。利用DAPI將細胞核染色。使用共聚焦雷射掃描顯微鏡(Olympus公司製造)觀察該等經染色之切片，取得免疫染色圖像。其結果，藉由上述分化誘導法誘導之開始分化誘導後第29天之細胞凝集體於內側存在Nkx2.1陽性之腹側下丘腦組織(圖3F)，於外側形成EpCAM、E-鈣黏附蛋白陽性之肥厚之上皮組織(圖3B、D)。進而，上皮組織之一部分呈Pitx1、Lhx3陽性，表明形成腦下垂體前體組織(圖3C、E)。 進而，於開始分化誘導後第61天、103天之細胞凝集體中，E-鈣黏附蛋白、EpCAM陽性之上皮組織(圖3J、K、P、Q)之一部分中存在ACTH陽性之腦下垂體激素產生細胞(圖3I、O)。又，可知於細胞凝集體之內側形成巢蛋白(Nestin)陽性之神經組織(圖3L)。
實施例 2 ：自包含下丘腦細胞、腦下垂體前體細胞及腦下垂體激素產生細胞之細胞凝集體純化 EpCAM 陽性細胞集群，純化後藉由長期培養製造包含腦下垂體激素產生細胞之細胞凝集體之例可知藉由實施例1之分化誘導法製作之細胞凝集體不僅包含腦下垂體前體組織及腦下垂體組織，且包含下丘腦組織及神經組織。為了自該細胞凝集體製作僅包含腦下垂體組織之高純度細胞凝集體，實施使用EpCAM之純化及長期培養，對純化後獲得之細胞凝集體之組成及結構進行研究。 對於藉由與實施例1相同之分化誘導法獲得之開始分化誘導後第62天、100天之細胞凝集體，實施使用抗EpCAM抗體之細胞分選。細胞分選分為三個步驟，即，(1)預處理、(2)細胞凝集體之分散、(3)EpCAM陽性細胞之分離來實施。 (1)利用Y27632之預處理 為了抑制因分散處理導致之細胞死亡，於操作日之前一天在培養基中添加Y27632(20 μM)，對細胞凝集體進行預處理。對後續操作中之所有之細胞暴露溶液添加20 μM Y27632直至細胞分選前。 (2)細胞凝集體之分散 為了促進利用酶處理之分散，使用手術刀將細胞凝集體切碎或於細胞凝集體上切開切口。其次，用PBS將細胞凝集體洗淨後，添加神經細胞分散套組之分散液(Wako公司製造)，於37℃下進行30分鐘之酶處理，進而藉由移液操作使細胞凝集體分解。反應結束後，用DMEM/F12(Wako公司製造)洗淨，添加膠原酶溶液，於37℃下進行30分鐘之回旋振盪(140～150 rpm)。膠原酶溶液之組成係於上述DMEM/F12中添加有0.2%膠原酶I型(Wako公司製造)及0.1%BSA(Themofisher公司製造)。膠原酶處理結束後，用PBS洗淨，添加10×TrypLE Select溶液(Themofisher公司製造)＋0.2 mg/mL DNaseI(Roche公司製造)，於37℃下進行10分鐘之酶處理後，進而藉由移液操作分散成單個細胞。使單個細胞懸浮於添加20%KSR之無血清培養基中，經過中和，進行離心後，再次懸浮於添加有10 μg/mL DnaseI、20%KSR之無血清培養基中，通過70 μm細胞過濾器而去除凝集團塊。 (3)藉由FACS之EpCAM陽性細胞之分離 上述獲得之單個細胞經過離心後，使其懸浮於添加有1 mM EDTA、1%FBS之DMEM/F-12溶液中。添加PE標記抗EpCAM抗體(Miltenyi公司製造)，於4℃下培養10分鐘，進行螢光活化細胞分選(FACS)，分離、回收EpCAM陽性細胞。作為用於進行FACS之細胞分選儀，使用BD公司之Stream-In-Air方式機型之FACS Aria Fusion。 使經純化之EpCAM陽性細胞以細胞非黏附性96孔板每孔10×10 4細胞之方式，於添加有20%KSR、20 μM Y27632之200 μL無血清培養基中再凝集，於37℃、40%O 2、5%CO 2之條件下懸浮培養。懸浮培養開始後第3天以後，使用添加20%KSR且不含Y27632之無血清培養基，每3天～4天半量更換一次，進行長期培養(圖4)。 對於使用開始分化誘導後第62天之細胞凝集體進行純化、再凝集後經過41天長期培養之細胞凝集體(day62 sort＋day41)、以及使用開始分化誘導後第100天之細胞凝集體進行純化、再凝集後經過31天長期培養之細胞凝集體(day100 sort＋day31)，分別利用4%多聚甲醛固定，製作冷凍切片。對於該等冷凍切片，使用作為腦下垂體前體標記物之Lhx3、作為上皮細胞標記物之EpCAM及E-鈣黏附蛋白、作為腦下垂體激素產生細胞標記物之促腎上腺皮質激素(ACTH)、泌乳素(PRL)(抗PRL抗體，Dako公司製造，兔)、卵泡刺激激素(FSH)(抗FSH抗體，Dako公司製造，小鼠)、促黃體激素(LH)(抗LH抗體，Dako公司製造，小鼠)及甲狀腺刺激激素(TSH)(抗TSH抗體，Dako公司製造，小鼠)，進行免疫染色。利用DAPI將細胞核染色。使用共聚焦雷射掃描顯微鏡(Olympus公司製造)觀察該等經染色之切片，取得免疫染色圖像。其結果可知，於day62 sort＋day41之細胞凝集體中，EpCAM陽性細胞、E-鈣黏附蛋白陽性細胞相互面附著，於凝集體整個表面形成上皮結構(圖5A、C、D、F、H、I)。進而，細胞凝集體內存在多個ACTH陽性及/或Lhx3陽性之腦下垂體激素產生細胞或腦下垂體前體細胞(圖5B、E、G、J)。另外，可知存在PRL、FSH陽性細胞(圖5L、N)。 又，可知於day100 sort＋day31之細胞凝集體中，亦與上述同樣地，EpCAM陽性細胞、E-鈣黏附蛋白陽性細胞相互面附著，於凝集體整個表面形成上皮結構(圖6A、C、D、E、G、H)。進而，細胞凝集體內存在多個ACTH陽性之腦下垂體激素產生細胞(圖6B、F)。另外，可知存在PRL、FSH、LH、TSH陽性細胞(圖6J、L、N、P)。即，可知EpCAM純化後藉由長期培養獲得之細胞凝集體為形成上皮結構、且包含至少1種以上之腦下垂體激素產生細胞之細胞凝集體。 進而，對day62 sort＋day41之細胞凝集體及day100 sort＋day31之細胞凝集體中之ACTH陽性細胞率、細胞密度及長徑進行定量。關於ACTH陽性細胞率之定量，根據各凝集體中觀察到ACTH陽性細胞之部位於共聚焦雷射掃描顯微鏡(Olympus公司製造)10倍透鏡下拍攝所得之圖像，解析每個凝集體中之ACTH陽性細胞數及DAPI陽性細胞數，算出比率。關於細胞密度之定量，使用上述拍攝所得之圖像，解析每個凝集體中之DAPI陽性細胞數及凝集體之表面積，算出密度。關於長徑之定量，使用倒置顯微鏡(Keyence公司製造)10倍透鏡下拍攝所得之圖像，進行計測(圖7C、D)。 其結果，於day62 sort＋day41之細胞凝集體及day100 sort＋day31之細胞凝集體中，ACTH陽性細胞率分別為11%、18%(圖7A)，密度分別為7880 cells/mm 2、7720 cells/mm 2(圖7B)，長徑分別為633 μm、639 μm(圖7E)。
實施例 3 ： EpCAM 純化後進行長期培養時藉由添加地塞米松而製造包含 ACTH 與 GH 之腦下垂體激素產生細胞之細胞凝集體之例根據實施例2之結果可知，純化後之細胞凝集體主要包含ACTH產生細胞。因此，於純化後之培養時，藉由使用作為類固醇之地塞米松能否使細胞凝集體中之GH產生細胞增加，對此展開研究。 使用於與實施例1相同之條件下獲得之開始分化誘導後第62天、100天之細胞凝集體，於與實施例2相同之條件下純化，將獲得之EpCAM陽性細胞以細胞非黏附性96孔板每孔10×10 4細胞之方式，於添加有20%KSR、20 μM Y27632之200 μL無血清培養基中再凝集，於37℃、40%O 2、5%CO 2之條件下懸浮培養。懸浮培養開始後第3天，使用添加有地塞米松(DX，ASPEN Japan公司製造，400 ng/mL)、20%KSR且不含Y27632之無血清培養基，進行半量培養基更換。懸浮培養開始後第3天至第24天使用添加有DX(400 ng/mL)、20%KSR之無血清培養基，懸浮培養開始後第24天以後使用添加20%KSR之無血清培養基，進行長期培養(圖8)。 對於使用開始分化誘導後第62天之細胞凝集體進行純化、再凝集後經過41天長期培養之細胞凝集體(day62 sort＋day41)、以及使用開始分化誘導後第100天之細胞凝集體進行純化、再凝集後經過31天長期培養之細胞凝集體(day100 sort＋day31)，分別利用4%多聚甲醛固定，製作冷凍切片。對於該等冷凍切片，使用作為上皮細胞標記物之EpCAM、作為腦下垂體激素產生細胞標記物之生長激素(GH)(抗GH抗體，Santacruz公司製造，小鼠)，進行免疫染色。利用DAPI將細胞核染色。使用共聚焦雷射掃描顯微鏡(Olympus公司製造)觀察該等經染色之切片，取得免疫染色圖像。其結果可知，day62 sort＋day41之細胞凝集體及day100 sort＋day31之細胞凝集體中，於未添加DX之培養條件下亦存在GH陽性之腦下垂體激素產生細胞(圖9B、D)，但於添加DX之培養條件下，GH陽性細胞數進一步增加(圖9F、H)。即表明，藉由在純化、再凝集後添加DX而分化誘導為GH產生細胞。
實施例 4 ： EpCAM 純化後藉由長期培養進行包含腦下垂體激素產生細胞之細胞凝集體之 ACTH 及 GH 分泌試驗之例於實施例2及實施例3中可知，純化後之細胞凝集體包含ACTH或GH等之腦下垂體激素產生細胞。因此，關於純化後長期培養對ACTH及GH分泌能力之影響展開研究。 使用於與實施例1相同之條件下獲得之開始分化誘導後第62天、100天之細胞凝集體，於與實施例2或實施例3相同之條件下純化，實施長期懸浮培養。 使用開始分化誘導後第62天及第100天之細胞凝集體進行純化、再凝集而獲得EpCAM陽性細胞凝集體及EpCAM陰性細胞凝集體，經時回收各細胞凝集體之培養上清液，測定ACTH及GH之分泌量。又，亦回收相當於與純化後之細胞凝集體之培養天數同期的純化前之細胞凝集體(day62 sort＋day41＝開始分化誘導後第103天)之培養上清液，進行測定，加以比較。藉由臨床檢查中採用之ELISA法測定所回收之培養上清液中之ACTH及GH濃度(委託SRL股份有限公司檢查)。結合所取得之ACTH及GH之濃度(pg/mL、ng/mL)之資料，根據取樣時細胞凝集體之總數及培養基之總量，計算每個細胞凝集體之分泌量(pg/aggregate、ng/aggregate)，繪製成圖。純化前之細胞凝集體係以20～60個/20 mL/dish進行培養，純化後之細胞凝集體係以1個/200 μL/well進行培養。 其結果，於自開始分化誘導後第62天之細胞凝集體純化、再凝集後經過69天懸浮培養之細胞凝集體中，ACTH之分泌量經時增加(圖10A)。進而，可知於純化後藉由添加DX進行培養，GH之分泌量增加，不僅分泌ACTH，亦同時分泌GH(圖10B)。 又，於自開始分化誘導後第100天之細胞凝集體純化、再凝集後經過31天懸浮培養之細胞凝集體中，ACTH之分泌量於懸浮培養開始後第13天之前呈增加態勢，但其後減少(圖11A)。進而，可知於純化後藉由添加DX進行培養，GH之分泌量經時增加，不僅分泌ACTH，亦同時分泌GH(圖11B)。 根據該等結果可知，純化、再凝集後藉由至少13天長期培養，ACTH及GH之分泌能力提昇。 使用自開始分化誘導後第62天之細胞凝集體純化、再凝集後經過41天懸浮培養之細胞凝集體，實施利用CRH(Nipro ES Pharma公司製造)之ACTH刺激試驗。將20個細胞凝集體移至裝有10 mL添加20%KSR之無血清培養基之10 cm懸浮培養用皿中，於37℃、40%O 2條件下培養24小時後，回收培養上清液。用添加20%KSR之無血清培養基將細胞凝集體洗淨後，移至裝有10 mL新鮮之添加20%KSR之無血清培養基之10 cm懸浮培養用皿中，添加5 μg/mL之CRH。於37℃、40%O 2條件下培養24小時後，回收培養上清液。藉由臨床檢查中採用之ELISA法測定所回收之培養上清液中之ACTH濃度(委託SRL股份有限公司檢查)。 其結果，藉由添加CRH使ACTH分泌量增加了不到一倍(圖10C)。根據以上結果可知，經純化、再凝集後藉由長期培養獲得之細胞凝集體為包含不僅具有分泌能力、亦具有應答性之功能性腦下垂體激素產生細胞之細胞凝集體。
實施例 5 ：自人 ES 細胞形成包含下丘腦細胞、腦下垂體前體細胞及腦下垂體激素產生細胞之細胞凝集體之例採用與實施例1相同之分化誘導法(不實施使用抗EpCAM抗體之細胞分選之方法)，製造包含下丘腦細胞、腦下垂體前體細胞及腦下垂體激素產生細胞之細胞凝集體。為了確認開始分化誘導後之各培養天數時之分化程度，藉由定量PCR研究腦下垂體標記物(PITX1、LHX3、POMC(ACTH前體細胞))及下丘腦標記物(RAX、NKX2.1(TTF1))之表現變化。具體而言，以如下方式實施。使用RNeasy Micro Kit(Qiagen公司)，每份樣品自6個細胞凝集體提取RNA。使用StepOne Plus即時PCR系統(Applied Biosystems)或Biomark HD(Fluidigm)實施定量PCR。再者，各基因之探針使用GAPDH(Hs02758991_g1)、PITX1(Hs00267528-m1)、LHX3(Hs01033412_m1)、POMC(Hs01596743_m1)、RAX(Hs00429459-m1)、TTF1(Hs00968940-m1)(TaqMan Probes；Thermo Fisher Scientific)。使用GAPDH作為內源性對照，對所取得之資料進行標準化(normalize)後，採用比較Ct法(ΔΔCt法)獲得定量結果。 其結果，於開始分化誘導第6天至第60天之期間LHX3之表現上調，於開始分化誘導第19天至第30天之期間LHX3之表現上調，於開始分化誘導第30天以後POMC之表現上調(圖12A)。根據該等結果，表明階段性地誘導向腦下垂體之分化。 另一方面，RAX之表現於開始分化誘導第3天至第6天左右達到平線區，其後下調(圖12B)。又，TTF1之表現於開始分化誘導第6天至第19天之期間上調，其後下調(圖12B)。根據該等結果，暗示於分化之初期階段，向腦下垂體前體組織分化之同時進行向下丘腦(腹側下丘腦)之分化。
實施例 6 ：自包含下丘腦細胞、腦下垂體前體細胞及腦下垂體激素產生細胞之細胞凝集體純化 EpCAM 陽性細胞集群，純化後藉由長期培養製造包含腦下垂體激素產生細胞之細胞凝集體之例採用與實施例1相同之分化誘導法，製造包含下丘腦細胞、腦下垂體前體細胞及腦下垂體激素產生細胞之細胞凝集體。對於未進行細胞分選之細胞凝集體，培養至開始分化誘導後第131天。對於一部分細胞凝集體，於開始分化誘導後第30天、60天及100天實施使用抗EpCAM抗體之細胞分選。細胞分選係藉由與實施例2相同之方式實施。將經純化之EpCAM陽性細胞或EpCAM陰性細胞以細胞非黏附性96孔板每孔10×10 4細胞之方式，於添加有20%KSR、20 μM Y27632之200 μL無血清培養基中再凝集，於37℃、40%O 2、5%CO 2之條件下懸浮培養。懸浮培養開始後第3天以後，使用添加20%KSR且不含Y27632之無血清培養基，每3天～4天半量更換一次，培養至開始分化誘導後第131天(圖4)。其後，採用定量PCR來定量所獲得之細胞凝集體中之POMC、巢蛋白(NESTIN)及SOX11之基因表現。定量PCR及其解析係藉由與實施例5相同之方式實施。再者，各基因之探針使用GAPDH(Hs02758991_g1)、POMC(Hs01596743_m1)、巢蛋白(NESTIN)(Hs04187831-g1)、SOX11(Hs00846583_s1)(TaqMan Probes；Thermo Fisher Scientific)。 其結果，使EpCAM陽性細胞再凝集而成之細胞凝集體中POMC之表現量較高，使EpCAM陰性細胞再凝集而成之細胞凝集體中幾乎未確認到POMC之表現(圖13A、C、E)。該結果與使用抗EpCAM抗體之細胞分選之實施時機無關，各結果均相同(圖13A、C、E)。 另一方面，於開始分化誘導後第60天、100天實施分選之情形時，使EpCAM陽性細胞再凝集而成之細胞凝集體中作為目標外細胞標記物之巢蛋白(NESTIN)及SOX11之表現較低，使EpCAM陰性細胞再凝集而成之細胞凝集體中巢蛋白(NESTIN)及SOX11之表現量較高(圖13D、F)。相對於此，於開始分化誘導後第30天實施分選之情形時，不僅於使EpCAM陰性細胞再凝集而成之細胞凝集體中，且於使EpCAM陽性細胞再凝集而成之細胞凝集體中，巢蛋白(NESTIN)及SOX11之表現量均較高(圖13B)。 根據該等結果，判斷藉由進行使用EpCAM抗體之細胞分選，能夠純化腦下垂體細胞。又，判斷為了減少目標外細胞之混入，於本案之分化誘導方法中，較佳為距開始分化誘導60天以後實施分選。
實施例 7 ：自包含下丘腦細胞、腦下垂體前體細胞及腦下垂體激素產生細胞之細胞凝集體純化 EpCAM 陽性細胞集群，純化後藉由長期培養製造包含腦下垂體激素產生細胞之細胞凝集體之例採用與實施例1相同之分化誘導法，製造包含下丘腦細胞、腦下垂體前體細胞及腦下垂體激素產生細胞之細胞凝集體。開始分化誘導後第60天，實施使用抗EpCAM抗體之細胞分選，其後分別使EpCAM陰性細胞及EpCAM陽性細胞再凝集。細胞分選及再凝集係藉由與實施例6相同之方式實施。其後，培養至開始分化誘導第103天或第107天，藉由與實施例2相同之方式分別製作冷凍切片。對於該等冷凍切片，使用實施例2中記載之抗體進行免疫染色，利用DAPI將細胞核染色。使用共聚焦雷射掃描顯微鏡(Olympus公司製造)觀察該等經染色之切片，取得免疫染色圖像。 其結果，關於EpCAM陽性細胞之再凝集體，獲得與實施例2相同之染色圖像。即，可知EpCAM陽性細胞、E-鈣黏附蛋白陽性細胞相互面附著，於凝集體整個表面形成上皮結構，於細胞凝集體內存在多個ACTH陽性之腦下垂體激素產生細胞(總細胞數之10.8±1.3%)，存在PRL、FSH、LH、TSH陽性細胞(數據未顯示)。進而，使用抗ACTH抗體(小鼠，1：200，Fitzgerald)及針對腦下垂體幹細胞標記物CXADR之抗CXADR抗體(兔，1：100，Atlas antibodies)，進行免疫染色，結果可知存在CXADR陽性且ACTH陰性細胞(圖14A、B、C)。因此，判斷於EpCAM陽性細胞之再凝集體中，不僅存在腦下垂體激素產生細胞，亦存在CXADR陽性之腦下垂體幹細胞，且CXADR陽性細胞與ACTH分泌細胞分開存在。 另一方面，於EpCAM陰性細胞之再凝集體中，存在下丘腦細胞(RAX陽性細胞：圖14E、F、H)、目標外細胞(巢蛋白(NESTIN)陽性細胞、SOX11細胞：圖14E、F、G、I、J)，確認為非腦下垂體細胞(ACTH陰性、EpCAM陰性且E-鈣黏附蛋白陰性：圖14D)。 進而，對於EpCAM陽性細胞再凝集後培養至開始分化誘導第201天之細胞凝集體，使用4%多聚甲醛、1%戊二醛及2%蔗糖，於4℃下固定3天。依據常規方法，利用醇溶液進行脫水，並利用LR-WHlTE樹脂(Nissin EM)進行聚合及包埋後，製作超薄切片，藉由電子顯微鏡進行觀察(Hitachi H-7500)。其結果可知，於細胞凝集體中複數個島狀結構相互形成叢集(圖15A，虛線)。島狀結構之表面散佈有多個纖毛細胞(ciliated cells)，暗示島狀結構之間存在空隙(voids：圖中*)。即，可知細胞凝集體整體具有海綿狀結構。未觀察到細胞凝集體之中心部之細胞壞死，經研究認為其原因在於，由於空隙之存在，培養液之營養或氧氣能夠到達內部。又，可知相較於未進行分選之細胞凝集體，包含分泌顆粒之細胞顯示出較弱之內側、外側之極性，結果暗示更接近由人體之腦下垂體內分泌細胞所形成之前葉之小樑結構(Trabecular structure)(圖15A、B)。再者，與腦下垂體、下丘腦類器官(Organoid)同樣地，亦確認到濾泡星狀細胞(folliculo-stellate cells：FSCs)之存在(圖15B、C中之虛線)。 又，研究EpCAM陽性細胞之再凝集體對激素之反應。於開始分化誘導後第60天，實施使用抗EpCAM抗體之細胞分選，其後使EpCAM陽性細胞再凝集，培養至開始分化誘導第103天。其後，實施利用CRH(Nipro ES Pharma公司製造)或地塞米松(DX，Aspen JAPAN公司製造)之ACTH刺激試驗。具體而言，將20個細胞凝集體移至裝有10 mL添加20%KSR之無血清培養基之10 cm懸浮培養用皿中，於37℃、40%O 2條件下培養24小時後，回收培養上清液。用添加20%KSR之無血清培養基將細胞凝集體洗淨後，移至裝有10 mL新鮮之添加20%KSR之無血清培養基之10 cm懸浮培養用皿中，添加5 μg/mL之CRH或500 ng/mL之地塞米松。分別設定未添加組作為對照。於37℃、40%O 2條件下培養24小時後，回收培養上清液。藉由臨床檢查中採用之ELISA法測定所回收之培養上清液中之ACTH濃度(委託SRL股份有限公司檢查)。其結果，藉由CRH刺激使ACTH分泌量增加至約2.2倍，藉由地塞米松刺激使ACTH分泌量降低了約50%(圖16)。根據該等結果，表明在EpCAM陽性細胞之再凝集體中，維持了激素之穩態。
實施例 8 ：對腦下垂體功能障礙小鼠移植 EpCAM 陽性細胞之再凝集體並確認藥效之例採用與實施例1相同之分化誘導法，製造包含下丘腦細胞、腦下垂體前體細胞及腦下垂體激素產生細胞之細胞凝集體。於開始分化誘導後第60天，實施使用抗EpCAM抗體之細胞分選，其後使EpCAM陽性細胞再凝集。細胞分選及再凝集係藉由與實施例6相同之方式實施。其後，培養至開始分化誘導第107天，移植至經外科切除腦下垂體之腦下垂體功能障礙小鼠(10-17週齡)之左腎被膜下(移植組)。亦設定僅實施移植操作但未移植EpCAM陽性細胞之對象組(假手術組)。再者，經外科切除腦下垂體之腦下垂體功能障礙小鼠係藉由對SCID小鼠(7-9週齡，雄性)進行公知之經耳手術而製作。移植24週後，摘取腎臟，使用各種抗體(human nuclei(小鼠，1：1000；Millipore)、ACTH(小鼠，1：200；Fitzgerald)、EpCAM(山羊，1：500；R&D Systems)、CXADR(兔，1：100；Atlas antibodies))，藉由常規方法實施免疫染色。其結果可知人核陽性且EpCAM陽性移植物包含ACTH陽性細胞(圖17A、B、B'、C)。又，於移植物、尤其是細胞間隙，確認到CXADR之表現，暗示移植物中存在FSCs之腦下垂體幹細胞龕(niche)樣結構(圖17D、E)。再者，於觀察期間未觀察到癌之形成。圖17A、圖17B、圖17B'、圖17D、圖17E之右下角之比例尺表示50 μm、圖17C之右下角之比例尺表示10 μm。 對移植組及假手術組施加CRH刺激，研究對ACTH分泌能力產生之影響。具體而言，對移植4週、12週或24週後之小鼠進行CRH投予(2 μg/kg，腹腔內投予)，採集CRH投予前及CHR投予1小時後之血液。使用ACTH ELISA套組(MD Bioproducts)，分別測定血中ACTH濃度。 其結果，移植4週後，移植組中之血中ACTH濃度與假手術組相比顯著上升(圖18A)。亦確認到CRH刺激引起之血中ACTH濃度之進一步上升(圖18A)。直至移植後24週之前，均可確認到血中ACTH濃度上升及CRH刺激引起之進一步之ACTH濃度上升(圖18A)。 對移植組施加地塞米松刺激，研究對ACTH分泌能力產生之影響。具體而言，移植6週後進行地塞米松投予(0.2 mg，肌肉內投予)，採集地塞米松投予前及地塞米松投予2小時後之血液。地塞米松投予2小時後之採血後，進而進行CRH投予(2 μg/kg，腹腔內投予)，採集CRH投予1小時後之血液。與上述同樣地測定血中ACTH濃度。 其結果可知，對移植6週後之小鼠投予地塞米松之組中，血中ACTH濃度顯著減少(圖18B)。又，即便於地塞米松投予後進行CRH投予，血中ACTH濃度仍然幾乎完全被抑制(圖18B)。對地塞米松介導之負反饋訊號顯示出反應暗示了於生物體內無需ACTH分泌時，藉由下游之糖皮質素之刺激而停止分泌，此就防止糖皮質素過剩之觀點而言重要。 於受到感染或手術之類的較強壓力之情形時，已知健康之正常人會自腦下垂體分泌大量ACTH，藉由刺激皮質類固醇之分泌，顯示對壓力之耐性。因此，為了於移植組及假手術組中誘發疑似感染壓力，施加LPS(InvivoGen，大腸桿菌來源(E. coli origin)，血清型(serotype)O111:B4)刺激，研究對ACTH分泌能力產生之影響。具體而言，對移植4週後之小鼠進行LPS投予(2.2 μg/kg，腹腔內投予)，採集LPS投予前及LPS投予2小時後之血液。與上述同樣地測定血中ACTH濃度。 其結果，於假手術組中未確認到LPS刺激引起之ACTH分泌促進，但於移植組中確認到LPS刺激引起之顯著之ACTH分泌促進(圖18C)。藉由增加所移植之EpCAM陽性細胞之凝集體之個數，該效果上升，確認到劑量依賴性(圖18C)。因此，暗示了所移植之EpCAM陽性細胞顯示出對感染壓力之反應。
實施例 9 ：自人 iPS 細胞形成包含下丘腦細胞、腦下垂體前體細胞及腦下垂體激素產生細胞之細胞凝集體之例採用與實施例1相同之分化誘導法(不實施使用抗EpCAM抗體之細胞分選之方法)，製造包含下丘腦細胞、腦下垂體前體細胞及腦下垂體激素產生細胞之細胞凝集體。其中，關於SAG之處理期，設定如下兩組：剛開始分化誘導後至第30天添加SAG之組(參照圖2)、與剛開始分化誘導後至第30天以後(至第61天、第103天及第131天)亦添加SAG之組，比較ACTH分泌能力。 其結果可知，藉由在開始分化誘導30天後停止SAG處理，ACTH分泌能力提高(圖19)。
實施例 10 ： EpCAM 純化後進行長期培養時藉由改變地塞米松添加期而製造包含比率不同之 ACTH 與 GH 之腦下垂體激素產生細胞之細胞凝集體之例根據實施例3及實施例4之結果可知，對純化後之細胞凝集體進行培養時藉由使用DX，能夠分化誘導為GH產生細胞。因此，針對培養時改變DX添加期所引起之對細胞凝集體中之向ACTH產生細胞及GH產生細胞之分化之影響展開研究。 使用於與實施例1相同之條件下獲得之開始分化誘導後第63天之細胞凝集體，於與實施例2相同之條件下純化，將獲得之EpCAM陽性細胞以細胞非黏附性96孔板每孔10×10 4細胞之方式，於添加有20%KSR、20 μM Y27632之200 μL無血清培養基中再凝集，於37℃、40%O 2、5%CO 2之條件下懸浮培養。懸浮培養開始後第3天，使用添加有DX(400 ng/mL)、20%KSR且不含Y27632之無血清培養基，進行半量培養基更換。作為DX添加期之條件研究，將添加3天、7天、14天DX之條件與未添加條件進行比較。懸浮培養開始後第3天起添加DX時，使用添加有DX(400 ng/mL)、20%KSR之無血清培養基進行長期培養，不添加DX時，使用添加20%KSR之無血清培養基進行長期培養(圖20)。 對於使用開始分化誘導後第63天之細胞凝集體進行純化、再凝集後經過40天長期培養之細胞凝集體(day63 sort＋day40)，分別利用4%多聚甲醛固定，製作冷凍切片。對於該等冷凍切片，使用作為上皮細胞標記物之EpCAM、作為腦下垂體激素產生細胞標記物之促腎上腺皮質激素(ACTH)及生長激素(GH)，進行免疫染色。其結果可知，day63 sort＋day40之細胞凝集體中，隨著DX之添加期變長，ACTH陽性細胞數減少，GH陽性細胞數增加(圖21)。 又，經時回收自開始分化誘導後第63天之細胞凝集體純化、再凝集而成、且添加有DX之EpCAM陽性之細胞凝集體及EpCAM陰性之細胞凝集體之培養上清液，於與實施例4相同之條件下測定ACTH及GH之分泌量。其結果，自開始分化誘導後第63天之細胞凝集體純化、再凝集後經過40天長期培養之細胞凝集體(day63 sort＋day40)中，依賴於DX添加期，ACTH之分泌量減少(圖22A)、GH之分泌量增加(圖22B)。即，表明藉由改變純化、再凝集後之DX添加期，能夠調節誘導向ACTH產生細胞分化及向GH產生細胞分化之比率。 自開始分化誘導後第63天之細胞凝集體純化、再凝集後進行40天懸浮培養，其後實施14天DX處理，使用如此獲得之細胞凝集體，實施利用GRF之GH刺激試驗及利用生長抑素之GH抑制試驗。將15個細胞凝集體移至裝有2 mL添加20%KSR之無血清培養基之6孔板(SUMITOMO BAKELITE公司製造，懸浮細胞培養用，培養面積9.2 cm 2)中，於37℃、40%O 2條件下培養24小時後，回收培養上清液。用添加20%KSR之無血清培養基將細胞凝集體洗淨後，移至裝有2 mL新鮮之添加20%KSR之無血清培養基之6孔板中，添加2 μg/mL之GRF或100 ng/mL之生長抑素。於37℃、40%O 2條件下培養24小時後，回收培養上清液。藉由臨床檢查中採用之ELISA法測定所回收之培養上清液中之ACTH濃度(委託SRL股份有限公司檢查)。其結果，藉由添加GRF使GH分泌量增加了不到一倍(圖22C)，藉由添加生長抑素使GH分泌量減少了20%(圖22D)。根據以上結果可知，純化、再凝集後進行長期培養時經過DX處理獲得之細胞凝集體為包含不僅具有GH之分泌能力、亦具有應答性之功能性腦下垂體激素產生細胞之細胞凝集體。 [產業上之可利用性]
根據本發明之方法，使多能幹細胞分化成包含下丘腦細胞、腦下垂體前體細胞及腦下垂體激素產生之細胞凝集體，使用EpCAM標記物有效率地分離功能性腦下垂體激素產生細胞及/或其前體細胞，使該細胞進一步分化，藉此能夠效率良好地取得包含腦下垂體激素產生細胞之細胞凝集體。又，經分離、純化之腦下垂體激素產生細胞等藉由生理性之腦下垂體激素分泌刺激，顯示出優異之腦下垂體激素之分泌能力，因此，可使用該細胞進行腦下垂體相關疾病之治療等。 本申請案係以於日本提出申請之日本專利特願2021-162253(申請日：2021年9月30日)及日本專利特願2022-116715(申請日：2022年7月21日)作為基礎，將其全部內容包含於本說明書中。
圖1係表示由人ES/iPS細胞製造包含腦下垂體激素產生細胞之細胞凝集體之整體步驟圖。作為製造步驟，分為以下三個步驟：(1)使人ES/iPS細胞分化為包含下丘腦細胞、腦下垂體前體細胞及腦下垂體激素產生細胞之細胞凝集體之步驟(步驟1：分化)；(2)自包含下丘腦細胞、腦下垂體前體細胞及腦下垂體激素產生細胞之細胞凝集體分離EpCAM陽性細胞集群之步驟(步驟2：中間純化)；(3)藉由將分離後之EpCAM陽性細胞集群進行長期培養而製造包含腦下垂體激素產生細胞之細胞凝集體之步驟(步驟3：成熟培養)。 圖2係表示用以使人ES細胞分化為包含下丘腦細胞、腦下垂體前體細胞及腦下垂體激素產生細胞之細胞凝集體之試驗方案。 圖3係對開始分化誘導後第29、61、103天之細胞凝集體中之各種細胞標記物之表現進行確認之圖。 圖4係表示用以使經純化之EpCAM陽性細胞再凝集，進行長期懸浮培養之試驗方案。 圖5係對於使用開始分化誘導後第62天之細胞凝集體進行純化，再凝集後經過41天長期培養所得之細胞凝集體(day62 sort＋day41)中之各種細胞標記物之表現進行確認之圖。 圖6係對於使用開始分化誘導後第100天之細胞凝集體進行純化，再凝集後經過31天長期培養所得之細胞凝集體(day100 sort＋day31)中之各種細胞標記物之表現進行確認之圖。 圖7A～E係對於day62 sort＋day41之細胞凝集體及day100 sort＋day31之細胞凝集體中之ACTH陽性細胞率、細胞密度及長徑進行定量之圖以及亮視野圖像。 圖8係表示用以使經純化之EpCAM陽性細胞再凝集，於地塞米松(DX)添加條件下長期懸浮培養之試驗方案。 圖9係對於day62 sort＋day41之細胞凝集體及day100 sort＋day31之細胞凝集體中之作為上皮細胞標記物之EpCAM、作為腦下垂體激素產生細胞標記物之生長激素(GH)之表現進行確認之圖。 圖10A、B係表示對於使用開始分化誘導後第62天之細胞凝集體進行純化、再凝集所得之EpCAM陽性之細胞凝集體及EpCAM陰性之細胞凝集體之各培養上清液中之ACTH及GH之量進行經時測定之結果之圖。又，圖10C係表示使用自開始分化誘導後第62天之細胞凝集體進行純化、再凝集後經過41天懸浮培養所得之細胞凝集體，進行利用CRH(Corticotropin Releasing Hormone，促腎上腺皮質激素釋放激素)之ACTH刺激試驗之結果之圖。 圖11A、B係表示對於使用開始分化誘導後第100天之細胞凝集體進行純化、再凝集所得之EpCAM陽性之細胞凝集體及EpCAM陰性之細胞凝集體之各培養上清液中之ACTH及GH之量進行經時測定之結果之圖。 圖12A、B係表示對於開始分化誘導後第3、6、19、30、60、100、201天之細胞凝集體中之各種細胞標記物之表現量進行測定之結果之圖。 圖13A～F係對於使用開始分化誘導後第30天、60天、100天之細胞凝集體進行純化，再凝集後培養至開始分化誘導後第131天所得之細胞凝集體中之各種細胞標記物之表現進行確認之圖。 圖14係對於使用開始分化誘導後第60天之細胞凝集體進行純化，再凝集後培養至開始分化誘導第103天所得之細胞凝集體中之各種細胞標記物之表現進行確認之圖。A～C為EpCAM陽性細胞之再凝集體，D～J為EpCAM陰性細胞之再凝集體。D、E、I之比例尺表示200 μm，A～C、F～H、J之比例尺表示50 μm。 圖15係對於使用開始分化誘導後第60天之細胞凝集體進行純化，再凝集後培養至開始分化誘導第201天所得之細胞凝集體，利用電子顯微鏡進行觀察之圖。A、B之比例尺表示2 μm，C之比例尺表示500 nm。 圖16A、B係表示對於使用開始分化誘導後第60天之細胞凝集體進行純化，再凝集後培養至開始分化誘導第103天所得之細胞凝集體，進行利用CRH或地塞米松之ACTH刺激試驗之結果之圖。**：p＜0.01，配對t試驗法(paired t-test)。 圖17A～E係於腦下垂體功能障礙小鼠腎被膜移植EpCAM陽性細胞之再凝集體，移植24週後，對於腎臟中之各種細胞標記物之表現進行確認之圖。 圖18係於腦下垂體功能障礙小鼠腎被膜移植EpCAM陽性細胞之再凝集體，對於CRH、地塞米松或LPS刺激對ACTH分泌產生之影響進行確認之圖。圖18A中，*：p＜0.05、**：p＜0.01、***：p＜0.001，曼-惠特尼試驗法(Mann-Whitney test)(假手術組與移植組(sham versus grafted))、配對t試驗法(移植前與移植後(grafted pre versus post))。圖18B及C中，**：p＜0.01、***：p＜0.001，配對t試驗法。 圖19係於用以使人iPS細胞分化為包含下丘腦細胞、腦下垂體前體細胞及腦下垂體激素產生細胞之細胞凝集體之試驗方案中，對於利用SAG進行處理直至開始分化誘導後第30天為止之情形時之ACTH分泌能力、與其後亦繼續利用SAG進行處理之情形時之ACTH分泌能力進行比較之圖。*：p＜0.05，史都登氏(Student's)t試驗法。 圖20係表示用以使經純化之EpCAM陽性細胞再凝集，於添加期互不相同之DX添加條件下長期懸浮培養之試驗方案。 圖21係對於使用開始分化誘導後第63天之細胞凝集體進行純化，再凝集後，經過3天後利用DX處理3、7或14天，培養至開始分化誘導第103天所得之細胞凝集體中之作為上皮細胞標記物之EpCAM、作為腦下垂體激素產生細胞標記物之生長激素(GH)之表現進行確認之圖。 圖22A、B係表示對於使用開始分化誘導後第63天之細胞凝集體進行純化，再凝集後，經過3天後利用DX處理3、7或14天，培養至開始分化誘導第103天所得之細胞凝集體之培養上清液中之ACTH及GH之量進行經時測定之結果之圖。圖22C係表示對於使用開始分化誘導後第63天之細胞凝集體進行純化，再凝集後，經過3天後利用DX處理14天，培養至開始分化誘導第103天所得之細胞凝集體，進行利用CRF之GH刺激試驗之結果之圖。圖22D係表示對於使用開始分化誘導後第63天之細胞凝集體進行純化，再凝集後，經過3天後利用DX處理14天，培養至開始分化誘導第103天所得之細胞凝集體，進行利用生長抑素(somatostatin)之GH抑制試驗之結果之圖。

Claims (19)

  1. 一種細胞凝集體，其特徵在於：其係包含腦下垂體激素產生細胞者，且 (1)該細胞凝集體中之EpCAM及E-鈣黏附蛋白之至少一者呈陽性之細胞之存在比率為80%以上； (2)該細胞凝集體中之神經細胞之存在比率為20%以下； (3)該細胞凝集體中之ACTH陽性細胞之存在比率為5%以上； (4)該細胞凝集體之細胞密度為3,000～20,000 cells/mm 2； (5)該細胞凝集體之長徑為200～3,000 μm； (6)於該細胞凝集體之表面，EpCAM及E-鈣黏附蛋白之至少一者呈陽性之細胞相互面附著而形成上皮結構；且 (7)該細胞凝集體之內部形成海綿狀結構。
  2. 如請求項1之細胞凝集體，其中該細胞凝集體中之腦下垂體幹細胞之存在比率為3%以上。
  3. 如請求項1之細胞凝集體，其中該細胞凝集體之ACTH分泌能力為200～1,000,000 pg/mL。
  4. 如請求項1之細胞凝集體，其中該細胞凝集體之GH分泌能力為0.05～100 ng/mL。
  5. 一種細胞集群，其包含占細胞凝集體總數40%以上之如請求項1之細胞凝集體。
  6. 一種由腦下垂體障礙引起之疾病之治療藥，其包含如請求項1之細胞凝集體。
  7. 一種包含腦下垂體激素產生細胞之細胞凝集體之製造方法，其包括以下之步驟： 步驟(1)，其係自源於多能幹細胞之包含下丘腦細胞、腦下垂體前體細胞及腦下垂體激素產生細胞的經分散之細胞集群，分離表現EpCAM之細胞；及 步驟(2)，其係將經分離之EpCAM表現細胞於能夠使腦下垂體前體細胞成熟為腦下垂體激素產生細胞之條件下懸浮培養14天以上。
  8. 如請求項7之製造方法，其中步驟(1)之細胞集群係藉由下述步驟(A)及(B)獲得： 步驟(A)，其係將多能幹細胞或其細胞凝集體，於能夠被分化誘導為包含下丘腦細胞、腦下垂體前體細胞及腦下垂體激素產生細胞之細胞凝集體之條件下進行培養；及 步驟(B)，其係使(A)中獲得之包含下丘腦細胞、腦下垂體前體細胞及腦下垂體激素產生細胞之細胞凝集體分散為細胞集群。
  9. 如請求項8之製造方法，其中步驟(A)包括以下之步驟： 第一步驟(1')，其係將多能幹細胞於存在Wnt訊號傳遞路徑抑制物質之條件下進行培養，形成細胞凝集體； 第二步驟(2)，其係將第一步驟中獲得之細胞凝集體於存在BMP訊號傳遞路徑作用物質及Shh訊號傳遞路徑作用物質之條件下進行培養，獲得包含下丘腦細胞、腦下垂體前體細胞及腦下垂體激素產生細胞之細胞凝集體。
  10. 如請求項8之製造方法，其中步驟(A)包括以下之步驟： 步驟(a)，其係將多能幹細胞於不存在餵養細胞之條件下，於包含1)TGFβ家族訊號傳遞路徑抑制物質及/或Shh訊號傳遞路徑作用物質、以及2)未分化維持因子之培養基中進行培養之a步驟； 第一步驟(1')，其係將a步驟中獲得之多能幹細胞於存在Wnt訊號傳遞路徑抑制物質之條件下懸浮培養，形成細胞凝集體； 第二步驟(2)，其係將第一步驟中獲得之細胞凝集體於存在BMP訊號傳遞路徑作用物質及Shh訊號傳遞路徑作用物質之條件下懸浮培養，獲得包含下丘腦細胞、腦下垂體前體細胞及腦下垂體激素產生細胞之細胞凝集體。
  11. 如請求項8之製造方法，其中步驟(A)包括以下之步驟： 步驟(a)，其係將多能幹細胞於不存在餵養細胞之條件下，於包含1)TGFβ家族訊號傳遞路徑抑制物質及/或Shh訊號傳遞路徑作用物質、以及2)未分化維持因子之培養基中進行培養之a步驟； 第一步驟(1)，其係將a步驟中獲得之多能幹細胞於存在JNK訊號傳遞路徑抑制物質及Wnt訊號傳遞路徑抑制物質之條件下懸浮培養，形成細胞凝集體； 第二步驟(2)，其係將第一步驟中獲得之細胞凝集體於存在BMP訊號傳遞路徑作用物質及Shh訊號傳遞路徑作用物質之條件下懸浮培養，獲得包含下丘腦細胞、腦下垂體前體細胞及腦下垂體激素產生細胞之細胞凝集體。
  12. 如請求項11之製造方法，其中第一步驟中之懸浮培養進而處於存在Shh訊號傳遞路徑作用物質之條件下，且於第一步驟及第二步驟中存在Shh訊號傳遞路徑作用物質之條件下之培養期為30天。
  13. 如請求項9至12中任一項之製造方法，其中進而將第二步驟中獲得之細胞凝集體於不存在Shh訊號傳遞路徑作用物質之條件下懸浮培養。
  14. 如請求項8至12中任一項之製造方法，其中步驟(A)之培養期係獲得包含分泌ACTH之腦下垂體激素產生細胞、且不含分泌GH或TSH之腦下垂體激素產生細胞的細胞凝集體之期間。
  15. 如請求項8至12中任一項之製造方法，其中步驟(A)之培養期為30天以上且100天以下。
  16. 如請求項7至12中任一項之製造方法，其中包含腦下垂體激素產生細胞之細胞凝集體包括以下之特徵： (1)該細胞凝集體中之EpCAM及E-鈣黏附蛋白之至少一者呈陽性之細胞之存在比率為80%以上； (2)該細胞凝集體中之神經細胞之存在比率為20%以下； (3)該細胞凝集體中之ACTH陽性細胞之存在比率為5%以上； (4)該細胞凝集體之細胞密度為3,000～20,000 cells/mm 2； (5)該細胞凝集體之長徑為200～3,000 μm； (6)於該細胞凝集體之表面，EpCAM及E-鈣黏附蛋白之至少一者呈陽性之細胞相互面附著而形成上皮結構；且 (7)該細胞凝集體形成海綿狀結構。
  17. 如請求項16之製造方法，其中該細胞凝集體中之腦下垂體幹細胞之存在比率為3%以上。
  18. 如請求項16之製造方法，其中該細胞凝集體之ACTH分泌能力為200～1,000,000 pg/mL。
  19. 如請求項16之製造方法，其中該細胞凝集體之GH分泌能力為0.05～100 ng/mL。
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