KR20200046099A - 줄기 세포-유도 외배엽 계통 전구체의 분화 방법 - Google Patents

줄기 세포-유도 외배엽 계통 전구체의 분화 방법 Download PDF

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Abstract

본원에서 개시되는 요지 사안은 줄기 세포의 신경 능선, 두개 기원판 또는 비-신경 외배엽 전구체로의 분화를 유도하는 시험관내 방법, 및 이러한 방법에 의해 생성된 세포를 제공한다. 본원에서 개시되는 요지 사안은 또한 신경변성 및 뇌하수체 장애를 치료하기 위한 이러한 세포의 용도를 제공한다.

Description

줄기 세포-유도 외배엽 계통 전구체의 분화 방법
관련 출원에 대한 교차-참조
본 출원은 그 내용의 전문이 본원에 참조로 포함되는, 2017년 9월 7일에 출원된 미국 가출원 번호 62/555,629에 대한 우선권을 청구한다.
1. 도입
본원에서 개시되는 요지 사안은 인간 줄기 세포로부터 유도된, 4개의 주요 외배엽 계통인 CNS, 신경 능선, 두개 기원판, 및 비-신경 외배엽의 세포, 그리고 신경학적 장애에서 세포-기반 치료 및 약물 발견을 위한 이의 용도에 관한 것이다.
2. 본 발명의 배경
초기 발생 세포 유형을 인간에서 단리하고 연구하는 것은 어렵다. 다능성 줄기 세포(PSC)의 유도된 분화는 기본 및 응용 생물학에서의 적용을 위해 체계화된 방식으로 초기 운명 결정에 접근하기 위한 모델 시스템을 제공한다. 자연 분화 패러다임 및 생체내 발생 동안 작용하는 것으로 알려진 발생 경로의 시험관내 조절에 기반한 유도된 분화 전략과 같이, PSC를 초기 계통으로 분화시키기 위한 몇몇 전략이 존재한다. 다양한 분화 플랫폼에 걸쳐 결과에 큰 영향을 미치는 요인에는 영양공급 세포의 사용, 단층 대 배아체-기반 전략 또는 복잡합 배지 조성의 사용이 포함된다. 예를 들어, 여러 공개된 프로토콜에는 요망되는 운명을 유도하기 위한 혈청 또는 혈청 대체 인자, 예컨대 KSR을 함유하는 배지가 관여된다. 이들 시약의 제조에서 배치별 변동성은 분화의 재현성에 영향을 미쳐서 종종 특정 관심 세포 유형을 생성하기 위해 고된 로트 평가를 추진해야 하도록 만든다(Blauwkamp et al., 2012). 복잡합 시약, 예컨대 KSR에 대한 이러한 광범위한 품질 제어 전략은 임의의 단일 프로토콜에 대해서는 타당하지만, 이들은 모듈식 방식으로 수십 개 또는 가능하게는 수백 개의 정의된 세포 유형을 생성하는 것으로 목표로 하는 보다 의욕적인 전략의 개발을 방지한다.
BMP 및 TGFβ 신호전달 경로를 각각 억제하고, 이에 의해 SMAD 신호전달을 억제하는 소분자인 LDN193189 및 SB431542의 첨가에 기반하여 신경계의 여러 세포 유형을 유도하기 위한 프로토콜이 확립되었다. 이중 SMAD 억제(dSMADi)로 명명된 이러한 억제성 칵테일 조합은 전사 인자 Pax6의 발현에 의해 표시되는 전방 신경외배엽(NE)을 디폴트로 하는 중추 신경계(CNS)에서 세포의 효율적 생성을 허용한다(Chambers et al., 2009). dSMADi로의 변형은 앞뇌, 중간뇌 및 척추 전구체를 포함하는 배아의 신경축을 따라 여러 상이한 신경 서브타입을 제공할 수 있다. 또한, dSMADi는 비-CNS 세포 유형, 예컨대 신경 능선(NC)(Mica et al., 2013), 두개 기원판(CP) 및 비-신경 외배엽(NNE)(Dincer et al., 2013)을 생성하기 위해 적응될 수 있다. 전반적으로, dSMADi는 거의 균일한 Pax6+ NE 층을 생성할 강력하고 널리 사용되는 플랫폼이다. 그러나, dSMADi 하에 Pax6+ NE를 유도하기 위해서도, PAX6+ 세포에서 최전방, 끝뇌 마커 FOXG1+의 획득은 KSR 배치 변동성에 의해 영향받을 수 있다. 따라서, 확장 가능한 완전 모듈식 분화 플랫폼에는 KSR 또는 다른 복잡한 배지 인자가 없어야 한다.
3. 발명의 요약
본원에서 개시되는 요지 사안은, 예컨대 시험관내 분화에 의한, 인간 줄기 세포로부터 유도된 신경 능선(NC), 두개 기원판(CP), 및 비-신경 외배엽(NNE) 전구체에 관한 것이다.
본원에서 개시되는 요지 사안은 적어도 부분적으로 신경 능선, 두개 기원판 및 비-신경 외배엽의 비-CNS 외배엽 계통이 BMP 신호전달의 활성화에 따른 SMAD 신호전달의 억제에 의해(예를 들어, TGFβ/액티빈(Activin)-노달(Nodal) 신호전달의 억제에 의해) 인간 줄기 세포로부터 분화될 수 있다는 발견에 기반하며, 여기서 BMP 신호전달은 유효량의 하나 이상의 SMAD 억제제 및 하나 이상의 BMP 활성화제에 대한 세포의 최초 접촉 후 적어도 2일 동안 활성화되며, 세포는 유효량의 하나 이상의 NC, CP 또는 NNE 계통 특이적 활성화제 및 억제제와 추가 접촉된다. 예를 들어, 줄기 세포는 세포를 유효량의 하나 이상의 Wnt 활성화제와 추가 접촉시켜 NC로 분화될 수 있고; CP는 줄기 세포를 유효량의 하나 이상의 FGF의 활성화제와 추가 접촉시켜 줄기 세포로부터 분화될 수 있고; NNE는 줄기 세포를 유효량의 하나 이상의 FGF의 억제제와 추가 접촉시켜 줄기 세포로부터 분화될 수 있다.
소정 구현예에서, 세포는 유효량의 하나 이상의 전환 성장 인자 베타(TGFβ)/액티빈-노달 신호전달의 억제제 및 하나 이상의 BMP 신호전달의 활성화제와 적어도 약 2일 동안 접촉된다. 소정 구현예에서, 세포는 유효량의 하나 이상의 전환 성장 인자 베타(TGFβ)/액티빈-노달 신호전달의 억제제와 적어도 약 12일 동안 접촉된다. 소정 구현예에서, 유효량의 하나 이상의 전환 성장 인자 베타(TGFβ)/액티빈-노달 신호전달의 억제제 및 하나 이상의 BMP 신호전달의 활성화제는 세포 집단과 동시에 접촉된다.
소정 구현예에서, 본원에서 개시되는 요지 사안은 인간 줄기 세포 집단을 유효량의 하나 이상의 TGFβ/액티빈-노달 신호전달의 억제제, 유효량의 하나 이상의 BMP 신호전달의 활성화제, 및 유효량의 하나 이상의 wingless(Wnt) 신호전달의 활성화제와 접촉시키는 단계를 포함하는, 인간 줄기 세포의 비-CNS NC 전구체로의 분화를 유도하는 시험관내 방법을 제공한다. 소정 구현예에서, 세포는 유효량의 하나 이상의 BMP 신호전달의 활성화제와 적어도 약 2일, 또는 적어도 약 3일 동안 접촉되어, TFAP2A, TFAP2B, NEUROG1, HAND1, ISL1, BRN3a 및/또는 MASH1로부터 선택되는 검출가능한 수준의 마커 또는 마커들을 발현하는 세포 집단을 생성한다. 소정 구현예에서, 세포는 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50% 또는 60% 이상의 세포가 검출가능한 수준의 상기 마커를 발현하도록 하는 시기 동안 유효량의 상기 제제와 접촉된다. 소정 구현예에서, 유효량의 하나 이상의 Wnt 신호전달의 활성화제 및 TGFβ/액티빈-노달 신호전달의 억제제는 세포와 동시에 접촉되며, 여기서 Wnt 활성화제의 농도는 세포가 Wnt 활성화제와 최초 접촉된 약 2일 후 증가되며. 세포는 최대 약 10일, 11일, 또는 12일 이상 동안 증가된 수준의 Wnt와 접촉된다. 소정 구현예에서, 세포는, 예를 들어, 유효량의 하나 이상의 TGFβ/액티빈-노달 신호전달의 억제제와 최초 접촉된 후 약 12일 후, 검출가능한 수준의 SOX10을 발현한다. 소정 구현예에서, 세포는 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50% 또는 60% 이상의 세포가 검출가능한 수준의 SOX10을 발현하도록 하는 시기 동안 유효량의 상기 제제와 접촉된다.
소정 구현예에서, 본원에서 개시되는 요지 사안은 인간 줄기 세포 집단을 유효량의 하나 이상의 TGFβ/액티빈-노달 신호전달의 억제제, 유효량의 하나 이상의 BMP 신호전달의 활성화제, 및 유효량의 하나 이상의 섬유아세포 성장 인자(FGF) 신호전달의 활성화제와 접촉시키는 단계를 포함하는, 인간 줄기 세포의 비-CNS CP 전구체로의 분화를 유도하는 시험관내 방법을 제공한다. 소정 구현예에서, 세포는 적어도 약 2일, 또는 적어도 약 3일 동안 유효량의 하나 이상의 BMP 신호전달의 활성화제와 접촉되어 TFAP2A, TFAP2B, NEUROG1, HAND1, ISL1, BRN3a, 및/또는 MASH1로부터 선택되는 검출가능한 수준의 하나 이상의 마커를 발현하는 세포 집단을 생성한다. 소정 구현예에서, 세포는 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50% 또는 60% 이상의 세포가 검출가능한 수준의 상기 마커를 발현하도록 하는 시기 동안 유효량의 상기 제제와 접촉된다. 소정 구현예에서, 유효량의 하나 이상의 FGF 신호전달의 활성화제는 세포가 TGFβ/액티빈-노달 신호전달의 억제제와 접촉된 적어도 2일 후 세포와 접촉된다. 소정 구현예에서, 세포는, 예를 들어, TGFβ/액티빈-노달 신호전달의 억제제와 최초 접촉된 후 약 12일 후, 검출가능한 수준의 SIX1 및/또는 ELAVL4를 발현한다. 소정 구현예에서, 세포는 세포가 TGFβ/액티빈-노달 신호전달의 억제제와 접촉된 약 12일 후 SIX1, PAX6, PITX3, 크리스탈린 알파 A, 및/또는 크리스탈린 알파 B로부터 선택되는 검출가능한 수준의 하나 이상의 수정체 기원판 전구체 마커를 발현한다. 소정 구현예에서, 세포는 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50% 또는 60% 이상의 세포가 검출가능한 수준의 상기 마커를 발현하도록 하는 시기 동안 유효량의 상기 제제와 접촉된다.
소정 구현예에서, 세포는 유효량의 하나 이상의 TGFβ/액티빈-노달 신호전달의 억제제와 접촉된 적어도 2일 후 유효량의 하나 이상의 Wnt 신호전달의 활성화제와 추가 접촉되며, 여기서 세포는 약 2일 동안 유효량의 하나 이상의 Wnt 활성화제와 접촉된다. 소정 구현예에서, 세포는 세포와 Wnt 활성화제의 접촉 동안 또는 이후 FGF 활성화제와 접촉되지 않는다. 소정 구현예에서, 세포는, 예를 들어, 유효량의 하나 이상의 TGFβ/액티빈-노달 신호전달의 억제제와 최초 접촉된 후 약 12일 후, 검출가능한 수준의 삼차 기원판 전구체 마커 PAX3을 발현한다. 소정 구현예에서, 세포는 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50% 또는 60% 이상의 세포가 검출가능한 수준의 SIX1 및/또는 PAX3을 발현하도록 하는 시기 동안 유효량의 상기 제제와 접촉된다.
소정 구현예에서, 본원에서 개시되는 요지 사안은 세포를 유효량의 하나 이상의 TGFβ/액티빈-노달 신호전달의 억제제, 유효량의 하나 이상의 BMP 신호전달의 활성화제, 유효량의 하나 이상의 Sonic Hedgehog(SHH) 신호전달의 활성화제, 및 유효량의 1개, 또는 2개 이상의 FGF 신호전달의 활성화제와 접촉시키는 단계에 의해, 인간 줄기 세포의 뇌하수체 세포, 또는 이의 두개 기원판 전구체로의 분화를 유도하는 시험관내 방법을 제공한다. 소정 구현예에서, FGF 신호전달의 활성화제는 FGF8 및 FGF10 신호전달을 활성화한다. 소정 구현예에서, 세포는 유효량의 하나 이상의 BMP 신호전달의 활성화제와 적어도 약 2일, 또는 적어도 약 3일 동안 접촉된다. 소정 구현예에서, 세포는 세포가 유효량의 하나 이상의 TGFβ/액티빈-노달 신호전달의 억제제와 접촉된 적어도 4일 후 유효량의 하나 이상의 SHH 신호전달의 활성화제 및 유효량의 1개, 또는 2개 이상의 FGF 신호전달의 활성화제와 접촉되며, 여기서 세포는 최대 적어도 26일 이상 동안 하나 이상의 SHH 활성화제 및 1개, 또는 2개 이상의 FGF 활성화제와 접촉된다.
소정 구현예에서, 뇌하수체 세포, 또는 이의 두개 기원판 전구체 집단을 생성하는 상기 방법은 PITX1, PITX2, LUX, LHX4, HESX1, SIX6, TBX19, PAX6, 또는 이의 조합으로부터 선택되는 검출가능한 수준의 하나 이상의 마커를 발현하는 세포 집단을 생성한다. 소정 구현예에서, 세포는 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50% 또는 60% 이상의 세포가 검출가능한 수준의 상기 마커를 발현하도록 하는 시기 동안 유효량의 상기 제제와 접촉된다.
소정 구현예에서, 세포는 유효량의 하나 이상의 등쪽화 제제, 예를 들어, FGF 신호전달의 활성화제; 유효량의 하나 이상의 배쪽화 제제, 예를 들어, BMP 신호전달의 활성화제; 또는 이의 조합과 추가 접촉되며, 여기서 세포는 세포가 유효량의 하나 이상의 TGFβ/액티빈-노달 신호전달의 억제제와 접촉된 적어도 30일 후 제제(들)와 접촉된다. 소정 구현예에서, 세포는 적어도 30일 이상 동안 유효량의 제제(들)와 접촉된다.
소정 구현예에서, 본원에서 개시되는 요지 사안은 인간 줄기 세포 집단을 유효량의 하나 이상의 TGFβ/액티빈-노달 신호전달의 억제제, 유효량의 하나 이상의 BMP 신호전달의 활성화제, 및 유효량의 하나 이상의 FGF 신호전달의 억제제와 접촉시키는 단계를 포함하는, 인간 줄기 세포의 비-CNS NNE 전구체로의 분화를 유도하는 시험관내 방법을 제공한다. 소정 구현예에서, 세포는, 예를 들어, 유효량의 하나 이상의 TGFβ/액티빈-노달 신호전달의 억제제와 접촉된 후 약 12일 후, 검출가능한 수준의 TFAP2A를 발현하며, 검출가능한 수준의 SIX1 및/또는 SOX10을 발현하지 않는다. 소정 구현예에서, 세포는 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50% 또는 60% 이상의 세포가 검출가능한 수준의 TFAP2A를 발현하도록 하는 시기 동안 유효량의 상기 제제와 접촉된다.
소정 구현예에서, 방법은 상기 인간 줄기 세포 집단을 상기 유효량의 하나 이상의 TGFβ/액티빈-노달 신호전달의 억제제 및 상기 유효량의 하나 이상의 BMP 신호전달의 활성화제와 동시에 접촉시키는 단계를 포함한다.
소정 구현예에서, 상기 인간 줄기 세포 집단은 상기 유효량의 하나 이상의 TGFβ/액티빈-노달 신호전달의 억제제와의 최초 접촉 후 약 12일째에 또는 그 후에 하나 이상의 신경 능선, 두개 기원판 또는 비-신경 외배엽 계통 마커를 발현하는 분화된 세포 집단으로 분화된다.
본 개시는 또한 본원에서 기재되는 방법에 따라 제조되는 하나 이상의 신경 능선, 두개 기원판 또는 비-신경 외배엽 계통 마커를 발현하는 시험관내 분화된 세포 집단을 제공한다. 소정 구현예에서, 분화된 세포 집단은 인간 줄기 세포 집단으로부터 유도된다. 본원에서 개시되는 요지 사안은 이러한 분화된 세포 집단을 포함하는 조성물을 추가로 제공한다.
소정 구현예에서, 세포 집단은 본원에서 기재되는 바와 같이 외배엽 계통으로 분화되며, 50%, 40%, 30%, 20%, 15%, 10%, 5%, 2% 또는 1% 미만의 세포 집단이 검출가능한 수준의 본원에서 기재되는 바와 같은 하나 이상의 다른 외배엽 계통 마커를 발현한다.
또한, 본원에서 개시되는 요지 사안은 줄기 세포의 분화를 유도하기 위한 키트를 제공한다.
소정 구현예에서, 키트는 (a) 하나 이상의 전환 성장 인자 베타(TGFβ)/액티빈-노달 신호전달의 억제제, (b) 하나 이상의 BMP 신호전달의 활성화제, (c) 하나 이상의 Wnt 신호전달의 활성화제, 및 (d) 줄기 세포의 하나 이상의 신경 능선 계통 마커를 발현하는 분화된 세포 집단으로의 분화를 유도하기 위한 지침을 포함한다.
소정 구현예에서, 키트는 (a) 하나 이상의 전환 성장 인자 베타(TGFβ)/액티빈-노달 신호전달의 억제제, (b) 하나 이상의 BMP 신호전달의 활성화제, (c) 하나 이상의 FGF 신호전달의 활성화제, 및 (d) 줄기 세포의 하나 이상의 두개 기원판 계통 마커를 발현하는 분화된 세포 집단으로의 분화를 유도하기 위한 지침을 포함한다. 소정 구현예에서, 키트는 선택적으로 (e) 하나 이상의 Wnt 신호전달의 활성화제를 포함한다.
소정 구현예에서, 키트는 (a) 하나 이상의 전환 성장 인자 베타(TGFβ)/액티빈-노달 신호전달의 억제제, (b) 하나 이상의 BMP 신호전달의 활성화제, (c) 하나 이상의 FGF 신호전달의 억제제, 및 (d) 줄기 세포의 하나 이상의 비-신경 외배엽 계통 마커를 발현하는 분화된 세포 집단으로의 분화를 유도하기 위한 지침을 포함한다.
소정 구현예에서, 키트는 (a) 하나 이상의 전환 성장 인자 베타(TGFβ)/액티빈-노달 신호전달의 억제제, (b) 하나 이상의 BMP 신호전달의 활성화제 (c) 하나 이상의 SHH 신호전달의 활성화제, (d) 2개 이상의 FGF 신호전달의 활성화제, 및 (e) 줄기 세포의 하나 이상의 뇌하수체 세포 또는 뇌하수체 세포 전구체 마커를 발현하는 분화된 세포 집단으로의 분화를 유도하기 위한 지침을 포함한다.
소정 구현예에서, 본 개시는 본원에서 기재되는 방법에 따라 제조되는 줄기 세포-유도 전구체를 포함하는 키트를 제공한다. 소정 구현예에서, 줄기 세포-유도 세포는 분화된 성숙 세포이다.
소정 구현예에서, 상기 하나 이상의 TGFβ/액티빈-노달 신호전달의 억제제는 SB431542, 이의 유도체, 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 소분자이다. 소정 구현예에서, 상기 하나 이상의 Wnt 신호전달의 활성화제는 Wnt 신호전달의 활성화를 위해 글리코겐 합성효소 키나제 3β(GSK3)를 감소시킨다. 소정 구현예에서, 상기 하나 이상의 Wnt 신호전달의 활성화제는 CHIR99021, WNT3A, 이의 유도체, 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 소분자이다. 소정 구현예에서, 상기 FGF 신호전달의 활성화제는 FGF2, FGF8, FGF10, 이의 유도체, 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 소정 구현예에서, 상기 FGF 신호전달의 억제제는 SU5402, 이의 유도체, 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 소분자이다. 소정 구현예에서, 상기 BMP 신호전달의 활성화제는 BMP4, BMP2, 이의 유도체, 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 소정 구현예에서, SHH 신호전달의 활성화제는 Sonic hedgehog(SHH), C25II 및 smoothened(SMO) 수용체 소분자 작용제, 예컨대 푸르모르파민, 이의 유도체, 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다.
소정 구현예에서, 상기 인간 줄기 세포는 인간 배아 줄기 세포, 인간 유도된 다능성 줄기 세포, 인간 단성생식 줄기 세포, 원시 배 세포-유사 다능성 줄기 세포, 배아덩이위판 줄기 세포, 및 F-클래스 다능성 줄기 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다.
소정 구현예에서, 방법은 상기 분화된 세포 집단으로 상기 분화된 세포의 NC-유도 뉴런, CP-유도 뉴런, 또는 NNE-유도 세포 집단으로의 성숙을 선호하는 조건을 거치는 단계를 추가로 포함한다.
본원에서 개시되는 요지 사안은 SOX10을 포함하는 적어도 하나의 신경 능선 계통 마커를 발현하는 시험관내 분화된 세포 집단을 추가로 제공하며, 여기서 상기 분화된 세포 집단은 적어도 약 2일 또는 3일 동안 줄기 세포 집단을 하나 이상의 전환 성장 인자 베타(TGFβ)/액티빈-노달 신호전달의 억제제 및 하나 이상의 BMP 신호전달의 활성화제에 노출시키는 단계; 및 세포를 하나 이상의 Wnt 신호전달의 활성화제에 노출시키는 단계를 포함하는 방법에 따라 줄기 세포 집단으로부터 유도되며, 여기서 약 20% 미만의 분화된 세포 집단은 FOXG1, PAX6, SIX1, 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 검출가능한 수준의 적어도 하나의 마커를 발현한다. 본원에서 개시되는 요지 사안은 SIX1, PAX3, PITX3, 크리스탈린 알파(크리스탈린 alpha) A, 크리스탈린 알파 B, 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 두개 기원판 계통 마커를 발현하는 시험관내 분화된 세포 집단을 추가로 제공하며, 여기서 상기 분화된 세포 집단은 적어도 약 2일 또는 3일 동안 줄기 세포 집단을 하나 이상의 TGFβ/액티빈-노달 신호전달의 억제제 및 하나 이상의 BMP 신호전달의 활성화제에 노출시키는 단계; 및 세포를 하나 이상의 FGF 신호전달의 활성화제에 노출시키는 단계를 포함하는 방법에 따라 줄기 세포 집단으로부터 유도되며, 여기서 약 20% 미만의 분화된 세포 집단은 FOXG1, PAX6, SOX10, 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 검출가능한 수준의 적어도 하나의 마커를 발현한다.
본원에서 개시되는 요지 사안은 SIX1, PAX3, 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 삼차 기원판 계통 마커를 발현하는 시험관내 분화된 세포 집단을 추가로 제공하며, 여기서 상기 분화된 세포 집단은 적어도 약 2일 또는 3일 동안 줄기 세포 집단을 하나 이상의 TGFβ/액티빈-노달 신호전달의 억제제 및 하나 이상의 BMP 신호전달의 활성화제에 노출시키는 단계; 및 세포를 하나 이상의 Wnt 신호전달의 활성화제에 노출시키는 단계를 포함하는 방법에 따라 줄기 세포 집단으로부터 유도되며, 약 20% 미만의 분화된 세포 집단은 FOXG1, PAX6, SOX10, 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 검출가능한 수준의 적어도 하나의 마커를 발현한다.
본원에서 개시되는 요지 사안은 TFAP2A를 포함하는 적어도 하나의 이상의 비-신경 외배엽 계통 마커를 발현하는 시험관내 분화된 세포 집단을 추가로 제공하며, 여기서 상기 분화된 세포 집단은 적어도 약 2일 또는 3일 동안 줄기 세포 집단을 하나 이상의 TGFβ/액티빈-노달 신호전달의 억제제 및 하나 이상의 BMP 신호전달의 활성화제에 노출시키는 단계; 및 세포를 하나 이상의 FGF 신호전달의 억제제에 노출시키는 단계를 포함하는 방법에 따라 줄기 세포 집단으로부터 유도되며, 약 20% 미만의 분화된 세포 집단은 FOXG1, PAX6, SOX10, SIX1 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 검출가능한 수준의 적어도 하나의 마커를 발현한다.
소정 구현예에서, 세포는 약 600 nM 내지 약 1.5 μM의 농도로 하나 이상의 Wnt 신호전달의 활성화제에 노출된다. 소정 구현예에서, 세포는 약 10 ng/㎖ 내지 약 200 ng/㎖의 농도로 하나 이상의 FGF 신호전달의 활성화제에 노출된다. 소정 구현예에서, 세포는 약 1 μM 내지 약 20 μM의 농도로 하나 이상의 FGF 신호전달의 억제제에 노출된다. 소정 구현예에서, 줄기 세포는 약 1 μM 내지 약 20 μM의 농도로 하나 이상의 TGFβ/액티빈-노달 신호전달의 억제제, 및 약 0.01 ng/㎖ 내지 약 30 ng/㎖의 농도로 하나 이상의 BMP 신호전달의 활성화제에 노출된다. 소정 구현예에서, 세포는 약 2일 동안 약 10 ng/㎖ 또는 약 20 ng/㎖의 농도로 하나 이상의 BMP 신호전달의 활성화제에 이어, 약 5 ng/㎖의 농도로 하나 이상의 BMP 신호전달의 활성화제에 노출된다.
소정 구현예에서, 상기 하나 이상의 TGFβ/액티빈-노달 신호전달의 억제제는 SB431542, 이의 유도체, 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 소분자를 포함한다. 소정 구현예에서, BMP 신호전달의 활성화제는 BMP2, BMP4, BMP6, BMP7, 이의 유도체, 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 소정 구현예에서, 상기 하나 이상의 Wnt 신호전달의 활성화제는 CHIR99021, WNT3A, 이의 유도체, 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 소분자이다. 소정 구현예에서, 상기 하나 이상의 FGF 신호전달의 활성화제는 FGF2, 이의 유도체, 및 이의 혼합물을 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 FGF 신호전달의 억제제는 SU5402, 이의 유도체, 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 소분자이다.
본원에서 개시되는 요지 사안은 줄기 세포 집단을 적어도 약 2일 또는 3일 동안 하나 이상의 TGFβ/액티빈-노달 신호전달의 억제제 및 하나 이상의 BMP 신호전달의 활성화제에 노출시키는 단계; 및 세포를 하나 이상의 Wnt 신호전달의 활성화제에 노출시켜 적어도 하나의 신경 능선 계통 마커를 발현하는 분화된 세포의 세포 집단을 수득하는 단계를 포함하는, 줄기 세포의 분화를 유도하는 시험관내 방법을 추가로 제공한다.
본원에서 개시되는 요지 사안은 줄기 세포 집단을 적어도 약 2일 또는 3일 동안 하나 이상의 TGFβ/액티빈-노달 신호전달의 억제제 및 하나 이상의 BMP 신호전달의 활성화제에 노출시키는 단계; 및 세포를 하나 이상의 Wnt 신호전달의 활성화제에 노출시켜 적어도 하나의 두개 기원판 계통 마커를 발현하는 분화된 세포의 세포 집단을 수득하는 단계를 포함하는, 줄기 세포의 분화를 유도하는 시험관내 방법을 추가로 제공한다.
본원에서 개시되는 요지 사안은 줄기 세포 집단을 적어도 약 2일 또는 3일 동안 하나 이상의 TGFβ/액티빈-노달 신호전달의 억제제 및 하나 이상의 BMP 신호전달의 활성화제에 노출시키는 단계; 및 세포를 하나 이상의 Wnt 신호전달의 활성화제에 노출시켜 적어도 하나의 삼차 기원판 계통 마커를 발현하는 분화된 세포의 세포 집단을 수득하는 단계를 포함하는, 줄기 세포의 분화를 유도하는 시험관내 방법을 추가로 제공한다.
본원에서 개시되는 요지 사안은 줄기 세포 집단을 적어도 약 2일 또는 3일 동안 하나 이상의 TGFβ/액티빈-노달 신호전달의 억제제 및 하나 이상의 BMP 신호전달의 활성화제에 노출시키는 단계; 및 세포를 하나 이상의 Wnt 신호전달의 활성화제에 노출시켜 적어도 하나의 비-신경 외배엽 계통 마커를 발현하는 분화된 세포의 세포 집단을 수득하는 단계를 포함하는, 줄기 세포의 분화를 유도하는 시험관내 방법을 추가로 제공한다.
소정 구현예에서, 세포는 약 600 nM 내지 약 1.5 μM의 농도로 하나 이상의 Wnt 신호전달의 활성화제에 노출된다. 소정 구현예에서, 세포는 약 10 ng/㎖ 내지 약 200 ng/㎖의 농도로 하나 이상의 FGF 신호전달의 활성화제에 노출된다. 소정 구현예에서, 세포는 약 1 μM 내지 약 20 μM의 농도로 하나 이상의 FGF 신호전달의 억제제에 노출된다. 소정 구현예에서, 줄기 세포는 약 1 μM 내지 약 20 μM의 농도로 하나 이상의 TGFβ/액티빈-노달 신호전달의 억제제, 및 약 0.01 ng/㎖ 내지 약 30 ng/㎖의 농도로 하나 이상의 BMP 신호전달의 활성화제에 노출된다. 소정 구현예에서, 줄기 세포는 약 2일 동안 약 10 ng/㎖ 또는 약 20 ng/㎖의 농도로 하나 이상의 BMP 신호전달의 활성화제에 이어 약 5 ng/㎖의 농도로 하나 이상의 BMP 신호전달의 활성화제에 노출된다.
소정 구현예에서, 상기 하나 이상의 TGFβ/액티빈-노달 신호전달의 억제제는 SB431542, 이의 유도체, 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 소분자를 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 하나 이상의 BMP 신호전달의 활성화제는 BMP2, BMP4, BMP6, BMP7, 이의 유도체, 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 소정 구현예에서, 상기 하나 이상의 Wnt 신호전달의 활성화제는 CHIR99021, WNT3A, 이의 유도체, 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 소분자이다. 소정 구현예에서, 상기 하나 이상의 FGF 신호전달의 활성화제는 FGF2, 이의 유도체, 및 이의 혼합물을 포함한다. 소정 구현예에서, 상기 FGF 신호전달의 억제제는 SU5402, 이의 유도체, 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 소분자이다.
소정 구현예에서, 적어도 하나의 신경 능선 계통 마커는 SOX10을 포함한다. 소정 구현예에서, 적어도 하나의 두개 기원판 계통 마커는 SIX1, PAX3, PITX3, 크리스탈린 알파 A, 크리스탈린 알파 B, 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 소정 구현예에서, 적어도 하나의 삼차 기원판 계통 마커는 SIX1, PAX3, 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 소정 구현예에서, 적어도 하나의 비-신경 외배엽 계통 마커는 TFAP2A를 포함한다. 소정 구현예에서, 약 20% 미만의 분화된 세포 집단은 FOXG1, PAX6, SIX1, 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 검출가능한 수준의 적어도 하나의 마커를 발현한다.
본원에서 개시되는 요지 사안은 본원에서 기재되는 분화된 세포 집단을 포함하는 조성물을 추가로 제공한다. 소정 구현예에서, 조성물은 약학 조성물이고 약학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체를 포함한다.
본원에서 개시되는 요지 사안은 대상체에서 신경변성 장애 또는 뇌하수체 장애를 치료하는 방법을 추가로 제공한다. 소정 구현예에서, 방법은 대상체에 유효량의 본원에서 기재되는 분화된 세포 집단 또는 본원에서 기재되는 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함한다.
본원에서 개시되는 요지 사안은 대상체에서 신경변성 장애 또는 뇌하수체 장애를 치료하기 위한 본원에서 기재되는 분화된 세포 집단 또는 본원에서 기재되는 조성물을 추가로 제공한다.
본원에서 개시되는 요지 사안은 신경변성 장애 또는 뇌하수체 장애 치료용 약제의 제조에서 본원에서 기재되는 분화된 세포 집단 또는 본원에서 기재되는 조성물의 용도를 추가로 제공한다.
소정 구현예에서, 뇌하수체 장애는 뇌하수체저하 장애이다.
4. 도면의 간략한 설명
도 1a~1f는 다음을 나타낸다: (a) KSR 배지에서 인간 다능성 줄기 세포(hPSC)로부터 신경외배엽(NE), 신경 능선(NC), 두개 기원판(CP), 비-신경 외배엽(NNE)을 분화시키기 위한 프로토콜. (b) KSR에서 분화된 NE, NC, CP 및 NNE 중 SOX1, PAX6, TFAP2A, SOX10의 발현. (c, d) KSR 배지에서 인간 다능성 줄기 세포의 특정 세포 유형으로의 분화는 각각 평균 95%, 50% 및 58%의 NE, 기원판 및 NC를 생성하였다. (e) PAX6을 발현하는 세포의 백분율은 E6 배지에서 배양된 인간 다능성 줄기 세포에 대한 SB431542(SB) 또는 dSMADi(즉, SB 및 LDN193189)의 첨가 시 개선되었으며, 여기서 PAX6 양성 세포의 백분율은 각각 거의 90% 및 80%까지 증가되었다. (f) E6 배지 대비 KSR 배지에서 NC 운명으로 분화된 hPSC의 비교 유전자 발현 분석은 E6 배지에서 배양된 경우 비-신경 마커 발현의 부재를 드러내었다.
도 2a~2j는 다음을 나타낸다: (a) BMP 신호전달은 발생 중인 닭 배아에서 NNE 및 기원판의 형성에 중요한 것으로 나타났다(Groves and LaBonne, 2014). (b, c) TFAP2A 발현은 E6 배지에서 SB431542와 함께, 용량 의존적 방식으로 BMP 처리 3일 내에 신속하게 상향조절된다. (d) 20 ng/㎖ BMP로, 세포는 TFAP2A 양성이 되고 SOX10 및 SIX1의 발현이 손실되어 NNE가 강한 BMP 신호전달 활성화에 의해 유발됨을 시사한다. (e) hPSC의 SB, BMP 및 SU5402와의 배양은 NNE 전구체를 생성하였고, 이는 미성숙(K14 양성) 및 성숙(K18 양성) 표피 세포 마커를 발현하였다. (f) SB431542와 함께 3일 BMP 펄스로 hPSC의 SIX1 양성 CP 전구체로의 분화를 일으켰다. (g) hPSC의 분화 동안 SB431542 및 BMP를 포함하는 E6 배양으로, FGF8이 아닌 FGF2의 첨가는 SIX1 양성 CP 세포의 형성을 거의 50%까지 증강시켰다. (h, i) SIX1 양성 CP 전구체의 말단 분화(30일 동안 세포 배양에 의함)는 수정체 특이적 인자, 예컨대 PITX3, 크리스탈린 알파 A 및 B의 증가를 일으켰다. (j) E6 배지에서 SB431542, BMP 및 FGF2와 함께 Wnt 활성화에 대한 hPSC의 노출은 세포를 삼차 기원판 운명을 시사하는, SIX1 및 PAX3을 발현하는 CP 전구체로 분화시켰다.
도 3a~3c는 다음을 나타낸다: (a) 짧은 펄스의 BMP4(1 ng/㎖) 및 SB431542와 함께 Wnt 신호전달의 활성화는 거의 동종성인 SOX10 양성 NC 집단을 생성할 수 있었다. (b) E6 배지로 SB431542와 함께, Wnt 및 BMP 둘 다의 첨가는 TFAP2A 발현뿐만 아니라 비-신경 외배엽 운명의 또 다른 마커인 DLX3을 활성화하였다. (c) SOX10 양성 NC 전구체의 분화는 Isl1 및 Mash1 양성 발현에 의해 표시된 자율 및 감각 뉴런을 생성하였다.
도 4a~4f는 다음을 나타낸다: (a, b) 모든 4개 인간 외배엽 계통의 전사 발현 특징부. NE는 hESC와 가깝게 클러스터링된 반면, NNE는 모든 다른 외배엽 계통과 가장 멀리 떨어져 클러스터링되었다. NC 및 CP는 서로 가깝게 클러스터링되었다. (c d) 4개 외배엽 전구체는 유전자 실체론 분석을 거친, 상이한 유전자의 발현을 상향조절하고 하향조절한다(Edgar et al., 2013). 세포외 기질 재구성과 연관된 유전자는 모든 비-CNS 유도 세포 유형에서 유의미하게 농축되었다. NE와 연관된 실체론에는 시냅스 전파 및 신경계 발생이 관여된다. (e) CNS 및 비-CNS 운명 간에 공유되는 외배엽 분화 동안 특이적으로 상향조절되는 유전자에는 ANXA1, LGI1, NR2F2 및 ZNF503이 포함된다. 세포를 CNS 전구체와 구별하는 비-CNS 세포 전구체에 의해 발현되는 인자에는 NEUROG1, HAND1, TFAP2A 및 TFAP2B가 포함된다. (f) 4개 외배엽 계통의 세포는 유전자 발현에서도 차이를 나타내었다. NE에서, SOX1, Hes5 및 PAX6이 상향조절된 반면, 저수준 PAX6 전사체가 모든 다른 계통에서 확인될 수 있다. 고수준의 아연 핑거 단백질 ZNF229는 NC 계통에서 특이적으로 관찰되었다. ELAVL4 및 SMYD1은 각각 기원판 및 NNE에서 우선적으로 발현되었다.
도 5a~5d는 다음을 나타낸다: (a) hESC에서 TFAP2A 발현의 녹아웃은 고 BMP의 존재 하에 짧은 3일 유도 후 TFAP2A 발현의 손실을 일으켰다. (b) 야생형 hESC는 CP 또는 NNE 조건 하에 E-카드헤린을 발현하지 않는 TFAP2A 녹아웃 세포에 비해, CP 또는 NNE 조건 하에 분화 6일째에 E-카드헤린의 강력한 상향조절을 나타내었다. (c, d) NE의 분화는 PAX6 및 SOX1 발현에 의해 명백한 바와 같이, TFAP2A 녹아웃에 의해 영향받지 않았다. NC 및 CP 프로토콜이 야생형 세포 대비 TFAP2A 녹아웃 세포에서 SOX1 및 PAX6 발현 수준을 증가시키지 않았고, SOX10 및 SIX1 발현이 또한 검출되어, TFAP2A 발현의 제거가 비-CNS 세포 유형을 억제하는 데 충분하지 않음을 시사하였다.
도 6a~6e는 다음을 나타낸다: (a) CP 유도를 증강시키는 화합물을 확인하기 위해 Six1::H2B-GFP 리포터 세포주를 사용하여 약리 활성 화합물 라이브러리(LOPAC)를 사용하는 소분자 스크리닝. (b, c) 대조군 분화에서 관찰된 수준을 초과하여 SIX1 발현을 증가시킨 3개 후보 화합물: 세로토닌 수용체 작용제인 BRL-5443; NF-kB 및 STAT 매개된 확인 전사를 억제하는 능력을 가진 식물 호르몬인 파르테놀라이드; 및 메탈로프로테아제 억제제인 펜안트롤린이 확인되었다. (d) CP로의 분화는 다른 계통 마커, 예컨대 Sox10, T, MyoD 또는 Sox17의 발현을 유도하지 않고, 대조군 대비 펜안트롤린의 존재 하에 SIX1 발현의 5배 증가를 나타내었다. (e) FGF2의 부재 하에 CP 프로토콜에 대한 펜안트롤린의 첨가 시 SIX1 양성 세포는 거의 4배 증가하였다(69% 대 18%). FGF2, 또는 FGF2와 펜안트롤린의 첨가 후, SIX1 양성 세포의 농축은 각각 34% 및 46%까지 감소되었다.
도 7a~7b는 E6 배지에서 용량 의존적 BMP 노출을 포함하는 NE, NC, CP 및 NNE 전구체의 모듈식 생성을 위한 배양 프로토콜을 나타낸다. (A) NE의 생성은 변형 없이 KSR 및 E6 시스템 둘 다에서 강력하였다. (B) 최초 BMP 펄스로 NC, CP 및 NNE 운명의 분화가 증가되었다.
도 8a~8f는 PAX6::H2B-GFP 및 SIX1::H2B-GFP hESC 리포터 세포주의 생성을 나타낸다. 정의된 분화 배지 하에 이들 다양한 외배엽 계통 마커의 획득을 모니터링하기 위해, 본 실시예에서는 3개의 GFP 리포터 세포주, PAX6::H2B-GFP(a, b, c 및 d) SOX10::GFP 및 SIX1::H2B-GFP(a, b, e 및 f)를 사용하였다.
도 9a~9e는 다음을 나타낸다: (A) E6 배지의 존재 하에 사용된 KSR 분화 프로토콜. (B) hESC는 임의의 소분자 첨가 없이 E6에서 NE 전구체로 분화될 수 있지만, PAX6을 발현하는 세포의 백분율은 SB431542의 첨가 또는 dSMADi 시 각각 거의 90% 및 80%까지 추가 개선되었다. (c, d) NC 유도는 E6 배지에서 PAX6 양성 세포도 SOX10 양성 세포도 생성하지 않아, Wnt 활성화가 NC를 유도하기보다는 분화 세포의 영역 정체성을 변경할 수 있음을 시사하였다. (E) PAX6 양성 NE는 E6 배지에서 Tbr1 양성 피질 뉴런으로 효율적으로 추가 분화되었다.
도 10은 SB431542와 함께 BMP 신호전달의 3일 펄스가 E6 배지에서 SIX1 양성 CP 전구체를 생성하는 데 충분하였음을 나타낸다. 용량-반응 연구는 중등도 농도의 BMP4(약 5 ng/㎖)가 CP 유도를 일으킴을 나타내었다.
도 11은 SB431542와 함께 BMP 신호전달의 3일 펄스가 E6 배지에서 SOX10 양성 NC 전구체를 생성하는 데 충분하였음을 나타낸다. 용량-반응 연구는 저농도의 BMP4(약 1 ng/㎖)가 강한 NC 유도를 일으킴을 나타내었다.
도 12a~12c는 CRISPR/Cas9 시스템을 사용하는 TFAP2A 녹아웃 hESC의 생성을 나타낸다. (a, b) 2개의 가이드 RNA를 사용하여 TFAP2A에서 틀 이동 결실을 유도하였고, 양성 클론을 서열분석하여 결실의 정도 및 성질을 결정하였다. (c) TFAP2A 발현의 제거는 고 BMP의 존재 하에 짧은 3일 유도를 사용하여 확인하였고, 야생형 세포 대비 TFAP2A 발현을 유발하지 못했다.
도 13a~13b는 (a) BRL-5443 및 (b) 파르테놀라이드가 CP 프로토콜을 사용하여 hESC로부터 분화된 SIX1 발현 CP 전구체 세포의 수준을 증가시켰음을 나타낸다.
도 14a~14c는 (a) 매트리겔 기재(수천 가지 단백질로 이루어진 코팅 기재) 및 비트로넥틴 기재(하나의 재조합 단백질로 이루어진 코팅 기재)가 모두 고강력 유도 효율을 제공하였음을 나타낸다. 매트리겔(b) 및 비트로넥틴(c)을 모두 사용하여 50,000개 내지 300,000개 세포/㎠를 사용하는 분화는 세포 운명 결정에 영향을 미치지 않았다.
도 15a~15c는 화학적으로 정의된 조건을 사용하는 hPSC의 두개 기원판으로의 분화를 나타낸다. (a) 두개 기원판 생체내 발생 및 인간 다능성 줄기 세포의 유도된 분화를 위한 프로토콜의 모식도. (b) 핵심 두개 기원판(SIX1, EYA1), 비-신경 외배엽(TFAP2A, DLX3/5, GATA3) 유전자뿐만 아니라 가능한 오염물에 대해 탐침분석하는 유전자(SOX10, T, SOX17, MYOD)의 실시간 PCR 유전자 발현 시간 경과. 값을 GAPDH 및 분화 0일째(분화 배지로의 교체 직전)의 발현에 대해 정상화하며 4회의 독립적 분화로부터 평균 ± SEM으로 도시한다. (c) 두개 기원판 유도 프로토콜 및 LSB(신경외배엽)의 11일째에 단백질 발현을 비교하는 면역형광 분석. 축적 막대: 50 ㎛.
도 16a~16c는 전방 두개 기원판 유도 hPSC의 뇌하수체 특화를 나타낸다. (a) 뇌하수체샘 생체내 발생 및 인간 다능성 줄기 세포의 전방 뇌하수체-유사 세포로의 유도된 분화를 위한 프로토콜의 모식도. (b) 각각의 배지에서 분화 15일 후 LSB, 뇌하수체 조건 및 시상하부 신경외배엽에 의해 컨디셔닝된 배지(시상하부 CM)에서 뇌하수체 발생에 관여되는 핵심 유전자의 발현을 비교하는 실시간 PCR 분석. 값을 GAPDH 및 수정체 분화(E6 단독) 15일째의 유전자 발현에 대해 정상화하고 적어도 4회의 독립적 실험의 평균 ± SEM으로 도시한다. 15일째에 E6 단독 조건 대비 *: p < 0.05, **: p < 0.01, ***: p < 0.001. (c) 수정체 또는 뇌하수체 조건 하에 분화 15일 후 PITX1, LHX3의 발현뿐만 아니라 뇌하수체 분화 15일째에 HESX1 및 SIX3/6의 발현을 비교하는 면역형광 분석. 축적 막대: 50 ㎛.
도 17a~17c는 패턴화되지 않은 SIX1 정제 세포로부터의 뇌하수체 기원판 유도를 나타낸다. (a) 실험 개요의 모식도. hESC를 6일 동안 디폴트 조건 하에 분화시켰다. 패턴화되지 않은 SIX1+ 세포를 FACS 정제하고 다양한 조건에서 추가 9일 동안 배양하였다. 세포를 15일째에 분석하였다. (b) a에 기재된 3가지 조건에서 성장시킨 세포에서의 핵심 뇌하수체 유전자의 유전자 발현 분석. 값을 GAPDH 및 수정체 분화(E6 단독) 15일째의 유전자 발현에 대해 정상화하고 적어도 4회의 독립적 실험의 평균 ± SEM으로 도시한다. 15일째에 E6 단독 조건 대비 *: p < 0.05, **: p < 0.01. (c) 각각의 배지 조건에서 분화 9일 후 SIX1 정렬 세포의 면역형광 분석. 화살표는 공동-배양 조건에서 SIX1+ 세포에서의 LHX3 발현의 부재를 시사하였다. 축적 막대: 50 ㎛.
도 18a~18e는 전방 뇌하수체 세포의 기능적 특성규명을 나타낸다. (a) 분화 30일 후 전방 뇌하수체 세포의 면역형광 분석. 30일째에, 배양은 코르티코트로프(ACTH), 소마토트로프(GH) 및 고나도트로프(FSH, LH)를 함유한다. 축적 막대: 50 ㎛. (b) ELISA에 의해 평가되는, 분화 30일째의 시험관내 기본 호르몬 방출. 데이터를 3회의 독립적 실험의 평균 ± SEM으로 도시한다. 세포 비함유(분화 배지만 함유) 대비 *: p < 0.05, ***: p < 0.001, ****: p < 0.0001. (c~e) 호르몬 방출을 유발하는 화합물을 사용하여 시험관내 자극 24 h 후 호르몬 수준의 정량. ACTH 방출은 CRF, 스트레신 또는 유로코르틴에 의해서 특이적으로 유도되었으나, 소마토크리닌 또는 그렐린에 의해서는 유도되지 않았고(c), GH 방출은 소마토크리닌에 의해 유도되었으나 CRF에 의해서는 유도되지 않았고(d), FSH 방출은 나파렐린에 의해 유도되었다(e). 데이터를 3회의 독립적 실험의 평균 ± SEM으로 도시한다. 용매 대조군 대비 *: p < 0.05.
도 19a~19e는 시험관내 전방 뇌하수체 발생의 경시적 단세포 qRT-PCR 분석을 나타낸다. (a, b) 분화 30일(검은색) 및 60일(녹색)째에 단세포의 주성분 분석은 2개의 구별되는 세포 집단을 드러낸다. (c) 34개의 상이한 프라이머쌍을 사용하는 30일 및 60일 세포의 미감독 계층 클러스터링으로 선두 세포(60일 세포와 유사한 30일 세포)가 거의 없고 뒤에 남는 세포(여전히 30일 세포와 더 유사한 60일 세포)가 없는 2개의 세포 클러스터가 확인된다. (d) 30일 및 60일째의 호르몬 발현 세포의 정량뿐만 아니라 세포 당 1개 초과의 호르몬 전사체를 발현하는 세포의 백분율. (e) 각각 30일 및 60일째에 단세포 당 개별 호르몬의 발현.
도 20a~20e는 시험관내 뇌하수체의 호르몬 세포의 특화를 나타낸다. (a) 30일 동안 FGF8, FGF8/BMP2 또는 BMP2로 패턴화된 60일 세포의 벌크 qRT-PCR 분석. BMP2로의 패턴화는 보다 배쪽 세포 정체성(PIT1, GATA2, GH1, FSHB 및 LHB)을 유도한 반면 FGF8은 등쪽 세포 유형(FSHB)을 억제하였다. 데이터를 2~4회의 독립적 실험의 평균 ± SEM으로 도시한다. 60일째에 "디폴트" 뇌하수체 분화 대비 *: p < 0.05, **: p < 0.01, ***: p < 0.001. (b) 34개의 프라이머쌍을 사용하는 FGF8, FGF8/BMP2 및 BMP2 패턴화된 세포의 미감독 계층 클러스터링으로 3개의 더 큰 세포 클러스터를 확인하였고, 클러스터 2는 주로 FGF8(또는 FGF8/BMP2)에 의해 패턴화된 세포로 이루어졌고, 클러스터 3은 주로 BMP2(또는 FGF8/BMP2)에 의해 패턴화된 세포로 이루어졌다. (c) 상이한 패턴화 조건에서 세포 당 호르몬 전사체의 정량. 데이터를 각각의 전사체를 발현하는 세포의 백분율로 도시한다(적절한 용융 곡선과 함께 ct 35사이클 미만). (d) 분화 60일째에 FGF8, FGF8/BMP2 또는 BMP2로 패턴화된 세포에서 호르몬 발현의 면역형광 분석(대표 이미지). 축적 막대: 50 ㎛. (e) 분화 60일째에 상이한 패턴화 조건에서 호르몬 발현 세포(서브타입 별)의 정량. 고수준의 FGF8은 등쪽 운명(ACTH)을 유도한 반면 중간 수준의 FGF8 및 BMP2는 디폴트 조건(E6 단독) 대비 등쪽/배쪽 운명(PRL 및 GH)을 유도하였다. 데이터를 2회의 독립적 실험의 평균 ± SEM으로 도시한다. 60일째에 "디폴트"(E6 단독) 뇌하수체 분화 대비 *: p < 0.05, **: p < 0.01.
도 21a~21g는 hPSC-유도 전방 뇌하수체 세포의 생체내 생존 및 기능을 나타낸다. (a) 실험 레이아웃의 모식도. 뇌하수체 샘의 수술적 제거 및 뇌하수체저하증의 확인 후, 매트리겔에 포매된 세포를 피하 이식하였다. (b~e) ACTH(b), GH(c), LH(d) 및 코르티코스테론(e) 수준을 ELISA를 사용하여 세포 이식 후 최대 7주 동안 혈청 중에서 정량하였다. 데이터는 평균 ± SEM으로 도시하며 각각의 점은 개별 동물을 나타낸다. 대응하는 모의 대조군 대비 *: p < 0.05, **: p < 0.01. (f) 이식 7주 후 이식편의 면역조직학적 분석. 전방 뇌하수체 샘의 6개 호르몬 계통 각각에 대한 세포는 이식편 내에서 검출가능하였다. 축적 막대: 50 ㎛. (g) 이식 7주 후 ACTH를 발현하는 세포의 정량 및 대응하는 이식편 부피. 데이터를 평균 ± SEM으로 도시하며 각각의 점은 개별 동물을 나타낸다(총 3마리 동물).
도 22a~22c는 화학적으로 정의된 매질에서의 "디폴트" 조건이 수정체 기원판 특화를 일으킴을 나타낸다. (a) "디폴트" 조건(E6 단독) 하에 30일 분화 후, 수정체 마커 PAX6에 대해 양성으로 염색된 렌즈꼴체(명시야 이미지에서 원으로 표시한 구조)는 뚜렷이 확인 가능하다. 축적 막대: 50 ㎛. (b) 추가 90일의 분화(120일) 후, 대부분의 세포는 수정체에서 우세한 구조 단백질인 크리스탈린을 발현한다. 축적 막대: 50 ㎛. (c) 수정체 분화 동안 qRT-PCR 유전자 발현의 시간 경과. 120일 동안 분화된 세포는 수정체 특징적 전사체 PITX3, CRYAA 및 CRYAB를 발현한다. 값을 GAPDH 및 미분화 ES 세포에서의 발현에 대해 정상화하였고 4회의 독립적 연속 실험의 평균 +/- SEM으로 도시한다.
도 23a~23b는 리포터 세포주를 사용하는 뇌하수체 분화 내 외배엽 서브타입의 정량을 나타낸다. (a) 디폴트 기원판 또는 뇌하수체 조건 하에 6일 및 11일 동안 분화된 세포(상이한 리포터 세포주)를 SOX10, PAX6 또는 SIX1 발현에 대해 유세포 측정을 사용하여 분석하였다. 대표 유세포 측정 그래프를 백분율과 함께 나타낸다. (b) (a)로부터의 데이터 정량은 오염 신경 능선 세포(SOX10+)가 거의 없음을 드러내는 반면, 세포의 전방 두개 기원판 특징(SIX1+, PAX6+)을 확인시켜 준다. 데이터를 2~8회 독립적 실험의 평균 ± SEM으로 도시한다.
도 24a~24b는 hESC의 시상하부 외배엽으로의 분화를 나타낸다. (a) 뇌하수체 또는 시상하부 조건 하에 15일 동안 분화된 세포의 면역형광 비교. 세포를 FOXG1(뇌하수체) 또는 NKX2.1(시상하부)에 대해 염색하였다. 축적 막대: 50 ㎛. (b) NKX2.1 및 FOXG1에 대해 탐침분석하는 뇌하수체 또는 시상하부 외배엽 조건 하에 분화된 15일 세포의 qRT-PCR 분석. 값을 GAPDH 및 6일 기원판 세포에서의 발현에 대해 정상화하였고 2~4회 독립적 실험의 평균 ± SEM으로 도시한다.
도 25a~25e는 SIX1 녹-인 리포터 세포주의 생성을 나탄낸다. (a) eGFP 함유 리포터 카세트를 사용하는 내인성 SIX1 정지 코돈의 TALEN-기반 표적화 모식도. (b) SIX1 상동성 암(arm) 바로 밖의 게놈 영역에 어닐링하는 프라이머를 사용하는 표적화된 클론의 PCR 스크리닝. 클론 #6을 선택하여 연구에서 사용하였다. (c) 정상 여성(XX) 핵형을 나타내는 H9 SIX1H2B::GFP 클론 #6의 핵형그래프. (d) GFP에 대해 양성으로 및 음성으로 정렬된 기원판 조건 하에 6일 동안 분화된 SIX1H2B::GFP 세포에서의 SIX1 발현의 qRT-PCR 분석. 값을 GAPDH 및 동일한 실험으로부터의 비정렬 세포에 대해 정상화하고 2개의 기술적 반복물을 갖는 단회 실험의 평균 ± SEM으로 도시한다. (e) 내인성 SIX1(red) 및 내인성 SIX1 프로모터의 제어 하 GFP(녹색)에 대해 염색하는 11일 뇌하수체 세포의 면역형광 분석. 축적 막대: 50 ㎛.
도 26은 단세포 qRT-PCR을 사용하는 단세포에서의 호르몬 전사체의 정량을 나타낸다. "디폴트" 뇌하수체 분화 프로토콜의 30일 및 60일로부터의 단세포 PCR 데이터를 적어도 하나의 호르몬 전사체를 발현하는 세포에 대해 마이닝하였다. 데이터를 각각의 전사체(들)를 발현하는 세포의 백분율로 도시한다(적절한 용융 곡선을 가지며 ct 35사이클 미만).
도 27은 실시예 2의 단세포 qRT-PCR 실험에서 사용되는 프라이머 목록을 나타낸다.
도 28은 실시예 2에서 사용되는 항체 목록을 나타낸다.
도 29a~29b는 다능성 세포의 신경 능선 유도 세포로의 분화를 나타낸다. (a) 다능성 세포를 2일 동안 SB431542, BMP4 및 CHIR99021이 보충된 E6 배지에서(즉, E6 배지에서 d0부터 d2까지), 그리고 d2부터 d11까지 SB431542 및 CHIR이 보충된 E6 배지에서 배양하여 신경 능선 전구체 세포로 분화시켰다. (b) 신경 능선 전구체는 d25에 MASH1 및 ISL1을 발현하는 세포로 자연 분화되었다.
도 30a~30b는 전통적 KSR-기반 뇌하수체 유도와 새로운 cGMP-대비(ready) 유도의 비교를 나타낸다. KSR-기반 배지에서 영양공급세포 상에서 성장시킨 세포를 기존 Dincer 등의 프로토콜(PIP-KSR)을 사용하여 분화시켰다. KSR의 로트별 변동을 보상하기 위해, 2개 농도의 LDN-193189를 사용하였다. PIP-E6 프로토콜을 사용하여 영양공급세포-비함유 Essential8 조건 하에 성장시킨 세포를 병렬적으로 분화시켰다. (a) SIX1, TFAP2A, PAX6, PITX1, PITX2, PITX3 및 PITX4에 대해 탐침분석하는 PIP-KSR 및 PIP-E6 조건 하에 분화된 15일 세포의 qRT-PCR 분석. 값을 GAPDH 및 15일 PIP-E6 세포에서의 발현에 대해 정상화하였고 2회 독립적 실험의 평균 ± SEM으로 도시한다. (b) PIP-KSR 또는 PIP-E6 조건 하에 15일 동안 분화된 세포의 면역형광 비교. 세포를 SIX1(범 기원판) 또는 LHX3(범 뇌하수체)에 대해 염색하였다. 축적 막대: 50 ㎛.
도 31a~31e는 E8/E6에서 그리고 재조합 SHH를 소분자 smoothened 작용제로 대체하는 뇌하수체 유도 프로토콜의 세포주 비교를 나타낸다. 4개의 상이한 hESC 세포주(H9 SIX1::H2B-GFP 클론 #6 포함) 및 1개의 hiPSC 세포주를 cGMP-대비 뇌하수체 유도 프로토콜을 사용하여 병렬적으로 분화시켰다. (a) 범 기원판 마커 SIX1뿐만 아니라 범 전방 뇌하수체 유전자 PITX1, PITX2, LHX3 및 LHX4에 대해 탐침분석하는 뇌하수체 조건 하에 분화된 15일 세포의 qRT-PCR 분석. 값을 GAPDH 및 30일 wt H9 세포에서의 발현에 대해 정상화하였고 2~4회 독립적 실험의 평균 ± SEM으로 도시한다. (b) 2개의 전방 뇌하수체 호르몬 전사체 POMC 및 GH1에 대해 탐침분석하는 15일째의 뇌하수체 조건 하에 분화된 30일 세포의 qRT-PCR 분석. 값을 GAPDH 및 30일 wt H9 세포에서의 발현에 대해 정상화하였고 3회 독립적 실험의 평균 ± SEM으로 도시한다. (c) 상이한 hPSC 세포주에 걸쳐 뇌하수체 기원판 유도 15일째의 단백질 발현을 비교하는 면역형광 분석. 축적 막대: 50 ㎛. SHH가 소분자에 의해 대체될 수 있는지를 조사하기 위해, 세포를 재조합 SHH 또는 소분자 작용제 푸르모르파민 또는 SAG 중 하나를 FGF8 및 FGF10과 함께 사용하는 cGMP-대비 뇌하수체 기원판 유도 프로토콜을 사용하여 분화시켰다. 수정체 기원판 분화를 병렬적으로 수행하였고 음성 대조군으로 작용하였다. (d) 범 뇌하수체 유전자 PITX1, PITX2, LHX3, LHX4, HESX1뿐만 아니라 호르몬 전사체 POMC1 더불어 수정체 마커 PITX3에 대해 탐침분석하며, 4일째부터 SHH, 푸르모르파민 또는 SAG를 사용하는 뇌하수체 조건 하에 분화된, 15일 세포의 qRT-PCR 분석. 값을 GAPDH 및 15일 수정체 기원판에서의 발현에 대해 정상화하였고 3회 독립적 실험의 평균 ± SEM으로 도시한다. (e) SHH 및 소분자 대안 푸르모르파민 및 SAG를 사용하여 뇌하수체 기원판 및 수정체 유도 15일째의 단백질 발현을 비교하는 면역형광 분석. 초기 렌즈꼴체(원으로 표시한 구조)는 범 기원판 마커 SIX1의 발현을 하향조절하기 시작하는 반면, 뇌하수체 기원판은 LHX3의 발현과 함께 높은 SIX1 발현을 보유한다. 축적 막대: 50 ㎛.
도 32는 각각의 세포 및 단세포 q-RT PCR에 의해 수득된 유전자에 대한 미가공 ct 값의 열지도를 나타낸다. 모든 세포 및 모든 단세포 PCR 수행에 대해 수득된 유전자에 대한 미가공 ct 값을 미처리 열지도로 표시한다.
도 33은 단세포 q-RT PCR 결과의 면역형광 검증 및 단세포 qRT-PCR을 사용하는 단세포에서 호르몬 전사체의 정량을 나타낸다. 뇌하수체 조건 하에 분화된 15일 및 30일 세포의 면역형광 분석. 세포를 전구체 마커 HESX1 및 일시적 코르티코트로프 마커 NEUROD1에 대해 공동 염색하였다. 축적 막대: 50 ㎛.
도 34a~34b는 호르몬 서브클래스 특이적 마커를 확인하기 위한 표면 마커 스크리닝을 나타낸다. (a) 실험 절차의 모식도. (b) 스크리닝 결과의 열지도. 백분율은 각각의 마커에 대해 양성으로 염색되는 세포를 나타낸다.
도 35는 상해를 입지 않은 동물에서의 내인성 래트 호르몬 및 상해를 입은 동물에서의 이식편 유래 인간 호르몬의 비교를 나타낸다. 도 21a~g에 나타낸 이식편-유래 호르몬 수준(5주째)을 상해를 입지 않은 래트에서의 내인성 호르몬 수준과 비교한다.
도 36은 본원에서 개시되는 요지 사안의 소정 구현예에 따른 분화 방식을 나타낸다.
도 37a~37g는 BMP 신호전달이 NNE를 수득하기 위해 필요함을 나타낸다. (a) E6에 대한 KSR의 대체에 의한 분화 전략 다이어그램. (b) hPSC의 외배엽 계통으로의 분화 동안 특정 계통 마커의 대표적 면역형광 염색. (c) 특정 세포 운명에 영향을 미치는 신경판 경계 모델 및 중요한 신호전달 경로의 표시. (d) 3일 동안 다양한 농도의 BMP4로 처리된 분화 세포의 면역형광 염색. (e) 치료 3일 후 다양한 BMP4 농도에서 TFAP2A+ 세포의 정량. 값은 평균 ± SEM을 나타낸다. (f) TFAP2A+, PAX6-, SIX1-, 및 SOX10- NNE의 유도는 고농도의 BMP4(20 ng/㎖)를 사용하여 달성된다. (g) 상이한 두 시점에서 NNE의 추가 분화 시 각질세포 마커 K18 및 K14의 면역형광 염색. 축적 막대, 50 ㎛.
도 38a~38i는 BMP 구배가 NC 및 CP 세포를 유도하는 데 충분함을 나타낸다. (a) BMP4의 구배를 사용하는 SIX1::GFP+ 기원판의 발현. 군 내 각각의 막대는 독립적 반복물을 나타낸다. (b) 분화 동안 FGF2 또는 FGF8로의 세포 치료 후 SIX::GFP의 정량. (c) 분화에 따른 상이한 두 시점 동안의 전방 마커 PAX6 및 SIX3의 정량적 PCR. 값은 평균 ± SEM을 나타낸다. (d) 30일째에 수정체 기원판 배양에서 CRYAA 및 CRYAB의 면역형광 염색. (e) WNT 신호의 첨가 후 WNT 및 PAX3+ 삼차 기원판의 부재 하에 PAX6+ 수정체 기원판의 면역형광 염색. (f) BMP4의 구배를 사용하는 SOX10::GFP+ NC의 발현. 군 내 각각의 막대는 독립적 반복물을 나타낸다. (g) 3일 동안 600 nM CHIR을 함유하거나 함유하지 않고 다양한 농도의 BMP4로 처리된 분화 세포의 면역형광 염색. (h) 자연 분화된 NC 세포가 각각 자율 및 감각 뉴런을 나타내는 ASCL1 및 ISL1 뉴런을 생성하는 능력에 대한 면역형광 염색. (i) 글루타메이트에 대한 반응에 대해 분화된 감각 및 자율 뉴런 상에서 칼슘 조영을 수행하였다. 값은 평균 ± SEM을 나타낸다. 축적 막대, 50 mm.
도 39a~39b는 신규한 분화 전략이 다양한 인간 배아 및 유도된 PSC에 적용 가능함을 나타낸다. (a) 상이한 외배엽 계통을 표시하기 위한 검증된 항체의 하이-컨텐츠 조영을 위해 사용된 대표 이미지. (b) 특정 분화 동안 양성 세포 백분율의 정량. 생물학적 반복물(n = 4) 및 기술적 반복물(생물학적 반복물 당 n = 2)로 수행하고 정량하였다. 축적 막대, 50 ㎜.
도 40a~40j는 혈청 대체 조건에서 4개의 외배엽 계통으로의 hPSC의 분화가 영역 패턴화에 영향을 미침을 나타낸다. (a) 녹아웃 혈청 대체물을 사용하는 4개의 외배엽 계통으로의 분화를 위한 일반 전략 모식도. (b) 분화 말기(즉, 12일)에 세포 정체성을 구별하는 전사 인자 발현 조합. (c) 공여체 플라스미드의 Pax6 유전자위 내로의 표적화 모식도. (d) 리포터 트랜스유전자를 운반하는 클론을 확인하기 위한 게놈 DNA의 PCR. (e) 신경외배엽 형성 동안 Pax6 및 GFP에 대한 세포내 FACS. (f) 비정렬, Six1-GFP 양성 및 Six1-GFP 음성 세포에서 Six1에 대한 정량적 PCR. (g) 분화 12일째에 GFP의 PAX6, SIX1 및 SOX10 GFP 리포터 세포주 발현. (h) 특정 계통으로의 분화를 거치고 있는 GFP의 백분율 정량. (i) 몇몇 녹아웃 혈청 대체물 로트를 신경외배엽을 생성하는 능력에 대해 평가하였고(3개가 나타남), PAX6의 발현 및 줄기 세포 인자 OCT4의 하향조절에 대해 결정하였다. (j) i와 유사하게, SOX1의 발현은 KSR 로트 간에 일치하지만, 전방 마커 FOXG1은 WNT 억제제, XAV-939의 존재 하에서도 가변적이다. 축적 막대 50 ㎛.
도 41a~41g는 외배엽으로의 분화가 화학적으로 정의된 시스템에서 CNS로 편중됨을 나타낸다. (a) 소분자의 부재, SB의 첨가, 및 LDN과 SB의 첨가 하에 Pax6::GFP 양성 세포의 정량. (b) 로제트 단계 세포를 나타내는 ZO-1 및 SOX2의 면역형광 염색. (c) 로제트의 TUJ-1 및 TBR1로 염색된 뉴런으로의 분화. (d) 피질 뉴런(분화 50일째)은 글루타메이트에 대한 반응을 나타낸다. (e) 각각 신경 능선 및 기원판으로의 분화에서 SOX10 및 SIX1의 PAX6과의 면역형광. (f) e에서 PAX6::H2B-GFP 발현의 정량. (g) KSR 및 E6에서 신경 능선의 분화 동안 일반적인 최조기(immediate early) 유전자의 정량적 PCR.
도 42a~42d는 외배엽 계통으로의 분화 전략이 다른 다능성 줄기 세포주에 적용 가능함을 나타낸다. (a) 외배엽 분화에 대한 면역형광 염색의 대표 이미지. (b) 분화 동안 특정 마커에 대해 양성인 세포의 백분율에 대한 정량. (c) 본 연구에서 정제된 인간 신경 능선 세포 대비 정제된 닭 신경 능선의 데이터세트 비교 분석. 초기하 분포를 사용해서 중첩 유의성을 평가하였다. (d) c에서의 벤 다이어그램으로부터 공통된 유전자 목록. 축적 막대 50 ㎛.
도 43a~43h는 TFAP2A 녹아웃 세포의 검증 및 특성규명을 나타낸다. (a) TFAP2A를 표적화하는 가이드 RNA의 모식도. (b) 3개의 가능한 클론의 서열분석 결과는 2개가 틀이동 돌연변이(AP2A.10 및 AP2A.11)를 가졌으며 다른 클론(AP2A.4)이 하나의 대립유전자 상에 틀이동 돌연변이 및 다른 대립유전자 상에 9 bp를 보유함을 시사한다. (c) 3일 동안 20 ng/㎖ BMP4로 처리된 상이한 ES 클론에서 TFAP2A의 면역형광. (d) 웨스턴 블롯을 수행하여 BMP4 처리 3일 후 돌연변이체 세포주에서 단백질 발현의 손실을 검증하였다. (e) 12일째에 TFAP2A 발현이 부재하는 SOX10 양성 세포의 면역형광. (f) 12일째에 TFAP2A 발현이 부재하는 SIX1 양성 세포의 면역형광. (g) 야생형 대비 TFAP2A KO 세포로부터 NNE의 유도 동안 KRT16 및 WISP1 발현의 정량적 PCR 분석. (h) 중첩을 거의 실증하지 않는 Sox10 GFP 및 Six1-H2B GFP와 함께 TFAP2C의 면역형광 염색. 축적 막대 50 ㎛.
도 44a~44b는 화학적 스크리닝으로부터의 다른 히트 검증이 SIX1::GFP 발현에서 유의차를 생성하지 않았음을 나타낸다. (a) BRL-54443으로의 분화 기원판 세포의 처리 후 SIX1 발현의 정량. (b) a에서와 같이, 그러나 파르테놀라이드로 처리함.
5. 발명의 상세한 설명
본원에서 개시되는 요지 사안은 인간 줄기 세포의 하나 이상의 신경외배엽, 신경 능선, 두개 기원판, 또는 비-신경 외배엽 계통 마커를 발현하는 세포로의 분화를 유도하는 시험관내 방법, 및 이러한 방법에 의해 생성되는 세포, 그리고 이러한 세포를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 또한 신경변성 장애를 치료하기 위한 이러한 세포의 용도가 제공된다.
개시의 명확성을 목적으로 그리고 비제한적으로, 상세한 설명은 하기 하위섹션으로 구분된다:
5.1. 정의;
5.2. 줄기 세포를 분화시키는 방법;
5.3 분화된 세포 집단을 포함하는 조성물;
5.4. 신경변성 및 뇌하수체 장애를 치료하는 방법;
5.5. 키트;
5.6 치료 화합물을 스크리닝하는 방법; 및
5.7 NE, NC, CP 또는 NNE 운명을 증가시키는 화합물을 스크리닝하는 방법.
5.1 정의
본 명세서에서 사용되는 용어는 일반적으로 본 발명의 맥락 내에서 그리고 각각의 용어가 사용되는 구체적 맥락에서, 당분야에서의 이의 일반적인 의미를 갖는다. 소정 용어가 아래에서, 또는 명세서의 다른 곳에서 논의되어 본 발명의 조성물 및 방법을 실시자에게 설명하고 이를 어떻게 제조하고 사용하는지에 대한 추가 안내를 제공한다.
용어 "약" 또는 "대략"은 당업자에 의해 결정되는 특정 값에 대한 허용가능한 오차 범위 내임을 의미하며, 이는 부분적으로 그 값이 어떻게 측정되는지 또는 결정되는지, 즉, 측정 시스템의 한계에 의존할 것이다. 예를 들어, "약"은 당분야에서의 실시에 따라 표준 편차 3 이내 또는 그 초과를 의미할 수 있다. 대안적으로, "약"은 주어진 값의 최대 20%, 예로, 최대 10%, 최대 5%, 또는 최대 1% 범위를 의미할 수 있다. 대안적으로, 특히 생물학적 시스템 또는 공정에 대해, 이 용어는 값의 10-배 크기 이내, 예로 5-배 이내, 또는 2-배 이내를 의미할 수 있다.
"신호 전달 단백질"에 대해 본원에서 사용되는 용어 "신호전달"은 막 수용체 단백질에 대한 리간드 결합 또는 일부 다른 자극에 의해 활성화되거나 달리 영향을 받는 단백질을 나타낸다. 신호 전달 단백질의 예에는 비제한적으로 SMAD, 베타-카테닌을 포함하는 wingless(Wnt) 복합체 단백질, NOTCH, 전환 성장 인자 베타(TGFβ), 액티빈, 노달, 글리코겐 합성효소 키나제 3β(GSK3β) 단백질, 뼈 형태형성 단백질(BMP) 및 섬유아세포 성장 인자(FGF)가 포함된다. 여러 세포 표면 수용체 또는 내부 수용체 단백질에 있어서, 리간드-수용체 상호작용은 세포의 반응에 직접 연관되지 않는다. 리간드 활성화된 수용체는 세포의 거동에 대한 리간드의 궁극적인 생리적 효과가 생성되기 전에 먼저 세포 내부의 다른 단백질과 상호작용할 수 있다. 종종, 몇몇 상호작용 세포 단백질의 연쇄 거동이 수용체 활성화 또는 억제 후 변경된다. 수용체 활성화에 의해 유도된 전체 세포 변화 세트가 신호 전달 메커니즘 또는 신호전달 경로로 불린다.
본원에서 사용되는 용어 "신호"는 세포 구조 및 기능에서 변화를 제어하는 내부 및 외부 인자를 나타낸다. 이들은 성질 상 화학적이거나 물리적일 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "리간드"는 수용체에 결합하는 분자 및 단백질, 예로, 전환 성장 인자 베타(TFGβ), 액티빈, 노달, 뼈 형태형성 단백질(BMP) 등을 나타낸다.
본원에서 사용되는 "억제제"는 분자 또는 경로의 신호 전달 기능을 방해하는(예로, 감소시키는, 줄이는, 억제하는, 제거하는, 또는 차단하는) 화합물 또는 분자(예로, 소분자, 펩타이드, 펩타이드 모사체, 천연 화합물, siRNA, 안티-센스 핵산, 앱타머, 또는 항체)를 나타낸다. 억제제는 언급된 단백질의 임의의 활성(신호전달 분자, 언급된 신호전달 분자에 관여되는 임의의 분자, 언급된 연관 분자, 예컨대 글리코겐 합성효소 키나제 3β(GSK3β))(예로, 비제한적으로 본원에서 기재되는 신호전달 분자 포함)을 변화시키는 임의의 화합물 또는 분자일 수 있다. 예를 들어, SMAD 신호전달의 억제제는 일례로, SMAD 신호전달과 직접 접촉함으로써, SMAD mRNA와 접촉함으로써, SMAD의 입체형태 변화를 유도함으로써, SMAD 단백질 수준을 줄임으로써, 또는 신호전달 파트너(예로, 본원에서 기재되는 것들 포함)와의 SMAD 상호작용을 방해함으로써, 그리고 SMAD 표적 유전자(예로, 본원에서 기재되는 것들)의 발현에 영향을 미침으로써, 기능할 수 있다. 억제제에는 또한 상류 신호전달 분자(예로, 세포외 도메인 내)를 인터셉트함으로써 SMAD의 생물학적 활성을 간접적으로 조절하는 분자가 포함된다. SMAD 신호전달 억제제 분자 및 효과의 예에는 ALK 수용체 1, 2, 3, 및 6의 활성화를 억제하여 하류 SMAD 활성화를 방지하는 뼈 형태형성 단백질을 격리하는 Noggin이 포함된다. 마찬가지로, Chordin, Cerberus, Follistatin은 SMAD 신호전달의 세포외 활성화제를 유사하게 격리한다. 막통과 단백질인 Bambi도 세포외 TGFβ 신호전달 분자를 격리하기 위한 가(pseudo)-수용체로서 작용한다. 다른 SMAD 억제제에는 도르소모르핀(dorsomorphin)이 포함된다. 액티빈, 노달, TGFb, 및 BMP를 차단하는 항체가 SMAD 신호전달 등의 세포외 활성화제를 중화시키기 위한 용도에 대해 고려된다. 상기 예는 SMAD 신호전달 억제에 관한 것이지만, 유사하거나 비슷한 메커니즘이 다른 신호전달 분자를 억제하기 위해 사용될 수 있다. 억제제의 예에는 비제한적으로 SMAD 신호전달 억제를 위한 LDN193189(LDN) 및 SB431542(SB)(LSB), Wnt 억제를 위한 XAV939(X), 및 FGF 신호전달 억제를 위한 SU5402(S)가 포함된다.
결합에 의해 유도되고 언급된 신호전달 분자로부터의 상류 분자에 영향을 미쳐, 다시 언급된 분자의 억제를 유도하는 억제에 부가하여, 억제제는 경쟁적 억제(또 다른 알려진 결합 단백질의 결합을 배제하거나 감소시키는 방식으로 활성 부위에 결합함) 및 알로스테릭 억제(그 단백질의 활성 부위에 대한 화합물의 결합을 방해하는 방식으로 단백질 입체형태를 변화시키는 방식으로 단백질에 결합함)의 관점에서 설명된다. 억제제는 신호전달 표적에 실제로 접촉함으로써 신호전달 표적 또는 신호전달 표적 경로를 억제하는 "직접적 억제제"일 수 있다.
본원에서 사용되는 "활성화제"는 분자 또는 경로의 신호전달 기능, 예로, Wnt 신호전달, BMP 신호전달, FGF 신호전달 등의 활성화를 증가시키거나, 유도하거나, 자극하거나, 활성화하거나, 촉진하거나, 증강시키는 화합물을 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "유도체"는 유사한 코어 구조를 갖는 화학적 화합물을 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "세포의 집단" 또는 "세포 집단"은 적어도 2개 세포의 그룹을 나타낸다. 비제한적 예에서, 세포 집단에는 적어도 약 10개, 적어도 약 100개, 적어도 약 200개, 적어도 약 300개, 적어도 약 400개, 적어도 약 500개, 적어도 약 600개, 적어도 약 700개, 적어도 약 800개, 적어도 약 900개, 적어도 약 1000개 세포, 적어도 약 5,000개 세포 또는 적어도 약 10,000개 세포 또는 적어도 약 100,000개 세포 또는 적어도 약 1,000,000개 세포가 포함될 수 있다. 집단은 하나의 세포 유형을 포함하는 순수한 집단, 예컨대 NE, CP, NC 또는 NNE 전구체 집단, 또는 미분화 줄기 세포의 집단일 수 있다. 대안적으로, 집단은 하나를 초과하는 세포 유형, 예를 들어 혼합된 세포 집단을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "줄기 세포"는 배양에서 무한한 기간 동안 분열하며 특화된 세포를 생성하는 능력을 갖는 세포를 나타낸다. 인간 줄기 세포는 인간으로부터 유도되는 줄기 세포를 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "배아 줄기 세포" 및 "ESC"는 배양에서 연장된 기간 동안 분화하지 않고 분열할 수 있는, 착상-전 단계 배아로부터 유도되며 3개의 일차 배엽층의 세포 및 조직으로 발생하는 것으로 알려져 있는 원시(미분화) 세포를 나타낸다. 인간 배아 줄기 세포는 인간으로부터 유도되는 배아 줄기 세포를 나타낸다. 본원에서 사용되는 용어 "인간 배아 줄기 세포" 또는 "hESC"는 배양에서 연장된 기간 동안 분화하지 않고 분열할 수 있고 3개의 일차 배엽층의 세포 및 조직으로 발생하는 것으로 알려져 있는, 최대로 포배 단계까지를 포함하는 초기 단계 인간 배아로부터 유도되는 다능성 줄기 세포의 한 유형을 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "배아 줄기 세포주"는 최대 수 일, 수 개월 내지 수 년 동안 분화하지 않고 증식하는 것을 허용하는 시험관내 조건 하에 배양된 배아 줄기 세포 집단을 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "만능"은 신체의 모든 세포 유형에 더하여 배아외 조직, 예컨대 태반을 이루는 모든 세포 유형을 생성하는 능력을 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "다능"은 신체의 하나를 초과하는 세포 유형으로 발생하는 능력을 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "다능성"은 내배엽, 중배엽, 및 외배엽을 포함하는 유기체의 3개 발생 배엽층으로 발생하는 능력을 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "유도된 다능성 줄기 세포" 또는 "iPSC"는 체세포, 예를 들어 CI 4, C72 등으로의 소정 배아 유전자(예컨대 OCT4, SOX2, 및 KLF4 트랜스유전자)의 도입에 의해 형성되는, 배아 줄기 세포와 유사한 다능성 줄기 세포의 한 유형을 나타낸다(예를 들어, 본원에 참조로 포함되는 문헌[Takahashi and Yamanaka Cell 126, 663-676 (2006)] 참고).
본원에서 사용되는 용어 "체세포"는 생식세포(난자 또는 정자) 이외의 체내의 모든 세포를 나타내며; 때때로 "성체" 세포로 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "신체(성체) 줄기 세포"는 자가-재생(실험실에서) 및 분화 모두에 대해 제한된 능력을 갖는 여러 기관 및 분화된 조직에서 확인되는 상대적으로 드문 미분화 세포를 나타낸다. 이러한 세포는 이의 분화능이 다양하지만, 보통 기원 기관에서의 세포 유형으로 제한된다.
본원에서 사용되는 용어 "뉴런"은 신경계의 기본적인 기능 단위인 신경 세포를 나타낸다. 뉴런은 세포체 및 그 돌기-축삭 및 하나 이상의 가지돌기로 구성된다. 뉴런은 시냅스에서 신경전달물질을 방출함으로써 다른 뉴런 또는 세포로 정보를 전달한다.
본원에서 사용되는 용어 "증식"은 세포수 증가를 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "미분화"는 아직 특화된 세포 유형으로 발생되지 않은 세포를 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "분화"는 특화되지 않은 배아 세포가 특화된 세포, 예컨대 심장, 간, 또는 근육 세포의 특성을 획득하는 공정을 나타낸다. 분화는 보통, 세포 표면에 포매된 단백질이 관여되는 신호전달 경로를 통해, 세포 유전자와 세포 밖의 물리적 및 화학적 조건의 상호작용에 의해 제어된다.
본원에서 사용되는 용어 "유도된 분화"는 특정(예를 들어, 요망되는) 세포 유형, 예컨대 신경, 신경 능선, 두개 기원판, 및 비-신경 외배엽 전구체로의 분화를 유도하는 줄기 세포 배양 조건의 조작을 나타낸다.
줄기 세포에 대해 본원에서 사용되는 용어 "유도된 분화"는 줄기 세포의 다능성 상태로부터 보다 성숙하거나 특화된 세포 운명으로의 전환을 촉진하는 소분자, 성장 인자 단백질, 및 다른 성장 조건의 사용을 나타낸다.
세포에 대해 본원에서 사용되는 용어 "분화 유도"는 디폴트 세포 유형(유전형 및/또는 표현형)의 비-디폴트 세포 유형(유전형 및/또는 표현형)으로의 변화를 나타낸다. 따라서, "줄기 세포에서의 분화 유도"는 줄기 세포(예로, 인간 줄기 세포)가 줄기 세포와 상이한 특징, 예컨대 유전형(예로, 유전 분석, 예컨대 마이크로어레이에 의해 결정되는 유전자 발현의 변화) 및/또는 표현형(예로, 단백질, 예컨대 SOX1, PAX6, SOX10, SIX1, PITX3, 및 TFAP2A의 발현 변화)을 갖는 자손 세포로 분열하도록 하는 유도를 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "세포 배양"은 연구 또는 의학적 치료를 위한 인공 배지에서의 시험관내 세포 성장을 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "배양 배지"는 배양 용기, 예컨대 페트리 플레이트, 멀티-웰 플레이트 등에서 세포를 덮고, 세포에 영양을 공급하고 세포를 지지하는 영양소를 함유하는 액체를 나타낸다. 배양 배지에는 또한 세포에서 요망되는 변화를 생성하기 위해 첨가된 성장 인자가 포함될 수 있다.
본원에서 사용되는 세포를 화합물(예로, 하나 이상의 억제제, 활성화제, 및/또는 유도제)과 "접촉시키는"이라는 용어는 화합물에 대한 세포 노출, 예를 들어 화합물이 세포를 터치할 수 있도록 할 위치에 이를 배치하는 것을 나타낸다. 접촉은 임의의 적합한 방법을 사용하여 달성될 수 있다. 예를 들어, 접촉은 화합물을 세포의 튜브에 첨가하여 달성될 수 있다. 접촉은 또한 화합물을 세포를 포함하는 배양 배지에 첨가하여 달성될 수 있다. 각각의 화합물(예로, 본원에서 개시되는 억제제 및 활성화제)은 용액(예로, 농축된 용액)으로서 세포를 포함하는 배양 배지에 첨가될 수 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, 세포뿐만 아니라 화합물(예로, 본원에서 개시되는 억제제 및 활성화제)이 제형화된 세포 배양 배지에 존재할 수 있다.
유효량은 요망되는 효과를 생성하는 양이다.
본원에서 사용되는 용어 "시험관내"는 인공 환경 및 인공 환경 내에서 일어나는 공정 또는 반응을 나타낸다. 시험관내 환경은 비제한적으로 시험관 및 세포 배양으로 예시된다.
본원에서 사용되는 용어 "생체내"는 천연 환경(예로, 동물 또는 세포) 및 천연 환경 내에서 일어나는 공정 또는 반응, 예컨대 배아 발생, 세포 분화, 신경관 형성 등을 나타낸다.
유전자 또는 단백질에 관해 본원에서 사용되는 용어 "발현"은 검정, 예컨대 마이크로어레이 검정, 항체 염색 검정 등을 사용해서 관찰될 수 있는 mRNA 또는 단백질의 제조를 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "마커" 또는 "세포 마커"는 특정 세포 또는 세포 유형을 확인시켜주는 유전자 또는 단백질을 나타낸다. 세포에 대한 마커는 하나의 마커에 제한되지 않을 수 있고, 마커는 지정된 마커 그룹이 하나의 세포 또는 세포 유형을 또 다른 세포 또는 세포 유형으로부터 확인시켜줄 수 있도록 하는 마커 "패턴"을 나타낼 수 있다.
본원에서 개시되는 임의의 세포에 대해 수행되는 경우, 본원에서 사용되는 용어 "로부터 유도되는" 또는 "로부터 확립되는" 또는 "로부터 분화되는"은 임의의 조작, 예컨대, 비제한적으로, 시험관내 배양된, 단세포 단리, 예를 들어 단백질, 화학물질, 방사선, 바이러스로의 감염, DNA 서열로의, 예컨대 형태원 등으로의 전달감염을 사용하는 처리 및/또는 돌연변이화, 배양된 모체 세포에 함유되는 임의의 세포의 선택(예컨대 연속 배양에 의해)을 사용하여 세포주, 조직(예컨대 해리된 배아), 또는 유체 내의 모체 세포로부터 수득된(예로, 단리된, 정제된 등) 세포를 나타낸다. 유도된 세포는 성장 인자, 사이토카인, 사이토카인 처리의 선택된 진행에 대한 반응, 접착성, 접착성의 부재, 정렬 절차 등에 의해 혼합된 집단으로부터 선택될 수 있다.
본원에서 "개체" 또는 "대상체"는 척추동물, 예컨대 인간 또는 비-인간 동물, 예를 들어, 포유류이다. 포유류에는 비제한적으로 인간, 영장류, 농장 동물, 스포츠 동물, 설치류 및 애완동물이 포함된다. 비-인간 동물 대상체의 비제한적 예에는 설치류, 예컨대 마우스, 래트, 햄스터, 및 기니아픽; 토끼; 개; 고양이; 양; 돼지; 염소; 소; 말; 및 비-인간 영장류, 예컨대 유인원 및 원숭이가 포함된다.
본원에서 사용되는 용어 "질환"은 세포, 조직, 또는 기관의 정상 기능을 손상시키거나 방해하는 임의의 상태 또는 장애를 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "치료하는" 또는 "치료"는 치료받는 개체 또는 세포의 질환 경과를 변경하려는 시도의 임상적 개입을 나타내며, 예방을 위해 또는 임상 병리 경과 동안 수행될 수 있다. 치료의 치료적 효과에는, 비제한적으로, 질환의 발생 또는 재발 방지, 증상의 경감, 질환의 임의의 직접적인 또는 간접적인 병리적 결과의 약화, 전환 방지, 질환 진행 속도의 감소, 질환 상태의 완화 또는 일시적 억제, 및 면제 또는 개선된 예후가 포함된다. 질환 또는 장애의 진행을 방지함으로써, 치료는 영향받거나 진단받은 대상체 또는 장애를 갖는 것으로 추정되는 대상체에서 장애로 인한 악화를 방지할 수 있지만, 또한 치료는 장애에 대한 위험에 처한 또는 장애를 갖는 것으로 추정되는 대상체에서 장애의 개시 또는 장애의 증상을 방지할 수 있다.
5.2 줄기 세포를 분화시키는 방법
본원에서 개시되는 요지 사안은 줄기 세포(예로, 인간 줄기 세포)의 분화를 유도하는 시험관내 방법을 제공한다. 인간 줄기 세포의 비제한적 예에는 인간 배아 줄기 세포(hESC), 인간 다능성 줄기 세포(hPSC), 인간 유도된 다능성 줄기 세포(hiPSC), 인간 단성생식 줄기 세포, 원시 생식 세포-유사 다능성 줄기 세포, 배아덩이위판 줄기 세포, F-클래스 다능성 줄기 세포, 신체 줄기 세포, 암 줄기 세포, 또는 계통 특이적 분화가 가능한 임의의 다른 세포가 포함된다. 소정 구현예에서, 인간 줄기 세포는 인간 배아 줄기 세포(hESC)이다. 소정 구현예에서, 인간 줄기 세포는 인간 유도된 다능성 줄기 세포(hiPSC)이다.
본원에서 개시되는 요지 사안은 적어도 부분적으로 신경 능선(NC), 두개 기원판(CP) 및 비-신경 외배엽(NNE)의 비-CNS 외배엽 계통이 BMP 신호전달의 활성화에 따른 SMAD 신호전달의 억제에 의해 인간 줄기 세포로부터 분화될 수 있다는 발견에 기반하며, 여기서 BMP 신호전달은 유효량의 하나 이상의 SMAD 억제제 및 BMP 활성화제에 대한 세포의 최초 접촉 후 적어도 2일 동안 활성화되며, 세포는 유효량의 하나 이상의 NC, CP 또는 NNE 계통 특이적 활성화제 및 억제제와 추가 접촉된다. 예를 들어, 줄기 세포는 세포를 유효량의 하나 이상의 Wnt 활성화제와 추가 접촉시켜 NC로 분화될 수 있고; CP는 줄기 세포를 유효량의 하나 이상의 FGF의 활성화제와 추가 접촉시켜 줄기 세포로부터 분화될 수 있고; NNE는 줄기 세포를 유효량의 하나 이상의 FGF의 억제제와 추가 접촉시켜 줄기 세포로부터 분화될 수 있다.
소정 구현예에서, 본원에서 개시되는 분화 방법은 인간 줄기 세포 집단을 유효량의 하나 이상의 전환 성장 인자 베타(TGFβ)/액티빈-노달 신호전달의 억제제와 접촉시키는 단계를 포함하며, 이는 SMAD(Small Mothers Against Decapentaplegic) 신호전달의 억제를 일으킨다. 소정 구현예에서, TGFβ/액티빈-노달 신호전달의 억제제는 TGFβ, 뼈 형태형성 단백질(BMP), 노달, 및 액티빈을 포함하는 리간드를 중화시키거나, 수용체 및 하류 효과기의 차단을 통해 이의 신호 경로를 차단한다.
TGFβ/액티빈-노달 신호전달의 억제제의 비제한적 예는 이의 전문이 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함되는 WO/2010/096496, WO/2011/149762, WO/2013/067362, WO/2014/176606, WO/2015/077648, 문헌[Chambers et al., Nature Biotechnology 27, 275-280 (2009), 및 Chambers et al., Nature biotechnology 30, 715-720 (2012)]에 개시된다. 소정 구현예에서, 하나 이상의 TGFβ/액티빈-노달 신호전달의 억제제는 SB431542, 이의 유도체, 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 소분자이다. "SB431542"는 번호 CAS 301836-41-9, 분자식 C22H18N4O3, 및 명칭 4-[4-(1,3-벤조디옥솔-5-일)-5-(2-피리디닐)-1H-이미다졸-2-일]-벤즈아미드를 갖는 분자를 나타내며, 예를 들어 아래의 구조를 참고한다:
Figure pct00001
.
5.2.1 신경 능선(NC) 전구체를 분화시키는 방법
소정 구현예에서, 본원에서 개시되는 요지 사안은 인간 줄기 세포의 비-CNS 전구체로의 분화를 유도하는 시험관내 방법을 제공하며, 여기서 비-CNS 전구체는 신경 능선(NC) 전구체이다. 소정 구현예에서, 방법은 인간 줄기 세포 집단을 유효량의 하나 이상의 TGFβ/액티빈-노달 신호전달의 억제제, 유효량의 하나 이상의 BMP 신호전달의 활성화제(예를 들어, 약 1 ng/㎖의 농도로), 및 유효량의 하나 이상의 wingless(Wnt) 신호전달의 활성화제와 접촉시키는 단계를 포함한다.
소정 구현예에서, BMP 활성화제는 적어도 약 2일, 적어도 약 3일, 적어도 약 4일, 또는 적어도 약 5일 동안, 또는 최대 약 2일, 최대 약 3일, 최대 약 4일, 최대 약 5일 이상 동안 세포와 접촉된다. 특정 구현예에서, BMP 활성 제제는 적어도 약 2일 동안 세포와 접촉된다.
소정 구현예에서, Wnt 신호전달의 활성화제 및 TGFβ/액티빈-노달 신호전달의 억제제는 세포와 동시에 접촉된다. 소정 구현예에서, Wnt 신호전달의 활성화제 및 TGFβ/액티빈-노달 신호전달의 억제제는 적어도 약 6일, 적어도 약 7일, 적어도 약 8일, 적어도 약 9일, 적어도 약 10일, 적어도 약 11일, 적어도 약 12일 이상 동안 세포와 접촉된다. 소정 구현예에서, Wnt 신호전달의 활성화제 및 TGFβ/액티빈-노달 신호전달의 억제제는 최대 약 6일, 최대 약 7일, 최대 약 8일, 최대 약 9일, 최대 약 10일, 최대 약 11일, 최대 약 12일 이상 동안 세포와 접촉된다. 특정 구현예에서, 세포는 약 12일 이상 동안 Wnt 활성화제 및 TGFβ/액티빈-노달 신호전달의 억제제와 접촉된다.
소정 구현예에서, Wnt 활성화제의 농도는 세포가 Wnt 신호전달 활성화제와 최초 접촉된 후 약 2일, 또는 약 3일, 또는 약 4일 후 증가된다. 소정 구현예에서, Wnt 신호전달 활성화제의 농도는 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100%만큼 증가된다. 특정 구현예에서 Wnt의 농도는 세포의 Wnt 활성화제에 대한 접촉 2일 후 약 50% 만큼 증가된다.
소정 구현예에서, 세포는, 예를 들어, TGFβ/액티빈-노달 신호전달의 억제제와 최초 접촉된 후 약 12일 후 검출가능한 수준의 SOX10을 발현한다. 소정 구현예에서, 세포는 적어도 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50% 또는 약 60% 이상의 세포가 검출가능한 수준의 SOX10을 발현하도록 하는 시기 동안 유효량의 상기 제제와 접촉된다.
소정 구현예에서, 세포는 약 1 μM 내지 약 20 μM, 약 2 μM 내지 약 18 μM, 약 4 μM 내지 약 16 μM, 약 6 μM 내지 약 14 μM, 또는 약 8 μM 내지 약 12 μM의 농도로 전환 성장 인자 베타(TGFβ)/액티빈-노달 신호전달의 억제제와 접촉된다. 특정 구현예에서, 세포는 약 10 μM의 농도로 전환 성장 인자 베타(TGFβ)/액티빈-노달 신호전달의 억제제와 접촉된다.
소정 구현예에서, 상기 BMP 신호전달의 활성화제는 BMP2, BMP4, BMP6, BMP7, 이의 유도체, 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 소정 구현예에서, BMP 신호전달의 활성화제는 약 0.01 ng/㎖ 내지 약 5 ng/㎖, 약 0.1 ng/㎖ 내지 약 2 ng/㎖, 또는 약 1 ng/㎖ 내지 약 1.5 ng/㎖의 농도로 세포와 접촉된다. 특정 구현예에서 BMP 신호전달의 활성화제는 약 1 ng/㎖의 농도로 세포와 접촉된다.
소정 구현예에서, 세포는 약 50 nM 내지 2 μM, 약 100 nM 내지 1.5 μM, 약 150 nM 내지 1 μM, 약 200 nM 내지 950 nM, 약 250 nM 내지 약 900 nM, 약 300 nM 내지 약 850 nM, 약 350 nM 내지 약 800 nM, 약 400 nM 내지 약 750 nM, 약 450 nM 내지 약 700 nM, 약 500 nM 내지 약 650 nM, 또는 약 550 nM 내지 약 600 nM의 농도로 Wnt 신호전달의 활성화제와 접촉된다. 특정 구현예에서, 세포는 약 600 nM 또는 약 1.5 μM의 농도로 Wnt 신호전달의 활성화제와 접촉된다.
특정 구현예에서, 비-CNS NC 전구체는 세포를 최대 12일 이상 동안 하나 이상의 TGFβ/액티빈-노달 신호전달의 억제제(10 μM)와, 최대 2일 또는 3일 동안 하나 이상의 BMP 신호전달의 활성화제(1 ng/㎖)와, 및 최대 12일 이상 동안 하나 이상의 wingless(Wnt) 신호전달의 활성화제(0~2일 동안 600 nM 및 2일 또는 3일부터는 1.5 μM)와 접촉시켜 인간 줄기 세포로부터 분화되며, 여기서 TGFβ/액티빈-노달 신호전달의 억제제, BMP 신호전달의 활성화제, 및 Wnt 신호전달의 활성화제는 세포와 동시에 접촉된다.
소정 구현예에서, 하나 이상의 Wnt 활성화제는 Wnt 신호전달의 활성화를 위해 글리코겐 합성효소 키나제 3β(GSK3β)를 감소시킨다. 따라서, Wnt 신호전달의 활성화제는 GSK3β 억제제일 수 있다. GSK3β 억제제는 WNT 신호전달 경로를 활성화할 수 있으며, 예로, 이의 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌[Cadigan, et al., J Cell Sci. 2006;119:395-402; Kikuchi, et al., Cell Signaling. 2007;19:659-671]을 참고한다. 본원에서 사용되는 용어 "글리코겐 합성효소 키나제 3β 억제제"는 글리코겐 합성효소 키나제 3β 효소를 억제하는 화합물을 나타내며, 예를 들어, 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌[Doble, et al., J Cell Sci. 2003;116:1175-1186]을 참고한다.
Wnt 활성화제 또는 GSK3β 억제제의 비제한적 예는 이의 전문이 참조로 포함되는 WO2011/149762, 문헌[Chambers (2012), 및 Calder et al., J Neurosci. 2015 Aug 19;35(33):11462-81]에 개시된다. 소정 구현예에서, 하나 이상의 Wnt 신호전달의 활성화제는 CHIR99021, 이의 유도체, 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 소분자이다. "CHIR99021"(또한 "아미노피리미딘" 또는 "3-[3-(2-카복시에틸)-4-메틸피롤-2-메틸리데닐]-2-인돌리논"으로 알려져 있음)은 하기 식을 갖는 IUPAC 명칭 6-(2-(4-(2,4-디클로로페닐)-5-(4-메틸-1H-이미다졸-2-일)피리미딘-2-일아미노)에틸아미노)니코티노니트릴을 나타낸다.
Figure pct00002
CHIR99021은 고도로 선택적이며, 관련 및 미관련 키나제 패널에 대해 거의 1000-배의 선택성을 나타내고, 인간 GSK3β에 대해 IC50=6.7 nM 및 설치류 GSK3β 상동체에 대해 나노몰 농도의 IC50 값을 갖는다.
5.2.2 두개 기원판(CP) 전구체를 분화시키는 방법
소정 구현예에서, 본원에서 개시되는 요지 사안은 인간 줄기 세포의 비-CNS 전구체로의 분화를 유도하는 시험관내 방법을 제공하며, 여기서 비-CNS 전구체는 두개 기원판(CP) 전구체이다. 소정 구현예에서, 방법은 인간 줄기 세포 집단을 유효 농도의 하나 이상의 TGFβ/액티빈-노달 신호전달의 억제제, 유효 농도의 하나 이상의 BMP 신호전달의 활성화제(예를 들어, 약 5 ng/㎖의 농도로), 및 유효 농도의 하나 이상의 섬유아세포 성장 인자(FGF) 신호전달의 활성화제와 접촉시키는 단계를 포함한다. 소정 구현예에서, BMP 활성화제는 적어도 약 2일, 적어도 약 3일, 적어도 약 4일, 또는 적어도 약 5일 동안, 또는 최대 약 2일, 최대 약 3일, 최대 약 4일, 최대 약 5일 이상 동안 세포와 접촉된다. 특정 구현예에서, BMP 활성 제제는 적어도 약 2일 동안 세포와 접촉된다.
소정 구현예에서, TGFβ/액티빈-노달 신호전달의 억제제는 적어도 약 6일, 적어도 약 7일, 적어도 약 8일, 적어도 약 9일, 적어도 약 10일, 적어도 약 11일, 적어도 약 12일 이상 동안 세포와 접촉된다. 소정 구현예에서, TGFβ/액티빈-노달 신호전달의 억제제는 최대 약 6일, 최대 약 7일, 최대 약 8일, 최대 약 9일, 최대 약 10일, 최대 약 11일, 최대 약 12일 이상 동안 세포와 접촉된다. 특정 구현예에서, 세포는 약 12일 이상 동안 TGFβ/액티빈-노달 신호전달의 억제제와 접촉된다.
소정 구현예에서, FGF 신호전달의 활성화제는 세포가 TGFβ/액티빈-노달 신호전달의 억제제와 접촉된 적어도 약 1일, 2일, 3일, 4일 또는 5일 후 세포와 접촉된다.
소정 구현예에서, FGF 신호전달의 활성화제는 적어도 약 6일, 적어도 약 7일, 적어도 약 8일, 적어도 약 9일, 적어도 약 10일, 적어도 약 11일, 적어도 약 12일 이상 동안 세포와 접촉된다. 소정 구현예에서, FGF 신호전달의 활성화제는 최대 약 6일, 최대 약 7일, 최대 약 8일, 최대 약 9일, 최대 약 10일, 최대 약 11일, 최대 약 12일 이상 동안 세포와 접촉된다.
특정 구현예에서, 세포는 세포가 TGFβ/액티빈-노달 신호전달의 억제제와 접촉된 약 2일 또는 3일 후 FGF 신호전달의 활성화제와 접촉되며, 여기서 세포는 약 10일 이상 동안 FGF 활성화제와 접촉된다.
소정 구현예에서, 세포는, 예를 들어, TGFβ/액티빈-노달 신호전달의 억제제와 최초 접촉된 후 약 12일 후, 검출가능한 수준의 SIX1 및/또는 ELAVL4를 발현한다. 소정 구현예에서, 세포는 검출가능한 수준의 PAX6, PITX3, 크리스탈린 알파 A, 및/또는 크리스탈린 알파 B를 발현하며, 여기서 세포는 수정체 기원판 전구체이다. 소정 구현예에서, 상기 FGF 신호전달의 활성화제는 FGF2, 이의 유도체, 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다.
소정 구현예에서, 세포는 적어도 약 2일, 적어도 약 3일, 적어도 약 4일, 또는 적어도 약 5일 이상 동안 Wnt 신호전달의 활성화제와 접촉된다. 소정 구현예에서, Wnt 신호전달의 활성화제는 최대 약 2일, 최대 약 3일, 최대 약 4일, 최대 약 5일 이상 동안 세포와 접촉된다. 소정 구현예에서, 이어서 세포는 세포가 TGFβ/액티빈-노달 신호전달의 억제제와 접촉된 적어도 약 1일, 2일, 3일, 4일 또는 5일 후 Wnt 신호전달의 활성화제와 접촉된다. 특정 구현예에서, 세포는 세포가 TGFβ/액티빈-노달 신호전달의 억제제와 접촉된 약 2일 후 Wnt 신호전달의 활성화제와 접촉되며, 여기서 세포는 약 2일 동안 Wnt 활성화제와 접촉된다. 소정 구현예에서, 세포는 FGF 신호전달의 활성화제와 접촉되지 않는다. 소정 구현예에서 CP 전구체 세포는 검출가능한 수준의 PAX3을 발현하며 삼차 기원판 전구체이다.
소정 구현예에서, 세포 적어도 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50% 또는 약 60% 이상의 세포가 검출가능한 수준의 상기 마커를 발현하도록 하는 시기 동안 유효량의 상기 제제와 접촉된다.
소정 구현예에서, 세포는 약 1 μM 내지 약 20 μM, 약 2 μM 내지 약 18 μM, 4 μM 내지 약 16 μM, 약 6 μM 내지 약 14 μM, 또는 약 8 μM 내지 약 12 μM, 또는 약 10 μM의 농도로 전환 성장 인자 베타(TGFβ)/액티빈-노달 신호전달의 억제제와 접촉된다. 특정 구현예에서, 세포는 약 10 μM의 농도로 전환 성장 인자 베타(TGFβ)/액티빈-노달 신호전달의 억제제와 접촉된다.
소정 구현예에서, 상기 BMP 신호전달의 활성화제는 BMP2, BMP4, BMP6, BMP7, 이의 유도체, 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 소정 구현예에서, BMP 신호전달의 활성화제는 약 0.01 ng/㎖ 내지 약 10 ng/㎖, 약 0.1 ng/㎖ 내지 약 8 ng/㎖, 약 1 ng/㎖ 내지 약 6 ng/㎖, 또는 약 2 ng/㎖ 내지 약 5 ng/㎖의 농도로 세포와 접촉된다. 특정 구현예에서 BMP 신호전달의 활성화제는 약 5 ng/㎖의 농도로 세포와 접촉된다.
소정 구현예에서, 상기 FGF 신호전달의 활성화제는 FGF2, FGF4, FGF7, FGF8 및 FGF10, 이의 유도체, 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 소정 구현예에서, 세포는 약 10 ng/㎖ 내지 약 200 ng/㎖, 약 20 ng/㎖ 내지 약 150 ng/㎖, 약 30 ng/㎖ 내지 약 100 ng/㎖, 또는 약 40 ng/㎖ 내지 약 75 ng/㎖의 농도로 FGF 신호전달의 활성화제와 접촉된다. 특정 구현예에서 FGF 신호전달의 활성화제는 약 50 ng/㎖ 또는 약 100 ng/㎖의 농도로 세포와 접촉된다.
소정 구현예에서, 세포는 약 50 nM 내지 약 2 μM, 약 100 nM 내지 약 1.5 μM, 약 150 nM 내지 약 1 μM, 약 200 nM 내지 약 950 nM, 약 250 nM 내지 약 900 nM, 약 300 nM 내지 약 850 nM, 약 350 nM 내지 약 800 nM, 약 400 nM 내지 약 750 nM, 약 450 nM 내지 약 700 nM, 약 500 nM 내지 약 650 nM, 또는 약 550 nM 내지 약 600 nM의 농도로 Wnt 신호전달의 활성화제와 접촉된다. 특정 구현예에서, 세포는 약 600 nM 내지 약 1.5 μM의 농도로 Wnt 신호전달의 활성화제와 접촉된다.
특정 구현예에서, 비-CNS CP 전구체는 세포를 최대 12일 이상 동안 하나 이상의 TGFβ/액티빈-노달 신호전달의 억제제(10 μM), 최대 2일 또는 3일 동안 하나 이상의 BMP 신호전달의 활성화제(5 ng/㎖), 최대 10일 이상 동안 하나 이상의 FGF 신호전달의 활성화제(50 ng/㎖)와 접촉시켜 인간 줄기 세포로부터 분화되며, 여기서 TGFβ/액티빈-노달 신호전달의 억제제 및 BMP 신호전달의 활성화제는 세포와 동시에 접촉되고, FGF 활성화제는 세포와 TGFβ/액티빈-노달 신호전달의 억제제 및 BMP 신호전달의 활성화제의 최초 접촉 2일 또는 3일 후 세포와 접촉된다.
Wnt 활성화제가 세포와 추가 접촉되어 삼차 기원판 전구체로 분화되는 경우, Wnt 활성화제는 최대 2일 이상 동안 세포와 접촉되며, 여기서 Wnt 활성화제는 세포의 TGFβ/액티빈-노달 신호전달의 억제제 및 BMP 신호전달의 활성화제와의 최초 접촉 2일 후 세포와 접촉된다. 소정 구현예에서, Wnt 신호전달의 활성화제와 접촉되지 않는 세포는 세포와 Wnt 신호전달의 활성화제의 접촉 동안 또는 이후 FGF 신호전달의 활성화제와 접촉되지 않는다.
5.2.2.1 뇌하수체 세포 전구체를 분화시키는 방법
소정 구현예에서, 본원에서 개시되는 요지 사안은 인간 줄기 세포의 비-CNS 전구체로의 분화를 유도하는 시험관내 방법을 개시하며, 여기서 비-CNS 전구체는 뇌하수체 기원판 전구체 또는 뇌하수체 세포이다.
소정 구현예에서, 줄기 세포는 뇌하수체 세포, 또는 뇌하수체 기원판 전구체로 분화되며, 여기서 인간 줄기 세포는 유효량의 하나 이상의 TGFβ/액티빈-노달 신호전달의 억제제, 유효량의 하나 이상의 BMP 신호전달의 활성화제, 유효량의 하나 이상의 Sonic Hedgehog(SHH) 신호전달의 활성화제, 및 유효량의 1개, 또는 2개 이상의 FGF 신호전달의 활성화제와 접촉된다. 소정 구현예에서, FGF 신호전달의 활성화제는 FGF8 및 FGF10 신호전달을 활성화한다. 소정 구현예에서, TGFβ/액티빈-노달 신호전달의 억제제는 적어도 약 6일, 적어도 약 7일, 적어도 약 8일, 적어도 약 9일, 적어도 약 10일, 적어도 약 11일, 적어도 약 12일, 적어도 약 13일, 적어도 약 14일, 적어도 약 15일, 적어도 약 16일, 적어도 약 17일, 적어도 약 18일, 적어도 약 19일, 적어도 약 20일 이상 동안 세포와 접촉된다. 소정 구현예에서, TGFβ/액티빈-노달 신호전달의 억제제는 최대 약 6일, 최대 약 7일, 최대 약 8일, 최대 약 9일, 최대 약 10일, 최대 약 11일, 최대 약 12일, 최대 약 13일, 최대 약 14일, 최대 약 15일, 최대 약 16일, 최대 약 17일, 최대 약 18일, 최대 약 19일, 최대 약 20일 이상 동안 세포와 접촉된다. 특정 구현예에서, 세포는 약 15일 이상 동안 TGFβ/액티빈-노달 신호전달의 억제제와 접촉된다.
소정 구현예에서, BMP 활성화제는 적어도 약 2일 동안, 적어도 약 3일, 적어도 약 4일, 또는 적어도 약 5일 동안, 또는 최대 약 2일, 최대 약 3일, 최대 약 4일, 최대 약 5일 이상 동안 세포와 접촉된다. 특정 구현예에서, BMP 활성 제제는 적어도 약 3일 동안 세포와 접촉된다.
소정 구현예에서, 하나 이상의 SHH 신호전달의 활성화제 및 2개 이상의 FGF 신호전달의 활성화제는 적어도 약 20일, 21일, 22일, 23일, 24일, 25일, 26일, 27일, 28일, 29일, 30일, 31일, 32일, 33일, 34일, 35일, 36일, 37일, 38일, 39일, 40일 이상 동안; 또는 최대 약 20일, 21일, 22일, 23일, 24일, 25일, 26일, 27일, 28일, 29일, 30일, 31일, 32일, 33일, 34일, 35일, 36일, 37일, 38일, 39일, 40일 이상 동안 세포와 접촉된다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 SHH 신호전달의 활성화제 및 2개 이상의 FGF 신호전달의 활성화제는 적어도 26일 이상 동안 세포와 접촉된다.
소정 구현예에서, 하나 이상의 SHH의 활성화제 및 2개 이상의 FGF의 활성화제는 세포가 하나 이상의 TGFβ/액티빈-노달 신호전달의 억제제와 접촉된 적어도 약 2일, 3일, 4일, 5일, 또는 6일 후 세포와 접촉된다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 SHH의 활성화제 및 2개 이상의 FGF의 활성화제는 세포가 하나 이상의 TGFβ/액티빈-노달 신호전달의 억제제와 접촉된 적어도 4일 후 세포와 접촉된다.
소정 구현예에서, 세포는 약 1 μM 내지 약 20 μM, 약 2 μM 내지 약 18 μM, 약 4 μM 내지 약 16 μM, 약 6 μM 내지 약 14 μM, 또는 약 8 μM 내지 약 12 μM의 농도로 전환 성장 인자 베타(TGFβ)/액티빈-노달 신호전달의 억제제와 접촉된다. 특정 구현예에서, 세포는 약 10 μM의 농도로 전환 성장 인자 베타(TGFβ)/액티빈-노달 신호전달의 억제제와 접촉된다.
소정 구현예에서, 상기 BMP 신호전달의 활성화제는 BMP2, BMP4, BMP6, BMP7, 이의 유도체, 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 소정 구현예에서, BMP 신호전달의 활성화제는 약 0.01 ng/㎖ 내지 약 10 ng/㎖, 약 0.1 ng/㎖ 내지 약 8 ng/㎖, 약 1 ng/㎖ 내지 약 6 ng/㎖, 또는 약 2 ng/㎖ 내지 약 5 ng/㎖의 농도로 세포와 접촉된다. 특정 구현예에서 BMP 신호전달의 활성화제는 약 5 ng/㎖의 농도로 세포와 접촉된다.
소정 구현예에서, 세포는 각각 약 10 ng/㎖ 내지 약 200 ng/㎖, 약 20 ng/㎖ 내지 약 150 ng/㎖, 약 30 ng/㎖ 내지 약 100 ng/㎖, 또는 약 40 ng/㎖ 내지 약 75 ng/㎖의 농도로 2개 이상의 FGF 신호전달의 활성화제와 접촉되며, 특정 구현예에서, 세포는 약 50 ng/㎖, 또는 약 100 ng/㎖의 농도로 하나 이상의 FGF 신호전달의 활성화제와 접촉된다.
소정 구현예에서, 세포는 약 10 ng/㎖ 내지 약 400 ng/㎖, 약 50 ng/㎖ 내지 약 350 ng/㎖, 약 100 ng/㎖ 내지 약 300 ng/㎖, 또는 약 150 ng/㎖ 내지 약 250 ng/㎖의 농도로 하나 이상의 SHH 신호전달의 활성화제와 접촉된다. 특정 구현예에서, 세포는 약 200 ng/㎖의 농도로 하나 이상의 SHH 신호전달의 활성화제와 접촉된다.
소정 구현예에서, SHH 신호전달의 활성화제는 Sonic hedgehog(SHH), C25II 및 smoothened(SMO) 수용체 소분자 작용제, 예컨대 푸르모르파민, SAG(예를 들어, 문헌[Stanton et al, Mol Biosyst. 2010 Jan;6(1):44-54]에 개시된 바와 같음), 이의 유도체, 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다.
소정 구현예에서, 세포는, 예를 들어, 세포가 TGFβ/액티빈-노달 신호전달의 억제제와 접촉된 적어도 약 9일, 15일, 30일 또는 60일 후, 검출가능한 수준의 PITX1, PITX2, LUX, LHX4, HESX1, SIX6, TBX19, 및/또는 PAX6을 발현한다. 소정 구현예에서, 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90% 초과의 세포 집단이 검출가능한 수준의 상기 마커를 발현한다.
소정 구현예에서, 세포는, 예를 들어, 세포가 TGFβ/액티빈-노달 신호전달의 억제제와 접촉된 약 30일 내지 60일 후, 검출가능한 수준의 하나 이상의 호르몬, 예를 들어, 아드레노코르티코트로픽 호르몬(ACTH), 성장 호르몬(GH), 프로락틴(PRL), 여포-자극 호르몬(FSH), 및/또는 황체형성 호르몬(LH)을 발현한다. 소정 구현예에서, 세포는 CRF 또는 스트레신과 접촉 시 ACTH를 발현하며; 세포는 소마토크리닌과 접촉 시 GH를 발현하고; 및/또는 세포는 나파렐린과 접촉 시 FSH를 발현한다. 소정 구현예에서, 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90% 초과의 세포 집단이 검출가능한 수준의 상기 호르몬을 발현한다. 소정 구현예에서, 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% 또는 50%의 세포가 하나를 초과하는 호르몬을 발현한다.
소정 구현예에서, 세포는 등쪽화 제제, 배쪽화 제제, 또는 이의 조합과 추가 접촉된다. 소정 구현예에서, 등쪽화 제제는 FGF 활성화제, 예를 들어 FGF8을 포함한다. 소정 구현예에서, 배쪽화 제제는 BMP의 활성화제, 예를 들어, BMP2를 포함한다. 소정 구현예에서, 세포는 세포가 TGFβ/액티빈-노달 신호전달의 억제제와 접촉한 적어도 약 20일, 25일, 30일, 35일, 40일 이상 후, 등쪽화 제제, 배쪽화 제제, 또는 이의 조합과 접촉된다. 소정 구현예에서, 세포는 적어도 약 15일, 20일, 25일, 30일, 35일, 40일, 또는 45일 이상 동안, 또는 최대 약 15일, 20일, 25일, 30일, 35일, 40일, 45일 이상 동안 등쪽화 제제, 배쪽화 제제, 또는 이의 조합과 접촉된다. 특정 구현예에서, 세포는 적어도 30일 동안 등쪽화 제제, 배쪽화 제제, 또는 이의 조합과 접촉된다.
소정 구현예에서, 세포는 약 10 ng/㎖ 내지 약 200 ng/㎖, 약 20 ng/㎖ 내지 약 150 ng/㎖, 약 30 ng/㎖ 내지 약 100 ng/㎖, 또는 약 40 ng/㎖ 내지 약 75 ng/㎖의 농도로 등쪽화 제제와 접촉된다. 특정 구현예에서, 세포는 약 50 ng/㎖, 또는 약 100 ng/㎖의 농도로 등쪽화 제제와 접촉된다.
소정 구현예에서, 세포는 약 1 ng/㎖ 내지 약 30 ng/㎖, 약 5 ng/㎖ 내지 약 25 ng/㎖, 또는 약 10 ng/㎖ 내지 약 20 ng/㎖의 농도로 배쪽화 제제와 접촉된다. 특정 구현예에서, 세포는 약 10 ng/㎖, 또는 약 20 ng/㎖의 농도로 배쪽화 제제와 접촉된다.
소정 구현예에서, 등쪽화 제제와 접촉된 세포는 검출가능한 수준의 프로-오피오멜라노코르틴(POMC)을 발현한다.
소정 구현예에서, 배쪽화 제제와 접촉된 세포는 검출가능한 수준의 FSH 및/또는 LH를 발현한다.
소정 구현예에서, 등쪽화 제제 및 배쪽화 제제의 혼합물과 접촉된 세포는 검출가능한 수준의 GH 및/또는 TSHB를 발현한다.
특정 구현예에서, 줄기 세포는 뇌하수체 세포, 또는 뇌하수체 기원판 전구체로 분화되며, 여기서 인간 줄기 세포는 하나 이상의 TGFβ/액티빈-노달 신호전달의 억제제(10 μM), 하나 이상의 BMP 신호전달의 활성화제(5 ng/㎖)와 약 3일 동안, 하나 이상의 Sonic Hedgehog(SHH) 신호전달의 활성화제(200 ng/㎖), 및 2개 이상의 FGF 신호전달의 활성화제(예컨대, 100 ng/㎖ FGF8 및 50 ng/㎖ FGF10)와 접촉된다. 소정 구현예에서, SHH 및 FGF 신호전달의 활성화제는 세포가 하나 이상의 TGFβ/액티빈-노달 신호전달의 억제제와 접촉된 약 4일 후 세포와 접촉되며, 여기서 세포는 적어도 약 26일 동안 SHH 및 FGF 신호 활성화제와 접촉된다.
5.2.3 비-신경 외배엽(NNE) 전구체의 분화 방법
소정 구현예에서, 본원에서 개시되는 요지 사안은 인간 줄기 세포의 비-CNS 전구체로의 분화를 유도하는 시험관내 방법을 제공하며, 여기서 비-CNS 전구체는 비-신경 외배엽(NNE) 전구체이다. 소정 구현예에서, 방법은 인간 줄기 세포 집단을 유효량의 하나 이상의 TGFβ/액티빈-노달 신호전달의 억제제, 유효량의 하나 이상의 BMP 신호전달의 활성화제(예를 들어, 약 10 ng/㎖ 또는 20 ng/㎖의 농도로), 및 유효량의 하나 이상의 FGF 신호전달의 억제제와 접촉시키는 단계를 포함한다.
FGF 신호전달의 억제제의 비제한적 예에는 SU5402(Sun et al., Journal of medicinal chemistry 42, 5120-5130 (1999); Paterson et al. Br. J. Haematol. 124 595 (2004); Tanaka et al., Nature 435:172 (2005)), PD 173074(N-[2-[[4-(디에틸아미노)부틸]아미노]-6-(3,5-디메톡시페닐)피리도[2,3-d]피리미딘-7-일]-N'-(1,1-디메틸에틸)우레아; Bansal et al., J.Neurosci.Res., 2003;74:486), FIIN 1 하이드로클로라이드(N-(3-((3-(2,6-디클로로-3,5-디메톡시페닐)-7-(4-(디에틸아미노)부틸아미노)-2-옥소-3,4-디하이드로피리미도[4,5-d]피리미딘-1(2H)-일)메틸)페닐)아크릴아마이드; Zhou, Chem. Biol., 2010;17:285), SU6668(5-[1,2-디하이드로-2-옥소-3H-인돌-3-일리덴)메틸]-2,4-디메틸-1H-피롤-3-프로판산; Yamamoto et al., Cancer Res. 2008 Dec 1;68(23):9754-62), PD 166285 디하이드로클로라이드(6-(2,6-디클로로페닐)-2-[[4-[2-(디에틸아미노)에톡시]페닐]아미노]-8-메틸피리도[2,3-d]피리미딘-7(8H)-온 디하이드로클로라이드; Panek et al., J Pharmacol Exp Ther. 1997 Dec;283(3):1433-44), PD 161570(N-[6-(2,6-디클로로페닐)-2-[[4-(디에틸아미노)부틸]아미노]피리도[2,3-d]피리미딘-7-일]-N'-(1,1-디메틸에틸)우레아; Hamby et al., J Med Chem. 1997 Jul 18;40(15):2296-303), AP 24534(3-(2-이미다조[1,2-b]피리다진-3-일에티닐)-4-메틸-N-[4-[(4-메틸-1-피페라지닐)메틸]-3-(트리플루오로메틸)페닐]-벤즈아마이드; Huang et al., J. Med. Chem., 2010;53:4701), 또는 이의 유도체가 포함된다.
소정 구현예에서, 용어 "SU5402"는 화학식이 C17H16N2O3이고 화학명이 2-[(1,2-디하이드로-2-옥소-3H-인돌-3-일리덴)메틸]-4-메틸-1H-피롤-3-프로판산인 소분자를 나타낸다. 소정 구현예에서, SU5402는 하기 식을 갖는다:
Figure pct00003
소정 구현예에서, TGFβ/액티빈-노달 신호전달의 억제제, BMP 신호전달의 활성화제, 및 FGF 신호전달의 억제제는 적어도 약 6일, 적어도 약 7일, 적어도 약 8일, 적어도 약 9일, 적어도 약 10일, 적어도 약 11일, 적어도 약 12일 이상 동안 세포와 접촉된다. 소정 구현예에서, TGFβ/액티빈-노달 신호전달의 억제제, BMP 신호전달의 활성화제, 및 FGF 신호전달의 억제제는 최대 약 6일, 최대 약 7일, 최대 약 8일, 최대 약 9일, 최대 약 10일, 최대 약 11일, 또는 최대 약 12일 이상 동안 세포와 접촉된다. 특정 구현예에서, 세포는 약 12일 이상 동안 TGFβ/액티빈-노달 신호전달의 억제제, BMP 신호전달의 활성화제, 및 FGF 신호전달의 억제제와 접촉된다.
소정 구현예에서, 세포는, 예를 들어, TGFβ/액티빈-노달 신호전달의 억제제와 최초 접촉된 후 약 12일 후, 검출가능한 수준의 TFAP2A를 발현하며, 검출가능한 수준의 SIX1 및/또는 SOX10을 발현하지 않는다.
소정 구현예에서, 세포는 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50% 또는 60% 이상의 세포가 검출가능한 수준의 TFAP2A를 발현하도록 하는 시기 동안 유효량의 상기 제제와 접촉된다.
소정 구현예에서, FGF 신호전달의 억제제는 SU5402(Sun et al., Journal of medicinal chemistry 42, 5120-5130 (1999)), 이의 유도체, 또는 이의 혼합물을 포함한다.
소정 구현예에서, 세포는 약 1 μM 내지 약 20 μM, 약 2 μM 내지 약 18 μM, 약 4 μM 내지 약 16 μM, 약 6 μM 내지 약 14 μM, 또는 약 8 μM 내지 약 12 μM의 농도로 전환 성장 인자 베타(TGFβ)/액티빈-노달 신호전달의 억제제와 접촉된다. 특정 구현예에서, 세포는 약 10 μM의 농도로 전환 성장 인자 베타(TGFβ)/액티빈-노달 신호전달의 억제제와 접촉된다.
소정 구현예에서, 상기 BMP 신호전달의 활성화제는 BMP2, BMP4, BMP6, BMP7, 이의 유도체, 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 소정 구현예에서, BMP 신호전달의 활성화제는 약 0.01 ng/㎖ 내지 약 30 ng/㎖, 약 1 ng/㎖ 내지 약 25 ng/㎖, 약 5 ng/㎖ 내지 약 20 ng/㎖, 또는 약 10 ng/㎖ 내지 약 15 ng/㎖의 농도로 세포와 접촉된다. 특정 구현예에서 BMP 신호전달의 활성화제는 약 10 ng/㎖ 또는 약 20 ng/㎖의 농도로 세포와 접촉된다.
소정 구현예에서, 세포는 약 1 μM 내지 약 20 μM, 약 2 μM 내지 약 18 μM, 약 4 μM 내지 약 16 μM, 약 6 μM 내지 약 14 μM, 또는 약 8 μM 내지 약 12 μM의 농도로 FGF 신호전달의 억제제와 접촉된다. 특정 구현예에서, 세포는 약 10 μM의 농도로 FGF 신호전달의 억제제와 접촉된다.
특정 구현예에서, 비-CNS NNE 전구체는 세포를 최대 12일 동안 하나 이상의 TGFβ/액티빈-노달 신호전달의 억제제(10 μM), 최대 12일 동안 하나 이상의 BMP 신호전달의 활성화제(약 2일 동안 10 ng/㎖ 또는 20 ng/㎖, 이어서 5 ng/㎖), 및 적어도 또는 약 2일, 또는 최대 12일 동안 하나 이상의 FGF 신호전달의 억제제(10 μM)와 접촉시켜 인간 줄기 세포로부터 분화되며, 여기서 TGFβ/액티빈-노달 신호전달의 억제제, BMP 신호전달의 활성화제 및 FGF 신호전달의 억제제는 세포와 동시에 접촉된다.
소정 구현예에서, 상술된 억제제, 활성화제 및 분자는 줄기 세포를 포함하는 세포 배양 배지에 첨가된다. 적합한 세포 배양 배지에는 비제한적으로 Essential 8®/Essential 6®("E8/E6") 배지가 포함된다. E8/E6 배지는 상업적으로 이용 가능하다.
E8/E6 배지는 인간 다능성 줄기 세포의 성장 및 증식을 지지하는, 영양공급세포가 없는 제노-프리(xeno-free) 배지이다. E8/E6 배지는 체세포 재프로그래밍을 지지함이 입증되었다. 또한, E8/E6 배지는 PSC의 배양을 위한 사제 배지의 제형화를 위한 기재로 사용될 수 있다. E8/E6 배지의 일례는 그 전문이 참조로 포함되는 문헌[Chen et al., Nat Methods. 2011 May;8(5):424-9]에 기재된다. E8/E6 배지의 일례는 그 전문이 참조로 포함되는 WO15/077648에 개시된다. 소정 구현예에서, E8/E6 세포 배양 배지는 DMEM/F12, 아스코르브산, 셀레늄, 인슐린, NaHCO3, 트랜스페린, FGF2 및 TGFβ를 포함한다. 소정 구현예에서, E6 배지에는 FGF2 및 TGFβ가 포함되지 않는다. E8/E6 배지는 E8/E6 배지에 활성 BMP 또는 Wnt 성분이 포함되지 않는다는 점에서 KSR 배지와 상이하다.
분화된 세포는 하나 이상의 리포터를 추가로 발현할 수 있다. 리포터의 비제한적 예에는 형광 단백질(예컨대 녹색 형광 단백질(GFP), 청색 형광 단백질(EBFP, EBFP2, 아주라이트(Azurite), mKalama1), 시안 형광 단백질(ECFP, 세룰리안(Cerulean), CyPet, mTurquoise2), 및 황색 형광 단백질 유도체(YFP, 시트린(Citrine), 비너스(Venus), YPet, EYFP)), β-갈락토시다제(LacZ), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(cat), 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(neo), 효소(예컨대 옥시다제 및 퍼옥시다제), 및 항원성 분자가 포함된다. 본원에서 사용되는 용어 "리포터 유전자" 또는 "리포터 작제물"은 쉽게 검출가능하거나 쉽게 검정 가능한 단백질, 예컨대 유색 단백질, 형광 단백질, 예컨대 GFP 또는 효소, 예컨대 베타-갈락토시다제(lacZ 유전자)를 인코딩하는 핵산을 포함하는 유전적 작제물을 나타낸다. 소정 구현예에서, 리포터는 NE 계통 마커 유전자의 재조합 프로모터, NC 계통 마커 유전자의 재조합 프로모터, CP 계통 마커 유전자의 재조합 프로모터, 또는 NNE 계통 마커 유전자의 재조합 프로모터에 의해 유도될 수 있다.
분화된 세포는 분화 후, 예로 세포 배양 배지 중에서 정제될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "정제된", "정제하다", "정제", "단리된", "단리하다" 및 "단리"는 샘플로부터 적어도 하나의 오염물질의 양의 감소를 나타낸다. 예를 들어, 요망되는 세포 유형은 요망되지 않는 세포 유형의 양의 대응하는 감소와 함께 적어도 약 10% 만큼, 적어도 약 30% 만큼, 적어도 약 50% 만큼, 적어도 약 75% 만큼, 및 적어도 약 90% 만큼 정제된다. 용어 "정제하다"는 샘플로부터 소정 세포(예로, 요망되지 않는 세포)의 제거를 나타낼 수 있다.
본원에서 개시되는 요지 사안은 또한 본원에서 기재되는 방법에 의해 생성되는 하나 이상의 NC, CP 또는 NNE 계통 마커를 발현하는 시험관내 분화된 세포 집단, 및 이러한 시험관내 분화된 세포를 포함하는 조성물을 제공한다.
5.3 분화된 세포 집단을 포함하는 조성물
본 개시는 본원에서 기재되는 방법에 따라 제조되는, 하나 이상의 신경 능선 계통 마커를 발현하는 시험관내 분화된 세포, 또는 이의 전구체 세포 집단을 제공한다. 소정 구현예에서, 적어도 약 10%, 20%, 30%, 또는 40%(예컨대, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 99%, 또는 적어도 약 99.5%, 또는 적어도 99.9%)의 세포 집단은 하나 이상의 신경 능선 계통 마커, 예를 들어, SOX10을 발현한다.
본 개시는 본원에서 기재되는 방법에 따라 제조되는, 하나 이상의 두개 수정체 기원판 계통 마커를 발현하는 시험관내 분화된 세포, 또는 이의 전구체 세포 집단을 제공한다. 소정 구현예에서, 적어도 약 10%, 20%, 30%, 또는 40%(예컨대, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 99%, 또는 적어도 약 99.5%, 또는 적어도 약 99.9%)의 세포 집단은 하나 이상의 두개 수정체 기원판 계통 마커, 예를 들어, SIX1, PAX6, PITX3, 크리스탈린 알파 A, 크리스탈린 알파 B, 또는 이의 조합을 발현한다.
본 개시는 본원에서 기재되는 방법에 따라 제조되는, 하나 이상의 두개 삼차 기원판 계통 마커를 발현하는 시험관내 분화된 세포, 또는 이의 전구체 세포 집단을 제공한다. 소정 구현예에서, 적어도 약 10%, 20%, 30%, 또는 40%(예컨대, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 99%, 또는 적어도 약 99.5%, 또는 적어도 약 99.9%)의 세포 집단은 하나 이상의 두개 삼차 기원판 계통 마커, 예를 들어, SIX1, PAX3, 또는 이의 조합을 발현한다.
본 개시는 본원에서 기재되는 방법에 따라 제조되는, 하나 이상의 비-신경 외배엽 계통 마커를 발현하는 시험관내 분화된 세포, 또는 이의 전구체 세포 집단을 제공한다. 소정 구현예에서, 적어도 약 10%, 20%, 30%, 또는 40%(예컨대, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 99%, 또는 적어도 약 99.5%, 또는 적어도 약 99.9%)의 세포 집단은 하나 이상의 비-신경 외배엽 계통 마커, 예를 들어, TFAP2A를 발현하며, 약 15% 미만(예컨대, 10% 미만, 5% 미만, 4% 미만, 3% 미만, 2% 미만, 1% 미만, 0.5% 미만, 또는 약 0.1% 미만)의 세포 집단은 SIX1, SOX10 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커를 발현한다.
본 개시는 본원에서 기재되는 방법에 따라 제조되는, 하나 이상의 뇌하수체 세포 마커를 발현하는 시험관내 분화된 세포, 또는 뇌하수체 기원판 전구체 집단을 제공한다. 소정 구현예에서, 적어도 약 10%, 20%, 또는 30%(예컨대, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 99%, 또는 적어도 약 99.5%, 또는 적어도 약 99.9%)의 세포 집단은 하나 이상의 뇌하수체 세포 마커, 예를 들어, PITX1, PITX2, LUX, LHX4, HESX1, SIX6, TBX19, PAX6, 또는 이의 조합을 발현한다.
소정 구현예에서, 분화된 세포 집단은 인간 줄기 세포 집단으로부터 유도된다. 본원에서 개시되는 요지 사안은 이러한 분화된 세포 집단을 포함하는 조성물을 추가로 제공한다.
소정 구현예에서, 조성물은 약 1 × 104 내지 약 1 × 1010, 약 1 × 104 내지 약 1 × 105, 약 1 × 105 내지 약 1 × 109, 약 1 × 105 내지 약 1 × 106, 약 1 × 105 내지 약 1 × 107, 약 1 × 106 내지 약 1 × 107, 약 1 × 106 내지 약 1 × 108, 약 1 × 107 내지 약 1 × 108, 약 1 × 108 내지 약 1 × 109, 약 1 × 108 내지 약 1 × 1010, 또는 약 1 × 109 내지 약 1 × 1010개의 본원에서 개시되는 줄기-세포-유도 세포 집단을 포함한다.
소정의 비제한적 구현예에서, 조성물은 생체적합성 스캐폴드 또는 기질, 예를 들어 세포가 대상체에 착상되거나 이식되는 경우, 조직 재생을 촉진하는 생체적합성 3-차원 스캐폴드를 추가로 포함한다. 소정의 비제한적 구현예에서, 생체적합성 스캐폴드는 세포외 기질 물질, 합성 중합체, 사이토카인, 콜라겐, 폴리펩타이드 또는 단백질, 피브로넥틴, 라미닌, 케라틴, 피브린, 피브리노겐, 히알루론산, 헤파린 설페이트, 콘드로이틴 설페이트, 아가로스 또는 젤라틴을 포함하는 다당류, 및/또는 하이드로겔을 포함한다(예로, 그 각각의 내용의 전문이 참조로 포함되는 미국 공개 번호 2015/0159135, 2011/0296542, 2009/0123433, 및 2008/0268019 참고).
소정 구현예에서, 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 희석제 또는 이의 조합을 포함하는 약학 조성물이다. 조성물은 본원에서 기재되는 바와 같이, 신경변성 및 뇌하수체 장애의 방지 및/또는 치료를 위해 사용될 수 있다.
5.4 신경변성 및 뇌하수체 장애를 치료하는 방법
하나 이상의 NC, CP 또는 NNE 계통 마커를 발현하는 시험관내 분화된 세포("줄기-세포-유도 NC, CP 또는 NNE 전구체"로도 나타냄)는 신경변성 장애 또는 뇌하수체 장애를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 본원에서 개시되는 요지 사안은 신경변성 장애 또는 뇌하수체 장애를 앓는 대상체에 유효량의 본원에서 개시되는 줄기-세포-유도 전구체를 투여하는 단계를 포함하는, 신경변성 장애 또는 뇌하수체 장애를 치료하는 방법을 제공한다.
신경변성 장애의 비제한적 예에는 프리드리히 실조(Friedrich's Ataxia)가 포함된다.
뇌하수체 장애의 비제한적 예에는 뇌하수체저하 장애가 포함된다.
본원에서 개시되는 줄기-세포-유도 전구체는 신경변성 장애 또는 뇌하수체 장애를 치료하거나 방지하기 위해 대상체에 전신으로 또는 직접적으로 투여되거나 제공될 수 있다. 소정 구현예에서, 본원에서 개시되는 줄기-세포-유도 전구체는 관심 기관(예컨대, 중추 신경계(CNS) 또는 말초 신경계(PNS)) 내로 직접 주사된다.
본원에서 개시되는 줄기-세포-유도 전구체는 임의의 생리적으로 허용가능한 비히클 중에 투여될 수 있다. 본원에서 개시되는 줄기-세포-유도 전구체 및 약학적으로 허용가능한 비히클을 포함하는 약학 조성물이 또한 제공된다. 본원에서 개시되는 줄기-세포-유도 전구체 및 상기 세포를 포함하는 약학 조성물은 국소화된 주사, 정위(OT) 주사, 전신 주사, 정맥내 주사, 또는 비경구 투여를 통해 투여될 수 있다. 소정 구현예에서, 본원에서 개시되는 줄기-세포-유도 전구체는 정위(OT) 주사를 통해 신경변성 장애 또는 뇌하수체 장애를 앓는 대상체에 투여된다.
본원에서 개시되는 줄기-세포-유도 전구체 및 상기 세포를 포함하는 약학 조성물은 멸균 액체 조제물, 예로, 등장성 수용액, 현탁액, 에멀젼, 분산액, 또는 점성 조성물로서 편리하게 제공될 수 있고, 이는 선택된 pH로 완충될 수 있다. 액체 조제물은 보통 겔, 다른 점성 조성물, 및 고체 조성물에 비해 제조하기 더 쉽다. 추가적으로, 액체 조성물은 특히 주사에 의해, 투여하기가 다소 더 편리하다. 반면에, 점성 조성물은 특정 조직과의 더 긴 접촉 기간을 제공하도록 적절한 점도 범위 내에서 제형화될 수 있다. 액체 또는 점성 조성물은 담체를 포함할 수 있고, 이는 예를 들어, 물, 식염수, 인산염 완충 식염수, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 배지일 수 있다. 멸균 주사제 용액은, 본원에서 개시되는 요지 사안의 조성물, 예로 본원에서 개시되는 줄기-세포-유도 전구체를 포함하는 조성물을 요망되는 바에 따라 다양한 양의 다른 성분과 함께 요구되는 양의 적절한 용매 중에 포함시켜 제조될 수 있다. 이러한 조성물은 적합한 담체, 희석제, 또는 부형제, 예컨대 멸균수, 생리 식염수, 글루코스, 덱스트로스 등과의 혼합물로 있을 수 있다. 조성물은 또한 동결건조될 수 있다. 조성물은 요망되는 투여 및 제조 경로에 따라, 보조 성분, 예컨대 수화제, 분산제, 또는 유화제(예로, 메틸셀룰로스), pH 완충제, 겔화 또는 점도 증강 첨가제, 보존제, 풍미제, 착색제 등을 함유할 수 있다. 과도한 실험 없이, 적합한 조제물을 제조하기 위해 본원에 참조로 포함되는 표준 교과서, 예컨대 문헌[REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCE", 17th edition, 1985]를 참조할 수 있다.
항균 보존제, 항산화제, 킬레이트화제 및 완충제를 포함하는 조성물의 안정성 및 멸균성을 증강시키는 다양한 첨가제가 첨가될 수 있다. 미생물의 작용 방지는 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산 등에 의해 보장될 수 있다. 주사제 약학 형태의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 사용에 의해 일으킬 수 있다. 그러나 본원에서 개시되는 요지 사안에 따르면, 사용되는 임의의 비히클, 희석제, 또는 첨가제는 본원에서 개시되는 줄기-세포-유도 전구체에 적합해야 할 것이다.
조성물의 점도는, 요망되는 경우, 약학적으로 허용가능한 증점제를 사용하여 선택된 수준으로 유지될 수 있다. 메틸셀룰로스는 쉽고 경제적으로 사용 가능하며 작업이 용이하므로 사용할 수 있다. 다른 적합한 증점제에는, 예를 들어, 잔탄 고무, 카복시메틸 셀룰로스, 하이드록시프로필 셀룰로스, 카보머 등이 포함된다. 증점제의 농도는 선택되는 제제에 의존할 수 있다. 중요한 포인트는 선택된 점도를 달성할 양을 사용하는 것이다. 담체 및 다른 첨가제의 선택은 정확한 투여 경로 및 특정 투여형, 예컨대 액체 투여형의 성질(예컨대, 조성물이 용액, 현탁액, 겔 또는 또 다른 액체 형태, 예컨대 시간 방출형 또는 액체 충전형으로 제형화될지 여부)에 의존할 것이다.
당업자는 조성물의 성분이 화학적으로 불활성이도록 선택되어야 하며 본원에서 개시되는 줄기-세포-유도 전구체의 생활성 또는 유효성에 영향을 미치지 않을 것임을 인식할 것이다. 이는 화학 및 약학 이론의 당업자에게 문제를 제공하지 않을 것이거나, 표준 교과서를 참조하여 또는 본 개시 및 본원에서 인용되는 문헌으로부터 단순한 실험에 의해(과도한 실험이 관여되지 않고) 문제가 쉽게 회피될 수 있다.
본원에서 개시되는 줄기-세포-유도 전구체의 치료적 사용에 관한 하나의 고려사항은 최적 효과를 달성하기 위해 필요한 세포의 양이다. 최적 효과에는 비제한적으로 신경변성 장애를 앓는 대상체의 CNS 및/또는 PNS 영역의 재증식, 및/또는 대상체의 CNS 및/또는 PNS의 개선된 기능이 포함된다.
"유효량"(또는 "치료 유효량")은 치료 시 유익하거나 요망되는 임상 결과에 영향을 미치기에 충분한 양이다. 유효량은 하나 이상의 용량으로 대상체에 투여될 수 있다. 치료의 관점에서, 유효량은 신경변성 장애 또는 뇌하수체 장애의 진행을 일시적으로 억제하거나, 완화하거나, 안정화하거나, 역전시키거나, 느리게 하기에, 또는 달리 신경변성 장애 또는 뇌하수체 장애의 병리적 결과를 감소시키기에 충분한 양이다. 유효량은 일반적으로 케이스별 기준에 따라 의사에 의해 결정되며 당업자의 기술 수준 내이다. 유효량을 달성하기 위해 적절한 투여량을 결정하는 경우 몇몇 요인이 전형적으로 고려된다. 이들 요인에는 대상체의 연령, 성별 및 체중, 치료받는 상태, 상태의 중증도 및 투여되는 세포의 형태 및 유효 농도가 포함된다.
소정 구현예에서, 본원에서 개시되는 줄기-세포-유도 전구체의 유효량은 신경변성 장애 또는 뇌하수체 장애를 앓는 대상체의 CNS 및/또는 PNS 영역에 재증식하기 충분한 양이다. 소정 구현예에서, 본원에서 개시되는 줄기-세포-유도 전구체의 유효량은 신경변성 장애 또는 뇌하수체 장애를 앓는 대상체의 CNS 및/또는 PNS의 기능을 개선하게 충분한 양이며, 예컨대 개선된 기능은 일반 개인의 CNS 및/또는 PNS 기능의 약 1%, 약 5%, 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 98%, 약 99% 또는 약 100%일 수 있다.
투여될 세포의 양은 치료받는 대상체에 따라 변할 것이다. 소정 구현예에서, 약 1 × 104 내지 약 1 × 1010, 약 1 × 104 내지 약 1 × 105, 약 1 × 105 내지 약 1 × 109, 약 1 × 105 내지 약 1 × 106, 약 1 × 105 내지 약 1 × 107, 약 1 × 106 내지 약 1 × 107, 약 1 × 106 내지 약 1 × 108, 약 1 × 107 내지 약 1 × 108, 약 1 × 108 내지 약 1 × 109, 약 1 × 108 내지 약 1 × 1010, 또는 약 1 × 109 내지 약 1 × 1010개의 본원에서 개시되는 줄기-세포-유도 전구체가 대상체에 투여된다. 소정 구현예에서, 약 1 × 105 내지 약 1 × 107개의 본원에서 개시되는 줄기-세포-유도 전구체가 신경변성 장애 또는 뇌하수체 장애를 앓는 대상체에 투여된다. 소정 구현예에서, 약 2 × 106개의 본원에서 개시되는 줄기-세포-유도 전구체가 신경변성 장애 또는 뇌하수체 장애를 앓는 대상체에 투여된다. 소정 구현예에서, 약 1 × 106 내지 약 1 × 107개의 본원에서 개시되는 줄기-세포-유도 전구체가 신경변성 장애 또는 뇌하수체 장애를 앓는 대상체에 투여된다. 소정 구현예에서, 약 1 × 106 내지 약 4 × 106개의 본원에서 개시되는 줄기-세포-유도 전구체가 신경변성 장애 또는 뇌하수체 장애를 앓는 대상체에 투여된다. 무엇이 유효 용량으로 간주될 것인지에 대한 정확한 결정은 특정 대상체의 체격, 연령, 성별, 체중 및 상태를 포함하여, 각 대상체에 대한 개별적인 요인에 기반할 수 있다. 투여량은 본 개시 및 당분야의 지식으로부터 당업자에 의해 쉽게 확인될 수 있다.
소정 구현예에서, 신경변성 또는 뇌하수체 장애를 치료하기 위해 신경변성 또는 뇌하수체 장애를 앓는 대상체에 투여되는 세포는 본원에서 개시되는 줄기-세포-유도 NC 또는 CP 전구체로부터 분화된/성숙된 뉴런 집단이다.
5.5 키트
본원에서 개시되는 요지 사안은 줄기 세포의 분화를 유도하기 위한 키트를 제공한다. 소정 구현예에서, 키트는 (a) 하나 이상의 전환 성장 인자 베타(TGFβ)/액티빈-노달 신호전달의 억제제, (b) 하나 이상의 BMP 신호전달의 활성화제 (c) 하나 이상의 Wnt 신호전달의 활성화제, 및 (c) 하나 이상의 신경 능선 계통 마커를 발현하는 분화된 세포 집단으로 줄기 세포의 분화를 유도하기 위한 지침을 포함한다.
소정 구현예에서, 키트는 (a) 하나 이상의 전환 성장 인자 베타(TGFβ)/액티빈-노달 신호전달의 억제제, (b) 하나 이상의 BMP 신호전달의 활성화제, (c) 하나 이상의 FGF 신호전달의 활성화제, 및 (d) 하나 이상의 두개 기원판 계통 마커를 발현하는 분화된 세포 집단으로 줄기 세포의 분화를 유도하기 위한 지침을 포함하며, 소정 구현예에서, 키트는 선택적으로 (e) 하나 이상의 Wnt 신호전달의 활성화제를 포함한다.
소정 구현예에서, 키트는 (a) 하나 이상의 전환 성장 인자 베타(TGFβ)/액티빈-노달 신호전달의 억제제, (b) 하나 이상의 BMP 신호전달의 활성화제, (c) 하나 이상의 FGF 신호전달의 억제제, 및 (d) 하나 이상의 비-신경 외배엽 계통 마커를 발현하는 분화된 세포 집단으로 줄기 세포의 분화를 유도하기 위한 지침을 포함한다.
소정 구현예에서, 키트는 (a) 하나 이상의 전환 성장 인자 베타(TGFβ)/액티빈-노달 신호전달의 억제제, (b) 하나 이상의 BMP 신호전달의 활성화제 (c) 하나 이상의 SHH 신호전달의 활성화제, (d) 2개 이상의 FGF 신호전달의 활성화제, 및 (e) 하나 이상의 뇌하수체 세포 또는 뇌하수체 세포 전구체 마커를 발현하는 분화된 세포 집단으로 줄기 세포의 분화를 유도하기 위한 지침을 포함한다.
소정 구현예에서, 지침은 줄기 세포를 억제제(들), 활성화제(들) 및 분자(들)와 특정 순서로 접촉시키는 단계를 포함한다. 억제제(들), 활성화제(들) 및 분자(들)의 접촉 순서는 줄기 세포를 배양하기 위해 사용되는 세포 배양 배지에 의해 결정될 수 있다.
소정 구현예에서, 지침은 본 개시의 방법(상기, 섹션 5.2 참고)에 의해 기재된 바와 같이 줄기 세포를 억제제(들), 활성화제(들) 및 분자(들)와 접촉시키는 단계를 포함한다.
소정 구현예에서, 본 개시는 단위 투여량 형태로 본원에서 개시되는 줄기-세포-유도 전구체 집단 또는 상기 전구체를 포함하는 조성물의 유효량을 포함하는 키트를 제공한다. 소정 구현예에서, 줄기-세포-유도 세포는 분화된 성숙 세포이다. 소정 구현예에서, 키트는 치료 조성물을 함유하는 멸균 용기를 포함한다; 이러한 용기는 상자, 앰플, 병, 바이알, 튜브, 백, 파우치, 블리스터-팩, 또는 당분야에 알려진 다른 적합한 용기일 수 있다. 이러한 용기는 플라스틱, 유리, 라미네이트지, 금속 호일, 또는 약제를 보유하기에 적합한 다른 물질로 제조될 수 있다.
소정 구현예에서, 키트는 본원에서 개시되는 줄기-세포-유도 전구체 집단 또는 이를 포함하는 조성물을 신경변성 장애 또는 뇌하수체 장애를 앓는 대상체에 투여하기 위한 지침을 포함한다. 지침은 신경변성 장애의 치료 또는 방지를 위한 세포 또는 조성물의 용도에 관한 정보를 포함할 수 있다. 소정 구현예에서, 지침은 하기: 치료제의 설명; 신경변성 장애 또는 이의 증상의 치료 또는 방지를 위한 투여량 일정 및 투여; 주의사항; 경고; 적응증; 역-적응증; 과투여량 정보; 유해 반응; 동물 약리; 임상 연구; 및/또는 참고문헌 중 적어도 하나를 포함한다. 지침은 (존재하는 경우) 용기 상에 직접적으로, 또는 용기에 적용되는 라벨로서, 또는 용기 내에 또는 용기와 함께 공급되는 별도 시트, 팜플렛, 카드, 또는 폴더로서 인쇄될 수 있다.
5.6 치료 화합물을 스크리닝하는 방법
본원에서 개시되는 줄기-세포-유도 NC 및 CP 전구체는 신경변성 장애 또는 뇌하수체 장애, 예를 들어 프리드리히 실조 또는 뇌하수체저하 장애를 모델링하기 위해 사용될 수 있고, 또한 질환 세포 표현형을 극복할 수 있는 후보 화합물에 대해 스크리닝하기 위한 플랫폼으로 작용할 수 있다. 후보 화합물이 신경변성 장애 또는 뇌하수체 장애를 경감시키는 능력은 후보 화합물이 신경변성 장애 또는 뇌하수체 장애를 유도하는 생리적 또는 세포성 결함을 구제하는 능력을 검정하여 결정될 수 있다.
소정 구현예에서, 방법은 (a) (i) 줄기 세포(예컨대, 인간 줄기 세포)로부터 유도되는 본원에서 개시되는 전구체 집단으로서, 전구체 세포가 신경변성 장애 또는 뇌하수체 장애를 앓는 대상체로부터의 iPSC로부터 제조되거나, 전구체 세포가 장애의 세포성 및/또는 대사적 특징을 발현하는, 집단, 및 (ii) 평가 화합물을 제공하는 단계; (b) 전구체를 평가 화합물과 접촉시키는 단계; 및 (c) 전구체의 기능적 활성, 또는 유전자 발현을 측정하는 단계를 포함한다. 소정 구현예에서, 전구체는 적어도 약 24시간(1일), 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 약 7일, 약 8일, 약 9일, 또는 약 10일 동안 평가 화합물과 접촉된다. 소정 구현예에서, 전구체는 평가 화합물과의 접촉 전에 분화된 뉴런으로 성숙된다.
5.7 NE, NC, CP 또는 NNE 운명을 증가시키는 화합물을 스크리닝하는 방법
본 개시는 NE, NC, CP 또는 NNE 전구체 분화를 촉진하는 화합물을 스크리닝하는(예를 들어, 고처리량 스크리닝) 방법을 제공한다. 소정 구현예에서, NE, NC, CP, 및 NNE는 본원에서 기재되는 방법에 따라 분화될 수 있고, 여기서 세포는 평가 화합물과 접촉되어 평가 화합물이 NE, NC, CP 또는 NNE 유도를 증강시키는지 여부를 결정한다. 소정 구현예에서, 세포는 세포의 NE, NC, CP 또는 NNE 운명으로의 분화를 결정하기 위한 리포터 작제물, 예를 들어, 검출가능한 리포터, 예컨대 NE, CP, NC 또는 NNE 전구체에 특이적인 유전자의 프로모터에 작동 가능하게 연결된 GFP를 발현한다. 소정 구현예에서, 리포터 작제물은 PAX6::H2B-GFP, SOX10::GFP, SIX1::H2B-GFP, 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
소정 구현예에서 스크리닝 방법은 본원에서 기재되는 방법에 따라 인간 줄기 세포를 배양하는 단계를 포함하며, 여기서 평가 화합물은 1일째, 또는 2일째, 또는 3일째, 또는 4일째, 또는 5일째, 또는 6일째, 또는 7일째에 배양 배지에 첨가된다. 소정 구현예에서, 스크리닝 방법은 평가 화합물과 함께 배양된 세포에서 하나 이상의 NE, NC, CP 또는 NNE 전구체 마커, 예컨대 SOX1 및/또는 PAX6(NE); SIX1, PAX6, PAX3, PITX3, 크리스탈린 알파 A, 크리스탈린 알파 B, 및/또는 TFAP2A(CP); SOX10 및/또는 TFAP2A(NC); 또는 TFAP2A의 검출가능한 발현 수준 및 검출가능한 SIX1 및 SOX10(NNE)의 발현 부재를 결정하는 단계, 및 상기 수준을 평가 화합물이 없는 배지에서 배양된 세포에서의 동일한 마커의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하며, 여기서 평가 화합물과 함께 배양된 세포에서 마커 발현 수준의 증가는 평가 화합물이 NE, NC, CP 또는 NNE 전구체 유도를 증강시킴을 시사한다.
6. 실시예
본원에서 개시되는 요지 사안은 제한으로서가 아니라 본원에서 개시되는 요지 사안의 예시로서 제공되는, 하기 실시예 및 별첨을 참조하여 더 잘 이해될 것이다.
6.1 실시예 1: 신경외배엽(NE), 신경 능선(NC) 두개 기원판(CP) 및 비-신경 외배엽(NNE) 외배엽 계통의 줄기 세포-유도 전구체 세포를 제조하는 방법
요약
인간 다능성 세포(hPSC)는 잠재적으로 신체의 모든 세포 유형을 생성할 수 있다. 장기 목표는 시험관내에서 완전한 인간 계통수를 재생성하는 전략의 개발이다. 이러한 시도는 각각의 3개 배엽층에 대한 접근을 제공하는 모듈식 분화 플랫폼의 확립에 의존한다. 본 실시예는 완전히 정의된 조건 하에 병렬적으로 모든 4개의 주요 외배엽 계통(CNS, 신경 능선, 두개 기원판, 비-신경 외배엽)을 유도하는 전략을 제공한다. 유전적 리포터 세포주를 사용하여, 비-CNS 외배엽 유도체의 유도에서 BMP 신호전달에 대한 용량- 및 시간-의존적 역할이 실증되었다. 초기 세포 운명 결정 메커니즘을 분석하고 두개 기원판 운명을 증가시키는 화합물에 대해 화학적 스크리닝에서 본 발명의 플랫폼의 유용성을 추가 실증하기 위해 유전자-편집 도구를 적용하였다. 요구 시 4개의 외배엽 계통에 대한 재현성 있는 접근은 시험관내 인간 외배엽 계통 다양성의 재생성으로 향하는 길에서의 첫 번째 이정표이다.
결과
4개의 외배엽 계통을 유도하기 위한 dSMADi-기반 분화 프로토콜이 화학적으로 정의된 시스템을 사용하여 NE 운명으로 편중됨
4개의 주요 외배엽 계통은 신경외배엽(NE), 신경 능선(NC), 두개 기원판(CP) 및 비-신경 외배엽(NNE)을 포함한다. 이들 계통은 각각 도 1a에 요약된 바와 같은 전통적 KSR-기반 프로토콜을 사용하는 dSMADi 조건을 변형시켜 생성할 수 있다. 흥미롭게도, KSR-조건 하에, 패턴화 인자를 포함시키거나 제거하기 위한 최적 시점은 유도 후 48시간째이다(Dincer et al., 2013; Mica et al., 2013). 이 시점에, dSMADi의 계속은 전방 NE를 생성하며, CHIR99021을 이용한 Wnt 신호전달의 활성화는 두개 NC를 생성하고, BMP 억제제 LDN193189의 제거는 두개 기원판을 생성하고, 또는 LDN193189 제거와 함께 SU5402를 이용한 FGF 신호전달의 차단은 NNE 운명을 유발한다. 정의된 전사 인자 및 다른 계통-특이적 마커를 사용하여 각각의 초기 외배엽 계통을 고유하게 확인할 수 있다. NE의 생성은 SOX1 및 PAX6의 발현 및 TFAP2A의 부재에 의해 표시된다. TFAP2A의 발현은 외배엽을 비-신경 외배엽-유도 세포 유형과 구별한다. TFAP2A와 함께, SOX10 대 SIX1의 발현은 각각 NC 대 기원판 정체성을 특이적으로 표시한다. NNE에 대한 특이적 전사 인자가 존재하는지는 불명확하지만, SOX10 및 SIX1 모두의 부재 하에 TFAP2A의 발현은 이들 배양 조건 하에 NNE를 신뢰할 수 있게 확인시켜주는 것으로 나타난다(도 1b).
정의된 분화 배지 하에 이들 다양한 외배엽 계통 마커의 획득을 모니터링하기 위해, 본 실시예에서는 3개의 GFP 리포터 세포주 PAX6::H2B-GFP(도 8a, b, c 및 d) SOX10::GFP(Chambers et al., 2012; Mica et al., 2013) 및 SIX1::H2B-GFP(도 8a, b, e 및 f)를 사용하였다. 세포주의 특정 세포 유형으로의 분화는 각각 평균 95%, 50% 및 58%의 NE, 기원판 및 NC를 생성하였다(도 1c 및 1d). 전반적 분화 효율이 상당히 높았음에도 불구하고, 기원판 및 NC 세포의 수율은 반복 분화에 걸쳐 가변적이어서, 분화 배지 내 소정 인자가 변할 수 있고 이에 의해 수율에 영향을 미칠 수 있음을 제시하였다.
이들 프로토콜을 더욱 정의된 E6 배지로 전환하기 위해, 본 실시예에서는 다회 계대배양 동안 E8 중에 hPSC를 적응시키고 4개의 주요 외배엽 계통을 유발하기 위해 전술된 인자 및 농도를 유지하면서, KSR-기반 배지를 E6 기반 분화로 단순 대체하였다(도 9a). 본 실시예에서는 원래 농도의 일부 소분자, 즉 CHIR99021 및 SU5402가 분화 동안 세포를 효과적으로 사멸시켰고 재-적정되어야 함을 확인하였다. 각각의 소분자에 대한 최적 무독성 농도를 결정한 후, 본 실시예에서는 E6 조건 하의 NE 형성이 KSR-기반 조건으로 수득된 것과 동등함을 관찰하였다. E6 조건 하에 소분자의 부재 하에서의 NE 형성은 이전에 실증되었다(Lippmann et al., 2014). 본 실시예에서는 소분자를 사용하지 않거나, dSMADi를 사용하거나, 단일 TGFβ 억제제 SB431542(SB)를 사용하여 PAX6 양성 세포를 생성하는 효율을 비교하였다. 본 실시예에서는 dSMADi의 부재 하에 강력한 PAX6 발현을 확인하였다(유도 후 12일째에 총 세포의 약 40%). 그러나, PAX6을 발현하는 세포의 백분율은 SB 또는 dSMADi의 첨가 시 각각 거의 90% 및 80%까지 추가 개선되었다(도 1e 및 9b). PAX6+ NE는 효율적으로 Tbr1 양성 피질 뉴런으로 추가 분화되어(도 9e) 이들 세포가 피질 발생의 초기 단계를 거쳐 진행될 수 있음을 시사하였다. 놀랍게도, CP 또는 NNE 하에서 유지된 세포를 포함하여 거의 모든 처리군에서 높은 백분율의 PAX6+ 세포를 관찰하였다. CP 세포가 PAX6을 발현할 수 있지만, 이들 세포는 Six1을 공동발현하지 않아 이들이 CP 기원이 아님을 제시하였다(도 1e). 추가로, NC 유도는 PAX6 양성 세포도 SOX10 양성 세포도 생성하지 않아, Wnt 활성화가 NC를 유도하기보다 분화하는 세포의 영역 정체성을 변경시킬 수 있음을 시사하였다(도 9c, d). 마지막으로, KSR 대 E6 조건 하에 NC로 분화된 hPSC의 비교 유전자 발현 분석은 E6 하에서 비-신경 마커 발현의 부재를 드러내었다(도 1f). 전반적으로, 데이터는 E6에 KSR 기반 분화를 위해 개발된 소분자 조건 하에 비-신경 운명을 유도하는 인자가 부재하였음을 제시한다.
TFAP2A를 통한 BMP 신호전달이 비-CNS 운명을 생성하는 데 필요함
대부분의 외배엽 계통 프로토콜이 PAX6 양성 NE를 디폴트로 한 이유를 이해하기 위해, 본 실시예에서는 전사 인자 AP2α(TFAP2A)의 유도를 조사하였다. TFAP2A는 NC, CP 및 NNE에서 고도 발현되며 다른 계통-한정 마커, 예컨대 각각 NC 및 CP에 대해 SOX10 및 SIX1의 발현 전 분화 2일 내에 상향조절된다(Dincer et al., 2013). 여러 신호전달 분자, 예컨대 레티노이드 그리고 WNT 및 BMP 신호전달의 활성화제가 TFAP2A의 발현을 유도하는 것으로 보고되었다(Luo et al., 2003; Xie et al., 1998). 흥미롭게도, KSR 조건 하에, 강력한 TFAP2A 발현에도 불구하고 비-CNS 운명의 유도 동안 이들 신호전달 인자는 첨가되지 않았다(Dincer et al., 2013). 따라서, 본 실시예는 KSR-기반 배지가 TFAP2A의 유도에 충분한 내인성 신호를 유발할 수 있는 반면, E6에는 이러한 인자가 부재한다고 가정하였다. 따라서, 본 실시예는 관련 신호전달 분자를 직접 첨가하여 TFAP2A 발현을 복원하고자 시도하였다.
기원판 및 비-신경 외배엽의 생성
BMP 신호전달은 발생 중인 닭 배아에서 NNE 및 기원판의 형성에 중요한 것으로 나타났다(도 2a)(Groves and LaBonne, 2014). 본 실시예에서는 TFAP2A의 발현을 유도하고 BMP 신호전달의 외인성 자극에 의해 PAX6+ NE를 억제하는 것을 추구하였다. 본 실시예에서는 TFAP2A 발현이 용량 의존적 방식으로 처리 3일 내에 신속히 상향조절됨을 관찰하였다(도 2b 및 c). 고농도(20 ng/㎖)에서, 세포는 TFAP2A 양성이 되고 SOX10 및 SIX1의 발현이 부재하여 NNE가 강한 BMP 신호전달 활성화에 의해 유발됨을 시사한다(도 2d). FGF 경로의 추가 억제는 CP 유도를 차단하며 이에 의해 NNE 유도 효율을 증가시킨다. NNE로 정의된 조건을 사용하여 각질세포로의 말단 분화를 거치는 경우, 본 실시예에서는 미성숙(K14 양성) 및 성숙 표피 세포(K18 양성)(도 2e)를 모두 획득할 수 있었다.
다음으로 본 실시예에서는 BMP 신호전달의 3일 펄스가 SIX1 양성 기원판을 생성하기 충분한지 여부를 질문하였다. 실제로, BMP의 첨가는 기원판 유도를 유발하였지만, 효율이 낮았다(도 2f 및 10). 용량-반응 연구는 중등도 농도의 BMP4(약 5 ng/㎖)가 CP 유도를 위해 최적임을 나타내었다. 흥미롭게도, 기원판 분화 동안 대부분의 세포가 NNE와 유사하여, FGF 작용제의 직접 첨가가 NNE 대신 기원판 생성 효율을 부양하기 위해 필요할 수 있음을 시사하였다. 실제로, FGF8이 아닌 FGF2의 첨가는 분화 동안 SIX1 양성 세포의 형성을 거의 50%까지 증강시켰다(도 2g).
삼차 기원판은 hPSC로부터 유도된 디폴트 기원판 운명임이 이전에 나타났다(Dincer et al., 2013). 본 실시예에서는 Six1 양성 CP를 최종 분화시키고, 후방 마커, 예컨대 PAX3이 아닌 전방 기원판 마커 PAX6의 발현을 관찰하였다(도 2h). 기원판 세포에서 PAX6의 발현은 수정체, 뇌하수체 또는 후각 정체성에 적합하다. 이들 세포의 추가 분화는 수정체 특이적 인자, 예컨대 PITX3, 크리스탈린 알파 A 및 B의 발현을 실증하여, 이의 운명을 삼차 기원판이 아닌 주로 수정체로 확인시켜주었다(도 2i 및 h).
다음으로 본 실시예에서는 수정체 기원판 대신 삼차 기원판의 유도를 촉진하는 인자를 확인하고자 추구하였고, 왜냐하면 이들 인자가 E6에는 없고 KSR에는 있을 수 있기 때문이다. 발생 동안, 삼차 기원판은 PAX6+ 수정체, 뇌하수체 및 후각 기원판 이후 유도된다. 따라서, 본 실시예에서는 발생 동안 후방 세포 정체성을 유발하는 것으로 알려진 정규 WNT 신호전달의 활성화가 패턴화를 삼차 계통으로 이동시키는 데 충분할 수 있는지 여부를 평가하였다. 기원판-유도 BMP 펄스 후, 초기 분화 단계 동안 CHIR99021의 추가 펄스로의 노출은 삼차 기원판을 시사하는 SIX1 기원판 세포에서 PAX3 발현을 유발할 수 있었다(도 2j). 이들 데이터는 최소 배지 조건 하에, 본 실시예가 시험관내 기원판 유도 동안 생체내의 세포 운명 선택 및 영역 특화를 면밀히 개괄할 수 있었음을 나타낸다.
신경 능선의 생성
본 실시예에서는 짧은 펄스의 BMP4(1 ng/㎖)와 함께 Wnt 신호전달의 활성화가 거의 동종성인 SOX10 양성 NC 집단을 생성할 수 있음을 관찰하였다(도 3a 및 도 11). 흥미롭게도, 이처럼 낮은 농도의 BMP4로, TFAP2A는 약하게만 유도되어(도 2f) NC가 TFAP2A를 발현하지 않거나 저수준 발현하는 초기 전구체 세포로부터 최초 발생할 수 있음을 제시한다. 그러나, WNT 및 BMP 모두의 첨가는 상승적으로 작용하여, TFAP2A뿐만 아니라 비-신경 외배엽 운명의 또 다른 마커인 DLX3을 활성화한다(도 3b). 또한, NC의 분화는 각각 Isl1 및 Mash1 염색에 의해 표시되는 자율 및 감각 뉴런을 생성할 수 있다(도 3c). 여기에 제시된 데이터는 BMP 신호전달의 초기, 용량-의존적 유도가 이전에 보고된 것보다 큰 효율과 낮은 변동성으로 NC를 포함하는 비-CNS 외배엽 운명의 형성을 허용함을 실증한다.
외배엽으로부터 정제된 세포 유형의 발현 분석
본 실시예에서 외배엽 특이적인 리포터 세포주를 생성하였으므로, 본 실시예에서는 모든 4개 인간 외배엽 계통의 전사 발현 특징부를 결정하고자 했다. NNE 계통을 제외하고, 본 실시예에서는 각각의 리포터 세포주를 사용하여 GFP 양성 세포를 정렬하였고(모든 세포주는 WA-09 hESC로부터 유도됨) 이들 정제된 세포에서 RNA 서열분석을 수행하였다. 비편향(Unbiased) 클러스터링 알고리즘으로 NE는 hESC와 가깝게 클러스터링된 반면 NNE는 모든 다른 외배엽 계통과 가장 멀리 떨어져 클러스터링됨이 나타났다. 흥미롭게도, 주성분 분석에 기반하여, NC 및 CP는 서로 가까이 클러스터링되어 이들 세포가 유사한 전사 프로필을 갖지만 각각 이의 SOX10 및 SIX1의 발현에서 발산됨을 제시하였다(도 4a 및 b). 이어서 차별적으로 발현된 유전자를 공유된 및 고유한 발현 프로필을 갖는 것들로 그룹화하였다(도 4c). 이어서 이러한 발현 패턴으로 유전자 실체론 분석을 거쳤다(Edgar et al., 2013)(도 4d). 세포외 기질 재구성과 연관된 유전자가 모든 비-CNS 유도 세포 유형에서 유의미하게 농축되었다. 이는 분화 동안 초기 BMP 신호가 부분적으로 ECM을 통해 작용할 수 있거나 적어도 ECM 관련 전사체가 농축된 세포 유형을 유도함을 시사한다. 반대로, NE와 연관된 실체론에는 시냅스 전파 및 신경계 발생이 관여된다. NC에 특이적인 개별 실체론에는 세포 접착 및 칼슘 결합이 포함되는 반면, CP는 시냅스 전파 및 이온 막 수송에 대해 농축되었다. 종합하면, 4개의 외배엽 계통에 대한 전사 발현 프로필은 전반적으로 구별되며 나타낸 각각의 특정 계통과 연관된 기능을 포착한다.
초기 인간 외배엽 계통 데이터의 부족으로 인해, 다음으로 본 실시예에서는 본 실시예로 각각의 외배엽 계통에 대한 더욱 특이적인 마커를 확인할 수 있는지 여부를 질문하였다. 외배엽 계통 간에 유의미한 차별적 발현을 갖는 전사체뿐만 아니라 고유하게 상향조절된 유전자로 추가 검증을 거쳤다. CNS 및 비-CNS 운명 간에 공유되는 외배엽 분화 동안 특이적으로 상향조절된 유전자에는 ANXA1, LGI1, NR2F2 및 ZNF503이 포함되었다. 또한, CNS 대 비-CNS를 묘사하는 인자는 NEUROG1, HAND1, TFAP2A 및 TFAP2B(도 4e)이다. NE에서, 인자, 예컨대 Sox1 및 Hes5가 CNS의 세포를 배타적으로 확인시켜주는 반면, 모든 다른 계통에서는 저수준 Pax6 전사체를 확인할 수 있었다(도 4f). 흥미롭게도, 본 실시예에서는 NC 계통에서 특이적으로 특성규명되지 않은 아연 핑거 단백질 ZNF229의 고발현을 관찰하였다. 다른 계통에 대한 것과 마찬가지로, 본 실시예에서는 ELAVL4 및 SMYD1이 각각 기원판 및 NNE에서 우선적으로 발현됨을 확인하였다. 상기 분석은 외배엽 형성 동안 각각의 주요 계통의 확인을 위해 알려진 및 신규한 유전자 모두의 하위세트를 제공한다.
TFAP2A의 손실이 비-CNS 유도체의 유도에 영향을 미침
4개의 주요 외배엽 계통을 유도하기 위해 본원에서 나타낸 신규한 조건은 강력하고 효율적이다. 따라서, 본 실시예에서는 외배엽 계통 특화 동안의 핵심 담당인자를 확인하기 위해 교란 연구를 수행하고자 한다. 비-CNS 운명으로의 수임에 대한 본 연구에서의 주요 후보 중 하나는 TFAP2A였는데, 이것이 dSMADi 동안 초기에 고도 발현되기 때문이다. 비-CNS 계통이 TFAP2A 발현에 의존하는지 여부를 설명하기 위해, 본 실시예에서는 CRISPR/Cas9 시스템을 사용하여 TFAP2A 녹아웃 hESC 세포주를 생성하였다. 2개의 가이드 RNA를 사용하여 틀 이동 결실을 유도하였고 양성 클론을 서열분석하여 결실의 정도 및 성질을 결정하였다(도 12a 및 12b). TFAP2A 발현의 제거는 고 BMP의 존재 하에 짧은 3일 유도를 사용해서 확인하였다(도 5a 및 12c). TFAP2A 대 야생형 hESC의 추가 비교 연구는 CP 또는 NNE 조건 하에 TFAP2A 녹아웃 세포에서가 아니라 야생형에서 분화 6일째에 E-카드헤린의 강력한 상향조절을 나타내었다(도 5b). 이들 데이터는 TFAP2A가 E-카드헤린의 발현을 촉진하며 이것이 세포를 NC 또는 CP 운명으로의 EMT-유사 전환으로부터 보호할 수 있음을 제시한다.
E-카드헤린 데이터에 기반하여, 본 실시예에서는 TFAP2A 녹아웃 세포가 비-CNS 계통으로 전환할 수 없고 CNS NE를 디폴트로 할 것으로 가정하였다. 상기 가설과 일치하게, NE의 유도는 TFAP2A의 손실에 영향받지 않았다(도 5c). CNS-농축 전사 인자, 예컨대 Sox1 및 Pax6은 다른 계통으로부터의 오염이 거의 없이 풍부하였다. 또한, NC 및 기원판 프로토콜은 TFAP2A 녹아웃 대 야생형 세포에서 SOX1 및 PAX6 발현의 수준을 증가시켰다(도 5c 및 d). 그러나 예상치 못하게, TFAP2A KO 세포의 NC 또는 CP로의 유도 동안, SOX10 및 SIX1 양성 세포를, 각각 야생형 대비 더 적은 수이기는 해도, 확인할 수 있었다. 이는 TFAP2A 발현의 제거가 비-CNS 세포 유형을 억제하는 데 충분하지 않음을 시사한다. 또 다른 놀라운 결과는 TFAP2A의 손상이 다른 NNE 관련 유전자, 예컨대 Smyd1의 발현에 영향을 미치지 않는다는 것이었다. 이들 데이터는 NNE의 형성이 TFAP2A 발현에만 의존하지 않음을 제시한다. 실제로, 이전 연구는 TFAP2C(AP2α)의 발현이 NNE에서 우세함을 나타내었다(Li and Cornell, 2007).
인간 외배엽 계통을 유도하기 위한 본 발명의 신규한 플랫폼은 생체내 발생 프로그램을 모사하는 외배엽 계통 특화 동안 BMP 신호전달에 있어서의 중요한 역할을 실증하였다. 또한, 본 실시예는 시스템을 운명 선택의 결정에 관여되는 정의된 발생 인자, 예컨대 TFAP2A의 역할을 밝히기 위해 유전적으로 조작할 수 있다는 개념-증명을 나타낸다.
기원판 형성을 증강시키기 위한 인자에 대한 소분자 스크리닝
화학적으로 정의된 시스템으로의 전환으로 가장 주요한 외배엽 계통을 위해 뛰어난 수율을 갖는 모듈식 분화 플랫폼을 제공한다. 그러나, CP 운명의 유도는 상대적으로 낮게 유지되었다(약 40%). CP 유도 효율을 추가 증강시키고 HTS 검정에서 본 발명의 플랫폼의 적합성을 실증하기 위해, 본 실시예에서는 Six1::H2B-GFP 리포터 세포주 상에서 약리 활성 화합물 라이브러리(LOPAC)를 사용하여 소분자 스크리닝을 수행하였다(도 6a). 본 실시예에서는 대조군 분화에서 관찰된 수준을 초과하여 Six1의 발현을 증가시키는 3개의 잠재 후보를 확인하였다. 세로토닌 수용체 작용제인 BRL-5443; NF-kB 및 STAT 매개 확인 전사를 억제하는 능력을 갖는 식물 호르몬인 파르테놀라이드; 및 메탈로프로테아제 억제제인 펜안트롤린. 일차 히트의 추가 검증 시, 펜안트롤린이 Six1을 발현하는 세포의 백분율을 신뢰할 수 있게 증강시킴을 확인하였다(도 6c, 13a, 13b).
화합물 및 CP 발생 간에 뚜렷한 연관성은 없었지만, 다음으로 본 실시예에서는 펜안트롤린이 어떻게 기원판 운명을 특이적으로 농축시키는 데 작용할 수 있는지를 결정하였다. CP로의 분화는 다른 계통 마커, 예컨대 Sox10, T, MyoD 또는 Sox17의 발현을 유도하지 않고 대조군 대비 Six1 발현의 5배 증가를 나타내었다(도 6d). 다음으로 본 실시예에서는 펜안트롤린의 첨가가 부가적이거나 선택적인 방식으로 CP 유도 효율을 개선하는지 여부를 평가하였다. 흥미롭게도, FGF2의 부재 하에 펜안트롤린의 첨가 시 Six1 양성 세포가 거의 4배 증가한다(69% 대 18%)(도 6e). FGF2 또는 FGF2와 펜안트롤린의 첨가 후, Six1 양성 세포의 농축은 각각 34% 및 46%로 감소하였다. 이들 결과는 펜안트롤린이 화합물의 존재 하에 생존하지 못할 수 있는 다른 외배엽 계통 대신 Six1 양성 CP 세포를 선택적으로 농축할 수 있음을 제시한다. 결론적으로, 소분자 스크리닝은 선택 계통으로의 hPSC 분화 효율을 추가 개선할 수 있는 신규한 인자를 확인하기 위한 본 발명의 외배엽 계통 플랫폼의 사용 타당성을 실증한다.
NC, CP 및 NNE의 모듈식 생성에 대한 변형된 접근은 용량-의존적 BMP 신호전달 반응에 의존한 반면, NE의 생성은 변형 없이 두 시스템에서 모두 강력하였다(도 7a). BMP 신호전달의 최초 펄스는 비-모듈식 KSR-기반 분화 조건과 비교되는 경우(도 7b 대 도 1d), NC 및 더 적은 정도로 CP의 생성에서 효율 증가 및 변동성 감소를 허용하였다.
주된 초점은 배지-관련 인자, 예컨대 KSR에 의해 유도된 변동성을 제거하는 매우 강력한 모듈식 외배엽 분화 플랫폼을 확립하는 것이었다. 그러나, 추가적인 잠재적 변동성 원천, 예컨대 코팅 기재 및 세포 밀도가 존재한다. 매트리겔은 수천 여 단백질로 이루어진 일반적으로 사용되는 코팅 기재인 반면, 본 연구에서 사용되는 비트로넥틴은 단일 재조합 단백질이다. 비트로넥틴 대신 매트리겔의 사용이 외배엽 계통 특화의 강력함에 부정적으로 영향을 미칠 수 있는지 여부를 결정하기 위해, 본 실시예에서는 표준 비트로넥틴-기반 프로토콜 대비 11개 배치의 매트리겔을 평가하였다. 놀랍게도, 2개를 제외한 모든 배치가 매우 강력한 유도 효율을 제공하였다(도 14a). 외배엽 계통 선택에 영향을 미치는 것으로 알려진 또 다른 잠재 인자는 세포 밀도이다. 즉, PAX6 양성 NE 대 Sox10 양성 NC의 생성은 시작 hPSC 접종 밀도에 의존하는 것으로 나타났다(Chambers et al., 2009). 본 실시예에서는 매트리겔(도 14b) 및 비트로넥틴(도 14c)을 모두 사용하여 50,000 내지 300,000개 세포/㎠를 사용하는 분화를 수행하였고, 세포 밀도가 세포 운명 결정에서 뚜렷한 역할을 담당하지 않음을 확인하였다. 이들 추가 데이터는 4개의 외배엽 계통의 획득을 위한 코팅 기재 또는 세포 밀도에 대해 최소 의존성을 나타내는 분화 플랫폼의 강력함을 추가로 확인시켜준다.
토의
hPSC로부터 요구 시 다량의 특정 세포 유형을 유도하는 목표는 적합한 분화 플랫폼의 이용 가능성에 의존한다. 현재 이용 가능한 프로토콜은 배지 조성 및 배양 기법에 있어서 여러 불일치를 겪기 쉽다. 여기서, 본 실시예에서는 화학적으로 정의된 시스템을 사용하여 모든 4개 주요 외배엽 계통을 유도하는 전략을 제공한다. 생체내 발생 신호의 적용은 분화의 성공을 크게 증강시키며, 본 실시예에서는 4개의 신호전달 경로의 조절이 초기 외배엽 계통 선택의 전체 다양성을 재생성하는 데 충분함을 나타낸다. CNS 대 비-CNS 운명의 묘사는 BMP를 이용하는 용량-의존적 처리에 의존한다. 임의의 특정 계통, 예컨대 NC, CP 및 NNE를 촉진하기 위한 특이적 BMP 농도는 매우 좁다. BMP는 적어도 부분적으로 TFAP2A의 상향조절을 통해 작용하며 이는 WNT 활성화와 함께 작용하여 NC를 생성하고, FGF 활성화와 함께 작용하여 CP를 생성하고, FGF 억제와 함께 작용하여 NNE를 생성할 수 있다. 이 결과는 최소 배지 시스템에서, 소수의 소분자를 사용하여 생체내 발생을 모사함으로써 외배엽 세포 운명 결정을 되풀이할 수 있음을 실증한다. 외배엽 분화 플랫폼은 발생 경로의 유전적 분석뿐만 아니라 소분자 스크리닝을 위해 매우 강력하고 적합하다. 본 발명의 연구는 또한 TFAP2A의 손실이 NE 또는 NNE의 형성에 영향을 미치지 않고 NC 및 CP 운명의 유도에 크게 영향을 미침을 실증하였다.
방법
hPSC 배양 및 분화
H9 ESC(WA09) 및 변형된 리포터 세포주(계대 40~70)를 마우스 배아 섬유아세포 영양공급세포 상에서 녹아웃 혈청 대체물(KSR)(Life Technologies) 기반 배지(DMEM-F12, 20% KSR, L-글루타메이트 및 10 ng/㎖ FGF2) 중에 배양하였다. KSR hPSC를 비트로넥틴이 코팅된 E8 배지(Life Technologies)로 직접 전달하고 4~5회 계대배양 동안 적응시킨 후 분화를 수행하였다. KSR 기반 분화를 신경외배엽 및 신경 능선(Mica et al., 2013), 그리고 기원판 및 비-신경 외배엽(Dincer et al., 2013)에 대해 전술된 바와 같이 수행하였다.
E8로부터 시작된 모든 분화를 EDTA를 사용하여 단세포로 해리하고 ROCK 억제제(Tocris) 함유 E8 중에 고밀도로 재접종하였다. 세포는 전형적으로 매트리겔 코팅된 디쉬 상에서 200,000개 세포/㎠의 밀도로 씨드접종하였다. E8에서 E6으로의 교체로 분화를 유발하였다(즉, d0). 세포를 d12까지 10 μM SB 및 500 nM LDN을 함유하는 E6 중에 배양하여 신경외배엽(NE) 형성을 일으켰다. 신경 능선(NC)을 먼저 d0~d2부터 10 μM SB, 600 nM CHIR 및 1 ng/㎖ BMP4로 처리하였다. d3에, 세포를 d12까지 1.5 μM CHIR을 함유하는 10 μM SB 중에 유지하였다. 수정체 기원판을 먼저 d0~d2부터 10 μM SB 및 5 ng/㎖ BMP4로 처리하였다. d3에, 세포를 d12까지 50 ng/㎖ FGF2를 함유하는 10 μM SB 중에 유지하였다. 삼차 기원판을 먼저 d0~d2부터 10 μM SB 및 5 ng/㎖ BMP4로 처리하였다. d2에, 600 nm CHIR을 첨가하였다. d3에, 세포를 10 μM SB 및 600 nM CHIR로 처리하였다. d4~d12부터, 세포를 10 μM SB로 처리하였다. 마지막으로, 비-신경 외배엽(NNE)을 d0~d1부터 10 μM SB, 10 μM SU5402 및 10 ng/㎖ BMP4로 처리한 후, d2~d12부터 10 μM SB 및 5 ng/㎖ BMP4로 처리하였다.
Pax6 및 Six1 H2B-GFP 녹-인 리포터 세포주의 생성.
공여체 플라스미드를 작제하고 인퓨전 클로닝 시스템(Infusion Cloning System, Clontech)을 사용해서 pUC19 내로 클로닝하였다. TAL 효과기 뉴클레오티드 타게터(TAL Effector Nucleotide Targeter) 소프트웨어(Cermak et al., 2011; Doyle et al., 2012)를 사용하여 TALEN 서열을 예측하였다.
Pax6 TALEN 및 Six1 TALEN: TALEN 툴박스(Addgene)(Sanjana et al., 2012)를 사용해서 TALEN을 생성하고 기재된 바와 같이 수행하였다. 공여체 플라스미드(20 ㎍) 및 TALEN 페어(각각 5 ㎍)를 H9 hESC(계대 32~36) 내로 뉴클레오감염시켰다(Lonza 키트 V). 뉴클레오감염된 세포를 ROCK 억제제를 함유하는 KSR 배지 중에 MEF 영양공급세포층 상으로 씨드접종하였다. 48시간 후, 퓨로마이신(1 ㎍/㎖)을 첨가하여 양성 클론을 선택하였다. 이어서 퓨로마이신 내성 콜로니를 단리하고 게놈 DNA를 추출하고, PCR을 사용해서 표적화를 확인하였다. 추가 검증에는 유도된 분화 및 Pax6 또는 Six1 항체를 이용하는 GFP의 공동-표지화가 포함되었다.
RNA 서열분석 및 분석 .
전체 RNA(Trizol)를 적어도 2개씩, 분화 12일째에 GFP 정렬 세포(NE, NC 및 기원판)로부터 또는 벌크로(NNE) 단리하였다. 6천만 개의 판독을 생성하고 Tophat v1.2(Trapnell et al., 2012)를 사용하여 정렬하였다. 이어서 판독을 HTseq(Anders et al., 2015)를 사용해서 계수하고 차별적으로 발현된 유전자를 DESeq(Anders and Huber, 2010)를 사용하여 계산하였다. 차별적으로 발현된 그룹을 LifeMap 유전자 분석학(Edgar et al., 2013)을 사용해서 이의 유전자 실체론 분류 및 신호전달 경로 농축에 대해 분석하였다. 생성 RNA 서열분석 데이터세트는 GEO로 업로딩한다.
TFAP2A 녹아웃 세포주 생성 .
CRISPR/Cas9 시스템을 사용하여 녹아웃 hESC 세포주를 생성하였다. 간략하게, 2개의 가이드 RNA를 CRISPR 설계 툴(Cong et al., 2013)을 사용하여 예측하고 TOPO-블런트 벡터(Mali et al., 2013)(Life Technologies) 내로 클로닝하였다. Cas9-GFP(5 ㎍) 및 두 가이드RNA(각각 1 ㎍)를 H9 hESC 내로 뉴클레오감염시키고 ROCK 억제제를 함유하는 KSR 배지 중 매트리겔 코팅 디쉬 상에 재접종하였다. 24시간 후, 세포를 GFP에 대해 정렬하고 ROCK 억제제를 함유하는 KSR 배지 중 MEF 영양공급세포층 상에 씨드접종하였다. 이어서 콜로니를 단리하고, TFAP2A의 표적화된 영역을 PCR에 의해 증폭하고 TOPO TA 벡터 내로 클로닝하고 서열분석하여 틀 이동 돌연변이체를 확인하였다.
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6.2 실시예 2: 인간 다능성 줄기 세포로부터 다양한 호르몬-방출 뇌하수체 세포의 유도
요약
인간 다능성 줄기 세포(hPSC)는 재생 의약에서의 적용을 위한 잠재적으로 무제한의 세포 원천을 나타낸다. 호르몬 생성 세포는 세포 치료법 적용에 특히 적합할 수 있고, 뇌하수체샘 기능부전의 치료는 잠재적인 치료 표적일 수 있다. 이전 연구에서는 생체내 뇌하수체샘 발생에 관여되는 발생 상호작용을 모사하는 3D 기관유사 배양을 사용하여 마우스 ESC로부터 뇌하수체 계통의 유도를 실증하였다.
본 실시예에서는 세포 제조에 적합한 화학적으로 정의된 단층 배양 조건을 사용하여 hPSC로부터 전방 뇌하수체 계통을 유도하기 위한 단순하고 고도로 효율적인 전략을 기재한다. 본 실시예에서는 정제된 기원판 계통이 복잡한 공동-배양 조건의 부재 하에 정의된 신호를 사용하여 뇌하수체 운명으로 유도될 수 있음을 실증한다. 단세포 유전자 발현 분석을 사용하여 본 실시예에서는 80% 초과의 뇌하수체 호르몬-발현 세포를 갖는 hPSC-유도 계통의 다양성을 정의한다. 마지막으로 본 실시예에서는 시험관내 기저 및 자극-유도 호르몬 방출 그리고 뇌하수체 기능부전의 쥐과 모델로의 이식 후 생체내 이식 및 호르몬 방출을 실증한다.
여기서 본 실시예에서는 완전 정의된 cGMP-대비 단층 배양 조건 하에 hPSC로부터 전방 뇌하수체의 호르몬-생성 세포의 효율적 유도를 보고한다. 추가로 본 실시예에서는 시험관내 달성될 수 있는 전방 뇌하수체 서브타입의 다양성을 설명하기 위한 단세포 mRNA 발현 데이터를 제공한다. 또한, 본 실시예에서는 생성된 세포가 적절한 자극에 반응함으로써 시험관내에서 기능적이고 생체내 뇌하수체저하증의 동물 모델에서 호르몬을 분비함을 나타낸다. 데이터는 mESC를 사용하는 초기 보고와는 대조적으로, 뇌하수체 세포 운명이 발생 중인 샘의 복잡한 3D 구성의 모사와는 독립적으로 그리고 전방 뇌하수체 정체성을 유도하는 것으로 여겨지는 시상하부 세포와의 직접적 접촉 없이 유도될 수 있음을 시사한다. 본 실시예는 정제된 기원판 전구체 세포에 적절한 신호를 제공함으로써 뇌하수체 정체성이 고효율로 특화될 수 있고 형태원 구배의 추가 조작이 호르몬 세포 유형의 상대적 조성에서 제어되는 변화를 허용함을 실증한다. 본 실시예에서는 뇌하수체저하증의 세포-기반 치료를 위한 추가 개발에 적합한 다양한 호르몬 생성 세포 유형에 접근하기 위한 강력한 분화 플랫폼을 제공한다.
결과
완전 정의된 조건 하에 hPSC로부터의 두개 기원판의 유도
본 실시예에서는 최근에 hPSC로부터의 샘뇌하수체를 포함하는 두개 기원판의 생성을 보고하였다(Dincer et al., 2013). 그러나 이전 프로토콜은 뇌하수체 계통 세포를 생성하기 위해 최적화되지 않았고 몇몇 잘못 정의된 시약, 예컨대 녹아웃 혈청 대체물(KSR), 매트리겔 및 마우스 배아 섬유아세포(iMEF) 영양공급세포를 함유하였다. 이들 성분은 주어진 분화 프로토콜의 강력함에 대한 변동성의 큰 원천이며 인간 적용에 적합한 세포 치료법의 개발을 복잡하게 만든다. 또한, PSC로부터 전방 뇌하수체 계통 세포를 생성하는 효율은 마우스 및 인간 세포 모두에서의 모든 공개된 연구에서 낮았다. 마지막으로, 마우스 ESC에서의 3D 배양 연구(Suga et al., 2011)에 의해 제시된 바와 같이 유도 공정 동안 시상하부 세포와의 직접적 상호작용이 요구되는지 여부 또는 제한된 수의 정의된 신호가 뇌하수체 운명을 유발하는 데 충분한지 여부를 결정적으로 평가하는 것이 중요했다.
프로토콜에서의 첫 번째 단계는 전방 뇌하수체 계통을 생성하는 데 적격인 초기 두개 기원판 세포의 효율적 유도이다. 신규한 두개 기원판 유도 프로토콜은 무혈청 단층-기반 유도 조건에 의존하며 완전 정의된 cGMP-대비 성분을 사용한다. 기원판 유도를 유발하기 위해 사용되는 특이적 신호는 생체내 기원판 유도를 특화하는 것으로 여겨지는 발생 신호에 기반한다(도 15a). 본 실시예에서는 중등도 농도의 BMP4로의 노출이 두개 기원판 운명의 효율적 유도를 위해 요구됨을 관찰한다. 또한 FGF 신호의 부재 하에 수정체 디폴트를 또한 보고하는 생체내 발생 중에 닭 배아에서의 연구와 일치하게 이러한 조건 하에(도 22) 수정체가 "디폴트" 기원판 운명인 것으로 드러난다(Bailey et al., 2006). 상세한 경시적 발현 분석은 다능성 마커의 신속한 손실 그리고 mRNA(도 15b) 및 단백질(도 15c) 수준 모두에서 분화 6일 경 핵심 기원판 유전자, 예컨대 SIX1, EYA1 및 DLX3/5의 강력한 유도를 드러내었다. 오염 세포 유형의 존재를 표시하는 전사체, 예컨대 SOX10(신경 능선), SOX17(내배엽), T/Brachyury(중배엽) 또는 MYOD(근육 계통)는 이러한 조건 하에 유도되지 않았다(도 15b). 이전 연구에서는 PAX3+ 삼차 기원판을 hPSC-유도 기원판 세포의 "디폴트" 정체성으로서 보고하였다(Dincer et al., 2013). 정의된 기원판 유도 조건을 사용하는 현재 프로토콜은 PAX3 발현이 아닌 PAX6 발현을 나타낸다(도 15c). 기원판 유도 및 PAX6 발현의 수율 및 선택성을 추가 정량하기 위해, 본 실시예에서는 SIX1::H2B-GFP(도 25)., PAX6::H2B-GFP, SOX10-GFP에 대한 hESC 유전 리포터 세포주를 사용하였다(Chambers et al., 2012; Mica et al., 2013). 분화 6일째 및 11일째의 유세포 측정은 오염 SOX10 양성 신경 능선 세포의 부재 하에 PAX6 양성 및 SIX1 양성 전방 두개 기원판의 강력한 유도를 확인시켜주었다(도 23).
hPSC-유도 두개 기원판으로부터 전방 뇌하수체의 패턴화
뇌하수체샘의 복잡한 형태형성 발생은 초기 배아 단계(마우스에서 약 E10)에 일어난다. 샘의 전방엽 및 중간엽은 모두 경구 외배엽으로부터 유도되며, 이는 뇌하수체 기원판에 대응하는 반면, 후방 뇌하수체샘은 신경 외배엽으로부터 발생한다(도 16a). 유도성 조직 상호작용뿐만 아니라 FGF, BMP 및 SHH를 포함하는 다양한 정의된 신호전달 경로가 생체내에서 오목부 함입, 적절한 샘 발생 및 호르몬 서브타입 특화를 위해 중요한 것으로 나타났다(도 16a, 상부 패널)(리뷰를 위해 문헌(Zhu et al., 2007) 참고). 여기서 본 실시예에서는 기원판 운명으로 hPSC 분화를 유도하는 이들 핵심-신호전달 경로의 조절이 뇌하수체 정체성을 유발하는 데 충분한지 여부를 평가하였다(도 16a, 하부 패널). 데이터는 SHH, FGF8 및 FGF10으로의 적시 노출이 PITX1/2, LHX3/4뿐만 아니라 HESX1 및 SIX6을 포함하는 전방 뇌하수체 발생과 연관된 유전자를 강력히 유도함을 나타낸다(도 16b). 뇌하수체 분화 조건 하의 발현을 또한 PITX1, LHX3, LHX4 및 SIX6에 대한 항체를 사용하여 단백질 수준 상에서 확인하였다(도 16c).
본 실시예에서는 cGMP-대비 E8/E6-기반 유도 프로토콜을 공개된 KSR-기반 기원판 유도 프로토콜(PIP)과 비교하였다(Dincer et al., 2013). KSR에 있어서, 분화 효율에 극적으로 영향을 미칠 수 있는 로트별 변동성을 보상하기 위해, 본 실시예에서는 2개의 구별되는 농도의 BMP 억제제 LDN-193189를 사용하여 PIP를 수행하였다. 분화 15일 후, 세포를 범-기원판 마커, 예컨대 SIX1뿐만 아니라 범-뇌하수체 마커 PITX1, PITX2, LHX3, 및 LHX4에 대해 탐침분석하는 qRT-PCR을 사용하여 분석하였다. 또한, 신경외배엽 마커 PAX6 및 비-신경 외배엽 전사 인자 TFAP2A를 분석에 포함시켰다(도 30a). 세포 정체성을 SIX1 및 LHX3에 대한 면역형광 염색을 사용하여 단백질 수준에서 추가 확인하였다(도 30b). 이들 실험을 위해 사용된 KSR 로트는 SIX1 및 TFAP2A의 저발현 및 PAX6이 고발현에 의해 나타난 바와 같이 뇌하수체 또는 기원판 정체성을 효과적으로 유도하는 데 실패하였다. LDN-193189 농도 감소는 새로운 E8/E6-기반 프로토콜에 비해 그 효과를 부분적으로는 구제할 수 있었으나 완전 구제할 수는 없었다. 여기에서 제시되는 cGMP대비 프로토콜은 다양한 hESC 및 hiPSC 세포주에 걸쳐 신뢰할 수 있고 필적하는 효율로 작용한다(도 31a~31c). 또한, 본 실시예에서는 재조합 단백질 SHH가 소분자 smoothened 작용제, 예컨대 푸르모르파민 및 SAG에 의해 대체될 수 있음을 확인시켜주었다(도 31d 및 31e). 그러나, 전방 뇌하수체-계통 마커의 강력한 유도에도 불구하고, 본 실시예에서는 소분자-기반 유도 조건을 사용하는 경우 세포사 증가를 관찰하였고, 이는 본 발명자들로 하여금 후속 연구를 위해 재조합 SHH를 사용하도록 촉발하였다.
흥미롭게도, hPSC-유도 시상하부 원기에 의해 컨디셔닝된 배지(Maroof et al., 2013; Merkle et al., 2015)(도 24)는 뇌하수체 마커 발현을 강력히 유도하기에 충분하지 않았다(도 16b). 구체적으로, CM만 사용하는 경우 LHX4뿐만 아니라 HESX1 및 SIX6의 유도가 부재하였다. LHX4 및 SIX6이 뇌하수체 전구체 증식에서 시사되었고, 이는 시상하부 계통 CM의 존재 하에 생성된 총 세포수의 감소를 설명할 수 있었다. 마우스 ESC에서는 시상하부 원기와의 직접적 조직 상호작용이 뇌하수체 발생 동안 필요할 수 있다는 증거가 존재한다(Suga et al., 2011). 그러나, 이 데이터는 정의된 외인성 신호가 뇌하수체 기원판 정체성을 유도하기에 충분할 수 있음을 제시한다. 뇌하수체 기원판 유도 및 분화 동안 시상하부 조직의 역할을 보다 직접적으로 평가하기 위해, 본 실시예에서는 SIX1::H2BGFP 리포터 세포주를 사용하였다(도 25). 디폴트 조건 하에 분화된 초기 기원판 세포를 분화 6일째에 SIX1::H2B-GFP 발현에 대해 정렬한 후, SHH, FGF8 및 FGF10(뇌하수체 조건)의 존재 하에서 또는 hPSC-유도 시상하부 신경외배엽에 의해 컨디셔닝된 배지의 존재 하에서, 수정체 조건(디폴트) 하에 추가 분화시켰다(도 17a). 유전자 발현 분석은 어떠한 시상하부 계통 세포가 없는, 정제된 SIX1::H2B-GFP+ 세포에서도, 정의된 유도 조건이 모든 핵심 뇌하수체 마커의 발현을 유도하는 데 충분함을 드러내었다. 대조적으로, 시상하부 CM은 디폴트 수정체 조건 하에 관찰된 수준을 초과하여 LHX4 발현을 유도하지 못했다(도 17b). 뇌하수체 유도는 전기원판 조직의의 패턴화를 배제하기 위해 표준 프로토콜에 비해 더 늦게 시작되었으므로(6일 대 4일), 특히 LHX4의, 유도 수준은 비정렬 세포 상에서의 표준 뇌하수체 기원판 유도 프로토콜 대비 SIX1::H2B-GFP 정제된 세포에서 약간 더 낮았다. 대안적으로, 정렬 공정도 유효 효율을 감소시킬 수 있었다.
상이한 실험 세트에서, 본 실시예에서는 6일째 정렬 SIX1::H2B-GFP+ 세포를 hPSC-유도 시상하부 원기와 직접 접촉시켜 공동 배양하고, 추가 분화 9일(15일)째에 예정-기원판 마커 SIX1뿐만 아니라 뇌하수체 마커 LHX3에 대해 세포를 염색하였다. 추가 대조군으로서, 본 실시예에서는 "디폴트" 수정체 조건뿐만 아니라 표준 뇌하수체 조건 및 시상하부 컨디셔닝된 배지를 포함시켰다(도 17a). 수정체 조건이 렌즈꼴-유사 클러스터를 형성하기 시작하고 SIX1 발현을 하향조절한 반면, 뇌하수체 조건은 SIX1/LHX3 이중 양성 세포를 생성하였다. 컨디셔닝된 배지는 SIX1을 유지할 수 있는 반면, 약한 수준의 LHX3 발현만을 유도하였다. 공동-배양 조건은 SIX1 발현을 유지할 수 있었지만, LHX3 발현은 관찰되지 않았다(도 17c). 이들 발견은 정확한 외인성 발생학적 신호가 시상하부 계통 세포로부터의 세포 접촉 매개된 신호의 부재 하에 hPSC를 뇌하수체 계통으로 유도하는 데 충분하다는 아이디어를 뒷받침한다. 본 실시예는 공동-배양 조건의 추가 최적화가 궁극적으로 뇌하수체 계통 세포를 제공할 수 있음을 배제할 수는 없지만, 정의된 계통의 hPSC-유도 세포 상에 작용하는 정의된 신호의 사용은 보다 복잡한 공동-배양 기반 시스템에 내재적인 변동성을 감소시킬 수 있고, 후속 응용 적용에 더 적합한 플랫폼을 제공할 수 있다.
hPSC 유도 샘뇌하수체 세포가 기능적임
샘뇌하수체의 주요 기능은 스트레스 반응(아드레노코르티코트로픽 호르몬[ACTH]), 골격 성장(성장 호르몬[GH]), 대사(갑상샘-자극 호르몬[TSH]) 및 생식 기능(프로락틴[PRL], 여포-자극 호르몬[FSH], 황체형성 호르몬[LH])을 포함하는 인체에서의 주요 이벤트를 제어하는 6개의 상이한 호르몬을 분비하는 것이다. 따라서 본 실시예에서는 분화 30일 후 배양에서 호르몬 서브타입의 존재를 평가하였다. 본 실시예에서는 배양에서 ACTH, GH, PRL뿐만 아니라 FSH 및 LH 발현 세포를 검출할 수 있었다(도 18a). 세포 배양 상청액의 ELISA 측정은 세포가 ACTH, GH 및 FSH에 대한 기본 분비율을 나타냄을 확인시켜주었다(도 18b). 전방 뇌하수체샘에서의 호르몬 방출은 다양한 표적 기관에 의해 분비되는 다양한 인자로부터 뿐만 아니라 문맥을 통해 시상하부 세포에 의해 방출된 상류 인자로부터 몇몇 피드백 메커니즘에 의해 철저히 조절된다. 따라서, 뇌하수체 세포의 기능적 반응은 이들 다양한 조절 자극과 밀접하게 연결되어야 한다. 분화 30일째의 hPSC-유도 뇌하수체 세포는 CRF, 스트레신 또는 유로코르틴으로의 자극에 반응하여 ACTH의 유도된 방출을 나타내었다. 대조적으로, 부적절한 자극, 예컨대 그렐린 또는 소마토크리닌에 대한 노출은 ACTH 방출을 유발하지 않았다(도 18c). 다른 한편, CRF가 아닌 소마토크리닌은 GH 방출에서 강력한 증가를 유발하였다(도 18d). 마지막으로, 본 실시예는 나파렐린으로의 노출 시 FSH의 유도를 나타낼 수 있었다(도 18e).
단세포 유전자 발현 분석이 호르몬 계통의 다양성을 드러냄
샘뇌하수체 내 다양한 호르몬 전구체 계통의 분화(Tabar, 2011)는 다양한 패턴화 이벤트가 관여되는 철저하게 조절되는 공간적 및 시간적 공정이다(도 16a). hPSC-기반 배양 시스템에서 전구체 운명의 다양성을 설명하기 위해, 본 실시예에서는 Fluidigm 플랫폼을 사용하여 단세포 qRT-PCR 실험을 수행하였다. 본 실시예에서는 다능성 줄기 세포로부터 성숙 호르몬-발현 세포로의 전체 뇌하수체 발생에 걸쳐 34개 유전자를 탐침분석하였다. 본 실시예에서는 또한 잠재적인 중배엽 또는 내배엽 오염물질, 예컨대 T(Brachyury), MYOD 및 SOX17에 대해 검정하기 위한 프라이머를 포함시켰다. 분화 30일째 및 60일째에 세포의 주성분 분석(PCA)은 대부분의 세포가 일정에 앞서 가거나(즉, 60일 프로필을 나타내는 30일 세포) 늦어지는(즉, 30일 특징을 보유하는 60일 세포) 세포가 거의 없이 뚜렷한 시간 의존적 변화를 나타냄을 보여주었다(도 19a, b). 스크레(scree) 그래프(도 19b)는 대부분의 데이터 변동성을 설명하는 PCA 성분을 정의하였다. 계층 클러스터링은 대부분 시간 축을 따라 몇몇 더 작은 서브클러스터가 산재되는 2개의 주요 클러스터를 생성하는 세포의 분리를 확인시켜주었다(도 19c).
또한, 미가공 ct 값에 기반한 열지도를 도 32에 제공한다. 본 실시예에서는 전구체 마커 HESX1에 대해, 그리고 코르티코트로프에서 일시적으로 발현되는 보다 성숙한 마커인 NEUROD1에 대해, 30일 배양에서 면역형광 염색에 의해 단세포 데이터를 추가 검증하였다. 분화 15일째의 면역형광 분석이 NEUROD1에 대한 음성 대조군으로 작용하였다(도 33a). 본 실시예에서는 분화 30일째에 동일한 세포에서 HESX1 및 NEUROD1의 공동-표지화를 확인시켜주었다. 그러나, HESX1 발현 수준은 15일째 대비 30일째에서 훨씬 더 낮았다.
분석은 30일 배양이 높은 백분율의 뇌하수체 유사 세포를 함유하며, 약 70%의 세포가 뇌하수체 마커 PITX1 및 LHX3을 공동 발현함을 드러내었다. 상기 백분율은 60일경 추가로 증가되었다. 다른 한편, 30일경 본 실시예에서는 T, SOX17 또는 MYOD를 발현하는 단 4개 세포(분석된 모든 세포의 약 5%)만을 검출할 수 있어서, 잠재 오염물질의 백분율이 낮음을 제시하였다. 대부분의 세포가 뇌하수체샘에서 POMC 계통의 발생을 위한 핵심으로 나타난 전사 인자인 TBX19(TPIT)를 발현하였다(Lamolet et al., 2001). 또한, 대부분의 세포(약 84%)가 범 기원판 마커 SIX1을 발현하였다. 또한 대부분의 SIX1+ 세포는 뇌하수체 기원판 운명에 적합한 PAX6을 발현하였다. 그러나, 본 실시예에서는 조합되어 세포의 총 20%를 나타내는 작은 세포 하위세트에서 PAX2(아가미위), PAX3(삼차) 또는 PAX8(귀)을 포함하는 다른 기원판 운명의 발현을 또한 관찰하였다.
전방 뇌하수체의 궁극적인 기능적 단위는 특정 호르몬을 발현하고 분비하는 세포이다. 단세포 분석은 분화 30일째에 대략 50%의 세포가 적어도 하나의 호르몬 mRNA종을 발현함을 나타내었다. 상기 백분율은 60일경 약 80%까지 증가되어, 추가적인 시험관내 성숙을 시사하였다(도 19d). 발생 중인 및 성체 설치류 뇌하수체샘이 모두 하나를 초과하는 호르몬을 발현하는 세포를 함유할 수 있음을 제시하는 보고가 있었다(Nunez et al., 2003; Villalobos et al., 2004). 실제로, hPSC-유도 배양에서 본 실시예에서는 분화 30일경 세포의 10%에서 하나를 초과하는 호르몬 전사체("다중호르몬")의 발현을 검출할 수 있었다. 분화 60일경, 상기 백분율은 전체 세포 집단의 약 30%까지 증가되었다(도 19d). 본 실시예에서는 60일경 다수의 다중호르몬 세포가 POMC 및 GH(약 10%)를 발현함을 확인하였다. 2개를 초과하는 전사체를 발현하는 세포는 60일경에만 검출되었고, 항상 POMC를 포함하였다(도 26).
분화 30일째에 hPSC-유도 뇌하수체 세포에서 발현되는 가장 빈번한 호르몬 전사체는 POMC(전체 세포의 30%)였고, 이는 등쪽 뇌하수체 원기로부터 출현하는 것으로 여겨진다. 보다 배쪽 세포 유형, 예컨대 GH 또는 TSH는 분화 30일경 전체 세포 집단에서 더 낮은 백분율(약 20%)을 차지하였다. PRL은 심지어 더 작은 세포 하위세트에서 발현되었다. 마지막으로, 발생 후기 단계에서만 나타나는, 2개의 가장 배쪽 세포 유형인 FSH 및 LH는 30일경에는 검출되지 않았다(도 19e). 분화 60일경, POMC 및 GH 발현 세포의 수는 각각 55% 및 30%까지 증가되었다. 여전히, 아주 소수의 세포만 분화 60일째에 FSH 및 LH를 발현하였다(도 19e). 단세포 PCR에 부가하여, 본 실시예에서는 상업적으로 이용 가능한 BD 라이오플레이트(Lyoplate) 스크리닝 키트를 사용하여 30일 배양의 세포-표면 마커 발현을 특성규명하였다(도 34).
형태원을 사용하는 시험관내 전방 뇌하수체 세포의 등쪽-배쪽 패턴화
뇌하수체저하증은 매우 다양하고 복잡한 질환이다. 뇌하수체 기능부전의 원인에 따라, 영향받는 호르몬 유형이 변할 수 있다. 예를 들어 GH 결핍은 선천성 유전 질환을 갖는 환자에서 일반적으로 관찰되지만(van Gelderen and van der Hoog, 1981) 또한 방사선 치료 후 환자에서도 일어날 수 있다(Sklar and Constine, 1995). 대조적으로, 뇌하수체샘의 자가면역 질환인 림프구성 뇌하수체염은 주로 ACTH에 영향을 미친다(Rivera, 2006). 따라서, 향후 hPSC 유도 뇌하수체 세포의 광범위한 적용을 위해, 세포 대체 치료법을 주어진 환자 집단의 구체적 요구에 대해 맞춤화해야 할 수 있다. 표준 조건은 대부분 등쪽, ACTH+ 세포를 제공하므로, 본 실시예에서는 추가 신호를 사용하여 보다 배쪽 세포 유형의 생성을 증강시킬 수 있는지 여부를 질문하였다.
FGF8 및 BMP2 신호전달 구배가 마우스 뇌하수체샘의 등쪽-배쪽 패턴화에서 중요한 역할을 담당하는 것으로 나타났다(Rosenfeld et al., 2000)(도 16a). 따라서 본 실시예에서는 뇌하수체-계통 세포를 고농도 FGF8(등쪽화) 또는 BMP2(배쪽화)로, 또는 중간 농도 수준의 2개의 패턴화 인자의 혼합물로 처리하여 생체내에서 일어나는 형태원 구배를 모사하였다. 뇌하수체 전구체 계통 및 호르몬 서브타입의 핵심 전사 인자에 대한 유전자 발현 연구는 가장 배쪽 세포 유형을 생성하기 위한 BMP2의 필요성을 확인시켜주었다. FSHB 및 LHB는 BMP2의 존재 하에 유의미하게 상향조절된 반면, FGF8은 FSHB 수율에 있어서 부정적 효과를 나타내었다(도 20a).
다음으로 본 실시예에서는 단세포 qRT-PCR 분석을 수행하여 분석의 해상도를 증가시켰다. FGF8, BMP2 또는 두 인자의 조합으로 처리된, 60일째 단세포의 미감독 계층 클러스터링은 3개의 더 큰 세포 클러스터를 드러내었다(도 20b). 또한, 미가공 ct 값에 기반한 열지도를 도 32에 제공한다. 각각의 3개의 처리에 해당하는 세포를 모든 클러스터에서 관찰하였다. 그러나, 클러스터 3에서 모든 전체 세포의 49%는 BMP2 처리군에서 유도된 반면, 클러스터 2에서 모든 세포의 56%는 FGF8 군으로부터 유도되었다. 클러스터 1은 모든 3개의 처리로부터의 세포를 대략 동일한 비율로 나타내었다. 각각의 전방 뇌하수체 호르몬에 대해 단세포 발현을 분석함으로써, 본 실시예에서는 hPSC-기반 배양 시스템에서 마우스 생체내 연구로부터 예측된 발견을 확인할 수 있었다(Rosenfeld et al., 2000). 고농도의 FGF8은 고농도의 BMP2 대비 POMC를 발현하는 세포 수의 증가를 야기하였다(각각 75% 대 40%)(도 20c). 또한 중간 농도의 두 신호전달 분자는 FGF8 또는 BMP2 단독 대비 GH 및 TSHB를 발현하는 세포의 증가를 일으켰다(도 20c). 마지막으로, 고농도 BMP2는 ACTH+ 등쪽 세포 유형의 수를 감소시켰을 뿐만 아니라 FSHB 및 LHB를 발현하는 배쪽 세포 유형의 수를 증가시켰다.
다음으로 본 실시예에서는 3개의 배양 조건(FGF8, FGF8/BMP2, BMP2; 도 20d) 하에 4개의 상이한 호르몬에 대해 전통적인 면역형광 염색을 사용하여 단세포 qRT-PCR 데이터를 검증하였다. 면역세포화학 데이터의 정량은 FGF8 처리 배양에서 등쪽 ACTH 발현 세포로의 편향을 확인시켜주었다. FGF8/BMP2로의 조합 처리 후 PRL 및 GH가 가장 풍부하게 관찰되는 호르몬이었으나, BMP2 처리 배양에서는 FSH가 가장 풍부한 세포 유형이었다(도 20e). POMC는 ACTH의 전구체 폴리펩타이드이며 44개 아미노산이 번역 동안 제거되어, 궁극적으로 호르몬 ACTH를 생성한다.
이식된 인간 ESC-유도 전방 뇌하수체 세포가 뇌하수체저하증의 생체내 모델에서 기능적임
hPSC-유도 뇌하수체 세포가 생체내에서 생존하고 기능하는 능력을 평가하기 위해, 본 실시예에서는 30일째 세포를 뇌하수체절제 래트 내로 이식하였다. 인두주위 방법을 사용하여 뇌하수체샘의 수술적 제거 후(도 21a), 혈중 ACTH 수준을 측정함으로써 래트에서의 뇌하수체저하증을 확인하였다. 성공적으로 뇌하수체절제된 래트를 매트리겔 단독 주사를 수여받는 모의군(n=4) 및 hESC-유도 뇌하수체 세포(30일째, BMP2 처리 없는 표준 조건)를 함유하는 매트리겔을 수여받는 이식군(n=7)의 2개 실험군으로 나누었다. 2 × 106개 세포의 피하 이식 후, 처리군 및 대조군을 모두 혈류 중 뇌하수체 호르몬 수준의 7주 이식 후 모니터링으로 추적하였다(도 21b~d). 이식 후 3주째부터 시작해서, 이식군에서의 호르몬 수준이 1주 시점 대비 증가하기 시작한 반면, 모의군에서의 수준은 크게 변화하지 않고 유지되었다. ACTH 수준은 7주 실험 기간 동안 대조군 대비 이식군에서 일관되게 더 높은 수준으로 유지되었다(도 21b). 상해를 입지 않은 동물에서 관찰된 ACTH 수준 대비, 이식군에서는 ACTH 수준의 약 60%를 회복하였다(데이터는 나타내지 않음). 다른 두 호르몬, 즉 GH 및 LH의 수준 증가는 보다 가변적이었지만, 평가된 모든 시점에서 유의성에 도달하지 못했다. 그러나, 본 실시예에서는 이식 3주 및 7주 후 GH 수준에서 유의미한 증가를 검출할 수 있었다(도 21c). LH 수준의 유의미한 증가는 관찰되지 않았다(도 21d). 이식 동물에서의 호르몬 수준을 온전한 연령 매칭 래트에서의 수준과 비교하였고, ACTH에 있어서 약 40%, GH에 있어서 약 28%, 및 PRL에 있어서 약 20%로 확인되었다(도 35). 이식된 세포의 기능을 평가하기 위한 최종 단계에서, 본 실시예에서는 호르몬 분비에 의해 영향받는 하류 인자의 측정을 수행하였다. ACTH의 방출 시, 정상 HPA-축 반응의 일환으로 부신에 의해 분비되는 글루코코르티코이드가 증가한다(Webster and Sternberg, 2004). 인간에서, ACTH는 코르티솔의 방출을 유발하는 반면, 설치류에서의 주요 글루코코르티코이드는 코르티코스테론이다(Wand, 2008). 따라서 본 실시예에서는 두 실험군에서 모두 코르티코스테론 수준을 측정하였다(도 21e). 이식군은 일관되게 더 높은 수준의 코르티코스테론을 나타내어 이식 후 7주경 통계적 유의차를 생성하였다. 이들 데이터는 hPSC-유도 세포에 의해 방출된 인간 ACTH가 숙주 부신으로부터 방출된 스테로이드 호르몬을 유발할 수 있음을 시사한다. 이식 7주째에, 동물을 희생시키고, 이식편을 조직학적으로 분석하였다(도 21f~g). 본 실시예에서는 이식편으로 각각 6개의 전방 뇌하수체 호르몬을 발현하는 세포를 검출할 수 있었다(도 21f). 이들 데이터는 생체내 세포 생존을 확인시켜주며 세포의 생체내 분화 및 성숙을 추가로 제시한다. 이식편의 입체적 정량은 이식편 당 평균 3.08 × 106 ± 0.42 × 106(평균 ± SD; n = 3)개의 인간 세포를 나타내었고, 면역조직화학에 의해 SIX1 및 인간 핵 항원(hNA)의 공동-발현에 의해 결정된 바와 같이, 대부분(95% 초과)이 기원판 정체성을 가졌다. 이식편에서 Ki67-양성 증식 세포의 비율은 hNA+ 집단의 9.6% ± 0.6%(평균 ± SD; n = 3)였다. 전체 이식편은 다능성-연관 표면 마커 SSEA-4 및 Tra1-60에 대해 음성으로 염색되었다. 이식 후 최대 7주까지 종양의 징후는 검출되지 않았다. 이식편의 입체적 정량은 동물 당 평균 18212 ± 2969개의 ACTH+ 세포를 나타내었고(광학 분할기 방법), 이식편 부피는 81 ± 10 ㎣ 이식편(Cavalieri 추정기; 평균 ± SD; n=3)이었다.
방법
ESC 및 배양 조건
인간 다능성 줄기 세포 H9(WA-09, XX, 35~50계대), MEL-1(XY, 20~40계대), HUES-6(XX, 24~40계대), hiPSC(태아 섬유아세포 세포주 MRC5(ATCC CCL-171)로부터 유도된 사제 생성 hiPSC(Chambers et al., 2009), XY, 15~30계대) 및 변형된 리포터 세포주(모두 H9 배경, 40~75계대)를 Essential8 배지(E8)(Fisher Scientific)를 사용하여 VTN-N(Fisher Scientific) 상에서 유지하고(Chen et al., 2011) EDTA를 사용하여 1주 2회 계대배양하였다(Chen, 2008). 세포를 월 1회 미코플라즈마 오염에 대해 평가하였다.
ESC 분화
신경 외배엽으로의 분화를 약간의 변형을 포함하여 전술된 바와 같이 수행하였다(Chambers 2009). 간략하게, 세포를 E8 + Y-27632(Tocris)에서 VTN-N 코팅 디쉬 상에서 250,000개 세포/㎠로 접종하였다. 24 h 후(0일째) 배지를 10 μM SB431542(Tocris Biosciences), 500 nM LDN193189(Stem Cell Technologies) 및 1 μM XAV939(Tocris Biosciences)가 보충된 Essential6(E6)(Chen)으로 교체하였다(5일까지). 5일째부터 XAV939 상에서 배지를 제거하엿다. 배지를 11일까지 매일 교체하였다.
시상하부 외배엽 분화를 약간의 변형을 포함하여 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다(Maroof et al., 2013; Merkle et al., 2015). 간략하게, 세포를 E8 + Y-27632 중 VTN-N 코팅 디쉬 상에서 250,000개 세포/㎠로 접종하였다. 24 h 후(0일째) 배지를 2일 동안 10 μM SB431542가 보충된 E6으로 교체하였다. 2일부터 11일까지 E6 배지 상에 고농도 SHH(1 ㎍/㎖)를 보충하였다. 컨디셔닝된 배지 제조를 위해, 세포를 E6 단독 중에 24 h 동안 배양하고 2회 세척한 후 유도 배지로부터 잠재적인 SHH를 제거하였다. 13일째에 E6 단독을 세포에 첨가하고 24 h 동안 컨디셔닝하였다. 이를 사용하기 전에, 컨디셔닝된 배지를 멸균 여과하여 파편 및 죽은 세포를 제거하였다.
수정체 분화를 위해 세포를 E8 + 10 μM Y-27632 중 VTN-N 코팅 디쉬 상에서 250,000개 세포/㎠로 접종하였다. 24 h(0일째) 후 배지를 10 μM SB431542 및 5 ng/㎖ BMP4(R&D Systems)가 보충된 E6으로 교체하였다. 배지를 매일 교체하였다. 3일째에 BMP4를 배지로부터 제거하고 세포를 15일째까지 E6 + 10 μM SB431542 중에 배양하였다. 15일째부터 세포 상에서 최대 120일 동안 E6 단독 중에 유지하였다. 30일째부터, 배지 교체 동안 배지에 1주 1회 VTN-N(1:100)을 보충하여 세포가 플레이트로부터 박리되는 것을 방지하였다.
뇌하수체 분화를 위해 세포를 E8 + 10 μM Y-27632 중 VTN-N 코팅 디쉬 상에서 250,000 세포/㎠로 접종하였다(분화는 24웰 플레이트에서 가장 잘 작용함). 24 h(0일째) 후 배지를 10 μM SB431542 및 5 ng/㎖ BMP4(R&D Systems)가 보충된 E6으로 교체하였다. 배지를 매일 교체하였다. 3일째에, BMP4를 배지로부터 제거하고 세포를 E6 + 10 μM SB431542 중 1일 동안 배양하였다. 표준 분화 조건을 위해, 4일째에 E6에 10 μM SB431542, 200 ng/㎖ SHH(R&D Systems, C25II), 100 ng/㎖ FGF8b(R&D Systems) 및 50 ng/㎖ FGF10(Peprotech Inc.)을 보충하였다. 일부 실험을 위해, SHH를 1 μM 푸르모르파민(Stemgent) 또는 1 μM SAG(Stemcell Technologies)로 대체하였다. 이제부터 배지 부피를 2배로 하여 세포를 15일째까지 2일마다 배지 교체하였다. 분화 15일째에 SIX1 H2B::GFP+ 세포를 BDFACS Aria III 세포 정렬기를 사용하여 정렬하였다. 이어서 정제된 세포를 폴리오르니틴/라미닌/파이브로넥틴-코팅 플레이트 상에서 10 μM Y-27632, 200 ng/㎖ SHH, 100 ng/㎖ FGF8b 및 50 ng/㎖ FGF10이 보충된 E6 중에 액적(50,000개 세포/10 ㎕ 방울)으로 접종하였다. 24 h 후 30일째까지 배지를 SHH, FGF8 및 FGF10 함유 E6으로 교체하였다. 배지를 2일마다 교체하였다. 일부 실험을 위해 뇌하수체 유도를 약간 더 늦게(6일째) 시작하거나 세포를 4일째 또는 6일째부터 시상하부 신경외배엽에 의해 컨디셔닝된 배지 중에 분화시켰다. 공동-배양 실험을 위해, SIX1 H2B::GFP 양성 세포를 6일째에 정렬하고 50,000개 세포/㎠를 10 μM SB431542가 보충된 E6 단독 중 시상하부 신경외배엽 세포 상에 직접 접종하였다.
뇌하수체 세포 성숙 및 서브타입 특화
표준(텍스트에서 달리 언급되지 않는 한) 뇌하수체 성숙을 위해, 30일째에 배지를 추가 30일 동안 "E6 단독"으로 교체하였다. 패턴화 실험을 위해(텍스트에 나타냄), E6 배지에 고농도 FGF8(100 ng/㎖, 등쪽화), 고농도 BMP2(20 ng/㎖, 배쪽화) 또는 중간 농도로 둘 다(FGF8 50 ng/㎖, BMP2 10 ng/㎖)를 보충하였다.
RNA 추출 및 전통적인 정량적 실시간 PCR
전체 RNA를 제조업체의 프로토콜에 따라 Phase-lock 튜브(5Prime)와 함께 TRIzol(Fisher Scientific) 시약을 사용하여 적어도 3회 독립 실험으로부터 추출하였다. 전체 RNA 1 ㎍을 iScript(BioRad)를 사용하여 cDNA로 역전사시켰다. 정량적 RT PCR을 위해, 본 실시예에서는 BioRad CFX96 열 사이클러 상에서 QuantiTect 프라이머 검정(Qiagen)과 함께 SSoFast EvaGreen Mix(BioRad)를 사용하였다. 모든 반응은 제조업체의 프로토콜에 따라 수행하였다. 유전자 발현을 글리세르알데하이드 3-포스페이트 탈수소효소(GAPDH) 및 대조군 세포 유형(도면에 나타냄)에 대해 정상화하였다. 결과를 ΔΔCt 방법을 사용하여 계산한다(Livak and Schmittgen, 2001).
단세포 정량적 RT-PCR
단세포 PCR 분석을 위해 세포를 아큐타제를 사용하여 탈착시켰다. 40 ㎛ 세포 여과기를 통해 여과한 후 DAPI 음성 세포를 BDFACS Aria III 기계 상에서 정렬하고, 파편 및 죽은 세포의 세포 조제물을 본질적으로 세정해냈다. 정렬 세포 현탁액을 400,000개 세포/㎖의 농도로 조정하였다. 단세포를 제조업체의 매뉴얼에 따라 Fluidigm C1 시스템을 사용하여 포착하였다. 각각의 C1 칩에 대한 포착률을 표준 조직 배양 명시야 현미경을 사용해서 현미경으로 확인하였다. 포착률은 다음과 같았다: 30일: 91%(87/96) 60일: 94%(90/96) 60일 FGF8: 93%(89/96) 60일 FGF8/BMP2: 89%(85/96) 60일 BMP2: 93%(89/96). 제조업체의 프로토콜에 따라 wet-lab 평가 Fluidigm DELTAgene 검정(도 27)과 함께 C1을 사용하여 세포를 용해시키고, RNA를 추출하고, cDNA로 전사시켰다. Wet-lab 평가 DELTAgene 검정은 Fluidigm에서 직접 구매하였다. 생성 cDNA를 1:5로 희석하고 제조업체의 매뉴얼("BioMark 또는 BioMark HD System 상에서 EvaGreen을 사용하는 신속 유전자 발현 분석")에 따라 EvaGreen 화학과 함께 Fluidigm BioMark 시스템을 사용하여 단세포 PCR 증폭을 거쳤다. PCR을 Fluidigm 96.96 다이내믹 어레이를 사용하여 수행하였다. 각각의 프라이머쌍을 칩 상에서 기술적 반복물로 사용하였다. 기술적 프라이머 반복물 간에 일관된 증폭 결과를 갖는 단세포만 고려하여 위음성의 수를 증가시키는 대신 위양성 콜을 최소화하였다. 전반적 불일치율은 낮았다(프라이머쌍 당 3% 미만). 발현 데이터를 Fluidigm SINGuLAR Analysis Toolset for R(Version 3.0.2(2013-09-25) "Frisbee Sailing")과 함께 Fluidigm 실시간 PCR 분석 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
현미경, 항체 및 유세포 측정
세포를 PBS로 1회 세척 후, 세포를 20분 동안 4%(v/v) 파라포름알데하이드로 고정하고, PBS로 2회 세척하고, PBS 중 0.1%(v/v) Triton X-100을 사용하여 투과화하고, 세포를 실온에서 1~5 h 동안 PBS 중 10%(v/v) FCS로 차단하였다. 세포를 하룻밤 동안 4℃에서 PBS 중 2% FCS(v/v)에 희석된 일차 항체와 인큐베이션하였다. 본 연구에서 사용된 일차 항체의 목록을 도 28로 제공한다. 일차 항체 인큐베이션 후 세포를 PBS로 2회 세척하고 이어서 1 h 동안 실온에서 PBS 중 희석된 적절한 AlexaFluor-컨주게이션된 이차 항체와 인큐베이션하였다(1:1000; Molecular Fisher Scientific). PBS로 2회 세척 후 핵을 DAPI를 사용하여 염색하였다. 추가 2회 세척 단계 후, 세포의 형광 이미지를 Hamamatsu ORCA CCD 카메라가 장착된 Olympus IX71 도립 현미경을 사용하여 촬영하였다.
면역조직화학 분석을 위해, 동물에 PBS에 이어 4% 파라포름알데하이드를 관류시켰다. 매트리겔 플러그를 4% 파라포름알데하이드 중에 후-고정한 후 30% 수크로스 중에 침지시켰다. 매트리겔 플러그를 면역조직화학 분석을 위해 30 ㎛로 냉동섹션화하였다. 섹션을 Antigen Retrieval Reagent-Universal 용액(R&D systems)으로 전처리하였다. 섹션을 PBS로 2회 세척한 후 실온에서 1시간 동안 차단 용액(1% BSA-0.3% Triton-PBS)으로 차단하였다. 섹션을 hNA, Ki67, ACTH, GH, TSH, PRL, FSH 및 LH에 이어 Alexa-568 컨주게이션된 이차 항체로 염색하였다. 이미지를 Hamamatsu 카메라가 장착된 Olympus BX51 현미경으로 획득하였다. 전체 매트리겔 플러그에서 ACTH 세포수의 입체적 정량을 광학 분할기 탐침을 사용해서 수행하고, 이식편 부피를 Cavalieri 추정기 방법을 사용하여 분석하였다(Stereo Investigator 소프트웨어, Microbrightfield Bioscience).
유세포 측정 분석을 위해 세포(상이한 리포터 세포주)를 TrypLE(Fisher Scientific)를 사용하여 세포 배양 플라스틱에서 탈착시켰다. PBS로 한 번 세척 후, 세포를 PBS 및 DAPI 중 2% FCS, 1 mM EDTA에 현탁시켰다. 세포를 40 ㎛ 세포 여과기를 사용하여 여과하고 BD LSRFortessa 유세포 측정기 상에서 분석하였다. 단일(이중체 배제) 생활성(DAPI-) 세포만 분석하였다. FlowJo Version 9.7.6(FLOWJO LLC)을 사용하여 데이터를 추가 가공하였다.
세포 표면 마커 스크리닝
BD Lyoplate™ 세포 표면 마커 스크리닝을 위해, 30일 세포를 아큐타제를 사용하여 96웰 조영 플레이트 내로 100,000개 세포/㎠의 밀도로 재접종하였다. 4시간 후, 부착상 세포를 생체조영을 위한 사용자 매뉴얼에 따라 염색하였다. 세포를 Operetta 하이 컨텐츠 조영 시스템(Perkin Elmer) 상에서 분석하였다. Harmony 소프트웨어 패키지(Perkin Elmer)를 사용하여 이미지를 가공하고 분석하였다.
호르몬 방출의 자극
시험관내 호르몬 방출을 자극하기 위해, 세포를 전술된 바와 같이 24웰 플레이트에서 분화시켰다. 분화 30일째에 세포를 PBS로 1회 세척하고 용매 또는 자극제를 함유하는 신선 배지 250 ㎕를 각각의 웰에 첨가하였다. 12 h 후 상청액을 제거하고 2000 g에서 5분 동안 원심분리하여 파편을 펠렛화하였다. 상청액을 신선 반응 튜브로 옮기고, 급속 냉동하고, ELISA 측정 시까지 -80℃에서 보관하였다. 사용된 자극제는 CRF(Tocris, 1 μM), 스트레신 I(Tocris, 2 μM), 그렐린(Tocris, 1 μM), 소마토크리닌(Accurate Chemical, 1 ㎍/㎖), 나파렐린(Tocris, 1 μM) 및 유로코르틴(Tocris, 500 nM)이었다.
ELISA 측정
세포 상청액 중 또는 동물 혈청 중 호르몬 농도를 ELISA 측정을 사용하여 분석하였다. 세포 배양 상청액 중 호르몬 농도를 제조업체의 매뉴얼에 따라 전통적인 단일 호르몬 ELISA 키트를 사용하여 평가하였다. ACTH(Calbiotech, 래트 및 인간 ACTH를 검출함), hGH(R&D Systems, 인간 특이적), FSH(Calbiotech, FSH(lumELISA, 인간 특이적) 및 코르티코스테론(Abcam). 플레이트는 EnSpire 멀티모드 플레이트 판독기(PerkinElmer)를 사용하여 판독하였다. 생체내 샘플 중 호르몬 농도를 전통적인 ELISA(ACTH 전용, 혈청은 1:2로 희석함) 또는 종 특이적(인간 또는 래트) Milliplex 멀티플렉스 ELISA를 사용하여 Luminex 기술(Millipore)을 사용해서 분석하였다. 자기 비드-기반 샌드위치 면역검정을 제조업체의 매뉴얼에 따라 수행하였다. 2개씩의 웰에서 25 ㎕의 희석되지 않은 혈청 샘플을 Luminex FlexMap 3D(Luminex Corp, Austin, TX)에 의해 분석하였다. 5-p log 분석을 사용하여 Luminex Xponent 4.1 및 EMD-Millipore Milliplex Analyst v5.1에 의해 사이토카인 농도를 결정하였다.
뇌하수체절제 래트 내로의 세포 이식, 샘플 제조
수컷 무흉선 누드 래트(RNU 래트 Crl:NIH-Foxn1rnu, Charles River Laboratories)를 8주령에 인두주위 접근을 사용해서 뇌하수체절제하였다. 뇌하수체 절제술 1주 후 혈장 ACTH를 측정하여 뇌하수체저하증을 확인하였다. 뇌하수체 절제된 래트를 모의 대조군(n=4), 인간 ES 유도 뇌하수체 세포 피하 이식군(n=7)의 2개 군으로 무작위화하였다. 주사기(1 ㎖, BD biosciences) 및 매트리겔(BD biosciences)을 주사 전에 얼음 상에서 냉각하여 주사 전 매트리겔의 겔 형성을 방지하였다. 래트의 목을 면도하고 베타딘 및 70% 에탄올로 준비시켰다. 0.9 ㎖ 매트리겔을 2백만 개의 인간 뇌하수체 세포 현탁액(100 ㎕ essential E6 배지 중)과 혼합하였다. 매트리겔 및 세포 혼합물을 래트의 목 상에서 피하 조직 내로 주사하였다.
오전 8시에 이소플루란 마취 하에, 이식 전, 이식 후 1주, 3주, 5주 및 7주째에 후방 안구 방혈에 의해 채혈하였다. 혈액을 K2 EDTA-처리 BD Microtainer MAP(BD Biosciences)으로 수집하고 혈장을 단리하여 -80℃에서 보관하였다.
이식 7주 후, 동물을 마취하고(Fatal Plus, 60 ㎎/㎏) 0.1 M 인산염 완충 식염수(PBS, pH 7.4)에 이어 4% 파라포름알데하이드(0.1 M PBS(pH 7.4) 중)로 심장내 관류시켰다 매트리겔 플러그를 절제하고 6시간 동안 4% 파라포름알데하이드 중에 후고정한 뒤 4℃에서 24시간 동안 30% 수크로스 중에 침지시키고, 이어서 포매 화합물(OCT, Tissue-Tek, Sakura Finetek USA, Inc.) 중에 냉동하였다. 매트리겔 플러그를 면역조직화학 분석을 위해 30 ㎛로 냉동섹션화하였다. 섹션을 ACTH, GH, TSH, PRL, FSH 및 LH(토끼 IgG, 1:100, the National Hormone and Peptide Program)에 이어 Alexa 568 컨주게이션된 염소 항-토끼(life technologies)로 염색하였다. 이미지를 Hamamatsu 카메라 및 Olympus BX51 현미경으로 촬영하였다. 전체 매트리겔 플러그 내 ACTH 세포수의 입체적 정량을 광학 분할기 탐침을 사용하여 수행하고, 이식편 부피를 cavalieri 추정기 방법(Stereo Investigator Software, Microbrightfield Bioscience)을 사용하여 분석하였다.
통계 분석
데이터는 각각의 도면 주석에 나타낸 바와 같이, 샘플 평균 ± SEM으로 제시된다. 평균은 독립 실험(횟수는 해당 도면 주석에 나타냄)의 데이터를 나타낸다. 군 간 차이를 페어링되지 않은 t 테스트 또는 Bonferroni 다중-비교 포스트 혹 테스트와 함께 원-웨이 ANOVA에 의해 분석하였다. p　< 0.05 = *, p　< 0.01 = **, p　< 0.001 = ***, p　< 0.0001 = ****
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6.3 실시예 3: 다능성 줄기 세포로부터 신경 능선의 유도
다능성 줄기 세포를 E8/E6 배지 중에 배양하여 신경 능선 전구체 세포로 분화시켰다. 이들 신경 능선 전구체 세포의 자연 분화로 MASH1 발현에 의해 표시되는 자율 뉴런, 및 ISL1 및/또는 BRN3a 발현에 의해 표시되는 감각 뉴런을 모두 생성하였다.
다능성 줄기 세포를 실시예 1에 기재된 바와 같이, 그리고 도 29a에 나타낸 바와 같이 E8/E6 배지 중에 분화시켰다. 특히, 다능성 줄기 세포를 2일 동안 SB431542, BMP4 및 CHIR99021이 보충된 E6 배지 중에 분화시켰다(즉, 배양 d0부터 d2까지 E6 배지 중에서). d2에, BMP4를 배양 배지로부터 제거하고, 세포를 d2부터 d11까지의 배양일 동안 SB431542 및 CHIR99021이 보충된 E6 배지 중에 배양하였다. 11일째에, 세포를 CD49d 및 Sox10을 발현하는 세포에 대해 FACS 정렬하고, 신경 능선 분화 배지 중에 추가 배양하였다. d15에, 배양으로부터 구형체를 선택하여 재접종하고, 이를 다시 d18에 재접종하였다. d25에, 정렬된 신경 능선 세포는 MASH1 및 ISL1을 발현하였다(도 29b).
6.4 실시예 4: 인간 PSC의 모든 주요 외배엽 계통으로의 분화를 위한 모듈식 플랫폼
요약
인간 다능성 줄기 세포(hPSC)의 상이한 계통으로의 운명 유도는 활성이 정의되지 않고, 재현성 및 특정 교란의 평가를 혼동시키는 비일관성을 도입하는 가변적인 시작 조건 및 성분을 필요로 한다. 여기서 본 실시예에서는 hPSC로부터 4개의 주요 외배엽 계통을 유도하기 위한 단순한 모듈식 프로토콜을 도입한다. 최소의, 화학적으로 정의된 배지 중에 FGF, BMP, WNT, 및 TGFb 경로 활성을 정확히 변화시킴으로써, 본 실시예에서는 세포 밀도와 무관하게 상이한 기재 상의 여러 hPSC 세포주에서 신경외배엽, 신경 능선(NC), 두개 기원판(CP), 및 비-신경 외배엽의 병렬적이고, 강력하며, 재현 가능한 유도를 나타낸다. 본 실시예에서는 외배엽 분화에서 TFAP2 전사 인자의 역할을 질문하고, NC 및 CP 특화에서 TFAP2A의 중요성을 드러내고, CP 분화를 추가 증강시키는 화합물을 확인시켜준 소분자 스크리닝을 수행함으로써 본 시스템의 유용성을 강조한다. 상기 플랫폼은 외배엽 세포 유형의 전체 범위의 체계적인 유도를 위한 단순한 단계를 제공한다.
개요
초기 발생 세포 유형은 인간에서 단리하고 연구하기 어렵다. 다능성 줄기 세포(PSC)의 유도된 분화는 기본 및 응용 생물학에서의 적용을 위해 체계적 방식으로 초기 운명 결정에 접근하기 위한 모델 시스템을 제공한다. PSC를 초기 계통으로 분화시키기 위한 몇몇 전략, 예컨대 자연 분화 패러다임 및 생체내 발생 동안 작용하는 것으로 알려진 발생 경로의 시험관내 조절에 기반한 유도된 분화 전략이 존재한다(Suzuki and Vanderhaeghen, 2015; Tabar and Studer, 2014). 다양한 분화 플랫폼에 걸쳐 결과에 크게 영향을 미치는 인자에는 영양공급 세포의 사용, 단층 대 배아체(EB)-기반 전략, 또는 복잡한 배지 조성이 포함된다. 예를 들어, 여러 공개된 프로토콜에는 혈청 또는 혈청-대체 인자, 예컨대 요망되는 운명의 유도를 위한 KSR(녹아웃 혈청 대체물)을 함유하는 배지가 관여된다. 이들 시약의 제조에서 배치별 변동성은 분화의 재현성에 영향을 미쳐, 종종 특정한 관심 세포 유형을 생성하기 위해 고된 로트 평가를 추진해야 하도록 만든다(Blauwkamp et al., 2012; Gadue et al., 2006; Zimmer et al., 2016). 복잡한 시약, 예컨대 KSR에 대한 이러한 광범위한 품질 제어 전략은 임의의 단일 프로토콜에 있어서는 타당하지만, 이들은 모듈식 방식으로 수십 개 또는 가능하게는 수백 개의 정의된 세포 유형을 생성하는 것을 목표로 하는 더욱 야심찬 전략의 개발을 방지한다.
실험실에서는 각각 BMP 및 TGFb 신호전달 경로를 억제하는 소분자인 LDN193189 및 SB431542(SB)의 첨가에 기반하여 신경계의 여러 세포 유형을 유도하기 위한 확립된 프로토콜을 갖고 있다. 이중 SMAD 억제(dSMADi)로 명명된 상기 억제성 칵테일 조합은 전사 인자 PAX6의 발현에 의해 표시되는 전방 신경외배엽(NE)을 디폴트로 하는 중추 신경계(CNS) 세포의 효율적 생성을 허용한다(Chambers et al., 2009). dSMADi의 변형은 앞뇌, 중간뇌, 및 척추 전구체를 포함하는 배아의 신경축을 따라 여러 상이한 신경 서브타입을 제공할 수 있다(Suzuki and Vanderhaeghen, 2015; Tabar and Studer, 2014). 또한, dSMADi는 비-CNS 세포 유형, 예컨대 신경 능선(NC)(Menendez et al., 2011; Mica et al., 2013), 두개 기원판(CP), 및 비-신경 외배엽(NNE)(Dincer et al., 2013; Leung et al., 2013)을 생성하기 위해 적응될 수 있다. 전반적으로, dSMADi는 PAX6+ NE의 거의 균일한 층을 생성할 강력하고 널리 사용되는 플랫폼이다. 그러나, dSMADi 하에서 PAX6+ NE를 유도하는 경우라도, PAX6+ 세포에서 가장 전방의 끝뇌 마커 FOXG1+의 획득은 끝뇌 운명 가능성을 완전 복원하기 위해 WNT 신호전달 경로의 간접적 억제제(XAV09393)의 첨가를 필요로 할 수 있는 문제점인 KSR 배치 변동성에 의해 영향받을 수 있다(Maroof et al., 2013). 따라서, 확장 가능한 완전 모듈식 분화 플랫폼에는 KSR 또는 다른 복잡한 배지 인자가 없어야 한다. 여기서 본 실시예에서는 병렬적으로 모든 주요 외배엽 계통(CNS-NE, NC, CP, 및 NNE)에 접근하기 위해 이처럼 정의된 플랫폼을 확립하고자 설정하였다.
최근에, 화학적으로 정의되고 더 적은 성분으로 생성되는 몇몇 대안적 기본 배지가 개발되었다. 특히, Essential 8(E8) 배지의 개발은 단지 8개의 정의된 화합물을 이용해서 임의의 동물 단백질이 없이 hPSC를 유지할 수 있게 한다(Chen et al., 2011). 또한, 2개 성분, 즉 TGFβ1 및 FGF2의 제거는 hPSC의 자연 분화를 유발한다. E8에서 Essential 6(E6)으로의 전환은 임의의 소분자 억제제의 첨가 없이 PAX6+ NE를 생성할 수 있지만(Lippmann et al., 2014), TGFI3 신호전달 억제제의 첨가는 신경 운명 획득의 속도 및 효율을 크게 개선한다. 본 보고서에서, 본 실시예에서는 완전 정의된 배지 조건 하에 인간 PSC로부터 병렬적으로 그리고 고순도로 모든 주요 외배엽 계통을 유도하기 위한 유도된 분화 시스템을 제형화하였다. 본 실시예에서는 (특정 계통에서가 아니라) 외배엽 계통의 전체 세트 상에서 유전 교란 실험의 효과를 설명하거나 특정 외배엽 운명으로의 분화를 추가 증강시키는 분자를 확인하기 위한 화학적 스크리닝의 타당성을 실증하는 개념-증명 연구를 추구하고자 이러한 분화 전략을 적용한다. 분화 플랫폼의 효율 및 다양성은 시험관내에서 요구 시 PSC로부터 모든 인간 세포 유형에 접근하기 위해 모듈식 유도된 분화 조건을 확립하려는 장기 목표를 향한 중요 단계를 나타낸다.
결과
화학적으로 정의된 시스템이 사용되는 경우 4개의 외배엽 계통을 유도하기 위한 dSMADi-기반 분화 프로토콜이 NE 운명으로 편중됨
4개의 주요 외배엽 계통은 NE, NC, CP, 및 NNE를 포함한다. 각각의 이들 계통은 도 40a에서 요약된 바와 같이 전통적인 KSR-기반 프로토콜을 사용하여 dSMADi 조건의 변형에 의해 생성할 수 있다. KSR 조건 하에, 패턴화 인자를 포함시키거나 제거하기 위한 최적 시점은 유도 후 48 hr째이다(Dincer et al., 2013; Mica et al., 2013). 상기 시점에서, dSMADi의 지속은 전방 NE를 생성하거나, CHIR99021을 이용하는 Wnt 신호전달의 활성화는 두개 NC를 생성하거나, BMP 억제제 LDN193189의 제거는 CP를 생성하거나, 또는 LDN193189 제거와 함께 SU5402를 이용하는 FGF 신호전달의 차단은 NNE 운명을 유발한다. 정의된 전사 인자 및 다른 계통-특이적 마커를 사용하여 각각의 초기 외배엽 계통을 고유하게 확인할 수 있다. NE의 생성은 SOX1 및 PAX6의 발현 및 전사 인자 AP2a(TFAP2A)의 부재에 의해 표시된다. SOX10 및 SIX1의 존재 또는 부재와 함께 TFAP2A의 발현은 외배엽을 NNE-유도 세포 유형과 분리한다. TFAP2A와 함께, SOX10 대 SIX1의 발현은 각각 NC 대 CP 정체성을 특이적으로 표시한다. NNE에 대한 특이적 전사 인자가 존재하는지 여부는 명확하지 않은 채 남아있다; 그러나, SOX10 및 SIX1 둘 다의 부재 하에 TFAP2A의 발현은 이들 배양 조건 하에 NNE를 신뢰할 수 있게 확인시켜주는 것으로 나타난다(도 40b).
정의된 분화 배지에서 이러한 다양한 외배엽 계통 마커의 획득을 모니터링하기 위해, 본 실시예에서는 3개의 GFP 리포터 세포주 PAX6::H2B-GFP(도 40c~40f), SOX10::GFP(Chambers et al., 2012; Mica et al., 2013), 및 SIX1::H2B-GFP(도 40c, 40g, 및 40h)를 사용하였다. KSR-기반 조건 하에 특정 세포 유형으로의 세포주의 분화는 각각 평균 95%, 50%, 및 58%의 NE, CP, 및 NC를 생성하였다(도 40i 및 40j). 전반적인 분화 효율은 상당히 높았지만, CP 및 NC 세포의 수율은 반복 분화에 걸쳐 가변적이어서, KSR-기반 조건에서 소정 인자가 변할 수 있고 이에 의해 수율에 영향을 미칠 수 있음을 제시하였다. 또한 NE의 영역 패턴화를 평가하는 경우, PAX6 및 SOX1의 발현은 매우 강력했지만(도 40i), 전방 마커 FOXG1은 평가된 KSR 배치 중 하나에서 WNT 억제로도 가변적이어서(도 40j), KSR이 분화 동안 영역 정체성을 변경할 수 있는 성분을 함유함을 시사하였다.
이들 프로토콜을 보다 정의된 E6 배지로 전환하기 위해, 본 실시예에서는 다회 계대배양 동안 E8 중에서 hPSC를 적응시키고 4개의 주요 외배엽 계통을 유발하기 위해 전술된 바와 같은 인자 및 성분을 유지하면서 처음에는 KSR-기반 배지를 E6-기반 분화로 단순히 대체하였다(도 37a). 본 실시예에서는 일부 소분자, 즉 CHIR99021 및 SU5402에 있어서 원래 농도가 분화 동안 세포를 효과적으로 사멸시키며 재적정할 필요가 있음을 확인하였다(데이터는 나타내지 않음). 각각의 소분자에 대한 최적 무독성 농도를 결정한 후, 본 실시예에서는 E6 조건 하의 NE 형성이 KSR-기반 조건으로 수득된 것과 동등함을 관찰하였다. E6 조건 하에 소분자의 부재 하에서의 NE 형성은 이전에 실증되었다(Lippmann et al., 2014). 본 실시예에서는 소분자를 사용하지 않거나, dSMADi를 사용하거나, 단일 TGFI3 억제제 SB를 사용하여 PAX6+ 세포를 생성하는 효율을 비교하였다. 본 실시예에서는 dSMADi의 부재 하에 PAX6 발현의 상향조절을 확인하였다(유도 후 12일째에 총 세포의 약 40%). 그러나, PAX6을 발현하는 세포의 백분율은 SB의 첨가 또는 완전 dSMADi 시 각각 거의 90% 및 80%까지 추가 개선되었다(도 41a). PAX6+ NE는 효율적으로 TBR1+ 피질 뉴런으로 추가 분화될 수 있는(도 41c) 신경 로제트를 효율적으로 형성할 수 있어서(도 41b), 이들 세포가 피질 발생의 초기 단계를 거쳐 진행될 수 있음을 시사하였다. 추가 배양 시(분화 50일째), 생성 뉴런은 칼슘 조영에 의해 나타낸 바와 같이 글루타메이트 처리에 반응성을 나타내었다(도 41d). 놀랍게도, CP 또는 NNE 조건 하에서 유지된 세포를 포함하여 거의 모든 처리군에서 높은 백분율의 PAX6+ 세포를 관찰하였다(도 37b). CP 세포는 PAX6을 발현할 수 있지만, 이들 세포는 SIX1을 공동발현하지 않아 이들이 CP 기원이 아님을 제시하였다. 추가로, NC 유도는 PAX6 또는 SOX10+ 세포를 효율적으로 생성하지 않아(도 41e 및 41f), WNT 활성화가 NC를 유도하기보다 분화 중인, 추정 NE 세포의 영역 정체성을 변경할 수 있음을 제시하였다. 마지막으로, KSR 대 E6 조건 하에 NC로 분화된 hPSC의 비교 유전자 발현 분석은 E6 하에 비-신경 마커 발현의 부재를 드러내었다(도 41g). 전반적으로, 데이터는 E6에 KSR 기반 분화를 위해 개발된 소분자 조건 하에 비-신경 운명을 유도하는 인자가 부재함을 제시한다.
TFAP2A를 통한 MP 신호전달이 비-CNS 운명을 생성하는 데 필요함
대부분의 외배엽 계통 프로토콜이 비-신경 운명을 유도하지 못하는 이유를 이해하기 위해, 본 실시예에서는 TFAP2A의 유도를 조사하였다. TFAP2A는 NC, CP, 및 NNE에서 고도 발현되며 다른 계통-한정 마커, 예컨대 각각 NC 및 CP에 대해 SOX10 및 SIX1의 발현에 앞서 분화 수일 내에 상향조절된다(Dincer et al., 2013). 여러 신호전달 분자, 예컨대 레티노이드 그리고 WNT 및 BMP 신호전달의 활성화제가 TFAP2A의 발현을 유도하는 것으로 보고되었다(Luo et al., 2003; Xie et al., 1998).
흥미롭게도, KSR 조건 하에, 강력한 TFAP2A 발현에도 불구하고 비-CNS 운명의 유도 동안 이들 신호전달 인자는 직접 첨가되지 않았다(Dincer et al., 2013). 따라서, 본 실시예는 KSR-기반 배지가 TFAP2A의 유도에 충분한 내인성 신호를 유발할 수 있는 반면, E6에는 이러한 인자가 부재한다고 가정하였다. 따라서, 본 실시예에서는 관련 신호전달 분자를 직접 첨가하여 TFAP2A 발현을 복원하고자 시도하였다.
BMP 신호전달은 NNE 및 기원판의 형성에 중요한 것으로 나타났다(도 37c)(Groves and LaBonne, 2014). 본 실시예에서는 TFAP2A의 발현을 유도한 후 BMP 신호전달의 외인성 자극에 의해 CNS 분화를 억제하고자 추구하였다. 본 실시예에서는 TFAP2A 발현이 용량 의존적 방식으로 BMP4의 처리 3일 내에 신속히 상향조절됨을 관찰하였다(도 1d 및 e). 고농도(20 ng/㎖)에서, 세포는 TFAP2A+가 되고 SOX10 및 SIX1의 발현이 부재하여, NNE가 강한 BMP 신호전달 활성화에 의해 유발됨을 시사한다(도 37f). FGF 경로의 추가적 억제는 CP 유도를 추가 차단하며 이에 의해 NNE 유도 효율을 증가시킨다(데이터는 나타내지 않음). NNE로 정의된 조건을 사용하여 각질세포로의 말단 분화를 거치는 경우, 본 실시예에서는 미성숙(K14+) 및 성숙(K18+) 표피 세포(도 37g)를 모두 획득할 수 있었다. 이들 데이터는 BMP4 신호전달이 NNE 형성을 신속히 유도할 수 있음을 제시한다.
실제로, BMP의 첨가는 기원판 유도를 유발했지만, 효율이 낮았다(도 38a 및 10). 용량-반응 연구는 중등도 농도의 BMP4(약 5 ng/㎖)가 CP 유도를 위해 최적임을 나타내었다. 흥미롭게도, 기원판 분화 동안 대부분의 세포는 NNE와 유사하여, FGF 작용제의 직접 첨가가 NNE 대신 기원판 생성 효율을 부양하기 위해 필요할 수 있음을 시사하였다. 실제로, FGF8이 아닌 FGF2의 첨가는 분화 동안 SIX1+ 세포의 형성을 거의 50%까지 증강시켰다(도 38b).
KSR-기반 배지에서 삼차 기원판은 hPSC로부터 유도된 디폴트 기원판 운명임이 이전에 나타났다(Dincer et al., 2013). 본 실시예에서는 Six1+ CP를 최종 분화시키고, 전방 기원판 마커 PAX6 및 SIX3의 발현을 관찰하였다(도 38c). 기원판 세포에서 PAX6의 발현은 수정체, 뇌하수체 또는 후각 정체성에 적합하다. 이들 세포의 추가 분화는 면역조직화학에 의해 SIX3, CRYAA, 및 CRYAB의 발현을 실증하였고, 최초 기원판 정체성이 후방 삼차 기원판이 아닌 전방 수정체에 대응할 수 있음을 제시한다(도 38d 및 38e). 흥미롭게도, 이들 데이터는 닭 배아에서의 작업과 일치하여 수정체가 생체내 발생 동안 디폴트 기원판임을 제시한다(Bailey et al., 2006).
다음으로 본 실시예에서는 수정체 기원판 대신 삼차 기원판의 유도를 촉진하는 인자를 확인하고자 추구하였는데, 왜냐하면 이들 인자가 E6에는 없고 KSR에 있을 수 있기 때문이다. 발생 동안, 삼차 기원판은 PAX6+ 수정체, 뇌하수체 및 후각 기원판 후방에서 유도된다. 따라서, 본 실시예에서는 발생 동안 후방 세포 정체성을 유발하는 것으로 알려진 정규 WNT 신호전달의 활성화가 삼차 계통으로 패턴화를 이동시키기 충분할 수 있는지 여부를 평가하였다. 기원판-유도 BMP 처리 후, 초기 분화 단계 동안 CHIR99021의 추가 펄스로의 노출은 삼차 기원판에 적합한 기원판 세포에서 PAX3+ 및 PAX6- 발현을 유발할 수 있었다(도 38e). 이들 데이터는 최소 배지 조건 하에, 본 실시예가 시험관내 기원판 유도 동안 생체내 세포 운명 선택 및 영역 특화를 면밀히 개괄할 수 있었음을 나타낸다.
흥미롭게도, 본 실시예에서는 또한 짧은 펄스의 저용량 BMP4(1 ng/㎖)와 함께 WNT 신호전달의 활성화가 거의 동종성인 SOX10+ NC 집단을 생성할 수 있음을 관찰하였다(도 38f 및 도 11). 상기 농도의 BMP4로, TFAP2A는 약하게만 유도되어, NC가 TFAP2A를 발현하지 않거나 저수준 발현하는 초기 전구체 세포로부터 최초 발생할 수 있음을 제시한다. 그러나, WNT 및 BMP의 첨가는 둘 다 상승적으로 작용하여, TFAP2A뿐만 아니라 NNE 운명의 또 다른 마커인 DLX3을 활성화한다(도 38g). 또한, NC의 자연 분화는 각각 ASCL1 및 ISL1을 발현하는 뉴런을 생성할 수 있고, 이는 각각 자율 및 감각 뉴런 운명에 적합하며(도 38h), 생성 뉴런은 연장 배양 시 기능적으로 활성이 있다(도 38i). 여기에 제시된 데이터는 BMP 신호전달의 초기, 용량-의존적 유도가 NC를 포함하는 비-CNS 외배엽 운명의 형성을 허용하며, 그 중 몇몇은 이전에 보고된 것보다 큰 효율과 낮은 변동성을 가지고 형성됨을 실증한다.
세포주에 걸친 프로토콜의 강력함을 설명하기 위해, 본 실시예에서는 7개의 추가 ESC/iPSC 세포주를 평가하고 검증된 항체를 사용하여 외배엽 계통의 수율을 정량하였다. 각각의 PSC 세포주는 특정한 분화 계통에 있어서 적절한 마커를 유도할 수 있었으나 효율 정도가 다양했다(도 39a 및 39b). CNS 및 비-CNS 계통의 구별은 TFAP2A의 발현에 의해 표시된다. TFAP2A+ 세포의 백분율은 BMP4 처리 없이 0%~5% 범위였고 평가된 세포 유형에서 BMP4 첨가로는 56%~95%였다. 다양한 세포주로부터 전방 NE의 생성은 67% 내지 95%(FOXG1) 및 56% 내지 91%(PAX6) 범위의 효율을 나타내었다. NC는 30%~58%(SOX10)를 나타내었고 CP는 10%~45%(SIX1)를 나타내었다. 종합적으로, 이들 데이터는 정의된 배양 조건이 hPSC 세포주에 걸쳐 모든 다양한 NNE 외배엽 운명에 접근할 수 있도록 함을 실증한다.
외배엽으로부터 정제된 세포 유형의 발현 분석
4개의 외배엽 계통은 전형적으로 초기 발생 동안의 일시적 단계를 나타내며, 고도로 정의된 단계의 다수 인간 세포를 수득하는 것은 어렵다. 전형적으로, 리포터 세포주를 이용하여 특정 세포 유형을 구별한다; 그러나, PAX6은 NE 및 CP 모두에서 확인할 수 있고 SOX10은 NC 및 귀 기원판 모두에서 확인할 수 있다(Taylor and Labonne, 2005). 다음으로 본 실시예에서는 각각의 4개 외배엽 계통의 정제된 세포로부터 전사 발현 특징부를 결정하고자 하였다. NNE 계통을 제외하고, 본 실시예에서는 각각의 리포터 세포주(모든 세포주는 WA-09 hESC로부터 유도됨)를 사용하여 GFP+ 세포를 정렬하였고 이들 정제된 세포에서 RNA 서열분석을 수행하였다. 비편향 클러스터링 알고리즘으로 NE는 hESC와 가깝게 클러스터링된 반면 NNE는 모든 다른 외배엽 계통과 가장 멀리 떨어져 클러스터링됨이 나타났다. 흥미롭게도, 단일 마커, 예컨대 각각 SOX10 및 SIX1에 기반하여 순수한 NC 및 CP를 단리하려는 노력에도 불구하고, 주성분 분석에 기반하여, NC 및 CP는 서로 가까이 클러스터링되어 이들 세포가 유사한 전사 프로필을 가짐을 제시하였다(도 4a 및 4b). 이어서 차별적으로 발현된 유전자를 공유된 및 고유한 발현 프로필을 갖는 것들로 그룹화하였다(도 4c). 이어서 이러한 발현 패턴으로 유전자 실체론 분석을 거쳤다(Edgar et al., 2013)(도 4d). ECM 재구성과 연관된 유전자가 모든 비-CNS 유도 세포 유형에서 유의미하게 농축되었다. 이는 분화 동안 초기 BMP 신호가 부분적으로 ECM을 통해 작용할 수 있거나 적어도 ECM 관련 전사체가 농축된 세포 유형을 유도함을 시사한다. 반대로, NE와 연관된 실체론에는 시냅스 전파 및 신경계 발생이 관여된다. NC에 특이적인 개별 실체론에는 세포 접착 및 칼슘 결합이 포함되는 반면, CP는 시냅스 전파 및 이온 막 수송에 대해 농축되었다. 종합하면, 4개의 외배엽 계통에 대한 전사 발현 프로필은 전반적으로 구별되며 나타낸 각각의 특정 계통과 연관된 기능을 포착한다.
초기 인간 외배엽 계통 데이터의 부족으로 인해, 다음으로 본 실시예에서는 본 실시예로 각각의 외배엽 계통에 대한 더욱 특이적인 마커를 확인할 수 있는지 여부를 질문하였다. 외배엽 계통 간에 유의미한 차별적 발현을 갖는 전사체뿐만 아니라 고유하게 상향조절된 유전자로 추가 검증을 거쳤다. CNS 및 비-CNS 운명 간에 공유되는 외배엽 분화 동안 특이적으로 상향조절된 유전자에는 ANXA1, LGI1, NR2F2, 및 ZNF503이 포함된다. 또한, 비-CNS 대 CNS를 묘사하는 인자는 NEUROG1, HAND1, TFAP2A, 및 TFAP2B(도 4e)이다. 놀랍지 않게, NE에서, 인자, 예컨대 SOX1 및 HES5는 CNS의 세포를 배타적으로 확인시켜주는 반면, 모든 다른 계통에서는 저수준 PAX6 전사체를 확인할 수 있었다(도 4f). 흥미롭게도, 본 실시예에서는 NC 계통에서 특이적으로 특성규명되지 않은 아연 핑거 단백질 ZNF229의 고발현을 관찰하였다. 다른 계통에 대한 것과 마찬가지로, 본 실시예에서는 ELAVL4 및 SMYD1이 각각 기원판 및 NNE에서 우선적으로 발현됨을 확인하였다(도 4f). 또한, 본 실시예에서는 NC 데이터세트를 닭에서 NC의 확인에 초점을 맞춘 이전에 공개된 연구와 비교하였다(Simoes-Costa and Bronner, 2016). NC에서 유의미하게 농축된 유전자 중에서, 본 실시예에서는 2개의 세이터세트 간 유의미한 중첩(p = 3.56 3 10-7)을 확인하였다(핵심 보존 NC 마커를 반영함; 도 42c 및 42d). 흥미롭게도, 연구에서 일부 후보 마커, 예컨대 ZNF229는 마우스에서 보존되지 않아, 검증 연구를 복잡하게 만든다. 그럼에도 불구하고, 추가적인, 적절한 일차 세포 데이터가 이용 가능해지면 데이터세트, 특히 CP 및 NNE에 대한 비교 연구는 가치있을 것이다.
본 실시예에서는 상술된 추가 PSC 세포주에서의 게노믹스 분석으로부터 선택된 계통 마커의 발현을 검증하였다. 유전자 하위세트에 대해, 본 실시예에서는 또한 면역세포화학 및 하이 컨텐츠 조영에 의해 발현을 평가하였다. 본 실시예에서는 RNA에 의해, 몇몇 유전자의 발현이 여러 계통에 존재하는 것으로 보이지만, 단백질 분석에 의해서는 이들 마커가 선택적으로 발현됨을 확인하였다. SOX1 및 ZBTB16(PLZF)은 일차적으로 NE에 주로 농축된 반면, 인자, 예컨대 TFAP2B 및 HAND1은 각각 NC 또는 NNE에 농축되었다(도 42a 및 42b). 기원판의 정체성은 SIX1의 발현 및 TFAP2B 발현의 부재에 의해 정의되었다. 상기 분석은 인간 외배엽 형성 동안 각각의 주요 계통의 특이적 확인을 위해 여전히 특성규명되지 않은 몇몇 유전자, 예컨대 ZNF229를 포함하는 알려진 및 신규한 마커 둘 다의 통합 세트를 제공한다.
TFAP2A의 손실이 비-CNS 유도체의 유도에 영향을 미침
4개의 주요 외배엽 계통을 유도하기 위해 본원에서 나타낸 신규한 조건은 강력하고 효율적이다. 따라서, 본 실시예에서는 외배엽 계통 특화 동안의 핵심 담당인자를 확인하기 위해 교란 연구를 수행하고자 플랫폼을 사용하였다. 비-CNS 운명으로의 수임에 대한 본 연구에서의 주요 후보 중 하나는 TFAP2A였는데, 이것이 유도 동안 초기에 고도 발현되기 때문이다. 비-CNS 계통이 TFAP2A 발현에 의존하는지 여부를 설명하기 위해, 본 실시예에서는 CRISPR/Cas9 시스템을 사용하여 TFAP2A 녹아웃 hESC 세포주를 생성하였다(Mali et al., 2013). 2개의 가이드 RNA를 사용하여 틀 이동 결실을 유도하였고 양성 클론을 서열분석하여 결실의 정도 및 성질을 결정하였다(도 43a 및 43b). 단백질 수준에서 TFAP2A 발현의 제거는 고 BMP의 존재 하에 짧은 3일 유도를 사용해서 확인하였다(도 5a, 43c 및 43d). TFAP2A 대 야생형 hESC의 추가 비교 연구는 CP 또는 NNE 조건 하에 TFAP2A, 녹아웃 세포에서가 아니라 야생형 세포에서 분화 6일째에 CDH1의 강력한 발현을 나타내었다(도 5b). 이들 데이터는 TFAP2A가 CDH1의 발현을 촉진하며 이것이 세포를 NC 운명으로의 EMT-유사 전환으로부터 보호할 수 있음을 제시한다.
CDH1 데이터에 기반하여, 본 실시예에서는 TFAP2A KO 세포가 비-CNS 계통으로 전환할 수 없고 CNS NE를 디폴트로 할 것으로 가정하였다. 상기 가설과 일치하게, NE의 유도는 TFAP2A의 손실에 영향받지 않았다(도 5c). CNS-농축 전사 인자, 예컨대 SOX1 및 PAX6은 다른 계통으로부터의 오염이 거의 없이 풍부하였다. 또한, NC 및 기원판 프로토콜은 TFAP2A KO 대 야생형 세포에서 SOX1 및 PAX6 발현 수준을 증가시켰다(도 5c 및 5d). 그러나 예상치 못하게, TFAP2A KO 세포의 NC 또는 CP로의 유도 동안, SOX10 및 SIX1+ 세포를, 각각 야생형 대비 더 적은 수이기는 해도, 확인할 수 있었다(도 43e 및 43f). 이는 TFAP2A 발현의 제거가 비-CNS 세포 유형을 억제하는 데 충분하지 않거나 다른 인자가 TFAP2A와 독립적으로 SOX10 또는 SIX1을 약하게 보상하고 조절할 수 있음을 시사한다. NC 및 CP의 유도에서 TFAP2A의 손실에 대한 효과는 극적이었지만, NNE 상의 효과는 현저하지 않았다. 본 실시예에서는 NNE 조건에서 PAX6 또는 SOX1의 발현이 관찰되지 않았고, NNE-관련 유전자, 예컨대 KRT16 및 WISP1의 발현은 아주 약하게만 영향받았다(도 5c 및 43g). 이들 데이터는 NNE의 형성이 TFAP2A 발현에만 의존하지 않음을 제시한다. 실제로, 이전 연구에서는 TFAP2C(AP2γ)의 발현이 NNE에서 우세함을 나타내었다(Li and Cornell, 2007). NNE가 NC 및 CP 분화에서 확인되는 일반적인 세포 유형이므로, 본 실시예에서는 이들 집단에서 TFAP2C의 발현을 분석하였고, 발현은 거의 내지 전혀 확인되지 않았다(도 43h). 이는 TFAP2C의 발현이 NNE 계통에 특이적임을 제시한다.
인간 외배엽 계통을 유도하기 위한 신규한 플랫폼은 생체내 발생 프로그램을 모사하는 외배엽 계통 특화 동안 BMP 신호전달에 있어서 중요한 역할을 실증하였다. 또한, 본 실시예는 시스템을 운명 선택의 결정에 관여되는, 정의된 발생 인자, 예컨대 TFAP2A의 역할을 밝히기 위해 유전적으로 조작할 수 있다는 개념-증명을 나타낸다.
기원판 형성을 증강시키기 위한 인자에 대한 소분자 스크리닝
신경 분화의 분자적 분석에 부가하여, 모듈식 플랫폼은 모든 4개의 주요 초기 외배엽 계통에 있어서 뛰어난 수율로 무제한의 세포수를 생성하는 능력을 가져서, 세포 유형을 단리하기 어려운 이러한 세포들에 대한 약물 스크리닝을 보다 적합하게 만든다. 그러나, CP 운명의 유도 효율은 상대적으로 낮게 유지되었다(약 40%). CP 유도 효율을 추가 증강시키고 고-처리량 스크리닝(HTS) 검정에서 플랫폼의 적합성을 실증하기 위해, 본 실시예에서는 Six1::H2B-GFP 리포터 세포주 상에서 약리 활성 화합물 라이브러리(LOPAC)를 사용하여 소분자 스크리닝을 수행하였다(도 6a). 최초 스크리닝에서는 대조군 대비 SIX1의 발현을 촉진한 11개 화합물이 드러났다. 재현성 및 관찰된 배율 변화의 강력함에 기반하여, 목록을 3개의 잠재 후보: 세로토닌 수용체 작용제인 BRL-5443; NF-κB 및 STAT-매개 확인 전사를 억제하는 능력을 갖는 식물 호르몬인 파르테놀라이드; 및 메탈로-프로테아제 억제제로 작용할 수 있는 금속 킬레이터인 펜안트롤린(도 6b)으로 좁혀나갔다. 이들 후보 화합물은 대조군 분화에서 관찰된 수준을 초과하여 SIX1의 발현을 증가시켰다. 일차 히트의 추가 검증 시, 펜안트롤린이 SIX1을 발현하는 세포의 백분율에서 강력한 증가를 유발함을 확인하였다(도 6c, 49a, 및 49b).
화합물 및 CP 발생 간에 뚜렷한 연관성은 없었지만, 다음으로 본 실시예에서는 펜안트롤린이 어떻게 기원판 운명을 특이적으로 농축시키는 데 작용할 수 있는지를 결정하였다. CP로의 분화는 다른 계통 마커, 예컨대 SOX10, T, MYOD 또는 SOX17의 발현을 유도하지 않고 대조군 대비 SIX1 발현의 5배 증가를 나타내었다(도 6d). 다음으로 본 실시예에서는 펜안트롤린의 첨가가 부가적이거나 선택적인 방식으로 CP 유도 효율을 개선하는지 여부를 평가하였다. 흥미롭게도, FGF2의 부재 하에 펜안트롤린의 첨가 시 SIX1+ 세포가 거의 4배 증가한다(69% 대 18%)(도 6e). FGF2 또는 FGF2와 펜안트롤린의 첨가 후, SIX1+ 세포의 농축은 각각 34% 및 46%로 감소하였다. 이들 결과는 FGF2의 존재 하를 제외하고 펜안트롤린이 화합물의 존재 하에 생존하지 못할 수 있는 다른 외배엽 계통 대신 SIX1+ CP 세포를 선택적으로 농축할 수 있음을 제시한다. 결론적으로, 소분자 스크리닝은 선택 계통으로의 hPSC 분화 효율을 추가 개선할 수 있는 신규한 인자를 확인하기 위한 외배엽 계통 플랫폼의 사용 타당성을 실증한다.
정의된 배지 조건, 즉 NC, CP 및 NNE의 E6 하에서의 모듈식 생성에 대한 변형된 접근은 용량-의존적 BMP 신호전달 반응에 의존한 반면, NE의 생성은 변형 없이 두 시스템에서 모두 강력하였다(도 7a). BMP 신호전달의 최초 펄스는 KSR-기반 분화 조건과 비교되는 경우(도 7b 대 도 44a), NC 및 더 적은 정도로 CP의 생성에서 효율 증가 및 변동성 감소를 허용하였다.
본 연구의 주요 초점은 배지-관련 인자, 예컨대 KSR에 의해 유도된 변동성을 제거하는 매우 강력한 모듈식 외배엽 분화 플랫폼을 확립하는 것이었다. 그러나, 추가적인 잠재적 변동성 원천, 예컨대 코팅 기재 및 세포 밀도가 존재한다. 매트리겔은 수천 여 단백질로 이루어진 일반적으로 사용되는 코팅 기재인 반면, 비트로넥틴은 단일 재조합 단백질이다. 비트로넥틴 대신 매트리겔의 사용이 외배엽 계통 특화의 강력함에 부정적으로 영향을 미칠 수 있는지 여부를 결정하기 위해, 본 실시예에서는 표준 비트로넥틴-기반 프로토콜 대비 11개의 독립적 로트의 매트리겔을 평가하였다. 놀랍게도, 2개를 제외한 모든 배치가 매우 강력한 유도 효율을 제공하였다(도 44a). 외배엽 계통 선택에 영향을 미치는 것으로 알려진 또 다른 잠재 인자는 세포 밀도이다. 즉, PAX6+ NE 대 Sox10+ NC의 생성은 시작 hPSC 접종 밀도에 의존하는 것으로 나타났다(Chambers et al., 2009). 본 실시예에서는 매트리겔 및 비트로넥틴을 모두 사용하고 50,000 내지 300,000개 세포/㎠를 사용하여 분화를 수행하였고(도 44b), 세포 밀도가 세포 운명 결정에서 뚜렷한 역할을 담당하지 않음을 확인하였다. 마지막으로, 성장 인자, 예컨대 재조합 BMP4가 효능에 있어서 기술적 변동성을 나타낼 수 있다. TFAP2A를 활성화하기 위해 요구되는 역치 농도가 결정되면, BMP4의 유효 용량을 적정할 수 있고, 이는 상기 우려사항을 해결해야 한다. BMP4 적정은 저수준의 TFAP2A가 (WNT 활성화와 함께) NC를 생성하는 반면, 중등도 수준은 CP 및 NNE 운명을 촉진하는, 다양한 비-CNS 계통의 생성에 유용한 것으로 증명되었다. 결론적으로, 데이터는 4개의 주요 외배엽 계통의 획득을 위한 코팅 기재 또는 세포 밀도에 대해 최소 의존성을 나타내는 분화 플랫폼의 강력함을 예시한다.
토의
hPSC로부터 요구 시 다량의 특정 세포 유형을 유도하는 목표는 적합한 분화 플랫폼의 이용 가능성에 의존한다. 현재 이용 가능한 프로토콜은 종종 변동성을 도입하기 쉽고 궁극적인 임상 응용에 적합하지 않은, 정의되지 않은 배지 성분을 사용한다. 또한, 이러한 프로토콜은 EB 대 단층 배양의 사용에서, 그리고 광범위한 배지 조성의 적용에서, 각각 세포 밀도가 다양한 조건 하에 개별 외배엽 계통에 대한 접근만을 제공한다. 따라서, 과거의 연구에서는 각각의 계통-특이적 프로토콜에 대해 상이한 다수의 교란 인자에 기반하여 모든 4개 계통에 걸쳐 특이적인 유전적 또는 화학적 교란의 영향을 정의하는 것이 거의 불가능하였다.
여기서는 강력한, 모듈식, 그리고 화학적으로 정의된 시스템을 사용하여 모든 4개 주요 외배엽 계통을 유도하는 전략을 제공하였다. 생체내 발생 신호의 적용은 이 시스템에서 분화의 성공을 크게 증강시키며, 본 실시예에서는 4개의 신호전달 경로의 조절이 초기 외배엽 계통 선택의 전체 다양성을 재생성하는 데 충분함을 나타낸다. CNS 대 비-CNS 운명의 묘사는 BMP를 이용하는 용량-의존적 처리에 의존한다. 임의의 특정 계통, 예컨대 NC, CP 및 NNE를 촉진하기 위한 특이적 BMP 농도는 매우 정확하다. BMP는 적어도 부분적으로 TFAP2A의 상향조절을 통해 작용하며, 이는 WNT 활성화와 함께 작용하여 NC를 생성하고, FGF 활성화와 함께 작용하여 CP를 생성하고, FGF 억제와 함께 작용하여 NNE를 생성할 수 있다. 이 결과는 최소 배지 시스템에서, 소수의 소분자를 사용하여 생체내 발생을 모사함으로써 외배엽 세포 운명 결정을 되풀이할 수 있음을 실증한다. 생성 시스템은 기술적으로 단순하며, 추가적인 정렬 또는 선택을 필요로 하지 않는 특정 외배엽 계통의 거의 균일한 집단을 제공한다. 재현성 개선 및 기술적 용이성에 더하여, 고도로 정의된 배지, 예컨대 E6의 사용은 향후 응용 적용을 위한 임상 등급 세포의 생성을 크게 촉진할 것이다.
본 실시예에서는 외배엽 분화 플랫폼이 발생 경로의 유전적 분석뿐만 아니라 소분자 스크리닝을 위해 적합함을 실증한다. 본 발명의 개념-증명 연구에서, 본 실시예에서는 또한 TFAP2A의 손실이 NE 또는 NNE의 형성에는 영향을 미치지 않지만 NC 및 CP 운명의 유도에 크게 영향을 미침을 실증한다. 본 발명의 데이터는 신경관 결함 및 감각 기관 발생 결함을 가지며 출생전후 치사성을 나타내지만, 비-신경 운명을 영향받지 않은 Tfap2α 녹아웃 마우스에서의 보고와 일치한다(Schorle et al., 1996). 다른 TFAP2 단백질, 예컨대 TFAP2C를 통한 TFAP2A 손실에 대한 보상이 있을 수 있다(Li and Cornell, 2007). 예비 데이터는 TFAP2C가 임의의 외배엽 분화 동안 상향조절되지 않음을 제시한다. 그러나, TFAP2B는 강력히 상향조절되어, NNE의 형성에서 가능한 보상 기능을 제시하였다.
소분자 스크리닝에서 본 발명의 분화 플랫폼의 사용에는 특정 영역-특이적 전구체 집단 또는 특정 클래스의 뉴런으로의 유도된 분화를 위한 화합물의 확인이 관여될 수 있다. 여기에서, 본 실시예에서는 기원판 계통의 농축을 위해 이러한 스크리닝을 수행하는 타당성을 실증하였다. 본 발명에서 정의된 분화 플랫폼은 최적화된 KSR 로트를 사용한 조건에 비해서도 NC 또는 NNE 계통을 생성하는 데 있어서 유의미하게 더 효율적이었으나(도 44h 및 7a), SIX1+ CP 전구체를 유도하는 효율은 개선되지 않았다. 그러나, 본 발명의 소분자 스크리닝에서 주요 히트 화합물인 펜안트롤린의 존재 하에(도 6e), 본 실시예에서는 다수의 세포에서 CP 마커 발현을 유발할 수 있었다. 펜안트롤린이 작용하는 메커니즘은 아직 결정되지 않았다. 그러나, 데이터는 상기 약물이 주로 SIX1+ 세포의 양성 선택을 통해 작용함을 제시한다. 기원판 발생 및 서브타입 특화 동안 펜안트롤린에 대한 작용 메커니즘을 설명하기 위해 추가 연구가 필요할 것이다.
본 실시예에서는 4개의 주요 외배엽 계통의 유도에 더하여, 다음 단계가 PAX6+ 수정체로부터 PAX3+ 삼차 기원판으로의 전환에서 예시된 바와 같은 영역적으로 편향된 계통의 체계적 유도일 것으로 고려한다. 영역-특이적 CNS 계통을 생성하는 능력은 당분야에 잘 알려져 있고, 특정 NC 계통의 생성, 예컨대 디폴트인 두개로부터 미주 및 장 NC로의 전환을 위해 유사한 전략을 현재 개발 중이다(Fattahi et al., 2016). 인간 외배엽 계통 프로젝트에서의 최종 단계는, 각각의 영역-특이적 외배엽 계통으로부터 생성된 다양한 신경 및 비-신경 서브타입의 유도, 단리, 및 분자적 특성규명일 것이다. 각각의 배엽층에 있어서 체계적인 분화 조건을 개발하는 목표는 인간 PSC로부터 중배엽 계통 다양성을 재생성하려는 현재의 시도에 의해 추가 예시된다(Loh et al., 2016). 이러한 배엽층-특이적 노력의 조합은 궁극적으로 요구 시 모든 인간 세포 유형에 접근하기 위한 균일한 플랫폼을 제공할 수 있다.
결론적으로, 본 연구는 외배엽 계통 다양성의 생성을 위한 청사진 및 4개의 주요 외배엽 계통의 발생에 병렬적으로 관여되는 분자 경로의 분석을 나타내는 당분야를 위한 자원을 제공한다. 본 연구는 세포 운명 결정, 예컨대 영역 패턴화 및 말단 운명 특화를 위한 최적 염색질 단계의 결정과 연관된 분자 메커니즘의 이해를 위한 기계적 연구를 포함하는, 여러 잠재적 적용을 위한 기초를 쌓는다. 또한 인간 장애에 대한 신규한 세포 치료법의 개발을 목표로 하는 적용을 포함하여, 향후 임상 응용에 적합한 조건 하에 광범위한 외배엽 계통을 유도하기 위한 단계를 설정한다.
방법
인간 배아 줄기 세포(hESC) 세포주 H9(XX, p31-40), H1(XY, p35-40), MEL1(XY, p40-46), HUES6(XX, p25-35), HUES8(XY, p64-68) 및 유도된 다능성 줄기 세포(iPSC) 세포주 BJ1, Sev6 및 MRC5를 DMEM-F12, 비-필수 아미노산, L-글루타민, 20% 녹아웃 혈청 대체물(KSR) 및 10 ng/㎖ FGF2를 함유하는 hESC 배지 중 마우스 배아 영양공급세포층 상에서 배양하였다. PAX6 H2B::GFP, SOX10 GFP 및 SIX1 H2B::GFP 모체 세포주는 H9이다. 다능성 줄기 세포를 0.5 mM EDTA로 해리하고 이를 비트로넥틴 코팅 디쉬 상에 접종하여 세포를 Essential 8(E8, Thermo Fisher Scientific)에 적응시켰다. 처음에 잘 적응하지 못한 세포주를 제거하고 매트리겔 코팅 디쉬 상에서 다시 시도하여 다음 계대에서 비트로넥틴으로 전환하였다. 세포는 3~4주 배양(약 6~8회 계대) 후 적응된 것으로 간주하였다. 모든 세포를 5% CO2로 37℃에서 배양하였다. 배지를 매일 교체하였다. 모든 세포주는 STR 분석으로 주기적으로 인증하고, 핵형 이상에 대해 주기적으로 평가하고, 미코플라즈마에 대해 일상적으로 확인하였다.
두 분화 유형(KSR 및 E6 기반) 모두에 대해, 사용된 약어 및 시점 세트를 아래의 표 1~2에 기재한다:
소분자 약어
소분자 약어
LDN193189 LDN
SB431542 SB
Y-27632 ROCKi
XAV939 XAV
CHIR99021 CHIR
SU5402 SU
노출 시점 대비 분화일
날짜 기간(hr)
0일 0~24
1일 24~48
2일 48~72
3일 72~96
4일 96~120
5일 120~144
6일 144~168
7일 168~192
8일 192~216
9일 216~240
10일 240~264
11일 264~288
KSR 기반 분화(10-12일)
배지 구배 대비 분화일
KSR 분화 배지% N2 배지%
100 0
100 0
100 0
100 0
75 25
75 25
50 50
50 50
25 75
25 75
0 100
0 100
분화 시작 전 준비
매트리겔을 DMEM-F12 기본 배지로 희석하고(1:50) 조직 배양 처리 디쉬를 코팅한다. 파라필름을 덮어 디쉬를 하룻밤 동안 4℃에서 보관한다.
배지 조성
KSR 분화 배지(1 ℓ). KSR 분화 배지는 하기와 같다: 820 ㎖ 녹아웃 DMEM(1X) 배지, 150 ㎖ 녹아웃 혈청 대체물, 10 ㎖ Pen Strep, 10 ㎖ L-글루타민 200 mM, 10 ㎖ MEM 비-필수 아미노산 100x, 및 1 ㎖ 2-메르캅토에탄올 1000x.
N2 배지(1 ℓ). N2 배지는 하기와 같다: 1 ℓ DMEM/F12(1:1) 1X 배지, 1 ㎖ 2-메르캅토에탄올 1000x, 2.0 g 나트륨 바이카보네이트, 1.56 g D-(+)-글루코스, 및 20 ㎕ 프로게스테론(스톡: 100 ㎖ 100% 에탄올 중에 0.032 g 프로게스테론을 용해시킴), 10 ㎖ N2 보충물질 B 100x 포함.
분화 -1일
분화 시작 전에 hPSC 배양은 70%~80% 융합성이 되어야 한다. 세포를 아큐타제 해리 완충액(37℃에서 30분)으로 탈착시키고, 세포를 플레이트에서 온건하게 해리시킨다. 세포로 45-마이크론 세포 여과기를 통과시키고 세포를 펠렛화한다(5분 동안 200 x g). 세포를 PBS로 온건하게 세척하고 다시 펠렛화한다. 10 μM ROCKi 함유 hESC 배지 중 ㎠ 당 250~300,000개 세포를 접종한다. 세포를 37℃ 인큐베이터에서 하룻밤 동안 인큐베이션한다.
분화 0일
hPSC는 고밀도 단층으로 나타나야 한다. 최소의 플라스틱은 가시적이어야 한다. 세포를 PBS 또는 KSR 분화 배지로 세척한 후 아래의 특정 분화를 시작한다:
신경외배엽 분화. 0일(0~24 hr): 500 nM LDN + 10 μM SB를 함유하는 KSR 분화 배지를 세포에 첨가한다. 분화를 더 전방 신경외배엽으로 편중시키기 위해, 세포에 500 nM LDN + 10 μM SB + 5 μM XAV를 함유하는 KSR 분화 배지를 첨가한다.
1일(24~48 hr): 세포에 대해 배지를 500 nM LDN + 10 μM SB를 함유하는 KSR 분화 배지로 교체한다. 전방 신경외배엽으로 분화하는 경우, 세포에 대해 500 nM LDN + 10 μM SB + 5 μM XAV 함유 KSR 분화 배지를 유지한다.
2일(48~72 hr): 세포에 대해 배지를 500 nM LDN + 10 μM SB를 함유하는 KSR 분화 배지로 교체한다. 전방 신경외배엽으로 분화하는 경우, 세포에 대해 500 nM LDN + 10 μM SB + 5 μM XAV 함유 KSR 분화 배지를 유지한다.
3일(72~96 hr): 세포에 대해 배지를 500 nM LDN + 10 μM SB를 함유하는 KSR 분화 배지로 교체한다. 전방 신경외배엽으로 분화하는 경우, 세포에 대해 500 nM LDN + 10 μM SB + 5 μM XAV 함유 KSR 분화 배지를 유지한다.
4일(96~120 hr): 세포에 대해 배지를 500 nM LDN + 10 μM SB를 함유하는 75% KSR 분화 배지 및 25% N2 배지로 교체한다. 전방 신경외배엽으로 분화하는 경우, 세포에 대해 500 nM LDN + 10 μM SB + 5 μM XAV 함유 75% KSR 분화 배지 및 25% N2 배지를 유지한다.
5일(120~144 hr): 세포에 대해 배지를 500 nM LDN + 10 μM SB를 함유하는 75% KSR 분화 배지 및 25% N2 배지로 교체한다. 전방 신경외배엽으로 분화하는 경우, XAV를 제거하고 세포를 계속 500 nM LDN + 10 μM SB 함유 75% KSR 분화 배지 및 25% N2 배지로 처리한다.
6~11일: 배지를 매일 500 nM LDN + 10 μM SB를 함유하는 배지 구배에 따라 교체한다.
신경 능선 분화. 0일(0~24 hr): 500 nM LDN + 10 μM SB를 함유하는 KSR 분화 배지를 세포에 첨가한다.
1일(24~48 hr): 세포에 대해 배지를 500 nM LDN + 10 μM SB 그리고 세포에 대해 + 3 μM CHIR을 함유하는 KSR 분화 배지로 교체한다.
2~11일: 세포에 대해 배지를 10 μM SB + 3 μM CHIR을 함유하는 배지 구배로 2일마다 교체한다.
삼차 기원판 분화. 0일(0~24 hr): 500 nM LDN + 10 μM SB를 함유하는 KSR 분화 배지를 세포에 첨가한다.
1일(24~48 hr): 세포에 대해 배지를 500 nM LDN + 10 μM SB를 함유하는 KSR 분화 배지로 교체한다.
2일(48~72 hr): 세포에 대해 배지를 10 μM SB를 함유하는 KSR 분화 배지로 교체한다.
3~11일: 세포에 대해 배지를 10 μM SB를 함유하는 배지 구배로 2일마다 교체한다.
비-신경 외배엽 분화. 0일(0~24 hr): 500 nM LDN + 10 μM SB를 함유하는 KSR 분화 배지를 세포에 첨가한다.
1일(24~48 hr): 세포에 대해 배지를 500 nM LDN + 10 μM SB를 함유하는 KSR 분화 배지로 교체한다.
2일(48~72 hr): 세포에 대해 배지를 500 nM LDN + 10 μM SB를 함유하는 KSR 분화 배지로 교체한다.
3~11일: 세포에 대해 배지를 10 μM SB + 10 μM SU를 함유하는 배지 구배로 2일마다 교체한다.
Essential 6 기반 분화(10~12일)
분화 시작 전 준비
매트리겔을 DMEM-F12 기본 배지(1:50) 또는 비트로넥틴을 PBS(1:100)로 희석하고 조직 배양 처리 디쉬를 코팅한다. 파라필름을 덮어 디쉬를 하룻밤 동안 4℃에서 보관한다.
분화 -1일
분화 시작 전에 hPSC 배양은 70%~80% 융합성이 되어야 한다. 세포를 EDTA 해리 완충액(37℃에서 5분)으로 탈착시키고, 세포를 플레이트에서 온건하게 해리시킨다. 세포로 45-마이크론 세포 여과기를 통과시키고 세포를 펠렛화한다(5분 동안 200 x g). 세포를 PBS로 온건하게 세척하고 다시 펠렛화한다. 10 μM ROCKi 함유 E8 배지 중 ㎠ 당 250~300,000개 세포를 접종한다. 세포를 37℃ 인큐베이터에서 하룻밤 동안 인큐베이션한다.
분화 0일
hPSC는 고밀도 단층으로 나타나야 한다. 최소의 플라스틱은 가시적이어야 한다. 세포를 PBS 또는 E6 배지로 세척한 후 아래의 특정 분화를 시작한다:
신경외배엽 분화. 0일(0~24 hr): 500 nM LDN + 10 μM SB를 함유하는 E6 배지를 세포에 첨가한다. 분화를 더 전방 신경외배엽으로 편중시키기 위해, 세포에 500 nM LDN + 10 μM SB + 5 μM XAV를 함유하는 E6 배지를 첨가한다.
3일(72~96 hr): 세포에 대해 배지를 500 nM LDN + 10 μM SB를 함유하는 E6 배지로 교체한다. 전방 신경외배엽으로 분화하는 경우, XAV를 제거하고 세포를 500 nM LDN + 10 μM SB로 계속 처리한다.
4~12일: 배지를 500 nM LDN + 10 μM SB를 함유하는 E6 배지로 2일마다 교체한다.
신경 능선 분화. 0일(0~24hr): 1 ng/㎖ BMP4 + 10μM SB + 600 nM CHIR을 함유하는 E6 배지를 세포에 첨가한다.
1일(24~48 hr): 세포에 대해 배지를 1 ng/㎖ BMP4 + 10 μM SB + 600 nM CHIR을 함유하는 E6 배지로 교체한다.
2일(48~72 hr): 세포에 대해 배지를 1 ng/㎖ BMP4 + 10 μM SB + 600 nM CHIR을 함유하는 E6 배지로 교체한다.
3일(72~96 hr): 세포에 대해 배지를 10 μM SB + 1.5 μM CHIR을 함유하는 E6 배지로 교체한다.
4~12일: 세포에 대해 배지를 10 μM SB + 1.5 μM CHIR을 함유하는 E6 배지로 2일마다 교체한다.
두개 기원판 분화. 0일(0~24 hr) 5 ng/㎖ BMP4 + 10 μM SB를 함유하는 E6 배지를 세포에 첨가한다.
1일(24~48 hr): 세포에 대해 배지를 5 ng/㎖ BMP4 + 10 μM SB를 함유하는 E6 배지로 교체한다.
2일(48~72 hr): 세포에 대해 배지를 5 ng/㎖ BMP4 + 10 μM SB를 함유하는 E6 배지로 교체한다.
3일(72~96 hr): 세포에 대해 배지를 10 μM SB + 50 ng/㎖ FGF2를 함유하는 E6 배지로 교체한다.
4~12일: 세포에 대해 배지를 10 μM SB + 50 ng/㎖ FGF2를 함유하는 E6 배지로 매일 교체한다.
삼차 기원판 분화. 0일(0~24 hr): 5 ng/㎖ BMP4 + 10 μM SB를 함유하는 E6 배지를 세포에 첨가한다.
1일(24~48 hr): 세포에 대해 배지를 5 ng/㎖ BMP4 + 10 μM SB를 함유하는 E6 배지로 교체한다.
2일(48~72 hr): 세포에 대해 배지를 5 ng/㎖ BMP4 + 10 μM SB + 600 nM CHIR을 함유하는 E6 배지로 교체한다.
3일(72~96 hr): 세포에 대해 배지를 10 μM SB + 600 nM CHIR을 함유하는 E6 배지로 교체한다.
4일(96~120 hr): 세포에 대해 배지를 10 μM SB를 함유하는 E6 배지로 교체한다. 5~12일: 세포에 대해 배지를 10 μM SB를 함유하는 E6 배지로 매일 교체한다.
비-신경 외배엽 분화. 0일(0~24 hr): 10 ng/㎖ BMP4 + 10 μM SB + 10 μM SU를 함유하는 E6 배지를 세포에 첨가한다.
1일(24~48 hr): 세포에 대해 배지를 10 ng/㎖ BMP4 + 10 μM SB + 10 μM SU를 함유하는 E6 배지로 교체한다.
2~12일: 세포에 대해 배지를 5 ng/㎖ BMP4 + 101 μ SB를 함유하는 E6 배지로 2일마다 교체한다.
외배엽 계통으로부터 전구체 세포의 분화
뉴런으로의 NE 분화. d10에 시작하여, 배양을 B27 보충물질을 함유하는 N2 배지 중에 추가 10일 유지하고, 아큐타제로 해리시키고, 45-마이크론 세포 여과기를 통과시키고, 세포를 배지 또는 PBS 중에 2회 세척하였다. 세포를 뉴런 분화 배지(Neurobasal, B27, 20 ng/㎖ BDNF, 100 μM AA, 20 ng/㎖ GDNF와 10 μM DAPT 함유) 중 약 50K개 세포/㎠의 저밀도로 씨드접종하였다. 배양이 뉴런으로 보이면(약 5~6일) DAPT를 제거한다.
감각 및 자율 뉴런으로의 NC 분화. 분화된 신경 능선 세포를 아큐타제로 d10에 해리하고 N2, B27, 10 ng/㎖ FGF2 및 3 μM CHIR99021이 보충된 신경기본 배지 중에 2백만 개/㎖로 재현탁하였다. 세포 현탁액을 현탁 배양을 위해 초-저부착 플레이트로 옮겨 NC 구형체를 형성한다. 구형체를 d15까지 N2, B27, 10 ng/㎖ FGF2 및 3 μM CHIR99021이 보충된 신경기본 배지 중에 유지한 후, N2, B27 및 10 ng/㎖ GDNF가 보충된 신경기본 배지 중 PO/LAM/FN 코팅 플레이트 상에서 1:1의 비로 접종하여 감각 및 자율 뉴런으로 자연 분화시킨다.
수정체 기원판 및 삼차 뉴런으로의 CP 분화. 수정체 기원판. d10에 시작하여, 두개 기원판 배양을 10μM SB431542를 함유하는 E6 중 추가 10일 유지하였다. d20에 시작하여, SB431542를 배지로부터 제거하고, 배양을 나머지 분화 동안 E6 단독 중에 유지하였다. 배지를 주 3회 교체하였다(월요일, 수요일, 금요일).
삼차 뉴런. d10, 삼차 기원판 클러스터를 200 ㎕ 피펫을 사용하여 손으로 골라내었다. 골라낸 클러스터를 B27 보충물질 10　μM DAPT, 50 ng/㎖ BDNF, 50 ng/㎖ GDNF, 100 ng/㎖ NGF 및 100 μM AA)을 함유하는 N2 배지로 옮겼다. 대략 10~20개 클러스터/㎠를 매트리겔 상에 접종하였다. 배지를 주 3회 교체하였다(월요일, 수요일, 금요일).
각질세포로의 NNE 분화. 분화 d10에, 세포를 아큐타제를 사용하여 해리하고, 45-마이크론 세포 여과기를 통과시키고, 세포를 배지 또는 PBS 중에 1회 세척하였다. 세포를 10 μM SB431542, 10 ng/㎖ BMP4 및 1011M SU5402를 함유하는 E6 중 제조업체의 사양에 따라 코팅 기질 키트 단백질을 사용하여 이전에 코팅된 세포 배양 플라스틱 상에서 1:2로 계대배양하였다. 2일 후, 배지를 S7 보충물질을 함유하는 75% E6/25% EpiLife로 교체하였다. 추가 2일 후, 배지를 S7 보충물질을 함유하는 50% E6/50% EpiLife로 교체하였다. 2일 후, 배지를 S7 보충물질을 함유하는 25% E6/75% EpiLife로 교체하였다. 다시 2일 후, 배지를 S7 보충물질을 함유하는 100% EpiLife로 교체하였다. 이제부터는 배지(S7 보충물질 함유 EpiLife)를 주 3회 교체하였다(월요일, 수요일, 금요일).
PAX6 및 SIX1 H2B GFP 리포터 세포주의 생성
공여체 플라스미드를 작제하고 Infusion Cloning System(Clontech)을 사용하여 pUC19 내로 클로닝하였다. TAL 효과기 뉴클레오티드 타게터 소프트웨어(Cermak et al., 2011; Doyle et al., 2012)를 사용하여 TALEN 서열을 예측하였다. Pax6 TALENS: TGTCCTGTATTG TACCACT 및 TGTATACAAAGGTCCTTGT SIX1 TALENS: TCTCTGCTCGGCCCCCTCA 및 TTGGGGTCCTAAGTGGGGA. TALEN 툴박스(Addgene)(Sanjana et al., 2012)를 사용해서 TALEN을 생성하고 기재된 바와 같이 수행하였다. 공여체 플라스미드(20 ㎍) 및 TALEN 페어(각각 5 ㎍)를 H9 hESC(32~36 계대) 내로 뉴클레오감염시켰다(B-016 프로그램을 사용하는 Lonza 키트 V). 뉴클레오감염된 세포를 10 μM ROCK 억제제를 함유하는 KSR 배지 중에 MEF 영양공급세포층 상으로 씨드접종하였다. 48 hr 후, 퓨로마이신(1 ㎍/㎖)을 첨가하여 양성 클론을 선택하였다. 이어서 퓨로마이신 내성 콜로니를 단리하고, 게놈 DNA를 추출하고, PCR을 사용해서 표적화를 확인하였다. 추가 검증에는 유도된 분화 및 Pax6 또는 SIX1 항체를 이용하는 GFP의 공동-표지화가 포함되었다.
TFAP2A 녹아웃 hESC 세포주의 생성
CRISPR/Cas9 시스템을 사용하여 녹아웃 hESC 세포주를 생성하였다. 간략하게, 2개의 가이드 RNA를 CRISPR 설계 툴(Cong et al., 2013)을 사용하여 예측하고 TOPO-블런트 벡터 내로 클로닝하였다. Cas9-GFP(5 ㎍) 및 두 가이드RNA(각각 1 ㎍)를 H9 hESC 내로 뉴클레오감염시키고(B-016 프로그램을 사용하는 Lonza 키트 V) 10 μM ROCKi를 함유하는 KSR 배지 중 매트리겔 코팅 디쉬 상에 씨드접종하였다. 24 hr 후, 세포를 GFP에 대해 정렬하고 ROCK 억제제를 함유하는 KSR 배지 중 MEF 영양공급세포층 상에 씨드접종하였다. 이어서 콜로니를 단리하고, TFAP2A의 표적화된 영역을 PCR에 의해 증폭하고 TOPO TA 벡터 내로 클로닝하고 서열분석하여 틀 이동 돌연변이체를 확인하였다.
하이 컨텐츠 이미지 분석
인간 배아(H9, H1, HUES8, HUES6 및 MEL1) 및 유도된 다능성 줄기 세포(BJ1, MRC5 및 SeV6)를 최소 4 계대(약 2주) 동안 E8 배지 중에 적응시키고 4개의 외배엽 계통으로 분화하도록 유도하였다. 벌크 분화물을 분화 10일째에 37℃에서 30분 동안 아큐타제로 해리하고 96웰 조영 플레이트에 씨드접종하였다. 세포를 2일 후 4% 파라포름알데하이드를 사용하여 고정하고 0.5% Triton-X를 사용하여 투과화하고, 모두 PBS로 희석된 0.2% Tween 중에 유지하였다. 이어서 세포를 외배엽 계통을 시사하는 다양한 마커에 대한 항체를 사용하여 염색하였다. 플레이트를 IN CELL 분석기 6000(GE)을 사용하여 스캐닝하고 측정을 기록하고, Columbus 이미지 분석 소프트웨어(PerkinElmer)를 사용하여 정량하였다. 이들 세포주가 관여되는 실험을 생물학적으로 반복하고(n = 4) 기술적으로 반복하였다(생물학적 반복물 당 n = 2).
RNA 서열분석 및 분석
전체 RNA(Trizol)를 적어도 2개씩, 분화 12일째에 GFP 정렬 세포(NE, NC 및 CP)로부터 또는 벌크로(NNE) 단리하였다. RNA 서열분석 라이브러리로 리보솜 제거를 거치고 대략 6천만 개의 판독을 생성하여 Tophat v1.2(Trapnell et al., 2012)를 사용해서 hg19와 정렬하였다. 이어서 판독을 HTseq(Anders et al., 2015)를 사용해서 계수하고 차별적으로 발현된 유전자를 DESeq(Anders and Huber, 2010)를 사용하여 계산하였다. 차별적으로 발현된 그룹을 LifeMap 유전자 분석학(Edgar et al., 2013)을 사용해서 이의 유전자 실체론 분류 및 신호전달 경로 농축에 대해 분석하였다. 생성 RNA 서열분석 데이터세트를 GEO로 업로딩한다(GSE101661).
기원판 운명의 증강제에 대한 소분자 스크리닝
H9 SIX1 H2B::GFP 세포를 이전에 기재된 바와 같이 수정체 기원판으로 분화시키고 매트리겔로 코팅된 96웰 플레이트 상에 접종하였다. 3일째(개별 세포에서 SIX1 H2B::GFP를 검출할 수 있기 전날)에 배지에 LOPAC 라이브러리로부터의 화합물을 추가 보충하였다. 화합물 당 2개의 상이한 농도(1 μM 및 10 μM)를 사용하였다. 분화 6일째까지 배지를 교체하지 않았다. 분화 6일째에 플레이트를 PBS로 1회 세척하고 세포를 4% PFA로 고정하였다. 배경 대비 신호 세기를 증가시키기 위해, 세포를 GFP에 대한 항체를 사용하여 염색하였다. 적절한 Alexa488-컨주게이션된 이차 항체 및 핵 카운터염색약 DAPI로의 표지 후, DAPI 양성 세포 대비 핵 GFP 신호%를 계산함으로써 Meta Express 소프트웨어(Meta-morph)를 사용하여 세포를 분석하였다.
피질 및 감각 뉴런의 칼슘 조영
NE로부터 유도된 피질 뉴런 및 NC로부터 유도된 감각 뉴런(상술된 바와 같음)을 폴리-오르니틴, 라미닌 및 파이브로넥틴으로 코팅된 Ibidi 플레이트 상에 접종하였다. 세포에 140 mmol/ℓ NaCl, 5.4 mmol/ℓ KCl, 1 mmol/ℓ MgCl2, 1.8 mmol/ℓ CaCl2, 10 mmol/ℓ 글루코스 및 10 mmol/ℓ HEPES(pH 7.4)로 구성되는 Tyrode 용액 중 RT에서 45분 동안 1:1(v/v) 양의 20% Pluronic®-F127 및 스톡 농도 1 mmol/ℓ인 DMSO 중에 용해시킨 2 μmol/ℓ Fluo-4 AM을 로딩하였다. 세포 내의 일시적 칼슘을 250 ms 간격으로(초 당 4 프레임) 도립 광시야 조영 시스템(Zeiss AxioObserver 도립 광시야/형광 현미경)을 사용하여 가열 스테이지 상에서 기록하였다. 이어서 관심 영역(ROI)을 MetaXpress 소프트웨어를 사용하여 배경 감산 기준선 형광에 대해 정상화된 배경 감산 형광 세기의 변화로서 정량하였다.
정량 및 통계 분석
다양한 외배엽 계통을 유도하기 위한 전략의 개발 동안, 80개를 초과하는 분화(생물학적 및 기술적)를 수행하여 계통 특이적 GFP에 대해 FACS 분석에 의해 프로토콜의 재현성 및 강력함을 평가하였다. 모든 데이터를 그 특정 실험에 대해 나타내는 상자그래프에 도시한다. 구체적으로, 도 37e(n = 3), 도 38a, 38g(n = 3), 도 38b(n = 2), 도 39(n = 2 생물학적 반복물, n = 4 기술적 반복물), 도 6c(n = 3), 도 6d(n = 2), 도 6e(n = 6) 및 도 7a(n = 8). 도 40h(n = 5 생물학적, n = 2 기술적), 도 42(n = 2 생물학적 반복물, n = 4 기술적 반복물), 도 44(n = 3).
본 논문에서 생성된 RNA 서열분석 데이터는 접근 번호 GEO: GSE101661로 GEO에 업로드한다. 상기 데이터세트에는 HTSeq로부터의 계수-표 출력물 및 시작 hESC 대비 각각의 세포 유형의 배율 변화 정량이 포함된다.
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본원에서 개시되는 요지 사안 및 그 장점이 상세히 기재되었으나, 다양한 변화, 치환 및 변경이 첨부되는 청구범위에 의해 정의된 바와 같은 본 발명의 정신 및 범위에서 벗어나지 않고 본원에서 수행될 수 있음이 이해되어야 한다. 또한, 본 출원의 범위는 명세서에 기재된 공정, 기계, 제조, 및 물질의 조성, 수단, 방법 및 단계의 특정 구현예로 제한되는 것이 아니다. 당업자가 본원에서 개시되는 요지 사안의 개시로부터 쉽게 이해할 바와 같이, 본원에 기재된 해당 구현예와 실질적으로 동일한 기능을 수행하거나 실질적으로 동일한 결과를 달성하는 현존하는 또는 이후 개발될 공정, 기계, 제조, 물질의 조성, 수단, 방법, 또는 단계는 본원에서 개시되는 요지 사안에 따라 이용될 수 있다. 따라서, 첨부되는 구현예는 이러한 공정, 기계, 제조, 물질의 조성, 수단, 방법, 또는 단계를 이의 범위 내에 포함한다.
특허, 특허 출원, 공보, 제품 설명 및 프로토콜이 본 출원에 걸쳐 인용되며 그 개시는 모든 목적을 위해 이의 전문이 본원에 참조로 포함된다.
<110> MEMORIAL SLOAN-KETTERING CANCER CENTER <120> METHODS OF DIFFERENTIATING STEM CELL-DERIVED ECTODERMAL LINEAGE PRECURSORS <130> 2020-FPA-9905 <140> PCT/US2018/049986 <141> 2018-09-07 <150> 62/555,629 <151> 2017-09-07 <160> 20 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1 tgtcctgtat tgtaccact 19 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2 tgtatacaaa ggtccttgt 19 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 3 tctctgctcg gccccctca 19 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 4 ttggggtcct aagtgggga 19 <210> 5 <211> 59 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 taccagccta tctaccccca gtcgcaagat ccttactccc acgtcaacga cccctacag 59 <210> 6 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 accctaccag cctatctacc cccagtcgca agatccttac tcccacgtca acgaccccta 60 60 <210> 7 <211> 54 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 caccctacca gcctatctac ccccagtcgc aagatcctta ctcccacgtc aacg 54 <210> 8 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (27) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (32) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 8 caccctacca gcctatctac ccccagnata gngggcaaga cccttactcc tacgtcctga 60 60 <210> 9 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 ccaccctacc agcctatcta cccccagtcg caagatcctt actcccacgt caacgacccc 60 60 <210> 10 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (28) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 10 ccaccctacc agcctatcta cccctccnag gtaaacaacc cc 42 <210> 11 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 cctaccagcc tatctacccc cagtcgcaag atccttactc ccacgtcaac gacccctaca 60 60 <210> 12 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 12 cctaccagcc tatctacccc cagtttacac ccatatccac gacccctaca 50 <210> 13 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 13 ctctctgctc ggccccctca cctccagtct ggtggacttg gggtcctaag tggggagg 58 <210> 14 <211> 101 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 14 ccctaccagc ctatctaccc ccagtcgcaa gatccttact cccacgtcaa cgacccctac 60 agcctgaacc ccctgcacgc ccagccgcag ccgcagcacc c 101 <210> 15 <211> 107 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 15 ccctaccagc ctatctaccc ccagtagata gggtaagatc cttactccca cgtcaacgac 60 ccctacagcc tgaaccccct gcacgcccag ccgcagccgc agcaccc 107 <210> 16 <211> 92 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 16 ccctaccagc ctatctaccc ccagccttgc tcccacgtca acgaccccta cagcctgaac 60 cccctgcacg cccagccgca gccgcagcac cc 92 <210> 17 <211> 82 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (77) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 17 ccctaccagc ctatctaccc ccccacgtca acgaccccta cagcctgaac cccctgcacg 60 cccagccgca gccgcancac cc 82 <210> 18 <211> 83 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 18 ccctaccagc ctatctaccc ctcccacgtc aacgacccct acagcctgaa ccccctgcac 60 gcccagccgc agccgcagca ccc 83 <210> 19 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 19 ccctaccagc ctatctaccc ccacgcaaga tccttactcc cacgtcaacg acccctacag 60 cctgaacccc ctgcacgccc agccgcagcc gcagcaccc 99 <210> 20 <211> 91 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 20 ccctaccagc ctatctaccc ccagtttact cccacgtcaa cgacccctac agcctgaacc 60 ccctgcacgc ccagccgcag ccgcagcacc c 91

Claims (43)

  1. SOX10을 포함하는 적어도 하나의 신경 능선 계통 마커를 발현하는 시험관내 분화된 세포 집단으로서, 상기 분화된 세포 집단은 줄기 세포 집단을 적어도 약 2일 또는 3일 동안 하나 이상의 전환 성장 인자 베타(TGFβ)/액티빈(Activin)-노달(Nodal) 신호전달의 억제제 및 하나 이상의 BMP 신호전달의 활성화제에 노출시키는 단계; 및 상기 세포를 하나 이상의 Wnt 신호전달의 활성화제에 노출시키는 단계;를 포함하는 방법에 따라 줄기 세포 집단으로부터 유도되며, 약 20% 미만의 분화된 세포 집단이 FOXG1, PAX6, SIX1, 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 검출가능한 수준의 적어도 하나의 마커를 발현하는 시험관내 분화된 세포 집단.
  2. SIX1, PAX3, PITX3, 크리스탈린 알파(Crystallin alpha) A, 크리스탈린 알파 B, 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 두개 기원판 계통 마커를 발현하는 시험관내 분화된 세포 집단으로서, 상기 분화된 세포 집단은 줄기 세포 집단을 적어도 약 2일 또는 3일 동안 하나 이상의 TGFβ/액티빈-노달 신호전달의 억제제 및 하나 이상의 BMP 신호전달의 활성화제에 노출시키는 단계; 및 상기 세포를 하나 이상의 FGF 신호전달의 활성화제에 노출시키는 단계;를 포함하는 방법에 따라 줄기 세포 집단으로부터 유도되며, 약 20% 미만의 분화된 세포 집단이 FOXG1, PAX6, SIX10, 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 검출가능한 수준의 적어도 하나의 마커를 발현하는 시험관내 분화된 세포 집단.
  3. SIX1, PAX3, 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 삼차 기원판 계통 마커를 발현하는 시험관내 분화된 세포 집단으로서, 상기 분화된 세포 집단은 줄기 세포 집단을 적어도 약 2일 또는 3일 동안 하나 이상의 TGFβ/액티빈-노달 신호전달의 억제제 및 하나 이상의 BMP 신호전달의 활성화제에 노출시키는 단계; 및 상기 세포를 하나 이상의 Wnt 신호전달의 활성화제에 노출시키는 단계;를 포함하는 방법에 따라 줄기 세포 집단으로부터 유도되며, 약 20% 미만의 분화된 세포 집단이 FOXG1, PAX6, SIX10, 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 검출가능한 수준의 적어도 하나의 마커를 발현하는 시험관내 분화된 세포 집단.
  4. TFAP2A를 포함하는 적어도 하나 이상의 비-신경 외배엽 계통 마커를 발현하는 시험관내 분화된 세포 집단으로서, 상기 분화된 세포 집단은 줄기 세포 집단을 (a) 적어도 약 2일 또는 3일 동안 하나 이상의 TGFβ/액티빈-노달 신호전달의 억제제 및 또는 하나 이상의 BMP 신호전달의 활성화제에 노출시키는 단계; 및 상기 세포를 하나 이상의 FGF 신호전달의 억제제에 노출시키는 단계;를 포함하는 방법에 따라 줄기 세포 집단으로부터 유도되며, 약 20% 미만의 분화된 세포 집단이 FOXG1, PAX6, SIX10, SIX1 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 검출가능한 수준의 적어도 하나의 마커를 발현하는 시험관내 분화된 세포 집단.
  5. 청구항 1 또는 청구항 3에 있어서,
    상기 세포는 약 600 nM 내지 약 1.5 μM의 농도로 하나 이상의 Wnt 신호전달의 활성화제에 노출되는 집단.
  6. 청구항 2에 있어서,
    상기 세포는 약 10 ng/㎖ 내지 약 200 ng/㎖의 농도로 하나 이상의 FGF 신호전달의 활성화제에 노출되는 집단.
  7. 청구항 4에 있어서,
    상기 세포는 약 1 μM 내지 약 20 μM의 농도로 하나 이상의 FGF 신호전달의 억제제에 노출되는 집단.
  8. 청구항 1 내지 청구항 7 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 줄기 세포는 약 1 μM 내지 약 20 μM의 농도로 하나 이상의 TGFβ/액티빈-노달 신호전달의 억제제에, 그리고 약 0.01 ng/㎖ 내지 약 30 ng/㎖의 농도로 하나 이상의 BMP 신호전달의 활성화제에 노출되는 집단.
  9. 청구항 4, 청구항 7, 및 청구항 8 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포는 약 2일 동안 약 10 ng/㎖ 또는 약 20 ng/㎖의 농도로 하나 이상의 BMP 신호전달의 활성화제에, 이어서 약 5 ng/㎖의 농도로 하나 이상의 BMP 신호전달의 활성화제에 노출되는 집단.
  10. 청구항 1 내지 청구항 9 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 하나 이상의 TGFβ/액티빈-노달 신호전달의 억제제는 SB431542, 이의 유도체, 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 소분자를 포함하는 집단.
  11. 청구항 1 내지 청구항 10 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 BMP 신호전달의 활성화제는 BMP2, BMP4, BMP6, BMP7, 이의 유도체, 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 집단.
  12. 청구항 1, 청구항 3, 청구항 5, 및 청구항 8 내지 청구항 11 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 하나 이상의 Wnt 신호전달의 활성화제는 CHIR99021, WNT3A, 이의 유도체, 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 소분자인 집단.
  13. 청구항 2, 청구항 6, 및 청구항 8 내지 청구항 12 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 하나 이상의 FGF 신호전달의 활성화제는 FGF2, 이의 유도체, 및 이의 혼합물을 포함하는 집단.
  14. 청구항 4, 청구항 7, 및 청구항 8 내지 청구항 13 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 FGF 신호전달의 억제제는 SU5402, 이의 유도체, 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 소분자인 집단.
  15. 줄기 세포 집단을 적어도 약 2일 또는 3일 동안 하나 이상의 TGFβ/액티빈-노달 신호전달의 억제제 및 하나 이상의 BMP 신호전달의 활성화제에 노출시키는 단계; 및 상기 세포를 하나 이상의 Wnt 신호전달의 활성화제에 노출시켜 적어도 하나의 신경 능선 계통 마커를 발현하는 분화된 세포의 세포 집단을 수득하는 단계;를 포함하는 줄기 세포의 분화를 유도하는 시험관내 방법.
  16. 줄기 세포 집단을 적어도 약 2일 또는 3일 동안 하나 이상의 TGFβ/액티빈-노달 신호전달의 억제제 및 하나 이상의 BMP 신호전달의 활성화제에 노출시키는 단계; 및 상기 세포를 하나 이상의 Wnt 신호전달의 활성화제에 노출시켜 적어도 하나의 두개 기원판 계통 마커를 발현하는 분화된 세포의 세포 집단을 수득하는 단계;를 포함하는 줄기 세포의 분화를 유도하는 시험관내 방법.
  17. 줄기 세포 집단을 적어도 약 2일 또는 3일 동안 하나 이상의 TGFβ/액티빈-노달 신호전달의 억제제 및 하나 이상의 BMP 신호전달의 활성화제에 노출시키는 단계; 및 상기 세포를 하나 이상의 Wnt 신호전달의 활성화제에 노출시켜 적어도 하나의 삼차 기원판 계통 마커를 발현하는 분화된 세포의 세포 집단을 수득하는 단계;를 포함하는 줄기 세포의 분화를 유도하는 시험관내 방법.
  18. 줄기 세포 집단을 적어도 약 2일 또는 3일 동안 하나 이상의 TGFβ/액티빈-노달 신호전달의 억제제 및 하나 이상의 BMP 신호전달의 활성화제에 노출시키는 단계; 및 상기 세포를 하나 이상의 Wnt 신호전달의 활성화제에 노출시켜 적어도 하나의 비-신경 외배엽 계통 마커를 발현하는 분화된 세포의 세포 집단을 수득하는 단계;를 포함하는 줄기 세포의 분화를 유도하는 시험관내 방법.
  19. 청구항 15 또는 청구항 17에 있어서,
    상기 세포는 약 600 nM 내지 약 1.5 μM의 농도로 하나 이상의 Wnt 신호전달의 활성화제에 노출되는 방법.
  20. 청구항 16에 있어서,
    상기 세포는 약 10 ng/㎖ 내지 약 200 ng/㎖의 농도로 하나 이상의 FGF 신호전달의 활성화제에 노출되는 방법.
  21. 청구항 18에 있어서,
    상기 세포는 약 1 μM 내지 약 20 μM의 농도로 하나 이상의 FGF 신호전달의 억제제에 노출되는 방법.
  22. 청구항 15 내지 청구항 21 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 줄기 세포는 약 1 μM 내지 약 20 μM의 농도로 하나 이상의 TGFβ/액티빈-노달 신호전달의 억제제에, 그리고 약 0.01 ng/㎖ 내지 약 30 ng/㎖의 농도로 하나 이상의 BMP 신호전달의 활성화제에 노출되는 방법.
  23. 청구항 18, 청구항 21, 및 청구항 22 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 줄기 세포는 약 2일 동안 약 10 ng/㎖ 또는 약 20 ng/㎖의 농도로 하나 이상의 BMP 신호전달의 활성화제에, 이어서 약 5 ng/㎖의 농도로 하나 이상의 BMP 신호전달의 활성화제에 노출되는 방법.
  24. 청구항 15 내지 청구항 23 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 하나 이상의 TGFβ/액티빈-노달 신호전달의 억제제는 SB431542, 이의 유도체, 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 소분자를 포함하는 방법.
  25. 청구항 15 내지 청구항 24 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 하나 이상의 BMP 신호전달의 활성화제는 BMP2, BMP4, BMP6, BMP7, 이의 유도체, 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  26. 청구항 15, 청구항 17, 청구항 19, 및 청구항 22 내지 청구항 25 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 하나 이상의 Wnt 신호전달의 활성화제는 CHIR99021, WNT3A, 이의 유도체, 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 소분자인 방법.
  27. 청구항 16, 청구항 20, 및 청구항 22 내지 청구항 26 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 하나 이상의 FGF 신호전달의 활성화제는 FGF2, 이의 유도체, 및 이의 혼합물을 포함하는 방법.
  28. 청구항 18, 청구항 21, 및 청구항 22 내지 청구항 27 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 FGF 신호전달의 억제제는 SU5402, 이의 유도체, 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 소분자인 방법.
  29. 청구항 15, 청구항 19, 및 청구항 22 내지 청구항 28 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 신경 능선 계통 마커는 SOX10을 포함하는 방법.
  30. 청구항 16, 청구항 20, 및 청구항 22 내지 청구항 28 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 두개 기원판 계통 마커는 SIX1, PAX3, PITX3, 크리스탈린 알파 A, 크리스탈린 알파 B, 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  31. 청구항 17, 청구항 19, 및 청구항 22 내지 청구항 28 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 삼차 기원판 계통 마커는 SIX1, PAX3, 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  32. 청구항 18, 청구항 21, 및 청구항 22 내지 청구항 28 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 비-신경 외배엽 계통 마커는 TFAP2A를 포함하는 방법.
  33. 청구항 15 내지 청구항 32 중 어느 한 항에 있어서,
    약 20% 미만의 분화된 세포 집단이 FOXG1, PAX6, SIX1, 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 검출가능한 수준의 적어도 하나의 마커를 발현하는 방법.
  34. 청구항 1 내지 청구항 14 중 어느 한 항의 시험관내 분화된 세포 집단을 포함하는 조성물.
  35. 청구항 34에 있어서,
    약학 조성물이며 약학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체를 추가로 포함하는 조성물.
  36. 대상체에 청구항 1 내지 청구항 14 중 어느 한 항의 시험관내 분화된 세포 또는 청구항 34 또는 청구항 35의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 대상체에서 신경변성 및/또는 뇌하수체 장애를 치료하는 방법.
  37. 청구항 36에 있어서,
    상기 뇌하수체 장애는 뇌하수체저하 장애인 방법.
  38. 신경변성 및/또는 뇌하수체 장애의 치료용 약제의 제조에 있어서의 청구항 1 내지 청구항 14 중 어느 한 항의 시험관내 분화된 세포 또는 청구항 34 또는 청구항 35의 조성물의 용도.
  39. 청구항 38에 있어서,
    뇌하수체 장애는 뇌하수체저하 장애인 방법.
  40. 청구항 1 내지 청구항 14 중 어느 한 항에 있어서,
    신경변성 및/또는 뇌하수체 장애의 치료에 사용하기 위한 시험관내 분화된 세포.
  41. 청구항 40에 있어서,
    뇌하수체 장애는 뇌하수체저하 장애인 세포.
  42. 청구항 34 또는 청구항 35에 있어서,
    신경변성 및/또는 뇌하수체 장애의 치료에 사용하기 위한 조성물.
  43. 청구항 42에 있어서,
    뇌하수체 장애는 뇌하수체저하 장애인 조성물.
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