WO2023277135A1 - 鼻腔上皮を構成する細胞の製造方法、及び鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞を含む細胞集団 - Google Patents

Abstract

鼻腔上皮を構成する細胞の製造方法であって、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質の存在下で多能性幹細胞を浮遊培養する工程（１）、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質の存在下で、前記工程（１）で培養した細胞を浮遊培養する工程（２）、ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質及びＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質からなる群より選ばれる少なくとも１つの存在下で、前記工程（２）で培養した細胞を浮遊培養する工程（３）、及び前記工程（３）で培養した細胞をさらに浮遊培養し、前記鼻腔上皮を構成する細胞を得る工程（４）であって、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質、ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質及びＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質からなる群より選ばれる少なくとも２つの非存在下で前記細胞を浮遊培養する工程を含む、製造方法。

Description

鼻腔上皮を構成する細胞の製造方法、及び鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞を含む細胞集団

　本発明は、鼻腔上皮を構成する細胞の製造方法、及び鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞を含む細胞集団に関する。

　非特許文献１において、マウスｉＰＳ細胞から形成させた胚様体を、マウスから採取した嗅上皮又は嗅球の初代培養細胞と共培養することにより、一部の嗅神経細胞マーカーを発現する神経細胞が分化誘導されることが報告されている。非特許文献２において、ヒト多能性幹細胞から嗅覚プラコード細胞及び嗅神経細胞を製造したことが報告されている。また、本願の発明者は、特許文献１において、ヒトＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞より立体的な非神経上皮組織及び嗅上皮組織を製造可能であることを報告している。

国際公開第２０２０／０３９７３２号

Ｉｎｔ　Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｅｘｐ　Ｐａｔｈｏｌ　２０１７；１０（７）：８０７２－８０８１ Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ　Ｄｅｖ．　２０２２　Ｍａｙ　２０．　ｄｏｉ：　１０．１０８９／ｓｃｄ．２０２１．０２５７．

　しかしながら、特許文献１には、鼻腔上皮組織を効率よく製造することは記載されていない。本発明の目的は、多能性幹細胞から効率よく鼻腔上皮を構成する細胞を製造する方法を提供することである。

　本発明者らは、上記課題を解決すべく検討を重ねたところ、多能性幹細胞をＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質の存在下で培養し、一度ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を添加して一定期間培養したのちに、ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質及びＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質からなる群より選ばれる少なくとも１つを添加して培養を行い、さらにＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質、ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質及びＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質からなる群より選ばれる少なくとも１つの非存在下で培養を継続することで鼻腔上皮を構成する細胞を効率よく製造できることを見出した。培養の継続は、ＦＧＦシグナル伝達経路阻害物質、Ｓｈｈシグナル伝達経路作用物質、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路阻害物質、アクチビン／ＴＧＦ－βシグナル伝達経路作用物質及びレチノイン酸シグナル伝達経路作用物質からなる群より選ばれる少なくとも１つの存在下で行うことが好ましい。さらに、一つのウェルが複数のマイクロウェルに分割され、前記マイクロウェルの１つにつき、１つの細胞塊が形成される培養器材を用いることで、鼻腔上皮を構成する細胞を含む細胞塊をさらに効率よく製造できることを見出した。さらに、別の態様として、多能性幹細胞をＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質の存在下で器材表面において接着培養し、一度ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を添加して一定期間培養したのちに、ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質及びＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質からなる群より選ばれる少なくとも１つを添加して培養を行うことによっても、鼻腔上皮を構成する細胞を効率よく製造できることを見出した。

　本発明は、以下に例示する鼻腔上皮を構成する細胞の製造方法、鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞を含む細胞集団、該細胞集団の疾患モデルとしての使用方法等に関する。
［１］　鼻腔上皮を構成する細胞の製造方法であって、
　Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質の存在下で多能性幹細胞を培養する工程（１）、
　ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質の存在下で、前記工程（１）で培養した細胞を培養する工程（２）、
　ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質及びＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質からなる群より選ばれる少なくとも１つの存在下で、前記工程（２）で培養した細胞を培養する工程（３）、及び
　前記工程（３）で培養した細胞をさらに培養し、前記鼻腔上皮を構成する細胞を得る工程（４）であって、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質、ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質及びＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質からなる群より選ばれる少なくとも２つの非存在下で前記細胞を培養する工程を含む、製造方法。
［２］　前記工程（４）において、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質、ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質及びＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質の非存在下で前記細胞を培養する、［１］に記載の製造方法。
［３］　前記工程（４）において、ＦＧＦシグナル伝達経路阻害物質、Ｓｈｈシグナル伝達経路作用物質、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路阻害物質、アクチビン／ＴＧＦ－βシグナル伝達経路作用物質及びレチノイン酸シグナル伝達経路作用物質からなる群より選ばれる少なくとも１つの存在下で前記細胞を培養する、［１］又は［２］に記載の製造方法。
［４］　鼻腔上皮を構成する細胞の製造方法であって、
　Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質の存在下で多能性幹細胞を培養する工程（１）であって、前記多能性幹細胞を浮遊培養し、細胞凝集体を形成させる工程、
　ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質の存在下で、前記工程（１）で培養した細胞を培養する工程（２）であって、前記細胞凝集体を浮遊培養する工程、
　ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質及びＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質からなる群より選ばれる少なくとも１つの存在下で、前記工程（２）で培養した細胞を培養する工程（３）であって、前記細胞凝集体を浮遊培養する工程、及び
　前記工程（３）で培養した細胞をさらに培養し、前記鼻腔上皮を構成する細胞を得る工程（４）であって、ＦＧＦシグナル伝達経路阻害物質、Ｓｈｈシグナル伝達経路作用物質、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路阻害物質、アクチビン／ＴＧＦ－βシグナル伝達経路作用物質及びレチノイン酸シグナル伝達経路作用物質からなる群より選ばれる少なくとも１つの存在下で前記細胞凝集体を浮遊培養する工程を含む、製造方法。
［５］前記工程（１）、及び工程（２）から（４）のうち任意の工程の浮遊培養を、少なくとも１つのウェルが形成されている培養器材中で実施し、
　前記ウェルは、複数のマイクロウェルに分割されていて、
　前記マイクロウェルの１つにつき、１つの細胞塊が形成されるように浮遊培養を実施する、［４］に記載の製造方法。
［６］前記培養器材は、前記１つのウェルが少なくとも１ｃｍ^２以上の底面積を有し、
　前記ウェルは、少なくとも１ｃｍ^２あたり４つ以上のマイクロウェルに分割されている、［５］に記載の製造方法。
［７］　鼻腔上皮を構成する細胞の製造方法であって、
　Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質の存在下で多能性幹細胞を培養する工程（１）であって、前記多能性幹細胞を培養器材上で接着培養する工程、
　ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質の存在下で、前記工程（１）で培養した細胞を培養する工程（２）であって、前記細胞を接着培養する工程、
　ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質及びＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質からなる群より選ばれる少なくとも１つの存在下で、前記工程（２）で培養した細胞を培養する工程（３）であって、前記細胞を接着培養する工程、及び
　前記工程（３）で培養した細胞をさらに培養し、前記鼻腔上皮を構成する細胞を得る工程（４）であって、ＦＧＦシグナル伝達経路阻害物質、Ｓｈｈシグナル伝達経路作用物質、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路阻害物質、アクチビン／ＴＧＦ－βシグナル伝達経路作用物質及びレチノイン酸シグナル伝達経路作用物質からなる群より選ばれる少なくとも１つの存在下で前記細胞を接着培養する工程を含む、製造方法。
［８］　前記培養器材は、細胞外マトリクス又は合成細胞接着分子でコーティングされている、［７］に記載の製造方法。
［９］　前記培養器材は、培地の灌流を行なうための流路を有し、
　前記工程（１）、前記工程（２）、前記工程（３）及び前記工程（４）からなる群より選ばれる少なくとも１つの工程において、灌流環境下で前記細胞を接着培養する、［７］又は［８］に記載の製造方法。
［１０］　前記培養器材は、酸素又は培地を透過する膜を有する、［７］～［９］のいずれかに記載の製造方法。
［１１］　鼻腔上皮を構成する細胞の製造方法であって、
　Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質の存在下で多能性幹細胞を培養する工程（１）であって、前記多能性幹細胞を浮遊培養し、細胞凝集体を形成させる工程、
　ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質の存在下で、前記工程（１）で培養した細胞を培養する工程（２）であって、前記細胞凝集体を浮遊培養する工程、
　ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質及びＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質からなる群より選ばれる少なくとも１つの存在下で、前記工程（２）で培養した細胞を培養する工程（３）であって、前記細胞凝集体中に嗅神経前駆細胞が分化するまで浮遊培養する工程、及び
　前記工程（３）で培養した細胞をさらに培養し、前記鼻腔上皮を構成する細胞を得る工程（４）であって、前記細胞凝集体を浮遊培養し、前記嗅神経前駆細胞が存在する上皮と連続する上皮上に前記鼻腔上皮を構成する細胞を得る工程を含む、製造方法。
［１２］　前記ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質は、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ７、ＢＭＰ１３及びＧＤＦ７からなる群より選ばれる少なくとも１つを含む、［１］～［１１］のいずれかに記載の製造方法。
［１３］　前記工程（３）において、ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質の存在下で細胞を培養し、
　前記ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質は、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ７、ＦＧＦ８、ＦＧＦ１０及びこれらの改変体からなる群より選ばれる少なくとも１つを含む、［１］～［１２］のいずれかに記載の製造方法。
［１４］　前記Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質は、非古典的Ｗｎｔ経路に対する阻害活性を有する物質を含む、［１］～［１３］のいずれかに記載の製造方法。
［１５］　前記Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質は、ＰＯＲＣＮ阻害剤を含む、［１］～［１４］のいずれかに記載の製造方法。
［１６］　前記ＰＯＲＣＮ阻害剤は、ＩＷＰ－２、ＩＷＰ－３、ＩＷＰ－４、ＩＷＰ－Ｌ６、ＩＷＰ－１２、ＩＷＰ－Ｏ１、ＬＧＫ－９７４、Ｗｎｔ－Ｃ５９、ＥＴＣ－１３１、ＥＴＣ－１５９、ＧＮＦ－１３３１、ＧＮＦ－６２３１、Ｐｏｒｃｎ－ＩＮ－１、ＲＸＣ００４、ＣＧＸ１３２１及びこれらの誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１つを含む、［１５］に記載の製造方法。
［１７］　前記Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質は、Ｗｎｔ／ＪＮＫシグナル伝達経路阻害物質を含む、［１］～［１６］のいずれかに記載の製造方法。
［１８］　前記Ｗｎｔ／ＪＮＫシグナル伝達経路阻害物質は、ＪＮＫ阻害剤を含む、［１７］に記載の製造方法。
［１９］　前記ＪＮＫ阻害剤は、ＳＰ６００１２５、ＪＮＫ－ＩＮ－８、ＤＢ０７２６８、ＩＱ－１Ｓ、Ｔａｎｚｉｓｅｒｔｉｂ、Ｂｅｎｔａｍａｐｉｍｏｄ、ＢＩ－７８Ｄ３、ＣＣ－４０１、ＴＣＳ　ＪＮＫ　５ａ、ＡＳ６０１２４５、ＣＶ－６５、Ｄ－ＪＮＫ１、ＥＲ－３５８０６３、ＥＲ－４０９９０３、ＥＲ－４１７２５８、ＣＣ－３５９、ＣＣ－９３０、ＳＢ２０３５８０及びこれらの誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１つを含む、［１８］に記載の製造方法。
［２０］　前記ＪＮＫ阻害剤はＪＮＫ－ＩＮ－８を含み、
　前記ＪＮＫ－ＩＮ－８の濃度が１ｎＭ～５０μＭである培地中で前記工程（１）を開始する、［１８］又は［１９］に記載の製造方法。
［２１］　前記Ｗｎｔ／ＪＮＫシグナル伝達経路阻害物質は、Ｒａｃ阻害剤を含む、［１７］～［２０］のいずれかに記載の製造方法。
［２２］　前記Ｒａｃ阻害剤は、ＮＳＣ２３７６６、ＥＨｏｐ－０１６、ＺＣＬ２７８、ＭＢＱ－１６７、ＫＲｐｅｐ－２ｄ、ＡＲＳ－８５３、Ｓａｌｉｒａｓｉｂ、ＭＬ１４１、ＥＨＴ１８６４及びこれらの誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１つを含む、［２１］に記載の製造方法。
［２３］　前記工程（３）において、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質の存在下で細胞を培養し、
　前記ＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質は、Ｉ型ＢＭＰ受容体阻害剤を含む、［１］～［２２］のいずれかに記載の製造方法。
［２４］　前記Ｉ型ＢＭＰ受容体阻害剤は、Ｋ０２２８８、Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ、ＬＤＮ－１９３１８９、ＬＤＮ－２１２８５４、ＬＤＮ－２１４１１７、ＭＬ３４７、ＤＭＨ１、ＤＭＨ２、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ　１、ＶＵ５３５０、ＯＤ５２、Ｅ６２０１、Ｓａｒａｃａｔｉｎｉｂ、ＢＹＬ７１９及びこれらの誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１つを含む、［２３］に記載の製造方法。
［２５］　前記工程（３）及び前記工程（４）からなる群より選ばれる少なくとも１つの工程において、ＥＧＦシグナル伝達経路作用物質がさらに存在する、［１］～［２４］のいずれかに記載の製造方法。
［２６］　前記工程（１）、前記工程（２）、前記工程（３）及び前記工程（４）からなる群より選ばれる少なくとも１つの工程において、ＴＧＦβシグナル伝達経路阻害物質がさらに存在する、［１］～［２５］のいずれかに記載の製造方法。
［２７］　前記ＴＧＦβシグナル伝達経路阻害物質は、Ａｌｋ５／ＴＧＦβＲ１阻害剤を含む、［２６］に記載の製造方法。
［２８］　前記Ａｌｋ５／ＴＧＦβＲ１阻害剤は、ＳＢ４３１５４２、ＳＢ５０５１２４、ＳＢ５２５３３４、ＬＹ２１５７２９９、ＧＷ７８８３８８、ＬＹ３６４９４７、ＳＤ－２０８、ＥＷ－７１９７、Ａ８３－０１、Ａ７７－０１、ＲｅｐＳｏｘ、ＢＩＢＦ－０７７５、ＴＰ０４２７７３６、ＴＧＦＢＲ１－ＩＮ－１、ＳＭ－１６、ＴＥＷ－７１９７、ＬＹ３２００８８２、ＬＹ２１０９７６１、ＫＲＣＡ　０００８、ＧＳＫ　１８３８７０５、Ｃｒｉｚｏｔｉｎｉｂ、Ｃｅｒｉｔｉｎｉｂ、ＡＳＰ　３０２６、ＴＡＥ６８４、ＡＺＤ３４６３及びこれらの誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１つを含む、［２７］に記載の製造方法。
［２９］　前記工程（１）、前記工程（２）、前記工程（３）及び前記工程（４）からなる群より選ばれる少なくとも１つの工程において、ＴＡＫ１阻害物質がさらに存在する、［１］～［２８］のいずれかに記載の製造方法。
［３０］　前記ＴＡＫ１阻害物質が、（５Ｚ）－７－Ｏｘｏｚｅａｅｎｏｌ、Ｎ－Ｄｅｓ（ａｍｉｎｏｃａｒｂｏｎｙｌ）ＡＺ－ＴＡＫ１　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、Ｔａｋｉｎｉｂ、ＮＧ２５及びこれらの誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１つを含む、［２９］に記載の製造方法。
［３１］　前記工程（３）及び前記工程（４）からなる群より選ばれる少なくとも１つの工程において、酸化ストレスを軽減する作用を有する物質がさらに存在する、［１］～［３０］のいずれかに記載の製造方法。
［３２］　酸化ストレスを軽減する作用を有する物質が、アスコルビン酸、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン、ニコチンアミド及びこれらの誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１つを含む、［３１］に記載の製造方法。
［３３］　前記工程（３）及び前記工程（４）からなる群より選ばれる少なくとも１つの工程において、ストレス応答シグナル伝達経路に対する阻害物質がさらに存在する、［１］～［３２］のいずれかに記載の製造方法。
［３４］　前記工程（３）及び前記工程（４）からなる群より選ばれる少なくとも１つの工程において、揺動しながら細胞を培養する、［１］～［３３］のいずれかに記載の製造方法。
［３５］　鼻腔上皮を構成する細胞の製造方法であって、
　ＦＧＦシグナル伝達経路阻害物質、Ｓｈｈシグナル伝達経路作用物質、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路阻害物質、アクチビン／ＴＧＦ－βシグナル伝達経路作用物質及びレチノイン酸シグナル伝達経路作用物質からなる群より選ばれる少なくとも１つの存在下で、嗅神経細胞又はその前駆細胞を含む細胞集団を培養する工程を含む、製造方法。
［３６］　［１］～［３５］のいずれかに記載の製造方法により得られる、鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞を含む細胞集団。
［３７］　鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞を含む細胞集団。
［３８］　前記鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞は、外胚葉マーカーを発現する、［３７］に記載の細胞集団。
［３９］　前記鼻腔上皮を構成する細胞は、分泌細胞を含む、［３７］又は［３８］に記載の細胞集団。
［４０］　前記分泌細胞は、ムチン１、ムチン２、ムチン３、ムチン４、ムチン５ＡＣ、ムチン５Ｂ、ＦｏｘＡ１、ＦｏｘＡ２、Ｎｋｘ２．１／ＴＴＦ－１及びＳＰＤＥＦからなる群より選ばれる少なくとも１つを発現する、［３９］に記載の細胞集団。
［４１］　前記鼻腔上皮を構成する細胞は、線毛細胞を含む、［３７］～［４０］のいずれかに記載の細胞集団。
［４２］　前記線毛細胞は、ＦｏｘＪ１、ＦｏｘＮ４、ｐ７３、アセチル化チューブリン及びβ４－Ｔｕｂｕｌｉｎからなる群より選ばれる少なくとも１つを発現する、［４１］に記載の細胞集団。
［４３］　前記線毛細胞は、細胞表面に線毛構造を有する、［４２］又は［４２］に記載の細胞集団。
［４４］　前記鼻腔上皮を構成する細胞は、基底細胞を含む、［３７］～［４３］のいずれかに記載の細胞集団。
［４５］　前記基底細胞は、サイトケラチン５、サイトケラチン１４、サイトケラチン１５、ｐ６３、ΔＮｐ６３及びｐ７５からなる群より選ばれる少なくとも１つを発現する、［４４］に記載の細胞集団。
［４６］　前記鼻腔上皮を構成する細胞は、塩類細胞を含む、［３７］～［４５］のいずれかに記載の細胞集団。
［４７］　前記塩類細胞は、ＣＦＴＲ、Ｆｏｘｉ１、液胞型プロトンＡＴＰａｓｅ、Ａｓｃｌ３、Ｔｆｃｐ２ｌ１及びＤＭＲＴ２からなる群より選ばれる少なくとも１つを発現する、［４６］に記載の細胞集団。
［４８］　前記鼻腔上皮を構成する細胞は、神経内分泌細胞を含む、［３７］～［４７］のいずれかに記載の細胞集団。
［４９］　前記神経内分泌細胞は、Ａｓｃｌ１、ＮｅｕｒｏＤ１、Ｃｈｒｏｍｏｇｒａｎｉｎ　Ａ、Ｓｙｎａｐｔｏｐｈｉｓｉｎ及び神経特異エノラーゼ（ＮＳＥ）からなる群より選ばれる少なくとも１つを発現する、［４８］に記載の細胞集団。
［５０］　前記鼻腔上皮を構成する細胞は、孤立化学感覚上皮細胞を含む、［３７］～［４９］のいずれかに記載の細胞集団。
［５１］　前記鼻腔上皮を構成する細胞は、クラブ細胞を含む、［３７］～［５０］のいずれかに記載の細胞集団。
［５２］　前記鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞は、ウイルス受容体又はウイルス感染関連因子を発現する、［３７］～［５１］のいずれかに記載の細胞集団。
［５３］　前記ウイルス受容体又は前記ウイルス感染関連因子は、ＡＣＥ２、シアル酸α２，６Ｇａｌ及びシアル酸α２，３Ｇａｌからなる群より選ばれる少なくとも１つを含む、［５２］に記載の細胞集団。
［５４］　基底側と頂端側との極性を有する、［３７］～［５３］のいずれかに記載の細胞集団。
［５５］　前記鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞は、細胞種ごとに集合している、［３７］～［５４］のいずれかに記載の細胞集団。
［５６］　嗅上皮を構成する細胞又はその前駆細胞をさらに含む、［３７］～［５５］のいずれかに記載の細胞集団。
［５７］　前記嗅上皮を構成する細胞は、嗅神経細胞を含む、［５６］に記載の細胞集団。
［５８］　中枢神経系を構成する神経系細胞をさらに含む、［３７］～［５７］のいずれかに記載の細胞集団。
［５９］　前記鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞を含む鼻腔上皮様組織と、前記鼻腔上皮様組織によって表面の少なくとも一部が被覆された神経組織とを有し、
　前記神経組織は、中枢神経系を構成する神経系細胞又はその前駆細胞を含む、［３７］～［５８］のいずれかに記載の細胞集団。
［６０］　前記神経組織の表面の少なくとも一部を被覆する嗅上皮様組織をさらに含み、
　前記嗅上皮様組織は、嗅上皮を構成する細胞又はその前駆細胞を含む、［５９］に記載の細胞集団。
［６１］　前記鼻腔上皮様組織と前記嗅上皮様組織とは、連続的に形成されている、［６０］に記載の細胞集団。
［６２］　前記嗅上皮様組織が細胞塊内側に向かって陥入しており、嗅窩様構造を形成している、［６１］に記載の細胞集団。
［６３］　前記鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞は、遺伝性疾患又は感染症に関連する遺伝子が欠損又は変異している、［３６］～［６２］のいずれかに記載の細胞集団。
［６４］前記遺伝性疾患又は感染症に関連する遺伝子はＡＣＥ２である、［６３］に記載の細胞集団。
［６５］　［３６］～［６４］のいずれかに記載の細胞集団を用いた、疾患治療用化合物のスクリーニング方法。
［６６］　［３６］～［６４］のいずれかに記載の細胞集団を含む、疾患治療用化合物のスクリーニングキット。
［６７］　鼻腔上皮の疾患モデルとしての［３６］～［６４］のいずれかに記載の細胞集団の使用方法。
［６８］　［３６］～［６４］のいずれかに記載の細胞集団を用いた対象物質の薬効又は毒性の評価方法。
［６９］　［３６］～［６４］のいずれかに記載の細胞集団を用いた対象物質の薬効又は毒性の評価キット。
［７０］　［３６］～［６４］のいずれかに記載の細胞集団を用いた、疾患特異的なバイオマーカーの探索方法。
［７１］　［３６］～［６４］のいずれかに記載の細胞集団又はその細胞集団から精製された細胞を含む、移植用細胞集団。
［７２］　［３５］～［６４］のいずれかに記載の細胞集団又はその細胞集団から精製された細胞の、ウイルスの分離培養における使用。

　別の側面において本発明は、以下に例示する鼻腔上皮を構成する細胞の製造方法、鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞を含む細胞集団、該細胞集団の疾患モデルとしての使用方法等に関する。
［Ｃ１］　鼻腔上皮を構成する細胞の製造方法であって、
　Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質の存在下で多能性幹細胞を浮遊培養する工程（１）、
　ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質の存在下で、前記工程（１）で培養した細胞を浮遊培養する工程（２）、
　ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質及びＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質からなる群より選ばれる少なくとも１つの存在下で、前記工程（２）で培養した細胞を浮遊培養する工程（３）、及び
　前記工程（３）で培養した細胞をさらに浮遊培養し、前記鼻腔上皮を構成する細胞を得る工程（４）であって、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質、ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質及びＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質からなる群より選ばれる少なくとも２つの非存在下で前記細胞を浮遊培養する工程を含む、製造方法。
［Ｃ２］　前記工程（４）において、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質、ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質及びＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質の非存在下で前記細胞を浮遊培養する、［Ｃ１］に記載の製造方法。
［Ｃ３］　前記工程（４）において、ＦＧＦシグナル伝達経路阻害物質、Ｓｈｈシグナル伝達経路作用物質、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路阻害物質、アクチビン／ＴＧＦ－βシグナル伝達経路作用物質及びレチノイン酸シグナル伝達経路作用物質からなる群より選ばれる少なくとも１つの存在下で前記細胞を浮遊培養する、［Ｃ１］又は［Ｃ２］に記載の製造方法。
［Ｃ４］　鼻腔上皮を構成する細胞の製造方法であって、
　Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質の存在下で多能性幹細胞を培養器材上接着培養する工程（１）、
　ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質の存在下で、前記工程（１）で培養した細胞を接着培養する工程（２）、
　ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質及びＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質からなる群より選ばれる少なくとも１つの存在下で、前記工程（２）で培養した細胞を接着培養する工程（３）を含む、製造方法。
［Ｃ５］　前記培養器材は、細胞外マトリクス若しくは合成細胞接着分子でコーティングされている培養器材、培地の灌流を行なうための流路を有する培養器材、又は、酸素若しくは培地を透過する膜を有する培養器材である、［Ｃ４］に記載の製造方法。
［Ｃ６］　前記工程（１）が、前記多能性幹細胞を浮遊培養し、細胞凝集体を形成させる工程であり、
　前記工程（２）が、前記細胞凝集体を浮遊培養する工程であり、
　前記工程（３）が、前記工程（２）で培養した前記細胞凝集体を細胞凝集体中の細胞が嗅神経前駆細胞に分化するまで浮遊培養する工程であり、
　前記工程（４）が前記工程（３）で培養した前記細胞凝集体を前記嗅神経前駆細胞が連続して存在する上皮と、当該上皮上に前記鼻腔上皮とを構成する細胞凝集体を得るまで培養する工程である、［Ｃ１］～［Ｃ３］のいずれかに記載の製造方法。
［Ｃ７］　前記工程（３）及び前記工程（４）からなる群より選ばれる少なくとも１つの工程において、ＥＧＦシグナル伝達経路作用物質がさらに存在する、［Ｃ１］～［Ｃ６］のいずれかに記載の製造方法。
［Ｃ８］　前記工程（１）、前記工程（２）、前記工程（３）及び前記工程（４）からなる群より選ばれる少なくとも１つの工程において、ＴＧＦβシグナル伝達経路阻害物質がさらに存在する、［Ｃ１］～［Ｃ７］のいずれかに記載の製造方法。
［Ｃ９］　前記工程（１）、前記工程（２）、前記工程（３）及び前記工程（４）からなる群より選ばれる少なくとも１つの工程において、ＪＮＫシグナル伝達経路阻害物質がさらに存在する、［Ｃ１］～［Ｃ８］のいずれかに記載の製造方法。
［Ｃ１０］　前記工程（１）、前記工程（２）、前記工程（３）及び前記工程（４）からなる群より選ばれる少なくとも１つの工程において、ＴＡＫ１阻害物質がさらに存在する、［Ｃ１］～［Ｃ９］のいずれかに記載の製造方法。
［Ｃ１１］　前記工程（３）及び前記工程（４）からなる群より選ばれる少なくとも１つの工程において、酸化ストレスを軽減する作用を有する物質又はストレス応答シグナル伝達経路に対する阻害物質がさらに存在する、［Ｃ１］～［Ｃ１０］のいずれかに記載の製造方法。
［Ｃ１２］　前記工程（３）及び前記工程（４）からなる群より選ばれる少なくとも１つの工程において、揺動しながら細胞を培養する、［Ｃ１］～［Ｃ１１］のいずれかに記載の製造方法。
［Ｃ１３］　［Ｃ１］～［Ｃ１２］のいずれかに記載の製造方法により得られる、鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞を含む細胞集団。
［Ｃ１４］　鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞を含む細胞集団。
［Ｃ１５］　前記鼻腔上皮を構成する細胞は、分泌細胞、線毛細胞、基底細胞、塩類細胞、神経内分泌細胞、孤立化学感覚上皮細胞及びクラブ細胞からなる群より選ばれる少なくとも１つを含む、［Ｃ１４］に記載の細胞集団。
［Ｃ１６］　基底側と頂端側との極性を有する、［Ｃ１４］又は［Ｃ１５］に記載の細胞集団。
［Ｃ１７］　嗅上皮を構成する細胞又はその前駆細胞をさらに含む、［Ｃ１４］～［Ｃ１６］のいずれかに記載の細胞集団。
［Ｃ１８］　中枢神経系を構成する神経系細胞をさらに含む、［Ｃ１４］～［Ｃ１７］のいずれかに記載の細胞集団。
［Ｃ１９］　三次元の立体的な細胞集団であって、前記鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞を含む鼻腔上皮様組織と、前記鼻腔上皮様組織によって表面の少なくとも一部が被覆された神経組織とを有し、前記神経組織は、中枢神経系を構成する神経系細胞又はその前駆細胞を含む、［Ｃ１４］～［Ｃ１８］のいずれかに記載の細胞集団。
［Ｃ２０］　前記神経組織の表面の少なくとも一部を被覆する嗅上皮様組織をさらに含み、前記嗅上皮様組織は、嗅上皮を構成する細胞又はその前駆細胞を含む、［１９］に記載の細胞集団。
［Ｃ２１］　前記鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞が培養器材に接着しており、連続した上皮構造により二次元的な鼻腔上皮様組織を形成している、［Ｃ１４］～［Ｃ２０］のいずれかに記載の細胞集団。
［Ｃ２２］　前記鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞は、遺伝性疾患又は感染症に関連する遺伝子が欠損又は変異している、［Ｃ１３］～［Ｃ２１］のいずれかに記載の細胞集団。
［Ｃ２３］　前記遺伝性疾患又は感染症に関連する遺伝子はＡＣＥ２である、［Ｃ２２］に記載の細胞集団。
［Ｃ２４］　［Ｃ１３］～［Ｃ２３］のいずれかに記載の細胞集団を用いた、疾患治療用化合物又は対象物質の毒性のスクリーニング方法。
［Ｃ２５］　［Ｃ１３］～［Ｃ２３］のいずれかに記載の細胞集団を含む、疾患治療用化合物又は対象物質の毒性のスクリーニング用キット。
［Ｃ２６］　［Ｃ１３］～［Ｃ２３］のいずれかに記載の細胞集団を用いた、疾患特異的なバイオマーカーの探索方法。
［Ｃ２７］　［Ｃ１３］～［Ｃ２３］のいずれかに記載の細胞集団又はその細胞集団から精製された細胞を含む、移植用細胞集団。
［Ｃ２８］　［Ｃ１３］～［Ｃ２３］のいずれかに記載の細胞集団又はその細胞集団から精製された細胞の、ウイルスの分離培養における使用。

　本発明によれば、多能性幹細胞から効率よく鼻腔上皮を構成する細胞を製造することが可能になる。また、本発明によれば、鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞を含む細胞集団を用いた疾患モデル、疾患の治療薬のスクリーニング方法、スクリーニングキット、化合物の薬効又は毒性の評価方法及び評価キット等を提供することができる。また、別の態様として、本発明によって製造した鼻腔上皮を、新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）及び季節性コロナウイルスを含む感染症の研究、ウイルスの分離培養その他に供することもできる。

Ａ～Ｊは、鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞を含む細胞集団の構造を模式的に表した図である。四角の点線で囲った部分は、鼻腔上皮様組織を形成している。図１に示す細胞集団は、立体的な構造を有する。 Ａ～Ｅは、鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞を含む細胞集団の構造を模式的に表した図である。図２に示す細胞集団は、平面状の構造を有する。Ａ、Ｂ及びＤは、細胞集団の上面図及び断面図、Ｃは細胞集団の上面図、Ｅは細胞集団の投影図及び断面図である。 Ａ～Ｃは、鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞を含む細胞集団の構造を模式的に表した図である。図３に示す細胞集団は、鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞を含む細胞塊と他の組織の細胞とを含む。 Ａ～Ｆは、非神経上皮組織に存在する鼻腔上皮様組織の構造を模式的に表した図である。 上段は、比較実験１において、ヒトＥＳ細胞から非神経上皮組織を含む細胞塊を作製する際の工程を模式的に示した図である。Ａは、比較実験１において、浮遊培養開始２８日後の細胞塊の倒立顕微鏡の明視野観察像である。Ｂは、比較実験１において、浮遊培養開始２８日後の細胞塊の免疫染色像とその核染色像である。Ｃは、比較実験１において、培養２８日目の細胞塊の構造を模式的に表した図である。 上段は、実験１において、ヒトＥＳ細胞から鼻腔上皮を構成する細胞を含む細胞集団を作製する際の工程を模式的に示した図である。Ａは、実験１において、培養開始３５日後の細胞集団の倒立顕微鏡の明視野観察像である。 実験１において、培養開始３５日後の細胞集団の免疫染色像とその核染色像である。 Ａは、実験１において、培養開始３５日後の細胞集団の免疫染色像とその核染色像である。Ｂは、実験１において、培養３５日目の細胞集団の構造を模式的に表した図である。 上段は、実験２において、ヒトＥＳ細胞から鼻腔上皮を構成する細胞を含む細胞集団を作製する際の工程を模式的に示した図である。Ａは、実験２において、培養開始２８日後の細胞集団の倒立顕微鏡の明視野観察像である。 実験２において、ＪＮＫ阻害剤を添加したときの培養開始２８日後の細胞集団の免疫染色像とその核染色像である。 上段は、実験３において、ヒトＥＳ細胞から鼻腔上皮を構成する細胞を含む細胞集団を作製する際の工程を模式的に示した図である。Ａは、実験３において、培養開始２８日後の細胞集団の倒立顕微鏡の明視野観察像である。Ｂ及びＣは、実験３において、培養開始２８日後の細胞集団の免疫染色像とその核染色像である。Ｄは、実験３において、培養２８日目の細胞集団の構造を模式的に表した図である。 上段は、実験４において、ヒトｉＰＳ細胞から鼻腔上皮を構成する細胞を含む細胞集団を作製する際の工程を模式的に示した図である。Ａは、実験４において、培養開始２１日後の細胞集団の倒立顕微鏡の明視野観察像である。 上段は、実験５において、ヒトＥＳ細胞から鼻腔上皮を構成する細胞を含む細胞集団を作製する際の工程を模式的に示した図である。Ａは、実験５において、培養開始３５日後の細胞集団の倒立顕微鏡の明視野観察像である。 Ａは、実験５において、培養開始３５日後の細胞集団の免疫染色像とその核染色像である。Ｂは、Ａ中で四角の点線で囲った部分の拡大図である。Ｃは、培養開始４５日目の細胞集団の動画を撮影した際の明視野像とその拡大図である。 実験５において、培養開始４２日後の細胞集団のインフルエンザウイルス受容体の免疫染色像とその核染色像である。 実験６及び以降の実験において、ウイルス感染実験及びシングルセル解析に用いたヒトＥＳ細胞から鼻腔上皮を構成する細胞を含む細胞集団（ヒトＥＳ細胞由来鼻腔上皮オルガノイド）を作製する際の工程を模式的に示した図である。 実験６において、鼻腔上皮を構成する細胞を含む細胞集団にインフルエンザウイルスを感染させ、感染後の日数ごとに測定したウイルス力価を示すグラフである。 上段は、実験７において、インフルエンザウイルスを感染させた細胞集団の免疫染色像とその核染色像である。下段は、上段の図の一部拡大図である。 実験８において、鼻腔上皮を構成する細胞を含む細胞集団にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を低濃度又は高濃度で感染させ、感染後の日数ごとに測定したウイルス力価を示すグラフである。Ｌ１からＬ５は、低ウイルス量で感染させた結果であり、Ｈ１からＨ５は、高ウイルス量で感染させた結果である。 実験９において、ウイルス感染前の培養２８日目の細胞集団の免疫染色像とその核染色像である。 Ａ～Ｄは、実験９において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染２日後の細胞集団の免疫染色像とその核染色像である。図中で四角の点線で囲った部分の拡大図をそれぞれの図の右図に示す。図中の矢頭は、ウイルスが感染した嗅上皮様組織又は鼻腔上皮様組織を示す。図中のアスタリスク（＊）は、アンジオテンシン変換酵素２を発現している嗅上皮様組織又は鼻腔上皮様組織を示す。 Ａ～Ｃは、実験９において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染２日後の細胞集団の免疫染色像とその核染色像である。図中で四角の点線で囲った部分の拡大図をそれぞれの図の右図に示す。Ａ及びＢ中の矢頭は、ウイルスが感染した嗅上皮様組織又は鼻腔上皮様組織を示す。 実験９において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染１１日後の細胞集団の免疫染色像とその核染色像である。左図でＡ、Ｂの枠で囲った部分の拡大図をそれぞれ中央図及び右図に示す。図中のアスタリスク（＊）は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２　Ｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ（ＳＡＲＳ－Ｎ）を発現しているオルガノイド内部の中枢神経系の細胞を示す。 Ａ～Ｊは、実験１０において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を感染させた細胞集団の電子顕微鏡像である。Ｂ及びＣは、Ａ中の四角で囲った部分の拡大図、Ｅ及びＦは、Ｄ中の四角で囲った部分の拡大図、Ｈは、Ｇ中の四角で囲った部分の拡大図、Ｊは、Ｉ中の四角で囲った部分の拡大図である。 実験１１において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染２日後の鼻腔上皮を構成する細胞を含む細胞集団のシングルセル解析結果である。Ａは、嗅上皮・鼻腔上皮の細胞集団（ＮＥ）と中枢神経系の細胞集団（ＣＮＳ）に分類したｔ－ＳＮＥプロット図である。Ｂは、鼻腔上皮・嗅上皮の細胞及び中枢神経系の細胞における、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来転写産物を含む各遺伝子発現量のバイオリンプロット図である。 実験１２において、鼻腔上皮を構成する細胞を含む細胞集団に含まれるサイトケラチン１８陽性細胞のシングルセル解析結果のｔ－ＳＮＥプロット図である。 実験１２において、鼻腔上皮を構成する細胞を含む細胞集団のサイトケラチン１８陽性細胞のシングルセル解析結果における各細胞のマーカー遺伝子の発現量解析結果である。 実験１２において、シングルセル解析によって分類された６つのクラスターで、特徴的に発現が高い遺伝子（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ　Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　Ｇｅｎｅｓ（ＤＥＧ））の遺伝子発現のヒートマップである。 図２８の（１）から（３）に記載されたＤＥＧのリストである。 図２８の（４）から（６）に記載されたＤＥＧのリストである。 Ａは、実験１３において、ヒト患者由来の鼻腔上皮・嗅上皮検体のシングルセル解析の結果である。Ｂは、Ａの解析結果とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を感染後２日目（培養３０日目）の鼻腔上皮を構成する細胞を含む細胞集団のシングルセル解析結果を重ねて比較した結果である。 Ａは、実験１４において、ヒト患者由来の鼻腔上皮・嗅上皮検体のシングルセル解析における、嗅神経マーカー及び嗅覚受容体の発現量解析の結果である。Ｂは、実験１４において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を感染後２日目の鼻腔上皮を構成する細胞を含む細胞集団のシングルセル解析における嗅神経マーカー及び嗅覚受容体の発現量解析の結果である。 実験１５において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を感染後２日目の鼻腔上皮を構成する細胞を含む細胞集団について免疫関連遺伝子の発現量をシングルセル解析した結果である。 図３３の破線部内の拡大図である。 実験１５において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を感染後２日目の鼻腔上皮を構成する細胞を含む細胞集団のシングルセル解析を行い、免疫関連遺伝子ごとに発現細胞を解析した結果である。 実験１５において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を感染後２、７及び１１日目の鼻腔上皮を構成する細胞を含む細胞集団のシングルセル解析を行い、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来転写産物（Ｓ）及び免疫関連遺伝子（ＩＳＧ１５）について発現細胞を解析した結果である。 Ａは、実験１６において用いたＡＣＥ２ノックアウトヒトＥＳ細胞株ＫｈＥＳ－１樹立に用いたプラスミドベクターの模式図である。Ｂは、野生型及びＡＣＥ２ノックアウトＫｈＥＳ－１のゲノム上のＡＣＥ２領域の構造である。Ｃは、野生型及びＡＣＥ２ノックアウトＫｈＥＳ－１から調製した培養２８日目の嗅上皮・鼻腔上皮オルガノイドにおけるＡＣＥ２発現をウエスタンブロットによって解析した結果である。 実験１７において、ＡＣＥ２ノックアウトヒトＥＳ細胞株ＫｈＥＳ－１から分化誘導した鼻腔上皮を構成する細胞を含む細胞集団にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を感染させた２日後の免疫染色の結果である。左図中で点線で囲った部分の拡大図をそれぞれの図の右図に示す。 実験１８において、ＡＣＥ２ノックアウトヒトＥＳ細胞株ＫｈＥＳ－１から分化誘導した鼻腔上皮を構成する細胞を含む細胞集団にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を低濃度又は高濃度で感染させ、感染後の日数ごとに測定したウイルス力価を示すグラフである。Ｌ１からＬ５は、低ウイルス量で感染させた結果であり、Ｈ１からＨ５は、高ウイルス量で感染させた結果である。 上段は、実験１９において、ヒトｉＰＳ細胞から鼻腔上皮を構成する細胞を含む細胞塊を作製し、長期培養する際の工程を模式的に示した図である。Ａは、培養開始４５日後及び５９日後の細胞塊の倒立顕微鏡の明視野観察像である。Ｂは、培養開始５９日後の細胞塊の免疫染色像とその核染色像である。 Ａ及びＢは、鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞を含む細胞集団の構造を模式的に表した図である。四角の点線で囲った部分は、鼻腔上皮様組織を形成している。図４１に示す細胞集団は、立体的な構造を有する。 上段は、実験２０において、ヒトｉＰＳ細胞から鼻腔上皮組織、及び嗅窩様構造を形成する嗅上皮組織を含有する細胞集団を作製する際の工程を模式的に示した図である。Ａは、実験２０において、培養開始２２日後の細胞集団の倒立顕微鏡の明視野観察像である。 実験２０において、培養開始２２日後の細胞集団の免疫染色像とその核染色像である。 実験２０において、培養開始２２日後の細胞集団の免疫染色像とその核染色像である。Ｂは、実験２０において、培養２２日目の細胞集団の構造を模式的に表した図である。 上段は、実験２１において、分割されたマイクロウェルを有する培養器材を用いたヒトｉＰＳ細胞から鼻腔上皮組織を含有する細胞集団を作製する際の工程を模式的に示した図である。Ａは、実験２１において、培養開始２１日後の細胞集団の倒立顕微鏡の明視野観察像である。 上段は、実験２２において、分割されたマイクロウェルを有する培養器材を用いたヒトｉＰＳ細胞から鼻腔上皮組織を含有する細胞集団を作製する際の工程を模式的に示した図である。Ａは、実験２２において、培養開始から１日後、２１日後、及び５０日後の細胞集団の倒立顕微鏡の明視野観察像である。 上段は、実験２３において、接着培養によってヒトＥＳ細胞から鼻腔上皮を構成する細胞を含有する細胞集団・二次元オルガノイドを作製する際の工程を模式的に示した図である。Ａは、実験２３において、培養開始から４７日後の細胞集団の抗サイトケラチン１８抗体及び抗ＳＰ８抗体を用いた蛍光免疫染色の観察像である。 上段は、実験２４において、実験２３に記載の方法で調製したヒトＥＳ細胞由来鼻腔上皮を構成する細胞を含有する細胞集団・二次元オルガノイドに対する季節性コロナウイルスの感染実験の手順を模式的に示した図である。Ａは、季節性コロナウイルス株ＨＣｏＶ－２２９ＥをヒトＥＳ細胞由来鼻腔二次元オルガノイド及びＭＲＣ５細胞株に感染させ、感染後１日目から８日目までの培地中のウイルス含有量を１日毎に計測した結果のグラフである。Ｂは、季節性コロナウイルス株ＨＣｏＶ－ＯＣ４３をヒトＥＳ細胞由来鼻腔二次元オルガノイド及びＨＣＴ－８細胞株に感染させ、感染後１日目から８日目までの培地中のウイルス含有量を１日毎に計測した結果のグラフである。 上段は、実験２４において、実験２３に記載の方法で調製したヒトＥＳ細胞由来鼻腔上皮を構成する細胞を含有する細胞集団・二次元オルガノイドに対する季節性コロナウイルスの感染実験の手順を模式的に示した図である。Ａは、季節性コロナウイルス株ＨＣｏＶ－ＮＬ６３をヒトＥＳ細胞由来鼻腔二次元オルガノイド及びＬＬＣ－ＭＫ２－Ｎ細胞株に感染させ、感染後１日目から８日目までの培地中のウイルス含有量を１日毎に計測した結果のグラフである。Ｂは、季節性コロナウイルス株ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１をヒトＥＳ細胞由来鼻腔二次元オルガノイド及びＶｅｒｏＥ６－ＴＭ２細胞株に感染させ、感染後１日目から８日目までの培地中のウイルス含有量を１日毎に計測した結果のグラフである。 実験２４において、ヒトＥＳ細胞由来鼻腔二次元オルガノイドと陽性対象の細胞株における各季節性コロナウイルス株の感染後３日目又は４日目の培地中のウイルス含有量を示したグラフである。

　［１．定義］
　本明細書において、用語の定義は下記のとおりである。「幹細胞」とは、分化能及び増殖能（特に自己複製能）を有する未分化な細胞を意味する。幹細胞には、分化能力に応じて、多能性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ）、複能性幹細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ）、単能性幹細胞（ｕｎｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ）等が含まれる。「多能性幹細胞」とは、インビトロにおいて培養することが可能で、かつ、生体を構成する全ての細胞に分化し得る能力（分化多能性：ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）を有する幹細胞をいう。全ての細胞とは、外胚葉、中胚葉及び内胚葉の三胚葉由来の細胞である。「複能性幹細胞」とは、全ての種類ではないが、複数種の組織や細胞へ分化し得る能力を有する幹細胞を意味する。「単能性幹細胞」とは、特定の組織や細胞へ分化し得る能力を有する幹細胞を意味する。

　多能性幹細胞は、受精卵、クローン胚、生殖幹細胞、組織内幹細胞、体細胞等から誘導することができる。多能性幹細胞としては、胚性幹細胞（ＥＳ細胞：Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ）、ＥＧ細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｇｅｒｍ　ｃｅｌｌ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞：ｉｎｄｕｃｅｄ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ）等を挙げることができる。間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ：ＭＳＣ）から得られるＭｕｓｅ細胞（Ｍｕｌｔｉ－ｌｉｎｅａｇｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ　Ｓｔｒｅｓｓ　Ｅｎｄｕｒｉｎｇ　ｃｅｌｌ）、及び生殖細胞（例えば精巣）から作製されるＧＳ細胞も多能性幹細胞に包含される。

　胚性幹細胞は、１９８１年に初めて樹立され、１９８９年以降ノックアウトマウス作製にも応用されている。１９９８年にはヒト胚性幹細胞が樹立されており、再生医学にも利用されつつある。ＥＳ細胞は、内部細胞塊をフィーダー細胞上又はｌｅｕｋｅｍｉａ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｆａｃｔｏｒ（ＬＩＦ）を含む培地中で培養することにより製造することができる。ＥＳ細胞の製造方法は、例えば国際公開第９６／２２３６２号、国際公開第０２／１０１０５７号、米国特許第５８４３７８０号明細書、米国特許第６２００８０６号明細書、米国特許第６２８０７１８号明細書等に記載されている。胚性幹細胞は、所定の機関より入手でき、市販品を購入することもできる。例えばヒト胚性幹細胞であるＫｈＥＳ－１、ＫｈＥＳ－２及びＫｈＥＳ－３は、京都大学再生医科学研究所より入手可能である。ヒトＥＳ細胞としては、生体内での発育を経ていない受精１４日以内のヒト胚胎を利用して分離又は獲得した幹細胞を挙げることもできる。いずれもマウス胚性幹細胞である、ＥＢ５細胞は国立研究開発法人理化学研究所より、Ｄ３株はＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）より、入手可能である。ＥＳ細胞の１つである核移植ＥＳ細胞（ｎｔＥＳ細胞）は、細胞核を取り除いた卵子に体細胞の細胞核を移植して作ったクローン胚から樹立することができる。

　ＥＧ細胞は、始原生殖細胞をマウス幹細胞因子（ｍＳＣＦ）、ＬＩＦ及び塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を含む培地中で培養することにより製造することができる（Ｃｅｌｌ，７０：８４１－８４７，１９９２）。

　「人工多能性幹細胞」とは、体細胞を公知の方法等により初期化（ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ）することにより、多能性を誘導した細胞である。人工多能性幹細胞としては、具体的には線維芽細胞、末梢血単核球等に分化した体細胞をＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｍｙｃ（ｃ－Ｍｙｃ、Ｎ－Ｍｙｃ、Ｌ－Ｍｙｃ）、Ｇｌｉｓ１、Ｎａｎｏｇ、Ｓａｌｌ４、ｌｉｎ２８、Ｅｓｒｒｂ等を含む初期化遺伝子群から選ばれる複数の遺伝子の発現により初期化して多分化能を誘導した細胞が挙げられる。２００６年、山中らによりマウス細胞で人工多能性幹細胞が樹立された（Ｃｅｌｌ，２００６，１２６（４）ｐｐ．６６３－６７６）。人工多能性幹細胞は、２００７年にヒト線維芽細胞でも樹立され、胚性幹細胞と同様に多能性と自己複製能を有する（Ｃｅｌｌ，２００７，１３１（５）ｐｐ．８６１－８７２；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００７，３１８（５８５８）ｐｐ．１９１７－１９２０；Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００８，２６（１）ｐｐ．１０１－１０６）。人工多能性幹細胞として、遺伝子発現による直接初期化で製造する方法以外に、化合物の添加などにより体細胞より人工多能性幹細胞を誘導することもできる（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１３，３４１，ｐｐ．６５１－６５４，　Ｎａｔｕｒｅ　（２０２２）．　ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１５８６－０２２－０４５９３－５）。

　人工多能性幹細胞を製造する際に用いられる体細胞としては、特に限定は無いが、組織由来の線維芽細胞、血球系細胞（例えば末梢血単核球、Ｔ細胞等）、肝細胞、膵臓細胞、腸上皮細胞、平滑筋細胞等が挙げられる。

　人工多能性幹細胞を製造する際に、数種類の遺伝子（例えばＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びＭｙｃの４因子）の発現により初期化する場合、遺伝子を発現させるための手段は特に限定されない。遺伝子を発現させるための手段としては、例えばウイルスベクター（例えばレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、センダイウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター）を用いた感染法、プラスミドベクター（例えばプラスミドベクター、エピソーマルベクター）を用いた遺伝子導入法（例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、レトロネクチン法、エレクトロポレーション法）、ＲＮＡベクターを用いた遺伝子導入法（例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法）、タンパク質の直接注入法等が挙げられる。

　多能性幹細胞は、遺伝子改変されていてもよい。遺伝子改変された多能性幹細胞は、例えば相同組換え技術を用いることにより作製できる。改変される染色体上の遺伝子としては、例えば細胞マーカー遺伝子、組織適合性抗原の遺伝子、神経系細胞の障害に基づく疾患関連遺伝子などが挙げられる。染色体上の標的遺伝子の改変は、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ　ｔｈｅ　Ｍｏｕｓｅ　Ｅｍｂｒｙｏ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９９４）、Ｇｅｎｅ　Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ　ａｔ　Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９９３）、バイオマニュアルシリーズ８、ジーンターゲッティング、ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製、羊土社（１９９５）等に記載の方法を用いて行うことができる。

　具体的には、例えば改変する標的遺伝子（例えば細胞マーカー遺伝子、組織適合性抗原の遺伝子や疾患関連遺伝子等）のゲノム遺伝子を単離し、単離されたゲノム遺伝子を用いて標的遺伝子を相同組換えするためのターゲットベクターを作製する。作製されたターゲットベクターを幹細胞に導入し、標的遺伝子とターゲットベクターの間で相同組換えを起こした細胞を選択することにより、染色体上の遺伝子が改変された幹細胞を作製することができる。

　標的遺伝子のゲノム遺伝子を単離する方法としては、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９８９）やＣｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９８７－１９９７）等に記載された公知の方法が挙げられる。ゲノムＤＮＡライブラリースクリーニングシステム（Ｇｅｎｏｍｅ　Ｓｙｓｔｅｍｓ製）やＵｎｉｖｅｒｓａｌ　ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒ　Ｋｉｔｓ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）などを用いることができる。

　標的遺伝子を相同組換えするためのターゲットベクターの作製、及び相同組換え体の効率的な選別は、Ｇｅｎｅ　Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ　ａｔ　Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９９３）、バイオマニュアルシリーズ８、ジーンターゲッティング、ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製、羊土社（１９９５）等に記載の方法に従って行うことができる。ターゲットベクターは、リプレースメント型又はインサーション型のいずれでも用いることができる。選別方法としては、ポジティブ選択、プロモーター選択、ネガティブ選択又はポリＡ選択などの方法を用いることができる。選別した細胞株の中から目的とする相同組換え体を選択する方法としては、ゲノムＤＮＡに対するサザンハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法等が挙げられる。

　多能性幹細胞として、ゲノム編集を行った多能性幹細胞を用いることもできる。「ゲノム編集」とは、ヌクレアーゼを用いた部位特異的なゲノムＤＮＡ鎖の切断、又は塩基の化学的変換等の原理により標的遺伝子もしくはゲノム領域を意図的に改変する技術である。部位特異的ヌクレアーゼとしては、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９及びこれらの変法等が挙げられる。ゲノム編集技術を用いることにより、特定の遺伝子を欠失したノックアウト細胞株、特定の遺伝子座に人工的に別の配列を挿入したノックイン細胞株等を作製することができる。例えば、アンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）をコードする領域を標的としてゲノム編集を実施することにより、ＡＣＥ２遺伝子を発現しない、（ノックアウトされた）多能性幹細胞を調製することができる。別の態様として、標的の疾患における原因遺伝子、関与遺伝子の解明等の目的から、Ｎａｔｕｒｅ　ｖｏｌｕｍｅ　５６８，ｐａｇｅｓ５１１－５１６（２０１９）等に記載の方法により網羅的に遺伝子変異を導入し、その遺伝子の機能、影響等を解析するスクリーニング（ＣＲＩＳＰＲスクリーニング）を実施することもできる。

　多能性幹細胞として、疾患特異的多能性幹細胞を用いてもよい。「疾患特異的多能性幹細胞」とは、疾患の発症に関与する遺伝子の変異又は遺伝的背景を有する多能性幹細胞を表す。疾患特異的多能性幹細胞は、対象となる疾患を発症している患者や近親者から前述の方法等により人工多能性幹細胞を樹立する方法、又は既に樹立済の多能性幹細胞のゲノムをジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲといったゲノム編集技術等により改変する方法により作製することができる。例えば、嚢胞性線維症の患者から樹立した人工多能性幹細胞は、嚢胞性線維症の疾患特異的多能性幹細胞（疾患特異的ｉＰＳ細胞）である。また、既に樹立済のＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞等に嚢胞性線維症患者に生じている既知の遺伝子の変異を導入することにより、嚢胞性線維症の疾患特異的多能性幹細胞を作製することができる。

　「哺乳動物」には、げっ歯類、有蹄類、ネコ目、ウサギ目、霊長類等が包含される。げっ歯類には、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等が包含される。有蹄類には、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等が包含される。ネコ目には、イヌ、ネコ等が包含される。ウサギ目には、ウサギ等が含包される。「霊長類」とは、霊長目に属する哺乳類動物をいい、霊長類としては、キツネザル、ロリス、ツバイ等の原猿亜目、及びサル、類人猿、ヒト等の真猿亜目が含まれる。

　本発明に用いる多能性幹細胞は、哺乳動物の多能性幹細胞であり、好ましくはげっ歯類（例えばマウス、ラット）又は霊長類（例えばヒト、サル）の多能性幹細胞であり、最も好ましくはヒトの多能性幹細胞である。

　「細胞接着（ｃｅｌｌ　ａｄｈｅｓｉｏｎ）」には、細胞と細胞との接着（細胞－細胞接着）及び細胞と細胞外マトリクス（基質）との接着（細胞－基質接着）が含まれる。インビトロの人工培養環境下で生じる、細胞の培養器材等への接着も細胞接着に含有される。細胞－細胞接着において形成される結合は細胞－細胞結合（ｃｅｌｌ－ｃｅｌｌ　ｊｕｎｃｔｉｏｎ）であり、細胞－基質接着において形成される結合は細胞－基質結合（ｃｅｌｌ－ｓｕｂｓｔｒａｔｕｍ　ｊｕｎｃｔｉｏｎ）である。細胞接着の種類として、例えば固定結合（ａｎｃｈｏｒｉｎｇ　ｊｕｎｃｔｉｏｎ）、連絡結合（ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｎｇ　ｊｕｎｃｔｉｏｎ）、閉鎖結合（ｏｃｃｌｕｄｉｎｇ　ｊｕｎｃｔｉｏｎ）が挙げられる。

　細胞－細胞結合として、「密着結合（ｔｉｇｈｔ　ｊｕｎｃｔｉｏｎ）」、「接着結合（ａｄｈｅｒｅｎｃｅ　ｊｕｎｃｔｉｏｎ）」が挙げられる。密着結合は比較的強い細胞－細胞結合であり、上皮細胞で生じ得る。細胞間に密着結合が存在しているかどうかは、例えば密着接合の構成成分に対する抗体（抗クローディン抗体、抗ＺＯ－１抗体等）を用いた免疫組織化学等の手法により検出することができる。

　「浮遊培養」とは、細胞が培養液に浮遊して存在する状態を維持しつつ培養することをいう。すなわち浮遊培養は、細胞を培養器材及び培養器材上のフィーダー細胞等（以下、「培養器材等」と記す。）に接着させない条件で行われ、培養器材等に接着させる条件で行われる培養（接着培養）とは区別される。より詳細には、浮遊培養とは、細胞と培養器材等との間に、強固な細胞－基質結合を作らせない条件での培養をいう。培養している細胞が浮遊培養状態であるか接着培養であるかの判別は、例えば顕微鏡観察時の培養器材の揺動等によって当業者であれば容易に可能である。

　「接着培養」とは、細胞が培養器材等に接着して存在する状態を維持しつつ培養することをいう。ここで、細胞が培養器材等に接着するとは、例えば細胞と培養器材等との間に細胞接着の一種である強固な細胞－基質結合ができることをいう。

　浮遊培養中の細胞凝集体においては、細胞と細胞とが面接着する。浮遊培養中の細胞凝集体では、細胞と培養器材等との間に、強固な細胞－基質結合は形成されておらず、細胞－基質結合はほとんど形成されないか、形成されていてもその寄与が小さい。浮遊培養中の細胞凝集体の内部には、内在の細胞－基質結合が存在してもよい。「細胞と細胞とが面接着（ｐｌａｎｅ　ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）する」とは、細胞と細胞とが面で接着することをいう。より詳細には、「細胞と細胞とが面接着する」とは、ある細胞の表面積のうち別の細胞の表面と接着している割合が、例えば１％以上、好ましくは３％以上、より好ましくは５％以上であることをいう。細胞の表面は、膜を染色する試薬（例えばＤｉＩ）による染色、細胞接着因子（例えばＥ－ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｎ－ｃａｄｈｅｒｉｎ等）の免疫染色等により観察できる。

　接着培養を行う際に用いられる培養器材は、接着培養することが可能なものであれば特に限定されず、当業者であれば適宜決定することが可能である。このような培養器材としては、例えばフラスコ、組織培養用フラスコ、ディッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マイクロポア、マルチプレート、マルチウェルプレート、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック及びオーガンオンチップ等の生体機能チップが挙げられる。これらの培養器材は、硬質、軟質いずれであってもよい。細胞接着性の培養器材としては、細胞との接着性を向上させる目的で培養器材の表面が人工的に処理されているもの等を使用できる。人工的な処理とは、例えば細胞外マトリクス、高分子等によるコーティング処理、及びガスプラズマ処理、正電荷処理等の表面加工が挙げられる。細胞が接着される細胞外マトリクスとしては、例えば基底膜標品、ラミニン、エンタクチン、コラーゲン、ゼラチン等が挙げられる。高分子としては、ポリリジン、ポリオルニチン等が挙げられる。培養器材の培養面は、平底でもよいし、凹凸があってもよい。

　「ラミニン」とは、α、β、γ鎖からなるヘテロ三量体分子であり、サブユニット鎖の組成が異なるアイソフォームが存在する細胞外マトリクスタンパク質である。具体的には、ラミニンは、５種のα鎖、４種のβ鎖及び３種のγ鎖のヘテロ三量体の組合せで約１５種類のアイソフォームを有する。α鎖（α１～α５）、β鎖（β１～β４）及びγ鎖（γ１～γ４）のそれぞれの数字を組み合わせて、ラミニンの名称が定められている。例えばα５鎖、β１鎖、γ１鎖の組合せによるラミニンをラミニン５１１という。

　浮遊培養を行う際に用いられる培養器材は、浮遊培養することが可能なものであれば特に限定されず、当業者であれば適宜決定することが可能である。このような培養器材としては、例えばフラスコ、組織培養用フラスコ、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マイクロポア、マルチプレート、マルチウェルプレート、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、スピナーフラスコ及びローラーボトルが挙げられる。これらの培養器材は、硬質、軟質いずれであってもよい。これらの培養器材は、浮遊培養を可能とするために、細胞非接着性であることが好ましい。細胞非接着性の培養器材としては、培養器材の表面に、細胞との接着性を向上させる目的で行われる上述の人工的な処理がされていないもの等を使用できる。細胞非接着性の培養器材として、細胞との接着性を低下させる目的で培養器材の表面が人工的に処理されたものを使用することもできる。培養器材の培養面は、平底、Ｕ底又はＶ底でもよいし、凹凸があってもよい。細胞との接着性を低下させる処理としては、例えば２－ｍｅｔｈａｃｒｙｌｏｙｌｏｘｙｅｔｈｙｌ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｃｈｏｌｉｎｅ（ＭＰＣ）ポリマー、Ｐｏｌｙ（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ　ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ）（Ｐｏｌｙ－ＨＥＭＡ）、ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ　ｇｌｙｃｏｌ（ＰＥＧ）等のコーティングによる超親水性処理、タンパク低吸着処理等が挙げられる。

　浮遊培養を行う際に生じる剪断力等の物理的ストレスから細胞凝集体を保護し、また細胞が分泌する増殖因子及びサイトカイン類の局所濃度を高め、組織の発達を促進する目的から、細胞凝集体をゲルに包埋、又は物質透過性のあるカプセルに封入したのちに浮遊培養を実施することもできる（Ｎａｔｕｒｅ，２０１３，５０１．７４６７：３７３）。包埋に用いるゲル又はカプセルは、生体由来又は合成高分子製のいずれであってもよい。このような目的に用いるゲル又はカプセルとしては、例えばマトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）、ＰｕｒａＭａｔｒｉｘ（３Ｄ　Ｍａｔｒｉｘ社製）、ＶｉｔｒｏＧｅｌ　３Ｄ（ＴｈｅＷｅｌｌ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）、コラーゲンゲル（新田ゼラチン株式会社製）、アルギン酸ゲル（株式会社ＰＧリサーチ製）、Ｃｅｌｌ－ｉｎ－ａ－Ｂｏｘ（Ａｕｓｔｒｉａｎｏｖａ社製）等、細胞培養用のハイドロゲル又は包埋培養キットとして市販されているものを用いることができる。

　細胞の培養に用いられる培地は、動物細胞の培養に通常用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えばＢａｓａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ　Ｅａｇｌｅ（ＢＭＥ）、ＢＧＪｂ培地、ＣＭＲＬ　１０６６培地、Ｇｌａｓｇｏｗ　Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｌａｓｇｏｗ　ＭＥＭ）、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ＭＥＭ　Ｚｉｎｃ　Ｏｐｔｉｏｎ、Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＩＭＤＭ）、Ｍｅｄｉｕｍ　１９９、Ｅａｇｌｅ　Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ（Ｅａｇｌｅ　ＭＥＭ）、Ａｌｐｈａ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ　Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ（αＭＥＭ）、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）、Ｆ－１２培地、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＩＭＤＭ／Ｆ１２、ハム培地、ＲＰＭＩ　１６４０、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、又はこれらの混合培地等が挙げられる。

　多能性幹細胞の培養には、上記基礎培地をベースとした多能性幹細胞培養用の培地、好ましく公知の胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞用の培地、フィーダーフリー下で多能性幹細胞を培養するための培地（フィーダーフリー培地）等を用いることができる。

　「無血清培地」とは、無調整又は未精製の血清を含まない培地を意味する。精製された血液由来成分や動物組織由来成分（例えば増殖因子）が混入している培地も、無調整又は未精製の血清を含まない限り無血清培地に含まれる。

　無血清培地は、血清代替物を含有していてもよい。血清代替物としては、例えばアルブミン、トランスフェリン、脂肪酸、コラーゲン前駆体、微量元素、２－メルカプトエタノール又は３’チオールグリセロール又はこれらの均等物等を適宜含有するものを挙げることができる。かかる血清代替物は、例えば、国際公開第９８／３０６７９号に記載の方法により調製することができる。血清代替物としては市販品を利用してもよい。市販の血清代替物としては、例えばＫｎｏｃｋｏｕｔ　Ｓｅｒｕｍ　Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）（以下、「ＫＳＲ」と記すこともある。）、Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ－ｄｅｆｉｎｅｄ　Ｌｉｐｉｄ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、Ｂ２７　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、Ｎ２　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）等が挙げられる。

　浮遊培養及び接着培養で用いる無血清培地は、適宜、脂肪酸又は脂質、アミノ酸（例えば非必須アミノ酸）、ビタミン、増殖因子、サイトカイン、抗酸化剤、２－メルカプトエタノール、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類等を含有してもよい。

　調製の煩雑さを回避するために、無血清培地として、市販のＫＳＲ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を適量（例えば約０．５％から約３０％、好ましくは約１％から約２０％）添加した無血清培地（例えばＦ－１２培地とＩＭＤＭ培地の１：１混合液に１×ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ－ｄｅｆｉｎｅｄ　Ｌｉｐｉｄ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ、５％ＫＳＲ及び４５０μＭ　１－モノチオグリセロールを添加した培地）を使用してもよい。また、ＫＳＲ同等品として特表２００１－５０８３０２号公報に開示された培地が挙げられる。

　「血清培地」とは、無調整又は未精製の血清を含む培地を意味する。当該培地は、脂肪酸又は脂質、アミノ酸（例えば非必須アミノ酸）、ビタミン、増殖因子、サイトカイン、抗酸化剤、２－メルカプトエタノール、１－モノチオグリセロール、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類等を含有してもよい。

　本発明における培養は、好ましくはゼノフリー条件で行われる。「ゼノフリー」とは、培養対象の細胞の生物種とは異なる生物種由来の成分が排除された条件を意味する。

　本発明に用いる培地は、化学的に未決定な成分の混入を回避する観点から、好ましくは、含有成分が化学的に決定された培地（Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ　ｄｅｆｉｎｅｄ　ｍｅｄｉｕｍ；ＣＤＭ）である。

　「基底膜（Ｂａｓｅｍｅｎｔ　ｍｅｍｂｒａｎｅ）構造」とは、細胞外マトリクスより構成される薄い膜状の構造を意味する。生体においては、基底膜は上皮細胞の基底側（ｂａｓａｌ）に形成される。基底膜の成分としては、ＩＶ型コラーゲン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン（パールカン）、エンタクチン／ニドゲン、サイトカイン、成長因子等が挙げられる。生体由来の組織中並びに本発明の製造方法等で作製された細胞塊中に基底膜が存在しているかどうかは、例えばＰＡＭ染色等の組織染色、並びに基底膜の構成成分に対する抗体（抗ラミニン抗体、抗ＩＶ型コラーゲン抗体等）を用いた免疫組織化学等の手法により検出することができる。

　「基底膜標品」とは、その上に基底膜形成能を有する所望の細胞を播種して培養した場合に、上皮細胞様の細胞形態、分化、増殖、運動、機能発現等を制御する機能を有する基底膜構成成分を含むものをいう。本発明において、細胞の接着培養を行う際には、基底膜標品存在下で培養することができる。ここで、「基底膜構成成分」とは、動物の組織において、上皮細胞層と間質細胞層等との間に存在する薄い膜状をした細胞外マトリクス分子をいう。基底膜標品は、例えば基底膜を介して支持体上に接着している基底膜形成能を有する細胞を、該細胞の脂質溶解能を有する溶液やアルカリ溶液などを用いて支持体から除去することで作製することができる。基底膜標品としては、基底膜調製物として市販されている商品、例えばマトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）、Ｇｅｌｔｒｅｘ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、基底膜成分として公知の細胞外マトリクス分子（例えばラミニン、ＩＶ型コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、エンタクチン等）を含むものが挙げられる。

　細胞又は組織の培養には、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ－Ｈｏｌｍ－Ｓｗａｒｍ（ＥＨＳ）マウス肉腫等の組織又は細胞から抽出、可溶化されたマトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）等の基底膜標品を用いることができる。同様に細胞培養に用いる基底膜成分として、ヒト可溶化羊膜（株式会社生物資源応用研究所製）、ＨＥＫ２９３細胞に産生させたヒト組換えラミニン（ＢｉｏＬａｍｉｎａ社製）、ヒト組換えラミニン断片（ニッピ社製）、ヒト組換えビトロネクチン（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）等も用いることができる。異なる生物種由来の成分混入を回避する観点、及び感染症のリスクを回避する観点から、基底膜標品は、好ましくは成分の明らかな組換えタンパク質を用いる。

　本明細書において、「物質Ｘを含む培地」及び「物質Ｘの存在下」とは、それぞれ外来性（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ）の物質Ｘが添加された培地もしくは外来性の物質Ｘを含む培地、及び外来性の物質Ｘの存在下を意味する。外来性の物質Ｘは、例えば培地中に存在する細胞又は組織が当該物質Ｘを内在的（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ）に発現、分泌又は産生する内在的な物質Ｘと区別される。培地中の物質Ｘは、物質Ｘの分解又は培地の蒸発による微量な濃度の変化が起こっていてもよい。

　本明細書において、物質Ｘの濃度がＹである培地中での培養開始時とは、好ましくは培地中の物質Ｘの濃度がＹで均一となった時点を指すが、培養容器が十分に小さい（例えば９６ウェルプレートや、培養液が２００μＬ以下での培養）場合、濃度がＹとなるように後述する培地添加操作、半量培地交換操作又は全量培地交換操作を行った時点を濃度Ｙでの培養開始時と解釈する。また、培地中の物質Ｘの濃度がＹであるとは、一定の培養期間を通じたＸの平均の濃度がＹである場合、物質ＸをＹの濃度で含む期間が培養期間の５０％以上である場合、物質ＸをＹの濃度で含む期間が各工程において想定される培養期間のうち最も短い期間以上である場合等を含む。

　本明細書において、「物質Ｘの非存在下」とは、外来性（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ）の物質Ｘが添加されていない培地もしくは外来性の物質Ｘを含まない培地、又は外来性の物質Ｘが存在しない状態を意味する。

　本明細書において、「ヒトタンパク質Ｘ」とは、タンパク質Ｘが、ヒト生体内で天然に発現するタンパク質Ｘのアミノ酸配列を有することを意味する。

　「単離」とは、目的とする成分や細胞以外の因子を除去する操作がなされ、天然に存在する状態を脱していることを意味する。従って、「単離されたタンパク質Ｘ」には、培養対象の細胞や組織から産生され細胞や組織及び培地中に含まれている内在性のタンパク質Ｘは包含されない。「単離されたタンパク質Ｘ」の純度（総タンパク質重量に占めるタンパク質Ｘの重量の百分率）は、通常７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９９％以上、最も好ましくは１００％である。

　本明細書において、「誘導体」とは、特定の化合物に対して、当該化合物の分子内の一部が、他の官能基又は他の原子と置換されることにより生じる化合物群を意図する。本明細書において、タンパク質の「改変体」とは、もとのタンパク質の特性を維持できる範囲でアミノ酸残基の欠失、付加、置換等の変異がされているタンパク質をいう。変異のアミノ酸の数としては、特に制限されないが、１～４、１～３、１～２、又は１個が挙げられる。タンパク質の「改変体」は、もとのタンパク質と少なくとも９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は９９．５％以上の同一性を示すアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。

　本明細書において、「Ａ時間（Ａ日）以降」とはＡ時間（Ａ日）を含み、Ａ時間（Ａ日）から後のことをいう。「Ｂ時間（Ｂ日）以内」とは、Ｂ時間（Ｂ日）を含み、Ｂ時間（Ｂ日）から前のことをいう。

　「フィーダー細胞」とは、幹細胞を培養するときに共存させる当該幹細胞以外の細胞を指す。多能性幹細胞の未分化維持培養に用いられるフィーダー細胞としては、例えばマウス線維芽細胞（ＭＥＦ）、ヒト線維芽細胞、ＳＮＬ細胞等が挙げられる。フィーダー細胞は、増殖抑制処理されていることが好ましい。増殖抑制処理としては、増殖抑制剤（例えばマイトマイシンＣ）処理、ＵＶ照射等が挙げられる。多能性幹細胞の未分化維持培養に用いられるフィーダー細胞は、液性因子（好ましくは未分化維持因子）の分泌、細胞接着用の足場（細胞外基質）の作製により、多能性幹細胞の未分化維持に貢献する。

　本明細書において、フィーダー細胞非存在下（フィーダーフリー）とは、フィーダー細胞非存在下にて培養することである。フィーダー細胞非存在下とは、例えばフィーダー細胞を添加していない条件、又はフィーダー細胞を実質的に含まない（例えば全細胞数に対するフィーダー細胞数の割合が３％以下）の条件が挙げられる。

　「細胞凝集体」（ｃｅｌｌ　ａｇｇｒｅｇａｔｅ）とは、細胞が集合して形成された塊であって、細胞同士が接着している塊をいう。細胞塊、胚様体（Ｅｍｂｒｙｏｉｄ　ｂｏｄｙ）、スフェア（Ｓｐｈｅｒｅ）、スフェロイド（Ｓｐｈｅｒｏｉｄ）、オルガノイド（Ｏｒｇａｎｏｉｄ）も細胞凝集体に包含される。細胞凝集体は、好ましくは細胞同士が面接着している。一部の態様において、細胞凝集体の一部分あるいは全部において、細胞同士が細胞接着し、例えば接着結合（ａｄｈｅｒｅｎｃｅ　ｊｕｎｃｔｉｏｎ）を形成している。一部の態様において、二つ以上の細胞凝集体同士をさらに人工的に接着又は凝集させることもできる。細胞塊同士をさらに接着又は凝集させた塊、及びアセンブロイド（ａｓｓｅｍｂｌｏｉｄ）も細胞凝集体に含まれる。細胞凝集体の形態は球状に限らず、例えば双球状、数珠状、球の集合体状、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　ｒｅｐｏｒｔｓ，　２０２１，　１１．１：　１－１４．、特願２０２１－０７８１５４に記載の紐状、分枝状等の形態であってもよい。

　「均一な細胞凝集体」とは、複数の細胞凝集体を培養する際に各細胞凝集体の大きさが一定であることを意味し、細胞凝集体の大きさを最大径の長さで評価する場合、均一な細胞凝集体とは、最大径の長さの分散が小さいことを意味する。より具体的には、複数の細胞凝集体のうち７５％以上の細胞凝集体において、その最大径が複数の細胞凝集体の最大径平均値の±１００％以内、好ましくは最大径平均値の±５０％以内、より好ましくは最大径平均値の±２０％以内であることを意味する。

　「細胞集団」とは、２以上の細胞から構成される細胞群をいう。細胞集団は、一種の細胞から構成されていてもよいし、複数種の細胞から構成されていてもよい。細胞集団を構成する細胞は、培地中に浮遊していてもよいし、培養器材等に接着していてもよい。また、細胞集団を構成する細胞は、単一細胞であってもよいし、細胞集団の少なくとも一部において、細胞同士が細胞接着し、細胞塊を形成していてもよい。ここで「単一細胞」とは、例えば細胞同士の接着（例えば面接着）がほとんどなくなった細胞をいう。一部の態様において、単一細胞に分散されるとは、細胞－細胞間結合（例えば接着結合）がほとんどなくなった状態が挙げられる。細胞集団は、細胞凝集体を含んでよい。

　「組織」とは、形態や性質が異なる複数種類の細胞が一定のパターンで立体的に配置した構造を有する細胞集団の構造体をさす。

　「外胚葉」とは生物の初期発生の過程において卵の受精後に形成される３つの胚葉のうち、最も外側に存在する胚葉を表す。外胚葉は発生の進行に従い神経外胚葉と表層外胚葉に分かれ、さらに神経外胚葉は神経管と神経堤に分かれる。これら外胚葉から身体の各種器官が形成され、外胚葉から形成された器官は外胚葉に由来すると称される。例えば神経管からは脳及び脊髄等の中枢神経系の器官又は組織が形成される。例えば神経堤からは一部の中枢神経系細胞、顔面の骨及び軟骨、感覚神経細胞、自律神経細胞、色素細胞、間葉系細胞等が形成される。表層外胚葉からは表皮、内耳、下垂体前葉、嗅上皮を含む上気道組織等が形成される。プラコード及びプラコード由来組織は表層外胚葉に由来する。多能性幹細胞は、外胚葉に分化する過程で、例えばＰａｘ３、Ｏｔｘ２、Ｓｏｘ１といった外胚葉マーカーとして知られている遺伝子を発現する。

　「内胚葉」とは生物の初期発生の過程において卵の受精後に形成される３つの胚葉のうち、最も内側に存在する胚葉を表す。内胚葉からは例えば消化器、尿路、咽頭、気管、気管支、肺といった嗅上皮及び鼻腔上皮を除いた呼吸器の大半が形成される。多能性幹細胞は、内胚葉に分化する過程で、例えばＳＯＸ１７、ＨＮＦ－３β／ＦｏｘＡ２、Ｋｌｆ５、ＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ６、ＰＤＸ－１といった内胚葉マーカーとして知られている遺伝子を発現する。

　「中胚葉」とは外胚葉と内胚葉の間に形成される胚葉を表す。中胚葉からは例えば循環器、骨格、筋肉といった器官又は組織が形成される。多能性幹細胞は、中胚葉に分化する過程で、例えばＴ／Ｂｒａｃｈｕｒｙ、ＳＭＡ、ＡＢＣＡ４、Ｎｋｘ２．５、ＰＤＧＦＲαといった中胚葉マーカーとして知られている遺伝子を発現する。

　「神経組織」とは、発生期又は成体期の大脳、中脳、小脳、脊髄、網膜、感覚神経、末梢神経等の神経系細胞によって構成される組織を意味する。本明細書において、「神経上皮組織」とは、神経組織が層構造をもつ上皮構造を形成したものをいい、神経組織中の神経上皮組織は光学顕微鏡を用いた明視野観察等により存在量を評価することができる。

　「中枢神経系」とは、神経組織が集積し、情報処理の中心をなす領域を表す。脊椎動物では、脳と脊髄が中枢神経系に含まれる。中枢神経系は外胚葉に由来する。

　「神経系細胞（Ｎｅｕｒａｌ　ｃｅｌｌ）」とは、外胚葉由来組織のうち表皮系細胞以外の細胞を表す。すなわち、神経系細胞には、神経系前駆細胞、ニューロン（神経細胞）、グリア細胞、神経幹細胞、ニューロン前駆細胞、グリア前駆細胞等の細胞を含む。神経系細胞には、後述する網膜組織を構成する細胞（網膜細胞）、網膜前駆細胞、網膜層特異的神経細胞、神経網膜細胞、網膜色素上皮細胞も包含される。神経系細胞は、Ｎｅｓｔｉｎ、βＩＩＩチューブリン（Ｔｕｊ１）、ＰＳＡ－ＮＣＡＭ、Ｎ－ｃａｄｈｅｒｉｎ等をマーカーとして同定することができる。

　ニューロンは、神経回路を形成し情報伝達に貢献する機能的な細胞であり、ＴｕＪ１、Ｄｃｘ、ＨｕＣ／Ｄ等の幼若神経細胞マーカー、及び／又はＭａｐ２、ＮｅｕＮ等の成熟神経細胞マーカーの発現を指標に同定することができる。

　グリア細胞としては、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、ミュラーグリア等が挙げられる。アストロサイトのマーカーとしてはＧＦＡＰ、オリゴデンドロサイトのマーカーとしてはＯ４、ミュラーグリアのマーカーとしてはＣＲＡＬＢＰ等が挙げられる。

　神経幹細胞とは、神経細胞及びグリア細胞への分化能（多分化能）と、多分化能を維持した増殖能（自己複製能ということもある）を有する細胞である。神経幹細胞のマーカーとしてはＮｅｓｔｉｎ、Ｓｏｘ２、Ｍｕｓａｓｈｉ、Ｈｅｓファミリー、ＣＤ１３３等が挙げられるが、これらのマーカーは前駆細胞全般のマーカーであり神経幹細胞特異的なマーカーとは考えられていない。神経幹細胞の数は、ニューロスフェアアッセイ、クローナルアッセイ等により評価することができる。

　ニューロン前駆細胞とは、増殖能をもち、神経細胞を産生し、グリア細胞を産生しない細胞である。ニューロン前駆細胞のマーカーとしては、Ｔｂｒ２、Ｔα１等が挙げられる。幼若神経細胞マーカー（ＴｕＪ１、Ｄｃｘ、ＨｕＣ／Ｄ）陽性かつ増殖マーカー（Ｋｉ６７、ｐＨ３、ＭＣＭ）陽性の細胞を、ニューロン前駆細胞として同定することもできる。グリア前駆細胞とは、増殖能もち、グリア細胞を産生し、神経細胞を産生しない細胞である。

　神経系前駆細胞（Ｎｅｕｒａｌ　Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ　ｃｅｌｌ）は、神経幹細胞、ニューロン前駆細胞及びグリア前駆細胞を含む前駆細胞の集合体であり、増殖能とニューロン及びグリア産生能をもつ。神経系前駆細胞はＮｅｓｔｉｎ、ＧＬＡＳＴ、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ１、Ｍｕｓａｓｈｉ、Ｐａｘ６等をマーカーとして同定することができる。神経系細胞のマーカー陽性かつ増殖マーカー（Ｋｉ６７、ｐＨ３、ＭＣＭ）陽性の細胞を、神経系前駆細胞として同定することもできる。

　「網膜組織」とは、生体網膜において各網膜層を構成する視細胞、水平細胞、双極細胞、アマクリン細胞、網膜神経節細胞、これらの前駆細胞、網膜前駆細胞等のうちの少なくとも複数種類が、層状で立体的に配列した網膜組織を意味する。それぞれの細胞がいずれの網膜層を構成する細胞であるかは、公知の方法、例えば細胞マーカーの発現有無、その程度等により確認できる。

　「網膜前駆細胞」とは、視細胞、水平細胞、双極細胞、アマクリン細胞、網膜神経節細胞、網膜色素上皮細胞のいずれの成熟な網膜細胞にも分化しうる前駆細胞をいう。視細胞前駆細胞、水平細胞前駆細胞、双極細胞前駆細胞、アマクリン細胞前駆細胞、網膜節細胞前駆細胞、網膜色素上皮前駆細胞とは、それぞれ、視細胞、水平細胞、双極細胞、アマクリン細胞、網膜神経節細胞、網膜色素上皮細胞への分化が決定付けられている前駆細胞をいう。

　「網膜層特異的神経細胞」とは、網膜層を構成する細胞であって網膜層に特異的な神経細胞を意味する。網膜層特異的神経細胞としては、双極細胞、網膜神経節節細胞、アマクリン細胞、水平細胞、視細胞、網膜色素上皮細胞、杆体細胞及び錐体細胞を挙げることができる。

　「網膜細胞」には、上述の網膜前駆細胞及び網膜層特異的神経細胞が包含される。網膜細胞マーカーとしては、網膜前駆細胞で発現するＲｘ（Ｒａｘとも言う）、Ａｌｄｈ１ａ３、及びＰａｘ６、視床下部ニューロンの前駆細胞では発現するが網膜前駆細胞では発現しないＮｋｘ２．１、視床下部神経上皮で発現し網膜では発現しないＳｏｘ１、視細胞の前駆細胞で発現するＣｒｘ、Ｂｌｉｍｐ１等が挙げられる。網膜層特異的神経細胞のマーカーとしては、双極細胞で発現するＣｈｘ１０、ＰＫＣα及びＬ７、網膜神経節細胞で発現するＴｕｊ１及びＢｒｎ３、アマクリン細胞で発現するＣａｌｒｅｔｉｎｉｎ、水平細胞で発現するＣａｌｂｉｎｄｉｎ、成熟視細胞で発現するＲｈｏｄｏｐｓｉｎ及びＲｅｃｏｖｅｒｉｎ、杆体細胞で発現するＮｒｌ、錐体細胞で発現するＲｘｒ－ｇａｍｍａ、網膜色素上皮細胞で発現するＲＥＰ６５及びＭｉｔｆ等が挙げられる。

　「大脳組織」とは、胎児期又は成体の大脳を構成する細胞（例えば大脳神経系前駆細胞（ｃｏｒｔｉｃａｌ　ｎｅｕｒａｌ　ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ　ｃｅｌｌ）、背側大脳神経系前駆細胞、腹側大脳神経系前駆細胞、大脳層構造特異的神経細胞（ニューロン）、第一層ニューロン、第二層ニューロン、第三層ニューロン、第四層ニューロン、第五層ニューロン、第六層ニューロン、グリア細胞（アストロサイト及びオリゴデンドロサイト）、これらの前駆細胞等）のうち一種類又は複数種類が、層状で立体的に配列した組織を意味する。胎児期の大脳は、前脳又は終脳とも呼ばれる。それぞれの細胞の存在は、公知の方法、例えば細胞マーカーの発現有無、その程度等により確認できる。

　大脳細胞マーカーとしては、大脳細胞で発現するＦｏｘＧ１（別名Ｂｆ１）、大脳神経系前駆細胞で発現するＳｏｘ２及びＮｅｓｔｉｎ、背側大脳神経系前駆細胞で発現するＰａｘ６及びＥｍｘ２、腹側大脳神経系前駆細胞で発現するＤｌｘ１、Ｄｌｘ２及びＮｋｘ２．１、ニューロン前駆細胞で発現するＴｂｒ２、Ｎｅｘ、Ｓｖｅｔ１、第六層ニューロンで発現するＴｂｒ１、第五層ニューロンで発現するＣｔｉｐ２、第四層ニューロンで発現するＲＯＲβ、第三層ニューロン又は第二層ニューロンで発現するＣｕｘ１又はＢｒｎ２、第一層ニューロンで発現するＲｅｅｌｉｎ等が挙げられる。

　「嗅皮質」とは、嗅球からの単シナプス性入力を受け、嗅覚情報の処理に関わる大脳の一領域である。嗅皮質で発現する遺伝子及びマーカーとしては、Ｔｂｒ１、ＦｏｘＰ２、Ｃｔｉｐ２、Ｎｏｒ１（ＮＲ４ａ３）、ＤＡＡＲＰ－３２、ＣＵＸ１、Ｂｒｎ２、ＣＡＲＴ等が挙げられる。

　「大脳基底核」とは、大脳の一領域に存在する神経核の集合体である。大脳基底核に含まれる神経核として、線条体、淡蒼球、視床下核、黒質等が挙げられる。「大脳基底核原基」とは、発生中の胚の脳室内に形成される神経系細胞からなる構造である。大脳基底核原基は成体の大脳基底核の基となることに加え、複数種の神経細胞を産生し、それらの細胞は発生中に中枢神経系の各所へと遊走する。

　「吻側移動経路（ｒｏｓｔｒａｌ　ｍｉｇｒａｔｏｒｙ　ｓｔｒｅａｍ）」とは、脳室下帯の神経幹細胞から産生された新生ニューロンが、嗅球へと遊走する現象及びその経路を表す。吻側移動経路を移動中のニューロンは、例えばＰＳＡ－ＮＣＡＭ、Ｄｃｘのような遊走中の神経細胞マーカーを用いて検出することができる。

　「嗅球」とは、大脳の先端部に存在し、嗅上皮に存在する嗅覚受容細胞から入力を受け、嗅覚情報の処理に関わる中枢神経系の一領域を意味する。嗅球に存在する細胞は層構造を形成しており、表層から順に、嗅神経層（ｏｌｆａｃｔｏｒｙ　ｎｅｒｖｅ　ｌａｙｅｒ）、糸球体層（ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ　ｌａｙｅｒ）、外網状層（ｅｘｔｅｒｎａｌ　ｐｌｅｘｉｆｏｒｍ　ｌａｙｅｒ）、僧帽細胞層（ｍｉｔｒａｌ　ｃｅｌｌ　ｌａｙｅｒ）、内網状層（ｉｎｔｅｒｎａｌ　ｐｌｅｘｉｆｏｒｍ　ｌａｙｅｒ）、顆粒細胞層（ｇｒａｎｕｌｅ　ｃｅｌｌ　ｌａｙｅｒ）と呼称される。嗅球の神経細胞には、興奮性ニューロンとして僧帽細胞（ｍｉｔｒａｌ　ｃｅｌｌ）と房飾細胞（ｔｕｆｔｅｄ　ｃｅｌｌ）があり、抑制性ニューロン（介在ニューロン）として傍糸球体細胞（ｐｅｒｉｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ　ｃｅｌｌ）と顆粒細胞（ｇｒａｎｕｌｅ　ｃｅｌｌ）がある。嗅球で発現する遺伝子及びマーカーとしては、Ａｒｘ、Ｔｂｒ１、Ｔｂｒ２／ＥＯＭＥＳ、Ｔｂｘ２１、Ｉｂａ１等が挙げられる。

　「非神経上皮組織」とは、上皮構造を有する組織のうち神経上皮組織以外の組織を表す。上皮組織は外胚葉、中胚葉、内胚葉、栄養外胚葉のいずれの胚葉からも形成される。上皮組織には上皮、中皮、内皮が含まれる。非神経上皮組織に含まれる組織の例としては、表皮、角膜上皮、鼻腔上皮、嗅上皮、口腔上皮、気管上皮、気管支上皮、気道上皮、腎上皮、腎皮質上皮、胎盤上皮等が挙げられる。上皮組織は通常種々の細胞間結合によりつながれており、単層又は重層化した層構造を有する組織を形成する。これら上皮組織の有無の確認、存在量の定量は、光学顕微鏡による観察又は、上皮細胞マーカーに対する抗体（抗Ｅ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ抗体、抗Ｎ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ抗体、抗ＥｐＣＡＭ抗体等）を用いた免疫組織化学等の手法により可能である。

　本発明において、「上皮細胞極性（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　ｐｏｌａｒｉｔｙ）」とは上皮細胞内に空間的に形成されている構成成分および細胞機能の分布の偏りを表す。例えば、角膜上皮細胞は眼球の最も外層に局在し、頂端側（ａｐｉｃａｌ）では涙液を保持するための膜結合型ムチン（ＭＵＣ－１、４、１６）等の頂端側特異的なタンパク質を発現している。また、角膜上皮細胞は基底側（ｂａｓａｌ）では基底膜に接着するためのα６インテグリン、β１インテグリン等の基底側特異的なタンパク質を発現している。
　生体由来の組織中及び本発明の製造方法等で作製された細胞集団中において、上皮細胞及び上皮組織に、上皮細胞極性が存在しているかどうかは、Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ、頂端側マーカー（抗ＭＵＣ－１抗体、抗ＰＫＣ－ｚｅｔａ抗体等）並びに基底側マーカー（抗α６インテグリン抗体、抗β１インテグリン抗体等）を用いた免疫組織化学等の手法により検出することができる。

　「プラコード（ｐｌａｃｏｄｅ）」とは、主に脊椎動物の発生過程において表皮外胚葉の一部が肥厚して形成される器官の原基を表す。プラコードに由来する組織としては、水晶体、嗅上皮、内耳、三叉神経、下垂体等が挙げられる。プラコードのマーカー及びその前駆組織である前プラコード領域（ｐｒｅｐｌａｃｏｄｅ　ｒｅｇｉｏｎ）のマーカーとしては、Ｓｉｘ１、Ｓｉｘ４、Ｄｌｘ５、Ｅｙａ２等が挙げられる。

　「嗅上皮プラコード・嗅プラコード（Ｏｌｆａｃｔｏｒｙ　ｐｌａｃｏｄｅ）」とは、胚発生の過程で表皮外胚葉の領域に形成される肥厚した構造であって、嗅上皮前駆細胞マーカーを発現し、将来の嗅上皮となる器官の原基を表す。嗅上皮前駆細胞マーカーとしては、Ｐａｘ６、Ｏｔｘ２、ＦｏｘＧ１（別名Ｂｆ１）、Ｓｏｘ２、Ｐｏｕ２ｆ１、Ｓｐ８、Ｃｈｄ７、Ｎ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｅ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ、ＥｐＣＡＭ、ＣＫ１８、ＰＤＧＦＲβ等が挙げられる。

　「呼吸器」とは、体外から酸素を取り入れ、体外へと二酸化炭素を排出する外呼吸に関与する器官、臓器を表す。呼吸器に含まれる器官、臓器の例として、鼻腔、咽頭、喉頭、気管、気管支、肺、胸郭等が挙げられる。呼吸器は解剖学的に上気道と下気道に分けられる。鼻孔、鼻腔、鼻咽腔、咽頭、喉頭は上気道に分類される。気管、気管支、細気管支、肺は下気道に分類される。鼻腔上皮及び嗅上皮は上気道組織の一つである。

　「鼻腔」とは、上気道組織の一つであり、顔の中心にある外鼻に空いている孔（鼻孔）より奥に存在する空間を表す。鼻腔は鼻孔より始まり、咽頭上部へと繋がっている。鼻腔は主として嗅部と呼ばれる嗅上皮が存在し、大気中のにおい物質を感知する部分、呼吸部と呼ばれる鼻腔上皮に覆われた部分、及び角化扁平重層上皮で覆われた皮膚と同様の性質を有している部分から構成される。

　「鼻腔上皮」とは鼻腔中にある上皮組織であり、主として後述する嗅上皮以外の領域を表す。鼻腔上皮の機能としては取り込んだ空気を温め、また表面に分泌された粘液と細胞表面の線毛の働きにより異物を除去する働きがある。鼻腔上皮は主として外胚葉性の非神経上皮に由来し、分泌細胞、線毛細胞、クラブ細胞、基底細胞、塩類細胞、神経内分泌細胞、孤立化学感覚上皮細胞等の細胞から構成されている。

　「分泌細胞」とは呼吸器系の組織において粘液又は漿液の分泌を行う細胞を表す。杯細胞及び腺細胞は分泌細胞に属する。分泌細胞及びその前駆細胞で発現する遺伝子及びマーカーとしては、例えばムチン１、ムチン２、ムチン３、ムチン４、ムチン５ＡＣ、ムチン５Ｂ、ＦｏｘＡ１、ＦｏｘＡ２、ＦＯＸＡ３、Ｎｋｘ２．１／ＴＴＦ－１、ＳＰＤＥＦ等が挙げられる。

　「線毛細胞」（「線毛上皮細胞」ともいう。）とは、上皮組織を形成する細胞であって、細胞の表面に線毛を有する細胞を表す。線毛細胞は呼吸器系、脳室、卵管等の上皮組織に存在し、線毛の運動により液体、液性因子、体内に侵入した異物、卵子等を特定の方向へ移送する働きがあることが知られている。線毛細胞及びその前駆細胞で発現する遺伝子及びマーカーとしては、ＦｏｘＪ１、ＦｏｘＮ４、ｐ７３、アセチル化チューブリン、β４チューブリン、ＤＮＡＩ１、ＤＮＡＨ５、ＳＮＴＮ等が挙げられる。組織又は細胞をヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色等を実施した後に顕微鏡で観察し、細胞表面の線毛構造を観察することにより、線毛細胞及びその前駆細胞の存在を確認することができる。例えばＪ．Ｍｉｃｒｏｓｃ．，２１１（２００３），ｐｐ．１０３－１１１に記載の方法により、線毛運動周波数：ｃｉｌｉａｒｙ　ｂｅａｔｉｎｇ　ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ（ＣＢＦ）の程度を計測することにより、線毛細胞の存在を観測することもできる。

　「線毛運動」とは、細胞表面にある線毛の動きであり、ヒトを含む哺乳動物の場合、呼吸器系では細菌やウイルスなどの病原体の排除、卵管では卵子の輸送等の機能を有する。線毛運動は通常、有効打と回復打からなる波動運動である。細胞が線毛運動を実施しているかは、例えば高倍率のレンズを用い、顕微鏡により動画を撮影することで検出できる。

　「クラブ細胞」（「クララ細胞」ともいう。）とは、上皮組織を形成する細胞であって、粘液又は漿液成分の分泌、ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ　Ｐ４５０による化合物代謝、サイトカインの分泌、免疫機能の制御等の機能を有する細胞を表す。クラブ細胞で発現する遺伝子及びマーカーとしては、ＳＣＧＢ１Ａ１、ＳＣＧＢ３Ａ２、ＣＹＰ２ｆ１、ＣＹＰ２ｆ２、ｕｒｏｐｌａｋｉｎ３ａ、Ｃｌｄｎ１０、Ａｏｘ３、Ｐｏｎ１、Ｃｃｋａｒ等が挙げられる。また、サイトケラチン４、サイトケラチン１３を発現し、バリア機能や免疫応答に関与していると考えられる「Ｈｉｌｌｏｃｋ（ヒロック）細胞」も、クラブ細胞のサブ集団として含まれる。

　「基底細胞」は、上皮の基底層に存在する細胞を表す。基底細胞は分裂能を有し、組織幹細胞として生体組織の長期的な維持や傷害の際の修復に寄与する。鼻腔上皮の基底細胞及びその前駆細胞で発現する遺伝子及びマーカーとしては、サイトケラチン５、サイトケラチン１４、サイトケラチン１５、ｐ６３、ΔＮｐ６３、ｐ７５等が挙げられる。

　塩類細胞（「イオノサイト：ｉｏｎｏｃｙｔｅ」ともいう。）は、ＣＦＴＲを発現し、粘膜粘液の粘稠性を制御する機能を有することが報告されている細胞を示す。塩類細胞及びその前駆細胞で発現する遺伝子及びマーカーとしては、ＣＦＴＲ、Ｆｏｘｉ１、液胞型プロトンＡＴＰａｓｅ（ｖａｃｕｏｌａｒ　Ｈ＋－ＡＴＰａｓｅ、Ｖ－ＡＴＰａｓｅ）、Ａｓｃｌ３、Ｔｆｃｐ２ｌ１、ＤＭＲＴ２等が挙げられる。

　神経内分泌細胞は、ホルモン及びペプチドを分泌し、生体の発生や恒常性を制御する機能を有する細胞を示す。神経内分泌細胞及びその前駆細胞で発現する遺伝子及びマーカーとしては、Ａｓｃｌ１、ＮｅｕｒｏＤ１、Ｃｈｒｏｍｏｇｒａｎｉｎ　Ａ、Ｓｙｎａｐｔｏｐｈｉｓｉｎ、神経特異エノラーゼ（ＮＳＥ）、ＣＡＬＣＡ等が挙げられる。

　孤立化学感覚上皮細胞は、化学物質の感知と生体防御反応の制御等の機能を有する細胞を示す。タフト（Ｔｕｆｔ）細胞、刷毛細胞、微絨毛細胞も同種の細胞を表す。孤立化学感覚上皮細胞で発現する遺伝子及びマーカーとしては、ＣｈＡＴ／Ｔｒｐｍ５、Ｐｏｕ２ｆ３／Ｓｋｎ－１ａ、苦味受容体Ｔａｓ２ｒ、Ｇｎａｔ３、Ｐｌｃｂ２、ＧＮＧ１３等が挙げられる。

　「嗅上皮」とは鼻腔中にある上皮組織であり、生体が匂いの情報を感知する嗅覚器官を表す。嗅上皮は上気道組織に分類される。嗅上皮はプラコードに由来する組織の一つであり、嗅覚受容体を発現し、空気中の揮発性分子を感知する嗅神経細胞、嗅神経細胞を支える支持細胞、嗅上皮の幹細胞及び前駆細胞である基底細胞、及び粘液を分泌するボーマン腺細胞等の細胞から構成されている。嗅上皮は形態的に表層、中間層、基底層に分類され、表層には支持細胞、中間層には嗅神経細胞、基底層には基底細胞が存在する。ボーマン腺は嗅上皮内に分枝管状の胞状腺を形成し、点在している。

　「嗅上皮の前駆組織」とは嗅上皮プラコードを含む。嗅上皮及び嗅上皮プラコードで発現する遺伝子及びマーカーとしては、上述のプラコード領域及び前プラコード領域のマーカーに加え、Ｐａｘ６、Ｏｔｘ２、ＦｏｘＧ１（別名Ｂｆ１）、Ｓｏｘ２、Ｐｏｕ２ｆ１、Ｓｐ８、Ｃｈｄ７、Ｎ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｅ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ、ＥｐＣＡＭ、ＣＫ１８、ＰＤＧＦＲβ等が挙げられる。

　「嗅覚系組織」とは、胎児期又は成体の嗅覚系組織、例えば嗅上皮を構成する細胞（例えば嗅神経細胞、支持細胞、基底細胞、ボーマン腺細胞、嗅神経鞘細胞及びこれらの前駆細胞等）、嗅球を構成する細胞、嗅皮質を構成する細胞等が、一種類又は少なくとも複数種類、層状で立体的に配列した組織を意味する。それぞれの細胞の存在は、公知の方法、例えば細胞特異的遺伝子の発現有無又はその程度等により確認できる。

　「嗅神経細胞」（ｏｌｆａｃｔｏｒｙ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｎｅｕｒｏｎ：ＯＲＮ）とは、鼻腔粘膜の嗅上皮中間層にある嗅覚を受容する神経細胞のことを表す。嗅神経細胞は表面の線毛にある嗅覚受容体で空気中の揮発性分子をとらえる。嗅神経細胞は双極性の感覚細胞であり、末梢側で発現している嗅覚受容体でとらえられた嗅覚情報は中枢側の嗅糸と呼ばれる神経軸索に伝搬される。嗅糸は数十本ずつ集まって一つの束を形成し、嗅神経はこれらの束すべてを指す。嗅糸は頭蓋骨の篩骨篩板にある篩骨孔を通って脳の嗅球に達し、そこで僧帽細胞等にシナプス結合して、脳内の嗅覚中枢へ嗅覚情報を伝達する。嗅神経細胞及びその前駆細胞で発現する遺伝子及びマーカーとしては、環状ヌクレオチド感受性チャンネルα２サブユニット（ＣＮＧＡ２）、環状ヌクレオチド感受性チャンネルα４サブユニット（ＣＮＧＡ４）、環状ヌクレオチド感受性チャンネルβ１ｂサブユニット、嗅覚特異性Ｇタンパク質（Ｇｏｌｆ）アデニル酸シクラーゼ、Ｏｌｆａｃｔｏｒｙ　Ｍａｒｋｅｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ（ＯＭＰ）、ＮＣＡＭ、ＯＣＡＭ（ＮＣＡＭ－２）、Ｅｂｆ１、Ｅｂｆ２、Ｅｂｆ３、ＮｅｕｒｏＤ、ＰＧＰ９．５、Ｎｅｕｒｏｎ　Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ｅｎｏｌａｓｅ（ＮＳＥ）、Ｇｒｏｗｔｈ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　４３（ＧＡＰ－４３／Ｂ５０）、ビメンチン、Ｌｈｘ２、Ｉｄ３、β－Ｔｕｂｕｌｉｎ　ＩＩＩ（Ｔｕｊ）、Ｃａｌｒｅｔｉｎｉｎ、ＴｒｋＢ、Ｃｔｉｐ２、Ｕｎｃｘ及び嗅覚受容体（ｏｌｆａｃｔｏｒｙ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＯＲ）等が挙げられる。

　「支持細胞」（ｓｕｐｐｏｒｔｉｎｇ　ｃｅｌｌ／ｓｕｓｔｅｎｔａｃｕｌａｒ　ｃｅｌｌ）とは、嗅上皮の最も頂端面側に存在する多列円柱上皮様の細胞を表す。支持細胞は嗅神経細胞等の他の細胞の機能の発揮、生存や上皮構造の維持等に関わる。嗅上皮の微絨毛細胞（ｍｉｃｒｏｖｉｌｌａｒ　ｃｅｌｌ）は支持細胞のサブタイプである。支持細胞で発現する遺伝子及びマーカーとしては、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、Ｃａｒｂｏｎｙｌ　ｒｅｄｕｃｔａｓｅ　２（Ｃｂｒ２）、Ｓ－１００、Ｅｚｒｉｎ、Ｒｅｅｐ６、Ｓｏｘ２、Ｔｙｒｏ３、ＣＹＰ２Ａ６、ＳＵＳ－１、ＳＵＳ－４、ＥＰＡＳ１等が挙げられる。

　嗅上皮における「基底細胞」（ｂａｓａｌ　ｃｅｌｌ）とは、嗅上皮の基底層に存在する細胞を表す。基底細胞は形態的に球状基底細胞（ｇｌｏｂｏｓｅ　ｂａｓａｌ　ｃｅｌｌ：ＧＢＣ）と水平基底細胞（ｈｏｒｉｚｏｎｔａｌ　ｂａｓａｌ　ｃｅｌｌ：ＨＢＣ）に分けられる。これら二種の細胞のうち、球状基底細胞は恒常的に細胞分裂を生じ、新しい嗅神経細胞を供給する活動中の前駆細胞、幹細胞である。一方で、水平基底細胞は通常では細胞分裂の細胞周期が停止した状態にあり、嗅上皮の大規模な損傷等が生じた際に活性化される休眠状態の幹細胞である。水平基底細胞で発現する遺伝子及びマーカーとしては、ｐ６３、サイトケラチン５、サイトケラチン１４、ＩＣＡＭ－１等が挙げられる。球状基底細胞で発現する遺伝子及びマーカーとしては、ＧＡＰ４３、ＧＢＣ－１、Ｌｇｒ５、Ａｓｃｌ１、ＬＳＤ１、ＳＥＣ８、ｃ－Ｋｉｔ／ＣＤ１１７、Ｓｏｘ２、Ｈｅｓ１、Ｉｄ、Ｂｍｉ１等が挙げられる。

　「ボーマン腺細胞」（Ｂｏｗｍａｎ’ｓ　ｇｌａｎｄ　ｃｅｌｌ）とは、ボーマン腺（嗅腺）を構成する細胞を表す。ボーマン腺は嗅上皮に存在する分岐した細い管上の組織であり、嗅上皮を保護する粘液の分泌等の機能を有する。ボーマン腺細胞で発現する遺伝子及びマーカーとしては、Ｓｏｘ９、Ｅ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ａｑｕａｐｏｒｉｎ５、Ａｓｃｌ３、サイトケラチン１８等が挙げられる。

　「嗅神経鞘細胞」（ｏｌｆａｃｔｏｒｙ　ｅｎｓｈｅａｔｉｎｇ　ｇｌｉａ：ＯＥＧ）とは、嗅上皮及び嗅球に存在するグリア細胞の一種を表す。嗅神経鞘細胞はＢＤＮＦ、ＮＧＦ等の神経栄養因子を放出し、嗅神経の恒常的な再生に関わる細胞である。嗅神経鞘細胞で発現する遺伝子及びマーカーとしては、ｐ７５ＮＴＲ、Ｓ１００β、Ｓｏｘ１０、ＧＦＡＰ、ＢＬＢＰ、Ａｑｕａｐｏｒｉｎ１、Ｉｎｔｅｇｒｉｎ　α７等が挙げられる。

　「嗅上皮周縁部」（ｌａｔｅｒａｌ　ｏｌｆａｃｔｏｒｙ　ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ）とは、嗅上皮の周縁の領域であり、嗅上皮以外の非神経上皮と連続している領域を表す。本発明における「嗅上皮内側部」（ｍｅｄｉａｌ　ｏｌｆａｃｔｏｒｙ　ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ）とは、嗅上皮周縁部に囲われた嗅上皮の中心領域を表す。嗅上皮周縁部と嗅上皮内側部では構成している細胞の割合が異なることが知られている（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２０１０，１３７：２４７１－２４８１）。嗅上皮周縁部で発現が高い遺伝子としてＰｂｘ１／２／３、Ｍｅｉｓ１、βＩＶＴｕｂｕｌｉｎが挙げられる。嗅上皮内側部で発現が高い遺伝子としてＴｕｊ１、Ａｓｃｌ１、Ｓｏｘ２が挙げられる。

　「性腺刺激ホルモン放出ホルモン陽性神経細胞」とは、主として中枢神経系の視床下部に存在し、生殖系の器官の制御に関与する性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ　ｒｅｌｅａｓｉｎｇ　ｈｏｒｍｏｎｅ：ＧｎＲＨ）を分泌する神経細胞である。性腺刺激ホルモン放出ホルモン陽性神経細胞は、胎生期に嗅上皮で発生したのちに、中枢神経系へと移動する。性腺刺激ホルモン放出ホルモン陽性神経細胞で発現する遺伝子及びマーカーとしては、性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ　ｒｅｌｅａｓｉｎｇ　ｈｏｒｍｏｎｅ：ＧｎＲＨ）等が挙げられる。

　「嗅窩：Ｏｌｆａｃｔｏｒｙ　Ｐｉｔ」とは、発生中の胚において、嗅上皮プラコードが胚の内側に陥入し形成される嗅覚系組織の基となる組織である。嗅窩は主として将来の嗅上皮を構成する組織、細胞、及び嗅上皮と連続して形成される鼻腔上皮の組織、細胞より構成される。

　「骨組織」とは、骨を構成する細胞と、リン酸カルシウム、Ｉ型コラーゲン等から構成される骨基質を表す。骨を構成する細胞には、骨細胞、破骨細胞、骨芽細胞等が含まれる。

　本発明において「間葉系細胞」とは、主に中胚葉並びに神経堤に由来し、結合組織を形成する非上皮性の細胞である。これらの細胞のうちの一部は、間葉系幹細胞と呼ばれる複能性を有した体性幹細胞である。本発明の製造方法で製造される細胞集団並びに本発明の製造方法で製造される組織中に間葉系細胞が含まれるかどうかは、Ｎｅｓｔｉｎ、Ｖｉｍｅｎｔｉｎ、Ｃａｄｈｅｒｉｎ－１１、Ｌａｍｉｎｉｎ、ＣＤ４４といった間葉系細胞マーカーに対する抗体を用いた免疫組織化学等の手法により検出することができる。間葉系幹細胞が含まれるかどうかは、ＣＤ９、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ１６６、ＶＣＡＭ－１、ＳＴＲＯ－１、ｃ－Ｋｉｔ、Ｓｃａ－１、Ｎｕｃｌｅｏｓｔｅｍｉｎ、ＣＤＣＰ１、ＢＭＰＲ２、ＢＭＰＲ１Ａ及びＢＰＭＲ１Ｂといった間葉系幹細胞マーカーに対する抗体を用いた免疫組織化学等の手法により検出することができる。

　本発明において、「ニッチ」、又は「幹細胞ニッチ」とは幹細胞の増殖、分化、性質の維持等に関わる微小環境をいう。生体におけるニッチの例としては、造血幹細胞ニッチ、毛包幹細胞ニッチ、腸管上皮幹細胞ニッチ、筋幹細胞ニッチ、下垂体ニッチ、基底細胞ニッチなどが挙げられる。これらのニッチにおいては、それぞれの組織特有の幹細胞とニッチを提供する支持細胞とが存在する。また、支持細胞が提供するサイトカイン、ケモカイン、細胞外マトリックス、細胞接着因子、細胞間シグナル伝達因子等により幹細胞が維持されている。

　「受容体タンパク質」とは、細胞膜、細胞質又は核内にあるタンパク質であり、ホルモン、サイトカイン、細胞増殖因子、化合物等の物質と結合し、各種の細胞の反応を惹起するタンパク質を表す。

　「嗅覚受容体」とは、嗅神経細胞及びその他の細胞で発現し、化合物等の感知に関わる受容体タンパク質を表す。

　「病原体」とは、宿主となる生物に病気を起こす性質を有するものをいう。ウイルス、真正細菌、菌類、原生動物、寄生虫、異常プリオンタンパク質等のタンパク質、核酸等が病原体として扱われる。

　「ウイルス受容体」とは、ウイルスが細胞、組織に感染する際に結合する宿主側の因子である。ウイルス受容体は通常、タンパク質又は糖鎖である。例えば、アンジオテンシン変換酵素２（Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ－ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ　ｅｎｚｙｍｅ　２：ＡＣＥ２）はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のウイルス受容体であり、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳｐｉｋｅタンパク質と結合することが報告されている。シアル酸α２，６Ｇａｌは、ヒト季節性インフルエンザウイルス（Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２等）の受容体であることが報告されている。シアル酸α２，３Ｇａｌは、トリインフルエンザウイルス（Ｈ５Ｎ１など）の受容体であることが報告されている。その他ウイルス受容体は、例えばＮａｔｕｒｅ　ｒｅｖｉｅｗｓ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｅｌｌ　ｂｉｏｌｏｇｙ　４．１（２００３）：５７－６８等に記載されている。

　「ウイルス感染関連因子」とは、ウイルスが細胞及び組織に感染する際に影響する宿主側の因子を表す。例えば、ＴＭＰＲＳＳ２はタンパク質分解酵素の一種であり、細胞への感染の際にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のタンパク質を開裂し、活性型へと変換することが報告されている。

　「パターン認識受容体（ＰＲＲｓ）」とは、病原体などの異物を認識する機能をもつ受容体を表す。パターン認識受容体としてはレクチン、補体、膜受容体、細胞質タンパク質等が挙げられる。パターン認識受容体は病原体特有の分子パターン（ｐａｔｈｏｇｅｎ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｐａｔｔｅｒｎｓ；ＰＡＭＰｓ）を認識し、機能を発揮する。病原体特有の分子パターンとしては、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）、糖鎖、タンパク質等が挙げられ、パターン認識受容体は各々固有の標的と結合する。

　「サイトカイン」とは、生体が細胞間情報伝達に用いる一群のタンパク質を表す。サイトカインには例えばケモカイン、増殖因子、造血因子、インターフェロン、インターロイキン、腫瘍壊死因子等が含まれる。

　「免疫」とは、病原体及びウイルスなどの非自己物質、がん細胞等の自己由来であっても異常を有し有害な細胞、及び異物等を認識し、排除又は無害化するための生体が有するシステムである。「免疫応答」とは、免疫が機能する際に免疫系の組織及び細胞が示す生理的反応である。

　「ウイルスの分離」とは、ウイルスの存在が予想される検体中に存在する特定のウイルスを増殖、同定することである。検体としては例えば、ヒトを含む動物、植物その他生物の組織、排泄物、分泌物等、又は環境中の試料が挙げられる。ウイルスの分離には、対象となるウイルスの種類、特性に応じ、培養細胞、動物等が用いられる。

　［２．鼻腔上皮を構成する細胞の製造方法］
　本発明は、鼻腔上皮を構成する細胞の製造方法を提供する。
　鼻腔上皮を構成する細胞の製造方法の一態様は、
　Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質の存在下で多能性幹細胞を培養する工程（１）、
　ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質の存在下で、前記工程（１）で培養した細胞を培養する工程（２）、
　ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質及びＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質からなる群より選ばれる少なくとも１つの存在下で、前記工程（２）で培養した細胞を培養する工程（３）、及び
　前記工程（３）で培養した細胞をさらに培養し、前記鼻腔上皮を構成する細胞を得る工程（４）であって、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質、ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質及びＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質からなる群より選ばれる少なくとも２つの非存在下で前記細胞を培養する工程を含む。

　鼻腔上皮を構成する細胞の製造方法の他の一態様は、
　Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質の存在下で多能性幹細胞を培養する工程（１）、
　ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質の存在下で、前記工程（１）で培養した細胞を培養する工程（２）、
　ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質及びＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質からなる群より選ばれる少なくとも１つの存在下で、前記工程（２）で培養した細胞を培養する工程（３）、及び
　前記工程（３）で培養した細胞をさらに培養し、前記鼻腔上皮を構成する細胞を得る工程（４）であって、ＦＧＦシグナル伝達経路阻害物質、Ｓｈｈシグナル伝達経路作用物質、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路阻害物質、アクチビン／ＴＧＦ－βシグナル伝達経路作用物質及びレチノイン酸シグナル伝達経路作用物質からなる群より選ばれる少なくとも１つの存在下で前記細胞を培養する工程を含む。

　鼻腔上皮を構成する細胞の製造方法の好ましい他の一態様は、
　Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質の存在下で多能性幹細胞を培養する工程（１）であって、前記多能性幹細胞を浮遊培養し、細胞凝集体を形成させる工程、
　ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質の存在下で、前記工程（１）で培養した細胞を培養する工程（２）であって、前記細胞凝集体を浮遊培養する工程、
　ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質及びＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質からなる群より選ばれる少なくとも１つの存在下で、前記工程（２）で培養した細胞を培養する工程（３）であって、前記細胞凝集体を浮遊培養する工程、及び
　前記工程（３）で培養した細胞をさらに培養し、前記鼻腔上皮を構成する細胞を得る工程（４）であって、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質、ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質及びＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質からなる群より選ばれる少なくとも２つの非存在下で前記細胞凝集体を浮遊培養する工程を含む。

　鼻腔上皮を構成する細胞の製造方法の好ましい他の一態様は、
　Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質の存在下で多能性幹細胞を培養する工程（１）であって、前記多能性幹細胞を浮遊培養し、細胞凝集体を形成させる工程、
　ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質の存在下で、前記工程（１）で培養した細胞を培養する工程（２）であって、前記細胞凝集体を浮遊培養する工程、
　ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質及びＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質からなる群より選ばれる少なくとも１つの存在下で、前記工程（２）で培養した細胞を培養する工程（３）であって、前記細胞凝集体を浮遊培養する工程、及び
　前記工程（３）で培養した細胞をさらに培養し、前記鼻腔上皮を構成する細胞を得る工程（４）であって、ＦＧＦシグナル伝達経路阻害物質、Ｓｈｈシグナル伝達経路作用物質、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路阻害物質、アクチビン／ＴＧＦ－βシグナル伝達経路作用物質及びレチノイン酸シグナル伝達経路作用物質からなる群より選ばれる少なくとも１つの存在下で前記細胞凝集体を浮遊培養する工程を含む。

　鼻腔上皮を構成する細胞の製造方法の好ましい他の一態様は、
　Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質の存在下で多能性幹細胞を培養する工程（１）であって、前記多能性幹細胞を培養器材上で接着培養する工程、
　ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質の存在下で、前記工程（１）で培養した細胞を培養する工程（２）であって、前記細胞を接着培養する工程、
　ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質及びＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質からなる群より選ばれる少なくとも１つの存在下で、前記工程（２）で培養した細胞を培養する工程（３）であって、前記細胞を接着培養する工程、及び
　前記工程（３）で培養した細胞をさらに培養し、前記鼻腔上皮を構成する細胞を得る工程（４）であって、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質、ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質及びＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質からなる群より選ばれる少なくとも２つの非存在下で前記細胞を接着培養する工程を含む。

　鼻腔上皮を構成する細胞の製造方法の好ましい他の一態様は、
　Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質の存在下で多能性幹細胞を培養する工程（１）であって、前記多能性幹細胞を培養器材上で接着培養する工程、
　ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質の存在下で、前記工程（１）で培養した細胞を培養する工程（２）であって、前記細胞を接着培養する工程、
　ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質及びＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質からなる群より選ばれる少なくとも１つの存在下で、前記工程（２）で培養した細胞を培養する工程（３）であって、前記細胞を接着培養する工程、及び
　前記工程（３）で培養した細胞をさらに培養し、前記鼻腔上皮を構成する細胞を得る工程（４）であって、ＦＧＦシグナル伝達経路阻害物質、Ｓｈｈシグナル伝達経路作用物質、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路阻害物質、アクチビン／ＴＧＦ－βシグナル伝達経路作用物質及びレチノイン酸シグナル伝達経路作用物質からなる群より選ばれる少なくとも１つの存在下で前記細胞を接着培養する工程を含む。

　鼻腔上皮を構成する細胞の製造方法の好ましい他の一態様は、
　Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質の存在下で多能性幹細胞を培養する工程（１）であって、前記多能性幹細胞を浮遊培養し、細胞凝集体を形成させる工程、
　ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質の存在下で、前記工程（１）で培養した細胞を培養する工程（２）であって、前記細胞凝集体を浮遊培養する工程、
　ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質及びＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質からなる群より選ばれる少なくとも１つの存在下で、前記工程（２）で培養した細胞を培養する工程（３）であって、前記細胞凝集体中に嗅神経前駆細胞が分化するまで浮遊培養する工程、及び
　前記工程（３）で培養した細胞をさらに培養し、前記鼻腔上皮を構成する細胞を得る工程（４）であって、前記細胞凝集体を浮遊培養し、前記嗅神経前駆細胞が存在する上皮と連続する上皮上に前記鼻腔上皮を構成する細胞を得る工程を含む。

　工程（１）～工程（３）により、嗅神経細胞又はその前駆細胞を含む嗅上皮様の上皮組織を製造することができる。工程（４）を行なうことで、上皮組織を鼻腔上皮を構成する細胞を含む鼻腔上皮様の組織に分化誘導することができる。本発明に係る製造方法によれば、鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞を含む細胞集団を得ることができる。鼻腔上皮を構成する細胞は、分泌細胞、線毛細胞、クラブ細胞、基底細胞、塩類細胞、神経内分泌細胞、孤立化学感覚上皮細胞からなる群より選ばれる少なくとも１種の細胞を含む。

　上記の製造方法において、工程（３）と同じ条件で培養を継続することで鼻腔上皮を構成する細胞を得ることもできる。
　鼻腔上皮を構成する細胞の製造方法の好ましい他の一態様は、
　ＦＧＦシグナル伝達経路阻害物質、Ｓｈｈシグナル伝達経路作用物質、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路阻害物質、アクチビン／ＴＧＦ－βシグナル伝達経路作用物質及びレチノイン酸シグナル伝達経路作用物質からなる群より選ばれる少なくとも１つの存在下で、嗅神経細胞又はその前駆細胞を含む細胞集団を培養する工程を含む。

　嗅神経細胞を含む非神経上皮組織を含む細胞塊は、国際公開第２０２０／０３９７３２号の実施例に記載の方法によっても製造することができる。

　＜工程（ａ）＞
　本実施形態に係る製造方法において、
　工程（１）の前に、多能性幹細胞をフィーダー細胞非存在下で、
　１）ＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及びソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質からなる群より選ばれる少なくとも１つと、
　２）未分化維持因子と、
　を含む培地で培養する工程（ａ）を含んでもよい。

　多能性幹細胞をＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及びソニック・ヘッジホッグシグナル（Ｓｈｈ）伝達経路作用物質からなる群より選ばれる少なくとも１つの存在下で培養してから、工程（１）を開始することにより、多能性幹細胞の状態が変わり、分化しやすく、細胞死が生じにくく、鼻腔上皮を構成する細胞の製造効率が向上する。

　本発明に係る鼻腔上皮を構成する細胞の製造方法において、多能性幹細胞は、好ましくは胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞である。人工多能性幹細胞は、所定の機関より入手でき、市販品を購入することもできる。例えばヒト人工多能性幹細胞株２０１Ｂ７株は、京都大学より入手できる。ＨＣ－６　＃１０株、１２３１Ａ３株及び１３８３Ｄ２株は国立研究開発法人理化学研究所より入手できる。ｈｉＰＳ　β－ａｃｔｉｎ　ＧＦＰ株はメルク社から入手できる。

　ＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路（すなわちＴＧＦβスーパーファミリーシグナル伝達経路）とは、形質転換増殖因子β（ＴＧＦβ）、Ｎｏｄａｌ／Ａｃｔｉｖｉｎ、又はＢＭＰをリガンドとし、細胞内でＳｍａｄファミリーの物質により伝達されるシグナル伝達経路である。

　ＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路阻害物質とは、ＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路、すなわちＳｍａｄファミリーの物質により伝達されるシグナル伝達経路を阻害する物質を表し、具体的にはＴＧＦβシグナル伝達経路阻害物質、Ｎｏｄａｌ／Ａｃｔｉｖｉｎシグナル伝達経路阻害物質及びＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質を挙げることができる。ＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路阻害物質としては、ＴＧＦβシグナル伝達経路阻害物質が好ましい。

　ＴＧＦβシグナル伝達経路阻害物質としては、ＴＧＦβに起因するシグナル伝達経路を阻害する物質であれば特に限定は無く、核酸、タンパク質、低分子有機化合物のいずれであってもよい。当該物質として例えばＴＧＦβに直接作用する物質（例えばタンパク質、抗体、アプタマー等）、ＴＧＦβをコードする遺伝子の発現を抑制する物質（例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ等）、ＴＧＦβ受容体とＴＧＦβの結合を阻害する物質、ＴＧＦβ受容体によるシグナル伝達に起因する生理活性を阻害する物質（例えばＴＧＦβ受容体の阻害剤、Ｓｍａｄの阻害剤等）を挙げることができる。ＴＧＦβシグナル伝達経路阻害物質として知られているタンパク質として、Ｌｅｆｔｙが挙げられる。

　ＴＧＦβシグナル伝達経路阻害物質として、当業者に周知の化合物を使用することができる。具体的には、ＳＢ４３１５４２（「ＳＢ４３１」と略記する場合がある。）（４－［４－（３，４－Ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）－５－（２－ｐｙｒｉｄｙｌ）－１Ｈ－ｉｍｉｄａｚｏｌ－２－ｙｌ］ｂｅｎｚａｍｉｄｅ）、ＳＢ５０５１２４（２－［４－（１，３－Ｂｅｎｚｏｄｉｏｘｏｌ－５－ｙｌ）－２－（１，１－ｄｉｍｅｔｈｙｌｅｔｈｙｌ）－１Ｈ－ｉｍｉｄａｚｏｌ－５－ｙｌ］－６－ｍｅｔｈｙｌｐｙｒｉｄｉｎｅ）、ＳＢ５２５３３４（６－［２－（１，１－Ｄｉｍｅｔｈｙｌｅｔｈｙｌ）－５－（６－ｍｅｔｈｙｌ－２－ｐｙｒｉｄｉｎｙｌ）－１Ｈ－ｉｍｉｄａｚｏｌ－４－ｙｌ］ｑｕｉｎｏｘａｌｉｎｅ）、ＬＹ２１５７２９９（４－［５，６－Ｄｉｈｙｄｒｏ－２－（６－ｍｅｔｈｙｌ－２－ｐｙｒｉｄｉｎｙｌ）－４Ｈ－ｐｙｒｒｏｌｏ［１，２－ｂ］ｐｙｒａｚｏｌ－３－ｙｌ］－６－ｑｕｉｎｏｌｉｎｅｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）、ＬＹ２１０９７６１（４－［５，６－ｄｉｈｙｄｒｏ－２－（２－ｐｙｒｉｄｉｎｙｌ）－４Ｈ－ｐｙｒｒｏｌｏ［１，２－ｂ］ｐｙｒａｚｏｌ－３－ｙｌ］－７－［２－（４－ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｙｌ）ｅｔｈｏｘｙ］－ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ）、ＧＷ７８８３８８（４－｛４－［３－（Ｐｙｒｉｄｉｎ－２－ｙｌ）－１Ｈ－ｐｙｒａｚｏｌ－４－ｙｌ］－ｐｙｒｉｄｉｎ－２－ｙｌ｝－Ｎ－（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－２Ｈ－ｐｙｒａｎ－４－ｙｌ）ｂｅｎｚａｍｉｄｅ）、ＬＹ３６４９４７（４－［３－（２－Ｐｙｒｉｄｉｎｙｌ）－１Ｈ－ｐｙｒａｚｏｌ－４－ｙｌ］ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ）、ＳＤ－２０８（２－（５－Ｃｈｌｏｒｏ－２－ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）ｐｔｅｒｉｄｉｎ－４－ｙｌ）ｐｙｒｉｄｉｎ－４－ｙｌ　ａｍｉｎｅ）、ＥＷ－７１９７（Ｎ－（２－ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）－５－（６－ｍｅｔｈｙｌ－２－ｐｙｒｉｄｉｎｙｌ）－４－［１，２，４］ｔｒｉａｚｏｌｏ［１，５－ａ］ｐｙｒｉｄｉｎ－６－ｙｌ－１Ｈ－Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ－２－ｍｅｔｈａｎａｍｉｎｅ）、Ａ８３－０１（３－（６－Ｍｅｔｈｙｌｐｙｒｉｄｉｎ－２－ｙｌ）－４－（４－ｑｕｉｎｏｌｙｌ）－１－ｐｈｅｎｙｌｔｈｉｏｃａｒｂａｍｏｙｌ－１Ｈ－ｐｙｒａｚｏｌｅ）、ＲｅｐＳｏｘ（２－［５－（６－Ｍｅｔｈｙｌｐｙｒｉｄｉｎ－２－ｙｌ）－１Ｈ－ｐｙｒａｚｏｌ－４－ｙｌ］－１，５－ｎａｐｈｔｈｙｒｉｄｉｎｅ）、ＳＭ１６（４－［４－（１，３－Ｂｅｎｚｏｄｉｏｘｏｌ－５－ｙｌ）－５－（６－ｍｅｔｈｙｌ－２－ｐｙｒｉｄｉｎｙｌ）－１Ｈ－ｉｍｉｄａｚｏｌ－２－ｙｌ］ｂｉｃｙｃｌｏ［２．２．２］ｏｃｔａｎｅ－１－ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）、Ｒ２６８７１２（４－［２－Ｆｌｕｏｒｏ－５－［３－（６－ｍｅｔｈｙｌ－２－ｐｙｒｉｄｉｎｙｌ）－１Ｈ－ｐｙｒａｚｏｌ－４－ｙｌ］ｐｈｅｎｙｌ］－１Ｈ－ｐｙｒａｚｏｌｅ－１－ｅｔｈａｎｏｌ）、ＩＮ１１３０（３－［［５－（６－Ｍｅｔｈｙｌ－２－ｐｙｒｉｄｉｎｙｌ）－４－（６－ｑｕｉｎｏｘａｌｉｎｙｌ）－１Ｈ－ｉｍｉｄａｚｏｌ－２－ｙｌ］ｍｅｔｈｙｌ］ｂｅｎｚａｍｉｄｅ）、Ｇａｌｕｎｉｓｅｒｔｉｂ（４－［５，６－Ｄｉｈｙｄｒｏ－２－（６－ｍｅｔｈｙｌ－２－ｐｙｒｉｄｉｎｙｌ）－４Ｈ－ｐｙｒｒｏｌｏ［１，２－ｂ］ｐｙｒａｚｏｌ－３－ｙｌ］－６－ｑｕｉｎｏｌｉｎｅｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）、ＡＺ１２７９９７３４（４－（｛４－［（２，６－ｄｉｍｅｔｈｙｌｐｙｒｉｄｉｎ－３－ｙｌ）ｏｘｙ］ｐｙｒｉｄｉｎ－２－ｙｌ｝ａｍｉｎｏ）ｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｍｉｄｅ）、Ａ７７－０１（４－［３－（６－Ｍｅｔｈｙｌｐｙｒｉｄｉｎ－２－ｙｌ）－１Ｈ－ｐｙｒａｚｏｌ－４－ｙｌ］ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ）、ＫＲＣＡ　０００８（１，１－［（５－Ｃｈｌｏｒｏ－２，４－ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅｄｉｙｌ）ｂｉｓ［ｉｍｉｎｏ（３－ｍｅｔｈｏｘｙ－４，１－ｐｈｅｎｙｌｅｎｅ）－４，１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｄｉｙｌ］］ｂｉｓｅｔｈａｎｏｎｅ）、ＧＳＫ　１８３８７０５（２－［［２－［［１－［（Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｅｔｈａｎｏｙｌ］－５－（ｍｅｔｈｙｌｏｘｙ）－２，３－ｄｉｈｙｄｒｏ－１Ｈ－ｉｎｄｏｌ－６－ｙｌ］ａｍｉｎｏ］－７Ｈ－ｐｙｒｒｏｌｏ［２，３－ｄ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－４－ｙｌ］ａｍｉｎｏ］－６－ｆｌｕｏｒｏ－Ｎ－ｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚａｍｉｄｅ）、Ｃｒｉｚｏｔｉｎｉｂ（３－［（１Ｒ）－１－（２，６－Ｄｉｃｈｌｏｒｏ－３－ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）ｅｔｈｏｘｙ］－５－［１－（ｐｉｐｅｒｉｄｉｎ－４－ｙｌ）－１Ｈ－ｐｙｒａｚｏｌ－４－ｙｌ］－２－ａＭｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎｅ）、Ｃｅｒｉｔｉｎｉｂ（５－Ｃｈｌｏｒｏ－Ｎ２－［２－ｉｓｏｐｒｏｐｏｘｙ－５－Ｍｅｔｈｙｌ－４－（４－ｐｉｐｅｒｉｄｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］－Ｎ４－（２－ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌｐｈｅｎｙｌ）ｐｙｒｉＭｉｄｉｎｅ－２，４－ｄｉａＭｉｎｅ）、ＡＳＰ　３０２６（Ｎ２－［２－Ｍｅｔｈｏｘｙ－４－［４－（４－ｍｅｔｈｙｌ－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ）－１－ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｙｌ］ｐｈｅｎｙｌ］－Ｎ４－［２－［（１－ｍｅｔｈｙｌｅｔｈｙｌ）ｓｕｌｆｏｎ）、ＴＡＥ６８４（５－Ｃｈｌｏｒｏ－Ｎ２－［２－ｍｅｔｈｏｘｙ－４－［４－（４－ｍｅｔｈｙｌ－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ）－１－ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｙｌ］ｐｈｅｎｙｌ］－Ｎ４－［２－［（１－ｍｅｔｈｙｌｅｔｈｙｌ）ｓｕｌｆｏｎｙｌ］ｐｈｅｎｙｌ］－２，４－ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅｄｉａｍｉｎｅ）、ＡＺＤ３４６３（Ｎ－［４－（４－Ａｍｉｎｏ－１－ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｙｌ）－２－ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ］－５－ｃｈｌｏｒｏ－４－（１Ｈ－ｉｎｄｏｌ－３－ｙｌ）－２－ｐｙｒｉｍｉｄｉｎａｍｉｎｅ）、ＴＰ０４２７７３６（６－［４－（４－ｍｅｔｈｙｌ－１，３－ｔｈｉａｚｏｌ－２－ｙｌ）－１Ｈ－ｉｍｉｄａｚｏｌ－５－ｙｌ］－１，３－ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｅ）等のＡｌｋ５／ＴＧＦβＲ１阻害剤、ＳＩＳ３（１－（３，４－ｄｉｈｙｄｒｏ－６，７－ｄｉｍｅｔｈｏｘｙ－２（１Ｈ）－ｉｓｏｑｕｉｎｏｌｉｎｙｌ）－３－（１－ｍｅｔｈｙｌ－２－ｐｈｅｎｙｌ－１Ｈ－ｐｙｒｒｏｌｏ［２，３－ｂ］ｐｙｒｉｄｉｎ－３－ｙｌ）－２－ｐｒｏｐｅｎ－１－ｏｎｅ）等のＳＭＡＤ３阻害剤、ＩＴＤ－１（４－［１，１’－Ｂｉｐｈｅｎｙｌ］－４－ｙｌ－１，４，５，６，７，８－ｈｅｘａｈｙｄｒｏ－２，７，７－ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ－５－ｏｘｏ－３－ｑｕｉｎｏｌｉｎｅｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ　ａｃｉｄ　ｅｔｈｙｌ　ｅｓｔｅｒ）等の受容体分解促進剤及びこれら化合物の誘導体等が挙げられる。これらの物質は単独で又は複数種を組み合わせて用いてもよい。ＳＢ４３１５４２は、ＴＧＦβ受容体（ＡＬＫ５）及びＡｃｔｉｖｉｎ受容体（ＡＬＫ４／７）の阻害剤（すなわちＴＧＦβＲ阻害剤）として公知の化合物である。ＳＩＳ３は、ＴＧＦβ受容体の制御下にある細胞内シグナル伝達因子であるＳＭＡＤ３のリン酸化を阻害するＴＧＦβシグナル伝達経路阻害物質である。ＩＴＤ－１は、ＴＧＦ－β　ｔｙｐｅ　ＩＩ　ｒｅｃｅｐｔｏｒのプロテアソーム分解促進剤である。上記の化合物等がＴＧＦβシグナル伝達経路阻害物質としての活性を有することは、例えばＥｘｐｅｒｔ　ｏｐｉｎｉｏｎ　ｏｎ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ　ｄｒｕｇｓ，　２０１０，　１９．１：　７７－９１．等に記載されており、当業者にとって公知である。

　ＴＧＦβシグナル伝達経路阻害物質は、好ましくはＡｌｋ５／ＴＧＦβＲ１阻害剤を含む。Ａｌｋ５／ＴＧＦβＲ１阻害剤は、好ましくはＳＢ４３１５４２、ＳＢ５０５１２４、ＳＢ５２５３３４、ＬＹ２１５７２９９、ＧＷ７８８３８８、ＬＹ３６４９４７、ＳＤ－２０８、ＥＷ－７１９７、Ａ８３－０１、ＲｅｐＳｏｘ、ＳＭ１６、Ｒ２６８７１２、ＩＮ１１３０、Ｇａｌｕｎｉｓｅｒｔｉｂ、ＡＺ１２７９９７３４、Ａ７７－０１、ＫＲＣＡ　０００８、ＧＳＫ　１８３８７０５、Ｃｒｉｚｏｔｉｎｉｂ、Ｃｅｒｉｔｉｎｉｂ、ＡＳＰ　３０２６、ＴＡＥ６８４、ＡＺＤ３４６３、ＴＰ０４２７７３６からなる群より選ばれる少なくとも１つを含み、さらに好ましくはＳＢ４３１５４２、ＲｅｐＳｏｘ又はＡ８３－０１を含む。

　培地中のＴＧＦβシグナル伝達経路阻害物質の濃度は、上述の効果を達成可能な範囲で適宜設定することが可能である。工程（ａ）におけるＴＧＦβ伝達経路阻害物質としてＳＢ４３１５４２を用いる場合は、通常約１ｎＭ～約１００μＭ、好ましくは約１０ｎＭ～１００μＭ、より好ましくは約１０ｎＭ～約５０μＭ、さらに好ましくは約１００ｎＭ～約５０μＭ、特に好ましくは約１μＭ～約１０μＭの濃度で使用される。また、ＳＢ４３１５４２以外のＴＧＦβシグナル伝達経路阻害物質を使用する場合、上記濃度のＳＢ４３１５４２と同等のＴＧＦβシグナル伝達経路阻害活性を示す濃度で用いられることが望ましい。

　Ｓｈｈ伝達経路作用物質とは、Ｓｈｈにより媒介されるシグナル伝達を増強し得る物質である。Ｓｈｈシグナル伝達経路作用物質としては、例えばＨｅｄｇｅｈｏｇファミリーに属するタンパク質（例えばＳｈｈ、Ｉｈｈ）、Ｓｈｈ受容体、Ｓｈｈ受容体アゴニスト、Ｓｍｏアゴニスト、Ｐｕｒｍｏｒｐｈａｍｉｎｅ（９－ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ－Ｎ－［４－（ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］－２－（１－ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｙｌｏｘｙ）－９Ｈ－ｐｕｒｉｎ－６－ａｍｉｎｅ）、ＧＳＡ－１０（Ｐｒｏｐｙｌ　４－（１－ｈｅｘｙｌ－４－ｈｙｄｒｏｘｙ－２－ｏｘｏ－１，２－ｄｉｈｙｄｒｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ－３－ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｏ）ｂｅｎｚｏａｔｅ）、Ｈｈ－Ａｇ１．５、２０（Ｓ）－Ｈｙｄｒｏｘｙｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ、ＳＡＧ（Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ　Ａｇｏｎｉｓｔ：Ｎ－Ｍｅｔｈｙｌ－Ｎ’－（３－ｐｙｒｉｄｉｎｙｌｂｅｎｚｙｌ）－Ｎ’－（３－ｃｈｌｏｒｏｂｅｎｚｏ［ｂ］ｔｈｉｏｐｈｅｎｅ－２－ｃａｒｂｏｎｙｌ）－１，４－ｄｉａｍｉｎｏｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ）等が挙げられる。これらの物質は単独で又は複数種を組み合わせて用いてもよい。上記の化合物等がＳｈｈ伝達経路作用物質としての活性を有することは、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ　ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ，　２０１０，　６．１：　４４－５４．に記載されており、当業者にとって公知である。

　Ｓｈｈシグナル伝達経路作用物質は、好ましくはＳＡＧ、Ｐｕｒｍｏｒｐｈａｍｉｎｅ、ＧＳＡ－１０からなる群より含まれる少なくとも１つを含み、より好ましくはＳＡＧを含む。培地中のＳｈｈシグナル伝達経路作用物質の濃度は、上述の効果を達成可能な範囲で適宜設定することが可能である。ＳＡＧは、工程（ａ）においては通常約１ｎＭ～約２０００ｎＭ、好ましくは約１０ｎＭ～約１０００ｎＭ、より好ましくは約１０ｎＭ～約７００ｎＭ、さらに好ましくは約５０ｎＭ～約７００ｎＭ、特に好ましくは約１００ｎＭ～約６００ｎＭ、最も好ましくは約１００ｎＭ～約５００ｎＭの濃度で使用される。また、ＳＡＧ以外のＳｈｈシグナル伝達経路作用物質を使用する場合、上記濃度のＳＡＧと同等のＳｈｈシグナル伝達促進活性を示す濃度で用いられることが望ましい。Ｓｈｈ伝達促進活性は、当業者に周知の方法、例えばＧｌｉ１遺伝子の発現に着目したレポータージーンアッセイにて決定することができる（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（２００７）２６，５１６３－５１６８）。

　工程（ａ）において用いられる培地は、未分化維持培養を可能にするため、未分化維持因子を含む。未分化維持因子は、多能性幹細胞の分化を抑制する作用を有する物質であれば特に限定されない。当業者に汎用されている未分化維持因子としては、プライムド多能性幹細胞（ｐｒｉｍｅｄ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ）（例えばヒトＥＳ細胞、ヒトｉＰＳ細胞）の場合、ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質、ＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路作用物質、ｉｎｓｕｌｉｎ等を挙げることができる。ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質として具体的には、線維芽細胞増殖因子（例えばｂＦＧＦ、ＦＧＦ４やＦＧＦ８）が挙げられる。また、ＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路作用物質としては、ＴＧＦβシグナル伝達経路作用物質、Ｎｏｄａｌ／Ａｃｔｉｖｉｎシグナル伝達経路作用物質が挙げられる。ＴＧＦβシグナル伝達経路作用物質としては、例えばＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２が挙げられる。Ｎｏｄａｌ／Ａｃｔｉｖｉｎシグナル伝達経路作用物質としては、例えばＮｏｄａｌ、ＡｃｔｉｖｉｎＡ、ＡｃｔｉｖｉｎＢが挙げられる。これらの物質は単独で又は複数種を組み合わせて用いてもよい。ヒト多能性幹細胞（例えばヒトＥＳ細胞、ヒトｉＰＳ細胞）を培養する場合、工程（ａ）における培地は、好ましくは未分化維持因子として、ｂＦＧＦを含む。

　未分化維持因子は、通常哺乳動物の未分化維持因子である。哺乳動物としては、上記のものを挙げることができる。未分化維持因子は、哺乳動物の種間で交差反応性を有し得るので、培養対象の多能性幹細胞の未分化状態を維持可能な限り、いずれの哺乳動物の未分化維持因子を用いてもよい。未分化維持因子は、好ましくは培養する細胞と同一種の哺乳動物の未分化維持因子である。例えばヒト多能性幹細胞の培養には、ヒト未分化維持因子（例えばｂＦＧＦ、ＦＧＦ４、ＦＧＦ８、ＥＧＦ、Ｎｏｄａｌ、ＡｃｔｉｖｉｎＡ、ＡｃｔｉｖｉｎＢ、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２等）が用いられる。未分化維持因子は、好ましくは単離されている。

　未分化維持因子は、培養対象である多能性幹細胞の未分化維持能を有する限り、いずれの宿主によって生産されたもの又は人工合成されたものを用いることができる。本発明に用いる未分化維持因子は、生体内で生じるものと同様の修飾を受けたものが好ましく、培養対象である多能性幹細胞と同種の細胞において異種成分を含まない条件下で産生されたものがさらに好ましい。

　本発明に係る製造方法の一態様は、単離された未分化維持因子を提供する工程を含む。本発明に係る製造方法の一態様は、工程（ａ）に用いる培地中へ、単離された未分化維持因子を外来的（又は外因的）に添加する工程を含む。工程（ａ）に用いる培地に予め未分化維持因子が添加されていてもよい。

　工程（ａ）において用いられる培地中の未分化維持因子濃度は、培養する多能性幹細胞の未分化状態を維持可能な濃度であり、当業者であれば適宜設定することができる。例えばフィーダー細胞非存在下で未分化維持因子としてｂＦＧＦを用いる場合、その濃度は、通常約４ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは約１０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは約３０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬである。

　工程（ａ）は、フィーダー細胞非存在下で実施する。工程（ａ）における多能性幹細胞の培養は、浮遊培養及び接着培養のいずれの条件で行われてもよいが、好ましくは接着培養により行われる。フィーダー細胞非存在下での多能性幹細胞の培養においては、フィーダー細胞に代わる足場を多能性幹細胞に提供するため、適切なマトリクスを足場として用いてもよい。足場であるマトリクスにより、表面をコーティングした培養器材中で、多能性幹細胞を接着培養する。

　足場として用いることのできるマトリクスとしては、ラミニン（Ｎａｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２８，６１１－６１５（２０１０））、ラミニン断片（Ｎａｔ　Ｃｏｍｍｕｎ　３，１２３６（２０１２））、基底膜標品（Ｎａｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　１９，９７１－９７４（２００１））、ゼラチン、コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、エンタクチン、ビトロネクチン（Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ）等が挙げられる。マトリクスは、好ましくはラミニン５１１が用いられる（Ｎａｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　２８，６１１－６１５（２０１０））。

　ラミニン断片は、多能性幹細胞への接着性を有しており、フィーダーフリー条件での多能性幹細胞の維持培養を可能とするものであれば特に限定されないが、好ましくはＥ８フラグメントである。ラミニンＥ８フラグメントは、ラミニン５１１をエラスターゼで消化して得られたフラグメントの中で、強い細胞接着活性をもつフラグメントとして同定されたものである（ＥＭＢＯ　Ｊ．，３：１４６３－１４６８，１９８４、Ｊ．　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．，１０５：５８９－５９８，１９８７）。ラミニン断片としては、好ましくはラミニン５１１のＥ８フラグメントが用いられる（Ｎａｔ　Ｃｏｍｍｕｎ　３，１２３６（２０１２）、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｒｅｐｏｒｔｓ　４，３５４９（２０１４））。ラミニンＥ８フラグメントは、ラミニンのエラスターゼ消化産物であることを要するものではなく、組換え体であってもよい。遺伝子組換え動物（カイコ等）に産生させたものであってもよい。未同定成分の混入を回避する観点から、好ましくは組換え体のラミニン断片が用いられる。ラミニン５１１のＥ８フラグメントは市販されており、例えばニッピ株式会社等から購入可能である。

　未同定成分の混入を回避する観点から、本発明において用いられるラミニン又はラミニン断片は、単離されていることが好ましい。工程（ａ）におけるフィーダー細胞非存在下での多能性幹細胞の培養においては、好ましくは単離されたラミニン５１１又はラミニン５１１のＥ８フラグメントによって、より好ましくはラミニン５１１のＥ８フラグメントによって表面をコーティングした培養器材中で、多能性幹細胞を接着培養する。

　工程（ａ）において用いられる培地は、フィーダーフリー条件下で、多能性幹細胞の未分化維持培養を可能にする培地（フィーダーフリー培地）であれば、特に限定されない。フィーダーフリー培地として、多くの合成培地が開発・市販されており、例えばＥｓｓｅｎｔｉａｌ　８培地が挙げられる。Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　８培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に、添加剤として、Ｌ－ａｓｃｏｒｂｉｃ　ａｃｉｄ－２－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｍａｇｎｅｓｉｕｍ（６４ｍｇ／ｌ）、ｓｏｄｉｕｍ　ｓｅｌｅｎｉｕｍ（１４μｇ／１）、ｉｎｓｕｌｉｎ（１９．４ｍｇ／ｌ）、ＮａＨＣＯ_３（５４３ｍｇ／ｌ）、ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ（１０．７ｍｇ／ｌ）、ｂＦＧＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）、及びＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路作用物質（ＴＧＦβ１（２ｎｇ／ｍＬ）又はＮｏｄａｌ（１００ｎｇ／ｍＬ））を含む（Ｎａｔｕｒｅ　Ｍｅｔｈｏｄｓ，８，４２４－４２９（２０１１））。市販のフィーダーフリー培地としては、例えばＥｓｓｅｎｔｉａｌ　８（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、Ｓ－ｍｅｄｉｕｍ（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社製）、ＳｔｅｍＦｌｅｘ　Ｍｅｄｉｕｍ、ＳｔｅｍＰｒｏ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、ｈＥＳＦ９、ｍＴｅＳＲ１（ＳＴＥＭＣＥＬＬ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ｍＴｅＳＲ２（ＳＴＥＭＣＥＬＬ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ＴｅＳＲ－Ｅ８（ＳＴＥＭＣＥＬＬ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ｍＴｅＳＲ　Ｐｌｕｓ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ＳｔｅｍＦｉｔ（味の素株式会社製）、ＲｅｐｒｏＭｅｄ　ｉＰＳＣ　Ｍｅｄｉｕｍ（リプロセル社製）、ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ　ＸＦ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社製）、ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ　Ｖ９（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社製）、Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ　ＤＥＦ－ＣＳ　Ｘｅｎｏ－Ｆｒｅｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｍｅｄｉｕｍ（タカラバイオ社製）、Ｓｔｅｍ－Ｐａｒｔｎｅｒ　ＳＦ（極東製薬社製）、ＰｌｕｒｉＳＴＥＭ　Ｈｕｍａｎ　ＥＳ／ｉＰＳ　Ｃｅｌｌ　Ｍｅｄｉｕｍ（メルク社製）、ＳｔｅｍＳｕｒｅ　ｈＰＳＣ　ＭｅｄｉｕｍΔ（富士フイルム和光純薬社製）、ｃｉＫＩＣ　ｉＰＳ　ｍｅｄｉｕｍ（関東化学株式会社製）、ＳｔｅｍＭＡＣＳ　ｉＰＳ－Ｂｒｅｗ　ＸＦ，　ｈｕｍａｎ（ミルテニーバイオテック社製）、ＥｘＣｅｌｌｅｒａｔｅ　ｉＰＳＣ　Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ　Ｍｅｄｉｕｍ，　Ａｎｉｍａｌ　Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ－Ｆｒｅｅ（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）、ＳＴＥＭｉｕｍ　Ｈｕｍａｎ　Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｍｅｄｉｕｍ（Ｃｌｉｎｉ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）、ＣＥＬＲＥＮＡ　Ｍｅｄｉｕｍ　（細胞科学研究所社製）、ｈＰＳＣ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｍｅｄｉｕｍ　ＤＸＦ（プロモセル社製）、ＰＳＧｒｏ　ｈＥＳＣ　／　ｉＰＳＣ　Ｍｅｄｉｕｍ（システムバイオサイエンス社製）等が挙げられる。工程（ａ）ではこれらを用いることにより、簡便に本発明を実施することができる。ＳｔｅｍＦｉｔ培地は未分化維持成分としてｂＦＧＦを含有する（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｒｅｐｏｒｔｓ（２０１４）４，３５９４）。

　工程（ａ）における多能性幹細胞はプライム状態（Ｐｒｉｍｅｄ　ｓｔａｔｅ）及びナイーブ様状態（Ｎａｉｖｅ－ｌｉｋｅ　ｓｔａｔｅ）のいずれであってもよいが、好ましくはプライム状態である。ナイーブ様状態の多能性幹細胞は、プライム状態の多能性幹細胞を例えばＣｅｌｌ，　２０１４，　１５８．６：　１２５４－１２６９．に記載の方法、あるいは市販のＲｅｐｒｏＮａｉｖｅ（リプロセル社製）、ＮａiｖｅＣｕｌｔ　Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ＲＳｅＴ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）ＡｌｐｈａＳＴＥＭ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｓｙｓｔｅｍ（ミネルバ　バイオテクノロジー社製）等の培地で処理、培養することにより得ることができる。

　工程（ａ）において用いられる培地は、血清培地であっても無血清培地であってもよい。化学的に未決定な成分の混入を回避する観点から、工程（ａ）において用いられる培地は、好ましくは無血清培地である。培地は、血清代替物を含んでいてもよい。

　工程（ａ）における多能性幹細胞の培養時間は、続く工程（１）において形成され得る細胞凝集体の質を向上させる効果が達成可能な範囲で特に限定されないが、通常０．５～１４４時間、好ましくは２～９６時間、より好ましくは６～４８時間、さらに好ましくは１２～４８時間、特に好ましくは１８～２８時間であり、例えば２４時間である。すなわち、工程（１）開始の０．５～１４４時間前、好ましくは１８～２８時間前に工程（ａ）を開始し、工程（ａ）を完了した後引き続き工程（１）が行われる。

　工程（ａ）の好ましい一態様において、ヒト多能性幹細胞を、フィーダー細胞非存在下で、ｂＦＧＦを含有する無血清培地中で、接着培養する。当該接着培養は、好ましくはラミニン５１１、ラミニン５１１のＥ８フラグメント又はビトロネクチンで表面をコーティングした培養器材中で実施される。当該接着培養は、好ましくはフィーダーフリー培地としてＳｔｅｍＦｉｔを用いて実施される。

　工程（ａ）の好ましい一態様において、ヒト多能性幹細胞を、フィーダー細胞非存在下で、ｂＦＧＦを含有する無血清培地中で、浮遊培養する。当該浮遊培養では、ヒト多能性幹細胞は、ヒト多能性幹細胞の凝集体を形成してもよい。

　工程（ａ）及び後述する工程において、培養温度、ＣＯ_２濃度等の培養条件は適宜設定できる。培養温度は、例えば約３０℃から約４０℃であってもよく、好ましくは約３７℃である。ＣＯ_２濃度は、例えば約１％から約１０％であってもよく、好ましくは約５％である。

　＜工程（１）＞
　工程（１）では、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質の存在下で多能性幹細胞を培養する。

　Ｗｎｔシグナル伝達経路とは、Ｗｎｔファミリー・タンパク質をリガンドとし、主としてＦｒｉｚｚｌｅｄを受容体とするシグナル伝達経路である。当該シグナル経路としては、古典的Ｗｎｔ経路（ｃａｎｏｎｉｃａｌ　Ｗｎｔ　ｐａｔｈｗａｙ）、非古典的Ｗｎｔ経路（ｎｏｎ－ｃａｎｏｎｉｃａｌ　Ｗｎｔ　ｐａｔｈｗａｙ）等が挙げられる。古典的Ｗｎｔ経路は、β－ｃａｔｅｎｉｎによって伝達される。非古典的Ｗｎｔ経路としては、ｐｌａｎａｒ　ｃｅｌｌ　ｐｏｌａｒｉｔｙ（ＰＣＰ）経路、Ｗｎｔ／ＪＮＫ経路、Ｗｎｔ／Ｃａｌｃｉｕｍ経路、Ｗｎｔ－ＲＡＰ１経路、Ｗｎｔ－Ｒｏｒ２経路、Ｗｎｔ－ＰＫＡ経路、Ｗｎｔ－ＧＳＫ３ＭＴ経路、Ｗｎｔ－ａＰＫＣ経路、Ｗｎｔ－ＲＹＫ経路、Ｗｎｔ－ｍＴＯＲ経路等が挙げられる。非古典的Ｗｎｔ経路では、Ｗｎｔ以外の他のシグナル伝達経路でも活性化される共通のシグナル伝達因子が存在するが、本発明ではそれらの因子もＣＨＩＲシグナル伝達経路の構成因子とし、それらの因子に対する阻害物質もＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質に含まれる。

　Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質は、Ｗｎｔファミリー・タンパク質により惹起されるシグナル伝達を抑制し得るものである限り限定されない。当該阻害物質は、核酸、タンパク質、低分子有機化合物のいずれであってもよい。当該阻害物質として例えばＷｎｔのプロセシングと細胞外への分泌を阻害する物質、Ｗｎｔに直接作用する物質（例えばタンパク質、抗体、アプタマー等）、Ｗｎｔをコードする遺伝子の発現を抑制する物質（例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ等）、Ｗｎｔ受容体とＷｎｔの結合を阻害する物質、Ｗｎｔ受容体によるシグナル伝達に起因する生理活性を阻害する物質を挙げることができる。

　Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質として知られているタンパク質として、ｓｅｃｒｅｔｅｄ　Ｆｒｉｚｚｌｅｄ　Ｒｅｌａｔｅｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎ（ｓＦＲＰ）クラスに属するタンパク質（ｓＦＲＰ１～５、Ｗｎｔ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　Ｆａｃｔｏｒ－１（ＷＩＦ－１）、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ）、Ｄｉｃｋｋｏｐｆ（Ｄｋｋ）クラスに属するタンパク質（Ｄｋｋ１～４、Ｋｒｅｍｅｎ）、ＡＰＣＤＤ１、ＡＰＣＤＤ１Ｌ、Ｄｒａｘｉｎファミリーに属するタンパク質、ＩＧＦＢＰ－４、Ｎｏｔｕｍ、ＳＯＳＴ／Ｓｃｌｅｒｏｓｔｉｎファミリーに属するタンパク質等が挙げられる。

　Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質としては、当業者に周知の化合物を使用することができる。古典的Ｗｎｔシグナル伝達経路の阻害物質として例えばＦｒｉｚｚｌｅｄ阻害剤、Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ（Ｄｖｌ）阻害剤、Ｔａｎｋｙｒａｓｅ（ＴＡＮＫ）阻害剤、カゼインキナーゼ１阻害剤、カテニン応答性転写阻害剤、ｐ３００阻害剤、ＣＲＥＢ－ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ（ＣＢＰ）阻害剤、ＢＣＬ－９阻害剤（Ａｍ　Ｊ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．２０１５；５（８）：２３４４－２３６０）等が挙げられる。非古典的Ｗｎｔ経路の阻害物質として、例えばＰｏｒｃｕｐｉｎｅ（ＰＯＲＣＮ）阻害剤、Ｃａｌｃｉｕｍ／ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅ　ＩＩ（ＣａＭＫＩＩ）阻害剤、（ＴＧＦ－β－ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｋｉｎａｓｅ　１（ＴＡＫ１）阻害剤、Ｎｅｍｏ－Ｌｉｋｅ　Ｋｉｎａｓｅ（ＮＬＫ）阻害剤、ＬＩＭ　Ｋｉｎａｓｅ阻害剤、ｍａｍｍａｌｉａｎ　ｔａｒｇｅｔ　ｏｆ　ｒａｐａｍｙｃｉｎ（ｍＴＯＲ）阻害剤、Ｒａｃ阻害剤、ｃ－Ｊｕｎ　ＮＨ　２－ｔｅｒｍｉｎａｌ　ｋｉｎａｓｅ（ＪＮＫ）阻害剤、ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅ　Ｃ（ＰＫＣ）阻害剤、Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ　Ａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ　２（ＭｅｔＡＰ２）阻害剤、Ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎ阻害剤、ｎｕｃｌｅａｒ　ｆａｃｔｏｒ　ｏｆ　ａｃｔｉｖａｔｅｄ　Ｔ　ｃｅｌｌｓ（ＮＦＡＴ）阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤等が挙げられる。また、作用機序は報告されていないが、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質としてＫＹ０２１１１（Ｎ－（６－Ｃｈｌｏｒｏ－２－ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｙｌ）－３，４－ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｂｅｎｚｅｎｅｐｒｏｐａｎａｍｉｄｅ）、ＫＹ０３－Ｉ（２－（４－（３，４－ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｂｕｔａｎａｍｉｄｅ）－６－Ｉｏｄｏｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｅ）が挙げられる。これらの物質は単独で又は複数種を組み合わせて用いてもよい。

　ＰＯＲＣＮ阻害剤として例えばＩＷＰ－２（Ｎ－（６－Ｍｅｔｈｙｌ－２－ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｙｌ）－２－［（３，４，６，７－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－４－ｏｘｏ－３－ｐｈｅｎｙｌｔｈｉｅｎｏ［３，２－ｄ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－２－ｙｌ）ｔｈｉｏ］－ａｃｅｔａｍｉｄｅ）、ＩＷＰ－３（２－［［３－（４－ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）－３，４，６，７－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－４－ｏｘｏｔｈｉｅｎｏ［３，２－ｄ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－２－ｙｌ］ｔｈｉｏ］－Ｎ－（６－ｍｅｔｈｙｌ－２－ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｙｌ）－ａｃｅｔａｍｉｄｅ）、ＩＷＰ－４（Ｎ－（６－ｍｅｔｈｙｌ－２－ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｙｌ）－２－［［３，４，６，７－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－３－（２－ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）－４－ｏｘｏｔｈｉｅｎｏ［３，２－ｄ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－２－ｙｌ］ｔｈｉｏ］－ａｃｅｔａｍｉｄｅ）、ＩＷＰ－Ｌ６（Ｎ－（５－ｐｈｅｎｙｌ－２－ｐｙｒｉｄｉｎｙｌ）－２－［（３，４，６，７－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－４－ｏｘｏ－３－ｐｈｅｎｙｌｔｈｉｅｎｏ［３，２－ｄ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－２－ｙｌ）ｔｈｉｏ］－ａｃｅｔａｍｉｄｅ）、ＩＷＰ－１２（Ｎ－（６－Ｍｅｔｈｙｌ－２－ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｙｌ）－２－［（３，４，６，７－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－３，６－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－４－ｏｘｏｔｈｉｅｎｏ［３，２－ｄ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－２－ｙｌ）ｔｈｉｏ］ａｃｅｔａｍｉｄｅ）、ＬＧＫ－９７４（２－（２’，３－Ｄｉｍｅｔｈｙｌ－２，４’－ｂｉｐｙｒｉｄｉｎ－５－ｙｌ）－Ｎ－（５－（ｐｙｒａｚｉｎ－２－ｙｌ）ｐｙｒｉｄｉｎ－２－ｙｌ）ａｃｅｔａｍｉｄｅ）、Ｗｎｔ－Ｃ５９（２－［４－（２－Ｍｅｔｈｙｌｐｙｒｉｄｉｎ－４－ｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］－Ｎ－［４－（ｐｙｒｉｄｉｎ－３－ｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］ａｃｅｔａｍｉｄｅ）、ＥＴＣ－１５９（１，２，３，６－Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－１，３－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－２，６－ｄｉｏｘｏ－Ｎ－（６－ｐｈｅｎｙｌ－３－ｐｙｒｉｄａｚｉｎｙｌ）－７Ｈ－ｐｕｒｉｎｅ－７－ａｃｅｔａｍｉｄｅ）、ＧＮＦ－６２３１（Ｎ－［５－（４－Ａｃｅｔｙｌ－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ）－２－ｐｙｒｉｄｉｎｙｌ］－２’－ｆｌｕｏｒｏ－３－ｍｅｔｈｙｌ［２，４’－ｂｉｐｙｒｉｄｉｎｅ］－５－ａｃｅｔａｍｉｄｅ）及びこれらの誘導体等が挙げられる。これらの物質は単独で又は複数種を組み合わせて用いてもよい。上記の化合物等がＰＯＲＣＮ阻害剤としての活性を有することは、例えばＢｉｏｏｒｇａｎｉｃ　＆　ｍｅｄｉｃｉｎａｌ　ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｌｅｔｔｅｒｓ，　２０１５，　２５．２３：　５４７２－５４７６．に記載されており、当業者にとって公知である。

　ＪＮＫ阻害剤としては、例えばＪＮＫ－ＩＮ－８（（Ｅ）－３－（４－（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｂｕｔ－２－ｅｎａｍｉｄｏ）－Ｎ－（３－ｍｅｔｈｙｌ－４－（（４－（ｐｙｒｉｄｉｎ－３－ｙｌ）ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－２－ｙｌ）ａｍｉｎｏ）ｐｈｅｎｙｌ）ｂｅｎｚａｍｉｄｅ）、ＳＰ６００１２５（Ａｎｔｈｒａ［１－９－ｃｄ］ｐｙｒａｚｏｌ－６（２Ｈ）－ｏｎｅ）、ＤＢ０７２６８（２－［［２－［（３－Ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ａｍｉｎｏ］－４－ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｂｅｎｚａｍｉｄｅ）、Ｔａｎｚｉｓｅｒｔｉｂ（ｔｒａｎｓ－４－［［９－［（３Ｓ）－Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－３－ｆｕｒａｎｙｌ］－８－［（２，４，６－ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）ａｍｉｎｏ］－９Ｈ－ｐｕｒｉｎ－２－ｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｏｌ）、Ｂｅｎｔａｍａｐｉｍｏｄ（１，３－Ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌ－２－ｙｌ）［２－［［４－［（ｍｏｒｐｈｏｌｉｎ－４－ｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ］ｂｅｎｚｙｌ］ｏｘｙ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－４－ｙｌ］ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ、ＴＣＳ　ＪＮＫ　６ｏ（Ｎ－（４－Ａｍｉｎｏ－５－ｃｙａｎｏ－６－ｅｔｈｏｘｙ－２－ｐｙｒｉｄｉｎｙｌ）－２，５－ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｂｅｎｚｅｎｅａｃｅｔａｍｉｄｅ）、ＳＵ３３２７（５－［（５－Ｎｉｔｒｏ－２－ｔｈｉａｚｏｌｙｌ）ｔｈｉｏ］－１，３，４ｔｈｉａｄｉａｚｏｌ－２－ａｍｉｎｅ）、ＣＥＰ１３４７（（９Ｓ，１０Ｒ，１２Ｒ）－５－１６－Ｂｉｓ［（ｅｔｈｙｌｔｈｉｏ）ｍｅｔｈｙｌ］－２，３，９，１０，１１，１２－ｈｅｘａｈｙｄｒｏ－１０－ｈｙｄｒｏｘｙ－９－ｍｅｔｈｙｌ－１－ｏｘｏ－９，１２－ｅｐｏｘｙ－１Ｈ－ｄｉｉｎｄｏｌｏ［１，２，３－ｆｇ：３’，２’，１’－ｋｌ］ｐｙｒｒｏｌｏ［３，４－ｉ］［１，６］ｂｅｎｚｏｄｉａｚｏｃｉｎｅ－１０－ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ　ａｃｉｄ　ｍｅｔｈｙｌ　ｅｓｔｅｒ）、ｃ－ＪＵＮ　ｐｅｐｔｉｄｅ、ＡＥＧ３４８２（６－Ｐｈｅｎｙｌｉｍｉｄａｚｏ［２，１－ｂ］－１，３，４－ｔｈｉａｄｉａｚｏｌｅ－２－ｓｕｌｆｏｎａｍｉｄｅ）、ＴＣＳ　ＪＮＫ　５ａ（Ｎ－（３－Ｃｙａｎｏ－４，５，６，７－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｂｅｎｚｏ［ｂ］ｔｈｉｅｎｙｌ－２－ｙｌ）－１－ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）、ＢＩ－７８Ｄ３（４－（２，３－Ｄｉｈｙｄｒｏ－１，４－ｂｅｎｚｏｄｉｏｘｉｎ－６－ｙｌ）－２，４－ｄｉｈｙｄｒｏ－５－［（５－ｎｉｔｒｏ－２－ｔｈｉａｚｏｌｙｌ）ｔｈｉｏ］－３Ｈ－１，２，４－ｔｒｉａｚｏｌ－３－ｏｎｅ）、ＩＱ－３（１１Ｈ－Ｉｎｄｅｎｏ［１，２－ｂ］ｑｕｉｎｏｘａｌｉｎ－１１－ｏｎｅ　Ｏ－（２－ｆｕｒａｎｙｌｃａｒｂｏｎｙｌ）ｏｘｉｍｅ）、ＳＲ　３５７６（３－［４－［［［（３－Ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌ）ａｍｉｎｏ］ｃａｒｂｏｎｙｌ］ａｍｉｎｏ］－１Ｈ－ｐｙｒａｚｏｌ－１－ｙｌ］－Ｎ－（３，４，５－ｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｂｅｎｚａｍｉｄｅ）、ＩＱ－１Ｓ（１１Ｈ－Ｉｎｄｅｎｏ［１，２－ｂ］ｑｕｉｎｏｘａｌｉｎ－１１－ｏｎｅ　ｏｘｉｍｅ　ｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔ）、ＪＩＰ－１（１５３－１６３）、ＣＣ－４０１（３－［３－［２－（１－Ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｙｌ）ｅｔｈｏｘｙ］ｐｈｅｎｙｌ］－５－（１Ｈ－１，２，４－ｔｒｉａｚｏｌ－５－ｙｌ）－１Ｈ－ｉｎｄａｚｏｌｅ　ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）及びこれらの誘導体等が挙げられる。これらの物質は単独で又は複数種を組み合わせて用いてもよい。上記の化合物等がＪＮＫ阻害剤としての活性を有することは、例えばＪ　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｉｎｈｉｂ　Ｍｅｄ　Ｃｈｅｍ．　２０２０；　３５（１）：　５７４－５８３．に記載されており、当業者にとって公知である。

　Ｒａｃ阻害剤としては、例えばＥＨＴ１８６４（５－（５－（７－（Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌ）ｑｕｉｎｏｌｉｎ－４－ｙｌｔｈｉｏ）ｐｅｎｔｙｌｏｘｙ）－２－（ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｍｅｔｈｙｌ）－４Ｈ－ｐｙｒａｎ－４－ｏｎｅ　ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ＮＳＣ２３７６６（Ｎ６－［２－［［４－（Ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）－１－ｍｅｔｈｙｌｂｕｔｙｌ］ａｍｉｎｏ］－６－ｍｅｔｈｙｌ－４－ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｙｌ］－２－ｍｅｔｈｙｌ－４，６－ｑｕｉｎｏｌｉｎｅｄｉａｍｉｎｅ　ｔｒｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ＥＨｏｐ－０１６（Ｎ４－（９－Ｅｔｈｙｌ－９Ｈ－ｃａｒｂａｚｏｌ－３－ｙｌ）－Ｎ２－［３－（４－ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｙｌ）ｐｒｏｐｙｌ］－２，４－ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅｄｉａｍｉｎｅ）、１Ａ－１１６（Ｎ－（３，５－Ｄｉｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌ）－Ｎ’－［２－（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］ｇｕａｎｉｄｉｎｅ）、ＺＣＬ２７８（２－（４－ｂｒｏＭｏ－２－ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｘｙ）－Ｎ－（４－（Ｎ－（４，６－ｄｉＭｅｔｈｙｌｐｙｒｉＭｉｄｉｎ－２－ｙｌ）ｓｕｌｆａＭｏｙｌ）ｐｈｅｎｙｌｃａｒｂａＭｏｔｈｉｏｙｌ）ａｃｅｔａＭｉｄｅ）、ＭＢＱ－１６７（９－ｅｔｈｙｌ－３－（５－ｐｈｅｎｙｌ－１Ｈ－１，２，３－ｔｒｉａｚｏｌ－１－ｙｌ）－９Ｈ－ｃａｒｂａｚｏｌｅ）、ＫＲｐｅｐ－２ｄ（ａｃｔｉｎｉｕｍ；［（２Ｓ）－１－［［（２Ｓ）－１－［［（２Ｓ）－１－［［（２Ｓ）－１－［［（３Ｒ，８Ｒ，１１Ｓ，１４Ｓ，２０Ｓ，２３Ｓ，２６Ｓ，２９Ｓ，３２Ｓ，３５Ｓ，３８Ｓ）－８－［［（２Ｓ）－１－［［（２Ｓ）－１－［［（２Ｓ）－１－［［（２Ｓ）－１－ａｍｉｎｏ－５－ｃａｒｂａｍｉｍｉｄａｍｉｄｏ－１－ｏｘｏｐｅｎｔａｎ－２－ｙｌ］ａｍｉｎｏ］－５－ｃａｒｂａｍｉｍｉｄａｍｉｄｏ－１－ｏｘｏｐｅｎｔａｎ－２－ｙｌ］ａｍｉｎｏ］－５－ｃａｒｂａｍｉｍｉｄａｍｉｄｏ－１－ｏｘｏｐｅｎｔａｎ－２－ｙｌ］ａｍｉｎｏ］－５－ｃａｒｂａｍｉｍｉｄａｍｉｄｏ－１－ｏｘｏｐｅｎｔａｎ－２－ｙｌ］ｃａｒｂａｍｏｙｌ］－２９－［（２Ｒ）－ｂｕｔａｎ－２－ｙｌ］－２０－（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）－２６－（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）－２３，３２－ｂｉｓ［（４－ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ］－３５－（２－ｍｅｔｈｙｌｐｒｏｐｙｌ）－２，１０，１３，１９，２２，２５，２８，３１，３４，３７－ｄｅｃａｏｘｏ－１１－ｐｒｏｐａｎ－２－ｙｌ－５，６－ｄｉｔｈｉａ－１，９，１２，１８，２１，２４，２７，３０，３３，３６－ｄｅｃａｚａｔｒｉｃｙｃｌｏ［３６．３．０．０１４，１８］ｈｅｎｔｅｔｒａｃｏｎｔａｎ－３－ｙｌ］ａｍｉｎｏ］－５－ｃａｒｂａｍｉｍｉｄａｍｉｄｏ－１－ｏｘｏｐｅｎｔａｎ－２－ｙｌ］ａｍｉｎｏ］－５－ｃａｒｂａｍｉｍｉｄａｍｉｄｏ－１－ｏｘｏｐｅｎｔａｎ－２－ｙｌ］ａｍｉｎｏ］－５－ｃａｒｂａｍｉｍｉｄａｍｉｄｏ－１－ｏｘｏｐｅｎｔａｎ－２－ｙｌ］ａｍｉｎｏ］－５－ｃａｒｂａｍｉｍｉｄａｍｉｄｏ－１－ｏｘｏｐｅｎｔａｎ－２－ｙｌ］ａｚａｎｉｄｅ）、ＡＲＳ－８５３（１－［３－［４－［２－［［４－Ｃｈｌｏｒｏ－２－ｈｙｄｒｏｘｙ－５－（１－ｍｅｔｈｙｌｃｙｃｌｏｐｒｏｐｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］ａｍｉｎｏ］ａｃｅｔｙｌ］－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ］－１－ａｚｅｔｉｄｉｎｙｌ］－２－ｐｒｏｐｅｎ－１－ｏｎｅ）、Ｓａｌｉｒａｓｉｂ（２－（（（２Ｅ，６Ｅ）－３，７，１１－Ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｄｏｄｅｃａ－２，６，１０－ｔｒｉｅｎ－１－ｙｌ）ｔｈｉｏ）ｂｅｎｚｏｉｃａｃｉｄ）、ＭＬ１４１（４－（５－（４－ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）－３－ｐｈｅｎｙｌ－４，５－ｄｉｈｙｄｒｏｐｙｒａｚｏｌ－１－ｙｌ）ｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｍｉｄｅ）及びこれらの誘導体等が挙げられる。これらの物質は単独で又は複数種を組み合わせて用いてもよい。上記の化合物等がＲａｃ阻害剤としての活性を有することは、例えばＣａｎｃｅｒ　ｒｅｓｅａｒｃｈ，　２０１８，　７８．１２：　３１０１－３１１１．に記載されており、当業者にとって公知である。

　Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質は、好ましくはＰＯＲＣＮ阻害剤、ＫＹ０２１１１及びＫＹ０３－Ｉからなる群より選ばれる少なくとも１つを含み、より好ましくはＰＯＲＣＮ阻害剤を含む。Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質は、Ｗｎｔの非古典的Ｗｎｔ経路への阻害活性を有する物質を含むこともまた好ましい。Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質は、より好ましくはＷｎｔ／Ｐｌａｎａｒ　Ｃｅｌｌ　Ｐｏｌａｒｉｔｙ（ＰＣＰ）経路への阻害活性を有する物質を含み、さらに好ましくはＷｎｔ／ＪＮＫ経路への阻害活性を有する物質を含む。本発明で用いられるＰＯＲＣＮ阻害剤は、好ましくはＩＷＰ－２、ＩＷＰ－３、ＩＷＰ－４、ＩＷＰ－Ｌ６、ＩＷＰ－１２、ＬＧＫ－９７４、Ｗｎｔ－Ｃ５９、ＥＴＣ－１５９及びＧＮＦ－６２３１からなる群より選ばれる少なくとも１つを含み、より好ましくはＩＷＰ－２又はＷｎｔ－Ｃ５９を含み、さらに好ましくはＩＷＰ－２を含む。

　Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質としてＰＯＲＣＮ阻害剤と他のＷｎｔ／ＰＣＰ経路への阻害活性を有する物質を組み合わせて用いることもまた好ましい。ＰＯＲＣＮ阻害剤と組み合わせて用いられるＷｎｔ／ＰＣＰ経路阻害物質は、好ましくはＪＮＫ阻害剤又はＲａｃ阻害剤である。本発明で用いられるＪＮＫ阻害剤は、好ましくはＪＮＫ－ＩＮ－８である。本発明で用いられるＲａｃ阻害剤は、好ましくはＥＨＴ１８６４である。

　培地中のＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質の濃度は、上述の効果を達成可能な範囲で適宜設定することが可能である。鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞を含む細胞の製造効率の観点からは、例えばＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質としてＰＯＲＣＮ阻害剤の１種であるＩＷＰ－２を用いる場合は、その濃度は通常約１０ｎＭ～約５０μＭであり、好ましくは約１０ｎＭ～約３０μＭであり、さらに好ましくは約１００ｎＭ～約１０μＭであり、最も好ましくは約０．５μＭである。ＰＯＲＣＮ阻害剤の１種であるＷｎｔ－Ｃ５９を用いる場合は、その濃度は通常約１０ｎＭ～約３０μＭであり、好ましくは約２０ｎＭ～約１０μＭであり、より好ましくは約５００ｎＭである。ＫＹ０２１１１を用いる場合は、その濃度は通常約１０ｎＭ～約５０μＭであり、好ましくは１０ｎＭ～約３０μＭであり、より好ましくは約１００ｎＭ～約１０μＭであり、さらに好ましくは約５μＭである。

　Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質としてＰＯＲＣＮ阻害剤とＪＮＫ阻害剤を組み合わせて用いる場合、例えばＪＮＫ阻害剤の１種であるＪＮＫ－ＩＮ－８を用いる場合は、その濃度は通常約１０ｎＭ～約５０μＭであり、好ましくは約１０ｎＭ～約３０μＭであり、さらに好ましくは約１００ｎＭ～約１０μＭであり、最も好ましくは約１μＭである。Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質としてＰＯＲＣＮ阻害剤とＲａｃ阻害剤とを組み合わせて用いる場合、例えばＲａｃ阻害剤の１種であるＥＨＴ１８６４を用いる場合は、その濃度は通常約１０ｎＭ～約５０μＭであり、好ましくは約１０ｎＭ～約３０μＭであり、さらに好ましくは約１００ｎＭ～約１０μＭであり、最も好ましくは約１μＭである。

　Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質の添加時期は、通常工程（１）の多能性幹細胞の培養開始より４８時間以内、好ましくは２４時間以内、より好ましくは１２時間以内、さらに好ましくは培養開始と同時である。

　工程（１）の培地中には、ＴＧＦβシグナル伝達経路阻害物質がさらに存在することが好ましい。工程（１）において用いられるＴＧＦβシグナル伝達経路阻害物質としては工程（ａ）で例示したものと同じものが用いられ得る。工程（ａ）及び工程（１）のＴＧＦβシグナル伝達経路阻害物質は同一であっても異なっていてもよいが、好ましくは同一である。

　培地中のＴＧＦβシグナル伝達経路阻害物質の濃度は、上述の効果を達成可能な範囲で適宜設定することが可能である。ＴＧＦβ伝達経路阻害物質としてＳＢ４３１５４２を用いる場合は、通常約１ｎＭ～約１００μＭ、好ましくは約１０ｎＭ～約１００μＭ、より好ましくは約１００ｎＭ～約５０μＭ、さらに好ましくは約５００ｎＭ～約１０μＭの濃度で使用される。また、ＳＢ４３１５４２以外のＴＧＦβシグナル伝達経路阻害物質を使用する場合、上記濃度のＳＢ４３１５４２と同等のＴＧＦβシグナル伝達経路阻害活性を示す濃度で用いられることが望ましい。

　工程（１）及び以降の工程において、中内胚葉への分化を抑制し、鼻腔上皮様組織の製造効率を向上させる観点から、Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ－β－ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｋｉｎａｓｅ　１（ＴＡＫ１）に対する阻害物質を添加することもまた好ましい。ＴＡＫ１は、ＴＧＦβ、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、インターロイキン１（ＩＬ－１）、ＴＮＦ－α等により活性化されるシグナル伝達を媒介する、ＭＡＰキナーゼキナーゼキナーゼ（ＭＡＰＫＫＫ）ファミリーのセリンスレオニンタンパク質キナーゼである。

　ＴＡＫ１阻害物質は、ＴＡＫ１が媒介するシグナル伝達を抑制し得るものである限り限定されない。ＴＡＫ１阻害物質は、核酸、タンパク質、低分子有機化合物のいずれであってもよい。当該物質として例えばＴＡＫ１と基質の結合を阻害する物質、ＴＡＫ１のリン酸化を阻害する物質、ＴＡＫ１の脱リン酸化を促進する物質、ＴＡＫ１の転写や翻訳を阻害する物質、ＴＡＫ１の分解を促進する物質等が挙げられる。

　ＴＡＫ１阻害物質として、例えば（５Ｚ）－７－Ｏｘｏｚｅａｅｎｏｌ（（３Ｓ，５Ｚ，８Ｓ，９Ｓ，１１Ｅ）－３，４，９，１０－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－８，９，１６－ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ－１４－ｍｅｔｈｏｘｙ－３－ｍｅｔｈｙｌ－１Ｈ－２－ｂｅｎｚｏｘａｃｙｃｌｏｔｅｔｒａｄｅｃｉｎ－１，７（８Ｈ）－ｄｉｏｎｅ）、Ｎ－Ｄｅｓ（ａｍｉｎｏｃａｒｂｏｎｙｌ）ＡＺ－ＴＡＫ１　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（３－Ａｍｉｎｏ－５－［４－（４－ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｙｌｍｅｔｈｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］－２－ｔｈｉｏｐｈｅｎｅｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）、Ｔａｋｉｎｉｂ（Ｎ１－（１－Ｐｒｏｐｙｌ－１Ｈ－ｂｅｎｚｉｍｉｄａｚｏｌ－２－ｙｌ）－１，３－ｂｅｎｚｅｎｅｄｉｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）、ＮＧ２５（Ｎ－［４－［（４－Ｅｔｈｙｌ－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ］－３－（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］－４－ｍｅｔｈｙｌ－３－（１Ｈ－ｐｙｒｒｏｌｏ［２，３－ｂ］ｐｙｒｉｄｉｎ－４－ｙｌｏｘｙ）－ｂｅｎｚａｍｉｄｅ　ｔｒｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）及びこれらの誘導体、類縁体が挙げられる。これらの物質は単独で又は複数種を組み合わせて用いてもよい。

　ＴＡＫ１阻害物質は、好ましくは（５Ｚ）－７－Ｏｘｏｚｅａｅｎｏｌである。工程（１）におけるＴＡＫ１阻害物質として（５Ｚ）－７－Ｏｘｏｚｅａｅｎｏｌを用いる場合は、通常約１ｎＭ～約１００μＭ、好ましくは約１０ｎＭ～約５０μＭ、より好ましくは約１００ｎＭ～約２５μＭ、さらに好ましくは約５００ｎＭ～約１０μＭの濃度で使用される。また、（５Ｚ）－７－Ｏｘｏｚｅａｅｎｏｌ以外のＴＡＫ１阻害物質を使用する場合、上記濃度の（５Ｚ）－７－Ｏｘｏｚｅａｅｎｏｌと同等のＴＡＫ１阻害活性を示す濃度で用いられることが好ましい。

　鼻腔上皮様組織に含有される細胞の割合を制御する観点から、上記ＴＡＫ１阻害物質は、工程（１）及び以降の工程の任意の段階で添加することができる。一態様として、得られた細胞集団における嗅上皮を構成する細胞の割合を増加させることを企図するのであれば、工程（１）の開始と同時にＴＡＫ１阻害物質を添加することが好ましい。得られた細胞集団における鼻腔上皮を構成する細胞の割合を増加させることを企図するのであれば、工程（３）の開始と同時、あるいは工程（３）の開始から一定期間以内、例えば工程（３）の開始から１４日間以内にＴＡＫ１阻害物質を添加することが好ましい。

　工程（１）において用いられる培地は、上記定義の項で記載したようなものである限り特に限定されない。工程（１）において用いられる培地は血清培地又は無血清培地であり得る。化学的に未決定な成分の混入を回避する観点から、本発明においては、無血清培地が好適に用いられる。調製の煩雑さを回避するには、例えば市販のＫＳＲ等の血清代替物を適量添加した無血清培地を使用することが好ましい。無血清培地へのＫＳＲの添加量としては、例えばヒトＥＳ細胞の場合は、通常約１％から約３０％であり、好ましくは約２％から約２０％である。無血清培地としては、例えばＩＭＤＭとＦ－１２の１：１の混合液に５％ＫＳＲ、４５０μＭ　１－モノチオグリセロール及び１ｘＣｈｅｍｉｃａｌｌｙ　Ｄｅｆｉｎｅｄ　Ｌｉｐｉｄ　Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅが添加された培地、又はＧＭＥＭに５％～２０％ＫＳＲ、ＮＥＡＡ、ピルビン酸及び２－メルカプトエタノールが添加された培地が挙げられる。

　工程（１）の開始時において、細胞は接着状態又は浮遊状態のいずれでもよい。好ましい一態様として、多能性幹細胞を単一細胞に分散させた後に再凝集させ、浮遊状態の細胞凝集体を形成させる。このために、工程（１）の開始前に、工程（ａ）で得られた多能性幹細胞を単一細胞に分散する操作（工程（ｂ）ともいう。）を行うことが好ましい。分散させる操作により得られた「分散された細胞」は、好ましくは単一細胞であるが、例えば２以上１００以下の少数の細胞からなる細胞の塊を含んでもよく、２以上５０以下の細胞からなる細胞の塊を含んでもよい。「分散された細胞」は、例えば単一細胞を７割以上及び細胞の塊を３割以下含んでいてもよく、好ましくは単一細胞を８割以上及び細胞の塊を２割以下含む。別の一態様として、多能性幹細胞を単一細胞に分散させた後に細胞接着性の培養器材へと播種し、接着状態に培養を実施する。

　多能性幹細胞を分散させる方法としては、機械的分散処理、細胞分散液処理、細胞保護剤添加処理が挙げられ、これらの処理を組み合わせて行ってもよい。細胞を分散させる方法としては、好ましくは細胞保護剤添加処理と同時に細胞分散液処理を行い、次いで機械的分散処理をするとよい。

　細胞保護剤添加処理に用いられる細胞保護剤としては、ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質、ヘパリン、Ｒｈｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅ（ＲＯＣＫ）阻害物質、ミオシン阻害物質、ポリアミン類、統合的ストレス応答（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　ｓｔｒｅｓｓ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ：ＩＳＲ）阻害剤、カスパーゼ阻害剤、血清、又は血清代替物等を挙げることができる。好ましい細胞保護剤としては、ＲＯＣＫ阻害物質が挙げられる。分散により誘導される多能性幹細胞（特に、ヒトの多能性幹細胞）の細胞死を抑制するために、ＲＯＣＫ阻害物質を工程（１）の培養開始時から添加してもよい。ＲＯＣＫ阻害物質としては、Ｙ－２７６３２（（Ｒ）－（＋）－ｔｒａｎｓ－４－（１－Ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）－Ｎ－（４－ｐｙｒｉｄｙｌ）ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ，ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、Ｆａｓｕｄｉｌ（ＨＡ１０７７）（１－（５－Ｉｓｏｑｕｉｎｏｌｉｎｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ）ｈｏｍｏｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ，ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、Ｈ－１１５２（５－［［（２Ｓ）－ｈｅｘａｈｙｄｒｏ－２－ｍｅｔｈｙｌ－１Ｈ－１，４－ｄｉａｚｅｐｉｎ－１－ｙｌ］ｓｕｌｆｏｎｙｌ］－４－ｍｅｔｈｙｌ－ｉｓｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ，ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ＨＡ－１１００（Ｈｙｄｒｏｘｙｆａｓｕｄｉｌ）（［１－（１－Ｈｙｄｒｏｘｙ－５－ｉｓｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ）ｈｏｍｏｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ，ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、Ｃｈｒｏｍａｎ　１（（３Ｓ）－Ｎ－［２－［２－（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｅｔｈｏｘｙ］－４－（１Ｈ－ｐｙｒａｚｏｌ－４－ｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］－６－ｍｅｔｈｏｘｙ－３，４－ｄｉｈｙｄｒｏ－２Ｈ－ｃｈｒｏｍｅｎｅ－３－ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）、Ｂｅｌｕｍｏｓｕｄｉｌ（ＫＤ０２５、２－［３－［４－［（１Ｈ－Ｉｎｄａｚｏｌ－５－ｙｌ）ａｍｉｎｏ］ｑｕｉｎａｚｏｌｉｎ－２－ｙｌ］ｐｈｅｎｏｘｙ］－Ｎ－ｉｓｏｐｒｏｐｙｌａｃｅｔａｍｉｄｅ）、ＨＳＤ１５９０（［２－Ｍｅｔｈｏｘｙ－３－（４，５，１０－ｔｒｉａｚａｔｅｔｒａｃｙｃｌｏ［７．７．０．０２，６．０１２，１６］ｈｅｘａｄｅｃａ－１（９），２（６），３，７，１０，１２（１６）－ｈｅｘａｅｎ－１１－ｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］ｂｏｒｏｎｉｃ　ａｃｉｄ）、ＣＲＴ００６６８５４（（Ｓ）－３－ｐｈｅｎｙｌ－Ｎ１－（２－ｐｙｒｉｄｉｎ－４－ｙｌ－５，６，７，８－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｂｅｎｚｏ［４，５］ｔｈｉｅｎｏ［２，３－ｄ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－４－ｙｌ）ｐｒｏｐａｎｅ－１，２－ｄｉａｍｉｎｅ）、ＲＫＩ１４４７（１－（３－ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｙｌ）－３－（４－（ｐｙｒｉｄｉｎ－４－ｙｌ）ｔｈｉａｚｏｌ－２－ｙｌ）ｕｒｅａ）、Ｒｉｐａｓｕｄｉｌ（４－Ｆｌｕｏｒｏ－５－［［（２Ｓ）－ｈｅｘａｈｙｄｒｏ－２－ｍｅｔｈｙｌ－１Ｈ－１，４－ｄｉａｚｅｐｉｎ－１－ｙｌ］ｓｕｌｆｏｎｙｌ］ｉｓｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ）、ＧＳＫ２６９９６２Ａ（Ｎ－［３－［２－（４－ａｍｉｎｏ－１，２，５－ｏｘａｄｉａｚｏｌ－３－ｙｌ）－１－ｅｔｈｙｌｉｍｉｄａｚｏ［４，５－ｃ］ｐｙｒｉｄｉｎ－６－ｙｌ］ｏｘｙｐｈｅｎｙｌ］－４－（２－ｍｏｒｐｈｏｌｉｎ－４－ｙｌｅｔｈｏｘｙ）ｂｅｎｚａｍｉｄｅ）、ＧＳＫ４２９２８６Ａ（Ｎ－（６－ｆｌｕｏｒｏ－１Ｈ－ｉｎｄａｚｏｌ－５－ｙｌ）－２－ｍｅｔｈｙｌ－６－ｏｘｏ－４－（４－（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ）－１，４，５，６－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｐｙｒｉｄｉｎｅ－３－ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）、Ｙ－３３０７５（（Ｒ）－４－（１－Ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）－Ｎ－１Ｈ－ｐｙｒｒｏｌｏ［２，３－ｂ］ｐｙｒｉｄｉｎ－４－ｙｌｂｅｎｚａｍｉｄｅ）、ＬＸ７１０１（Ｎ，Ｎ－Ｄｉｍｅｔｈｙｌｃａｒｂａｍｉｃ　ａｃｉｄ　３－［［［４－（ａｍｉｎｏｍｅｔｈｙｌ）－１－（５－ｍｅｔｈｙｌ－７Ｈ－ｐｙｒｒｏｌｏ［２，３－ｄ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－４－ｙｌ）－４－ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｙｌ］ｃａｒｂｏｎｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｐｈｅｎｙｌ　ｅｓｔｅｒ）、ＡＴ１３１４８（（ａｌｐｈａＳ）－ａｌｐｈａ－（Ａｍｉｎｏｍｅｔｈｙｌ）－ａｌｐｈａ－（４－ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）－４－（１Ｈ－ｐｙｒａｚｏｌ－４－ｙｌ）ｂｅｎｚｅｎｅｍｅｔｈａｎｏｌ）、ＳＡＲ４０７８９９（６－（ｐｉｐｅｒｉｄｉｎ－４－ｙｌｏｘｙ）ｉｓｏｑｕｉｎｏｌｉｎ－１（２Ｈ）－ｏｎｅ　ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ＧＳＫ１８０７３６Ａ（４－（４－ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）－Ｎ－（１Ｈ－ｉｎｄａｚｏｌ－５－ｙｌ）－６－ｍｅｔｈｙｌ－２－ｏｘｏ－１，２，３，４－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ－５－ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）、Ｈｙｄｒｏｘｙｆａｓｕｄｉｌ（１－（１－ｈｙｄｒｏｘｙ－５－ｉｓｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ）ｈｏｍｏｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ，ＨＣｌ）、ｂｄｐ５２９０（４－Ｃｈｌｏｒｏ－１－（４－ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｙｌ）－Ｎ－［３－（２－ｐｙｒｉｄｉｎｙｌ）－１Ｈ－ｐｙｒａｚｏｌ－４－ｙｌ］－１Ｈ－ｐｙｒａｚｏｌｅ－３－ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）、ｓｒ－３６７７（Ｎ－［２－［２－（Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｅｔｈｏｘｙ］－４－（１Ｈ－ｐｙｒａｚｏｌ－４－ｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ－２，３－ｄｉｈｙｄｒｏ－１，４－ｂｅｎｚｏｄｉｏｘｉｎ－２－ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ＣＣＧ－２２２７４０（Ｎ－（４－Ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）－５，５－ｄｉｆｌｕｏｒｏ－１－（３－（ｆｕｒａｎ－２－ｙｌ）ｂｅｎｚｏｙｌ）ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ－３－ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）、ＲＯＣＫ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ－２（Ｎ－［（１Ｒ）－１－（３－ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｅｔｈｙｌ］－４－ｐｙｒｉｄｉｎ－４－ｙｌｂｅｎｚａｍｉｄｅ）、Ｒｈｏ－Ｋｉｎａｓｅ－ＩＮ－１（Ｎ－［１－［（４－ｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆａｎｙｌｐｈｅｎｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ］ｐｉｐｅｒｉｄｉｎ－３－ｙｌ］－１Ｈ－ｉｎｄａｚｏｌ－５－ａｍｉｎｅ）、ＺＩＮＣ００８８１５２４（Ｎ－（４，５－ｄｉｈｙｄｒｏｎａｐｈｔｈｏ［１，２－ｄ］ｔｈｉａｚｏｌ－２－ｙｌ）－２－（３，４－ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ａｃｅｔａｍｉｄｅ）、ＳＢ７７２０７７Ｂ（（３Ｓ）－１－［［２－（４－Ａｍｉｎｏ－１，２，５－ｏｘａｄｉａｚｏｌ－３－ｙｌ）－１－ｅｔｈｙｌ－１Ｈ－ｉｍｉｄａｚｏ［４，５－ｃ］ｐｙｒｉｄｉｎ－７－ｙｌ］ｃａｒｂｏｎｙｌ］－３－ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎａｍｉｎｅ　ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、Ｖｅｒｏｓｕｄｉｌ（Ｎ－（１，２－Ｄｉｈｙｄｒｏ－１－ｏｘｏ－６－ｉｓｏｑｕｉｎｏｌｉｎｙｌ）－ａｌｐｈａ－（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）－３－ｔｈｉｏｐｈｅｎｅａｃｅｔａｍｉｄｅ）、ＧＳＫ－２５（４－（４－ｃｈｌｏｒｏ－２－ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）－２－（２－ｃｈｌｏｒｏｐｙｒｉｄｉｎ－４－ｙｌ）－１－（６－ｆｌｕｏｒｏ－１Ｈ－ｉｎｄａｚｏｌ－５－ｙｌ）－６－ｍｅｔｈｙｌ－４Ｈ－ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ－５－ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）及びこれらの誘導体等を挙げることができる。上記化合物等がＲＯＣＫ阻害剤としての活性を有することは、例えばＪ　Ｍｅｄ　Ｃｈｅｍ．　２０１６　Ｍａｒ　２４；５９（６）：２２６９－３００．及びＪｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ　２０２１：１３　１９７－２１２等に記載されており、当業者にとって公知である。細胞保護剤としては、調製済みの細胞保護剤を用いることもできる。調製済みの細胞保護剤としては、例えばＲｅｖｉｔａＣｅｌｌ　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、ＣｌｏｎｅＲ、ＣｌｏｎｅＲ２（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）が挙げられる。これらの物質は単独で又は複数種を組み合わせて用いてもよい。工程（１）において、細胞保護剤としてＲＯＣＫ阻害物質であるＹ－２７６３２を添加する場合は、通常１ｎＭから１００ｍＭ、好ましくは１０ｎＭから１０ｍＭ、より好ましくは１μＭから１００μＭの濃度となるように培養環境中に添加する。工程（１）において、細胞保護剤としてＲＯＣＫ阻害物質であるＣｈｒｏｍａｎ　１を添加する場合は、通常１０ｐＭから１ｍＭ、好ましくは１００ｐＭから１００μＭ、より好ましくは１ｎＭから１０μＭの濃度となるように培養環境中に添加する。調製済みの細胞保護剤を用いる場合は、製品に添付される使用説明書に記載の濃度を中心に、例えばその１００分の１から１００倍の濃度、好ましくはその１０分の１から１０倍の濃度、より好ましくはその３分の１から３倍の濃度で使用することができる。

　細胞分散液処理に用いられる細胞分散液としては、トリプシン、コラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼ、エラスターゼ、プロナーゼ、ＤＮａｓｅ、パパイン等の酵素及びエチレンジアミン四酢酸等のキレート剤の少なくとも１つを含む溶液を挙げることができる。市販の細胞分散液、例えばＴｒｉｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）やＴｒｉｐＬＥ　Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、Ａｃｃｕｍａｘ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ　Ｃｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いることもできる。工程（ｂ）における好ましい細胞分散液は、５ｍＭのＥＤＴＡを添加したリン酸緩衝液であるが、これに限定されない。

　機械的分散処理の方法としては、ピペッティング処理又はスクレーパーでの掻き取り操作が挙げられる。分散された細胞は上記培地中に懸濁される。

　多能性幹細胞を分散させる方法としては、例えば多能性幹細胞のコロニーをＲＯＣＫ阻害物質の存在下で、エチレンジアミン四酢酸又はＡｃｃｕｍａｘで処理し、さらにピペッティングにより分散させる方法が挙げられる。

　工程（１）において浮遊培養を実施する場合は、分散された多能性幹細胞の懸濁液を非細胞接着性の培養器材中に播種する。培養器材が非接着性である場合、細胞は浮遊培養され、複数の多能性幹細胞が集合して細胞凝集体を形成する。

　浮遊培養する際、分散された多能性幹細胞を、１０ｃｍディッシュのような比較的大きな培養器材に播種することにより、１つの培養器材中に複数の細胞凝集体を同時に形成させてもよい。細胞凝集体ごとの大きさのばらつきを生じにくくする観点からは、例えば非細胞接着性の９６ウェルマイクロプレートのようなマルチウェルプレート（Ｕ底、Ｖ底）の各ウェルに一定数の分散された多能性幹細胞を播種することが好ましい。これを静置培養すると、細胞が迅速に凝集することにより、各ウェルに１個の細胞凝集体を形成させることができる。例えば培養器材の表面に超親水性のポリマーをコートする等の加工により培養器材を非細胞接着性とすることができる。非細胞接着性のマルチウェルプレートとしては、例えばＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ　９６Ｖ底プレート（ＭＳ－９０９６Ｖ、住友ベークライト株式会社製）等が挙げられる。より迅速に細胞凝集体を形成させるために遠心操作を行ってもよい。各ウェルで形成された細胞凝集体を複数のウェルから回収することにより、均一な細胞凝集体の集団を得ることができる。細胞凝集体が均一であれば、その後の工程において、ウェルごと及び反復実験ごとの製造効率をより安定させることができ、より再現性よく鼻腔上皮を構成する細胞を製造することができる。

　分散された多能性幹細胞から細胞凝集体を形成させるための別の態様としては、一つのウェルが複数のマイクロウェルに分割され、２つ以上の細胞塊が形成される培養器材を用いることができる。言い換えると、本実施形態の一側面において、前記工程（１）、及び工程（２）から（４）のうち任意の工程の浮遊培養を、少なくとも１つのウェルが形成されている培養器材中で実施し、前記ウェルは、複数のマイクロウェルに分割されていて、前記マイクロウェルの１つにつき、１つの細胞塊が形成されるように浮遊培養を実施し、１つのウェルにつき分割されたマイクロウェルに相当する数の細胞塊を調製してもよい。上記マイクロウェルとして、細胞が底面の一ヶ所に沈降して細胞凝集体の形成が促進されるすり鉢、下向きの四角錐、凹状等の加工、グリッド、隆起等が複数形成されている培養器材、又は細胞凝集体を形成しやすいように底面の一部のみに細胞が接着可能な加工を施されている培養器材等が挙げられる。マイクロウェルを有する培養器材のウェル一つ当たりの培養面積は特に限定されないが、細胞塊を効率よく生産する観点から、好ましくは底面積が１ｃｍ^２（４８ウェルプレート相当）より大きく、より好ましくは２ｃｍ^２（２４ウェルプレート相当）より大きく、さらに好ましくは４ｃｍ^２（１２ウェルプレート相当）より大きい。上記のような培養器材としては、例えば胚様体形成プレートＡｇｇｒｅＷｅｌｌ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ＰＡＭＣＥＬＬ（ＡＮＫ社製）、スフェロイドマイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）、ＮａｎｏＣｕｌｔｕｒｅ　Ｐｌａｔｅ／Ｄｉｓｈ（Ｏｒｇａｎｏｇｅｎｉｘ社製）、Ｃｅｌｌ－ａｂｌｅ（東洋合成社製）、ＥＺＳＰＨＥＲＥ（ＡＧＣテクノグラス社製）、ＳＰＨＥＲＩＣＡＬＰＬＡＴＥ　５Ｄ（水戸工業社製）、ＴＡＳＣＬ（シムスバイオ社製）、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　ｒｅｐｏｒｔｓ，　２０２２，　１２．１：　１－１１．に記載のマイクロウェルバッグ等が挙げられるが、これらに限定されない。

　培養器材としては、各ウェル内に細胞凝集体が入ったままの状態でプレート全体の培地を一度に交換することが可能な三次元細胞培養容器を用いることもまた好ましい。このような三次元細胞培養容器としては、例えばＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ　９６スリットウェルプレート（住友ベークライト株式会社製）等が挙げられる。このプレートには９６ウェルのそれぞれの上部に培地が出入りできる細い開口部（スリット）が設けられている。スリットは細胞凝集体が通過しにくい幅に設定されているため、細胞凝集体同士の癒着を防止しながら、プレート全体の培地を一度に交換することができ、操作の効率性及び細胞凝集体の質を向上させることができる。

　工程（１）における多能性幹細胞の濃度（密度）は、細胞凝集体をより均一に、効率的に形成させるように適宜設定することができる。例えば９６ウェルマイクロウェルプレートを用いてヒト多能性幹細胞（例えば工程（ａ）から得られたヒトｉＰＳ細胞）を浮遊培養する場合、１ウェルあたり通常約１×１０^３から約１×１０^５細胞、好ましくは約３×１０^３から約５×１０^４細胞、より好ましくは約４×１０^３から約２×１０^４細胞、さらに好ましくは約４×１０^３から約１．６×１０^４細胞、特に好ましくは約８×１０^３から約１．２×１０^４細胞となるように調製した液を各ウェルに添加し、プレートを静置、または遠心して細胞凝集体を形成させる。例えば１ディッシュあたり約２６０個のマイクロウェルを有する培養器材であるＥＺＳＰＨＥＲＥ　ＳＰ　ディッシュ３５ｍｍ　Ｔｙｐｅ９０５を用いてヒト多能性幹細胞（例えば工程（ａ）から得られたヒトｉＰＳ細胞）を浮遊培養する場合、１ディッシュあたり通常約１×１０^４から約１×１０^８細胞、好ましくは約３×１０^４から約５×１０^７細胞、より好ましくは約４×１０^４から約２×１０^７細胞、さらに好ましくは約４×１０^４から約１．６×１０^７細胞、特に好ましくは約８×１０^４から約１．２×１０^７細胞となるように調製した液をディッシュに添加し、ディッシュを静置して細胞凝集体を形成させる。例えば１ウェルあたり約１８００個のマイクロウェルを有する培養器材であるＡｇｇｒｅＷｅｌｌ　８００，　６－ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅを用いてヒト多能性幹細胞（例えば工程（ａ）から得られたヒトｉＰＳ細胞）を浮遊培養する場合、１ウェルあたり通常約１×１０^４から約１×１０^８細胞、好ましくは約３×１０^４から約５×１０^７細胞、より好ましくは約４×１０^４から約２×１０^７細胞、さらに好ましくは約４×１０^４から約１．６×１０^７細胞、特に好ましくは約８×１０^４から約１．２×１０^７細胞となるように調製した液を各ウェルに添加し、プレートを遠心して細胞凝集体を形成させる。播種する細胞数は、例えば血球計算盤等で計数することによって求めることができる。

　細胞凝集体を形成させるために必要な浮遊培養の時間は、用いる多能性幹細胞によって適宜決定可能であるが、均一な細胞凝集体を形成するためにはできる限り短時間であることが望ましい。分散された細胞が、細胞凝集体が形成されるに至るまでの工程は、細胞が集合する工程、及び集合した細胞が凝集体を形成する工程にわけられる。分散された細胞を播種する時点（すなわち浮遊培養開始時）から細胞が集合するまでは、例えばヒト多能性幹細胞（ヒトｉＰＳ細胞等）の場合には、好ましくは約２４時間以内、より好ましくは約１２時間以内である。分散された細胞を播種する時点（すなわち浮遊培養開始時）から細胞凝集体が形成されるまでは、例えばヒト多能性幹細胞（ヒトｉＰＳ細胞等）の場合には、好ましくは約７２時間以内、より好ましくは約４８時間以内である。細胞凝集体を形成するまでの時間は、細胞を凝集させる用具や、遠心条件等を調整することにより適宜調節することが可能である。

　多能性幹細胞を迅速に集合させて細胞凝集体を形成させると、形成された凝集体から分化誘導される細胞は上皮様構造を再現性よく形成させることができる。細胞凝集体を形成させる実験的な操作としては、例えばウェルの小さなプレート（例えばウェルの底面積が平底換算で０．１～２．０ｃｍ^２程度のプレート）やマイクロポア等を用いて小さいスペースに細胞を閉じ込める方法、小さな遠心チューブを用いて短時間遠心することで細胞を凝集させる方法が挙げられる。ウェルの小さなプレートとして、例えば２４ウェルプレート（面積が平底換算で１．８８ｃｍ^２程度）、４８ウェルプレート（面積が平底換算で１．０ｃｍ^２程度）、９６ウェルプレート（面積が平底換算で０．３５ｃｍ^２程度、内径６～８ｍｍ程度）、３８４ウェルプレートが挙げられる。好ましくは９６ウェルプレートが挙げられる。ウェルの小さなプレートの形状として、ウェルを上から見たときの底面の形状としては、多角形、長方形、楕円、真円が挙げられ、好ましくは真円が挙げられる。ウェルの小さなプレートの形状として、ウェルを横から見たときの底面の形状としては、外周部が高く内部が低くくぼんだ構造が好ましく、例えばＵ底、Ｖ底、Ｍ底が挙げられ、好ましくはＵ底又はＶ底、最も好ましくはＶ底が挙げられる。ウェルの小さなプレートとして、細胞培養皿（例えば６０ｍｍ～１５０ｍｍディッシュ、カルチャーフラスコ）の底面に凹凸又はくぼみがあるものを用いてもよい。ウェルの小さなプレートの底面は、細胞非接着性の底面、好ましくは細胞非接着性コートした底面を用いるのが好ましい。別の態様として、例えば紐状の細胞凝集体を形成させる場合は、例えば断面がＶ字状、Ｕ字状等である細長いレーンを有した培養器材中に細胞を播種し、細胞凝集体を形成させることができる。

　細胞凝集体を形成させる別の手法として、立体印刷機、３Ｄプリンターを用いることもまた好ましい。分散された単一の細胞もしくは複数の細胞から構成されるスフェロイドを、生体適合性を有するインク（バイオインク）に懸濁し、バイオ３Ｄプリンター（例えばＣｅｌｌｉｎｋ社製　ＢＩＯ　Ｘ等）で出力する、又は細胞塊をニードルに刺して積み上げる（サイフューズ社製　Ｓｐｉｋｅ等）といった手法により、所望の形態の細胞凝集体を調製することができる。

　細胞凝集体が形成されたことは、細胞凝集体のサイズ及び細胞数、巨視的形態、組織染色解析による微視的形態及びその均一性、分化及び未分化マーカーの発現及びその均一性、分化マーカーの発現制御及びその同期性、分化効率の凝集体間の再現性等に基づき判断することが可能である。

　工程（１）の開始時において、別の好ましい一態様として、接着培養を実施する。工程（ａ）後の培養器材上の多能性幹細胞をそのまま工程（１）に用いてもよいし、多能性幹細胞を単一細胞に分散させた後に再度接着性の培養器材に播種してもよい。多能性幹細胞の単一細胞への分散後の再播種を実施する際に、適切な細胞外マトリクス又は合成細胞接着分子を足場として用いてもよい。足場により、表面をコーティングした培養器材中で、多能性幹細胞を接着培養できる。細胞外マトリクスは、好ましくはマトリゲル又はラミニンである。合成細胞接着分子としては、ポリ－Ｄ－リジン、ＲＧＤ配列等細胞接着性のドメインを含有する合成ペプチド等が挙げられる。工程（１）における多能性幹細胞の濃度（密度）は、培養器材上に形成される組織をより均一に、効率的に形成させるように適宜設定することができる。例えば９６ウェル平底マイクロウェルプレートを用いてヒト多能性幹細胞（例えば工程（ａ）から得られたヒトＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞）を接着培養する場合、１ウェルあたり通常約１×１０^２から約１×１０^５細胞、好ましくは約２×１０^２から約５×１０^４細胞、より好ましくは約５×１０^２から約２×１０^４細胞となるように調製した液を各ウェルに添加し、プレートを静置して細胞を接着させ、以降の培養操作を実施する。本実施形態の一側面において、細胞の播種数としては鼻腔上皮への分化が生じる限り特に限定されないが、細胞間の接着と相互作用を再現する観点から、培養器材への播種後７２時間以内に細胞密度が器材の培養スペースの６割以上に相当するサブコンフルエントに到達するような密度であってもよい。

　接着性の培養器材として、マイクロパターンが施された培養器材を用いることもまた好ましい。培養器材上のマイクロパターンは、細胞接着性領域と細胞非接着性領域から構成することができ、細胞接着性領域で細胞が接着培養されることが好ましい。細胞接着性領域と細胞非接着性領域の形状は、培養器材上に展開可能である限り限定されない。細胞接着性領域と細胞非接着性領域は、一つの培養器材上に単一の領域が形成されていてもよいし、複数個形成されていてもよい。細胞接着性領域は、接着性を向上させる目的で人工的に処理されていることが好ましい。マイクロパターンが施された培養器材としては、例えばＣＹＴＯＯｃｈｉｐ（ＣＹＴＯＯ社製）、ｉｂｉｄｉ　Ｍｉｃｒｏｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ（ｉｂｉｄｉ社製）等が挙げられる。ＰＤＭＳ製モールドとマトリクス等を用いて培養器材を調製することもできる。工程（ａ）で得られた多能性幹細胞をマイクロパターンが施された培養器材上で培養する場合、例えば既報の方法を参照し実施することができる（Ｎａｔｕｒｅ　ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，１１（１１），２２２３－２２３２．）。マイクロパターンが施された培養器材への細胞の播種数としては鼻腔上皮への分化が生じる限り特に限定されないが、細胞間の接着と相互作用を再現する観点から、培養器材への播種後７２時間以内に細胞密度が器材のマイクロパターン上の培養スペースの６割以上に相当するサブコンフルエントに到達するような密度であることもまた好ましい。

　培養器材が培地の灌流を行なうための流路（マイクロ流路）を有することも好ましく、工程（１）及びその後の工程において、灌流環境下で細胞を培養してもよい。このような培養器材をマイクロ流体チップともいう。培養器材（例えばマイクロ流体チップ）は、本発明の製造方法において培養される細胞以外の細胞又は組織を培養する他の培養器材（例えばマイクロ流体チップ）と連結部により接続されていてもよい。連結部は、例えば流路となっていてもよい。これにより、鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞及びこれらを含む細胞集団と、他の細胞又は組織との相互作用を再現することができる。鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞及びこれらを含む細胞集団と共培養する他の細胞又は組織としては、例えば気管、気管支、肺、肝臓、脳及び中枢神経系、血管、肝臓、腎臓、咽喉、口腔上皮、胃、小腸、大腸の細胞及び組織等が挙げられるが、これらに限定されない。

　培養器材は、酸素又は培地を透過可能な膜を有してもよい。培養器材は、化合物、増殖因子等の濃度勾配を形成可能であってもよい。膜は、例えば多孔質膜である。このような膜を有する培養器材においては、膜で隔てた一方で本発明の製造方法によって細胞を培養し、他方でそれ以外の細胞又は組織、フィーダー細胞などを培養することができる。これにより、鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞及びこれらを含む細胞集団と、他の細胞又は組織とをコンタミネーションさせることなく培養することができる。

　工程（１）及び以降の工程において、培地交換操作を行う場合、例えば元ある培地を捨てずに新しい培地を加える操作（培地添加操作）、元ある培地を半量程度（元ある培地の体積量の３０～９０％程度、例えば４０～６０％程度）捨てて新しい培地を半量程度（元ある培地の体積量の３０～９０％、例えば４０～６０％程度）加える操作（半量培地交換操作）、元ある培地を全量程度（元ある培地の体積量の９０％以上）捨てて新しい培地を全量程度（元ある培地の体積量の９０％以上）加える操作（全量培地交換操作）が挙げられる。

　ある時点で、特定の成分を添加する場合、例えば終濃度を計算した上で、元ある培地を半量程度捨てて、特定の成分を終濃度よりも高い濃度で含む新しい培地を半量程度加える操作（半量培地交換操作）を行ってもよい。ある時点で、元の培地に含まれる成分を希釈して濃度を下げる場合、例えば培地交換操作を、１日に複数回、好ましくは１時間以内に複数回（例えば２～３回）行ってもよい。また、ある時点で、元の培地に含まれる成分を希釈して濃度を下げる場合、細胞又は細胞凝集体を別の培養容器に移してもよい。培地交換操作に用いる道具は特に限定されないが、例えばピペッター、ピペットマン（登録商標）、マルチチャンネルピペット、連続分注器等が挙げられる。例えば培養器材として９６ウェルプレートを用いる場合、マルチチャンネルピペットを使ってもよい。

　工程（１）における培養の時間は、通常８時間～６日間程度、好ましくは１２時間～４８時間程度である。

　細胞の分化の方向性の制御、並びに、細胞又は組織の生存及び増殖を促進する観点から、工程（１）～（３）のいずれか１つ以上の工程を、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質の存在下で行うこともできる。前述の通り、Ｗｎｔシグナル伝達経路として古典的Ｗｎｔ経路、非古典的Ｗｎｔ経路等が挙げられる。

　Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質とはＷｎｔファミリー・タンパク質により惹起されるシグナル伝達を活性化し得るものである限り限定されない。Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質は、核酸、タンパク質、低分子有機化合物のいずれであってもよい。当該物質として例えば、Ｗｎｔの自己分泌を促進する物質、Ｗｎｔを安定化させて分解を抑制する物質、Ｗｎｔの組換えタンパク質、Ｗｎｔの部分配列ペプチド及びその派生物や誘導体、Ｗｎｔ受容体に作用し活性化させる物質、Ｗｎｔの細胞内シグナル伝達機構を活性化させる物質、Ｗｎｔの細胞内シグナル伝達因子及びその改変体（β－Ｃａｔｅｎｉｎ　Ｓ３３Ｙ等）、Ｗｎｔ応答配列下流の遺伝子発現を活性化させる物質等を挙げることができる。Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質として知られているタンパク質として、Ｗｎｔ、Ｒ－スポンジンが挙げられる。

　Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質としてＷｎｔの組換えタンパク質を用いる場合は、由来は特に限定されず、対象の細胞に対し活性を有する限り各種生物由来のＷｎｔタンパク質を用いることができる。中でも、哺乳動物由来のＷｎｔタンパク質であることが好ましい。哺乳動物としては、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ブタ、ウサギ等が挙げられる。より好ましくは、本発明に係る細胞集団の製造に用いられる多能性幹細胞と同種に由来する組換えタンパク質である。哺乳動物のＷｎｔタンパク質としては、例えばＷｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ８ｂ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ９ｂ、Ｗｎｔ１０ａ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｗｎｔ１１、Ｗｎｔ１６等が挙げられるがこれに限定されない。本発明に係る細胞集団の製造において、Ｗｎｔタンパク質は複数種を組み合わせて用いてもよい。本発明に係る細胞集団の製造に用いることができるＷｎｔの組換えタンパク質は、例えばＲ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社、富士フイルム和光純薬社から入手が可能である。

　本発明に係る細胞集団の製造において、Ｗｎｔの組換えタンパク質を培地中で安定させ、活性を維持する観点から、アファミンを添加することもまた好ましい。アファミンはアルブミンファミリーに属する糖タンパク質であり、疎水性の高いＷｎｔのタンパク質の凝集及び不活性化を抑制し、活性を維持することが知られている。アファミンの組換えタンパク質は、例えばＲ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社から入手が可能である。アファミンとＷｎｔの組換えタンパク質との混合物は、ＭＢＬライフサイエンス社から入手が可能である。

　Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質として用いることができるＲ－スポンジンとしては、Ｒ－スポンジン１、Ｒ－スポンジン２、Ｒ－スポンジン３及びＲ－スポンジン４からなるＲ－スポンジンファミリーに属するタンパク質が挙げられる。Ｒ－スポンジンファミリーは、分泌タンパク質であり、Ｗｎｔシグナル伝達経路の活性化及び制御に関わることが知られている。本発明に係る細胞集団の製造において、Ｒ－スポンジンを複数種組み合わせて用いてもよい。本発明に係る細胞集団の製造に用いることができるＲ－スポンジンの組換えタンパク質は、例えばＲ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社、富士フイルム和光純薬社から入手が可能である。

　Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質として、当業者に周知の化合物を使用することもできる。Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質としての活性を有する化合物として、例えばＧＳＫ３βに対する阻害活性を有する化合物、Ｗｎｔ脱アシル化酵素に対する阻害活性を有する化合物、ＡＡＫ１に対する阻害活性を有する化合物等が挙げられる。上記のような活性を有する化合物として、例えば塩化リチウム、ＳＧＣ　ＡＡＫ１　１（Ｎ－（６－（３－（（Ｎ，Ｎ－ｄｉｅｔｈｙｌｓｕｌｆａｍｏｙｌ）ａｍｉｎｏ）ｐｈｅｎｙｌ）－１Ｈ－ｉｎｄａｚｏｌ－３－ｙｌ）ｃｙｃｌｏｐｒｏｐａｎｅｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）、Ｆｏｘｙ　５（Ｎ－ｆｏｒｍｙｌ－Ｌ－ｍｅｔｈｉｏｎｙｌ－Ｌ－ａｌｐｈａ－ａｓｐａｒｔｙｌ－ｇｌｙｃｙｌ－Ｌ－ｃｙｓｔｅｉｎｙｌ－Ｌ－ａｌｐｈａ－ｇｌｕｔａｍｙｌ－Ｌ－ｌｅｕｃｉｎｅ）、ＣＨＩＲ９９０２１（６－［２－［４－（２，４－Ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）－５－（４－ｍｅｔｈｙｌ－１Ｈ－ｉｍｉｄａｚｏｌ－２－ｙｌ）ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－２－ｙｌａｍｉｎｏ］ｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ］ｐｙｒｉｄｉｎｅ－３－ｃａｒｂｏｎｉｔｒｉｌｅ）、ＣＨＩＲ９８０１４（Ｎ６－［２－［［４－（２，４－Ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）－５－（１Ｈ－ｉＭｉｄａｚｏｌ－２－ｙｌ）－２－ｐｙｒｉＭｉｄｉｎｙｌ］ａＭｉｎｏ］ｅｔｈｙｌ］－３－ｎｉｔｒｏ－２，６－ｐｙｒｉｄｉｎｅｄｉａＭｉｎｅ）、ＴＷＳ１１９（３－［６－（３－ａｍｉｎｏ－ｐｈｅｎｙｌ）－７Ｈ－ｐｙｒｒｏｌｏ［２，３－Ｄ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－４－ｙｌｏｘｙ］－ｐｈｅｎｏｌ）、ＳＢ２１６７６３（３－（２，４－ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）－４－（１－ｍｅｔｈｙｌ－１Ｈ－ｉｎｄｏｌ－３－ｙｌ）－２，５－ｄｉｈｙｄｒｏ－１Ｈ－ｐｙｒｒｏｌｅ－２，５－ｄｉｏｎｅ）、ＳＢ４１５２８６（３－［（３－ｃｈｌｏｒｏ－４－ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ａｍｉｎｏ］－４－（２－ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）－１Ｈ－ｐｙｒｒｏｌ－２，５－ｄｉｏｎｅ）、ＢＩＯ（（２Ｚ，３Ｅ）－６－ｂｒｏｍｏｉｎｄｉｒｕｂｉｎ－３－ｏｘｉｍｅ）、ＡＺＤ２８５８（３－Ａｍｉｎｏ－６－［４－［（４－ｍｅｔｈｙｌ－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ）ｓｕｌｆｏｎｙｌ］ｐｈｅｎｙｌ］－Ｎ－３－ｐｙｒｉｄｉｎｙｌ－ｐｙｒａｚｉｎｅｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）、ＡＺＤ１０８０（２－Ｈｙｄｒｏｘｙ－３－（５－（ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｍｅｔｈｙｌ）ｐｙｒｉｄｉｎ－２－ｙｌ）－１Ｈ－ｉｎｄｏｌｅ－５－ｃａｒｂｏｎｉｔｒｉｌｅ）、ＡＲ－Ａ０１４４１８（Ｎ－（４－Ｍｅｔｈｏｘｙｂｅｎｚｙｌ）－ｎ－（５－ｎｉｔｒｏ－１，３－ｔｈｉａｚｏｌ－２－ｙｌ）ｕｒｅａ）、ＴＤＺＤ－８（４－Ｂｅｎｚｙｌ－２－ｍｅｔｈｙｌ－１，２，４－ｔｈｉａｄｉａｚｏｌｉｄｉｎｅ－３，５－ｄｉｏｎｅ）、ＬＹ２０９０３１４（７－（２，５－Ｄｉｈｙｄｒｏ－４－ｉｍｉｄａｚｏ［１，２－ａ］ｐｙｒｉｄｉｎ－３－ｙｌ－２，５－ｄｉｏｘｏ－１Ｈ－ｐｙｒｒｏｌ－３－ｙｌ）－９－ｆｌｕｏｒｏ－１，２，３，４－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－２－（１－ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｙｌｃａｒｂｏｎｙｌ）ｐｙｒｒｏｌｏ［３，２，１－ｊｋ］［１，４］ｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅ）、ＩＭ－１２（３－（４－ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｅｔｈｙｌａＭｉｎｏ）－１－Ｍｅｔｈｙｌ－４－（２－Ｍｅｔｈｙｌ－１Ｈ－ｉｎｄｏｌ－３－ｙｌ）－１Ｈ－ｐｙｒｒｏｌｅ－２，５－ｄｉｏｎｅ）、Ｉｎｄｉｒｕｂｉｎ（［２，３－Ｂｉｉｎｄｏｌｉｎｙｌｉｄｅｎｅ］－２，３－ｄｉｏｎｅ）、Ｂｉｋｉｎｉｎ（４－（（５－Ｂｒｏｍｏ－２－ｐｙｒｉｄｉｎｙｌ）ａｍｉｎｏ）－４－ｏｘｏｂｕｔａｎｏｉｃ　ａｃｉｄ）、Ａ－１０７０７２２（１－（７－Ｍｅｔｈｏｘｙｑｕｉｎｏｌｉｎ－４－ｙｌ）－３－［６－（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌ）ｐｙｒｉｄｉｎ－２－ｙｌ］ｕｒｅａ）、３Ｆ８（５－Ｅｔｈｙｌ－７，８－ｄｉｍｅｔｈｏｘｙ－１Ｈ－ｐｙｒｒｏｌｏ［３，４－ｃ］ｉｓｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ－１，３（２Ｈ）－ｄｉｏｎｅ）、Ｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ（９－Ｂｒｏｍｏ－７，１２－ｄｉｈｙｄｒｏ－ｉｎｄｏｌｏ［３，２－ｄ］［１］ｂｅｎｚａｚｅｐｉｎ－６（５Ｈ）－ｏｎｅ）、１０Ｚ－Ｈｙｍｅｎｉａｌｄｉｓｉｎｅ（（４Ｚ）－４－（２－Ａｍｉｎｏ－１，５－ｄｉｈｙｄｒｏ－５－ｏｘｏ－４Ｈ－ｉｍｉｄａｚｏｌ－４－ｙｌｉｄｅｎｅ）－２－ｂｒｏｍｏ－４，５，６，７－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－ｐｙｒｒｏｌｏ［２，３－ｃ］ａｚｅｐｉｎ－８（１Ｈ）－ｏｎｅ）、Ｉｎｄｉｒｕｂｉｎ－３’－ｏｘｉｍｅ（３－［１，３－ｄｉｈｙｄｒｏ－３－（ｈｙｄｒｏｘｙｉｍｉｎｏ）－２Ｈ－ｉｎｄｏｌ－２－ｙｌｉｄｅｎｅ］－１，３－ｄｉｈｙｄｒｏ－２Ｈ－ｉｎｄｏｌ－２－ｏｎｅ）、ＮＳＣ　６９３８６８（１Ｈ－ｐｙｒａｚｏｌｏ［３，４－ｂ］ｑｕｉｎｏｘａｌｉｎ－３－ａｍｉｎｅ）、ＴＣ－Ｇ　２４（Ｎ－（３－Ｃｈｌｏｒｏ－４－ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌ）－５－（４－ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）－１，３，４－ｏｘａｄｉａｚｏｌ－２－ａｍｉｎｅ）、ＴＣＳ　２００２（２－Ｍｅｔｈｙｌ－５－［３－［４－（ｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｉｎｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］－５－ｂｅｎｚｏｆｕｒａｎｙｌ］－１，３，４－ｏｘａｄｉａｚｏｌｅ）、ＴＣＳ　２１３１１（３－［５－［４－（２－Ｈｙｄｒｏｘｙ－２－Ｍｅｔｈｙｌ－１－ｏｘｏｐｒｏｐｙｌ）－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ］－２－（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏＭｅｔｈｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］－４－（１Ｈ－ｉｎｄｏｌ－３－ｙｌ）－１Ｈ－ｐｙｒｒｏｌｅ－２，５－ｄｉｏｎｅ）、ＣＰ２１Ｒ７（３－（３－Ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌ）－４－（１－ｍｅｔｈｙｌ－１Ｈ－ｉｎｄｏｌ－３－ｙｌ）ｐｙｒｒｏｌｅ－２，５－ｄｉｏｎｅ）、ＢＭＬ－２８４（ＡＭＢＭＰ　ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、Ｎ４－（１，３－ｂｅｎｚｏｄｉｏｘｏｌ－５－ｙｌｍｅｔｈｙｌ）－６－（３－ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）－２，４－ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅｄｉａｍｉｎｅ　ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ＳＫＬ２００１（Ｎ－（３－（１Ｈ－ｉｍｉｄａｚｏｌ－１－ｙｌ）ｐｒｏｐｙｌ）－５－（ｆｕｒａｎ－２－ｙｌ）ｉｓｏｘａｚｏｌｅ－３－ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）、ＷＡＹ－２６２６１１（１－［４－（２－Ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｙｌ）－２－ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｙｌ］－４－ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅｍｅｔｈａｎａｍｉｎｅ）、ＩＩＩＣ３ａ（９－Ｃａｒｂｏｘｙ－３－（ｄｉｍｅｔｈｙｌｉｍｉｎｉｏ）－６，７－ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ－１０－ｍｅｔｈｙｌ－３Ｈ－ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎ－１０－ｉｕｍ　ｉｏｄｉｄｅ）、Ｍｅｔｈｙｌ　Ｖａｎｉｌｌａｔｅ、ＩＱ－１（２－［（４－Ａｃｅｔｙｌｐｈｅｎｙｌ）ａｚｏ］－２－（３，４－ｄｉｈｙｄｒｏ－３，３－ｄｉＭｅｔｈｙｌ－１（２Ｈ）－ｉｓｏｑｕｉｎｏｌｉｎｙｌｉｄｅｎｅ）ａｃｅｔａＭｉｄｅ）及びこれらの誘導体等が挙げられる。

　工程（１）において、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質を添加しているが、作用点の異なるＷｎｔシグナル伝達経路作用物質とＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質を併用することで、前述の複数あるＷｎｔシグナル伝達経路のうち特定の経路のみを活性化、あるいは阻害することができる。Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質は、工程（１）にて添加するＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質の下流の因子に作用する物質であることが好ましい。添加するＷｎｔシグナル伝達経路作用物質が古典的Ｗｎｔ経路を活性化させる物質であることもまた好ましく、細胞内のＷｎｔシグナル伝達因子であるβカテニンの分解の阻害、安定化作用によりＷｎｔシグナル伝達経路を活性化させる物質であることがさらに好ましい。βカテニンの分解の阻害、安定化作用を有する物質としては、例えばＧＳＫ３阻害剤及びＢＭＬ－２８４、ＳＫＬ２００１等が挙げられる。添加するＷｎｔシグナル伝達経路作用物質がβカテニン応答性転写（β－ｃａｔｅｎｉｎ　ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ：ＣＲＴ）を促進又は活性化させる物質であることもまた好ましい。

　ＧＳＫ３阻害剤としては、ＣＨＩＲ９９０２１、ＣＨＩＲ９８０１４、ＴＷＳ１１９、ＳＢ２１６７６３、ＳＢ４１５２８６、ＢＩＯ、ＡＺＤ２８５８、ＡＺＤ１０８０、ＡＲ－Ａ０１４４１８、ＴＤＺＤ－８、ＬＹ２０９０３１４、ＩＭ－１２、Ｉｎｄｉｒｕｂｉｎ、Ｂｉｋｉｎｉｎ、Ａ　１０７０７２２、３Ｆ８、Ｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ、１０Ｚ－Ｈｙｍｅｎｉａｌｄｉｓｉｎｅ、Ｉｎｄｉｒｕｂｉｎ－３’－ｏｘｉｍｅ、ＮＳＣ　６９３８６８、ＴＣ－Ｇ　２４、ＴＣＳ　２００２、ＴＣＳ　２１３１１、ＣＰ２１Ｒ７及びこれらの誘導体等が挙げられる。

　好ましいＷｎｔシグナル伝達経路作用物質とＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質との組み合わせとして、ＧＳＫ３阻害剤とＰＯＲＣＮ阻害剤が挙げられる。ＧＳＫ３阻害剤とＰＯＲＣＮ阻害剤を併用した場合、古典的Ｗｎｔ経路は活性化され、非古典的Ｗｎｔ経路は阻害される。ＧＳＫ３阻害剤とＰＯＲＣＮ阻害剤とを併用した場合、ＧＳＫ３阻害剤は、好ましくはＣＨＩＲ９９０２１、ＣＨＩＲ９８０１４、ＳＢ２１６７６３、ＳＢ４１５２８６、ＢＩＯからなる群より選ばれる少なくとも１つを含み、さらに好ましくはＣＨＩＲ９９０２１を含む。ＧＳＫ３阻害剤とＰＯＲＣＮ阻害剤とを併用した場合、ＰＯＲＣＮ阻害剤は、好ましくはＩＷＰ－２、ＩＷＰ－３、ＩＷＰ－４、ＩＷＰ－Ｌ６、ＩＷＰ－１２、ＬＧＫ－９７４、ＥＴＣ－１５９、ＧＮＦ－６２３１、Ｗｎｔ－Ｃ５９からなる群より選ばれる少なくとも１つを含み、さらに好ましくはＩＷＰ－２を含む。また、ＧＳＫ３阻害剤とＫＹ０２１１１又はその誘導体等を組み合わせて用いてもよい。ＧＳＫ３阻害剤とは作用機序の異なるβカテニンの分解の阻害、安定化作用を有する物質としては例えばＢＭＬ－２８４、ＳＫＬ２００１が挙げられ、これら化合物又はその誘導体もＰＯＲＣＮ阻害剤、ＫＹ０２１１１又はその誘導体等と組み合わせて用いてもよい。さらに好ましいＷｎｔシグナル伝達経路作用物質とＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質との組み合わせとして、ＧＳＫ３阻害剤とＰＯＲＣＮ阻害剤及びＪＮＫ阻害剤とが挙げられる。ＧＳＫ３阻害剤とＰＯＲＣＮ阻害剤及びＪＮＫ阻害剤とを併用した場合、ＪＮＫ阻害剤は、好ましくはＪＮＫ－ＩＮ－８を含む。

　培地中のＷｎｔシグナル伝達経路作用物質の濃度は、上述の効果を達成可能な範囲で適宜設定することが可能である。細胞塊内部の神経系細胞又は組織の生存及び増殖の促進の観点からは、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質としてＣＨＩＲ９９０２１を用いる場合は、通常約１０ｐＭ～約１０ｍＭ、好ましくは約１００ｐＭ～約１ｍＭ、より好ましくは約１ｎＭ～約１００μＭ、さらに好ましくは約１０ｎＭ～約３０μＭ、最も好ましくは約１００ｎＭ～約３μＭの濃度で使用される。また、ＣＨＩＲ９９０２１以外のＷｎｔシグナル伝達経路作用物質を使用する場合、上記濃度のＣＨＩＲ９９０２１と同等のＷｎｔシグナル伝達経路促進活性を示す濃度で用いられることが望ましい。Ｗｎｔシグナル伝達経路促進活性は、例えばＨＥＫ２９３細胞を用いたＴｏｐｆｌａｓｈレポーターアッセイによって決定することができる。

　工程（１）及び以降の工程において、鼻腔上皮を構成する細胞の誘導に関与する嗅上皮様組織の製造効率を向上させる観点から、プラコード領域への分化を促進する化合物を添加することもまた好ましい。上記のような作用を有する化合物として、例えば米国特許出願公開第２０１６／０３２６４９１号明細書に記載のＢＲＬ－５４４４３、Ｐｈｅｎａｎｔｈｒｏｌｉｎｅ、Ｐａｒｔｈｅｎｏｌｉｄｅ等が挙げられる。プラコード領域への分化を促進する化合物としてＢＲＬ－５４４４３を用いる場合は通常１０ｎＭ～１００μＭ、Ｐｈｅｎａｎｔｈｒｏｌｉｎｅを用いる場合は通常１０ｎＭ～１００μＭ、Ｐａｒｔｈｅｎｏｌｉｄｅを用いる場合は通常１０ｎＭ～１００μＭの濃度で用いられる。

　本発明に係る製造方法に用いる多能性幹細胞の調製、及び工程（１）及び以降の工程において、作業者間の手技の差による影響を排し、作業者に由来する異物等の混入を防止し、製造品質を安定させ、生産量を増大させる観点から、自動培養装置、自動培養ロボット、ラボオートメーション機器を用いることもまた好ましい。本発明の実施に用いることができる上記機器としては、例えば自動培養装置（パナソニック社製、川崎重工業社製、日立製作所社製、ｉＡＣＥ２（ＡＣＣ－２００））、ＳＬＡＳ　ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：　Ｔｒａｎｓｌａｔｉｎｇ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ，２０２０，２４７２６３０３２０９７２１０９．に記載のロボット（ロボティック・バイオロジー・インスティテュート株式会社製、ＬａｂＤｒｏｉｄ）等が挙げられるが、これに限定されない。上記機器を用いた本発明の実施にあたり、当業者であれば本発明に記載の製造方法及び工程を、使用する機器向けに調節又は変更することができる。

　本発明に係る製造方法に用いる多能性幹細胞、及び工程（１）及び以降の工程において、製造品質を管理し安定させる観点から、製造物の中間評価を実施することもまた好ましい。上記中間評価は製造中の細胞塊の一部を消費して実施する抜き取り検査、及び非侵襲的検査のいずれであってもよいが、好ましくは非侵襲的検査である。非侵襲的検査としては、例えば顕微鏡による光学観察、光干渉断層計（Ｏｐｔｉｃａｌ　Ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ　Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ：ＯＣＴ）による測定、培地交換時に回収した培地中に含まれる代謝物、核酸、分泌タンパク質の定量等の手法が挙げられる。顕微鏡による光学観察の一態様としては、例えば国際公開第２０１７／０９０７４１号に記載の方法等を用いて、細胞塊の表面に形成された上皮構造、鼻腔上皮、嗅上皮等を光学的に観察及び検出し、数値化して評価することもできる。上記光学観察の評価基準は、例えば当業者による目視の判断、又は撮影した画像の機械学習によるモデル構築等の手法により適宜設定することができる。評価基準としては、例えば細胞塊表面が上皮に覆われている面積の割合、表面の上皮の厚さ、表面の上皮の割合、細胞塊周囲の死細胞、デブリの量等が使用され得る。光干渉断層計を用いた評価手法としては、例えばＣｅｌｌ３ｉＭａｇｅｒ　Ｅｓｔｉｅｒ（ＳＣＲＥＥＮホールディングス社製）を用いて断層画像、３Ｄイメージ等を取得し、細胞塊の断層面積、体積、真球度、面粗度、内部空洞体積、表面の上皮の厚さ等を定量することにより実施することができる。回収した培地を用いた解析としては、例えばエクソソーム解析、メタボロミクス解析等が実施可能である。

　＜工程（２）＞
　工程（２）は、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質の存在下で、工程（１）で培養した細胞を培養する。工程（１）で細胞を浮遊培養している場合は、工程（２）でも引き続き形成された細胞凝集体を浮遊培養すればよい。工程（１）で細胞を接着培養している場合は、工程（２）でも引き続き細胞を接着培養すればよい。工程（１）で細胞を浮遊培養した後、工程（２）で接着培養してもよい。工程（１）で細胞を接着培養した後、工程（２）で浮遊培養してもよい。

　ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質とは、ＢＭＰにより媒介されるシグナル伝達経路を増強し得る物質である。ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質としては、例えばＢＭＰ２、ＢＭＰ４及びＢＭＰ７等のＢＭＰタンパク質、ＧＤＦ７等のＧＤＦタンパク質、抗ＢＭＰ受容体抗体、並びに、ＢＭＰ部分ペプチド等が挙げられる。これらの物質は単独で又は複数種を組み合わせて用いてもよい。生物学的活性の見地からのＢＭＰシグナル伝達経路作用物質としては、例えば、マウス前駆軟骨細胞株ＡＴＤＣ５、マウス頭蓋冠由来細胞株ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１、及びマウス横紋筋由来細胞株Ｃ２Ｃ１２等の細胞に対する骨芽細胞様細胞への分化誘導能、及びアルカリホスファターゼ産生誘導能を有する物質が挙げられる。上記活性を有する物質としては、例えばＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ１３／ＧＤＦ６、ＢＭＰ１４／ＧＤＦ５、ＧＤＦ７等が挙げられる。

　ＢＭＰ２タンパク質及びＢＭＰ４タンパク質は例えばＲ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓから入手可能である。ＢＭＰ７タンパク質は例えばＢｉｏｌｅｇｅｎｄ社から入手可能である。ＧＤＦ７タンパク質は例えば富士フィルム和光純薬株式会社から入手可能である。ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質は、好ましくはＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ７、ＢＭＰ１３及びＧＤＦ７からなる群より選ばれる少なくとも１つのタンパク質を含み、より好ましくはＢＭＰ４を含む。

　培地中のＢＭＰシグナル伝達経路作用物質の濃度は、上述の効果を達成可能な範囲で適宜設定することが可能である。鼻腔上皮を構成する細胞の製造効率向上の観点から、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質としてＢＭＰ４を用いる場合は、通常約１ｐＭ～約１００ｎＭ、好ましくは約１０ｐＭ～約５０ｎＭ、より好ましくは約２５ｐＭ～約２５ｎＭ、さらに好ましくは約２５ｐＭ～約５ｎＭ、特に好ましくは約１００ｐＭ～約５ｎＭ、最も好ましくは約５００ｐＭ～約２ｎＭの濃度で使用される。また、ＢＭＰ４以外のＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を使用する場合、上述の濃度のＢＭＰ４と同等のＢＭＰシグナル伝達経路促進活性を示す濃度で用いられることが望ましい。当業者であれば、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質として例えば市販の組換えＢＭＰタンパク質等を用いる場合、製品添付書類に記載の活性、例えばマウス前駆軟骨細胞株ＡＴＤＣ５に対するアルカリホスファターゼ産生誘導能のＥＤ_５０等の値と上述のＢＭＰ４の濃度と活性を比較することにより、添加するＢＭＰシグナル伝達経路作用物質濃度を容易に決定することができる。

　ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質として、当業者に周知の化合物を使用することもできる。ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質としては、例えばＳｍｕｒｆ１阻害物質、Ｃｈｋ１阻害物質等が挙げられる。上記のような活性を有する化合物としては、例えばＡ－０１（［４－［［４－Ｃｈｌｏｒｏ－３－（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］ｓｕｌｆｏｎｙｌ］－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ］［４－（５－ｍｅｔｈｙｌ－１Ｈ－ｐｙｒａｚｏｌ－１－ｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］ｍｅｔｈａｎｏｎｅ）、ＰＤ　４０７８２４（９－Ｈｙｄｒｏｘｙ－４－ｐｈｅｎｙｌ－ｐｙｒｒｏｌｏ［３，４－ｃ］ｃａｒｂａｚｏｌｅ－１，３（２Ｈ，６Ｈ）－ｄｉｏｎｅ）及びこれらの誘導体等が挙げられる。

　工程（２）において用いられる培地は、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を含む限り特に限定されない。工程（２）において用いられる培地としては、工程（１）に挙げた培地が挙げられる。

　鼻腔上皮を構成する細胞の製造効率向上の観点から、工程（２）の開始時期は、工程（１）における培養開始から好ましくは０．５時間以降６日以内であり、より好ましくは０．５時間以降７２時間以内であり、さらに好ましくは１８時間以降６０時間以内であり、２４時間以降６０時間以内であってもよい。浮遊培養を実施する場合、Ｗｎｔシグナル経路阻害物質存在下で上記期間に工程（２）を開始すると、細胞凝集体の表面に非神経上皮様の組織が形成され、極めて効率よく鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞が形成される。

　工程（１）で浮遊培養を行なっている場合、鼻腔上皮を構成する細胞の製造効率向上の観点から、工程（２）の開始時期は、好ましくは工程（１）において形成された細胞凝集体の表層における１割以上１０割以下、より好ましくは３割以上１０割以下、さらに好ましくは５割以上１０割以下の細胞が互いに密着結合を形成している時期である。細胞凝集体において密着結合が形成しているかは、例えば抗ＺＯ－１抗体を用いた免疫染色等の手法により判別することができる。

　工程（２）におけるＢＭＰシグナル伝達経路作用物質の存在下での培養開始は、工程（１）を行った培養容器を用いて、上述の培地交換操作（例えば培地添加操作、半量培地交換操作、全量培地交換操作等）を行ってもよいし、細胞を別の培養容器に移してもよい。

　工程（２）におけるＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を含む培地での培養の期間は、適宜設定できる。工程（２）における培養の時間は、通常８時間～６日間程度、好ましくは１０時間～１０８時間程度、より好ましくは１２時間～９６時間程度、さらに好ましくは１８時間～７２時間程度、最も好ましくは２４時間～６０時間程度である。本実施形態の一側面において、工程（２）における培養の時間は、通常８時間～６日間程度、好ましくは１０時間～９６時間程度、より好ましくは１２時間～７２時間程度、さらに好ましくは１４時間～４８時間程度、最も好ましくは１６時間～３６時間程度である。

　工程（２）において、工程（ａ）又は工程（１）において用いた添加物、例えばＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質、ＴＧＦβシグナル伝達経路阻害物質、ＴＡＫ１阻害物質等を引き続き添加することもまた好ましい。工程（２）で添加するＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質又はＴＧＦβシグナル伝達経路阻害物質は、それ以前の工程に用いられた物質と異なっていてもよいが、好ましくは同一である。添加物の濃度及び種類については、適宜調整することができる。これらの物質の添加時期は、工程（２）の開始と同時であってもよいし、異なっていてもよい。

　＜工程（３）＞
　工程（３）では、ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質及びＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質からなる群より選ばれる少なくとも１つの存在下で、工程（２）で培養した細胞を培養する。工程（２）で細胞を浮遊培養している場合は、工程（３）でも引き続き細胞凝集体を浮遊培養すればよい。工程（２）で細胞を接着培養している場合は、工程（３）でも引き続き細胞を接着培養すればよい。工程（２）で細胞を浮遊培養した後、工程（３）で接着培養してもよい。工程（２）で細胞を接着培養した後、工程（３）で浮遊培養してもよい。

　工程（３）において、ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質及びＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質の少なくとも一方を培地に添加する。本実施形態の一側面において、ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質とＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質とを両方とも添加して細胞を培養してもよい。

　ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質とは、ＦＧＦ（線維芽細胞増殖因子）により媒介されるシグナル伝達経路を増強し得る物質である限り特に限定はされない。ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質としては、例えばＦＧＦ１、ＦＧＦ２（ｂＦＧＦと称することもある。）、ＦＧＦ３、ＦＧＦ７、ＦＧＦ８、及びＦＧＦ１０等のＦＧＦタンパク質、抗ＦＧＦ受容体抗体、並びに、ＦＧＦ部分ペプチド等が挙げられる。これらの物質は単独で又は複数種を組み合わせて用いてもよい。

　ＦＧＦ２タンパク質及びＦＧＦ８タンパク質は、例えば富士フィルム和光純薬株式会社から入手可能である。ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質は、好ましくはＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ８及びＦＧＦ１０、並びにこれらの改変体からなる群より選ばれる少なくとも１つを含み、より好ましくはＦＧＦ２を含み、さらに好ましくは組換えヒトＦＧＦ２を含む。

　培地中のＦＧＦシグナル伝達経路作用物質の濃度は、上述の効果を達成可能な範囲で適宜設定することが可能である。鼻腔上皮を構成する細胞への分化及び細胞の生存と増殖の促進の観点からは、ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質としてＦＧＦ２を用いる場合は、通常約１ｐｇ／ｍｌ～約１００μｇ／ｍｌ、好ましくは約１０ｐｇ／ｍｌ～約５０μｇ／ｍｌ、より好ましくは約１００ｐｇ／ｍｌ～約１０μｇ／ｍｌ、さらに好ましくは約５００ｐｇ／ｍｌ～約１μｇ／ｍｌ、最も好ましくは約１ｎｇ／ｍｌ～約２００ｎｇ／ｍｌの濃度で使用される。また、ＦＧＦ２以外のＦＧＦシグナル伝達経路作用物質を使用する場合、上記濃度のＦＧＦ２と同等のＦＧＦシグナル伝達経路促進活性を示す濃度で用いられることが望ましい。添加する物質のＦＧＦシグナル伝達経路促進活性については、例えば３Ｔ３細胞を用いた細胞増殖試験等の手法により測定することができる。

　培地中でのＦＧＦタンパク質の活性を保持する目的から、ＦＧＦタンパク質を含む培地中にヘパリン、ヘパラン硫酸を添加することも好ましい。ヘパリンはナトリウム塩として例えば富士フィルム和光純薬株式会社から入手可能である。培地中のヘパリン又はヘパラン硫酸の濃度は、上述の効果を達成可能な範囲で適宜設定することが可能である。培地中のヘパリンナトリウムの濃度は、通常約１ｎｇ／ｍｌ～約１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約１０ｎｇ／ｍｌ～約５０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは約１００ｎｇ／ｍｌ～約１０ｍｇ／ｍｌ、さらに好ましくは約５００ｎｇ／ｍｌ～約１ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは約１μｇ／ｍｌ～約２００μｇ／ｍｌである。ヘパラン硫酸を用いる場合、上記濃度のヘパリンと同様のＦＧＦタンパク質保護の活性をもつ濃度であることが好ましい。３７℃等での細胞培養環境下でＦＧＦタンパク質の活性を保持する目的から、例えば米国特許第８７７２４６０号明細書に記載のＴｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ　ＦＧＦ２等のＦＧＦの改変体や生分解性ポリマーにＦＧＦ２を結合させたＳｔｅｍＢｅａｄｓ　ＦＧＦ２等のＦＧＦ２徐放性ビーズを用いることもまた好ましい。Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ　ＦＧＦ２は、例えばＨｕｍａｎＺｙｍｅ社から入手可能である。ＳｔｅｍＢｅａｄｓ　ＦＧＦ２は例えばＳｔｅｍＣｕｌｔｕｒｅ社から入手可能である。

　ＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質とは、ＢＭＰファミリー・タンパク質により惹起されるシグナル伝達を抑制し得るものである限り限定されない。ＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質は、核酸、タンパク質、低分子有機化合物のいずれであってもよい。当該物質として例えばＢＭＰのプロセシングと細胞外への分泌を阻害する物質、ＢＭＰに直接作用する物質（例えばタンパク質、抗体、アプタマー等）、ＢＭＰをコードする遺伝子の発現を抑制する物質（例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ等）、ＢＭＰ受容体とＢＭＰの結合を阻害する物質、ＢＭＰ受容体によるシグナル伝達に起因する生理活性を阻害する物質を挙げることができる。ＢＭＰ受容体にはＩ型ＢＭＰ受容体とＩＩ型ＢＭＰ受容体が存在する。Ｉ型ＢＭＰ受容体としては、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＡＣＶＲが知られている。ＩＩ型ＢＭＰ受容体としては、ＴＧＦ－ｂｅｔａ　Ｒ－ＩＩ、ＡｃｔＲ－ＩＩ、ＡｃｔＲ－ＩＩＢ、ＢＭＰＲ２、ＭＩＳＲ－ＩＩが知られている。

　ＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質として知られているタンパク質として、例えばＮｏｇｇｉｎ、Ｃｈｏｒｄｉｎ、Ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ、Ｇｒｅｍｌｉｎ、Ｉｎｈｉｂｉｎ、Ｔｗｉｓｔｅｄ　Ｇａｓｔｒｕｌａｔｉｏｎ、Ｃｏｃｏ、ＤＡＮファミリーに属する分泌タンパク質等が挙げられる。上記工程（２）において培養液中にＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を添加していることから、以降のＢＭＰシグナル伝達経路をより効果的に阻害するという観点から、工程（３）におけるＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質は、細胞外へのＢＭＰの分泌よりも後のシグナル伝達経路を阻害する物質、例えばＢＭＰ受容体とＢＭＰとの結合を阻害する物質、ＢＭＰ受容体によるシグナル伝達に起因する生理活性を阻害する物質等を含むことが好ましく、より好ましくはＩ型ＢＭＰ受容体の阻害剤を含む。

　ＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質として、当業者に周知の化合物を使用することもできる。ＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質としては、例えばＩ型ＢＭＰ受容体の阻害物質が挙げられる。上記のような活性を有する化合物としては、例えばＫ０２２８８（３－［（６－Ａｍｉｎｏ－５－（３，４，５－ｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）－３－ｐｙｒｉｄｉｎｙｌ］ｐｈｅｎｏｌ，３－［６－Ａｍｉｎｏ－５－（３，４，５－ｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）－３－ｐｙｒｉｄｉｎｙｌ］－ｐｈｅｎｏｌ）、Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ（６－［４－［２－（１－Ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｙｌ）ｅｔｈｏｘｙ］ｐｈｅｎｙｌ］－３－（４－ｐｙｒｉｄｉｎｙｌ）ｐｙｒａｚｏｌｏ［１，５－ａ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ）、ＬＤＮ－１９３１８９（４－［６－［４－（１－Ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］ｐｙｒａｚｏｌｏ［１，５－ａ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－３－ｙｌ］ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ　ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ＬＤＮ－２１２８５４（５－［６－［４－（１－Ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］ｐｙｒａｚｏｌｏ［１，５－ａ］ｐｙｒｉＭｉｄｉｎ－３－ｙｌ］ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ）、ＬＤＮ－２１４１１７（１－（４－（６－ｍｅｔｈｙｌ－５－（３，４，５－ｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｐｙｒｉｄｉｎ－３－ｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ）ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ）、ＭＬ３４７（５－［６－（４－Ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｐｙｒａｚｏｌｏ［１，５－ａ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－３－ｙｌ］ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ））、ＤＭＨ１（４－（６－（４－Ｉｓｏｐｒｏｐｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｐｙｒａｚｏｌｏ［１，５－ａ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－３－ｙｌ）ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ）、ＤＭＨ２（４－［６－［４－［２－（４－Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｙｌ）ｅｔｈｏｘｙ］ｐｈｅｎｙｌ］ｐｙｒａｚｏｌｏ［１，５－ａ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－３－ｙｌ］－ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ）等が挙げられる。これらの物質は単独で又は複数種を組み合わせて用いてもよい。

　ＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質は、好ましくはＩ型ＢＭＰ受容体阻害剤であり、より好ましくはＫ０２２８８、Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ、ＬＤＮ－１９３１８９、ＬＤＮ－２１２８５４、ＬＤＮ－２１４１１７、ＭＬ３４７、ＤＭＨ１及びＤＭＨ２からなる群より選ばれる少なくとも１つを含み、さらに好ましくはＫ０２２８８を含む。

　培地中のＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質の濃度は、上述の効果を達成可能な範囲で適宜設定することが可能である。鼻腔上皮を構成する細胞の形成効率の観点から、工程（３）におけるＢＭＰ伝達経路阻害物質としてＫ０２２８８を用いる場合は、通常約１ｎＭ～約１００μＭ、好ましくは約１０ｎＭ～約５０μＭ、より好ましくは約１００ｎＭ～約５０μＭ、さらに好ましくは約５００ｎＭ～約２５μＭの濃度で使用される。ＢＭＰ伝達経路阻害物質としてＬＤＮ－１９３１８９を用いる場合は、通常約１ｎＭ～約１００μＭ、好ましくは約１０ｎＭ～約１０μＭ、より好ましくは約２５ｎＭ～約１μＭ、さらに好ましくは約１００ｎＭ～約５００ｎＭの濃度で使用される。ＢＭＰ伝達経路阻害物質としてＬＤＮ－２１２８５４を用いる場合は、通常約１ｎＭ～約１００μＭ、好ましくは約１０ｎＭ～約１０μＭ、より好ましくは約２５ｎＭ～約５μＭ、さらに好ましくは約２５０ｎＭ～約３μＭの濃度で使用される。ＢＭＰ伝達経路阻害物質としてＭＬ－３４７を用いる場合は、通常約１ｎＭ～約１００μＭ、好ましくは約１０ｎＭ～約５０μＭ、より好ましくは約１００ｎＭ～約５０μＭ、さらに好ましくは約１μＭ～約２５μＭの濃度で使用される。ＢＭＰ伝達経路阻害物質としてＤＭＨ２を用いる場合は、通常約１ｎＭ～約１００μＭ、好ましくは約１０ｎＭ～約１０μＭ、より好ましくは約２５ｎＭ～約５μＭ、さらに好ましくは約２５０ｎＭ～約３μＭの濃度で使用される。また、Ｋ０２２８８以外のＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質を使用する場合、上記濃度のＫ０２２８８と同等のＢＭＰシグナル伝達経路阻害活性を示す濃度で用いられることが望ましい。

　鼻腔上皮を構成する細胞の形成効率の観点から、工程（３）の開始時期は、工程（２）のＢＭＰシグナル伝達経路作用物質の添加から好ましくは０．５時間以降２４０時間以内であり、より好ましくは６時間以降１９２時間以内であり、さらに好ましくは９時間以降１２０時間以内であり、特に好ましくは１２時間以降７２時間以内である。工程（３）におけるＦＧＦシグナル伝達経路作用物質及びＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質の添加時期は同時でもよいし、異なっていてもよい。

　工程（３）における一態様としては、まずＦＧＦシグナル伝達経路作用物質を添加し、その後にＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質を添加してもよい。具体的には、例えば工程（２）の開始後４８時間以内にまずＦＧＦシグナル伝達経路作用物質を添加し、その後、９６時間以内にＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質を添加してもよい。あるいは、細胞集団中に混入する未分化細胞の増殖を抑制する観点からの別の一態様としては、例えば工程（２）の開始後７２時間以降１２０時間以内にＦＧＦシグナル伝達経路作用物質とＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質を添加してもよい。

　鼻腔上皮を構成する細胞の形成効率の観点から、工程（３）の開始時期は、工程（２）のＢＭＰシグナル伝達経路作用物質の添加後に細胞凝集体の表面に非神経上皮組織が形成されるよりも前に開始することが好ましい。細胞凝集体の表面に非神経上皮組織が形成されたかを調べるためには、顕微鏡等により細胞凝集体表面に上皮様の組織が形成されたかを観察、又は細胞凝集体の切片を作製し、サイトケラチン、Ｅ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ、ＥｐＣＡＭ等の非神経上皮組織で発現するマーカーに対する蛍光免疫染色等の手法により行うことができる。

　工程（３）の培養開始は、工程（２）を行った培養容器を用いて、上述の培地交換操作（例えば培地添加操作、半量培地交換操作、全量培地交換操作等）を行ってもよいし、細胞凝集体を別の培養容器に移してもよい。

　浮遊培養を行なっている場合、工程（３）の培養は、例えば細胞凝集体中に鼻腔上皮細胞が分化するまで行えばよい。鼻腔上皮細胞への分化は、例えば細胞の免疫染色によって確認することができ、マーカーとしてはサイトケラチン１５、サイトケラチン１８、および前記した鼻腔上皮を構成する各種細胞のマーカー遺伝子等を用いることができる。あるいは、工程（３）の培養は、嗅神経前駆細胞が分化するまで行えばよい。嗅神経前駆細胞への分化は、例えば細胞の免疫染色によって確認することができ、マーカーとしてはＥｂｆ２、ＮｅｕｒｏＤ、Ｌｈｘ２、Ｔｕｊ１、ＮＣＡＭ、Ｃａｌｒｅｔｉｎｉｎを用いることができる。

　工程（３）において用いられる培地は、特に限定されないが、工程（１）において用いられる培地の他、ＮｅｕｒｏｂａｓａｌにＢ２７　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔが添加された培地、ＤＭＥＭ／Ｆ－１２にＮ２　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔが添加された培地、ＳｔｅｍＰｒｏ　ＮＳＣ　ＳＦＭ　無血清ヒト神経幹細胞培養培地（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）等の調製済の神経細胞培養用の培地が挙げられる。

　工程（３）において、工程（ａ）、工程（１）及び工程（２）の何れかの工程において用いた添加物、例えばＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質、ＴＧＦβシグナル伝達経路阻害物質、ＴＡＫ１阻害物質等を引き続き添加することもまた好ましい。工程（３）で添加するＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質、ＴＧＦβシグナル伝達経路阻害物質及びＴＡＫ１阻害物質は、それぞれ工程（ａ）、工程（１）及び工程（２）の何れかの工程において用いられた物質と異なっていてもよいが、好ましくは同一である。添加物の濃度及び種類については、適宜調整することができる。工程（３）において使用される添加物は、好ましくはＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質を含み、さらに好ましくはＷｎｔシグナル伝達経路作用物質、ＴＧＦβシグナル伝達経路阻害物質及びＴＡＫ１阻害物質を含む。

　鼻腔上皮構造の形成並びに細胞の生存及び増殖促進の観点から、工程（３）は、ＥＧＦシグナル伝達経路作用物質の存在下で行うこともまた好ましい。ＥＧＦシグナル伝達経路作用物質とは、上皮成長因子（ＥＧＦ）により媒介されるシグナル伝達経路を増強し得る物質である。ＥＧＦシグナル伝達経路作用物質としては、例えばＥＧＦ、ＴＧＦ－α、ＡＲ（アンフィレギュリン）、ＥＰＧ、ＨＢ－ＥＧＦ（ヘパリン結合ＥＧＦ様増殖因子）、ＢＴＣ（ベータセルリン）、及びＥＰＲ（エピレグリン）等のＥＧＦＲリガンドタンパク質、ＮＲＧ（ニューレグリン）１～４のＥｒｂＢ３／４（上皮成長因子受容体、ＨＲＥ）リガンドタンパク質、並びに、アルプレノール、及びカルベジロール等の低分子化合物等が挙げられる。これらの物質は単独で又は複数種を組み合わせて用いてもよい。ＥＧＦタンパク質は例えばＴｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社及びＰｒｉｍｅＧｅｎｅ社から入手可能である。ＨＢ－ＥＧＦタンパク質は、例えばＲ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社から入手可能である。ＥＧＦシグナル伝達経路作用物質は、好ましくはＥＧＦを含む。

　培地中のＥＧＦシグナル伝達経路作用物質の濃度は、上述の効果を達成可能な範囲で適宜設定することが可能である。ＥＧＦシグナル伝達経路作用物質としてＥＧＦを用いる場合は、通常約１ｐｇ／ｍｌ～約１００μｇ／ｍｌ、好ましくは約１０ｐｇ／ｍｌ～約５０μｇ／ｍｌ、より好ましくは約１００ｐｇ／ｍｌ～約１０μｇ／ｍｌ、さらに好ましくは約５００ｐｇ／ｍｌ～約１μｇ／ｍｌ、最も好ましくは約１ｎｇ／ｍｌ～約２００ｎｇ／ｍｌの濃度で使用される。またＥＧＦ以外のＥＧＦシグナル伝達経路作用物質を使用する場合、上記濃度のＥＧＦと同等のＥＧＦシグナル伝達経路促進活性を示す濃度で用いられることが望ましい。

　鼻腔上皮様組織中の細胞の分化傾向の調節並びに細胞の生存及び増殖促進の観点からは、工程（３）は、Ｓｈｈシグナル伝達経路作用物質の存在下で行うこともまた好ましい。Ｓｈｈシグナル伝達経路作用物質としては、上記工程（ａ）にて記載のもの等を用いることができる。工程（３）におけるＳｈｈシグナル伝達経路作用物質は、工程（ａ）で用いるものと同じでもよいし、異なっていてもよいが、好ましくは同一の物質である。工程（３）におけるＳｈｈシグナル伝達経路作用物質は、好ましくはＳＡＧ、Ｐｕｒｍｏｒｐｈａｍｉｎｅ、ＧＳＡ－１０からなる群より含まれる少なくとも１つを含み、より好ましくはＳＡＧを含む。培地中のＳｈｈシグナル伝達経路作用物質の濃度は、上述の効果を達成可能な範囲で適宜設定することが可能である。ＳＡＧは、工程（３）においては通常約１ｎＭ～約１０μＭ、好ましくは約１０ｎＭ～約７μＭ、より好ましくは約５０ｎＭ～約５μＭ、さらに好ましくは約１００ｎＭ～約３μＭ、特に好ましくは約３００ｎＭ～約２μＭ、最も好ましくは約５００ｎＭ～約１．５μＭの濃度で使用される。また、ＳＡＧ以外のＳｈｈシグナル伝達経路作用物質を使用する場合、上記濃度のＳＡＧと同等のＳｈｈシグナル伝達促進活性を示す濃度で用いられることが望ましい。

　鼻腔上皮様組織中の細胞の分化傾向の調節の観点から、工程（３）は、レチノイン酸シグナル伝達経路作用物質の存在下で行うこともまた好ましい。レチノイン酸伝達経路作用物質としては、例えばレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）又はレチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）に結合し、下流の転写を活性化させる物質等が挙げられる。上記のような作用を有する化合物としては、例えばオールトランスレチノイン酸、イソトレチノイン、９－ｃｉｓレチノイン酸、ＴＴＮＰＢ（４－［（Ｅ）－２－［（５，５，８，８－Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ－５，６，７，８－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ）－２－ｙｌ］－１－ｐｒｏｐｅｎｙｌ］ｂｅｎｚｏｉｃ　ａｃｉｄ）、Ｃｈ５５（４－［（Ｅ）－３－（３，５－ｄｉ－ｔｅｒｔ－ｂｕｔｙｌｐｈｅｎｙｌ）－３－ｏｘｏ－１－ｐｒｏｐｅｎｙｌ］ｂｅｎｚｏｉｃ　ａｃｉｄ）、ＥＣ１９（３－［２－（５，６，７，８－Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－５，５，８，８－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ－２－ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｙｌ）ｅｔｈｙｎｙｌ］ｂｅｎｚｏｉｃ　ａｃｉｄ）、ＥＣ２３（４－［２－（５，６，７，８－Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－５，５，８，８－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ－２－ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｙｌ）ｅｔｈｙｎｙｌ）－ｂｅｎｚｏｉｃａｃｉｄ）、Ｆｅｎｒｅｔｉｎｉｄｅ（４－ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌｒｅｔｉｎａｍｉｄｅ）、Ａｃｉｔｒｅｔｉｎ（（ａｌｌ－ｅ）－９－（４－ｍｅｔｈｏｘｙ－２，３，６－ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌ）－３，７－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－２，４，６，８－ｎｏｎａｔｅｔｒａｅｎ）、Ｔｒｉｆａｒｏｔｅｎｅ、Ａｄａｐａｌｅｎｅ、ＡＣ　２６１０６６（４－［４－（２－Ｂｕｔｏｘｙｅｔｈｏｘｙ－）－５－ｍｅｔｈｙｌ－２－ｔｈｉａｚｏｌｙｌ］－２－ｆｌｕｏｒｏｂｅｎｚｏｉｃａｃｉｄ）、ＡＣ　５５６４９（４－Ｎ－Ｏｃｔｙｌｂｉｐｈｅｎｙｌ－４－ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ　ａｃｉｄ）、ＡＭ　５８０（４－［（５，６，７，８－Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－５，５，８，８－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ－２－ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｙｌ）ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｏ］ｂｅｎｚｏｉｃ　ａｃｉｄ）、ＡＭ８０（４－［（５，５，８，８－Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ－６，７－ｄｉｈｙｄｒｏｎａｐｈｔｈａｌｅｎ－２－ｙｌ）ｃａｒｂａｍｏｙｌ］ｂｅｎｚｏｉｃ　ａｃｉｄ）、ＢＭＳ　７５３（４－［［（２，３－Ｄｉｈｙｄｒｏ－１，１，３，３－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ－２－ｏｘｏ－１Ｈ－ｉｎｄｅｎ－５－ｙｌ）ｃａｒｂｏｎｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｂｅｎｚｏｉｃａｃｉｄ）、ＢＭＳ　９６１（３－Ｆｌｕｏｒｏ－４－［（ｒ）－２－ｈｙｄｒｏｘｙ－２－（５，５，８，８－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ－５，６，７，８－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－ｎａｐｈｔｈａｌｅｎ－２－ｙｌ）－ａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏ］－ｂｅｎｚｏｉｃ　ａｃｉｄ）、ＣＤ１５３０（４－（６－Ｈｙｄｒｏｘｙ－７－ｔｒｉｃｙｃｌｏ［３．３．１．１３，７］ｄｅｃ－１－ｙｌ－２－ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｙｌ）ｂｅｎｚｏｉｃａｃｉｄ）、ＣＤ２３１４（５－（５，６，７，８－Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－５，５，８，８－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ－２－ａｎｔｈｒａｃｅｎｙｌ）－３－ｔｈｉｏｐｈｅｎｅｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ　ａｃｉｄ）、ＣＤ４３７（２－ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅｃａｒｂｏｘｙｌｉｃａｃｉｄ，６－（４－ｈｙｄｒｏｘｙ－３－ｔｒｉｃｙｃｌｏ（３．３．１．１（３，７））ｄｅｃ－１－ｙｌｐｈｅｎ）、ＣＤ２７１（６－［３－（１－Ａｄａｍａｎｔｙｌ）－４－ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ］－２－ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ　ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ　ａｃｉｄ）及びこれらの誘導体等が挙げられる。これらの物質は単独で又は複数種を組み合わせて用いてもよい。

　工程（３）におけるレチノイン酸伝達経路作用物質は、好ましくはＥＣ２３を含む。培地中のレチノイン酸伝達経路作用物質の濃度は、上述の効果を達成可能な範囲であれば特に限定されない。レチノイン酸伝達経路作用物質としてＥＣ２３を用いる場合は、例えばＥＣ２３の濃度が約１０ｐＭ～約３０μＭであり、好ましくは約１００ｐＭ～約２０μＭであり、より好ましくは約１０ｎＭ～約１０μＭであり、さらに好ましくは約１００ｎＭ～約５μＭである。ＥＣ２３以外のレチノイン酸伝達経路作用物質を使用する場合、上記濃度のＥＣ２３と同等のレチノイン酸伝達経路作用活性を示す濃度で用いられることが望ましい。

　鼻腔上皮様組織中の細胞の分化傾向の調節の観点からは、工程（３）は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路阻害物質の存在下で行うこともまた好ましい。本発明において、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路とは、細胞膜上に発現する受容体であるＮｏｔｃｈタンパク質と隣接細胞の膜上に発現するＮｏｔｃｈリガンド（Ｄｅｌｔａ、Ｊａｇｇｅｄ等）との直接相互作用により活性化されるシグナル伝達経路を表す。Ｎｏｔｃｈシグナルが伝達された細胞においては、Ｎｏｔｃｈタンパク質が段階的にプロセシングを受け膜上で切り出された細胞内ドメインが核内へと運ばれて下流遺伝子の発現を制御する。

　Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路阻害物質は、Ｎｏｔｃｈにより媒介されるシグナル伝達を抑制し得るものである限り特に限定されない。Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路阻害物質は、核酸、タンパク質、低分子有機化合物のいずれであってもよい。当該物質として例えば、機能欠失型のＮｏｔｃｈ受容体及びリガンド、Ｎｏｔｃｈのプロセシング（Ｓ１切断）を阻害する物質、Ｎｏｔｃｈ及びＮｏｔｃｈリガンドの糖鎖修飾を阻害する物質、細胞膜移行を阻害する物質、Ｎｏｔｃｈの細胞内ドメイン（ＮＩＣＤ）のプロセシング（Ｓ２切断、Ｓ３切断）を阻害する物質（γセクレターゼ阻害剤）、ＮＩＣＤを分解する物質、ＮＩＣＤ依存的な転写を阻害する物質等を挙げることができる。

　Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路阻害物質として、当業者に周知の化合物を使用することもできる。Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路阻害物質としての活性を有する化合物として、例えばＤＡＰＴ（Ｎ－［Ｎ－（３，５－ｄｉｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎａｃｅｔｙｌ）－ｌ－ａｌａｎｙｌ］－Ｓ－ｐｈｅｎｙｌｇｌｙｃｉｎｅ　ｔ－ｂｕｔｙｌ　ｅｓｔｅｒ）、ＤＢＺ（（２Ｓ）－２－［［２－（３，５－ｄｉｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）ａｃｅｔｙｌ］ａｍｉｎｏ］－Ｎ－［（７Ｓ）－５－ｍｅｔｈｙｌ－６－ｏｘｏ－７Ｈ－ｂｅｎｚｏ［ｄ］［１］ｂｅｎｚａｚｅｐｉｎ－７－ｙｌ］ｐｒｏｐａｎａｍｉｄｅ）、ＭＤＬ２８１７０（ｂｅｎｚｙｌ　Ｎ－［（２Ｓ）－３－ｍｅｔｈｙｌ－１－ｏｘｏ－１－［［（２Ｓ）－１－ｏｘｏ－３－ｐｈｅｎｙｌｐｒｏｐａｎ－２－ｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｂｕｔａｎ－２－ｙｌ］ｃａｒｂａｍａｔｅ）、ＦＬＩ－０６（ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ　２，７，７－ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ－４－（４－ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）－５－ｏｘｏ－１，４，６，８－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ－３－ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ）、Ｌ－６８５，４５８（ｔｅｒｔ－ｂｕｔｙｌ　Ｎ－［６－［［１－［（１－ａｍｉｎｏ－１－ｏｘｏ－３－ｐｈｅｎｙｌｐｒｏｐａｎ－２－ｙｌ）ａｍｉｎｏ］－４－ｍｅｔｈｙｌ－１－ｏｘｏｐｅｎｔａｎ－２－ｙｌ］ａｍｉｎｏ］－５－ｂｅｎｚｙｌ－３－ｈｙｄｒｏｘｙ－６－ｏｘｏ－１－ｐｈｅｎｙｌｈｅｘａｎ－２－ｙｌ］ｃａｒｂａｍａｔｅ）、ＣＢ－１０３（６－（４－ｔｅｒｔ－ｂｕｔｙｌｐｈｅｎｏｘｙ）ｐｙｒｉｄｉｎ－３－ａｍｉｎｅ）及びこれらの誘導体等、並びにＯｎｃｏ　Ｔａｒｇｅｔｓ　Ｔｈｅｒ．２０１３；６：９４３－９５５．に記載の物質等が挙げられる。Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路阻害物質は、好ましくはＤＡＰＴを含む。

　培地中におけるＮｏｔｃｈシグナル阻害物質の濃度は、上述の効果を達成可能な範囲であれば特に限定されない。例えばＮｏｔｃｈシグナル伝達経路阻害物質としてＤＡＰＴを用いる場合は、例えばＤＡＰＴの濃度が約１００ｐＭ～約５０μＭであり、好ましくは約１ｎＭ～約３０μＭであり、より好ましくは約１００ｎＭ～約２０μＭであり、さらに好ましくは約１μＭ～約１０μＭである。ＤＡＰＴ以外のＮｏｔｃｈシグナル伝達経路阻害物質を使用する場合、上記濃度のＤＡＰＴと同等のＮｏｔｃｈシグナル伝達経路阻害活性を示す濃度で用いられることが望ましい。

　鼻腔上皮様組織中の細胞の分化傾向の調節の観点からは、工程（３）および以降の工程を、Ｈｉｐｐｏ／ＹＡＰシグナル伝達経路調節物質の存在下で行うこともまた好ましい。本発明において、Ｈｉｐｐｏ／ＹＡＰシグナル伝達経路とは、細胞増殖やアポトーシス、幹細胞の自己複製の制御、器官のサイズ調節等に関与する、Ｍｓｔ１／２やＬＡＴＳ１／２等より構成されるキナーゼカスケードと、転写因子ＹＡＰ／ＴＡＺにより制御されるシグナル伝達経路とを表す。例えば、細胞の増殖と幹細胞の未分化性の維持とを企図する場合は、当業者であれば、Ｈｉｐｐｏ経路を阻害し、ＹＡＰ／ＴＡＺタンパク質の脱リン酸化と核内移行を促進する作用を有する物質、ＹＡＰ／ＴＡＺにより惹起される転写を促進する物質等を添加することにより行うことができる。細胞の分化促進を企図する場合は、当業者であれば、Ｈｉｐｐｏ経路を活性化し、ＹＡＰ／ＴＡＺタンパク質のリン酸化とユビキチン・プロテオソーム系等による分解を促進する作用を有する物質、ＹＡＰ／ＴＡＺにより惹起される転写を抑制する物質等を添加することにより行うことができる。

　Ｈｉｐｐｏ経路阻害物質としては上流のキナーゼカスケードを阻害し、またはＹＡＰ／ＴＡＺにより惹起される下流の標的遺伝子の転写・細胞応答を亢進させるものである限り特に限定されない。Ｈｉｐｐｏ経路阻害物質は核酸、タンパク質、低分子有機化合物のいずれであってもよい。Ｈｉｐｐｏ経路阻害物質としては、例えば、増殖因子、サイトカイン、Ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ－１－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　２（Ｓ１ＰＲ２）活性化物質、ｍａｍｍａｌｉａｎ　ｓｔｅｒｉｌｅ　２０－ｌｉｋｅ　ｋｉｎａｓｅ　（ＭＳＴ）　１／２阻害物質、ｌａｒｇｅ　ｔｕｍｏｒ　ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ　ｋｉｎａｓｅ　１　ａｎｄ　２　（ＬＡＴＳ１／２）　阻害物質、ａｎｎｅｘｉｎ　Ａ２　（ＡＮＸＡ２）結合阻害物質、ＴＡＺ活性化物質等が挙げられる。上記のような作用を有する物質としては例えばＣＹＭ－５５２０（１－［２－（１－ｂｅｎｚｙｌ－２，５－ｄｉｍｅｔｈｙｌｐｙｒｒｏｌ－３－ｙｌ）－２－ｏｘｏｅｔｈｙｌ］－６－ｏｘｏｐｙｒｉｄｉｎｅ－３－ｃａｒｂｏｎｉｔｒｉｌｅ）、ＸＭＵ－ＭＰ－１（４－［（２，９－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－８－ｏｘｏ－６－ｔｈｉａ－２，９，１２，１４－ｔｅｔｒａｚａｔｒｉｃｙｃｌｏ［８．４．０．０３，７］ｔｅｔｒａｄｅｃａ－１（１４），３（７），４，１０，１２－ｐｅｎｔａｅｎ－１３－ｙｌ）ａｍｉｎｏ］ｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｍｉｄｅ）、ＰＹ－６０（５－ｐｈｅｎｙｌ－Ｎ－（３－（ｔｈｉａｚｏｌ－２－ｙｌ）ｐｒｏｐｙｌ）ｉｓｏｘａｚｏｌｅ－３－ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）、ＧＡ－０１７（［（Ｅ）－２－（１－（２，４－ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ－３－ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌ）ｐｒｏｐｙｌｉｄｅｎｅ）－Ｎ－（３－ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｙｌ）ｈｙｄｒａｚｉｎｅ－１－ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ］）、Ｌａｔｓ－ＩＮ－１（Ｎ－（３－ｂｅｎｚｙｌ－１，３－ｔｈｉａｚｏｌ－２－ｙｌｉｄｅｎｅ）－１Ｈ－ｐｙｒｒｏｌｏ［２，３－ｂ］ｐｙｒｉｄｉｎｅ－３－ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）、ＩＢＳ００８７３８（［３－（４－ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌ）－５－［（Ｅ）－ｍｏｒｐｈｏｌｉｎ－４－ｙｌｍｅｔｈｙｌｉｄｅｎｅａｍｉｎｏ］ｉｍｉｄａｚｏｌ－４－ｙｌ］－ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈａｎｏｎｅ）、ＴＭ－２５６５９（２－ｂｕｔｙｌ－５－ｍｅｔｈｙｌ－６－ｐｙｒｉｄｉｎ－３－ｙｌ－３－［［４－［２－（２Ｈ－ｔｅｔｒａｚｏｌ－５－ｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］ｐｈｅｎｙｌ］ｍｅｔｈｙｌ］ｉｍｉｄａｚｏ［４，５－ｂ］ｐｙｒｉｄｉｎｅ）、ＳＢＰ－３２６４（Ｎ－［１－［５－（３－ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）－７Ｈ－ｐｙｒｒｏｌｏ［２，３－ｄ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－４－ｙｌ］ｐｉｐｅｒｉｄｉｎ－４－ｙｌ］ａｃｅｔａｍｉｄｅ）、ＶＴ０２９５６、ＴＤＩ－０１１５３６およびこれらの誘導体等が挙げられる。

　Ｈｉｐｐｏ経路活性化物質としてはＹＡＰ／ＴＡＺにより惹起される下流の遺伝子の転写・細胞応答を抑制させるものである限り特に限定されない。Ｈｉｐｐｏ経路活性化物質は核酸、タンパク質、低分子有機化合物のいずれであってもよい。Ｈｉｐｐｏ経路活性化物質としては、例えば、ＴＥＡＤ阻害物質、ＹＡＰ－ＴＥＡＤ結合阻害物質、ＡＭＰＫ活性化剤、ＹＡＰ／ＴＡＺ転写活性阻害物質、細胞間および細胞外マトリックスへの接着刺激の擬似活性化物質等が挙げられる。上記のような作用を有する物質としては例えばＶｅｒｔｅｐｏｒｆｉｎ（３－［（２３Ｓ，２４Ｒ）－１４－ｅｔｈｅｎｙｌ－２２，２３－ｂｉｓ（ｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）－５－（３－ｍｅｔｈｏｘｙ－３－ｏｘｏｐｒｏｐｙｌ）－４，１０，１５，２４－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ－２５，２６，２７，２８－ｔｅｔｒａｚａｈｅｘａｃｙｃｌｏ［１６．６．１．１３，６．１８，１１．１１３，１６．０１９，２４］ｏｃｔａｃｏｓａ－１，３，５，７，９，１１（２７），１２，１４，１６，１８（２５），１９，２１－ｄｏｄｅｃａｅｎ－９－ｙｌ］ｐｒｏｐａｎｏｉｃ　ａｃｉｄ；３－［（２３Ｓ，２４Ｒ）－１４－ｅｔｈｅｎｙｌ－２２，２３－ｂｉｓ（ｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）－９－（３－ｍｅｔｈｏｘｙ－３－ｏｘｏｐｒｏｐｙｌ）－４，１０，１５，２４－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ－２５，２６，２７，２８－ｔｅｔｒａｚａｈｅｘａｃｙｃｌｏ［１６．６．１．１３，６．１８，１１．１１３，１６．０１９，２４］ｏｃｔａｃｏｓａ－１，３，５，７，９，１１（２７），１２，１４，１６，１８（２５），１９，２１－ｄｏｄｅｃａｅｎ－５－ｙｌ］ｐｒｏｐａｎｏｉｃ　ａｃｉｄ）、ＡＩＣＡＲ（５－ａｍｉｎｏ－１－［（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）－３，４－ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ－５－（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｏｘｏｌａｎ－２－ｙｌ］ｉｍｉｄａｚｏｌｅ－４－ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）、Ｋ－９７５（Ｎ－（３－（４－ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｘｙ）－４－ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌ）ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）、ＭＹＦ－０１－３７（１－［３－ｍｅｔｈｙｌ－３－［３－（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌ）ａｎｉｌｉｎｏ］ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎ－１－ｙｌ］ｐｒｏｐ－２－ｅｎ－１－ｏｎｅ）、ＴＥＤ－３４７（２－ｃｈｌｏｒｏ－１－［２－［３－（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌ）ａｎｉｌｉｎｏ］ｐｈｅｎｙｌ］ｅｔｈａｎｏｎｅ）、ＶＴ１０７（Ｎ－［（１Ｓ）－１－（６－ａｍｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎ－２－ｙｌ）ｅｔｈｙｌ］－５－［４－（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ－２－ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）、ＹＡＰ－ＴＥＡＤ－ＩＮ－１（（４Ｓ）－４－［［（２Ｓ）－１－［（２Ｓ）－１－［（２Ｓ）－２－［［（３Ｓ，６Ｓ，９Ｓ，１２Ｓ，１５Ｓ，２４Ｓ，２７Ｓ，３０Ｓ，３３Ｓ）－１５－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ）－１－［（２Ｓ）－２－ａｃｅｔａｍｉｄｏ－３－ｍｅｔｈｙｌｂｕｔａｎｏｙｌ］ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｅ－２－ｃａｒｂｏｎｙｌ］ａｍｉｎｏ］－３－（３－ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）ｐｒｏｐａｎｏｙｌ］ａｍｉｎｏ］－６－（４－ａｍｉｎｏｂｕｔｙｌ）－２４－ｂｅｎｚｙｌ－３－ｂｕｔｙｌ－９－（３－ｃａｒｂａｍｉｍｉｄａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）－２７－（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）－３０－ｍｅｔｈｙｌ－１２－（２－ｍｅｔｈｙｌｐｒｏｐｙｌ）－２，５，８，１１，１４，２３，２６，２９，３２－ｎｏｎａｏｘｏ－１８，１９－ｄｉｔｈｉａ－１，４，７，１０，１３，２２，２５，２８，３１－ｎｏｎａｚａｂｉｃｙｃｌｏ［３１．３．０］ｈｅｘａｔｒｉａｃｏｎｔａｎｅ－２１－ｃａｒｂｏｎｙｌ］ａｍｉｎｏ］－６－ａｍｉｎｏｈｅｘａｎｏｙｌ］ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｅ－２－ｃａｒｂｏｎｙｌ］ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｅ－２－ｃａｒｂｏｎｙｌ］ａｍｉｎｏ］－５－ａｍｉｎｏ－５－ｏｘｏｐｅｎｔａｎｏｉｃ　ａｃｉｄ）、Ｓｕｐｅｒ－ＴＤＵ（（４Ｓ）－５－ａｍｉｎｏ－４－［［（２Ｓ）－１－［（２Ｓ）－１－［（２Ｓ）－６－ａｍｉｎｏ－２－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ）－１－［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ）－６－ａｍｉｎｏ－２－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ）－１－［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ，３Ｓ）－２－［２－［（３Ｓ）－６－ａｍｉｎｏ－１－［（２Ｓ）－１－［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ）－４－ａｍｉｎｏ－２－［［（２Ｒ）－２－［［（２Ｓ，３Ｓ）－２－［［（２Ｓ）－６－ａｍｉｎｏ－２－［［（２Ｓ）－１－［（２Ｓ）－４－ａｍｉｎｏ－２－［［２－［［（２Ｓ）－２－［［２－［［２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－２－［［（２Ｓ）－５－ａｍｉｎｏ－２－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ，３Ｓ）－２－［［（２Ｓ）－２－［［２－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ）－６－ａｍｉｎｏ－２－［［（２Ｒ）－２－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ）－３－ｃａｒｂｏｘｙ－２－［［（２Ｓ）－３－ｃａｒｂｏｘｙ－２－［［（２Ｓ）－２－［２－［（２Ｓ）－１－ｈｙｄｒｏｘｙ－３－ｏｘｏｐｒｏｐａｎ－２－ｙｌ］ｈｙｄｒａｚｉｎｙｌ］－３－ｍｅｔｈｙｌｂｕｔａｎｏｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｐｒｏｐａｎｏｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｐｒｏｐａｎｏｙｌ］ａｍｉｎｏ］－３－（１Ｈ－ｉｍｉｄａｚｏｌ－５－ｙｌ）ｐｒｏｐａｎｏｙｌ］ａｍｉｎｏ］－３－ｐｈｅｎｙｌｐｒｏｐａｎｏｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｐｒｏｐａｎｏｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｈｅｘａｎｏｙｌ］ａｍｉｎｏ］－３－ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐａｎｏｙｌ］ａｍｉｎｏ］－４－ｍｅｔｈｙｌｐｅｎｔａｎｏｙｌ］ａｍｉｎｏ］ａｃｅｔｙｌ］ａｍｉｎｏ］－３－ｃａｒｂｏｘｙｐｒｏｐａｎｏｙｌ］ａｍｉｎｏ］－３－ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔａｎｏｙｌ］ａｍｉｎｏ］－３－（１Ｈ－ｉｎｄｏｌ－３－ｙｌ）ｐｒｏｐａｎｏｙｌ］ａｍｉｎｏ］－４－ｍｅｔｈｙｌｐｅｎｔａｎｏｙｌ］ａｍｉｎｏ］－５－ｏｘｏｐｅｎｔａｎｏｙｌ］ａｍｉｎｏ］－３－ｍｅｔｈｙｌｐｅｎｔａｎｏｙｌ］ａｍｉｎｏ］ａｃｅｔｙｌ］ａｍｉｎｏ］ａｃｅｔｙｌ］ａｍｉｎｏ］－３－ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐａｎｏｙｌ］ａｍｉｎｏ］ａｃｅｔｙｌ］ａｍｉｎｏ］－４－ｏｘｏｂｕｔａｎｏｙｌ］ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｅ－２－ｃａｒｂｏｎｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｈｅｘａｎｏｙｌ］ａｍｉｎｏ］－３－ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔａｎｏｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｐｒｏｐａｎｏｙｌ］ａｍｉｎｏ］－４－ｏｘｏｂｕｔａｎｏｙｌ］ａｍｉｎｏ］－３－ｍｅｔｈｙｌｂｕｔａｎｏｙｌ］ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎ－２－ｙｌ］－１，２，６－ｔｒｉｏｘｏｈｅｘａｎ－３－ｙｌ］ｈｙｄｒａｚｉｎｙｌ］－３－ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔａｎｏｙｌ］ａｍｉｎｏ］－３－ｍｅｔｈｙｌｂｕｔａｎｏｙｌ］ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｅ－２－ｃａｒｂｏｎｙｌ］ａｍｉｎｏ］－４－ｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆａｎｙｌｂｕｔａｎｏｙｌ］ａｍｉｎｏ］－５－ｃａｒｂａｍｉｍｉｄａｍｉｄｏｐｅｎｔａｎｏｙｌ］ａｍｉｎｏ］－４－ｍｅｔｈｙｌｐｅｎｔａｎｏｙｌ］ａｍｉｎｏ］－５－ｃａｒｂａｍｉｍｉｄａｍｉｄｏｐｅｎｔａｎｏｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｈｅｘａｎｏｙｌ］ａｍｉｎｏ］－４－ｍｅｔｈｙｌｐｅｎｔａｎｏｙｌ］ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｅ－２－ｃａｒｂｏｎｙｌ］ａｍｉｎｏ］－３－ｃａｒｂｏｘｙｐｒｏｐａｎｏｙｌ］ａｍｉｎｏ］－３－ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐａｎｏｙｌ］ａｍｉｎｏ］－３－ｐｈｅｎｙｌｐｒｏｐａｎｏｙｌ］ａｍｉｎｏ］－３－ｐｈｅｎｙｌｐｒｏｐａｎｏｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｈｅｘａｎｏｙｌ］ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｅ－２－ｃａｒｂｏｎｙｌ］ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｅ－２－ｃａｒｂｏｎｙｌ］ａｍｉｎｏ］－５－ｏｘｏｐｅｎｔａｎｏｉｃ　ａｃｉｄ）およびこれらの誘導体等が挙げられる。

　上記の物質等がＨｉｐｐｏ経路阻害物質および活性化物質としての活性を有することは、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ　ｄｒｕｇ　ｔａｒｇｅｔｓ，　２０１７，　１８．４：　４４７－４５４．に記載されており、当業者にとって公知である。上記文献に記載の物質等をＨｉｐｐｏ経路阻害物質および活性化物質として用いることもできる。

　前述の通り、鼻腔上皮様組織中の細胞の分化傾向の調節の観点からは、工程（３）は、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質の存在下で行うこともまた好ましい。培地中のＷｎｔシグナル伝達経路作用物質の濃度は、上述の効果を達成可能な範囲で適宜設定することが可能である。鼻腔上皮様組織中の細胞の分化傾向の調節の観点からは、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質としてＣＨＩＲ９９０２１を用いる場合は、通常約１０ｐＭ～約１０ｍＭ、好ましくは約１００ｐＭ～約１ｍＭ、より好ましくは約１ｎＭ～約１００μＭ、さらに好ましくは約１０ｎＭ～約３０μＭ、最も好ましくは約１００ｎＭ～約３μＭの濃度で使用される。また、ＣＨＩＲ９９０２１以外のＷｎｔシグナル伝達経路作用物質を使用する場合、上記濃度のＣＨＩＲ９９０２１と同等のＷｎｔシグナル伝達経路促進活性を示す濃度で用いられることが望ましい。Ｗｎｔシグナル伝達経路促進活性は、例えばＨＥＫ２９３細胞を用いたＴｏｐｆｌａｓｈレポーターアッセイを用いて決定することができる。

　鼻腔上皮様組織中の細胞の分化傾向の調節の観点から、工程（３）及び以降の工程をアクチビン／ＴＧＦ－βシグナル伝達経路作用物質の存在下で行うこともまた好ましい。アクチビン／ＴＧＦ－βシグナル伝達経路作用物質とは、アクチビン／ＴＧＦ－βにより媒介されるシグナル伝達経路を増強し得る物質である。アクチビン／ＴＧＦ－βシグナル伝達経路作用物質としては、例えばアクチビン、及びＴＧＦ－β等の組換えタンパク質、並びに、Ａｌａｎｔｏｌａｃｔｏｎｅ等のアクチビン／ＴＧＦ－βシグナル伝達経路を活性化させる物質等が挙げられる。これらの物質は単独で又は複数種を組み合わせて用いてもよい。生物学的活性の見地からのアクチビン／ＴＧＦ－βシグナル伝達経路作用物質としては、例えばヒト慢性骨髄性白血病由来細胞株Ｋ５６２等の細胞に対するヘモグロビン発現誘導能を有する物質が挙げられる。アクチビン／ＴＧＦ－βシグナル伝達経路作用物質としてヒト組換えアクチビン（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いる場合は、通常１ｐｇ／ｍｌ～１ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１００ｐｇ／ｍｌ～１０μｇ／ｍｌ、より好ましくは１ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度で用いる。ヒト組換えアクチビン以外のアクチビン／ＴＧＦ－βシグナル伝達経路作用物質を用いる場合は、当業者にとって周知の、前記ヒト組替アクチビン添加濃度と同様の生理活性を示す濃度で添加すればよい。工程（３）より以前の工程においてアクチビン／ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害物質を添加している場合は、例えば細胞凝集体を培養器材から回収後、アクチビン／ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害物質を含まない培地、緩衝液等で複数回洗浄し、新しい培養器材に細胞凝集体を移設したあとアクチビン／ＴＧＦ－βシグナル伝達経路作用物質を含む培地を添加することが好ましい。

　浮遊培養を実施している場合、工程（３）及び以降の工程において細胞凝集体同士の接着を抑制、細胞の保護及び生体の物理的環境を模して鼻腔上皮様組織の製造効率を向上させる観点から、増粘剤を含有し、粘性を有する培地中で細胞凝集体を培養することもできる。

　培地に粘性を付与する手段は特に制限されないが、例えば、一般に増粘剤として知られる物質を適当な濃度で培地に添加することにより実施されうる。増粘剤としては、培地に上記の適度な粘度を付与し得るものであって、当該粘度を付与し得る濃度範囲において、細胞に悪影響を及ぼさない（細胞毒性がない）ものであれば、いかなる増粘剤も使用することができる。増粘剤としては、例えばペクチン、グアーガム、キサンタンガム、タマリンドガム、カラギーナン、ローカストビーンガム、ジェランガム、デキストリン、ダイユータンガム、デンプン、タラガム、アルギン酸、カードラン、カゼインナトリウム、カロブビーンガム、キチン、キトサン、グルコサミン、プルラン、食物繊維及びこれらの化学修飾された物質又は誘導体、セルロース、アガロースなどの多糖、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルエチルセルロース、ヒドロキシプロピルエチルセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロース、ジヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルヒドロキシプロピルセルロースなどの多糖のエーテル、ポリアクリルアミド、ポリエチレンオキシド、及びポリビニルピロリドン、エチレングリコール／プロピレングリコール共重合体、ポリエチレンイミンポリビニルメチルエーテル、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、マレイン酸共重合体などの合成高分子、コラーゲン、ゼラチン、ヒアルロン酸、及びデキストランなどの生体高分子、あるいはそれらを模倣した人工高分子（例えば、エラスチン様ペプチドなど）が挙げられる。好ましくは、これら増粘剤は単独で用いてもよいし、何種類かの増粘剤の混合物として用いることもできる。また、増粘剤として用いられる水溶性高分子の共重合体を用いてもよい。好ましくは、メチルセルロース、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロース又はそれらの混合物、より好ましくはメチルセルロースを用いることができる。

　粘性を有する培地は、培養環境として好適に用いられる３７℃条件下で、通常１００ｍＰａ・Ｓ以上、好ましくは２５０ｍＰａ・Ｓ以上、より好ましくは５００ｍＰａ・Ｓ以上、さらに好ましくは１０００ｍＰａ・Ｓ以上の粘性を有するものが用いられる。上記粘性は、例えば日本産業規格（ＪＩＳ）に基づき、細管粘度計、落球粘度計、回転粘度計、振動粘度計等を用いて測定することが可能である。

　培地に添加される増粘剤の濃度は、粘性を付与可能であり細胞に対する障害性を有しない限り適宜調製可能である。増粘剤としてメチルセルロース（４０００ｃＰ）を用いる場合は、通常０．１％から１０％、好ましくは０．３％から７．５％、さらに好ましくは０．５％から５％の濃度で用いられる。

　浮遊培養を実施している場合、工程（３）及び以降の工程において細胞凝集体同士の接着・凝集を抑制、剪断力等の物理的刺激からの細胞の保護及び生体の物理的環境を模して鼻腔上皮様組織の製造効率を向上させる観点から、界面活性作用を有する物質を添加することもできる。このような物質としては例えば、アラキドン酸、リノール酸、リノレイン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、パルミチン酸、パルミトイル酸、及びステアリン酸等の脂肪酸、プルロニック　Ｆ－６８、及びＴｗｅｅｎ　８０等の界面活性剤、並びに、コレステロールが挙げられる。

　浮遊培養を実施している場合、工程（３）及び以降の工程において製造される細胞塊のサイズを均一にし、分化誘導の効率を制御する観点から、形成された細胞塊同士の接着を防止するような処置を講じることも望ましい。上記を実現する手段としては例えば、国際公開第２０１６／１２１７３７号に記載のリゾリン脂質類の添加、国際公開第２０１９／１３１９４１号に記載のトロンビン受容体アゴニストの添加、国際公開第２０１６／１２１８４０号に記載の細胞間接着の阻害物質の添加等の手段が挙げられるが、これらに限定されない。細胞塊同士の接着を防止する別の態様として、細胞接着を制御するＲｈｏシグナル伝達経路に対する阻害物質の添加が挙げられる。細胞塊同士の接着を防止するＲｈｏシグナル伝達経路阻害物質は、好ましくはＲＯＣＫ阻害物質である。細胞塊同士の接着を防止する目的でＲＯＣＫ阻害物質であるＹ－２７６３２又はＣｈｒｏｍａｎ　１を添加する場合は、細胞保護物質として使用する場合と同様の条件にて添加することができる。ＲＯＣＫ阻害物質であるＹ－２７６３２を添加する場合は、通常１０ｎＭから１０ｍＭ、好ましくは１００ｎＭから１ｍＭ、より好ましくは１μＭから１００μＭの濃度となるように培養環境中に添加する。ＲＯＣＫ阻害物質であるＣｈｒｏｍａｎ　１を添加する場合は通常１０ｐＭから１ｍＭ、好ましくは１００ｐＭから１００μＭ、より好ましくは１ｎＭから１０μＭの濃度となるように培養環境中に添加する。

　工程（２）まで浮遊培養を実施している場合、工程（３）及び以降の工程において形成された鼻腔上皮を構成する細胞の分化成熟を促進する観点から、形成された細胞凝集体を接着培養することもまた好ましい。浮遊培養から接着培養への移行の際には細胞凝集体をそのまま細胞培養ディッシュ上に静置することで接着させてもよいし、カッティング処置、あるいは細胞分散処置等を実施し、より小さな細胞凝集体又は単離された細胞の懸濁液を調製し、播種後に接着させてもよい。

　細胞を接着させる培養器材として、前述した平面の細胞培養ディッシュ、あるいはＴｒａｎｓｗｅｌｌ等の物質透過性を有する薄膜状の細胞培養器材のいずれの形態でも用いることができる。培養器材は、細胞の接着を促進するために基底膜標品、ラミニン等の細胞外マトリクス、ポリ－Ｄ－リジン等の合成細胞接着分子等でコーティングされていてもよい。

　工程（３）及び以降の工程において、鼻腔上皮を構成する細胞の生存及び分化成熟を促進する観点から、細胞凝集体を気相液相境界面培養法で培養することもまた好ましい。気相液相境界面培養法（Ａｉｒ　ｌｉｑｕｉｄ　ｉｎｔｅｒｆａｃｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ）とは、細胞又は組織の少なくとも一面が大気に暴露されているか、極めて近い位置にある条件での培養を表す。気相液相境界面培養法を実施するためには、例えば細胞又は組織を多孔性メンブレン上又はカルチャーインサート内で培養し、インサート内（内腔側）の培養液を抜き取り、インサート外側のウェル内の培養液のみで培養する方法、アガロース等のハイドロゲルを培養ディッシュ内に置き、その上に細胞又は組織等を置いてディッシュ内の培地から露出しつつ乾燥しない条件下で培養する方法、及び、アガロース等に包埋後、振動刃ミクロトーム等で細胞凝集体を薄切し、セルインサート内で薄切片を培養する方法等が挙げられる。主として酸素による大気への暴露の毒性を軽減する目的から、ＰＤＭＳ等の酸素透過性の膜や板を細胞又は組織等の上に置き、暴露条件を調節することもできる。上記のような気相液相境界面培養法は、例えばＲｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　１８．１（２０１７）：１９５、Ｓｃｉ　Ｒｅｐ　６，２１４７２、Ｎａｔ　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０１９　Ａｐｒ；２２（４）：６６９－６７９等を参照して実施することができる。

　工程（３）及び以降の工程において、鼻腔上皮を構成する細胞の生存及び分化成熟を促進する観点から、細胞凝集体をゲル中に包埋して培養する工程を含んでもよい。ゲルとしては、例えばアガロース、メチルセルロース、コラーゲン、及びマトリゲル等を用いたゲルが挙げられ、マトリゲルを用いることが好ましい。

　工程（３）及び以降の工程のゲル中に包埋して細胞を培養する工程において、細胞凝集体をそのまま包埋してもよいし、分散及び単離した後の細胞をゲル中に播種してもよい。セルソーター等を用いて基底細胞等特定の細胞腫を分取した後に播種してもよい。ゲル中に包埋する培養法のさらなる一態様として、線維芽細胞、間葉系細胞、血管系の細胞等の鼻腔上皮以外の細胞との共培養を実施することもできる。上記のようなゲル包埋培養は、例えばＮａｔｕｒｅ　５０１，３７３－３７９（２０１３）、Ｎａｔｕｒｅ，４９９，４８１－４８４（２０１３）、Ｎａｔ　Ｐｒｏｔｏｃ　１４，５１８－５４０（２０１９）、Ｇｅｎｅｓ　２０２０，１１，６０３等を参照して実施することができる。

　工程（３）及び以降の工程において、細胞への栄養及び酸素供給を改善し、物質交換を改善する目的から、細胞が物理的に揺動される培養方法を実施することも好ましい。このような培養方法としては、振盪培養、回転培養、攪拌培養等の静置培養以外の方法が挙げられる。振盪培養、回転培養、攪拌培養等を実施するための手段は特に限定されないが、例えば細胞を培養している培養器材をローテーター、シェーカー等に設置する、又は細胞をスターラー等が回転している環境下に置くことにより実施することができる。振盪培養、回転培養、攪拌培養の速度等のパラメーターは当業者であれば細胞への障害を生じない範囲で適宜設定可能である。例えば波動形揺動の３Ｄシェーカー（例えばＭｉｎｉ－Ｓｈａｋｅｒ　３Ｄ、Ｂｉｏｓａｎ社製）を用いて振盪培養を実施する場合は、例えば５～６０ｒｐｍ、好ましくは５～４０ｒｐｍ、より好ましくは５～２０ｒｐｍの範囲で振盪速度範囲を設定可能である。往復式のシェーカー（例えばＮＳ－ＬＲ、アズワン社製）を用いて振盪培養を実施する場合は、例えば１５～６０ｒｐｍ、好ましくは１５～５０ｒｐｍ、より好ましくは１５～４５ｒｐｍの範囲で振盪速度範囲を設定可能である。シーソー式のシェーカー（例えばＮＳ－Ｓ、アズワン社製）を用いて振盪培養を実施する場合は、例えば５～５０ｒｐｍ、好ましくは５～４０ｒｐｍ、より好ましくは５～３０ｒｐｍの範囲で振盪速度範囲を設定可能である。細胞凝集体を攪拌培養、回転培養で培養する場合は、例えばスピナーフラスコ（例えば３１５２、コーニング社製）をマグネティックスターラー上に設置し、細胞凝集体が目視で沈降しない程度の回転数で培養を実施することもできる。三次元回転浮遊培養装置（例えばＣｅｌｌＰｅｔ　ＣＵＢＥ、ジェイテック社製；Ｃｌｉｎｏｓｔａｒ、Ｃｅｌｖｉｖｏ社製）を用いて培養を実施することもできる。細胞への摩擦等の物理的な障害を抑制する観点から、前記のゲルに包埋した細胞凝集体を振盪培養、回転培養又は攪拌培養することもまた好ましい。

　工程（３）及び以降の工程において、細胞死を抑制し、細胞の増殖を促進する観点から、培地中にさらなる増殖因子を添加することもまた好ましい。添加される増殖因子の種類は、上記目的を達成可能な限り特に限定されない。かかる目的で用いられる増殖因子としては、インスリン様成長因子（ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ：ＩＧＦ）、神経成長因子（ｎｅｒｖｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ：ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ｂｒａｉｎ－ｄｅｒｉｖｅｄ　ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ　ｆａｃｔｏｒ：ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン３、ニューロトロフィン４／５、毛様体神経栄養因子（ｃｉｌｉａｒｙ　ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ　ｆａｃｔｏｒ：ＣＮＴＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ｖｅｓｉｃｕｌａｒ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ：ＶＥＧＦ）、色素上皮由来因子（ｐｉｇｍｅｎｔ　ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ－ｄｅｒｉｖｅｄ　ｆａｃｔｏｒ：ＰＥＤＦ）、肝細胞増殖因子（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ：ＨＧＦ）等が挙げられる。これらの増殖因子は、上記目的を達成可能な濃度で添加すればよい。

　工程（３）及び以降の工程において、細胞死を抑制し、細胞の増殖を促進する観点から、血小板由来成長因子（ｐｌａｔｅｌｅｔ－ｄｅｒｉｖｅｄ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ：ＰＤＧＦ）等の血小板由来成長因子受容体作用物質を培地中に添加することもまた好ましい。ＰＤＧＦにはＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄの四種類の遺伝子が存在し、ＡＡ、ＡＢ、ＢＢ、ＣＣ、ＤＤのホモ又は特定の組み合わせのヘテロの二量体を形成してリガンドとして機能する。ＰＤＧＦ受容体にはα及びβの二種類の遺伝子が存在し、αα、αβ、ββの組み合わせのホモ又はヘテロの二量体を形成して受容体として機能する。このうち、プラコードを含む非神経外胚葉ではＰＤＧＦＲβがよく発現している。本発明で用いる血小板由来成長因子受容体作用物質は、好ましくはＰＤＧＦＲββ又はＰＤＧＦＲαβに対する作用を有している。上記血小板由来成長因子受容体作用物質は、より好ましくはＰＤＧＦ－ＡＢ、ＰＤＧＦ－ＢＢ、ＰＤＧＦ－ＣＣ及びＰＤＧＦ－ＤＤのからなる群より選ばれる少なくとも１つを含み、さらに好ましくはＰＤＧＦ－ＢＢ及びＰＤＧＦ－ＣＣからなる群より選ばれる少なくとも１つを含む。ＰＤＧＦ－ＡＢ、ＰＤＧＦ－ＢＢ、ＰＤＧＦ－ＣＣ及びＰＤＧＦ－ＤＤは、組換えタンパク質としてＲ＆Ｄ　ｓｙｓｔｅｍｓ社、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社等から入手可能である。

　工程（３）及び以降の工程において、細胞死を抑制し、細胞の増殖を促進する観点から、高酸素の雰囲気下で培養することもまた好ましい。培養過程における高酸素条件は、例えば細胞を培養するインキュベーターに酸素ボンベを接続し、人工的に酸素を供給することにより実現できる。かかる目的での酸素濃度は、通常２５％から８０％であり、より好ましくは３０％から６０％である。

　工程（３）及び以降の工程において、細胞凝集体を培養する培地中への酸素供給量を増やす観点から、ガス交換効率の高い培養器材を用いることもできる。このような培養器材の例として、細胞培養ディッシュ、プレートの底面をガス透過性のフィルムとしたＬｕｍｏｘディッシュ（ザルスタット株式会社製）、ＶＥＣＥＬＬ　９６ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅ（株式会社ベセル製）等が挙げられる。前述した高酸素濃度条件下での培養と組み合わせて用いることもまた好ましい。

　工程（３）及び以降の工程において、細胞凝集体中の上皮組織の構造を維持する観点から、細胞保護剤を培地に添加することもできる。工程（３）及び以降の工程において用いられる細胞保護剤としては、上述したＦＧＦシグナル伝達経路作用物質、ヘパリン、ＲＯＣＫ阻害物質、基底膜標品、ミオシン阻害物質、ポリアミン類、ＩＳＲ阻害剤、カスパーゼ阻害剤、血清、及び血清代替物等が挙げられる。ミオシン阻害物質としては、例えば非筋型ミオシンＩＩ　ＡＴＰアーゼの阻害物質であるＢｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎ、ミオシン軽鎖キナーゼ（ＭＬＣＫ）の阻害物質であるＭＬ－７、ＭＬ－９、Ｗ－７、ＭＬＣＫ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｐｅｐｔｉｄｅ　１８及びこれらの誘導体等が挙げられる。添加する細胞保護剤は、工程（１）で添加したものと同一であっても異なっていてもよいが、好ましくは同一である。好ましい細胞保護剤としては、ＲＯＣＫ阻害物質が挙げられる。工程（３）及び以降の工程において、細胞保護剤としてＲＯＣＫ阻害物質であるＹ－２７６３２を添加する場合は、通常１０ｎＭから１０ｍＭ、好ましくは１００ｎＭから１ｍＭ、より好ましくは１μＭから１００μＭの濃度となるように培養環境中に添加する。ＲＯＣＫ阻害物質であるＣｈｒｏｍａｎ　１を添加する場合は通常１０ｐＭから１ｍＭ、好ましくは１００ｐＭから１００μＭ、より好ましくは１ｎＭから１０μＭの濃度となるように培養環境中に添加する。細胞保護剤として非筋型ミオシンＩＩ　ＡＴＰアーゼの阻害物質であるＢｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎを添加する場合は、通常１０ｎＭから１０ｍＭ、好ましくは１００ｎＭから１ｍＭ、より好ましくは１μＭから１００μＭの濃度となるように培養環境中に添加する。

　工程（３）及び以降の工程において、細胞保護剤以外の上皮組織の構造を維持する作用を有する物質を添加することもできる。上記のような物質として例えば細胞接着を促進する物質、基底膜成分の合成を促進する物質、基底膜成分の分解を阻害する物質等が挙げられる。細胞接着を促進する物質は細胞－細胞間の接着、細胞－基底膜間の接着、細胞－培養器材間の接着等いずれを促進するものであってもよいし、細胞接着に関与する因子の産生を促すものであってもよい。細胞接着を促進する物質として例えばアドヘサミン、アドヘサミン－ＲＧＤＳ誘導体、Ｐｙｒｉｎｔｅｇｒｉｎ、Ｂｉｏｔｉｎ　ｔｒｉｐｅｐｔｉｄｅ－１、Ａｃｅｔｙｌ　Ｔｅｔｒａｐｅｐｔｉｄｅ－３、ＲＧＤＳ　Ｐｅｐｔｉｄｅ及びこれらの誘導体等が挙げられる。基底膜成分の合成を促進する物質として例えばアスコルビン酸誘導体等が挙げられる。アスコルビン酸誘導体としては、例えばアスコルビン酸リン酸ナトリウム、アスコルビン酸リン酸マグネシウム、アスコルビン酸２－グルコシド、３－Ｏ－エチルアスコルビン酸、テトラヘキシルデカン酸アスコルビル、パルミチン酸アスコルビル、ステアリン酸アスコルビル、アスコルビン酸－２リン酸－６パルミチン酸、グリセリルオクチルアスコルビン酸等が挙げられる。基底膜成分の分解を阻害する物質として、例えばマトリックスメタロプロテアーゼ及びセリンプロテアーゼの阻害剤等が挙げられる。基底膜成分の合成を促進する物質であるアスコルビン酸誘導体の一種であるアスコルビン酸２－リン酸を添加する場合は、通常１０μｇ／ｍｌ以上１０００μｇ／ｍｌ以下、好ましくは３０μｇ／ｍｌ以上５００μｇ／ｍｌ以下、さらに好ましくは５０μｇ／ｍｌ以上３００μｇ／ｍｌ以下の濃度となるように培養環境中に添加する。他のアスコルビン酸及びアスコルビン酸の誘導体等を添加する際は、上記の濃度とモル当量が同程度となるように添加すればよい。

　工程（３）及び以降の工程において、鼻腔上皮又は嗅上皮を構成する細胞の生存を促進する観点から、酸化ストレスを軽減する作用を有する物質を添加することも好ましい。上記のような活性を有する物質として例えば抗酸化物質、フリーラジカルスカベンジャー作用を有する物質、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ阻害物質、シクロオキシゲナーゼ阻害物質、リポキシゲナーゼ（ＬＯＸ）阻害物質、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）様物質、Ｎｒｆ２活性化剤等が挙げられる。上記のような活性を有する物質として例えばアスコルビン酸、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン、酢酸（±）－α－トコフェロール、Ａｐｏｃｙｎｉｎ（４’－Ｈｙｄｒｏｘｙ－３’－ｍｅｔｈｏｘｙａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ）、ニコチンアミド、タウリン（２－アミノエタンスルホン酸）、ＩＭ－９３（１－Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ－３－（１－ｍｅｔｈｙｌ－１Ｈ－Ｉｎｄｏｌｅ－３－ｙｌ）－４－（Ｎ，Ｎ－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－１，３－ｐｒｏｐａｎｅｄｉａｍｉｎｅ）－１Ｈ－Ｐｙｒｒｏｌｅ－２、５Ｈ－ｄｉｏｎｅ）、Ｃａｆｆｅｉｃ　Ａｃｉｄ（３，４－Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｃｉｎｎａｍｉｃ　Ａｃｉｄ）、Ｃｅｌａｓｔｒｏｌ（３－Ｈｙｄｒｏｘｙ－２４－ｎｏｒ－２－ｏｘｏ－１（１０），３，５，７－ｆｒｉｅｄｅｌａｔｅｔｒａｅｎ－２９－ｏｉｃ　Ａｃｉｄ；Ｔｒｉｐｔｅｒｉｎ）、Ｅｂｓｅｌｅｎ（２－Ｐｈｅｎｙｌ－１，２－ｂｅｎｚｉｓｏｓｅｌｅｎａｚｏｌ－３（２Ｈ）－ｏｎｅ）、（－）－Ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ　Ｇａｌｌａｔｅ（（２Ｒ，３Ｒ）－２－（３，４，５－Ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）－３，４－ｄｉｈｙｄｒｏ－１［２Ｈ］－ｂｅｎｚｏｐｙｒａｎ－３，５，７－ｔｒｉｏｌ－３－（３，４，５－ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏａｔｅ））、ＥＵＫ－８（Ｎ，Ｎ’－Ｂｉｓ（ｓａｌｉｃｙｌｉｄｅｎｅａｍｉｎｏ）ｅｔｈａｎｅ－ｍａｎｇａｎｅｓｅ（ＩＩ））、Ｅｄａｒａｖｏｎｅ（３－Ｍｅｔｈｙｌ－１－ｐｈｅｎｙｌ－２－ｐｙｒａｚｏｌｉｎ－５－ｏｎｅ）、ＭｎＴＢＡＰ（Ｍｎ（ＩＩＩ）ｔｅｔｒａｋｉｓ（４－ｂｅｎｚｏｉｃ　ａｃｉｄ）ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ　Ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、Ｎｏｒｄｉｈｙｄｒｏｇｕａｉａｒｅｔｉｃ　Ａｃｉｄ、Ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ（ｔｒａｎｓ－３，４，５－Ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙｓｔｉｌｂｅｎｅ）及びこれらの誘導体等が挙げられるが、これらに限定はされない。細胞培養用に調製済の試薬（例えば抗酸化サプリメント、Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ社製、Ａ１３４５）を用いることもできる。本発明で用いる酸化ストレスを軽減する作用を有する物質は、好ましくはアスコルビン酸、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン並びにこれらの誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１つを含む。アスコルビン酸は、例えばその誘導体であるアスコルビン酸２リン酸として、１Ｍから１ｎＭ、好ましくは１００ｍＭから１０ｎＭ、より好ましくは１０ｍＭから１００ｎＭ、さらに好ましくは３ｍＭから１μＭの濃度で培地中に添加することができる。Ｎ－アセチル－Ｌ－システインは、例えば１ｎＭから１Ｍ、好ましくは１０ｎＭから１００ｍＭ、より好ましくは１００ｎＭから１０ｍＭ、さらに好ましくは１μＭから５ｍＭの濃度で培地中に添加することができる。

　工程（３）及び以降の工程において、鼻腔上皮又は嗅上皮を構成する細胞の生存を促進する観点から、ストレス応答シグナル伝達経路に対する阻害物質（ストレスに対する細胞内シグナル伝達機構を阻害する物質）を添加することもまた好ましい。ストレス応答性ＭＡＰキナーゼ経路（ｓｔｒｅｓｓ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅ：ＳＡＰＫ）はストレスに対する細胞内シグナル伝達機構の主要なものの一つである。ストレス応答性ＭＡＰキナーゼ経路の阻害剤としては例えばＭＡＰ３Ｋ阻害剤、ＭＡＰ２Ｋ阻害剤、ＡＳＫ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、Ａｋｔ阻害剤、Ｒｈｏファミリーキナーゼ阻害剤、ＪＮＫ阻害剤、ｐ３８阻害剤、ＭＳＫ阻害剤、ＳＴＡＴ阻害剤、ＮＦ－κＢ阻害剤、ＣＡＭＫ阻害剤等が挙げられる。

　ＭＥＫ阻害剤としては、例えばＳｅｌｕｍｅｔｉｎｉｂ（ＡＺＤ６２４４，６－（４－ｂｒｏｍｏ－２－ｃｈｌｏｒｏａｎｉｌｉｎｏ）－７－ｆｌｕｏｒｏ－Ｎ－（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｏｘｙ）－３－ｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｍｉｄａｚｏｌｅ－５－ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）、Ｍｉｒｄａｍｅｔｉｎｉｂ（ＰＤ０３２５９０１，Ｎ－［（２Ｒ）－２，３－ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｏｘｙ］－３，４－ｄｉｆｌｕｏｒｏ－２－（２－ｆｌｕｏｒｏ－４－ｉｏｄｏａｎｉｌｉｎｏ）ｂｅｎｚａｍｉｄｅ）、Ｔｒａｍｅｔｉｎｉｂ（ＧＳＫ１１２０２１２，Ｎ－［３－［３－ｃｙｃｌｏｐｒｏｐｙｌ－５－（２－ｆｌｕｏｒｏ－４－ｉｏｄｏａｎｉｌｉｎｏ）－６，８－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－２，４，７－ｔｒｉｏｘｏｐｙｒｉｄｏ［４，３－ｄ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－１－ｙｌ］ｐｈｅｎｙｌ］ａｃｅｔａｍｉｄｅ）、Ｕ０１２６（１，４－ｄｉａｍｉｎｏ－２，３－ｄｉｃｙａｎｏ－１，４－ｂｉｓ（２－ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌｔｈｉｏ）ｂｕｔａｄｉｅｎｅ）、ＰＤ１８４３５２（ＣＩ－１０４０，２－（２－ｃｈｌｏｒｏ－４－ｉｏｄｏａｎｉｌｉｎｏ）－Ｎ－（ｃｙｃｌｏｐｒｏｐｙｌｍｅｔｈｏｘｙ）－３，４－ｄｉｆｌｕｏｒｏｂｅｎｚａｍｉｄｅ）、ＰＤ９８０５９（２－（２－ａｍｉｎｏ－３－ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｃｈｒｏｍｅｎ－４－ｏｎｅ）、ＢＩＸ　０２１８９（３－［Ｎ－［３－［（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｍｅｔｈｙｌ］ｐｈｅｎｙｌ］－Ｃ－ｐｈｅｎｙｌｃａｒｂｏｎｉｍｉｄｏｙｌ］－２－ｈｙｄｒｏｘｙ－Ｎ，Ｎ－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－１Ｈ－ｉｎｄｏｌｅ－６－ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）、Ｐｉｍａｓｅｒｔｉｂ（ＡＳ－７０３０２６，Ｎ－［（２Ｓ）－２，３－ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌ］－３－（２－ｆｌｕｏｒｏ－４－ｉｏｄｏａｎｉｌｉｎｏ）ｐｙｒｉｄｉｎｅ－４－ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）、Ｐｅｌｉｔｉｎｉｂ（ＥＫＢ－５６９，（Ｅ）－Ｎ－［４－（３－ｃｈｌｏｒｏ－４－ｆｌｕｏｒｏａｎｉｌｉｎｏ）－３－ｃｙａｎｏ－７－ｅｔｈｏｘｙｑｕｉｎｏｌｉｎ－６－ｙｌ］－４－（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｂｕｔ－２－ｅｎａｍｉｄｅ）、ＢＩＸ　０２１８８（３－［Ｎ－［３－［（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｍｅｔｈｙｌ］ｐｈｅｎｙｌ］－Ｃ－ｐｈｅｎｙｌｃａｒｂｏｎｉｍｉｄｏｙｌ］－２－ｈｙｄｒｏｘｙ－１Ｈ－ｉｎｄｏｌｅ－６－ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）、ＴＡＫ－７３３（３－［（２Ｒ）－２，３－ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌ］－６－ｆｌｕｏｒｏ－５－（２－ｆｌｕｏｒｏ－４－ｉｏｄｏａｎｉｌｉｎｏ）－８－ｍｅｔｈｙｌｐｙｒｉｄｏ［２，３－ｄ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ－４，７－ｄｉｏｎｅ）、ＡＺＤ８３３０　（２－（２－ｆｌｕｏｒｏ－４－ｉｏｄｏａｎｉｌｉｎｏ）－Ｎ－（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｏｘｙ）－１，５－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－６－ｏｘｏｐｙｒｉｄｉｎｅ－３－ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）、Ｂｉｎｉｍｅｔｉｎｉｂ（ＭＥＫ１６２，６－（４－ｂｒｏｍｏ－２－ｆｌｕｏｒｏａｎｉｌｉｎｏ）－７－ｆｌｕｏｒｏ－Ｎ－（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｏｘｙ）－３－ｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｍｉｄａｚｏｌｅ－５－ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）、ＳＬ－３２７（（Ｚ）－３－ａｍｉｎｏ－３－（４－ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌ）ｓｕｌｆａｎｙｌ－２－［２－（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］ｐｒｏｐ－２－ｅｎｅｎｉｔｒｉｌｅ）、Ｒｅｆａｍｅｔｉｎｉｂ（ＲＤＥＡ１１９，Ｎ－［３，４－ｄｉｆｌｕｏｒｏ－２－（２－ｆｌｕｏｒｏ－４－ｉｏｄｏａｎｉｌｉｎｏ）－６－ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ］－１－［（２Ｓ）－２，３－ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌ］ｃｙｃｌｏｐｒｏｐａｎｅ－１－ｓｕｌｆｏｎａｍｉｄｅ）、ＧＤＣ－０６２３（５－（２－ｆｌｕｏｒｏ－４－ｉｏｄｏａｎｉｌｉｎｏ）－Ｎ－（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｏｘｙ）ｉｍｉｄａｚｏ［１，５－ａ］ｐｙｒｉｄｉｎｅ－６－ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）、ＢＩ－８４７３２５（３－［３－［Ｎ－［４－［（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｍｅｔｈｙｌ］ｐｈｅｎｙｌ］－Ｃ－ｐｈｅｎｙｌｃａｒｂｏｎｉｍｉｄｏｙｌ］－２－ｈｙｄｒｏｘｙ－１Ｈ－ｉｎｄｏｌ－６－ｙｌ］－Ｎ－ｅｔｈｙｌｐｒｏｐ－２－ｙｎａｍｉｄｅ）、ＲＯ５１２６７６６（ＣＨ５１２６７６６，３－［［３－ｆｌｕｏｒｏ－２－（ｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆａｍｏｙｌａｍｉｎｏ）ｐｙｒｉｄｉｎ－４－ｙｌ］ｍｅｔｈｙｌ］－４－ｍｅｔｈｙｌ－７－ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－２－ｙｌｏｘｙｃｈｒｏｍｅｎ－２－ｏｎｅ）、Ｃｏｂｉｍｅｔｉｎｉｂ（ＧＤＣ－０９７３，［３，４－ｄｉｆｌｕｏｒｏ－２－（２－ｆｌｕｏｒｏ－４－ｉｏｄｏａｎｉｌｉｎｏ）ｐｈｅｎｙｌ］－［３－ｈｙｄｒｏｘｙ－３－［（２Ｓ）－ｐｉｐｅｒｉｄｉｎ－２－ｙｌ］ａｚｅｔｉｄｉｎ－１－ｙｌ］ｍｅｔｈａｎｏｎｅ）及びこれらの誘導体等が挙げられる。

　ｐ３８阻害剤としては、例えば、ＳＢ２０３５８０（４－［４－（４－ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）－２－（４－ｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｉｎｙｌｐｈｅｎｙｌ）－１Ｈ－ｉｍｉｄａｚｏｌ－５－ｙｌ］ｐｙｒｉｄｉｎｅ）、Ｄｏｒａｍａｐｉｍｏｄ（ＢＩＲＢ　７９６，１－［５－ｔｅｒｔ－ｂｕｔｙｌ－２－（４－ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌ）ｐｙｒａｚｏｌ－３－ｙｌ］－３－［４－（２－ｍｏｒｐｈｏｌｉｎ－４－ｙｌｅｔｈｏｘｙ）ｎａｐｈｔｈａｌｅｎ－１－ｙｌ］ｕｒｅａ）、ＳＢ２０２１９０（ＦＨＰＩ，４－［４－（４－ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）－５－ｐｙｒｉｄｉｎ－４－ｙｌ－１Ｈ－ｉｍｉｄａｚｏｌ－２－ｙｌ］ｐｈｅｎｏｌ）、Ｒａｌｉｍｅｔｉｎｉｂ　ｄｉｍｅｓｙｌａｔｅ（５－［２－ｔｅｒｔ－ｂｕｔｙｌ－４－（４－ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）－１Ｈ－ｉｍｉｄａｚｏｌ－５－ｙｌ］－３－（２，２－ｄｉｍｅｔｈｙｌｐｒｏｐｙｌ）ｉｍｉｄａｚｏ［４，５－ｂ］ｐｙｒｉｄｉｎ－２－ａｍｉｎｅ；ｍｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ）、ＶＸ－７０２（６－（Ｎ－ｃａｒｂａｍｏｙｌ－２，６－ｄｉｆｌｕｏｒｏａｎｉｌｉｎｏ）－２－（２，４－ｄｉｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）ｐｙｒｉｄｉｎｅ－３－ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）、ＰＨ－７９７８０４（３－［３－ｂｒｏｍｏ－４－［（２，４－ｄｉｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）ｍｅｔｈｏｘｙ］－６－ｍｅｔｈｙｌ－２－ｏｘｏｐｙｒｉｄｉｎ－１－ｙｌ］－Ｎ，４－ｄｉｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚａｍｉｄｅ）、Ｎｅｆｌａｍａｐｉｍｏｄ（ＶＸ－７４５，５－（２，６－ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）－２－（２，４－ｄｉｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）ｓｕｌｆａｎｙｌｐｙｒｉｍｉｄｏ［１，６－ｂ］ｐｙｒｉｄａｚｉｎ－６－ｏｎｅ）、ＴＡＫ－７１５（Ｎ－［４－［２－ｅｔｈｙｌ－４－（３－ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌ）－１，３－ｔｈｉａｚｏｌ－５－ｙｌ］ｐｙｒｉｄｉｎ－２－ｙｌ］ｂｅｎｚａｍｉｄｅ）、ＰＤ　１６９３１６（４－［４－（４－ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）－２－（４－ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）－１Ｈ－ｉｍｉｄａｚｏｌ－５－ｙｌ］ｐｙｒｉｄｉｎｅ）、ＴＡ－０２（４－［２－（２－ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）－４－（４－ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）－１Ｈ－ｉｍｉｄａｚｏｌ－５－ｙｌ］ｐｙｒｉｄｉｎｅ）、ＳＤ　０００６（１－［４－［３－（４－ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）－４－ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－４－ｙｌ－１Ｈ－ｐｙｒａｚｏｌ－５－ｙｌ］ｐｉｐｅｒｉｄｉｎ－１－ｙｌ］－２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈａｎｏｎｅ）、Ｐａｍａｐｉｍｏｄ（６－（２，４－ｄｉｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｏｘｙ）－２－（１，５－ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｅｎｔａｎ－３－ｙｌａｍｉｎｏ）－８－ｍｅｔｈｙｌｐｙｒｉｄｏ［２，３－ｄ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－７－ｏｎｅ）、ＢＭＳ－５８２９４９（４－［５－（ｃｙｃｌｏｐｒｏｐｙｌｃａｒｂａｍｏｙｌ）－２－ｍｅｔｈｙｌａｎｉｌｉｎｏ］－５－ｍｅｔｈｙｌ－Ｎ－ｐｒｏｐｙｌｐｙｒｒｏｌｏ［２，１－ｆ］［１，２，４］ｔｒｉａｚｉｎｅ－６－ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）、ＳＢ２３９０６３（４－［４－（４－ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）－５－（２－ｍｅｔｈｏｘｙｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－４－ｙｌ）ｉｍｉｄａｚｏｌ－１－ｙｌ］ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎ－１－ｏｌ）、Ｓｋｅｐｉｎｏｎｅ－Ｌ（１３－（２，４－ｄｉｆｌｕｏｒｏａｎｉｌｉｎｏ）－５－［（２Ｒ）－２，３－ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｏｘｙ］ｔｒｉｃｙｃｌｏ［９．４．０．０３，８］ｐｅｎｔａｄｅｃａ－１（１１），３（８），４，６，１２，１４－ｈｅｘａｅｎ－２－ｏｎｅ）、ＤＢＭ　１２８５（Ｎ－ｃｙｃｌｏｐｒｏｐｙｌ－４－［４－（４－ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）－２－ｐｉｐｅｒｉｄｉｎ－４－ｙｌ－１，３－ｔｈｉａｚｏｌ－５－ｙｌ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－２－ａｍｉｎｅ；ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ＳＢ　７０６５０４（１－ｃｙａｎｏ－２－［２－［［８－（２，６－ｄｉｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）－４－（４－ｆｌｕｏｒｏ－２－ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌ）－７－ｏｘｏｐｙｒｉｄｏ［２，３－ｄ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－２－ｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｅｔｈｙｌ］ｇｕａｎｉｄｉｎｅ）、ＳＣＩＯ　４６９（２－［６－ｃｈｌｏｒｏ－５－［（２Ｒ，５Ｓ）－４－［（４－ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ］－２，５－ｄｉｍｅｔｈｙｌｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ－１－ｃａｒｂｏｎｙｌ］－１－ｍｅｔｈｙｌｉｎｄｏｌ－３－ｙｌ］－Ｎ，Ｎ－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－２－ｏｘｏａｃｅｔａｍｉｄｅ）、Ｐｅｘｍｅｔｉｎｉｂ（１－［５－ｔｅｒｔ－ｂｕｔｙｌ－２－（４－ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌ）ｐｙｒａｚｏｌ－３－ｙｌ］－３－［［５－ｆｌｕｏｒｏ－２－［１－（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｉｎｄａｚｏｌ－５－ｙｌ］ｏｘｙｐｈｅｎｙｌ］ｍｅｔｈｙｌ］ｕｒｅａ）、ＵＭ－１６４（２－［［６－［４－（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｐｉｐｅｒａｚｉｎ－１－ｙｌ］－２－ｍｅｔｈｙｌｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－４－ｙｌ］ａｍｉｎｏ］－Ｎ－［２－ｍｅｔｈｙｌ－５－［［３－（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌ）ｂｅｎｚｏｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｐｈｅｎｙｌ］－１，３－ｔｈｉａｚｏｌｅ－５－ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）、ｐ３８　ＭＡＰＫ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（４－（２，４－ｄｉｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）－８－（２－ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌ）－７－ｏｘｉｄｏ－１，７－ｎａｐｈｔｈｙｒｉｄｉｎ－７－ｉｕｍ）、ｐ３８　ＭＡＰ　Ｋｉｎａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ
　ＩＩＩ（４－［５－（４－ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）－２－ｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆａｎｙｌ－１Ｈ－ｉｍｉｄａｚｏｌ－４－ｙｌ］－Ｎ－（１－ｐｈｅｎｙｌｅｔｈｙｌ）ｐｙｒｉｄｉｎ－２－ａｍｉｎｅ）、ｐ３８　ＭＡＰ　Ｋｉｎａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ＩＶ（３，４，６－ｔｒｉｃｈｌｏｒｏ－２－（２，３，５－ｔｒｉｃｈｌｏｒｏ－６－ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｓｕｌｆｏｎｙｌｐｈｅｎｏｌ）、ＣＡＹ１０５５７１（４－［５－（４－ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）－２－［４－（ｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］－１Ｈ－ｉｍｉｄａｚｏｌ－４－ｙｌ］－ｐｙｒｉｄｉｎｅ）及びこれらの誘導体等が挙げられる。

　ＪＮＫ阻害剤としては、例えば工程（１）で記載したものと同様の物が挙げられる。本発明で用いるストレスに対する細胞内シグナル伝達機構を阻害する物質は、好ましくはＭＥＫ阻害剤、ｐ３８阻害剤、及びＪＮＫ阻害剤からなる群から選ばれる一つ以上である。ｐ３８阻害剤としてＳＢ２０３５８０を用いる場合は、通常１ｎＭから１ｍＭ、好ましくは１０ｎＭから１００μＭ、より好ましくは１００ｎＭから１０μＭ、さらに好ましくは５００ｎＭから５μＭの濃度で、培地中に添加することができる。ＭＥＫ阻害剤としてＰＤ０３２５９０１を用いる場合は、通常１ｎＭから１ｍＭ、好ましくは１０ｎＭから１００μＭ、より好ましくは１００ｎＭから１０μＭ、さらに好ましくは５００ｎＭから５μＭの濃度で、培地中に添加することができる。ＪＮＫ阻害剤としてＪＮＫ－ＩＮ－８を用いる場合は、工程（１）に記載の濃度と同様の濃度で、培地中に添加することができる。他のＭＥＫ阻害剤、ｐ３８阻害剤、ＪＮＫ阻害剤を用いる場合は上記阻害剤の添加濃度と同等の阻害活性を有する濃度で添加することが好ましい。

　＜工程（４）＞
　工程（４）では、工程（３）で培養した細胞をさらに培養し、鼻腔上皮を構成する細胞を得る。工程（４）の一形態は、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質、ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質及びＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質からなる群より選ばれる少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つの非存在下で細胞を培養する。工程（４）の好ましい一形態は、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質、ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質及びＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質の非存在下で細胞を培養する。工程（４）の一形態は、ＦＧＦシグナル伝達経路阻害物質、Ｓｈｈシグナル伝達経路作用物質、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路阻害物質、アクチビン／ＴＧＦ－βシグナル伝達経路作用物質及びレチノイン酸シグナル伝達経路作用物質からなる群より選ばれる少なくとも１つの存在下で細胞を培養する。工程（４）は、好ましくはＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質、ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質及びＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質からなる群より選ばれる少なくとも２つの非存在下、かつ、ＦＧＦシグナル伝達経路阻害物質、Ｓｈｈシグナル伝達経路作用物質、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路阻害物質、アクチビン／ＴＧＦ－βシグナル伝達経路作用物質及びレチノイン酸シグナル伝達経路作用物質からなる群より選ばれる少なくとも１つの存在下で細胞を培養する。

　工程（３）で細胞を浮遊培養している場合は、工程（４）でも引き続き細胞凝集体を浮遊培養すればよい。工程（３）で細胞を接着培養している場合は、工程（４）でも引き続き細胞を接着培養すればよい。工程（３）で浮遊培養した後、工程（４）で接着培養してもよい。工程（３）で接着培養した後、工程（４）で浮遊培養してもよい。

　工程（４）においてＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質、ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質及びＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質からなる群より選ばれる少なくとも１つの非存在下で浮遊培養を行うためには、工程（３）にて添加され得る上記物質を培養環境中より除く必要がある。その為の操作として、例えば半量培地交換操作、全量培地交換操作が挙げられる。上記の培地交換操作を、１日に複数回、好ましくは１時間以内に複数回（例えば２～３回）行ってもよい。培地交換操作を複数回行う際の最終回、工程（４）以降の培養を行う培地以外は、細胞培養にかかる費用を低減する観点から、例えば生理食塩水、並びに、ＫＳＲ及び増殖因子等の添加物を含まない培地等を用いてもよい。

　Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質、ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質及びＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質からなる群より選ばれる少なくとも１つの非存在下で浮遊培養を行うための別の操作として、細胞を別の滅菌済み容器（１５ｍｌチューブ、浮遊培養用シャーレ等）に回収し、培地又は生理食塩水等で洗浄したのちに、上記物質のうち少なくとも１つの非存在下の培養環境に移す操作が挙げられる。その際の移設後の培養に用いる培養容器は、工程（３）までで用いていたものと同様の物（９６ウェルプレート等）でもよいし、別の容器（浮遊培養用ディッシュ等）でもよい。

　工程（４）においてＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質、ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質及びＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質からなる群より選ばれる少なくとも１つの非存在下での浮遊培養を実施するに当たり、培地交換操作又は細胞凝集体の移設操作の煩雑さを回避する観点から、各ウェル内に細胞凝集体が入ったままの状態でプレート全体の培地を一度に交換することが可能な三次元細胞培養容器を用いることもまた好ましい。

　工程（４）において、工程（３）で得られた細胞を、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質、ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質及びＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質からなる群より選ばれる少なくとも１つの非存在下で浮遊培養することで、上気道様組織の形成効率が向上し、鼻腔上皮を構成する細胞の割合が向上した細胞集団を得ることができる。

　上気道様組織の形成効率及び鼻腔上皮を構成する細胞の増殖の促進の観点からは、工程（４）の開始時期は、一定程度の非神経上皮細胞の分化が生じた後に実施するのが好ましく、具体的な時期としては、工程（３）の開始からは０．５時間以降６０日以内であり、好ましくは２４時間以降４５日以内であり、より好ましくは３日以降３０日以内である。

　工程（４）における培養の期間は、適宜設定できる。工程（４）における培養の時間は、通常８時間～２００日間程度、好ましくは１０時間～１８０日間程度、より好ましくは１２時間～１５０日間程度、さらに好ましくは１４時間～１２０日間程度、最も好ましくは２０日間～１００日間程度である。

　鼻腔上皮様組織中の細胞の分化傾向の調節の観点から、工程（４）は、ＦＧＦシグナル伝達経路阻害物質の存在下で行うこともまた好ましい。ＦＧＦシグナル伝達経路阻害物質としてはＦＧＦにより媒介されるシグナル伝達を抑制し得るものである限り特に限定されず、核酸、タンパク質、低分子有機化合物のいずれであってもよい。当該物質として例えば、ＦＧＦと直接結合してトラップする物質、ＦＧＦ受容体のキナーゼ活性を阻害する物質、ＦＧＦによって活性化される細胞内シグナル伝達を阻害する物質、ＦＧＦ刺激によって誘導される遺伝子発現を抑制する物質等が挙げられる。上記のような作用を有する物質としては、例えば抗ＦＧＦ抗体、ＧＰ３６９（抗ＦＧＦＲ２抗体）、ＳＵ５４０２（３－［４－Ｍｅｔｈｙｌ－２－［（２－ｏｘｏ－１Ｈ－ｉｎｄｏｌ－３－ｙｌｉｄｅｎｅ）ｍｅｔｈｙｌ］－１Ｈ－ｐｙｒｒｏｌ－３－ｙｌ］ｐｒｏｐａｎｏｉｃ　ａｃｉｄ）、ＢＧＪ３９８（３－（２，６－Ｄｉｃｈｌｏｒｏ－３，５－ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）－１－［６－［［４－（４－ｅｔｈｙｌｐｉｐｅｒａｚｉｎ－１－ｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－４－ｙｌ］－１－ｍｅｔｈｙｌｕｒｅａ）、ＰＤ１７３０７４（１－（Ｔｅｒｔ－Ｂｕｔｙｌ）－３－（２－（（４－（ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｂｕｔｙｌ）ａｍｉｎｏ）－６－（３，５－ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｐｙｒｉｄｏ［２，３－ｄ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－７－ｙｌ）ｕｒｅａ）、ＡＺＤ４５４７（ｒｅｌ－Ｎ－［５－［２－（３，５－Ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｅｔｈｙｌ］－１Ｈ－ｐｙｒａｚｏｌ－３－ｙｌ］－４－［（３Ｒ，５Ｓ）－３，５－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ］ｂｅｎｚａｍｉｄｅ）、Ｅｒｄａｆｉｔｉｎｉｂ（Ｎ－（３，５－ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）－Ｎ－（１－ｍｅｔｈｙｌｅｔｈｙｌ）－Ｎ－［３－（１－ｍｅｔｈｙｌ－１Ｈ－ｐｙｒａｚｏｌ－４－ｙｌ）ｑｕｉｎｏｘａｌｉｎ－６－ｙｌ］ｅｔｈａｎｅ－１，２－ｄｉａｍｉｎｅ）、ＢＹＬ７１９（（２Ｓ）－Ｎ１－［４－Ｍｅｔｈｙｌ－５－［２－（２，２，２－ｔｒｉｆｌｕｏｒｏ－１，１－ｄｉｍｅｔｈｙｌｅｔｈｙｌ）－４－ｐｙｒｉｄｉｎｙｌ］－２－ｔｈｉａｚｏｌｙｌ］－１，２－ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｅｄｉｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）、ＧＳＫ２６３６７７１（２－Ｍｅｔｈｙｌ－１－［［２－Ｍｅｔｈｙｌ－３－（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏＭｅｔｈｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］Ｍｅｔｈｙｌ］－６－（４－Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｙｌ）－１Ｈ－ｂｅｎｚｉＭｉｄａｚｏｌｅ－４－ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ　ａｃｉｄ）、Ｔａｓｅｌｉｓｉｂ（２－Ｍｅｔｈｙｌ－２－［４－［２－（５－Ｍｅｔｈｙｌ－２－ｐｒｏｐａｎ－２－ｙｌ－１，２，４－ｔｒｉａｚｏｌ－３－ｙｌ）－５，６－ｄｉｈｙｄｒｏｉＭｉｄａｚｏ［１，２－ｄ］［１，４］ｂｅｎｚｏｘａｚｅｐｉｎ－９－ｙｌ］ｐｙｒａｚｏｌ－１－ｙｌ］ｐｒｏｐａｎａＭｉｄｅ）、Ｃａｐｉｖａｓｅｒｔｉｂ（４－Ａｍｉｎｏ－Ｎ－［（１Ｓ）－１－（４－ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）－３－ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌ］－１－（７Ｈ－ｐｙｒｒｏｌｏ［２，３－ｄ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－４－ｙｌ）－４－ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）、Ｓａｐａｎｉｓｅｒｔｉｂ（２－（（（１Ｒ，４Ｒ）－４－（（（（４－ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）（ｐｈｅｎｙｌ）ｃａｒｂａｍｏｙｌ）ｏｘｙ）ｍｅｔｈｙｌ）ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ）ｍｅｔｈｏｘｙ）ａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ）、Ｄａｂｒａｆｅｎｉｂ（Ｎ－［３－［５－（２－Ａｍｉｎｏ－４－ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｙｌ）－２－（ｔｅｒｔ－ｂｕｔｙｌ）－４－ｔｈｉａｚｏｌｙｌ］－２－ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ］－２，６－ｄｉｆｌｕｏｒｏｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｍｉｄｅ）、Ｂｉｎｉｍｅｔｉｎｉｂ（５－［（４－Ｂｒｏｍｏ－２－ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）ａｍｉｎｏ］－４－ｆｌｕｏｒｏ－Ｎ－（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｏｘｙ）－１－ｍｅｔｈｙｌ－１Ｈ－ｂｅｎｚｉｍｉｄａｚｏｌｅ－６－ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）、Ｔｒａｍｅｔｉｎｉｂ（Ｎ－［３－［３－Ｃｙｃｌｏｐｒｏｐｙｌ－５－［（２－ｆｌｕｏｒｏ－４－ｉｏｄｏｐｈｅｎｙｌ）ａｍｉｎｏ］－３，４，６，７－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－６，８－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－２，４，７－ｔｒｉｏｘｏｐｙｒｉｄｏ［４，３－ｄ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－１（２Ｈ）－ｙｌ］ｐｈｅｎｙｌ］ａｃｅｔａｍｉｄｅ）及びこれらの誘導体等が挙げられる。

　ＦＧＦシグナル伝達経路阻害物質の濃度は、鼻腔上皮を構成する細胞を効率よく製造できる範囲で適宜設定することができる。ＦＧＦシグナル伝達経路阻害物質としてＳＵ５４０２を用いる場合には、工程（４）におけるＦＧＦシグナル伝達経路阻害物質の濃度は、通常１ｎＭから１００ｍＭ、好ましくは１０ｎＭ～１０ｍＭ、より好ましくは１００ｎＭ～１ｍＭである。ＦＧＦシグナル伝達経路阻害物質としてＰＤ１７３０７４を用いる場合には、工程（４）におけるＦＧＦシグナル伝達経路阻害物質の濃度は、１ｎＭから１００ｍＭ、好ましくは１０ｎＭ～１０ｍＭ、より好ましくは１００ｎＭ～１ｍＭである。上記以外のＦＧＦシグナル伝達経路阻害物質を用いる場合には、上記濃度のＳＵ５４０２と同等のＦＧＦシグナル伝達経路阻害活性を示す濃度で用いられることが好ましい。

　鼻腔上皮様組織中の細胞の分化傾向の調節の観点から、工程（４）は、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質の存在下で行うこともまた好ましい。工程（４）で用いるＢＭＰシグナル伝達経路作用物質は、工程（２）で用いた物質と同一であっても異なっていてもよいが、好ましくは同一である。

　鼻腔上皮様組織中の細胞の分化傾向の調節の観点から、工程（４）は、さらにＳｈｈシグナル伝達経路作用物質、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路阻害物質、アクチビン／ＴＧＦ－βシグナル伝達経路作用物質及びレチノイン酸シグナル伝達経路作用物質からなる群より選ばれる少なくとも１つの存在下で行なうこともまた好ましい。工程（４）で用いる上記物質は、工程（ａ）～工程（３）で用いた物質と異なっていてもよいが、好ましくは同一である。添加物の濃度及び種類については、適宜調整することができる。

　工程（４）の別の一態様として、工程（３）では細胞凝集体中に嗅神経前駆細胞が分化するまで浮遊培養し、工程（４）ではさらに培養を継続し、嗅神経前駆細胞が存在する上皮と連続する同一の上皮上に鼻腔上皮を構成する細胞を得ることができる。より好ましくは、工程（３）までを実施し、細胞凝集体中の非神経上皮組織中に嗅神経細胞及び嗅上皮組織が形成された細胞凝集体を、工程（４）としてさらなる培養を実施することで、非神経上皮組織中に鼻腔上皮を構成する細胞を形成させることができる。その際の培地としては、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質、ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質及びＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質を含有しない培地を用いてもよいし、工程（３）と同じ培地を用いてもよい。

　細胞集団への病原体の接触及び疾患モデルの形成を企図する場合は、工程（３）の後に細胞集団への病原体の接触を行ってもよい。細胞集団と病原体との接触は、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質、ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質及びＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質からなる群より選ばれる少なくとも１つを含まない培地中で行ってもよいし、工程（３）と同じ培地中で行なってもよい。

　工程（４）に用いられる培地は、特に限定されないが、工程（１）から工程（３）で用いた培地と同じ培地を用いることができる。神経細胞等の培養に用いる既知の培地、例えばＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地とＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地の１：１混合液に０．５％　Ｎ２　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔと１％　Ｂ２７　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔが添加された培地（Ｎ２Ｂ２７培地）、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ　ＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地にＳｔｅｍＰｒｏ　ＮＳＣ　ＳＦＭ　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔが添加された培地（ＳｔｅｍＰｒｏ　ＮＳＣ　ＳＦＭ培地）、中枢神経系オルガノイド用の培地（ＳＴＥＭｄｉｆｆ　Ｃｅｒｅｂｒａｌ　Ｏｒｇａｎｏｉｄ　Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ）、上皮細胞培養用の培地（ＰｎｅｕｍｏＣｕｌｔ　ＡＬＩ　ｍｅｄｉｕｍ、ＣｎＴ－Ｐｒｉｍｅ、Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｍｅｄｉｕｍ）等を用いることもできる。

　工程（４）において、上記工程の何れかの工程において用いた添加物、例えばＴＧＦβシグナル伝達経路阻害物質、ＥＧＦシグナル伝達経路作用物質、酸化ストレスを軽減する作用を有する物質、ストレス応答シグナル伝達経路に対する阻害物質等を引き続き添加することもまた好ましい。工程（４）で添加するこれらの物質は、それぞれ上記工程の何れかの工程において用いられた物質と同一であっても異なっていてもよいが、好ましくは同一である。添加物の濃度及び種類については、適宜調整することができる。

　上皮組織の成熟促進の観点からは、工程（４）において、好ましくは血清がさらに存在する。血清としては特に限定されないが、細胞培養において通常用いられる血清を用いることができる。培地中の血清の濃度は、上述の効果を達成可能な範囲であれば特に限定されないが、例えば約１％～２０％であり、好ましくは約３％～約１５％である。

　異種成分及び未決定因子の混入を回避する観点からは、工程（１）～工程（４）からなる群より選ばれる少なくとも１つの工程をマウス肉腫由来基底膜標品（マトリゲル）の非存在下で行うことが好ましい。上皮組織の成長促進の観点からは、工程（３）及び工程（４）は、マトリゲルの存在下で行ってもよい。培地中の基底膜標品の濃度は、マトリゲルを用いた場合には好ましくは０．５％以上４％以下であり、実験操作の点からより好ましくは０．５％以上１．５％以下である。

　生体の組織間の相互作用モデル又はアセンブロイドの形成を企図して、鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞を含む細胞凝集体は、他の細胞凝集体又は組織と同時に培養してもよい。これにより、二つ以上の細胞塊を含む細胞集団、又は細胞塊及び組織を含む細胞集団が形成され得る。同時に培養される対象は、生体由来の組織であってもよいし、培養細胞又は幹細胞由来の細胞凝集体であってもよい。同時に培養される対象は、好ましくは幹細胞由来の細胞凝集体であり、さらに好ましくは生体内の組織を一定程度再現した構造を有するオルガノイドである。同時に培養される組織は、いずれの動物種に由来するものであってもよいが、好ましくはヒトに由来する組織である。同時に培養される組織は、生体のいずれの組織であってもよいが、好ましくは中枢神経系の組織であり、より好ましくは嗅覚野（嗅球及び嗅皮質）を含む中枢神経系の組織である。別の一態様として、同時に培養する組織は、好ましくは嗅上皮及び鼻腔上皮以外の呼吸器系の組織であり、咽喉、気管、気管支及び肺のいずれかを含む呼吸器系の組織であってよい。別の一態様として、同時に培養する組織は、好ましくは鼻腔上皮又は嗅上皮に感染する病原体又はウイルスに対して感染感受性を有する組織であり、中枢神経系、血管、腎臓、肝臓、小腸又は大腸であってよい。同時に培養される細胞凝集体は、上記組織を構成する細胞を含むことが好ましい。同時に培養される対象は、上記組織を構成する細胞又はその細胞を含む細胞集団であってもよい。

　同時培養の方法としては、細胞凝集体同士又は細胞凝集体と組織との接着が生じ得るコンパートメント内に本発明に係る製造方法によって製造された細胞凝集体と他の細胞凝集体又は組織を投入する方法、細胞凝集体同士又は細胞凝集体と組織とをゲル等の材料で接触した状態で固定する方法、細胞凝集体同士又は細胞凝集体と組織とをカバーグラス等で押さえつけた状態で培養する方法、及び、異なる種類の細胞凝集体を各々単細胞まで分散後、同一コンパートメント内で再凝集させる方法等が挙げられるが、特に限定はされない。Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ　２０１７，９，１４４１－１４４９．に記載の方法等を用いて本発明に係る製造方法により製造された細胞凝集体と中枢神経系の組織を同時に培養することで、嗅神経の投射を再現することもできる。

　［３．鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞を含む細胞集団］
　本明細書において、「細胞」及び「組織」という表記は、それぞれ生体内に存在する対応する細胞及び組織と同様のマーカーによる免疫染色、形状観察その他特定の方法によってその存在を確認することができるが、「細胞」及び「組織」の機能、遺伝子発現、構造等は生体内に存在する細胞及び組織と必ずしも同一であるとは限らない。

　本発明の一実施形態は、鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞を含む細胞集団を提供する。細胞は好ましくは三次元培養細胞集団である。三次元培養細胞集団は、２以上の細胞が集合し、立体的な構造を形成している。細胞集団は、人工的に形成された細胞の集団であり、一定の細胞種、細胞数、形状及び構成を有する。本発明の細胞集団を構成する細胞数は特に限定されないが、好ましくは３０個以上、より好ましくは５００個以上である。上記細胞集団を構成する細胞数の上限は、特に限定されないが例えば、１×１０^７個以下であってもよいし、５×１０^６個以下であってもよい。本発明の細胞集団の形状は特に限定されず、球状、楕円状、シート状、一部がひだ状に折りたたまれたシート状、一部が収縮したシート状、中身が空洞（袋状）であってもよい。本発明の細胞集団は、好ましくは上記の鼻腔上皮を構成する細胞の製造方法により製造された細胞を含むことができる。

　以下、本発明に係る細胞集団を、図１、図２及び図３を適宜用いて説明する。本発明に係る細胞集団の一形態を図１のＡ～Ｊおよび図４１に示す。図１のＡの細胞集団は、非神経上皮組織と神経組織とを含む。図１に示す細胞集団は三次元的に形成され、通常培養器材に接着していない。神経組織は、好ましくは球状に形成される。神経組織の少なくとも一部は非神経上皮組織に覆われていてよい。非神経上皮組織は、鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞を含む鼻腔上皮様組織（図中、四角の点線で囲まれた部分）を含む。神経組織の表面は、好ましくは３割以上（図１のＢ）、より好ましくは６割以上、さらに好ましくは８割以上、最も好ましくは全体が非神経上皮組織に覆われている。非神経上皮組織と神経組織の間の少なくとも一部に間隙が形成されていてもよい（図１のＣ）。非神経上皮組織は、菲薄化していてもよい（図１のＣ）。非神経上皮組織の一部が収縮した構造が形成されていてもよい（図１のＤ）。表面の非神経上皮組織に隆起が存在していてもよく、隆起部分は袋状となっていてもよい（図１のＥ）。また、隆起は折り畳まれたひだ状であってもよい。非神経上皮組織は、鼻腔上皮様組織に加えて嗅上皮様組織を含んでいてもよい（図１のＦ）。神経組織の一部が非神経上皮組織に被覆されており、非神経上皮組織の一部が嗅上皮様組織であってもよい（図１のＧ）。非神経上皮組織は、同一の上皮組織上に複数の嗅上皮様組織と鼻腔上皮様組織とを有してもよい。細胞集団は、上述の特徴を組み合わせて有していてもよい。

　細胞集団の他の一形態として、神経組織は非神経上皮組織に被覆されていないが、神経組織と非神経上皮組織とが接した又は連結した形態を呈する（図１のＨ、Ｉ）。複数の神経組織と複数の非神経上皮組織が集合していてもよい。非神経上皮組織は、折れ曲がって入り組んだ隆起を生じていてもよく（図１のＨ）、薄い（例えば非神経上皮組織の直径の五分の一以下の厚さ）上皮により構成される膨らんだ風船状（袋状）の形態を呈してもよい（図１のＩ）。

　細胞集団の他の一形態として、神経組織と非神経上皮組織とが分離している（図１のＪ）。鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞を含む細胞集団は、分離した非神経上皮組織を指してもよい。神経組織は、例えば少なくとも８割の細胞が神経系細胞からなり、非神経上皮組織は、例えば少なくとも８割の細胞が非神経細胞からなる。非神経上皮組織は、上述の様に上皮が折れ曲がって入り組んだ隆起を生じているか、風船状の形態を呈してもよい。

　細胞集団の他の一形態として、嗅上皮様組織の一部が細胞塊の内部へと陥入し、嗅窩様の構造を形成していてもよい（図４１ＡおよびＢ）。嗅窩様の構造を形成する嗅上皮様組織は、好ましくは嗅神経細胞を含んでいてもよい。嗅窩様の構造を形成する嗅上皮様組織は、好ましくは非神経上皮組織、より好ましくは鼻腔上皮組織と連続した同一の上皮上に形成されていてもよい。嗅窩様の構造を形成する嗅上皮様組織と非神経上皮組織、より好ましくは鼻腔上皮組織との接合部において、嗅上皮周縁部様構造が形成されていてもよい。

　細胞集団は、平面状の培養細胞集団であってもよい。細胞集団の他の一形態は、培養器材上に平面的に形成され、神経組織と非神経上皮組織とを含む。細胞集団の外縁部に非神経上皮組織、内側に神経組織が形成されている（図２のＡ）。神経組織及び非神経上皮組織は、それぞれ１層の細胞から形成されてもよいし、多層（例えば２層～６層）の細胞から形成されてもよい。細胞集団の形状は、培養器材上に展開可能である限りいずれの形態を呈してもよい。好ましくは、細胞集団と培養器材との間に基底膜構造が形成される。本実施形態の他の側面において、上記細胞集団は、鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞が培養器材に接着しており、連続した上皮構造により二次元的な鼻腔上皮様組織（以下、「二次元オルガノイド」と表記する場合がある。）を形成していると把握することもできる。

　細胞集団の他の一形態は、マイクロ流体チップ上に平面的に形成され、神経組織と非神経上皮組織とを含む（図２のＢ）。マイクロ流体チップは流路を有し、培地の灌流がなされている。マイクロ流体チップは、本発明に係る細胞集団以外の細胞又は組織を含有するチップと流路により接続されていてもよい（図２のＣ）。接続されるチップに含有される細胞又は組織としては、例えば咽喉、気管、気管支、及び肺等の呼吸器系の組織、脳を含む中枢神経系、肝臓、血管、腎臓、口腔上皮、胃、小腸、大腸、並びに、生殖器等を構成する細胞又は組織等が挙げられるが、これらに限定されない。接続されるチップに含有される細胞又は組織は、好ましくはヒトの細胞であるが、動物からヒトへの感染症の伝播を再現する等の目的でヒト以外の細胞又は組織を含有するチップと接続してもよい。

　細胞集団の他の一形態は、マイクロパターンを施した培養器材上に平面的に形成され、神経組織と非神経上皮組織とを含む（図２のＤ）。培養器材上のマイクロパターンは細胞接着性領域と細胞非接着性領域とから構成され、細胞集団は細胞接着性領域に形成される。

　細胞集団の他の一形態は、物質透過性を有する多孔質膜上に平面的に形成され、神経組織と非神経上皮組織とを含む（図２のＥ）。多孔質膜は培養液中にあるか、又は接している。本発明に係る細胞集団の上部は培養液に覆われているか、又は気相に接してもよい。多孔質膜で隔てた一方で本発明に係る細胞が培養され、他方でそれ以外の細胞又は組織、フィーダー細胞等が培養される。

　細胞集団の他の一形態は、二つ以上の細胞塊の集合体であって、少なくとも１つの細胞塊が鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞を含む（図３のＡ）。少なくとも１つの細胞塊は、鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞、及び嗅上皮を構成する細胞又はその前駆細胞を含んでもよく、図１に例示された細胞集団であってよい。細胞塊の集合体において、鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞を含む細胞塊以外の細胞塊は、他の組織を構成する細胞を含む細胞塊であってよい。他の組織は、神経組織であってよく、好ましくは中枢神経系の細胞を含み、より好ましくは嗅覚野（嗅球及び嗅皮質を含む。）を含む中枢神経系を構成する細胞を含む。鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞を含む細胞塊と、他の組織を含む細胞塊とは、好ましくは細胞間接着又は神経細胞間のシナプス結合等で機能的に連結されている。細胞集団の他の一形態として、他の組織を含む細胞塊は、嗅上皮及び鼻腔上皮以外の呼吸器系の細胞又は組織を含む（図３のＢ）。細胞塊の集合体は、細胞塊同士の接着を促進するためのコンパートメント内に設置されているか、又はゲルに包埋されていることが好ましい。

　細胞集団の他の一形態は、細胞塊と他の組織を構成する細胞との集合体であってよい（図３のＣ）。細胞塊は、鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞を含み、さらに嗅上皮を構成する細胞又はその前駆細胞を含んでもよく、図１に例示された細胞集団であってよい。他の組織を構成する細胞としては、特に限定されないが、中枢神経系の細胞を含んでよく、嗅覚野を含む中枢神経系を構成する細胞を含んでよく、嗅上皮及び鼻腔上皮以外の呼吸器系の細胞を含んでよい。細胞塊と他の細胞とは、細胞間接着又はシナプス結合等で連結されていてもよい。

　＜非神経上皮組織＞
　本発明の細胞集団は、非神経上皮組織を含む。本明細書において、非神経上皮組織は、上皮構造を有する組織であって、神経上皮組織を含まないものをいう。上皮構造とは細胞同士が細胞間結合によりつながれており、層を形成している構造をいう。層は単層であってもよいし、多層であってもよい。また、上皮構造の一部が多層であってもよい。本発明の細胞集団において、非神経上皮組織は、好ましくは５割以上９割以下、より好ましくは８割以上１０割以下、最も好ましくは全体（１０割）が上皮構造を有する。

　非神経上皮組織は、鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞を含む。鼻腔上皮を構成する細胞として、分泌細胞、線毛細胞、クラブ細胞、基底細胞、塩類細胞、神経内分泌細胞、孤立化学感覚上皮細胞等が挙げられる。鼻腔上皮を構成する細胞は、これらの細胞を少なくとも１種、好ましくは複数種の細胞を含む。

　鼻腔上皮は主として外胚葉性の非神経上皮に由来するため、鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞は、好ましくは外胚葉マーカーを発現する。鼻腔上皮を構成する細胞の前駆細胞とは、成熟すると鼻腔上皮を構成する細胞になる細胞を指し、鼻腔上皮を構成する細胞への分化能を有する細胞も含む。

　鼻腔上皮を構成する細胞は、好ましくは分泌細胞を含む。分泌細胞又はその前駆細胞はムチン１、ムチン２、ムチン３、ムチン４、ムチン５ＡＣ、ムチン５Ｂ、ＦｏｘＡ１、ＦｏｘＡ２、Ｎｋｘ２．１／ＴＴＦ－１及びＳＰＤＥＦからなる群から選ばれる少なくとも１つを発現し、好ましくはＦｏｘＡ１、ＦｏｘＡ２、Ｎｋｘ２．１／ＴＴＦ－１及びＳＰＤＥＦを発現している細胞と定義することができる。

　鼻腔上皮を構成する細胞は、好ましくは線毛細胞を含む。線毛細胞は細胞表面に線毛構造を有する。線毛細胞又はその前駆細胞は、好ましくはＦｏｘＪ１、ＦｏｘＮ４、ｐ７３、アセチル化チューブリン及びβ４チューブリンからなる群から選ばれる少なくとも１つを発現している細胞及び／又は細胞表面に線毛を有する細胞と定義することができる。

　鼻腔上皮を構成する細胞は、好ましくはクラブ細胞を含む。クラブ細胞又はその前駆細胞は、ＳＣＧＢ１Ａ１、ＳＣＧＢ３Ａ２、Ｃｙｐ２ｆ２、ｕｒｏｐｌａｋｉｎ３ａ、Ｃｌｄｎ１０、Ａｏｘ３、Ｐｏｎ１及びＣｃｋａｒからなる群から選ばれる少なくとも１つを発現している細胞と定義することができる。クラブ細胞は、サイトケラチン４及びサイトケラチン１３から選ばれる少なくとも１つを発現しているＨｉｌｌｏｃｋ細胞を含んでいてもよい。

　鼻腔上皮を構成する細胞は、好ましくは基底細胞を含む。基底細胞は、非神経上皮組織の基底面に位置し、好ましくは基底膜構造上に整列する。基底細胞又はその前駆細胞は、好ましくはサイトケラチン５、サイトケラチン１４、サイトケラチン１５、ｐ６３、ΔＮｐ６３及びｐ７５からなる群から選ばれる少なくとも１つを発現している細胞と定義することができる。

　鼻腔上皮を構成する細胞は、好ましくは塩類細胞を含む。塩類細胞又はその前駆細胞は、ＣＦＴＲを発現し、好ましくはＦｏｘｉ１、液胞型プロトンＡＴＰａｓｅ（ｖａｃｕｏｌａｒ　Ｈ＋－ＡＴＰａｓｅ、Ｖ－ＡＴＰａｓｅ）、Ａｓｃｌ３、Ｔｆｃｐ２ｌ１及びＤＭＲＴ２からなる群から選ばれる少なくとも１つを発現している細胞と定義することができる。

　鼻腔上皮を構成する細胞は、好ましくは神経内分泌細胞を含む。神経内分泌細胞又はその前駆細胞は、Ａｓｃｌ１、ＮｅｕｒｏＤ１、Ｃｈｒｏｍｏｇｒａｎｉｎ　Ａ、Ｓｙｎａｐｔｏｐｈｉｓｉｎ、神経特異エノラーゼ（ＮＳＥ）からなる群から選ばれる少なくとも１つを発現している細胞と定義することができる。

　鼻腔上皮を構成する細胞は、好ましくは孤立化学感覚上皮細胞を含む。孤立化学感覚上皮細胞又はその前駆細胞は、ＣｈＡＴ／Ｔｒｐｍ５、Ｐｏｕ２ｆ３／Ｓｋｎ－１ａ、Ｔａｓ２ｒ、Ｇｎａｔ３、Ｐｌｃｂ２からなる群から選ばれる少なくとも１つを発現している細胞と定義することができる。

　細胞集団の鼻腔上皮様組織の拡大図を図４に示す。鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞は、神経組織と接する非神経上皮組織（図４のＡ）、神経組織と接していない非神経上皮組織（図４のＢ）、収縮した非神経上皮組織（図４のＣ）、菲薄化した非神経上皮組織（図４のＤ）のいずれにも存在し得る。鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞は、好ましくは細胞種ごとに集合している。例えば、鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞は、細胞種ごとに２以上の細胞が連続していることが好ましい。

　非神経上皮組織は、細胞外マトリクスを含んでいてもよい。非神経上皮組織は、好ましくは基底膜構造をさらに含む。基底膜構造は、好ましくは非神経上皮組織と神経組織との間に形成される（図１のＡ）。基底膜構造は、培養器材と細胞集団、特に培養器材と非神経上皮組織との間に形成されてもよい（図２）。好ましくは基底膜構造上に、非神経上皮組織に含まれる細胞が接着している。基底膜構造とは、細胞外マトリクスより構成される薄い膜状の構造を指し、ラミニンの免疫染色によって判断することができる。基底膜構造は、好ましくは生体内の基底膜と同様に非神経上皮組織の構造の維持、非神経上皮組織と神経組織又は培養器材との機械的な分離、物質の選択的透過等に寄与する。基底膜構造の形成に伴い、非神経上皮組織が頂端面と基底面との極性を有していることもまた好ましい。細胞集団が三次元的な構造（例えば球状）を有する場合には、細胞集団の外側（表面側）が頂端面であり、内側が基底面であることが好ましい。細胞集団が平面状である場合には、培養器材側が基底面であり、培養器材とは反対側（表面側）が頂端面であることが好ましい。非神経上皮組織は、好ましくは基底側に基底細胞を含む（図４のＥ）。

　鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞は、好ましくは感染症に関連する因子、例えばウイルス受容体、ウイルス感染関連因子、パターン認識受容体を発現している（図４のＦ）。ウイルス受容体、ウイルス感染関連因子としては、後述する鼻腔上皮に感染するウイルスの受容体又はウイルス感染関連因子であってよく、例えばＡＣＥ２、シアル酸α２，６Ｇａｌ、シアル酸α２，３Ｇａｌ等が含まれる。

　鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞は、ウイルス感染関連因子あるいは疾患関連遺伝子が欠損又は変異していてもよい。このような細胞を含む細胞集団は、例えば後述する再生医療用途の移植用細胞、疾患モデル、化合物スクリーニング等に利用できる。ウイルス感染関連因子は、例えばウイルス受容体を含み、ＡＣＥ２を含む。ウイルス感染関連因子を欠損又は変異させることにより、ウイルス感染に対する抵抗性を有することが期待される。

　疾患関連遺伝子は、例えば遺伝性疾患又は感染症に関連する遺伝子である。遺伝子が欠損又は変異した鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞は、遺伝病の患者から樹立又はゲノム編集を施した多能性幹細胞から分化させて得ることができる。疾患としては、例えば嚢胞性線維症、線毛機能不全症候群、カルタゲナー症候群、ムコ多糖症、喘息が挙げられる。別の態様の疾患関連遺伝子は、鼻腔又は上気道の癌及び腫瘍発生に関わる遺伝子である。このような疾患関連遺伝子としては、例えばＡＢＬ１、ＢＲＡＦ、ＤＤＲ、ＥＧＦＲ、ＥＰＨＡ２、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ４、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＬＴ１、ＦＬＴ４、ＦＲＫ、ＫＤＲ、ＫＩＴ、ＭＡＰＫ１１、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、ＲＡＦ１、ＲＥＴ、ＴＥＫ、ＴＲＮＡＫ２、ＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＢ、ＶＥＧＦＣ、ＴＰ５３、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＴＥＮ、ＫＭＴ２Ｄ、ＦＢＸＷ７、ＳＭＡＲＣＢ１、ＰＲＥＸ２、ＡＲＩＤ１Ａ、ＦＡＮＣＡ、ＩＤＨ２、ＰＲＫＤＣ、ＨＲＡＳ、ＮＯＴＣＨ２、ＮＯＴＣＨ１、ＮＦ１、ＴＳＣ２、ＥＰＨＡ７、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＡＴＲＸ、ＡＲＩＤ２、ＡＫＴ３、ＢＲＣＡ２、ＢＣＬ６、ＡＳＸＬ１、ＡＲ、及びＡＬＫ等が挙げられるが、これらに限定されない。鼻腔又は上気道組織の正常部及び病変部から細胞を採取し、ｉＰＳ細胞を樹立し、本願に記載の鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞を調製することもできる。

　細胞集団は、鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞に加えて嗅上皮様組織を含んでいてもよい。嗅上皮様組織は、非神経上皮組織に含まれ、好ましくは神経組織の表面の少なくとも一部を被覆する。嗅上皮様組織は、嗅上皮又はその前駆組織（嗅上皮プラコード）で発現するＳｉｘ１、Ｓｐ８、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ３、Ｄｌｘ５、Ｅｍｘ２、Ｐａｘ６、Ｏｔｘ２、ＰＤＧＦＲβ、サイトケラチン、ＥｐＣＡＭ、Ｅ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ及びＮ－Ｃａｄｈｅｒｉｎからなる群より選ばれる少なくとも１つを発現している領域を指し、Ｏｔｘ２、Ｓｐ８、Ｓｏｘ２、ＥｐＣＡＭ、Ｅ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ及びサイトケラチンを発現していることが好ましい。嗅上皮様組織は、上皮組織が非神経上皮組織の外側に肥厚していてもよい。

　細胞集団は、嗅神経細胞又はその前駆細胞を含んでいてもよい。嗅神経細胞又はその前駆細胞は、好ましくは嗅上皮様組織に含まれる。嗅神経細胞又はその前駆細胞は、神経系細胞のマーカーであるＴｕｊ１、ＮＣＡＭ、Ｎ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｃａｌｒｅｔｉｎｉｎからなる群より選ばれる少なくとも１つと、嗅神経細胞又はその前駆細胞で特異的に発現する転写因子であるＥｂｆ１、Ｅｂｆ２、Ｅｂｆ３、ＮｅｕｒｏＤ、Ｌｈｘ２、Ａｓｃｌ１からなる群より選ばれる少なくとも１つとを発現している細胞と定義することができる。嗅上皮様組織に含まれる嗅神経細胞は、好ましくは嗅覚受容体を発現しており、より好ましくは生体内の嗅上皮に局在する嗅神経細胞と同様に嗅覚情報を受容し、中枢神経系へ情報を伝達することができる。嗅神経細胞の前駆細胞とは、成熟すると嗅神経細胞となる細胞を指し、嗅神経細胞への分化能を有する細胞も含む。嗅神経細胞の前駆細胞は、好ましくは嗅上皮プラコードに存在する神経細胞と同様の性質を示す。

　嗅上皮様組織は、嗅上皮を構成する細胞又はその前駆細胞をさらに含んでよく、支持細胞、基底細胞及びボーマン腺細胞、並びにこれらの前駆細胞からなる群より選ばれる少なくとも２種の細胞をさらに含むことが好ましく、基底細胞又はその前駆細胞を含むことがより好ましい。支持細胞又はその前駆細胞は、ＨＩＦ２α、Ｓｏｘ２、Ｈｅｓ１、Ｈｅｓ５及びＳｉｘ１からなる群より選ばれる少なくとも１つを発現している細胞を指す。基底細胞又はその前駆細胞は、ｐ６３、Ｗｔ１及びＬｇｒ５からなる群より選ばれる少なくとも１つを発現している細胞を指す。ボーマン腺細胞又はその前駆細胞は、サイトケラチン及びＡｓｃｌ３からなる群より選ばれる少なくとも１つを発現している細胞を指す。嗅上皮様組織は、嗅神経鞘細胞又はその前駆細胞をさらに含んでいることが好ましい。嗅神経鞘細胞又はその前駆細胞はＳ１００、Ｓｏｘ１０及びビメンチンからなる群より選ばれる少なくとも１つを発現している細胞を指す。嗅神経鞘細胞又はその前駆細胞のマーカーとして、例えばＢｒａｉｎ　Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎ　２２２．４（２０１７）：１８７７－１８９５．に記載のマーカーを用いることもできる。支持細胞、基底細胞、ボーマン腺細胞もしくは嗅神経鞘細胞又はこれらの前駆細胞は、好ましくは生体内の嗅上皮又は嗅上皮プラコードに存在する支持細胞、基底細胞、ボーマン腺細胞もしくは嗅神経鞘細胞又はこれらの前駆細胞と同様の性質を示す。

　非神経上皮組織において、鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞が存在する鼻腔上皮様組織と嗅上皮様組織とは、連続する上皮上に形成されていることもまた好ましい。鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞が存在する領域と嗅上皮様組織との間に嗅上皮周縁部が形成されていることもまた好ましい（図１のＦ及びＧ）。嗅上皮周縁部は、Ｐｂｘ、Ｍｅｉｓ１、Ｐａｘ６、βＩＶｔｕｂｕｌｉｎからなる群より選ばれる少なくとも１つ、好ましくはＰａｘ６及びＰｂｘを発現している細胞が局在している領域を指す。

　＜神経組織＞
　細胞集団の一実施形態は、神経系細胞又はその前駆細胞を含み、好ましくは中枢神経系を構成する神経系細胞又はその前駆細胞を含む。細胞集団の一実施形態は、神経系細胞又はその前駆細胞を含む神経組織を含む。神経組織は、好ましくは中枢神経系を構成する神経系細胞又はその前駆細胞を含む。中枢神経系を構成する神経系細胞又はその前駆細胞は、Ｐａｘ６、Ｂｆ１、Ｓｐ８、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｅｍｘ２、Ｔｕｊ１、Ｎ－Ｃａｄｈｅｒｉｎからなる群より選ばれる少なくとも１つを発現し、かつサイトケラチンを発現していない細胞と定義することができる。中枢神経系を構成する神経系細胞又はその前駆細胞は、Ｐａｘ６、Ｓｏｘ２及びＴｕｊ１を発現していることが好ましい。中枢神経系を構成する神経系細胞又はその前駆細胞は、好ましくは生体内の中枢神経系における神経細胞、グリア細胞、神経幹細胞等又はこれらの前駆細胞と同様の性質を示す。

　神経組織は、少なくとも一部が非神経上皮組織に覆われていてもよい。神経組織は、上皮構造を形成していてもよい。上皮構造は、神経組織の一部に形成されていてもよいし、全体に形成されていてもよい。非神経上皮組織と神経組織との間の少なくとも一部に間隙が形成されていてもよい。

　神経系細胞又はその前駆細胞は、好ましくは網膜を構成する神経系細胞又はその前駆細胞を含む。網膜を構成する神経系細胞又はその前駆細胞は、Ｒａｘ、Ｓｉｘ３、Ｃｈｘ１０、Ｐａｘ６、Ｌｈｘ２、Ａｌｄｈ１ａ３からなる群より選ばれる少なくとも１つを発現している細胞と定義することができる。網膜を構成する神経系細胞又はその前駆細胞は、Ｒａｘ及びＣｈｘ１０を発現していることが好ましい。網膜を構成する神経系細胞又はその前駆細胞は、好ましくは生体内の網膜細胞、網膜前駆細胞、網膜特異的神経細胞等又はこれらの前駆細胞と同様の性質を示す。

　中枢神経系は大脳を含むことが好ましい。大脳（大脳を構成している細胞を含む）は、Ｅｍｘファミリー遺伝子、Ｏｔｘ２、Ｂｆ１及びＰａｘ６からなる群より選ばれる少なくとも１つを発現している組織を指す。また、大脳は層構造を有していることが好ましい。大脳は、嗅皮質を含むことが好ましい。嗅皮質は、Ｔｂｒ１、Ｃｔｉｐ２及びＦｏｘＰ２からなる群より選ばれる少なくとも１つを発現している組織を指す。大脳は、大脳基底核又はその原基を含むことが好ましい。大脳基底核又はその原基はＤｌｘファミリー遺伝子、Ｇｓｈ２、Ｎｋｘ２．１及びＩｓｌｅｔ１からなる群より選ばれる少なくとも１つを発現している組織を指す。大脳基底核又はその原基は外側基底核原基であることが好ましい。外側基底核原基はＥｒ８１及びＩｓｌｅｔ１からなる群より選ばれる少なくとも１つを発現している組織を指す。大脳は、嗅球又はその前駆組織を含むことが好ましい。嗅球又はその前駆組織はＡｒｘ、Ｔｂｒ１及びＴｂｘ２１からなる群より選ばれる少なくとも１つを発現している組織を指す。

　細胞集団は、性腺刺激ホルモン放出ホルモン陽性神経細胞を含んでいてもよい。性腺刺激ホルモン放出ホルモン陽性神経細胞は、性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）を発現している細胞及びその前駆細胞を指す。

　生体の鼻腔組織と異なり、本発明の細胞集団には通常骨組織は形成されないが、細胞集団中に骨組織を含んでいてもよい。骨組織、骨細胞又はその前駆細胞は、Ｒｕｎｘ２、Ｏｓｔｅｒｉｘ及びＡＴＦからなる群より選ばれる少なくとも１つを発現していることが好ましい。形成された細胞集団中に骨組織が形成されているか否かは、当業者に周知の方法、例えばアリザリンレッド染色、アルカリホスファターゼ染色、又は上記骨組織特異的遺伝子に対する免疫染色等の手法により判別できる。

　製造された細胞集団中に含まれる細胞及び組織を検出する手法については特に限定されないが、信頼性と再現性が高く簡便に実施できる手法が好ましい。一例として顕微鏡による光学的な観察、各細胞又は組織マーカーに対する抗体を用いた免疫染色、マーカー遺伝子に対するリアルタイムＰＣＲ法等の遺伝子発現解析、シングルセルＲＮＡ－Ｓｅｑ解析、電子顕微鏡による細胞種特異的な微細構造物の観察、マウス、ラット等への移植等が挙げられ、好ましくは上記記載のマーカーに対する抗体を用いた免疫染色又はシングルセルＲＮＡ－Ｓｅｑ解析である。

　免疫染色の結果の解釈は、当業者の目視による判別、又は撮影した画像に対する画像解析ソフト等を用いた定量的な解析等、当業者に周知の方法により行うことができる。免疫染色の結果の解釈に当たっては、例えば蛋白質核酸酵素Ｖｏｌ．５４　Ｎｏ．２（２００９）Ｐ１８５－１９２等を参照し、自家蛍光、二次抗体の非特異的吸着、多重染色時の蛍光の漏れこみ等により生じる偽陽性を排除せねばならない。

　シングルセルＲＮＡ－Ｓｅｑ解析の結果は、例えば得られた細胞集団の発現プロファイルを公知のデーターベース等の生体の組織のプロファイルと比較し、その遺伝子発現、構成する細胞集団の類似性から製造された細胞集団中に含まれる細胞及び組織を推定することができる。

　［４．鼻腔上皮疾患モデルとしての使用方法］
　本発明の一実施形態は、上述の「鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞を含む細胞集団」を用いた鼻腔上皮のインビトロ疾患モデルを提供する。より具体的には、鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞を含む細胞集団は、ウイルス及び微生物等の病原体による感染症の疾患モデルとして使用することができる。鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞を含む細胞集団のインビトロ疾患モデルとしての使用方法は、例えば上記細胞集団に病原体を接触させる工程と、病原体の増殖を検出する等の鼻腔上皮における病原体の感染を確認する工程と、を含む。さらに、感染した細胞を解析することで、病原体の標的細胞の同定、宿主因子の解析を行うこともできる。鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞を含む細胞集団の他のインビトロ疾患モデルとしての使用方法は、例えば上記細胞集団に病原体を接触させる工程と、評価対象物質を接触させる工程と、病原体の増殖を検出する工程を含み、評価対象物質の薬効評価系として利用できる。

　本発明の鼻腔上皮疾患モデルとしての使用方法の一態様は、下記工程（Ａ）～（Ｃ）を含む、病原体の感染性評価系及び評価対象物質の薬効評価系としての使用方法である。
（Ａ）鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞を含む細胞集団に病原体を接触させる工程
（Ｂ）病原体を検出する工程
（Ｃ）病原体が感染した細胞を解析する工程

　＜工程（Ａ）＞
　鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞を含む細胞集団に病原体を接触させる工程（Ａ）について説明する。鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞を含む細胞集団に病原体を接触させる方法は、特に限定されないが、例えばウイルス実験学総論（丸善）、ウイルス実験学各論（丸善）、ウイルス実験プロトコール（メジカルビュー社）、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ　１４８，１２６－３６（２０１５）、及びＣｅｌｌ　Ｓｔｅｍ
　Ｃｅｌｌ　２７，１２５－３６（２０２０）等を参照して行うことができる。病原体と細胞集団とを接触させる工程は、作業者の安全を確保した上で再現性良く病原体と細胞の相互作用が実現可能であることが望ましい。一態様としては、細胞集団を培養している培地中に微生物であれば生菌数、ウイルスであれば力価を決定済の病原体の懸濁液を直接一定量添加することで、工程（Ａ）を実施することができる。

　工程（Ａ）に用いる細胞集団は、細胞塊そのままでもよいし、カッティング等により小さな細胞塊へ細切したものでもよい。または工程（Ａ）に用いる細胞集団は、分散後接着させたものでもよい。細胞集団からは、鼻腔上皮を構成する特定の細胞が精製されてもよい。好ましい一態様としては、生体に類似した構造を有した細胞集団に、病原体を接触させる。

　工程（Ａ）にて接触させる病原体については特に限定されない。病原体は１種単独であってもよいし、２種以上組み合わせてもよい。工程（Ａ）にて接触させる病原体は、好ましくは呼吸器感染症の病原体、又は鼻腔上皮を経由した感染が生じる病原体である。上記病原体としては、例えばコロナウイルス、インフルエンザウイルス（例えばＡ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルスなど）、ＲＳウイルス、アデノウイルス、Ａ群溶連菌、肺炎マイコプラズマ、百日咳菌、パラ百日咳菌、気管支敗血症菌、肺炎クラミジア、オウム病クラミジアなどであってよい。好ましい呼吸器感染症病原体又は鼻腔上皮からの感染が生じる病原体は、コロナウイルス及びインフルエンザウイルスである。２種以上組み合わせて接触させる場合には、これらの病原体は同時に接触させてもよいし、一定の期間を空けて接触させてもよい。

　工程（Ａ）にて２種以上の病原体を接触させることによって、病原体間の相互作用による影響等を評価することもできる。上記のような病原体間の相互作用として例えばウイルス学において「干渉（ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）」と称される現象等が挙げられる。

　工程（Ａ）における病原体の接触条件における培養温度、ＣＯ_２濃度等の培養条件は適宜設定できる。培養温度は、通常約３０℃から約４０℃であり、好ましくは約３７℃であるが、病原体の特性に応じてこれらを変更してもよい。ＣＯ_２濃度は、例えば約１％から約１０％であり、好ましくは約５％である。

　工程（Ａ）において、評価対象物質の薬効を評価する目的で、任意の評価対象物質を培養環境中に添加することもできる。その際の評価対象物質は特に限定されないが、一態様としては低分子化合物、抗体、核酸、遺伝子治療用のベクターであり得る。評価対象物質は、細胞集団に病原体を接触させる以前に添加してもよいし、細胞集団に病原体を接触させた後に添加してもよい。評価対象物質と病原体を同時に培養環境中に添加してもよい。

　病原体を検出する工程（Ｂ）について説明する。培養上清又は細胞中の病原体を検出することにより、細胞集団への病原体の感染を確認することができる。病原体を検出する方法は特に限定されないが、例えばウイルス実験学総論（丸善）、ウイルス実験学各論（丸善）、ウイルス実験プロトコール（メジカルビュー社）、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ　１４８，１２６－１３６（２０１５）、及びＣｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　２７，１２５－１３６（２０２０）等を参照して行うことができる。病原体を検出する工程は、対象となる病原体ごとに選択することが好ましいが、例えば病原体特異的な抗原を標的としたＥＬＩＳＡ法、病原体特異的な塩基配列を標的としたＰＣＲ法、ＲＴ－ＰＣＲ法、定量的ＰＣＲ法、赤血球凝集反応、蛍光抗体法等、電子顕微鏡法等の手法が挙げられる。

　工程（Ａ）において、評価対象物質を培養環境中に添加していた場合、工程（Ｂ）においてコントロール群（評価対象物質を添加していない群）と評価対象物質添加群とを比較することで、評価対象物質の薬効を評価することもできる。鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞を含む細胞集団は、病原体感染抑制剤又は病原体感染による疾病の治療薬のスクリーニングに使用することができる。薬効の評価方法としては特に限定されないが、再現性良く定量的な評価が可能な手法を実施することが好ましく、例えば病原体感染の成立の有無の他、病原体の増殖性、細胞傷害性、免疫応答等を評価する。

　病原体が感染した細胞を解析する工程（Ｃ）について説明する。病原体を接触させた細胞を解析する方法は特に限定されないが、例えばウイルス実験学総論（丸善）、ウイルス実験学各論（丸善）、ウイルス実験プロトコール（メジカルビュー社）、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ　１４８，１２６－１３６（２０１５）、及びＣｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　２７，１２５－１３６（２０２０）等を参照して行うことができる。工程（Ｃ）は工程（Ｂ）と同時に行ってもよいし、別の工程として行ってもよい。工程（Ｃ）において解析の対象となる病原体は、通常細胞内寄生性の病原体であり、好ましくはマイコプラズマ、ウイルス、原虫、真菌、細菌である。細胞を解析する方法は、対象となる病原体ごとに選択することが好ましいが、例えば病原体特異的な抗原と細胞種特異的な抗体を併用した免疫染色法、シングルセルＲＮＡ－ｓｅｑ解析、電子顕微鏡法等の手法が挙げられる。シングルセルＲＮＡ－ｓｅｑ解析においては、例えば病原体特異的な塩基配列を含有する細胞の遺伝子発現プロファイルを解析することにより、細胞種を同定することができる。上記手法等を用いることにより、未知の病原体の向性（ｔｒｏｐｉｓｍ）を決定することができる。

　病原体を接触させた細胞のうち、病原体が感染した細胞と感染しなかった細胞とを比較することで、病原体の感染や病原体の増殖に必要な因子、例えばウイルス受容体、ウイルス感染関連因子、パターン認識受容体等を同定することができる。ウイルス感染症の疾患モデルの場合、鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞は、ウイルス受容体又はウイルス感染に関与する因子が発現している。疾患モデルとして、上述の因子の遺伝子を欠損又は変異させた鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞を含む細胞集団を用いることもできる。遺伝子の欠損又は変異等の改変方法は、特に限定されず、例えばゲノム編集によって行なえばよい。

　鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞を含む細胞集団は、ウイルスを感染させて、ワクチン等の製造に要するウイルスを増殖させるために使用することもできる。

　鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞を含む細胞集団の他のインビトロ疾患モデルとしての使用方法は、例えば患者由来ｉＰＳ細胞又はゲノム編集を施した多能性幹細胞等を出発原料として上記細胞集団を調製する工程と、評価対象物質を上記細胞集団に接触させる工程と、接触後の上記細胞集団を評価する工程と、を含み、評価対象物質の薬効評価系として利用できる。

　本発明の鼻腔上皮疾患モデルとしての使用方法の一態様は、下記工程（ｉ）～（ｉｖ）を含む、患者由来多能性幹細胞又はゲノム編集を施した多能性幹細胞からの鼻腔上皮の製造と解析、及び評価対象物質の薬効評価系としての使用方法である。
（ｉ）患者由来多能性幹細胞又はゲノム編集を施した多能性幹細胞を樹立する工程
（ｉｉ）工程（ｉ）で樹立した上記多能性幹細胞から鼻腔上皮を構成する細胞を含む細胞集団を製造する工程
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で製造した上記細胞集団に評価対象物質を接触させる工程
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）で上記評価対象物質に接触させた上記細胞集団を解析する工程

　＜工程（ｉ）＞
　患者由来多能性幹細胞又はゲノム編集を施した多能性幹細胞を樹立する工程（ｉ）について説明する。患者由来多能性幹細胞又はゲノム編集を施した多能性幹細胞を樹立する手法については、のちの工程で鼻腔上皮の製造に用いることができる量と品質の多能性幹細胞が得られる限り、特に限定はされない。一形態としては、患者由来の多能性幹細胞以外の細胞を初期化して多能性幹細胞を得る方法、樹立済の多能性幹細胞のゲノムを操作して多能性幹細胞をクローニングする方法等が挙げられる。通常、遺伝性疾患の患者由来の多能性幹細胞又は遺伝病の原因遺伝子にゲノム編集を施した多能性幹細胞が好適に用いられるが、病原体に対する感受性を調べる等の目的から、感染症その他の疾病の患者由来多能性幹細胞又は該疾病の関連遺伝子にゲノム編集を施した多能性幹細胞を用いることもできる。

　患者由来多能性幹細胞としては、例えば嚢胞性線維症、線毛機能不全症候群、カルタゲナー症候群、ムコ多糖症、喘息（アレルギー性の炎症）、好酸球性副鼻腔炎等の患者に由来する多能性幹細胞が挙げられるが、特に限定されない。ゲノム編集を施した多能性幹細胞としては例えば遺伝病の原因遺伝子を編集し、機能欠損型としたもの、遺伝病の患者由来多能性幹細胞の原因遺伝子を編集し、機能を回復させたもの、遺伝子発現等を評価する為、蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ等のレポーターを組み込んだもの等が挙げられるが、特に限定されない。

　＜工程（ｉｉ）＞
　工程（ｉ）で樹立した多能性幹細胞から鼻腔上皮を構成する細胞を含む細胞集団を製造する工程（ｉｉ）について説明する。多能性幹細胞から鼻腔上皮を含む細胞集団を製造する方法については、本願に記載の工程（ａ）、（１）、（２）、（３）及び（４）を行うことにより実施することができる。実際の製造の条件に関しては、細胞株の株間の差を考慮し、細胞の播種数、添加する作用物質の添加時期、濃度等適宜調製することができる。

　＜工程（ｉｉｉ）＞
　工程（ｉｉ）で製造した鼻腔上皮を含む細胞集団に評価対象物質を接触させる工程（ｉｉｉ）について説明する。工程（ｉｉｉ）において、評価対象物質の薬効を評価する目的で、任意の評価対象物質を培養環境中に添加する。その際の評価対象物質は特に限定されないが、一態様としては低分子化合物、抗体、核酸、遺伝子治療用のベクターであり得る。

　＜工程（ｉｖ）＞
　工程（ｉｉｉ）で評価対象物質に接触させた細胞集団を解析する工程（ｉｖ）について説明する。工程（ｉｖ）における解析手法は、評価対象物質の作用を解析可能である限り特に限定はされない。例えば、染色による組織の解析、ウエスタンブロット法等を用いたタンパク質発現の解析、リアルタイムＰＣＲ法、ＤＮＡマイクロアレイ法、シングルセルＲＮＡ－Ｓｅｑ法等を用いた遺伝子発現の解析、細胞増殖・細胞死アッセイ、細胞機能評価アッセイ等が挙げられる。細胞集団の解析を行なうことで、接触させた評価対象物質が疾患に与える効果を評価することができる。

　［５．疾患治療用化合物の評価用キット又は疾患治療用化合物のスクリーニングキット］
　本発明の一実施形態は、上述の「４．鼻腔上皮疾患モデルとしての使用方法」を実施するための疾患治療用化合物の評価用キット及び疾患治療用化合物のスクリーニングキットを提供する。

　評価用キット又はスクリーニングキットには、例えば本発明に係る細胞集団、又は細胞集団から分取された鼻腔上皮を構成する細胞もしくは鼻腔上皮様組織と、上述の工程（Ａ）～（Ｃ）を行うために用いられる試薬、培養液、培養器材、解析プログラムの少なくとも１つとを含み、好ましくはポジティブコントロールもしくはネガティブコントロールとして用いられる試薬（化合物）、又は評価対象物質との接触により活性化された細胞を同定する試薬を含む。本キットには、さらにスクリーニングの手順を記載した書面や説明書が含まれていてもよい。

　［６．対象物質の薬効又は毒性の評価方法及び評価キット］
　本発明の一実施形態として、本発明に係る細胞集団を用いて対象物質の薬効又は毒性、特に呼吸器毒性を評価する方法及び評価キットが提供される。細胞集団からは、鼻腔上皮を構成する特定の細胞又は鼻腔上皮様組織が精製されてもよい。本実施形態の他の側面において、「対象物質の薬効又は毒性の評価方法及び評価キット」は、「対象物質の薬効又は毒性のスクリーニング方法及びスクリーニング用キット」と把握することもできる。

　対象物質の薬効又は毒性を評価する方法は、上述の「４．鼻腔上皮疾患モデルとしての使用方法」の工程（ｉｉｉ）及び工程（ｉｖ）を参照して行なうことができる。対象物質の薬効又は毒性を評価する方法は、例えば細胞集団に評価対象物質を接触させる工程及び評価対象物質に接触させた細胞集団を解析する工程とを含む。評価対象物質は、特に限定されないが、一態様としては低分子化合物、抗体、核酸、遺伝子治療用のベクターであり得る。細胞集団の解析を行なうことで、接触させた評価対象物質が細胞に与える効果を評価することができる。

　対象物質の薬効又は毒性の評価キットは、「５．疾患治療用化合物の評価用キット又は疾患治療用化合物のスクリーニングキット」に記載のキットと同じものを含んでいてもよい。対象物質の薬効又は毒性の評価キットは、例えば本発明に係る細胞集団、又は細胞集団から分取された鼻腔上皮を構成する細胞もしくは鼻腔上皮様組織と、培養液、培養器材、解析プログラムの少なくとも１つとを含み、好ましくはポジティブコントロールもしくはネガティブコントロールとして用いられる試薬（化合物）、及び評価対象物質との接触により活性化された細胞を同定する試薬を含む。本キットには、さらにスクリーニングの手順を記載した書面や説明書が含まれていてもよい。

　［７．疾患特異的なバイオマーカーの探索方法］
　本発明の一実施形態として、本発明に係る細胞集団を用いて疾患特異的なバイオマーカーを探索する方法が提供される。細胞集団からは、鼻腔上皮を構成する特定の細胞又は鼻腔上皮様組織が精製されてもよい。疾患特異的なバイオマーカーを探索する方法は、例えば細胞集団に病原体を感染させる等の手法で疾患の状態を再現する工程、及び疾患の状態が再現された細胞集団、その培養上清、代謝物、分泌物等を回収し、検体を解析してコントロールと比較し、変動するバイオマーカーを同定する工程とを含む。対象となるバイオマーカーは、好ましくは分子バイオマーカーである。対象となる分子バイオマーカーは、タンパク質、核酸、糖鎖、ペプチド及び低分子化合物でありうるが、これらに限定されない。対象となる分子バイオマーカーは、揮発性であってもよいし、非揮発性であってもよい。分子バイオマーカーの探索は、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ＆Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ　４．２（２００５）：１８２－１９０、Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ．２０１４　Ｍａｙ　５；１５（７）：１０４０－１０４８、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ　Ｃｈｅｍｉｅ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，２０１０，４９．３２：５４２６－５４４５．に記載の方法等を用いて行うことができる。

　［８．治療薬及び疾患の治療方法］
　本発明の一実施形態は、上記細胞集団又は上記細胞集団に含まれる細胞もしくは組織を含む、呼吸器の障害又は感覚器の障害、好ましくは嗅覚系の障害に基づく疾患の治療薬を提供する。これらの疾患は、ヒトの疾患であってもよく、ヒト以外の動物の疾患であってもよい。細胞集団は、再生医療の治療薬として使用することができる。例えば鼻腔上皮組織又は嗅上皮組織に傷害が生じたとき、上記細胞集団を移植片として用いることができる。細胞集団からは、鼻腔上皮を構成する特定の細胞が精製されてもよい。具体的な移植の方法としては、例えばＳｔｅｍ　ｃｅｌｌ　ｒｅｐｏｒｔｓ，１２（６），１３５４－１３６５．に記載の通り、細胞集団に含まれる治療効果を有する細胞、例えば基底細胞を精製し、調製した細胞懸濁液を患部に直接投与、例えば点鼻により嗅上皮に移植するような手法、あるいは細胞集団からシート状の組織を調製し、患部を被覆する方法等が挙げられる。

　治療薬としては、例えば本発明の細胞集団又は細胞集団に含まれる細胞もしくは組織を含む懸濁液、並びにこれらを含む移植片（移植用担体）が挙げられる。懸濁液としては、例えば細胞集団を人工涙液又は生理食塩水に懸濁した液が挙げられる。懸濁液は、細胞集団から単離された非神経上皮細胞を含んでいてもよく、細胞の接着を促進する因子、例えば細胞外基質やヒアルロン酸等を含んでいてもよい。

　さらに、本発明の細胞集団に含まれる細胞又は組織を、治療上必要とされる有効量、移植を必要とする対象に移植する工程を含む、疾患の治療方法が提供され得る。治療上有効な細胞量の移植により、組織が回復し、典型的には、疾患に関連する症状が軽減され得る。

　疾患の治療薬として用いる細胞集団又は上記細胞集団に含まれる細胞もしくは組織は、対象となる疾患に対し抵抗性を有することが好ましい。例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染により生じた嗅覚障害に対し本発明の細胞集団に含まれる細胞又は組織を移植することにより治療を実施する場合は、移植する細胞はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染に対し抵抗性を有することが好ましい。上記のような疾患抵抗性の細胞は、例えばウイルス感染に関与する遺伝子、例えばＡＣＥ２、ＴＭＰＲＳＳ２、Ｎｒｐ１といった遺伝子をゲノム編集により変異又は欠失させた多能性幹細胞を材料として用いることにより調製できる。

　［９．ウイルスの分離培養に用いる宿主細胞としての使用］
　本発明の一実施形態は、上記細胞集団又は上記細胞集団に含まれる細胞もしくは組織を用いる、ウイルスの分離の為の培養方法を提供する。上記ウイルスは、ヒトの疾患の原因ウイルスであってもよく、ヒト以外の動物の疾患の原因ウイルスであってもよい。本発明の方法によって分離培養されるウイルスは、例えば上気道感染症、普通感冒、流行性感冒、又は新興感染症の原因ウイルスであるが、これらに限定されない。上記のようなウイルスとしては例えば、ライノウイルス、ヒトコロナウイルス、インフルエンザウイルス、ＲＳウイルス、パラインフルエンザウイルス、アデノウイルス、エンテロウイルス、ヒトメタニューモウイルス、ボカウイルス等が挙げられる。ヒトコロナウイルスとしては例えば、アルファコロナウイルス属のＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ベータコロナウイルス属のＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１等が挙げられる。新興感染症の原因ウイルスとして例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２等が挙げられる。

　ウイルスの分離培養に用いる細胞集団又は上記細胞集団に含まれる細胞もしくは組織は、対象となるウイルスに対する受容体を有することが好ましい。ウイルスの分離培養の効率を改善する観点から、例えばＮａｔｕｒｅ　ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，　２０１９，　４．８：　１２６８－１２７３．等を参照し、ウイルス感染に関与する遺伝子、例えばＡＣＥ２、ＴＭＰＲＳＳ２、Ｎｒｐ１といった遺伝子をゲノム編集等により操作し、発現を増強した多能性幹細胞を材料として用いることもできる。ｉｎ　ｖｉｔｒｏにて増殖させる影響や生じる変異を可能な限り排し、生体にて増殖している臨床検体等に含まれているウイルスと極めて近しいウイルスを検体として得るという観点からは、ウイルスの分離培養に用いる細胞集団又は上記細胞集団含まれる細胞もしくは組織は、含まれる細胞の種類、ウイルス感染に関与する遺伝子等の発現が生体に近いものであることもまた好ましい。

　本発明の細胞集団又は上記細胞集団に含まれる細胞を用いたウイルスの分離培養の一態様は、上述の［４．鼻腔上皮疾患モデルとしての使用方法］の工程（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）を参照して行うこともできる。ウイルスの分離培養が為されたか否かを評価する方法としては、ウイルスを接種した細胞に生じる細胞変性効果（ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ　ｅｆｆｅｃｔ；　ＣＰＥ）の観察、赤血球凝集抑制試験、各種抗ウイルス抗体を用いた中和試験、ウイルスの特定の遺伝子の増幅をＰＣＲ法による確認する、あるいは遺伝子の塩基配列を解読する遺伝子検査等の手法が挙げられるが、これに限定されない。

　以下に実施例を示して、本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。また、使用する試薬及び材料は特に限定されない限り商業的に入手可能である。本明細書において、細胞の免疫染色結果の判断基準は、国際公開第２０２０／０３９７３２号の予備実験１と同じである。

　［比較実験１：ヒトＥＳ細胞からの嗅上皮様組織及び非神経上皮組織を含有する細胞塊の製造・分化誘導］
　図５の上段に示す培養工程に従って、多能性幹細胞から嗅上皮様組織を含む非神経上皮組織を含む細胞塊を製造した。多能性幹細胞として、ヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ－１株、京都大学より入手）を用いた。多能性幹細胞は、国際公開第２０２０／０３９７３２号に記載の通り、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｒｅｐｏｒｔｓ，４，３５９４（２０１４）に記載の方法に準じてフィーダーフリー条件で維持培養した。フィーダーフリー培地としてはＳｔｅｍＦｉｔ培地（ＡＫ０２Ｎ、味の素株式会社製）、フィーダーフリー足場にはＬａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８（株式会社ニッピ製）を用いた。

　具体的な維持培養操作としては、まずサブコンフルエントになったヒトＥＳ細胞を、５ｍＭ　ＥＤＴＡ／ＰＢＳにて２回洗浄後、さらに５ｍＭ　ＥＤＴＡ／ＰＢＳで３７℃１０分間処理した。ピペッティングを行い、培養ディッシュ表面から細胞を剥がし、単一細胞へ分散した。その後、単一細胞へ分散されたヒトＥＳ細胞を、Ｌａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８にてコートしたプラスチック培養ディッシュに播種し、Ｙ２７６３２（ＲＯＣＫ阻害物質、富士フィルム和光純薬株式会社製、１０μＭ）存在下、ＳｔｅｍＦｉｔ培地にてフィーダーフリー培養した。プラスチック培養ディッシュとして、６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、細胞培養用、培養面積９．５ｃｍ^２）を用いた場合、単一細胞へ分散されたヒトＥＳ細胞の播種細胞数は１．２×１０^４とした。播種した１日後に、Ｙ２７６３２を含まないＳｔｅｍＦｉｔ培地に全量培地交換した。以降、１日～２日に１回、Ｙ２７６３２を含まないＳｔｅｍＦｉｔ培地にて全量培地交換した。播種後７日間、サブコンフルエント（培養面積の６割が細胞に覆われる程度）になるまで培養した。

　培養した多能性幹細胞を分化誘導に用いる際には、播種した６日後にＳｔｅｍＦｉｔ培地の培地交換と同時にＳＢ４３１５４２（ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害物質、富士フィルム和光純薬株式会社製、終濃度５μＭ、図５等では「ＳＢ４３１」と表記）とＳＡＧ（Ｓｈｈシグナル経路作用物質、Ｅｎｚｏ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、終濃度３００ｎＭ）を添加して２４時間培養した（工程（ａ）開始）。

　調製したサブコンフルエントのヒトＥＳ細胞を、上記継代時と同様に５ｍＭ　ＥＤＴＡ／ＰＢＳにて処理した。分化誘導用の無血清培地を添加し、ピペッティングを行って培養ディッシュ表面から細胞を剥がし、単一細胞へ分散した。
　その後、単一細胞に分散されたヒトＥＳ細胞を非細胞接着性の９６ウェル培養プレート（ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ　９６Ｖ底プレート、ＭＳ－９０９６Ｖ、住友ベークライト株式会社製）に、１ウェルあたり９×１０^３細胞になるように１００μｌの無血清培地に懸濁し、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で浮遊培養した。その際の無血清培地には、Ｆ－１２＋Ｇｌｕｔａｍａｘ培地（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）とＩＭＤＭ＋Ｇｌｕｔａｍａｘ培地（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）の体積比１：１混合液に５％　Ｋｎｏｃｋｏｕｔ　Ｓｅｒｕｍ　Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、４５０μＭ　１－モノチオグリセロール（富士フィルム和光純薬株式会社社製）、１ｘ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ　ｄｅｆｉｎｅｄ　ｌｉｐｉｄ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、５０ｕｎｉｔ／ｍｌペニシリン－５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン（ナカライテスク株式会社製）を添加した無血清培地を用いた（工程（１）開始）。以降、この無血清培地を５％　ＫＳＲ　ｇｆＣＤＭともいう。

　浮遊培養開始時（浮遊培養開始後０日目、工程（１）開始）に、上記無血清培地にＹ２７６３２（終濃度１０μＭ）、ＩＷＰ－２（Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質、Ｔｏｃｒｉｓ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製、終濃度０．５μＭ）、ＳＢ４３１５４２（ＴＧＦシグナル伝達経路阻害物質、富士フィルム和光純薬株式会社製、終濃度１μＭ）を添加した。

　浮遊培養開始後２日目にＹ２７６３２を含まず、ＩＷＰ－２、ＳＢ４３１５４２、ＢＭＰ４（ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質、Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社製、終濃度０．５ｎＭ）を含む無血清培地を１ウェルあたり１００μｌ加えた（工程（２）開始）。

　さらに、浮遊培養開始後３日目にＹ２７６３２とＢＭＰ４を含まず、ＩＷＰ－２、ＳＢ４３１５４２、ｂＦＧＦ－ＴＳ（ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質、ＨｕｍａｎＺｙｍｅ社製、終濃度２０ｎｇ／ｍｌ）、Ｈｅｐａｒｉｎ　Ｓｏｄｉｕｍ（終濃度１０μｇ／ｍｌ）、５Ｚ－７－Ｏｘｏ　Ｚｅａｅｎｏｌ（ＴＡＫ１阻害物質、Ｃａｙｍａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製、終濃度２μＭ）を含む無血清培地を用いて半量培地交換を行った（工程（３）開始）。浮遊培養開始後６日目にＩＷＰ－２、ＳＢ４３１５４２、ｂＦＧＦ－ＴＳ、Ｈｅｐａｒｉｎ　Ｓｏｄｉｕｍ、５Ｚ－７－Ｏｘｏ　Ｚｅａｅｎｏｌ、Ｋ０２２８８（ＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質、Ｃａｙｍａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製、終濃度１μＭ）を含む無血清培地を用いて半量培地交換を行った。以降、培養１０、１３、１７、２１、２４日目に同様に半量培地交換を行った。培養１３日目以降の培地交換の際に、ＥＧＦ（ＰｒｉｍｅＧｅｎｅ社製、終濃度２０ｎｇ／ｍｌ）を添加した。

　上記ＢＭＰ４、ｂＦＧＦ－ＴＳ、Ｈｅｐａｒｉｎ　Ｓｏｄｉｕｍ、５Ｚ－７－Ｏｘｏ　Ｚｅａｅｎｏｌ、Ｋ０２２８８及びＥＧＦは最初に添加する際は半量交換で添加する培地に各々２倍の濃度で添加し、ウェル中の終濃度が記載の濃度となるようにした。以降の培地交換の際は、記載の終濃度で培地に添加した。また、以降の記載において、他の各条件で添加する因子、化合物等も同様の方法で添加した。

　浮遊培養開始後２８日目に倒立顕微鏡（株式会社キーエンス製、ＢＩＯＲＥＶＯ）を用いて、明視野観察を行った（図５のＡ）。上記分化誘導法により直径約６００μｍ程度の球状の細胞凝集体が形成されていた。

　浮遊培養開始後２８日目の細胞凝集体を、先端口径が太い２００μｌチップで培養用チューブに回収し、ＰＢＳで２回洗浄作業を行った後、４％パラホルムアルデヒド・りん酸緩衝液（富士フィルム和光純薬株式会社社製）で室温１５分固定した。固定後の細胞凝集体をＰＢＳで３回洗浄した後、２０％スクロース／ＰＢＳに４℃で一晩浸漬し凍結保護処理を行った。凍結保護処理後の凝集体をクリオモルド＜３号＞（Ｓａｋｕｒａ　Ｆｉｎｅｔｅｋ社製）に移し、細胞凝集体の周囲の余分な２０％スクロース／ＰＢＳをマイクロピペッターで除いた後にＯ．Ｃ．Ｔコンパウンド（Ｓａｋｕｒａ　Ｆｉｎｅｔｅｋ社製）に包埋し、ドライアイスで冷却したアルミヒートブロック上で急速凍結し、凍結切片作製用のブロックを作製した。上記凝集体を包埋したブロックからライカＣＭ１９５０クライオスタット（Ｌｅｉｃａ社製）により１０μｍ厚の凍結切片を作製し、クレストスライドグラス（松浪硝子工業株式会社製）に張り付けた。スライドグラス上の凍結切片の周囲を免疫組織化学用パップペン（大道産業株式会社製）で囲んだ後、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００／ＴＢＳで室温１０分間透過処理し、続けてブロッキング試薬Ｎ－１０２（日油株式会社製）とＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ（ＴＢＳ）Ｂｌｏｃｋｉｎｇ　Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）の体積比１：４混合液で室温３０分間ブロッキング処理を行った。

　ブロッキング処理後の凍結切片に関し、Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｄｉｌｕｅｎｔ　ＯＰ　Ｑｕａｎｔｏ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）で希釈した一次抗体をスライドグラス１枚あたり２５０μｌ添加し、湿箱中にて４℃で一晩反応させた。一次抗体処理後の凍結切片を０．０５％　Ｔｗｅｅｎ－２０／ＴＢＳで室温１０分間処理する洗浄操作を３回行った後に、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ　Ｏｎｅ　Ｈｉｓｔｏ（ナカライテスク株式会社製）と０．２％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００／ＴＢＳを体積比１：１９の割合で混合した緩衝液で二次抗体を希釈し、希釈液をスライドグラス１枚あたり２５０μｌ凍結切片に添加し、室温で１時間反応させた。二次抗体処理後の凍結切片を０．０５％　Ｔｗｅｅｎ－２０／ＴＢＳで室温１０分間処理する洗浄操作を３回行った後に、純水で凍結切片を一回洗浄し、その後、ＮＥＯカバーグラス（松浪硝子工業株式会社製）とスライドグラス１枚当たり３０μｌのＰｒｏｌｏｎｇ　Ｇｌａｓｓ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて凍結切片を封入した。封入後の標本を室温の暗所で一晩静置してＰｒｏｌｏｎｇ　Ｇｌａｓｓを固化させたのち、透明のマニキュアでカバーグラスの周囲をコーティングし室温の暗所で風乾後、蛍光顕微鏡による観察を行った。標本の観察及び画像の取得には正立蛍光顕微鏡Ａｘｉｏ　Ｉｍａｇｅｒ　Ｍ２（Ｃａｒｌ　Ｚｅｉｓｓ社製）及び附属ソフトウェアのＡｘｉｏ　Ｖｉｓｉｏｎを用いた。

　一次抗体としては、表１－１又は１－２に記載のプラコード及び非神経上皮組織を染色する抗Ｓｉｘ１抗体、神経網膜及び嗅神経細胞を染色する抗Ｌｈｘ２抗体、嗅神経細胞及びその前駆細胞を染色する抗Ｃａｌｒｅｔｉｎｉｎ抗体を用いた。蛍光標識二次抗体としては、表２に記載のＡｌｅｘａ４８８標識ロバ抗ウサギ抗体、ＣＦ５５５標識ロバ抗マウス抗体、Ａｌｅｘａ６４７標識ロバ抗ヤギ抗体を用いて多重染色を行い、核の対比染色には１μｇ／ｍｌのＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を二次抗体希釈液中に添加した。

　染色結果を図５のＢに示す。浮遊培養開始２８日目には、細胞塊の外側にＳｉｘ１陽性のプラコード様の非神経上皮組織が形成された。それらの一部の細胞は、Ｌｈｘ２、Ｃａｌｒｅｔｉｎｉｎ陽性の嗅神経細胞又はその未成熟な前駆細胞であった。以上より、比較実験１の培養方法により、細胞塊の外側に非神経上皮が存在し、その一部が嗅神経細胞である細胞塊が製造可能であることが示された。上記製造法により形成された細胞塊の模式図を図５のＣに示す。

　［実験１：ヒトＥＳ細胞からの鼻腔上皮を構成する細胞を含有する細胞集団の製造・分化誘導］
　実験１では、図６の上段に示す工程に従って、鼻腔上皮を構成する細胞を含む細胞集団を製造した。培養２８日目までは、比較実験１と同じ方法で多能性幹細胞を培養した。その後、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質、ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質及びＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質の非存在下で細胞を培養する工程（４）を実施した。実験１では、特に記載された操作以外は比較実験１と同様の操作を行った。

　具体的には、維持培養されたヒトＥＳ細胞を用いて、比較実験１と同じ方法で工程（ａ）、工程（１）、工程（２）及び工程（３）を行った後、培養２８日目に９６ウェル培養プレートから１５ｍｌ遠心チューブに細胞塊を回収し、培地にて２回洗浄を実施した後、９ｃｍ浮遊培養用ディッシュ（住友ベークライト株式会社製）に細胞塊を移した。培地は、無血清培地（５％　ＫＳＲ　ｇｆＣＤＭ）に１μＭ　ＳＢ４３１５４２と２０ｎｇ／ｍｌ　ＥＧＦを添加したものを用いた。ディッシュ１枚当たり４８個の細胞塊を１２ｍｌの培地で培養した。培養３５日目に倒立顕微鏡を用いて明視野観察を行った（図６のＡ）。培養３５日目の細胞集団は、一部の上皮組織が細胞塊から分離していた。

　培養３５日目の細胞集団を、比較実験１に記載の方法で固定し、蛍光免疫染色を実施した。一次抗体としては、表１－１又は１－２に記載の神経網膜及び嗅神経細胞を染色する抗Ｌｈｘ２抗体、嗅神経細胞及びその前駆細胞で陽性となる抗Ｅｂｆ１抗体、神経系細胞で陽性となる抗Ｔｕｊ１抗体、分泌細胞を染色する抗ＭＵＣ５ＡＣ抗体、抗ＭＵＣ５Ｂ抗体、呼吸器系の上皮細胞で陽性となる抗ＦｏｘＡ２抗体、線毛細胞で陽性となる抗ＦｏｘＪ１抗体、塩類細胞で陽性となる抗ＣＦＴＲ抗体、外胚葉の前方領域で陽性となる抗Ｏｔｘ２抗体、非神経上皮で陽性となる抗Ｐａｎ　Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ（ＰａｎＣＫ）抗体、基底細胞で陽性となる抗サイトケラチン５抗体及び抗ｐ７５抗体、並びに鼻腔上皮、嗅上皮及び非神経上皮で陽性となる抗Ｅ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ抗体を用いた。蛍光標識二次抗体としては、表２に記載のＡｌｅｘａ４８８標識ロバ抗ウサギ抗体、ＣＦ５５５標識ロバ抗マウス抗体、Ａｌｅｘａ６４７標識ロバ抗ヤギ抗体を用いて多重染色を行い、核の対比染色には１μｇ／ｍｌのＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を二次抗体希釈液中に添加した。

　染色結果を図７及び図８のＡに示す。浮遊培養開始３５日目には、非神経上皮組織にＬｈｘ２、Ｅｂｆ１、Ｔｕｊ１陽性の嗅神経細胞、ＦｏｘＪ１陽性の線毛細胞、ムチン５ＡＣ、ムチン５Ｂ、ＦｏｘＡ２陽性の分泌細胞、ＣＦＴＲ陽性の塩類細胞、サイトケラチン５、ｐ７５、Ｅ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ陽性の基底細胞様の細胞が存在していた。また、これらの細胞が存在する領域はいずれもＯｔｘ２陽性かつ汎サイトケラチン陽性であり、上記細胞が外胚葉に属する非神経系細胞であることが示された。上記の結果から、鼻腔上皮を構成する細胞が細胞集団に含まれており、本発明に係る製造方法により、線毛細胞、分泌細胞、塩類細胞、基底細胞等の鼻腔上皮を構成する細胞が製造可能であることが示された。上記製造方法により形成された細胞集団の模式図を図８のＢに示す。

　細胞集団は、１）中枢神経系を構成する神経系細胞を含む神経組織、及び２）鼻腔上皮を構成する細胞を含む鼻腔上皮様組織と、嗅神経細胞を含む嗅上皮様組織と、を含む非神経上皮組織を有していた。神経組織は、鼻腔上皮様組織によって表面の少なくとも一部が被覆されていた。鼻腔上皮様組織と嗅上皮様組織とは、連続する非神経上皮組織上に存在していた。細胞集団において、基底細胞は非神経上皮組織の内側に局在し、線毛細胞は非神経上皮組織の外側に局在しており、非神経上皮組織は基底側と頂端側との極性を有していた。細胞集団において、鼻腔上皮を構成する細胞は、細胞種ごとに集合していた。

　［実験２：ヒトＥＳ細胞からの鼻腔上皮を構成する細胞を含有する細胞集団の製造・分化誘導］
　実験２では、図９の上段に示す工程に従って、鼻腔上皮を構成する細胞を含む細胞集団を製造した。実験２では、工程（１）からＪＮＫ阻害剤であるＪＮＫ－ＩＮ－８をさらに添加した以外は、比較実験１と同じ操作を行なった。

　具体的には、維持培養されたヒトＥＳ細胞を用いて、工程（ａ）を行った後、工程（１）において、ＪＮＫ阻害剤ＪＮＫ－ＩＮ－８を終濃度３００ｎＭ又は１μＭの条件で添加した。培地交換の際にも終濃度が同じとなるように、交換する培地にＪＮＫ－ＩＮ－８を添加した。培養２８日目に倒立顕微鏡を用いて、明視野観察を行った（図９のＡ）。ＪＮＫ－ＩＮ－８を添加した群、特にＪＮＫ－ＩＮ－８を終濃度１μＭ添加した群は、得られた細胞集団が均一な球形に近い細胞塊を含み、細胞塊の表面が非神経上皮に覆われている割合も高かった。

　培養２８日目の細胞集団を、比較実験１に記載の方法で固定し、蛍光免疫染色を実施した。一次抗体としては、表１－１又は１－２に記載の前方領域の外胚葉を染色する抗Ｏｔｘ２抗体、嗅神経細胞及びその前駆細胞で陽性となる抗Ｅｂｆ１抗体、嗅神経細胞及びその前駆細胞を含む神経細胞を染色する抗Ｔｕｊ１抗体、基底細胞で陽性となる抗サイトケラチン５抗体及び抗ｐ７５抗体を用いた。蛍光標識二次抗体としては、表２に記載のＡｌｅｘａ４８８標識ロバ抗ウサギ抗体、ＣＦ５５５標識ロバ抗マウス抗体、Ａｌｅｘａ６４７標識ロバ抗ヤギ抗体を用いて多重染色を行い、核の対比染色には１μｇ／ｍｌのＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を二次抗体希釈液中に添加した。

　染色結果を図１０に示す。コントロールと比較して、ＪＮＫ－ＩＮ－８を終濃度１μＭ添加した群は、得られた細胞集団の表面に非神経上皮がより効率よく形成されていた。また、ＪＮＫ阻害剤添加条件下でも、Ｏｔｘ２陽性の外胚葉の前方領域の上皮が形成され、その中にＥｂｆ１、Ｔｕｊ１陽性の嗅神経細胞への分化が生じていた。また、ＪＮＫ阻害剤添加条件下でも、サイトケラチン５及びｐ７５陽性の基底細胞への分化が生じ、細胞集団は、鼻腔上皮を構成する細胞を含んでいた。上記の結果から、Ｗｎｔ／ＪＮＫ経路の阻害により、嗅上皮及び鼻腔上皮領域の形成を阻害せずに質の良い非神経上皮を有する細胞集団が調製可能であることが分かった。

　［実験３：ヒトＥＳ細胞からの鼻腔上皮を構成する細胞を含有する細胞集団の製造・分化誘導］
　実験３では、図１１の上段に示す工程に従って、鼻腔上皮を構成する細胞を含む細胞集団を製造した。実験３では、工程（３）からＳｈｈシグナル伝達経路作用物質であるＳＡＧを終濃度１μＭとなるようにさらに添加した以外は、比較実験１と同じ操作を行なった。

　培養２８日目に倒立顕微鏡を用いて、明視野観察を行った（図１１のＡ）。表１－１又は１－２に記載の抗Ｆｏｘ２Ａ抗体及び抗Ｐａｎ　Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ抗体、及び表２に記載の二次抗体を用いて免疫染色を行なった。染色結果を図１１のＢ及びＣに示す。コントロールと比較して、工程（３）の培養１３日目からＳＡＧを終濃度１μＭ添加した群は、培養２８日目において汎サイトケラチン陽性、ＦｏｘＡ２陽性の非神経上皮組織の形成が促進されていた。上記の結果から、工程（３）のＳｈｈシグナル伝達経路の活性化により、非神経上皮部分がより鼻腔上皮へと分化しやすい細胞塊が調製可能であることが分かった。鼻腔上皮様組織へ方向づけられた非神経上皮組織を含む細胞塊の模式図を、図１１のＤに示す。

　［実験４：ヒトｉＰＳ細胞から鼻腔上皮を構成する細胞を含有する細胞集団の製造・分化誘導における、酸化ストレスを軽減する作用を有する物質の効果の検討］
　実験４では、図１２に示す工程に従って、ヒトｉＰＳ細胞１２３１Ａ３株から鼻腔上皮を構成する細胞を含む細胞集団を製造した。実験４では、実験２と同じように工程（１）からＪＮＫ阻害剤を添加し、さらに、工程（３）の途中（培養１０日目）から酸化ストレスを軽減する作用を有する物質（図１２における「Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ」）を各種添加し、その効果を検討した。酸化ストレスを軽減する作用を有する物質として、具体的には、３００μＭ、１ｍＭ又は３ｍＭ　Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン（ＮＡＣ）、２５０μＭ　アスコルビン酸２リン酸（ＡＡ２Ｐ）、５００μＭ　ニコチンアミド（ＮＡＤ）、１０μＭ　酢酸（±）－α－トコフェロール（αＴＯＡ）及び１μＭ　ＩＭ－９３のいずれか、又はＡＡ２Ｐと１μＭ　ＮＡＣとＮＡＤとを組み合わせて添加した。培養２１日目に倒立顕微鏡を用いて、明視野観察を行った（図１２のＡ）。培養２１日目の細胞塊において、酸化ストレスを軽減する作用を有する物質を添加しない条件では、表面に鼻腔上皮及び嗅上皮が形成されている細胞塊がある一方で、細胞死によって鼻腔上皮及び嗅上皮が失われている細胞塊が存在した。これに対し、上記酸化ストレスを軽減する作用を有する物質を添加した条件では、鼻腔上皮及び嗅上皮領域での細胞死が抑制され、鼻腔上皮様組織及び嗅上皮様組織が細胞塊表面に維持されていた。特に、ＡＡ２Ｐ、ＮＡＣ、ＮＡＤを組み合わせて添加した際はよく鼻腔上皮様組織及び嗅上皮様組織が維持されていた。これらの結果から、鼻腔上皮を構成する細胞を含有する細胞集団の製造において、酸化ストレスを軽減する作用を有する物質を添加することが有効であることが示された。

　［実験５：ヒトＥＳ細胞由来鼻腔上皮オルガノイドにおけるインフルエンザウイルス受容体の発現解析］
　実験５では、まず、図１３の上段に示す工程に従って鼻腔上皮を構成する細胞を含む細胞集団を製造した。この製造工程では、比較実験１と同じ方法で工程（ａ）～工程（３）を行い、嗅神経細胞が含まれる細胞塊を得た後、さらに培養を継続した（工程（４））。培養３５日目に倒立顕微鏡を用いて、細胞集団の明視野観察を行った（図１３のＡ）。培養３５日目の細胞集団を固定し、表１－１又は１－２に記載の非神経上皮組織を染色する抗Ｓｉｘ１抗体、線毛細胞で陽性となる抗ＦｏｘＪ１抗体及び線毛を染色する抗アセチル化チューブリン（ＡｃＴｕｂ）並びに表２に記載の二次抗体を用いて免疫染色を行なった。染色結果を図１４に示す。非神経上皮組織において、ＦｏｘＪ１とＡｃｔｕｂとが同じ細胞で染色されており、細胞集団には線毛細胞が分化していることがわかった。また、線毛細胞は、細胞集団中で集合して存在していた。線毛は、細胞集団の非神経上皮組織の外側に形成され、非神経上皮組織は極性を有していることがわかる。この細胞集団をヒトＥＳ細胞由来鼻腔上皮オルガノイドともいう。さらに、培養期間を延長した培養４５日目に倒立顕微鏡を用いて動画を撮影した。動画のうちの１フレームを静止画化したものを図１４のＣに示す。動画では、細胞集団の表面の上皮において線毛様の構造が観察され、さらにそれが線毛運動を行っていることが観察された。本発明に係る製造方法により、線毛運動機能を有する線毛細胞を表面の上皮に有する細胞集団を調製可能であることがわかった。

　鼻腔上皮オルガノイドを培養４２日目に固定し、インフルエンザウイルス受容体の発現を解析した。ヒトインフルエンザウイルス受容体シアル酸α２，６Ｇａｌの発現を検出するために、比較実験１に記載の方法で調製した切片を、表１－１又は１－２に記載のビオチン標識したニホンニワトコレクチン（Ｌｅｃｔｉｎ　ｆｒｏｍ　Ｓａｍｂｕｃｕｓ　ｓｉｅｂｏｌｄｉａｎａ／ＳＳＡ－Ｂｉｏｔｉｎ；Ｊ－ケミカル社製）を添加した抗体希釈液を４℃で一晩反応させた後、表２に記載のＡｌｅｘａ５９４標識ストレプトアビジン（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて抗体染色と同様の手法で検出した。また、トリインフルエンザウイルス受容体シアル酸α２，３Ｇａｌの発現を検出するために、抗Ｓｉａα２，３Ｇａｌ抗体（自家調製、ＰＣＴ／ＪＰ２０２０／００３７８２に記載の抗体３Ｂ１Ｅ２）を用いて比較実験１に記載の方法で免疫染色を行った。

　染色結果を図１５に示す。培養４２日目の鼻腔上皮を構成する細胞を含む細胞集団において、シアル酸α２，６Ｇａｌ（Ｓｉａα２，６Ｇａｌ）を発現する細胞、及びシアル酸α２，３Ｇａｌ（Ｓｉａα２，３Ｇａｌ）を発現する細胞がそれぞれ観察された。Ｓｉａα２，６Ｇａｌを発現する細胞は、細胞同士が密着して上皮構造を形成している多列上皮状の細胞であった。一方で、Ｓｉａα２，３Ｇａｌを発現する細胞は、単層の扁平上皮様の細胞が多かった。Ｓｉａα２，６とＳｉａα２，３Ｇａｌは異なる細胞で発現しているようであった。上記の結果から、鼻腔上皮を構成する細胞を含む細胞集団にインフルエンザウイルスが感染する可能性が示された。また、Ｓｉａα２，６Ｇａｌ及びＳｉａα２，３Ｇａｌをそれぞれ受容体とするヒトインフルエンザウイルスとトリヒトインフルエンザウイルスとは、鼻腔上皮及び嗅上皮の異なる細胞に感染する可能性が示された。

　［実験６：ヒトＥＳ細胞由来鼻腔上皮オルガノイドへのインフルエンザウイルス感染及びウイルス増殖試験］
　図１６に記載の方法で調製したヒトＥＳ細胞由来鼻腔上皮オルガノイドを実験に用いた。具体的な製造方法は、工程（３）において、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質として１μＭのＬＤＮ－１９３１８９（メルク社製）を培養６日目より添加したこと、及びＴＡＫ１阻害剤５ｚ－７ｏｘｏｚｅａｅｎｏｌを添加しなかったこと以外は実験１と同じである。実験６以降のウイルス感染実験には、本製造条件にて調製したヒトＥＳ細胞由来鼻腔上皮オルガノイドを用いた。

　培養開始から２８日目のヒトＥＳ細胞由来鼻腔上皮オルガノイドに１０，０００ＰＦＵのＨ１Ｎ１ヒトインフルエンザウイルスＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９（Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ）を感染させた。２４時間ごとに培地を回収し、ＨＡ－ＭＤＣＫ細胞を用いたプラーク法により各日におけるウイルスの増殖及び力価を決定した。実験は５連で実施した。

　結果を図１７に示す。５連で行った実験のうち３回分でウイルスの増殖が観察された。培地に放出されたウイルスの力価は感染後２日目から３日目に最大となり、その後低下した。上記の結果より、本明細書に記載の方法で作製されたヒトＥＳ細胞由来鼻腔上皮オルガノイドにインフルエンザウイルスが感染すること、細胞内でのウイルス増殖が起こること、及び感染性を有したウイルス粒子の細胞外への放出が生じることが示された。作製された鼻腔上皮オルガノイドは、インフルエンザウイルス感染症モデルとして使用できることが示された。

　［実験７：蛍光抗体法によるヒトＥＳ細胞由来鼻腔上皮オルガノイドへのインフルエンザウイルス感染確認］
　実験６に記載の方法でヒトインフルエンザウイルスを感染させたヒトＥＳ細胞由来鼻腔上皮オルガノイドを、感染から２４、４８、１６８又は２６４時間後に固定し、比較実験１に記載の蛍光抗体法によってヒトインフルエンザウイルスの感染を確認した。インフルエンザウイルスの検出には、表１－１又は１－２に記載の抗インフルエンザウイルス核タンパク質抗体（Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ　ＮＰ、ＡｂＣａｍ社製、ａｂ２０３４３）を用い、核の対比染色には１μｇ／ｍｌのＤＡＰＩ（ナカライテスク社製）を二次抗体希釈液中に添加した。

　感染から２４、４８、１６８及び２６４時間後の鼻腔上皮オルガノイドは、いずれも最も外側に位置するＳｏｘ２陽性の嗅上皮中の細胞の一部に、抗インフルエンザウイルス核タンパク質抗体染色が陽性の細胞が存在した。感染から２４時間後の染色結果を図１８に示す。上記の結果から、本明細書に記載の方法で作製されたヒトＥＳ細胞由来鼻腔上皮オルガノイドにインフルエンザウイルスが感染することが確認された。

　［実験８：ヒトＥＳ細胞由来鼻腔上皮オルガノイドへのコロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染・ウイルス増殖試験］
　実験６に記載の方法で調製した、培養開始から２８日目のヒトＥＳ細胞由来鼻腔上皮オルガノイドを用いてコロナウイルス感染実験を実施した。オルガノイドへのウイルス感染の方法としては、５％ＫＳＲ　ｇｆＣＤＭ培地でウイルス液を調製し、培養中のオルガノイドの培地を除き、ウイルス液５０μＬを加えて３７℃で５％ＣＯ_２インキュベーターで１時間培養した。ウイルス液を除き、２００μＬ　５％ＫＳＲ　ｇｆＣＤＭ培地で、上記オルガノイドを２回洗浄した後、２００μＬ　５％ＫＳＲ　ｇｆＣＤＭ培地を加えて、ＣＯ_２インキュベーターで培養した。ウイルス感染は、低濃度条件：１０，０００　ＴＣＩＤ５０又は高濃度条件：１００，０００　ＴＣＩＤ５０の２条件で、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２／Ｈｕ／ＤＰ／Ｋｎｇ／１９－０２７）を用いて行った。

　ウイルス力価測定のため、毎日培養上清を５０μＬずつ回収し、－８０℃で保存した。培地を回収したウェルには、５％ＫＳＲ　ｇｆＣＤＭ培地を５０μＬずつ添加した。ウイルスの力価は次の手順で測定した。９６ウェルプレートにＶｅｒｏＥ６／ＴＭＰＲＳＳ２細胞を播種し、ウイルス含有培養上清を５％ＦＣＳ　ＤＭＥＭで１０倍階段希釈して添加した。１希釈につき３ウェル以上に接種した。ＣＯ_２インキュベーターで、４～５日間培養後に細胞を観察し、細胞変性効果（ＣＰＥ）の有無を判定した。ＣＰＥ陽性ウェル数からＲｅｅｄ－Ｍｕｅｎｃｈ法によりＴＣＩＤ５０を算出し、ウイルスの力価とした。実験は低濃度条件（図１９のＬ１からＬ５）及び高濃度条件（図１９のＨ１からＨ５）について各々５連で実施した。

　結果を図１９に示す。低濃度条件では５連で行った実験のうち１回分（Ｌ３）、高濃度条件では５回実施したすべての回（Ｈ１からＨ５）でウイルスの増殖が観察された。培地中に放出されたウイルスの力価は感染後２日目から３日目に最大となり、その後一旦低下し、感染後７日目以降に再度上昇した。その後、感染後１５日目から１７日目にかけて第二のピークを迎え、その後低下したものの、感染後２２日目でもウイルスの産生は持続していた。上記のようなウイルス力価の再上昇は、性質が一様な培養細胞ではなく、生体由来の組織を用いてウイルス増殖試験を実施した際によく観察される現象である。上記の結果より、本明細書に記載の方法で作製されたヒトＥＳ細胞由来鼻腔上皮オルガノイドにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が感染すること、細胞内でのウイルス増殖が起こること、及び感染性を有したウイルス粒子の細胞外への放出が生じることが示された。また、力価の再上昇が生じることから、上記オルガノイドは生体由来の組織に近い性質を有していることも示された。鼻腔上皮・嗅上皮オルガノイドは、コロナウイルス感染症モデルとして使用できることが示された。オルガノイドから継続してウイルスが産生されていることから、鼻腔上皮・嗅上皮オルガノイドはコロナウイルスに対する持続的感染モデルとしても使用可能であることが分かった。

　［実験９：蛍光抗体法によるヒトＥＳ細胞由来鼻腔上皮オルガノイドへのコロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染確認］
　まず、比較実験１に記載の蛍光抗体法によって感染前の細胞集団の解析を行った。続いて、上記実験８の方法でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を感染させた感染から２日後及び１１日後のヒトＥＳ細胞由来鼻腔上皮オルガノイドを固定し、蛍光抗体法によってＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染を確認した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出には、表１－１又は１－２に記載の抗ＳＡＲＳ核タンパク質抗体（ＳＡＲＳ２　ＮＰ、ＧｅｎｅＴｅｘ社製、ＧＮＴ－ＧＴＸ１３５３５７）を用い、核の対比染色には１μｇ／ｍｌのＤＡＰＩ（ナカライテスク社製）を二次抗体希釈液中に添加した。

　感染前の細胞集団の染色結果を図２０に示す。未感染の培養２８日目のヒトＥＳ細胞由来鼻腔上皮オルガノイドでは、細胞塊の表面に鼻腔上皮（ＲＥ）と嗅上皮（ＯＥ）が連続した、サイトケラチン１８（ＣＫ１８）陽性の上皮構造が形成されていた。このうち、鼻腔上皮部分はサイトケラチン１５（ＣＫ１５）陽性であり、嗅上皮部分はＳｉｘ１、Ｓｏｘ２陽性であった。鼻腔上皮（ＲＥ）の部分で特に強くＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の受容体であるＡＣＥ２を発現していた。

　感染から４８時間後のヒトＥＳ細胞由来鼻腔上皮オルガノイドの染色結果を図２１及び図２２に示す。鼻腔上皮オルガノイドの最も外側に位置し、Ｓｏｘ２陽性かつ一部の細胞がＴｕｊ１陽性の嗅神経である嗅上皮中の細胞の一部に抗ＳＡＲＳ核タンパク質抗体染色が陽性の細胞が存在した（図２１のＡ及びＢ、図２２のＢ）。加えて、サイトケラチン１５（ＫＲＴ１５）陽性の上皮組織である鼻腔上皮はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス受容体であるＡＣＥ２を発現しており、一部の細胞は抗ＳＡＲＳ核タンパク質抗体染色が陽性であった（図２１のＣ及びＤ、図２２のＡ）。加えて、鼻腔上皮オルガノイドの一部の細胞がＦｏｘＩ１を発現しており、塩類細胞（イオノサイト）又はその前駆細胞が鼻腔上皮オルガノイド中に含まれることが示された。ＦｏｘＩ１陽性細胞の一部はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核タンパク質陽性であった（図２２のＣ）。上記の結果から、本明細書に記載の方法で作製されたヒトＥＳ細胞由来鼻腔上皮オルガノイドにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が感染することが示された。また、コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、鼻腔上皮と嗅上皮それぞれに感染することが示された。本明細書に記載の方法で鼻腔上皮の塩類細胞が製造可能であり、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は塩類細胞に感染する可能性が示された。

　感染１１日後のヒトＥＳ細胞由来鼻腔上皮オルガノイドを図２３に示す。Ｓｐ８陽性の嗅上皮（ＯＥ）部分が細胞塊表面に残存していた。加えて、細胞塊内部の細胞も抗ＳＡＲＳ核タンパク質抗体染色が陽性であった。細胞塊内部のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染細胞はＴｕｊ１陽性であり、中枢神経系の神経細胞であることが示された。これらの結果から、本明細書に記載の方法で作製されたヒトＥＳ細胞由来鼻腔上皮オルガノイドを、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の鼻腔上皮・嗅上皮から中枢神経系への感染伝播モデルとして使用できることが示された。

　［実験１０：透過型電子顕微鏡を用いたヒトＥＳ細胞由来鼻腔上皮オルガノイドへのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染確認］
　実験８に記載の方法でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を感染させたヒトＥＳ細胞由来鼻腔上皮オルガノイドを電子顕微鏡で観察した。ウイルス感染から４８時間後に培地を取り除き、ウイルスに感染させたオルガノイドを２．５％グルタールアルデヒドで氷上で１時間固定した。固定したオルガノイドを０．１Ｍカコジル酸バッファーで洗浄し、さらに１％四酸化オスミウムで氷上で１時間固定した。オルガノイドを超純水で洗浄後、５０％～９９％エタノール希釈系列で脱水し、プロピレンオキシドにより置換した。オルガノイドをエポキシ樹脂に包埋後、６０℃で２日間重合させた。ウルトラミクロトームを用いて包埋したオルガノイドの５０ｎｍ厚の超薄切片を薄切し、酢酸ウラン及びクエン酸鉛を用いて電子染色後、透過型電子顕微鏡（日立株式会社製、製品番号ＨＴ－７７００）によって撮像した。

　結果を図２４に示す。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を感染させたヒトＥＳ細胞由来鼻腔上皮オルガノイド中の細胞の表面及び細胞内にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のウイルス粒子が存在していた。さらに、感染した細胞内に二重膜小胞：ｄｏｕｂｌｅ－ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｖｅｓｉｃｌｅｓ（ＤＭＶ）、二重膜小球：ｄｏｕｂｌｅ－ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｓｐｈｅｒｕｌｅｓ　（ＤＭＳ）といった、コロナウイルスを含むある種のウイルスへの感染時に形成される特徴的な細胞内構造が観察された。上記の結果から、本明細書に記載の方法で作製されたヒトＥＳ細胞由来鼻腔上皮オルガノイドにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２等のウイルスが感染すること、及び細胞内でウイルスの複製・増殖が生じることが示された。

　［実験１１：ヒトＥＳ細胞由来嗅上皮・鼻腔上皮オルガノイドを用いたシングルセル解析］
　培養２８日目のヒトＥＳ細胞由来鼻腔上皮オルガノイド、及び実験６に記載の方法でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を感染させた感染後２、７、１１日目のヒトＥＳ細胞由来鼻腔上皮オルガノイドを実験に用いた。１条件あたりオルガノイド４個を１５ｍｌチューブ中で１０Ｕ／ｍＬ　ｐａｐａｉｎ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ、ＬＳ００３１１９）と５００μｇ／ｍＬ　ＤＮａｓｅ　Ｉ（Ｒｏｃｈｅ、１０１０４１５９００１）で３７℃１５分間処理した。上記処理後に１０％ウシ胎児血清含有培地添加により酵素反応を停止し、Ｐ１０００のマイクロピペットを用いて単細胞に分散後、孔径４０μｍのセルストレーナーを用いて夾雑物を除去した。上記細胞懸濁液をスイングローターで遠心（１０００ｒｐｍ、５分）し、上清を除いた後に細胞のペレットを０．０４％　ＢＳＡ入りのＰＢＳで１×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度となるように再度懸濁した。約１６，０００個の細胞相当の上記懸濁液をＣｈｒｏｍｉｕｍ　Ｎｅｘｔ　ＧＥＭ　Ｓｉｎｇｌｅ　Ｃｅｌｌ　３’ＧＥＭ，Ｌｉｂｒａｒｙ＆Ｇｅｌ　Ｂｅａｄ　Ｋｉｔ　ｖ３．１（１０ｘ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ社製、ＰＮ－１０００１２１及びＰＮ－１０００１２８）とともにシングルセル解析用のチップＣｈｒｏｍｉｕｍ　Ｎｅｘｔ　ＧＥＭ　Ｃｈｉｐ　Ｇ　Ｓｉｎｇｌｅ　Ｃｅｌｌ　Ｋｉｔ（１０ｘ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ社製、ＰＮ－１０００１２０）に添加し、キット付属の手順書に従いＳｉｎｇｌｅ　Ｉｎｄｅｘ　Ｋｉｔ　Ｔ　Ｓｅｔ　Ａ（１０ｘ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ社製、ＰＮ－１０００２１３）を用いてＣｈｒｏｍｉｕｍ　Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ（１０ｘ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ社製）によりシングルセル解析用のｃＤＮＡライブラリを調製した。調製した各サンプルのｃＤＮＡライブラリをＮｏｖａＳｅｑ　Ｓ４　２×１５０ｂｐ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社製）を用いて配列を解読し、得られたデータをＣｅｌｌ　Ｒａｎｇｅｒ　ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖｅｒｓｉｏｎ　４．０．０）、Ｓｅｕｒａｔ　ｖ４．０及びＲ　ｐａｃｋａｇｅ　Ｓｅｕｒａｔ（ｖｅｒｓｉｏｎ　４．０．３）を用いて解析した。

　培養２８日目にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を感染させた培養３０日目、すなわち感染後２日目（２ｄａｙｓ　ｐｏｓｔ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ（ｄｐｉ））のヒトＥＳ細胞由来鼻腔上皮オルガノイドを解析して得られたデータより作成したｔ分布型確率的近傍埋め込み（ｔ－ＳＮＥ）のプロット図を図２５のＡに示す。クラスタリングの結果、上記オルガノイドに含まれる細胞を嗅上皮・鼻腔上皮の細胞集団（ＮＥ）と中枢神経系の細胞集団（ＣＮＳ）に分類できた。さらに、嗅上皮、鼻腔上皮、中枢神経系で発現が高い遺伝子、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来転写産物の１細胞ごとの発現量を示したバイオリン図を図２５のＢに示す。解析の結果、ＮＥは嗅上皮・鼻腔上皮で発現するサイトケラチン１８、サイトケラチン１９、Ｓｉｘ１遺伝子の発現が高い細胞集団であった。ＣＮＳは中枢神経系で発現するＦｏｘｇ１、Ｉｒｘ３、Ｔｂｒ１、Ｒｅｅｌｉｎ、Ｅｍｘ１遺伝子の発現が高い細胞集団であった。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染を示す、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来転写産物である膜（Ｍ）タンパク質とスパイク（Ｓ）タンパク質は、ＮＥでより多くの発現する細胞が見られたが、ＣＮＳでも発現する細胞が観察された。上記の結果より、本発明に記載の方法で製造した細胞集団は、嗅上皮・鼻腔上皮の細胞及び中枢神経系の細胞を含有し、さらにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が感染することが示された。

　［実験１２：ヒトＥＳ細胞由来嗅上皮・鼻腔上皮オルガノイドに含まれる細胞のクラスタリング解析］
　実験１１の培養２８日目のヒトＥＳ細胞由来鼻腔上皮オルガノイドに含まれる嗅上皮・鼻腔上皮の細胞集団（ＮＥ）をさらにクラスタリング解析した。クラスタリングの結果、上記上皮・鼻腔上皮の細胞集団を６つのクラスターに分類できた。６つのクラスターのｔ分布型確率的近傍埋め込み（ｔ－ＳＮＥ）のプロット図を図２６に示す。さらに、各クラスターにおける嗅上皮を構成する各細胞のマーカー遺伝子の発現について解析し、上記ｔ－ＳＮＥプロット図において遺伝子ごとに発現量を反映した色付けを実施した結果を図２７に示す。解析の結果、６つのクラスターは各々、神経前駆細胞マーカーであるＮｅｕｒｏＤ１及びＡｓｃｌ１の発現量が高い集団（（１）ＮＰＣ）、嗅神経マーカーであるＳＴＯＭＬ３及びＧＮＧ１３の発現量が高い集団（（２）ＯＳＣ）、未成熟嗅神経マーカーであるＧＮＧ８の発現量が高い集団（（３）ｉｍＯＳＣ）、分泌細胞・杯細胞マーカーであるＭＵＣ５ＡＣの発現量が高い集団（（４）ＭＵＣ）、水平基底細胞マーカーであるサイトケラチン５の発現量が高い集団（（５）ＨＢＣ）、支持細胞マーカーであるＣＹＰ２Ａ１３及びＥＬＦ５の発現量が高い集団（（６）ＳＵＳ）であった。

　分類された６つのクラスターにおいて、特徴的に発現が高い遺伝子（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ　Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　Ｇｅｎｅｓ（ＤＥＧ））を選抜し、遺伝子発現のヒートマップを作製した。クラスター毎のＤＥＧ発現量のヒートマップを図２８に示す。６つのクラスター各々のＤＥＧを図２９及び図３０に示す。解析の結果、各クラスターはＤＥＧの発現量において各々異なった特徴的な発現プロファイルを示し、異なる種類の細胞であることが示された。加えて、（２）ＯＳＣと（３）ｉｍＯＳＣのようにクラスター間でプロファイルが似ている組み合わせが存在し、集団同士の発生・分化上の関係性を示していた。上記の結果から、本発明のヒトＥＳ細胞由来鼻腔上皮オルガノイドに含まれる嗅上皮・鼻腔上皮の細胞集団は、少なくとも６種の細胞を含んでおり、それぞれ神経前駆細胞、嗅神経細胞、未成熟嗅神経細胞、分泌細胞・杯細胞、水平基底細胞、支持細胞であることが示された。

　［実験１３：ヒトＥＳ細胞由来嗅上皮・鼻腔上皮オルガノイドとヒト患者検体由来嗅上皮・鼻腔上皮組織の比較］
　ヒトＥＳ細胞由来鼻腔上皮オルガノイドに含まれる細胞集団をヒトの嗅上皮・鼻腔上皮組織と比較した。ヒト患者検体由来嗅上皮・鼻腔上皮組織のシングルセル解析データのｔ－ＳＮＥプロット図を図３１のＡに示す。神経前駆細胞（ＮＰＣ）、嗅神経細胞（ＯＳＣ）、未成熟嗅神経細胞（ｉｍＯＳＣ）、分泌細胞・杯細胞（ＭＵＣ）、水平基底細胞（ＨＢＣ）、支持細胞（ＳＵＳ）の細胞集団に加えて、さらにＦｏｘＪ１を発現する線毛細胞（ＣＥ）の細胞集団が存在していた。

　上記ヒト患者検体とヒトＥＳ細胞由来鼻腔上皮オルガノイドのシングルセル解析データを比較した。図３１のＢの枠線内に示すとおり、ヒトＥＳ細胞由来鼻腔上皮オルガノイドに含まれる細胞は、ヒト患者検体由来の細胞と非常に似通った位置にプロットされた。上記の結果から、本発明のヒトＥＳ細胞由来鼻腔上皮オルガノイドを構成している細胞は、ヒト組織と同様の細胞から構成されていることが示された。さらに、ヒトＥＳ細胞由来鼻腔上皮オルガノイドが、少数の細胞であるがＦｏｘＪ１を発現している線毛細胞も含有していた。

　［実験１４：ヒトＥＳ細胞由来嗅上皮・鼻腔上皮オルガノイドを用いた嗅覚受容体発現のシングルセル解析］
　ヒトＥＳ細胞由来鼻腔上皮オルガノイドに含まれる嗅神経細胞における嗅覚受容体の発現を、ヒトの嗅上皮・鼻腔上皮組織と比較した。ヒト患者検体由来嗅上皮・鼻腔上皮組織のシングルセル解析データの遺伝子発現ヒートマップを図３２のＡに示す。ヒト患者検体においてＧＮＧ８、ＧＮＧ１３及びＳＴＯＭＬ３を発現する嗅神経細胞は、大多数が細胞ごとに異なる１種の嗅覚受容体のみを発現していた。一方で、ヒトＥＳ細胞由来鼻腔上皮オルガノイドの嗅神経細胞は一つの細胞に複数の嗅覚受容体が発現していた（図３２のＢ）。上記の結果から、ヒトＥＳ細胞由来鼻腔上皮オルガノイドは、嗅覚受容体を発現していること、及びヒト成体の嗅上皮組織と比較して、嗅覚受容体を複数発現する未成熟な嗅神経細胞をより多く含んでいることが示された。

　［実験１５：ヒトＥＳ細胞由来嗅上皮・鼻腔上皮オルガノイドを用いた免疫関連遺伝子発現のシングルセル解析］
　培養２８日目にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を感染させた培養３０日目すなわち感染後２日目のヒトＥＳ細胞由来鼻腔上皮オルガノイドについて、免疫関連遺伝子の発現をシングルセル解析して得られた遺伝子発現ヒートマップを図３３に示す。図３３の破線部の拡大図を図３４に示す。上記シングルセル解析データにおける個別遺伝子発現のＵＭＡＰ解析の結果を図３５及び図３６に示す。解析の結果、ヒトＥＳ細胞由来鼻腔上皮オルガノイドに含まれる鼻腔上皮（ＮＲＥ）及び嗅上皮細胞（ＯＥ）の細胞において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来転写産物であるＯＲＦ１０及びｏｒｆ１ａｂを発現する細胞が検出された。上記感染細胞の遺伝子発現を解析したところ、感染した鼻腔上皮細胞の一部は、ＩＬ３２、ＩＬ１Ａ、ＩＬ６、ＣＸＣＬ８、ＩＦＮＬ１～３及びＩＦＮＢ１を高発現していた（図３４及び図３５）。上記の結果は、本発明のヒトＥＳ細胞由来嗅上皮・鼻腔上皮オルガノイドはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染時に生じる免疫応答をインビトロで再現可能であることを示している。特に、Ｉ型インターフェロンであるＩＦＮＢ１、ＩＩＩ型インターフェロンであるＩＦＮＬ１～３、及びサイトカイン・インターロイキンであるＩＬ３２、ＩＬ１Ａ、ＩＬ６、ＣＸＣＬ８の発現上昇が観察されたことから、これらの免疫応答を再現可能であることを示している。

　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来転写産物であるＯＲＦ１０及びｏｒｆ１ａｂの発現の有無に関わらず、ヒトＥＳ細胞由来鼻腔上皮オルガノイドに含まれる細胞は、一定程度のＩＦＮＡＲ１、ＩＦＮＧＲ１、ＩＬ１Ｒ１といったインターフェロン・インターロイキンの受容体を発現していた（図３３アスタリスク）。加えて、大多数のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来転写産物であるＳタンパク質を発現していない細胞を含む細胞集団全体で、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染後に、インターフェロン刺激により誘導される遺伝子ＩＳＧ１５の発現が亢進していた（図３６）。上記の結果は、本発明に係る細胞集団（細胞塊）において、ウイルスに感染した細胞から分泌されたサイトカインに対する非感染細胞の免疫応答がインビトロで再現されていることを示している。

　［実験１６：ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを用いたＡＣＥ２ノックアウトヒトＥＳ細胞株の樹立］
　ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを用いたノックアウトを実施するために、ゲノム上のヒトＡＣＥ２遺伝子［ＬｏｃｕｓＩＤ（ＮＣＢＩ）５９２７２］の５‘ＵＴＲ領域（５’－ＣＡＡＡＴＧＡＴＧＧＡＡＴＣＡＧＡＡＣＡ－３’）及び第２イントロン領域（５’－ＡＣＴＡＡＡＣＴＴＡＡＴＴＧＡＣＣＣＴＧ－３’）の配列をそれぞれコードしたガイドＲＮＡ発現ベクターを調製した。発現ベクターにはＣａｓ－９　ｓｇＲＮＡ　ｖｅｃｔｏｒ（Ａｄｄｇｅｎｅ、＃６８４６３）を用いた。上記２種のガイドＲＮＡ発現ベクターをＣａｓ９発現ベクター（Ｃａｓ９－２Ａ－ｅＧＦＰ、Ａｄｄｇｅｎｅ、＃４４７１９）とともにヒトＥＳ細胞株（ＫｈＥＳ－１）にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　Ｓｔｅｍ　ｒｅａｇｅｎｔ（サーモフィッシャー社製）を用いて同時に遺伝子導入した。導入したプラスミドの模式図を図３７Ａに示す。導入したガイドＲＮＡ及びＣａｓ９の機能によりＡＣＥ２遺伝子の５‘ＵＴＲ領域及び第２イントロン領域の標的領域においてＤＮＡの二本鎖切断が生じ、細胞の有する非相同末端結合修復（ＮＨＥＪ）により標的領域の欠失が生じる（図３７Ｂ）。

　遺伝子導入実施より２日後にｅＧＦＰ陽性細胞をセルソーターによって分取し、低密度で播種し、単一の細胞に由来するコロニーをピックアップし、クローニングを実施した。得られたコロニーをＣａｓ９標的領域のゲノムＰＣＲ及びゲノムシークエンスによって評価し、ゲノムの両アリルにおいてＡＣＥ２遺伝子のＥｘｏｎ１とＥｘｏｎ２が欠損したクローン２株（ｃｌｏｎｅ　＃１、＃８）を得た。クローニングしたこれら２株を図１６に記載の方法で分化誘導を実施し、培養２８日目にＲＩＰＡバッファーによりライセートサンプル調製を実施し、抗ＡＣＥ２抗体及びローディングコントロールである抗βアクチン抗体を用いたウエスタンブロットを実施した。その結果、コントロールの野生型ＫｈＥＳ－１ではＡＣＥ２の発現が確認されたが、ｃｌｏｎｅ　＃１及び＃８では培養２８日目の嗅上皮・鼻腔上皮への分化後もＡＣＥ２の発現が観察されなかった（図３７のＣ）。上記の結果より、ｃｌｏｎｅ　＃１及び＃８がＡＣＥ２ノックアウトヒトＥＳ細胞株として樹立されたことが示された。

　［実験１７：ＡＣＥ２ノックアウトヒトＥＳ細胞株由来嗅上皮・鼻腔上皮オルガノイドの形成とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染実験］
　実験１６で樹立したＡＣＥ２ノックアウトヒトＥＳ細胞株Ｃｌｏｎｅ　＃１を、図１６に記載の方法で分化誘導を実施し、嗅上皮・鼻腔上皮オルガノイドを作製した。その後、実験８の高濃度条件と同じ方法でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を感染させ、感染から２日後に固定し、蛍光抗体法による解析を実施した。染色結果を図３８に示す。ＡＣＥ２ノックアウトヒトＥＳ細胞株由来嗅上皮・鼻腔上皮オルガノイドにおいてＫＲＴ１５陽性の鼻腔上皮（ＮＲＥ）、Ｓｐ８陽性の嗅上皮（ＯＥ）が形成されており、ＡＣＥ２ノックアウト株は親株と同様の嗅上皮・鼻腔上皮への分化能を有していることが示された。嗅上皮様組織及び鼻腔上皮様組織においてＡＣＥ２の発現は検出されず、ＡＣＥ２遺伝子がノックアウトされていることが確認された。ＡＣＥ２ノックアウトヒトＥＳ細胞株由来嗅上皮・鼻腔上皮オルガノイドにおいては、実験８と同じ感染条件によってもＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染細胞が検出されなかった。従って、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２がＡＣＥ２に依存して感染すること、及びＡＣＥ２ノックアウトヒトＥＳ細胞株由来嗅上皮・鼻腔上皮オルガノイドがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染に対し抵抗性を有することが示された。

　［実験１８：ＡＣＥ２ノックアウトヒトＥＳ細胞株由来鼻腔上皮オルガノイドへのコロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染・ウイルス増殖試験］
　実験１６で樹立したＡＣＥ２ノックアウトヒトＥＳ細胞株Ｃｌｏｎｅ　＃１を、図１６に記載の方法で分化誘導を実施し、嗅上皮・鼻腔上皮オルガノイドを作製した。その後、実験８に記載の方法で鼻腔上皮オルガノイドへのコロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染・ウイルス増殖試験を実施した。実験はウイルス量低濃度条件（図３９のＬ１からＬ５）及び高濃度条件（図３９のＨ１からＨ５）について各々５連で実施した。

　その結果、野生型のヒトＥＳ細胞株由来鼻腔上皮オルガノイドにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を感染させた際に計測された感染後１日目から３日目のウイルスの増殖、力価の上昇は、低濃度条件、高濃度条件のいずれでもＡＣＥ２ノックアウトヒトＥＳ細胞株由来鼻腔上皮オルガノイドへの感染実験では見られず、感染後４日目以降は検出限界以下となった。野生型で生じた感染後１０日目以降の力価の再上昇も検出されなかった。従って、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２がＡＣＥ２に依存して感染すること、及びＡＣＥ２ノックアウトヒトＥＳ細胞株由来嗅上皮・鼻腔上皮オルガノイドがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染に対し抵抗性を有することが示された。

　［実験１９：振盪培養によるヒトｉＰＳ細胞由来嗅上皮・鼻腔上皮オルガノイドの長期培養による分化・成熟の誘導］
　実験１９では、図４０に示す工程に従って、嗅上皮を構成する細胞及び鼻腔上皮を構成する細胞を含む細胞集団を製造した。実験１９では、実験２と同じように工程（１）からＪＮＫ阻害剤を添加し、さらに、工程（３）の途中からアスコルビン酸２リン酸（ＡＡ２Ｐ）、ニコチンアミド（ＮＡＤ）、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン（ＮＡＣ）を添加して培養し、その後培養２８日目から振盪培養を実施した。多能性細胞としてはヒトｉＰＳ細胞株１２３１Ａ３を用いた。具体的な実験操作としては、実験４と同じ方法で２８日間培養した後、先太のチップを用いて嗅上皮・鼻腔上皮を含む細胞塊をコニカルチューブに回収した。増殖因子及び阻害剤を添加しない５％　ＫＳＲ　ｇｆＣＤＭ培地を用いて細胞塊を２回洗浄した後、２５ｍＬの１０％ＫＳＲ　ｇｆＣＤＭ培地を入れた細胞非接着性の培養用７５ｃｍ^２フラスコ（コーニング社製、３５３１３３）に９６個の細胞塊を移設した。その際の培地には１μＭ　ＳＢ４３１５４２、１００ｎＭ　ＥＣ２３、２０ｎｇ／ｍｌ　ｂＦＧＦ－ＴＳ、１０μｇ／ｍｌ　Ｈｅｐａｒｉｎ　Ｓｏｄｉｕｍ、２０ｎｇ／ｍｌ　ＥＧＦ、２５０μＭ　ＡＡ２Ｐ、１ｍＭ　ＮＡＣ、５００μＭ　ＮＡＤを添加した。サンフラワー式シェーカー（Ｍｉｎｉ－Ｓｈａｋｅｒ　３Ｄ、バイオサン社製）による５ｒｐｍの波動形揺動の条件下で振盪培養を実施した。培養４５日目及び５９日目に位相差像の観察を実施した。培養５９日目の試料を固定して比較実験１に記載の方法で免疫染色を実施した。前記した実験で使用した表１－１又は１－２に記載の抗Ｓｉｘ１、Ｓｏｘ２、Ｅ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｓｐ８抗体に加え、神経系の上皮組織及びプラコードで発現する抗Ｎ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ抗体、嗅上皮領域のマーカーである抗サイトケラチン１８（ＣＫ１８）抗体並びに表２に記載の二次抗体を用いて免疫染色を行なった。染色結果を図４０に示す。

　振盪培養を実施することにより、培養４５日目及び５９日目においても細胞塊の表面に肥厚した上皮構造が維持されていた。また、免疫染色による解析の結果、上記上皮はＳｉｘ１、Ｓｏｘ２、Ｅ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｓｐ８、ＣＫ１８及びＮ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ陽性の嗅上皮・鼻腔上皮の組織であった。振盪培養により細胞塊表面の嗅上皮様組織及び鼻腔上皮様組織を維持したまま、オルガノイドの維持及び／又は成熟培養を実施できることがわかった。

　［実験２０：ヒトｉＰＳ細胞からの鼻腔上皮組織、及び嗅窩様構造を形成する嗅上皮組織を含有する細胞集団の製造・分化誘導］
　実験２０では、図４２の上段に示す工程に従って、鼻腔上皮組織、及び嗅窩様構造を形成する嗅上皮組織を含有する細胞集団を製造した。多能性幹細胞として、β－ａｃｔｉｎ遺伝子座にＧＦＰ遺伝子を導入し、恒常的にＧＦＰを発現するヒトｉＰＳ細胞（ｈｉＰＳ　β－ａｃｔｉｎ　ＧＦＰ株、ＩＰＳＣ１０３０、メルク社より購入）を用いた。多能性幹細胞は、国際公開第２０２０／０３９７３２号に記載の通り、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｒｅｐｏｒｔｓ，４，３５９４（２０１４）に記載の方法に準じてフィーダーフリー条件に馴化し、維持培養した。フィーダーフリー培地としてはＳｔｅｍＦｉｔ培地（ＡＫ０２Ｎ、味の素株式会社製）、フィーダーフリー足場にはＬａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８（株式会社ニッピ製）を用いた。具体的な維持培養操作としては、比較実験１に記載のヒトＥＳ細胞の培養と同様に行った。

　培養した多能性幹細胞を分化誘導に用いる際には、播種した６日後にＳｔｅｍＦｉｔ培地の培地交換と同時に５μＭ　ＳＢ４３１５４２と３００ｎＭＳＡＧを添加して２４時間培養した（工程（ａ）開始）。

　調製したサブコンフルエントのヒトｉＰＳ細胞を、上記継代時と同様に５ｍＭ　ＥＤＴＡ／ＰＢＳにて処理した。分化誘導用の無血清培地を添加し、ピペッティングを行って培養ディッシュ表面から細胞を剥がし、単一細胞へ分散した。
　その後、単一細胞に分散されたヒトｉＰＳ細胞を非細胞接着性の９６ウェル培養プレートに、１ウェルあたり１．３５×１０^４細胞になるように１００μｌの無血清培地に懸濁し、スイングローター遠心機を用いて細胞を底面に集めた後に、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で浮遊培養した。その際の無血清培地には、５％　ＫＳＲ　ｇｆＣＤＭを用いた（工程（１）開始）。

　浮遊培養開始時（浮遊培養開始後０日目、工程（１）開始）に、上記無血清培地にＹ２７６３２（終濃度１０μＭ）、ＩＷＰ－２（終濃度１μＭ）、ＳＢ４３１５４２（終濃度１μＭ）、ＪＮＫ－ＩＮ－８（終濃度１μＭ）を添加した。

　浮遊培養開始後１日目にＹ２７６３２を含まず、ＩＷＰ－２、ＳＢ４３１５４２、ＪＮＫ－ＩＮ－８、ＢＭＰ４（終濃度０．５ｎＭ）を含む無血清培地を１ウェルあたり５０μｌ加えた（工程（２）開始）。

　さらに、浮遊培養開始後３日目にＹ２７６３２とＢＭＰ４を含まず、ＩＷＰ－２、ＳＢ４３１５４２、ＪＮＫ－ＩＮ－８、Ｋ０２２８８（終濃度１μＭ）、５Ｚ－７－Ｏｘｏ　Ｚｅａｅｎｏｌ（終濃度２μＭ）を含む無血清培地を１ウェルあたり５０μｌ加えた（工程（３）開始）。以降、培養６、１０、１３、１７日目に同様に半量培地交換を行った。培養１０日目以降の培地交換の際に、１ｍＭ　Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン（ＮＡＣ）、２５０μＭ　アスコルビン酸２リン酸（ＡＡ２Ｐ）、５００μＭ　ニコチンアミド（ＮＡＤ）、培養１３日目以降の培地交換の際に、ＥＧＦ（終濃度２０ｎｇ／ｍｌ）を添加した。

　上記ＢＭＰ４、５Ｚ－７－Ｏｘｏ　Ｚｅａｅｎｏｌ、Ｋ０２２８８、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン、アスコルビン酸２リン酸、ニコチンアミド及びＥＧＦは最初に添加する際は半量交換で添加する培地に各々２倍、３倍、４倍のいずれかの濃度で添加し、ウェル中の終濃度が記載の濃度となるようにした。以降の培地交換の際は、記載の終濃度で培地に添加した。また、以降の記載において、他の各条件で添加する因子、化合物等も同様の方法で添加した。

　浮遊培養開始後２２日目に９６ウェル培養プレートより細胞集団を回収し、浮遊培養用ディッシュへと移し、倒立蛍光顕微鏡（ＢＩＯＲＥＶＯ　ＢＺ－Ｘ８００、キーエンス社製）を用いて偏斜照明観察および蛍光観察を行った（図４２のＡ）。その結果、本発明によりヒトｉＰＳ細胞から製造した細胞塊の表面が非神経上皮組織に覆われ、その一部に非神経上皮と連続し、非神経上皮よりも肥厚した嗅上皮様組織が形成され、嗅上皮様組織が細胞塊の内側に陥入し嗅窩様構造を形成していることが分かった。

　培養２２日目の細胞集団を、比較実験１に記載の方法で固定し、蛍光免疫染色を実施した。一次抗体としては、前記の実施例にて用いたものに加え、表１－１又は１－２に記載の、ｈｉＰＳ　β－ａｃｔｉｎ　ＧＦＰ株において恒常発現しているＧＦＰを認識する抗ＧＦＰ抗体、嗅神経細胞及びその前駆細胞で陽性となる抗Ｅｂｆ２抗体、Ｌｈｘ２抗体、嗅上皮、非神経上皮において陽性となる抗βカテニン抗体、サイトケラチン１８抗体、ＥｐＣＡＭ抗体、嗅上皮および中枢神経系で陽性となるＮ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ抗体、嗅上皮様組織において発現する抗Ｐａｘ６抗体、非神経上皮組織において発現する抗ＥＧＦＲ抗体、基底膜様構造において発現する抗ラミニン抗体、抗コラーゲン４抗体、細胞の基底側の接着面にて陽性となる抗β４インテグリン抗体、細胞の頂端面にて陽性となる抗Ｅｚｒｉｎ抗体を用いた。蛍光標識二次抗体としては、表２に記載の抗体を用いて多重染色を行い、核の対比染色には１μｇ／ｍｌのＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を二次抗体希釈液中に添加した。同一の枠内は同じ切片の異なる蛍光検出条件による多重蛍光染色像である。

　染色結果を図４３および図４４の上段に示す。また、本製造方法により形成された細胞集団の模式図を図４４の下段に示す。培養２２日目の細胞塊において、細胞塊の表面にて肥厚した多列上皮である嗅上皮様組織が折れ曲がって中心部がくぼんだ、胚の嗅覚器の原基となる嗅窩様構造を形成していた。嗅上皮様組織と連続して非神経上皮組織が細胞塊の表面を覆っていた。細胞塊の内部は中枢神経系の細胞であり、細胞塊の表面の連続した嗅上皮様組織、嗅窩様構造、非神経上皮組織との間にラミニン、コラーゲン４陽性の基底膜様構造が形成されていた。嗅上皮様組織、嗅窩様構造、非神経上皮組織の細胞塊表面側はＥｚｒｉｎ陽性の頂端面であり、頂端面－基底面の細胞極性が形成されていた。嗅上皮様組織の基底膜様構造と接する箇所はβ４インテグリン陽性であった。嗅上皮様組織はＥ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ、β－Ｃａｔｅｎｉｎ、サイトケラチン１８、Ｎ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｐａｘ６、Ｓｏｘ２、Ｓｉｘ１、ＡＣＥ２、Ｓｐ８、汎サイトケラチン、ＥｐＣＡＭ陽性であり、嗅上皮様組織中にＮ－ＣＡＭ、Ｔｕｊ１、Ｎ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｅｂｆ２、Ｌｈｘ２、Ｃａｌｒｅｔｉｎｉｎ陽性である嗅神経細胞又はその前駆細胞が存在していた。後に鼻腔上皮組織へと分化し得る非神経上皮組織はＥ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ、β－Ｃａｔｅｎｉｎ、ＣＫ１８、ＥＧＦＲ、ＡＣＥ２、Ｓｉｘ１、汎サイトケラチン陽性であった。中枢神経系組織はＮ－ＣＡＭ、Ｔｕｊ１、Ｎ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｐａｘ６、Ｓｏｘ２陽性であった。上記の結果から、本発明に記載の製造法にて、多能性幹細胞より嗅窩様構造を有する細胞集団を製造可能であることが分かった。

　［実験２１：分割されたマイクロウェルを有する培養器材を用いたヒトｉＰＳ細胞からの鼻腔上皮組織を含有する細胞集団の製造・分化誘導］
　実験２１では、図４５の上段に示す工程に従って、分割されたマイクロウェルを有する培養器材を用いて鼻腔上皮組織、を含有する細胞集団を製造した。多能性幹細胞として、ヒトｉＰＳ細胞１２３１Ａ３株を用いた。分化誘導に用いる細胞は、実験２０と同様に調製した。

　事前に３５ｍｍ　ＥＺＳＰＨＥＲＥ　Ｄｉｓｈ　Ｔｙｐｅ　９０５（旭テクノグラス社製）に後述する分化誘導用の無血清培地を添加し２ｍｌを添加し、１時間程度、ＣＯ_２インキュベーター中に静置し、マイクロウェル内の気泡の除去を顕微鏡で確認した。
　その後、調製したサブコンフルエントのヒトｉＰＳ細胞を、上記継代時と同様に５ｍＭ　ＥＤＴＡ／ＰＢＳにて処理した。細胞回収時に分化誘導用の無血清培地を添加し、ピペッティングを行って培養ディッシュ表面から細胞を剥がし、単一細胞へ分散し、事前に調製した３５ｍｍ　ＥＺＳＰＨＥＲＥ　Ｄｉｓｈに、１ディッシュあたり１．８×１０^６細胞になるように３ｍｌの無血清培地に懸濁し、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で浮遊培養した。その際の無血清培地には、５％　ＫＳＲ　ｇｆＣＤＭを用いた（工程（１）開始）。

　浮遊培養開始時（浮遊培養開始後０日目、工程（１）開始）に、上記無血清培地にＹ２７６３２（終濃度１０μＭ）、ＩＷＰ－２（終濃度１μＭ）、ＳＢ４３１５４２（終濃度１μＭ）、ＪＮＫ－ＩＮ－８（終濃度１μＭ）を添加した。

　浮遊培養開始後１日目に顕微鏡にてマイクロウェル内に細胞凝集体が形成されているのを確認した後に、Ｙ２７６３２を含まず、ＩＷＰ－２、ＳＢ４３１５４２、ＪＮＫ－ＩＮ－８、ＢＭＰ４（終濃度１ｎＭ）を含む無血清培地を１ディッシュあたり１ｍｌ加えた（工程（２）開始）。

　さらに、浮遊培養開始後３日目に、ワイドボアの１０００μｌピペットチップを用いて細胞凝集体を回収し、１０ｃｍ浮遊培養用ディッシュへと移送した。その際の培地には、Ｙ２７６３２とＢＭＰ４を含まず、ＩＷＰ－２、ＳＢ４３１５４２、ＪＮＫ－ＩＮ－８、Ｋ０２２８８（終濃度１μＭ）、５Ｚ－７－Ｏｘｏ　Ｚｅａｅｎｏｌ（終濃度２μＭ）を含む５％　ＫＳＲ　ｇｆＣＤＭを１２ｍｌ用いた（工程（３）開始）。以降、培養６、１０、１３、１７日目にディッシュより６ｍｌの培地を、細胞凝集体を吸わないように回収し、新しい培地を６ｍｌ添加する半量培地交換を行った。培養１０日目以降の培地交換の際に、１ｍＭ　Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン（ＮＡＣ）、２５０μＭ　アスコルビン酸２リン酸（ＡＡ２Ｐ）、５００μＭ　ニコチンアミド（ＮＡＤ）、培養１３日目以降の培地交換の際に、ＥＧＦ（終濃度２０ｎｇ／ｍｌ）を添加した。

　浮遊培養開始後２１日目に倒立蛍光顕微鏡（ＢＩＯＲＥＶＯ　ＢＺ－Ｘ８００、キーエンス社製）を用いて偏斜照明観察を行った（図４５のＡ）。その結果、前記９６ウェルマイクロウェルプレートを用いた際と同様に、分割されたマイクロウェルを有する培養器材を用いることによって、表面に鼻腔上皮及び嗅上皮様組織を有する細胞塊が製造可能であった。

　［実験２２：分割されたマイクロウェルを有する培養器材を用いたヒトｉＰＳ細胞からの鼻腔上皮組織を含有する細胞集団の製造・分化誘導］
　実験２２では、図４６の上段に示す工程に従って、分割されたマイクロウェルを有する培養器材を用いて鼻腔上皮組織、を含有する細胞集団を製造した。多能性幹細胞として、ヒトｉＰＳ細胞１２３１Ａ３株を用いた。分化誘導に用いる細胞は、実験２０と同様に調製した。

　事前にＡｇｇｒｅＷｅｌｌ　８００，　６－ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅ（３４８２１、ＳＴＥＭＣＥＬＬ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）のウェルに２ｍｌのＡｎｔｉ－Ａｄｈｅｒｅｎｃｅ　Ｒｉｎｓｉｎｇ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（０７０１０、ＳＴＥＭＣＥＬＬ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を添加し、スイングローター遠心機を用いて遠心し、気泡を除去した。遠心後にＲｉｎｓｉｎｇ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎを除き、後述する分化誘導用の無血清培地によってウェルを洗浄した後、新しい無血清培地５ｍｌを添加し、１時間程度、ＣＯ２インキュベーター中に静置し平衡化した。
　その後、調製したサブコンフルエントのヒトｉＰＳ細胞を、上記継代時と同様に５ｍＭ　ＥＤＴＡ／ＰＢＳにて処理した。細胞回収時に分化誘導用の無血清培地を添加し、ピペッティングを行って培養ディッシュ表面から細胞を剥がし、単一細胞へ分散し、事前に調製したＡｇｇｒｅＷｅｌｌ　８００，　６－ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅに、１ウェルあたり５．４×１０^６細胞になるように平衡化した５ｍｌの無血清培地に懸濁し、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で浮遊培養した。その際の無血清培地には、５％　ＫＳＲ　ｇｆＣＤＭを用いた（工程（１）開始）。

　浮遊培養開始時（浮遊培養開始後０日目、工程（１）開始）に、上記無血清培地にＹ２７６３２（終濃度１０μＭ）、ＩＷＰ－２（終濃度１μＭ）、ＳＢ４３１５４２（終濃度１μＭ）、ＪＮＫ－ＩＮ－８（終濃度１μＭ）を添加した。

　浮遊培養開始後１日目に顕微鏡にてマイクロウェル内に細胞凝集体が形成されているのを確認した後に、Ｙ２７６３２を含まず、ＩＷＰ－２、ＳＢ４３１５４２、ＪＮＫ－ＩＮ－８、ＢＭＰ４（終濃度１ｎＭ）を含む無血清培地を１ウェルあたり１ｍｌ加えた（工程（２）開始）。

　さらに、浮遊培養開始後３日目に、ワイドボアの１０００μｌピペットチップを用いて細胞凝集体を３７μｍ　Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ　Ｓｔｒａｉｎｅｒ　Ｌａｒｇｅ（２７２５０、ＳＴＥＭＣＥＬＬ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）に回収し、死細胞とデブリを除去後、１０ｃｍ浮遊培養用ディッシュへと移送した。その際の培地には、Ｙ２７６３２とＢＭＰ４を含まず、ＩＷＰ－２、ＳＢ４３１５４２、ＪＮＫ－ＩＮ－８、Ｋ０２２８８（終濃度１μＭ）、５Ｚ－７－Ｏｘｏ　Ｚｅａｅｎｏｌ（終濃度２μＭ）を含む５％　ＫＳＲ　ｇｆＣＤＭを１２ｍｌ用いた（工程（３）開始）。以降、培養６、１０、１３、１７日目にディッシュより６ｍｌの培地を、細胞凝集体を吸わないように回収し、新しい培地を６ｍｌ添加する半量培地交換を行った。培養１０日目以降の培地交換の際に、１ｍＭ　Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン（ＮＡＣ）、２５０μＭ　アスコルビン酸２リン酸（ＡＡ２Ｐ）、５００μＭ　ニコチンアミド（ＮＡＤ）、培養１３日目以降の培地交換の際に、ＥＧＦ（終濃度２０ｎｇ／ｍｌ）を添加した。

　浮遊培養開始後１、２１、５０日目に倒立蛍光顕微鏡（ＢＩＯＲＥＶＯ　ＢＺ－Ｘ８００、キーエンス社製）を用いて位相差観察及び偏斜照明観察を行った（図４６のＡ）。その結果、前記９６ウェルマイクロウェルプレートを用いた際と同様に、分割されたマイクロウェルを有する培養器材を用いることによって、表面に鼻腔上皮及び嗅上皮様組織を有する細胞塊が製造可能であった。

　［実験２３：ヒトＥＳ細胞からの鼻腔上皮を構成する細胞を含有する細胞集団・二次元（２Ｄ）オルガノイドの製造及び季節性コロナウイルス感染・増殖実験］
　図４７の上段に示す培養工程に従って、多能性幹細胞から鼻腔上皮様組織を含む非神経上皮組織を含む細胞集団を接着培養により二次元的に製造した。多能性幹細胞として、ヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ－１株、京都大学より入手）を用いた。多能性幹細胞は、国際公開第２０２０／０３９７３２号に記載の通り、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｒｅｐｏｒｔｓ，４，３５９４（２０１４）に記載の方法に準じてフィーダーフリー条件で維持培養した。フィーダーフリー培地としてはＳｔｅｍＦｉｔ培地（ＡＫ０２Ｎ、味の素株式会社製）、フィーダーフリー足場にはＬａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８（株式会社ニッピ製）を用いた。具体的な維持培養操作としては、比較実験１に記載のヒトＥＳ細胞の培養と同様に行った。

　培養した多能性幹細胞を分化誘導に用いる際には、播種した６日後にＳｔｅｍＦｉｔ培地の培地交換と同時にＳＢ４３１５４２（ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害物質、富士フィルム和光純薬株式会社製、終濃度５μＭ）とＳＡＧ（Ｓｈｈシグナル経路作用物質、Ｅｎｚｏ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、終濃度３００ｎＭ）を添加して２４時間培養した（工程（ａ）開始）。

　調製したサブコンフルエントのヒトＥＳ細胞を、上記継代時と同様に５ｍＭ　ＥＤＴＡ／ＰＢＳにて処理した。分化誘導用の無血清培地を添加し、ピペッティングを行って培養ディッシュ表面から細胞を剥がし、単一細胞へ分散し、回収した。
　その後、単一細胞に分散されたヒトＥＳ細胞を細胞接着性の平底９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）に、１ウェルあたり１×１０^３細胞になるように１００μｌの無血清培地に細胞を懸濁して播種し、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で接着培養した。その際の培養プレートは、Ｌａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８（株式会社ニッピ製）によってコーティングを実施した。また、無血清培地として、Ｆ－１２＋Ｇｌｕｔａｍａｘ培地（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）とＩＭＤＭ＋Ｇｌｕｔａｍａｘ培地（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）の体積比１：１混合液に５％　Ｋｎｏｃｋｏｕｔ　Ｓｅｒｕｍ　Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、４５０μＭ　１－モノチオグリセロール（富士フィルム和光純薬株式会社社製）、１ｘ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ　ｄｅｆｉｎｅｄ　ｌｉｐｉｄ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、５０ｕｎｉｔ／ｍｌペニシリン－５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン（ナカライテスク株式会社製）を添加した培地を用いた（工程（１）開始）。

　接着培養開始時（接着培養開始後０日目、工程（１）開始）に、上記無血清培地にＹ２７６３２（終濃度１０μＭ）、ＩＷＰ－２（終濃度０．５μＭ）、ＳＢ４３１５４２（終濃度１μＭ）を添加した。

接着培養開始後２日目にＹ２７６３２を含まず、ＩＷＰ－２、ＳＢ４３１５４２、ＢＭＰ４（終濃度０．５ｎＭ）を含む無血清培地を１ウェルあたり１００μｌ加えた（工程（２）開始）。

　さらに、接着培養開始後３日目にＹ２７６３２とＢＭＰ４を含まず、ＩＷＰ－２、ＳＢ４３１５４２、ｂＦＧＦ（終濃度２０ｎｇ／ｍｌ）、Ｈｅｐａｒｉｎ　Ｓｏｄｉｕｍ（終濃度１０μｇ／ｍｌ）、ＬＤＮ－１９３１８９（終濃度１００ｎＭ）を含む無血清培地を用いて半量培地交換を行った（工程（３）開始）。以降、培養２日又は３日毎に同様に半量培地交換を行い、鼻腔上皮を構成する細胞を含有する細胞集団・二次元（２Ｄ）オルガノイドを調製した。

　上記ＢＭＰ４、ｂＦＧＦ、Ｈｅｐａｒｉｎ　Ｓｏｄｉｕｍ及びＬＤＮ－１９３１８９は最初に添加する際は半量交換で添加する培地に各々２倍の濃度で添加し、ウェル中の終濃度が記載の濃度となるようにした。以降の培地交換の際は、記載の終濃度で培地に添加した。

　培養開始後４７日目にサイトケラチン１８（ＫＲＴ１８）およびＳＰ８に対する免疫染色を行い、共焦点レーザー顕微鏡（ライカ社製、ＴＣＳ　ＳＰ８）を用いて、観察を行った（図４７）。その結果、上記分化誘導法によりサイトケラチン１８陽性の鼻腔上皮細胞及びＳＰ８陽性の中枢神経系の細胞、サイトケラチン１８、ＳＰ８陽性の嗅上皮細胞を含有し、それらが連続した上皮構造を呈し、鼻腔上皮組織を形成している細胞集団・二次元（２Ｄ）オルガノイドを調製可能であることが分かった。

　［実験２４：ヒトＥＳ細胞から製造した鼻腔上皮を構成する細胞を含有する細胞集団・二次元オルガノイドへの季節性コロナウイルス感染・増殖実験］
　実験２３に記載の方法で製造した鼻腔上皮を構成する細胞を含有する細胞集団・二次元（２Ｄ）オルガノイドに対し、季節性コロナウイルスの感染・増殖実験を実施した。実験操作としては、ヒトＥＳ細胞由来鼻腔上皮２Ｄオルガノイドに対し、Ｊａｐａｎｅｓｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ，　２０２１，　７４．４：　２８５－２９２．及びＪａｐａｎｅｓｅ　ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　ｄｉｓｅａｓｅｓ，　２０１５，　６８．５：　４４２－４４５．に記載の方法に準じて季節性コロナウイルス株ＨＣｏＶ－２２９Ｅ株（「２２９Ｅ」と記載する場合がある。）、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３株（「ＯＣ４３」と記載する場合がある。）、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３株（「ＮＬ６３」と記載する場合がある。）、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１株（「ＨＫＵ１」と記載する場合がある。）の４株（京都府立医科大学及び山形県衛生研究所より入手）を各々感染させ、感染後のウイルス増殖量を経時的に測定した。具体的な感染・増殖実験操作としては、まず、培養２８日目のヒトＥＳ細胞由来鼻腔上皮２Ｄオルガノイドに対し、低用量として５×１０^５　ｃｏｐｉｅｓ／ｗｅｌｌ、高用量として５×１０^６　ｃｏｐｉｅｓ／ｗｅｌｌの条件で単離した各ウイルスを添加した。次に、感染後１日目から８日目まで１日毎に試料として培地を回収し、培地に含まれるウイルス量をリアルタイムＰＣＲ法によって測定した。また併せて、ウイルス感染による細胞変性効果についても観察した。低用量及び高用量ごとに各３連で実験を実施した。陽性対象として、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ株ではＭＲＣ５細胞、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３株ではＨＣＴ－８細胞、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３株ではＬＬＣ－ＭＫ２－Ｎ細胞、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１株ではＶｅｒｏＥ６－ＴＭ２細胞を用いたウイルス増殖試験を実施し、ヒトＥＳ細胞由来鼻腔上皮２Ｄオルガノイドを用いた試験と比較した。

　ウイルス増殖試験の結果を図４８、図４９及び図５０に示す。上記検討の結果、ヒトＥＳ細胞由来鼻腔上皮２Ｄオルガノイドは、気相液相境界面培養法を行うことなく、季節性コロナウイルス株ＨＣｏＶ－２２９Ｅ株、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３株、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３株、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１株の４株すべての増殖をサポートすることが分かった。特に、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３株及びＨＣｏＶ－ＨＫＵ１株は株化培養細胞での増殖のサポートが困難な季節性コロナウイルス株であり、本願に記載の細胞集団及び製造法を用いることにより、効率よく季節性コロナウイルスを分離培養・増殖・調製可能であることが示された（図５０）。

Claims (28)

1. 　鼻腔上皮を構成する細胞の製造方法であって、
   　Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質の存在下で多能性幹細胞を浮遊培養する工程（１）、
   　ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質の存在下で、前記工程（１）で培養した細胞を浮遊培養する工程（２）、
   　ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質及びＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質からなる群より選ばれる少なくとも１つの存在下で、前記工程（２）で培養した細胞を浮遊培養する工程（３）、及び
   　前記工程（３）で培養した細胞をさらに浮遊培養し、前記鼻腔上皮を構成する細胞を得る工程（４）であって、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質、ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質及びＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質からなる群より選ばれる少なくとも２つの非存在下で前記細胞を浮遊培養する工程を含む、製造方法。
2. 　前記工程（４）において、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質、ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質及びＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質の非存在下で前記細胞を浮遊培養する、請求項１に記載の製造方法。
3. 　前記工程（４）において、ＦＧＦシグナル伝達経路阻害物質、Ｓｈｈシグナル伝達経路作用物質、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路阻害物質、アクチビン／ＴＧＦ－βシグナル伝達経路作用物質及びレチノイン酸シグナル伝達経路作用物質からなる群より選ばれる少なくとも１つの存在下で前記細胞を浮遊培養する、請求項１又は２に記載の製造方法。
4. 　鼻腔上皮を構成する細胞の製造方法であって、
   　Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質の存在下で多能性幹細胞を培養器材上で接着培養する工程（１）、
   　ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質の存在下で、前記工程（１）で培養した細胞を接着培養する工程（２）、
   　ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質及びＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質からなる群より選ばれる少なくとも１つの存在下で、前記工程（２）で培養した細胞を接着培養する工程（３）を含む、製造方法。
5. 　前記培養器材は、細胞外マトリクス若しくは合成細胞接着分子でコーティングされている培養器材、培地の灌流を行なうための流路を有する培養器材、又は、酸素若しくは培地を透過する膜を有する培養器材である、請求項４に記載の製造方法。
6. 　前記工程（１）が、前記多能性幹細胞を浮遊培養し、細胞凝集体を形成させる工程であり、
   　前記工程（２）が、前記細胞凝集体を浮遊培養する工程であり、
   　前記工程（３）が、前記工程（２）で培養した前記細胞凝集体を細胞凝集体中の細胞が嗅神経前駆細胞に分化するまで浮遊培養する工程であり、
   　前記工程（４）が前記工程（３）で培養した前記細胞凝集体を前記嗅神経前駆細胞が連続して存在する上皮と、当該上皮上に前記鼻腔上皮とを構成する細胞凝集体を得るまで培養する工程である、請求項１又は請求項２に記載の製造方法。
7. 　前記工程（３）及び前記工程（４）からなる群より選ばれる少なくとも１つの工程において、ＥＧＦシグナル伝達経路作用物質がさらに存在する、請求項１、請求項２、請求項４及び請求項５のいずれか１項に記載の製造方法。
8. 　前記工程（１）、前記工程（２）、前記工程（３）及び前記工程（４）からなる群より選ばれる少なくとも１つの工程において、ＴＧＦβシグナル伝達経路阻害物質がさらに存在する、請求項１、請求項２、請求項４及び請求項５のいずれか１項に記載の製造方法。
9. 　前記工程（１）、前記工程（２）、前記工程（３）及び前記工程（４）からなる群より選ばれる少なくとも１つの工程において、ＪＮＫシグナル伝達経路阻害物質がさらに存在する、請求項１、請求項２、請求項４及び請求項５のいずれか１項に記載の製造方法。
10. 　前記工程（１）、前記工程（２）、前記工程（３）及び前記工程（４）からなる群より選ばれる少なくとも１つの工程において、ＴＡＫ１阻害物質がさらに存在する、請求項１、請求項２、請求項４及び請求項５のいずれか１項に記載の製造方法。
11. 　前記工程（３）及び前記工程（４）からなる群より選ばれる少なくとも１つの工程において、酸化ストレスを軽減する作用を有する物質又はストレス応答シグナル伝達経路に対する阻害物質がさらに存在する、請求項１、請求項２、請求項４及び請求項５のいずれか１項に記載の製造方法。
12. 　前記工程（３）及び前記工程（４）からなる群より選ばれる少なくとも１つの工程において、揺動しながら細胞を培養する、請求項１、請求項２、請求項４及び請求項５のいずれか１項に記載の製造方法。
13. 　請求項１、請求項２、請求項４及び請求項５のいずれか１項に記載の製造方法により得られる、鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞を含む細胞集団。
14. 　鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞を含む細胞集団。
15. 　前記鼻腔上皮を構成する細胞は、分泌細胞、線毛細胞、基底細胞、塩類細胞、神経内分泌細胞、孤立化学感覚上皮細胞及びクラブ細胞からなる群より選ばれる少なくとも１つを含む、請求項１４に記載の細胞集団。
16. 　基底側と頂端側との極性を有する、請求項１４又は請求項１５に記載の細胞集団。
17. 　嗅上皮を構成する細胞又はその前駆細胞をさらに含む、請求項１４又は請求項１５に記載の細胞集団。
18. 　中枢神経系を構成する神経系細胞をさらに含む、請求項１４又は請求項１５に記載の細胞集団。
19. 　三次元の立体的な細胞集団であって、前記鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞を含む鼻腔上皮様組織と、前記鼻腔上皮様組織によって表面の少なくとも一部が被覆された神経組織とを有し、前記神経組織は、中枢神経系を構成する神経系細胞又はその前駆細胞を含む、請求項１４又は請求項１５に記載の細胞集団。
20. 　前記神経組織の表面の少なくとも一部を被覆する嗅上皮様組織をさらに含み、前記嗅上皮様組織は、嗅上皮を構成する細胞又はその前駆細胞を含む、請求項１９に記載の細胞集団。
21. 　前記鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞が培養器材に接着しており、連続した上皮構造により二次元的な鼻腔上皮様組織を形成している、請求項１４又は請求項１５に記載の細胞集団。
22. 　前記鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞は、遺伝性疾患又は感染症に関連する遺伝子が欠損又は変異している、請求項１４又は請求項１５に記載の細胞集団。
23. 　前記遺伝性疾患又は感染症に関連する遺伝子はＡＣＥ２である、請求項２２に記載の細胞集団。
24. 　請求項１４又は請求項１５に記載の細胞集団を用いた、疾患治療用化合物又は対象物質の毒性のスクリーニング方法。
25. 　請求項１４又は請求項１５に記載の細胞集団を含む、疾患治療用化合物又は対象物質の毒性のスクリーニング用キット。
26. 　請求項１４又は請求項１５に記載の細胞集団を用いた、疾患特異的なバイオマーカーの探索方法。
27. 　請求項１４又は請求項１５に記載の細胞集団又はその細胞集団から精製された細胞を含む、移植用細胞集団。
28. 　請求項１４又は請求項１５に記載の細胞集団又はその細胞集団から精製された細胞の、ウイルスの分離培養における使用。

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