WO2023277135A1 - 鼻腔上皮を構成する細胞の製造方法、及び鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞を含む細胞集団 - Google Patents
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
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- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
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-
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
Definitions
- the present invention relates to a method for producing cells constituting nasal epithelium, and a cell population containing cells constituting nasal epithelium or progenitor cells thereof.
- Non-Patent Document 1 by co-culturing embryoid bodies formed from mouse iPS cells with primary cultured cells of the olfactory epithelium or olfactory bulb collected from mice, neurons that express some olfactory neuron markers are generated. It has been reported that differentiation is induced.
- Non-Patent Document 2 reports that olfactory placode cells and olfactory nerve cells were produced from human pluripotent stem cells.
- the inventor of the present application reports in Patent Document 1 that three-dimensional non-neural epithelial tissue and olfactory epithelial tissue can be produced from human ES cells and iPS cells.
- Patent Document 1 does not describe efficient production of nasal epithelial tissue.
- An object of the present invention is to provide a method for efficiently producing cells constituting nasal epithelium from pluripotent stem cells.
- the present inventors cultured pluripotent stem cells in the presence of a Wnt signaling pathway inhibitor, once added a BMP signaling pathway agent, and cultured for a certain period of time. Thereafter, culture is performed by adding at least one selected from the group consisting of FGF signaling pathway acting substances and BMP signaling pathway inhibitors, and further Wnt signaling pathway inhibitors, FGF signaling pathway acting substances and BMP.
- the present inventors have found that by continuing the culture in the absence of at least one substance selected from the group consisting of signal transduction pathway inhibitors, cells constituting the nasal epithelium can be efficiently produced.
- Continuation of the culture is FGF signaling pathway inhibitor, Shh signaling pathway agonist, BMP signaling pathway agonist, Wnt signaling pathway agonist, Notch signaling pathway inhibitor, activin/TGF- ⁇ signaling pathway agonist and the presence of at least one selected from the group consisting of retinoic acid signaling pathway active substances. Furthermore, by using a cultureware in which one well is divided into a plurality of microwells and one cell cluster is formed per one of the microwells, cell clusters containing cells that constitute the nasal epithelium can be produced more efficiently. I found that it can be manufactured well.
- the pluripotent stem cells are adherently cultured on the surface of the instrument in the presence of a Wnt signaling pathway inhibitor, once added with a BMP signaling pathway agent and cultured for a certain period of time, and then FGF signaling
- a Wnt signaling pathway inhibitor once added with a BMP signaling pathway agent and cultured for a certain period of time.
- FGF signaling FGF signaling
- the present invention relates to methods for producing nasal epithelial cells, cell populations containing nasal epithelial cells or progenitor cells thereof, methods for using the cell populations as disease models, and the like.
- a method for producing cells constituting nasal epithelium comprising: step (1) of culturing pluripotent stem cells in the presence of a Wnt signaling pathway inhibitor; step (2) of culturing the cells cultured in step (1) in the presence of a BMP signaling pathway agonist; Step (3) of culturing the cells cultured in step (2) in the presence of at least one selected from the group consisting of FGF signaling pathway agonists and BMP signaling pathway inhibitors, and in step (3)
- a method for producing cells constituting nasal epithelium comprising: Step (1) of culturing pluripotent stem cells in the presence of a Wnt signaling pathway inhibitor, wherein the pluripotent stem cells are cultured in suspension to form cell aggregates; Step (2) of culturing the cells cultured in step (1) in the presence of a BMP signaling pathway agent, wherein the cell aggregates are subjected to suspension culture; Step (3) of culturing the cells cultured in step (2) in the presence of at least one selected from the group consisting of an FGF signaling pathway agonist and a BMP signaling pathway inhibitor, wherein the cell aggregate and further culturing the cells cultured in the step (3) to obtain cells constituting the nasal epithelium (4), wherein the FGF signaling pathway inhibitor, the Shh signaling pathway action At least one selected from the group consisting of substances, BMP signaling pathway agonists, Wnt signaling pathway agonists, Notch signaling pathway inhibitors, activin/TGF- ⁇ signaling pathway agonists
- each well has a bottom area of at least 1 cm 2 or more, The manufacturing method according to [5], wherein the well is divided into at least 4 or more microwells per 1 cm 2 .
- a method for producing cells constituting nasal epithelium comprising: Step (1) of culturing pluripotent stem cells in the presence of a Wnt signaling pathway inhibitor, wherein the pluripotent stem cells are adherently cultured on a culture device; step (2) of culturing the cells cultured in step (1) in the presence of a BMP signaling pathway agent, wherein the cells are adherently cultured; Step (3) of culturing the cells cultured in step (2) in the presence of at least one selected from the group consisting of FGF signaling pathway agonists and BMP signaling pathway inhibitors, wherein the cells are adhered.
- the FGF signaling pathway inhibitor the Shh signaling pathway active substance
- the cultureware has a channel for perfusing the culture medium, In at least one step selected from the group consisting of the step (1), the step (2), the step (3) and the step (4), the cells are adherently cultured under a perfusion environment [7] or The production method according to [8]. [10] The production method according to any one of [7] to [9], wherein the cultureware has a membrane permeable to oxygen or medium.
- a method for producing cells constituting nasal epithelium comprising: Step (1) of culturing pluripotent stem cells in the presence of a Wnt signaling pathway inhibitor, wherein the pluripotent stem cells are cultured in suspension to form cell aggregates; Step (2) of culturing the cells cultured in step (1) in the presence of a BMP signaling pathway agent, wherein the cell aggregates are subjected to suspension culture; Step (3) of culturing the cells cultured in step (2) in the presence of at least one selected from the group consisting of an FGF signaling pathway agonist and a BMP signaling pathway inhibitor, wherein the cell aggregate a step of floating culture until olfactory nerve progenitor cells are differentiated therein; and a step (4) of further culturing the cells cultured in the step (3) to obtain cells constituting the nasal epithelium, wherein the cell aggregates
- a production method comprising the step of culturing aggregates in suspension to obtain cells constituting the nasal epithelium on an epithelium that is
- the Wnt signaling pathway inhibitor includes a PORCN inhibitor.
- the PORCN inhibitor is IWP-2, IWP-3, IWP-4, IWP-L6, IWP-12, IWP-O1, LGK-974, Wnt-C59, ETC-131, ETC-159, GNF -1331, GNF-6231, Porcn-IN-1, RXC004, CGX1321 and at least one selected from the group consisting of derivatives thereof.
- the Wnt signaling pathway inhibitor includes a Wnt/JNK signaling pathway inhibitor.
- the JNK inhibitor is SP600125, JNK-IN-8, DB07268, IQ-1S, Tanzisertib, Bentamapimod, BI-78D3, CC-401, TCS JNK 5a, AS601245, CV-65, D-JNK1, ER -358063, ER-409903, ER-417258, CC-359, CC-930, SB203580 and at least one selected from the group consisting of derivatives thereof, the production method according to [18].
- the JNK inhibitor comprises JNK-IN-8; The production method according to [18] or [19], wherein the step (1) is initiated in a medium in which the JNK-IN-8 concentration is 1 nM to 50 ⁇ M.
- the Rac inhibitor comprises at least one selected from the group consisting of NSC23766, EHop-016, ZCL278, MBQ-167, KRpep-2d, ARS-853, Salirasib, ML141, EHT1864 and derivatives thereof; The production method according to [21].
- step (3) culturing the cells in the presence of a BMP signaling pathway inhibitor;
- the production method according to any one of [1] to [22], wherein the BMP signaling pathway inhibitor includes a type I BMP receptor inhibitor.
- the type I BMP receptor inhibitor includes K02288, Dorsomorphin, LDN-193189, LDN-212854, LDN-214117, ML347, DMH1, DMH2, Compound 1, VU5350, OD52, E6201, Saracatinib, BYL719 and these
- the production method of [23] including at least one selected from the group consisting of derivatives.
- Production method [26] In at least one step selected from the group consisting of the step (1), the step (2), the step (3) and the step (4), a TGF ⁇ signaling pathway inhibitor is further present, [ 1] The production method according to any one of [25]. [27] The production method of [26], wherein the TGF ⁇ signaling pathway inhibitor includes an Alk5/TGF ⁇ R1 inhibitor.
- the Alk5/TGF ⁇ R1 inhibitor is SB431542, SB505124, SB525334, LY2157299, GW788388, LY364947, SD-208, EW-7197, A83-01, A77-01, RepSox, BIBF-0775, TP0427736 -1, SM-16, TEW-7197, LY3200882, LY2109761, KRCA 0008, GSK 1838705, Crizotinib, Ceritinib, ASP 3026, TAE684, AZD3463 and at least one selected from the group consisting of derivatives thereof [27] The manufacturing method described in .
- a TAK1 inhibitor is further present, [1]- The production method according to any one of [28].
- the TAK1 inhibitor comprises at least one selected from the group consisting of (5Z)-7-Oxozeaenol, N-Des(aminocarbonyl)AZ-TAK1 inhibitor, Takinib, NG25 and derivatives thereof, [29] The manufacturing method described in . [31] Any one of [1] to [30], wherein in at least one step selected from the group consisting of the step (3) and the step (4), a substance having an action to reduce oxidative stress is further present. The manufacturing method described in .
- [32] The production of [31], wherein the substance having an effect of reducing oxidative stress contains at least one selected from the group consisting of ascorbic acid, N-acetyl-L-cysteine, nicotinamide and derivatives thereof.
- Method. Any one of [1] to [32], wherein in at least one step selected from the group consisting of the step (3) and the step (4), an inhibitor against a stress response signaling pathway is further present. Method of manufacture as described.
- [34] The production method according to any one of [1] to [33], wherein in at least one step selected from the group consisting of step (3) and step (4), the cells are cultured while shaking. .
- a method for producing cells constituting nasal epithelium comprising: FGF signaling pathway inhibitors, Shh signaling pathway agonists, BMP signaling pathway agonists, Wnt signaling pathway agonists, Notch signaling pathway inhibitors, activin/TGF- ⁇ signaling pathway agonists and retinoic acid signaling
- a production method comprising the step of culturing a cell population containing olfactory nerve cells or their progenitor cells in the presence of at least one selected from the group consisting of pathway-acting substances.
- a cell population comprising cells constituting nasal epithelium or progenitor cells thereof.
- the secretory cell expresses at least one selected from the group consisting of mucin 1, mucin 2, mucin 3, mucin 4, mucin 5AC, mucin 5B, FoxA1, FoxA2, Nkx2.1/TTF-1 and SPDEF. , the cell population of [39].
- [41] The cell population according to any one of [37] to [40], wherein the cells constituting the nasal epithelium include ciliated cells.
- [42] The cell population of [41], wherein the pili cells express at least one selected from the group consisting of FoxJ1, FoxN4, p73, acetylated tubulin and ⁇ 4-Tubulin.
- [48] The cell population according to any one of [37] to [47], wherein the cells constituting the nasal epithelium include neuroendocrine cells.
- NSE neuro-specific enolase
- [52] The cell population according to any one of [37] to [51], wherein the cells constituting the nasal epithelium or progenitor cells thereof express virus receptors or virus infection-related factors.
- the cell population of any one of [37] to [53] which has basal and apical polarity.
- [56] The cell population according to any one of [37] to [55], further comprising cells constituting the olfactory epithelium or progenitor cells thereof.
- a nasal epithelial-like tissue containing cells constituting the nasal epithelium or progenitor cells thereof;
- the cell population according to any one of [37] to [58], wherein the nervous tissue comprises nervous system cells constituting the central nervous system or progenitor cells thereof.
- [60] further comprising an olfactory epithelium-like tissue covering at least a portion of the surface of the nerve tissue;
- the cell population of [61] wherein the olfactory epithelium-like tissue is invaginated toward the inside of the cell mass to form an olfactory fossa-like structure.
- [63] The cell population according to any one of [36] to [62], wherein the cells constituting the nasal epithelium or their progenitor cells have deletions or mutations in genes associated with hereditary diseases or infectious diseases.
- a method of screening for a compound for treating a disease using the cell population of any one of [36] to [64].
- a screening kit for disease-treating compounds comprising the cell population of any one of [36] to [64].
- [67] A method of using the cell population according to any one of [36] to [64] as a disease model for nasal epithelium.
- [68] A method for evaluating efficacy or toxicity of a target substance using the cell population according to any one of [36] to [64].
- [69] A kit for evaluating efficacy or toxicity of a target substance using the cell population according to any one of [36] to [64].
- [70] A method for searching for disease-specific biomarkers, using the cell population of any one of [36] to [64].
- [71] A cell population for transplantation, comprising the cell population of any one of [36] to [64] or cells purified from the cell population.
- the present invention relates to a method for producing the cells constituting the nasal epithelium, a cell population containing the cells constituting the nasal epithelium or their progenitor cells, a method for using the cell population as a disease model, and the like.
- [C1] A method for producing cells constituting nasal epithelium, comprising: (1) suspension culture of pluripotent stem cells in the presence of a Wnt signaling pathway inhibitor; step (2) of suspension culture of the cells cultured in step (1) in the presence of a BMP signaling pathway agent; Step (3) of suspension culture of the cells cultured in step (2) in the presence of at least one selected from the group consisting of FGF signaling pathway agonists and BMP signaling pathway inhibitors, and step (3) Further floating culture the cells cultured in A to obtain cells constituting the nasal epithelium (4), the group consisting of Wnt signaling pathway inhibitors, FGF signaling pathway active substances and BMP signaling pathway inhibitors
- a production method comprising the step of suspension culture of the cells in the absence of at least two selected from.
- [C2] The production method according to [C1], wherein in the step (4), the cells are suspension-cultured in the absence of the Wnt signaling pathway inhibitor, the FGF signaling pathway active substance, and the BMP signaling pathway inhibitor. .
- [C3] In the step (4), FGF signaling pathway inhibitor, Shh signaling pathway agonist, BMP signaling pathway agonist, Wnt signaling pathway agonist, Notch signaling pathway inhibitor, activin/TGF- ⁇
- the production method according to [C1] or [C2] wherein the cells are cultured in suspension in the presence of at least one selected from the group consisting of a signal transduction pathway agent and a retinoic acid signal transduction pathway agent.
- a method for producing cells constituting nasal epithelium comprising: Step (1) of adherently culturing pluripotent stem cells on a culture device in the presence of a Wnt signaling pathway inhibitor; step (2) of adherent culture of the cells cultured in step (1) in the presence of a BMP signaling pathway agent; A production method comprising step (3) of adherently culturing the cells cultured in step (2) in the presence of at least one selected from the group consisting of FGF signaling pathway active substances and BMP signaling pathway inhibitors.
- the culture equipment is a culture equipment coated with an extracellular matrix or synthetic cell adhesion molecules, a culture equipment having a channel for perfusing a medium, or a culture equipment having a membrane permeable to oxygen or a medium.
- the step (1) is a step of suspension culture of the pluripotent stem cells to form cell aggregates
- the step (2) is a step of suspension culture of the cell aggregate
- the step (3) is a step of suspension culture of the cell aggregates cultured in the step (2) until the cells in the cell aggregates differentiate into olfactory nerve progenitor cells, until the step (4) obtains the cell aggregates composing the epithelium in which the olfactory nerve progenitor cells are continuously present and the nasal cavity epithelium on the epithelium from the cell aggregates cultured in the step (3);
- the production method according to any one of [C1] to [C3], which is a step of culturing.
- the EGF signaling pathway agonist is further present in at least one step selected from the group consisting of the step (3) and the step (4), according to any one of [C1] to [C6].
- Production method [C8] In at least one step selected from the group consisting of the step (1), the step (2), the step (3) and the step (4), a TGF ⁇ signaling pathway inhibitor is further present, [ C1] The production method according to any one of [C7].
- a JNK signaling pathway inhibitor is further present, [ C1] The production method according to any one of [C8].
- a TAK1 inhibitor is further present, [C1]- The production method according to any one of [C9].
- [C11] In at least one step selected from the group consisting of the step (3) and the step (4), a substance having an action to reduce oxidative stress or an inhibitor of a stress response signaling pathway is further present, [ C1] The production method according to any one of [C10].
- [C12] The production method according to any one of [C1] to [C11], wherein in at least one step selected from the group consisting of the step (3) and the step (4), the cells are cultured with shaking. .
- [C13] A cell population containing cells constituting the nasal epithelium or progenitor cells thereof, obtained by the production method according to any one of [C1] to [C12].
- [C14] A cell population containing cells constituting nasal epithelium or progenitor cells thereof.
- the cells constituting the nasal epithelium include at least one selected from the group consisting of secretory cells, ciliated cells, basal cells, saline cells, neuroendocrine cells, solitary chemosensory epithelial cells and club cells, [ C14].
- [C16] The cell population of [C14] or [C15], which has basal and apical polarity.
- [C17] The cell population according to any one of [C14] to [C16], further comprising cells constituting the olfactory epithelium or progenitor cells thereof.
- [C18] The cell population according to any one of [C14] to [C17], further comprising nervous system cells that constitute the central nervous system.
- [C19] A three-dimensional three-dimensional cell population, comprising a nasal epithelial-like tissue containing cells constituting the nasal epithelium or progenitor cells thereof, and a nerve having at least a portion of the surface covered by the nasal epithelial-like tissue
- the neural tissue comprises neural cells constituting the central nervous system or progenitor cells thereof.
- [C20] The cell of [19], further comprising an olfactory epithelium-like tissue covering at least a portion of the surface of the nerve tissue, wherein the olfactory epithelium-like tissue comprises cells constituting the olfactory epithelium or precursor cells thereof. group. [C21] of [C14] to [C20], wherein the cells constituting the nasal epithelium or their progenitor cells are adhered to a culture device and form a two-dimensional nasal epithelial-like tissue with a continuous epithelial structure. A cell population according to any one of the above.
- [C22] The cell population according to any one of [C13] to [C21], wherein the cells constituting the nasal epithelium or their progenitor cells have deletions or mutations in genes associated with genetic diseases or infectious diseases.
- [C23] The cell population of [C22], wherein the gene associated with the genetic disease or infectious disease is ACE2.
- [C24] A method of screening toxicity of a disease-treating compound or target substance, using the cell population according to any one of [C13] to [C23].
- [C25] A kit for screening toxicity of a compound for treating a disease or a target substance, comprising the cell population according to any one of [C13] to [C23].
- [C26] A method for searching for a disease-specific biomarker using the cell population according to any one of [C13] to [C23].
- [C27] A cell population for transplantation, comprising the cell population according to any one of [C13] to [C23] or cells purified from the cell population.
- [C28] Use of the cell population according to any one of [C13] to [C23] or cells purified from the cell population in virus isolation culture.
- the present invention it is possible to efficiently produce cells that constitute the nasal epithelium from pluripotent stem cells.
- a disease model using a cell population comprising cells constituting the nasal epithelium or their progenitor cells a screening method for a therapeutic agent for a disease, a screening kit, a method and an evaluation kit for evaluating efficacy or toxicity of a compound. etc. can be provided.
- the nasal epithelium produced by the present invention can be used for research on infectious diseases including novel coronaviruses (SARS-CoV-2) and seasonal coronaviruses, isolation culture of viruses, and the like.
- a to J are diagrams schematically showing the structures of cell populations containing cells constituting the nasal epithelium or progenitor cells thereof. The portion enclosed by the square dotted line forms the nasal epithelial-like tissue.
- the cell population shown in FIG. 1 has a three-dimensional structure.
- a to E are diagrams schematically showing the structures of cell populations containing cells constituting the nasal epithelium or progenitor cells thereof.
- the cell population shown in FIG. 2 has a planar structure.
- A, B and D are top and cross-sectional views of cell populations, C is top view of cell populations, and E is projection and cross-sectional views of cell populations.
- 1A to 1C are diagrams schematically showing structures of cell populations containing cells constituting nasal epithelium or progenitor cells thereof.
- the cell population shown in FIG. 3 includes cells constituting the nasal epithelium or cell clusters containing progenitor cells thereof and cells of other tissues.
- a to F are diagrams schematically showing the structure of nasal epithelial-like tissue present in non-neural epithelial tissue.
- the upper row is a diagram schematically showing the steps for producing a cell cluster containing a non-neural epithelial tissue from human ES cells in Comparative Experiment 1.
- FIG. A is a bright-field observation image of an inverted microscope of cell clusters 28 days after the start of suspension culture in Comparative Experiment 1.
- FIG. B is an immunostained image of a cell mass 28 days after the start of suspension culture and its nuclear stained image in Comparative Experiment 1.
- FIG. C is a diagram schematically showing the structure of cell clusters on day 28 of culture in Comparative Experiment 1.
- the upper part is a diagram schematically showing the process of preparing a cell population containing cells constituting the nasal epithelium from human ES cells in Experiment 1.
- A is a bright-field observation image of a cell population 35 days after the start of culture in Experiment 1, taken with an inverted microscope. 1 shows an immunostained image of a cell population 35 days after the start of culture and its nuclear stained image in Experiment 1.
- FIG. A is an immunostaining image and its nuclear staining image of the cell population 35 days after the start of culture in Experiment 1.
- FIG. B is a diagram schematically showing the structure of the cell population on day 35 of culture in Experiment 1.
- the upper part is a diagram schematically showing the process of preparing a cell population containing cells constituting the nasal epithelium from human ES cells in Experiment 2.
- A is a bright-field observation image of a cell population 28 days after the start of culture in Experiment 2 with an inverted microscope.
- FIG. 2 shows immunostained images and nuclear stained images of cell populations 28 days after the start of culture when a JNK inhibitor was added in Experiment 2.
- FIG. The upper part is a diagram schematically showing the process of preparing a cell population containing cells constituting the nasal epithelium from human ES cells in Experiment 3.
- A is a bright-field observation image of a cell population 28 days after the start of culture in Experiment 3, taken with an inverted microscope.
- B and C are immunostained images and nuclear stained images of the cell population 28 days after the start of culture in Experiment 3.
- D is a diagram schematically showing the structure of the cell population on day 28 of culture in Experiment 3.
- FIG. The upper part is a diagram schematically showing the process of preparing a cell population containing cells that constitute the nasal epithelium from human iPS cells in Experiment 4.
- A is a bright-field observation image of the cell population 21 days after the start of culture in Experiment 4 with an inverted microscope.
- the upper row is a diagram schematically showing the process of preparing a cell population containing cells constituting the nasal epithelium from human ES cells in Experiment 5.
- A is a bright-field observation image of a cell population 35 days after the start of culture in Experiment 5 with an inverted microscope.
- A is an immunostained image and its nuclear stained image of the cell population 35 days after the start of culture in Experiment 5.
- FIG. B is an enlarged view of the portion enclosed by the dotted line in the square in A.
- FIG. C is a bright-field image and its enlarged view when a moving image of the cell population on the 45th day after the start of culture was taken.
- FIG. 10 is an immunostained image of influenza virus receptors in a cell population 42 days after the start of culture in Experiment 5, and its nuclear stained image.
- FIG. Fig. 10 is a graph showing virus titers measured every day after infection in Experiment 6, in which a cell population containing cells constituting nasal epithelium was infected with influenza virus.
- the upper row shows an immunostained image of a cell population infected with influenza virus in Experiment 7 and its nuclear stained image.
- the lower part is a partially enlarged view of the upper part.
- FIG. 10 is a graph showing virus titers measured every number of days after infection in Experiment 8, in which a cell population containing cells constituting the nasal epithelium was infected with SARS-CoV-2 at a low concentration or a high concentration.
- L1 to L5 are the results of infection with low viral load and H1 to H5 are the results of infection with high viral load.
- it is an immunostaining image and its nuclear staining image of the cell population on the 28th day of culture before virus infection.
- a to D are immunostaining images and nuclear staining images of cell populations two days after infection with SARS-CoV-2 in Experiment 9.
- FIG. Enlarged views of portions enclosed by dotted lines in squares in the figures are shown in the right figures of the respective figures.
- FIG. A to C are immunostaining images and nuclear staining images of cell populations two days after infection with SARS-CoV-2 in Experiment 9.
- FIG. Enlarged views of portions enclosed by dotted lines in squares in the figures are shown in the right figures of the respective figures.
- Arrowheads in A and B indicate virus-infected olfactory epithelium-like tissue or nasal epithelium-like tissue.
- FIG. 11 shows immunostained images and nuclear stained images of cell populations 11 days after infection with SARS-CoV-2 in Experiment 9.
- FIG. Enlarged views of the parts enclosed by frames A and B in the left figure are shown in the center and right figures, respectively.
- Asterisks (*) in the figure indicate cells of the central nervous system inside the organoid expressing the SARS-CoV2 N protein (SARS-N).
- AJ are electron micrographs of cell populations infected with SARS-CoV-2 in Experiment 10.
- FIG. 11 shows the results of single-cell analysis of a cell population containing cells that constitute the nasal epithelium two days after infection with SARS-CoV-2 in Experiment 11.
- FIG. A is a t-SNE plot diagram classified into olfactory epithelium/nasal epithelium cell population (NE) and central nervous system cell population (CNS).
- FIG. 10 is a t-SNE plot diagram of single-cell analysis results of cytokeratin 18-positive cells contained in a cell population containing cells constituting nasal epithelium in Experiment 12.
- FIG. 12 shows the results of expression level analysis of marker genes in each cell in single-cell analysis of cytokeratin 18-positive cells in a cell population containing cells constituting nasal epithelium in Experiment 12.
- FIG. 12 is a heat map of gene expression of differentially expressed genes (DEG) in six clusters classified by single-cell analysis in Experiment 12.
- DEG differentially expressed genes
- 29 is a list of DEGs described in (1) to (3) of FIG. 28; 29 is a list of DEGs described in (4) to (6) of FIG. 28; A shows the results of single-cell analysis of human patient-derived nasal and olfactory epithelium specimens in Experiment 13.
- B is the result of superimposing and comparing the analysis results of A and the single-cell analysis results of the cell population containing the cells constituting the nasal epithelium 2 days after infection with SARS-CoV-2 (30 days of culture).
- A is the result of expression level analysis of olfactory nerve markers and olfactory receptors in single-cell analysis of human patient-derived nasal epithelium/olfactory epithelium specimens in Experiment 14.
- B is the result of expression level analysis of olfactory nerve markers and olfactory receptors in single-cell analysis of cell populations containing cells constituting the nasal epithelium on day 2 after infection with SARS-CoV-2 in Experiment 14.
- 15 shows the results of single-cell analysis of the expression levels of immune-related genes in cell populations containing cells constituting the nasal epithelium two days after infection with SARS-CoV-2 in Experiment 15.
- FIG. 34 is an enlarged view of the inside of the dashed line portion of FIG. 33;
- FIG. 15 shows the results of single-cell analysis of a cell population containing cells that constitute the nasal epithelium two days after infection with SARS-CoV-2 in Experiment 15, and analysis of expressing cells for each immune-related gene.
- A is a schematic diagram of the plasmid vector used to establish the ACE2-knockout human ES cell line KhES-1 used in Experiment 16.
- FIG. B is the structure of the ACE2 region on the genome of wild type and ACE2 knockout KhES-1.
- FIG. 1 shows the results of Western blot analysis of ACE2 expression in olfactory epithelium/nasal epithelium organoids prepared from wild-type and ACE2-knockout KhES-1 on day 28 of culture.
- 2 shows the results of immunostaining two days after SARS-CoV-2 infection of a cell population containing cells constituting the nasal epithelium differentiated from the ACE2-knockout human ES cell line KhES-1 in Experiment 17.
- FIG. Enlarged views of portions surrounded by dotted lines in the left figures are shown in the right figures of each figure.
- FIG. 18 a cell population containing cells constituting the nasal epithelium induced to differentiate from the ACE2 knockout human ES cell line KhES-1 was infected with SARS-CoV-2 at a low or high concentration, and measured every number of days after infection.
- Figure 2 is a graph showing the virus titers obtained from the assay.
- L1 to L5 are the results of infection with low viral load and H1 to H5 are the results of infection with high viral load.
- the upper row is a diagram schematically showing the process of preparing cell clusters containing cells constituting the nasal epithelium from human iPS cells and culturing them for a long period of time in Experiment 19.
- A is bright-field observation images of cell clusters taken 45 days and 59 days after the start of culture, taken with an inverted microscope.
- B is an immunostained image of a cell cluster 59 days after the start of culture and its nuclear stained image.
- a and B are diagrams schematically showing the structures of cell populations containing cells constituting the nasal epithelium or progenitor cells thereof. The portion enclosed by the square dotted line forms the nasal epithelial-like tissue.
- the cell population shown in FIG. 41 has a three-dimensional structure.
- the upper row is a diagram schematically showing the steps for producing a cell population containing nasal epithelial tissue and olfactory epithelial tissue forming an olfactory fossa-like structure from human iPS cells in Experiment 20.
- FIG. A is a bright-field observation image of the cell population 22 days after the start of culture in Experiment 20 with an inverted microscope.
- FIG. 10 shows an immunostained image of a cell population 22 days after the start of culture and its nuclear stained image in Experiment 20.
- FIG. 10 shows an immunostained image of a cell population 22 days after the start of culture and its nuclear stained image in Experiment 20.
- FIG. B is a diagram schematically showing the structure of the cell population on day 22 of culture in Experiment 20.
- FIG. The upper row is a diagram schematically showing the steps for producing a cell population containing nasal epithelial tissue from human iPS cells using cultureware having divided microwells in Experiment 21.
- A is a bright-field observation image of a cell population 21 days after the start of culture in Experiment 21, taken with an inverted microscope.
- the upper row is a diagram schematically showing the steps for producing a cell population containing nasal epithelial tissue from human iPS cells using cultureware having divided microwells in Experiment 22.
- A is bright-field observation images of the cell population 1 day, 21 days, and 50 days after the start of culture in Experiment 22, taken with an inverted microscope.
- the upper row is a diagram schematically showing the steps for producing cell populations and two-dimensional organoids containing cells constituting the nasal epithelium from human ES cells by adhesion culture in Experiment 23.
- A is an observed image of fluorescence immunostaining of a cell population 47 days after the start of culture in Experiment 23 using an anti-cytokeratin 18 antibody and an anti-SP8 antibody.
- the upper row schematically shows the procedure for seasonal coronavirus infection experiments on cell populations and two-dimensional organoids containing cells constituting human ES cell-derived nasal epithelium prepared by the method described in Experiment 23 in Experiment 24. It is a diagram.
- human ES cell-derived nasal two-dimensional organoids and MRC5 cell line were infected with the seasonal coronavirus strain HCoV-229E, and the virus content in the medium was measured daily from day 1 to day 8 after infection. It is a graph of the results obtained.
- FIG. 10 is a graph showing the virus content in the medium on day 3 or 4 after infection with each seasonal coronavirus strain in human ES cell-derived nasal two-dimensional organoids and positive control cell lines in Experiment 24.
- a “stem cell” means an undifferentiated cell having differentiation potential and proliferation potential (especially self-renewal potential).
- Stem cells include pluripotent stem cells, multipotent stem cells, unipotent stem cells, etc., depending on their ability to differentiate.
- a “pluripotent stem cell” refers to a stem cell that can be cultured in vitro and has the ability to differentiate into all cells that constitute a living body (pluripotency). All cells are derived from three germ layers: ectoderm, mesoderm and endoderm.
- multipotent stem cell is meant a stem cell that has the ability to differentiate into multiple, but not all, types of tissues and cells.
- a “unipotent stem cell” means a stem cell that has the ability to differentiate into a specific tissue or cell.
- Pluripotent stem cells can be derived from fertilized eggs, cloned embryos, germ stem cells, tissue stem cells, somatic cells, etc.
- pluripotent stem cells include embryonic stem cells (ES cells: Embryonic stem cells), EG cells (Embryonic germ cells), induced pluripotent stem cells (iPS cells: induced pluripotent stem cells), and the like.
- Pluripotent stem cells also include Muse cells (Multi-lineage differentiating Stress Enduring cells) obtained from mesenchymal stem cells (MSCs) and GS cells produced from germ cells (eg, testis).
- Embryonic stem cells were first established in 1981 and have been applied to the production of knockout mice since 1989. Human embryonic stem cells were established in 1998 and are being used in regenerative medicine. ES cells can be produced by culturing the inner cell mass on feeder cells or in a medium containing a leukemia inhibitory factor (LIF). Methods for producing ES cells are described in, for example, WO96/22362, WO02/101057, US Pat. No. 5,843,780, US Pat. No. 6,200,806, US Pat. It is Embryonic stem cells can be obtained from designated institutions and can also be purchased commercially. For example, human embryonic stem cells KhES-1, KhES-2 and KhES-3 are available from the Institute for Frontier Medical Sciences, Kyoto University.
- LIF leukemia inhibitory factor
- Human ES cells also include stem cells isolated or obtained using human embryos within 14 days of fertilization that have not undergone in vivo development. Both are mouse embryonic stem cells, EB5 cells are available from the National Institute of Physical and Chemical Research, and D3 strain is available from the American Type Culture Collection (ATCC).
- a nuclear-transplanted ES cell (ntES cell), which is one of ES cells, can be established from a cloned embryo produced by transplanting the cell nucleus of a somatic cell into an egg from which the cell nucleus has been removed.
- EG cells can be produced by culturing primordial germ cells in a medium containing mouse stem cell factor (mSCF), LIF and basic fibroblast growth factor (bFGF) (Cell, 70:841-847, 1992).
- mSCF mouse stem cell factor
- bFGF basic fibroblast growth factor
- “Induced pluripotent stem cells” are cells in which pluripotency is induced by reprogramming somatic cells by known methods.
- induced pluripotent stem cells specifically, somatic cells differentiated into fibroblasts, peripheral blood mononuclear cells, etc. are Oct3/4, Sox2, Klf4, Myc (c-Myc, N-Myc, L-Myc). , Glis1, Nanog, Sall4, lin28, Esrrb, etc., and reprogrammed by the expression of multiple genes to induce pluripotency.
- Yamanaka et al. established mouse induced pluripotent stem cells (Cell, 2006, 126(4) pp.663-676).
- Induced pluripotent stem cells were also established in human fibroblasts in 2007, and have pluripotency and self-renewal ability like embryonic stem cells (Cell, 2007, 131(5) pp.861-872; Science, 2007, 318(5858) pp. 1917-1920; Nat. Biotechnol., 2008, 26(1) pp. 101-106).
- induced pluripotent stem cells can be induced from somatic cells by addition of compounds, etc., in addition to the method of producing induced pluripotent stem cells by direct reprogramming by gene expression (Science, 2013, 341, pp. 651- 654, Nature (2022).https://doi.org/10.1038/s41586-022-04593-5).
- Somatic cells used for producing induced pluripotent stem cells are not particularly limited, but tissue-derived fibroblasts, blood cells (e.g., peripheral blood mononuclear cells, T cells, etc.), hepatocytes, pancreas cells, intestinal epithelial cells, smooth muscle cells, and the like.
- Means for expressing genes include, for example, infection methods using viral vectors (e.g., retroviral vectors, lentiviral vectors, Sendai viral vectors, adenoviral vectors, adeno-associated viral vectors), plasmid vectors (e.g., plasmid vectors, episomal vectors). vector) using gene transfer method (e.g. calcium phosphate method, lipofection method, retronectin method, electroporation method), gene transfer method using RNA vector (e.g. calcium phosphate method, lipofection method, electroporation method), protein A direct injection method and the like can be mentioned.
- viral vectors e.g., retroviral vectors, lentiviral vectors, Sendai viral vectors, adenoviral vectors, adeno-associated viral vectors
- plasmid vectors e.g., plasmid vectors, episomal vectors.
- gene transfer method e.g. calcium phosphate method, lipofection
- Pluripotent stem cells may be genetically modified.
- Genetically modified pluripotent stem cells can be produced, for example, by using homologous recombination techniques.
- Genes on the chromosome to be modified include, for example, cell marker genes, histocompatibility antigen genes, and disease-associated genes based on nervous system cell disorders. ⁇ Manipulating the Mouse Embryo,A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1994) ⁇ Gene Targeting,A Practical Approach,IRL Press at Oxford University Press(1993) ⁇ 8. Gene targeting, generation of mutant mice using ES cells, methods described in Yodosha (1995), etc. can be used.
- the genomic gene of the target gene to be modified (e.g., cell marker gene, histocompatibility antigen gene, disease-related gene, etc.) is isolated, and the target gene is homologously recombined using the isolated genomic gene.
- Create a target vector for By introducing the produced target vector into stem cells and selecting cells in which homologous recombination has occurred between the target gene and the target vector, stem cells in which genes on chromosomes have been modified can be produced.
- Methods for isolating the genomic gene of the target gene include those described in Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) and Current Protocols in Molecular Biology, Johns Wiley 7-19 (19), etc. A well-known method is mentioned.
- a genomic DNA library screening system manufactured by Genome Systems
- Universal GenomeWalker Kits manufactured by Clontech
- Target vectors for homologous recombination of target genes Preparation of target vectors for homologous recombination of target genes and efficient selection of homologous recombinants are described in Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993), Biomanual Series 8, Gene Targeting , Production of Mutant Mouse Using ES Cells, Yodosha (1995), and the like. Either a replacement type or an insertion type target vector can be used.
- methods such as positive selection, promoter selection, negative selection, poly A selection, and the like can be used.
- Methods for selecting the desired homologous recombinant from the screened cell lines include Southern hybridization method and PCR method for genomic DNA.
- Genome-edited pluripotent stem cells can also be used as pluripotent stem cells.
- Gene editing is a technique for intentionally modifying a target gene or genomic region by the principle of site-specific cleavage of genomic DNA strands using a nuclease, chemical conversion of bases, or the like.
- Site-specific nucleases include zinc finger nucleases (ZFNs), TALENs, CRISPR/Cas9 and modifications thereof.
- ACE2 angiotensin-converting enzyme 2
- pluripotent stem cells that do not express the ACE2 gene can be prepared.
- gene mutations are comprehensively introduced by the method described in Nature volume 568, pages 511-516 (2019), etc., and the functions of the genes are , effects, etc. (CRISPR screening) can also be performed.
- Disease-specific pluripotent stem cells may be used as pluripotent stem cells.
- a “disease-specific pluripotent stem cell” refers to a pluripotent stem cell with a genetic background or mutation of a gene involved in disease development.
- Disease-specific pluripotent stem cells are obtained by establishing induced pluripotent stem cells from patients with the target disease or their relatives by the method described above, or by obtaining the genome of already established pluripotent stem cells. It can be produced by a modification method using genome editing techniques such as zinc finger nuclease (ZFN), TALEN, and CRISPR.
- ZFN zinc finger nuclease
- TALEN TALEN
- induced pluripotent stem cells established from cystic fibrosis patients are cystic fibrosis disease-specific pluripotent stem cells (disease-specific iPS cells).
- disease-specific pluripotent stem cells of cystic fibrosis can be produced by introducing mutations of known genes that occur in cystic fibrosis patients into already established ES cells, iPS cells, etc. can.
- “Mammals” include rodents, ungulates, cats, lagomorphs, primates, and the like. Rodents include mice, rats, hamsters, guinea pigs, and the like. Hoofed animals include pigs, cows, goats, horses, sheep, and the like. The Felida includes dogs, cats, and the like. Lagomorpha includes rabbits and the like.
- the term “primate” refers to a mammal belonging to the order Primate, and includes lemurs, lorises, tsubai, and the like of the order Prosimian, and monkeys, anthropoids, and humans, and the like.
- the pluripotent stem cells used in the present invention are mammalian pluripotent stem cells, preferably rodent (e.g., mouse, rat) or primate (e.g., human, monkey) pluripotent stem cells, most preferably. are human pluripotent stem cells.
- Cell adhesion includes cell-to-cell adhesion (cell-cell adhesion) and cell-to-extracellular matrix (substrate) adhesion (cell-substrate adhesion). Adhesion of cells to culture equipment and the like that occurs in an in vitro artificial culture environment is also included in cell adhesion.
- the junctions formed in cell-cell adhesion are cell-cell junctions, and the junctions formed in cell-substrate adhesion are cell-substrate junctions.
- Types of cell adhesion include, for example, anchoring junctions, communicating junctions, and occluding junctions.
- Tight junctions are relatively strong cell-cell junctions and can occur in epithelial cells. The presence or absence of tight junctions between cells can be detected, for example, by techniques such as immunohistochemistry using antibodies against tight junction constituents (anti-claudin antibody, anti-ZO-1 antibody, etc.).
- suspension culture refers to culturing cells while maintaining the state in which they are floating in the culture solution.
- suspension culture is carried out under conditions that do not allow cells to adhere to the cultureware and feeder cells on the cultureware (hereinafter referred to as “cultureware, etc.”). culture). More specifically, suspension culture refers to culture under conditions that do not form strong cell-substrate bonds between cells and cultureware. A person skilled in the art can easily determine whether the cultured cells are in a state of suspension culture or adherence culture, for example, by swinging culture equipment during microscopic observation.
- Adhesive culture refers to culturing while maintaining the state in which cells adhere to cultureware and the like.
- the adherence of cells to a cultureware or the like means that a strong cell-substrate bond, which is a type of cell adhesion, can be formed between the cells and the cultureware or the like.
- cell aggregates in suspension culture cells adhere to each other.
- strong cell-substrate bonds are not formed between cells and cultureware, and cell-substrate bonds are hardly formed, or even if they are formed, they do not contribute. small.
- Plant attachment between cells means that the cells adhere to each other on the plane. More specifically, "cells are surface-to-cell adhered” means that the ratio of the surface area of a certain cell that is adhered to the surface of another cell is, for example, 1% or more, preferably 3% or more, more preferably means 5% or more.
- the cell surface can be observed by staining with a membrane-staining reagent (eg, DiI), immunostaining with cell adhesion factors (eg, E-cadherin, N-cadherin, etc.), and the like.
- a membrane-staining reagent eg, DiI
- cell adhesion factors eg
- the cultureware used for adherent culture is not particularly limited as long as it allows adherent culture, and can be appropriately determined by those skilled in the art.
- Examples of such culture equipment include flasks, tissue culture flasks, dishes, tissue culture dishes, multidishes, microplates, microwell plates, micropores, multiplates, multiwell plates, chamber slides, Petri dishes, tubes, Biofunctional chips such as trays, culture bags, and organ-on-chips are included.
- These cultureware may be either hard or soft.
- As the cell-adhesive cultureware those whose surfaces are artificially treated for the purpose of improving adhesion to cells can be used.
- the artificial treatment includes, for example, coating treatment with extracellular matrix, polymer, etc., and surface treatment such as gas plasma treatment and positive charge treatment.
- extracellular matrices to which cells adhere include basement membrane samples, laminin, entactin, collagen, gelatin and the like.
- Polymers include polylysine, polyornithine, and the like.
- the culture surface of the cultureware may be flat or uneven.
- laminin is a heterotrimeric molecule consisting of ⁇ , ⁇ , and ⁇ chains, and is an extracellular matrix protein that has isoforms with different subunit chain compositions. Specifically, laminin has about 15 isoforms, which are heterotrimeric combinations of 5 ⁇ -chains, 4 ⁇ -chains and 3 ⁇ -chains.
- the name of laminin is determined by combining the respective numbers of the ⁇ chain ( ⁇ 1 to ⁇ 5), ⁇ chain ( ⁇ 1 to ⁇ 4) and ⁇ chain ( ⁇ 1 to ⁇ 4). For example, laminin composed of a combination of ⁇ 5 chain, ⁇ 1 chain and ⁇ 1 chain is called laminin-511.
- the cultureware used for suspension culture is not particularly limited as long as it is capable of suspension culture, and can be appropriately determined by those skilled in the art.
- Examples of such culture equipment include flasks, tissue culture flasks, dishes, petri dishes, tissue culture dishes, multidishes, microplates, microwell plates, micropores, multiplates, multiwell plates, chamber slides, petri dishes. , tubes, trays, culture bags, spinner flasks and roller bottles.
- These cultureware may be either hard or soft.
- These cultureware are preferably cell non-adhesive in order to enable suspension culture.
- the non-cell-adherent cultureware the surface of the cultureware is not subjected to the artificial treatment described above for the purpose of improving the adhesion to cells.
- non-cell-adhesive cultureware cultureware whose surface has been artificially treated for the purpose of reducing adhesion to cells can also be used.
- the culture surface of the cultureware may be flat, U-bottomed or V-bottomed, and may be uneven.
- treatments that reduce adhesion to cells include 2-methyloxyethyl phosphorylcholine (MPC) polymer, Poly (2-hydroxyethyl methacrylate) (Poly-HEMA), and superhydrophilic treatment by coating with polyethylene glycol (PEG). Low adsorption treatment and the like can be mentioned.
- cell aggregates can be embedded in a gel or encapsulated in a substance-permeable capsule and then subjected to suspension culture (Nature, 2013, 501.7467:373).
- Gels or capsules used for embedding may be made of either biological or synthetic polymers.
- gels or capsules used for such purposes examples include Matrigel (manufactured by Corning), PuraMatrix (manufactured by 3D Matrix), VitroGel 3D (manufactured by The Well Bioscience), collagen gel (manufactured by Nitta Gelatin Co., Ltd.), and alginate gel. (manufactured by PG Research Co., Ltd.), Cell-in-a-Box (manufactured by Austrianova), and the like, which are commercially available as hydrogel or embedding culture kits for cell culture can be used.
- the medium used for culturing cells can be prepared using the medium normally used for culturing animal cells as a basal medium.
- a medium for culturing pluripotent stem cells based on the above basal medium preferably a known medium for embryonic stem cells or induced pluripotent stem cells, pluripotent stem cells under feeder-free conditions.
- a medium for culturing (feeder-free medium) or the like can be used.
- “Serum-free medium” means a medium that does not contain unadjusted or unpurified serum.
- Media containing purified blood-derived components or animal tissue-derived components (eg, growth factors) are also included in serum-free media as long as they do not contain unadjusted or unpurified serum.
- the serum-free medium may contain serum replacement.
- serum substitutes include those containing albumin, transferrin, fatty acids, collagen precursors, trace elements, 2-mercaptoethanol, 3' thiol glycerol, or equivalents thereof as appropriate.
- serum substitutes can be prepared, for example, by the method described in WO98/30679. A commercially available product may be used as a serum substitute.
- serum substitutes include, for example, Knockout Serum Replacement (manufactured by Thermo Fisher Scientific) (hereinafter sometimes referred to as "KSR"), Chemically-defined Lipid concentrated (manufactured by Thermo Fisher Scientific), Glutath Scientific), B27 Supplement (Thermo Fisher Scientific), N2 Supplement (Thermo Fisher Scientific), and the like.
- KSR Knockout Serum Replacement
- Chemically-defined Lipid concentrated manufactured by Thermo Fisher Scientific
- Glutath Scientific Glutath Scientific
- B27 Supplement Thermo Fisher Scientific
- N2 Supplement Thermo Fisher Scientific
- Serum-free media used in suspension culture and adhesion culture suitably contain fatty acids or lipids, amino acids (e.g., non-essential amino acids), vitamins, growth factors, cytokines, antioxidants, 2-mercaptoethanol, pyruvic acid, buffers, and inorganic salts. etc. may be included.
- an appropriate amount for example, about 0.5% to about 30%, preferably about 1% to about 20%
- a serum-free medium for example, a 1:1 mixture of F-12 medium and IMDM medium supplemented with 1 ⁇ chemically-defined Lipid concentrated, 5% KSR and 450 ⁇ M 1-monothioglycerol
- the medium disclosed in Japanese Patent Publication No. 2001-508302 can be mentioned as a KSR equivalent.
- “Serum medium” means a medium containing unadjusted or unpurified serum.
- the medium contains fatty acids or lipids, amino acids (eg, non-essential amino acids), vitamins, growth factors, cytokines, antioxidants, 2-mercaptoethanol, 1-monothioglycerol, pyruvic acid, buffers, inorganic salts, and the like.
- Cultivation in the present invention is preferably performed under xeno-free conditions.
- Xeno-free means conditions under which components derived from a biological species different from the biological species of cells to be cultured are eliminated.
- the medium used in the present invention is preferably a chemically defined medium (CDM) containing components.
- Basis membrane structure means a thin membranous structure composed of an extracellular matrix.
- basement membranes are formed on the basal side of epithelial cells.
- Basement membrane components include type IV collagen, laminin, heparan sulfate proteoglycan (perlecan), entactin/nidogen, cytokines, growth factors, and the like. Whether the basement membrane is present in the tissue derived from the living body and in the cell mass prepared by the production method of the present invention can be determined by, for example, tissue staining such as PAM staining, and an antibody against a component of the basement membrane (anti-laminin antibody , anti-type IV collagen antibody, etc.).
- Base membrane preparation refers to the ability to control epithelial cell-like cell morphology, differentiation, proliferation, motility, functional expression, etc., when desired cells with basement membrane-forming ability are seeded on it and cultured. It refers to those containing basement membrane constituents having In the present invention, when cells are adherently cultured, they can be cultured in the presence of a basement membrane sample.
- basement membrane component refers to a thin membrane-like extracellular matrix molecule present between the epithelial cell layer and the stromal cell layer in animal tissues.
- a basement membrane preparation is obtained by removing, for example, cells having the ability to form a basement membrane adhered to a support via the basement membrane from the support using a solution having lipid-dissolving ability of the cells, an alkaline solution, or the like. It can be made by Basement membrane preparations include commercially available basement membrane preparations such as Matrigel (manufactured by Corning), Geltrex (manufactured by Thermo Fisher Scientific), extracellular matrix molecules known as basement membrane components (e.g., laminin, IV type collagen, heparan sulfate proteoglycan, entactin, etc.).
- basement membrane preparations include commercially available basement membrane preparations such as Matrigel (manufactured by Corning), Geltrex (manufactured by Thermo Fisher Scientific), extracellular matrix molecules known as basement membrane components (e.g., laminin, IV type collagen, heparan sulfate proteoglycan, entactin, etc.).
- a basement membrane preparation such as Matrigel (manufactured by Corning) extracted and solubilized from tissues or cells such as Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma
- EHS Engelbreth-Holm-Swarm
- basement membrane components used in cell culture human solubilized amniotic membrane (manufactured by Bioresources Applied Laboratories, Inc.), human recombinant laminin produced in HEK293 cells (manufactured by BioLamina), human recombinant laminin fragments (Nippi) (manufactured by Thermo Fisher Scientific), human recombinant vitronectin (manufactured by Thermo Fisher Scientific), etc. can also be used.
- the basement membrane preparation preferably uses a recombinant protein whose components are clear.
- the terms "medium containing substance X" and “in the presence of substance X” refer to a medium supplemented with exogenous substance X, a medium containing exogenous substance X, and a medium containing exogenous substance X, respectively. means the presence of the substance X of An exogenous substance X is distinguished from an endogenous substance X, for example, which is endogenously expressed, secreted or produced by cells or tissues present in the culture medium. Substance X in the medium may undergo a slight change in concentration due to decomposition of substance X or evaporation of the medium.
- the term “at the start of culture in a medium having a concentration of substance X of Y” preferably refers to the time at which the concentration of substance X in the medium becomes uniform at Y, but the culture vessel is sufficiently small.
- the concentration of substance X in the medium is Y
- the average concentration of X over a certain culture period is Y
- the period containing substance X at the concentration of Y is 50% or more of the culture period. In some cases, the period during which the substance X is contained at the concentration Y is equal to or longer than the shortest culture period assumed in each step.
- exogenous substance X in the absence of substance X means a medium to which exogenous substance X is not added, a medium containing no exogenous substance X, or no exogenous substance X. means state.
- human protein X means that protein X has the amino acid sequence of protein X that is naturally expressed in the human body.
- isolated protein X does not include endogenous protein X produced from the cells or tissues to be cultured and contained in the cells, tissues, or medium.
- the purity of "isolated protein X" is usually 70% or higher, preferably 80% or higher, more preferably 90% or higher, further preferably 99% or higher, Most preferably 100%.
- a “derivative” refers to a group of compounds produced by substituting a part of the molecule of a specific compound with another functional group or another atom.
- a “variant” of a protein refers to a protein in which amino acid residues have been mutated, such as deletion, addition, or substitution, to the extent that the properties of the original protein can be maintained.
- the number of amino acids to be mutated is not particularly limited, but may be 1-4, 1-3, 1-2, or 1.
- a “variant" of a protein is at least 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, It may be a protein having an amino acid sequence showing 99% or more, or 99.5% or more identity.
- after A time (A day) includes A time (A day) and refers to after A time (A day).
- Within B hours (B days) includes B hours (B days) and refers to before B hours (B days).
- feeder cells refer to cells other than the stem cells that coexist when the stem cells are cultured.
- Examples of feeder cells used for undifferentiated maintenance culture of pluripotent stem cells include mouse fibroblasts (MEF), human fibroblasts, SNL cells and the like.
- the feeder cells are preferably growth-inhibitory treated.
- the growth inhibitory treatment includes growth inhibitor (eg, mitomycin C) treatment, UV irradiation, and the like.
- Feeder cells used for undifferentiated maintenance culture of pluripotent stem cells secrete humoral factors (preferably undifferentiated maintenance factors) and prepare scaffolds (extracellular matrix) for cell adhesion, thereby preserving pluripotent stem cells. Contributes to maintenance of differentiation.
- feeder-free means culturing in the absence of feeder cells.
- the absence of feeder cells includes, for example, conditions in which feeder cells are not added or conditions in which feeder cells are not substantially contained (for example, the ratio of feeder cells to the total number of cells is 3% or less).
- a "cell aggregate” is a clump formed by aggregation of cells, and refers to a clump in which the cells are adhered to each other.
- Cell aggregates, embryoid bodies, spheres, spheroids, and organoids are also included in cell aggregates.
- the cells are preferably surface-adhered to each other.
- some or all of the cell aggregates have cell-to-cell adhesion, eg, formation of adherence junctions.
- two or more cell aggregates can also be artificially adhered or aggregated together.
- Cell aggregates also include clumps and assemblebloids in which cell clumps are further adhered or aggregated.
- the morphology of cell aggregates is not limited to spheres, and includes, for example, bispherical, beaded, aggregates of spheres, Scientific reports, 2021, 11.1: 1-14. , a form such as a string-like or branched form described in Japanese Patent Application No. 2021-078154.
- Uniform cell aggregate means that the size of each cell aggregate is constant when culturing multiple cell aggregates, and the size of the cell aggregate is evaluated by the length of the maximum diameter.
- uniform cell aggregates means that the lengths of the largest diameters have a small variance. More specifically, in cell aggregates of 75% or more of the plurality of cell aggregates, the maximum diameter is within ⁇ 100% of the average maximum diameter of the plurality of cell aggregates, preferably ⁇ of the average maximum diameter It means within 50%, more preferably within ⁇ 20% of the average maximum diameter.
- Cell population refers to a cell group composed of two or more cells.
- a cell population may be composed of one type of cells, or may be composed of multiple types of cells.
- the cells that make up the cell population may be floating in the medium, or may be adhered to cultureware or the like.
- the cells constituting the cell population may be single cells, or at least a part of the cell population may be cell-adhered to each other to form a cell cluster.
- single cell means, for example, a cell in which cell-to-cell adhesion (for example, surface adhesion) is almost lost.
- dispersed in single cells includes a state in which cell-to-cell junctions (eg, adherens junctions) are almost absent.
- a cell population may comprise cell aggregates.
- tissue refers to the structure of a cell population that has a structure in which multiple types of cells with different morphologies and properties are three-dimensionally arranged in a certain pattern.
- Ectoderm refers to the outermost germ layer of the three germ layers formed after egg fertilization in the process of early development of an organism.
- the ectoderm is divided into neuroectoderm and superficial ectoderm according to the progress of development, and the neuroectoderm is further divided into neural tube and neural crest.
- Various organs of the body are formed from these ectoderm, and organs formed from ectoderm are said to be derived from ectoderm.
- central nervous system organs or tissues such as the brain and spinal cord are formed from the neural tube.
- central nervous system cells for example, some central nervous system cells, facial bones and cartilage, sensory nerve cells, autonomic nerve cells, pigment cells, mesenchymal cells, and the like are formed from the neural crest.
- the superficial ectoderm forms the epidermis, inner ear, anterior pituitary gland, upper respiratory tract tissues including the olfactory epithelium, and the like. Placode and placode-derived tissues are derived from the superficial ectoderm.
- Pluripotent stem cells express genes known as ectoderm markers, such as Pax3, Otx2, and Sox1, in the process of differentiation into ectoderm.
- Endoderm represents the innermost germ layer among the three germ layers formed after egg fertilization in the process of early development of an organism.
- the endoderm forms most of the respiratory tract, eg, the digestive tract, urinary tract, pharynx, trachea, bronchi, and lungs, except for the olfactory epithelium and nasal epithelium.
- Pluripotent stem cells express genes known as endoderm markers, such as SOX17, HNF-3 ⁇ /FoxA2, Klf5, GATA4, GATA6, PDX-1, during differentiation into endoderm.
- Mesoderm represents the germ layer formed between the ectoderm and the endoderm. Organs or tissues such as circulatory organs, skeletons, and muscles are formed from the mesoderm. Pluripotent stem cells express genes known as mesoderm markers, such as T/Brachury, SMA, ABCA4, Nkx2.5, PDGFR ⁇ , during differentiation into mesoderm.
- Neuro tissue means a tissue composed of nervous system cells such as the developing or adult cerebrum, midbrain, cerebellum, spinal cord, retina, sensory nerves, and peripheral nerves.
- nerve tissue refers to an epithelial structure in which nerve tissue has a layered structure, and neuroepithelial tissue in nerve tissue is determined by bright field observation using an optical microscope. can be evaluated.
- Central nervous system refers to the area where nerve tissue is concentrated and forms the center of information processing. In vertebrates, the brain and spinal cord are included in the central nervous system. The central nervous system derives from the ectoderm.
- Neuron progenitor cells refers to cells other than epidermal cells among ectodermal-derived tissues.
- nervous system cells include cells such as nervous system progenitor cells, neurons (nerve cells), glial cells, neural stem cells, neuron progenitor cells, and glial progenitor cells.
- the nervous system cells also include cells (retinal cells) that constitute the retinal tissue described below, retinal progenitor cells, retinal layer-specific nerve cells, neural retinal cells, and retinal pigment epithelial cells.
- Neural cells can be identified using markers such as Nestin, ⁇ III tubulin (Tuj1), PSA-NCAM, and N-cadherin.
- Neurons are functional cells that form neural circuits and contribute to information transmission. can be identified by indicators.
- Glial cells include astrocytes, oligodendrocytes, Müller glia, and the like.
- astrocyte markers include GFAP, oligodendrocyte markers such as O4, and Müller glia markers such as CRALBP.
- Neural stem cells are cells that have the ability to differentiate into neurons and glial cells (pluripotency) and the ability to proliferate while maintaining pluripotency (sometimes referred to as self-renewal ability).
- Neural stem cell markers include Nestin, Sox2, Musashi, Hes family, CD133, etc., but these markers are general progenitor cell markers and are not considered neural stem cell-specific markers. The number of neural stem cells can be evaluated by neurosphere assay, clonal assay and the like.
- Neuronal progenitor cells are cells that have the ability to proliferate, produce nerve cells, and do not produce glial cells. Markers of neuronal progenitor cells include Tbr2, T ⁇ 1 and the like. Cells positive for immature neuronal markers (TuJ1, Dcx, HuC/D) and proliferation markers (Ki67, pH3, MCM) can also be identified as neuronal progenitor cells. Glial progenitor cells are proliferative cells that produce glial cells but do not produce nerve cells.
- Neural precursor cells are aggregates of progenitor cells including neural stem cells, neuronal progenitor cells and glial progenitor cells, and have the ability to proliferate and produce neurons and glia.
- Neural progenitor cells can be identified using markers such as Nestin, GLAST, Sox2, Sox1, Musashi, and Pax6.
- Neural cell marker-positive and proliferation marker (Ki67, pH3, MCM)-positive cells can also be identified as neural progenitor cells.
- Retinal tissue means that at least multiple types of photoreceptor cells, horizontal cells, bipolar cells, amacrine cells, retinal ganglion cells, their progenitor cells, retinal progenitor cells, etc. that constitute each retinal layer in the living retina are It means a retinal tissue that is layered and three-dimensionally arranged. Which retinal layer each cell constitutes can be confirmed by a known method, for example, the presence or absence of cell marker expression, the degree of expression, and the like.
- Retinal progenitor cells refer to progenitor cells that can differentiate into any mature retinal cells such as photoreceptor cells, horizontal cells, bipolar cells, amacrine cells, retinal ganglion cells, and retinal pigment epithelial cells.
- Photoreceptor progenitor cells, horizontal cell progenitor cells, bipolar cell progenitor cells, amacrine cell progenitor cells, retinal node cell progenitor cells, and retinal pigment epithelial progenitor cells are, respectively, photoreceptors, horizontal cells, bipolar cells, amacrine cells, and retinal neurons.
- Nodal cells refer to progenitor cells committed to differentiate into retinal pigment epithelial cells.
- Retinal layer-specific nerve cells means cells that constitute the retinal layer and are specific to the retinal layer.
- Retinal layer-specific neurons include bipolar cells, retinal ganglion cells, amacrine cells, horizontal cells, photoreceptor cells, retinal pigment epithelial cells, rod cells and cone cells.
- Retinal cells include the above-mentioned retinal progenitor cells and retinal layer-specific neurons.
- Retinal cell markers include Rx (also known as Rax), Aldh1a3, and Pax6 expressed in retinal progenitor cells, Nkx2.1 expressed in hypothalamic neuron progenitor cells but not retinal progenitor cells, and expressed in hypothalamic neuroepithelium.
- Sox1, which is not expressed in the retina Crx, Blimp1, etc., which are expressed in photoreceptor progenitor cells, can be mentioned.
- Markers of retinal layer-specific neurons include Chx10, PKC ⁇ and L7 expressed in bipolar cells, Tuj1 and Brn3 expressed in retinal ganglion cells, Calretinin expressed in amacrine cells, Calbindin expressed in horizontal cells, and mature photoreceptors. Examples include Rhodopsin and Recoverin expressed in cells, Nrl expressed in rod cells, Rxr-gamma expressed in cone cells, REP65 and Mitf expressed in retinal pigment epithelial cells, and the like.
- Cerebral tissue refers to cells that constitute the fetal or adult cerebrum (e.g., cortical neural precursor cells, dorsal cerebral nervous system precursor cells, ventral cerebral nervous system precursor cells, cerebral layer structure Specific nerve cells (neurons), layer 1 neurons, layer 2 neurons, layer 3 neurons, layer 4 neurons, layer 5 neurons, layer 6 neurons, glial cells (astrocytes and oligodendrocytes), these progenitor cells, etc.), means a tissue in which one or more types are layered and three-dimensionally arranged.
- the fetal cerebrum is also called the forebrain or telencephalon.
- the presence of each cell can be confirmed by a known method, for example, the presence or absence of cell marker expression, the degree of expression, and the like.
- Cerebral cell markers include FoxG1 (also known as Bf1) expressed in cerebral cells, Sox2 and Nestin expressed in cerebral nervous system progenitor cells, Pax6 and Emx2 expressed in dorsal cerebral nervous system progenitor cells, and ventral cerebral nervous system progenitor cells.
- the "olfactory cortex” is a region of the cerebrum that receives monosynaptic input from the olfactory bulb and is involved in the processing of olfactory information. Genes and markers expressed in the olfactory cortex include Tbr1, FoxP2, Ctip2, Nor1 (NR4a3), DAARP-32, CUX1, Brn2, CART and the like.
- the basal ganglia is a collection of nerve nuclei that exist in one area of the cerebrum. Neuronal nuclei contained in the basal ganglia include striatum, globus pallidum, subthalamic nucleus, substantia nigra, and the like.
- a "basal ganglia primordium” is a structure composed of nervous system cells that forms within the ventricles of the developing embryo. In addition to being the basis for the adult ganglia basalis, the basal ganglia primordium produces multiple types of neurons that migrate throughout the central nervous system during development.
- Rostral migratory stream refers to the phenomenon and the route in which newborn neurons produced from neural stem cells in the subventricular zone migrate to the olfactory bulb. Neurons migrating down the rostral migration path can be detected using migrating neuronal markers such as PSA-NCAM, Dcx.
- Optfactory bulb means a region of the central nervous system that is located at the tip of the cerebrum, receives input from olfactory receptor cells present in the olfactory epithelium, and is involved in the processing of olfactory information.
- the cells present in the olfactory bulb form a layered structure, which is the olfactory nerve layer, the glomerular layer, the external plexiform layer, the mitral cell layer, in order from the surface layer. cell layer), internal plexiform layer, and granule cell layer.
- Neurons in the olfactory bulb include mitral cells and tufted cells as excitatory neurons, and periglomerular cells and granule cells as inhibitory neurons (interneurons). cell).
- Genes and markers expressed in the olfactory bulb include Arx, Tbr1, Tbr2/EOMES, Tbx21, Iba1 and the like.
- Non-neuroepithelial tissue refers to tissues other than neuroepithelial tissue among tissues having an epithelial structure.
- Epithelial tissue is formed from any of the germ layers of ectoderm, mesoderm, endoderm and trophectoderm.
- Epithelial tissue includes epithelium, mesothelium, and endothelium.
- tissues included in non-neural epithelial tissues include epidermis, corneal epithelium, nasal epithelium, olfactory epithelium, oral epithelium, tracheal epithelium, bronchial epithelium, airway epithelium, renal epithelium, renal cortical epithelium, placental epithelium, and the like.
- Epithelial tissue is usually connected by various intercellular junctions, and forms a tissue having a single-layered or multi-layered structure.
- epithelial polarity refers to the biased distribution of components and cell functions spatially formed in epithelial cells.
- corneal epithelial cells are localized in the outermost layer of the eyeball, and on the apical side (apical), apical side-specific proteins such as membrane-bound mucin (MUC-1, 4, 16) for retaining tear fluid are produced. It is expressed.
- corneal epithelial cells express basal side-specific proteins such as ⁇ 6 integrin and ⁇ 1 integrin for adhesion to the basement membrane on the basal side.
- Phalloidin an apical marker (anti-MUC-1 antibody , anti-PKC-zeta antibody, etc.) and a technique such as immunohistochemistry using a basolateral marker (anti- ⁇ 6 integrin antibody, anti- ⁇ 1 integrin antibody, etc.).
- Placode refers to the primordium of an organ that is formed by thickening part of the epidermal ectoderm mainly during the development process of vertebrates. Placode-derived tissues include the lens, olfactory epithelium, inner ear, trigeminal nerve, pituitary gland, and the like. Six1, Six4, Dlx5, Eya2 and the like are examples of placode markers and markers of the pre-placode region, which is the precursor tissue thereof.
- olfactory epithelium placode refers to a thickened structure formed in the epidermal ectoderm region during embryogenesis, which expresses olfactory epithelial progenitor cell markers and is responsible for future olfactory epithelial cell markers. Represents the primordium of the organ that becomes the epithelium. Olfactory epithelium progenitor cell markers include Pax6, Otx2, FoxG1 (also known as Bf1), Sox2, Pou2f1, Sp8, Chd7, N-Cadherin, E-Cadherin, EpCAM, CK18, PDGFR ⁇ and the like.
- Respiratory system refers to the organs and organs involved in external respiration that take in oxygen from the outside of the body and expel carbon dioxide out of the body.
- organs included in respiratory organs include nasal cavity, pharynx, larynx, trachea, bronchi, lungs, ribcage and the like.
- the respiratory system is anatomically divided into upper and lower respiratory tracts.
- the nostrils, nasal cavities, nasopharynx, pharynx, and larynx are classified as the upper respiratory tract.
- the trachea, bronchi, bronchioles, and lungs are classified under the lower respiratory tract.
- Nasal epithelium and olfactory epithelium are one of the tissues of the upper respiratory tract.
- nasal cavity is one of the tissues of the upper respiratory tract, and represents the space that exists behind the holes (nostrils) in the outer nostrils in the center of the face.
- the nasal cavity begins at the nostrils and connects to the upper pharynx.
- the nasal cavity mainly has an olfactory epithelium called the olfactory part, a part that senses odorants in the atmosphere, a part covered with the nasal epithelium called the respiratory part, and a skin covered with cornified squamous stratified epithelium. It consists of a part having
- nasal epithelium is the epithelial tissue in the nasal cavity, mainly representing areas other than the olfactory epithelium, which will be described later.
- the function of the nasal epithelium is to warm the air taken in, and to remove foreign matter through the action of the mucus secreted on the surface and the fimbriae on the cell surface.
- the nasal epithelium is mainly derived from ectodermal non-neural epithelium and is composed of cells such as secretory cells, ciliated cells, club cells, basal cells, saline cells, neuroendocrine cells, and solitary chemosensory epithelial cells.
- “Secretory cells” refer to cells that secrete mucus or serous fluid in respiratory tissues. Goblet cells and glandular cells belong to secretory cells. Examples of genes and markers expressed in secretory cells and their progenitor cells include mucin 1, mucin 2, mucin 3, mucin 4, mucin 5AC, mucin 5B, FoxA1, FoxA2, FOXA3, Nkx2.1/TTF-1, SPDEF, etc. are mentioned.
- Ciliated cells are cells that form epithelial tissue and have cilia on the surface of the cells. Ciliary cells are present in epithelial tissues such as the respiratory system, brain ventricles, and fallopian tubes, and have the function of transporting liquids, humoral factors, foreign substances that have entered the body, ova, etc. in specific directions by the movement of the cilia. It is known. Genes and markers expressed in ciliated cells and their progenitor cells include FoxJ1, FoxN4, p73, acetylated tubulin, ⁇ 4 tubulin, DNAI1, DNAH5, SNTN, and the like.
- ciliated cells and their progenitor cells can be confirmed by observing the tissue or cells under a microscope after hematoxylin-eosin (HE) staining or the like and observing the ciliary structure on the cell surface.
- HE hematoxylin-eosin
- the presence of ciliated cells can also be monitored by measuring the degree of ciliary beating frequency (CBF).
- Ciliary movement is the movement of cilia on the cell surface. In the case of mammals, including humans, functions such as eliminating pathogens such as bacteria and viruses in the respiratory system and transporting eggs in the oviduct. have. Ciliary motion is usually wave motion consisting of effective and recovery strokes. Whether or not cells are performing ciliary movement can be detected by, for example, using a high-magnification lens and photographing moving images with a microscope.
- Crab cells are cells that form epithelial tissue, and have functions such as secretion of mucus or serous components, metabolism of compounds by cytochrome P450, secretion of cytokines, and regulation of immune function. represents cells with Genes and markers expressed in club cells include SCGB1A1, SCGB3A2, CYP2f1, CYP2f2, uroplakin3a, Cldn10, Aox3, Pon1, Cckar and the like.
- Hailllock cells which express cytokeratin 4 and cytokeratin 13 and are considered to be involved in barrier function and immune response, are also included as a subpopulation of club cells.
- Basal cells represent cells present in the basal layer of the epithelium. Basal cells have the ability to divide and contribute to the long-term maintenance of living tissue and repair in the event of injury as tissue stem cells. Genes and markers expressed in basal cells of the nasal epithelium and their progenitor cells include cytokeratin 5, cytokeratin 14, cytokeratin 15, p63, ⁇ Np63, p75 and the like.
- Saline cells also referred to as "ionocytes" indicate cells that express CFTR and are reported to have the function of controlling the viscosity of mucosal mucus.
- Genes and markers expressed in saline cells and their progenitor cells include CFTR, Foxi1, vacuolar proton ATPase (vacuolar H+-ATPase, V-ATPase), Ascl3, Tfcp2l1, DMRT2, and the like.
- Neuroendocrine cells are cells that secrete hormones and peptides and have the function of controlling the development and homeostasis of living organisms. Genes and markers expressed in neuroendocrine cells and their progenitor cells include Ascl1, NeuroD1, Chromogranin A, Synaptophisin, Neuro-specific enolase (NSE), CALCA and the like.
- Solitary chemosensory epithelial cells are cells that have functions such as sensing chemical substances and controlling biological defense reactions. Tuft cells, brush cells, microvillus cells also represent allogeneic cells. Genes and markers expressed in isolated chemosensory epithelial cells include ChAT/Trpm5, Pou2f3/Skn-1a, bitter taste receptor Tas2r, Gnat3, Plcb2, GNG13, and the like.
- the "olfactory epithelium” is the epithelial tissue in the nasal cavity, and represents the olfactory organ through which the body perceives odor information.
- the olfactory epithelium is classified as an upper airway tissue.
- the olfactory epithelium is one of the tissues derived from the placode, which expresses olfactory receptors and senses volatile molecules in the air. It is composed of cells such as basal cells, which are basal cells, and Bowman's gland cells, which secrete mucus.
- the olfactory epithelium is morphologically classified into a superficial layer, an intermediate layer, and a basal layer.
- Supporting cells are present in the superficial layer, olfactory nerve cells are present in the intermediate layer, and basal cells are present in the basal layer.
- Bowman's glands form branched tubular antral glands within the olfactory epithelium and are scattered.
- Progenitor tissue of the olfactory epithelium includes the olfactory epithelium placode.
- Genes and markers expressed in the olfactory epithelium and olfactory epithelium placode include Pax6, Otx2, FoxG1 (also known as Bf1), Sox2, Pou2f1, Sp8, Chd7, N -Cadherin, E-Cadherin, EpCAM, CK18, PDGFR ⁇ and the like.
- olfactory tissue refers to fetal or adult olfactory tissue, such as cells that constitute the olfactory epithelium (e.g., olfactory nerve cells, supporting cells, basal cells, Bowman gland cells, olfactory nerve sheath cells, and their progenitor cells).
- cells that make up the olfactory bulb, cells that make up the olfactory cortex, and the like mean a tissue in which one type or at least multiple types are arranged in a layered and three-dimensional manner. The presence of each cell can be confirmed by a known method, for example, the presence or absence or degree of cell-specific gene expression.
- Olfactory receptor neuron refers to nerve cells that receive olfaction in the middle layer of the olfactory epithelium of the nasal mucosa. Olfactory neurons capture volatile molecules in the air with olfactory receptors on the surface cilia. Olfactory neurons are bipolar sensory cells, and olfactory information captured by olfactory receptors expressed on the peripheral side is propagated to nerve axons called olfactory filaments on the central side. Dozens of olfactory threads gather to form a bundle, and the olfactory nerve refers to all of these bundles.
- Olfactory filaments reach the olfactory bulb of the brain through the ethmoid foramen in the ethmoid cribriform plate of the skull, where they synaptically connect to mitral cells and the like to transmit olfactory information to the olfactory center in the brain.
- Genes and markers expressed in olfactory neurons and their progenitor cells include cyclic nucleotide-sensitive channel ⁇ 2 subunit (CNGA2), cyclic nucleotide-sensitive channel ⁇ 4 subunit (CNGA4), cyclic nucleotide-sensitive channel ⁇ 1b subunit, olfactory specific G Protein (Golf) adenylate cyclase, Olfactory Marker protein (OMP), NCAM, OCAM (NCAM-2), Ebf1, Ebf2, Ebf3, NeuroD, PGP9.5, Neuron Specific Enolase (NSE), Growth Associated Protein-43 43/B50), vimentin, Lhx2, Id3, ⁇ -Tubulin III (Tuj), Calretinin, TrkB, Ctip2, Uncx and olfactory receptor (OR).
- CNGA2 subunit cyclic nucleotide-sensitive channel ⁇ 4 subunit
- “Supporting cells/sustentacular cells” refer to multi-row columnar epithelial-like cells present on the most apical side of the olfactory epithelium. Supporting cells are involved in the functioning of other cells such as olfactory neurons, their survival, and the maintenance of epithelial structures. Microvillar cells of the olfactory epithelium are a subtype of supporting cells. Genes and markers expressed in feeder cells include Notch2, Notch3, Carbonyl reductase 2 (Cbr2), S-100, Ezrin, Reep6, Sox2, Tyro3, CYP2A6, SUS-1, SUS-4, EPAS1 and the like.
- Cbr2 Carbonyl reductase 2
- Basal cells in the olfactory epithelium represent cells present in the basal layer of the olfactory epithelium. Basal cells are morphologically divided into globose basal cells (GBC) and horizontal basal cells (HBC). Of these two types of cells, globular basal cells are active progenitor cells, stem cells, that constantly undergo cell division and supply new olfactory neurons. On the other hand, horizontal basal cells are dormant stem cells that are normally in a state where the cell cycle of cell division has stopped and are activated when large-scale damage to the olfactory epithelium occurs.
- GBC globose basal cells
- HBC horizontal basal cells
- Genes and markers expressed in horizontal basal cells include p63, cytokeratin 5, cytokeratin 14, ICAM-1, and others.
- Genes and markers expressed in globular basal cells include GAP43, GBC-1, Lgr5, Ascl1, LSD1, SEC8, c-Kit/CD117, Sox2, Hes1, Id, Bmi1, and the like.
- Bowman's gland cell refers to the cells that make up the Bowman's gland (olfactory gland).
- the Bowman's gland is a branched thin tubular tissue present in the olfactory epithelium, and has functions such as secretion of mucus that protects the olfactory epithelium.
- Genes and markers expressed in Bowman's gland cells include Sox9, E-Cadherin, Aquaporin5, Ascl3, Cytokeratin 18, and the like.
- Olfactory enheating glia refers to a type of glial cell present in the olfactory epithelium and olfactory bulb.
- Olfactory nerve sheath cells are cells that release neurotrophic factors such as BDNF and NGF and are involved in constant regeneration of olfactory nerves. Genes and markers expressed in olfactory nerve sheath cells include p75NTR, S100 ⁇ , Sox10, GFAP, BLBP, Aquaporin1, Integrin ⁇ 7, and the like.
- the "lateral olfactory epithelium” is the peripheral area of the olfactory epithelium, and represents the area that is continuous with the non-neural epithelium other than the olfactory epithelium.
- the term "medial olfactory epithelium” in the present invention refers to the central region of the olfactory epithelium surrounded by the peripheral part of the olfactory epithelium. It is known that the ratio of cells constituting the peripheral part of the olfactory epithelium differs from that of the inner part of the olfactory epithelium (Development, 2010, 137:2471-2481).
- Pbx1/2/3, Meis1, and ⁇ IVTubulin are examples of genes highly expressed in the peripheral part of the olfactory epithelium. Genes highly expressed in the medial olfactory epithelium include Tuj1, Ascl1, and Sox2.
- Gonadotropin-releasing hormone-positive nerve cells are nerve cells that are mainly present in the hypothalamus of the central nervous system and secrete gonadotropin-releasing hormone (GnRH) involved in the control of organs of the reproductive system. is. Gonadotropin-releasing hormone-positive neurons develop in the olfactory epithelium during embryogenesis and migrate to the central nervous system. Examples of genes and markers expressed in gonadotropin-releasing hormone-positive neurons include gonadotropin-releasing hormone (GnRH) and the like.
- the "olfactory pit” is the tissue that forms the basis of the olfactory system tissue that is formed when the olfactory epithelium placode invades the inside of the developing embryo.
- the olfactory fossa is mainly composed of tissues and cells that will constitute the future olfactory epithelium, and tissues and cells of the nasal epithelium that are formed continuously with the olfactory epithelium.
- Bone tissue refers to bone matrix composed of cells that constitute bones, calcium phosphate, type I collagen, and the like. Bone-constituting cells include osteocytes, osteoclasts, osteoblasts, and the like.
- mesenchymal cells are non-epithelial cells that are mainly derived from mesoderm and neural crest and form connective tissue. Some of these cells are multipotent somatic stem cells called mesenchymal stem cells. Whether mesenchymal cells are contained in the cell population produced by the production method of the present invention and the tissue produced by the production method of the present invention can be determined by mesenchymal cells such as Nestin, Vimentin, Cadherin-11, Laminin, and CD44. It can be detected by techniques such as immunohistochemistry using antibodies against cell markers.
- mesenchymal stem cells are included CD9, CD13, CD29, CD44, CD55, CD59, CD73, CD105, CD140b, CD166, VCAM-1, STRO-1, c-Kit, Sca-1, Nucleostemin, CDCP1 , BMPR2, BMPR1A and BPMR1B.
- stem cell niche refers to the microenvironment involved in the proliferation, differentiation, maintenance of properties, etc. of stem cells.
- biological niches include hematopoietic stem cell niche, hair follicle stem cell niche, intestinal epithelial stem cell niche, muscle stem cell niche, pituitary niche, and basal cell niche.
- stem cells are maintained by cytokines, chemokines, extracellular matrices, cell adhesion factors, intercellular signaling factors, etc. provided by supporting cells.
- a “receptor protein” is a protein in the cell membrane, cytoplasm, or nucleus, and represents a protein that binds to substances such as hormones, cytokines, cell growth factors, and compounds and causes various cellular reactions.
- Olefactory receptor refers to a receptor protein that is expressed in olfactory nerve cells and other cells and is involved in sensing compounds.
- Phathogen refers to something that has the property of causing disease in the host organism. Viruses, eubacteria, fungi, protozoa, parasites, proteins such as abnormal prion proteins, nucleic acids and the like are treated as pathogens.
- a "virus receptor” is a host-side factor that binds when a virus infects cells and tissues. Viral receptors are usually proteins or sugar chains.
- angiotensin-converting enzyme 2 ACE2
- Sialic acid ⁇ 2,6Gal has been reported to be a receptor for human seasonal influenza viruses (H1N1, H3N2, etc.).
- Sialic acid ⁇ 2,3Gal has been reported to be a receptor for avian influenza viruses (such as H5N1).
- Other viral receptors are described, for example, in Nature reviews Molecular cell biology 4.1 (2003): 57-68.
- Virus infection-related factor refers to a host-side factor that affects when a virus infects cells and tissues.
- TMPRSS2 is a type of proteolytic enzyme, and has been reported to cleave the protein of SARS-CoV-2 during cell infection and convert it into an active form.
- Pattern recognition receptors refers to receptors that have the function of recognizing foreign substances such as pathogens. Pattern recognition receptors include lectins, complement, membrane receptors, cytoplasmic proteins and the like. Pattern recognition receptors recognize pathogen-specific molecular patterns (pathogen-associated molecular patterns; PAMPs) and exert their functions. Molecular patterns peculiar to pathogens include nucleic acids (DNA, RNA), sugar chains, proteins and the like, and pattern recognition receptors bind to their own targets.
- Cytoke refers to a group of proteins that the body uses for intercellular communication. Cytokines include, for example, chemokines, growth factors, hematopoietic factors, interferons, interleukins, tumor necrosis factors, and the like.
- Immunity refers to the ability of the body to recognize, eliminate, or render harmless non-self substances such as pathogens and viruses, abnormal and harmful cells such as cancer cells that are self-derived, and foreign substances. It is a system with An "immune response” is the physiological response of the tissues and cells of the immune system during immune function.
- Isolation of virus refers to the propagation and identification of a specific virus present in a specimen in which the presence of a virus is expected. Specimens include, for example, tissues, excretions, secretions, etc. of animals (including humans), plants and other organisms, and samples in the environment. For virus isolation, cultured cells, animals, etc. are used depending on the type and characteristics of the target virus.
- the present invention provides a method for producing cells that constitute nasal epithelium.
- One aspect of the method for producing cells that make up the nasal epithelium comprises: step (1) of culturing pluripotent stem cells in the presence of a Wnt signaling pathway inhibitor; step (2) of culturing the cells cultured in step (1) in the presence of a BMP signaling pathway agonist; Step (3) of culturing the cells cultured in step (2) in the presence of at least one selected from the group consisting of FGF signaling pathway agonists and BMP signaling pathway inhibitors, and in step (3)
- Another preferred embodiment of the method for producing cells constituting the nasal epithelium comprises Step (1) of culturing pluripotent stem cells in the presence of a Wnt signaling pathway inhibitor, wherein the pluripotent stem cells are cultured in suspension to form cell aggregates; Step (2) of culturing the cells cultured in step (1) in the presence of a BMP signaling pathway agent, wherein the cell aggregates are subjected to suspension culture; Step (3) of culturing the cells cultured in step (2) in the presence of at least one selected from the group consisting of an FGF signaling pathway agonist and a BMP signaling pathway inhibitor, wherein the cell aggregate and further culturing the cells cultured in step (3) to obtain cells constituting the nasal epithelium (4), wherein Wnt signaling pathway inhibitor, FGF signaling pathway action
- the step of suspension culture of the cell aggregate in the absence of at least two substances selected from the group consisting of a substance and a BMP signaling pathway inhibitor.
- Another preferred embodiment of the method for producing cells constituting the nasal epithelium comprises Step (1) of culturing pluripotent stem cells in the presence of a Wnt signaling pathway inhibitor, wherein the pluripotent stem cells are cultured in suspension to form cell aggregates; Step (2) of culturing the cells cultured in step (1) in the presence of a BMP signaling pathway agent, wherein the cell aggregates are subjected to suspension culture; Step (3) of culturing the cells cultured in step (2) in the presence of at least one selected from the group consisting of an FGF signaling pathway agonist and a BMP signaling pathway inhibitor, wherein the cell aggregate and further culturing the cells cultured in the step (3) to obtain cells constituting the nasal epithelium (4), wherein the FGF signaling pathway inhibitor, the Shh signaling pathway action At least one selected from the group consisting of substances, BMP signaling pathway agonists, Wnt signaling pathway agonists, Notch signaling pathway inhibitors, activin/TGF- ⁇ signaling pathway agonists
- Another preferred embodiment of the method for producing cells constituting the nasal epithelium comprises Step (1) of culturing pluripotent stem cells in the presence of a Wnt signaling pathway inhibitor, wherein the pluripotent stem cells are adherently cultured on a culture device; step (2) of culturing the cells cultured in step (1) in the presence of a BMP signaling pathway agent, wherein the cells are adherently cultured; Step (3) of culturing the cells cultured in step (2) in the presence of at least one selected from the group consisting of FGF signaling pathway agonists and BMP signaling pathway inhibitors, wherein the cells are adhered culturing, and further culturing the cells cultured in step (3) to obtain cells constituting the nasal epithelium (4), wherein the Wnt signaling pathway inhibitor, the FGF signaling pathway agonist, and The step of adherently culturing the cells in the absence of at least two selected from the group consisting of BMP signaling pathway inhibitors.
- Another preferred embodiment of the method for producing cells constituting the nasal epithelium comprises Step (1) of culturing pluripotent stem cells in the presence of a Wnt signaling pathway inhibitor, wherein the pluripotent stem cells are adherently cultured on a culture device; step (2) of culturing the cells cultured in step (1) in the presence of a BMP signaling pathway agent, wherein the cells are adherently cultured; Step (3) of culturing the cells cultured in step (2) in the presence of at least one selected from the group consisting of FGF signaling pathway agonists and BMP signaling pathway inhibitors, wherein the cells are adhered The step of culturing, and the step (4) of further culturing the cells cultured in the step (3) to obtain cells constituting the nasal epithelium, wherein the FGF signaling pathway inhibitor, the Shh signaling pathway active substance, In the presence of at least one selected from the group consisting of BMP signaling pathway agonists, Wnt signaling pathway agonists, Notch signaling pathway
- Another preferred embodiment of the method for producing cells constituting the nasal epithelium comprises Step (1) of culturing pluripotent stem cells in the presence of a Wnt signaling pathway inhibitor, wherein the pluripotent stem cells are cultured in suspension to form cell aggregates; Step (2) of culturing the cells cultured in step (1) in the presence of a BMP signaling pathway agent, wherein the cell aggregates are subjected to suspension culture; Step (3) of culturing the cells cultured in step (2) in the presence of at least one selected from the group consisting of an FGF signaling pathway agonist and a BMP signaling pathway inhibitor, wherein the cell aggregate a step of floating culture until olfactory nerve progenitor cells differentiate into the cells; and a step (4) of further culturing the cells cultured in the step (3) to obtain cells constituting the nasal epithelium, wherein the cell aggregates A step of culturing the aggregates in suspension to obtain cells constituting the nasal epithelium on the epithelium that is continuous with the epithe
- an olfactory epithelium-like epithelial tissue containing olfactory nerve cells or their progenitor cells can be produced.
- the epithelial tissue can be induced to differentiate into a nasal epithelium-like tissue containing cells constituting the nasal epithelium.
- a cell population containing cells constituting the nasal epithelium or their progenitor cells can be obtained.
- Cells constituting the nasal epithelium include at least one cell selected from the group consisting of secretory cells, ciliated cells, club cells, basal cells, saline cells, neuroendocrine cells, and solitary chemosensory epithelial cells.
- cells composing the nasal epithelium can also be obtained by continuing the culture under the same conditions as in step (3).
- Another preferred embodiment of the method for producing cells constituting the nasal epithelium comprises FGF signaling pathway inhibitors, Shh signaling pathway agonists, BMP signaling pathway agonists, Wnt signaling pathway agonists, Notch signaling pathway inhibitors, activin/TGF- ⁇ signaling pathway agonists and retinoic acid signaling Culturing a cell population comprising olfactory nerve cells or their progenitor cells in the presence of at least one selected from the group consisting of pathway agents.
- a cell mass containing non-neural epithelial tissue containing olfactory nerve cells can also be produced by the method described in the examples of International Publication No. 2020/039732.
- step (1) pluripotent stem cells in the absence of feeder cells, 1) at least one selected from the group consisting of TGF ⁇ family signaling pathway inhibitors and Sonic hedgehog signaling pathway agonists; 2) an undifferentiated maintenance factor; It may comprise a step (a) of culturing in a medium comprising
- pluripotent stem cells in the presence of at least one selected from the group consisting of TGF ⁇ family signaling pathway inhibitors and Sonic hedgehog signaling (Shh) signaling pathway agonists, and then starting step (1);
- TGF ⁇ family signaling pathway inhibitors and Sonic hedgehog signaling (Shh) signaling pathway agonists
- the pluripotent stem cells are preferably embryonic stem cells or induced pluripotent stem cells.
- Induced pluripotent stem cells can be obtained from predetermined institutions, and can also be purchased as commercial products.
- human induced pluripotent stem cell line 201B7 is available from Kyoto University.
- HC-6 strains #10, 1231A3 and 1383D2 are available from RIKEN, a national research and development agency.
- the hiPS ⁇ -actin GFP strain is available from Merck.
- the TGF ⁇ family signaling pathway (that is, the TGF ⁇ superfamily signaling pathway) is a signaling pathway transduced by substances of the Smad family in cells with transforming growth factor ⁇ (TGF ⁇ ), Nodal/Activin, or BMP as ligands. is.
- the TGF ⁇ family signaling pathway inhibitor refers to a substance that inhibits the TGF ⁇ family signaling pathway, that is, the signaling pathway transmitted by Smad family substances, specifically TGF ⁇ signaling pathway inhibitor, Nodal/Activin signal Transduction pathway inhibitors and BMP signaling pathway inhibitors may be mentioned.
- TGF ⁇ family signaling pathway inhibitor a TGF ⁇ signaling pathway inhibitor is preferred.
- the TGF ⁇ signal transduction pathway inhibitor is not particularly limited as long as it inhibits the signal transduction pathway caused by TGF ⁇ , and may be any of nucleic acids, proteins, and low-molecular-weight organic compounds. Examples of such substances include substances that directly act on TGF ⁇ (e.g., proteins, antibodies, aptamers, etc.), substances that suppress the expression of genes encoding TGF ⁇ (e.g., antisense oligonucleotides, siRNA, etc.), and substances that inhibit the binding of TGF ⁇ receptors to TGF ⁇ . Inhibitory substances and substances that inhibit physiological activities caused by signal transduction by TGF ⁇ receptors (eg, TGF ⁇ receptor inhibitors, Smad inhibitors, etc.) can be mentioned. Proteins known as TGF ⁇ signaling pathway inhibitors include Lefty.
- SB431542 (sometimes abbreviated as "SB431") (4-[4-(3,4-methylenedioxyphenyl)-5-(2-pyridyl)-1H-imidazol-2-yl]benzamide)
- SB505124 (2-[4-(1,3-Benzodioxol-5-yl)-2-(1,1-dimethylethyl)-1H-imidazol-5-yl]-6-methylpyridine
- SB525334 (6-[2 -(1,1-Dimethylethyl)-5-(6-methyl-2-pyridinyl)-1H-imidazol-4-yl]quinoxaline)
- LY2157299 (4-[5,6-Dihydro-2-(6-methyl- 2-pyridinyl)-4H-pyrrolo[1,2-b]pyrazol-3-yl]-6-quinolinecarboxamide
- SB431542 is a compound known as an inhibitor of TGF ⁇ receptor (ALK5) and Activin receptor (ALK4/7) (ie TGF ⁇ R inhibitor).
- SIS3 is a TGF ⁇ signaling pathway inhibitor that inhibits phosphorylation of SMAD3, an intracellular signaling factor under the control of TGF ⁇ receptors.
- ITD-1 is a TGF- ⁇ type II receptor proteasomal degradation accelerator. The fact that the above-mentioned compounds and the like have activity as TGF ⁇ signaling pathway inhibitors can be found, for example, in Expert opinion on investigational drugs, 2010, 19.1: 77-91. et al., and are known to those skilled in the art.
- the TGF ⁇ signaling pathway inhibitor preferably includes an Alk5/TGF ⁇ R1 inhibitor.
- the concentration of the TGF ⁇ signaling pathway inhibitor in the medium can be appropriately set within a range that can achieve the above effects.
- SB431542 is used as the TGF ⁇ transduction pathway inhibitor in step (a)
- it is generally about 1 nM to about 100 ⁇ M, preferably about 10 nM to 100 ⁇ M, more preferably about 10 nM to about 50 ⁇ M, still more preferably about 100 nM to about 50 ⁇ M, especially It is preferably used at a concentration of about 1 ⁇ M to about 10 ⁇ M.
- a TGF ⁇ signaling pathway inhibitor other than SB431542 it is preferably used at a concentration that exhibits the same TGF ⁇ signaling pathway inhibitory activity as SB431542 at the above concentrations.
- a Shh transduction pathway agonist is a substance that can enhance signal transduction mediated by Shh.
- Shh signaling pathway agonists include proteins belonging to the Hedgehog family (eg, Shh, Ihh), Shh receptors, Shh receptor agonists, Smo agonists, Purmorphamine (9-cyclohexyl-N-[4-(morpholinyl)phenyl] -2-(1-naphthalenyloxy)-9H-purin-6-amine), GSA-10 (Propyl 4-(1-hexyl-4-hydroxy-2-oxo-1,2-dihydroquinoline-3-carboxymido) benzoate) , Hh-Ag1.5, 20(S)-Hydroxycholesterol, SAG (Smoothened Agonist: N-Methyl-N'-(3-pyridinylbenzol)-N'-(3-chlorobenzo[b]thiophene-2-carbonyl)-1 , 4-d
- the Shh signaling pathway agent preferably contains at least one selected from the group consisting of SAG, Purmorphamine and GSA-10, more preferably SAG.
- the concentration of the Shh signaling pathway active substance in the medium can be appropriately set within a range in which the above effects can be achieved.
- SAG is generally about 1 nM to about 2000 nM, preferably about 10 nM to about 1000 nM, more preferably about 10 nM to about 700 nM, still more preferably about 50 nM to about 700 nM, particularly preferably about 100 nM to about 600 nM in step (a). , most preferably at a concentration of about 100 nM to about 500 nM.
- Shh transduction-promoting activity can be determined by a method well known to those skilled in the art, for example, a reporter gene assay focusing on Gli1 gene expression (Oncogene (2007) 26, 5163-5168).
- the medium used in step (a) contains an undifferentiated maintenance factor to enable undifferentiated maintenance culture.
- the undifferentiation maintenance factor is not particularly limited as long as it is a substance that has an effect of suppressing differentiation of pluripotent stem cells.
- Undifferentiated maintenance factors commonly used by those skilled in the art include, in the case of primed pluripotent stem cells (e.g., human ES cells, human iPS cells), FGF signaling pathway agonists, TGF ⁇ family signaling pathways An active substance, insulin, etc., can be mentioned.
- FGF signaling pathway agonists include fibroblast growth factors (eg, bFGF, FGF4 and FGF8).
- TGF ⁇ family signaling pathway agonists include TGF ⁇ signaling pathway agonists and Nodal/Activin signaling pathway agonists.
- TGF ⁇ signaling pathway agonists include, for example, TGF ⁇ 1 and TGF ⁇ 2.
- Nodal/Activin signaling pathway agonists include, for example, Nodal, ActivinA, and ActivinB. These substances may be used alone or in combination.
- the medium in step (a) preferably contains bFGF as an undifferentiated maintenance factor.
- Undifferentiated maintenance factors are usually mammalian undifferentiated maintenance factors. Examples of mammals include those described above. Since the undifferentiation maintenance factor may have cross-reactivity between mammalian species, any mammalian undifferentiation maintenance factor can be used as long as the undifferentiated state of the pluripotent stem cells to be cultured can be maintained. good too.
- the undifferentiation maintenance factor is preferably a mammalian undifferentiation maintenance factor of the same species as the cells to be cultured.
- human undifferentiated maintenance factors eg, bFGF, FGF4, FGF8, EGF, Nodal, ActivinA, ActivinB, TGF ⁇ 1, TGF ⁇ 2, etc.
- the undifferentiated maintenance factor is preferably isolated.
- the undifferentiation maintenance factor can be produced by any host or artificially synthesized as long as it has the ability to maintain undifferentiation of the pluripotent stem cells to be cultured.
- the factor for maintaining undifferentiation used in the present invention is preferably one that has undergone modifications similar to those produced in vivo, and is produced in cells of the same type as the pluripotent stem cells to be cultured under conditions that do not contain xenogeneic components. is more preferred.
- One aspect of the production method according to the present invention includes a step of providing an isolated undifferentiated maintenance factor.
- One aspect of the production method according to the present invention includes the step of exogenously (or exogenously) adding the isolated factor for maintaining undifferentiation to the medium used in step (a).
- An undifferentiation maintenance factor may be added in advance to the medium used in step (a).
- the concentration of the undifferentiated maintenance factor in the medium used in step (a) is a concentration that can maintain the undifferentiated state of the cultured pluripotent stem cells, and can be appropriately set by those skilled in the art.
- concentration is usually about 4 ng/mL to about 500 ng/mL, preferably about 10 ng/mL to about 200 ng/mL, more preferably about 30 ng/mL. mL to about 150 ng/mL.
- Step (a) is performed in the absence of feeder cells.
- Cultivation of pluripotent stem cells in step (a) may be performed under either suspension culture or adherent culture, but adherent culture is preferred.
- an appropriate matrix may be used as a scaffold to provide the pluripotent stem cells with a scaffold that replaces feeder cells.
- Pluripotent stem cells are adherently cultured in a cultureware whose surface is coated with a scaffold matrix.
- Matrices that can be used as scaffolds include laminin (Nat Biotechnol. 28, 611-615 (2010)), laminin fragments (Nat Commun 3, 1236 (2012)), basement membrane preparations (Nat Biotechnol 19, 971-974 (2001)), gelatin, collagen, heparan sulfate proteoglycan, entactin, vitronectin, and the like.
- Laminin 511 is preferably used for the matrix (Nat Biotechnol 28, 611-615 (2010)).
- the laminin fragment is not particularly limited as long as it has adhesiveness to pluripotent stem cells and enables maintenance and culture of pluripotent stem cells under feeder-free conditions, but is preferably an E8 fragment.
- Laminin E8 fragment was identified as a fragment having strong cell adhesive activity among fragments obtained by digesting laminin 511 with elastase (EMBO J., 3: 1463-1468, 1984, J. Am. Cell Biol., 105:589-598, 1987).
- the E8 fragment of laminin 511 is preferably used (Nat Commun 3, 1236 (2012), Scientific Reports 4, 3549 (2014)).
- the laminin E8 fragment need not be an elastase digestion product of laminin and may be recombinant. It may be one produced by a genetically modified animal (such as a silkworm). From the viewpoint of avoiding contamination with unidentified components, a recombinant laminin fragment is preferably used.
- the E8 fragment of laminin 511 is commercially available and can be purchased from Nippi Co., Ltd., for example.
- the laminin or laminin fragment used in the present invention is preferably isolated.
- the surface is preferably coated with isolated laminin 511 or E8 fragment of laminin 511, more preferably with E8 fragment of laminin 511.
- Pluripotent stem cells are adherently cultured in cultureware.
- the medium used in step (a) is not particularly limited as long as it allows undifferentiated maintenance culture of pluripotent stem cells under feeder-free conditions (feeder-free medium).
- feed-free medium Many synthetic media have been developed and are commercially available as feeder-free media, such as Essential 8 medium.
- Essential 8 medium is DMEM / F12 medium, as additives, L-ascorbic acid-2-phosphate magnesium (64 mg / l), sodium selenium (14 ⁇ g / 1), insulin (19.4 mg / l), NaHCO 3 ( 543 mg/l), transferrin (10.7 mg/l), bFGF (100 ng/ml), and TGF ⁇ family signaling pathway agonists (TGF ⁇ 1 (2 ng/ml) or Nodal (100 ng/ml)) (Nature Methods, 8, 424-429 (2011)).
- feeder-free media examples include Essential 8 (manufactured by Thermo Fisher Scientific), S-medium (manufactured by DS Pharma Biomedical Co., Ltd.), StemFlex Medium, StemPro (manufactured by Thermo Fisher Scientific), hESF9, mTeSR1 (STEMCELL Technology company), mTeSR2 (manufactured by STEMCELL Technologies), TeSR-E8 (manufactured by STEMCELL Technologies), mTeSR Plus (manufactured by STEMCELL Technologies), StemFit (manufactured by Ajinomoto Co., Inc.), ReproMed iPSC Medium (manufactured by Reprocell), NutriS (manufactured by Biological Industries), NutriStem V9 (manufactured by Biological Industries), Cellartis DEF-CS Xeno-Free Culture Medium (manufactured by Takara Bio), Stem-Partner SF (manufactureured by
- the pluripotent stem cells in step (a) may be in either a primed state or a naive-like state, preferably in the primed state.
- Naive-like state pluripotent stem cells can be compared with primed pluripotent stem cells, for example Cell, 2014, 158.6: 1254-1269.
- culture media such as commercially available ReproNaive (manufactured by Reprocell), NaiveCult Induction Kit (manufactured by STEMCELL Technologies), RSeT Medium (manufactured by STEMCELL Technologies), AlphaSTEM Culture System (manufactured by Minerva Biotechnology), etc. can be obtained by
- the medium used in step (a) may be a serum medium or a serum-free medium. From the viewpoint of avoiding contamination with chemically undetermined components, the medium used in step (a) is preferably a serum-free medium.
- the medium may contain serum replacement.
- the culturing time of pluripotent stem cells in step (a) is not particularly limited as long as the effect of improving the quality of cell aggregates that can be formed in subsequent step (1) can be achieved, but usually 0.5 to 144 hours. , preferably 2 to 96 hours, more preferably 6 to 48 hours, even more preferably 12 to 48 hours, particularly preferably 18 to 28 hours, for example 24 hours. That is, the step (a) is started 0.5 to 144 hours, preferably 18 to 28 hours before the start of the step (1), and the step (1) is continued after the step (a) is completed.
- human pluripotent stem cells are adherently cultured in a serum-free medium containing bFGF in the absence of feeder cells.
- the adherent culture is preferably carried out in a cultureware surface-coated with laminin-511, E8 fragment of laminin-511 or vitronectin.
- the adherent culture is preferably performed using StemFit as a feeder-free medium.
- human pluripotent stem cells are suspended in a bFGF-containing serum-free medium in the absence of feeder cells.
- human pluripotent stem cells may form aggregates of human pluripotent stem cells.
- culture conditions such as culture temperature and CO 2 concentration can be appropriately set.
- the culture temperature may be, for example, about 30°C to about 40°C, preferably about 37°C.
- the CO2 concentration may be, for example, about 1% to about 10%, preferably about 5%.
- step (1) pluripotent stem cells are cultured in the presence of a Wnt signaling pathway inhibitor.
- the Wnt signaling pathway is a signaling pathway that uses Wnt family proteins as ligands and mainly Frizzled as receptors.
- Examples of the signal pathway include canonical Wnt pathway, non-canonical Wnt pathway, and the like.
- the canonical Wnt pathway is mediated by ⁇ -catenin.
- Non-classical Wnt pathways include planar cell polarity (PCP) pathway, Wnt/JNK pathway, Wnt/Calcium pathway, Wnt-RAP1 pathway, Wnt-Ror2 pathway, Wnt-PKA pathway, Wnt-GSK3MT pathway, Wnt-aPKC pathway , Wnt-RYK pathway, Wnt-mTOR pathway, and the like.
- PCP planar cell polarity
- Wnt/JNK pathway Wnt/Calcium pathway
- Wnt-RAP1 pathway Wnt-Ror2 pathway
- Wnt-PKA pathway Wnt-GSK3MT
- the Wnt signaling pathway inhibitor is not limited as long as it can suppress signal transduction triggered by Wnt family proteins.
- the inhibitory substance may be any of nucleic acids, proteins, and low-molecular-weight organic compounds.
- examples of such inhibitors include substances that inhibit Wnt processing and extracellular secretion, substances that act directly on Wnt (e.g., proteins, antibodies, aptamers, etc.), and substances that suppress the expression of genes encoding Wnt (e.g., antisense oligonucleotides, siRNA, etc.), substances that inhibit binding between Wnt receptors and Wnts, and substances that inhibit physiological activities caused by signal transduction by Wnt receptors.
- proteins belonging to the secret Frizzled Related Protein (sFRP) class proteins belonging to the secret Frizzled Related Protein (sFRP1) class (sFRP1-5, Wnt Inhibitory Factor-1 (WIF-1), Cerberus), Dickkopf (Dkk) class proteins (Dkk1-4, Kremen), APCDD1, APCDD1L, proteins belonging to the Draxin family, IGFBP-4, Notum, proteins belonging to the SOST/Sclerostin family, and the like.
- Wnt signaling pathway inhibitors Compounds well known to those skilled in the art can be used as Wnt signaling pathway inhibitors.
- inhibitors of the classical Wnt signaling pathway include Frizzled inhibitors, Disheveled (Dvl) inhibitors, Tankyrase (TANK) inhibitors, casein kinase 1 inhibitors, catenin-responsive transcription inhibitors, p300 inhibitors, CREB-binding protein (CBP) inhibitors, BCL-9 inhibitors (Am J Cancer Res. 2015; 5(8): 2344-2360) and the like.
- Non-classical Wnt pathway inhibitors include, for example, porcupine (PORCN) inhibitors, calcium/calmodulin-dependent protein kinase II (CaMKII) inhibitors, (TGF- ⁇ -activated kinase 1 (TAK1) inhibitors, Nemo-Like Kinase (NLK) inhibitor, LIM Kinase inhibitor, mammalian target of rapamycin (mTOR) inhibitor, Rac inhibitor, c-Jun NH 2-terminal kinase (JNK) inhibitor, protein kinase C (PKC) inhibitor, methionine aminopeptidase 2 (MetAP2) inhibitors, calcineurin inhibitors, nuclear factor of activated T cells (NFAT) inhibitors, ROCK inhibitors, etc.
- PORCN porcupine
- CaMKII calcium/calmodulin-dependent protein kinase II
- NLK Nemo-Like Kinase
- Wnt signaling pathway inhibitors include KY02111 (N-(6-Chloro-2-benzothiazolyl)-3,4-dimethoxybenzenepropanamide), KY03-I (2-(4-(3,4-dimethoxyphenyl)butanamide)-6-Iodobenzothiazole).
- KY02111 N-(6-Chloro-2-benzothiazolyl)-3,4-dimethoxybenzenepropanamide
- KY03-I (2-(4-(3,4-dimethoxyphenyl)butanamide)-6-Iodobenzothiazole).
- a substance may be used singly or in combination.
- IWP-2 N-(6-Methyl-2-benzothiazolyl)-2-[(3,4,6,7-tetrahydro-4-oxo-3-phenylthieno[3,2-d]pyrimidin -2-yl)thio]-acetamide
- IWP-3 (2-[[3-(4-fluorophenyl)-3,4,6,7-tetrahydro-4-oxothieno[3,2-d]pyrimidin-2 -yl]thio]-N-(6-methyl-2-benzothiazolyl)-acetamide
- IWP-4 N-(6-methyl-2-benzothiazolyl)-2-[[3,4,6,7-tetrahydro -3-(2-methylphenyl)-4-oxothieno[3,2-d]pyrimidin-2-yl]thio]-acetamide
- IWP-L6 N-(5-phenyl-2-pyridinyl)-2-[
- JNK inhibitors include JNK-IN-8 ((E)-3-(4-(dimethylamino)but-2-enamide)-N-(3-methyl-4-((4-(pyridin-3- yl)pyrimidin-2-yl)amino)phenyl)benzamide), SP600125 (Anthra[1-9-cd]pyrazol-6(2H)-one), DB07268 (2-[[2-[(3-Hydroxyphenyl)amino ]-4-pyrimidinyl]amino]benzamide), Tanzisertib (trans-4-[[9-[(3S)-Tetrahydro-3-furanyl]-8-[(2,4,6-trifluorophenyl)amino]-9H- purin-2-yl]amino]cyclohexanol), Bentamapimod (1,3-benzothiazol-2-yl) [2-[[4-[(morpholin-4-yl)methyl]
- JNK inhibitors are disclosed, for example, in J Enzyme Inhib Med Chem. 2020; 35(1): 574-583. and are known to those skilled in the art.
- Rac inhibitors include EHT1864 (5-(5-(7-(Trifluoromethyl)quinolin-4-ylthio)pentyloxy)-2-(morpholinomethyl)-4H-pyran-4-one dihydrochloride), NSC23766 (N6-[ 2-[[4-(Diethylamino)-1-methylbutyl]amino]-6-methyl-4-pyrimidinyl]-2-methyl-4,6-quinolinediamine trihydrochloride), EHop-016 (N4-(9-Ethyl-9H -carbazol-3-yl)-N2-[3-(4-morpholinyl)propyl]-2,4-pyrimidinediamine), 1A-116(N-(3,5-Dimethylphenyl)-N′-[2-(trifluoromethyl )phenyl]guanidine), ZCL278 (2-(4-broMo-2-chlorophenoxy)-N-(4-(N-(4,6
- the Wnt signaling pathway inhibitor preferably contains at least one selected from the group consisting of a PORCN inhibitor, KY02111 and KY03-I, more preferably a PORCN inhibitor.
- Wnt signaling pathway inhibitors also preferably include substances having inhibitory activity on the non-canonical Wnt pathway of Wnt.
- the Wnt signaling pathway inhibitor more preferably includes a substance having inhibitory activity on the Wnt/Planar Cell Polarity (PCP) pathway, and more preferably includes a substance with inhibitory activity on the Wnt/JNK pathway.
- PCP Planar Cell Polarity
- PORCN inhibitors used in the present invention are preferably the group consisting of IWP-2, IWP-3, IWP-4, IWP-L6, IWP-12, LGK-974, Wnt-C59, ETC-159 and GNF-6231 It contains at least one selected from the above, more preferably contains IWP-2 or Wnt-C59, and still more preferably contains IWP-2.
- Wnt/PCP pathway inhibitors used in combination with PORCN inhibitors are preferably JNK inhibitors or Rac inhibitors.
- the JNK inhibitor used in the present invention is preferably JNK-IN-8.
- the Rac inhibitor used in the present invention is preferably EHT1864.
- the concentration of the Wnt signaling pathway inhibitor in the medium can be appropriately set within a range where the above effects can be achieved. From the viewpoint of production efficiency of cells comprising nasal epithelium or cells containing progenitor cells thereof, for example, when using IWP-2, which is a PORCN inhibitor, as a Wnt signaling pathway inhibitor, the concentration is usually about 10 nM to about 50 ⁇ M, preferably about 10 nM to about 30 ⁇ M, more preferably about 100 nM to about 10 ⁇ M, most preferably about 0.5 ⁇ M.
- Wnt-C59 one of the PORCN inhibitors
- its concentration is usually about 10 nM to about 30 ⁇ M, preferably about 20 nM to about 10 ⁇ M, more preferably about 500 nM.
- KY02111 its concentration is usually about 10 nM to about 50 ⁇ M, preferably 10 nM to about 30 ⁇ M, more preferably about 100 nM to about 10 ⁇ M, and even more preferably about 5 ⁇ M.
- the concentration is usually about 10 nM to about 50 ⁇ M. , preferably about 10 nM to about 30 ⁇ M, more preferably about 100 nM to about 10 ⁇ M, most preferably about 1 ⁇ M.
- the concentration is usually about 10 nM to about 50 ⁇ M, preferably About 10 nM to about 30 ⁇ M, more preferably about 100 nM to about 10 ⁇ M, most preferably about 1 ⁇ M.
- the timing of addition of the Wnt signaling pathway inhibitor is usually within 48 hours, preferably within 24 hours, more preferably within 12 hours, and more preferably at the same time as the start of culture of the pluripotent stem cells in step (1). be.
- a TGF ⁇ signaling pathway inhibitor is preferably further present in the medium in step (1).
- the TGF ⁇ signaling pathway inhibitor used in step (1) the same substances as exemplified in step (a) can be used.
- the TGF ⁇ signaling pathway inhibitors in step (a) and step (1) may be the same or different, but are preferably the same.
- the concentration of the TGF ⁇ signaling pathway inhibitor in the medium can be appropriately set within the range where the above effects can be achieved.
- SB431542 is used as a TGF ⁇ transduction pathway inhibitor, it is usually used at a concentration of about 1 nM to about 100 ⁇ M, preferably about 10 nM to about 100 ⁇ M, more preferably about 100 nM to about 50 ⁇ M, still more preferably about 500 nM to about 10 ⁇ M.
- a TGF ⁇ signaling pathway inhibitor other than SB431542 it is preferably used at a concentration that exhibits the same TGF ⁇ signaling pathway inhibitory activity as SB431542 at the above concentrations.
- an inhibitor against transforming growth factor- ⁇ -activated kinase 1 is added from the viewpoint of suppressing differentiation into mesendoderm and improving the production efficiency of nasal epithelial-like tissue. It is also preferred to TAK1 is a serine-threonine protein kinase of the MAP kinase kinase kinase (MAPKKK) family that mediates signaling activated by TGF ⁇ , bone morphogenetic proteins (BMPs), interleukin-1 (IL-1), TNF- ⁇ , etc. be.
- TAK1 inhibitor is not limited as long as it can suppress signal transduction mediated by TAK1.
- TAK1 inhibitors may be nucleic acids, proteins, or small organic compounds. Examples of the substance include a substance that inhibits binding of TAK1 to a substrate, a substance that inhibits phosphorylation of TAK1, a substance that promotes dephosphorylation of TAK1, a substance that inhibits transcription and translation of TAK1, and a substance that promotes degradation of TAK1. etc.
- TAK1 inhibitor for example, (5Z)-7-Oxozeaenol ((3S,5Z,8S,9S,11E)-3,4,9,10-tetrahydro-8,9,16-trihydroxy-14-methoxy-3- methyl-1H-2-benzoxacyclotetradecin-1,7(8H)-dione), N-Des(aminocarbonyl)AZ-TAK1 inhibitor (3-Amino-5-[4-(4-morpholinylmethyl)phenyl]-2-thiophenecarboxamine) , Takinib (N1-(1-Propyl-1H-benzomidazol-2-yl)-1,3-benzenedicarboxamide), NG25 (N-[4-[(4-Ethyl-1-piperazinyl)methyl]-3-(trifluoromethyl ) phenyl]-4-methyl-3-(1H-pyrrolo[2,3-b]pyridin-4-y
- the TAK1 inhibitor is preferably (5Z)-7-Oxozeaenol.
- (5Z)-7-Oxozeaenol is used as the TAK1 inhibitor in step (1), it is generally about 1 nM to about 100 ⁇ M, preferably about 10 nM to about 50 ⁇ M, more preferably about 100 nM to about 25 ⁇ M, still more preferably about 500 nM. Concentrations of ⁇ 10 ⁇ M are used.
- a TAK1 inhibitor other than (5Z)-7-Oxozeaenol it is preferably used at a concentration that exhibits TAK1 inhibitory activity equivalent to that of (5Z)-7-Oxozeaenol at the above concentrations.
- the above TAK1 inhibitor can be added at any stage of step (1) and subsequent steps.
- a TAK1 inhibitor at the same time as step (1) is started. If it is intended to increase the proportion of cells that constitute the nasal epithelium in the obtained cell population, it may be performed simultaneously with the start of step (3), or within a certain period of time from the start of step (3), for example, step (3 ) is preferably added within 14 days of initiation of the TAK1 inhibitor.
- the medium used in step (1) is not particularly limited as long as it is as described in the definition section above.
- the medium used in step (1) can be serum medium or serum-free medium. From the viewpoint of avoiding contamination with chemically undetermined components, a serum-free medium is preferably used in the present invention. In order to avoid complicated preparation, it is preferable to use a serum-free medium supplemented with an appropriate amount of a serum substitute such as commercially available KSR.
- the amount of KSR added to the serum-free medium for example, in the case of human ES cells, is generally about 1% to about 30%, preferably about 2% to about 20%.
- the serum-free medium includes, for example, a 1:1 mixture of IMDM and F-12 supplemented with 5% KSR, 450 ⁇ M 1-monothioglycerol and 1x Chemically Defined Lipid Concentrate, or 5% to 20% KSR in GMEM. , NEAA, pyruvate and 2-mercaptoethanol.
- the cells may be in either an adherent state or a floating state.
- pluripotent stem cells are dispersed into single cells and then reaggregated to form cell aggregates in a floating state. For this reason, it is preferable to perform an operation of dispersing the pluripotent stem cells obtained in step (a) into single cells (also referred to as step (b)) before starting step (1).
- the "dispersed cells" obtained by the dispersing operation are preferably single cells, but may include cell clusters consisting of a small number of cells, for example, 2 or more and 100 or less. It may contain clumps of different cells.
- Dispersed cells may contain, for example, 70% or more single cells and 30% or less cell clusters, preferably 80% or more single cells and 20% or less cell clusters.
- the pluripotent stem cells are dispersed into single cells, seeded onto a cell-adhesive cultureware, and cultured in an adherent state.
- Methods for dispersing pluripotent stem cells include mechanical dispersion treatment, cell dispersion treatment, and cell protective agent addition treatment, and these treatments may be combined.
- a method for dispersing the cells it is preferable to carry out the cell-dispersing solution treatment at the same time as the cell protective agent addition treatment, followed by mechanical dispersion treatment.
- Cell protective agents used in cell protective agent addition treatment include FGF signaling pathway agents, heparin, Rho-associated protein kinase (ROCK) inhibitors, myosin inhibitors, polyamines, integrated stress response: ISR) inhibitors, caspase inhibitors, serum or serum substitutes, and the like.
- Preferred cytoprotective agents include ROCK inhibitors.
- a ROCK inhibitor may be added from the start of culture in step (1).
- ROCK inhibitors examples include Y-27632 ((R)-(+)-trans-4-(1-Aminoethyl)-N-(4-pyridyl)cyclohexanecarboxamide, dihydrochloride), Fasudil (HA1077) (1-(5- isoquinolinylsulfonyl) homopiperazine, hydrochloride), H-1152 (5-[[(2S)-hexahydro-2-methyl-1H-1,4-diazepin-1-yl]sulfonyl]-4-methyl-isoquinoline, dihydrochloride) -1100 (Hydroxyfasudil) ([1-(1-Hydroxy-5-isoquinolinesulfonyl) homopiperazine, hydrochloride), Chroman 1 ((3S)-N-[2-[2-(dimethylamino)ethoxy]-4-(1H-pyrazol -4-yl)phenyl]-6
- a prepared cell protective agent can also be used as the cell protective agent.
- prepared cytoprotective agents include RevitaCell Supplement (manufactured by Thermo Fisher Scientific), CloneR, and CloneR2 (manufactured by Stemcell Technologies). These substances may be used alone or in combination.
- step (1) when Y-27632, a ROCK inhibitor, is added as a cytoprotective agent, it is usually added to the culture environment at a concentration of 1 nM to 100 mM, preferably 10 nM to 10 mM, more preferably 1 ⁇ M to 100 ⁇ M. Add to.
- step (1) when the ROCK inhibitor Chroman 1 is added as a cytoprotective agent, it is usually added to the culture environment at a concentration of 10 pM to 1 mM, preferably 100 pM to 100 ⁇ M, more preferably 1 nM to 10 ⁇ M. Added.
- the concentration described in the instructions attached to the product for example, 1/100 to 100 times the concentration, preferably 1/10 to 10 times the concentration Concentrations, more preferably 1/3 to 3 times that concentration, can be used.
- the cell dispersion used for the cell dispersion treatment can include a solution containing at least one enzyme such as trypsin, collagenase, hyaluronidase, elastase, pronase, DNase, papain, and a chelating agent such as ethylenediaminetetraacetic acid.
- a chelating agent such as ethylenediaminetetraacetic acid.
- Commercially available cell dispersions such as TripLE Select (manufactured by Thermo Fisher Scientific), TripLE Express (manufactured by Thermo Fisher Scientific), and Accumax (manufactured by Innovative Cell Technologies) can also be used.
- a preferred cell dispersion in step (b) is, but is not limited to, phosphate buffer supplemented with 5 mM EDTA.
- Mechanical dispersion methods include pipetting or scraping with a scraper.
- the dispersed cells are suspended in the medium.
- a method for dispersing pluripotent stem cells includes, for example, a method in which colonies of pluripotent stem cells are treated with ethylenediaminetetraacetic acid or Accumax in the presence of a ROCK inhibitor, and further dispersed by pipetting.
- a suspension of dispersed pluripotent stem cells is seeded in a non-cell-adhesive cultureware.
- the cultureware is non-adhesive, cells are cultured in suspension, and multiple pluripotent stem cells aggregate to form cell aggregates.
- each cell aggregate When carrying out suspension culture, by seeding the dispersed pluripotent stem cells in a relatively large culture vessel such as a 10 cm dish, multiple cell aggregates may be simultaneously formed in one culture vessel. From the viewpoint of making it difficult for the size of each cell aggregate to vary, for example, a certain number of cells dispersed in each well of a multiwell plate (U bottom, V bottom) such as a non-cell-adhesive 96-well microplate Pluripotent stem cells are preferably seeded. When this is statically cultured, the cells rapidly aggregate to form one cell aggregate in each well.
- the cultureware can be made non-cell-adhesive by processing such as coating the surface of the cultureware with a superhydrophilic polymer.
- non-cell-adhesive multiwell plates examples include PrimeSurface 96V bottom plate (MS-9096V, manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd.). Centrifugation may be performed to form cell aggregates more quickly.
- a uniform population of cell aggregates can be obtained by collecting the cell aggregates formed in each well from a plurality of wells. If the cell aggregates are uniform, in the subsequent steps, the production efficiency for each well and for each repeated experiment can be more stabilized, and cells that constitute the nasal epithelium can be produced with higher reproducibility.
- Another embodiment for forming cell aggregates from dispersed pluripotent stem cells is to use a cultureware in which one well is divided into a plurality of microwells and two or more cell aggregates are formed.
- the suspension culture of any of the steps (1) and (2) to (4) is carried out in a cultureware in which at least one well is formed. Then, the well is divided into a plurality of microwells, suspension culture is performed so that one cell cluster is formed in each of the microwells, and the microwell is divided into one well. A corresponding number of cell clumps may be prepared.
- the culture area per well of the cultureware having microwells is not particularly limited, but from the viewpoint of efficiently producing cell aggregates, the bottom area is preferably larger than 1 cm 2 (equivalent to a 48-well plate), more preferably 2 cm. 2 (equivalent to a 24-well plate), more preferably greater than 4 cm 2 (equivalent to a 12-well plate).
- Examples of such cultureware include AggreWell plate for embryoid body formation (manufactured by StemCell Technologies), PAMCELL (manufactured by ANK), spheroid microplate (manufactured by Corning), NanoCulture Plate/Dish (manufactured by Organogenix), Cell -able (manufactured by Toyo Gosei), EZSPHERE (manufactured by AGC Techno Glass), SPHERICALPLATE 5D (manufactured by Mito Kogyo), TASCL (manufactured by Sims Bio), Scientific reports, 2022, 12.1: 1-11. Examples include, but are not limited to, the microwell bags described in .
- a three-dimensional cell culture vessel that can replace the medium of the entire plate at once while cell aggregates remain in each well.
- examples of such a three-dimensional cell culture vessel include PrimeSurface 96 slit well plate (manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd.). This plate has narrow openings (slits) through which the medium can enter and exit at the top of each of the 96 wells. Since the slit is set to a width that makes it difficult for cell aggregates to pass through, it is possible to exchange the medium for the entire plate at once while preventing cell aggregates from adhering to each other. quality can be improved.
- the concentration (density) of the pluripotent stem cells in step (1) can be appropriately set so as to form cell aggregates more uniformly and efficiently.
- human pluripotent stem cells for example, human iPS cells obtained from step (a)
- a solution prepared to obtain about 8 ⁇ 10 3 to about 1.2 ⁇ 10 4 cells is added to each well, and the plate is allowed to stand or centrifuged to form cell aggregates.
- EZSPHERE SP dish 35 mm Type 905 which is a culture device having about 260 microwells per dish
- a solution prepared to give about 4 ⁇ 10 4 to about 1.6 ⁇ 10 7 cells, particularly preferably about 8 ⁇ 10 4 to about 1.2 ⁇ 10 7 cells is added to the dish, and the dish is allowed to stand. to form cell aggregates.
- human pluripotent stem cells for example, human iPS cells obtained from step (a)
- AggreWell 800, 6-well plate which is a culture device having about 1800 microwells per well.
- the number of cells to be seeded can be determined, for example, by counting with a hemocytometer or the like.
- the suspension culture time required to form cell aggregates can be appropriately determined depending on the pluripotent stem cells used, but it is desirable to be as short as possible in order to form uniform cell aggregates.
- the process by which dispersed cells form cell aggregates is divided into a process of cell aggregation and a process of aggregated cells forming aggregates. From the time the dispersed cells are seeded (i.e., at the start of suspension culture) until the cells aggregate, for example, in the case of human pluripotent stem cells (human iPS cells, etc.), preferably within about 24 hours, more preferably Within about 12 hours.
- the time of seeding the dispersed cells i.e., the start of suspension culture
- the formation of cell aggregates for example, in the case of human pluripotent stem cells (human iPS cells, etc.), preferably within about 72 hours, More preferably within about 48 hours.
- the time required to form cell aggregates can be appropriately adjusted by adjusting the tool for aggregating cells, centrifugation conditions, and the like.
- cells differentiated from the formed aggregates can reproducibly form epithelial-like structures.
- Experimental manipulations to form cell aggregates include, for example, plates with small wells (for example, plates with a well bottom area of about 0.1 to 2.0 cm 2 in terms of a flat bottom), micropores, etc., in a small space. Methods include confining the cells and aggregating the cells with a short centrifugation using a small centrifuge tube.
- Plates with small wells include, for example, a 24-well plate (an area of about 1.88 cm 2 in terms of flat bottom), a 48-well plate (an area of about 1.0 cm 2 in terms of flat bottom), and a 96-well plate (an area of about 0.0 cm 2 in terms of flat bottom). 35 cm 2 , inner diameter of about 6 to 8 mm), 384-well plate. A 96-well plate is preferred.
- the shape of the plate with small wells the shape of the bottom when the wells are viewed from above includes polygonal, rectangular, elliptical, and perfect circle, preferably perfect circle.
- the shape of the bottom surface when the wells are viewed from the side is preferably a structure in which the outer periphery is high and the interior is low, and examples thereof include a U bottom, a V bottom, and an M bottom.
- U-bottoms or V-bottoms, most preferably V-bottoms are mentioned.
- a cell culture dish eg, 60 mm to 150 mm dish, culture flask
- the bottom of the small plate of wells preferably uses a cell non-adhesive bottom, preferably a cell non-adhesive coated bottom.
- cells are seeded in a cultureware having elongated lanes having a V-shaped or U-shaped cross section to form cell aggregates. can be made
- a three-dimensional printer or a 3D printer Dispersed single cells or spheroids composed of a plurality of cells are suspended in biocompatible ink (bioink) and printed with a bio 3D printer (eg BIO X manufactured by Celllink, etc.), or cells
- a bio 3D printer eg BIO X manufactured by Celllink, etc.
- a desired form of cell aggregates can be prepared by a technique of pricking a needle and piling up the clumps (Spike manufactured by Cyfuse, etc.).
- cell aggregates are determined by the size and number of cells of cell aggregates, macroscopic morphology, microscopic morphology by tissue staining analysis and its uniformity, expression of differentiation and undifferentiated markers and their uniformity, differentiation markers can be determined based on the expression control and its synchrony, reproducibility of differentiation efficiency between aggregates, and the like.
- adherent culture is performed as another preferred embodiment.
- the pluripotent stem cells on the cultureware after step (a) may be used as they are in step (1), or the pluripotent stem cells may be dispersed into single cells and then seeded again on the adhesive cultureware. good too.
- Appropriate extracellular matrices or synthetic cell adhesion molecules may be used as scaffolds in performing reseeding after dispersal of pluripotent stem cells into single cells.
- the scaffold allows adherent culture of pluripotent stem cells in a surface-coated cultureware.
- the extracellular matrix is preferably matrigel or laminin.
- Synthetic cell adhesion molecules include poly-D-lysine, synthetic peptides containing a cell adhesion domain such as the RGD sequence, and the like.
- concentration (density) of the pluripotent stem cells in step (1) can be appropriately set so as to form tissues on the cultureware more uniformly and efficiently.
- human pluripotent stem cells for example, human ES cells or iPS cells obtained from step (a)
- adherently cultured using a 96-well flat-bottom microwell plate usually about 1 ⁇ 10 2 to about 1 ⁇ 10 2 per well x10 5 cells, preferably about 2 x 10 2 to about 5 x 10 4 cells, more preferably about 5 x 10 2 to about 2 x 10 4 cells are added to each well, and plated is allowed to adhere to the cells, and the subsequent culture operation is performed.
- the seeding number of cells is not particularly limited as long as differentiation into nasal epithelium occurs. The density may be such that the cell density reaches sub-confluence corresponding to 60% or more of the culture space of the device.
- micropatterned cultureware as the adhesive cultureware.
- the micropattern on the cultureware can be composed of a cell-adhesive region and a cell-non-adhesive region, and cells are preferably adherently cultured in the cell-adhesive region.
- the shapes of the cell adhesive region and the cell non-adhesive region are not limited as long as they can be developed on the cultureware.
- a single cell-adhesive region and a cell-non-adhesive region may be formed on one culture device, or a plurality of regions may be formed.
- the cell adhesive region is preferably artificially treated for the purpose of improving adhesiveness.
- micropatterned cultureware examples include CYTOOchip (manufactured by CYTOO) and ibidi Micropatterning (manufactured by ibidi).
- a culture device can also be prepared using a PDMS mold, matrix, and the like.
- When culturing the pluripotent stem cells obtained in step (a) on a micropatterned cultureware it can be carried out with reference to, for example, a previously reported method (Nature Protocols, 11 (11), 2223- 2232.).
- the number of cells seeded on the micropatterned cultureware is not particularly limited as long as differentiation into nasal epithelium occurs, but from the viewpoint of reproducing adhesion and interaction between cells, 72 hours after seeding on the cultureware. It is also preferable that the cell density reaches subconfluence within 60% or more of the culture space on the micropattern of the device.
- the cultureware preferably has a channel (microchannel) for perfusion of the medium, and cells may be cultured under a perfusion environment in step (1) and subsequent steps.
- a culture device is also called a microfluidic chip.
- the culture device e.g., microfluidic chip
- the culture device may be connected by a connector to another culture device (e.g., microfluidic chip) for culturing cells or tissues other than the cells cultured in the production method of the present invention.
- the connecting portion may be, for example, a channel. This makes it possible to reproduce the interaction between the cells constituting the nasal epithelium or their progenitor cells and cell populations containing these, and other cells or tissues.
- nasal epithelium or their progenitor cells and cell populations containing these include, for example, trachea, bronchi, lungs, liver, brain and central nervous system, blood vessels, liver, kidneys, and throat. , oral epithelium, stomach, small intestine, colon cells and tissues, and the like, but are not limited thereto.
- the cultureware may have a membrane permeable to oxygen or medium.
- the cultureware may be capable of forming concentration gradients of compounds, growth factors, and the like.
- the membrane is for example a porous membrane.
- cells can be cultured by the production method of the present invention on one side separated by the membrane, and other cells or tissues, feeder cells, etc. can be cultured on the other side.
- the cells constituting the nasal epithelium, their progenitor cells, and the cell population containing these cells can be cultured without contamination with other cells or tissues.
- step (1) and subsequent steps when performing a medium replacement operation, for example, an operation of adding a new medium without discarding the original medium (medium addition operation), about half the original medium (the volume of the original medium about 30 to 90%, for example, about 40 to 60%) and add about half of the new medium (30 to 90% of the volume of the original medium, for example, about 40 to 60%) (half medium replacement operation), the original An operation of discarding about the entire amount (90% or more of the volume of the original medium) of a certain medium and adding about the entire amount (90% or more of the volume of the original medium) of a new medium (full medium exchange operation) can be mentioned.
- a medium replacement operation for example, an operation of adding a new medium without discarding the original medium (medium addition operation), about half the original medium (the volume of the original medium about 30 to 90%, for example, about 40 to 60%) and add about half of the new medium (30 to 90% of the volume of the original medium, for example, about 40 to 60%) (half medium replacement operation)
- Half volume medium exchange operation When adding a specific component at a certain point, for example, after calculating the final concentration, about half of the original medium is discarded, and about half of the new medium containing the specific component at a higher concentration than the final concentration is added ( Half volume medium exchange operation) may be performed.
- the concentration of the components contained in the original medium is diluted at a certain point to lower the concentration, for example, the medium exchange operation is performed multiple times a day, preferably multiple times (for example, 2 to 3 times) within an hour. good.
- the cells or cell aggregates may be transferred to another culture vessel if the components contained in the original medium are diluted to a lower concentration.
- Tools used for the medium exchange operation are not particularly limited, and examples thereof include pipettors, Pipetman (registered trademark), multichannel pipettes, continuous pipettors, and the like.
- pipettors When using a 96-well plate as culture equipment, a multichannel pipette may be used.
- the culture time in step (1) is usually about 8 hours to 6 days, preferably about 12 hours to 48 hours.
- any one or more of steps (1) to (3) may be performed in the presence of an agent acting on the Wnt signaling pathway. You can also do it below.
- the Wnt signaling pathway includes the canonical Wnt pathway, the non-canonical Wnt pathway, and the like.
- Wnt signaling pathway agents are not limited as long as they can activate signal transduction triggered by Wnt family proteins.
- Wnt signaling pathway agonists may be nucleic acids, proteins, or small organic compounds. Examples of such substances include substances that promote Wnt autocrine, substances that stabilize Wnt and suppress its degradation, Wnt recombinant proteins, Wnt partial sequence peptides and their derivatives and derivatives, and substances that act on Wnt receptors. Substances that activate, substances that activate Wnt intracellular signaling mechanisms, Wnt intracellular signaling factors and variants thereof ( ⁇ -catenin S33Y, etc.), substances that activate gene expression downstream of Wnt response elements, etc. can be mentioned. Proteins known to be Wnt signaling pathway agonists include Wnt and R-spondin.
- Wnt proteins derived from various organisms can be used as long as they have activity against target cells.
- Wnt proteins derived from mammals are preferred. Examples of mammals include humans, mice, rats, cows, pigs, rabbits, and the like. More preferably, it is a recombinant protein derived from the same species as the pluripotent stem cell used for producing the cell population of the present invention.
- Examples of mammalian Wnt proteins include Wnt1, Wnt2, Wnt2b, Wnt3, Wnt3a, Wnt4, Wnt5a, Wnt5b, Wnt6, Wnt7a, Wnt7b, Wnt8a, Wnt8b, Wnt9a, Wnt9b, Wnt10a, Wnt10b, Wnt11, Wnt16, and the like. is not limited to this. In the production of the cell population according to the present invention, multiple Wnt proteins may be used in combination. Recombinant Wnt proteins that can be used to produce the cell populations of the present invention are available from, for example, R&D Systems and Fujifilm Wako Pure Chemical Industries.
- afamin is a glycoprotein belonging to the albumin family, and is known to suppress aggregation and inactivation of highly hydrophobic Wnt protein and maintain its activity.
- Afamin recombinant protein is available, for example, from R&D Systems.
- a mixture of afamin and Wnt recombinant protein is available from MBL Life Sciences.
- R-spondins that can be used as Wnt signaling pathway agonists include proteins belonging to the R-spondin family consisting of R-spondin1, R-spondin2, R-spondin3 and R-spondin4.
- the R-spondin family are secreted proteins and are known to be involved in the activation and regulation of the Wnt signaling pathway.
- multiple types of R-spondin may be used in combination.
- Recombinant proteins of R-spondin that can be used for the production of the cell population of the present invention are available from, for example, R&D Systems and Fujifilm Wako Pure Chemical Industries.
- Compounds well known to those skilled in the art can also be used as Wnt signaling pathway agonists.
- Compounds having activity as a Wnt signaling pathway agonist include, for example, compounds having inhibitory activity against GSK3 ⁇ , compounds having inhibitory activity against Wnt deacylase, compounds having inhibitory activity against AAK1, and the like.
- Examples of compounds having the above activity include lithium chloride, SGC AAK11 (N-(6-(3-((N,N-diethylsulfamoyl)amino)phenyl)-1H-indazol-3-yl)cyclopropanecarboxamide), Foxy 5 (N-formyl-L-methionyl-L-alpha-aspartyl-glycyl-L-cysteinyl-L-alpha-glutamyl-L-leucine), CHIR99021 (6-[2-[4-(2,4-Dichlorophenyl )-5-(4-methyl-1H-imidazol-2-yl)pyrimidin-2-ylamino]ethylamino]pyridine-3-carbonitrile), CHIR98014 (N6-[2-[[4-(2,4-Dichlorophenyl) -5-(1H-iMidazol-2-yl)-2-pyriMidinyl]a
- a Wnt signaling pathway inhibitor is added, but by using a Wnt signaling pathway agonist and a Wnt signaling pathway inhibitor at different points of action in combination, the above-mentioned multiple Wnt signaling pathways Only specific pathways among them can be activated or inhibited.
- the Wnt signaling pathway active substance is preferably a substance that acts on a factor downstream of the Wnt signaling pathway inhibitor added in step (1). It is also preferable that the Wnt signaling pathway active substance to be added is a substance that activates the classical Wnt pathway, and inhibits the degradation of ⁇ -catenin, an intracellular Wnt signaling factor, and stabilizes the Wnt signaling pathway. More preferably, it is an activating substance.
- Substances that inhibit and stabilize the degradation of ⁇ -catenin include, for example, GSK3 inhibitors, BML-284, and SKL2001. It is also preferred that the Wnt signaling pathway agent to be added is a substance that promotes or activates ⁇ -catenin responsive transcription (CRT).
- CRT ⁇ -catenin responsive transcription
- Wnt signaling pathway agonists and Wnt signaling pathway inhibitors include GSK3 inhibitors and PORCN inhibitors.
- GSK3 inhibitors and PORCN inhibitors When combined with a GSK3 inhibitor and a PORCN inhibitor, the canonical Wnt pathway is activated and the non-canonical Wnt pathway is inhibited.
- the GSK3 inhibitor preferably contains at least one selected from the group consisting of CHIR99021, CHIR98014, SB216763, SB415286 and BIO, more preferably CHIR99021.
- the PORCN inhibitor is preferably IWP-2, IWP-3, IWP-4, IWP-L6, IWP-12, LGK-974, ETC-159, GNF- 6231, Wnt-C59, and more preferably IWP-2.
- a GSK3 inhibitor and KY02111 or a derivative thereof may be used in combination. Examples of substances having ⁇ -catenin degradation inhibitory and stabilizing effects that have different mechanisms of action from GSK3 inhibitors include BML-284 and SKL2001, and these compounds or derivatives thereof are also PORCN inhibitors, KY02111 or derivatives thereof, and the like.
- Wnt signaling pathway agonists and Wnt signaling pathway inhibitors include GSK3 inhibitors, PORCN inhibitors and JNK inhibitors.
- GSK3 inhibitor When a GSK3 inhibitor is used in combination with a PORCN inhibitor and a JNK inhibitor, the JNK inhibitor preferably comprises JNK-IN-8.
- the concentration of the Wnt signaling pathway agonist in the medium can be appropriately set within a range where the above effects can be achieved. From the viewpoint of promoting the survival and proliferation of nervous system cells or tissues inside cell clusters, when CHIR99021 is used as a Wnt signaling pathway agonist, it is usually about 10 pM to about 10 mM, preferably about 100 pM to about 1 mM, more preferably about 10 pM to about 1 mM. is used at a concentration of about 1 nM to about 100 ⁇ M, more preferably about 10 nM to about 30 ⁇ M, most preferably about 100 nM to about 3 ⁇ M.
- Wnt signaling pathway active substance other than CHIR99021 when using a Wnt signaling pathway active substance other than CHIR99021, it is preferably used at a concentration that exhibits the same Wnt signaling pathway promoting activity as CHIR99021 at the above concentration.
- Wnt signaling pathway promoting activity can be determined, for example, by a Topflash reporter assay using HEK293 cells.
- step (1) and subsequent steps from the viewpoint of improving the production efficiency of the olfactory epithelium-like tissue involved in the induction of cells constituting the nasal epithelium, it is also possible to add a compound that promotes differentiation into placode regions.
- a compound that promotes differentiation into placode regions preferable.
- compounds having the above effects include BRL-54443, phenanthroline, and Parthenolide described in US Patent Application Publication No. 2016/0326491.
- the concentration is usually 10 nM to 100 ⁇ M
- phenanthroline it is usually 10 nM to 100 ⁇ M
- Parthenolide it is usually used at a concentration of 10 nM to 100 ⁇ M.
- step (1) and subsequent steps the effects of differences in technique between workers are eliminated, and contamination by foreign substances derived from workers is prevented.
- an automatic culturing device an automatic culturing robot, or a laboratory automation device.
- the equipment that can be used in the practice of the present invention include automatic culture equipment (Panasonic, Kawasaki Heavy Industries, Hitachi, iACE2 (ACC-200)), SLAS TECHNOLOGY: Translating Life Sciences Innovation, 2020. , 2472630320972109. (LabDroid, manufactured by the Robotic Biology Institute, Inc.), etc., but are not limited thereto.
- one skilled in the art can adapt or modify the manufacturing methods and processes described in the present invention for the equipment used.
- the intermediate evaluation may be either a sampling test conducted by consuming a portion of the cell mass during production or a non-invasive test, but is preferably a non-invasive test.
- non-invasive tests include optical observation using a microscope, measurement using optical coherence tomography (OCT), and quantification of metabolites, nucleic acids, and secreted proteins contained in the medium collected during medium exchange. mentioned.
- the epithelial structure formed on the surface of the cell mass, the nasal epithelium, the olfactory epithelium, etc. are optically observed and It can also be detected, quantified and evaluated.
- the evaluation criteria for the optical observation can be appropriately set, for example, by visual judgment by a person skilled in the art, or by a method such as model building by machine learning of photographed images.
- Evaluation criteria that can be used include, for example, the ratio of the surface area of the cell mass covered with epithelium, the thickness of the surface epithelium, the ratio of the surface epithelium, the amount of dead cells around the cell mass, and the amount of debris.
- Cell3iMager Estier manufactured by SCREEN Holdings
- SCREEN Holdings SCREEN Holdings
- the analysis using the collected medium for example, exosome analysis, metabolomics analysis and the like can be performed.
- Step (2) the cells cultured in step (1) are cultured in the presence of a BMP signaling pathway agent.
- the formed cell aggregates may be continuously cultured in suspension in step (2).
- the cells may be adherently cultured in step (2).
- adhesion culture may be performed in step (2).
- suspension culture may be performed in step (2).
- a BMP signaling pathway agonist is a substance that can enhance the signaling pathway mediated by BMP.
- BMP signaling pathway agents include BMP proteins such as BMP2, BMP4 and BMP7, GDF proteins such as GDF7, anti-BMP receptor antibodies, and BMP partial peptides. These substances may be used alone or in combination.
- BMP signaling pathway agonists from the standpoint of biological activity include, for example, mouse prochondrocyte cell line ATDC5, mouse calvaria-derived cell line MC3T3-E1, and mouse striated muscle-derived cell line C2C12. Examples thereof include substances capable of inducing differentiation into blast-like cells and alkaline phosphatase production. Examples of substances having the above activity include BMP2, BMP4, BMP5, BMP6, BMP7, BMP9, BMP10, BMP13/GDF6, BMP14/GDF5, GDF7 and the like.
- BMP2 protein and BMP4 protein are available from, for example, R&D Systems.
- BMP7 protein is available, for example, from Biolegend.
- GDF7 protein is available, for example, from Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
- the BMP signaling pathway agonist preferably comprises at least one protein selected from the group consisting of BMP2, BMP4, BMP7, BMP13 and GDF7, more preferably BMP4.
- the concentration of the BMP signaling pathway active substance in the medium can be appropriately set within a range in which the above effects can be achieved.
- BMP4 when BMP4 is used as a BMP signaling pathway agonist, it is usually about 1 pM to about 100 nM, preferably about 10 pM to about 50 nM, more preferably about 25 pM to about 25 nM. , more preferably from about 25 pM to about 5 nM, particularly preferably from about 100 pM to about 5 nM, most preferably from about 500 pM to about 2 nM.
- BMP signaling pathway active substance other than BMP4 when using a BMP signaling pathway active substance other than BMP4, it is preferably used at a concentration that exhibits the same BMP signaling pathway promoting activity as BMP4 at the concentration described above.
- a person skilled in the art uses, for example, a commercially available recombinant BMP protein as an active substance of the BMP signaling pathway, the activity described in the product package insert, such as the ED 50 of the ability to induce alkaline phosphatase production in the mouse progenitor chondrocyte cell line ATDC5, etc.
- the concentration of the BMP signaling pathway agonist to be added can be easily determined.
- BMP signaling pathway agonists include, for example, Smurf1 inhibitors, Chk1 inhibitors, and the like.
- Examples of compounds having the above activity include A-01 ([4-[[4-Chloro-3-(trifluoromethyl)phenyl]sulfonyl]-1-piperazinyl][4-(5-methyl-1H-pyrazol -1-yl)phenyl]methanone), PD 407824 (9-Hydroxy-4-phenyl-pyrrolo[3,4-c]carbazole-1,3(2H,6H)-dione) and derivatives thereof, etc. .
- the medium used in step (2) is not particularly limited as long as it contains a BMP signaling pathway active substance.
- Examples of the medium used in step (2) include the medium listed in step (1).
- the start time of step (2) is preferably 0.5 hours to 6 days from the start of culture in step (1), more preferably 0.5 hours. It is within 72 hours after 12:00, more preferably within 18 hours and within 60 hours, and may be within 24 hours and within 60 hours.
- a Wnt signaling pathway inhibitor When suspension culture is carried out, if the step (2) is started in the presence of a Wnt signaling pathway inhibitor during the above period, a non-neural epithelium-like tissue is formed on the surface of the cell aggregates, which very efficiently constitutes the nasal epithelium. A cell or its progenitor is formed.
- the start of step (2) is preferably This is the stage when 10% or more and 100% or less, more preferably 30% or more and 100% or less, still more preferably 50% or more and 100% or less of the cells in the surface layer form tight junctions with each other. Whether or not tight junctions are formed in cell aggregates can be determined by a technique such as immunostaining using an anti-ZO-1 antibody.
- Initiation of culture in the presence of the BMP signaling pathway agent in step (2) is performed using the culture vessel in which step (1) has been performed, and the above-described medium replacement operation (e.g., medium addition operation, half volume medium replacement operation, full volume medium exchange operation, etc.) may be performed, or the cells may be transferred to another culture vessel.
- medium replacement operation e.g., medium addition operation, half volume medium replacement operation, full volume medium exchange operation, etc.
- the period of culture in the medium containing the BMP signaling pathway active substance in step (2) can be set as appropriate.
- Cultivation time in step (2) is usually about 8 hours to 6 days, preferably about 10 hours to 108 hours, more preferably about 12 hours to 96 hours, still more preferably about 18 hours to 72 hours, most preferably about It is about 24 hours to 60 hours.
- the culture time in step (2) is usually about 8 hours to 6 days, preferably about 10 hours to 96 hours, more preferably about 12 hours to 72 hours, still more preferably 14 hours. It is about 48 hours, most preferably about 16 hours to 36 hours.
- step (2) the additives used in step (a) or step (1), such as Wnt signaling pathway inhibitors, Wnt signaling pathway active substances, TGF ⁇ signaling pathway inhibitors, TAK1 inhibitors, etc., are continuously added. It is also preferred to The Wnt signaling pathway inhibitor, Wnt signaling pathway active substance, or TGF ⁇ signaling pathway inhibitor added in step (2) may be different from the substance used in the previous steps, but is preferably the same. be. The concentration and type of additive can be adjusted as appropriate. The timing of addition of these substances may be simultaneous with the start of step (2), or may be different.
- step (3) the cells cultured in step (2) are cultured in the presence of at least one selected from the group consisting of FGF signaling pathway agonists and BMP signaling pathway inhibitors.
- cell aggregates may be cultured in suspension in step (3).
- cells may be adherently cultured in step (3).
- adhesion culture may be performed in step (3).
- suspension culture may be performed in step (3).
- step (3) at least one of the FGF signaling pathway active substance and the BMP signaling pathway inhibitory substance is added to the medium.
- cells may be cultured with both the FGF signaling pathway agonist and the BMP signaling pathway inhibitor added.
- the FGF signal transduction pathway agent is not particularly limited as long as it is a substance capable of enhancing the signal transduction pathway mediated by FGF (fibroblast growth factor).
- FGF signaling pathway agents include FGF proteins such as FGF1, FGF2 (sometimes referred to as bFGF), FGF3, FGF7, FGF8, and FGF10, anti-FGF receptor antibodies, and FGF partial peptides. be done. These substances may be used alone or in combination.
- FGF2 protein and FGF8 protein are available, for example, from Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
- FGF signaling pathway agent preferably contains at least one selected from the group consisting of FGF2, FGF3, FGF8 and FGF10, and variants thereof, more preferably FGF2, more preferably recombinant human FGF2 include.
- the concentration of the FGF signaling pathway agonist in the medium can be appropriately set within the range where the above effects can be achieved.
- FGF2 when used as an active substance of the FGF signaling pathway, it is usually about 1 pg/ml to about 100 ⁇ g/ml, preferably about 10 pg/ml. /ml to about 50 ⁇ g/ml, more preferably about 100 pg/ml to about 10 ⁇ g/ml, more preferably about 500 pg/ml to about 1 ⁇ g/ml, most preferably about 1 ng/ml to about 200 ng/ml. be done.
- an FGF signaling pathway active substance other than FGF2 when using an FGF signaling pathway active substance other than FGF2, it is preferably used at a concentration that exhibits the same FGF signaling pathway promoting activity as FGF2 at the above concentration.
- the FGF signaling pathway promoting activity of the substance to be added can be measured, for example, by a method such as a cell proliferation test using 3T3 cells.
- Heparin is available as the sodium salt from, for example, Fujifilm Wako Pure Chemical Industries.
- the concentration of heparin or heparan sulfate in the medium can be appropriately set within a range in which the above effects can be achieved.
- the concentration of sodium heparin in the medium is usually about 1 ng/ml to about 100 mg/ml, preferably about 10 ng/ml to about 50 mg/ml, more preferably about 100 ng/ml to about 10 mg/ml, still more preferably about 500 ng.
- FGF2 is bound to a modified FGF such as Thermostable FGF2 or a biodegradable polymer described in US Patent No. 8,772,460. It is also preferred to use FGF2 sustained release beads such as StemBeads FGF2.
- Thermostable FGF2 is available, for example, from HumanZyme. StemBeads FGF2 are available, for example, from StemCulture.
- BMP signaling pathway inhibitors are not limited as long as they can suppress signal transduction triggered by BMP family proteins.
- BMP signaling pathway inhibitors may be nucleic acids, proteins, or small organic compounds. Such substances include, for example, substances that inhibit BMP processing and extracellular secretion, substances that directly act on BMPs (e.g., proteins, antibodies, aptamers, etc.), and substances that suppress the expression of genes encoding BMPs (e.g., antisense oligos). nucleotides, siRNA, etc.), substances that inhibit binding between BMP receptors and BMPs, and substances that inhibit physiological activities caused by signal transduction by BMP receptors.
- BMP receptors include type I BMP receptors and type II BMP receptors.
- BMPR1A, BMPR1B, and ACVR are known as type I BMP receptors.
- type II BMP receptors include TGF-betaR-II, ActR-II, ActR-IIB, BMPR2, and MISR-II.
- BMP signaling pathway inhibitors include, for example, Noggin, Chordin, Follistatin, Gremlin, Inhibin, Twisted Gastrulation, Coco, and secretory proteins belonging to the DAN family. Since the BMP signaling pathway agent is added to the culture medium in the above step (2), the BMP signaling pathway in step (3) from the viewpoint of more effectively inhibiting the subsequent BMP signaling pathway
- the inhibitory substance is a substance that inhibits the signal transduction pathway after the secretion of BMP to the outside of the cell, such as a substance that inhibits the binding of BMP receptor and BMP, and inhibits the physiological activity caused by signal transduction by BMP receptor. It preferably contains a substance or the like, more preferably an inhibitor of the type I BMP receptor.
- BMP signaling pathway inhibitors include, for example, inhibitors of type I BMP receptors.
- Examples of compounds having the above activity include K02288 (3-[(6-Amino-5-(3,4,5-trimethoxyphenyl)-3-pyridinyl]phenol, 3-[6-Amino-5-( 3,4,5-trimethoxyphenyl)-3-pyridinyl]-phenol), Dorsomorphin (6-[4-[2-(1-Piperidinyl)ethoxy]phenyl]-3-(4-pyridinyl)pyrazolo[1,5- a]pyrimidine), LDN-193189 (4-[6-[4-(1-Piperazinyl)phenyl]pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl]quinoline dihydrochloride), LDN-212854 (5-[6 -[4-(1-Piperazin
- the BMP signaling pathway inhibitor is preferably a type I BMP receptor inhibitor, more preferably selected from the group consisting of K02288, Dorsomorphin, LDN-193189, LDN-212854, LDN-214117, ML347, DMH1 and DMH2. At least one, more preferably K02288.
- the concentration of the BMP signaling pathway inhibitor in the medium can be appropriately set within the range where the above-mentioned effects can be achieved.
- K02288 is used as the BMP transduction pathway inhibitor in step (3), it is usually about 1 nM to about 100 ⁇ M, preferably about 10 nM to about 50 ⁇ M, more preferably about 100 nM. Concentrations of from to about 50 ⁇ M, more preferably from about 500 nM to about 25 ⁇ M are used.
- LDN-193189 When LDN-193189 is used as a BMP transduction pathway inhibitor, it is usually used at a concentration of about 1 nM to about 100 ⁇ M, preferably about 10 nM to about 10 ⁇ M, more preferably about 25 nM to about 1 ⁇ M, still more preferably about 100 nM to about 500 nM. be done.
- LDN-212854 When LDN-212854 is used as a BMP transduction pathway inhibitor, it is usually used at a concentration of about 1 nM to about 100 ⁇ M, preferably about 10 nM to about 10 ⁇ M, more preferably about 25 nM to about 5 ⁇ M, still more preferably about 250 nM to about 3 ⁇ M. be done.
- ML-347 When ML-347 is used as a BMP transduction pathway inhibitor, it is usually used at a concentration of about 1 nM to about 100 ⁇ M, preferably about 10 nM to about 50 ⁇ M, more preferably about 100 nM to about 50 ⁇ M, still more preferably about 1 ⁇ M to about 25 ⁇ M. be done.
- DMH2 When used as a BMP transduction pathway inhibitor, it is usually used at a concentration of about 1 nM to about 100 ⁇ M, preferably about 10 nM to about 10 ⁇ M, more preferably about 25 nM to about 5 ⁇ M, still more preferably about 250 nM to about 3 ⁇ M.
- K02288 when using a BMP signaling pathway inhibitor other than K02288, it is desirable to use it at a concentration that exhibits the same BMP signaling pathway inhibitory activity as K02288 at the above concentration.
- the time to start step (3) is preferably 0.5 to 240 hours from the addition of the BMP signaling pathway agent in step (2), and more It is preferably from 6 hours to 192 hours, more preferably from 9 hours to 120 hours, and particularly preferably from 12 hours to 72 hours.
- the FGF signaling pathway agonist and the BMP signaling pathway inhibitor may be added at the same time or at different times in step (3).
- the FGF signaling pathway active substance may be added first, and then the BMP signaling pathway inhibitor may be added.
- the FGF signaling pathway active substance may be added first within 48 hours after the start of step (2), and then the BMP signaling pathway inhibitor may be added within 96 hours.
- the FGF signaling pathway agent and BMP signal within 72 hours to 120 hours after the start of step (2) A pathway inhibitor may be added.
- the start time of step (3) is when non-neural epithelial tissue is formed on the surface of the cell aggregates after the addition of the BMP signaling pathway agent in step (2). It is preferable to start before In order to investigate whether non-neural epithelial tissue is formed on the surface of cell aggregates, observe whether epithelial-like tissue is formed on the surface of cell aggregates with a microscope, etc., or prepare a section of cell aggregates and examine the site. It can be performed by techniques such as fluorescent immunostaining for markers expressed in non-neural epithelial tissues such as keratin, E-cadherin, and EpCAM.
- the above-described medium replacement operation (e.g., medium addition operation, half volume medium replacement operation, full volume medium replacement operation, etc.) may be performed using the culture vessel in which step (2) has been performed.
- the cell aggregates may be transferred to another culture vessel.
- the culture in step (3) may be performed, for example, until nasal epithelial cells differentiate into cell aggregates. Differentiation into nasal epithelial cells can be confirmed, for example, by immunostaining of cells, and cytokeratin 15, cytokeratin 18, marker genes of various cells constituting the nasal epithelium, and the like can be used as markers. .
- the culture in step (3) may be performed until olfactory nerve progenitor cells differentiate. Differentiation into olfactory nerve progenitor cells can be confirmed, for example, by immunostaining of cells, and Ebf2, NeuroD, Lhx2, Tuj1, NCAM, and Calretinin can be used as markers.
- the medium used in step (3) is not particularly limited, but in addition to the medium used in step (1), a medium containing Neurobasal supplemented with B27 supplement, a medium containing DMEM/F-12 supplemented with N2 supplement, Prepared media for nerve cell culture such as StemPro NSC SFM Serum-free human neural stem cell culture medium (manufactured by Thermo Fisher Scientific) can be mentioned.
- Additives used in any one of step (a), step (1) and step (2) in step (3) such as Wnt signaling pathway inhibitors, Wnt signaling pathway agonists, TGF ⁇ signaling pathway Subsequent addition of inhibitors, TAK1 inhibitors, etc. is also preferred.
- the Wnt signaling pathway inhibitor, Wnt signaling pathway active substance, TGF ⁇ signaling pathway inhibitor and TAK1 inhibitor added in step (3) are added in step (a), step (1) and step (2) respectively. It may be different from the material used in one step, but is preferably the same. The concentration and type of additive can be adjusted as appropriate.
- the additive used in step (3) preferably contains a Wnt signaling pathway inhibitor, more preferably a Wnt signaling pathway agonist, a TGF ⁇ signaling pathway inhibitor and a TAK1 inhibitor.
- step (3) is also preferably carried out in the presence of an EGF signaling pathway agonist.
- EGF signaling pathway agonists are substances capable of enhancing the signaling pathway mediated by epidermal growth factor (EGF). Examples of EGF signaling pathway agonists include EGF, TGF- ⁇ , AR (amphiregulin), EPG, HB-EGF (heparin-binding EGF-like growth factor), BTC (betacellulin), and EPR (epiregulin).
- EGF proteins are available, for example, from Thermo Fisher Scientific and PrimeGene.
- HB-EGF protein is available from, for example, R&D Systems.
- EGF signaling pathway agonists preferably include EGF.
- the concentration of the EGF signaling pathway agonist in the medium can be appropriately set within the range where the above effects can be achieved.
- EGF is used as the EGF signaling pathway agonist, it is generally about 1 pg/ml to about 100 ⁇ g/ml, preferably about 10 pg/ml to about 50 ⁇ g/ml, more preferably about 100 pg/ml to about 10 ⁇ g/ml, and Preferably, concentrations of about 500 pg/ml to about 1 ⁇ g/ml, most preferably about 1 ng/ml to about 200 ng/ml are used.
- EGF signaling pathway active substance other than EGF it is preferably used at a concentration that exhibits an EGF signaling pathway promoting activity equivalent to that of EGF at the above concentrations.
- step (3) is also preferably performed in the presence of an agent acting on the Shh signaling pathway.
- the Shh signaling pathway active substance those described in the above step (a) and the like can be used.
- the Shh signaling pathway agonist in step (3) may be the same as or different from that used in step (a), but is preferably the same substance.
- the Shh signaling pathway agonist in step (3) preferably includes at least one selected from the group consisting of SAG, Purmorphamine and GSA-10, more preferably SAG.
- the concentration of the Shh signaling pathway active substance in the medium can be appropriately set within a range in which the above effects can be achieved.
- SAG is generally about 1 nM to about 10 ⁇ M, preferably about 10 nM to about 7 ⁇ M, more preferably about 50 nM to about 5 ⁇ M, even more preferably about 100 nM to about 3 ⁇ M, particularly preferably about 300 nM to about 2 ⁇ M in step (3). , most preferably at a concentration of about 500 nM to about 1.5 ⁇ M.
- an active substance of the Shh signaling pathway other than SAG it is desirable to use it at a concentration that exhibits Shh signaling promotion activity equivalent to that of SAG at the above concentrations.
- step (3) is also preferably performed in the presence of a retinoic acid signaling pathway agent.
- Retinoic acid transduction pathway agents include, for example, substances that bind to retinoic acid receptor (RAR) or retinoid X receptor (RXR) and activate downstream transcription.
- Examples of compounds having the above effects include all-trans retinoic acid, isotretinoin, 9-cis retinoic acid, TTNPB (4-[(E)-2-[(5,5,8,8-Tetramethyl-5 ,6,7,8-tetrahydronaphthalene)-2-yl]-1-propenyl]benzoic acid), Ch55 (4-[(E)-3-(3,5-di-tert-butylphenyl)-3-oxo- 1-propenyl]benzoic acid), EC19 (3-[2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)ethyl]benzoic acid), EC23 (4- [2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)ethyl)-benzoicacid), Fenretinide (4-hydroxyphenylretinamide), Acitretin ((all
- the retinoic acid transduction pathway agonist in step (3) preferably contains EC23.
- the concentration of the retinoic acid transduction pathway active substance in the medium is not particularly limited as long as the above effects can be achieved.
- the concentration of EC23 is about 10 pM to about 30 ⁇ M, preferably about 100 pM to about 20 ⁇ M, more preferably about 10 nM to about 10 ⁇ M, and still more preferably. about 100 nM to about 5 ⁇ M.
- a retinoic acid transduction pathway active substance other than EC23 it is preferably used at a concentration that exhibits retinoic acid transduction pathway activity equivalent to that of EC23 at the concentration described above.
- step (3) is also preferably performed in the presence of a Notch signaling pathway inhibitor.
- the Notch signaling pathway is a signal activated by direct interaction between the Notch protein, which is a receptor expressed on the cell membrane, and the Notch ligand (Delta, Jagged, etc.) expressed on the membrane of adjacent cells. Represents the transfer pathway.
- Notch proteins undergo stepwise processing, and intracellular domains excised on the membrane are transported into the nucleus to control expression of downstream genes.
- the Notch signaling pathway inhibitor is not particularly limited as long as it can suppress signal transduction mediated by Notch.
- Notch signaling pathway inhibitors may be nucleic acids, proteins, or small organic compounds.
- Such substances include, for example, functionally deficient Notch receptors and ligands, substances that inhibit Notch processing (S1 cleavage), substances that inhibit glycosylation of Notch and Notch ligands, substances that inhibit cell membrane translocation, Notch Substances that inhibit intracellular domain (NICD) processing (S2 cleavage, S3 cleavage) ( ⁇ -secretase inhibitors), substances that degrade NICD, substances that inhibit NICD-dependent transcription, and the like can be mentioned.
- Notch signaling pathway inhibitors may be nucleic acids, proteins, or small organic compounds.
- Such substances include, for example, functionally deficient Notch receptors and ligands, substances that inhibit Notch processing (S1 cleavage), substances that inhibit glycosylation of Notch and Notch ligands
- Notch signaling pathway inhibitors Compounds well known to those skilled in the art can also be used as Notch signaling pathway inhibitors.
- Examples of compounds having activity as Notch signaling pathway inhibitors include DAPT (N-[N-(3,5-difluorophenacetyl)-l-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester), DBZ ((2S)- 2-[[2-(3,5-difluorophenyl)acetyl]amino]-N-[(7S)-5-methyl-6-oxo-7H-benzo[d][1]benzazepin-7-yl]propanamide) , MDL28170 (benzyl N-[(2S)-3-methyl-1-oxo-1-[[(2S)-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl]amino]butan-2-yl]carbamate), FLI-06 (cyclohexyl 2,7,7-tri
- the concentration of the Notch signal inhibitor in the medium is not particularly limited as long as the above effects can be achieved.
- the concentration of DAPT is, for example, about 100 pM to about 50 ⁇ M, preferably about 1 nM to about 30 ⁇ M, more preferably about 100 nM to about 20 ⁇ M, still more preferably. is about 1 ⁇ M to about 10 ⁇ M.
- a Notch signaling pathway inhibitor other than DAPT it is preferably used at a concentration that exhibits Notch signaling pathway inhibitory activity equivalent to that of DAPT at the above concentration.
- the Hippo/YAP signaling pathway refers to a kinase cascade composed of Mst1/2, LATS1/2, etc., involved in cell proliferation, apoptosis, control of stem cell self-renewal, organ size regulation, etc.
- Signal transduction pathways controlled by the transcription factors YAP/TAZ controlled by the transcription factors YAP/TAZ.
- those skilled in the art have the ability to inhibit the Hippo pathway and promote dephosphorylation and nuclear translocation of YAP/TAZ proteins.
- YAP/TAZ is a substance that activates the Hippo pathway and promotes phosphorylation of YAP/TAZ protein and degradation by the ubiquitin/proteosome system. This can be done by adding a substance or the like that suppresses the transfer that occurs.
- Hippo pathway inhibitor is not particularly limited as long as it inhibits the upstream kinase cascade or enhances the transcription/cell response of the downstream target gene induced by YAP/TAZ.
- Hippo pathway inhibitors may be nucleic acids, proteins, or small organic compounds.
- Hippo pathway inhibitors include, for example, growth factors, cytokines, sphingosine-1-phosphate receptor 2 (S1PR2) activators, mammalian sterile 20-like kinase (MST) 1/2 inhibitors, large tumor suppressor kinases 1 and 2 (LATS1/2) inhibitors, annexin A2 (ANXA2) binding inhibitors, TAZ activators and the like.
- substances having the above effects include CYM-5520 (1-[2-(1-benzyl-2,5-dimethylpyrrol-3-yl)-2-oxoethyl]-6-oxopyridine-3-carbonitrile), XMU-MP-1(4-[(2,9-dimethyl-8-oxo-6-thia-2,9,12,14-tetrazatricyclo[8.4.0.03,7]tetradeca-1 (14) ,3(7),4,10,12-pentaen-13-yl)amino]benzenesulfonamide), PY-60 (5-phenyl-N-(3-(thiazol-2-yl)propyl)isoxazole-3-carboxamide ), GA-017 ([(E)-2-(1-(2,4-dihydroxy-3-methylphenyl)propylidene)-N-(3-hydroxybenzyl)hydrazine-1-carboxamide]), Lats-IN-1 (N-(3-(
- the Hippo pathway activator is not particularly limited as long as it suppresses downstream gene transcription/cell response induced by YAP/TAZ.
- the Hippo pathway activator may be any of nucleic acids, proteins, and low-molecular-weight organic compounds.
- Hippo pathway activators include, for example, TEAD inhibitors, YAP-TEAD binding inhibitors, AMPK activators, YAP/TAZ transcription activity inhibitors, pseudo-activators of intercellular and extracellular matrix adhesion stimulation, and the like. are mentioned.
- Substances having the above action include, for example, Verteporfin (3-[(23S,24R)-14-ethyl-22,23-bis(methoxycarbonyl)-5-(3-methoxy-3-oxopropyl)-4,10 , 15,24-tetramethyl-25,26,27,28-tetrazahexacyclo[16.6.1.13,6.18,11.113,16.019,24] octacosa-1,3,5,7,9 , 11(27), 12, 14, 16, 18(25), 19, 21-dodecaen-9-yl] propanoic acid; )-9-(3-methoxy-3-oxopropyl)-4,10,15,24-tetramethyl-25,26,27,28-tetrazahexacyclo [16.6.1.13, 6.18, 11.113, 16.019,24]octacosa-1,3,5,7,9,11(27),12,14,16,18(25
- step (3) is also preferably performed in the presence of a Wnt signaling pathway agent.
- concentration of the Wnt signaling pathway active substance in the medium can be appropriately set within a range in which the above effects can be achieved.
- CHIR99021 when CHIR99021 is used as a Wnt signaling pathway agonist, it is usually about 10 pM to about 10 mM, preferably about 100 pM to about 1 mM, more preferably about 1 nM.
- Concentrations of from to about 100 ⁇ M, more preferably from about 10 nM to about 30 ⁇ M, most preferably from about 100 nM to about 3 ⁇ M are used.
- Wnt signaling pathway active substance other than CHIR99021 it is preferably used at a concentration that exhibits the same Wnt signaling pathway promoting activity as CHIR99021 at the above concentration.
- Wnt signaling pathway promoting activity can be determined using, for example, a Topflash reporter assay using HEK293 cells.
- an activin/TGF- ⁇ signaling pathway agonist is a substance capable of enhancing the signaling pathway mediated by activin/TGF- ⁇ .
- Activin/TGF- ⁇ signaling pathway agonists include, for example, recombinant proteins such as activin and TGF- ⁇ , and substances that activate the activin/TGF- ⁇ signaling pathway such as Alantolactone. These substances may be used alone or in combination.
- activin/TGF- ⁇ signaling pathway agonists include, for example, substances capable of inducing hemoglobin expression in cells such as human chronic myelogenous leukemia-derived cell line K562.
- human recombinant activin manufactured by R&D Systems
- it is usually 1 pg/ml to 1 mg/ml, preferably 100 pg/ml to 10 ⁇ g/ml, more preferably 1 ng/ml. Concentrations ranging from ml to 100 ng/ml are used.
- an activin/TGF- ⁇ signaling pathway agonist other than human recombinant activin it may be added at a concentration that exhibits the same physiological activity as the human recombinant activin added concentration, which is well known to those skilled in the art.
- the activin/TGF- ⁇ signaling pathway inhibitor is added in the steps prior to step (3), for example, after collecting the cell aggregates from the cultureware, the activin/TGF- ⁇ signaling pathway inhibitor is added. It is preferable to add a medium containing activin/TGF- ⁇ signal transduction pathway after washing the aggregates several times with a free medium, buffer solution, etc., and transferring the cell aggregates to new cultureware.
- step (3) adhesion between cell aggregates is suppressed in step (3) and subsequent steps to protect cells and improve the production efficiency of nasal epithelial-like tissue by simulating the physical environment of the living body.
- cell aggregates can also be cultured in a viscous medium containing a thickening agent.
- the means for imparting viscosity to the medium is not particularly limited, it can be carried out, for example, by adding a substance generally known as a thickening agent to the medium at an appropriate concentration.
- a thickening agent any one that can impart the appropriate viscosity to the medium and does not adversely affect cells (no cytotoxicity) in the concentration range that can impart the viscosity Thickeners can also be used.
- Thickeners include, for example, pectin, guar gum, xanthan gum, tamarind gum, carrageenan, locust bean gum, gellan gum, dextrin, diutane gum, starch, tara gum, alginic acid, curdlan, sodium caseinate, carob bean gum, chitin, chitosan, glucosamine, Pullulan, dietary fiber and chemically modified substances or derivatives thereof, cellulose, polysaccharides such as agarose, methylcellulose, ethylcellulose, hydroxyethylcellulose, hydroxypropylcellulose, hydroxyethylmethylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, hydroxyethylethylcellulose, hydroxypropylethylcellulose, ethyl Ethers of polysaccharides such as hydroxyethyl cellulose, dihydroxypropyl cellulose, hydroxyethyl hydroxypropyl cellulose, polyacrylamide, polyethylene oxide and polyvinylpyrrol
- these thickening agents can be used alone or as a mixture of several thickening agents.
- Copolymers of water-soluble polymers used as thickeners may also be used.
- methylcellulose, polyethylene glycol, polyvinylpyrrolidone, carboxymethylcellulose or mixtures thereof, more preferably methylcellulose can be used.
- a viscous medium usually has a viscosity of 100 mPa ⁇ S or more, preferably 250 mPa ⁇ S or more, more preferably 500 mPa ⁇ S or more, and still more preferably 1000 mPa ⁇ S or more under conditions of 37° C., which is preferably used as a culture environment. What has is used.
- the viscosity can be measured using a capillary viscometer, a falling ball viscometer, a rotational viscometer, a vibration viscometer, or the like, based on Japanese Industrial Standards (JIS), for example.
- JIS Japanese Industrial Standards
- the concentration of the thickening agent added to the medium can be adjusted as appropriate as long as it can impart viscosity and does not cause damage to cells.
- methyl cellulose (4000 cP) is used as a thickener, it is usually used at a concentration of 0.1% to 10%, preferably 0.3% to 7.5%, more preferably 0.5% to 5%.
- step (3) and subsequent steps the adhesion and aggregation of cell aggregates is suppressed, the cells are protected from physical stimuli such as shear force, and the physical environment of the living body is simulated.
- a substance having surface activity can also be added.
- fatty acids such as arachidonic acid, linoleic acid, linoleic acid, myristic acid, oleic acid, palmitic acid, palmitoic acid, and stearic acid, surfactants such as Pluronic F-68 and Tween 80, and cholesterol.
- the size of the cell clusters produced in step (3) and subsequent steps is made uniform, and adhesion between the formed cell clusters is prevented from the viewpoint of controlling the efficiency of differentiation induction. It is also desirable to take such measures.
- means for realizing the above include the addition of lysophospholipids described in WO 2016/121737, the addition of thrombin receptor agonists described in WO 2019/131941, and WO 2016/121840. Examples include, but are not limited to, means such as addition of the inhibitors of cell-to-cell adhesion described above. Another aspect of preventing adhesion between cell clusters is the addition of inhibitors to the Rho signaling pathway that regulates cell adhesion.
- a Rho signaling pathway inhibitor that prevents adhesion between cell masses is preferably a ROCK inhibitor.
- the ROCK inhibitor Y-27632 or Chroman 1 is added for the purpose of preventing adhesion between cell clusters, it can be added under the same conditions as when used as a cell protective substance.
- the ROCK inhibitor Y-27632 is added, it is added to the culture environment at a concentration of usually 10 nM to 10 mM, preferably 100 nM to 1 mM, more preferably 1 ⁇ M to 100 ⁇ M.
- the ROCK inhibitor Chroman 1 is added, it is added to the culture environment at a concentration of usually 10 pM to 1 mM, preferably 100 pM to 100 ⁇ M, more preferably 1 nM to 10 ⁇ M.
- the formed cell aggregates are subjected to adhesion culture. It is also preferred to When transitioning from suspension culture to adherent culture, the cell aggregates may be left to stand on a cell culture dish to adhere to each other, or a cutting treatment, cell dispersion treatment, or the like may be performed to reduce the size of the cell aggregates.
- a suspension of aggregates or isolated cells may be prepared and allowed to adhere after seeding.
- the cultureware for adhering cells it is possible to use either the flat cell culture dish described above or a thin film-like cell cultureware having substance permeability such as Transwell.
- the cultureware may be coated with a basement membrane preparation, an extracellular matrix such as laminin, a synthetic cell adhesion molecule such as poly-D-lysine, or the like to promote cell adhesion.
- Air liquid interface culture refers to culturing under conditions in which at least one surface of cells or tissues is exposed to, or very close to, the atmosphere.
- cells or tissues are cultured on a porous membrane or in a culture insert, the culture medium inside the insert (lumen side) is removed, and the well outside the insert
- a method of culturing only with a culture solution a method of placing a hydrogel such as agarose in a culture dish, placing cells or tissues on it, and culturing under conditions that are exposed from the medium in the dish and do not dry, and After embedding in agarose or the like, cell aggregates are thinly sliced with a vibrating blade microtome or the like, and the thin slices are cultured in cell inserts.
- Oxygen-permeable membranes or plates such as PDMS can also be placed over the cells, tissues, or the like to control the exposure conditions, primarily to reduce the toxicity of atmospheric exposure due to oxygen.
- the gas-liquid interface culture method as described above is described in, for example, Respiratory research 18.1 (2017): 195, Sci Rep 6, 21472, Nat Neurosci. 2019 Apr;22(4):669-679.
- step (3) and subsequent steps may include a step of embedding the cell aggregates in a gel and culturing them.
- gels include gels using agarose, methylcellulose, collagen, Matrigel, etc. Matrigel is preferably used.
- step (3) and subsequent steps of culturing cells by embedding in a gel the cell aggregates may be embedded as they are, or the cells after dispersion and isolation may be seeded in the gel. may Specific cell tumors such as basal cells may be sorted using a cell sorter or the like, and then seeded.
- co-culturing with cells other than nasal epithelium such as fibroblasts, mesenchymal cells, and vascular cells, can also be carried out.
- Gel-embedded culture as described above is, for example, Nature 501, 373-379 (2013), Nature, 499, 481-484 (2013), Nat Protoc 14, 518-540 (2019), Genes 2020, 11, 603, etc. can be implemented by referring to
- step (3) and subsequent steps it is also preferable to implement a culture method in which cells are physically shaken for the purpose of improving nutrition and oxygen supply to cells and improving substance exchange.
- culture methods include methods other than stationary culture such as shaking culture, rotary culture, and agitation culture.
- the means for performing shaking culture, rotary culture, stirring culture, etc. is not particularly limited. This can be done by putting down A person skilled in the art can appropriately set parameters such as the speed of shaking culture, rotation culture, and agitation culture within a range that does not cause damage to the cells.
- the speed is, for example, 5 to 60 rpm, preferably 5 to 40 rpm, more preferably 5 to 20 rpm.
- Shaking speed range can be set.
- the shaking speed range is set in the range of, for example, 15 to 60 rpm, preferably 15 to 50 rpm, more preferably 15 to 45 rpm. It is possible.
- the shaking speed range is set in the range of, for example, 5 to 50 rpm, preferably 5 to 40 rpm, more preferably 5 to 30 rpm. It is possible.
- a spinner flask e.g., 3152, manufactured by Corning
- the culture is carried out at a rotational speed that does not allow the cell aggregates to visually settle.
- Cultivation can also be carried out using a three-dimensional rotary floating culture apparatus (for example, CellPet CUBE, manufactured by J-Tech; Clinostar, manufactured by Celvivo). From the viewpoint of suppressing physical damage to cells such as friction, it is also preferable to culture the cell aggregates embedded in the gel with shaking, rotation, or agitation.
- a three-dimensional rotary floating culture apparatus for example, CellPet CUBE, manufactured by J-Tech; Clinostar, manufactured by Celvivo.
- growth factor to be added is not particularly limited as long as the above purpose can be achieved.
- Growth factors used for such purposes include insulin-like growth factor (IGF), nerve growth factor (NGF), brain-derived neurotrophic factor (BDNF), Neurotrophin 3, neurotrophin 4/5, ciliary neurotrophic factor (CNTF), vascular endothelial growth factor (VEGF), pigment epithelium-derived factor : PEDF), hepatocyte growth factor (HGF), and the like.
- IGF insulin-like growth factor
- NEF nerve growth factor
- BDNF brain-derived neurotrophic factor
- CNTF ciliary neurotrophic factor
- VEGF vascular endothelial growth factor
- PEDF pigment epithelium-derived factor
- HGF hepatocyte growth factor
- a platelet-derived growth factor receptor agonist such as platelet-derived growth factor (PDGF) is added to the medium. It is also preferred to add in.
- PDGF has four types of genes, A, B, C, and D, and functions as a ligand by forming a homozygous dimer of AA, AB, BB, CC, and DD or a heterodimer of a specific combination.
- the PDGF receptor has two types of genes, ⁇ and ⁇ , and functions as a receptor by forming homo- or hetero-dimers of combinations of ⁇ , ⁇ , and ⁇ .
- the platelet-derived growth factor receptor agonist used in the present invention preferably has an action on PDGFR ⁇ or PDGFR ⁇ .
- the platelet-derived growth factor receptor agonist more preferably contains at least one selected from the group consisting of PDGF-AB, PDGF-BB, PDGF-CC and PDGF-DD, more preferably PDGF-BB and PDGF - including at least one selected from the group consisting of CC; PDGF-AB, PDGF-BB, PDGF-CC and PDGF-DD are available as recombinant proteins from R&D Systems, GenScript, etc.
- step (3) and subsequent steps it is also preferable to culture in a high-oxygen atmosphere from the viewpoint of suppressing cell death and promoting cell growth.
- High-oxygen conditions in the culture process can be realized, for example, by connecting an oxygen cylinder to an incubator for culturing cells and artificially supplying oxygen.
- the oxygen concentration for such purposes is usually 25% to 80%, more preferably 30% to 60%.
- cultureware with high gas exchange efficiency can be used from the viewpoint of increasing the amount of oxygen supplied to the medium in which the cell aggregates are cultured.
- examples of such cultureware include a cell culture dish, a Lumox dish with a gas-permeable film on the bottom of the plate (manufactured by Sarstedt Co., Ltd.), and a VECELL 96-well plate (manufactured by Bethel Co., Ltd.). It is also preferable to use in combination with the above-described culture under high oxygen concentration conditions.
- a cell protective agent can be added to the medium from the viewpoint of maintaining the structure of the epithelial tissue in the cell aggregates.
- Cell protective agents used in step (3) and subsequent steps include the above-mentioned FGF signaling pathway agents, heparin, ROCK inhibitors, basement membrane preparations, myosin inhibitors, polyamines, ISR inhibitors, and caspase inhibitors. agents, sera, and serum substitutes.
- myosin inhibitors include blebbistatin, which is a non-muscle myosin II ATPase inhibitor, ML-7, ML-9, W-7, which are inhibitors of myosin light chain kinase (MLCK), MLCK inhibitor peptide 18, and Derivatives of these and the like are included.
- the cytoprotective agent to be added may be the same as or different from that added in step (1), but is preferably the same.
- Preferred cytoprotective agents include ROCK inhibitors.
- the concentration is usually 10 nM to 10 mM, preferably 100 nM to 1 mM, more preferably 1 ⁇ M to 100 ⁇ M. to the culture environment.
- the ROCK inhibitor Chroman 1 is added, it is added to the culture environment at a concentration of usually 10 pM to 1 mM, preferably 100 pM to 100 ⁇ M, more preferably 1 nM to 10 ⁇ M.
- Blebbistatin a non-muscle myosin II ATPase inhibitor
- cytoprotective agent it is usually added to the culture environment at a concentration of 10 nM to 10 mM, preferably 100 nM to 1 mM, more preferably 1 ⁇ M to 100 ⁇ M. Added.
- substances other than cell protective agents that have the effect of maintaining the structure of epithelial tissue can be added.
- substances that promote cell adhesion include substances that promote cell adhesion, substances that promote synthesis of basement membrane components, substances that inhibit decomposition of basement membrane components, and the like.
- Substances that promote cell adhesion may be those that promote cell-to-cell adhesion, cell-to-basement membrane adhesion, cell-to-cultureware adhesion, or the like, and production of factors involved in cell adhesion.
- Substances that promote cell adhesion include, for example, adhesamine, adhesamine-RGDS derivatives, pyrintegrin, biotin tripeptide-1, acetyltetrapeptide-3, RGDS peptide and derivatives thereof.
- Substances that promote the synthesis of basement membrane components include, for example, ascorbic acid derivatives. Examples of ascorbic acid derivatives include sodium ascorbyl phosphate, magnesium ascorbyl phosphate, ascorbyl 2-glucoside, 3-O-ethylascorbic acid, ascorbyl tetrahexyldecanoate, ascorbyl palmitate, ascorbyl stearate, and ascorbyl-2.
- the concentration is usually 10 ⁇ g/ml or more and 1000 ⁇ g/ml or less, preferably 30 ⁇ g/ml or more and 500 ⁇ g/ml or less. , and more preferably added to the culture environment at a concentration of 50 ⁇ g/ml or more and 300 ⁇ g/ml or less.
- ascorbic acid, ascorbic acid derivatives, etc. they may be added so that the above concentration and molar equivalent are approximately the same.
- step (3) and subsequent steps it is also preferable to add a substance that has the effect of reducing oxidative stress from the viewpoint of promoting the survival of cells that constitute the nasal epithelium or olfactory epithelium.
- substances having the above activity include antioxidant substances, substances having free radical scavenger action, NADPH oxidase inhibitors, cyclooxygenase inhibitors, lipoxygenase (LOX) inhibitors, superoxide dismutase (SOD)-like substances, and Nrf2 activators. agents and the like.
- substances having the above activity include ascorbic acid, N-acetyl-L-cysteine, ( ⁇ )- ⁇ -tocopherol acetate, apocynin (4′-Hydroxy-3′-methoxyacetophenone), nicotinamide, taurine (2- aminoethanesulfonic acid), IM-93 (1-Isopropyl-3-(1-methyl-1H-Indole-3-yl)-4-(N,N-dimethyl-1,3-propanediamine)-1H-Pyrrole- 2,5H-dione), Caffeic Acid (3,4-Dihydroxycinnamic Acid), Celastrol (3-Hydroxy-24-nor-2-oxo-1(10), 3,5,7-friedelatetraen-29-oic Acid; Tripterin), Ebselen (2-Phenyl-1,2-benzoisoselenazol-3(2H)-one), (-)-Epigallocatechin
- Reagents already prepared for cell culture can also be used.
- the substance having the effect of reducing oxidative stress used in the present invention preferably contains at least one selected from the group consisting of ascorbic acid, N-acetyl-L-cysteine and derivatives thereof.
- Ascorbic acid for example, as its derivative, ascorbic acid diphosphate, can be added to the medium at a concentration of 1 M to 1 nM, preferably 100 mM to 10 nM, more preferably 10 mM to 100 nM, still more preferably 3 mM to 1 ⁇ M. .
- N-acetyl-L-cysteine can be added to the medium at a concentration of, for example, 1 nM to 1 M, preferably 10 nM to 100 mM, more preferably 100 nM to 10 mM, still more preferably 1 ⁇ M to 5 mM.
- step (3) and subsequent steps from the viewpoint of promoting the survival of cells constituting the nasal epithelium or olfactory epithelium, inhibitors of stress response signaling pathways (substances that inhibit intracellular signaling mechanisms against stress) are added. It is also preferred to The stress-activated protein kinase pathway (SAPK) is one of the major intracellular signaling mechanisms for stress. Inhibitors of the stress responsive MAP kinase pathway include e.g.
- MAP3K inhibitors MAP2K inhibitors, ASK inhibitors, MEK inhibitors, Akt inhibitors, Rho family kinase inhibitors, JNK inhibitors, p38 inhibitors, MSK inhibitors, STAT inhibitors, NF- ⁇ B inhibitors, CAMK inhibitors and the like.
- MEK inhibitors include selumetinib (AZD6244, 6-(4-bromo-2-chloroanilino)-7-fluoro-N-(2-hydroxyethoxy)-3-methylbenzimidazole-5-carboxamide), mirdametinib (PD0325901, N [(2R)-2,3-dihydroxypropoxy]-3,4-difluoro-2-(2-fluoro-4-iodoanilino) benzamide), Trametinib (GSK1120212, N-[3-[3-cyclopropyl-5-(2 -fluoro-4-iodoanilino)-6,8-dimethyl-2,4,7-trioxopyrido[4,3-d]pyrimidin-1-yl]phenyl]acetamide), U0126 (1,4-diamino-2,3 -dicyano-1,4-bis(2-aminophenylthio)butadiene),
- Examples of p38 inhibitors include SB203580 (4-[4-(4-fluorophenyl)-2-(4-methylsulfinylphenyl)-1H-imidazol-5-yl]pyridine), Doramapimod (BIRB 796, 1-[5- tert-butyl-2-(4-methylphenyl)pyrazol-3-yl]-3-[4-(2-morpholin-4-ylethoxy)naphthalen-1-yl]urea), SB202190 (FHPI, 4-[4- (4-fluorophenyl)-5-pyridin-4-yl-1H-imidazol-2-yl]phenol), ralimetinib dimesylate (5-[2-tert-butyl-4-(4-fluorophenyl)-1H-imidazol-5 -yl]-3-(2,2-dimethylpropyl)imidazo[4,5-b]pyridin-2-amine; methanesulfonic acid), VX-7
- JNK inhibitors include those described in step (1).
- the substance that inhibits the intracellular signaling mechanism against stress used in the present invention is preferably one or more selected from the group consisting of MEK inhibitors, p38 inhibitors, and JNK inhibitors.
- SB203580 When SB203580 is used as the p38 inhibitor, it can be added to the medium at a concentration of generally 1 nM to 1 mM, preferably 10 nM to 100 ⁇ M, more preferably 100 nM to 10 ⁇ M, and even more preferably 500 nM to 5 ⁇ M.
- PD0325901 When PD0325901 is used as the MEK inhibitor, it can be added to the medium at a concentration of generally 1 nM to 1 mM, preferably 10 nM to 100 ⁇ M, more preferably 100 nM to 10 ⁇ M, still more preferably 500 nM to 5 ⁇ M.
- JNK-IN-8 When JNK-IN-8 is used as the JNK inhibitor, it can be added to the medium at a concentration similar to that described in step (1).
- other MEK inhibitors, p38 inhibitors, and JNK inhibitors it is preferable to add them at a concentration having an inhibitory activity equivalent to that of the above inhibitors.
- step (4) the cells cultured in step (3) are further cultured to obtain cells constituting nasal epithelium.
- cells are treated in the absence of at least one, preferably at least two selected from the group consisting of Wnt signaling pathway inhibitors, FGF signaling pathway agonists, and BMP signaling pathway inhibitors.
- a preferred form of step (4) is culturing the cells in the absence of Wnt signaling pathway inhibitors, FGF signaling pathway agonists and BMP signaling pathway inhibitors.
- step (4) is FGF signaling pathway inhibitor, Shh signaling pathway agonist, BMP signaling pathway agonist, Wnt signaling pathway agonist, Notch signaling pathway inhibitor, activin/TGF- ⁇ signal Cells are cultured in the presence of at least one selected from the group consisting of transduction pathway agents and retinoic acid signaling pathway agents.
- Step (4) is preferably performed in the absence of at least two selected from the group consisting of Wnt signaling pathway inhibitors, FGF signaling pathway agonists and BMP signaling pathway inhibitors, and FGF signaling pathway inhibitors, from the group consisting of Shh signaling pathway agonists, BMP signaling pathway agonists, Wnt signaling pathway agonists, Notch signaling pathway inhibitors, activin/TGF- ⁇ signaling pathway agonists and retinoic acid signaling pathway agonists Cells are cultured in the presence of at least one of choice.
- cell aggregates may be cultured in suspension in step (4).
- cells When cells are cultured in suspension in step (3), cell aggregates may be cultured in suspension in step (4).
- cells When cells are adherently cultured in step (3), cells may be adherently cultured in step (4).
- adhesion culture After suspension culture in step (3), adhesion culture may be performed in step (4). After adhesion culture in step (3), suspension culture may be performed in step (4).
- step (3) It is necessary to remove the above substances that may be added in the culture environment from the culture environment.
- Operations for this purpose include, for example, a half-volume medium replacement operation and a full-volume medium replacement operation.
- the medium exchange operation described above may be performed multiple times a day, preferably multiple times (for example, 2 to 3 times) within one hour.
- physiological saline, KSR, growth factors, etc. are added. You may use the culture medium etc. which do not contain a substance.
- the cells are subjected to another sterilized Examples include an operation of collecting in a container (15 ml tube, petri dish for floating culture, etc.), washing with medium or physiological saline, etc., and then transferring to a culture environment in the absence of at least one of the above substances.
- the culture vessel used for culture after transfer may be the same one (96-well plate, etc.) used up to step (3), or another vessel (suspension culture dish, etc.).
- a medium exchange operation In carrying out suspension culture in the absence of at least one selected from the group consisting of Wnt signaling pathway inhibitors, FGF signaling pathway active substances and BMP signaling pathway inhibitors in step (4), a medium exchange operation or From the viewpoint of avoiding the complicated operation of transferring cell aggregates, use a three-dimensional cell culture vessel that can replace the medium of the entire plate at once while cell aggregates remain in each well. is also preferred.
- step (4) the cells obtained in step (3) are treated in the absence of at least one selected from the group consisting of Wnt signaling pathway inhibitors, FGF signaling pathway agonists and BMP signaling pathway inhibitors.
- Suspension culture improves the formation efficiency of upper respiratory tract-like tissue, and a cell population with an improved percentage of cells constituting the nasal epithelium can be obtained.
- the step (4) After a certain degree of differentiation of non-neural epithelial cells has occurred.
- the period is from 0.5 hours to 60 days, preferably from 24 hours to 45 days, more preferably from 3 days to 30 days, from the start of step (3).
- the culture period in step (4) can be set as appropriate.
- the culture time in step (4) is usually about 8 hours to 200 days, preferably about 10 hours to 180 days, more preferably about 12 hours to 150 days, still more preferably about 14 hours to 120 days, most preferably about 14 hours to 120 days. It is about 20 days to 100 days.
- step (4) is also preferably performed in the presence of an inhibitor of the FGF signaling pathway.
- the FGF signaling pathway inhibitor is not particularly limited as long as it can suppress signal transduction mediated by FGF, and may be any of nucleic acids, proteins, and low-molecular-weight organic compounds. Examples of such substances include substances that directly bind to and trap FGF, substances that inhibit the kinase activity of FGF receptors, substances that inhibit intracellular signaling activated by FGF, and gene expression induced by FGF stimulation.
- Substances that inhibit Substances having the above effects include, for example, anti-FGF antibody, GP369 (anti-FGFR2 antibody), SU5402 (3-[4-Methyl-2-[(2-oxo-1H-indol-3-ylidene)methyl] -1H-pyrrol-3-yl]propanoic acid), BGJ398 (3-(2,6-Dichloro-3,5-dimethyloxyphenyl)-1-[6-[[4-(4-ethylpiperazin-1-yl)phenyl ]amino]pyrimidin-4-yl]-1-methylurea), PD173074 (1-(Tert-Butyl)-3-(2-((4-(diethylamino)butyl)amino)-6-(3,5-dimethylphenyl )pyrido[2,3-d]pyrimidin-7-yl)urea), AZD4547 (rel-N-[5-[2-
- the concentration of the FGF signaling pathway inhibitor can be appropriately set within a range that allows efficient production of the cells that make up the nasal epithelium.
- the concentration of the FGF signaling pathway inhibitor in step (4) is generally 1 nM to 100 mM, preferably 10 nM to 10 mM, more preferably 100 nM to 1 mM.
- the concentration of the FGF signaling pathway inhibitor in step (4) is 1 nM to 100 mM, preferably 10 nM to 10 mM, more preferably 100 nM to 1 mM.
- an FGF signaling pathway inhibitor other than the above it is preferably used at a concentration that exhibits FGF signaling pathway inhibitory activity equivalent to that of SU5402 at the above concentration.
- step (4) is also preferably performed in the presence of a BMP signaling pathway agonist.
- the BMP signaling pathway agonist used in step (4) may be the same as or different from the substance used in step (2), but is preferably the same.
- step (4) further includes Shh signaling pathway agonist, Wnt signaling pathway agonist, Notch signaling pathway inhibitor, activin/TGF- ⁇ signal It is also preferred to carry out in the presence of at least one selected from the group consisting of transduction pathway agents and retinoic acid signaling pathway agents.
- the substance used in step (4) may be different from the substance used in steps (a) to (3), but is preferably the same. The concentration and type of additive can be adjusted as appropriate.
- step (3) suspension culture is performed until olfactory nerve progenitor cells are differentiated into cell aggregates, and in step (4), the culture is continued, and olfactory nerve progenitor cells are present.
- Cells composing the nasal epithelium can be obtained on the same epithelium that is continuous with the epithelium on which the nasal cavity is formed. More preferably, steps up to step (3) are performed, and cell aggregates in which olfactory nerve cells and olfactory epithelial tissue are formed in non-neural epithelial tissue in the cell aggregate are further cultured as step (4). In this way, cells that constitute the nasal epithelium can be formed in the non-neural epithelial tissue.
- a medium containing no Wnt signaling pathway inhibitor, FGF signaling pathway acting substance and BMP signaling pathway inhibitor may be used, or the same medium as in step (3) may be used. .
- the pathogen When intending to bring the pathogen into contact with the cell population and form a disease model, the pathogen may be brought into contact with the cell population after step (3).
- the contact between the cell population and the pathogen may be performed in a medium that does not contain at least one selected from the group consisting of Wnt signaling pathway inhibitors, FGF signaling pathway active substances and BMP signaling pathway inhibitors, You may carry out in the same culture medium as step (3).
- the medium used in step (4) is not particularly limited, but the same medium as the medium used in steps (1) to (3) can be used.
- a known medium used for culturing nerve cells, etc. such as a 1:1 mixture of DMEM/F-12 medium and Neurobasal medium supplemented with 0.5% N2 supplement and 1% B27 supplement (N2B27 medium), Knockout Medium with StemPro NSC SFM Supplement added to DMEM/F-12 medium (StemPro NSC SFM medium), medium for central nervous system organoids (STEMdiff Cerebral Organoid Maturation Kit), medium for epithelial cell culture (PneumoCult ALI medium, CnT -Prime, Epithelial Culture Medium, etc. can also be used.
- step (4) additives used in any of the above steps, such as TGF ⁇ signaling pathway inhibitors, EGF signaling pathway active substances, substances that reduce oxidative stress, stress response signaling pathways Subsequent addition of inhibitors and the like is also preferred. These substances added in step (4) may be the same as or different from the substances used in any of the above steps, but are preferably the same. The concentration and type of additive can be adjusted as appropriate.
- serum is preferably further present in step (4).
- Serum is not particularly limited, but serum commonly used in cell culture can be used.
- the concentration of serum in the medium is not particularly limited as long as the above effects can be achieved, and is, for example, about 1% to 20%, preferably about 3% to about 15%.
- step (3) and step (4) may be performed in the presence of Matrigel.
- concentration of the basement membrane sample in the medium is preferably 0.5% or more and 4% or less when Matrigel is used, and more preferably 0.5% or more and 1.5% or less in terms of experimental procedures. be.
- Cell aggregates containing the cells that make up the nasal epithelium or their progenitor cells may be cultured simultaneously with other cell aggregates or tissues, with the intention of forming an interaction model or an assemblebroid between living tissues. This can form a cell population comprising two or more cell clusters, or a cell cluster comprising a cell cluster and a tissue.
- the object to be cultured at the same time may be a tissue derived from a living body, or may be a cell aggregate derived from cultured cells or stem cells.
- the object to be cultured at the same time is preferably stem cell-derived cell aggregates, more preferably organoids having a structure that reproduces in vivo tissue to some extent.
- the co-cultured tissue may be derived from any animal species, but is preferably human-derived tissue.
- the tissue to be cultured at the same time may be any tissue of a living body, preferably a tissue of the central nervous system, more preferably a tissue of the central nervous system containing the olfactory cortex (olfactory bulb and olfactory cortex).
- the tissue to be cultured at the same time is preferably a respiratory system tissue other than the olfactory epithelium and the nasal epithelium, and may be a respiratory system tissue including any of the throat, trachea, bronchi and lungs. .
- the tissue to be cultured at the same time is preferably a tissue susceptible to infection with pathogens or viruses that infect the nasal epithelium or olfactory epithelium, in the central nervous system, blood vessels, kidneys, liver, small intestine, or large intestine. It can be.
- the cell aggregates cultured at the same time preferably contain cells that constitute the tissue.
- the object to be cultured at the same time may be the cells constituting the tissue or a cell population containing the cells.
- cell aggregates produced by the production method according to the present invention and other cell aggregates or tissues are introduced into a compartment in which adhesion between cell aggregates or between cell aggregates and tissue may occur.
- method a method of fixing cell aggregates together or cell aggregates and tissue in contact with a material such as gel, and a method of culturing cell aggregates together or cell aggregates and tissue while pressing them with cover glass or the like.
- a method of dispersing different types of cell aggregates into single cells and then reaggregating them in the same compartment but are not particularly limited.
- the projection of the olfactory nerve can also be reproduced by simultaneously culturing the cell aggregate produced by the production method of the present invention and the tissue of the central nervous system using the method described in 1. above.
- cell population containing cells constituting nasal epithelium or progenitor cells thereof can be confirmed by immunostaining with markers similar to the corresponding cells and tissues existing in vivo, shape observation, or other specific methods. However, the functions, gene expressions, structures, etc. of “cells” and “tissues” are not necessarily the same as those of cells and tissues existing in vivo.
- One embodiment of the present invention provides a cell population comprising cells that make up the nasal epithelium or progenitor cells thereof.
- the cells are preferably three-dimensional cultured cell populations. In a three-dimensional cultured cell population, two or more cells aggregate to form a three-dimensional structure.
- a cell population is an artificially formed population of cells, and has a certain cell type, cell number, shape and composition.
- the number of cells constituting the cell population of the present invention is not particularly limited, it is preferably 30 or more, more preferably 500 or more.
- the upper limit of the number of cells constituting the cell population is not particularly limited, but may be, for example, 1 ⁇ 10 7 or less, or 5 ⁇ 10 6 or less.
- the shape of the cell population of the present invention is not particularly limited. may
- the cell population of the present invention preferably contains cells produced by the above-described method for producing cells constituting nasal epithelium.
- the cell population of FIG. 1A includes non-neural epithelial tissue and neural tissue.
- the cell population shown in FIG. 1 is formed three-dimensionally and is usually not adhered to the cultureware.
- Nerve tissue is preferably spherically formed. At least part of the neural tissue may be covered with non-neural epithelial tissue.
- the non-neural epithelial tissue includes nasal epithelial-like tissue containing cells that constitute the nasal epithelium or progenitor cells thereof (part surrounded by a square dotted line in the figure).
- the surface of nerve tissue is preferably covered with non-neural epithelial tissue at least 30% (FIG. 1B), more preferably at least 60%, still more preferably at least 80%, and most preferably entirely.
- a gap may be formed at least partially between the non-neural epithelial tissue and the neural tissue (C in FIG. 1).
- the non-neural epithelial tissue may be thinned (Fig. 1C).
- a structure in which a part of the non-neural epithelial tissue is contracted may be formed (D in FIG. 1).
- the non-neural epithelial tissue on the surface may have protuberances, and the protuberances may be bag-like (E in FIG. 1). Also, the ridges may be folded pleats.
- Non-neural epithelial tissue may include olfactory epithelial-like tissue in addition to nasal cavity epithelial-like tissue (FIG. 1F). Part of the nerve tissue may be covered with non-neural epithelial tissue, and part of the non-neural epithelial tissue may be olfactory epithelium-like tissue (G in FIG. 1). The non-neural epithelial tissue may have multiple olfactory epithelial-like tissues and nasal epithelial-like tissues on the same epithelial tissue. A cell population may have a combination of the above characteristics.
- nerve tissue is not covered with non-neural epithelial tissue, but exhibits a form in which nerve tissue and non-neural epithelial tissue are in contact or connected (H and I in Figure 1).
- a plurality of neural tissues and a plurality of non-neural epithelial tissues may aggregate.
- the non-neural epithelial tissue may be bent to give rise to intricate ridges (Fig. 1H) and bulges composed of thin (e.g., less than one-fifth the thickness of the non-neural epithelial tissue diameter) epithelium. It may have a balloon-like (bag-like) form (I in FIG. 1).
- a cell population comprising the cells that make up the nasal epithelium or their progenitor cells may refer to an isolated non-neural epithelial tissue.
- at least 80% of neural tissue consists of neural cells
- non-neural epithelial tissue consists of at least 80% of non-neuronal cells.
- the non-neural epithelial tissue may have an intricate bulge due to the bending of the epithelium as described above, or may have a balloon-like morphology.
- part of the olfactory epithelium-like tissue may be invaginated into the cell mass to form an olfactory fossa-like structure ( Figures 41A and B).
- the olfactory epithelium-like tissue forming an olfactory fossa-like structure may preferably contain olfactory nerve cells.
- the olfactory epithelium-like tissue that forms an olfactory fossa-like structure may be formed on the same epithelium that is continuous with the non-neural epithelial tissue, more preferably the nasal epithelial tissue.
- An olfactory epithelium rim-like structure may be formed at the junction between the olfactory epithelium-like tissue forming the olfactory fossa-like structure and the non-neural epithelial tissue, more preferably the nasal epithelial tissue.
- the cell population may be a planar cultured cell population.
- Another form of cell population is planarly formed on a culture substrate and includes neural tissue and non-neural epithelial tissue.
- Non-neural epithelial tissue is formed on the outer edge of the cell population, and nerve tissue is formed on the inner side (Fig. 2A).
- Nerve tissue and non-neural epithelial tissue may each be formed from one layer of cells, or may be formed from multiple layers (eg, 2 to 6 layers) of cells.
- the shape of the cell population may take any form as long as it can be developed on the cultureware.
- a basement membrane structure is formed between the cell population and the cultureware.
- the cell population is a two-dimensional nasal epithelial-like tissue (hereinafter referred to as " It can also be grasped as forming a two-dimensional organoid.
- a microfluidic chip has channels and is perfused with a medium.
- the microfluidic chip may be connected to a chip containing cells or tissues other than the cell population according to the present invention via channels (C in FIG. 2).
- Cells or tissues contained in the chip to be connected include, for example, respiratory tissues such as throat, trachea, bronchi, and lungs, central nervous system including brain, liver, blood vessels, kidneys, oral epithelium, stomach, and small intestine. , colon, reproductive organs, and the like, but not limited thereto.
- Cells or tissues contained in the chip to be connected are preferably human cells, but may be connected to chips containing non-human cells or tissues for the purpose of reproducing the transmission of infectious diseases from animals to humans. You may
- FIG. 2D Another form of cell population is formed planarly on a micropatterned cultureware and includes neural tissue and non-neural epithelial tissue (Fig. 2D).
- the micropattern on the cultureware consists of a cell-adhesive region and a cell-non-adhesive region, and cell clusters are formed in the cell-adhesive region.
- Another form of cell population is planarly formed on a substance-permeable porous membrane and includes neural tissue and non-neural epithelial tissue (E in Figure 2).
- the porous membrane is in or in contact with the medium.
- the upper part of the cell population according to the present invention may be covered with a culture solution or may be in contact with the gas phase.
- Cells according to the present invention are cultured on one side separated by a porous membrane, and other cells or tissues, feeder cells, etc. are cultured on the other side.
- Another form of cell population is an assembly of two or more cell clusters, at least one of which contains cells constituting the nasal epithelium or their progenitor cells (Fig. 3A). At least one cell mass may contain cells that constitute the nasal epithelium or their progenitor cells and cells that constitute the olfactory epithelium or their progenitor cells, and may be the cell populations illustrated in FIG. In aggregates of cell clusters, cell clusters other than cell clusters containing cells constituting nasal epithelium or progenitor cells thereof may be cell clusters containing cells constituting other tissues.
- the other tissue may be nerve tissue, preferably including cells of the central nervous system, more preferably cells that make up the central nervous system including the olfactory cortex (including the olfactory bulb and olfactory cortex).
- the cell cluster containing the cells constituting the nasal epithelium or their progenitor cells and the cell cluster containing other tissues are preferably functionally linked by intercellular adhesion or synaptic connections between nerve cells.
- the cell mass containing other tissues contains respiratory system cells or tissues other than the olfactory epithelium and the nasal epithelium (FIG. 3B).
- the assembly of cell masses is preferably placed in a compartment for promoting adhesion between cell masses or embedded in a gel.
- Another form of cell population may be an aggregate of cell clusters and cells that constitute other tissues (C in FIG. 3).
- the cell mass contains cells that constitute the nasal epithelium or their progenitor cells, and may further contain cells that constitute the olfactory epithelium or their progenitor cells, and may be the cell population illustrated in FIG.
- Cells that make up other tissues are not particularly limited, but may include cells of the central nervous system, cells that make up the central nervous system including the olfactory cortex, and respiratory organs other than the olfactory epithelium and nasal epithelium. cells of the lineage.
- the cell mass and other cells may be connected by intercellular adhesion, synaptic bond, or the like.
- non-neural epithelial tissue refers to tissue having an epithelial structure and not including neuroepithelial tissue.
- the epithelial structure refers to a structure in which cells are connected to each other by intercellular junctions to form a layer.
- the layer may be a single layer or multiple layers.
- part of the epithelial structure may be multi-layered.
- Non-neural epithelial tissue contains cells that constitute the nasal epithelium or their progenitor cells.
- Cells constituting the nasal epithelium include secretory cells, ciliated cells, club cells, basal cells, saline cells, neuroendocrine cells, solitary chemosensory epithelial cells, and the like.
- Cells constituting the nasal epithelium include at least one, preferably multiple types of these cells.
- nasal epithelium is primarily derived from ectodermal non-neural epithelium
- the cells that make up the nasal epithelium or their progenitor cells preferably express ectodermal markers.
- Progenitor cells of nasal epithelial cells refer to cells that mature into nasal epithelial cells, and include cells capable of differentiating into nasal epithelial cells.
- the cells that make up the nasal epithelium preferably contain secretory cells.
- the secretory cells or their progenitor cells express at least one selected from the group consisting of mucin 1, mucin 2, mucin 3, mucin 4, mucin 5AC, mucin 5B, FoxA1, FoxA2, Nkx2.1/TTF-1 and SPDEF. , preferably FoxA1, FoxA2, Nkx2.1/TTF-1 and SPDEF expressing cells.
- the cells that make up the nasal epithelium preferably contain ciliated cells.
- Ciliated cells have a pilus structure on the cell surface.
- the ciliated cells or their progenitor cells are preferably cells expressing at least one selected from the group consisting of FoxJ1, FoxN4, p73, acetylated tubulin and ⁇ 4 tubulin and/or have pili on the cell surface. can be defined as cells.
- the cells that make up the nasal epithelium preferably contain club cells.
- Club cells or progenitor cells thereof can be defined as cells expressing at least one selected from the group consisting of SCGB1A1, SCGB3A2, Cyp2f2, uroplakin3a, Cldn10, Aox3, Pon1 and Cckar.
- Club cells may include Hillock cells expressing at least one selected from cytokeratin 4 and cytokeratin 13.
- the cells that make up the nasal epithelium preferably contain basal cells.
- Basal cells are located on the basal surface of non-neural epithelial tissue and preferably line up on basement membrane structures.
- Basal cells or progenitor cells thereof can be preferably defined as cells expressing at least one selected from the group consisting of cytokeratin 5, cytokeratin 14, cytokeratin 15, p63, ⁇ Np63 and p75.
- the cells that make up the nasal epithelium preferably contain saline cells.
- Saline cells or their progenitor cells express CFTR, and preferably at least one selected from the group consisting of Foxi1, vacuolar proton ATPase (vacuolar H+-ATPase, V-ATPase), Ascl3, Tfcp2l1 and DMRT2.
- Foxi1 vacuolar proton ATPase (vacuolar H+-ATPase, V-ATPase)
- Ascl3, Tfcp2l1 and DMRT2. can be defined as cells with
- the cells that make up the nasal epithelium preferably contain neuroendocrine cells.
- a neuroendocrine cell or its progenitor cell can be defined as a cell expressing at least one selected from the group consisting of Ascl1, NeuroD1, chromogranin A, synaptophisin, and neuro-specific enolase (NSE).
- the cells that make up the nasal epithelium preferably contain solitary chemosensory epithelial cells.
- An isolated chemosensory epithelial cell or its progenitor cell can be defined as a cell expressing at least one selected from the group consisting of ChAT/Trpm5, Pou2f3/Skn-1a, Tas2r, Gnat3 and Plcb2.
- Fig. 4 shows an enlarged view of the nasal epithelium-like tissue of the cell population.
- Cells constituting the nasal epithelium or their progenitor cells are non-neural epithelial tissue in contact with nerve tissue (A in FIG. 4), non-neural epithelial tissue not in contact with nerve tissue (B in FIG. 4), and contracted non-neural epithelial tissue. (Fig. 4C) and thinned non-neural epithelial tissue (Fig. 4D).
- Cells constituting the nasal epithelium or progenitor cells thereof are preferably aggregated by cell type.
- the cells constituting the nasal epithelium or their progenitor cells preferably have two or more consecutive cells for each cell type.
- the non-neural epithelial tissue may contain an extracellular matrix.
- the non-neural epithelial tissue preferably further comprises basement membrane structures.
- a basement membrane structure is preferably formed between non-neural epithelial tissue and neural tissue (A in FIG. 1).
- a basement membrane structure may be formed between the culture medium and the cell population, particularly between the culture medium and non-neural epithelial tissue (Fig. 2).
- cells contained in non-neural epithelial tissue adhere to the basement membrane structure.
- a basement membrane structure refers to a thin membranous structure composed of an extracellular matrix, and can be determined by immunostaining for laminin.
- the basement membrane structure preferably contributes to maintenance of the structure of non-neural epithelial tissue, mechanical separation of non-neural epithelial tissue from nerve tissue or cultureware, selective permeation of substances, etc., in the same manner as the basement membrane in vivo. . It is also preferred that the non-neural epithelial tissue has an apical-to-basolateral polarity with the formation of basement membrane structures.
- the cell population has a three-dimensional structure (for example, a spherical shape)
- the outside (surface side) of the cell population be the apical surface and the inside be the basal surface.
- Non-neuroepithelial tissues preferably contain basal cells on the basal side (FIG. 4E).
- the cells that make up the nasal epithelium or their progenitor cells preferably express factors related to infectious diseases, such as virus receptors, virus infection-related factors, and pattern recognition receptors (Fig. 4F).
- Viral receptors and viral infection-associated factors may be receptors of viruses that infect the nasal epithelium or viral infection-associated factors, which will be described later, and include, for example, ACE2, ⁇ 2,6Gal sialic acid, ⁇ 2,3Gal sialic acid, and the like. .
- the cells that make up the nasal epithelium or their progenitor cells may be deficient or mutated in viral infection-related factors or disease-related genes.
- Cell populations containing such cells can be used, for example, for transplantation cells for regenerative medicine applications, disease models, compound screening, and the like, which will be described later.
- Viral infection-associated factors include, for example, viral receptors, including ACE2. Deleting or mutating factors associated with viral infection is expected to provide resistance to viral infection.
- a disease-associated gene is, for example, a gene associated with a hereditary disease or an infectious disease.
- Cells constituting nasal epithelium with gene deletion or mutation or progenitor cells thereof can be obtained by differentiating from pluripotent stem cells established or genome-edited from patients with genetic diseases.
- Diseases include, for example, cystic fibrosis, ciliary dysfunction syndrome, Kartagener's syndrome, mucopolysaccharidoses, and asthma.
- Another aspect of the disease-associated gene is a gene involved in cancer and tumorigenesis of the nasal cavity or upper respiratory tract.
- disease-related genes include ABL1, BRAF, DDR, EGFR, EPHA2, ERBB2, ERBB4, FGFR1, FGFR2, FLT1, FLT4, FRK, KDR, KIT, MAPK11, PDGFRA, PDGFRB, RAF1, RET, TEK, TRNAK2, VEGFA, VEGFB, VEGFC, TP53, CDKN2A, PIK3CA, PTEN, KMT2D, FBXW7, SMARCB1, PREX2, ARID1A, FANCA, IDH2, PRKDC, HRAS, NOTCH2, NOTCH1, NF1, TSC2, EPHA7, CDKN2B, ATRX, ARID2, including, but not limited to, AKT3, BRCA2, BCL6, ASXL1, AR, and ALK. It is also possible to collect cells from normal and diseased parts of the nasal cavity or upper respiratory tract tissue, establish iPS cells, and prepare the cells constituting the nasal epithelium or their progenitor
- the cell population may contain olfactory epithelium-like tissue in addition to the cells that make up the nasal epithelium or their progenitor cells.
- the olfactory epithelium-like tissue is included in non-neural epithelial tissue and preferably covers at least part of the surface of nerve tissue.
- the olfactory epithelium-like tissue includes Six1, Sp8, Sox2, Sox3, Dlx5, Emx2, Pax6, Otx2, PDGFR ⁇ , cytokeratin, EpCAM, E-Cadherin and N-expressed in the olfactory epithelium or its precursor tissue (olfactory epithelium placode).
- the olfactory epithelium-like tissue may have epithelial tissue thickened outside the non-neural epithelial tissue.
- the cell population may contain olfactory neurons or their progenitor cells.
- the olfactory nerve cell or its progenitor cell is preferably contained in the olfactory epithelium-like tissue.
- the olfactory nerve cell or its progenitor cell comprises at least one selected from the group consisting of nervous system cell markers Tuj1, NCAM, N-Cadherin, and Calretinin, and a transcription factor specifically expressed in the olfactory nerve cell or its progenitor cell.
- the olfactory nerve cells contained in the olfactory epithelium-like tissue preferably express olfactory receptors, more preferably receive olfactory information in the same way as olfactory nerve cells localized in the olfactory epithelium in vivo, and are distributed in the central nervous system. can transmit information to Progenitor cells of olfactory neurons refer to cells that become olfactory neurons when matured, and include cells that have the potential to differentiate into olfactory neurons.
- the progenitor cells of olfactory neurons preferably exhibit properties similar to those of neurons present in the olfactory epithelium placode.
- the olfactory epithelium-like tissue may further contain cells constituting the olfactory epithelium or their progenitor cells, and further contains at least two types of cells selected from the group consisting of supporting cells, basal cells, Bowman's gland cells, and these progenitor cells. Preferably, it contains basal cells or their progenitor cells. Supporting cells or progenitor cells thereof refer to cells expressing at least one selected from the group consisting of HIF2 ⁇ , Sox2, Hes1, Hes5 and Six1.
- a basal cell or its progenitor cell refers to a cell expressing at least one selected from the group consisting of p63, Wt1 and Lgr5.
- Bowman's gland cells or progenitor cells thereof refer to cells expressing at least one selected from the group consisting of cytokeratin and Ascl3.
- the olfactory epithelium-like tissue preferably further contains olfactory nerve sheath cells or progenitor cells thereof.
- Olfactory nerve sheath cells or progenitor cells thereof refer to cells expressing at least one selected from the group consisting of S100, Sox10 and vimentin.
- As a marker for olfactory nerve sheath cells or their progenitor cells for example, Brain Structure and Function 222.4 (2017): 1877-1895. Markers described in can also be used.
- Supporting cells, basal cells, Bowman's gland cells or olfactory sheath cells or progenitor cells thereof are preferably supporting cells, basal cells, Bowman's gland cells or olfactory sheath cells present in the olfactory epithelium or olfactory epithelium placode in vivo, or these show properties similar to those of progenitor cells.
- the nasal epithelial-like tissue and the olfactory epithelial-like tissue, in which the cells constituting the nasal epithelium or their progenitor cells exist are formed on a continuous epithelium. It is also preferred that an olfactory epithelium rim is formed between the region where the cells constituting the nasal epithelium or their progenitor cells exist and the olfactory epithelium-like tissue (FIGS. 1F and G).
- the olfactory epithelium margin refers to a region where cells expressing at least one selected from the group consisting of Pbx, Meis1, Pax6, and ⁇ IVtubulin, preferably Pax6 and Pbx, are localized.
- One embodiment of the cell population contains nervous system cells or progenitor cells thereof, preferably nervous system cells constituting the central nervous system or progenitor cells thereof.
- One embodiment of the cell population includes neural tissue comprising neural cells or progenitor cells thereof.
- Nerve tissue preferably contains nervous system cells or their progenitor cells that constitute the central nervous system.
- Nervous system cells or their progenitor cells constituting the central nervous system express at least one selected from the group consisting of Pax6, Bf1, Sp8, Sox1, Sox2, Emx2, Tuj1, and N-Cadherin, and express cytokeratin.
- can be defined as cells that do not Nervous system cells or progenitor cells thereof that constitute the central nervous system preferably express Pax6, Sox2 and Tuj1.
- Nervous system cells or their progenitor cells that constitute the central nervous system preferably exhibit properties similar to those of nerve cells, glial cells, neural stem cells, etc., or their progenitor cells in the central nervous system in vivo.
- the nerve tissue may be at least partially covered with non-neural epithelial tissue.
- Nerve tissue may form an epithelial structure.
- the epithelial structure may be formed in a part of the nerve tissue or may be formed in the whole.
- a gap may be formed at least partially between the non-neural epithelial tissue and the neural tissue.
- the nervous system cells or their progenitor cells preferably include nervous system cells or their progenitor cells that constitute the retina.
- Nervous system cells or progenitor cells thereof constituting the retina can be defined as cells expressing at least one selected from the group consisting of Rax, Six3, Chx10, Pax6, Lhx2 and Aldh1a3.
- Nervous system cells or their progenitor cells that constitute the retina preferably express Rax and Chx10.
- Nervous system cells or their progenitor cells that constitute the retina preferably exhibit properties similar to those of in vivo retinal cells, retinal progenitor cells, retina-specific nerve cells, or the like, or their progenitor cells.
- the central nervous system preferably includes the cerebrum.
- Cerebrum (including cells constituting the cerebrum) refers to a tissue expressing at least one selected from the group consisting of Emx family genes, Otx2, Bf1 and Pax6.
- the cerebrum preferably has a layered structure.
- the cerebrum preferably contains the olfactory cortex.
- the olfactory cortex refers to a tissue expressing at least one selected from the group consisting of Tbr1, Ctip2 and FoxP2.
- the cerebrum preferably contains the basal ganglia or primordia thereof.
- the basal ganglia or its primordium refers to a tissue expressing at least one selected from the group consisting of Dlx family genes, Gsh2, Nkx2.1 and Islet1.
- the basal ganglia or primordium thereof is the lateral basal ganglia primordium.
- the lateral basal ganglia primordium refers to a tissue expressing at least one selected from the group consisting of Er81 and Islet1.
- the cerebrum preferably contains the olfactory bulb or its progenitor tissue.
- the olfactory bulb or its progenitor tissue refers to a tissue expressing at least one selected from the group consisting of Arx, Tbr1 and Tbx21.
- the cell population may contain gonadotropin-releasing hormone-positive neurons.
- Gonadotropin-releasing hormone-positive nerve cells refer to cells expressing gonadotropin-releasing hormone (GnRH) and their progenitor cells.
- bone tissue is not usually formed in the cell population of the present invention, but the cell population may contain bone tissue.
- Bone tissue, osteocytes or progenitor cells thereof preferably express at least one selected from the group consisting of Runx2, Osterix and ATF. Whether bone tissue is formed in the formed cell population can be determined by methods well known to those skilled in the art, such as alizarin red staining, alkaline phosphatase staining, or immunostaining for the bone tissue-specific gene. .
- the method for detecting cells and tissues contained in the manufactured cell population is not particularly limited, but a method that is highly reliable and reproducible and can be easily performed is preferable. Examples include optical observation using a microscope, immunostaining using antibodies against each cell or tissue marker, gene expression analysis such as real-time PCR for marker genes, single-cell RNA-Seq analysis, and cell type-specific microscopic analysis using electron microscopy. Examples include observation of structures, transplantation into mice, rats, etc., and immunostaining or single-cell RNA-Seq analysis using antibodies against the markers described above are preferred.
- Results of single-cell RNA-Seq analysis for example, comparing the expression profile of the obtained cell population with the profile of living tissue such as a known database, the gene expression, the similarity of the cell population that constitutes manufactured Cells and tissues contained in cell populations can be estimated.
- One embodiment of the present invention provides an in vitro disease model of nasal epithelium using the above-described "cell population comprising cells constituting nasal epithelium or progenitor cells thereof". More specifically, a cell population containing cells constituting the nasal epithelium or their progenitor cells can be used as a disease model for infectious diseases caused by pathogens such as viruses and microorganisms.
- a method for using a cell population containing cells constituting the nasal epithelium or their progenitor cells as an in vitro disease model includes, for example, a step of contacting a pathogen with the cell population, and detection of pathogen infection in the nasal epithelium, such as detecting proliferation of the pathogen.
- a method for using a cell population containing cells constituting the nasal epithelium or their progenitor cells as another in vitro disease model includes, for example, a step of contacting the cell population with a pathogen, a step of contacting a substance to be evaluated, and growth of the pathogen. can be used as a drug efficacy evaluation system for substances to be evaluated.
- One aspect of the method for use as a nasal epithelial disease model of the present invention is a method for use as a pathogen infectivity evaluation system and a drug efficacy evaluation system for an evaluation target substance, including the following steps (A) to (C).
- Step (A) The step (A) of contacting a pathogen with a cell population containing cells constituting the nasal epithelium or their progenitor cells will be described.
- the method of bringing the pathogen into contact with the cells that make up the nasal epithelium or the cell population containing the progenitor cells is not particularly limited. ), Gastroenterology 148, 126-36 (2015), and Cell Stem Cell 27, 125-36 (2020) and the like. It is desirable that the step of bringing the pathogen and the cell population into contact ensures the safety of the operator and enables the interaction between the pathogen and the cells with good reproducibility.
- the step (A ) can be implemented.
- the cell population used in step (A) may be the cell mass as it is, or may be cut into small cell masses by cutting or the like. Alternatively, the cell population used in step (A) may be dispersed and adhered. Specific cells that make up the nasal epithelium may be purified from the cell population. In a preferred embodiment, the pathogen is brought into contact with a cell population having a structure similar to that of a living body.
- the pathogen to be contacted in step (A) is not particularly limited. A single pathogen may be used alone, or two or more pathogens may be used in combination.
- the pathogen to be contacted in step (A) is preferably a respiratory infectious disease pathogen or a pathogen that causes infection via the nasal epithelium. Examples of the pathogen include coronavirus, influenza virus (e.g., influenza A virus, influenza B virus, etc.), respiratory syncytial virus, adenovirus, group A streptococcus, mycoplasma pneumoniae, bacillus pertussis, bacillus parapertussis, bronchiseptica, pneumonia.
- influenza virus e.g., influenza A virus, influenza B virus, etc.
- respiratory syncytial virus e.g., adenovirus
- group A streptococcus e.g., mycoplasma pneumoniae, bacillus pertussis, bacillus parapertussis, bronchiseptic
- Preferred respiratory infection pathogens or pathogens that result in infection from the nasal epithelium are coronaviruses and influenza viruses. When two or more pathogens are combined and brought into contact, these pathogens may be brought into contact at the same time, or may be brought into contact at intervals of a certain period of time.
- step (A) By bringing two or more pathogens into contact in step (A), it is also possible to evaluate the effects of interactions between pathogens.
- the interaction between pathogens as described above includes, for example, a phenomenon called "interference" in virology.
- Culture conditions such as culture temperature, CO 2 concentration, etc. in contact conditions of pathogens in step (A) can be appropriately set.
- Incubation temperatures are usually about 30° C. to about 40° C., preferably about 37° C., but these may vary depending on the characteristics of the pathogen.
- the CO2 concentration is for example about 1% to about 10%, preferably about 5%.
- any substance to be evaluated can be added to the culture environment for the purpose of evaluating the efficacy of the substance to be evaluated.
- the substance to be evaluated at that time is not particularly limited, but may be a low-molecular-weight compound, an antibody, a nucleic acid, or a vector for gene therapy as one aspect.
- the substance to be evaluated may be added before contacting the cell population with the pathogen, or may be added after contacting the cell population with the pathogen.
- the substance to be evaluated and the pathogen may be added to the culture environment at the same time.
- the step of detecting a pathogen is preferably selected for each target pathogen, but for example, an ELISA method targeting a pathogen-specific antigen, a PCR method targeting a pathogen-specific base sequence, and an RT-PCR method. , quantitative PCR, hemagglutination, fluorescent antibody, and electron microscopy.
- the control group the group to which the evaluation target substance was not added
- the evaluation target substance addition group were compared.
- a cell population comprising nasal epithelial cells or progenitor cells thereof can be used for screening of pathogen infection inhibitors or therapeutic agents for diseases caused by pathogen infection.
- the method for evaluating drug efficacy is not particularly limited, it is preferable to implement a method that allows quantitative evaluation with good reproducibility. etc.
- Step (C) of analyzing cells infected with pathogens.
- the method of analyzing cells that have been contacted with a pathogen is not particularly limited, but for example, Viral Experimental General Review (Maruzen), Viral Experimental Specifics (Maruzen), Viral Experimental Protocol (Medical View), Gastroenterology 148, 126-136 (2015) , and Cell Stem Cell 27, 125-136 (2020).
- Step (C) may be performed simultaneously with step (B), or may be performed as a separate step.
- Pathogens to be analyzed in step (C) are usually intracellular parasitic pathogens, preferably mycoplasma, viruses, protozoa, fungi, and bacteria.
- the method of analyzing cells is preferably selected for each target pathogen, but for example, an immunostaining method using a combination of a pathogen-specific antigen and a cell type-specific antibody, single-cell RNA-seq analysis, and electron microscopy. and other techniques.
- single-cell RNA-seq analysis cell types can be identified, for example, by analyzing gene expression profiles of cells containing pathogen-specific nucleotide sequences. By using techniques such as those described above, the tropism of an unknown pathogen can be determined.
- pathogen-infected and non-infected cells By comparing pathogen-infected and non-infected cells among pathogen-contacted cells, factors necessary for pathogen infection and pathogen proliferation, such as viral receptors, viral infection-related factors, and patterns Recognition receptors and the like can be identified.
- viral receptors or factors involved in viral infection are expressed in cells constituting the nasal epithelium or their progenitor cells.
- a cell population containing nasal epithelial cells or progenitor cells thereof in which the genes of the aforementioned factors have been deleted or mutated can also be used. Modification methods such as deletion or mutation of genes are not particularly limited, and may be performed by genome editing, for example.
- the cells that make up the nasal epithelium or cell populations containing their progenitor cells can be infected with viruses and used to propagate the viruses required for the production of vaccines and the like.
- a method of using a cell population containing cells constituting the nasal epithelium or their progenitor cells as another in vitro disease model is, for example, using patient-derived iPS cells or genome-edited pluripotent stem cells as starting materials, and using the above cell population as a starting material. It includes a step of preparing, a step of contacting the cell population with the substance to be evaluated, and a step of evaluating the cell population after contact, and can be used as a drug efficacy evaluation system for the substance to be evaluated.
- One aspect of the method for use as a nasal epithelial disease model of the present invention is production of nasal epithelium from patient-derived pluripotent stem cells or genome-edited pluripotent stem cells, including the following steps (i) to (iv): and analysis, and the method of use as a drug efficacy evaluation system for the substance to be evaluated.
- Step of establishing patient-derived pluripotent stem cells or genome-edited pluripotent stem cells (i) Step of establishing patient-derived pluripotent stem cells or genome-edited pluripotent stem cells (ii) A cell population containing cells constituting nasal epithelium from the pluripotent stem cells established in step (i) Manufacture step (iii) contacting the cell population produced in step (ii) with an evaluation target substance (iv) analyzing the cell population contacted with the evaluation target substance in step (iii)
- Step (i) The step (i) of establishing patient-derived pluripotent stem cells or genome-edited pluripotent stem cells will be described.
- the method of establishing patient-derived pluripotent stem cells or genome-edited pluripotent stem cells as long as the quantity and quality of pluripotent stem cells that can be used for the production of nasal epithelium in a later process can be obtained, Not limited. Examples include a method of reprogramming cells other than patient-derived pluripotent stem cells to obtain pluripotent stem cells, and a method of cloning pluripotent stem cells by manipulating the genome of established pluripotent stem cells. mentioned.
- pluripotent stem cells derived from patients with hereditary diseases or pluripotent stem cells obtained by genome-editing causative genes of hereditary diseases are preferably used.
- Disease patient-derived pluripotent stem cells or disease-associated pluripotent stem cells that have undergone genome editing can also be used.
- Patient-derived pluripotent stem cells include, for example, cystic fibrosis, ciliary dysfunction syndrome, Kartagener's syndrome, mucopolysaccharidosis, asthma (allergic inflammation), eosinophilic sinusitis, and other patients-derived stem cells. It includes, but is not limited to, potential stem cells.
- Examples of genome-edited pluripotent stem cells include those in which a causative gene of a genetic disease has been edited into a function-deficient type, and in which a causative gene in pluripotent stem cells derived from a patient with a genetic disease has been edited and the function has been restored.
- examples include those incorporating a reporter such as fluorescent protein and luciferase, but are not particularly limited.
- Step (ii) of producing a cell population containing cells constituting nasal epithelium from the pluripotent stem cells established in step (i) will be described.
- a method for producing a cell population containing nasal epithelium from pluripotent stem cells can be carried out by performing steps (a), (1), (2), (3) and (4) described in the present application. can.
- steps (a), (1), (2), (3) and (4) described in the present application. can be carried out by performing steps (a), (1), (2), (3) and (4) described in the present application. can.
- the number of seeded cells, the timing of addition of the agent to be added, the concentration, etc. can be appropriately adjusted in consideration of differences between cell lines.
- Step (iii) The step (iii) of contacting the substance to be evaluated with the cell population containing the nasal epithelium prepared in step (ii) will be described.
- any substance to be evaluated is added to the culture environment for the purpose of evaluating the efficacy of the substance to be evaluated.
- the substance to be evaluated at that time is not particularly limited, but may be a low-molecular-weight compound, an antibody, a nucleic acid, or a vector for gene therapy as one aspect.
- Step (iv) The step (iv) of analyzing the cell population contacted with the substance to be evaluated in step (iii) will be described.
- the analysis method in step (iv) is not particularly limited as long as it can analyze the action of the substance to be evaluated.
- tissue analysis by staining protein expression analysis using Western blotting method, etc.
- gene expression analysis using real-time PCR method DNA microarray method, single-cell RNA-Seq method, etc.
- cell proliferation/cell death assay cell function evaluation assays, and the like.
- One embodiment of the present invention provides a disease-treating compound evaluation kit and a disease-treating compound screening kit for carrying out the above-described "4. Method for use as a nasal epithelial disease model.”
- the cell population according to the present invention or the cells constituting the nasal epithelium isolated from the cell population or the nasal epithelium-like tissue, and the above steps (A) to (C) are performed.
- At least one of reagents, culture media, culture equipment, and analysis programs used for, preferably reagents (compounds) used as positive or negative controls, or cells activated by contact with the substance to be evaluated Contains identifying reagents.
- the kit may further contain a written document or instructions describing the screening procedure.
- An embodiment of the present invention provides a method and an evaluation kit for evaluating the efficacy or toxicity of a target substance, particularly respiratory toxicity, using the cell population of the present invention. Specific cells constituting the nasal epithelium or nasal epithelium-like tissue may be purified from the cell population.
- the "method and evaluation kit for evaluating efficacy or toxicity of a target substance” can also be understood as "method and screening kit for screening efficacy or toxicity of target substance”.
- a method for evaluating the efficacy or toxicity of a target substance includes, for example, a step of contacting a cell population with the target substance and a step of analyzing the cell population contacted with the target substance.
- the substance to be evaluated is not particularly limited, but may be a low-molecular-weight compound, an antibody, a nucleic acid, or a vector for gene therapy as one aspect. By analyzing the cell population, it is possible to evaluate the effect of the contacted substance to be evaluated on the cells.
- kits for evaluating the efficacy or toxicity of the target substance may include the same kit as described in "5. Evaluation kit for disease-treating compounds or screening kit for disease-treating compounds".
- a kit for evaluating efficacy or toxicity of a target substance includes, for example, at least a cell population according to the present invention, or cells constituting nasal epithelium isolated from the cell population or nasal epithelial-like tissue, a culture medium, culture equipment, and an analysis program. preferably a reagent (compound) used as a positive or negative control, and a reagent that identifies cells activated by contact with the substance to be evaluated.
- the kit may further contain a written document or instructions describing the screening procedure.
- One embodiment of the present invention provides a method of searching for disease-specific biomarkers using the cell population of the present invention.
- Specific cells constituting the nasal epithelium or nasal epithelium-like tissue may be purified from the cell population.
- the method of searching for disease-specific biomarkers includes, for example, a process of reproducing a disease state by a method such as infecting a cell population with a pathogen, and a cell population in which the disease state is reproduced, its culture supernatant, and metabolites , collecting secretions, etc., analyzing the specimens and comparing them to controls to identify variable biomarkers.
- the biomarkers of interest are preferably molecular biomarkers.
- Molecular biomarkers of interest can be, but are not limited to, proteins, nucleic acids, sugar chains, peptides and small compounds. Molecular biomarkers of interest may be volatile or non-volatile. The search for molecular biomarkers is described, for example, in Molecular & Cellular Proteomics 4.2 (2005): 182-190, Chembiochem. 2014 May 5;15(7):1040-1048, Angewandte Chemie International Edition, 2010, 49.32:5426-5445. It can be performed using the method described in .
- One embodiment of the present invention provides a therapeutic agent for diseases based on respiratory disorders or sensory disorders, preferably olfactory disorders, comprising the above cell populations or cells or tissues contained in the above cell populations. These diseases may be human diseases or non-human animal diseases.
- Cell populations can be used as therapeutic agents in regenerative medicine.
- the cell population can be used as a graft when injury occurs in the nasal epithelium or olfactory epithelium.
- Specific cells that make up the nasal epithelium may be purified from the cell population. Specific transplantation methods are described, for example, in Stem cell reports, 12(6), 1354-1365.
- a method such as purifying cells having a therapeutic effect contained in the cell population, such as basal cells, and directly administering the prepared cell suspension to the affected area, such as transplanting to the olfactory epithelium by nasal drip, or cells
- Examples include a method of preparing a sheet-like tissue from a population and covering the affected area.
- Therapeutic agents include, for example, the cell population of the present invention, a suspension containing the cells or tissues contained in the cell population, and a graft (transplantation carrier) containing these.
- Suspensions include, for example, cell populations suspended in artificial tears or saline.
- the suspension may contain non-neural epithelial cells isolated from the cell population, and may contain factors that promote cell adhesion, such as extracellular matrix and hyaluronic acid.
- a method for treating a disease comprises the step of transplanting an effective amount of cells or tissues contained in the cell population of the present invention into a subject in need of transplantation.
- Implantation of a therapeutically effective dose of cells can restore tissue and typically alleviate symptoms associated with the disease.
- a cell population used as a therapeutic drug for a disease or cells or tissues contained in the cell population preferably have resistance to the target disease.
- the cells to be transplanted are infected with SARS-CoV-2 preferably resistant to Disease-resistant cells such as those described above can be prepared by using, as a material, pluripotent stem cells in which genes involved in virus infection, such as ACE2, TMPRSS2, and Nrp1, have been mutated or deleted by genome editing.
- One embodiment of the present invention provides a culture method for virus isolation using the above cell population or cells or tissues contained in the above cell population.
- the virus may be a disease-causing virus in humans or a disease-causing virus in animals other than humans.
- Viruses isolated and cultured by the method of the present invention include, but are not limited to, viruses causing upper respiratory tract infections, common colds, epidemics, or emerging infectious diseases. Examples of such viruses include rhinovirus, human coronavirus, influenza virus, respiratory syncytial virus, parainfluenza virus, adenovirus, enterovirus, human metapneumovirus, bocavirus, and the like.
- Examples of human coronaviruses include HCoV-NL63 and HCoV-229E belonging to the genus Alphacoronavirus, HCoV-OC43 and HCoV-HKU1 belonging to the genus Betacoronavirus.
- Examples of viruses causing emerging infectious diseases include SARS-CoV, MERS-CoV, SARS-CoV2, and the like.
- the cell population used for virus isolation culture or the cells or tissues contained in the cell population preferably have a receptor for the target virus.
- a receptor for the target virus for example, Nature microbiology, 2019, 4.8: 1268-1273. etc.
- pluripotent stem cells in which genes involved in viral infection, such as genes such as ACE2, TMPRSS2, and Nrp1, have been manipulated by genome editing or the like to enhance expression can also be used as materials.
- the cell population used for , or the cells or tissues contained in the above cell population are similar to those in vivo in terms of the types of cells contained and the expression of genes involved in viral infection and the like.
- Methods for evaluating whether the virus has been isolated and cultured include observation of the cytopathic effect (CPE) that occurs in cells inoculated with the virus, hemagglutination inhibition test, and neutralization using various antiviral antibodies. Examples include, but are not limited to, techniques such as testing, confirmation of amplification of specific viral genes by PCR, or genetic testing for decoding the nucleotide sequences of genes.
- StemFit medium (AK02N, manufactured by Ajinomoto Co., Inc.) was used as a feeder-free medium, and Laminin 511-E8 (manufactured by Nippi Co., Ltd.) was used as a feeder-free scaffold.
- subconfluent human ES cells were first washed twice with 5 mM EDTA/PBS, and then treated with 5 mM EDTA/PBS at 37° C. for 10 minutes. Cells were detached from the culture dish surface by pipetting and dispersed into single cells. Thereafter, the human ES cells dispersed into single cells were seeded on a plastic culture dish coated with Laminin511-E8, and Y27632 (ROCK inhibitor, manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd., 10 ⁇ M) was used in the presence of StemFit medium. was feeder-free cultured.
- ROCK inhibitor manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd., 10 ⁇ M
- the number of disseminated human ES cells dispersed into single cells was 1.2 ⁇ 10 4 . and One day after seeding, the entire medium was replaced with StemFit medium containing no Y27632. Thereafter, once every 1 to 2 days, the entire medium was replaced with StemFit medium containing no Y27632. Seven days after seeding, the cells were cultured until subconfluent (60% of the culture area was covered with cells).
- SB431542 TGF- ⁇ signaling pathway inhibitor, manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd., final concentration 5 ⁇ M , labeled as "SB431" in FIG. 5, etc.
- SAG Shh signaling pathway agonist, manufactured by Enzo Life Sciences, final concentration 300 nM
- the prepared subconfluent human ES cells were treated with 5 mM EDTA/PBS in the same manner as in the above passage.
- a serum-free medium for differentiation induction was added, and the cells were peeled from the culture dish surface by pipetting and dispersed into single cells.
- the human ES cells dispersed into single cells are transferred to a non-cell-adhesive 96-well culture plate (PrimeSurface 96V bottom plate, MS-9096V, manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd.) to 9 ⁇ 10 3 cells per well.
- the cells were suspended in 100 ⁇ l of serum-free medium as shown in Figure 1 and subjected to suspension culture at 37°C and 5% CO2 .
- the serum-free medium at that time was a mixture of F-12 + Glutamax medium (manufactured by Thermo Fisher Scientific) and IMDM + Glutamax medium (manufactured by Thermo Fisher Scientific) at a volume ratio of 1: 1, and 5% Knockout Serum Replacement (manufactured by Thermo Fisheric Scientific).
- step (1) At the start of the suspension culture (day 0 after the start of the suspension culture, step (1) is started), Y27632 (final concentration 10 ⁇ M), IWP-2 (Wnt signaling pathway inhibitor, manufactured by Tocris Bioscience) were added to the serum-free medium.
- SB431542 TGF signaling pathway inhibitor, manufactured by Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd., final concentration 1 ⁇ M was added.
- Y27632 and BMP4 were not included, IWP-2, SB431542, bFGF-TS (FGF signaling pathway agonist, manufactured by HumanZyme, final concentration 20 ng / ml), Heparin Sodium (final concentration 10 ⁇ g/ml) and 5Z-7-Oxo Zeaenol (TAK1 inhibitor, manufactured by Cayman Chemicals, final concentration 2 ⁇ M) was used to replace half the medium (start of step (3)).
- FGF signaling pathway agonist manufactured by HumanZyme, final concentration 20 ng / ml
- Heparin Sodium final concentration 10 ⁇ g/ml
- 5Z-7-Oxo Zeaenol TAK1 inhibitor, manufactured by Cayman Chemicals, final concentration 2 ⁇ M
- BMP signaling pathway inhibitor manufactured by Cayman Chemicals, final concentration 1 ⁇ M
- the aggregates after cryoprotection treatment were transferred to cryomold ⁇ 3> (manufactured by Sakura Finetek), excess 20% sucrose/PBS around the cell aggregates was removed with a micropipette, and then O.D. C. It was embedded in T compound (manufactured by Sakura Finetek) and rapidly frozen on an aluminum heat block cooled with dry ice to prepare a block for preparing a frozen section.
- a 10 ⁇ m-thick frozen section was prepared from the aggregate-embedded block using a Leica CM1950 cryostat (manufactured by Leica) and attached to a crest slide glass (manufactured by Matsunami Glass Industry Co., Ltd.).
- the frozen section After performing the washing operation of treating the frozen section after secondary antibody treatment with 0.05% Tween-20/TBS for 10 minutes at room temperature three times, the frozen section is washed once with pure water, and then covered with a NEO cover glass ( (manufactured by Matsunami Glass Industry Co., Ltd.) and 30 ⁇ l of Prolong Glass (manufactured by Thermo Fisher Scientific) per slide glass were used to encapsulate the frozen sections. After the sealed specimen was allowed to stand overnight in a dark place at room temperature to solidify the Prolong Glass, the periphery of the cover glass was coated with transparent nail polish, air-dried in a dark place at room temperature, and observed with a fluorescence microscope. . An upright fluorescence microscope Axio Imager M2 (manufactured by Carl Zeiss) and attached software Axio Vision were used to observe the specimen and acquire images.
- a NEO cover glass (manufactured by Matsunami Glass Industry Co., Ltd.) and
- the primary antibodies include anti-Six1 antibody that stains the placode and non-neural epithelial tissue described in Table 1-1 or 1-2, anti-Lhx2 antibody that stains the neural retina and olfactory nerve cells, olfactory nerve cells and their progenitor cells.
- An anti-Calretinin antibody that stains was used.
- fluorescence-labeled secondary antibodies Alexa488-labeled donkey anti-rabbit antibody, CF555-labeled donkey anti-mouse antibody, and Alexa647-labeled donkey anti-goat antibody listed in Table 2 were used for multiple staining, and nuclear counterstaining was performed at 1 ⁇ g/ml.
- Hoechst 33342 manufactured by Sigma Aldrich was added to the secondary antibody diluent.
- Experiment 1 Production and induction of differentiation of cell population containing cells constituting nasal epithelium from human ES cells
- a cell population containing cells constituting the nasal epithelium was produced according to the steps shown in the upper part of FIG.
- Pluripotent stem cells were cultured in the same manner as in Comparative Experiment 1 until day 28 of culture.
- the step (4) of culturing the cells in the absence of the Wnt signaling pathway inhibitor, the FGF signaling pathway agonist and the BMP signaling pathway inhibitor was performed.
- the same operations as in comparative experiment 1 were performed except for the operations specifically described.
- step (a), step (1), step (2) and step (3) were performed in the same manner as in Comparative Experiment 1, and then cultured for 28 days.
- Cell masses were collected from the 96-well culture plate into a 15 ml centrifuge tube, washed twice with medium, and then transferred to a 9 cm suspension culture dish (manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd.).
- the medium used was a serum-free medium (5% KSR gfCDM) supplemented with 1 ⁇ M SB431542 and 20 ng/ml EGF.
- 48 cell clusters were cultured in 12 ml of medium per dish.
- On day 35 of culture bright field observation was performed using an inverted microscope (A in FIG. 6). A part of the epithelial tissue was separated from the cell mass in the cell mass on the 35th day of culture.
- the cell population on day 35 of culture was fixed by the method described in Comparative Experiment 1 and subjected to fluorescent immunostaining.
- primary antibodies anti-Lhx2 antibody that stains the neural retina and olfactory nerve cells listed in Table 1-1 or 1-2, anti-Ebf1 antibody that is positive for olfactory nerve cells and their progenitor cells, and positive for nervous system cells.
- Anti-Tuj1 antibody that stains secretory cells anti-MUC5AC antibody that stains secretory cells, anti-MUC5B antibody, anti-FoxA2 antibody that is positive in respiratory epithelial cells, anti-FoxJ1 antibody that is positive in ciliated cells, anti-FoxJ1 antibody that is positive in saline cells CFTR antibody, anti-Otx2 antibody that is positive in the anterior region of the ectoderm, anti-Pan Cytokeratin (PanCK) antibody that is positive in non-neural epithelium, anti-cytokeratin 5 antibody and anti-p75 antibody that are positive in basal cells, and nasal epithelium , an anti-E-Cadherin antibody that was positive in the olfactory epithelium and non-neural epithelium was used.
- PanCK Pan Cytokeratin
- Alexa488-labeled donkey anti-rabbit antibody Alexa488-labeled donkey anti-rabbit antibody
- CF555-labeled donkey anti-mouse antibody Alexa647-labeled donkey anti-goat antibody listed in Table 2
- nuclear counterstaining was performed at 1 ⁇ g/ml.
- Hoechst 33342 manufactured by Sigma Aldrich was added to the secondary antibody diluent.
- the staining results are shown in A of FIGS. 7 and 8.
- Lhx2, Ebf1, Tuj1 positive olfactory neurons, FoxJ1 positive ciliated cells, mucin 5AC, mucin 5B, FoxA2 positive secretory cells, CFTR positive saline cells, Cytokeratin 5, p75 and E-Cadherin positive basal cell-like cells were present.
- the regions where these cells existed were both Otx2-positive and pan-cytokeratin-positive, indicating that the cells were non-neural cells belonging to the ectoderm.
- cells that constitute the nasal epithelium are contained in the cell population, and cells that constitute the nasal epithelium, such as ciliated cells, secretory cells, saline cells, and basal cells, are produced by the production method according to the present invention. It has been shown to be possible.
- a schematic diagram of the cell population formed by the above production method is shown in FIG. 8B.
- the cell population includes 1) nerve tissue containing nervous system cells constituting the central nervous system, and 2) nasal epithelium-like tissue containing cells constituting the nasal epithelium, and olfactory epithelium-like tissue containing olfactory nerve cells. It had non-neural epithelial tissue. Nerve tissue was covered at least partially on the surface by nasal epithelial-like tissue. Nasal epithelial-like tissue and olfactory epithelial-like tissue were present on continuous non-neural epithelial tissue.
- basal cells are located inside the non-neuroepithelial tissue
- ciliated cells are located outside the non-neuroepithelial tissue
- the non-neuroepithelial tissue has a basal-apical polarity.
- the cells constituting the nasal epithelium aggregated according to cell type.
- Experiment 2 Production and induction of differentiation of cell populations containing cells constituting nasal epithelium from human ES cells
- a cell population containing cells constituting nasal epithelium was produced according to the steps shown in the upper part of FIG.
- the same procedure as in Comparative Experiment 1 was performed, except that the JNK inhibitor JNK-IN-8 was further added from step (1).
- step (1) the JNK inhibitor JNK-IN-8 was added at a final concentration of 300 nM or 1 ⁇ M. . JNK-IN-8 was added to the medium to be replaced so that the final concentration was the same when the medium was replaced. Bright field observation was performed using an inverted microscope on day 28 of culture (A in FIG. 9).
- the obtained cell population contained uniform nearly spherical cell clusters, and the surface of the cell clusters was non-neural epithelium. There was a high proportion of coverage.
- the cell population on the 28th day of culture was fixed by the method described in Comparative Experiment 1, and fluorescence immunostaining was performed.
- primary antibodies anti-Otx2 antibody that stains the ectoderm in the anterior region described in Table 1-1 or 1-2, anti-Ebf1 antibody that is positive in olfactory nerve cells and their progenitor cells, olfactory nerve cells and their progenitor cells
- An anti-Tuj1 antibody that stains nerve cells containing an anti-cytokeratin 5 antibody that is positive in basal cells, and an anti-p75 antibody were used.
- Alexa488-labeled donkey anti-rabbit antibody Alexa488-labeled donkey anti-rabbit antibody
- CF555-labeled donkey anti-mouse antibody Alexa647-labeled donkey anti-goat antibody listed in Table 2
- nuclear counterstaining was performed at 1 ⁇ g/ml.
- Hoechst 33342 manufactured by Sigma Aldrich was added to the secondary antibody diluent.
- Experiment 3 Production and induction of differentiation of cell population containing cells constituting nasal epithelium from human ES cells
- a cell population containing cells constituting nasal epithelium was produced according to the steps shown in the upper part of FIG.
- SAG an active substance of the Shh signaling pathway
- step (3) the activation of the Shh signaling pathway in step (3) enables the preparation of cell clusters in which the non-neural epithelium is more likely to differentiate into the nasal epithelium.
- FIG. 11D A schematic representation of a cell mass containing non-neural epithelial tissue directed toward nasal epithelial-like tissue is shown in FIG. 11D.
- Experiment 4 Investigation of the effect of a substance that reduces oxidative stress in the production and induction of differentiation of a cell population containing cells constituting nasal epithelium from human iPS cells]
- a cell population containing cells constituting the nasal epithelium was produced from the human iPS cell line 1231A3.
- the JNK inhibitor was added from step (1) in the same manner as in Experiment 2, and a substance having an effect of reducing oxidative stress (in FIG. 12 "Antioxidants”) were added and their effects were examined.
- substances that reduce oxidative stress include 300 ⁇ M, 1 mM or 3 mM N-acetyl-L-cysteine (NAC), 250 ⁇ M ascorbic acid diphosphate (AA2P), 500 ⁇ M nicotinamide (NAD), 10 ⁇ M Either ( ⁇ )- ⁇ -tocopherol acetate ( ⁇ TOA) and 1 ⁇ M IM-93 or a combination of AA2P and 1 ⁇ M NAC and NAD were added.
- NAC N-acetyl-L-cysteine
- AAD ascorbic acid diphosphate
- NAD 500 ⁇ M nicotinamide
- 10 ⁇ M Either ( ⁇ )- ⁇ -tocopherol acetate ( ⁇ TOA) and 1 ⁇ M IM-93 or a combination of AA2P and 1 ⁇ M NAC and NAD were added.
- Experiment 5 Expression analysis of influenza virus receptors in human ES cell-derived nasal epithelial organoids
- a cell population containing cells constituting the nasal epithelium was produced according to the steps shown in the upper part of FIG.
- steps (a) to (3) were performed in the same manner as in Comparative Experiment 1, and after obtaining a cell mass containing olfactory nerve cells, the culture was continued (step (4)).
- Bright field observation of the cell population was performed using an inverted microscope on day 35 of culture (A in FIG. 13).
- FIG. 14 shows the staining results.
- FoxJ1 and Actub were stained with the same cells, indicating that ciliated cells differentiated into the cell population. Also, pili cells were clustered in the cell population.
- FIG. 14C shows a still image of one frame of the moving image.
- a pilus-like structure was observed in the epithelium on the surface of the cell population, and it was also observed that it was performing pilus movement. It was found that the production method according to the present invention enables the preparation of a cell population having ciliated cells with ciliary motility on the surface epithelium.
- the nasal epithelial organoids were fixed on day 42 of culture, and the expression of influenza virus receptors was analyzed.
- the sections prepared by the method described in Comparative Experiment 1 were treated with the biotin-labeled Japanese elderberry lectin (Lectin) described in Table 1-1 or 1-2. from Sambucus sieboldiana/SSA-Biotin; manufactured by J-Chemical) was reacted overnight at 4°C, and then Alexa594-labeled streptavidin (manufactured by Thermo Fisher Scientific) listed in Table 2 was used. It was detected by the same method as antibody staining.
- Comparative Experiment 1 in order to detect the expression of the avian influenza virus receptor sialic acid ⁇ 2,3Gal, the method described in Comparative Experiment 1 was performed using an anti-Sia ⁇ 2,3Gal antibody (self-prepared, antibody 3B1E2 described in PCT/JP2020/003782). immunostaining was performed.
- FIG. Cells expressing sialic acid ⁇ 2,6Gal (Sia ⁇ 2,6Gal) and cells expressing sialic acid ⁇ 2,3Gal (Sia ⁇ 2,3Gal) were observed in a cell population containing cells constituting nasal epithelium on day 42 of culture. was done.
- the cells expressing Sia ⁇ 2,6Gal were multi-strand epithelial cells in which the cells were in close contact with each other to form an epithelial structure.
- most of the cells expressing Sia ⁇ 2,3Gal were monolayer squamous epithelium-like cells. Sia ⁇ 2,6 and Sia ⁇ 2,3Gal appeared to be expressed in different cells.
- influenza virus infects cell populations including cells that constitute the nasal epithelium. It was also shown that human influenza viruses and avian human influenza viruses that use Sia ⁇ 2,6Gal and Sia ⁇ 2,3Gal as receptors, respectively, may infect different cells of the nasal epithelium and olfactory epithelium.
- Example 6 Influenza virus infection and virus growth test on human ES cell-derived nasal epithelial organoids
- Human ES cell-derived nasal epithelial organoids prepared by the method described in FIG. 16 were used in the experiment.
- a specific production method is that in step (3), 1 ⁇ M of LDN-193189 (manufactured by Merck) was added as a BMP signaling pathway inhibitor from day 6 of culture, and the TAK1 inhibitor 5z-7oxozeaenol was added. It is the same as Experiment 1 except that there was no Human ES cell-derived nasal epithelial organoids prepared under these production conditions were used in virus infection experiments from Experiment 6 onwards.
- Human ES cell-derived nasal epithelial organoids 28 days after the start of culture were infected with 10,000 PFU of H1N1 human influenza virus A/California/04/2009 (H1N1pdm). Medium was harvested every 24 hours and virus growth and titers were determined each day by the plaque method using HA-MDCK cells. Experiments were performed in 5 replicates.
- Example 7 Confirmation of influenza virus infection of human ES cell-derived nasal epithelial organoids by fluorescent antibody method.
- Human ES cell-derived nasal epithelial organoids infected with human influenza virus by the method described in Experiment 6 were fixed 24, 48, 168, or 264 hours after infection, and the human influenza virus was detected by the fluorescent antibody method described in Comparative Experiment 1. infection was confirmed.
- Anti-influenza virus nucleoprotein antibody (Influenza NP, AbCam, ab20343) described in Table 1-1 or 1-2 is used for detection of influenza virus, and 1 ⁇ g/ml DAPI (Nacalai Tesque) was added to the secondary antibody diluent.
- FIG. 18 shows the staining results 24 hours after infection. From the above results, it was confirmed that the human ES cell-derived nasal epithelial organoids produced by the method described herein were infected with the influenza virus.
- Example 8 Coronavirus SARS-CoV-2 infection and virus proliferation test on human ES cell-derived nasal epithelial organoids
- a coronavirus infection experiment was carried out using human ES cell-derived nasal epithelial organoids prepared by the method described in Experiment 6 and 28 days after the start of culture.
- a virus solution was prepared in 5% KSR gfCDM medium, the medium of the organoids being cultured was removed, 50 ⁇ L of the virus solution was added, and cultured at 37° C. in a 5% CO 2 incubator for 1 hour. .
- Viral infection was performed using SARS-CoV-2 (SARS-CoV-2/Hu/DP/Kng/19-027) under two conditions: low concentration: 10,000 TCID50 or high concentration: 100,000 TCID50. went.
- Viral titers were determined by the following procedure. VeroE6/TMPRSS2 cells were seeded in 96-well plates, and virus-containing culture supernatants were added in 10-fold serial dilutions with 5% FCS DMEM. Three or more wells were inoculated per dilution. Cells were observed after 4-5 days of culture in a CO2 incubator to determine the presence or absence of cytopathic effect (CPE).
- CPE cytopathic effect
- TCID50 was calculated from the number of CPE-positive wells by the Reed-Muench method and used as the virus titer. Experiments were performed in five replicates each for low concentration conditions (L1 to L5 in FIG. 19) and high concentration conditions (H1 to H5 in FIG. 19).
- Virus growth was observed in one of five replicate experiments under low concentration conditions (L3) and in all five replicate experiments under high concentration conditions (H1 to H5).
- the titer of the virus released into the medium reached a maximum on the 2nd and 3rd days after infection, decreased once thereafter, and increased again after 7 days after infection. After that, the virus production reached a second peak from the 15th day to the 17th day after the infection and then decreased, but the virus production continued even on the 22nd day after the infection.
- the re-elevation of the virus titer as described above is a phenomenon that is often observed when a virus proliferation test is performed using tissue derived from a living body instead of cultured cells with uniform properties.
- human ES cell-derived nasal epithelial organoids produced by the method described herein were infected with SARS-CoV-2, viral proliferation occurred in the cells, and they had infectivity. It was shown that extracellular release of virus particles occurred. In addition, since the titer re-increased, it was also shown that the above organoids have properties similar to those of tissues derived from living organisms. It was shown that nasal and olfactory epithelial organoids can be used as coronavirus infection models. Since viruses are continuously produced from organoids, it was found that nasal and olfactory epithelium organoids can also be used as a persistent infection model for coronavirus.
- Fig. 20 shows the staining results of the cell population before infection.
- a cytokeratin 18 (CK18)-positive epithelial structure was formed in which the nasal epithelium (RE) and olfactory epithelium (OE) were continuous on the surface of the cell mass.
- the nasal epithelium portion was cytokeratin 15 (CK15) positive
- the olfactory epithelium portion was Six1 and Sox2 positive.
- ACE2 the receptor for SARS-CoV-2, was particularly strongly expressed in the nasal epithelium (RE).
- Figures 21 and 22 show the staining results of human ES cell-derived nasal epithelial organoids 48 hours after infection.
- a and B of FIG. 22B the nasal epithelium, a cytokeratin 15 (KRT15)-positive epithelial tissue, expresses the SARS-CoV-2 virus receptor ACE2, and some cells were positive for anti-SARS nucleoprotein antibody staining.
- KRT15 cytokeratin 15
- SARS-CoV-2 infects human ES cell-derived nasal epithelial organoids produced by the methods described herein.
- the coronavirus SARS-CoV-2 was also shown to infect the nasal and olfactory epithelia, respectively.
- Salinocytes of the nasal epithelium can be produced by the methods described herein, demonstrating the potential for SARS-CoV-2 to infect saline cells.
- Fig. 23 shows human ES cell-derived nasal epithelial organoids 11 days after infection.
- An Sp8-positive olfactory epithelium (OE) portion remained on the surface of the cell mass.
- cells inside the cell mass were also positive for anti-SARS nucleoprotein antibody staining.
- SARS-CoV-2-infected cells inside the cell mass were Tuj1-positive, indicating that they are neurons of the central nervous system.
- SARS-CoV-2 virus particles were present on the surface and intracellularly of human ES cell-derived nasal epithelial organoids infected with SARS-CoV-2. Furthermore, it is formed during infection with certain viruses, including coronaviruses, such as double-membrane vesicles (DMV) and double-membrane spherules (DMS) in infected cells. A characteristic intracellular structure was observed. From the above results, human ES cell-derived nasal epithelial organoids produced by the method described herein can be infected with viruses such as SARS-CoV-2, and intracellular viral replication/proliferation can occur. shown.
- coronaviruses such as double-membrane vesicles (DMV) and double-membrane spherules (DMS) in infected cells.
- DMV double-membrane vesicles
- DMS double-membrane spherules
- the enzymatic reaction was stopped by adding a medium containing 10% fetal bovine serum, the cells were dispersed into single cells using a P1000 micropipette, and contaminants were removed using a cell strainer with a pore size of 40 ⁇ m.
- the above cell suspension was centrifuged with a swing rotor (1000 rpm, 5 minutes), the supernatant was removed, and the cell pellet was diluted with PBS containing 0.04% BSA to a concentration of 1 ⁇ 10 6 cells/mL. Suspended again.
- Chromium Next GEM Single Cell 3'GEM, Library & Gel Bead Kit v3.1 (manufactured by 10x Genomics, PN-1000121 and PN-1000128) and a chip for single-cell analysis were added to the above suspension corresponding to about 16,000 cells.
- Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit manufactured by 10x Genomics, PN-1000120
- Chromium Controller manufactured by 10x Genomics, PN-1000213 was used according to the procedure attached to the kit using Single Index Kit T Set A (PN-1000213). 10x Genomics) to prepare a cDNA library for single cell analysis.
- the prepared cDNA library of each sample was sequenced using NovaSeq S4 2 x 150 bp (manufactured by Illumina), and the obtained data was analyzed with Cell Ranger software (version 4.0.0), Seurat v4.0 and R package. Analysis was performed using Seurat (version 4.0.3).
- FIG. 1 From data obtained by analyzing human ES cell-derived nasal epithelial organoids infected with SARS-CoV-2 on day 28 of culture and on day 30 of culture, that is, on day 2 after infection (2 days post infection (dpi)) A plot of the created t-distributed stochastic neighborhood embedding (t-SNE) is shown in A of FIG. As a result of clustering, the cells contained in the above organoids could be classified into the cell population of the olfactory epithelium/nasal cavity epithelium (NE) and the cell population of the central nervous system (CNS). Furthermore, FIG.
- 25B shows a violin diagram showing the expression levels of genes highly expressed in the olfactory epithelium, nasal epithelium, and central nervous system, and SARS-CoV-2-derived transcripts in each cell.
- NE was a cell population with high expression of cytokeratin 18, cytokeratin 19, and Six1 genes expressed in the olfactory epithelium/nasal epithelium.
- the CNS was a cell population with high expression of Foxg1, Irx3, Tbr1, Reelin, and Emx1 genes expressed in the central nervous system.
- SARS-CoV-2-derived transcripts membrane (M) and spike (S) proteins indicative of SARS-CoV-2 infection, were found in more cells in the NE but also expressed in the CNS. cells were observed. From the above results, it was shown that the cell population produced by the method according to the present invention contains cells of the olfactory epithelium/nasal epithelium and cells of the central nervous system, and is infected with SARS-CoV-2.
- Example 12 Clustering analysis of cells contained in human ES cell-derived olfactory epithelium/nasal epithelium organoids
- the cell population (NE) of the olfactory epithelium/nasal epithelium contained in the human ES cell-derived nasal epithelial organoids on day 28 of culture in Experiment 11 was further clustered and analyzed.
- the cell populations of the epithelium/nasal cavity epithelium could be classified into 6 clusters.
- a plot of the t-distributed stochastic neighborhood embedding (t-SNE) of the six clusters is shown in FIG.
- each of the six clusters was a group with high expression levels of neuroprogenitor cell markers NeuroD1 and Ascl1 ((1) NPC), and a group with high expression levels of olfactory nerve markers STOML3 and GNG13 ((2) OSC), a population with high expression of immature olfactory nerve marker GNG8 ((3) imOSC), a population with high expression of MUC5AC, a secretory cell/goblet cell marker ((4) MUC), horizontal basal cell marker ((5) HBC), and a population ((6) SUS) with high expression levels of supporting cell markers CYP2A13 and ELF5.
- FIG. 28 shows a heat map of DEG expression levels for each cluster. DEGs for each of the six clusters are shown in FIGS. As a result of the analysis, each cluster showed a different characteristic expression profile in terms of DEG expression level, indicating that they are different types of cells. In addition, there were combinations with similar profiles between clusters, such as (2) OSC and (3) imOSC, indicating developmental and differentiation relationships between populations.
- the cell populations of the olfactory epithelium/nasal epithelium contained in the human ES cell-derived nasal epithelial organoids of the present invention contain at least six types of cells, which are neural progenitor cells, olfactory neurons, and immature olfactory neurons, respectively. They were shown to be nerve cells, secretory cells/goblet cells, horizontal basal cells, and supporting cells.
- FIG. 31A shows a t-SNE plot of single-cell analysis data of olfactory epithelium/nasal epithelium tissue derived from a human patient specimen.
- NPC neural progenitor cells
- OSC olfactory neurons
- imOSC immature olfactory neurons
- MUC secretory cells/goblet cells
- HBC horizontal basal cells
- SUS supporting cells
- the single-cell analysis data of the above human patient samples and human ES cell-derived nasal epithelial organoids were compared. As shown within the box in FIG. 31B, the cells contained in the human ES cell-derived nasal epithelial organoids were plotted at positions very similar to those from human patient specimens. The above results indicated that the cells constituting the human ES cell-derived nasal epithelial organoids of the present invention were composed of cells similar to those in human tissues. In addition, human ES cell-derived nasal epithelial organoids also contained a small number of ciliated cells expressing FoxJ1.
- FIG. 32A shows a gene expression heat map of single-cell analysis data of olfactory epithelium/nasal epithelium tissue derived from a human patient specimen. The majority of olfactory neurons expressing GNG8, GNG13 and STOML3 in human patient specimens expressed only one olfactory receptor that varied from cell to cell.
- multiple olfactory receptors were expressed in one olfactory nerve cell of the human ES cell-derived nasal epithelial organoid (B in FIG. 32). From the above results, human ES cell-derived nasal epithelial organoids express olfactory receptors, and compared to adult human olfactory epithelial tissue, immature olfactory neurons expressing multiple olfactory receptors shown to contain more
- ORF10 and orf1ab which are SARS-CoV-2-derived transcripts
- cells contained in human ES cell-derived nasal epithelial organoids have a certain degree of receptors for interferons and interleukins such as IFNAR1, IFNGR1, and IL1R1.
- IFNAR1, IFNGR1, and IL1R1 was expressed (Fig. 33 asterisk).
- expression of the interferon-stimulated gene ISG15 increased after SARS-CoV-2 infection throughout the cell population, including cells that did not express the S protein, the majority of SARS-CoV-2-derived transcripts. It was enhanced (Fig. 36).
- the above results show that the cell population (cell mass) according to the present invention reproduces in vitro the immune response of non-infected cells to cytokines secreted from virus-infected cells.
- the above two guide RNA expression vectors are introduced into a human ES cell line (KhES-1) together with a Cas9 expression vector (Cas9-2A-eGFP, Addgene, #44719) using Lipofectamine Stem reagent (manufactured by Thermo Fisher) at the same time. did.
- a schematic diagram of the introduced plasmid is shown in FIG. 37A.
- the functions of the introduced guide RNA and Cas9 cause DNA double-strand breaks in the target region of the 5'UTR region and the second intron region of the ACE2 gene, and the non-homologous end-joining repair (NHEJ) possessed by cells causes the deletion of the target region. loss occurs (Fig. 37B).
- the eGFP-positive cells were sorted by a cell sorter, seeded at a low density, and colonies derived from single cells were picked up and cloned. The resulting colonies were evaluated by genomic PCR and genomic sequencing of the Cas9 target region to obtain 2 clones (clone #1, #8) lacking Exon1 and Exon2 of the ACE2 gene in both alleles of the genome. These two cloned strains were induced to differentiate by the method described in FIG. A blot was performed.
- ACE2 As a result, the expression of ACE2 was confirmed in the control wild-type KhES-1, but the expression of ACE2 was not observed in clones #1 and #8 even after differentiation into olfactory epithelium and nasal epithelium on day 28 of culture. (C in FIG. 37). The above results indicated that clones #1 and #8 were established as ACE2 knockout human ES cell lines.
- Example 17 Formation of ACE2 knockout human ES cell line-derived olfactory epithelium/nasal epithelium organoids and SARS-CoV-2 infection experiment
- the ACE2 knockout human ES cell line Clone #1 established in Experiment 16 was induced to differentiate by the method described in FIG. 16 to prepare olfactory epithelium/nasal epithelium organoids. Thereafter, the cells were infected with SARS-CoV-2 in the same manner as the high-concentration conditions in Experiment 8, fixed two days after infection, and analyzed by the fluorescent antibody method. The staining results are shown in FIG.
- KRT15-positive nasal epithelium (NRE) and Sp8-positive olfactory epithelium (OE) are formed in ACE2 knockout human ES cell line-derived olfactory epithelium/nasal epithelium organoids. It was shown to have the ability to differentiate into Expression of ACE2 was not detected in olfactory epithelium-like tissue and nasal cavity epithelium-like tissue, confirming that the ACE2 gene was knocked out. SARS-CoV-2-infected cells were not detected in the ACE2 knockout human ES cell line-derived olfactory epithelium/nasal epithelium organoids even under the same infection conditions as Experiment 8. Therefore, SARS-CoV-2 infection was dependent on ACE2, and ACE2 knockout human ES cell line-derived olfactory and nasal epithelial organoids were shown to be resistant to SARS-CoV-2 infection. .
- Example 18 Coronavirus SARS-CoV-2 infection and virus growth test on nasal epithelial organoids derived from ACE2 knockout human ES cell line
- Differentiation of the ACE2 knockout human ES cell line Clone #1 established in Experiment 16 was performed by the method described in FIG. 16 to prepare olfactory epithelium/nasal epithelium organoids.
- a coronavirus SARS-CoV-2 infection and virus growth test on nasal epithelial organoids was performed by the method described in Experiment 8.
- Experiments were performed in five replicates for each of the low viral load concentration conditions (L1 to L5 in FIG. 39) and the high viral load conditions (H1 to H5 in FIG. 39).
- Experiment 19 Induction of differentiation/maturation by long-term culture of human iPS cell-derived olfactory/nasal epithelial organoids by shaking culture]
- a cell population containing olfactory epithelium-constituting cells and nasal cavity epithelium-constituting cells was produced according to the steps shown in FIG.
- the JNK inhibitor was added from step (1) in the same manner as in Experiment 2, and further, from the middle of step (3), ascorbic acid diphosphate (AA2P), nicotinamide (NAD), N-acetyl- Culture was performed by adding L-cysteine (NAC), and then shaking culture was performed from the 28th day of culture.
- A2P ascorbic acid diphosphate
- NAD nicotinamide
- N-acetyl- Culture was performed by adding L-cysteine (NAC), and then shaking culture was performed from the 28th day of culture.
- Human iPS cell line 1231A3 was used as pluripotent cells.
- cell masses containing olfactory epithelium and nasal epithelium were collected in a conical tube using a tip with a thick tip.
- 25 mL of 10% KSR gfCDM medium was added to a non-adherent 75 cm 2 flask for culture (manufactured by Corning, Inc.). 353133) were transferred with 96 cell clumps.
- anti-N-Cadherin antibodies and olfactory epithelium expressed in epithelial tissues and placodes of the nervous system Immunostaining was performed using an anti-cytokeratin 18 (CK18) antibody, which is a region marker, and the secondary antibodies listed in Table 2.
- FIG. 40 shows the staining results.
- the epithelium was Six1, Sox2, E-Cadherin, Sp8, CK18 and N-Cadherin-positive olfactory epithelium/nasal epithelium tissue. It was found that the maintenance and/or maturation culture of organoids can be performed while maintaining the olfactory epithelium-like tissue and nasal epithelium-like tissue on the surface of the cell mass by shaking culture.
- Experiment 20 Production and induction of differentiation of a cell population containing nasal epithelial tissue and olfactory epithelial tissue forming an olfactory fossa-like structure from human iPS cells]
- a cell population containing nasal epithelium and olfactory epithelium that forms an olfactory fossa-like structure was produced.
- pluripotent stem cells human iPS cells (hiPS ⁇ -actin GFP strain, IPSC1030, purchased from Merck & Co.) that constitutively express GFP by introducing a GFP gene into the ⁇ -actin locus were used.
- Pluripotent stem cells were adapted to feeder-free conditions according to the method described in Scientific Reports, 4, 3594 (2014), and maintained and cultured, as described in International Publication No. 2020/039732.
- StemFit medium (AK02N, manufactured by Ajinomoto Co., Inc.) was used as a feeder-free medium
- Laminin 511-E8 manufactured by Nippi Co., Ltd.
- the specific maintenance culture operation was performed in the same manner as in the culture of human ES cells described in Comparative Experiment 1.
- step (a) start When the cultured pluripotent stem cells were used for differentiation induction, 5 ⁇ M SB431542 and 300 nMSAG were added at the same time as the StemFit medium was changed 6 days after seeding, and the cells were cultured for 24 hours (step (a) start).
- the prepared subconfluent human iPS cells were treated with 5 mM EDTA/PBS in the same manner as in the above passage.
- a serum-free medium for differentiation induction was added, and the cells were peeled from the culture dish surface by pipetting and dispersed into single cells.
- the human iPS cells dispersed into single cells were suspended in a non-cell-adhesive 96-well culture plate in 100 ⁇ l of serum-free medium so that 1.35 ⁇ 10 4 cells per well, and centrifuged with a swing rotor. After collecting the cells on the bottom surface using a machine, they were subjected to suspension culture under the conditions of 37° C. and 5% CO 2 . 5% KSR gfCDM was used as the serum-free medium at that time (start of step (1)).
- step (1) At the start of the suspension culture (0 days after the start of the suspension culture, step (1) is started), Y27632 (final concentration 10 ⁇ M), IWP-2 (final concentration 1 ⁇ M), SB431542 (final concentration 1 ⁇ M), JNK were added to the serum-free medium. - IN-8 (1 ⁇ M final concentration) was added.
- step (2) start 50 ⁇ l per well of a serum-free medium containing IWP-2, SB431542, JNK-IN-8, and BMP4 (final concentration 0.5 nM) without Y27632 was added on day 1 after the start of suspension culture (step (2) start).
- a free culture medium containing IWP-2, SB431542, JNK-IN-8, K02288 (final concentration 1 ⁇ M), 5Z-7-Oxo Zeaenol (final concentration 2 ⁇ M) was added without Y27632 and BMP4. 50 ⁇ l of serum medium was added per well (start of step (3)). After that, on the 6th, 10th, 13th and 17th days of culture, half the medium was exchanged in the same manner.
- NAC N-acetyl-L-cysteine
- A2P ascorbic acid diphosphate
- NAD nicotinamide
- the cell population was collected from the 96-well culture plate, transferred to a dish for suspension culture, and observed under oblique illumination and fluorescence using an inverted fluorescence microscope (BIOREVO BZ-X800, manufactured by Keyence Corporation). was performed (A in FIG. 42).
- the surface of the cell mass produced from human iPS cells according to the present invention is covered with non-neural epithelial tissue, and an olfactory epithelium-like tissue that is continuous with the non-neural epithelium and thicker than the non-neural epithelium is formed.
- the olfactory epithelium-like tissue invaded inside the cell mass and formed an olfactory fossa-like structure.
- anti-GFP antibodies that recognize GFP that is constitutively expressed in the hiPS ⁇ -actin GFP strain, olfactory Anti-Ebf2 antibody, Lhx2 antibody positive in nerve cells and their progenitor cells, anti- ⁇ -catenin antibody, cytokeratin 18 antibody, EpCAM antibody positive in olfactory epithelium and non-neural epithelium, positive in olfactory epithelium and central nervous system N-Cadherin antibody, anti-Pax6 antibody expressed in olfactory epithelium-like tissue, anti-EGFR antibody expressed in non-neural epithelium-like tissue, anti-laminin antibody expressed in basement membrane-like structure, anti-collagen 4 antibody, basal adhesive surface of cells An anti- ⁇ 4 integrin antibody, which is positive at
- FIGS. 43 and 44 The staining results are shown in the upper part of FIGS. 43 and 44.
- a schematic diagram of the cell population formed by this production method is shown in the lower part of FIG.
- the olfactory epithelium-like tissue which is a multi-stratified epithelium thickened on the surface of the cell mass, is bent and the central part is depressed, forming an olfactory fossa-like structure that serves as the primordium of the olfactory organ of the embryo.
- Non-neural epithelium covered the surface of the cell mass continuously with olfactory epithelium-like tissue.
- the inside of the cell mass is cells of the central nervous system, and a laminin- and collagen-4-positive basement membrane-like structure is formed between the continuous olfactory epithelium-like tissue, olfactory fossa-like structure, and non-neural epithelial tissue on the surface of the cell mass. It had been.
- the cell mass surface side of the olfactory epithelium-like tissue, olfactory fossa-like structure, and non-neural epithelial tissue was the Ezrin-positive apical surface, and the apical surface-basal surface cell polarity was formed.
- ⁇ 4 integrin-positive was found in the area in contact with the basement membrane-like structure of the olfactory epithelium-like tissue.
- the olfactory epithelium-like tissue was positive for E-Cadherin, ⁇ -Catenin, cytokeratin 18, N-Cadherin, Pax6, Sox2, Six1, ACE2, Sp8, pancytokeratin, and EpCAM. Tuj1, N-Cadherin, Ebf2, Lhx2 and Calretinin-positive olfactory nerve cells or their progenitor cells were present.
- Non-neuroepithelial tissues that could later differentiate into nasal epithelial tissues were positive for E-Cadherin, ⁇ -catenin, CK18, EGFR, ACE2, Six1 and pancytokeratin.
- Central nervous system tissues were positive for N-CAM, Tuj1, N-Cadherin, Pax6 and Sox2. From the above results, it was found that a cell population having an olfactory cavity-like structure can be produced from pluripotent stem cells by the production method according to the present invention.
- Experiment 21 Production and induction of differentiation of a cell population containing nasal epithelial tissue from human iPS cells using cultureware with divided microwells
- a cell population containing nasal epithelial tissue was produced using cultureware having divided microwells according to the steps shown in the upper part of FIG.
- Human iPS cell 1231A3 strain was used as pluripotent stem cells.
- Cells used for differentiation induction were prepared in the same manner as in Experiment 20.
- step (1) At the start of the suspension culture (0 days after the start of the suspension culture, step (1) is started), Y27632 (final concentration 10 ⁇ M), IWP-2 (final concentration 1 ⁇ M), SB431542 (final concentration 1 ⁇ M), JNK were added to the serum-free medium. - IN-8 (1 ⁇ M final concentration) was added.
- step (3) start After that, on the 6th, 10th, 13th and 17th days of culture, 6 ml of medium was collected from the dish without sucking cell aggregates, and 6 ml of new medium was added to replace half of the medium.
- NAC N-acetyl-L-cysteine
- A2P ascorbic acid diphosphate
- NAD nicotinamide
- Experiment 22 Production and induction of differentiation of a cell population containing nasal epithelial tissue from human iPS cells using cultureware with divided microwells
- a cell population containing nasal epithelial tissue was produced using cultureware having divided microwells according to the steps shown in the upper part of FIG.
- Human iPS cell 1231A3 strain was used as pluripotent stem cells.
- Cells used for differentiation induction were prepared in the same manner as in Experiment 20.
- a serum-free medium for differentiation induction was added, and the cells were peeled off from the culture dish surface by pipetting, dispersed into single cells, and added to a previously prepared AggreWell 800, 6-well plate, per well.
- the cells were suspended in 5 ml of serum-free medium equilibrated to 5.4 ⁇ 10 6 cells and cultured in suspension at 37° C. and 5% CO 2 .
- 5% KSR gfCDM was used as the serum-free medium at that time (start of step (1)).
- step (1) At the start of the suspension culture (0 days after the start of the suspension culture, step (1) is started), Y27632 (final concentration 10 ⁇ M), IWP-2 (final concentration 1 ⁇ M), SB431542 (final concentration 1 ⁇ M), JNK were added to the serum-free medium. - IN-8 (1 ⁇ M final concentration) was added.
- step (2) start After confirming the formation of cell aggregates in the microwells with a microscope on the first day after the start of suspension culture, Y27632 was not included, and IWP-2, SB431542, JNK-IN-8, BMP4 (final concentration 1 ml of serum-free medium containing 1 nM) was added per well (step (2) start).
- the cell aggregates were collected in a 37 ⁇ m Reversible Strainer Large (27250, manufactured by STEMCELL Technologies) using a wide-bore 1000 ⁇ l pipette tip, and dead cells and debris were removed, followed by 10 cm suspension culture. transferred to a serving dish.
- the medium did not contain Y27632 and BMP4, and contained 5% KSR gfCDM containing IWP-2, SB431542, JNK-IN-8, K02288 (final concentration 1 ⁇ M), 5Z-7-Oxo Zeaenol (final concentration 2 ⁇ M). was used (step (3) start).
- phase contrast observation and oblique illumination observation were performed using an inverted fluorescence microscope (BIOREVO BZ-X800, manufactured by Keyence Corporation) (A in FIG. 46).
- BIOREVO BZ-X800 inverted fluorescence microscope
- StemFit medium (AK02N, manufactured by Ajinomoto Co., Inc.) was used as a feeder-free medium, and Laminin 511-E8 (manufactured by Nippi Co., Ltd.) was used as a feeder-free scaffold.
- the specific maintenance culture operation was performed in the same manner as in the culture of human ES cells described in Comparative Experiment 1.
- SB431542 TGF- ⁇ signaling pathway inhibitor, manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd., final concentration 5 ⁇ M
- SAG Shh signaling pathway active substance, manufactured by Enzo Life Sciences, final concentration 300 nM
- the prepared subconfluent human ES cells were treated with 5 mM EDTA/PBS in the same manner as in the above passage.
- a serum-free medium for differentiation induction was added, and the cells were peeled from the culture dish surface by pipetting, dispersed into single cells, and collected.
- the human ES cells dispersed into single cells were placed in a cell-adhesive flat-bottom 96-well plate (manufactured by Corning), and the cells were suspended in 100 ⁇ l of serum-free medium so that 1 ⁇ 10 3 cells per well. and adherently cultured under conditions of 37° C. and 5% CO 2 .
- the culture plate at that time was coated with Laminin 511-E8 (manufactured by Nippi Co., Ltd.).
- Laminin 511-E8 manufactured by Nippi Co., Ltd.
- 5% Knockout Serum Replacement manufactured by Thermo Fisher Scientific was added to a mixture of F-12 + Glutamax medium (manufactured by Thermo Fisher Scientific) and IMDM + Glutamax medium (manufactured by Thermo Fisher Scientific) at a volume ratio of 1:1.
- step (1) start 450 ⁇ M 1-monothioglycerol (manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 1 ⁇ Chemically defined lipid concentrate (manufactured by Thermo Fisher Scientific), and 50 units/ml penicillin-50 ⁇ g/ml streptomycin (manufactured by Nacalai Tesque Co., Ltd.) were added.
- a culture medium was used (step (1) start).
- step (1) At the start of adhesion culture (day 0 after the start of adhesion culture, step (1) start), Y27632 (final concentration 10 ⁇ M), IWP-2 (final concentration 0.5 ⁇ M), SB431542 (final concentration 1 ⁇ M) were added to the serum-free medium. was added.
- Y27632 and BMP4 were not included, and IWP-2, SB431542, bFGF (final concentration 20 ng/ml), Heparin Sodium (final concentration 10 ⁇ g/ml), LDN-193189 (final concentration 100 nM).
- a half-volume medium exchange was performed using a serum-free medium containing (step (3) start). Thereafter, half of the medium was exchanged in the same manner every 2 or 3 days of culture to prepare cell populations and two-dimensional (2D) organoids containing cells constituting the nasal epithelium.
- BMP4 When BMP4, bFGF, Heparin Sodium, and LDN-193189 were first added, they were each added at twice the concentration to the medium that was added in half-exchange, so that the final concentration in the wells was the indicated concentration. When replacing the medium thereafter, it was added to the medium at the indicated final concentration.
- cytokeratin 18 On the 47th day after the start of culture, immunostaining for cytokeratin 18 (KRT18) and SP8 was performed, and observation was performed using a confocal laser microscope (manufactured by Leica, TCS SP8) (Fig. 47).
- cytokeratin 18-positive nasal epithelial cells SP8-positive central nervous system cells
- cytokeratin 18- and SP8-positive olfactory epithelial cells were contained, and they exhibited a continuous epithelial structure. It was found that cell populations forming epithelial tissue and two-dimensional (2D) organoids can be prepared.
- Example 24 Seasonal coronavirus infection/proliferation experiment on cell populations/two-dimensional organoids containing cells constituting nasal epithelium produced from human ES cells.
- a seasonal coronavirus infection/proliferation experiment was performed on the cell populations and two-dimensional (2D) organoids containing cells constituting the nasal epithelium produced by the method described in Experiment 23.
- human ES cell-derived nasal epithelial 2D organoids were treated as described in Japanese Journal of Infectious Diseases, 2021, 74.4: 285-292. and Japanese journal of infectious diseases, 2015, 68.5: 442-445.
- Seasonal coronavirus strain HCoV-229E strain (may be referred to as “229E”), HCoV-OC43 strain (may be referred to as “OC43”), HCoV-NL63 strain according to the method described in (may be described as "NL63”), HCoV-HKU1 strain (may be described as "HKU1"), 4 strains (obtained from Kyoto Prefectural University of Medicine and Yamagata Institute of Health). , the amount of virus multiplication after infection was measured over time. As a specific infection/proliferation experiment procedure, first, 5 ⁇ 10 5 copies/well as a low dose and 5 ⁇ 10 6 copies/well as a high dose for human ES cell-derived nasal epithelial 2D organoids on day 28 of culture.
- virus growth test using MRC5 cells for HCoV-229E strain, HCT-8 cells for HCoV-OC43 strain, LLC-MK2-N cells for HCoV-NL63 strain, and VeroE6-TM2 cells for HCoV-HKU1 strain. were performed and compared to studies using human ES cell-derived nasal epithelial 2D organoids.
- the results of the virus proliferation test are shown in Figures 48, 49 and 50.
- human ES cell-derived nasal epithelial 2D organoids were able to produce seasonal coronavirus strains HCoV-229E strain, HCoV-OC43 strain, HCoV-NL63 strain, HCoV- It was found to support the growth of all four HKU1 strains.
- the HCoV-NL63 strain and the HCoV-HKU1 strain are seasonal coronavirus strains that are difficult to support growth in established cell lines. It was shown that coronaviruses can be isolated, cultured, propagated, and prepared (Fig. 50).
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Abstract
鼻腔上皮を構成する細胞の製造方法であって、Wntシグナル伝達経路阻害物質の存在下で多能性幹細胞を浮遊培養する工程(1)、BMPシグナル伝達経路作用物質の存在下で、前記工程(1)で培養した細胞を浮遊培養する工程(2)、FGFシグナル伝達経路作用物質及びBMPシグナル伝達経路阻害物質からなる群より選ばれる少なくとも1つの存在下で、前記工程(2)で培養した細胞を浮遊培養する工程(3)、及び前記工程(3)で培養した細胞をさらに浮遊培養し、前記鼻腔上皮を構成する細胞を得る工程(4)であって、Wntシグナル伝達経路阻害物質、FGFシグナル伝達経路作用物質及びBMPシグナル伝達経路阻害物質からなる群より選ばれる少なくとも2つの非存在下で前記細胞を浮遊培養する工程を含む、製造方法。
Description
本発明は、鼻腔上皮を構成する細胞の製造方法、及び鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞を含む細胞集団に関する。
非特許文献1において、マウスiPS細胞から形成させた胚様体を、マウスから採取した嗅上皮又は嗅球の初代培養細胞と共培養することにより、一部の嗅神経細胞マーカーを発現する神経細胞が分化誘導されることが報告されている。非特許文献2において、ヒト多能性幹細胞から嗅覚プラコード細胞及び嗅神経細胞を製造したことが報告されている。また、本願の発明者は、特許文献1において、ヒトES細胞及びiPS細胞より立体的な非神経上皮組織及び嗅上皮組織を製造可能であることを報告している。
Int J Clin Exp Pathol 2017;10(7):8072-8081
Stem Cells Dev. 2022 May 20. doi: 10.1089/scd.2021.0257.
しかしながら、特許文献1には、鼻腔上皮組織を効率よく製造することは記載されていない。本発明の目的は、多能性幹細胞から効率よく鼻腔上皮を構成する細胞を製造する方法を提供することである。
本発明者らは、上記課題を解決すべく検討を重ねたところ、多能性幹細胞をWntシグナル伝達経路阻害物質の存在下で培養し、一度BMPシグナル伝達経路作用物質を添加して一定期間培養したのちに、FGFシグナル伝達経路作用物質及びBMPシグナル伝達経路阻害物質からなる群より選ばれる少なくとも1つを添加して培養を行い、さらにWntシグナル伝達経路阻害物質、FGFシグナル伝達経路作用物質及びBMPシグナル伝達経路阻害物質からなる群より選ばれる少なくとも1つの非存在下で培養を継続することで鼻腔上皮を構成する細胞を効率よく製造できることを見出した。培養の継続は、FGFシグナル伝達経路阻害物質、Shhシグナル伝達経路作用物質、BMPシグナル伝達経路作用物質、Wntシグナル伝達経路作用物質、Notchシグナル伝達経路阻害物質、アクチビン/TGF-βシグナル伝達経路作用物質及びレチノイン酸シグナル伝達経路作用物質からなる群より選ばれる少なくとも1つの存在下で行うことが好ましい。さらに、一つのウェルが複数のマイクロウェルに分割され、前記マイクロウェルの1つにつき、1つの細胞塊が形成される培養器材を用いることで、鼻腔上皮を構成する細胞を含む細胞塊をさらに効率よく製造できることを見出した。さらに、別の態様として、多能性幹細胞をWntシグナル伝達経路阻害物質の存在下で器材表面において接着培養し、一度BMPシグナル伝達経路作用物質を添加して一定期間培養したのちに、FGFシグナル伝達経路作用物質及びBMPシグナル伝達経路阻害物質からなる群より選ばれる少なくとも1つを添加して培養を行うことによっても、鼻腔上皮を構成する細胞を効率よく製造できることを見出した。
本発明は、以下に例示する鼻腔上皮を構成する細胞の製造方法、鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞を含む細胞集団、該細胞集団の疾患モデルとしての使用方法等に関する。
[1] 鼻腔上皮を構成する細胞の製造方法であって、
Wntシグナル伝達経路阻害物質の存在下で多能性幹細胞を培養する工程(1)、
BMPシグナル伝達経路作用物質の存在下で、前記工程(1)で培養した細胞を培養する工程(2)、
FGFシグナル伝達経路作用物質及びBMPシグナル伝達経路阻害物質からなる群より選ばれる少なくとも1つの存在下で、前記工程(2)で培養した細胞を培養する工程(3)、及び
前記工程(3)で培養した細胞をさらに培養し、前記鼻腔上皮を構成する細胞を得る工程(4)であって、Wntシグナル伝達経路阻害物質、FGFシグナル伝達経路作用物質及びBMPシグナル伝達経路阻害物質からなる群より選ばれる少なくとも2つの非存在下で前記細胞を培養する工程を含む、製造方法。
[2] 前記工程(4)において、Wntシグナル伝達経路阻害物質、FGFシグナル伝達経路作用物質及びBMPシグナル伝達経路阻害物質の非存在下で前記細胞を培養する、[1]に記載の製造方法。
[3] 前記工程(4)において、FGFシグナル伝達経路阻害物質、Shhシグナル伝達経路作用物質、BMPシグナル伝達経路作用物質、Wntシグナル伝達経路作用物質、Notchシグナル伝達経路阻害物質、アクチビン/TGF-βシグナル伝達経路作用物質及びレチノイン酸シグナル伝達経路作用物質からなる群より選ばれる少なくとも1つの存在下で前記細胞を培養する、[1]又は[2]に記載の製造方法。
[4] 鼻腔上皮を構成する細胞の製造方法であって、
Wntシグナル伝達経路阻害物質の存在下で多能性幹細胞を培養する工程(1)であって、前記多能性幹細胞を浮遊培養し、細胞凝集体を形成させる工程、
BMPシグナル伝達経路作用物質の存在下で、前記工程(1)で培養した細胞を培養する工程(2)であって、前記細胞凝集体を浮遊培養する工程、
FGFシグナル伝達経路作用物質及びBMPシグナル伝達経路阻害物質からなる群より選ばれる少なくとも1つの存在下で、前記工程(2)で培養した細胞を培養する工程(3)であって、前記細胞凝集体を浮遊培養する工程、及び
前記工程(3)で培養した細胞をさらに培養し、前記鼻腔上皮を構成する細胞を得る工程(4)であって、FGFシグナル伝達経路阻害物質、Shhシグナル伝達経路作用物質、BMPシグナル伝達経路作用物質、Wntシグナル伝達経路作用物質、Notchシグナル伝達経路阻害物質、アクチビン/TGF-βシグナル伝達経路作用物質及びレチノイン酸シグナル伝達経路作用物質からなる群より選ばれる少なくとも1つの存在下で前記細胞凝集体を浮遊培養する工程を含む、製造方法。
[5]前記工程(1)、及び工程(2)から(4)のうち任意の工程の浮遊培養を、少なくとも1つのウェルが形成されている培養器材中で実施し、
前記ウェルは、複数のマイクロウェルに分割されていて、
前記マイクロウェルの1つにつき、1つの細胞塊が形成されるように浮遊培養を実施する、[4]に記載の製造方法。
[6]前記培養器材は、前記1つのウェルが少なくとも1cm2以上の底面積を有し、
前記ウェルは、少なくとも1cm2あたり4つ以上のマイクロウェルに分割されている、[5]に記載の製造方法。
[7] 鼻腔上皮を構成する細胞の製造方法であって、
Wntシグナル伝達経路阻害物質の存在下で多能性幹細胞を培養する工程(1)であって、前記多能性幹細胞を培養器材上で接着培養する工程、
BMPシグナル伝達経路作用物質の存在下で、前記工程(1)で培養した細胞を培養する工程(2)であって、前記細胞を接着培養する工程、
FGFシグナル伝達経路作用物質及びBMPシグナル伝達経路阻害物質からなる群より選ばれる少なくとも1つの存在下で、前記工程(2)で培養した細胞を培養する工程(3)であって、前記細胞を接着培養する工程、及び
前記工程(3)で培養した細胞をさらに培養し、前記鼻腔上皮を構成する細胞を得る工程(4)であって、FGFシグナル伝達経路阻害物質、Shhシグナル伝達経路作用物質、BMPシグナル伝達経路作用物質、Wntシグナル伝達経路作用物質、Notchシグナル伝達経路阻害物質、アクチビン/TGF-βシグナル伝達経路作用物質及びレチノイン酸シグナル伝達経路作用物質からなる群より選ばれる少なくとも1つの存在下で前記細胞を接着培養する工程を含む、製造方法。
[8] 前記培養器材は、細胞外マトリクス又は合成細胞接着分子でコーティングされている、[7]に記載の製造方法。
[9] 前記培養器材は、培地の灌流を行なうための流路を有し、
前記工程(1)、前記工程(2)、前記工程(3)及び前記工程(4)からなる群より選ばれる少なくとも1つの工程において、灌流環境下で前記細胞を接着培養する、[7]又は[8]に記載の製造方法。
[10] 前記培養器材は、酸素又は培地を透過する膜を有する、[7]~[9]のいずれかに記載の製造方法。
[11] 鼻腔上皮を構成する細胞の製造方法であって、
Wntシグナル伝達経路阻害物質の存在下で多能性幹細胞を培養する工程(1)であって、前記多能性幹細胞を浮遊培養し、細胞凝集体を形成させる工程、
BMPシグナル伝達経路作用物質の存在下で、前記工程(1)で培養した細胞を培養する工程(2)であって、前記細胞凝集体を浮遊培養する工程、
FGFシグナル伝達経路作用物質及びBMPシグナル伝達経路阻害物質からなる群より選ばれる少なくとも1つの存在下で、前記工程(2)で培養した細胞を培養する工程(3)であって、前記細胞凝集体中に嗅神経前駆細胞が分化するまで浮遊培養する工程、及び
前記工程(3)で培養した細胞をさらに培養し、前記鼻腔上皮を構成する細胞を得る工程(4)であって、前記細胞凝集体を浮遊培養し、前記嗅神経前駆細胞が存在する上皮と連続する上皮上に前記鼻腔上皮を構成する細胞を得る工程を含む、製造方法。
[12] 前記BMPシグナル伝達経路作用物質は、BMP2、BMP4、BMP7、BMP13及びGDF7からなる群より選ばれる少なくとも1つを含む、[1]~[11]のいずれかに記載の製造方法。
[13] 前記工程(3)において、FGFシグナル伝達経路作用物質の存在下で細胞を培養し、
前記FGFシグナル伝達経路作用物質は、FGF2、FGF3、FGF7、FGF8、FGF10及びこれらの改変体からなる群より選ばれる少なくとも1つを含む、[1]~[12]のいずれかに記載の製造方法。
[14] 前記Wntシグナル伝達経路阻害物質は、非古典的Wnt経路に対する阻害活性を有する物質を含む、[1]~[13]のいずれかに記載の製造方法。
[15] 前記Wntシグナル伝達経路阻害物質は、PORCN阻害剤を含む、[1]~[14]のいずれかに記載の製造方法。
[16] 前記PORCN阻害剤は、IWP-2、IWP-3、IWP-4、IWP-L6、IWP-12、IWP-O1、LGK-974、Wnt-C59、ETC-131、ETC-159、GNF-1331、GNF-6231、Porcn-IN-1、RXC004、CGX1321及びこれらの誘導体からなる群より選ばれる少なくとも1つを含む、[15]に記載の製造方法。
[17] 前記Wntシグナル伝達経路阻害物質は、Wnt/JNKシグナル伝達経路阻害物質を含む、[1]~[16]のいずれかに記載の製造方法。
[18] 前記Wnt/JNKシグナル伝達経路阻害物質は、JNK阻害剤を含む、[17]に記載の製造方法。
[19] 前記JNK阻害剤は、SP600125、JNK-IN-8、DB07268、IQ-1S、Tanzisertib、Bentamapimod、BI-78D3、CC-401、TCS JNK 5a、AS601245、CV-65、D-JNK1、ER-358063、ER-409903、ER-417258、CC-359、CC-930、SB203580及びこれらの誘導体からなる群より選ばれる少なくとも1つを含む、[18]に記載の製造方法。
[20] 前記JNK阻害剤はJNK-IN-8を含み、
前記JNK-IN-8の濃度が1nM~50μMである培地中で前記工程(1)を開始する、[18]又は[19]に記載の製造方法。
[21] 前記Wnt/JNKシグナル伝達経路阻害物質は、Rac阻害剤を含む、[17]~[20]のいずれかに記載の製造方法。
[22] 前記Rac阻害剤は、NSC23766、EHop-016、ZCL278、MBQ-167、KRpep-2d、ARS-853、Salirasib、ML141、EHT1864及びこれらの誘導体からなる群より選ばれる少なくとも1つを含む、[21]に記載の製造方法。
[23] 前記工程(3)において、BMPシグナル伝達経路阻害物質の存在下で細胞を培養し、
前記BMPシグナル伝達経路阻害物質は、I型BMP受容体阻害剤を含む、[1]~[22]のいずれかに記載の製造方法。
[24] 前記I型BMP受容体阻害剤は、K02288、Dorsomorphin、LDN-193189、LDN-212854、LDN-214117、ML347、DMH1、DMH2、Compound 1、VU5350、OD52、E6201、Saracatinib、BYL719及びこれらの誘導体からなる群より選ばれる少なくとも1つを含む、[23]に記載の製造方法。
[25] 前記工程(3)及び前記工程(4)からなる群より選ばれる少なくとも1つの工程において、EGFシグナル伝達経路作用物質がさらに存在する、[1]~[24]のいずれかに記載の製造方法。
[26] 前記工程(1)、前記工程(2)、前記工程(3)及び前記工程(4)からなる群より選ばれる少なくとも1つの工程において、TGFβシグナル伝達経路阻害物質がさらに存在する、[1]~[25]のいずれかに記載の製造方法。
[27] 前記TGFβシグナル伝達経路阻害物質は、Alk5/TGFβR1阻害剤を含む、[26]に記載の製造方法。
[28] 前記Alk5/TGFβR1阻害剤は、SB431542、SB505124、SB525334、LY2157299、GW788388、LY364947、SD-208、EW-7197、A83-01、A77-01、RepSox、BIBF-0775、TP0427736、TGFBR1-IN-1、SM-16、TEW-7197、LY3200882、LY2109761、KRCA 0008、GSK 1838705、Crizotinib、Ceritinib、ASP 3026、TAE684、AZD3463及びこれらの誘導体からなる群より選ばれる少なくとも1つを含む、[27]に記載の製造方法。
[29] 前記工程(1)、前記工程(2)、前記工程(3)及び前記工程(4)からなる群より選ばれる少なくとも1つの工程において、TAK1阻害物質がさらに存在する、[1]~[28]のいずれかに記載の製造方法。
[30] 前記TAK1阻害物質が、(5Z)-7-Oxozeaenol、N-Des(aminocarbonyl)AZ-TAK1 inhibitor、Takinib、NG25及びこれらの誘導体からなる群より選ばれる少なくとも1つを含む、[29]に記載の製造方法。
[31] 前記工程(3)及び前記工程(4)からなる群より選ばれる少なくとも1つの工程において、酸化ストレスを軽減する作用を有する物質がさらに存在する、[1]~[30]のいずれかに記載の製造方法。
[32] 酸化ストレスを軽減する作用を有する物質が、アスコルビン酸、N-アセチル-L-システイン、ニコチンアミド及びこれらの誘導体からなる群より選ばれる少なくとも1つを含む、[31]に記載の製造方法。
[33] 前記工程(3)及び前記工程(4)からなる群より選ばれる少なくとも1つの工程において、ストレス応答シグナル伝達経路に対する阻害物質がさらに存在する、[1]~[32]のいずれかに記載の製造方法。
[34] 前記工程(3)及び前記工程(4)からなる群より選ばれる少なくとも1つの工程において、揺動しながら細胞を培養する、[1]~[33]のいずれかに記載の製造方法。
[35] 鼻腔上皮を構成する細胞の製造方法であって、
FGFシグナル伝達経路阻害物質、Shhシグナル伝達経路作用物質、BMPシグナル伝達経路作用物質、Wntシグナル伝達経路作用物質、Notchシグナル伝達経路阻害物質、アクチビン/TGF-βシグナル伝達経路作用物質及びレチノイン酸シグナル伝達経路作用物質からなる群より選ばれる少なくとも1つの存在下で、嗅神経細胞又はその前駆細胞を含む細胞集団を培養する工程を含む、製造方法。
[36] [1]~[35]のいずれかに記載の製造方法により得られる、鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞を含む細胞集団。
[37] 鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞を含む細胞集団。
[38] 前記鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞は、外胚葉マーカーを発現する、[37]に記載の細胞集団。
[39] 前記鼻腔上皮を構成する細胞は、分泌細胞を含む、[37]又は[38]に記載の細胞集団。
[40] 前記分泌細胞は、ムチン1、ムチン2、ムチン3、ムチン4、ムチン5AC、ムチン5B、FoxA1、FoxA2、Nkx2.1/TTF-1及びSPDEFからなる群より選ばれる少なくとも1つを発現する、[39]に記載の細胞集団。
[41] 前記鼻腔上皮を構成する細胞は、線毛細胞を含む、[37]~[40]のいずれかに記載の細胞集団。
[42] 前記線毛細胞は、FoxJ1、FoxN4、p73、アセチル化チューブリン及びβ4-Tubulinからなる群より選ばれる少なくとも1つを発現する、[41]に記載の細胞集団。
[43] 前記線毛細胞は、細胞表面に線毛構造を有する、[42]又は[42]に記載の細胞集団。
[44] 前記鼻腔上皮を構成する細胞は、基底細胞を含む、[37]~[43]のいずれかに記載の細胞集団。
[45] 前記基底細胞は、サイトケラチン5、サイトケラチン14、サイトケラチン15、p63、ΔNp63及びp75からなる群より選ばれる少なくとも1つを発現する、[44]に記載の細胞集団。
[46] 前記鼻腔上皮を構成する細胞は、塩類細胞を含む、[37]~[45]のいずれかに記載の細胞集団。
[47] 前記塩類細胞は、CFTR、Foxi1、液胞型プロトンATPase、Ascl3、Tfcp2l1及びDMRT2からなる群より選ばれる少なくとも1つを発現する、[46]に記載の細胞集団。
[48] 前記鼻腔上皮を構成する細胞は、神経内分泌細胞を含む、[37]~[47]のいずれかに記載の細胞集団。
[49] 前記神経内分泌細胞は、Ascl1、NeuroD1、Chromogranin A、Synaptophisin及び神経特異エノラーゼ(NSE)からなる群より選ばれる少なくとも1つを発現する、[48]に記載の細胞集団。
[50] 前記鼻腔上皮を構成する細胞は、孤立化学感覚上皮細胞を含む、[37]~[49]のいずれかに記載の細胞集団。
[51] 前記鼻腔上皮を構成する細胞は、クラブ細胞を含む、[37]~[50]のいずれかに記載の細胞集団。
[52] 前記鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞は、ウイルス受容体又はウイルス感染関連因子を発現する、[37]~[51]のいずれかに記載の細胞集団。
[53] 前記ウイルス受容体又は前記ウイルス感染関連因子は、ACE2、シアル酸α2,6Gal及びシアル酸α2,3Galからなる群より選ばれる少なくとも1つを含む、[52]に記載の細胞集団。
[54] 基底側と頂端側との極性を有する、[37]~[53]のいずれかに記載の細胞集団。
[55] 前記鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞は、細胞種ごとに集合している、[37]~[54]のいずれかに記載の細胞集団。
[56] 嗅上皮を構成する細胞又はその前駆細胞をさらに含む、[37]~[55]のいずれかに記載の細胞集団。
[57] 前記嗅上皮を構成する細胞は、嗅神経細胞を含む、[56]に記載の細胞集団。
[58] 中枢神経系を構成する神経系細胞をさらに含む、[37]~[57]のいずれかに記載の細胞集団。
[59] 前記鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞を含む鼻腔上皮様組織と、前記鼻腔上皮様組織によって表面の少なくとも一部が被覆された神経組織とを有し、
前記神経組織は、中枢神経系を構成する神経系細胞又はその前駆細胞を含む、[37]~[58]のいずれかに記載の細胞集団。
[60] 前記神経組織の表面の少なくとも一部を被覆する嗅上皮様組織をさらに含み、
前記嗅上皮様組織は、嗅上皮を構成する細胞又はその前駆細胞を含む、[59]に記載の細胞集団。
[61] 前記鼻腔上皮様組織と前記嗅上皮様組織とは、連続的に形成されている、[60]に記載の細胞集団。
[62] 前記嗅上皮様組織が細胞塊内側に向かって陥入しており、嗅窩様構造を形成している、[61]に記載の細胞集団。
[63] 前記鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞は、遺伝性疾患又は感染症に関連する遺伝子が欠損又は変異している、[36]~[62]のいずれかに記載の細胞集団。
[64]前記遺伝性疾患又は感染症に関連する遺伝子はACE2である、[63]に記載の細胞集団。
[65] [36]~[64]のいずれかに記載の細胞集団を用いた、疾患治療用化合物のスクリーニング方法。
[66] [36]~[64]のいずれかに記載の細胞集団を含む、疾患治療用化合物のスクリーニングキット。
[67] 鼻腔上皮の疾患モデルとしての[36]~[64]のいずれかに記載の細胞集団の使用方法。
[68] [36]~[64]のいずれかに記載の細胞集団を用いた対象物質の薬効又は毒性の評価方法。
[69] [36]~[64]のいずれかに記載の細胞集団を用いた対象物質の薬効又は毒性の評価キット。
[70] [36]~[64]のいずれかに記載の細胞集団を用いた、疾患特異的なバイオマーカーの探索方法。
[71] [36]~[64]のいずれかに記載の細胞集団又はその細胞集団から精製された細胞を含む、移植用細胞集団。
[72] [35]~[64]のいずれかに記載の細胞集団又はその細胞集団から精製された細胞の、ウイルスの分離培養における使用。
[1] 鼻腔上皮を構成する細胞の製造方法であって、
Wntシグナル伝達経路阻害物質の存在下で多能性幹細胞を培養する工程(1)、
BMPシグナル伝達経路作用物質の存在下で、前記工程(1)で培養した細胞を培養する工程(2)、
FGFシグナル伝達経路作用物質及びBMPシグナル伝達経路阻害物質からなる群より選ばれる少なくとも1つの存在下で、前記工程(2)で培養した細胞を培養する工程(3)、及び
前記工程(3)で培養した細胞をさらに培養し、前記鼻腔上皮を構成する細胞を得る工程(4)であって、Wntシグナル伝達経路阻害物質、FGFシグナル伝達経路作用物質及びBMPシグナル伝達経路阻害物質からなる群より選ばれる少なくとも2つの非存在下で前記細胞を培養する工程を含む、製造方法。
[2] 前記工程(4)において、Wntシグナル伝達経路阻害物質、FGFシグナル伝達経路作用物質及びBMPシグナル伝達経路阻害物質の非存在下で前記細胞を培養する、[1]に記載の製造方法。
[3] 前記工程(4)において、FGFシグナル伝達経路阻害物質、Shhシグナル伝達経路作用物質、BMPシグナル伝達経路作用物質、Wntシグナル伝達経路作用物質、Notchシグナル伝達経路阻害物質、アクチビン/TGF-βシグナル伝達経路作用物質及びレチノイン酸シグナル伝達経路作用物質からなる群より選ばれる少なくとも1つの存在下で前記細胞を培養する、[1]又は[2]に記載の製造方法。
[4] 鼻腔上皮を構成する細胞の製造方法であって、
Wntシグナル伝達経路阻害物質の存在下で多能性幹細胞を培養する工程(1)であって、前記多能性幹細胞を浮遊培養し、細胞凝集体を形成させる工程、
BMPシグナル伝達経路作用物質の存在下で、前記工程(1)で培養した細胞を培養する工程(2)であって、前記細胞凝集体を浮遊培養する工程、
FGFシグナル伝達経路作用物質及びBMPシグナル伝達経路阻害物質からなる群より選ばれる少なくとも1つの存在下で、前記工程(2)で培養した細胞を培養する工程(3)であって、前記細胞凝集体を浮遊培養する工程、及び
前記工程(3)で培養した細胞をさらに培養し、前記鼻腔上皮を構成する細胞を得る工程(4)であって、FGFシグナル伝達経路阻害物質、Shhシグナル伝達経路作用物質、BMPシグナル伝達経路作用物質、Wntシグナル伝達経路作用物質、Notchシグナル伝達経路阻害物質、アクチビン/TGF-βシグナル伝達経路作用物質及びレチノイン酸シグナル伝達経路作用物質からなる群より選ばれる少なくとも1つの存在下で前記細胞凝集体を浮遊培養する工程を含む、製造方法。
[5]前記工程(1)、及び工程(2)から(4)のうち任意の工程の浮遊培養を、少なくとも1つのウェルが形成されている培養器材中で実施し、
前記ウェルは、複数のマイクロウェルに分割されていて、
前記マイクロウェルの1つにつき、1つの細胞塊が形成されるように浮遊培養を実施する、[4]に記載の製造方法。
[6]前記培養器材は、前記1つのウェルが少なくとも1cm2以上の底面積を有し、
前記ウェルは、少なくとも1cm2あたり4つ以上のマイクロウェルに分割されている、[5]に記載の製造方法。
[7] 鼻腔上皮を構成する細胞の製造方法であって、
Wntシグナル伝達経路阻害物質の存在下で多能性幹細胞を培養する工程(1)であって、前記多能性幹細胞を培養器材上で接着培養する工程、
BMPシグナル伝達経路作用物質の存在下で、前記工程(1)で培養した細胞を培養する工程(2)であって、前記細胞を接着培養する工程、
FGFシグナル伝達経路作用物質及びBMPシグナル伝達経路阻害物質からなる群より選ばれる少なくとも1つの存在下で、前記工程(2)で培養した細胞を培養する工程(3)であって、前記細胞を接着培養する工程、及び
前記工程(3)で培養した細胞をさらに培養し、前記鼻腔上皮を構成する細胞を得る工程(4)であって、FGFシグナル伝達経路阻害物質、Shhシグナル伝達経路作用物質、BMPシグナル伝達経路作用物質、Wntシグナル伝達経路作用物質、Notchシグナル伝達経路阻害物質、アクチビン/TGF-βシグナル伝達経路作用物質及びレチノイン酸シグナル伝達経路作用物質からなる群より選ばれる少なくとも1つの存在下で前記細胞を接着培養する工程を含む、製造方法。
[8] 前記培養器材は、細胞外マトリクス又は合成細胞接着分子でコーティングされている、[7]に記載の製造方法。
[9] 前記培養器材は、培地の灌流を行なうための流路を有し、
前記工程(1)、前記工程(2)、前記工程(3)及び前記工程(4)からなる群より選ばれる少なくとも1つの工程において、灌流環境下で前記細胞を接着培養する、[7]又は[8]に記載の製造方法。
[10] 前記培養器材は、酸素又は培地を透過する膜を有する、[7]~[9]のいずれかに記載の製造方法。
[11] 鼻腔上皮を構成する細胞の製造方法であって、
Wntシグナル伝達経路阻害物質の存在下で多能性幹細胞を培養する工程(1)であって、前記多能性幹細胞を浮遊培養し、細胞凝集体を形成させる工程、
BMPシグナル伝達経路作用物質の存在下で、前記工程(1)で培養した細胞を培養する工程(2)であって、前記細胞凝集体を浮遊培養する工程、
FGFシグナル伝達経路作用物質及びBMPシグナル伝達経路阻害物質からなる群より選ばれる少なくとも1つの存在下で、前記工程(2)で培養した細胞を培養する工程(3)であって、前記細胞凝集体中に嗅神経前駆細胞が分化するまで浮遊培養する工程、及び
前記工程(3)で培養した細胞をさらに培養し、前記鼻腔上皮を構成する細胞を得る工程(4)であって、前記細胞凝集体を浮遊培養し、前記嗅神経前駆細胞が存在する上皮と連続する上皮上に前記鼻腔上皮を構成する細胞を得る工程を含む、製造方法。
[12] 前記BMPシグナル伝達経路作用物質は、BMP2、BMP4、BMP7、BMP13及びGDF7からなる群より選ばれる少なくとも1つを含む、[1]~[11]のいずれかに記載の製造方法。
[13] 前記工程(3)において、FGFシグナル伝達経路作用物質の存在下で細胞を培養し、
前記FGFシグナル伝達経路作用物質は、FGF2、FGF3、FGF7、FGF8、FGF10及びこれらの改変体からなる群より選ばれる少なくとも1つを含む、[1]~[12]のいずれかに記載の製造方法。
[14] 前記Wntシグナル伝達経路阻害物質は、非古典的Wnt経路に対する阻害活性を有する物質を含む、[1]~[13]のいずれかに記載の製造方法。
[15] 前記Wntシグナル伝達経路阻害物質は、PORCN阻害剤を含む、[1]~[14]のいずれかに記載の製造方法。
[16] 前記PORCN阻害剤は、IWP-2、IWP-3、IWP-4、IWP-L6、IWP-12、IWP-O1、LGK-974、Wnt-C59、ETC-131、ETC-159、GNF-1331、GNF-6231、Porcn-IN-1、RXC004、CGX1321及びこれらの誘導体からなる群より選ばれる少なくとも1つを含む、[15]に記載の製造方法。
[17] 前記Wntシグナル伝達経路阻害物質は、Wnt/JNKシグナル伝達経路阻害物質を含む、[1]~[16]のいずれかに記載の製造方法。
[18] 前記Wnt/JNKシグナル伝達経路阻害物質は、JNK阻害剤を含む、[17]に記載の製造方法。
[19] 前記JNK阻害剤は、SP600125、JNK-IN-8、DB07268、IQ-1S、Tanzisertib、Bentamapimod、BI-78D3、CC-401、TCS JNK 5a、AS601245、CV-65、D-JNK1、ER-358063、ER-409903、ER-417258、CC-359、CC-930、SB203580及びこれらの誘導体からなる群より選ばれる少なくとも1つを含む、[18]に記載の製造方法。
[20] 前記JNK阻害剤はJNK-IN-8を含み、
前記JNK-IN-8の濃度が1nM~50μMである培地中で前記工程(1)を開始する、[18]又は[19]に記載の製造方法。
[21] 前記Wnt/JNKシグナル伝達経路阻害物質は、Rac阻害剤を含む、[17]~[20]のいずれかに記載の製造方法。
[22] 前記Rac阻害剤は、NSC23766、EHop-016、ZCL278、MBQ-167、KRpep-2d、ARS-853、Salirasib、ML141、EHT1864及びこれらの誘導体からなる群より選ばれる少なくとも1つを含む、[21]に記載の製造方法。
[23] 前記工程(3)において、BMPシグナル伝達経路阻害物質の存在下で細胞を培養し、
前記BMPシグナル伝達経路阻害物質は、I型BMP受容体阻害剤を含む、[1]~[22]のいずれかに記載の製造方法。
[24] 前記I型BMP受容体阻害剤は、K02288、Dorsomorphin、LDN-193189、LDN-212854、LDN-214117、ML347、DMH1、DMH2、Compound 1、VU5350、OD52、E6201、Saracatinib、BYL719及びこれらの誘導体からなる群より選ばれる少なくとも1つを含む、[23]に記載の製造方法。
[25] 前記工程(3)及び前記工程(4)からなる群より選ばれる少なくとも1つの工程において、EGFシグナル伝達経路作用物質がさらに存在する、[1]~[24]のいずれかに記載の製造方法。
[26] 前記工程(1)、前記工程(2)、前記工程(3)及び前記工程(4)からなる群より選ばれる少なくとも1つの工程において、TGFβシグナル伝達経路阻害物質がさらに存在する、[1]~[25]のいずれかに記載の製造方法。
[27] 前記TGFβシグナル伝達経路阻害物質は、Alk5/TGFβR1阻害剤を含む、[26]に記載の製造方法。
[28] 前記Alk5/TGFβR1阻害剤は、SB431542、SB505124、SB525334、LY2157299、GW788388、LY364947、SD-208、EW-7197、A83-01、A77-01、RepSox、BIBF-0775、TP0427736、TGFBR1-IN-1、SM-16、TEW-7197、LY3200882、LY2109761、KRCA 0008、GSK 1838705、Crizotinib、Ceritinib、ASP 3026、TAE684、AZD3463及びこれらの誘導体からなる群より選ばれる少なくとも1つを含む、[27]に記載の製造方法。
[29] 前記工程(1)、前記工程(2)、前記工程(3)及び前記工程(4)からなる群より選ばれる少なくとも1つの工程において、TAK1阻害物質がさらに存在する、[1]~[28]のいずれかに記載の製造方法。
[30] 前記TAK1阻害物質が、(5Z)-7-Oxozeaenol、N-Des(aminocarbonyl)AZ-TAK1 inhibitor、Takinib、NG25及びこれらの誘導体からなる群より選ばれる少なくとも1つを含む、[29]に記載の製造方法。
[31] 前記工程(3)及び前記工程(4)からなる群より選ばれる少なくとも1つの工程において、酸化ストレスを軽減する作用を有する物質がさらに存在する、[1]~[30]のいずれかに記載の製造方法。
[32] 酸化ストレスを軽減する作用を有する物質が、アスコルビン酸、N-アセチル-L-システイン、ニコチンアミド及びこれらの誘導体からなる群より選ばれる少なくとも1つを含む、[31]に記載の製造方法。
[33] 前記工程(3)及び前記工程(4)からなる群より選ばれる少なくとも1つの工程において、ストレス応答シグナル伝達経路に対する阻害物質がさらに存在する、[1]~[32]のいずれかに記載の製造方法。
[34] 前記工程(3)及び前記工程(4)からなる群より選ばれる少なくとも1つの工程において、揺動しながら細胞を培養する、[1]~[33]のいずれかに記載の製造方法。
[35] 鼻腔上皮を構成する細胞の製造方法であって、
FGFシグナル伝達経路阻害物質、Shhシグナル伝達経路作用物質、BMPシグナル伝達経路作用物質、Wntシグナル伝達経路作用物質、Notchシグナル伝達経路阻害物質、アクチビン/TGF-βシグナル伝達経路作用物質及びレチノイン酸シグナル伝達経路作用物質からなる群より選ばれる少なくとも1つの存在下で、嗅神経細胞又はその前駆細胞を含む細胞集団を培養する工程を含む、製造方法。
[36] [1]~[35]のいずれかに記載の製造方法により得られる、鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞を含む細胞集団。
[37] 鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞を含む細胞集団。
[38] 前記鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞は、外胚葉マーカーを発現する、[37]に記載の細胞集団。
[39] 前記鼻腔上皮を構成する細胞は、分泌細胞を含む、[37]又は[38]に記載の細胞集団。
[40] 前記分泌細胞は、ムチン1、ムチン2、ムチン3、ムチン4、ムチン5AC、ムチン5B、FoxA1、FoxA2、Nkx2.1/TTF-1及びSPDEFからなる群より選ばれる少なくとも1つを発現する、[39]に記載の細胞集団。
[41] 前記鼻腔上皮を構成する細胞は、線毛細胞を含む、[37]~[40]のいずれかに記載の細胞集団。
[42] 前記線毛細胞は、FoxJ1、FoxN4、p73、アセチル化チューブリン及びβ4-Tubulinからなる群より選ばれる少なくとも1つを発現する、[41]に記載の細胞集団。
[43] 前記線毛細胞は、細胞表面に線毛構造を有する、[42]又は[42]に記載の細胞集団。
[44] 前記鼻腔上皮を構成する細胞は、基底細胞を含む、[37]~[43]のいずれかに記載の細胞集団。
[45] 前記基底細胞は、サイトケラチン5、サイトケラチン14、サイトケラチン15、p63、ΔNp63及びp75からなる群より選ばれる少なくとも1つを発現する、[44]に記載の細胞集団。
[46] 前記鼻腔上皮を構成する細胞は、塩類細胞を含む、[37]~[45]のいずれかに記載の細胞集団。
[47] 前記塩類細胞は、CFTR、Foxi1、液胞型プロトンATPase、Ascl3、Tfcp2l1及びDMRT2からなる群より選ばれる少なくとも1つを発現する、[46]に記載の細胞集団。
[48] 前記鼻腔上皮を構成する細胞は、神経内分泌細胞を含む、[37]~[47]のいずれかに記載の細胞集団。
[49] 前記神経内分泌細胞は、Ascl1、NeuroD1、Chromogranin A、Synaptophisin及び神経特異エノラーゼ(NSE)からなる群より選ばれる少なくとも1つを発現する、[48]に記載の細胞集団。
[50] 前記鼻腔上皮を構成する細胞は、孤立化学感覚上皮細胞を含む、[37]~[49]のいずれかに記載の細胞集団。
[51] 前記鼻腔上皮を構成する細胞は、クラブ細胞を含む、[37]~[50]のいずれかに記載の細胞集団。
[52] 前記鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞は、ウイルス受容体又はウイルス感染関連因子を発現する、[37]~[51]のいずれかに記載の細胞集団。
[53] 前記ウイルス受容体又は前記ウイルス感染関連因子は、ACE2、シアル酸α2,6Gal及びシアル酸α2,3Galからなる群より選ばれる少なくとも1つを含む、[52]に記載の細胞集団。
[54] 基底側と頂端側との極性を有する、[37]~[53]のいずれかに記載の細胞集団。
[55] 前記鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞は、細胞種ごとに集合している、[37]~[54]のいずれかに記載の細胞集団。
[56] 嗅上皮を構成する細胞又はその前駆細胞をさらに含む、[37]~[55]のいずれかに記載の細胞集団。
[57] 前記嗅上皮を構成する細胞は、嗅神経細胞を含む、[56]に記載の細胞集団。
[58] 中枢神経系を構成する神経系細胞をさらに含む、[37]~[57]のいずれかに記載の細胞集団。
[59] 前記鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞を含む鼻腔上皮様組織と、前記鼻腔上皮様組織によって表面の少なくとも一部が被覆された神経組織とを有し、
前記神経組織は、中枢神経系を構成する神経系細胞又はその前駆細胞を含む、[37]~[58]のいずれかに記載の細胞集団。
[60] 前記神経組織の表面の少なくとも一部を被覆する嗅上皮様組織をさらに含み、
前記嗅上皮様組織は、嗅上皮を構成する細胞又はその前駆細胞を含む、[59]に記載の細胞集団。
[61] 前記鼻腔上皮様組織と前記嗅上皮様組織とは、連続的に形成されている、[60]に記載の細胞集団。
[62] 前記嗅上皮様組織が細胞塊内側に向かって陥入しており、嗅窩様構造を形成している、[61]に記載の細胞集団。
[63] 前記鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞は、遺伝性疾患又は感染症に関連する遺伝子が欠損又は変異している、[36]~[62]のいずれかに記載の細胞集団。
[64]前記遺伝性疾患又は感染症に関連する遺伝子はACE2である、[63]に記載の細胞集団。
[65] [36]~[64]のいずれかに記載の細胞集団を用いた、疾患治療用化合物のスクリーニング方法。
[66] [36]~[64]のいずれかに記載の細胞集団を含む、疾患治療用化合物のスクリーニングキット。
[67] 鼻腔上皮の疾患モデルとしての[36]~[64]のいずれかに記載の細胞集団の使用方法。
[68] [36]~[64]のいずれかに記載の細胞集団を用いた対象物質の薬効又は毒性の評価方法。
[69] [36]~[64]のいずれかに記載の細胞集団を用いた対象物質の薬効又は毒性の評価キット。
[70] [36]~[64]のいずれかに記載の細胞集団を用いた、疾患特異的なバイオマーカーの探索方法。
[71] [36]~[64]のいずれかに記載の細胞集団又はその細胞集団から精製された細胞を含む、移植用細胞集団。
[72] [35]~[64]のいずれかに記載の細胞集団又はその細胞集団から精製された細胞の、ウイルスの分離培養における使用。
別の側面において本発明は、以下に例示する鼻腔上皮を構成する細胞の製造方法、鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞を含む細胞集団、該細胞集団の疾患モデルとしての使用方法等に関する。
[C1] 鼻腔上皮を構成する細胞の製造方法であって、
Wntシグナル伝達経路阻害物質の存在下で多能性幹細胞を浮遊培養する工程(1)、
BMPシグナル伝達経路作用物質の存在下で、前記工程(1)で培養した細胞を浮遊培養する工程(2)、
FGFシグナル伝達経路作用物質及びBMPシグナル伝達経路阻害物質からなる群より選ばれる少なくとも1つの存在下で、前記工程(2)で培養した細胞を浮遊培養する工程(3)、及び
前記工程(3)で培養した細胞をさらに浮遊培養し、前記鼻腔上皮を構成する細胞を得る工程(4)であって、Wntシグナル伝達経路阻害物質、FGFシグナル伝達経路作用物質及びBMPシグナル伝達経路阻害物質からなる群より選ばれる少なくとも2つの非存在下で前記細胞を浮遊培養する工程を含む、製造方法。
[C2] 前記工程(4)において、Wntシグナル伝達経路阻害物質、FGFシグナル伝達経路作用物質及びBMPシグナル伝達経路阻害物質の非存在下で前記細胞を浮遊培養する、[C1]に記載の製造方法。
[C3] 前記工程(4)において、FGFシグナル伝達経路阻害物質、Shhシグナル伝達経路作用物質、BMPシグナル伝達経路作用物質、Wntシグナル伝達経路作用物質、Notchシグナル伝達経路阻害物質、アクチビン/TGF-βシグナル伝達経路作用物質及びレチノイン酸シグナル伝達経路作用物質からなる群より選ばれる少なくとも1つの存在下で前記細胞を浮遊培養する、[C1]又は[C2]に記載の製造方法。
[C4] 鼻腔上皮を構成する細胞の製造方法であって、
Wntシグナル伝達経路阻害物質の存在下で多能性幹細胞を培養器材上接着培養する工程(1)、
BMPシグナル伝達経路作用物質の存在下で、前記工程(1)で培養した細胞を接着培養する工程(2)、
FGFシグナル伝達経路作用物質及びBMPシグナル伝達経路阻害物質からなる群より選ばれる少なくとも1つの存在下で、前記工程(2)で培養した細胞を接着培養する工程(3)を含む、製造方法。
[C5] 前記培養器材は、細胞外マトリクス若しくは合成細胞接着分子でコーティングされている培養器材、培地の灌流を行なうための流路を有する培養器材、又は、酸素若しくは培地を透過する膜を有する培養器材である、[C4]に記載の製造方法。
[C6] 前記工程(1)が、前記多能性幹細胞を浮遊培養し、細胞凝集体を形成させる工程であり、
前記工程(2)が、前記細胞凝集体を浮遊培養する工程であり、
前記工程(3)が、前記工程(2)で培養した前記細胞凝集体を細胞凝集体中の細胞が嗅神経前駆細胞に分化するまで浮遊培養する工程であり、
前記工程(4)が前記工程(3)で培養した前記細胞凝集体を前記嗅神経前駆細胞が連続して存在する上皮と、当該上皮上に前記鼻腔上皮とを構成する細胞凝集体を得るまで培養する工程である、[C1]~[C3]のいずれかに記載の製造方法。
[C7] 前記工程(3)及び前記工程(4)からなる群より選ばれる少なくとも1つの工程において、EGFシグナル伝達経路作用物質がさらに存在する、[C1]~[C6]のいずれかに記載の製造方法。
[C8] 前記工程(1)、前記工程(2)、前記工程(3)及び前記工程(4)からなる群より選ばれる少なくとも1つの工程において、TGFβシグナル伝達経路阻害物質がさらに存在する、[C1]~[C7]のいずれかに記載の製造方法。
[C9] 前記工程(1)、前記工程(2)、前記工程(3)及び前記工程(4)からなる群より選ばれる少なくとも1つの工程において、JNKシグナル伝達経路阻害物質がさらに存在する、[C1]~[C8]のいずれかに記載の製造方法。
[C10] 前記工程(1)、前記工程(2)、前記工程(3)及び前記工程(4)からなる群より選ばれる少なくとも1つの工程において、TAK1阻害物質がさらに存在する、[C1]~[C9]のいずれかに記載の製造方法。
[C11] 前記工程(3)及び前記工程(4)からなる群より選ばれる少なくとも1つの工程において、酸化ストレスを軽減する作用を有する物質又はストレス応答シグナル伝達経路に対する阻害物質がさらに存在する、[C1]~[C10]のいずれかに記載の製造方法。
[C12] 前記工程(3)及び前記工程(4)からなる群より選ばれる少なくとも1つの工程において、揺動しながら細胞を培養する、[C1]~[C11]のいずれかに記載の製造方法。
[C13] [C1]~[C12]のいずれかに記載の製造方法により得られる、鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞を含む細胞集団。
[C14] 鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞を含む細胞集団。
[C15] 前記鼻腔上皮を構成する細胞は、分泌細胞、線毛細胞、基底細胞、塩類細胞、神経内分泌細胞、孤立化学感覚上皮細胞及びクラブ細胞からなる群より選ばれる少なくとも1つを含む、[C14]に記載の細胞集団。
[C16] 基底側と頂端側との極性を有する、[C14]又は[C15]に記載の細胞集団。
[C17] 嗅上皮を構成する細胞又はその前駆細胞をさらに含む、[C14]~[C16]のいずれかに記載の細胞集団。
[C18] 中枢神経系を構成する神経系細胞をさらに含む、[C14]~[C17]のいずれかに記載の細胞集団。
[C19] 三次元の立体的な細胞集団であって、前記鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞を含む鼻腔上皮様組織と、前記鼻腔上皮様組織によって表面の少なくとも一部が被覆された神経組織とを有し、前記神経組織は、中枢神経系を構成する神経系細胞又はその前駆細胞を含む、[C14]~[C18]のいずれかに記載の細胞集団。
[C20] 前記神経組織の表面の少なくとも一部を被覆する嗅上皮様組織をさらに含み、前記嗅上皮様組織は、嗅上皮を構成する細胞又はその前駆細胞を含む、[19]に記載の細胞集団。
[C21] 前記鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞が培養器材に接着しており、連続した上皮構造により二次元的な鼻腔上皮様組織を形成している、[C14]~[C20]のいずれかに記載の細胞集団。
[C22] 前記鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞は、遺伝性疾患又は感染症に関連する遺伝子が欠損又は変異している、[C13]~[C21]のいずれかに記載の細胞集団。
[C23] 前記遺伝性疾患又は感染症に関連する遺伝子はACE2である、[C22]に記載の細胞集団。
[C24] [C13]~[C23]のいずれかに記載の細胞集団を用いた、疾患治療用化合物又は対象物質の毒性のスクリーニング方法。
[C25] [C13]~[C23]のいずれかに記載の細胞集団を含む、疾患治療用化合物又は対象物質の毒性のスクリーニング用キット。
[C26] [C13]~[C23]のいずれかに記載の細胞集団を用いた、疾患特異的なバイオマーカーの探索方法。
[C27] [C13]~[C23]のいずれかに記載の細胞集団又はその細胞集団から精製された細胞を含む、移植用細胞集団。
[C28] [C13]~[C23]のいずれかに記載の細胞集団又はその細胞集団から精製された細胞の、ウイルスの分離培養における使用。
[C1] 鼻腔上皮を構成する細胞の製造方法であって、
Wntシグナル伝達経路阻害物質の存在下で多能性幹細胞を浮遊培養する工程(1)、
BMPシグナル伝達経路作用物質の存在下で、前記工程(1)で培養した細胞を浮遊培養する工程(2)、
FGFシグナル伝達経路作用物質及びBMPシグナル伝達経路阻害物質からなる群より選ばれる少なくとも1つの存在下で、前記工程(2)で培養した細胞を浮遊培養する工程(3)、及び
前記工程(3)で培養した細胞をさらに浮遊培養し、前記鼻腔上皮を構成する細胞を得る工程(4)であって、Wntシグナル伝達経路阻害物質、FGFシグナル伝達経路作用物質及びBMPシグナル伝達経路阻害物質からなる群より選ばれる少なくとも2つの非存在下で前記細胞を浮遊培養する工程を含む、製造方法。
[C2] 前記工程(4)において、Wntシグナル伝達経路阻害物質、FGFシグナル伝達経路作用物質及びBMPシグナル伝達経路阻害物質の非存在下で前記細胞を浮遊培養する、[C1]に記載の製造方法。
[C3] 前記工程(4)において、FGFシグナル伝達経路阻害物質、Shhシグナル伝達経路作用物質、BMPシグナル伝達経路作用物質、Wntシグナル伝達経路作用物質、Notchシグナル伝達経路阻害物質、アクチビン/TGF-βシグナル伝達経路作用物質及びレチノイン酸シグナル伝達経路作用物質からなる群より選ばれる少なくとも1つの存在下で前記細胞を浮遊培養する、[C1]又は[C2]に記載の製造方法。
[C4] 鼻腔上皮を構成する細胞の製造方法であって、
Wntシグナル伝達経路阻害物質の存在下で多能性幹細胞を培養器材上接着培養する工程(1)、
BMPシグナル伝達経路作用物質の存在下で、前記工程(1)で培養した細胞を接着培養する工程(2)、
FGFシグナル伝達経路作用物質及びBMPシグナル伝達経路阻害物質からなる群より選ばれる少なくとも1つの存在下で、前記工程(2)で培養した細胞を接着培養する工程(3)を含む、製造方法。
[C5] 前記培養器材は、細胞外マトリクス若しくは合成細胞接着分子でコーティングされている培養器材、培地の灌流を行なうための流路を有する培養器材、又は、酸素若しくは培地を透過する膜を有する培養器材である、[C4]に記載の製造方法。
[C6] 前記工程(1)が、前記多能性幹細胞を浮遊培養し、細胞凝集体を形成させる工程であり、
前記工程(2)が、前記細胞凝集体を浮遊培養する工程であり、
前記工程(3)が、前記工程(2)で培養した前記細胞凝集体を細胞凝集体中の細胞が嗅神経前駆細胞に分化するまで浮遊培養する工程であり、
前記工程(4)が前記工程(3)で培養した前記細胞凝集体を前記嗅神経前駆細胞が連続して存在する上皮と、当該上皮上に前記鼻腔上皮とを構成する細胞凝集体を得るまで培養する工程である、[C1]~[C3]のいずれかに記載の製造方法。
[C7] 前記工程(3)及び前記工程(4)からなる群より選ばれる少なくとも1つの工程において、EGFシグナル伝達経路作用物質がさらに存在する、[C1]~[C6]のいずれかに記載の製造方法。
[C8] 前記工程(1)、前記工程(2)、前記工程(3)及び前記工程(4)からなる群より選ばれる少なくとも1つの工程において、TGFβシグナル伝達経路阻害物質がさらに存在する、[C1]~[C7]のいずれかに記載の製造方法。
[C9] 前記工程(1)、前記工程(2)、前記工程(3)及び前記工程(4)からなる群より選ばれる少なくとも1つの工程において、JNKシグナル伝達経路阻害物質がさらに存在する、[C1]~[C8]のいずれかに記載の製造方法。
[C10] 前記工程(1)、前記工程(2)、前記工程(3)及び前記工程(4)からなる群より選ばれる少なくとも1つの工程において、TAK1阻害物質がさらに存在する、[C1]~[C9]のいずれかに記載の製造方法。
[C11] 前記工程(3)及び前記工程(4)からなる群より選ばれる少なくとも1つの工程において、酸化ストレスを軽減する作用を有する物質又はストレス応答シグナル伝達経路に対する阻害物質がさらに存在する、[C1]~[C10]のいずれかに記載の製造方法。
[C12] 前記工程(3)及び前記工程(4)からなる群より選ばれる少なくとも1つの工程において、揺動しながら細胞を培養する、[C1]~[C11]のいずれかに記載の製造方法。
[C13] [C1]~[C12]のいずれかに記載の製造方法により得られる、鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞を含む細胞集団。
[C14] 鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞を含む細胞集団。
[C15] 前記鼻腔上皮を構成する細胞は、分泌細胞、線毛細胞、基底細胞、塩類細胞、神経内分泌細胞、孤立化学感覚上皮細胞及びクラブ細胞からなる群より選ばれる少なくとも1つを含む、[C14]に記載の細胞集団。
[C16] 基底側と頂端側との極性を有する、[C14]又は[C15]に記載の細胞集団。
[C17] 嗅上皮を構成する細胞又はその前駆細胞をさらに含む、[C14]~[C16]のいずれかに記載の細胞集団。
[C18] 中枢神経系を構成する神経系細胞をさらに含む、[C14]~[C17]のいずれかに記載の細胞集団。
[C19] 三次元の立体的な細胞集団であって、前記鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞を含む鼻腔上皮様組織と、前記鼻腔上皮様組織によって表面の少なくとも一部が被覆された神経組織とを有し、前記神経組織は、中枢神経系を構成する神経系細胞又はその前駆細胞を含む、[C14]~[C18]のいずれかに記載の細胞集団。
[C20] 前記神経組織の表面の少なくとも一部を被覆する嗅上皮様組織をさらに含み、前記嗅上皮様組織は、嗅上皮を構成する細胞又はその前駆細胞を含む、[19]に記載の細胞集団。
[C21] 前記鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞が培養器材に接着しており、連続した上皮構造により二次元的な鼻腔上皮様組織を形成している、[C14]~[C20]のいずれかに記載の細胞集団。
[C22] 前記鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞は、遺伝性疾患又は感染症に関連する遺伝子が欠損又は変異している、[C13]~[C21]のいずれかに記載の細胞集団。
[C23] 前記遺伝性疾患又は感染症に関連する遺伝子はACE2である、[C22]に記載の細胞集団。
[C24] [C13]~[C23]のいずれかに記載の細胞集団を用いた、疾患治療用化合物又は対象物質の毒性のスクリーニング方法。
[C25] [C13]~[C23]のいずれかに記載の細胞集団を含む、疾患治療用化合物又は対象物質の毒性のスクリーニング用キット。
[C26] [C13]~[C23]のいずれかに記載の細胞集団を用いた、疾患特異的なバイオマーカーの探索方法。
[C27] [C13]~[C23]のいずれかに記載の細胞集団又はその細胞集団から精製された細胞を含む、移植用細胞集団。
[C28] [C13]~[C23]のいずれかに記載の細胞集団又はその細胞集団から精製された細胞の、ウイルスの分離培養における使用。
本発明によれば、多能性幹細胞から効率よく鼻腔上皮を構成する細胞を製造することが可能になる。また、本発明によれば、鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞を含む細胞集団を用いた疾患モデル、疾患の治療薬のスクリーニング方法、スクリーニングキット、化合物の薬効又は毒性の評価方法及び評価キット等を提供することができる。また、別の態様として、本発明によって製造した鼻腔上皮を、新型コロナウイルス(SARS-CoV-2)及び季節性コロナウイルスを含む感染症の研究、ウイルスの分離培養その他に供することもできる。
[1.定義]
本明細書において、用語の定義は下記のとおりである。「幹細胞」とは、分化能及び増殖能(特に自己複製能)を有する未分化な細胞を意味する。幹細胞には、分化能力に応じて、多能性幹細胞(pluripotent stem cell)、複能性幹細胞(multipotent stem cell)、単能性幹細胞(unipotent stem cell)等が含まれる。「多能性幹細胞」とは、インビトロにおいて培養することが可能で、かつ、生体を構成する全ての細胞に分化し得る能力(分化多能性:pluripotency)を有する幹細胞をいう。全ての細胞とは、外胚葉、中胚葉及び内胚葉の三胚葉由来の細胞である。「複能性幹細胞」とは、全ての種類ではないが、複数種の組織や細胞へ分化し得る能力を有する幹細胞を意味する。「単能性幹細胞」とは、特定の組織や細胞へ分化し得る能力を有する幹細胞を意味する。
本明細書において、用語の定義は下記のとおりである。「幹細胞」とは、分化能及び増殖能(特に自己複製能)を有する未分化な細胞を意味する。幹細胞には、分化能力に応じて、多能性幹細胞(pluripotent stem cell)、複能性幹細胞(multipotent stem cell)、単能性幹細胞(unipotent stem cell)等が含まれる。「多能性幹細胞」とは、インビトロにおいて培養することが可能で、かつ、生体を構成する全ての細胞に分化し得る能力(分化多能性:pluripotency)を有する幹細胞をいう。全ての細胞とは、外胚葉、中胚葉及び内胚葉の三胚葉由来の細胞である。「複能性幹細胞」とは、全ての種類ではないが、複数種の組織や細胞へ分化し得る能力を有する幹細胞を意味する。「単能性幹細胞」とは、特定の組織や細胞へ分化し得る能力を有する幹細胞を意味する。
多能性幹細胞は、受精卵、クローン胚、生殖幹細胞、組織内幹細胞、体細胞等から誘導することができる。多能性幹細胞としては、胚性幹細胞(ES細胞:Embryonic stem cell)、EG細胞(Embryonic germ cell)、人工多能性幹細胞(iPS細胞:induced pluripotent stem cell)等を挙げることができる。間葉系幹細胞(mesenchymal stem cell:MSC)から得られるMuse細胞(Multi-lineage differentiating Stress Enduring cell)、及び生殖細胞(例えば精巣)から作製されるGS細胞も多能性幹細胞に包含される。
胚性幹細胞は、1981年に初めて樹立され、1989年以降ノックアウトマウス作製にも応用されている。1998年にはヒト胚性幹細胞が樹立されており、再生医学にも利用されつつある。ES細胞は、内部細胞塊をフィーダー細胞上又はleukemia inhibitory factor(LIF)を含む培地中で培養することにより製造することができる。ES細胞の製造方法は、例えば国際公開第96/22362号、国際公開第02/101057号、米国特許第5843780号明細書、米国特許第6200806号明細書、米国特許第6280718号明細書等に記載されている。胚性幹細胞は、所定の機関より入手でき、市販品を購入することもできる。例えばヒト胚性幹細胞であるKhES-1、KhES-2及びKhES-3は、京都大学再生医科学研究所より入手可能である。ヒトES細胞としては、生体内での発育を経ていない受精14日以内のヒト胚胎を利用して分離又は獲得した幹細胞を挙げることもできる。いずれもマウス胚性幹細胞である、EB5細胞は国立研究開発法人理化学研究所より、D3株はAmerican Type Culture Collection(ATCC)より、入手可能である。ES細胞の1つである核移植ES細胞(ntES細胞)は、細胞核を取り除いた卵子に体細胞の細胞核を移植して作ったクローン胚から樹立することができる。
EG細胞は、始原生殖細胞をマウス幹細胞因子(mSCF)、LIF及び塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)を含む培地中で培養することにより製造することができる(Cell,70:841-847,1992)。
「人工多能性幹細胞」とは、体細胞を公知の方法等により初期化(reprogramming)することにより、多能性を誘導した細胞である。人工多能性幹細胞としては、具体的には線維芽細胞、末梢血単核球等に分化した体細胞をOct3/4、Sox2、Klf4、Myc(c-Myc、N-Myc、L-Myc)、Glis1、Nanog、Sall4、lin28、Esrrb等を含む初期化遺伝子群から選ばれる複数の遺伝子の発現により初期化して多分化能を誘導した細胞が挙げられる。2006年、山中らによりマウス細胞で人工多能性幹細胞が樹立された(Cell,2006,126(4)pp.663-676)。人工多能性幹細胞は、2007年にヒト線維芽細胞でも樹立され、胚性幹細胞と同様に多能性と自己複製能を有する(Cell,2007,131(5)pp.861-872;Science,2007,318(5858)pp.1917-1920;Nat.Biotechnol.,2008,26(1)pp.101-106)。人工多能性幹細胞として、遺伝子発現による直接初期化で製造する方法以外に、化合物の添加などにより体細胞より人工多能性幹細胞を誘導することもできる(Science,2013,341,pp.651-654, Nature (2022). https://doi.org/10.1038/s41586-022-04593-5)。
人工多能性幹細胞を製造する際に用いられる体細胞としては、特に限定は無いが、組織由来の線維芽細胞、血球系細胞(例えば末梢血単核球、T細胞等)、肝細胞、膵臓細胞、腸上皮細胞、平滑筋細胞等が挙げられる。
人工多能性幹細胞を製造する際に、数種類の遺伝子(例えばOct3/4、Sox2、Klf4及びMycの4因子)の発現により初期化する場合、遺伝子を発現させるための手段は特に限定されない。遺伝子を発現させるための手段としては、例えばウイルスベクター(例えばレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、センダイウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター)を用いた感染法、プラスミドベクター(例えばプラスミドベクター、エピソーマルベクター)を用いた遺伝子導入法(例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、レトロネクチン法、エレクトロポレーション法)、RNAベクターを用いた遺伝子導入法(例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法)、タンパク質の直接注入法等が挙げられる。
多能性幹細胞は、遺伝子改変されていてもよい。遺伝子改変された多能性幹細胞は、例えば相同組換え技術を用いることにより作製できる。改変される染色体上の遺伝子としては、例えば細胞マーカー遺伝子、組織適合性抗原の遺伝子、神経系細胞の障害に基づく疾患関連遺伝子などが挙げられる。染色体上の標的遺伝子の改変は、Manipulating the Mouse Embryo,A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1994)、Gene Targeting,A Practical Approach,IRL Press at Oxford University Press(1993)、バイオマニュアルシリーズ8、ジーンターゲッティング、ES細胞を用いた変異マウスの作製、羊土社(1995)等に記載の方法を用いて行うことができる。
具体的には、例えば改変する標的遺伝子(例えば細胞マーカー遺伝子、組織適合性抗原の遺伝子や疾患関連遺伝子等)のゲノム遺伝子を単離し、単離されたゲノム遺伝子を用いて標的遺伝子を相同組換えするためのターゲットベクターを作製する。作製されたターゲットベクターを幹細胞に導入し、標的遺伝子とターゲットベクターの間で相同組換えを起こした細胞を選択することにより、染色体上の遺伝子が改変された幹細胞を作製することができる。
標的遺伝子のゲノム遺伝子を単離する方法としては、Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)やCurrent Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons(1987-1997)等に記載された公知の方法が挙げられる。ゲノムDNAライブラリースクリーニングシステム(Genome Systems製)やUniversal GenomeWalker Kits(Clontech製)などを用いることができる。
標的遺伝子を相同組換えするためのターゲットベクターの作製、及び相同組換え体の効率的な選別は、Gene Targeting,A Practical Approach,IRL Press at Oxford University Press(1993)、バイオマニュアルシリーズ8、ジーンターゲッティング、ES細胞を用いた変異マウスの作製、羊土社(1995)等に記載の方法に従って行うことができる。ターゲットベクターは、リプレースメント型又はインサーション型のいずれでも用いることができる。選別方法としては、ポジティブ選択、プロモーター選択、ネガティブ選択又はポリA選択などの方法を用いることができる。選別した細胞株の中から目的とする相同組換え体を選択する方法としては、ゲノムDNAに対するサザンハイブリダイゼーション法やPCR法等が挙げられる。
多能性幹細胞として、ゲノム編集を行った多能性幹細胞を用いることもできる。「ゲノム編集」とは、ヌクレアーゼを用いた部位特異的なゲノムDNA鎖の切断、又は塩基の化学的変換等の原理により標的遺伝子もしくはゲノム領域を意図的に改変する技術である。部位特異的ヌクレアーゼとしては、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、TALEN、CRISPR/Cas9及びこれらの変法等が挙げられる。ゲノム編集技術を用いることにより、特定の遺伝子を欠失したノックアウト細胞株、特定の遺伝子座に人工的に別の配列を挿入したノックイン細胞株等を作製することができる。例えば、アンジオテンシン変換酵素2(ACE2)をコードする領域を標的としてゲノム編集を実施することにより、ACE2遺伝子を発現しない、(ノックアウトされた)多能性幹細胞を調製することができる。別の態様として、標的の疾患における原因遺伝子、関与遺伝子の解明等の目的から、Nature volume 568,pages511-516(2019)等に記載の方法により網羅的に遺伝子変異を導入し、その遺伝子の機能、影響等を解析するスクリーニング(CRISPRスクリーニング)を実施することもできる。
多能性幹細胞として、疾患特異的多能性幹細胞を用いてもよい。「疾患特異的多能性幹細胞」とは、疾患の発症に関与する遺伝子の変異又は遺伝的背景を有する多能性幹細胞を表す。疾患特異的多能性幹細胞は、対象となる疾患を発症している患者や近親者から前述の方法等により人工多能性幹細胞を樹立する方法、又は既に樹立済の多能性幹細胞のゲノムをジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、TALEN、CRISPRといったゲノム編集技術等により改変する方法により作製することができる。例えば、嚢胞性線維症の患者から樹立した人工多能性幹細胞は、嚢胞性線維症の疾患特異的多能性幹細胞(疾患特異的iPS細胞)である。また、既に樹立済のES細胞、iPS細胞等に嚢胞性線維症患者に生じている既知の遺伝子の変異を導入することにより、嚢胞性線維症の疾患特異的多能性幹細胞を作製することができる。
「哺乳動物」には、げっ歯類、有蹄類、ネコ目、ウサギ目、霊長類等が包含される。げっ歯類には、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等が包含される。有蹄類には、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等が包含される。ネコ目には、イヌ、ネコ等が包含される。ウサギ目には、ウサギ等が含包される。「霊長類」とは、霊長目に属する哺乳類動物をいい、霊長類としては、キツネザル、ロリス、ツバイ等の原猿亜目、及びサル、類人猿、ヒト等の真猿亜目が含まれる。
本発明に用いる多能性幹細胞は、哺乳動物の多能性幹細胞であり、好ましくはげっ歯類(例えばマウス、ラット)又は霊長類(例えばヒト、サル)の多能性幹細胞であり、最も好ましくはヒトの多能性幹細胞である。
「細胞接着(cell adhesion)」には、細胞と細胞との接着(細胞-細胞接着)及び細胞と細胞外マトリクス(基質)との接着(細胞-基質接着)が含まれる。インビトロの人工培養環境下で生じる、細胞の培養器材等への接着も細胞接着に含有される。細胞-細胞接着において形成される結合は細胞-細胞結合(cell-cell junction)であり、細胞-基質接着において形成される結合は細胞-基質結合(cell-substratum junction)である。細胞接着の種類として、例えば固定結合(anchoring junction)、連絡結合(communicating junction)、閉鎖結合(occluding junction)が挙げられる。
細胞-細胞結合として、「密着結合(tight junction)」、「接着結合(adherence junction)」が挙げられる。密着結合は比較的強い細胞-細胞結合であり、上皮細胞で生じ得る。細胞間に密着結合が存在しているかどうかは、例えば密着接合の構成成分に対する抗体(抗クローディン抗体、抗ZO-1抗体等)を用いた免疫組織化学等の手法により検出することができる。
「浮遊培養」とは、細胞が培養液に浮遊して存在する状態を維持しつつ培養することをいう。すなわち浮遊培養は、細胞を培養器材及び培養器材上のフィーダー細胞等(以下、「培養器材等」と記す。)に接着させない条件で行われ、培養器材等に接着させる条件で行われる培養(接着培養)とは区別される。より詳細には、浮遊培養とは、細胞と培養器材等との間に、強固な細胞-基質結合を作らせない条件での培養をいう。培養している細胞が浮遊培養状態であるか接着培養であるかの判別は、例えば顕微鏡観察時の培養器材の揺動等によって当業者であれば容易に可能である。
「接着培養」とは、細胞が培養器材等に接着して存在する状態を維持しつつ培養することをいう。ここで、細胞が培養器材等に接着するとは、例えば細胞と培養器材等との間に細胞接着の一種である強固な細胞-基質結合ができることをいう。
浮遊培養中の細胞凝集体においては、細胞と細胞とが面接着する。浮遊培養中の細胞凝集体では、細胞と培養器材等との間に、強固な細胞-基質結合は形成されておらず、細胞-基質結合はほとんど形成されないか、形成されていてもその寄与が小さい。浮遊培養中の細胞凝集体の内部には、内在の細胞-基質結合が存在してもよい。「細胞と細胞とが面接着(plane attachment)する」とは、細胞と細胞とが面で接着することをいう。より詳細には、「細胞と細胞とが面接着する」とは、ある細胞の表面積のうち別の細胞の表面と接着している割合が、例えば1%以上、好ましくは3%以上、より好ましくは5%以上であることをいう。細胞の表面は、膜を染色する試薬(例えばDiI)による染色、細胞接着因子(例えばE-cadherin、N-cadherin等)の免疫染色等により観察できる。
接着培養を行う際に用いられる培養器材は、接着培養することが可能なものであれば特に限定されず、当業者であれば適宜決定することが可能である。このような培養器材としては、例えばフラスコ、組織培養用フラスコ、ディッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マイクロポア、マルチプレート、マルチウェルプレート、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック及びオーガンオンチップ等の生体機能チップが挙げられる。これらの培養器材は、硬質、軟質いずれであってもよい。細胞接着性の培養器材としては、細胞との接着性を向上させる目的で培養器材の表面が人工的に処理されているもの等を使用できる。人工的な処理とは、例えば細胞外マトリクス、高分子等によるコーティング処理、及びガスプラズマ処理、正電荷処理等の表面加工が挙げられる。細胞が接着される細胞外マトリクスとしては、例えば基底膜標品、ラミニン、エンタクチン、コラーゲン、ゼラチン等が挙げられる。高分子としては、ポリリジン、ポリオルニチン等が挙げられる。培養器材の培養面は、平底でもよいし、凹凸があってもよい。
「ラミニン」とは、α、β、γ鎖からなるヘテロ三量体分子であり、サブユニット鎖の組成が異なるアイソフォームが存在する細胞外マトリクスタンパク質である。具体的には、ラミニンは、5種のα鎖、4種のβ鎖及び3種のγ鎖のヘテロ三量体の組合せで約15種類のアイソフォームを有する。α鎖(α1~α5)、β鎖(β1~β4)及びγ鎖(γ1~γ4)のそれぞれの数字を組み合わせて、ラミニンの名称が定められている。例えばα5鎖、β1鎖、γ1鎖の組合せによるラミニンをラミニン511という。
浮遊培養を行う際に用いられる培養器材は、浮遊培養することが可能なものであれば特に限定されず、当業者であれば適宜決定することが可能である。このような培養器材としては、例えばフラスコ、組織培養用フラスコ、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マイクロポア、マルチプレート、マルチウェルプレート、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、スピナーフラスコ及びローラーボトルが挙げられる。これらの培養器材は、硬質、軟質いずれであってもよい。これらの培養器材は、浮遊培養を可能とするために、細胞非接着性であることが好ましい。細胞非接着性の培養器材としては、培養器材の表面に、細胞との接着性を向上させる目的で行われる上述の人工的な処理がされていないもの等を使用できる。細胞非接着性の培養器材として、細胞との接着性を低下させる目的で培養器材の表面が人工的に処理されたものを使用することもできる。培養器材の培養面は、平底、U底又はV底でもよいし、凹凸があってもよい。細胞との接着性を低下させる処理としては、例えば2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine(MPC)ポリマー、Poly(2-hydroxyethyl methacrylate)(Poly-HEMA)、polyethylene glycol(PEG)等のコーティングによる超親水性処理、タンパク低吸着処理等が挙げられる。
浮遊培養を行う際に生じる剪断力等の物理的ストレスから細胞凝集体を保護し、また細胞が分泌する増殖因子及びサイトカイン類の局所濃度を高め、組織の発達を促進する目的から、細胞凝集体をゲルに包埋、又は物質透過性のあるカプセルに封入したのちに浮遊培養を実施することもできる(Nature,2013,501.7467:373)。包埋に用いるゲル又はカプセルは、生体由来又は合成高分子製のいずれであってもよい。このような目的に用いるゲル又はカプセルとしては、例えばマトリゲル(Corning社製)、PuraMatrix(3D Matrix社製)、VitroGel 3D(TheWell Bioscience社製)、コラーゲンゲル(新田ゼラチン株式会社製)、アルギン酸ゲル(株式会社PGリサーチ製)、Cell-in-a-Box(Austrianova社製)等、細胞培養用のハイドロゲル又は包埋培養キットとして市販されているものを用いることができる。
細胞の培養に用いられる培地は、動物細胞の培養に通常用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えばBasal Medium Eagle(BME)、BGJb培地、CMRL 1066培地、Glasgow Minimum Essential Medium(Glasgow MEM)、Improved MEM Zinc Option、Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium(IMDM)、Medium 199、Eagle Minimum Essential Medium(Eagle MEM)、Alpha Modified Eagle Minimum Essential Medium(αMEM)、Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM)、F-12培地、DMEM/F12、IMDM/F12、ハム培地、RPMI 1640、Fischer’s培地、又はこれらの混合培地等が挙げられる。
多能性幹細胞の培養には、上記基礎培地をベースとした多能性幹細胞培養用の培地、好ましく公知の胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞用の培地、フィーダーフリー下で多能性幹細胞を培養するための培地(フィーダーフリー培地)等を用いることができる。
「無血清培地」とは、無調整又は未精製の血清を含まない培地を意味する。精製された血液由来成分や動物組織由来成分(例えば増殖因子)が混入している培地も、無調整又は未精製の血清を含まない限り無血清培地に含まれる。
無血清培地は、血清代替物を含有していてもよい。血清代替物としては、例えばアルブミン、トランスフェリン、脂肪酸、コラーゲン前駆体、微量元素、2-メルカプトエタノール又は3’チオールグリセロール又はこれらの均等物等を適宜含有するものを挙げることができる。かかる血清代替物は、例えば、国際公開第98/30679号に記載の方法により調製することができる。血清代替物としては市販品を利用してもよい。市販の血清代替物としては、例えばKnockout Serum Replacement(Thermo Fisher Scientific社製)(以下、「KSR」と記すこともある。)、Chemically-defined Lipid concentrated(Thermo Fisher Scientific社製)、Glutamax(Thermo Fisher Scientific社製)、B27 Supplement(Thermo Fisher Scientific社製)、N2 Supplement(Thermo Fisher Scientific社製)等が挙げられる。
浮遊培養及び接着培養で用いる無血清培地は、適宜、脂肪酸又は脂質、アミノ酸(例えば非必須アミノ酸)、ビタミン、増殖因子、サイトカイン、抗酸化剤、2-メルカプトエタノール、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類等を含有してもよい。
調製の煩雑さを回避するために、無血清培地として、市販のKSR(Thermo Fisher Scientific社製)を適量(例えば約0.5%から約30%、好ましくは約1%から約20%)添加した無血清培地(例えばF-12培地とIMDM培地の1:1混合液に1×chemically-defined Lipid concentrated、5%KSR及び450μM 1-モノチオグリセロールを添加した培地)を使用してもよい。また、KSR同等品として特表2001-508302号公報に開示された培地が挙げられる。
「血清培地」とは、無調整又は未精製の血清を含む培地を意味する。当該培地は、脂肪酸又は脂質、アミノ酸(例えば非必須アミノ酸)、ビタミン、増殖因子、サイトカイン、抗酸化剤、2-メルカプトエタノール、1-モノチオグリセロール、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類等を含有してもよい。
本発明における培養は、好ましくはゼノフリー条件で行われる。「ゼノフリー」とは、培養対象の細胞の生物種とは異なる生物種由来の成分が排除された条件を意味する。
本発明に用いる培地は、化学的に未決定な成分の混入を回避する観点から、好ましくは、含有成分が化学的に決定された培地(Chemically defined medium;CDM)である。
「基底膜(Basement membrane)構造」とは、細胞外マトリクスより構成される薄い膜状の構造を意味する。生体においては、基底膜は上皮細胞の基底側(basal)に形成される。基底膜の成分としては、IV型コラーゲン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン(パールカン)、エンタクチン/ニドゲン、サイトカイン、成長因子等が挙げられる。生体由来の組織中並びに本発明の製造方法等で作製された細胞塊中に基底膜が存在しているかどうかは、例えばPAM染色等の組織染色、並びに基底膜の構成成分に対する抗体(抗ラミニン抗体、抗IV型コラーゲン抗体等)を用いた免疫組織化学等の手法により検出することができる。
「基底膜標品」とは、その上に基底膜形成能を有する所望の細胞を播種して培養した場合に、上皮細胞様の細胞形態、分化、増殖、運動、機能発現等を制御する機能を有する基底膜構成成分を含むものをいう。本発明において、細胞の接着培養を行う際には、基底膜標品存在下で培養することができる。ここで、「基底膜構成成分」とは、動物の組織において、上皮細胞層と間質細胞層等との間に存在する薄い膜状をした細胞外マトリクス分子をいう。基底膜標品は、例えば基底膜を介して支持体上に接着している基底膜形成能を有する細胞を、該細胞の脂質溶解能を有する溶液やアルカリ溶液などを用いて支持体から除去することで作製することができる。基底膜標品としては、基底膜調製物として市販されている商品、例えばマトリゲル(Corning社製)、Geltrex(Thermo Fisher Scientific社製)、基底膜成分として公知の細胞外マトリクス分子(例えばラミニン、IV型コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、エンタクチン等)を含むものが挙げられる。
細胞又は組織の培養には、Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)マウス肉腫等の組織又は細胞から抽出、可溶化されたマトリゲル(Corning社製)等の基底膜標品を用いることができる。同様に細胞培養に用いる基底膜成分として、ヒト可溶化羊膜(株式会社生物資源応用研究所製)、HEK293細胞に産生させたヒト組換えラミニン(BioLamina社製)、ヒト組換えラミニン断片(ニッピ社製)、ヒト組換えビトロネクチン(Thermo Fisher Scientific社製)等も用いることができる。異なる生物種由来の成分混入を回避する観点、及び感染症のリスクを回避する観点から、基底膜標品は、好ましくは成分の明らかな組換えタンパク質を用いる。
本明細書において、「物質Xを含む培地」及び「物質Xの存在下」とは、それぞれ外来性(exogenous)の物質Xが添加された培地もしくは外来性の物質Xを含む培地、及び外来性の物質Xの存在下を意味する。外来性の物質Xは、例えば培地中に存在する細胞又は組織が当該物質Xを内在的(endogenous)に発現、分泌又は産生する内在的な物質Xと区別される。培地中の物質Xは、物質Xの分解又は培地の蒸発による微量な濃度の変化が起こっていてもよい。
本明細書において、物質Xの濃度がYである培地中での培養開始時とは、好ましくは培地中の物質Xの濃度がYで均一となった時点を指すが、培養容器が十分に小さい(例えば96ウェルプレートや、培養液が200μL以下での培養)場合、濃度がYとなるように後述する培地添加操作、半量培地交換操作又は全量培地交換操作を行った時点を濃度Yでの培養開始時と解釈する。また、培地中の物質Xの濃度がYであるとは、一定の培養期間を通じたXの平均の濃度がYである場合、物質XをYの濃度で含む期間が培養期間の50%以上である場合、物質XをYの濃度で含む期間が各工程において想定される培養期間のうち最も短い期間以上である場合等を含む。
本明細書において、「物質Xの非存在下」とは、外来性(exogenous)の物質Xが添加されていない培地もしくは外来性の物質Xを含まない培地、又は外来性の物質Xが存在しない状態を意味する。
本明細書において、「ヒトタンパク質X」とは、タンパク質Xが、ヒト生体内で天然に発現するタンパク質Xのアミノ酸配列を有することを意味する。
「単離」とは、目的とする成分や細胞以外の因子を除去する操作がなされ、天然に存在する状態を脱していることを意味する。従って、「単離されたタンパク質X」には、培養対象の細胞や組織から産生され細胞や組織及び培地中に含まれている内在性のタンパク質Xは包含されない。「単離されたタンパク質X」の純度(総タンパク質重量に占めるタンパク質Xの重量の百分率)は、通常70%以上、好ましくは80%以上、より好ましくは90%以上、さらに好ましくは99%以上、最も好ましくは100%である。
本明細書において、「誘導体」とは、特定の化合物に対して、当該化合物の分子内の一部が、他の官能基又は他の原子と置換されることにより生じる化合物群を意図する。本明細書において、タンパク質の「改変体」とは、もとのタンパク質の特性を維持できる範囲でアミノ酸残基の欠失、付加、置換等の変異がされているタンパク質をいう。変異のアミノ酸の数としては、特に制限されないが、1~4、1~3、1~2、又は1個が挙げられる。タンパク質の「改変体」は、もとのタンパク質と少なくとも90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、又は99.5%以上の同一性を示すアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。
本明細書において、「A時間(A日)以降」とはA時間(A日)を含み、A時間(A日)から後のことをいう。「B時間(B日)以内」とは、B時間(B日)を含み、B時間(B日)から前のことをいう。
「フィーダー細胞」とは、幹細胞を培養するときに共存させる当該幹細胞以外の細胞を指す。多能性幹細胞の未分化維持培養に用いられるフィーダー細胞としては、例えばマウス線維芽細胞(MEF)、ヒト線維芽細胞、SNL細胞等が挙げられる。フィーダー細胞は、増殖抑制処理されていることが好ましい。増殖抑制処理としては、増殖抑制剤(例えばマイトマイシンC)処理、UV照射等が挙げられる。多能性幹細胞の未分化維持培養に用いられるフィーダー細胞は、液性因子(好ましくは未分化維持因子)の分泌、細胞接着用の足場(細胞外基質)の作製により、多能性幹細胞の未分化維持に貢献する。
本明細書において、フィーダー細胞非存在下(フィーダーフリー)とは、フィーダー細胞非存在下にて培養することである。フィーダー細胞非存在下とは、例えばフィーダー細胞を添加していない条件、又はフィーダー細胞を実質的に含まない(例えば全細胞数に対するフィーダー細胞数の割合が3%以下)の条件が挙げられる。
「細胞凝集体」(cell aggregate)とは、細胞が集合して形成された塊であって、細胞同士が接着している塊をいう。細胞塊、胚様体(Embryoid body)、スフェア(Sphere)、スフェロイド(Spheroid)、オルガノイド(Organoid)も細胞凝集体に包含される。細胞凝集体は、好ましくは細胞同士が面接着している。一部の態様において、細胞凝集体の一部分あるいは全部において、細胞同士が細胞接着し、例えば接着結合(adherence junction)を形成している。一部の態様において、二つ以上の細胞凝集体同士をさらに人工的に接着又は凝集させることもできる。細胞塊同士をさらに接着又は凝集させた塊、及びアセンブロイド(assembloid)も細胞凝集体に含まれる。細胞凝集体の形態は球状に限らず、例えば双球状、数珠状、球の集合体状、Scientific reports, 2021, 11.1: 1-14.、特願2021-078154に記載の紐状、分枝状等の形態であってもよい。
「均一な細胞凝集体」とは、複数の細胞凝集体を培養する際に各細胞凝集体の大きさが一定であることを意味し、細胞凝集体の大きさを最大径の長さで評価する場合、均一な細胞凝集体とは、最大径の長さの分散が小さいことを意味する。より具体的には、複数の細胞凝集体のうち75%以上の細胞凝集体において、その最大径が複数の細胞凝集体の最大径平均値の±100%以内、好ましくは最大径平均値の±50%以内、より好ましくは最大径平均値の±20%以内であることを意味する。
「細胞集団」とは、2以上の細胞から構成される細胞群をいう。細胞集団は、一種の細胞から構成されていてもよいし、複数種の細胞から構成されていてもよい。細胞集団を構成する細胞は、培地中に浮遊していてもよいし、培養器材等に接着していてもよい。また、細胞集団を構成する細胞は、単一細胞であってもよいし、細胞集団の少なくとも一部において、細胞同士が細胞接着し、細胞塊を形成していてもよい。ここで「単一細胞」とは、例えば細胞同士の接着(例えば面接着)がほとんどなくなった細胞をいう。一部の態様において、単一細胞に分散されるとは、細胞-細胞間結合(例えば接着結合)がほとんどなくなった状態が挙げられる。細胞集団は、細胞凝集体を含んでよい。
「組織」とは、形態や性質が異なる複数種類の細胞が一定のパターンで立体的に配置した構造を有する細胞集団の構造体をさす。
「外胚葉」とは生物の初期発生の過程において卵の受精後に形成される3つの胚葉のうち、最も外側に存在する胚葉を表す。外胚葉は発生の進行に従い神経外胚葉と表層外胚葉に分かれ、さらに神経外胚葉は神経管と神経堤に分かれる。これら外胚葉から身体の各種器官が形成され、外胚葉から形成された器官は外胚葉に由来すると称される。例えば神経管からは脳及び脊髄等の中枢神経系の器官又は組織が形成される。例えば神経堤からは一部の中枢神経系細胞、顔面の骨及び軟骨、感覚神経細胞、自律神経細胞、色素細胞、間葉系細胞等が形成される。表層外胚葉からは表皮、内耳、下垂体前葉、嗅上皮を含む上気道組織等が形成される。プラコード及びプラコード由来組織は表層外胚葉に由来する。多能性幹細胞は、外胚葉に分化する過程で、例えばPax3、Otx2、Sox1といった外胚葉マーカーとして知られている遺伝子を発現する。
「内胚葉」とは生物の初期発生の過程において卵の受精後に形成される3つの胚葉のうち、最も内側に存在する胚葉を表す。内胚葉からは例えば消化器、尿路、咽頭、気管、気管支、肺といった嗅上皮及び鼻腔上皮を除いた呼吸器の大半が形成される。多能性幹細胞は、内胚葉に分化する過程で、例えばSOX17、HNF-3β/FoxA2、Klf5、GATA4、GATA6、PDX-1といった内胚葉マーカーとして知られている遺伝子を発現する。
「中胚葉」とは外胚葉と内胚葉の間に形成される胚葉を表す。中胚葉からは例えば循環器、骨格、筋肉といった器官又は組織が形成される。多能性幹細胞は、中胚葉に分化する過程で、例えばT/Brachury、SMA、ABCA4、Nkx2.5、PDGFRαといった中胚葉マーカーとして知られている遺伝子を発現する。
「神経組織」とは、発生期又は成体期の大脳、中脳、小脳、脊髄、網膜、感覚神経、末梢神経等の神経系細胞によって構成される組織を意味する。本明細書において、「神経上皮組織」とは、神経組織が層構造をもつ上皮構造を形成したものをいい、神経組織中の神経上皮組織は光学顕微鏡を用いた明視野観察等により存在量を評価することができる。
「中枢神経系」とは、神経組織が集積し、情報処理の中心をなす領域を表す。脊椎動物では、脳と脊髄が中枢神経系に含まれる。中枢神経系は外胚葉に由来する。
「神経系細胞(Neural cell)」とは、外胚葉由来組織のうち表皮系細胞以外の細胞を表す。すなわち、神経系細胞には、神経系前駆細胞、ニューロン(神経細胞)、グリア細胞、神経幹細胞、ニューロン前駆細胞、グリア前駆細胞等の細胞を含む。神経系細胞には、後述する網膜組織を構成する細胞(網膜細胞)、網膜前駆細胞、網膜層特異的神経細胞、神経網膜細胞、網膜色素上皮細胞も包含される。神経系細胞は、Nestin、βIIIチューブリン(Tuj1)、PSA-NCAM、N-cadherin等をマーカーとして同定することができる。
ニューロンは、神経回路を形成し情報伝達に貢献する機能的な細胞であり、TuJ1、Dcx、HuC/D等の幼若神経細胞マーカー、及び/又はMap2、NeuN等の成熟神経細胞マーカーの発現を指標に同定することができる。
グリア細胞としては、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、ミュラーグリア等が挙げられる。アストロサイトのマーカーとしてはGFAP、オリゴデンドロサイトのマーカーとしてはO4、ミュラーグリアのマーカーとしてはCRALBP等が挙げられる。
神経幹細胞とは、神経細胞及びグリア細胞への分化能(多分化能)と、多分化能を維持した増殖能(自己複製能ということもある)を有する細胞である。神経幹細胞のマーカーとしてはNestin、Sox2、Musashi、Hesファミリー、CD133等が挙げられるが、これらのマーカーは前駆細胞全般のマーカーであり神経幹細胞特異的なマーカーとは考えられていない。神経幹細胞の数は、ニューロスフェアアッセイ、クローナルアッセイ等により評価することができる。
ニューロン前駆細胞とは、増殖能をもち、神経細胞を産生し、グリア細胞を産生しない細胞である。ニューロン前駆細胞のマーカーとしては、Tbr2、Tα1等が挙げられる。幼若神経細胞マーカー(TuJ1、Dcx、HuC/D)陽性かつ増殖マーカー(Ki67、pH3、MCM)陽性の細胞を、ニューロン前駆細胞として同定することもできる。グリア前駆細胞とは、増殖能もち、グリア細胞を産生し、神経細胞を産生しない細胞である。
神経系前駆細胞(Neural Precursor cell)は、神経幹細胞、ニューロン前駆細胞及びグリア前駆細胞を含む前駆細胞の集合体であり、増殖能とニューロン及びグリア産生能をもつ。神経系前駆細胞はNestin、GLAST、Sox2、Sox1、Musashi、Pax6等をマーカーとして同定することができる。神経系細胞のマーカー陽性かつ増殖マーカー(Ki67、pH3、MCM)陽性の細胞を、神経系前駆細胞として同定することもできる。
「網膜組織」とは、生体網膜において各網膜層を構成する視細胞、水平細胞、双極細胞、アマクリン細胞、網膜神経節細胞、これらの前駆細胞、網膜前駆細胞等のうちの少なくとも複数種類が、層状で立体的に配列した網膜組織を意味する。それぞれの細胞がいずれの網膜層を構成する細胞であるかは、公知の方法、例えば細胞マーカーの発現有無、その程度等により確認できる。
「網膜前駆細胞」とは、視細胞、水平細胞、双極細胞、アマクリン細胞、網膜神経節細胞、網膜色素上皮細胞のいずれの成熟な網膜細胞にも分化しうる前駆細胞をいう。視細胞前駆細胞、水平細胞前駆細胞、双極細胞前駆細胞、アマクリン細胞前駆細胞、網膜節細胞前駆細胞、網膜色素上皮前駆細胞とは、それぞれ、視細胞、水平細胞、双極細胞、アマクリン細胞、網膜神経節細胞、網膜色素上皮細胞への分化が決定付けられている前駆細胞をいう。
「網膜層特異的神経細胞」とは、網膜層を構成する細胞であって網膜層に特異的な神経細胞を意味する。網膜層特異的神経細胞としては、双極細胞、網膜神経節節細胞、アマクリン細胞、水平細胞、視細胞、網膜色素上皮細胞、杆体細胞及び錐体細胞を挙げることができる。
「網膜細胞」には、上述の網膜前駆細胞及び網膜層特異的神経細胞が包含される。網膜細胞マーカーとしては、網膜前駆細胞で発現するRx(Raxとも言う)、Aldh1a3、及びPax6、視床下部ニューロンの前駆細胞では発現するが網膜前駆細胞では発現しないNkx2.1、視床下部神経上皮で発現し網膜では発現しないSox1、視細胞の前駆細胞で発現するCrx、Blimp1等が挙げられる。網膜層特異的神経細胞のマーカーとしては、双極細胞で発現するChx10、PKCα及びL7、網膜神経節細胞で発現するTuj1及びBrn3、アマクリン細胞で発現するCalretinin、水平細胞で発現するCalbindin、成熟視細胞で発現するRhodopsin及びRecoverin、杆体細胞で発現するNrl、錐体細胞で発現するRxr-gamma、網膜色素上皮細胞で発現するREP65及びMitf等が挙げられる。
「大脳組織」とは、胎児期又は成体の大脳を構成する細胞(例えば大脳神経系前駆細胞(cortical neural precursor cell)、背側大脳神経系前駆細胞、腹側大脳神経系前駆細胞、大脳層構造特異的神経細胞(ニューロン)、第一層ニューロン、第二層ニューロン、第三層ニューロン、第四層ニューロン、第五層ニューロン、第六層ニューロン、グリア細胞(アストロサイト及びオリゴデンドロサイト)、これらの前駆細胞等)のうち一種類又は複数種類が、層状で立体的に配列した組織を意味する。胎児期の大脳は、前脳又は終脳とも呼ばれる。それぞれの細胞の存在は、公知の方法、例えば細胞マーカーの発現有無、その程度等により確認できる。
大脳細胞マーカーとしては、大脳細胞で発現するFoxG1(別名Bf1)、大脳神経系前駆細胞で発現するSox2及びNestin、背側大脳神経系前駆細胞で発現するPax6及びEmx2、腹側大脳神経系前駆細胞で発現するDlx1、Dlx2及びNkx2.1、ニューロン前駆細胞で発現するTbr2、Nex、Svet1、第六層ニューロンで発現するTbr1、第五層ニューロンで発現するCtip2、第四層ニューロンで発現するRORβ、第三層ニューロン又は第二層ニューロンで発現するCux1又はBrn2、第一層ニューロンで発現するReelin等が挙げられる。
「嗅皮質」とは、嗅球からの単シナプス性入力を受け、嗅覚情報の処理に関わる大脳の一領域である。嗅皮質で発現する遺伝子及びマーカーとしては、Tbr1、FoxP2、Ctip2、Nor1(NR4a3)、DAARP-32、CUX1、Brn2、CART等が挙げられる。
「大脳基底核」とは、大脳の一領域に存在する神経核の集合体である。大脳基底核に含まれる神経核として、線条体、淡蒼球、視床下核、黒質等が挙げられる。「大脳基底核原基」とは、発生中の胚の脳室内に形成される神経系細胞からなる構造である。大脳基底核原基は成体の大脳基底核の基となることに加え、複数種の神経細胞を産生し、それらの細胞は発生中に中枢神経系の各所へと遊走する。
「吻側移動経路(rostral migratory stream)」とは、脳室下帯の神経幹細胞から産生された新生ニューロンが、嗅球へと遊走する現象及びその経路を表す。吻側移動経路を移動中のニューロンは、例えばPSA-NCAM、Dcxのような遊走中の神経細胞マーカーを用いて検出することができる。
「嗅球」とは、大脳の先端部に存在し、嗅上皮に存在する嗅覚受容細胞から入力を受け、嗅覚情報の処理に関わる中枢神経系の一領域を意味する。嗅球に存在する細胞は層構造を形成しており、表層から順に、嗅神経層(olfactory nerve layer)、糸球体層(glomerular layer)、外網状層(external plexiform layer)、僧帽細胞層(mitral cell layer)、内網状層(internal plexiform layer)、顆粒細胞層(granule cell layer)と呼称される。嗅球の神経細胞には、興奮性ニューロンとして僧帽細胞(mitral cell)と房飾細胞(tufted cell)があり、抑制性ニューロン(介在ニューロン)として傍糸球体細胞(periglomerular cell)と顆粒細胞(granule cell)がある。嗅球で発現する遺伝子及びマーカーとしては、Arx、Tbr1、Tbr2/EOMES、Tbx21、Iba1等が挙げられる。
「非神経上皮組織」とは、上皮構造を有する組織のうち神経上皮組織以外の組織を表す。上皮組織は外胚葉、中胚葉、内胚葉、栄養外胚葉のいずれの胚葉からも形成される。上皮組織には上皮、中皮、内皮が含まれる。非神経上皮組織に含まれる組織の例としては、表皮、角膜上皮、鼻腔上皮、嗅上皮、口腔上皮、気管上皮、気管支上皮、気道上皮、腎上皮、腎皮質上皮、胎盤上皮等が挙げられる。上皮組織は通常種々の細胞間結合によりつながれており、単層又は重層化した層構造を有する組織を形成する。これら上皮組織の有無の確認、存在量の定量は、光学顕微鏡による観察又は、上皮細胞マーカーに対する抗体(抗E-Cadherin抗体、抗N-Cadherin抗体、抗EpCAM抗体等)を用いた免疫組織化学等の手法により可能である。
本発明において、「上皮細胞極性(Epithelial polarity)」とは上皮細胞内に空間的に形成されている構成成分および細胞機能の分布の偏りを表す。例えば、角膜上皮細胞は眼球の最も外層に局在し、頂端側(apical)では涙液を保持するための膜結合型ムチン(MUC-1、4、16)等の頂端側特異的なタンパク質を発現している。また、角膜上皮細胞は基底側(basal)では基底膜に接着するためのα6インテグリン、β1インテグリン等の基底側特異的なタンパク質を発現している。
生体由来の組織中及び本発明の製造方法等で作製された細胞集団中において、上皮細胞及び上皮組織に、上皮細胞極性が存在しているかどうかは、Phalloidin、頂端側マーカー(抗MUC-1抗体、抗PKC-zeta抗体等)並びに基底側マーカー(抗α6インテグリン抗体、抗β1インテグリン抗体等)を用いた免疫組織化学等の手法により検出することができる。
生体由来の組織中及び本発明の製造方法等で作製された細胞集団中において、上皮細胞及び上皮組織に、上皮細胞極性が存在しているかどうかは、Phalloidin、頂端側マーカー(抗MUC-1抗体、抗PKC-zeta抗体等)並びに基底側マーカー(抗α6インテグリン抗体、抗β1インテグリン抗体等)を用いた免疫組織化学等の手法により検出することができる。
「プラコード(placode)」とは、主に脊椎動物の発生過程において表皮外胚葉の一部が肥厚して形成される器官の原基を表す。プラコードに由来する組織としては、水晶体、嗅上皮、内耳、三叉神経、下垂体等が挙げられる。プラコードのマーカー及びその前駆組織である前プラコード領域(preplacode region)のマーカーとしては、Six1、Six4、Dlx5、Eya2等が挙げられる。
「嗅上皮プラコード・嗅プラコード(Olfactory placode)」とは、胚発生の過程で表皮外胚葉の領域に形成される肥厚した構造であって、嗅上皮前駆細胞マーカーを発現し、将来の嗅上皮となる器官の原基を表す。嗅上皮前駆細胞マーカーとしては、Pax6、Otx2、FoxG1(別名Bf1)、Sox2、Pou2f1、Sp8、Chd7、N-Cadherin、E-Cadherin、EpCAM、CK18、PDGFRβ等が挙げられる。
「呼吸器」とは、体外から酸素を取り入れ、体外へと二酸化炭素を排出する外呼吸に関与する器官、臓器を表す。呼吸器に含まれる器官、臓器の例として、鼻腔、咽頭、喉頭、気管、気管支、肺、胸郭等が挙げられる。呼吸器は解剖学的に上気道と下気道に分けられる。鼻孔、鼻腔、鼻咽腔、咽頭、喉頭は上気道に分類される。気管、気管支、細気管支、肺は下気道に分類される。鼻腔上皮及び嗅上皮は上気道組織の一つである。
「鼻腔」とは、上気道組織の一つであり、顔の中心にある外鼻に空いている孔(鼻孔)より奥に存在する空間を表す。鼻腔は鼻孔より始まり、咽頭上部へと繋がっている。鼻腔は主として嗅部と呼ばれる嗅上皮が存在し、大気中のにおい物質を感知する部分、呼吸部と呼ばれる鼻腔上皮に覆われた部分、及び角化扁平重層上皮で覆われた皮膚と同様の性質を有している部分から構成される。
「鼻腔上皮」とは鼻腔中にある上皮組織であり、主として後述する嗅上皮以外の領域を表す。鼻腔上皮の機能としては取り込んだ空気を温め、また表面に分泌された粘液と細胞表面の線毛の働きにより異物を除去する働きがある。鼻腔上皮は主として外胚葉性の非神経上皮に由来し、分泌細胞、線毛細胞、クラブ細胞、基底細胞、塩類細胞、神経内分泌細胞、孤立化学感覚上皮細胞等の細胞から構成されている。
「分泌細胞」とは呼吸器系の組織において粘液又は漿液の分泌を行う細胞を表す。杯細胞及び腺細胞は分泌細胞に属する。分泌細胞及びその前駆細胞で発現する遺伝子及びマーカーとしては、例えばムチン1、ムチン2、ムチン3、ムチン4、ムチン5AC、ムチン5B、FoxA1、FoxA2、FOXA3、Nkx2.1/TTF-1、SPDEF等が挙げられる。
「線毛細胞」(「線毛上皮細胞」ともいう。)とは、上皮組織を形成する細胞であって、細胞の表面に線毛を有する細胞を表す。線毛細胞は呼吸器系、脳室、卵管等の上皮組織に存在し、線毛の運動により液体、液性因子、体内に侵入した異物、卵子等を特定の方向へ移送する働きがあることが知られている。線毛細胞及びその前駆細胞で発現する遺伝子及びマーカーとしては、FoxJ1、FoxN4、p73、アセチル化チューブリン、β4チューブリン、DNAI1、DNAH5、SNTN等が挙げられる。組織又は細胞をヘマトキシリン・エオジン(HE)染色等を実施した後に顕微鏡で観察し、細胞表面の線毛構造を観察することにより、線毛細胞及びその前駆細胞の存在を確認することができる。例えばJ.Microsc.,211(2003),pp.103-111に記載の方法により、線毛運動周波数:ciliary beating frequency(CBF)の程度を計測することにより、線毛細胞の存在を観測することもできる。
「線毛運動」とは、細胞表面にある線毛の動きであり、ヒトを含む哺乳動物の場合、呼吸器系では細菌やウイルスなどの病原体の排除、卵管では卵子の輸送等の機能を有する。線毛運動は通常、有効打と回復打からなる波動運動である。細胞が線毛運動を実施しているかは、例えば高倍率のレンズを用い、顕微鏡により動画を撮影することで検出できる。
「クラブ細胞」(「クララ細胞」ともいう。)とは、上皮組織を形成する細胞であって、粘液又は漿液成分の分泌、cytochrome P450による化合物代謝、サイトカインの分泌、免疫機能の制御等の機能を有する細胞を表す。クラブ細胞で発現する遺伝子及びマーカーとしては、SCGB1A1、SCGB3A2、CYP2f1、CYP2f2、uroplakin3a、Cldn10、Aox3、Pon1、Cckar等が挙げられる。また、サイトケラチン4、サイトケラチン13を発現し、バリア機能や免疫応答に関与していると考えられる「Hillock(ヒロック)細胞」も、クラブ細胞のサブ集団として含まれる。
「基底細胞」は、上皮の基底層に存在する細胞を表す。基底細胞は分裂能を有し、組織幹細胞として生体組織の長期的な維持や傷害の際の修復に寄与する。鼻腔上皮の基底細胞及びその前駆細胞で発現する遺伝子及びマーカーとしては、サイトケラチン5、サイトケラチン14、サイトケラチン15、p63、ΔNp63、p75等が挙げられる。
塩類細胞(「イオノサイト:ionocyte」ともいう。)は、CFTRを発現し、粘膜粘液の粘稠性を制御する機能を有することが報告されている細胞を示す。塩類細胞及びその前駆細胞で発現する遺伝子及びマーカーとしては、CFTR、Foxi1、液胞型プロトンATPase(vacuolar H+-ATPase、V-ATPase)、Ascl3、Tfcp2l1、DMRT2等が挙げられる。
神経内分泌細胞は、ホルモン及びペプチドを分泌し、生体の発生や恒常性を制御する機能を有する細胞を示す。神経内分泌細胞及びその前駆細胞で発現する遺伝子及びマーカーとしては、Ascl1、NeuroD1、Chromogranin A、Synaptophisin、神経特異エノラーゼ(NSE)、CALCA等が挙げられる。
孤立化学感覚上皮細胞は、化学物質の感知と生体防御反応の制御等の機能を有する細胞を示す。タフト(Tuft)細胞、刷毛細胞、微絨毛細胞も同種の細胞を表す。孤立化学感覚上皮細胞で発現する遺伝子及びマーカーとしては、ChAT/Trpm5、Pou2f3/Skn-1a、苦味受容体Tas2r、Gnat3、Plcb2、GNG13等が挙げられる。
「嗅上皮」とは鼻腔中にある上皮組織であり、生体が匂いの情報を感知する嗅覚器官を表す。嗅上皮は上気道組織に分類される。嗅上皮はプラコードに由来する組織の一つであり、嗅覚受容体を発現し、空気中の揮発性分子を感知する嗅神経細胞、嗅神経細胞を支える支持細胞、嗅上皮の幹細胞及び前駆細胞である基底細胞、及び粘液を分泌するボーマン腺細胞等の細胞から構成されている。嗅上皮は形態的に表層、中間層、基底層に分類され、表層には支持細胞、中間層には嗅神経細胞、基底層には基底細胞が存在する。ボーマン腺は嗅上皮内に分枝管状の胞状腺を形成し、点在している。
「嗅上皮の前駆組織」とは嗅上皮プラコードを含む。嗅上皮及び嗅上皮プラコードで発現する遺伝子及びマーカーとしては、上述のプラコード領域及び前プラコード領域のマーカーに加え、Pax6、Otx2、FoxG1(別名Bf1)、Sox2、Pou2f1、Sp8、Chd7、N-Cadherin、E-Cadherin、EpCAM、CK18、PDGFRβ等が挙げられる。
「嗅覚系組織」とは、胎児期又は成体の嗅覚系組織、例えば嗅上皮を構成する細胞(例えば嗅神経細胞、支持細胞、基底細胞、ボーマン腺細胞、嗅神経鞘細胞及びこれらの前駆細胞等)、嗅球を構成する細胞、嗅皮質を構成する細胞等が、一種類又は少なくとも複数種類、層状で立体的に配列した組織を意味する。それぞれの細胞の存在は、公知の方法、例えば細胞特異的遺伝子の発現有無又はその程度等により確認できる。
「嗅神経細胞」(olfactory receptor neuron:ORN)とは、鼻腔粘膜の嗅上皮中間層にある嗅覚を受容する神経細胞のことを表す。嗅神経細胞は表面の線毛にある嗅覚受容体で空気中の揮発性分子をとらえる。嗅神経細胞は双極性の感覚細胞であり、末梢側で発現している嗅覚受容体でとらえられた嗅覚情報は中枢側の嗅糸と呼ばれる神経軸索に伝搬される。嗅糸は数十本ずつ集まって一つの束を形成し、嗅神経はこれらの束すべてを指す。嗅糸は頭蓋骨の篩骨篩板にある篩骨孔を通って脳の嗅球に達し、そこで僧帽細胞等にシナプス結合して、脳内の嗅覚中枢へ嗅覚情報を伝達する。嗅神経細胞及びその前駆細胞で発現する遺伝子及びマーカーとしては、環状ヌクレオチド感受性チャンネルα2サブユニット(CNGA2)、環状ヌクレオチド感受性チャンネルα4サブユニット(CNGA4)、環状ヌクレオチド感受性チャンネルβ1bサブユニット、嗅覚特異性Gタンパク質(Golf)アデニル酸シクラーゼ、Olfactory Marker protein(OMP)、NCAM、OCAM(NCAM-2)、Ebf1、Ebf2、Ebf3、NeuroD、PGP9.5、Neuron Specific Enolase(NSE)、Growth Associated Protein 43(GAP-43/B50)、ビメンチン、Lhx2、Id3、β-Tubulin III(Tuj)、Calretinin、TrkB、Ctip2、Uncx及び嗅覚受容体(olfactory receptor:OR)等が挙げられる。
「支持細胞」(supporting cell/sustentacular cell)とは、嗅上皮の最も頂端面側に存在する多列円柱上皮様の細胞を表す。支持細胞は嗅神経細胞等の他の細胞の機能の発揮、生存や上皮構造の維持等に関わる。嗅上皮の微絨毛細胞(microvillar cell)は支持細胞のサブタイプである。支持細胞で発現する遺伝子及びマーカーとしては、Notch2、Notch3、Carbonyl reductase 2(Cbr2)、S-100、Ezrin、Reep6、Sox2、Tyro3、CYP2A6、SUS-1、SUS-4、EPAS1等が挙げられる。
嗅上皮における「基底細胞」(basal cell)とは、嗅上皮の基底層に存在する細胞を表す。基底細胞は形態的に球状基底細胞(globose basal cell:GBC)と水平基底細胞(horizontal basal cell:HBC)に分けられる。これら二種の細胞のうち、球状基底細胞は恒常的に細胞分裂を生じ、新しい嗅神経細胞を供給する活動中の前駆細胞、幹細胞である。一方で、水平基底細胞は通常では細胞分裂の細胞周期が停止した状態にあり、嗅上皮の大規模な損傷等が生じた際に活性化される休眠状態の幹細胞である。水平基底細胞で発現する遺伝子及びマーカーとしては、p63、サイトケラチン5、サイトケラチン14、ICAM-1等が挙げられる。球状基底細胞で発現する遺伝子及びマーカーとしては、GAP43、GBC-1、Lgr5、Ascl1、LSD1、SEC8、c-Kit/CD117、Sox2、Hes1、Id、Bmi1等が挙げられる。
「ボーマン腺細胞」(Bowman’s gland cell)とは、ボーマン腺(嗅腺)を構成する細胞を表す。ボーマン腺は嗅上皮に存在する分岐した細い管上の組織であり、嗅上皮を保護する粘液の分泌等の機能を有する。ボーマン腺細胞で発現する遺伝子及びマーカーとしては、Sox9、E-Cadherin、Aquaporin5、Ascl3、サイトケラチン18等が挙げられる。
「嗅神経鞘細胞」(olfactory ensheating glia:OEG)とは、嗅上皮及び嗅球に存在するグリア細胞の一種を表す。嗅神経鞘細胞はBDNF、NGF等の神経栄養因子を放出し、嗅神経の恒常的な再生に関わる細胞である。嗅神経鞘細胞で発現する遺伝子及びマーカーとしては、p75NTR、S100β、Sox10、GFAP、BLBP、Aquaporin1、Integrin α7等が挙げられる。
「嗅上皮周縁部」(lateral olfactory epithelium)とは、嗅上皮の周縁の領域であり、嗅上皮以外の非神経上皮と連続している領域を表す。本発明における「嗅上皮内側部」(medial olfactory epithelium)とは、嗅上皮周縁部に囲われた嗅上皮の中心領域を表す。嗅上皮周縁部と嗅上皮内側部では構成している細胞の割合が異なることが知られている(Development,2010,137:2471-2481)。嗅上皮周縁部で発現が高い遺伝子としてPbx1/2/3、Meis1、βIVTubulinが挙げられる。嗅上皮内側部で発現が高い遺伝子としてTuj1、Ascl1、Sox2が挙げられる。
「性腺刺激ホルモン放出ホルモン陽性神経細胞」とは、主として中枢神経系の視床下部に存在し、生殖系の器官の制御に関与する性腺刺激ホルモン放出ホルモン(gonadotropin releasing hormone:GnRH)を分泌する神経細胞である。性腺刺激ホルモン放出ホルモン陽性神経細胞は、胎生期に嗅上皮で発生したのちに、中枢神経系へと移動する。性腺刺激ホルモン放出ホルモン陽性神経細胞で発現する遺伝子及びマーカーとしては、性腺刺激ホルモン放出ホルモン(gonadotropin releasing hormone:GnRH)等が挙げられる。
「嗅窩:Olfactory Pit」とは、発生中の胚において、嗅上皮プラコードが胚の内側に陥入し形成される嗅覚系組織の基となる組織である。嗅窩は主として将来の嗅上皮を構成する組織、細胞、及び嗅上皮と連続して形成される鼻腔上皮の組織、細胞より構成される。
「骨組織」とは、骨を構成する細胞と、リン酸カルシウム、I型コラーゲン等から構成される骨基質を表す。骨を構成する細胞には、骨細胞、破骨細胞、骨芽細胞等が含まれる。
本発明において「間葉系細胞」とは、主に中胚葉並びに神経堤に由来し、結合組織を形成する非上皮性の細胞である。これらの細胞のうちの一部は、間葉系幹細胞と呼ばれる複能性を有した体性幹細胞である。本発明の製造方法で製造される細胞集団並びに本発明の製造方法で製造される組織中に間葉系細胞が含まれるかどうかは、Nestin、Vimentin、Cadherin-11、Laminin、CD44といった間葉系細胞マーカーに対する抗体を用いた免疫組織化学等の手法により検出することができる。間葉系幹細胞が含まれるかどうかは、CD9、CD13、CD29、CD44、CD55、CD59、CD73、CD105、CD140b、CD166、VCAM-1、STRO-1、c-Kit、Sca-1、Nucleostemin、CDCP1、BMPR2、BMPR1A及びBPMR1Bといった間葉系幹細胞マーカーに対する抗体を用いた免疫組織化学等の手法により検出することができる。
本発明において、「ニッチ」、又は「幹細胞ニッチ」とは幹細胞の増殖、分化、性質の維持等に関わる微小環境をいう。生体におけるニッチの例としては、造血幹細胞ニッチ、毛包幹細胞ニッチ、腸管上皮幹細胞ニッチ、筋幹細胞ニッチ、下垂体ニッチ、基底細胞ニッチなどが挙げられる。これらのニッチにおいては、それぞれの組織特有の幹細胞とニッチを提供する支持細胞とが存在する。また、支持細胞が提供するサイトカイン、ケモカイン、細胞外マトリックス、細胞接着因子、細胞間シグナル伝達因子等により幹細胞が維持されている。
「受容体タンパク質」とは、細胞膜、細胞質又は核内にあるタンパク質であり、ホルモン、サイトカイン、細胞増殖因子、化合物等の物質と結合し、各種の細胞の反応を惹起するタンパク質を表す。
「嗅覚受容体」とは、嗅神経細胞及びその他の細胞で発現し、化合物等の感知に関わる受容体タンパク質を表す。
「病原体」とは、宿主となる生物に病気を起こす性質を有するものをいう。ウイルス、真正細菌、菌類、原生動物、寄生虫、異常プリオンタンパク質等のタンパク質、核酸等が病原体として扱われる。
「ウイルス受容体」とは、ウイルスが細胞、組織に感染する際に結合する宿主側の因子である。ウイルス受容体は通常、タンパク質又は糖鎖である。例えば、アンジオテンシン変換酵素2(Angiotensin-converting enzyme 2:ACE2)はSARS-CoV-2のウイルス受容体であり、SARS-CoV-2のSpikeタンパク質と結合することが報告されている。シアル酸α2,6Galは、ヒト季節性インフルエンザウイルス(H1N1、H3N2等)の受容体であることが報告されている。シアル酸α2,3Galは、トリインフルエンザウイルス(H5N1など)の受容体であることが報告されている。その他ウイルス受容体は、例えばNature reviews Molecular cell biology 4.1(2003):57-68等に記載されている。
「ウイルス感染関連因子」とは、ウイルスが細胞及び組織に感染する際に影響する宿主側の因子を表す。例えば、TMPRSS2はタンパク質分解酵素の一種であり、細胞への感染の際にSARS-CoV-2のタンパク質を開裂し、活性型へと変換することが報告されている。
「パターン認識受容体(PRRs)」とは、病原体などの異物を認識する機能をもつ受容体を表す。パターン認識受容体としてはレクチン、補体、膜受容体、細胞質タンパク質等が挙げられる。パターン認識受容体は病原体特有の分子パターン(pathogen-associated molecular patterns;PAMPs)を認識し、機能を発揮する。病原体特有の分子パターンとしては、核酸(DNA、RNA)、糖鎖、タンパク質等が挙げられ、パターン認識受容体は各々固有の標的と結合する。
「サイトカイン」とは、生体が細胞間情報伝達に用いる一群のタンパク質を表す。サイトカインには例えばケモカイン、増殖因子、造血因子、インターフェロン、インターロイキン、腫瘍壊死因子等が含まれる。
「免疫」とは、病原体及びウイルスなどの非自己物質、がん細胞等の自己由来であっても異常を有し有害な細胞、及び異物等を認識し、排除又は無害化するための生体が有するシステムである。「免疫応答」とは、免疫が機能する際に免疫系の組織及び細胞が示す生理的反応である。
「ウイルスの分離」とは、ウイルスの存在が予想される検体中に存在する特定のウイルスを増殖、同定することである。検体としては例えば、ヒトを含む動物、植物その他生物の組織、排泄物、分泌物等、又は環境中の試料が挙げられる。ウイルスの分離には、対象となるウイルスの種類、特性に応じ、培養細胞、動物等が用いられる。
[2.鼻腔上皮を構成する細胞の製造方法]
本発明は、鼻腔上皮を構成する細胞の製造方法を提供する。
鼻腔上皮を構成する細胞の製造方法の一態様は、
Wntシグナル伝達経路阻害物質の存在下で多能性幹細胞を培養する工程(1)、
BMPシグナル伝達経路作用物質の存在下で、前記工程(1)で培養した細胞を培養する工程(2)、
FGFシグナル伝達経路作用物質及びBMPシグナル伝達経路阻害物質からなる群より選ばれる少なくとも1つの存在下で、前記工程(2)で培養した細胞を培養する工程(3)、及び
前記工程(3)で培養した細胞をさらに培養し、前記鼻腔上皮を構成する細胞を得る工程(4)であって、Wntシグナル伝達経路阻害物質、FGFシグナル伝達経路作用物質及びBMPシグナル伝達経路阻害物質からなる群より選ばれる少なくとも2つの非存在下で前記細胞を培養する工程を含む。
本発明は、鼻腔上皮を構成する細胞の製造方法を提供する。
鼻腔上皮を構成する細胞の製造方法の一態様は、
Wntシグナル伝達経路阻害物質の存在下で多能性幹細胞を培養する工程(1)、
BMPシグナル伝達経路作用物質の存在下で、前記工程(1)で培養した細胞を培養する工程(2)、
FGFシグナル伝達経路作用物質及びBMPシグナル伝達経路阻害物質からなる群より選ばれる少なくとも1つの存在下で、前記工程(2)で培養した細胞を培養する工程(3)、及び
前記工程(3)で培養した細胞をさらに培養し、前記鼻腔上皮を構成する細胞を得る工程(4)であって、Wntシグナル伝達経路阻害物質、FGFシグナル伝達経路作用物質及びBMPシグナル伝達経路阻害物質からなる群より選ばれる少なくとも2つの非存在下で前記細胞を培養する工程を含む。
鼻腔上皮を構成する細胞の製造方法の他の一態様は、
Wntシグナル伝達経路阻害物質の存在下で多能性幹細胞を培養する工程(1)、
BMPシグナル伝達経路作用物質の存在下で、前記工程(1)で培養した細胞を培養する工程(2)、
FGFシグナル伝達経路作用物質及びBMPシグナル伝達経路阻害物質からなる群より選ばれる少なくとも1つの存在下で、前記工程(2)で培養した細胞を培養する工程(3)、及び
前記工程(3)で培養した細胞をさらに培養し、前記鼻腔上皮を構成する細胞を得る工程(4)であって、FGFシグナル伝達経路阻害物質、Shhシグナル伝達経路作用物質、BMPシグナル伝達経路作用物質、Wntシグナル伝達経路作用物質、Notchシグナル伝達経路阻害物質、アクチビン/TGF-βシグナル伝達経路作用物質及びレチノイン酸シグナル伝達経路作用物質からなる群より選ばれる少なくとも1つの存在下で前記細胞を培養する工程を含む。
Wntシグナル伝達経路阻害物質の存在下で多能性幹細胞を培養する工程(1)、
BMPシグナル伝達経路作用物質の存在下で、前記工程(1)で培養した細胞を培養する工程(2)、
FGFシグナル伝達経路作用物質及びBMPシグナル伝達経路阻害物質からなる群より選ばれる少なくとも1つの存在下で、前記工程(2)で培養した細胞を培養する工程(3)、及び
前記工程(3)で培養した細胞をさらに培養し、前記鼻腔上皮を構成する細胞を得る工程(4)であって、FGFシグナル伝達経路阻害物質、Shhシグナル伝達経路作用物質、BMPシグナル伝達経路作用物質、Wntシグナル伝達経路作用物質、Notchシグナル伝達経路阻害物質、アクチビン/TGF-βシグナル伝達経路作用物質及びレチノイン酸シグナル伝達経路作用物質からなる群より選ばれる少なくとも1つの存在下で前記細胞を培養する工程を含む。
鼻腔上皮を構成する細胞の製造方法の好ましい他の一態様は、
Wntシグナル伝達経路阻害物質の存在下で多能性幹細胞を培養する工程(1)であって、前記多能性幹細胞を浮遊培養し、細胞凝集体を形成させる工程、
BMPシグナル伝達経路作用物質の存在下で、前記工程(1)で培養した細胞を培養する工程(2)であって、前記細胞凝集体を浮遊培養する工程、
FGFシグナル伝達経路作用物質及びBMPシグナル伝達経路阻害物質からなる群より選ばれる少なくとも1つの存在下で、前記工程(2)で培養した細胞を培養する工程(3)であって、前記細胞凝集体を浮遊培養する工程、及び
前記工程(3)で培養した細胞をさらに培養し、前記鼻腔上皮を構成する細胞を得る工程(4)であって、Wntシグナル伝達経路阻害物質、FGFシグナル伝達経路作用物質及びBMPシグナル伝達経路阻害物質からなる群より選ばれる少なくとも2つの非存在下で前記細胞凝集体を浮遊培養する工程を含む。
Wntシグナル伝達経路阻害物質の存在下で多能性幹細胞を培養する工程(1)であって、前記多能性幹細胞を浮遊培養し、細胞凝集体を形成させる工程、
BMPシグナル伝達経路作用物質の存在下で、前記工程(1)で培養した細胞を培養する工程(2)であって、前記細胞凝集体を浮遊培養する工程、
FGFシグナル伝達経路作用物質及びBMPシグナル伝達経路阻害物質からなる群より選ばれる少なくとも1つの存在下で、前記工程(2)で培養した細胞を培養する工程(3)であって、前記細胞凝集体を浮遊培養する工程、及び
前記工程(3)で培養した細胞をさらに培養し、前記鼻腔上皮を構成する細胞を得る工程(4)であって、Wntシグナル伝達経路阻害物質、FGFシグナル伝達経路作用物質及びBMPシグナル伝達経路阻害物質からなる群より選ばれる少なくとも2つの非存在下で前記細胞凝集体を浮遊培養する工程を含む。
鼻腔上皮を構成する細胞の製造方法の好ましい他の一態様は、
Wntシグナル伝達経路阻害物質の存在下で多能性幹細胞を培養する工程(1)であって、前記多能性幹細胞を浮遊培養し、細胞凝集体を形成させる工程、
BMPシグナル伝達経路作用物質の存在下で、前記工程(1)で培養した細胞を培養する工程(2)であって、前記細胞凝集体を浮遊培養する工程、
FGFシグナル伝達経路作用物質及びBMPシグナル伝達経路阻害物質からなる群より選ばれる少なくとも1つの存在下で、前記工程(2)で培養した細胞を培養する工程(3)であって、前記細胞凝集体を浮遊培養する工程、及び
前記工程(3)で培養した細胞をさらに培養し、前記鼻腔上皮を構成する細胞を得る工程(4)であって、FGFシグナル伝達経路阻害物質、Shhシグナル伝達経路作用物質、BMPシグナル伝達経路作用物質、Wntシグナル伝達経路作用物質、Notchシグナル伝達経路阻害物質、アクチビン/TGF-βシグナル伝達経路作用物質及びレチノイン酸シグナル伝達経路作用物質からなる群より選ばれる少なくとも1つの存在下で前記細胞凝集体を浮遊培養する工程を含む。
Wntシグナル伝達経路阻害物質の存在下で多能性幹細胞を培養する工程(1)であって、前記多能性幹細胞を浮遊培養し、細胞凝集体を形成させる工程、
BMPシグナル伝達経路作用物質の存在下で、前記工程(1)で培養した細胞を培養する工程(2)であって、前記細胞凝集体を浮遊培養する工程、
FGFシグナル伝達経路作用物質及びBMPシグナル伝達経路阻害物質からなる群より選ばれる少なくとも1つの存在下で、前記工程(2)で培養した細胞を培養する工程(3)であって、前記細胞凝集体を浮遊培養する工程、及び
前記工程(3)で培養した細胞をさらに培養し、前記鼻腔上皮を構成する細胞を得る工程(4)であって、FGFシグナル伝達経路阻害物質、Shhシグナル伝達経路作用物質、BMPシグナル伝達経路作用物質、Wntシグナル伝達経路作用物質、Notchシグナル伝達経路阻害物質、アクチビン/TGF-βシグナル伝達経路作用物質及びレチノイン酸シグナル伝達経路作用物質からなる群より選ばれる少なくとも1つの存在下で前記細胞凝集体を浮遊培養する工程を含む。
鼻腔上皮を構成する細胞の製造方法の好ましい他の一態様は、
Wntシグナル伝達経路阻害物質の存在下で多能性幹細胞を培養する工程(1)であって、前記多能性幹細胞を培養器材上で接着培養する工程、
BMPシグナル伝達経路作用物質の存在下で、前記工程(1)で培養した細胞を培養する工程(2)であって、前記細胞を接着培養する工程、
FGFシグナル伝達経路作用物質及びBMPシグナル伝達経路阻害物質からなる群より選ばれる少なくとも1つの存在下で、前記工程(2)で培養した細胞を培養する工程(3)であって、前記細胞を接着培養する工程、及び
前記工程(3)で培養した細胞をさらに培養し、前記鼻腔上皮を構成する細胞を得る工程(4)であって、Wntシグナル伝達経路阻害物質、FGFシグナル伝達経路作用物質及びBMPシグナル伝達経路阻害物質からなる群より選ばれる少なくとも2つの非存在下で前記細胞を接着培養する工程を含む。
Wntシグナル伝達経路阻害物質の存在下で多能性幹細胞を培養する工程(1)であって、前記多能性幹細胞を培養器材上で接着培養する工程、
BMPシグナル伝達経路作用物質の存在下で、前記工程(1)で培養した細胞を培養する工程(2)であって、前記細胞を接着培養する工程、
FGFシグナル伝達経路作用物質及びBMPシグナル伝達経路阻害物質からなる群より選ばれる少なくとも1つの存在下で、前記工程(2)で培養した細胞を培養する工程(3)であって、前記細胞を接着培養する工程、及び
前記工程(3)で培養した細胞をさらに培養し、前記鼻腔上皮を構成する細胞を得る工程(4)であって、Wntシグナル伝達経路阻害物質、FGFシグナル伝達経路作用物質及びBMPシグナル伝達経路阻害物質からなる群より選ばれる少なくとも2つの非存在下で前記細胞を接着培養する工程を含む。
鼻腔上皮を構成する細胞の製造方法の好ましい他の一態様は、
Wntシグナル伝達経路阻害物質の存在下で多能性幹細胞を培養する工程(1)であって、前記多能性幹細胞を培養器材上で接着培養する工程、
BMPシグナル伝達経路作用物質の存在下で、前記工程(1)で培養した細胞を培養する工程(2)であって、前記細胞を接着培養する工程、
FGFシグナル伝達経路作用物質及びBMPシグナル伝達経路阻害物質からなる群より選ばれる少なくとも1つの存在下で、前記工程(2)で培養した細胞を培養する工程(3)であって、前記細胞を接着培養する工程、及び
前記工程(3)で培養した細胞をさらに培養し、前記鼻腔上皮を構成する細胞を得る工程(4)であって、FGFシグナル伝達経路阻害物質、Shhシグナル伝達経路作用物質、BMPシグナル伝達経路作用物質、Wntシグナル伝達経路作用物質、Notchシグナル伝達経路阻害物質、アクチビン/TGF-βシグナル伝達経路作用物質及びレチノイン酸シグナル伝達経路作用物質からなる群より選ばれる少なくとも1つの存在下で前記細胞を接着培養する工程を含む。
Wntシグナル伝達経路阻害物質の存在下で多能性幹細胞を培養する工程(1)であって、前記多能性幹細胞を培養器材上で接着培養する工程、
BMPシグナル伝達経路作用物質の存在下で、前記工程(1)で培養した細胞を培養する工程(2)であって、前記細胞を接着培養する工程、
FGFシグナル伝達経路作用物質及びBMPシグナル伝達経路阻害物質からなる群より選ばれる少なくとも1つの存在下で、前記工程(2)で培養した細胞を培養する工程(3)であって、前記細胞を接着培養する工程、及び
前記工程(3)で培養した細胞をさらに培養し、前記鼻腔上皮を構成する細胞を得る工程(4)であって、FGFシグナル伝達経路阻害物質、Shhシグナル伝達経路作用物質、BMPシグナル伝達経路作用物質、Wntシグナル伝達経路作用物質、Notchシグナル伝達経路阻害物質、アクチビン/TGF-βシグナル伝達経路作用物質及びレチノイン酸シグナル伝達経路作用物質からなる群より選ばれる少なくとも1つの存在下で前記細胞を接着培養する工程を含む。
鼻腔上皮を構成する細胞の製造方法の好ましい他の一態様は、
Wntシグナル伝達経路阻害物質の存在下で多能性幹細胞を培養する工程(1)であって、前記多能性幹細胞を浮遊培養し、細胞凝集体を形成させる工程、
BMPシグナル伝達経路作用物質の存在下で、前記工程(1)で培養した細胞を培養する工程(2)であって、前記細胞凝集体を浮遊培養する工程、
FGFシグナル伝達経路作用物質及びBMPシグナル伝達経路阻害物質からなる群より選ばれる少なくとも1つの存在下で、前記工程(2)で培養した細胞を培養する工程(3)であって、前記細胞凝集体中に嗅神経前駆細胞が分化するまで浮遊培養する工程、及び
前記工程(3)で培養した細胞をさらに培養し、前記鼻腔上皮を構成する細胞を得る工程(4)であって、前記細胞凝集体を浮遊培養し、前記嗅神経前駆細胞が存在する上皮と連続する上皮上に前記鼻腔上皮を構成する細胞を得る工程を含む。
Wntシグナル伝達経路阻害物質の存在下で多能性幹細胞を培養する工程(1)であって、前記多能性幹細胞を浮遊培養し、細胞凝集体を形成させる工程、
BMPシグナル伝達経路作用物質の存在下で、前記工程(1)で培養した細胞を培養する工程(2)であって、前記細胞凝集体を浮遊培養する工程、
FGFシグナル伝達経路作用物質及びBMPシグナル伝達経路阻害物質からなる群より選ばれる少なくとも1つの存在下で、前記工程(2)で培養した細胞を培養する工程(3)であって、前記細胞凝集体中に嗅神経前駆細胞が分化するまで浮遊培養する工程、及び
前記工程(3)で培養した細胞をさらに培養し、前記鼻腔上皮を構成する細胞を得る工程(4)であって、前記細胞凝集体を浮遊培養し、前記嗅神経前駆細胞が存在する上皮と連続する上皮上に前記鼻腔上皮を構成する細胞を得る工程を含む。
工程(1)~工程(3)により、嗅神経細胞又はその前駆細胞を含む嗅上皮様の上皮組織を製造することができる。工程(4)を行なうことで、上皮組織を鼻腔上皮を構成する細胞を含む鼻腔上皮様の組織に分化誘導することができる。本発明に係る製造方法によれば、鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞を含む細胞集団を得ることができる。鼻腔上皮を構成する細胞は、分泌細胞、線毛細胞、クラブ細胞、基底細胞、塩類細胞、神経内分泌細胞、孤立化学感覚上皮細胞からなる群より選ばれる少なくとも1種の細胞を含む。
上記の製造方法において、工程(3)と同じ条件で培養を継続することで鼻腔上皮を構成する細胞を得ることもできる。
鼻腔上皮を構成する細胞の製造方法の好ましい他の一態様は、
FGFシグナル伝達経路阻害物質、Shhシグナル伝達経路作用物質、BMPシグナル伝達経路作用物質、Wntシグナル伝達経路作用物質、Notchシグナル伝達経路阻害物質、アクチビン/TGF-βシグナル伝達経路作用物質及びレチノイン酸シグナル伝達経路作用物質からなる群より選ばれる少なくとも1つの存在下で、嗅神経細胞又はその前駆細胞を含む細胞集団を培養する工程を含む。
鼻腔上皮を構成する細胞の製造方法の好ましい他の一態様は、
FGFシグナル伝達経路阻害物質、Shhシグナル伝達経路作用物質、BMPシグナル伝達経路作用物質、Wntシグナル伝達経路作用物質、Notchシグナル伝達経路阻害物質、アクチビン/TGF-βシグナル伝達経路作用物質及びレチノイン酸シグナル伝達経路作用物質からなる群より選ばれる少なくとも1つの存在下で、嗅神経細胞又はその前駆細胞を含む細胞集団を培養する工程を含む。
嗅神経細胞を含む非神経上皮組織を含む細胞塊は、国際公開第2020/039732号の実施例に記載の方法によっても製造することができる。
<工程(a)>
本実施形態に係る製造方法において、
工程(1)の前に、多能性幹細胞をフィーダー細胞非存在下で、
1)TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及びソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質からなる群より選ばれる少なくとも1つと、
2)未分化維持因子と、
を含む培地で培養する工程(a)を含んでもよい。
本実施形態に係る製造方法において、
工程(1)の前に、多能性幹細胞をフィーダー細胞非存在下で、
1)TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及びソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質からなる群より選ばれる少なくとも1つと、
2)未分化維持因子と、
を含む培地で培養する工程(a)を含んでもよい。
多能性幹細胞をTGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及びソニック・ヘッジホッグシグナル(Shh)伝達経路作用物質からなる群より選ばれる少なくとも1つの存在下で培養してから、工程(1)を開始することにより、多能性幹細胞の状態が変わり、分化しやすく、細胞死が生じにくく、鼻腔上皮を構成する細胞の製造効率が向上する。
本発明に係る鼻腔上皮を構成する細胞の製造方法において、多能性幹細胞は、好ましくは胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞である。人工多能性幹細胞は、所定の機関より入手でき、市販品を購入することもできる。例えばヒト人工多能性幹細胞株201B7株は、京都大学より入手できる。HC-6 #10株、1231A3株及び1383D2株は国立研究開発法人理化学研究所より入手できる。hiPS β-actin GFP株はメルク社から入手できる。
TGFβファミリーシグナル伝達経路(すなわちTGFβスーパーファミリーシグナル伝達経路)とは、形質転換増殖因子β(TGFβ)、Nodal/Activin、又はBMPをリガンドとし、細胞内でSmadファミリーの物質により伝達されるシグナル伝達経路である。
TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質とは、TGFβファミリーシグナル伝達経路、すなわちSmadファミリーの物質により伝達されるシグナル伝達経路を阻害する物質を表し、具体的にはTGFβシグナル伝達経路阻害物質、Nodal/Activinシグナル伝達経路阻害物質及びBMPシグナル伝達経路阻害物質を挙げることができる。TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質としては、TGFβシグナル伝達経路阻害物質が好ましい。
TGFβシグナル伝達経路阻害物質としては、TGFβに起因するシグナル伝達経路を阻害する物質であれば特に限定は無く、核酸、タンパク質、低分子有機化合物のいずれであってもよい。当該物質として例えばTGFβに直接作用する物質(例えばタンパク質、抗体、アプタマー等)、TGFβをコードする遺伝子の発現を抑制する物質(例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、siRNA等)、TGFβ受容体とTGFβの結合を阻害する物質、TGFβ受容体によるシグナル伝達に起因する生理活性を阻害する物質(例えばTGFβ受容体の阻害剤、Smadの阻害剤等)を挙げることができる。TGFβシグナル伝達経路阻害物質として知られているタンパク質として、Leftyが挙げられる。
TGFβシグナル伝達経路阻害物質として、当業者に周知の化合物を使用することができる。具体的には、SB431542(「SB431」と略記する場合がある。)(4-[4-(3,4-Methylenedioxyphenyl)-5-(2-pyridyl)-1H-imidazol-2-yl]benzamide)、SB505124(2-[4-(1,3-Benzodioxol-5-yl)-2-(1,1-dimethylethyl)-1H-imidazol-5-yl]-6-methylpyridine)、SB525334(6-[2-(1,1-Dimethylethyl)-5-(6-methyl-2-pyridinyl)-1H-imidazol-4-yl]quinoxaline)、LY2157299(4-[5,6-Dihydro-2-(6-methyl-2-pyridinyl)-4H-pyrrolo[1,2-b]pyrazol-3-yl]-6-quinolinecarboxamide)、LY2109761(4-[5,6-dihydro-2-(2-pyridinyl)-4H-pyrrolo[1,2-b]pyrazol-3-yl]-7-[2-(4-morpholinyl)ethoxy]-quinoline)、GW788388(4-{4-[3-(Pyridin-2-yl)-1H-pyrazol-4-yl]-pyridin-2-yl}-N-(tetrahydro-2H-pyran-4-yl)benzamide)、LY364947(4-[3-(2-Pyridinyl)-1H-pyrazol-4-yl]quinoline)、SD-208(2-(5-Chloro-2-fluorophenyl)pteridin-4-yl)pyridin-4-yl amine)、EW-7197(N-(2-fluorophenyl)-5-(6-methyl-2-pyridinyl)-4-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pyridin-6-yl-1H-Imidazole-2-methanamine)、A83-01(3-(6-Methylpyridin-2-yl)-4-(4-quinolyl)-1-phenylthiocarbamoyl-1H-pyrazole)、RepSox(2-[5-(6-Methylpyridin-2-yl)-1H-pyrazol-4-yl]-1,5-naphthyridine)、SM16(4-[4-(1,3-Benzodioxol-5-yl)-5-(6-methyl-2-pyridinyl)-1H-imidazol-2-yl]bicyclo[2.2.2]octane-1-carboxamide)、R268712(4-[2-Fluoro-5-[3-(6-methyl-2-pyridinyl)-1H-pyrazol-4-yl]phenyl]-1H-pyrazole-1-ethanol)、IN1130(3-[[5-(6-Methyl-2-pyridinyl)-4-(6-quinoxalinyl)-1H-imidazol-2-yl]methyl]benzamide)、Galunisertib(4-[5,6-Dihydro-2-(6-methyl-2-pyridinyl)-4H-pyrrolo[1,2-b]pyrazol-3-yl]-6-quinolinecarboxamide)、AZ12799734(4-({4-[(2,6-dimethylpyridin-3-yl)oxy]pyridin-2-yl}amino)benzenesulfonamide)、A77-01(4-[3-(6-Methylpyridin-2-yl)-1H-pyrazol-4-yl]quinoline)、KRCA 0008(1,1-[(5-Chloro-2,4-pyrimidinediyl)bis[imino(3-methoxy-4,1-phenylene)-4,1-piperazinediyl]]bisethanone)、GSK 1838705(2-[[2-[[1-[(Dimethylamino)ethanoyl]-5-(methyloxy)-2,3-dihydro-1H-indol-6-yl]amino]-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-yl]amino]-6-fluoro-N-methylbenzamide)、Crizotinib(3-[(1R)-1-(2,6-Dichloro-3-fluorophenyl)ethoxy]-5-[1-(piperidin-4-yl)-1H-pyrazol-4-yl]-2-aMinopyridine)、Ceritinib(5-Chloro-N2-[2-isopropoxy-5-Methyl-4-(4-piperidyl)phenyl]-N4-(2-isopropylsulfonylphenyl)pyriMidine-2,4-diaMine)、ASP 3026(N2-[2-Methoxy-4-[4-(4-methyl-1-piperazinyl)-1-piperidinyl]phenyl]-N4-[2-[(1-methylethyl)sulfon)、TAE684(5-Chloro-N2-[2-methoxy-4-[4-(4-methyl-1-piperazinyl)-1-piperidinyl]phenyl]-N4-[2-[(1-methylethyl)sulfonyl]phenyl]-2,4-pyrimidinediamine)、AZD3463(N-[4-(4-Amino-1-piperidinyl)-2-methoxyphenyl]-5-chloro-4-(1H-indol-3-yl)-2-pyrimidinamine)、TP0427736(6-[4-(4-methyl-1,3-thiazol-2-yl)-1H-imidazol-5-yl]-1,3-benzothiazole)等のAlk5/TGFβR1阻害剤、SIS3(1-(3,4-dihydro-6,7-dimethoxy-2(1H)-isoquinolinyl)-3-(1-methyl-2-phenyl-1H-pyrrolo[2,3-b]pyridin-3-yl)-2-propen-1-one)等のSMAD3阻害剤、ITD-1(4-[1,1’-Biphenyl]-4-yl-1,4,5,6,7,8-hexahydro-2,7,7-trimethyl-5-oxo-3-quinolinecarboxylic acid ethyl ester)等の受容体分解促進剤及びこれら化合物の誘導体等が挙げられる。これらの物質は単独で又は複数種を組み合わせて用いてもよい。SB431542は、TGFβ受容体(ALK5)及びActivin受容体(ALK4/7)の阻害剤(すなわちTGFβR阻害剤)として公知の化合物である。SIS3は、TGFβ受容体の制御下にある細胞内シグナル伝達因子であるSMAD3のリン酸化を阻害するTGFβシグナル伝達経路阻害物質である。ITD-1は、TGF-β type II receptorのプロテアソーム分解促進剤である。上記の化合物等がTGFβシグナル伝達経路阻害物質としての活性を有することは、例えばExpert opinion on investigational drugs, 2010, 19.1: 77-91.等に記載されており、当業者にとって公知である。
TGFβシグナル伝達経路阻害物質は、好ましくはAlk5/TGFβR1阻害剤を含む。Alk5/TGFβR1阻害剤は、好ましくはSB431542、SB505124、SB525334、LY2157299、GW788388、LY364947、SD-208、EW-7197、A83-01、RepSox、SM16、R268712、IN1130、Galunisertib、AZ12799734、A77-01、KRCA 0008、GSK 1838705、Crizotinib、Ceritinib、ASP 3026、TAE684、AZD3463、TP0427736からなる群より選ばれる少なくとも1つを含み、さらに好ましくはSB431542、RepSox又はA83-01を含む。
培地中のTGFβシグナル伝達経路阻害物質の濃度は、上述の効果を達成可能な範囲で適宜設定することが可能である。工程(a)におけるTGFβ伝達経路阻害物質としてSB431542を用いる場合は、通常約1nM~約100μM、好ましくは約10nM~100μM、より好ましくは約10nM~約50μM、さらに好ましくは約100nM~約50μM、特に好ましくは約1μM~約10μMの濃度で使用される。また、SB431542以外のTGFβシグナル伝達経路阻害物質を使用する場合、上記濃度のSB431542と同等のTGFβシグナル伝達経路阻害活性を示す濃度で用いられることが望ましい。
Shh伝達経路作用物質とは、Shhにより媒介されるシグナル伝達を増強し得る物質である。Shhシグナル伝達経路作用物質としては、例えばHedgehogファミリーに属するタンパク質(例えばShh、Ihh)、Shh受容体、Shh受容体アゴニスト、Smoアゴニスト、Purmorphamine(9-cyclohexyl-N-[4-(morpholinyl)phenyl]-2-(1-naphthalenyloxy)-9H-purin-6-amine)、GSA-10(Propyl 4-(1-hexyl-4-hydroxy-2-oxo-1,2-dihydroquinoline-3-carboxamido)benzoate)、Hh-Ag1.5、20(S)-Hydroxycholesterol、SAG(Smoothened Agonist:N-Methyl-N’-(3-pyridinylbenzyl)-N’-(3-chlorobenzo[b]thiophene-2-carbonyl)-1,4-diaminocyclohexane)等が挙げられる。これらの物質は単独で又は複数種を組み合わせて用いてもよい。上記の化合物等がShh伝達経路作用物質としての活性を有することは、例えばMolecular BioSystems, 2010, 6.1: 44-54.に記載されており、当業者にとって公知である。
Shhシグナル伝達経路作用物質は、好ましくはSAG、Purmorphamine、GSA-10からなる群より含まれる少なくとも1つを含み、より好ましくはSAGを含む。培地中のShhシグナル伝達経路作用物質の濃度は、上述の効果を達成可能な範囲で適宜設定することが可能である。SAGは、工程(a)においては通常約1nM~約2000nM、好ましくは約10nM~約1000nM、より好ましくは約10nM~約700nM、さらに好ましくは約50nM~約700nM、特に好ましくは約100nM~約600nM、最も好ましくは約100nM~約500nMの濃度で使用される。また、SAG以外のShhシグナル伝達経路作用物質を使用する場合、上記濃度のSAGと同等のShhシグナル伝達促進活性を示す濃度で用いられることが望ましい。Shh伝達促進活性は、当業者に周知の方法、例えばGli1遺伝子の発現に着目したレポータージーンアッセイにて決定することができる(Oncogene(2007)26,5163-5168)。
工程(a)において用いられる培地は、未分化維持培養を可能にするため、未分化維持因子を含む。未分化維持因子は、多能性幹細胞の分化を抑制する作用を有する物質であれば特に限定されない。当業者に汎用されている未分化維持因子としては、プライムド多能性幹細胞(primed pluripotent stem cells)(例えばヒトES細胞、ヒトiPS細胞)の場合、FGFシグナル伝達経路作用物質、TGFβファミリーシグナル伝達経路作用物質、insulin等を挙げることができる。FGFシグナル伝達経路作用物質として具体的には、線維芽細胞増殖因子(例えばbFGF、FGF4やFGF8)が挙げられる。また、TGFβファミリーシグナル伝達経路作用物質としては、TGFβシグナル伝達経路作用物質、Nodal/Activinシグナル伝達経路作用物質が挙げられる。TGFβシグナル伝達経路作用物質としては、例えばTGFβ1、TGFβ2が挙げられる。Nodal/Activinシグナル伝達経路作用物質としては、例えばNodal、ActivinA、ActivinBが挙げられる。これらの物質は単独で又は複数種を組み合わせて用いてもよい。ヒト多能性幹細胞(例えばヒトES細胞、ヒトiPS細胞)を培養する場合、工程(a)における培地は、好ましくは未分化維持因子として、bFGFを含む。
未分化維持因子は、通常哺乳動物の未分化維持因子である。哺乳動物としては、上記のものを挙げることができる。未分化維持因子は、哺乳動物の種間で交差反応性を有し得るので、培養対象の多能性幹細胞の未分化状態を維持可能な限り、いずれの哺乳動物の未分化維持因子を用いてもよい。未分化維持因子は、好ましくは培養する細胞と同一種の哺乳動物の未分化維持因子である。例えばヒト多能性幹細胞の培養には、ヒト未分化維持因子(例えばbFGF、FGF4、FGF8、EGF、Nodal、ActivinA、ActivinB、TGFβ1、TGFβ2等)が用いられる。未分化維持因子は、好ましくは単離されている。
未分化維持因子は、培養対象である多能性幹細胞の未分化維持能を有する限り、いずれの宿主によって生産されたもの又は人工合成されたものを用いることができる。本発明に用いる未分化維持因子は、生体内で生じるものと同様の修飾を受けたものが好ましく、培養対象である多能性幹細胞と同種の細胞において異種成分を含まない条件下で産生されたものがさらに好ましい。
本発明に係る製造方法の一態様は、単離された未分化維持因子を提供する工程を含む。本発明に係る製造方法の一態様は、工程(a)に用いる培地中へ、単離された未分化維持因子を外来的(又は外因的)に添加する工程を含む。工程(a)に用いる培地に予め未分化維持因子が添加されていてもよい。
工程(a)において用いられる培地中の未分化維持因子濃度は、培養する多能性幹細胞の未分化状態を維持可能な濃度であり、当業者であれば適宜設定することができる。例えばフィーダー細胞非存在下で未分化維持因子としてbFGFを用いる場合、その濃度は、通常約4ng/mL~約500ng/mL、好ましくは約10ng/mL~約200ng/mL、より好ましくは約30ng/mL~約150ng/mLである。
工程(a)は、フィーダー細胞非存在下で実施する。工程(a)における多能性幹細胞の培養は、浮遊培養及び接着培養のいずれの条件で行われてもよいが、好ましくは接着培養により行われる。フィーダー細胞非存在下での多能性幹細胞の培養においては、フィーダー細胞に代わる足場を多能性幹細胞に提供するため、適切なマトリクスを足場として用いてもよい。足場であるマトリクスにより、表面をコーティングした培養器材中で、多能性幹細胞を接着培養する。
足場として用いることのできるマトリクスとしては、ラミニン(Nat Biotechnol.28,611-615(2010))、ラミニン断片(Nat Commun 3,1236(2012))、基底膜標品(Nat Biotechnol 19,971-974(2001))、ゼラチン、コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、エンタクチン、ビトロネクチン(Vitronectin)等が挙げられる。マトリクスは、好ましくはラミニン511が用いられる(Nat Biotechnol 28,611-615(2010))。
ラミニン断片は、多能性幹細胞への接着性を有しており、フィーダーフリー条件での多能性幹細胞の維持培養を可能とするものであれば特に限定されないが、好ましくはE8フラグメントである。ラミニンE8フラグメントは、ラミニン511をエラスターゼで消化して得られたフラグメントの中で、強い細胞接着活性をもつフラグメントとして同定されたものである(EMBO J.,3:1463-1468,1984、J. Cell Biol.,105:589-598,1987)。ラミニン断片としては、好ましくはラミニン511のE8フラグメントが用いられる(Nat Commun 3,1236(2012)、Scientific Reports 4,3549(2014))。ラミニンE8フラグメントは、ラミニンのエラスターゼ消化産物であることを要するものではなく、組換え体であってもよい。遺伝子組換え動物(カイコ等)に産生させたものであってもよい。未同定成分の混入を回避する観点から、好ましくは組換え体のラミニン断片が用いられる。ラミニン511のE8フラグメントは市販されており、例えばニッピ株式会社等から購入可能である。
未同定成分の混入を回避する観点から、本発明において用いられるラミニン又はラミニン断片は、単離されていることが好ましい。工程(a)におけるフィーダー細胞非存在下での多能性幹細胞の培養においては、好ましくは単離されたラミニン511又はラミニン511のE8フラグメントによって、より好ましくはラミニン511のE8フラグメントによって表面をコーティングした培養器材中で、多能性幹細胞を接着培養する。
工程(a)において用いられる培地は、フィーダーフリー条件下で、多能性幹細胞の未分化維持培養を可能にする培地(フィーダーフリー培地)であれば、特に限定されない。フィーダーフリー培地として、多くの合成培地が開発・市販されており、例えばEssential 8培地が挙げられる。Essential 8培地は、DMEM/F12培地に、添加剤として、L-ascorbic acid-2-phosphate magnesium(64mg/l)、sodium selenium(14μg/1)、insulin(19.4mg/l)、NaHCO3(543mg/l)、transferrin(10.7mg/l)、bFGF(100ng/mL)、及びTGFβファミリーシグナル伝達経路作用物質(TGFβ1(2ng/mL)又はNodal(100ng/mL))を含む(Nature Methods,8,424-429(2011))。市販のフィーダーフリー培地としては、例えばEssential 8(Thermo Fisher Scientific社製)、S-medium(DSファーマバイオメディカル株式会社製)、StemFlex Medium、StemPro(Thermo Fisher Scientific社製)、hESF9、mTeSR1(STEMCELL Technologies社製)、mTeSR2(STEMCELL Technologies社製)、TeSR-E8(STEMCELL Technologies社製)、mTeSR Plus(STEMCELL Technologies社製)、StemFit(味の素株式会社製)、ReproMed iPSC Medium(リプロセル社製)、NutriStem XF(Biological Industries社製)、NutriStem V9(Biological Industries社製)、Cellartis DEF-CS Xeno-Free Culture Medium(タカラバイオ社製)、Stem-Partner SF(極東製薬社製)、PluriSTEM Human ES/iPS Cell Medium(メルク社製)、StemSure hPSC MediumΔ(富士フイルム和光純薬社製)、ciKIC iPS medium(関東化学株式会社製)、StemMACS iPS-Brew XF, human(ミルテニーバイオテック社製)、ExCellerate iPSC Expansion Medium, Animal Component-Free(R&D Systems社製)、STEMium Human Pluripotent Stem Cell Growth Medium(Clini Sciences社製)、CELRENA Medium (細胞科学研究所社製)、hPSC Growth Medium DXF(プロモセル社製)、PSGro hESC / iPSC Medium(システムバイオサイエンス社製)等が挙げられる。工程(a)ではこれらを用いることにより、簡便に本発明を実施することができる。StemFit培地は未分化維持成分としてbFGFを含有する(Scientific Reports(2014)4,3594)。
工程(a)における多能性幹細胞はプライム状態(Primed state)及びナイーブ様状態(Naive-like state)のいずれであってもよいが、好ましくはプライム状態である。ナイーブ様状態の多能性幹細胞は、プライム状態の多能性幹細胞を例えばCell, 2014, 158.6: 1254-1269.に記載の方法、あるいは市販のReproNaive(リプロセル社製)、NaiveCult Induction Kit(STEMCELL Technologies社製)、RSeT Medium(STEMCELL Technologies社製)AlphaSTEM Culture System(ミネルバ バイオテクノロジー社製)等の培地で処理、培養することにより得ることができる。
工程(a)において用いられる培地は、血清培地であっても無血清培地であってもよい。化学的に未決定な成分の混入を回避する観点から、工程(a)において用いられる培地は、好ましくは無血清培地である。培地は、血清代替物を含んでいてもよい。
工程(a)における多能性幹細胞の培養時間は、続く工程(1)において形成され得る細胞凝集体の質を向上させる効果が達成可能な範囲で特に限定されないが、通常0.5~144時間、好ましくは2~96時間、より好ましくは6~48時間、さらに好ましくは12~48時間、特に好ましくは18~28時間であり、例えば24時間である。すなわち、工程(1)開始の0.5~144時間前、好ましくは18~28時間前に工程(a)を開始し、工程(a)を完了した後引き続き工程(1)が行われる。
工程(a)の好ましい一態様において、ヒト多能性幹細胞を、フィーダー細胞非存在下で、bFGFを含有する無血清培地中で、接着培養する。当該接着培養は、好ましくはラミニン511、ラミニン511のE8フラグメント又はビトロネクチンで表面をコーティングした培養器材中で実施される。当該接着培養は、好ましくはフィーダーフリー培地としてStemFitを用いて実施される。
工程(a)の好ましい一態様において、ヒト多能性幹細胞を、フィーダー細胞非存在下で、bFGFを含有する無血清培地中で、浮遊培養する。当該浮遊培養では、ヒト多能性幹細胞は、ヒト多能性幹細胞の凝集体を形成してもよい。
工程(a)及び後述する工程において、培養温度、CO2濃度等の培養条件は適宜設定できる。培養温度は、例えば約30℃から約40℃であってもよく、好ましくは約37℃である。CO2濃度は、例えば約1%から約10%であってもよく、好ましくは約5%である。
<工程(1)>
工程(1)では、Wntシグナル伝達経路阻害物質の存在下で多能性幹細胞を培養する。
工程(1)では、Wntシグナル伝達経路阻害物質の存在下で多能性幹細胞を培養する。
Wntシグナル伝達経路とは、Wntファミリー・タンパク質をリガンドとし、主としてFrizzledを受容体とするシグナル伝達経路である。当該シグナル経路としては、古典的Wnt経路(canonical Wnt pathway)、非古典的Wnt経路(non-canonical Wnt pathway)等が挙げられる。古典的Wnt経路は、β-cateninによって伝達される。非古典的Wnt経路としては、planar cell polarity(PCP)経路、Wnt/JNK経路、Wnt/Calcium経路、Wnt-RAP1経路、Wnt-Ror2経路、Wnt-PKA経路、Wnt-GSK3MT経路、Wnt-aPKC経路、Wnt-RYK経路、Wnt-mTOR経路等が挙げられる。非古典的Wnt経路では、Wnt以外の他のシグナル伝達経路でも活性化される共通のシグナル伝達因子が存在するが、本発明ではそれらの因子もCHIRシグナル伝達経路の構成因子とし、それらの因子に対する阻害物質もWntシグナル伝達経路阻害物質に含まれる。
Wntシグナル伝達経路阻害物質は、Wntファミリー・タンパク質により惹起されるシグナル伝達を抑制し得るものである限り限定されない。当該阻害物質は、核酸、タンパク質、低分子有機化合物のいずれであってもよい。当該阻害物質として例えばWntのプロセシングと細胞外への分泌を阻害する物質、Wntに直接作用する物質(例えばタンパク質、抗体、アプタマー等)、Wntをコードする遺伝子の発現を抑制する物質(例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、siRNA等)、Wnt受容体とWntの結合を阻害する物質、Wnt受容体によるシグナル伝達に起因する生理活性を阻害する物質を挙げることができる。
Wntシグナル伝達経路阻害物質として知られているタンパク質として、secreted Frizzled Related Protein(sFRP)クラスに属するタンパク質(sFRP1~5、Wnt Inhibitory Factor-1(WIF-1)、Cerberus)、Dickkopf(Dkk)クラスに属するタンパク質(Dkk1~4、Kremen)、APCDD1、APCDD1L、Draxinファミリーに属するタンパク質、IGFBP-4、Notum、SOST/Sclerostinファミリーに属するタンパク質等が挙げられる。
Wntシグナル伝達経路阻害物質としては、当業者に周知の化合物を使用することができる。古典的Wntシグナル伝達経路の阻害物質として例えばFrizzled阻害剤、Dishevelled(Dvl)阻害剤、Tankyrase(TANK)阻害剤、カゼインキナーゼ1阻害剤、カテニン応答性転写阻害剤、p300阻害剤、CREB-binding protein(CBP)阻害剤、BCL-9阻害剤(Am J Cancer Res.2015;5(8):2344-2360)等が挙げられる。非古典的Wnt経路の阻害物質として、例えばPorcupine(PORCN)阻害剤、Calcium/calmodulin-dependent protein kinase II(CaMKII)阻害剤、(TGF-β-activated kinase 1(TAK1)阻害剤、Nemo-Like Kinase(NLK)阻害剤、LIM Kinase阻害剤、mammalian target of rapamycin(mTOR)阻害剤、Rac阻害剤、c-Jun NH 2-terminal kinase(JNK)阻害剤、protein kinase C(PKC)阻害剤、Methionine Aminopeptidase 2(MetAP2)阻害剤、Calcineurin阻害剤、nuclear factor of activated T cells(NFAT)阻害剤、ROCK阻害剤等が挙げられる。また、作用機序は報告されていないが、Wntシグナル伝達経路阻害物質としてKY02111(N-(6-Chloro-2-benzothiazolyl)-3,4-dimethoxybenzenepropanamide)、KY03-I(2-(4-(3,4-dimethoxyphenyl)butanamide)-6-Iodobenzothiazole)が挙げられる。これらの物質は単独で又は複数種を組み合わせて用いてもよい。
PORCN阻害剤として例えばIWP-2(N-(6-Methyl-2-benzothiazolyl)-2-[(3,4,6,7-tetrahydro-4-oxo-3-phenylthieno[3,2-d]pyrimidin-2-yl)thio]-acetamide)、IWP-3(2-[[3-(4-fluorophenyl)-3,4,6,7-tetrahydro-4-oxothieno[3,2-d]pyrimidin-2-yl]thio]-N-(6-methyl-2-benzothiazolyl)-acetamide)、IWP-4(N-(6-methyl-2-benzothiazolyl)-2-[[3,4,6,7-tetrahydro-3-(2-methoxyphenyl)-4-oxothieno[3,2-d]pyrimidin-2-yl]thio]-acetamide)、IWP-L6(N-(5-phenyl-2-pyridinyl)-2-[(3,4,6,7-tetrahydro-4-oxo-3-phenylthieno[3,2-d]pyrimidin-2-yl)thio]-acetamide)、IWP-12(N-(6-Methyl-2-benzothiazolyl)-2-[(3,4,6,7-tetrahydro-3,6-dimethyl-4-oxothieno[3,2-d]pyrimidin-2-yl)thio]acetamide)、LGK-974(2-(2’,3-Dimethyl-2,4’-bipyridin-5-yl)-N-(5-(pyrazin-2-yl)pyridin-2-yl)acetamide)、Wnt-C59(2-[4-(2-Methylpyridin-4-yl)phenyl]-N-[4-(pyridin-3-yl)phenyl]acetamide)、ETC-159(1,2,3,6-Tetrahydro-1,3-dimethyl-2,6-dioxo-N-(6-phenyl-3-pyridazinyl)-7H-purine-7-acetamide)、GNF-6231(N-[5-(4-Acetyl-1-piperazinyl)-2-pyridinyl]-2’-fluoro-3-methyl[2,4’-bipyridine]-5-acetamide)及びこれらの誘導体等が挙げられる。これらの物質は単独で又は複数種を組み合わせて用いてもよい。上記の化合物等がPORCN阻害剤としての活性を有することは、例えばBioorganic & medicinal chemistry letters, 2015, 25.23: 5472-5476.に記載されており、当業者にとって公知である。
JNK阻害剤としては、例えばJNK-IN-8((E)-3-(4-(dimethylamino)but-2-enamido)-N-(3-methyl-4-((4-(pyridin-3-yl)pyrimidin-2-yl)amino)phenyl)benzamide)、SP600125(Anthra[1-9-cd]pyrazol-6(2H)-one)、DB07268(2-[[2-[(3-Hydroxyphenyl)amino]-4-pyrimidinyl]amino]benzamide)、Tanzisertib(trans-4-[[9-[(3S)-Tetrahydro-3-furanyl]-8-[(2,4,6-trifluorophenyl)amino]-9H-purin-2-yl]amino]cyclohexanol)、Bentamapimod(1,3-Benzothiazol-2-yl)[2-[[4-[(morpholin-4-yl)methyl]benzyl]oxy]pyrimidin-4-yl]acetonitrile、TCS JNK 6o(N-(4-Amino-5-cyano-6-ethoxy-2-pyridinyl)-2,5-dimethoxybenzeneacetamide)、SU3327(5-[(5-Nitro-2-thiazolyl)thio]-1,3,4thiadiazol-2-amine)、CEP1347((9S,10R,12R)-5-16-Bis[(ethylthio)methyl]-2,3,9,10,11,12-hexahydro-10-hydroxy-9-methyl-1-oxo-9,12-epoxy-1H-diindolo[1,2,3-fg:3’,2’,1’-kl]pyrrolo[3,4-i][1,6]benzodiazocine-10-carboxylic acid methyl ester)、c-JUN peptide、AEG3482(6-Phenylimidazo[2,1-b]-1,3,4-thiadiazole-2-sulfonamide)、TCS JNK 5a(N-(3-Cyano-4,5,6,7-tetrahydrobenzo[b]thienyl-2-yl)-1-naphthalenecarboxamide)、BI-78D3(4-(2,3-Dihydro-1,4-benzodioxin-6-yl)-2,4-dihydro-5-[(5-nitro-2-thiazolyl)thio]-3H-1,2,4-triazol-3-one)、IQ-3(11H-Indeno[1,2-b]quinoxalin-11-one O-(2-furanylcarbonyl)oxime)、SR 3576(3-[4-[[[(3-Methylphenyl)amino]carbonyl]amino]-1H-pyrazol-1-yl]-N-(3,4,5-trimethoxyphenyl)benzamide)、IQ-1S(11H-Indeno[1,2-b]quinoxalin-11-one oxime sodium salt)、JIP-1(153-163)、CC-401(3-[3-[2-(1-Piperidinyl)ethoxy]phenyl]-5-(1H-1,2,4-triazol-5-yl)-1H-indazole dihydrochloride)及びこれらの誘導体等が挙げられる。これらの物質は単独で又は複数種を組み合わせて用いてもよい。上記の化合物等がJNK阻害剤としての活性を有することは、例えばJ Enzyme Inhib Med Chem. 2020; 35(1): 574-583.に記載されており、当業者にとって公知である。
Rac阻害剤としては、例えばEHT1864(5-(5-(7-(Trifluoromethyl)quinolin-4-ylthio)pentyloxy)-2-(morpholinomethyl)-4H-pyran-4-one dihydrochloride)、NSC23766(N6-[2-[[4-(Diethylamino)-1-methylbutyl]amino]-6-methyl-4-pyrimidinyl]-2-methyl-4,6-quinolinediamine trihydrochloride)、EHop-016(N4-(9-Ethyl-9H-carbazol-3-yl)-N2-[3-(4-morpholinyl)propyl]-2,4-pyrimidinediamine)、1A-116(N-(3,5-Dimethylphenyl)-N’-[2-(trifluoromethyl)phenyl]guanidine)、ZCL278(2-(4-broMo-2-chlorophenoxy)-N-(4-(N-(4,6-diMethylpyriMidin-2-yl)sulfaMoyl)phenylcarbaMothioyl)acetaMide)、MBQ-167(9-ethyl-3-(5-phenyl-1H-1,2,3-triazol-1-yl)-9H-carbazole)、KRpep-2d(actinium;[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(3R,8R,11S,14S,20S,23S,26S,29S,32S,35S,38S)-8-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-amino-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]carbamoyl]-29-[(2R)-butan-2-yl]-20-(carboxymethyl)-26-(hydroxymethyl)-23,32-bis[(4-hydroxyphenyl)methyl]-35-(2-methylpropyl)-2,10,13,19,22,25,28,31,34,37-decaoxo-11-propan-2-yl-5,6-dithia-1,9,12,18,21,24,27,30,33,36-decazatricyclo[36.3.0.014,18]hentetracontan-3-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]azanide)、ARS-853(1-[3-[4-[2-[[4-Chloro-2-hydroxy-5-(1-methylcyclopropyl)phenyl]amino]acetyl]-1-piperazinyl]-1-azetidinyl]-2-propen-1-one)、Salirasib(2-(((2E,6E)-3,7,11-Trimethyldodeca-2,6,10-trien-1-yl)thio)benzoicacid)、ML141(4-(5-(4-methoxyphenyl)-3-phenyl-4,5-dihydropyrazol-1-yl)benzenesulfonamide)及びこれらの誘導体等が挙げられる。これらの物質は単独で又は複数種を組み合わせて用いてもよい。上記の化合物等がRac阻害剤としての活性を有することは、例えばCancer research, 2018, 78.12: 3101-3111.に記載されており、当業者にとって公知である。
Wntシグナル伝達経路阻害物質は、好ましくはPORCN阻害剤、KY02111及びKY03-Iからなる群より選ばれる少なくとも1つを含み、より好ましくはPORCN阻害剤を含む。Wntシグナル伝達経路阻害物質は、Wntの非古典的Wnt経路への阻害活性を有する物質を含むこともまた好ましい。Wntシグナル伝達経路阻害物質は、より好ましくはWnt/Planar Cell Polarity(PCP)経路への阻害活性を有する物質を含み、さらに好ましくはWnt/JNK経路への阻害活性を有する物質を含む。本発明で用いられるPORCN阻害剤は、好ましくはIWP-2、IWP-3、IWP-4、IWP-L6、IWP-12、LGK-974、Wnt-C59、ETC-159及びGNF-6231からなる群より選ばれる少なくとも1つを含み、より好ましくはIWP-2又はWnt-C59を含み、さらに好ましくはIWP-2を含む。
Wntシグナル伝達経路阻害物質としてPORCN阻害剤と他のWnt/PCP経路への阻害活性を有する物質を組み合わせて用いることもまた好ましい。PORCN阻害剤と組み合わせて用いられるWnt/PCP経路阻害物質は、好ましくはJNK阻害剤又はRac阻害剤である。本発明で用いられるJNK阻害剤は、好ましくはJNK-IN-8である。本発明で用いられるRac阻害剤は、好ましくはEHT1864である。
培地中のWntシグナル伝達経路阻害物質の濃度は、上述の効果を達成可能な範囲で適宜設定することが可能である。鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞を含む細胞の製造効率の観点からは、例えばWntシグナル伝達経路阻害物質としてPORCN阻害剤の1種であるIWP-2を用いる場合は、その濃度は通常約10nM~約50μMであり、好ましくは約10nM~約30μMであり、さらに好ましくは約100nM~約10μMであり、最も好ましくは約0.5μMである。PORCN阻害剤の1種であるWnt-C59を用いる場合は、その濃度は通常約10nM~約30μMであり、好ましくは約20nM~約10μMであり、より好ましくは約500nMである。KY02111を用いる場合は、その濃度は通常約10nM~約50μMであり、好ましくは10nM~約30μMであり、より好ましくは約100nM~約10μMであり、さらに好ましくは約5μMである。
Wntシグナル伝達経路阻害物質としてPORCN阻害剤とJNK阻害剤を組み合わせて用いる場合、例えばJNK阻害剤の1種であるJNK-IN-8を用いる場合は、その濃度は通常約10nM~約50μMであり、好ましくは約10nM~約30μMであり、さらに好ましくは約100nM~約10μMであり、最も好ましくは約1μMである。Wntシグナル伝達経路阻害物質としてPORCN阻害剤とRac阻害剤とを組み合わせて用いる場合、例えばRac阻害剤の1種であるEHT1864を用いる場合は、その濃度は通常約10nM~約50μMであり、好ましくは約10nM~約30μMであり、さらに好ましくは約100nM~約10μMであり、最も好ましくは約1μMである。
Wntシグナル伝達経路阻害物質の添加時期は、通常工程(1)の多能性幹細胞の培養開始より48時間以内、好ましくは24時間以内、より好ましくは12時間以内、さらに好ましくは培養開始と同時である。
工程(1)の培地中には、TGFβシグナル伝達経路阻害物質がさらに存在することが好ましい。工程(1)において用いられるTGFβシグナル伝達経路阻害物質としては工程(a)で例示したものと同じものが用いられ得る。工程(a)及び工程(1)のTGFβシグナル伝達経路阻害物質は同一であっても異なっていてもよいが、好ましくは同一である。
培地中のTGFβシグナル伝達経路阻害物質の濃度は、上述の効果を達成可能な範囲で適宜設定することが可能である。TGFβ伝達経路阻害物質としてSB431542を用いる場合は、通常約1nM~約100μM、好ましくは約10nM~約100μM、より好ましくは約100nM~約50μM、さらに好ましくは約500nM~約10μMの濃度で使用される。また、SB431542以外のTGFβシグナル伝達経路阻害物質を使用する場合、上記濃度のSB431542と同等のTGFβシグナル伝達経路阻害活性を示す濃度で用いられることが望ましい。
工程(1)及び以降の工程において、中内胚葉への分化を抑制し、鼻腔上皮様組織の製造効率を向上させる観点から、Transforming growth factor-β-activated kinase 1(TAK1)に対する阻害物質を添加することもまた好ましい。TAK1は、TGFβ、骨形成タンパク質(BMP)、インターロイキン1(IL-1)、TNF-α等により活性化されるシグナル伝達を媒介する、MAPキナーゼキナーゼキナーゼ(MAPKKK)ファミリーのセリンスレオニンタンパク質キナーゼである。
TAK1阻害物質は、TAK1が媒介するシグナル伝達を抑制し得るものである限り限定されない。TAK1阻害物質は、核酸、タンパク質、低分子有機化合物のいずれであってもよい。当該物質として例えばTAK1と基質の結合を阻害する物質、TAK1のリン酸化を阻害する物質、TAK1の脱リン酸化を促進する物質、TAK1の転写や翻訳を阻害する物質、TAK1の分解を促進する物質等が挙げられる。
TAK1阻害物質として、例えば(5Z)-7-Oxozeaenol((3S,5Z,8S,9S,11E)-3,4,9,10-tetrahydro-8,9,16-trihydroxy-14-methoxy-3-methyl-1H-2-benzoxacyclotetradecin-1,7(8H)-dione)、N-Des(aminocarbonyl)AZ-TAK1 inhibitor(3-Amino-5-[4-(4-morpholinylmethyl)phenyl]-2-thiophenecarboxamide)、Takinib(N1-(1-Propyl-1H-benzimidazol-2-yl)-1,3-benzenedicarboxamide)、NG25(N-[4-[(4-Ethyl-1-piperazinyl)methyl]-3-(trifluoromethyl)phenyl]-4-methyl-3-(1H-pyrrolo[2,3-b]pyridin-4-yloxy)-benzamide trihydrochloride)及びこれらの誘導体、類縁体が挙げられる。これらの物質は単独で又は複数種を組み合わせて用いてもよい。
TAK1阻害物質は、好ましくは(5Z)-7-Oxozeaenolである。工程(1)におけるTAK1阻害物質として(5Z)-7-Oxozeaenolを用いる場合は、通常約1nM~約100μM、好ましくは約10nM~約50μM、より好ましくは約100nM~約25μM、さらに好ましくは約500nM~約10μMの濃度で使用される。また、(5Z)-7-Oxozeaenol以外のTAK1阻害物質を使用する場合、上記濃度の(5Z)-7-Oxozeaenolと同等のTAK1阻害活性を示す濃度で用いられることが好ましい。
鼻腔上皮様組織に含有される細胞の割合を制御する観点から、上記TAK1阻害物質は、工程(1)及び以降の工程の任意の段階で添加することができる。一態様として、得られた細胞集団における嗅上皮を構成する細胞の割合を増加させることを企図するのであれば、工程(1)の開始と同時にTAK1阻害物質を添加することが好ましい。得られた細胞集団における鼻腔上皮を構成する細胞の割合を増加させることを企図するのであれば、工程(3)の開始と同時、あるいは工程(3)の開始から一定期間以内、例えば工程(3)の開始から14日間以内にTAK1阻害物質を添加することが好ましい。
工程(1)において用いられる培地は、上記定義の項で記載したようなものである限り特に限定されない。工程(1)において用いられる培地は血清培地又は無血清培地であり得る。化学的に未決定な成分の混入を回避する観点から、本発明においては、無血清培地が好適に用いられる。調製の煩雑さを回避するには、例えば市販のKSR等の血清代替物を適量添加した無血清培地を使用することが好ましい。無血清培地へのKSRの添加量としては、例えばヒトES細胞の場合は、通常約1%から約30%であり、好ましくは約2%から約20%である。無血清培地としては、例えばIMDMとF-12の1:1の混合液に5%KSR、450μM 1-モノチオグリセロール及び1xChemically Defined Lipid Concentrateが添加された培地、又はGMEMに5%~20%KSR、NEAA、ピルビン酸及び2-メルカプトエタノールが添加された培地が挙げられる。
工程(1)の開始時において、細胞は接着状態又は浮遊状態のいずれでもよい。好ましい一態様として、多能性幹細胞を単一細胞に分散させた後に再凝集させ、浮遊状態の細胞凝集体を形成させる。このために、工程(1)の開始前に、工程(a)で得られた多能性幹細胞を単一細胞に分散する操作(工程(b)ともいう。)を行うことが好ましい。分散させる操作により得られた「分散された細胞」は、好ましくは単一細胞であるが、例えば2以上100以下の少数の細胞からなる細胞の塊を含んでもよく、2以上50以下の細胞からなる細胞の塊を含んでもよい。「分散された細胞」は、例えば単一細胞を7割以上及び細胞の塊を3割以下含んでいてもよく、好ましくは単一細胞を8割以上及び細胞の塊を2割以下含む。別の一態様として、多能性幹細胞を単一細胞に分散させた後に細胞接着性の培養器材へと播種し、接着状態に培養を実施する。
多能性幹細胞を分散させる方法としては、機械的分散処理、細胞分散液処理、細胞保護剤添加処理が挙げられ、これらの処理を組み合わせて行ってもよい。細胞を分散させる方法としては、好ましくは細胞保護剤添加処理と同時に細胞分散液処理を行い、次いで機械的分散処理をするとよい。
細胞保護剤添加処理に用いられる細胞保護剤としては、FGFシグナル伝達経路作用物質、ヘパリン、Rho-associated protein kinase(ROCK)阻害物質、ミオシン阻害物質、ポリアミン類、統合的ストレス応答(Integrated stress response:ISR)阻害剤、カスパーゼ阻害剤、血清、又は血清代替物等を挙げることができる。好ましい細胞保護剤としては、ROCK阻害物質が挙げられる。分散により誘導される多能性幹細胞(特に、ヒトの多能性幹細胞)の細胞死を抑制するために、ROCK阻害物質を工程(1)の培養開始時から添加してもよい。ROCK阻害物質としては、Y-27632((R)-(+)-trans-4-(1-Aminoethyl)-N-(4-pyridyl)cyclohexanecarboxamide,dihydrochloride)、Fasudil(HA1077)(1-(5-Isoquinolinylsulfonyl)homopiperazine,hydrochloride)、H-1152(5-[[(2S)-hexahydro-2-methyl-1H-1,4-diazepin-1-yl]sulfonyl]-4-methyl-isoquinoline,dihydrochloride)、HA-1100(Hydroxyfasudil)([1-(1-Hydroxy-5-isoquinolinesulfonyl)homopiperazine,hydrochloride)、Chroman 1((3S)-N-[2-[2-(dimethylamino)ethoxy]-4-(1H-pyrazol-4-yl)phenyl]-6-methoxy-3,4-dihydro-2H-chromene-3-carboxamide)、Belumosudil(KD025、2-[3-[4-[(1H-Indazol-5-yl)amino]quinazolin-2-yl]phenoxy]-N-isopropylacetamide)、HSD1590([2-Methoxy-3-(4,5,10-triazatetracyclo[7.7.0.02,6.012,16]hexadeca-1(9),2(6),3,7,10,12(16)-hexaen-11-yl)phenyl]boronic acid)、CRT0066854((S)-3-phenyl-N1-(2-pyridin-4-yl-5,6,7,8-tetrahydrobenzo[4,5]thieno[2,3-d]pyrimidin-4-yl)propane-1,2-diamine)、RKI1447(1-(3-hydroxybenzyl)-3-(4-(pyridin-4-yl)thiazol-2-yl)urea)、Ripasudil(4-Fluoro-5-[[(2S)-hexahydro-2-methyl-1H-1,4-diazepin-1-yl]sulfonyl]isoquinoline)、GSK269962A(N-[3-[2-(4-amino-1,2,5-oxadiazol-3-yl)-1-ethylimidazo[4,5-c]pyridin-6-yl]oxyphenyl]-4-(2-morpholin-4-ylethoxy)benzamide)、GSK429286A(N-(6-fluoro-1H-indazol-5-yl)-2-methyl-6-oxo-4-(4-(trifluoromethyl)phenyl)-1,4,5,6-tetrahydropyridine-3-carboxamide)、Y-33075((R)-4-(1-Aminoethyl)-N-1H-pyrrolo[2,3-b]pyridin-4-ylbenzamide)、LX7101(N,N-Dimethylcarbamic acid 3-[[[4-(aminomethyl)-1-(5-methyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-yl)-4-piperidinyl]carbonyl]amino]phenyl ester)、AT13148((alphaS)-alpha-(Aminomethyl)-alpha-(4-chlorophenyl)-4-(1H-pyrazol-4-yl)benzenemethanol)、SAR407899(6-(piperidin-4-yloxy)isoquinolin-1(2H)-one hydrochloride)、GSK180736A(4-(4-fluorophenyl)-N-(1H-indazol-5-yl)-6-methyl-2-oxo-1,2,3,4-tetrahydropyrimidine-5-carboxamide)、Hydroxyfasudil(1-(1-hydroxy-5-isoquinolinesulfonyl)homopiperazine,HCl)、bdp5290(4-Chloro-1-(4-piperidinyl)-N-[3-(2-pyridinyl)-1H-pyrazol-4-yl]-1H-pyrazole-3-carboxamide)、sr-3677(N-[2-[2-(Dimethylamino)ethoxy]-4-(1H-pyrazol-4-yl)phenyl-2,3-dihydro-1,4-benzodioxin-2-carboxamidehydrochloride)、CCG-222740(N-(4-Chlorophenyl)-5,5-difluoro-1-(3-(furan-2-yl)benzoyl)piperidine-3-carboxamide)、ROCK inhibitor-2(N-[(1R)-1-(3-methoxyphenyl)ethyl]-4-pyridin-4-ylbenzamide)、Rho-Kinase-IN-1(N-[1-[(4-methylsulfanylphenyl)methyl]piperidin-3-yl]-1H-indazol-5-amine)、ZINC00881524(N-(4,5-dihydronaphtho[1,2-d]thiazol-2-yl)-2-(3,4-dimethoxyphenyl)acetamide)、SB772077B((3S)-1-[[2-(4-Amino-1,2,5-oxadiazol-3-yl)-1-ethyl-1H-imidazo[4,5-c]pyridin-7-yl]carbonyl]-3-pyrrolidinamine dihydrochloride)、Verosudil(N-(1,2-Dihydro-1-oxo-6-isoquinolinyl)-alpha-(dimethylamino)-3-thiopheneacetamide)、GSK-25(4-(4-chloro-2-fluorophenyl)-2-(2-chloropyridin-4-yl)-1-(6-fluoro-1H-indazol-5-yl)-6-methyl-4H-pyrimidine-5-carboxamide)及びこれらの誘導体等を挙げることができる。上記化合物等がROCK阻害剤としての活性を有することは、例えばJ Med Chem. 2016 Mar 24;59(6):2269-300.及びJournal of Experimental Pharmacology 2021:13 197-212等に記載されており、当業者にとって公知である。細胞保護剤としては、調製済みの細胞保護剤を用いることもできる。調製済みの細胞保護剤としては、例えばRevitaCell Supplement(Thermo Fisher Scientific社製)、CloneR、CloneR2(Stemcell Technologies社製)が挙げられる。これらの物質は単独で又は複数種を組み合わせて用いてもよい。工程(1)において、細胞保護剤としてROCK阻害物質であるY-27632を添加する場合は、通常1nMから100mM、好ましくは10nMから10mM、より好ましくは1μMから100μMの濃度となるように培養環境中に添加する。工程(1)において、細胞保護剤としてROCK阻害物質であるChroman 1を添加する場合は、通常10pMから1mM、好ましくは100pMから100μM、より好ましくは1nMから10μMの濃度となるように培養環境中に添加する。調製済みの細胞保護剤を用いる場合は、製品に添付される使用説明書に記載の濃度を中心に、例えばその100分の1から100倍の濃度、好ましくはその10分の1から10倍の濃度、より好ましくはその3分の1から3倍の濃度で使用することができる。
細胞分散液処理に用いられる細胞分散液としては、トリプシン、コラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼ、エラスターゼ、プロナーゼ、DNase、パパイン等の酵素及びエチレンジアミン四酢酸等のキレート剤の少なくとも1つを含む溶液を挙げることができる。市販の細胞分散液、例えばTripLE Select(Thermo Fisher Scientific社製)やTripLE Express(Thermo Fisher Scientific社製)、Accumax(Innovative Cell Technologies社製)を用いることもできる。工程(b)における好ましい細胞分散液は、5mMのEDTAを添加したリン酸緩衝液であるが、これに限定されない。
機械的分散処理の方法としては、ピペッティング処理又はスクレーパーでの掻き取り操作が挙げられる。分散された細胞は上記培地中に懸濁される。
多能性幹細胞を分散させる方法としては、例えば多能性幹細胞のコロニーをROCK阻害物質の存在下で、エチレンジアミン四酢酸又はAccumaxで処理し、さらにピペッティングにより分散させる方法が挙げられる。
工程(1)において浮遊培養を実施する場合は、分散された多能性幹細胞の懸濁液を非細胞接着性の培養器材中に播種する。培養器材が非接着性である場合、細胞は浮遊培養され、複数の多能性幹細胞が集合して細胞凝集体を形成する。
浮遊培養する際、分散された多能性幹細胞を、10cmディッシュのような比較的大きな培養器材に播種することにより、1つの培養器材中に複数の細胞凝集体を同時に形成させてもよい。細胞凝集体ごとの大きさのばらつきを生じにくくする観点からは、例えば非細胞接着性の96ウェルマイクロプレートのようなマルチウェルプレート(U底、V底)の各ウェルに一定数の分散された多能性幹細胞を播種することが好ましい。これを静置培養すると、細胞が迅速に凝集することにより、各ウェルに1個の細胞凝集体を形成させることができる。例えば培養器材の表面に超親水性のポリマーをコートする等の加工により培養器材を非細胞接着性とすることができる。非細胞接着性のマルチウェルプレートとしては、例えばPrimeSurface 96V底プレート(MS-9096V、住友ベークライト株式会社製)等が挙げられる。より迅速に細胞凝集体を形成させるために遠心操作を行ってもよい。各ウェルで形成された細胞凝集体を複数のウェルから回収することにより、均一な細胞凝集体の集団を得ることができる。細胞凝集体が均一であれば、その後の工程において、ウェルごと及び反復実験ごとの製造効率をより安定させることができ、より再現性よく鼻腔上皮を構成する細胞を製造することができる。
分散された多能性幹細胞から細胞凝集体を形成させるための別の態様としては、一つのウェルが複数のマイクロウェルに分割され、2つ以上の細胞塊が形成される培養器材を用いることができる。言い換えると、本実施形態の一側面において、前記工程(1)、及び工程(2)から(4)のうち任意の工程の浮遊培養を、少なくとも1つのウェルが形成されている培養器材中で実施し、前記ウェルは、複数のマイクロウェルに分割されていて、前記マイクロウェルの1つにつき、1つの細胞塊が形成されるように浮遊培養を実施し、1つのウェルにつき分割されたマイクロウェルに相当する数の細胞塊を調製してもよい。上記マイクロウェルとして、細胞が底面の一ヶ所に沈降して細胞凝集体の形成が促進されるすり鉢、下向きの四角錐、凹状等の加工、グリッド、隆起等が複数形成されている培養器材、又は細胞凝集体を形成しやすいように底面の一部のみに細胞が接着可能な加工を施されている培養器材等が挙げられる。マイクロウェルを有する培養器材のウェル一つ当たりの培養面積は特に限定されないが、細胞塊を効率よく生産する観点から、好ましくは底面積が1cm2(48ウェルプレート相当)より大きく、より好ましくは2cm2(24ウェルプレート相当)より大きく、さらに好ましくは4cm2(12ウェルプレート相当)より大きい。上記のような培養器材としては、例えば胚様体形成プレートAggreWell(StemCell Technologies社製)、PAMCELL(ANK社製)、スフェロイドマイクロプレート(Corning社製)、NanoCulture Plate/Dish(Organogenix社製)、Cell-able(東洋合成社製)、EZSPHERE(AGCテクノグラス社製)、SPHERICALPLATE 5D(水戸工業社製)、TASCL(シムスバイオ社製)、Scientific reports, 2022, 12.1: 1-11.に記載のマイクロウェルバッグ等が挙げられるが、これらに限定されない。
培養器材としては、各ウェル内に細胞凝集体が入ったままの状態でプレート全体の培地を一度に交換することが可能な三次元細胞培養容器を用いることもまた好ましい。このような三次元細胞培養容器としては、例えばPrimeSurface 96スリットウェルプレート(住友ベークライト株式会社製)等が挙げられる。このプレートには96ウェルのそれぞれの上部に培地が出入りできる細い開口部(スリット)が設けられている。スリットは細胞凝集体が通過しにくい幅に設定されているため、細胞凝集体同士の癒着を防止しながら、プレート全体の培地を一度に交換することができ、操作の効率性及び細胞凝集体の質を向上させることができる。
工程(1)における多能性幹細胞の濃度(密度)は、細胞凝集体をより均一に、効率的に形成させるように適宜設定することができる。例えば96ウェルマイクロウェルプレートを用いてヒト多能性幹細胞(例えば工程(a)から得られたヒトiPS細胞)を浮遊培養する場合、1ウェルあたり通常約1×103から約1×105細胞、好ましくは約3×103から約5×104細胞、より好ましくは約4×103から約2×104細胞、さらに好ましくは約4×103から約1.6×104細胞、特に好ましくは約8×103から約1.2×104細胞となるように調製した液を各ウェルに添加し、プレートを静置、または遠心して細胞凝集体を形成させる。例えば1ディッシュあたり約260個のマイクロウェルを有する培養器材であるEZSPHERE SP ディッシュ35mm Type905を用いてヒト多能性幹細胞(例えば工程(a)から得られたヒトiPS細胞)を浮遊培養する場合、1ディッシュあたり通常約1×104から約1×108細胞、好ましくは約3×104から約5×107細胞、より好ましくは約4×104から約2×107細胞、さらに好ましくは約4×104から約1.6×107細胞、特に好ましくは約8×104から約1.2×107細胞となるように調製した液をディッシュに添加し、ディッシュを静置して細胞凝集体を形成させる。例えば1ウェルあたり約1800個のマイクロウェルを有する培養器材であるAggreWell 800, 6-well plateを用いてヒト多能性幹細胞(例えば工程(a)から得られたヒトiPS細胞)を浮遊培養する場合、1ウェルあたり通常約1×104から約1×108細胞、好ましくは約3×104から約5×107細胞、より好ましくは約4×104から約2×107細胞、さらに好ましくは約4×104から約1.6×107細胞、特に好ましくは約8×104から約1.2×107細胞となるように調製した液を各ウェルに添加し、プレートを遠心して細胞凝集体を形成させる。播種する細胞数は、例えば血球計算盤等で計数することによって求めることができる。
細胞凝集体を形成させるために必要な浮遊培養の時間は、用いる多能性幹細胞によって適宜決定可能であるが、均一な細胞凝集体を形成するためにはできる限り短時間であることが望ましい。分散された細胞が、細胞凝集体が形成されるに至るまでの工程は、細胞が集合する工程、及び集合した細胞が凝集体を形成する工程にわけられる。分散された細胞を播種する時点(すなわち浮遊培養開始時)から細胞が集合するまでは、例えばヒト多能性幹細胞(ヒトiPS細胞等)の場合には、好ましくは約24時間以内、より好ましくは約12時間以内である。分散された細胞を播種する時点(すなわち浮遊培養開始時)から細胞凝集体が形成されるまでは、例えばヒト多能性幹細胞(ヒトiPS細胞等)の場合には、好ましくは約72時間以内、より好ましくは約48時間以内である。細胞凝集体を形成するまでの時間は、細胞を凝集させる用具や、遠心条件等を調整することにより適宜調節することが可能である。
多能性幹細胞を迅速に集合させて細胞凝集体を形成させると、形成された凝集体から分化誘導される細胞は上皮様構造を再現性よく形成させることができる。細胞凝集体を形成させる実験的な操作としては、例えばウェルの小さなプレート(例えばウェルの底面積が平底換算で0.1~2.0cm2程度のプレート)やマイクロポア等を用いて小さいスペースに細胞を閉じ込める方法、小さな遠心チューブを用いて短時間遠心することで細胞を凝集させる方法が挙げられる。ウェルの小さなプレートとして、例えば24ウェルプレート(面積が平底換算で1.88cm2程度)、48ウェルプレート(面積が平底換算で1.0cm2程度)、96ウェルプレート(面積が平底換算で0.35cm2程度、内径6~8mm程度)、384ウェルプレートが挙げられる。好ましくは96ウェルプレートが挙げられる。ウェルの小さなプレートの形状として、ウェルを上から見たときの底面の形状としては、多角形、長方形、楕円、真円が挙げられ、好ましくは真円が挙げられる。ウェルの小さなプレートの形状として、ウェルを横から見たときの底面の形状としては、外周部が高く内部が低くくぼんだ構造が好ましく、例えばU底、V底、M底が挙げられ、好ましくはU底又はV底、最も好ましくはV底が挙げられる。ウェルの小さなプレートとして、細胞培養皿(例えば60mm~150mmディッシュ、カルチャーフラスコ)の底面に凹凸又はくぼみがあるものを用いてもよい。ウェルの小さなプレートの底面は、細胞非接着性の底面、好ましくは細胞非接着性コートした底面を用いるのが好ましい。別の態様として、例えば紐状の細胞凝集体を形成させる場合は、例えば断面がV字状、U字状等である細長いレーンを有した培養器材中に細胞を播種し、細胞凝集体を形成させることができる。
細胞凝集体を形成させる別の手法として、立体印刷機、3Dプリンターを用いることもまた好ましい。分散された単一の細胞もしくは複数の細胞から構成されるスフェロイドを、生体適合性を有するインク(バイオインク)に懸濁し、バイオ3Dプリンター(例えばCellink社製 BIO X等)で出力する、又は細胞塊をニードルに刺して積み上げる(サイフューズ社製 Spike等)といった手法により、所望の形態の細胞凝集体を調製することができる。
細胞凝集体が形成されたことは、細胞凝集体のサイズ及び細胞数、巨視的形態、組織染色解析による微視的形態及びその均一性、分化及び未分化マーカーの発現及びその均一性、分化マーカーの発現制御及びその同期性、分化効率の凝集体間の再現性等に基づき判断することが可能である。
工程(1)の開始時において、別の好ましい一態様として、接着培養を実施する。工程(a)後の培養器材上の多能性幹細胞をそのまま工程(1)に用いてもよいし、多能性幹細胞を単一細胞に分散させた後に再度接着性の培養器材に播種してもよい。多能性幹細胞の単一細胞への分散後の再播種を実施する際に、適切な細胞外マトリクス又は合成細胞接着分子を足場として用いてもよい。足場により、表面をコーティングした培養器材中で、多能性幹細胞を接着培養できる。細胞外マトリクスは、好ましくはマトリゲル又はラミニンである。合成細胞接着分子としては、ポリ-D-リジン、RGD配列等細胞接着性のドメインを含有する合成ペプチド等が挙げられる。工程(1)における多能性幹細胞の濃度(密度)は、培養器材上に形成される組織をより均一に、効率的に形成させるように適宜設定することができる。例えば96ウェル平底マイクロウェルプレートを用いてヒト多能性幹細胞(例えば工程(a)から得られたヒトES細胞又はiPS細胞)を接着培養する場合、1ウェルあたり通常約1×102から約1×105細胞、好ましくは約2×102から約5×104細胞、より好ましくは約5×102から約2×104細胞となるように調製した液を各ウェルに添加し、プレートを静置して細胞を接着させ、以降の培養操作を実施する。本実施形態の一側面において、細胞の播種数としては鼻腔上皮への分化が生じる限り特に限定されないが、細胞間の接着と相互作用を再現する観点から、培養器材への播種後72時間以内に細胞密度が器材の培養スペースの6割以上に相当するサブコンフルエントに到達するような密度であってもよい。
接着性の培養器材として、マイクロパターンが施された培養器材を用いることもまた好ましい。培養器材上のマイクロパターンは、細胞接着性領域と細胞非接着性領域から構成することができ、細胞接着性領域で細胞が接着培養されることが好ましい。細胞接着性領域と細胞非接着性領域の形状は、培養器材上に展開可能である限り限定されない。細胞接着性領域と細胞非接着性領域は、一つの培養器材上に単一の領域が形成されていてもよいし、複数個形成されていてもよい。細胞接着性領域は、接着性を向上させる目的で人工的に処理されていることが好ましい。マイクロパターンが施された培養器材としては、例えばCYTOOchip(CYTOO社製)、ibidi Micropatterning(ibidi社製)等が挙げられる。PDMS製モールドとマトリクス等を用いて培養器材を調製することもできる。工程(a)で得られた多能性幹細胞をマイクロパターンが施された培養器材上で培養する場合、例えば既報の方法を参照し実施することができる(Nature protocols,11(11),2223-2232.)。マイクロパターンが施された培養器材への細胞の播種数としては鼻腔上皮への分化が生じる限り特に限定されないが、細胞間の接着と相互作用を再現する観点から、培養器材への播種後72時間以内に細胞密度が器材のマイクロパターン上の培養スペースの6割以上に相当するサブコンフルエントに到達するような密度であることもまた好ましい。
培養器材が培地の灌流を行なうための流路(マイクロ流路)を有することも好ましく、工程(1)及びその後の工程において、灌流環境下で細胞を培養してもよい。このような培養器材をマイクロ流体チップともいう。培養器材(例えばマイクロ流体チップ)は、本発明の製造方法において培養される細胞以外の細胞又は組織を培養する他の培養器材(例えばマイクロ流体チップ)と連結部により接続されていてもよい。連結部は、例えば流路となっていてもよい。これにより、鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞及びこれらを含む細胞集団と、他の細胞又は組織との相互作用を再現することができる。鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞及びこれらを含む細胞集団と共培養する他の細胞又は組織としては、例えば気管、気管支、肺、肝臓、脳及び中枢神経系、血管、肝臓、腎臓、咽喉、口腔上皮、胃、小腸、大腸の細胞及び組織等が挙げられるが、これらに限定されない。
培養器材は、酸素又は培地を透過可能な膜を有してもよい。培養器材は、化合物、増殖因子等の濃度勾配を形成可能であってもよい。膜は、例えば多孔質膜である。このような膜を有する培養器材においては、膜で隔てた一方で本発明の製造方法によって細胞を培養し、他方でそれ以外の細胞又は組織、フィーダー細胞などを培養することができる。これにより、鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞及びこれらを含む細胞集団と、他の細胞又は組織とをコンタミネーションさせることなく培養することができる。
工程(1)及び以降の工程において、培地交換操作を行う場合、例えば元ある培地を捨てずに新しい培地を加える操作(培地添加操作)、元ある培地を半量程度(元ある培地の体積量の30~90%程度、例えば40~60%程度)捨てて新しい培地を半量程度(元ある培地の体積量の30~90%、例えば40~60%程度)加える操作(半量培地交換操作)、元ある培地を全量程度(元ある培地の体積量の90%以上)捨てて新しい培地を全量程度(元ある培地の体積量の90%以上)加える操作(全量培地交換操作)が挙げられる。
ある時点で、特定の成分を添加する場合、例えば終濃度を計算した上で、元ある培地を半量程度捨てて、特定の成分を終濃度よりも高い濃度で含む新しい培地を半量程度加える操作(半量培地交換操作)を行ってもよい。ある時点で、元の培地に含まれる成分を希釈して濃度を下げる場合、例えば培地交換操作を、1日に複数回、好ましくは1時間以内に複数回(例えば2~3回)行ってもよい。また、ある時点で、元の培地に含まれる成分を希釈して濃度を下げる場合、細胞又は細胞凝集体を別の培養容器に移してもよい。培地交換操作に用いる道具は特に限定されないが、例えばピペッター、ピペットマン(登録商標)、マルチチャンネルピペット、連続分注器等が挙げられる。例えば培養器材として96ウェルプレートを用いる場合、マルチチャンネルピペットを使ってもよい。
工程(1)における培養の時間は、通常8時間~6日間程度、好ましくは12時間~48時間程度である。
細胞の分化の方向性の制御、並びに、細胞又は組織の生存及び増殖を促進する観点から、工程(1)~(3)のいずれか1つ以上の工程を、Wntシグナル伝達経路作用物質の存在下で行うこともできる。前述の通り、Wntシグナル伝達経路として古典的Wnt経路、非古典的Wnt経路等が挙げられる。
Wntシグナル伝達経路作用物質とはWntファミリー・タンパク質により惹起されるシグナル伝達を活性化し得るものである限り限定されない。Wntシグナル伝達経路作用物質は、核酸、タンパク質、低分子有機化合物のいずれであってもよい。当該物質として例えば、Wntの自己分泌を促進する物質、Wntを安定化させて分解を抑制する物質、Wntの組換えタンパク質、Wntの部分配列ペプチド及びその派生物や誘導体、Wnt受容体に作用し活性化させる物質、Wntの細胞内シグナル伝達機構を活性化させる物質、Wntの細胞内シグナル伝達因子及びその改変体(β-Catenin S33Y等)、Wnt応答配列下流の遺伝子発現を活性化させる物質等を挙げることができる。Wntシグナル伝達経路作用物質として知られているタンパク質として、Wnt、R-スポンジンが挙げられる。
Wntシグナル伝達経路作用物質としてWntの組換えタンパク質を用いる場合は、由来は特に限定されず、対象の細胞に対し活性を有する限り各種生物由来のWntタンパク質を用いることができる。中でも、哺乳動物由来のWntタンパク質であることが好ましい。哺乳動物としては、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ブタ、ウサギ等が挙げられる。より好ましくは、本発明に係る細胞集団の製造に用いられる多能性幹細胞と同種に由来する組換えタンパク質である。哺乳動物のWntタンパク質としては、例えばWnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt9a、Wnt9b、Wnt10a、Wnt10b、Wnt11、Wnt16等が挙げられるがこれに限定されない。本発明に係る細胞集団の製造において、Wntタンパク質は複数種を組み合わせて用いてもよい。本発明に係る細胞集団の製造に用いることができるWntの組換えタンパク質は、例えばR&D Systems社、富士フイルム和光純薬社から入手が可能である。
本発明に係る細胞集団の製造において、Wntの組換えタンパク質を培地中で安定させ、活性を維持する観点から、アファミンを添加することもまた好ましい。アファミンはアルブミンファミリーに属する糖タンパク質であり、疎水性の高いWntのタンパク質の凝集及び不活性化を抑制し、活性を維持することが知られている。アファミンの組換えタンパク質は、例えばR&D Systems社から入手が可能である。アファミンとWntの組換えタンパク質との混合物は、MBLライフサイエンス社から入手が可能である。
Wntシグナル伝達経路作用物質として用いることができるR-スポンジンとしては、R-スポンジン1、R-スポンジン2、R-スポンジン3及びR-スポンジン4からなるR-スポンジンファミリーに属するタンパク質が挙げられる。R-スポンジンファミリーは、分泌タンパク質であり、Wntシグナル伝達経路の活性化及び制御に関わることが知られている。本発明に係る細胞集団の製造において、R-スポンジンを複数種組み合わせて用いてもよい。本発明に係る細胞集団の製造に用いることができるR-スポンジンの組換えタンパク質は、例えばR&D Systems社、富士フイルム和光純薬社から入手が可能である。
Wntシグナル伝達経路作用物質として、当業者に周知の化合物を使用することもできる。Wntシグナル伝達経路作用物質としての活性を有する化合物として、例えばGSK3βに対する阻害活性を有する化合物、Wnt脱アシル化酵素に対する阻害活性を有する化合物、AAK1に対する阻害活性を有する化合物等が挙げられる。上記のような活性を有する化合物として、例えば塩化リチウム、SGC AAK1 1(N-(6-(3-((N,N-diethylsulfamoyl)amino)phenyl)-1H-indazol-3-yl)cyclopropanecarboxamide)、Foxy 5(N-formyl-L-methionyl-L-alpha-aspartyl-glycyl-L-cysteinyl-L-alpha-glutamyl-L-leucine)、CHIR99021(6-[2-[4-(2,4-Dichlorophenyl)-5-(4-methyl-1H-imidazol-2-yl)pyrimidin-2-ylamino]ethylamino]pyridine-3-carbonitrile)、CHIR98014(N6-[2-[[4-(2,4-Dichlorophenyl)-5-(1H-iMidazol-2-yl)-2-pyriMidinyl]aMino]ethyl]-3-nitro-2,6-pyridinediaMine)、TWS119(3-[6-(3-amino-phenyl)-7H-pyrrolo[2,3-D]pyrimidin-4-yloxy]-phenol)、SB216763(3-(2,4-dichlorophenyl)-4-(1-methyl-1H-indol-3-yl)-2,5-dihydro-1H-pyrrole-2,5-dione)、SB415286(3-[(3-chloro-4-hydroxyphenyl)amino]-4-(2-nitrophenyl)-1H-pyrrol-2,5-dione)、BIO((2Z,3E)-6-bromoindirubin-3-oxime)、AZD2858(3-Amino-6-[4-[(4-methyl-1-piperazinyl)sulfonyl]phenyl]-N-3-pyridinyl-pyrazinecarboxamide)、AZD1080(2-Hydroxy-3-(5-(morpholinomethyl)pyridin-2-yl)-1H-indole-5-carbonitrile)、AR-A014418(N-(4-Methoxybenzyl)-n-(5-nitro-1,3-thiazol-2-yl)urea)、TDZD-8(4-Benzyl-2-methyl-1,2,4-thiadiazolidine-3,5-dione)、LY2090314(7-(2,5-Dihydro-4-imidazo[1,2-a]pyridin-3-yl-2,5-dioxo-1H-pyrrol-3-yl)-9-fluoro-1,2,3,4-tetrahydro-2-(1-piperidinylcarbonyl)pyrrolo[3,2,1-jk][1,4]benzodiazepine)、IM-12(3-(4-fluorophenethylaMino)-1-Methyl-4-(2-Methyl-1H-indol-3-yl)-1H-pyrrole-2,5-dione)、Indirubin([2,3-Biindolinylidene]-2,3-dione)、Bikinin(4-((5-Bromo-2-pyridinyl)amino)-4-oxobutanoic acid)、A-1070722(1-(7-Methoxyquinolin-4-yl)-3-[6-(trifluoromethyl)pyridin-2-yl]urea)、3F8(5-Ethyl-7,8-dimethoxy-1H-pyrrolo[3,4-c]isoquinoline-1,3(2H)-dione)、Kenpaullone(9-Bromo-7,12-dihydro-indolo[3,2-d][1]benzazepin-6(5H)-one)、10Z-Hymenialdisine((4Z)-4-(2-Amino-1,5-dihydro-5-oxo-4H-imidazol-4-ylidene)-2-bromo-4,5,6,7-tetrahydro-pyrrolo[2,3-c]azepin-8(1H)-one)、Indirubin-3’-oxime(3-[1,3-dihydro-3-(hydroxyimino)-2H-indol-2-ylidene]-1,3-dihydro-2H-indol-2-one)、NSC 693868(1H-pyrazolo[3,4-b]quinoxalin-3-amine)、TC-G 24(N-(3-Chloro-4-methylphenyl)-5-(4-nitrophenyl)-1,3,4-oxadiazol-2-amine)、TCS 2002(2-Methyl-5-[3-[4-(methylsulfinyl)phenyl]-5-benzofuranyl]-1,3,4-oxadiazole)、TCS 21311(3-[5-[4-(2-Hydroxy-2-Methyl-1-oxopropyl)-1-piperazinyl]-2-(trifluoroMethyl)phenyl]-4-(1H-indol-3-yl)-1H-pyrrole-2,5-dione)、CP21R7(3-(3-Aminophenyl)-4-(1-methyl-1H-indol-3-yl)pyrrole-2,5-dione)、BML-284(AMBMP hydrochloride、N4-(1,3-benzodioxol-5-ylmethyl)-6-(3-methoxyphenyl)-2,4-pyrimidinediamine hydrochloride)、SKL2001(N-(3-(1H-imidazol-1-yl)propyl)-5-(furan-2-yl)isoxazole-3-carboxamide)、WAY-262611(1-[4-(2-Naphthalenyl)-2-pyrimidinyl]-4-piperidinemethanamine)、IIIC3a(9-Carboxy-3-(dimethyliminio)-6,7-dihydroxy-10-methyl-3H-phenoxazin-10-ium iodide)、Methyl Vanillate、IQ-1(2-[(4-Acetylphenyl)azo]-2-(3,4-dihydro-3,3-diMethyl-1(2H)-isoquinolinylidene)acetaMide)及びこれらの誘導体等が挙げられる。
工程(1)において、Wntシグナル伝達経路阻害物質を添加しているが、作用点の異なるWntシグナル伝達経路作用物質とWntシグナル伝達経路阻害物質を併用することで、前述の複数あるWntシグナル伝達経路のうち特定の経路のみを活性化、あるいは阻害することができる。Wntシグナル伝達経路作用物質は、工程(1)にて添加するWntシグナル伝達経路阻害物質の下流の因子に作用する物質であることが好ましい。添加するWntシグナル伝達経路作用物質が古典的Wnt経路を活性化させる物質であることもまた好ましく、細胞内のWntシグナル伝達因子であるβカテニンの分解の阻害、安定化作用によりWntシグナル伝達経路を活性化させる物質であることがさらに好ましい。βカテニンの分解の阻害、安定化作用を有する物質としては、例えばGSK3阻害剤及びBML-284、SKL2001等が挙げられる。添加するWntシグナル伝達経路作用物質がβカテニン応答性転写(β-catenin responsive transcription:CRT)を促進又は活性化させる物質であることもまた好ましい。
GSK3阻害剤としては、CHIR99021、CHIR98014、TWS119、SB216763、SB415286、BIO、AZD2858、AZD1080、AR-A014418、TDZD-8、LY2090314、IM-12、Indirubin、Bikinin、A 1070722、3F8、Kenpaullone、10Z-Hymenialdisine、Indirubin-3’-oxime、NSC 693868、TC-G 24、TCS 2002、TCS 21311、CP21R7及びこれらの誘導体等が挙げられる。
好ましいWntシグナル伝達経路作用物質とWntシグナル伝達経路阻害物質との組み合わせとして、GSK3阻害剤とPORCN阻害剤が挙げられる。GSK3阻害剤とPORCN阻害剤を併用した場合、古典的Wnt経路は活性化され、非古典的Wnt経路は阻害される。GSK3阻害剤とPORCN阻害剤とを併用した場合、GSK3阻害剤は、好ましくはCHIR99021、CHIR98014、SB216763、SB415286、BIOからなる群より選ばれる少なくとも1つを含み、さらに好ましくはCHIR99021を含む。GSK3阻害剤とPORCN阻害剤とを併用した場合、PORCN阻害剤は、好ましくはIWP-2、IWP-3、IWP-4、IWP-L6、IWP-12、LGK-974、ETC-159、GNF-6231、Wnt-C59からなる群より選ばれる少なくとも1つを含み、さらに好ましくはIWP-2を含む。また、GSK3阻害剤とKY02111又はその誘導体等を組み合わせて用いてもよい。GSK3阻害剤とは作用機序の異なるβカテニンの分解の阻害、安定化作用を有する物質としては例えばBML-284、SKL2001が挙げられ、これら化合物又はその誘導体もPORCN阻害剤、KY02111又はその誘導体等と組み合わせて用いてもよい。さらに好ましいWntシグナル伝達経路作用物質とWntシグナル伝達経路阻害物質との組み合わせとして、GSK3阻害剤とPORCN阻害剤及びJNK阻害剤とが挙げられる。GSK3阻害剤とPORCN阻害剤及びJNK阻害剤とを併用した場合、JNK阻害剤は、好ましくはJNK-IN-8を含む。
培地中のWntシグナル伝達経路作用物質の濃度は、上述の効果を達成可能な範囲で適宜設定することが可能である。細胞塊内部の神経系細胞又は組織の生存及び増殖の促進の観点からは、Wntシグナル伝達経路作用物質としてCHIR99021を用いる場合は、通常約10pM~約10mM、好ましくは約100pM~約1mM、より好ましくは約1nM~約100μM、さらに好ましくは約10nM~約30μM、最も好ましくは約100nM~約3μMの濃度で使用される。また、CHIR99021以外のWntシグナル伝達経路作用物質を使用する場合、上記濃度のCHIR99021と同等のWntシグナル伝達経路促進活性を示す濃度で用いられることが望ましい。Wntシグナル伝達経路促進活性は、例えばHEK293細胞を用いたTopflashレポーターアッセイによって決定することができる。
工程(1)及び以降の工程において、鼻腔上皮を構成する細胞の誘導に関与する嗅上皮様組織の製造効率を向上させる観点から、プラコード領域への分化を促進する化合物を添加することもまた好ましい。上記のような作用を有する化合物として、例えば米国特許出願公開第2016/0326491号明細書に記載のBRL-54443、Phenanthroline、Parthenolide等が挙げられる。プラコード領域への分化を促進する化合物としてBRL-54443を用いる場合は通常10nM~100μM、Phenanthrolineを用いる場合は通常10nM~100μM、Parthenolideを用いる場合は通常10nM~100μMの濃度で用いられる。
本発明に係る製造方法に用いる多能性幹細胞の調製、及び工程(1)及び以降の工程において、作業者間の手技の差による影響を排し、作業者に由来する異物等の混入を防止し、製造品質を安定させ、生産量を増大させる観点から、自動培養装置、自動培養ロボット、ラボオートメーション機器を用いることもまた好ましい。本発明の実施に用いることができる上記機器としては、例えば自動培養装置(パナソニック社製、川崎重工業社製、日立製作所社製、iACE2(ACC-200))、SLAS TECHNOLOGY: Translating Life Sciences Innovation,2020,2472630320972109.に記載のロボット(ロボティック・バイオロジー・インスティテュート株式会社製、LabDroid)等が挙げられるが、これに限定されない。上記機器を用いた本発明の実施にあたり、当業者であれば本発明に記載の製造方法及び工程を、使用する機器向けに調節又は変更することができる。
本発明に係る製造方法に用いる多能性幹細胞、及び工程(1)及び以降の工程において、製造品質を管理し安定させる観点から、製造物の中間評価を実施することもまた好ましい。上記中間評価は製造中の細胞塊の一部を消費して実施する抜き取り検査、及び非侵襲的検査のいずれであってもよいが、好ましくは非侵襲的検査である。非侵襲的検査としては、例えば顕微鏡による光学観察、光干渉断層計(Optical Coherence Tomography:OCT)による測定、培地交換時に回収した培地中に含まれる代謝物、核酸、分泌タンパク質の定量等の手法が挙げられる。顕微鏡による光学観察の一態様としては、例えば国際公開第2017/090741号に記載の方法等を用いて、細胞塊の表面に形成された上皮構造、鼻腔上皮、嗅上皮等を光学的に観察及び検出し、数値化して評価することもできる。上記光学観察の評価基準は、例えば当業者による目視の判断、又は撮影した画像の機械学習によるモデル構築等の手法により適宜設定することができる。評価基準としては、例えば細胞塊表面が上皮に覆われている面積の割合、表面の上皮の厚さ、表面の上皮の割合、細胞塊周囲の死細胞、デブリの量等が使用され得る。光干渉断層計を用いた評価手法としては、例えばCell3iMager Estier(SCREENホールディングス社製)を用いて断層画像、3Dイメージ等を取得し、細胞塊の断層面積、体積、真球度、面粗度、内部空洞体積、表面の上皮の厚さ等を定量することにより実施することができる。回収した培地を用いた解析としては、例えばエクソソーム解析、メタボロミクス解析等が実施可能である。
<工程(2)>
工程(2)は、BMPシグナル伝達経路作用物質の存在下で、工程(1)で培養した細胞を培養する。工程(1)で細胞を浮遊培養している場合は、工程(2)でも引き続き形成された細胞凝集体を浮遊培養すればよい。工程(1)で細胞を接着培養している場合は、工程(2)でも引き続き細胞を接着培養すればよい。工程(1)で細胞を浮遊培養した後、工程(2)で接着培養してもよい。工程(1)で細胞を接着培養した後、工程(2)で浮遊培養してもよい。
工程(2)は、BMPシグナル伝達経路作用物質の存在下で、工程(1)で培養した細胞を培養する。工程(1)で細胞を浮遊培養している場合は、工程(2)でも引き続き形成された細胞凝集体を浮遊培養すればよい。工程(1)で細胞を接着培養している場合は、工程(2)でも引き続き細胞を接着培養すればよい。工程(1)で細胞を浮遊培養した後、工程(2)で接着培養してもよい。工程(1)で細胞を接着培養した後、工程(2)で浮遊培養してもよい。
BMPシグナル伝達経路作用物質とは、BMPにより媒介されるシグナル伝達経路を増強し得る物質である。BMPシグナル伝達経路作用物質としては、例えばBMP2、BMP4及びBMP7等のBMPタンパク質、GDF7等のGDFタンパク質、抗BMP受容体抗体、並びに、BMP部分ペプチド等が挙げられる。これらの物質は単独で又は複数種を組み合わせて用いてもよい。生物学的活性の見地からのBMPシグナル伝達経路作用物質としては、例えば、マウス前駆軟骨細胞株ATDC5、マウス頭蓋冠由来細胞株MC3T3-E1、及びマウス横紋筋由来細胞株C2C12等の細胞に対する骨芽細胞様細胞への分化誘導能、及びアルカリホスファターゼ産生誘導能を有する物質が挙げられる。上記活性を有する物質としては、例えばBMP2、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、BMP9、BMP10、BMP13/GDF6、BMP14/GDF5、GDF7等が挙げられる。
BMP2タンパク質及びBMP4タンパク質は例えばR&D Systemsから入手可能である。BMP7タンパク質は例えばBiolegend社から入手可能である。GDF7タンパク質は例えば富士フィルム和光純薬株式会社から入手可能である。BMPシグナル伝達経路作用物質は、好ましくはBMP2、BMP4、BMP7、BMP13及びGDF7からなる群より選ばれる少なくとも1つのタンパク質を含み、より好ましくはBMP4を含む。
培地中のBMPシグナル伝達経路作用物質の濃度は、上述の効果を達成可能な範囲で適宜設定することが可能である。鼻腔上皮を構成する細胞の製造効率向上の観点から、BMPシグナル伝達経路作用物質としてBMP4を用いる場合は、通常約1pM~約100nM、好ましくは約10pM~約50nM、より好ましくは約25pM~約25nM、さらに好ましくは約25pM~約5nM、特に好ましくは約100pM~約5nM、最も好ましくは約500pM~約2nMの濃度で使用される。また、BMP4以外のBMPシグナル伝達経路作用物質を使用する場合、上述の濃度のBMP4と同等のBMPシグナル伝達経路促進活性を示す濃度で用いられることが望ましい。当業者であれば、BMPシグナル伝達経路作用物質として例えば市販の組換えBMPタンパク質等を用いる場合、製品添付書類に記載の活性、例えばマウス前駆軟骨細胞株ATDC5に対するアルカリホスファターゼ産生誘導能のED50等の値と上述のBMP4の濃度と活性を比較することにより、添加するBMPシグナル伝達経路作用物質濃度を容易に決定することができる。
BMPシグナル伝達経路作用物質として、当業者に周知の化合物を使用することもできる。BMPシグナル伝達経路作用物質としては、例えばSmurf1阻害物質、Chk1阻害物質等が挙げられる。上記のような活性を有する化合物としては、例えばA-01([4-[[4-Chloro-3-(trifluoromethyl)phenyl]sulfonyl]-1-piperazinyl][4-(5-methyl-1H-pyrazol-1-yl)phenyl]methanone)、PD 407824(9-Hydroxy-4-phenyl-pyrrolo[3,4-c]carbazole-1,3(2H,6H)-dione)及びこれらの誘導体等が挙げられる。
工程(2)において用いられる培地は、BMPシグナル伝達経路作用物質を含む限り特に限定されない。工程(2)において用いられる培地としては、工程(1)に挙げた培地が挙げられる。
鼻腔上皮を構成する細胞の製造効率向上の観点から、工程(2)の開始時期は、工程(1)における培養開始から好ましくは0.5時間以降6日以内であり、より好ましくは0.5時間以降72時間以内であり、さらに好ましくは18時間以降60時間以内であり、24時間以降60時間以内であってもよい。浮遊培養を実施する場合、Wntシグナル経路阻害物質存在下で上記期間に工程(2)を開始すると、細胞凝集体の表面に非神経上皮様の組織が形成され、極めて効率よく鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞が形成される。
工程(1)で浮遊培養を行なっている場合、鼻腔上皮を構成する細胞の製造効率向上の観点から、工程(2)の開始時期は、好ましくは工程(1)において形成された細胞凝集体の表層における1割以上10割以下、より好ましくは3割以上10割以下、さらに好ましくは5割以上10割以下の細胞が互いに密着結合を形成している時期である。細胞凝集体において密着結合が形成しているかは、例えば抗ZO-1抗体を用いた免疫染色等の手法により判別することができる。
工程(2)におけるBMPシグナル伝達経路作用物質の存在下での培養開始は、工程(1)を行った培養容器を用いて、上述の培地交換操作(例えば培地添加操作、半量培地交換操作、全量培地交換操作等)を行ってもよいし、細胞を別の培養容器に移してもよい。
工程(2)におけるBMPシグナル伝達経路作用物質を含む培地での培養の期間は、適宜設定できる。工程(2)における培養の時間は、通常8時間~6日間程度、好ましくは10時間~108時間程度、より好ましくは12時間~96時間程度、さらに好ましくは18時間~72時間程度、最も好ましくは24時間~60時間程度である。本実施形態の一側面において、工程(2)における培養の時間は、通常8時間~6日間程度、好ましくは10時間~96時間程度、より好ましくは12時間~72時間程度、さらに好ましくは14時間~48時間程度、最も好ましくは16時間~36時間程度である。
工程(2)において、工程(a)又は工程(1)において用いた添加物、例えばWntシグナル伝達経路阻害物質、Wntシグナル伝達経路作用物質、TGFβシグナル伝達経路阻害物質、TAK1阻害物質等を引き続き添加することもまた好ましい。工程(2)で添加するWntシグナル伝達経路阻害物質、Wntシグナル伝達経路作用物質又はTGFβシグナル伝達経路阻害物質は、それ以前の工程に用いられた物質と異なっていてもよいが、好ましくは同一である。添加物の濃度及び種類については、適宜調整することができる。これらの物質の添加時期は、工程(2)の開始と同時であってもよいし、異なっていてもよい。
<工程(3)>
工程(3)では、FGFシグナル伝達経路作用物質及びBMPシグナル伝達経路阻害物質からなる群より選ばれる少なくとも1つの存在下で、工程(2)で培養した細胞を培養する。工程(2)で細胞を浮遊培養している場合は、工程(3)でも引き続き細胞凝集体を浮遊培養すればよい。工程(2)で細胞を接着培養している場合は、工程(3)でも引き続き細胞を接着培養すればよい。工程(2)で細胞を浮遊培養した後、工程(3)で接着培養してもよい。工程(2)で細胞を接着培養した後、工程(3)で浮遊培養してもよい。
工程(3)では、FGFシグナル伝達経路作用物質及びBMPシグナル伝達経路阻害物質からなる群より選ばれる少なくとも1つの存在下で、工程(2)で培養した細胞を培養する。工程(2)で細胞を浮遊培養している場合は、工程(3)でも引き続き細胞凝集体を浮遊培養すればよい。工程(2)で細胞を接着培養している場合は、工程(3)でも引き続き細胞を接着培養すればよい。工程(2)で細胞を浮遊培養した後、工程(3)で接着培養してもよい。工程(2)で細胞を接着培養した後、工程(3)で浮遊培養してもよい。
工程(3)において、FGFシグナル伝達経路作用物質及びBMPシグナル伝達経路阻害物質の少なくとも一方を培地に添加する。本実施形態の一側面において、FGFシグナル伝達経路作用物質とBMPシグナル伝達経路阻害物質とを両方とも添加して細胞を培養してもよい。
FGFシグナル伝達経路作用物質とは、FGF(線維芽細胞増殖因子)により媒介されるシグナル伝達経路を増強し得る物質である限り特に限定はされない。FGFシグナル伝達経路作用物質としては、例えばFGF1、FGF2(bFGFと称することもある。)、FGF3、FGF7、FGF8、及びFGF10等のFGFタンパク質、抗FGF受容体抗体、並びに、FGF部分ペプチド等が挙げられる。これらの物質は単独で又は複数種を組み合わせて用いてもよい。
FGF2タンパク質及びFGF8タンパク質は、例えば富士フィルム和光純薬株式会社から入手可能である。FGFシグナル伝達経路作用物質は、好ましくはFGF2、FGF3、FGF8及びFGF10、並びにこれらの改変体からなる群より選ばれる少なくとも1つを含み、より好ましくはFGF2を含み、さらに好ましくは組換えヒトFGF2を含む。
培地中のFGFシグナル伝達経路作用物質の濃度は、上述の効果を達成可能な範囲で適宜設定することが可能である。鼻腔上皮を構成する細胞への分化及び細胞の生存と増殖の促進の観点からは、FGFシグナル伝達経路作用物質としてFGF2を用いる場合は、通常約1pg/ml~約100μg/ml、好ましくは約10pg/ml~約50μg/ml、より好ましくは約100pg/ml~約10μg/ml、さらに好ましくは約500pg/ml~約1μg/ml、最も好ましくは約1ng/ml~約200ng/mlの濃度で使用される。また、FGF2以外のFGFシグナル伝達経路作用物質を使用する場合、上記濃度のFGF2と同等のFGFシグナル伝達経路促進活性を示す濃度で用いられることが望ましい。添加する物質のFGFシグナル伝達経路促進活性については、例えば3T3細胞を用いた細胞増殖試験等の手法により測定することができる。
培地中でのFGFタンパク質の活性を保持する目的から、FGFタンパク質を含む培地中にヘパリン、ヘパラン硫酸を添加することも好ましい。ヘパリンはナトリウム塩として例えば富士フィルム和光純薬株式会社から入手可能である。培地中のヘパリン又はヘパラン硫酸の濃度は、上述の効果を達成可能な範囲で適宜設定することが可能である。培地中のヘパリンナトリウムの濃度は、通常約1ng/ml~約100mg/ml、好ましくは約10ng/ml~約50mg/ml、より好ましくは約100ng/ml~約10mg/ml、さらに好ましくは約500ng/ml~約1mg/ml、最も好ましくは約1μg/ml~約200μg/mlである。ヘパラン硫酸を用いる場合、上記濃度のヘパリンと同様のFGFタンパク質保護の活性をもつ濃度であることが好ましい。37℃等での細胞培養環境下でFGFタンパク質の活性を保持する目的から、例えば米国特許第8772460号明細書に記載のThermostable FGF2等のFGFの改変体や生分解性ポリマーにFGF2を結合させたStemBeads FGF2等のFGF2徐放性ビーズを用いることもまた好ましい。Thermostable FGF2は、例えばHumanZyme社から入手可能である。StemBeads FGF2は例えばStemCulture社から入手可能である。
BMPシグナル伝達経路阻害物質とは、BMPファミリー・タンパク質により惹起されるシグナル伝達を抑制し得るものである限り限定されない。BMPシグナル伝達経路阻害物質は、核酸、タンパク質、低分子有機化合物のいずれであってもよい。当該物質として例えばBMPのプロセシングと細胞外への分泌を阻害する物質、BMPに直接作用する物質(例えばタンパク質、抗体、アプタマー等)、BMPをコードする遺伝子の発現を抑制する物質(例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、siRNA等)、BMP受容体とBMPの結合を阻害する物質、BMP受容体によるシグナル伝達に起因する生理活性を阻害する物質を挙げることができる。BMP受容体にはI型BMP受容体とII型BMP受容体が存在する。I型BMP受容体としては、BMPR1A、BMPR1B、ACVRが知られている。II型BMP受容体としては、TGF-beta R-II、ActR-II、ActR-IIB、BMPR2、MISR-IIが知られている。
BMPシグナル伝達経路阻害物質として知られているタンパク質として、例えばNoggin、Chordin、Follistatin、Gremlin、Inhibin、Twisted Gastrulation、Coco、DANファミリーに属する分泌タンパク質等が挙げられる。上記工程(2)において培養液中にBMPシグナル伝達経路作用物質を添加していることから、以降のBMPシグナル伝達経路をより効果的に阻害するという観点から、工程(3)におけるBMPシグナル伝達経路阻害物質は、細胞外へのBMPの分泌よりも後のシグナル伝達経路を阻害する物質、例えばBMP受容体とBMPとの結合を阻害する物質、BMP受容体によるシグナル伝達に起因する生理活性を阻害する物質等を含むことが好ましく、より好ましくはI型BMP受容体の阻害剤を含む。
BMPシグナル伝達経路阻害物質として、当業者に周知の化合物を使用することもできる。BMPシグナル伝達経路阻害物質としては、例えばI型BMP受容体の阻害物質が挙げられる。上記のような活性を有する化合物としては、例えばK02288(3-[(6-Amino-5-(3,4,5-trimethoxyphenyl)-3-pyridinyl]phenol,3-[6-Amino-5-(3,4,5-trimethoxyphenyl)-3-pyridinyl]-phenol)、Dorsomorphin(6-[4-[2-(1-Piperidinyl)ethoxy]phenyl]-3-(4-pyridinyl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidine)、LDN-193189(4-[6-[4-(1-Piperazinyl)phenyl]pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl]quinoline dihydrochloride)、LDN-212854(5-[6-[4-(1-Piperazinyl)phenyl]pyrazolo[1,5-a]pyriMidin-3-yl]quinoline)、LDN-214117(1-(4-(6-methyl-5-(3,4,5-trimethoxyphenyl)pyridin-3-yl)phenyl)piperazine)、ML347(5-[6-(4-Methoxyphenyl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl]quinoline))、DMH1(4-(6-(4-Isopropoxyphenyl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl)quinoline)、DMH2(4-[6-[4-[2-(4-Morpholinyl)ethoxy]phenyl]pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl]-quinoline)等が挙げられる。これらの物質は単独で又は複数種を組み合わせて用いてもよい。
BMPシグナル伝達経路阻害物質は、好ましくはI型BMP受容体阻害剤であり、より好ましくはK02288、Dorsomorphin、LDN-193189、LDN-212854、LDN-214117、ML347、DMH1及びDMH2からなる群より選ばれる少なくとも1つを含み、さらに好ましくはK02288を含む。
培地中のBMPシグナル伝達経路阻害物質の濃度は、上述の効果を達成可能な範囲で適宜設定することが可能である。鼻腔上皮を構成する細胞の形成効率の観点から、工程(3)におけるBMP伝達経路阻害物質としてK02288を用いる場合は、通常約1nM~約100μM、好ましくは約10nM~約50μM、より好ましくは約100nM~約50μM、さらに好ましくは約500nM~約25μMの濃度で使用される。BMP伝達経路阻害物質としてLDN-193189を用いる場合は、通常約1nM~約100μM、好ましくは約10nM~約10μM、より好ましくは約25nM~約1μM、さらに好ましくは約100nM~約500nMの濃度で使用される。BMP伝達経路阻害物質としてLDN-212854を用いる場合は、通常約1nM~約100μM、好ましくは約10nM~約10μM、より好ましくは約25nM~約5μM、さらに好ましくは約250nM~約3μMの濃度で使用される。BMP伝達経路阻害物質としてML-347を用いる場合は、通常約1nM~約100μM、好ましくは約10nM~約50μM、より好ましくは約100nM~約50μM、さらに好ましくは約1μM~約25μMの濃度で使用される。BMP伝達経路阻害物質としてDMH2を用いる場合は、通常約1nM~約100μM、好ましくは約10nM~約10μM、より好ましくは約25nM~約5μM、さらに好ましくは約250nM~約3μMの濃度で使用される。また、K02288以外のBMPシグナル伝達経路阻害物質を使用する場合、上記濃度のK02288と同等のBMPシグナル伝達経路阻害活性を示す濃度で用いられることが望ましい。
鼻腔上皮を構成する細胞の形成効率の観点から、工程(3)の開始時期は、工程(2)のBMPシグナル伝達経路作用物質の添加から好ましくは0.5時間以降240時間以内であり、より好ましくは6時間以降192時間以内であり、さらに好ましくは9時間以降120時間以内であり、特に好ましくは12時間以降72時間以内である。工程(3)におけるFGFシグナル伝達経路作用物質及びBMPシグナル伝達経路阻害物質の添加時期は同時でもよいし、異なっていてもよい。
工程(3)における一態様としては、まずFGFシグナル伝達経路作用物質を添加し、その後にBMPシグナル伝達経路阻害物質を添加してもよい。具体的には、例えば工程(2)の開始後48時間以内にまずFGFシグナル伝達経路作用物質を添加し、その後、96時間以内にBMPシグナル伝達経路阻害物質を添加してもよい。あるいは、細胞集団中に混入する未分化細胞の増殖を抑制する観点からの別の一態様としては、例えば工程(2)の開始後72時間以降120時間以内にFGFシグナル伝達経路作用物質とBMPシグナル伝達経路阻害物質を添加してもよい。
鼻腔上皮を構成する細胞の形成効率の観点から、工程(3)の開始時期は、工程(2)のBMPシグナル伝達経路作用物質の添加後に細胞凝集体の表面に非神経上皮組織が形成されるよりも前に開始することが好ましい。細胞凝集体の表面に非神経上皮組織が形成されたかを調べるためには、顕微鏡等により細胞凝集体表面に上皮様の組織が形成されたかを観察、又は細胞凝集体の切片を作製し、サイトケラチン、E-Cadherin、EpCAM等の非神経上皮組織で発現するマーカーに対する蛍光免疫染色等の手法により行うことができる。
工程(3)の培養開始は、工程(2)を行った培養容器を用いて、上述の培地交換操作(例えば培地添加操作、半量培地交換操作、全量培地交換操作等)を行ってもよいし、細胞凝集体を別の培養容器に移してもよい。
浮遊培養を行なっている場合、工程(3)の培養は、例えば細胞凝集体中に鼻腔上皮細胞が分化するまで行えばよい。鼻腔上皮細胞への分化は、例えば細胞の免疫染色によって確認することができ、マーカーとしてはサイトケラチン15、サイトケラチン18、および前記した鼻腔上皮を構成する各種細胞のマーカー遺伝子等を用いることができる。あるいは、工程(3)の培養は、嗅神経前駆細胞が分化するまで行えばよい。嗅神経前駆細胞への分化は、例えば細胞の免疫染色によって確認することができ、マーカーとしてはEbf2、NeuroD、Lhx2、Tuj1、NCAM、Calretininを用いることができる。
工程(3)において用いられる培地は、特に限定されないが、工程(1)において用いられる培地の他、NeurobasalにB27 Supplementが添加された培地、DMEM/F-12にN2 Supplementが添加された培地、StemPro NSC SFM 無血清ヒト神経幹細胞培養培地(Thermo Fisher Scientific社製)等の調製済の神経細胞培養用の培地が挙げられる。
工程(3)において、工程(a)、工程(1)及び工程(2)の何れかの工程において用いた添加物、例えばWntシグナル伝達経路阻害物質、Wntシグナル伝達経路作用物質、TGFβシグナル伝達経路阻害物質、TAK1阻害物質等を引き続き添加することもまた好ましい。工程(3)で添加するWntシグナル伝達経路阻害物質、Wntシグナル伝達経路作用物質、TGFβシグナル伝達経路阻害物質及びTAK1阻害物質は、それぞれ工程(a)、工程(1)及び工程(2)の何れかの工程において用いられた物質と異なっていてもよいが、好ましくは同一である。添加物の濃度及び種類については、適宜調整することができる。工程(3)において使用される添加物は、好ましくはWntシグナル伝達経路阻害物質を含み、さらに好ましくはWntシグナル伝達経路作用物質、TGFβシグナル伝達経路阻害物質及びTAK1阻害物質を含む。
鼻腔上皮構造の形成並びに細胞の生存及び増殖促進の観点から、工程(3)は、EGFシグナル伝達経路作用物質の存在下で行うこともまた好ましい。EGFシグナル伝達経路作用物質とは、上皮成長因子(EGF)により媒介されるシグナル伝達経路を増強し得る物質である。EGFシグナル伝達経路作用物質としては、例えばEGF、TGF-α、AR(アンフィレギュリン)、EPG、HB-EGF(ヘパリン結合EGF様増殖因子)、BTC(ベータセルリン)、及びEPR(エピレグリン)等のEGFRリガンドタンパク質、NRG(ニューレグリン)1~4のErbB3/4(上皮成長因子受容体、HRE)リガンドタンパク質、並びに、アルプレノール、及びカルベジロール等の低分子化合物等が挙げられる。これらの物質は単独で又は複数種を組み合わせて用いてもよい。EGFタンパク質は例えばThermo Fisher Scientific社及びPrimeGene社から入手可能である。HB-EGFタンパク質は、例えばR&D Systems社から入手可能である。EGFシグナル伝達経路作用物質は、好ましくはEGFを含む。
培地中のEGFシグナル伝達経路作用物質の濃度は、上述の効果を達成可能な範囲で適宜設定することが可能である。EGFシグナル伝達経路作用物質としてEGFを用いる場合は、通常約1pg/ml~約100μg/ml、好ましくは約10pg/ml~約50μg/ml、より好ましくは約100pg/ml~約10μg/ml、さらに好ましくは約500pg/ml~約1μg/ml、最も好ましくは約1ng/ml~約200ng/mlの濃度で使用される。またEGF以外のEGFシグナル伝達経路作用物質を使用する場合、上記濃度のEGFと同等のEGFシグナル伝達経路促進活性を示す濃度で用いられることが望ましい。
鼻腔上皮様組織中の細胞の分化傾向の調節並びに細胞の生存及び増殖促進の観点からは、工程(3)は、Shhシグナル伝達経路作用物質の存在下で行うこともまた好ましい。Shhシグナル伝達経路作用物質としては、上記工程(a)にて記載のもの等を用いることができる。工程(3)におけるShhシグナル伝達経路作用物質は、工程(a)で用いるものと同じでもよいし、異なっていてもよいが、好ましくは同一の物質である。工程(3)におけるShhシグナル伝達経路作用物質は、好ましくはSAG、Purmorphamine、GSA-10からなる群より含まれる少なくとも1つを含み、より好ましくはSAGを含む。培地中のShhシグナル伝達経路作用物質の濃度は、上述の効果を達成可能な範囲で適宜設定することが可能である。SAGは、工程(3)においては通常約1nM~約10μM、好ましくは約10nM~約7μM、より好ましくは約50nM~約5μM、さらに好ましくは約100nM~約3μM、特に好ましくは約300nM~約2μM、最も好ましくは約500nM~約1.5μMの濃度で使用される。また、SAG以外のShhシグナル伝達経路作用物質を使用する場合、上記濃度のSAGと同等のShhシグナル伝達促進活性を示す濃度で用いられることが望ましい。
鼻腔上皮様組織中の細胞の分化傾向の調節の観点から、工程(3)は、レチノイン酸シグナル伝達経路作用物質の存在下で行うこともまた好ましい。レチノイン酸伝達経路作用物質としては、例えばレチノイン酸受容体(RAR)又はレチノイドX受容体(RXR)に結合し、下流の転写を活性化させる物質等が挙げられる。上記のような作用を有する化合物としては、例えばオールトランスレチノイン酸、イソトレチノイン、9-cisレチノイン酸、TTNPB(4-[(E)-2-[(5,5,8,8-Tetramethyl-5,6,7,8-tetrahydronaphthalene)-2-yl]-1-propenyl]benzoic acid)、Ch55(4-[(E)-3-(3,5-di-tert-butylphenyl)-3-oxo-1-propenyl]benzoic acid)、EC19(3-[2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)ethynyl]benzoic acid)、EC23(4-[2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)ethynyl)-benzoicacid)、Fenretinide(4-hydroxyphenylretinamide)、Acitretin((all-e)-9-(4-methoxy-2,3,6-trimethylphenyl)-3,7-dimethyl-2,4,6,8-nonatetraen)、Trifarotene、Adapalene、AC 261066(4-[4-(2-Butoxyethoxy-)-5-methyl-2-thiazolyl]-2-fluorobenzoicacid)、AC 55649(4-N-Octylbiphenyl-4-carboxylic acid)、AM 580(4-[(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)carboxamido]benzoic acid)、AM80(4-[(5,5,8,8-Tetramethyl-6,7-dihydronaphthalen-2-yl)carbamoyl]benzoic acid)、BMS 753(4-[[(2,3-Dihydro-1,1,3,3-tetramethyl-2-oxo-1H-inden-5-yl)carbonyl]amino]benzoicacid)、BMS 961(3-Fluoro-4-[(r)-2-hydroxy-2-(5,5,8,8-tetramethyl-5,6,7,8-tetrahydro-naphthalen-2-yl)-acetylamino]-benzoic acid)、CD1530(4-(6-Hydroxy-7-tricyclo[3.3.1.13,7]dec-1-yl-2-naphthalenyl)benzoicacid)、CD2314(5-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-anthracenyl)-3-thiophenecarboxylic acid)、CD437(2-naphthalenecarboxylicacid,6-(4-hydroxy-3-tricyclo(3.3.1.1(3,7))dec-1-ylphen)、CD271(6-[3-(1-Adamantyl)-4-methoxyphenyl]-2-naphthalene carboxylic acid)及びこれらの誘導体等が挙げられる。これらの物質は単独で又は複数種を組み合わせて用いてもよい。
工程(3)におけるレチノイン酸伝達経路作用物質は、好ましくはEC23を含む。培地中のレチノイン酸伝達経路作用物質の濃度は、上述の効果を達成可能な範囲であれば特に限定されない。レチノイン酸伝達経路作用物質としてEC23を用いる場合は、例えばEC23の濃度が約10pM~約30μMであり、好ましくは約100pM~約20μMであり、より好ましくは約10nM~約10μMであり、さらに好ましくは約100nM~約5μMである。EC23以外のレチノイン酸伝達経路作用物質を使用する場合、上記濃度のEC23と同等のレチノイン酸伝達経路作用活性を示す濃度で用いられることが望ましい。
鼻腔上皮様組織中の細胞の分化傾向の調節の観点からは、工程(3)は、Notchシグナル伝達経路阻害物質の存在下で行うこともまた好ましい。本発明において、Notchシグナル伝達経路とは、細胞膜上に発現する受容体であるNotchタンパク質と隣接細胞の膜上に発現するNotchリガンド(Delta、Jagged等)との直接相互作用により活性化されるシグナル伝達経路を表す。Notchシグナルが伝達された細胞においては、Notchタンパク質が段階的にプロセシングを受け膜上で切り出された細胞内ドメインが核内へと運ばれて下流遺伝子の発現を制御する。
Notchシグナル伝達経路阻害物質は、Notchにより媒介されるシグナル伝達を抑制し得るものである限り特に限定されない。Notchシグナル伝達経路阻害物質は、核酸、タンパク質、低分子有機化合物のいずれであってもよい。当該物質として例えば、機能欠失型のNotch受容体及びリガンド、Notchのプロセシング(S1切断)を阻害する物質、Notch及びNotchリガンドの糖鎖修飾を阻害する物質、細胞膜移行を阻害する物質、Notchの細胞内ドメイン(NICD)のプロセシング(S2切断、S3切断)を阻害する物質(γセクレターゼ阻害剤)、NICDを分解する物質、NICD依存的な転写を阻害する物質等を挙げることができる。
Notchシグナル伝達経路阻害物質として、当業者に周知の化合物を使用することもできる。Notchシグナル伝達経路阻害物質としての活性を有する化合物として、例えばDAPT(N-[N-(3,5-difluorophenacetyl)-l-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester)、DBZ((2S)-2-[[2-(3,5-difluorophenyl)acetyl]amino]-N-[(7S)-5-methyl-6-oxo-7H-benzo[d][1]benzazepin-7-yl]propanamide)、MDL28170(benzyl N-[(2S)-3-methyl-1-oxo-1-[[(2S)-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl]amino]butan-2-yl]carbamate)、FLI-06(cyclohexyl 2,7,7-trimethyl-4-(4-nitrophenyl)-5-oxo-1,4,6,8-tetrahydroquinoline-3-carboxylate)、L-685,458(tert-butyl N-[6-[[1-[(1-amino-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl)amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-benzyl-3-hydroxy-6-oxo-1-phenylhexan-2-yl]carbamate)、CB-103(6-(4-tert-butylphenoxy)pyridin-3-amine)及びこれらの誘導体等、並びにOnco Targets Ther.2013;6:943-955.に記載の物質等が挙げられる。Notchシグナル伝達経路阻害物質は、好ましくはDAPTを含む。
培地中におけるNotchシグナル阻害物質の濃度は、上述の効果を達成可能な範囲であれば特に限定されない。例えばNotchシグナル伝達経路阻害物質としてDAPTを用いる場合は、例えばDAPTの濃度が約100pM~約50μMであり、好ましくは約1nM~約30μMであり、より好ましくは約100nM~約20μMであり、さらに好ましくは約1μM~約10μMである。DAPT以外のNotchシグナル伝達経路阻害物質を使用する場合、上記濃度のDAPTと同等のNotchシグナル伝達経路阻害活性を示す濃度で用いられることが望ましい。
鼻腔上皮様組織中の細胞の分化傾向の調節の観点からは、工程(3)および以降の工程を、Hippo/YAPシグナル伝達経路調節物質の存在下で行うこともまた好ましい。本発明において、Hippo/YAPシグナル伝達経路とは、細胞増殖やアポトーシス、幹細胞の自己複製の制御、器官のサイズ調節等に関与する、Mst1/2やLATS1/2等より構成されるキナーゼカスケードと、転写因子YAP/TAZにより制御されるシグナル伝達経路とを表す。例えば、細胞の増殖と幹細胞の未分化性の維持とを企図する場合は、当業者であれば、Hippo経路を阻害し、YAP/TAZタンパク質の脱リン酸化と核内移行を促進する作用を有する物質、YAP/TAZにより惹起される転写を促進する物質等を添加することにより行うことができる。細胞の分化促進を企図する場合は、当業者であれば、Hippo経路を活性化し、YAP/TAZタンパク質のリン酸化とユビキチン・プロテオソーム系等による分解を促進する作用を有する物質、YAP/TAZにより惹起される転写を抑制する物質等を添加することにより行うことができる。
Hippo経路阻害物質としては上流のキナーゼカスケードを阻害し、またはYAP/TAZにより惹起される下流の標的遺伝子の転写・細胞応答を亢進させるものである限り特に限定されない。Hippo経路阻害物質は核酸、タンパク質、低分子有機化合物のいずれであってもよい。Hippo経路阻害物質としては、例えば、増殖因子、サイトカイン、Sphingosine-1-phosphate receptor 2(S1PR2)活性化物質、mammalian sterile 20-like kinase (MST) 1/2阻害物質、large tumor suppressor kinase 1 and 2 (LATS1/2) 阻害物質、annexin A2 (ANXA2)結合阻害物質、TAZ活性化物質等が挙げられる。上記のような作用を有する物質としては例えばCYM-5520(1-[2-(1-benzyl-2,5-dimethylpyrrol-3-yl)-2-oxoethyl]-6-oxopyridine-3-carbonitrile)、XMU-MP-1(4-[(2,9-dimethyl-8-oxo-6-thia-2,9,12,14-tetrazatricyclo[8.4.0.03,7]tetradeca-1(14),3(7),4,10,12-pentaen-13-yl)amino]benzenesulfonamide)、PY-60(5-phenyl-N-(3-(thiazol-2-yl)propyl)isoxazole-3-carboxamide)、GA-017([(E)-2-(1-(2,4-dihydroxy-3-methylphenyl)propylidene)-N-(3-hydroxybenzyl)hydrazine-1-carboxamide])、Lats-IN-1(N-(3-benzyl-1,3-thiazol-2-ylidene)-1H-pyrrolo[2,3-b]pyridine-3-carboxamide)、IBS008738([3-(4-methylphenyl)-5-[(E)-morpholin-4-ylmethylideneamino]imidazol-4-yl]-phenylmethanone)、TM-25659(2-butyl-5-methyl-6-pyridin-3-yl-3-[[4-[2-(2H-tetrazol-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazo[4,5-b]pyridine)、SBP-3264(N-[1-[5-(3-chlorophenyl)-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-yl]piperidin-4-yl]acetamide)、VT02956、TDI-011536およびこれらの誘導体等が挙げられる。
Hippo経路活性化物質としてはYAP/TAZにより惹起される下流の遺伝子の転写・細胞応答を抑制させるものである限り特に限定されない。Hippo経路活性化物質は核酸、タンパク質、低分子有機化合物のいずれであってもよい。Hippo経路活性化物質としては、例えば、TEAD阻害物質、YAP-TEAD結合阻害物質、AMPK活性化剤、YAP/TAZ転写活性阻害物質、細胞間および細胞外マトリックスへの接着刺激の擬似活性化物質等が挙げられる。上記のような作用を有する物質としては例えばVerteporfin(3-[(23S,24R)-14-ethenyl-22,23-bis(methoxycarbonyl)-5-(3-methoxy-3-oxopropyl)-4,10,15,24-tetramethyl-25,26,27,28-tetrazahexacyclo[16.6.1.13,6.18,11.113,16.019,24]octacosa-1,3,5,7,9,11(27),12,14,16,18(25),19,21-dodecaen-9-yl]propanoic acid;3-[(23S,24R)-14-ethenyl-22,23-bis(methoxycarbonyl)-9-(3-methoxy-3-oxopropyl)-4,10,15,24-tetramethyl-25,26,27,28-tetrazahexacyclo[16.6.1.13,6.18,11.113,16.019,24]octacosa-1,3,5,7,9,11(27),12,14,16,18(25),19,21-dodecaen-5-yl]propanoic acid)、AICAR(5-amino-1-[(2R,3R,4S,5R)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]imidazole-4-carboxamide)、K-975(N-(3-(4-chlorophenoxy)-4-methylphenyl)acrylamide)、MYF-01-37(1-[3-methyl-3-[3-(trifluoromethyl)anilino]pyrrolidin-1-yl]prop-2-en-1-one)、TED-347(2-chloro-1-[2-[3-(trifluoromethyl)anilino]phenyl]ethanone)、VT107(N-[(1S)-1-(6-aminopyridin-2-yl)ethyl]-5-[4-(trifluoromethyl)phenyl]naphthalene-2-carboxamide)、YAP-TEAD-IN-1((4S)-4-[[(2S)-1-[(2S)-1-[(2S)-2-[[(3S,6S,9S,12S,15S,24S,27S,30S,33S)-15-[[(2S)-2-[[(2S)-1-[(2S)-2-acetamido-3-methylbutanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-(3-chlorophenyl)propanoyl]amino]-6-(4-aminobutyl)-24-benzyl-3-butyl-9-(3-carbamimidamidopropyl)-27-(hydroxymethyl)-30-methyl-12-(2-methylpropyl)-2,5,8,11,14,23,26,29,32-nonaoxo-18,19-dithia-1,4,7,10,13,22,25,28,31-nonazabicyclo[31.3.0]hexatriacontane-21-carbonyl]amino]-6-aminohexanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-5-amino-5-oxopentanoic acid)、Super-TDU((4S)-5-amino-4-[[(2S)-1-[(2S)-1-[(2S)-6-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-1-[(2S)-2-[[(2S)-6-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-1-[(2S)-2-[[(2S,3S)-2-[2-[(3S)-6-amino-1-[(2S)-1-[(2S)-2-[[(2S)-4-amino-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2S)-6-amino-2-[[(2S)-1-[(2S)-4-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-6-amino-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-3-carboxy-2-[[(2S)-3-carboxy-2-[[(2S)-2-[2-[(2S)-1-hydroxy-3-oxopropan-2-yl]hydrazinyl]-3-methylbutanoyl]amino]propanoyl]amino]propanoyl]amino]-3-(1H-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]propanoyl]amino]hexanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]acetyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-methylpentanoyl]amino]acetyl]amino]acetyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]hexanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]propanoyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]pyrrolidin-2-yl]-1,2,6-trioxohexan-3-yl]hydrazinyl]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]hexanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]hexanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-5-oxopentanoic acid)およびこれらの誘導体等が挙げられる。
上記の物質等がHippo経路阻害物質および活性化物質としての活性を有することは、例えば、Current drug targets, 2017, 18.4: 447-454.に記載されており、当業者にとって公知である。上記文献に記載の物質等をHippo経路阻害物質および活性化物質として用いることもできる。
前述の通り、鼻腔上皮様組織中の細胞の分化傾向の調節の観点からは、工程(3)は、Wntシグナル伝達経路作用物質の存在下で行うこともまた好ましい。培地中のWntシグナル伝達経路作用物質の濃度は、上述の効果を達成可能な範囲で適宜設定することが可能である。鼻腔上皮様組織中の細胞の分化傾向の調節の観点からは、Wntシグナル伝達経路作用物質としてCHIR99021を用いる場合は、通常約10pM~約10mM、好ましくは約100pM~約1mM、より好ましくは約1nM~約100μM、さらに好ましくは約10nM~約30μM、最も好ましくは約100nM~約3μMの濃度で使用される。また、CHIR99021以外のWntシグナル伝達経路作用物質を使用する場合、上記濃度のCHIR99021と同等のWntシグナル伝達経路促進活性を示す濃度で用いられることが望ましい。Wntシグナル伝達経路促進活性は、例えばHEK293細胞を用いたTopflashレポーターアッセイを用いて決定することができる。
鼻腔上皮様組織中の細胞の分化傾向の調節の観点から、工程(3)及び以降の工程をアクチビン/TGF-βシグナル伝達経路作用物質の存在下で行うこともまた好ましい。アクチビン/TGF-βシグナル伝達経路作用物質とは、アクチビン/TGF-βにより媒介されるシグナル伝達経路を増強し得る物質である。アクチビン/TGF-βシグナル伝達経路作用物質としては、例えばアクチビン、及びTGF-β等の組換えタンパク質、並びに、Alantolactone等のアクチビン/TGF-βシグナル伝達経路を活性化させる物質等が挙げられる。これらの物質は単独で又は複数種を組み合わせて用いてもよい。生物学的活性の見地からのアクチビン/TGF-βシグナル伝達経路作用物質としては、例えばヒト慢性骨髄性白血病由来細胞株K562等の細胞に対するヘモグロビン発現誘導能を有する物質が挙げられる。アクチビン/TGF-βシグナル伝達経路作用物質としてヒト組換えアクチビン(R&D Systems社製)を用いる場合は、通常1pg/ml~1mg/ml、好ましくは100pg/ml~10μg/ml、より好ましくは1ng/ml~100ng/mlの範囲の濃度で用いる。ヒト組換えアクチビン以外のアクチビン/TGF-βシグナル伝達経路作用物質を用いる場合は、当業者にとって周知の、前記ヒト組替アクチビン添加濃度と同様の生理活性を示す濃度で添加すればよい。工程(3)より以前の工程においてアクチビン/TGF-βシグナル伝達経路阻害物質を添加している場合は、例えば細胞凝集体を培養器材から回収後、アクチビン/TGF-βシグナル伝達経路阻害物質を含まない培地、緩衝液等で複数回洗浄し、新しい培養器材に細胞凝集体を移設したあとアクチビン/TGF-βシグナル伝達経路作用物質を含む培地を添加することが好ましい。
浮遊培養を実施している場合、工程(3)及び以降の工程において細胞凝集体同士の接着を抑制、細胞の保護及び生体の物理的環境を模して鼻腔上皮様組織の製造効率を向上させる観点から、増粘剤を含有し、粘性を有する培地中で細胞凝集体を培養することもできる。
培地に粘性を付与する手段は特に制限されないが、例えば、一般に増粘剤として知られる物質を適当な濃度で培地に添加することにより実施されうる。増粘剤としては、培地に上記の適度な粘度を付与し得るものであって、当該粘度を付与し得る濃度範囲において、細胞に悪影響を及ぼさない(細胞毒性がない)ものであれば、いかなる増粘剤も使用することができる。増粘剤としては、例えばペクチン、グアーガム、キサンタンガム、タマリンドガム、カラギーナン、ローカストビーンガム、ジェランガム、デキストリン、ダイユータンガム、デンプン、タラガム、アルギン酸、カードラン、カゼインナトリウム、カロブビーンガム、キチン、キトサン、グルコサミン、プルラン、食物繊維及びこれらの化学修飾された物質又は誘導体、セルロース、アガロースなどの多糖、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルエチルセルロース、ヒドロキシプロピルエチルセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロース、ジヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルヒドロキシプロピルセルロースなどの多糖のエーテル、ポリアクリルアミド、ポリエチレンオキシド、及びポリビニルピロリドン、エチレングリコール/プロピレングリコール共重合体、ポリエチレンイミンポリビニルメチルエーテル、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、マレイン酸共重合体などの合成高分子、コラーゲン、ゼラチン、ヒアルロン酸、及びデキストランなどの生体高分子、あるいはそれらを模倣した人工高分子(例えば、エラスチン様ペプチドなど)が挙げられる。好ましくは、これら増粘剤は単独で用いてもよいし、何種類かの増粘剤の混合物として用いることもできる。また、増粘剤として用いられる水溶性高分子の共重合体を用いてもよい。好ましくは、メチルセルロース、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロース又はそれらの混合物、より好ましくはメチルセルロースを用いることができる。
粘性を有する培地は、培養環境として好適に用いられる37℃条件下で、通常100mPa・S以上、好ましくは250mPa・S以上、より好ましくは500mPa・S以上、さらに好ましくは1000mPa・S以上の粘性を有するものが用いられる。上記粘性は、例えば日本産業規格(JIS)に基づき、細管粘度計、落球粘度計、回転粘度計、振動粘度計等を用いて測定することが可能である。
培地に添加される増粘剤の濃度は、粘性を付与可能であり細胞に対する障害性を有しない限り適宜調製可能である。増粘剤としてメチルセルロース(4000cP)を用いる場合は、通常0.1%から10%、好ましくは0.3%から7.5%、さらに好ましくは0.5%から5%の濃度で用いられる。
浮遊培養を実施している場合、工程(3)及び以降の工程において細胞凝集体同士の接着・凝集を抑制、剪断力等の物理的刺激からの細胞の保護及び生体の物理的環境を模して鼻腔上皮様組織の製造効率を向上させる観点から、界面活性作用を有する物質を添加することもできる。このような物質としては例えば、アラキドン酸、リノール酸、リノレイン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、パルミチン酸、パルミトイル酸、及びステアリン酸等の脂肪酸、プルロニック F-68、及びTween 80等の界面活性剤、並びに、コレステロールが挙げられる。
浮遊培養を実施している場合、工程(3)及び以降の工程において製造される細胞塊のサイズを均一にし、分化誘導の効率を制御する観点から、形成された細胞塊同士の接着を防止するような処置を講じることも望ましい。上記を実現する手段としては例えば、国際公開第2016/121737号に記載のリゾリン脂質類の添加、国際公開第2019/131941号に記載のトロンビン受容体アゴニストの添加、国際公開第2016/121840号に記載の細胞間接着の阻害物質の添加等の手段が挙げられるが、これらに限定されない。細胞塊同士の接着を防止する別の態様として、細胞接着を制御するRhoシグナル伝達経路に対する阻害物質の添加が挙げられる。細胞塊同士の接着を防止するRhoシグナル伝達経路阻害物質は、好ましくはROCK阻害物質である。細胞塊同士の接着を防止する目的でROCK阻害物質であるY-27632又はChroman 1を添加する場合は、細胞保護物質として使用する場合と同様の条件にて添加することができる。ROCK阻害物質であるY-27632を添加する場合は、通常10nMから10mM、好ましくは100nMから1mM、より好ましくは1μMから100μMの濃度となるように培養環境中に添加する。ROCK阻害物質であるChroman 1を添加する場合は通常10pMから1mM、好ましくは100pMから100μM、より好ましくは1nMから10μMの濃度となるように培養環境中に添加する。
工程(2)まで浮遊培養を実施している場合、工程(3)及び以降の工程において形成された鼻腔上皮を構成する細胞の分化成熟を促進する観点から、形成された細胞凝集体を接着培養することもまた好ましい。浮遊培養から接着培養への移行の際には細胞凝集体をそのまま細胞培養ディッシュ上に静置することで接着させてもよいし、カッティング処置、あるいは細胞分散処置等を実施し、より小さな細胞凝集体又は単離された細胞の懸濁液を調製し、播種後に接着させてもよい。
細胞を接着させる培養器材として、前述した平面の細胞培養ディッシュ、あるいはTranswell等の物質透過性を有する薄膜状の細胞培養器材のいずれの形態でも用いることができる。培養器材は、細胞の接着を促進するために基底膜標品、ラミニン等の細胞外マトリクス、ポリ-D-リジン等の合成細胞接着分子等でコーティングされていてもよい。
工程(3)及び以降の工程において、鼻腔上皮を構成する細胞の生存及び分化成熟を促進する観点から、細胞凝集体を気相液相境界面培養法で培養することもまた好ましい。気相液相境界面培養法(Air liquid interface culture)とは、細胞又は組織の少なくとも一面が大気に暴露されているか、極めて近い位置にある条件での培養を表す。気相液相境界面培養法を実施するためには、例えば細胞又は組織を多孔性メンブレン上又はカルチャーインサート内で培養し、インサート内(内腔側)の培養液を抜き取り、インサート外側のウェル内の培養液のみで培養する方法、アガロース等のハイドロゲルを培養ディッシュ内に置き、その上に細胞又は組織等を置いてディッシュ内の培地から露出しつつ乾燥しない条件下で培養する方法、及び、アガロース等に包埋後、振動刃ミクロトーム等で細胞凝集体を薄切し、セルインサート内で薄切片を培養する方法等が挙げられる。主として酸素による大気への暴露の毒性を軽減する目的から、PDMS等の酸素透過性の膜や板を細胞又は組織等の上に置き、暴露条件を調節することもできる。上記のような気相液相境界面培養法は、例えばRespiratory research 18.1(2017):195、Sci Rep 6,21472、Nat Neurosci.2019 Apr;22(4):669-679等を参照して実施することができる。
工程(3)及び以降の工程において、鼻腔上皮を構成する細胞の生存及び分化成熟を促進する観点から、細胞凝集体をゲル中に包埋して培養する工程を含んでもよい。ゲルとしては、例えばアガロース、メチルセルロース、コラーゲン、及びマトリゲル等を用いたゲルが挙げられ、マトリゲルを用いることが好ましい。
工程(3)及び以降の工程のゲル中に包埋して細胞を培養する工程において、細胞凝集体をそのまま包埋してもよいし、分散及び単離した後の細胞をゲル中に播種してもよい。セルソーター等を用いて基底細胞等特定の細胞腫を分取した後に播種してもよい。ゲル中に包埋する培養法のさらなる一態様として、線維芽細胞、間葉系細胞、血管系の細胞等の鼻腔上皮以外の細胞との共培養を実施することもできる。上記のようなゲル包埋培養は、例えばNature 501,373-379(2013)、Nature,499,481-484(2013)、Nat Protoc 14,518-540(2019)、Genes 2020,11,603等を参照して実施することができる。
工程(3)及び以降の工程において、細胞への栄養及び酸素供給を改善し、物質交換を改善する目的から、細胞が物理的に揺動される培養方法を実施することも好ましい。このような培養方法としては、振盪培養、回転培養、攪拌培養等の静置培養以外の方法が挙げられる。振盪培養、回転培養、攪拌培養等を実施するための手段は特に限定されないが、例えば細胞を培養している培養器材をローテーター、シェーカー等に設置する、又は細胞をスターラー等が回転している環境下に置くことにより実施することができる。振盪培養、回転培養、攪拌培養の速度等のパラメーターは当業者であれば細胞への障害を生じない範囲で適宜設定可能である。例えば波動形揺動の3Dシェーカー(例えばMini-Shaker 3D、Biosan社製)を用いて振盪培養を実施する場合は、例えば5~60rpm、好ましくは5~40rpm、より好ましくは5~20rpmの範囲で振盪速度範囲を設定可能である。往復式のシェーカー(例えばNS-LR、アズワン社製)を用いて振盪培養を実施する場合は、例えば15~60rpm、好ましくは15~50rpm、より好ましくは15~45rpmの範囲で振盪速度範囲を設定可能である。シーソー式のシェーカー(例えばNS-S、アズワン社製)を用いて振盪培養を実施する場合は、例えば5~50rpm、好ましくは5~40rpm、より好ましくは5~30rpmの範囲で振盪速度範囲を設定可能である。細胞凝集体を攪拌培養、回転培養で培養する場合は、例えばスピナーフラスコ(例えば3152、コーニング社製)をマグネティックスターラー上に設置し、細胞凝集体が目視で沈降しない程度の回転数で培養を実施することもできる。三次元回転浮遊培養装置(例えばCellPet CUBE、ジェイテック社製;Clinostar、Celvivo社製)を用いて培養を実施することもできる。細胞への摩擦等の物理的な障害を抑制する観点から、前記のゲルに包埋した細胞凝集体を振盪培養、回転培養又は攪拌培養することもまた好ましい。
工程(3)及び以降の工程において、細胞死を抑制し、細胞の増殖を促進する観点から、培地中にさらなる増殖因子を添加することもまた好ましい。添加される増殖因子の種類は、上記目的を達成可能な限り特に限定されない。かかる目的で用いられる増殖因子としては、インスリン様成長因子(insulin-like growth factor:IGF)、神経成長因子(nerve growth factor:NGF)、脳由来神経栄養因子(brain-derived neurotrophic factor:BDNF)、ニューロトロフィン3、ニューロトロフィン4/5、毛様体神経栄養因子(ciliary neurotrophic factor:CNTF)、血管内皮細胞増殖因子(vesicular endothelial growth factor:VEGF)、色素上皮由来因子(pigment epithelium-derived factor:PEDF)、肝細胞増殖因子(hepatocyte growth factor:HGF)等が挙げられる。これらの増殖因子は、上記目的を達成可能な濃度で添加すればよい。
工程(3)及び以降の工程において、細胞死を抑制し、細胞の増殖を促進する観点から、血小板由来成長因子(platelet-derived growth factor:PDGF)等の血小板由来成長因子受容体作用物質を培地中に添加することもまた好ましい。PDGFにはA、B、C、Dの四種類の遺伝子が存在し、AA、AB、BB、CC、DDのホモ又は特定の組み合わせのヘテロの二量体を形成してリガンドとして機能する。PDGF受容体にはα及びβの二種類の遺伝子が存在し、αα、αβ、ββの組み合わせのホモ又はヘテロの二量体を形成して受容体として機能する。このうち、プラコードを含む非神経外胚葉ではPDGFRβがよく発現している。本発明で用いる血小板由来成長因子受容体作用物質は、好ましくはPDGFRββ又はPDGFRαβに対する作用を有している。上記血小板由来成長因子受容体作用物質は、より好ましくはPDGF-AB、PDGF-BB、PDGF-CC及びPDGF-DDのからなる群より選ばれる少なくとも1つを含み、さらに好ましくはPDGF-BB及びPDGF-CCからなる群より選ばれる少なくとも1つを含む。PDGF-AB、PDGF-BB、PDGF-CC及びPDGF-DDは、組換えタンパク質としてR&D systems社、GenScript社等から入手可能である。
工程(3)及び以降の工程において、細胞死を抑制し、細胞の増殖を促進する観点から、高酸素の雰囲気下で培養することもまた好ましい。培養過程における高酸素条件は、例えば細胞を培養するインキュベーターに酸素ボンベを接続し、人工的に酸素を供給することにより実現できる。かかる目的での酸素濃度は、通常25%から80%であり、より好ましくは30%から60%である。
工程(3)及び以降の工程において、細胞凝集体を培養する培地中への酸素供給量を増やす観点から、ガス交換効率の高い培養器材を用いることもできる。このような培養器材の例として、細胞培養ディッシュ、プレートの底面をガス透過性のフィルムとしたLumoxディッシュ(ザルスタット株式会社製)、VECELL 96well plate(株式会社ベセル製)等が挙げられる。前述した高酸素濃度条件下での培養と組み合わせて用いることもまた好ましい。
工程(3)及び以降の工程において、細胞凝集体中の上皮組織の構造を維持する観点から、細胞保護剤を培地に添加することもできる。工程(3)及び以降の工程において用いられる細胞保護剤としては、上述したFGFシグナル伝達経路作用物質、ヘパリン、ROCK阻害物質、基底膜標品、ミオシン阻害物質、ポリアミン類、ISR阻害剤、カスパーゼ阻害剤、血清、及び血清代替物等が挙げられる。ミオシン阻害物質としては、例えば非筋型ミオシンII ATPアーゼの阻害物質であるBlebbistatin、ミオシン軽鎖キナーゼ(MLCK)の阻害物質であるML-7、ML-9、W-7、MLCK inhibitor peptide 18及びこれらの誘導体等が挙げられる。添加する細胞保護剤は、工程(1)で添加したものと同一であっても異なっていてもよいが、好ましくは同一である。好ましい細胞保護剤としては、ROCK阻害物質が挙げられる。工程(3)及び以降の工程において、細胞保護剤としてROCK阻害物質であるY-27632を添加する場合は、通常10nMから10mM、好ましくは100nMから1mM、より好ましくは1μMから100μMの濃度となるように培養環境中に添加する。ROCK阻害物質であるChroman 1を添加する場合は通常10pMから1mM、好ましくは100pMから100μM、より好ましくは1nMから10μMの濃度となるように培養環境中に添加する。細胞保護剤として非筋型ミオシンII ATPアーゼの阻害物質であるBlebbistatinを添加する場合は、通常10nMから10mM、好ましくは100nMから1mM、より好ましくは1μMから100μMの濃度となるように培養環境中に添加する。
工程(3)及び以降の工程において、細胞保護剤以外の上皮組織の構造を維持する作用を有する物質を添加することもできる。上記のような物質として例えば細胞接着を促進する物質、基底膜成分の合成を促進する物質、基底膜成分の分解を阻害する物質等が挙げられる。細胞接着を促進する物質は細胞-細胞間の接着、細胞-基底膜間の接着、細胞-培養器材間の接着等いずれを促進するものであってもよいし、細胞接着に関与する因子の産生を促すものであってもよい。細胞接着を促進する物質として例えばアドヘサミン、アドヘサミン-RGDS誘導体、Pyrintegrin、Biotin tripeptide-1、Acetyl Tetrapeptide-3、RGDS Peptide及びこれらの誘導体等が挙げられる。基底膜成分の合成を促進する物質として例えばアスコルビン酸誘導体等が挙げられる。アスコルビン酸誘導体としては、例えばアスコルビン酸リン酸ナトリウム、アスコルビン酸リン酸マグネシウム、アスコルビン酸2-グルコシド、3-O-エチルアスコルビン酸、テトラヘキシルデカン酸アスコルビル、パルミチン酸アスコルビル、ステアリン酸アスコルビル、アスコルビン酸-2リン酸-6パルミチン酸、グリセリルオクチルアスコルビン酸等が挙げられる。基底膜成分の分解を阻害する物質として、例えばマトリックスメタロプロテアーゼ及びセリンプロテアーゼの阻害剤等が挙げられる。基底膜成分の合成を促進する物質であるアスコルビン酸誘導体の一種であるアスコルビン酸2-リン酸を添加する場合は、通常10μg/ml以上1000μg/ml以下、好ましくは30μg/ml以上500μg/ml以下、さらに好ましくは50μg/ml以上300μg/ml以下の濃度となるように培養環境中に添加する。他のアスコルビン酸及びアスコルビン酸の誘導体等を添加する際は、上記の濃度とモル当量が同程度となるように添加すればよい。
工程(3)及び以降の工程において、鼻腔上皮又は嗅上皮を構成する細胞の生存を促進する観点から、酸化ストレスを軽減する作用を有する物質を添加することも好ましい。上記のような活性を有する物質として例えば抗酸化物質、フリーラジカルスカベンジャー作用を有する物質、NADPHオキシダーゼ阻害物質、シクロオキシゲナーゼ阻害物質、リポキシゲナーゼ(LOX)阻害物質、スーパーオキシドジスムターゼ(SOD)様物質、Nrf2活性化剤等が挙げられる。上記のような活性を有する物質として例えばアスコルビン酸、N-アセチル-L-システイン、酢酸(±)-α-トコフェロール、Apocynin(4’-Hydroxy-3’-methoxyacetophenone)、ニコチンアミド、タウリン(2-アミノエタンスルホン酸)、IM-93(1-Isopropyl-3-(1-methyl-1H-Indole-3-yl)-4-(N,N-dimethyl-1,3-propanediamine)-1H-Pyrrole-2、5H-dione)、Caffeic Acid(3,4-Dihydroxycinnamic Acid)、Celastrol(3-Hydroxy-24-nor-2-oxo-1(10),3,5,7-friedelatetraen-29-oic Acid;Tripterin)、Ebselen(2-Phenyl-1,2-benzisoselenazol-3(2H)-one)、(-)-Epigallocatechin Gallate((2R,3R)-2-(3,4,5-Trihydroxyphenyl)-3,4-dihydro-1[2H]-benzopyran-3,5,7-triol-3-(3,4,5-trihydroxybenzoate))、EUK-8(N,N’-Bis(salicylideneamino)ethane-manganese(II))、Edaravone(3-Methyl-1-phenyl-2-pyrazolin-5-one)、MnTBAP(Mn(III)tetrakis(4-benzoic acid)porphyrin Chloride)、Nordihydroguaiaretic Acid、Resveratrol(trans-3,4,5-Trihydroxystilbene)及びこれらの誘導体等が挙げられるが、これらに限定はされない。細胞培養用に調製済の試薬(例えば抗酸化サプリメント、Sigma Aldrich社製、A1345)を用いることもできる。本発明で用いる酸化ストレスを軽減する作用を有する物質は、好ましくはアスコルビン酸、N-アセチル-L-システイン並びにこれらの誘導体からなる群より選ばれる少なくとも1つを含む。アスコルビン酸は、例えばその誘導体であるアスコルビン酸2リン酸として、1Mから1nM、好ましくは100mMから10nM、より好ましくは10mMから100nM、さらに好ましくは3mMから1μMの濃度で培地中に添加することができる。N-アセチル-L-システインは、例えば1nMから1M、好ましくは10nMから100mM、より好ましくは100nMから10mM、さらに好ましくは1μMから5mMの濃度で培地中に添加することができる。
工程(3)及び以降の工程において、鼻腔上皮又は嗅上皮を構成する細胞の生存を促進する観点から、ストレス応答シグナル伝達経路に対する阻害物質(ストレスに対する細胞内シグナル伝達機構を阻害する物質)を添加することもまた好ましい。ストレス応答性MAPキナーゼ経路(stress-activated protein kinase:SAPK)はストレスに対する細胞内シグナル伝達機構の主要なものの一つである。ストレス応答性MAPキナーゼ経路の阻害剤としては例えばMAP3K阻害剤、MAP2K阻害剤、ASK阻害剤、MEK阻害剤、Akt阻害剤、Rhoファミリーキナーゼ阻害剤、JNK阻害剤、p38阻害剤、MSK阻害剤、STAT阻害剤、NF-κB阻害剤、CAMK阻害剤等が挙げられる。
MEK阻害剤としては、例えばSelumetinib(AZD6244,6-(4-bromo-2-chloroanilino)-7-fluoro-N-(2-hydroxyethoxy)-3-methylbenzimidazole-5-carboxamide)、Mirdametinib(PD0325901,N-[(2R)-2,3-dihydroxypropoxy]-3,4-difluoro-2-(2-fluoro-4-iodoanilino)benzamide)、Trametinib(GSK1120212,N-[3-[3-cyclopropyl-5-(2-fluoro-4-iodoanilino)-6,8-dimethyl-2,4,7-trioxopyrido[4,3-d]pyrimidin-1-yl]phenyl]acetamide)、U0126(1,4-diamino-2,3-dicyano-1,4-bis(2-aminophenylthio)butadiene)、PD184352(CI-1040,2-(2-chloro-4-iodoanilino)-N-(cyclopropylmethoxy)-3,4-difluorobenzamide)、PD98059(2-(2-amino-3-methoxyphenyl)chromen-4-one)、BIX 02189(3-[N-[3-[(dimethylamino)methyl]phenyl]-C-phenylcarbonimidoyl]-2-hydroxy-N,N-dimethyl-1H-indole-6-carboxamide)、Pimasertib(AS-703026,N-[(2S)-2,3-dihydroxypropyl]-3-(2-fluoro-4-iodoanilino)pyridine-4-carboxamide)、Pelitinib(EKB-569,(E)-N-[4-(3-chloro-4-fluoroanilino)-3-cyano-7-ethoxyquinolin-6-yl]-4-(dimethylamino)but-2-enamide)、BIX 02188(3-[N-[3-[(dimethylamino)methyl]phenyl]-C-phenylcarbonimidoyl]-2-hydroxy-1H-indole-6-carboxamide)、TAK-733(3-[(2R)-2,3-dihydroxypropyl]-6-fluoro-5-(2-fluoro-4-iodoanilino)-8-methylpyrido[2,3-d]pyrimidine-4,7-dione)、AZD8330 (2-(2-fluoro-4-iodoanilino)-N-(2-hydroxyethoxy)-1,5-dimethyl-6-oxopyridine-3-carboxamide)、Binimetinib(MEK162,6-(4-bromo-2-fluoroanilino)-7-fluoro-N-(2-hydroxyethoxy)-3-methylbenzimidazole-5-carboxamide)、SL-327((Z)-3-amino-3-(4-aminophenyl)sulfanyl-2-[2-(trifluoromethyl)phenyl]prop-2-enenitrile)、Refametinib(RDEA119,N-[3,4-difluoro-2-(2-fluoro-4-iodoanilino)-6-methoxyphenyl]-1-[(2S)-2,3-dihydroxypropyl]cyclopropane-1-sulfonamide)、GDC-0623(5-(2-fluoro-4-iodoanilino)-N-(2-hydroxyethoxy)imidazo[1,5-a]pyridine-6-carboxamide)、BI-847325(3-[3-[N-[4-[(dimethylamino)methyl]phenyl]-C-phenylcarbonimidoyl]-2-hydroxy-1H-indol-6-yl]-N-ethylprop-2-ynamide)、RO5126766(CH5126766,3-[[3-fluoro-2-(methylsulfamoylamino)pyridin-4-yl]methyl]-4-methyl-7-pyrimidin-2-yloxychromen-2-one)、Cobimetinib(GDC-0973,[3,4-difluoro-2-(2-fluoro-4-iodoanilino)phenyl]-[3-hydroxy-3-[(2S)-piperidin-2-yl]azetidin-1-yl]methanone)及びこれらの誘導体等が挙げられる。
p38阻害剤としては、例えば、SB203580(4-[4-(4-fluorophenyl)-2-(4-methylsulfinylphenyl)-1H-imidazol-5-yl]pyridine)、Doramapimod(BIRB 796,1-[5-tert-butyl-2-(4-methylphenyl)pyrazol-3-yl]-3-[4-(2-morpholin-4-ylethoxy)naphthalen-1-yl]urea)、SB202190(FHPI,4-[4-(4-fluorophenyl)-5-pyridin-4-yl-1H-imidazol-2-yl]phenol)、Ralimetinib dimesylate(5-[2-tert-butyl-4-(4-fluorophenyl)-1H-imidazol-5-yl]-3-(2,2-dimethylpropyl)imidazo[4,5-b]pyridin-2-amine;methanesulfonic acid)、VX-702(6-(N-carbamoyl-2,6-difluoroanilino)-2-(2,4-difluorophenyl)pyridine-3-carboxamide)、PH-797804(3-[3-bromo-4-[(2,4-difluorophenyl)methoxy]-6-methyl-2-oxopyridin-1-yl]-N,4-dimethylbenzamide)、Neflamapimod(VX-745,5-(2,6-dichlorophenyl)-2-(2,4-difluorophenyl)sulfanylpyrimido[1,6-b]pyridazin-6-one)、TAK-715(N-[4-[2-ethyl-4-(3-methylphenyl)-1,3-thiazol-5-yl]pyridin-2-yl]benzamide)、PD 169316(4-[4-(4-fluorophenyl)-2-(4-nitrophenyl)-1H-imidazol-5-yl]pyridine)、TA-02(4-[2-(2-fluorophenyl)-4-(4-fluorophenyl)-1H-imidazol-5-yl]pyridine)、SD 0006(1-[4-[3-(4-chlorophenyl)-4-pyrimidin-4-yl-1H-pyrazol-5-yl]piperidin-1-yl]-2-hydroxyethanone)、Pamapimod(6-(2,4-difluorophenoxy)-2-(1,5-dihydroxypentan-3-ylamino)-8-methylpyrido[2,3-d]pyrimidin-7-one)、BMS-582949(4-[5-(cyclopropylcarbamoyl)-2-methylanilino]-5-methyl-N-propylpyrrolo[2,1-f][1,2,4]triazine-6-carboxamide)、SB239063(4-[4-(4-fluorophenyl)-5-(2-methoxypyrimidin-4-yl)imidazol-1-yl]cyclohexan-1-ol)、Skepinone-L(13-(2,4-difluoroanilino)-5-[(2R)-2,3-dihydroxypropoxy]tricyclo[9.4.0.03,8]pentadeca-1(11),3(8),4,6,12,14-hexaen-2-one)、DBM 1285(N-cyclopropyl-4-[4-(4-fluorophenyl)-2-piperidin-4-yl-1,3-thiazol-5-yl]pyrimidin-2-amine;dihydrochloride)、SB 706504(1-cyano-2-[2-[[8-(2,6-difluorophenyl)-4-(4-fluoro-2-methylphenyl)-7-oxopyrido[2,3-d]pyrimidin-2-yl]amino]ethyl]guanidine)、SCIO 469(2-[6-chloro-5-[(2R,5S)-4-[(4-fluorophenyl)methyl]-2,5-dimethylpiperazine-1-carbonyl]-1-methylindol-3-yl]-N,N-dimethyl-2-oxoacetamide)、Pexmetinib(1-[5-tert-butyl-2-(4-methylphenyl)pyrazol-3-yl]-3-[[5-fluoro-2-[1-(2-hydroxyethyl)indazol-5-yl]oxyphenyl]methyl]urea)、UM-164(2-[[6-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]-2-methylpyrimidin-4-yl]amino]-N-[2-methyl-5-[[3-(trifluoromethyl)benzoyl]amino]phenyl]-1,3-thiazole-5-carboxamide)、p38 MAPK Inhibitor(4-(2,4-difluorophenyl)-8-(2-methylphenyl)-7-oxido-1,7-naphthyridin-7-ium)、p38 MAP Kinase Inhibitor
III(4-[5-(4-fluorophenyl)-2-methylsulfanyl-1H-imidazol-4-yl]-N-(1-phenylethyl)pyridin-2-amine)、p38 MAP Kinase Inhibitor IV(3,4,6-trichloro-2-(2,3,5-trichloro-6-hydroxyphenyl)sulfonylphenol)、CAY105571(4-[5-(4-fluorophenyl)-2-[4-(methylsulfonyl)phenyl]-1H-imidazol-4-yl]-pyridine)及びこれらの誘導体等が挙げられる。
III(4-[5-(4-fluorophenyl)-2-methylsulfanyl-1H-imidazol-4-yl]-N-(1-phenylethyl)pyridin-2-amine)、p38 MAP Kinase Inhibitor IV(3,4,6-trichloro-2-(2,3,5-trichloro-6-hydroxyphenyl)sulfonylphenol)、CAY105571(4-[5-(4-fluorophenyl)-2-[4-(methylsulfonyl)phenyl]-1H-imidazol-4-yl]-pyridine)及びこれらの誘導体等が挙げられる。
JNK阻害剤としては、例えば工程(1)で記載したものと同様の物が挙げられる。本発明で用いるストレスに対する細胞内シグナル伝達機構を阻害する物質は、好ましくはMEK阻害剤、p38阻害剤、及びJNK阻害剤からなる群から選ばれる一つ以上である。p38阻害剤としてSB203580を用いる場合は、通常1nMから1mM、好ましくは10nMから100μM、より好ましくは100nMから10μM、さらに好ましくは500nMから5μMの濃度で、培地中に添加することができる。MEK阻害剤としてPD0325901を用いる場合は、通常1nMから1mM、好ましくは10nMから100μM、より好ましくは100nMから10μM、さらに好ましくは500nMから5μMの濃度で、培地中に添加することができる。JNK阻害剤としてJNK-IN-8を用いる場合は、工程(1)に記載の濃度と同様の濃度で、培地中に添加することができる。他のMEK阻害剤、p38阻害剤、JNK阻害剤を用いる場合は上記阻害剤の添加濃度と同等の阻害活性を有する濃度で添加することが好ましい。
<工程(4)>
工程(4)では、工程(3)で培養した細胞をさらに培養し、鼻腔上皮を構成する細胞を得る。工程(4)の一形態は、Wntシグナル伝達経路阻害物質、FGFシグナル伝達経路作用物質及びBMPシグナル伝達経路阻害物質からなる群より選ばれる少なくとも1つ、好ましくは少なくとも2つの非存在下で細胞を培養する。工程(4)の好ましい一形態は、Wntシグナル伝達経路阻害物質、FGFシグナル伝達経路作用物質及びBMPシグナル伝達経路阻害物質の非存在下で細胞を培養する。工程(4)の一形態は、FGFシグナル伝達経路阻害物質、Shhシグナル伝達経路作用物質、BMPシグナル伝達経路作用物質、Wntシグナル伝達経路作用物質、Notchシグナル伝達経路阻害物質、アクチビン/TGF-βシグナル伝達経路作用物質及びレチノイン酸シグナル伝達経路作用物質からなる群より選ばれる少なくとも1つの存在下で細胞を培養する。工程(4)は、好ましくはWntシグナル伝達経路阻害物質、FGFシグナル伝達経路作用物質及びBMPシグナル伝達経路阻害物質からなる群より選ばれる少なくとも2つの非存在下、かつ、FGFシグナル伝達経路阻害物質、Shhシグナル伝達経路作用物質、BMPシグナル伝達経路作用物質、Wntシグナル伝達経路作用物質、Notchシグナル伝達経路阻害物質、アクチビン/TGF-βシグナル伝達経路作用物質及びレチノイン酸シグナル伝達経路作用物質からなる群より選ばれる少なくとも1つの存在下で細胞を培養する。
工程(4)では、工程(3)で培養した細胞をさらに培養し、鼻腔上皮を構成する細胞を得る。工程(4)の一形態は、Wntシグナル伝達経路阻害物質、FGFシグナル伝達経路作用物質及びBMPシグナル伝達経路阻害物質からなる群より選ばれる少なくとも1つ、好ましくは少なくとも2つの非存在下で細胞を培養する。工程(4)の好ましい一形態は、Wntシグナル伝達経路阻害物質、FGFシグナル伝達経路作用物質及びBMPシグナル伝達経路阻害物質の非存在下で細胞を培養する。工程(4)の一形態は、FGFシグナル伝達経路阻害物質、Shhシグナル伝達経路作用物質、BMPシグナル伝達経路作用物質、Wntシグナル伝達経路作用物質、Notchシグナル伝達経路阻害物質、アクチビン/TGF-βシグナル伝達経路作用物質及びレチノイン酸シグナル伝達経路作用物質からなる群より選ばれる少なくとも1つの存在下で細胞を培養する。工程(4)は、好ましくはWntシグナル伝達経路阻害物質、FGFシグナル伝達経路作用物質及びBMPシグナル伝達経路阻害物質からなる群より選ばれる少なくとも2つの非存在下、かつ、FGFシグナル伝達経路阻害物質、Shhシグナル伝達経路作用物質、BMPシグナル伝達経路作用物質、Wntシグナル伝達経路作用物質、Notchシグナル伝達経路阻害物質、アクチビン/TGF-βシグナル伝達経路作用物質及びレチノイン酸シグナル伝達経路作用物質からなる群より選ばれる少なくとも1つの存在下で細胞を培養する。
工程(3)で細胞を浮遊培養している場合は、工程(4)でも引き続き細胞凝集体を浮遊培養すればよい。工程(3)で細胞を接着培養している場合は、工程(4)でも引き続き細胞を接着培養すればよい。工程(3)で浮遊培養した後、工程(4)で接着培養してもよい。工程(3)で接着培養した後、工程(4)で浮遊培養してもよい。
工程(4)においてWntシグナル伝達経路阻害物質、FGFシグナル伝達経路作用物質及びBMPシグナル伝達経路阻害物質からなる群より選ばれる少なくとも1つの非存在下で浮遊培養を行うためには、工程(3)にて添加され得る上記物質を培養環境中より除く必要がある。その為の操作として、例えば半量培地交換操作、全量培地交換操作が挙げられる。上記の培地交換操作を、1日に複数回、好ましくは1時間以内に複数回(例えば2~3回)行ってもよい。培地交換操作を複数回行う際の最終回、工程(4)以降の培養を行う培地以外は、細胞培養にかかる費用を低減する観点から、例えば生理食塩水、並びに、KSR及び増殖因子等の添加物を含まない培地等を用いてもよい。
Wntシグナル伝達経路阻害物質、FGFシグナル伝達経路作用物質及びBMPシグナル伝達経路阻害物質からなる群より選ばれる少なくとも1つの非存在下で浮遊培養を行うための別の操作として、細胞を別の滅菌済み容器(15mlチューブ、浮遊培養用シャーレ等)に回収し、培地又は生理食塩水等で洗浄したのちに、上記物質のうち少なくとも1つの非存在下の培養環境に移す操作が挙げられる。その際の移設後の培養に用いる培養容器は、工程(3)までで用いていたものと同様の物(96ウェルプレート等)でもよいし、別の容器(浮遊培養用ディッシュ等)でもよい。
工程(4)においてWntシグナル伝達経路阻害物質、FGFシグナル伝達経路作用物質及びBMPシグナル伝達経路阻害物質からなる群より選ばれる少なくとも1つの非存在下での浮遊培養を実施するに当たり、培地交換操作又は細胞凝集体の移設操作の煩雑さを回避する観点から、各ウェル内に細胞凝集体が入ったままの状態でプレート全体の培地を一度に交換することが可能な三次元細胞培養容器を用いることもまた好ましい。
工程(4)において、工程(3)で得られた細胞を、Wntシグナル伝達経路阻害物質、FGFシグナル伝達経路作用物質及びBMPシグナル伝達経路阻害物質からなる群より選ばれる少なくとも1つの非存在下で浮遊培養することで、上気道様組織の形成効率が向上し、鼻腔上皮を構成する細胞の割合が向上した細胞集団を得ることができる。
上気道様組織の形成効率及び鼻腔上皮を構成する細胞の増殖の促進の観点からは、工程(4)の開始時期は、一定程度の非神経上皮細胞の分化が生じた後に実施するのが好ましく、具体的な時期としては、工程(3)の開始からは0.5時間以降60日以内であり、好ましくは24時間以降45日以内であり、より好ましくは3日以降30日以内である。
工程(4)における培養の期間は、適宜設定できる。工程(4)における培養の時間は、通常8時間~200日間程度、好ましくは10時間~180日間程度、より好ましくは12時間~150日間程度、さらに好ましくは14時間~120日間程度、最も好ましくは20日間~100日間程度である。
鼻腔上皮様組織中の細胞の分化傾向の調節の観点から、工程(4)は、FGFシグナル伝達経路阻害物質の存在下で行うこともまた好ましい。FGFシグナル伝達経路阻害物質としてはFGFにより媒介されるシグナル伝達を抑制し得るものである限り特に限定されず、核酸、タンパク質、低分子有機化合物のいずれであってもよい。当該物質として例えば、FGFと直接結合してトラップする物質、FGF受容体のキナーゼ活性を阻害する物質、FGFによって活性化される細胞内シグナル伝達を阻害する物質、FGF刺激によって誘導される遺伝子発現を抑制する物質等が挙げられる。上記のような作用を有する物質としては、例えば抗FGF抗体、GP369(抗FGFR2抗体)、SU5402(3-[4-Methyl-2-[(2-oxo-1H-indol-3-ylidene)methyl]-1H-pyrrol-3-yl]propanoic acid)、BGJ398(3-(2,6-Dichloro-3,5-dimethoxyphenyl)-1-[6-[[4-(4-ethylpiperazin-1-yl)phenyl]amino]pyrimidin-4-yl]-1-methylurea)、PD173074(1-(Tert-Butyl)-3-(2-((4-(diethylamino)butyl)amino)-6-(3,5-dimethoxyphenyl)pyrido[2,3-d]pyrimidin-7-yl)urea)、AZD4547(rel-N-[5-[2-(3,5-Dimethoxyphenyl)ethyl]-1H-pyrazol-3-yl]-4-[(3R,5S)-3,5-dimethyl-1-piperazinyl]benzamide)、Erdafitinib(N-(3,5-dimethoxyphenyl)-N-(1-methylethyl)-N-[3-(1-methyl-1H-pyrazol-4-yl)quinoxalin-6-yl]ethane-1,2-diamine)、BYL719((2S)-N1-[4-Methyl-5-[2-(2,2,2-trifluoro-1,1-dimethylethyl)-4-pyridinyl]-2-thiazolyl]-1,2-pyrrolidinedicarboxamide)、GSK2636771(2-Methyl-1-[[2-Methyl-3-(trifluoroMethyl)phenyl]Methyl]-6-(4-Morpholinyl)-1H-benziMidazole-4-carboxylic acid)、Taselisib(2-Methyl-2-[4-[2-(5-Methyl-2-propan-2-yl-1,2,4-triazol-3-yl)-5,6-dihydroiMidazo[1,2-d][1,4]benzoxazepin-9-yl]pyrazol-1-yl]propanaMide)、Capivasertib(4-Amino-N-[(1S)-1-(4-chlorophenyl)-3-hydroxypropyl]-1-(7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-yl)-4-piperidinecarboxamide)、Sapanisertib(2-(((1R,4R)-4-((((4-chlorophenyl)(phenyl)carbamoyl)oxy)methyl)cyclohexyl)methoxy)acetic acid)、Dabrafenib(N-[3-[5-(2-Amino-4-pyrimidinyl)-2-(tert-butyl)-4-thiazolyl]-2-fluorophenyl]-2,6-difluorobenzenesulfonamide)、Binimetinib(5-[(4-Bromo-2-fluorophenyl)amino]-4-fluoro-N-(2-hydroxyethoxy)-1-methyl-1H-benzimidazole-6-carboxamide)、Trametinib(N-[3-[3-Cyclopropyl-5-[(2-fluoro-4-iodophenyl)amino]-3,4,6,7-tetrahydro-6,8-dimethyl-2,4,7-trioxopyrido[4,3-d]pyrimidin-1(2H)-yl]phenyl]acetamide)及びこれらの誘導体等が挙げられる。
FGFシグナル伝達経路阻害物質の濃度は、鼻腔上皮を構成する細胞を効率よく製造できる範囲で適宜設定することができる。FGFシグナル伝達経路阻害物質としてSU5402を用いる場合には、工程(4)におけるFGFシグナル伝達経路阻害物質の濃度は、通常1nMから100mM、好ましくは10nM~10mM、より好ましくは100nM~1mMである。FGFシグナル伝達経路阻害物質としてPD173074を用いる場合には、工程(4)におけるFGFシグナル伝達経路阻害物質の濃度は、1nMから100mM、好ましくは10nM~10mM、より好ましくは100nM~1mMである。上記以外のFGFシグナル伝達経路阻害物質を用いる場合には、上記濃度のSU5402と同等のFGFシグナル伝達経路阻害活性を示す濃度で用いられることが好ましい。
鼻腔上皮様組織中の細胞の分化傾向の調節の観点から、工程(4)は、BMPシグナル伝達経路作用物質の存在下で行うこともまた好ましい。工程(4)で用いるBMPシグナル伝達経路作用物質は、工程(2)で用いた物質と同一であっても異なっていてもよいが、好ましくは同一である。
鼻腔上皮様組織中の細胞の分化傾向の調節の観点から、工程(4)は、さらにShhシグナル伝達経路作用物質、Wntシグナル伝達経路作用物質、Notchシグナル伝達経路阻害物質、アクチビン/TGF-βシグナル伝達経路作用物質及びレチノイン酸シグナル伝達経路作用物質からなる群より選ばれる少なくとも1つの存在下で行なうこともまた好ましい。工程(4)で用いる上記物質は、工程(a)~工程(3)で用いた物質と異なっていてもよいが、好ましくは同一である。添加物の濃度及び種類については、適宜調整することができる。
工程(4)の別の一態様として、工程(3)では細胞凝集体中に嗅神経前駆細胞が分化するまで浮遊培養し、工程(4)ではさらに培養を継続し、嗅神経前駆細胞が存在する上皮と連続する同一の上皮上に鼻腔上皮を構成する細胞を得ることができる。より好ましくは、工程(3)までを実施し、細胞凝集体中の非神経上皮組織中に嗅神経細胞及び嗅上皮組織が形成された細胞凝集体を、工程(4)としてさらなる培養を実施することで、非神経上皮組織中に鼻腔上皮を構成する細胞を形成させることができる。その際の培地としては、Wntシグナル伝達経路阻害物質、FGFシグナル伝達経路作用物質及びBMPシグナル伝達経路阻害物質を含有しない培地を用いてもよいし、工程(3)と同じ培地を用いてもよい。
細胞集団への病原体の接触及び疾患モデルの形成を企図する場合は、工程(3)の後に細胞集団への病原体の接触を行ってもよい。細胞集団と病原体との接触は、Wntシグナル伝達経路阻害物質、FGFシグナル伝達経路作用物質及びBMPシグナル伝達経路阻害物質からなる群より選ばれる少なくとも1つを含まない培地中で行ってもよいし、工程(3)と同じ培地中で行なってもよい。
工程(4)に用いられる培地は、特に限定されないが、工程(1)から工程(3)で用いた培地と同じ培地を用いることができる。神経細胞等の培養に用いる既知の培地、例えばDMEM/F-12培地とNeurobasal培地の1:1混合液に0.5% N2 Supplementと1% B27 supplementが添加された培地(N2B27培地)、Knockout DMEM/F-12培地にStemPro NSC SFM Supplementが添加された培地(StemPro NSC SFM培地)、中枢神経系オルガノイド用の培地(STEMdiff Cerebral Organoid Maturation Kit)、上皮細胞培養用の培地(PneumoCult ALI medium、CnT-Prime、Epithelial Culture Medium)等を用いることもできる。
工程(4)において、上記工程の何れかの工程において用いた添加物、例えばTGFβシグナル伝達経路阻害物質、EGFシグナル伝達経路作用物質、酸化ストレスを軽減する作用を有する物質、ストレス応答シグナル伝達経路に対する阻害物質等を引き続き添加することもまた好ましい。工程(4)で添加するこれらの物質は、それぞれ上記工程の何れかの工程において用いられた物質と同一であっても異なっていてもよいが、好ましくは同一である。添加物の濃度及び種類については、適宜調整することができる。
上皮組織の成熟促進の観点からは、工程(4)において、好ましくは血清がさらに存在する。血清としては特に限定されないが、細胞培養において通常用いられる血清を用いることができる。培地中の血清の濃度は、上述の効果を達成可能な範囲であれば特に限定されないが、例えば約1%~20%であり、好ましくは約3%~約15%である。
異種成分及び未決定因子の混入を回避する観点からは、工程(1)~工程(4)からなる群より選ばれる少なくとも1つの工程をマウス肉腫由来基底膜標品(マトリゲル)の非存在下で行うことが好ましい。上皮組織の成長促進の観点からは、工程(3)及び工程(4)は、マトリゲルの存在下で行ってもよい。培地中の基底膜標品の濃度は、マトリゲルを用いた場合には好ましくは0.5%以上4%以下であり、実験操作の点からより好ましくは0.5%以上1.5%以下である。
生体の組織間の相互作用モデル又はアセンブロイドの形成を企図して、鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞を含む細胞凝集体は、他の細胞凝集体又は組織と同時に培養してもよい。これにより、二つ以上の細胞塊を含む細胞集団、又は細胞塊及び組織を含む細胞集団が形成され得る。同時に培養される対象は、生体由来の組織であってもよいし、培養細胞又は幹細胞由来の細胞凝集体であってもよい。同時に培養される対象は、好ましくは幹細胞由来の細胞凝集体であり、さらに好ましくは生体内の組織を一定程度再現した構造を有するオルガノイドである。同時に培養される組織は、いずれの動物種に由来するものであってもよいが、好ましくはヒトに由来する組織である。同時に培養される組織は、生体のいずれの組織であってもよいが、好ましくは中枢神経系の組織であり、より好ましくは嗅覚野(嗅球及び嗅皮質)を含む中枢神経系の組織である。別の一態様として、同時に培養する組織は、好ましくは嗅上皮及び鼻腔上皮以外の呼吸器系の組織であり、咽喉、気管、気管支及び肺のいずれかを含む呼吸器系の組織であってよい。別の一態様として、同時に培養する組織は、好ましくは鼻腔上皮又は嗅上皮に感染する病原体又はウイルスに対して感染感受性を有する組織であり、中枢神経系、血管、腎臓、肝臓、小腸又は大腸であってよい。同時に培養される細胞凝集体は、上記組織を構成する細胞を含むことが好ましい。同時に培養される対象は、上記組織を構成する細胞又はその細胞を含む細胞集団であってもよい。
同時培養の方法としては、細胞凝集体同士又は細胞凝集体と組織との接着が生じ得るコンパートメント内に本発明に係る製造方法によって製造された細胞凝集体と他の細胞凝集体又は組織を投入する方法、細胞凝集体同士又は細胞凝集体と組織とをゲル等の材料で接触した状態で固定する方法、細胞凝集体同士又は細胞凝集体と組織とをカバーグラス等で押さえつけた状態で培養する方法、及び、異なる種類の細胞凝集体を各々単細胞まで分散後、同一コンパートメント内で再凝集させる方法等が挙げられるが、特に限定はされない。Stem Cell Reports 2017,9,1441-1449.に記載の方法等を用いて本発明に係る製造方法により製造された細胞凝集体と中枢神経系の組織を同時に培養することで、嗅神経の投射を再現することもできる。
[3.鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞を含む細胞集団]
本明細書において、「細胞」及び「組織」という表記は、それぞれ生体内に存在する対応する細胞及び組織と同様のマーカーによる免疫染色、形状観察その他特定の方法によってその存在を確認することができるが、「細胞」及び「組織」の機能、遺伝子発現、構造等は生体内に存在する細胞及び組織と必ずしも同一であるとは限らない。
本明細書において、「細胞」及び「組織」という表記は、それぞれ生体内に存在する対応する細胞及び組織と同様のマーカーによる免疫染色、形状観察その他特定の方法によってその存在を確認することができるが、「細胞」及び「組織」の機能、遺伝子発現、構造等は生体内に存在する細胞及び組織と必ずしも同一であるとは限らない。
本発明の一実施形態は、鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞を含む細胞集団を提供する。細胞は好ましくは三次元培養細胞集団である。三次元培養細胞集団は、2以上の細胞が集合し、立体的な構造を形成している。細胞集団は、人工的に形成された細胞の集団であり、一定の細胞種、細胞数、形状及び構成を有する。本発明の細胞集団を構成する細胞数は特に限定されないが、好ましくは30個以上、より好ましくは500個以上である。上記細胞集団を構成する細胞数の上限は、特に限定されないが例えば、1×107個以下であってもよいし、5×106個以下であってもよい。本発明の細胞集団の形状は特に限定されず、球状、楕円状、シート状、一部がひだ状に折りたたまれたシート状、一部が収縮したシート状、中身が空洞(袋状)であってもよい。本発明の細胞集団は、好ましくは上記の鼻腔上皮を構成する細胞の製造方法により製造された細胞を含むことができる。
以下、本発明に係る細胞集団を、図1、図2及び図3を適宜用いて説明する。本発明に係る細胞集団の一形態を図1のA~Jおよび図41に示す。図1のAの細胞集団は、非神経上皮組織と神経組織とを含む。図1に示す細胞集団は三次元的に形成され、通常培養器材に接着していない。神経組織は、好ましくは球状に形成される。神経組織の少なくとも一部は非神経上皮組織に覆われていてよい。非神経上皮組織は、鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞を含む鼻腔上皮様組織(図中、四角の点線で囲まれた部分)を含む。神経組織の表面は、好ましくは3割以上(図1のB)、より好ましくは6割以上、さらに好ましくは8割以上、最も好ましくは全体が非神経上皮組織に覆われている。非神経上皮組織と神経組織の間の少なくとも一部に間隙が形成されていてもよい(図1のC)。非神経上皮組織は、菲薄化していてもよい(図1のC)。非神経上皮組織の一部が収縮した構造が形成されていてもよい(図1のD)。表面の非神経上皮組織に隆起が存在していてもよく、隆起部分は袋状となっていてもよい(図1のE)。また、隆起は折り畳まれたひだ状であってもよい。非神経上皮組織は、鼻腔上皮様組織に加えて嗅上皮様組織を含んでいてもよい(図1のF)。神経組織の一部が非神経上皮組織に被覆されており、非神経上皮組織の一部が嗅上皮様組織であってもよい(図1のG)。非神経上皮組織は、同一の上皮組織上に複数の嗅上皮様組織と鼻腔上皮様組織とを有してもよい。細胞集団は、上述の特徴を組み合わせて有していてもよい。
細胞集団の他の一形態として、神経組織は非神経上皮組織に被覆されていないが、神経組織と非神経上皮組織とが接した又は連結した形態を呈する(図1のH、I)。複数の神経組織と複数の非神経上皮組織が集合していてもよい。非神経上皮組織は、折れ曲がって入り組んだ隆起を生じていてもよく(図1のH)、薄い(例えば非神経上皮組織の直径の五分の一以下の厚さ)上皮により構成される膨らんだ風船状(袋状)の形態を呈してもよい(図1のI)。
細胞集団の他の一形態として、神経組織と非神経上皮組織とが分離している(図1のJ)。鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞を含む細胞集団は、分離した非神経上皮組織を指してもよい。神経組織は、例えば少なくとも8割の細胞が神経系細胞からなり、非神経上皮組織は、例えば少なくとも8割の細胞が非神経細胞からなる。非神経上皮組織は、上述の様に上皮が折れ曲がって入り組んだ隆起を生じているか、風船状の形態を呈してもよい。
細胞集団の他の一形態として、嗅上皮様組織の一部が細胞塊の内部へと陥入し、嗅窩様の構造を形成していてもよい(図41AおよびB)。嗅窩様の構造を形成する嗅上皮様組織は、好ましくは嗅神経細胞を含んでいてもよい。嗅窩様の構造を形成する嗅上皮様組織は、好ましくは非神経上皮組織、より好ましくは鼻腔上皮組織と連続した同一の上皮上に形成されていてもよい。嗅窩様の構造を形成する嗅上皮様組織と非神経上皮組織、より好ましくは鼻腔上皮組織との接合部において、嗅上皮周縁部様構造が形成されていてもよい。
細胞集団は、平面状の培養細胞集団であってもよい。細胞集団の他の一形態は、培養器材上に平面的に形成され、神経組織と非神経上皮組織とを含む。細胞集団の外縁部に非神経上皮組織、内側に神経組織が形成されている(図2のA)。神経組織及び非神経上皮組織は、それぞれ1層の細胞から形成されてもよいし、多層(例えば2層~6層)の細胞から形成されてもよい。細胞集団の形状は、培養器材上に展開可能である限りいずれの形態を呈してもよい。好ましくは、細胞集団と培養器材との間に基底膜構造が形成される。本実施形態の他の側面において、上記細胞集団は、鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞が培養器材に接着しており、連続した上皮構造により二次元的な鼻腔上皮様組織(以下、「二次元オルガノイド」と表記する場合がある。)を形成していると把握することもできる。
細胞集団の他の一形態は、マイクロ流体チップ上に平面的に形成され、神経組織と非神経上皮組織とを含む(図2のB)。マイクロ流体チップは流路を有し、培地の灌流がなされている。マイクロ流体チップは、本発明に係る細胞集団以外の細胞又は組織を含有するチップと流路により接続されていてもよい(図2のC)。接続されるチップに含有される細胞又は組織としては、例えば咽喉、気管、気管支、及び肺等の呼吸器系の組織、脳を含む中枢神経系、肝臓、血管、腎臓、口腔上皮、胃、小腸、大腸、並びに、生殖器等を構成する細胞又は組織等が挙げられるが、これらに限定されない。接続されるチップに含有される細胞又は組織は、好ましくはヒトの細胞であるが、動物からヒトへの感染症の伝播を再現する等の目的でヒト以外の細胞又は組織を含有するチップと接続してもよい。
細胞集団の他の一形態は、マイクロパターンを施した培養器材上に平面的に形成され、神経組織と非神経上皮組織とを含む(図2のD)。培養器材上のマイクロパターンは細胞接着性領域と細胞非接着性領域とから構成され、細胞集団は細胞接着性領域に形成される。
細胞集団の他の一形態は、物質透過性を有する多孔質膜上に平面的に形成され、神経組織と非神経上皮組織とを含む(図2のE)。多孔質膜は培養液中にあるか、又は接している。本発明に係る細胞集団の上部は培養液に覆われているか、又は気相に接してもよい。多孔質膜で隔てた一方で本発明に係る細胞が培養され、他方でそれ以外の細胞又は組織、フィーダー細胞等が培養される。
細胞集団の他の一形態は、二つ以上の細胞塊の集合体であって、少なくとも1つの細胞塊が鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞を含む(図3のA)。少なくとも1つの細胞塊は、鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞、及び嗅上皮を構成する細胞又はその前駆細胞を含んでもよく、図1に例示された細胞集団であってよい。細胞塊の集合体において、鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞を含む細胞塊以外の細胞塊は、他の組織を構成する細胞を含む細胞塊であってよい。他の組織は、神経組織であってよく、好ましくは中枢神経系の細胞を含み、より好ましくは嗅覚野(嗅球及び嗅皮質を含む。)を含む中枢神経系を構成する細胞を含む。鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞を含む細胞塊と、他の組織を含む細胞塊とは、好ましくは細胞間接着又は神経細胞間のシナプス結合等で機能的に連結されている。細胞集団の他の一形態として、他の組織を含む細胞塊は、嗅上皮及び鼻腔上皮以外の呼吸器系の細胞又は組織を含む(図3のB)。細胞塊の集合体は、細胞塊同士の接着を促進するためのコンパートメント内に設置されているか、又はゲルに包埋されていることが好ましい。
細胞集団の他の一形態は、細胞塊と他の組織を構成する細胞との集合体であってよい(図3のC)。細胞塊は、鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞を含み、さらに嗅上皮を構成する細胞又はその前駆細胞を含んでもよく、図1に例示された細胞集団であってよい。他の組織を構成する細胞としては、特に限定されないが、中枢神経系の細胞を含んでよく、嗅覚野を含む中枢神経系を構成する細胞を含んでよく、嗅上皮及び鼻腔上皮以外の呼吸器系の細胞を含んでよい。細胞塊と他の細胞とは、細胞間接着又はシナプス結合等で連結されていてもよい。
<非神経上皮組織>
本発明の細胞集団は、非神経上皮組織を含む。本明細書において、非神経上皮組織は、上皮構造を有する組織であって、神経上皮組織を含まないものをいう。上皮構造とは細胞同士が細胞間結合によりつながれており、層を形成している構造をいう。層は単層であってもよいし、多層であってもよい。また、上皮構造の一部が多層であってもよい。本発明の細胞集団において、非神経上皮組織は、好ましくは5割以上9割以下、より好ましくは8割以上10割以下、最も好ましくは全体(10割)が上皮構造を有する。
本発明の細胞集団は、非神経上皮組織を含む。本明細書において、非神経上皮組織は、上皮構造を有する組織であって、神経上皮組織を含まないものをいう。上皮構造とは細胞同士が細胞間結合によりつながれており、層を形成している構造をいう。層は単層であってもよいし、多層であってもよい。また、上皮構造の一部が多層であってもよい。本発明の細胞集団において、非神経上皮組織は、好ましくは5割以上9割以下、より好ましくは8割以上10割以下、最も好ましくは全体(10割)が上皮構造を有する。
非神経上皮組織は、鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞を含む。鼻腔上皮を構成する細胞として、分泌細胞、線毛細胞、クラブ細胞、基底細胞、塩類細胞、神経内分泌細胞、孤立化学感覚上皮細胞等が挙げられる。鼻腔上皮を構成する細胞は、これらの細胞を少なくとも1種、好ましくは複数種の細胞を含む。
鼻腔上皮は主として外胚葉性の非神経上皮に由来するため、鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞は、好ましくは外胚葉マーカーを発現する。鼻腔上皮を構成する細胞の前駆細胞とは、成熟すると鼻腔上皮を構成する細胞になる細胞を指し、鼻腔上皮を構成する細胞への分化能を有する細胞も含む。
鼻腔上皮を構成する細胞は、好ましくは分泌細胞を含む。分泌細胞又はその前駆細胞はムチン1、ムチン2、ムチン3、ムチン4、ムチン5AC、ムチン5B、FoxA1、FoxA2、Nkx2.1/TTF-1及びSPDEFからなる群から選ばれる少なくとも1つを発現し、好ましくはFoxA1、FoxA2、Nkx2.1/TTF-1及びSPDEFを発現している細胞と定義することができる。
鼻腔上皮を構成する細胞は、好ましくは線毛細胞を含む。線毛細胞は細胞表面に線毛構造を有する。線毛細胞又はその前駆細胞は、好ましくはFoxJ1、FoxN4、p73、アセチル化チューブリン及びβ4チューブリンからなる群から選ばれる少なくとも1つを発現している細胞及び/又は細胞表面に線毛を有する細胞と定義することができる。
鼻腔上皮を構成する細胞は、好ましくはクラブ細胞を含む。クラブ細胞又はその前駆細胞は、SCGB1A1、SCGB3A2、Cyp2f2、uroplakin3a、Cldn10、Aox3、Pon1及びCckarからなる群から選ばれる少なくとも1つを発現している細胞と定義することができる。クラブ細胞は、サイトケラチン4及びサイトケラチン13から選ばれる少なくとも1つを発現しているHillock細胞を含んでいてもよい。
鼻腔上皮を構成する細胞は、好ましくは基底細胞を含む。基底細胞は、非神経上皮組織の基底面に位置し、好ましくは基底膜構造上に整列する。基底細胞又はその前駆細胞は、好ましくはサイトケラチン5、サイトケラチン14、サイトケラチン15、p63、ΔNp63及びp75からなる群から選ばれる少なくとも1つを発現している細胞と定義することができる。
鼻腔上皮を構成する細胞は、好ましくは塩類細胞を含む。塩類細胞又はその前駆細胞は、CFTRを発現し、好ましくはFoxi1、液胞型プロトンATPase(vacuolar H+-ATPase、V-ATPase)、Ascl3、Tfcp2l1及びDMRT2からなる群から選ばれる少なくとも1つを発現している細胞と定義することができる。
鼻腔上皮を構成する細胞は、好ましくは神経内分泌細胞を含む。神経内分泌細胞又はその前駆細胞は、Ascl1、NeuroD1、Chromogranin A、Synaptophisin、神経特異エノラーゼ(NSE)からなる群から選ばれる少なくとも1つを発現している細胞と定義することができる。
鼻腔上皮を構成する細胞は、好ましくは孤立化学感覚上皮細胞を含む。孤立化学感覚上皮細胞又はその前駆細胞は、ChAT/Trpm5、Pou2f3/Skn-1a、Tas2r、Gnat3、Plcb2からなる群から選ばれる少なくとも1つを発現している細胞と定義することができる。
細胞集団の鼻腔上皮様組織の拡大図を図4に示す。鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞は、神経組織と接する非神経上皮組織(図4のA)、神経組織と接していない非神経上皮組織(図4のB)、収縮した非神経上皮組織(図4のC)、菲薄化した非神経上皮組織(図4のD)のいずれにも存在し得る。鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞は、好ましくは細胞種ごとに集合している。例えば、鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞は、細胞種ごとに2以上の細胞が連続していることが好ましい。
非神経上皮組織は、細胞外マトリクスを含んでいてもよい。非神経上皮組織は、好ましくは基底膜構造をさらに含む。基底膜構造は、好ましくは非神経上皮組織と神経組織との間に形成される(図1のA)。基底膜構造は、培養器材と細胞集団、特に培養器材と非神経上皮組織との間に形成されてもよい(図2)。好ましくは基底膜構造上に、非神経上皮組織に含まれる細胞が接着している。基底膜構造とは、細胞外マトリクスより構成される薄い膜状の構造を指し、ラミニンの免疫染色によって判断することができる。基底膜構造は、好ましくは生体内の基底膜と同様に非神経上皮組織の構造の維持、非神経上皮組織と神経組織又は培養器材との機械的な分離、物質の選択的透過等に寄与する。基底膜構造の形成に伴い、非神経上皮組織が頂端面と基底面との極性を有していることもまた好ましい。細胞集団が三次元的な構造(例えば球状)を有する場合には、細胞集団の外側(表面側)が頂端面であり、内側が基底面であることが好ましい。細胞集団が平面状である場合には、培養器材側が基底面であり、培養器材とは反対側(表面側)が頂端面であることが好ましい。非神経上皮組織は、好ましくは基底側に基底細胞を含む(図4のE)。
鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞は、好ましくは感染症に関連する因子、例えばウイルス受容体、ウイルス感染関連因子、パターン認識受容体を発現している(図4のF)。ウイルス受容体、ウイルス感染関連因子としては、後述する鼻腔上皮に感染するウイルスの受容体又はウイルス感染関連因子であってよく、例えばACE2、シアル酸α2,6Gal、シアル酸α2,3Gal等が含まれる。
鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞は、ウイルス感染関連因子あるいは疾患関連遺伝子が欠損又は変異していてもよい。このような細胞を含む細胞集団は、例えば後述する再生医療用途の移植用細胞、疾患モデル、化合物スクリーニング等に利用できる。ウイルス感染関連因子は、例えばウイルス受容体を含み、ACE2を含む。ウイルス感染関連因子を欠損又は変異させることにより、ウイルス感染に対する抵抗性を有することが期待される。
疾患関連遺伝子は、例えば遺伝性疾患又は感染症に関連する遺伝子である。遺伝子が欠損又は変異した鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞は、遺伝病の患者から樹立又はゲノム編集を施した多能性幹細胞から分化させて得ることができる。疾患としては、例えば嚢胞性線維症、線毛機能不全症候群、カルタゲナー症候群、ムコ多糖症、喘息が挙げられる。別の態様の疾患関連遺伝子は、鼻腔又は上気道の癌及び腫瘍発生に関わる遺伝子である。このような疾患関連遺伝子としては、例えばABL1、BRAF、DDR、EGFR、EPHA2、ERBB2、ERBB4、FGFR1、FGFR2、FLT1、FLT4、FRK、KDR、KIT、MAPK11、PDGFRA、PDGFRB、RAF1、RET、TEK、TRNAK2、VEGFA、VEGFB、VEGFC、TP53、CDKN2A、PIK3CA、PTEN、KMT2D、FBXW7、SMARCB1、PREX2、ARID1A、FANCA、IDH2、PRKDC、HRAS、NOTCH2、NOTCH1、NF1、TSC2、EPHA7、CDKN2B、ATRX、ARID2、AKT3、BRCA2、BCL6、ASXL1、AR、及びALK等が挙げられるが、これらに限定されない。鼻腔又は上気道組織の正常部及び病変部から細胞を採取し、iPS細胞を樹立し、本願に記載の鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞を調製することもできる。
細胞集団は、鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞に加えて嗅上皮様組織を含んでいてもよい。嗅上皮様組織は、非神経上皮組織に含まれ、好ましくは神経組織の表面の少なくとも一部を被覆する。嗅上皮様組織は、嗅上皮又はその前駆組織(嗅上皮プラコード)で発現するSix1、Sp8、Sox2、Sox3、Dlx5、Emx2、Pax6、Otx2、PDGFRβ、サイトケラチン、EpCAM、E-Cadherin及びN-Cadherinからなる群より選ばれる少なくとも1つを発現している領域を指し、Otx2、Sp8、Sox2、EpCAM、E-Cadherin及びサイトケラチンを発現していることが好ましい。嗅上皮様組織は、上皮組織が非神経上皮組織の外側に肥厚していてもよい。
細胞集団は、嗅神経細胞又はその前駆細胞を含んでいてもよい。嗅神経細胞又はその前駆細胞は、好ましくは嗅上皮様組織に含まれる。嗅神経細胞又はその前駆細胞は、神経系細胞のマーカーであるTuj1、NCAM、N-Cadherin、Calretininからなる群より選ばれる少なくとも1つと、嗅神経細胞又はその前駆細胞で特異的に発現する転写因子であるEbf1、Ebf2、Ebf3、NeuroD、Lhx2、Ascl1からなる群より選ばれる少なくとも1つとを発現している細胞と定義することができる。嗅上皮様組織に含まれる嗅神経細胞は、好ましくは嗅覚受容体を発現しており、より好ましくは生体内の嗅上皮に局在する嗅神経細胞と同様に嗅覚情報を受容し、中枢神経系へ情報を伝達することができる。嗅神経細胞の前駆細胞とは、成熟すると嗅神経細胞となる細胞を指し、嗅神経細胞への分化能を有する細胞も含む。嗅神経細胞の前駆細胞は、好ましくは嗅上皮プラコードに存在する神経細胞と同様の性質を示す。
嗅上皮様組織は、嗅上皮を構成する細胞又はその前駆細胞をさらに含んでよく、支持細胞、基底細胞及びボーマン腺細胞、並びにこれらの前駆細胞からなる群より選ばれる少なくとも2種の細胞をさらに含むことが好ましく、基底細胞又はその前駆細胞を含むことがより好ましい。支持細胞又はその前駆細胞は、HIF2α、Sox2、Hes1、Hes5及びSix1からなる群より選ばれる少なくとも1つを発現している細胞を指す。基底細胞又はその前駆細胞は、p63、Wt1及びLgr5からなる群より選ばれる少なくとも1つを発現している細胞を指す。ボーマン腺細胞又はその前駆細胞は、サイトケラチン及びAscl3からなる群より選ばれる少なくとも1つを発現している細胞を指す。嗅上皮様組織は、嗅神経鞘細胞又はその前駆細胞をさらに含んでいることが好ましい。嗅神経鞘細胞又はその前駆細胞はS100、Sox10及びビメンチンからなる群より選ばれる少なくとも1つを発現している細胞を指す。嗅神経鞘細胞又はその前駆細胞のマーカーとして、例えばBrain Structure and Function 222.4(2017):1877-1895.に記載のマーカーを用いることもできる。支持細胞、基底細胞、ボーマン腺細胞もしくは嗅神経鞘細胞又はこれらの前駆細胞は、好ましくは生体内の嗅上皮又は嗅上皮プラコードに存在する支持細胞、基底細胞、ボーマン腺細胞もしくは嗅神経鞘細胞又はこれらの前駆細胞と同様の性質を示す。
非神経上皮組織において、鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞が存在する鼻腔上皮様組織と嗅上皮様組織とは、連続する上皮上に形成されていることもまた好ましい。鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞が存在する領域と嗅上皮様組織との間に嗅上皮周縁部が形成されていることもまた好ましい(図1のF及びG)。嗅上皮周縁部は、Pbx、Meis1、Pax6、βIVtubulinからなる群より選ばれる少なくとも1つ、好ましくはPax6及びPbxを発現している細胞が局在している領域を指す。
<神経組織>
細胞集団の一実施形態は、神経系細胞又はその前駆細胞を含み、好ましくは中枢神経系を構成する神経系細胞又はその前駆細胞を含む。細胞集団の一実施形態は、神経系細胞又はその前駆細胞を含む神経組織を含む。神経組織は、好ましくは中枢神経系を構成する神経系細胞又はその前駆細胞を含む。中枢神経系を構成する神経系細胞又はその前駆細胞は、Pax6、Bf1、Sp8、Sox1、Sox2、Emx2、Tuj1、N-Cadherinからなる群より選ばれる少なくとも1つを発現し、かつサイトケラチンを発現していない細胞と定義することができる。中枢神経系を構成する神経系細胞又はその前駆細胞は、Pax6、Sox2及びTuj1を発現していることが好ましい。中枢神経系を構成する神経系細胞又はその前駆細胞は、好ましくは生体内の中枢神経系における神経細胞、グリア細胞、神経幹細胞等又はこれらの前駆細胞と同様の性質を示す。
細胞集団の一実施形態は、神経系細胞又はその前駆細胞を含み、好ましくは中枢神経系を構成する神経系細胞又はその前駆細胞を含む。細胞集団の一実施形態は、神経系細胞又はその前駆細胞を含む神経組織を含む。神経組織は、好ましくは中枢神経系を構成する神経系細胞又はその前駆細胞を含む。中枢神経系を構成する神経系細胞又はその前駆細胞は、Pax6、Bf1、Sp8、Sox1、Sox2、Emx2、Tuj1、N-Cadherinからなる群より選ばれる少なくとも1つを発現し、かつサイトケラチンを発現していない細胞と定義することができる。中枢神経系を構成する神経系細胞又はその前駆細胞は、Pax6、Sox2及びTuj1を発現していることが好ましい。中枢神経系を構成する神経系細胞又はその前駆細胞は、好ましくは生体内の中枢神経系における神経細胞、グリア細胞、神経幹細胞等又はこれらの前駆細胞と同様の性質を示す。
神経組織は、少なくとも一部が非神経上皮組織に覆われていてもよい。神経組織は、上皮構造を形成していてもよい。上皮構造は、神経組織の一部に形成されていてもよいし、全体に形成されていてもよい。非神経上皮組織と神経組織との間の少なくとも一部に間隙が形成されていてもよい。
神経系細胞又はその前駆細胞は、好ましくは網膜を構成する神経系細胞又はその前駆細胞を含む。網膜を構成する神経系細胞又はその前駆細胞は、Rax、Six3、Chx10、Pax6、Lhx2、Aldh1a3からなる群より選ばれる少なくとも1つを発現している細胞と定義することができる。網膜を構成する神経系細胞又はその前駆細胞は、Rax及びChx10を発現していることが好ましい。網膜を構成する神経系細胞又はその前駆細胞は、好ましくは生体内の網膜細胞、網膜前駆細胞、網膜特異的神経細胞等又はこれらの前駆細胞と同様の性質を示す。
中枢神経系は大脳を含むことが好ましい。大脳(大脳を構成している細胞を含む)は、Emxファミリー遺伝子、Otx2、Bf1及びPax6からなる群より選ばれる少なくとも1つを発現している組織を指す。また、大脳は層構造を有していることが好ましい。大脳は、嗅皮質を含むことが好ましい。嗅皮質は、Tbr1、Ctip2及びFoxP2からなる群より選ばれる少なくとも1つを発現している組織を指す。大脳は、大脳基底核又はその原基を含むことが好ましい。大脳基底核又はその原基はDlxファミリー遺伝子、Gsh2、Nkx2.1及びIslet1からなる群より選ばれる少なくとも1つを発現している組織を指す。大脳基底核又はその原基は外側基底核原基であることが好ましい。外側基底核原基はEr81及びIslet1からなる群より選ばれる少なくとも1つを発現している組織を指す。大脳は、嗅球又はその前駆組織を含むことが好ましい。嗅球又はその前駆組織はArx、Tbr1及びTbx21からなる群より選ばれる少なくとも1つを発現している組織を指す。
細胞集団は、性腺刺激ホルモン放出ホルモン陽性神経細胞を含んでいてもよい。性腺刺激ホルモン放出ホルモン陽性神経細胞は、性腺刺激ホルモン放出ホルモン(GnRH)を発現している細胞及びその前駆細胞を指す。
生体の鼻腔組織と異なり、本発明の細胞集団には通常骨組織は形成されないが、細胞集団中に骨組織を含んでいてもよい。骨組織、骨細胞又はその前駆細胞は、Runx2、Osterix及びATFからなる群より選ばれる少なくとも1つを発現していることが好ましい。形成された細胞集団中に骨組織が形成されているか否かは、当業者に周知の方法、例えばアリザリンレッド染色、アルカリホスファターゼ染色、又は上記骨組織特異的遺伝子に対する免疫染色等の手法により判別できる。
製造された細胞集団中に含まれる細胞及び組織を検出する手法については特に限定されないが、信頼性と再現性が高く簡便に実施できる手法が好ましい。一例として顕微鏡による光学的な観察、各細胞又は組織マーカーに対する抗体を用いた免疫染色、マーカー遺伝子に対するリアルタイムPCR法等の遺伝子発現解析、シングルセルRNA-Seq解析、電子顕微鏡による細胞種特異的な微細構造物の観察、マウス、ラット等への移植等が挙げられ、好ましくは上記記載のマーカーに対する抗体を用いた免疫染色又はシングルセルRNA-Seq解析である。
免疫染色の結果の解釈は、当業者の目視による判別、又は撮影した画像に対する画像解析ソフト等を用いた定量的な解析等、当業者に周知の方法により行うことができる。免疫染色の結果の解釈に当たっては、例えば蛋白質核酸酵素Vol.54 No.2(2009)P185-192等を参照し、自家蛍光、二次抗体の非特異的吸着、多重染色時の蛍光の漏れこみ等により生じる偽陽性を排除せねばならない。
シングルセルRNA-Seq解析の結果は、例えば得られた細胞集団の発現プロファイルを公知のデーターベース等の生体の組織のプロファイルと比較し、その遺伝子発現、構成する細胞集団の類似性から製造された細胞集団中に含まれる細胞及び組織を推定することができる。
[4.鼻腔上皮疾患モデルとしての使用方法]
本発明の一実施形態は、上述の「鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞を含む細胞集団」を用いた鼻腔上皮のインビトロ疾患モデルを提供する。より具体的には、鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞を含む細胞集団は、ウイルス及び微生物等の病原体による感染症の疾患モデルとして使用することができる。鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞を含む細胞集団のインビトロ疾患モデルとしての使用方法は、例えば上記細胞集団に病原体を接触させる工程と、病原体の増殖を検出する等の鼻腔上皮における病原体の感染を確認する工程と、を含む。さらに、感染した細胞を解析することで、病原体の標的細胞の同定、宿主因子の解析を行うこともできる。鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞を含む細胞集団の他のインビトロ疾患モデルとしての使用方法は、例えば上記細胞集団に病原体を接触させる工程と、評価対象物質を接触させる工程と、病原体の増殖を検出する工程を含み、評価対象物質の薬効評価系として利用できる。
本発明の一実施形態は、上述の「鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞を含む細胞集団」を用いた鼻腔上皮のインビトロ疾患モデルを提供する。より具体的には、鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞を含む細胞集団は、ウイルス及び微生物等の病原体による感染症の疾患モデルとして使用することができる。鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞を含む細胞集団のインビトロ疾患モデルとしての使用方法は、例えば上記細胞集団に病原体を接触させる工程と、病原体の増殖を検出する等の鼻腔上皮における病原体の感染を確認する工程と、を含む。さらに、感染した細胞を解析することで、病原体の標的細胞の同定、宿主因子の解析を行うこともできる。鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞を含む細胞集団の他のインビトロ疾患モデルとしての使用方法は、例えば上記細胞集団に病原体を接触させる工程と、評価対象物質を接触させる工程と、病原体の増殖を検出する工程を含み、評価対象物質の薬効評価系として利用できる。
本発明の鼻腔上皮疾患モデルとしての使用方法の一態様は、下記工程(A)~(C)を含む、病原体の感染性評価系及び評価対象物質の薬効評価系としての使用方法である。
(A)鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞を含む細胞集団に病原体を接触させる工程
(B)病原体を検出する工程
(C)病原体が感染した細胞を解析する工程
(A)鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞を含む細胞集団に病原体を接触させる工程
(B)病原体を検出する工程
(C)病原体が感染した細胞を解析する工程
<工程(A)>
鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞を含む細胞集団に病原体を接触させる工程(A)について説明する。鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞を含む細胞集団に病原体を接触させる方法は、特に限定されないが、例えばウイルス実験学総論(丸善)、ウイルス実験学各論(丸善)、ウイルス実験プロトコール(メジカルビュー社)、Gastroenterology 148,126-36(2015)、及びCell Stem
Cell 27,125-36(2020)等を参照して行うことができる。病原体と細胞集団とを接触させる工程は、作業者の安全を確保した上で再現性良く病原体と細胞の相互作用が実現可能であることが望ましい。一態様としては、細胞集団を培養している培地中に微生物であれば生菌数、ウイルスであれば力価を決定済の病原体の懸濁液を直接一定量添加することで、工程(A)を実施することができる。
鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞を含む細胞集団に病原体を接触させる工程(A)について説明する。鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞を含む細胞集団に病原体を接触させる方法は、特に限定されないが、例えばウイルス実験学総論(丸善)、ウイルス実験学各論(丸善)、ウイルス実験プロトコール(メジカルビュー社)、Gastroenterology 148,126-36(2015)、及びCell Stem
Cell 27,125-36(2020)等を参照して行うことができる。病原体と細胞集団とを接触させる工程は、作業者の安全を確保した上で再現性良く病原体と細胞の相互作用が実現可能であることが望ましい。一態様としては、細胞集団を培養している培地中に微生物であれば生菌数、ウイルスであれば力価を決定済の病原体の懸濁液を直接一定量添加することで、工程(A)を実施することができる。
工程(A)に用いる細胞集団は、細胞塊そのままでもよいし、カッティング等により小さな細胞塊へ細切したものでもよい。または工程(A)に用いる細胞集団は、分散後接着させたものでもよい。細胞集団からは、鼻腔上皮を構成する特定の細胞が精製されてもよい。好ましい一態様としては、生体に類似した構造を有した細胞集団に、病原体を接触させる。
工程(A)にて接触させる病原体については特に限定されない。病原体は1種単独であってもよいし、2種以上組み合わせてもよい。工程(A)にて接触させる病原体は、好ましくは呼吸器感染症の病原体、又は鼻腔上皮を経由した感染が生じる病原体である。上記病原体としては、例えばコロナウイルス、インフルエンザウイルス(例えばA型インフルエンザウイルス、B型インフルエンザウイルスなど)、RSウイルス、アデノウイルス、A群溶連菌、肺炎マイコプラズマ、百日咳菌、パラ百日咳菌、気管支敗血症菌、肺炎クラミジア、オウム病クラミジアなどであってよい。好ましい呼吸器感染症病原体又は鼻腔上皮からの感染が生じる病原体は、コロナウイルス及びインフルエンザウイルスである。2種以上組み合わせて接触させる場合には、これらの病原体は同時に接触させてもよいし、一定の期間を空けて接触させてもよい。
工程(A)にて2種以上の病原体を接触させることによって、病原体間の相互作用による影響等を評価することもできる。上記のような病原体間の相互作用として例えばウイルス学において「干渉(interference)」と称される現象等が挙げられる。
工程(A)における病原体の接触条件における培養温度、CO2濃度等の培養条件は適宜設定できる。培養温度は、通常約30℃から約40℃であり、好ましくは約37℃であるが、病原体の特性に応じてこれらを変更してもよい。CO2濃度は、例えば約1%から約10%であり、好ましくは約5%である。
工程(A)において、評価対象物質の薬効を評価する目的で、任意の評価対象物質を培養環境中に添加することもできる。その際の評価対象物質は特に限定されないが、一態様としては低分子化合物、抗体、核酸、遺伝子治療用のベクターであり得る。評価対象物質は、細胞集団に病原体を接触させる以前に添加してもよいし、細胞集団に病原体を接触させた後に添加してもよい。評価対象物質と病原体を同時に培養環境中に添加してもよい。
病原体を検出する工程(B)について説明する。培養上清又は細胞中の病原体を検出することにより、細胞集団への病原体の感染を確認することができる。病原体を検出する方法は特に限定されないが、例えばウイルス実験学総論(丸善)、ウイルス実験学各論(丸善)、ウイルス実験プロトコール(メジカルビュー社)、Gastroenterology 148,126-136(2015)、及びCell Stem Cell 27,125-136(2020)等を参照して行うことができる。病原体を検出する工程は、対象となる病原体ごとに選択することが好ましいが、例えば病原体特異的な抗原を標的としたELISA法、病原体特異的な塩基配列を標的としたPCR法、RT-PCR法、定量的PCR法、赤血球凝集反応、蛍光抗体法等、電子顕微鏡法等の手法が挙げられる。
工程(A)において、評価対象物質を培養環境中に添加していた場合、工程(B)においてコントロール群(評価対象物質を添加していない群)と評価対象物質添加群とを比較することで、評価対象物質の薬効を評価することもできる。鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞を含む細胞集団は、病原体感染抑制剤又は病原体感染による疾病の治療薬のスクリーニングに使用することができる。薬効の評価方法としては特に限定されないが、再現性良く定量的な評価が可能な手法を実施することが好ましく、例えば病原体感染の成立の有無の他、病原体の増殖性、細胞傷害性、免疫応答等を評価する。
病原体が感染した細胞を解析する工程(C)について説明する。病原体を接触させた細胞を解析する方法は特に限定されないが、例えばウイルス実験学総論(丸善)、ウイルス実験学各論(丸善)、ウイルス実験プロトコール(メジカルビュー社)、Gastroenterology 148,126-136(2015)、及びCell Stem Cell 27,125-136(2020)等を参照して行うことができる。工程(C)は工程(B)と同時に行ってもよいし、別の工程として行ってもよい。工程(C)において解析の対象となる病原体は、通常細胞内寄生性の病原体であり、好ましくはマイコプラズマ、ウイルス、原虫、真菌、細菌である。細胞を解析する方法は、対象となる病原体ごとに選択することが好ましいが、例えば病原体特異的な抗原と細胞種特異的な抗体を併用した免疫染色法、シングルセルRNA-seq解析、電子顕微鏡法等の手法が挙げられる。シングルセルRNA-seq解析においては、例えば病原体特異的な塩基配列を含有する細胞の遺伝子発現プロファイルを解析することにより、細胞種を同定することができる。上記手法等を用いることにより、未知の病原体の向性(tropism)を決定することができる。
病原体を接触させた細胞のうち、病原体が感染した細胞と感染しなかった細胞とを比較することで、病原体の感染や病原体の増殖に必要な因子、例えばウイルス受容体、ウイルス感染関連因子、パターン認識受容体等を同定することができる。ウイルス感染症の疾患モデルの場合、鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞は、ウイルス受容体又はウイルス感染に関与する因子が発現している。疾患モデルとして、上述の因子の遺伝子を欠損又は変異させた鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞を含む細胞集団を用いることもできる。遺伝子の欠損又は変異等の改変方法は、特に限定されず、例えばゲノム編集によって行なえばよい。
鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞を含む細胞集団は、ウイルスを感染させて、ワクチン等の製造に要するウイルスを増殖させるために使用することもできる。
鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞を含む細胞集団の他のインビトロ疾患モデルとしての使用方法は、例えば患者由来iPS細胞又はゲノム編集を施した多能性幹細胞等を出発原料として上記細胞集団を調製する工程と、評価対象物質を上記細胞集団に接触させる工程と、接触後の上記細胞集団を評価する工程と、を含み、評価対象物質の薬効評価系として利用できる。
本発明の鼻腔上皮疾患モデルとしての使用方法の一態様は、下記工程(i)~(iv)を含む、患者由来多能性幹細胞又はゲノム編集を施した多能性幹細胞からの鼻腔上皮の製造と解析、及び評価対象物質の薬効評価系としての使用方法である。
(i)患者由来多能性幹細胞又はゲノム編集を施した多能性幹細胞を樹立する工程
(ii)工程(i)で樹立した上記多能性幹細胞から鼻腔上皮を構成する細胞を含む細胞集団を製造する工程
(iii)工程(ii)で製造した上記細胞集団に評価対象物質を接触させる工程
(iv)工程(iii)で上記評価対象物質に接触させた上記細胞集団を解析する工程
(i)患者由来多能性幹細胞又はゲノム編集を施した多能性幹細胞を樹立する工程
(ii)工程(i)で樹立した上記多能性幹細胞から鼻腔上皮を構成する細胞を含む細胞集団を製造する工程
(iii)工程(ii)で製造した上記細胞集団に評価対象物質を接触させる工程
(iv)工程(iii)で上記評価対象物質に接触させた上記細胞集団を解析する工程
<工程(i)>
患者由来多能性幹細胞又はゲノム編集を施した多能性幹細胞を樹立する工程(i)について説明する。患者由来多能性幹細胞又はゲノム編集を施した多能性幹細胞を樹立する手法については、のちの工程で鼻腔上皮の製造に用いることができる量と品質の多能性幹細胞が得られる限り、特に限定はされない。一形態としては、患者由来の多能性幹細胞以外の細胞を初期化して多能性幹細胞を得る方法、樹立済の多能性幹細胞のゲノムを操作して多能性幹細胞をクローニングする方法等が挙げられる。通常、遺伝性疾患の患者由来の多能性幹細胞又は遺伝病の原因遺伝子にゲノム編集を施した多能性幹細胞が好適に用いられるが、病原体に対する感受性を調べる等の目的から、感染症その他の疾病の患者由来多能性幹細胞又は該疾病の関連遺伝子にゲノム編集を施した多能性幹細胞を用いることもできる。
患者由来多能性幹細胞又はゲノム編集を施した多能性幹細胞を樹立する工程(i)について説明する。患者由来多能性幹細胞又はゲノム編集を施した多能性幹細胞を樹立する手法については、のちの工程で鼻腔上皮の製造に用いることができる量と品質の多能性幹細胞が得られる限り、特に限定はされない。一形態としては、患者由来の多能性幹細胞以外の細胞を初期化して多能性幹細胞を得る方法、樹立済の多能性幹細胞のゲノムを操作して多能性幹細胞をクローニングする方法等が挙げられる。通常、遺伝性疾患の患者由来の多能性幹細胞又は遺伝病の原因遺伝子にゲノム編集を施した多能性幹細胞が好適に用いられるが、病原体に対する感受性を調べる等の目的から、感染症その他の疾病の患者由来多能性幹細胞又は該疾病の関連遺伝子にゲノム編集を施した多能性幹細胞を用いることもできる。
患者由来多能性幹細胞としては、例えば嚢胞性線維症、線毛機能不全症候群、カルタゲナー症候群、ムコ多糖症、喘息(アレルギー性の炎症)、好酸球性副鼻腔炎等の患者に由来する多能性幹細胞が挙げられるが、特に限定されない。ゲノム編集を施した多能性幹細胞としては例えば遺伝病の原因遺伝子を編集し、機能欠損型としたもの、遺伝病の患者由来多能性幹細胞の原因遺伝子を編集し、機能を回復させたもの、遺伝子発現等を評価する為、蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ等のレポーターを組み込んだもの等が挙げられるが、特に限定されない。
<工程(ii)>
工程(i)で樹立した多能性幹細胞から鼻腔上皮を構成する細胞を含む細胞集団を製造する工程(ii)について説明する。多能性幹細胞から鼻腔上皮を含む細胞集団を製造する方法については、本願に記載の工程(a)、(1)、(2)、(3)及び(4)を行うことにより実施することができる。実際の製造の条件に関しては、細胞株の株間の差を考慮し、細胞の播種数、添加する作用物質の添加時期、濃度等適宜調製することができる。
工程(i)で樹立した多能性幹細胞から鼻腔上皮を構成する細胞を含む細胞集団を製造する工程(ii)について説明する。多能性幹細胞から鼻腔上皮を含む細胞集団を製造する方法については、本願に記載の工程(a)、(1)、(2)、(3)及び(4)を行うことにより実施することができる。実際の製造の条件に関しては、細胞株の株間の差を考慮し、細胞の播種数、添加する作用物質の添加時期、濃度等適宜調製することができる。
<工程(iii)>
工程(ii)で製造した鼻腔上皮を含む細胞集団に評価対象物質を接触させる工程(iii)について説明する。工程(iii)において、評価対象物質の薬効を評価する目的で、任意の評価対象物質を培養環境中に添加する。その際の評価対象物質は特に限定されないが、一態様としては低分子化合物、抗体、核酸、遺伝子治療用のベクターであり得る。
工程(ii)で製造した鼻腔上皮を含む細胞集団に評価対象物質を接触させる工程(iii)について説明する。工程(iii)において、評価対象物質の薬効を評価する目的で、任意の評価対象物質を培養環境中に添加する。その際の評価対象物質は特に限定されないが、一態様としては低分子化合物、抗体、核酸、遺伝子治療用のベクターであり得る。
<工程(iv)>
工程(iii)で評価対象物質に接触させた細胞集団を解析する工程(iv)について説明する。工程(iv)における解析手法は、評価対象物質の作用を解析可能である限り特に限定はされない。例えば、染色による組織の解析、ウエスタンブロット法等を用いたタンパク質発現の解析、リアルタイムPCR法、DNAマイクロアレイ法、シングルセルRNA-Seq法等を用いた遺伝子発現の解析、細胞増殖・細胞死アッセイ、細胞機能評価アッセイ等が挙げられる。細胞集団の解析を行なうことで、接触させた評価対象物質が疾患に与える効果を評価することができる。
工程(iii)で評価対象物質に接触させた細胞集団を解析する工程(iv)について説明する。工程(iv)における解析手法は、評価対象物質の作用を解析可能である限り特に限定はされない。例えば、染色による組織の解析、ウエスタンブロット法等を用いたタンパク質発現の解析、リアルタイムPCR法、DNAマイクロアレイ法、シングルセルRNA-Seq法等を用いた遺伝子発現の解析、細胞増殖・細胞死アッセイ、細胞機能評価アッセイ等が挙げられる。細胞集団の解析を行なうことで、接触させた評価対象物質が疾患に与える効果を評価することができる。
[5.疾患治療用化合物の評価用キット又は疾患治療用化合物のスクリーニングキット]
本発明の一実施形態は、上述の「4.鼻腔上皮疾患モデルとしての使用方法」を実施するための疾患治療用化合物の評価用キット及び疾患治療用化合物のスクリーニングキットを提供する。
本発明の一実施形態は、上述の「4.鼻腔上皮疾患モデルとしての使用方法」を実施するための疾患治療用化合物の評価用キット及び疾患治療用化合物のスクリーニングキットを提供する。
評価用キット又はスクリーニングキットには、例えば本発明に係る細胞集団、又は細胞集団から分取された鼻腔上皮を構成する細胞もしくは鼻腔上皮様組織と、上述の工程(A)~(C)を行うために用いられる試薬、培養液、培養器材、解析プログラムの少なくとも1つとを含み、好ましくはポジティブコントロールもしくはネガティブコントロールとして用いられる試薬(化合物)、又は評価対象物質との接触により活性化された細胞を同定する試薬を含む。本キットには、さらにスクリーニングの手順を記載した書面や説明書が含まれていてもよい。
[6.対象物質の薬効又は毒性の評価方法及び評価キット]
本発明の一実施形態として、本発明に係る細胞集団を用いて対象物質の薬効又は毒性、特に呼吸器毒性を評価する方法及び評価キットが提供される。細胞集団からは、鼻腔上皮を構成する特定の細胞又は鼻腔上皮様組織が精製されてもよい。本実施形態の他の側面において、「対象物質の薬効又は毒性の評価方法及び評価キット」は、「対象物質の薬効又は毒性のスクリーニング方法及びスクリーニング用キット」と把握することもできる。
本発明の一実施形態として、本発明に係る細胞集団を用いて対象物質の薬効又は毒性、特に呼吸器毒性を評価する方法及び評価キットが提供される。細胞集団からは、鼻腔上皮を構成する特定の細胞又は鼻腔上皮様組織が精製されてもよい。本実施形態の他の側面において、「対象物質の薬効又は毒性の評価方法及び評価キット」は、「対象物質の薬効又は毒性のスクリーニング方法及びスクリーニング用キット」と把握することもできる。
対象物質の薬効又は毒性を評価する方法は、上述の「4.鼻腔上皮疾患モデルとしての使用方法」の工程(iii)及び工程(iv)を参照して行なうことができる。対象物質の薬効又は毒性を評価する方法は、例えば細胞集団に評価対象物質を接触させる工程及び評価対象物質に接触させた細胞集団を解析する工程とを含む。評価対象物質は、特に限定されないが、一態様としては低分子化合物、抗体、核酸、遺伝子治療用のベクターであり得る。細胞集団の解析を行なうことで、接触させた評価対象物質が細胞に与える効果を評価することができる。
対象物質の薬効又は毒性の評価キットは、「5.疾患治療用化合物の評価用キット又は疾患治療用化合物のスクリーニングキット」に記載のキットと同じものを含んでいてもよい。対象物質の薬効又は毒性の評価キットは、例えば本発明に係る細胞集団、又は細胞集団から分取された鼻腔上皮を構成する細胞もしくは鼻腔上皮様組織と、培養液、培養器材、解析プログラムの少なくとも1つとを含み、好ましくはポジティブコントロールもしくはネガティブコントロールとして用いられる試薬(化合物)、及び評価対象物質との接触により活性化された細胞を同定する試薬を含む。本キットには、さらにスクリーニングの手順を記載した書面や説明書が含まれていてもよい。
[7.疾患特異的なバイオマーカーの探索方法]
本発明の一実施形態として、本発明に係る細胞集団を用いて疾患特異的なバイオマーカーを探索する方法が提供される。細胞集団からは、鼻腔上皮を構成する特定の細胞又は鼻腔上皮様組織が精製されてもよい。疾患特異的なバイオマーカーを探索する方法は、例えば細胞集団に病原体を感染させる等の手法で疾患の状態を再現する工程、及び疾患の状態が再現された細胞集団、その培養上清、代謝物、分泌物等を回収し、検体を解析してコントロールと比較し、変動するバイオマーカーを同定する工程とを含む。対象となるバイオマーカーは、好ましくは分子バイオマーカーである。対象となる分子バイオマーカーは、タンパク質、核酸、糖鎖、ペプチド及び低分子化合物でありうるが、これらに限定されない。対象となる分子バイオマーカーは、揮発性であってもよいし、非揮発性であってもよい。分子バイオマーカーの探索は、例えばMolecular&Cellular Proteomics 4.2(2005):182-190、Chembiochem.2014 May 5;15(7):1040-1048、Angewandte Chemie International Edition,2010,49.32:5426-5445.に記載の方法等を用いて行うことができる。
本発明の一実施形態として、本発明に係る細胞集団を用いて疾患特異的なバイオマーカーを探索する方法が提供される。細胞集団からは、鼻腔上皮を構成する特定の細胞又は鼻腔上皮様組織が精製されてもよい。疾患特異的なバイオマーカーを探索する方法は、例えば細胞集団に病原体を感染させる等の手法で疾患の状態を再現する工程、及び疾患の状態が再現された細胞集団、その培養上清、代謝物、分泌物等を回収し、検体を解析してコントロールと比較し、変動するバイオマーカーを同定する工程とを含む。対象となるバイオマーカーは、好ましくは分子バイオマーカーである。対象となる分子バイオマーカーは、タンパク質、核酸、糖鎖、ペプチド及び低分子化合物でありうるが、これらに限定されない。対象となる分子バイオマーカーは、揮発性であってもよいし、非揮発性であってもよい。分子バイオマーカーの探索は、例えばMolecular&Cellular Proteomics 4.2(2005):182-190、Chembiochem.2014 May 5;15(7):1040-1048、Angewandte Chemie International Edition,2010,49.32:5426-5445.に記載の方法等を用いて行うことができる。
[8.治療薬及び疾患の治療方法]
本発明の一実施形態は、上記細胞集団又は上記細胞集団に含まれる細胞もしくは組織を含む、呼吸器の障害又は感覚器の障害、好ましくは嗅覚系の障害に基づく疾患の治療薬を提供する。これらの疾患は、ヒトの疾患であってもよく、ヒト以外の動物の疾患であってもよい。細胞集団は、再生医療の治療薬として使用することができる。例えば鼻腔上皮組織又は嗅上皮組織に傷害が生じたとき、上記細胞集団を移植片として用いることができる。細胞集団からは、鼻腔上皮を構成する特定の細胞が精製されてもよい。具体的な移植の方法としては、例えばStem cell reports,12(6),1354-1365.に記載の通り、細胞集団に含まれる治療効果を有する細胞、例えば基底細胞を精製し、調製した細胞懸濁液を患部に直接投与、例えば点鼻により嗅上皮に移植するような手法、あるいは細胞集団からシート状の組織を調製し、患部を被覆する方法等が挙げられる。
本発明の一実施形態は、上記細胞集団又は上記細胞集団に含まれる細胞もしくは組織を含む、呼吸器の障害又は感覚器の障害、好ましくは嗅覚系の障害に基づく疾患の治療薬を提供する。これらの疾患は、ヒトの疾患であってもよく、ヒト以外の動物の疾患であってもよい。細胞集団は、再生医療の治療薬として使用することができる。例えば鼻腔上皮組織又は嗅上皮組織に傷害が生じたとき、上記細胞集団を移植片として用いることができる。細胞集団からは、鼻腔上皮を構成する特定の細胞が精製されてもよい。具体的な移植の方法としては、例えばStem cell reports,12(6),1354-1365.に記載の通り、細胞集団に含まれる治療効果を有する細胞、例えば基底細胞を精製し、調製した細胞懸濁液を患部に直接投与、例えば点鼻により嗅上皮に移植するような手法、あるいは細胞集団からシート状の組織を調製し、患部を被覆する方法等が挙げられる。
治療薬としては、例えば本発明の細胞集団又は細胞集団に含まれる細胞もしくは組織を含む懸濁液、並びにこれらを含む移植片(移植用担体)が挙げられる。懸濁液としては、例えば細胞集団を人工涙液又は生理食塩水に懸濁した液が挙げられる。懸濁液は、細胞集団から単離された非神経上皮細胞を含んでいてもよく、細胞の接着を促進する因子、例えば細胞外基質やヒアルロン酸等を含んでいてもよい。
さらに、本発明の細胞集団に含まれる細胞又は組織を、治療上必要とされる有効量、移植を必要とする対象に移植する工程を含む、疾患の治療方法が提供され得る。治療上有効な細胞量の移植により、組織が回復し、典型的には、疾患に関連する症状が軽減され得る。
疾患の治療薬として用いる細胞集団又は上記細胞集団に含まれる細胞もしくは組織は、対象となる疾患に対し抵抗性を有することが好ましい。例えば、SARS-CoV-2の感染により生じた嗅覚障害に対し本発明の細胞集団に含まれる細胞又は組織を移植することにより治療を実施する場合は、移植する細胞はSARS-CoV-2の感染に対し抵抗性を有することが好ましい。上記のような疾患抵抗性の細胞は、例えばウイルス感染に関与する遺伝子、例えばACE2、TMPRSS2、Nrp1といった遺伝子をゲノム編集により変異又は欠失させた多能性幹細胞を材料として用いることにより調製できる。
[9.ウイルスの分離培養に用いる宿主細胞としての使用]
本発明の一実施形態は、上記細胞集団又は上記細胞集団に含まれる細胞もしくは組織を用いる、ウイルスの分離の為の培養方法を提供する。上記ウイルスは、ヒトの疾患の原因ウイルスであってもよく、ヒト以外の動物の疾患の原因ウイルスであってもよい。本発明の方法によって分離培養されるウイルスは、例えば上気道感染症、普通感冒、流行性感冒、又は新興感染症の原因ウイルスであるが、これらに限定されない。上記のようなウイルスとしては例えば、ライノウイルス、ヒトコロナウイルス、インフルエンザウイルス、RSウイルス、パラインフルエンザウイルス、アデノウイルス、エンテロウイルス、ヒトメタニューモウイルス、ボカウイルス等が挙げられる。ヒトコロナウイルスとしては例えば、アルファコロナウイルス属のHCoV-NL63、HCoV-229E、ベータコロナウイルス属のHCoV-OC43、HCoV-HKU1等が挙げられる。新興感染症の原因ウイルスとして例えばSARS-CoV、MERS-CoV、SARS-CoV2等が挙げられる。
本発明の一実施形態は、上記細胞集団又は上記細胞集団に含まれる細胞もしくは組織を用いる、ウイルスの分離の為の培養方法を提供する。上記ウイルスは、ヒトの疾患の原因ウイルスであってもよく、ヒト以外の動物の疾患の原因ウイルスであってもよい。本発明の方法によって分離培養されるウイルスは、例えば上気道感染症、普通感冒、流行性感冒、又は新興感染症の原因ウイルスであるが、これらに限定されない。上記のようなウイルスとしては例えば、ライノウイルス、ヒトコロナウイルス、インフルエンザウイルス、RSウイルス、パラインフルエンザウイルス、アデノウイルス、エンテロウイルス、ヒトメタニューモウイルス、ボカウイルス等が挙げられる。ヒトコロナウイルスとしては例えば、アルファコロナウイルス属のHCoV-NL63、HCoV-229E、ベータコロナウイルス属のHCoV-OC43、HCoV-HKU1等が挙げられる。新興感染症の原因ウイルスとして例えばSARS-CoV、MERS-CoV、SARS-CoV2等が挙げられる。
ウイルスの分離培養に用いる細胞集団又は上記細胞集団に含まれる細胞もしくは組織は、対象となるウイルスに対する受容体を有することが好ましい。ウイルスの分離培養の効率を改善する観点から、例えばNature microbiology, 2019, 4.8: 1268-1273.等を参照し、ウイルス感染に関与する遺伝子、例えばACE2、TMPRSS2、Nrp1といった遺伝子をゲノム編集等により操作し、発現を増強した多能性幹細胞を材料として用いることもできる。in vitroにて増殖させる影響や生じる変異を可能な限り排し、生体にて増殖している臨床検体等に含まれているウイルスと極めて近しいウイルスを検体として得るという観点からは、ウイルスの分離培養に用いる細胞集団又は上記細胞集団含まれる細胞もしくは組織は、含まれる細胞の種類、ウイルス感染に関与する遺伝子等の発現が生体に近いものであることもまた好ましい。
本発明の細胞集団又は上記細胞集団に含まれる細胞を用いたウイルスの分離培養の一態様は、上述の[4.鼻腔上皮疾患モデルとしての使用方法]の工程(A)、(B)及び(C)を参照して行うこともできる。ウイルスの分離培養が為されたか否かを評価する方法としては、ウイルスを接種した細胞に生じる細胞変性効果(cytopathic effect; CPE)の観察、赤血球凝集抑制試験、各種抗ウイルス抗体を用いた中和試験、ウイルスの特定の遺伝子の増幅をPCR法による確認する、あるいは遺伝子の塩基配列を解読する遺伝子検査等の手法が挙げられるが、これに限定されない。
以下に実施例を示して、本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。また、使用する試薬及び材料は特に限定されない限り商業的に入手可能である。本明細書において、細胞の免疫染色結果の判断基準は、国際公開第2020/039732号の予備実験1と同じである。
[比較実験1:ヒトES細胞からの嗅上皮様組織及び非神経上皮組織を含有する細胞塊の製造・分化誘導]
図5の上段に示す培養工程に従って、多能性幹細胞から嗅上皮様組織を含む非神経上皮組織を含む細胞塊を製造した。多能性幹細胞として、ヒトES細胞(KhES-1株、京都大学より入手)を用いた。多能性幹細胞は、国際公開第2020/039732号に記載の通り、Scientific Reports,4,3594(2014)に記載の方法に準じてフィーダーフリー条件で維持培養した。フィーダーフリー培地としてはStemFit培地(AK02N、味の素株式会社製)、フィーダーフリー足場にはLaminin511-E8(株式会社ニッピ製)を用いた。
図5の上段に示す培養工程に従って、多能性幹細胞から嗅上皮様組織を含む非神経上皮組織を含む細胞塊を製造した。多能性幹細胞として、ヒトES細胞(KhES-1株、京都大学より入手)を用いた。多能性幹細胞は、国際公開第2020/039732号に記載の通り、Scientific Reports,4,3594(2014)に記載の方法に準じてフィーダーフリー条件で維持培養した。フィーダーフリー培地としてはStemFit培地(AK02N、味の素株式会社製)、フィーダーフリー足場にはLaminin511-E8(株式会社ニッピ製)を用いた。
具体的な維持培養操作としては、まずサブコンフルエントになったヒトES細胞を、5mM EDTA/PBSにて2回洗浄後、さらに5mM EDTA/PBSで37℃10分間処理した。ピペッティングを行い、培養ディッシュ表面から細胞を剥がし、単一細胞へ分散した。その後、単一細胞へ分散されたヒトES細胞を、Laminin511-E8にてコートしたプラスチック培養ディッシュに播種し、Y27632(ROCK阻害物質、富士フィルム和光純薬株式会社製、10μM)存在下、StemFit培地にてフィーダーフリー培養した。プラスチック培養ディッシュとして、6ウェルプレート(Corning社製、細胞培養用、培養面積9.5cm2)を用いた場合、単一細胞へ分散されたヒトES細胞の播種細胞数は1.2×104とした。播種した1日後に、Y27632を含まないStemFit培地に全量培地交換した。以降、1日~2日に1回、Y27632を含まないStemFit培地にて全量培地交換した。播種後7日間、サブコンフルエント(培養面積の6割が細胞に覆われる程度)になるまで培養した。
培養した多能性幹細胞を分化誘導に用いる際には、播種した6日後にStemFit培地の培地交換と同時にSB431542(TGF-βシグナル伝達経路阻害物質、富士フィルム和光純薬株式会社製、終濃度5μM、図5等では「SB431」と表記)とSAG(Shhシグナル経路作用物質、Enzo Life Sciences社製、終濃度300nM)を添加して24時間培養した(工程(a)開始)。
調製したサブコンフルエントのヒトES細胞を、上記継代時と同様に5mM EDTA/PBSにて処理した。分化誘導用の無血清培地を添加し、ピペッティングを行って培養ディッシュ表面から細胞を剥がし、単一細胞へ分散した。
その後、単一細胞に分散されたヒトES細胞を非細胞接着性の96ウェル培養プレート(PrimeSurface 96V底プレート、MS-9096V、住友ベークライト株式会社製)に、1ウェルあたり9×103細胞になるように100μlの無血清培地に懸濁し、37℃、5%CO2の条件下で浮遊培養した。その際の無血清培地には、F-12+Glutamax培地(Thermo Fisher Scientific社製)とIMDM+Glutamax培地(Thermo Fisher Scientific社製)の体積比1:1混合液に5% Knockout Serum Replacement(Thermo Fisher Scientific社製)、450μM 1-モノチオグリセロール(富士フィルム和光純薬株式会社社製)、1x Chemically defined lipid concentrate(Thermo Fisher Scientific社製)、50unit/mlペニシリン-50μg/mlストレプトマイシン(ナカライテスク株式会社製)を添加した無血清培地を用いた(工程(1)開始)。以降、この無血清培地を5% KSR gfCDMともいう。
その後、単一細胞に分散されたヒトES細胞を非細胞接着性の96ウェル培養プレート(PrimeSurface 96V底プレート、MS-9096V、住友ベークライト株式会社製)に、1ウェルあたり9×103細胞になるように100μlの無血清培地に懸濁し、37℃、5%CO2の条件下で浮遊培養した。その際の無血清培地には、F-12+Glutamax培地(Thermo Fisher Scientific社製)とIMDM+Glutamax培地(Thermo Fisher Scientific社製)の体積比1:1混合液に5% Knockout Serum Replacement(Thermo Fisher Scientific社製)、450μM 1-モノチオグリセロール(富士フィルム和光純薬株式会社社製)、1x Chemically defined lipid concentrate(Thermo Fisher Scientific社製)、50unit/mlペニシリン-50μg/mlストレプトマイシン(ナカライテスク株式会社製)を添加した無血清培地を用いた(工程(1)開始)。以降、この無血清培地を5% KSR gfCDMともいう。
浮遊培養開始時(浮遊培養開始後0日目、工程(1)開始)に、上記無血清培地にY27632(終濃度10μM)、IWP-2(Wntシグナル伝達経路阻害物質、Tocris Bioscience社製、終濃度0.5μM)、SB431542(TGFシグナル伝達経路阻害物質、富士フィルム和光純薬株式会社製、終濃度1μM)を添加した。
浮遊培養開始後2日目にY27632を含まず、IWP-2、SB431542、BMP4(BMPシグナル伝達経路作用物質、R&D Systems社製、終濃度0.5nM)を含む無血清培地を1ウェルあたり100μl加えた(工程(2)開始)。
さらに、浮遊培養開始後3日目にY27632とBMP4を含まず、IWP-2、SB431542、bFGF-TS(FGFシグナル伝達経路作用物質、HumanZyme社製、終濃度20ng/ml)、Heparin Sodium(終濃度10μg/ml)、5Z-7-Oxo Zeaenol(TAK1阻害物質、Cayman Chemicals社製、終濃度2μM)を含む無血清培地を用いて半量培地交換を行った(工程(3)開始)。浮遊培養開始後6日目にIWP-2、SB431542、bFGF-TS、Heparin Sodium、5Z-7-Oxo Zeaenol、K02288(BMPシグナル伝達経路阻害物質、Cayman Chemicals社製、終濃度1μM)を含む無血清培地を用いて半量培地交換を行った。以降、培養10、13、17、21、24日目に同様に半量培地交換を行った。培養13日目以降の培地交換の際に、EGF(PrimeGene社製、終濃度20ng/ml)を添加した。
上記BMP4、bFGF-TS、Heparin Sodium、5Z-7-Oxo Zeaenol、K02288及びEGFは最初に添加する際は半量交換で添加する培地に各々2倍の濃度で添加し、ウェル中の終濃度が記載の濃度となるようにした。以降の培地交換の際は、記載の終濃度で培地に添加した。また、以降の記載において、他の各条件で添加する因子、化合物等も同様の方法で添加した。
浮遊培養開始後28日目に倒立顕微鏡(株式会社キーエンス製、BIOREVO)を用いて、明視野観察を行った(図5のA)。上記分化誘導法により直径約600μm程度の球状の細胞凝集体が形成されていた。
浮遊培養開始後28日目の細胞凝集体を、先端口径が太い200μlチップで培養用チューブに回収し、PBSで2回洗浄作業を行った後、4%パラホルムアルデヒド・りん酸緩衝液(富士フィルム和光純薬株式会社社製)で室温15分固定した。固定後の細胞凝集体をPBSで3回洗浄した後、20%スクロース/PBSに4℃で一晩浸漬し凍結保護処理を行った。凍結保護処理後の凝集体をクリオモルド<3号>(Sakura Finetek社製)に移し、細胞凝集体の周囲の余分な20%スクロース/PBSをマイクロピペッターで除いた後にO.C.Tコンパウンド(Sakura Finetek社製)に包埋し、ドライアイスで冷却したアルミヒートブロック上で急速凍結し、凍結切片作製用のブロックを作製した。上記凝集体を包埋したブロックからライカCM1950クライオスタット(Leica社製)により10μm厚の凍結切片を作製し、クレストスライドグラス(松浪硝子工業株式会社製)に張り付けた。スライドグラス上の凍結切片の周囲を免疫組織化学用パップペン(大道産業株式会社製)で囲んだ後、0.2%Triton-X100/TBSで室温10分間透過処理し、続けてブロッキング試薬N-102(日油株式会社製)とSuperBlock(TBS)Blocking Buffer(Thermo Fisher Scientific社製)の体積比1:4混合液で室温30分間ブロッキング処理を行った。
ブロッキング処理後の凍結切片に関し、Antibody Diluent OP Quanto(Thermo Fisher Scientific社製)で希釈した一次抗体をスライドグラス1枚あたり250μl添加し、湿箱中にて4℃で一晩反応させた。一次抗体処理後の凍結切片を0.05% Tween-20/TBSで室温10分間処理する洗浄操作を3回行った後に、Blocking One Histo(ナカライテスク株式会社製)と0.2%Triton-X100/TBSを体積比1:19の割合で混合した緩衝液で二次抗体を希釈し、希釈液をスライドグラス1枚あたり250μl凍結切片に添加し、室温で1時間反応させた。二次抗体処理後の凍結切片を0.05% Tween-20/TBSで室温10分間処理する洗浄操作を3回行った後に、純水で凍結切片を一回洗浄し、その後、NEOカバーグラス(松浪硝子工業株式会社製)とスライドグラス1枚当たり30μlのProlong Glass(Thermo Fisher Scientific社製)を用いて凍結切片を封入した。封入後の標本を室温の暗所で一晩静置してProlong Glassを固化させたのち、透明のマニキュアでカバーグラスの周囲をコーティングし室温の暗所で風乾後、蛍光顕微鏡による観察を行った。標本の観察及び画像の取得には正立蛍光顕微鏡Axio Imager M2(Carl Zeiss社製)及び附属ソフトウェアのAxio Visionを用いた。
一次抗体としては、表1-1又は1-2に記載のプラコード及び非神経上皮組織を染色する抗Six1抗体、神経網膜及び嗅神経細胞を染色する抗Lhx2抗体、嗅神経細胞及びその前駆細胞を染色する抗Calretinin抗体を用いた。蛍光標識二次抗体としては、表2に記載のAlexa488標識ロバ抗ウサギ抗体、CF555標識ロバ抗マウス抗体、Alexa647標識ロバ抗ヤギ抗体を用いて多重染色を行い、核の対比染色には1μg/mlのHoechst33342(Sigma Aldrich社製)を二次抗体希釈液中に添加した。
染色結果を図5のBに示す。浮遊培養開始28日目には、細胞塊の外側にSix1陽性のプラコード様の非神経上皮組織が形成された。それらの一部の細胞は、Lhx2、Calretinin陽性の嗅神経細胞又はその未成熟な前駆細胞であった。以上より、比較実験1の培養方法により、細胞塊の外側に非神経上皮が存在し、その一部が嗅神経細胞である細胞塊が製造可能であることが示された。上記製造法により形成された細胞塊の模式図を図5のCに示す。
[実験1:ヒトES細胞からの鼻腔上皮を構成する細胞を含有する細胞集団の製造・分化誘導]
実験1では、図6の上段に示す工程に従って、鼻腔上皮を構成する細胞を含む細胞集団を製造した。培養28日目までは、比較実験1と同じ方法で多能性幹細胞を培養した。その後、Wntシグナル伝達経路阻害物質、FGFシグナル伝達経路作用物質及びBMPシグナル伝達経路阻害物質の非存在下で細胞を培養する工程(4)を実施した。実験1では、特に記載された操作以外は比較実験1と同様の操作を行った。
実験1では、図6の上段に示す工程に従って、鼻腔上皮を構成する細胞を含む細胞集団を製造した。培養28日目までは、比較実験1と同じ方法で多能性幹細胞を培養した。その後、Wntシグナル伝達経路阻害物質、FGFシグナル伝達経路作用物質及びBMPシグナル伝達経路阻害物質の非存在下で細胞を培養する工程(4)を実施した。実験1では、特に記載された操作以外は比較実験1と同様の操作を行った。
具体的には、維持培養されたヒトES細胞を用いて、比較実験1と同じ方法で工程(a)、工程(1)、工程(2)及び工程(3)を行った後、培養28日目に96ウェル培養プレートから15ml遠心チューブに細胞塊を回収し、培地にて2回洗浄を実施した後、9cm浮遊培養用ディッシュ(住友ベークライト株式会社製)に細胞塊を移した。培地は、無血清培地(5% KSR gfCDM)に1μM SB431542と20ng/ml EGFを添加したものを用いた。ディッシュ1枚当たり48個の細胞塊を12mlの培地で培養した。培養35日目に倒立顕微鏡を用いて明視野観察を行った(図6のA)。培養35日目の細胞集団は、一部の上皮組織が細胞塊から分離していた。
培養35日目の細胞集団を、比較実験1に記載の方法で固定し、蛍光免疫染色を実施した。一次抗体としては、表1-1又は1-2に記載の神経網膜及び嗅神経細胞を染色する抗Lhx2抗体、嗅神経細胞及びその前駆細胞で陽性となる抗Ebf1抗体、神経系細胞で陽性となる抗Tuj1抗体、分泌細胞を染色する抗MUC5AC抗体、抗MUC5B抗体、呼吸器系の上皮細胞で陽性となる抗FoxA2抗体、線毛細胞で陽性となる抗FoxJ1抗体、塩類細胞で陽性となる抗CFTR抗体、外胚葉の前方領域で陽性となる抗Otx2抗体、非神経上皮で陽性となる抗Pan Cytokeratin(PanCK)抗体、基底細胞で陽性となる抗サイトケラチン5抗体及び抗p75抗体、並びに鼻腔上皮、嗅上皮及び非神経上皮で陽性となる抗E-Cadherin抗体を用いた。蛍光標識二次抗体としては、表2に記載のAlexa488標識ロバ抗ウサギ抗体、CF555標識ロバ抗マウス抗体、Alexa647標識ロバ抗ヤギ抗体を用いて多重染色を行い、核の対比染色には1μg/mlのHoechst33342(Sigma Aldrich社製)を二次抗体希釈液中に添加した。
染色結果を図7及び図8のAに示す。浮遊培養開始35日目には、非神経上皮組織にLhx2、Ebf1、Tuj1陽性の嗅神経細胞、FoxJ1陽性の線毛細胞、ムチン5AC、ムチン5B、FoxA2陽性の分泌細胞、CFTR陽性の塩類細胞、サイトケラチン5、p75、E-Cadherin陽性の基底細胞様の細胞が存在していた。また、これらの細胞が存在する領域はいずれもOtx2陽性かつ汎サイトケラチン陽性であり、上記細胞が外胚葉に属する非神経系細胞であることが示された。上記の結果から、鼻腔上皮を構成する細胞が細胞集団に含まれており、本発明に係る製造方法により、線毛細胞、分泌細胞、塩類細胞、基底細胞等の鼻腔上皮を構成する細胞が製造可能であることが示された。上記製造方法により形成された細胞集団の模式図を図8のBに示す。
細胞集団は、1)中枢神経系を構成する神経系細胞を含む神経組織、及び2)鼻腔上皮を構成する細胞を含む鼻腔上皮様組織と、嗅神経細胞を含む嗅上皮様組織と、を含む非神経上皮組織を有していた。神経組織は、鼻腔上皮様組織によって表面の少なくとも一部が被覆されていた。鼻腔上皮様組織と嗅上皮様組織とは、連続する非神経上皮組織上に存在していた。細胞集団において、基底細胞は非神経上皮組織の内側に局在し、線毛細胞は非神経上皮組織の外側に局在しており、非神経上皮組織は基底側と頂端側との極性を有していた。細胞集団において、鼻腔上皮を構成する細胞は、細胞種ごとに集合していた。
[実験2:ヒトES細胞からの鼻腔上皮を構成する細胞を含有する細胞集団の製造・分化誘導]
実験2では、図9の上段に示す工程に従って、鼻腔上皮を構成する細胞を含む細胞集団を製造した。実験2では、工程(1)からJNK阻害剤であるJNK-IN-8をさらに添加した以外は、比較実験1と同じ操作を行なった。
実験2では、図9の上段に示す工程に従って、鼻腔上皮を構成する細胞を含む細胞集団を製造した。実験2では、工程(1)からJNK阻害剤であるJNK-IN-8をさらに添加した以外は、比較実験1と同じ操作を行なった。
具体的には、維持培養されたヒトES細胞を用いて、工程(a)を行った後、工程(1)において、JNK阻害剤JNK-IN-8を終濃度300nM又は1μMの条件で添加した。培地交換の際にも終濃度が同じとなるように、交換する培地にJNK-IN-8を添加した。培養28日目に倒立顕微鏡を用いて、明視野観察を行った(図9のA)。JNK-IN-8を添加した群、特にJNK-IN-8を終濃度1μM添加した群は、得られた細胞集団が均一な球形に近い細胞塊を含み、細胞塊の表面が非神経上皮に覆われている割合も高かった。
培養28日目の細胞集団を、比較実験1に記載の方法で固定し、蛍光免疫染色を実施した。一次抗体としては、表1-1又は1-2に記載の前方領域の外胚葉を染色する抗Otx2抗体、嗅神経細胞及びその前駆細胞で陽性となる抗Ebf1抗体、嗅神経細胞及びその前駆細胞を含む神経細胞を染色する抗Tuj1抗体、基底細胞で陽性となる抗サイトケラチン5抗体及び抗p75抗体を用いた。蛍光標識二次抗体としては、表2に記載のAlexa488標識ロバ抗ウサギ抗体、CF555標識ロバ抗マウス抗体、Alexa647標識ロバ抗ヤギ抗体を用いて多重染色を行い、核の対比染色には1μg/mlのHoechst33342(Sigma Aldrich社製)を二次抗体希釈液中に添加した。
染色結果を図10に示す。コントロールと比較して、JNK-IN-8を終濃度1μM添加した群は、得られた細胞集団の表面に非神経上皮がより効率よく形成されていた。また、JNK阻害剤添加条件下でも、Otx2陽性の外胚葉の前方領域の上皮が形成され、その中にEbf1、Tuj1陽性の嗅神経細胞への分化が生じていた。また、JNK阻害剤添加条件下でも、サイトケラチン5及びp75陽性の基底細胞への分化が生じ、細胞集団は、鼻腔上皮を構成する細胞を含んでいた。上記の結果から、Wnt/JNK経路の阻害により、嗅上皮及び鼻腔上皮領域の形成を阻害せずに質の良い非神経上皮を有する細胞集団が調製可能であることが分かった。
[実験3:ヒトES細胞からの鼻腔上皮を構成する細胞を含有する細胞集団の製造・分化誘導]
実験3では、図11の上段に示す工程に従って、鼻腔上皮を構成する細胞を含む細胞集団を製造した。実験3では、工程(3)からShhシグナル伝達経路作用物質であるSAGを終濃度1μMとなるようにさらに添加した以外は、比較実験1と同じ操作を行なった。
実験3では、図11の上段に示す工程に従って、鼻腔上皮を構成する細胞を含む細胞集団を製造した。実験3では、工程(3)からShhシグナル伝達経路作用物質であるSAGを終濃度1μMとなるようにさらに添加した以外は、比較実験1と同じ操作を行なった。
培養28日目に倒立顕微鏡を用いて、明視野観察を行った(図11のA)。表1-1又は1-2に記載の抗Fox2A抗体及び抗Pan Cytokeratin抗体、及び表2に記載の二次抗体を用いて免疫染色を行なった。染色結果を図11のB及びCに示す。コントロールと比較して、工程(3)の培養13日目からSAGを終濃度1μM添加した群は、培養28日目において汎サイトケラチン陽性、FoxA2陽性の非神経上皮組織の形成が促進されていた。上記の結果から、工程(3)のShhシグナル伝達経路の活性化により、非神経上皮部分がより鼻腔上皮へと分化しやすい細胞塊が調製可能であることが分かった。鼻腔上皮様組織へ方向づけられた非神経上皮組織を含む細胞塊の模式図を、図11のDに示す。
[実験4:ヒトiPS細胞から鼻腔上皮を構成する細胞を含有する細胞集団の製造・分化誘導における、酸化ストレスを軽減する作用を有する物質の効果の検討]
実験4では、図12に示す工程に従って、ヒトiPS細胞1231A3株から鼻腔上皮を構成する細胞を含む細胞集団を製造した。実験4では、実験2と同じように工程(1)からJNK阻害剤を添加し、さらに、工程(3)の途中(培養10日目)から酸化ストレスを軽減する作用を有する物質(図12における「Antioxidants」)を各種添加し、その効果を検討した。酸化ストレスを軽減する作用を有する物質として、具体的には、300μM、1mM又は3mM N-アセチル-L-システイン(NAC)、250μM アスコルビン酸2リン酸(AA2P)、500μM ニコチンアミド(NAD)、10μM 酢酸(±)-α-トコフェロール(αTOA)及び1μM IM-93のいずれか、又はAA2Pと1μM NACとNADとを組み合わせて添加した。培養21日目に倒立顕微鏡を用いて、明視野観察を行った(図12のA)。培養21日目の細胞塊において、酸化ストレスを軽減する作用を有する物質を添加しない条件では、表面に鼻腔上皮及び嗅上皮が形成されている細胞塊がある一方で、細胞死によって鼻腔上皮及び嗅上皮が失われている細胞塊が存在した。これに対し、上記酸化ストレスを軽減する作用を有する物質を添加した条件では、鼻腔上皮及び嗅上皮領域での細胞死が抑制され、鼻腔上皮様組織及び嗅上皮様組織が細胞塊表面に維持されていた。特に、AA2P、NAC、NADを組み合わせて添加した際はよく鼻腔上皮様組織及び嗅上皮様組織が維持されていた。これらの結果から、鼻腔上皮を構成する細胞を含有する細胞集団の製造において、酸化ストレスを軽減する作用を有する物質を添加することが有効であることが示された。
実験4では、図12に示す工程に従って、ヒトiPS細胞1231A3株から鼻腔上皮を構成する細胞を含む細胞集団を製造した。実験4では、実験2と同じように工程(1)からJNK阻害剤を添加し、さらに、工程(3)の途中(培養10日目)から酸化ストレスを軽減する作用を有する物質(図12における「Antioxidants」)を各種添加し、その効果を検討した。酸化ストレスを軽減する作用を有する物質として、具体的には、300μM、1mM又は3mM N-アセチル-L-システイン(NAC)、250μM アスコルビン酸2リン酸(AA2P)、500μM ニコチンアミド(NAD)、10μM 酢酸(±)-α-トコフェロール(αTOA)及び1μM IM-93のいずれか、又はAA2Pと1μM NACとNADとを組み合わせて添加した。培養21日目に倒立顕微鏡を用いて、明視野観察を行った(図12のA)。培養21日目の細胞塊において、酸化ストレスを軽減する作用を有する物質を添加しない条件では、表面に鼻腔上皮及び嗅上皮が形成されている細胞塊がある一方で、細胞死によって鼻腔上皮及び嗅上皮が失われている細胞塊が存在した。これに対し、上記酸化ストレスを軽減する作用を有する物質を添加した条件では、鼻腔上皮及び嗅上皮領域での細胞死が抑制され、鼻腔上皮様組織及び嗅上皮様組織が細胞塊表面に維持されていた。特に、AA2P、NAC、NADを組み合わせて添加した際はよく鼻腔上皮様組織及び嗅上皮様組織が維持されていた。これらの結果から、鼻腔上皮を構成する細胞を含有する細胞集団の製造において、酸化ストレスを軽減する作用を有する物質を添加することが有効であることが示された。
[実験5:ヒトES細胞由来鼻腔上皮オルガノイドにおけるインフルエンザウイルス受容体の発現解析]
実験5では、まず、図13の上段に示す工程に従って鼻腔上皮を構成する細胞を含む細胞集団を製造した。この製造工程では、比較実験1と同じ方法で工程(a)~工程(3)を行い、嗅神経細胞が含まれる細胞塊を得た後、さらに培養を継続した(工程(4))。培養35日目に倒立顕微鏡を用いて、細胞集団の明視野観察を行った(図13のA)。培養35日目の細胞集団を固定し、表1-1又は1-2に記載の非神経上皮組織を染色する抗Six1抗体、線毛細胞で陽性となる抗FoxJ1抗体及び線毛を染色する抗アセチル化チューブリン(AcTub)並びに表2に記載の二次抗体を用いて免疫染色を行なった。染色結果を図14に示す。非神経上皮組織において、FoxJ1とActubとが同じ細胞で染色されており、細胞集団には線毛細胞が分化していることがわかった。また、線毛細胞は、細胞集団中で集合して存在していた。線毛は、細胞集団の非神経上皮組織の外側に形成され、非神経上皮組織は極性を有していることがわかる。この細胞集団をヒトES細胞由来鼻腔上皮オルガノイドともいう。さらに、培養期間を延長した培養45日目に倒立顕微鏡を用いて動画を撮影した。動画のうちの1フレームを静止画化したものを図14のCに示す。動画では、細胞集団の表面の上皮において線毛様の構造が観察され、さらにそれが線毛運動を行っていることが観察された。本発明に係る製造方法により、線毛運動機能を有する線毛細胞を表面の上皮に有する細胞集団を調製可能であることがわかった。
実験5では、まず、図13の上段に示す工程に従って鼻腔上皮を構成する細胞を含む細胞集団を製造した。この製造工程では、比較実験1と同じ方法で工程(a)~工程(3)を行い、嗅神経細胞が含まれる細胞塊を得た後、さらに培養を継続した(工程(4))。培養35日目に倒立顕微鏡を用いて、細胞集団の明視野観察を行った(図13のA)。培養35日目の細胞集団を固定し、表1-1又は1-2に記載の非神経上皮組織を染色する抗Six1抗体、線毛細胞で陽性となる抗FoxJ1抗体及び線毛を染色する抗アセチル化チューブリン(AcTub)並びに表2に記載の二次抗体を用いて免疫染色を行なった。染色結果を図14に示す。非神経上皮組織において、FoxJ1とActubとが同じ細胞で染色されており、細胞集団には線毛細胞が分化していることがわかった。また、線毛細胞は、細胞集団中で集合して存在していた。線毛は、細胞集団の非神経上皮組織の外側に形成され、非神経上皮組織は極性を有していることがわかる。この細胞集団をヒトES細胞由来鼻腔上皮オルガノイドともいう。さらに、培養期間を延長した培養45日目に倒立顕微鏡を用いて動画を撮影した。動画のうちの1フレームを静止画化したものを図14のCに示す。動画では、細胞集団の表面の上皮において線毛様の構造が観察され、さらにそれが線毛運動を行っていることが観察された。本発明に係る製造方法により、線毛運動機能を有する線毛細胞を表面の上皮に有する細胞集団を調製可能であることがわかった。
鼻腔上皮オルガノイドを培養42日目に固定し、インフルエンザウイルス受容体の発現を解析した。ヒトインフルエンザウイルス受容体シアル酸α2,6Galの発現を検出するために、比較実験1に記載の方法で調製した切片を、表1-1又は1-2に記載のビオチン標識したニホンニワトコレクチン(Lectin from Sambucus sieboldiana/SSA-Biotin;J-ケミカル社製)を添加した抗体希釈液を4℃で一晩反応させた後、表2に記載のAlexa594標識ストレプトアビジン(Thermo Fisher Scientific社製)を用いて抗体染色と同様の手法で検出した。また、トリインフルエンザウイルス受容体シアル酸α2,3Galの発現を検出するために、抗Siaα2,3Gal抗体(自家調製、PCT/JP2020/003782に記載の抗体3B1E2)を用いて比較実験1に記載の方法で免疫染色を行った。
染色結果を図15に示す。培養42日目の鼻腔上皮を構成する細胞を含む細胞集団において、シアル酸α2,6Gal(Siaα2,6Gal)を発現する細胞、及びシアル酸α2,3Gal(Siaα2,3Gal)を発現する細胞がそれぞれ観察された。Siaα2,6Galを発現する細胞は、細胞同士が密着して上皮構造を形成している多列上皮状の細胞であった。一方で、Siaα2,3Galを発現する細胞は、単層の扁平上皮様の細胞が多かった。Siaα2,6とSiaα2,3Galは異なる細胞で発現しているようであった。上記の結果から、鼻腔上皮を構成する細胞を含む細胞集団にインフルエンザウイルスが感染する可能性が示された。また、Siaα2,6Gal及びSiaα2,3Galをそれぞれ受容体とするヒトインフルエンザウイルスとトリヒトインフルエンザウイルスとは、鼻腔上皮及び嗅上皮の異なる細胞に感染する可能性が示された。
[実験6:ヒトES細胞由来鼻腔上皮オルガノイドへのインフルエンザウイルス感染及びウイルス増殖試験]
図16に記載の方法で調製したヒトES細胞由来鼻腔上皮オルガノイドを実験に用いた。具体的な製造方法は、工程(3)において、BMPシグナル伝達経路阻害物質として1μMのLDN-193189(メルク社製)を培養6日目より添加したこと、及びTAK1阻害剤5z-7oxozeaenolを添加しなかったこと以外は実験1と同じである。実験6以降のウイルス感染実験には、本製造条件にて調製したヒトES細胞由来鼻腔上皮オルガノイドを用いた。
図16に記載の方法で調製したヒトES細胞由来鼻腔上皮オルガノイドを実験に用いた。具体的な製造方法は、工程(3)において、BMPシグナル伝達経路阻害物質として1μMのLDN-193189(メルク社製)を培養6日目より添加したこと、及びTAK1阻害剤5z-7oxozeaenolを添加しなかったこと以外は実験1と同じである。実験6以降のウイルス感染実験には、本製造条件にて調製したヒトES細胞由来鼻腔上皮オルガノイドを用いた。
培養開始から28日目のヒトES細胞由来鼻腔上皮オルガノイドに10,000PFUのH1N1ヒトインフルエンザウイルスA/California/04/2009(H1N1pdm)を感染させた。24時間ごとに培地を回収し、HA-MDCK細胞を用いたプラーク法により各日におけるウイルスの増殖及び力価を決定した。実験は5連で実施した。
結果を図17に示す。5連で行った実験のうち3回分でウイルスの増殖が観察された。培地に放出されたウイルスの力価は感染後2日目から3日目に最大となり、その後低下した。上記の結果より、本明細書に記載の方法で作製されたヒトES細胞由来鼻腔上皮オルガノイドにインフルエンザウイルスが感染すること、細胞内でのウイルス増殖が起こること、及び感染性を有したウイルス粒子の細胞外への放出が生じることが示された。作製された鼻腔上皮オルガノイドは、インフルエンザウイルス感染症モデルとして使用できることが示された。
[実験7:蛍光抗体法によるヒトES細胞由来鼻腔上皮オルガノイドへのインフルエンザウイルス感染確認]
実験6に記載の方法でヒトインフルエンザウイルスを感染させたヒトES細胞由来鼻腔上皮オルガノイドを、感染から24、48、168又は264時間後に固定し、比較実験1に記載の蛍光抗体法によってヒトインフルエンザウイルスの感染を確認した。インフルエンザウイルスの検出には、表1-1又は1-2に記載の抗インフルエンザウイルス核タンパク質抗体(Influenza NP、AbCam社製、ab20343)を用い、核の対比染色には1μg/mlのDAPI(ナカライテスク社製)を二次抗体希釈液中に添加した。
実験6に記載の方法でヒトインフルエンザウイルスを感染させたヒトES細胞由来鼻腔上皮オルガノイドを、感染から24、48、168又は264時間後に固定し、比較実験1に記載の蛍光抗体法によってヒトインフルエンザウイルスの感染を確認した。インフルエンザウイルスの検出には、表1-1又は1-2に記載の抗インフルエンザウイルス核タンパク質抗体(Influenza NP、AbCam社製、ab20343)を用い、核の対比染色には1μg/mlのDAPI(ナカライテスク社製)を二次抗体希釈液中に添加した。
感染から24、48、168及び264時間後の鼻腔上皮オルガノイドは、いずれも最も外側に位置するSox2陽性の嗅上皮中の細胞の一部に、抗インフルエンザウイルス核タンパク質抗体染色が陽性の細胞が存在した。感染から24時間後の染色結果を図18に示す。上記の結果から、本明細書に記載の方法で作製されたヒトES細胞由来鼻腔上皮オルガノイドにインフルエンザウイルスが感染することが確認された。
[実験8:ヒトES細胞由来鼻腔上皮オルガノイドへのコロナウイルスSARS-CoV-2感染・ウイルス増殖試験]
実験6に記載の方法で調製した、培養開始から28日目のヒトES細胞由来鼻腔上皮オルガノイドを用いてコロナウイルス感染実験を実施した。オルガノイドへのウイルス感染の方法としては、5%KSR gfCDM培地でウイルス液を調製し、培養中のオルガノイドの培地を除き、ウイルス液50μLを加えて37℃で5%CO2インキュベーターで1時間培養した。ウイルス液を除き、200μL 5%KSR gfCDM培地で、上記オルガノイドを2回洗浄した後、200μL 5%KSR gfCDM培地を加えて、CO2インキュベーターで培養した。ウイルス感染は、低濃度条件:10,000 TCID50又は高濃度条件:100,000 TCID50の2条件で、SARS-CoV-2(SARS-CoV-2/Hu/DP/Kng/19-027)を用いて行った。
実験6に記載の方法で調製した、培養開始から28日目のヒトES細胞由来鼻腔上皮オルガノイドを用いてコロナウイルス感染実験を実施した。オルガノイドへのウイルス感染の方法としては、5%KSR gfCDM培地でウイルス液を調製し、培養中のオルガノイドの培地を除き、ウイルス液50μLを加えて37℃で5%CO2インキュベーターで1時間培養した。ウイルス液を除き、200μL 5%KSR gfCDM培地で、上記オルガノイドを2回洗浄した後、200μL 5%KSR gfCDM培地を加えて、CO2インキュベーターで培養した。ウイルス感染は、低濃度条件:10,000 TCID50又は高濃度条件:100,000 TCID50の2条件で、SARS-CoV-2(SARS-CoV-2/Hu/DP/Kng/19-027)を用いて行った。
ウイルス力価測定のため、毎日培養上清を50μLずつ回収し、-80℃で保存した。培地を回収したウェルには、5%KSR gfCDM培地を50μLずつ添加した。ウイルスの力価は次の手順で測定した。96ウェルプレートにVeroE6/TMPRSS2細胞を播種し、ウイルス含有培養上清を5%FCS DMEMで10倍階段希釈して添加した。1希釈につき3ウェル以上に接種した。CO2インキュベーターで、4~5日間培養後に細胞を観察し、細胞変性効果(CPE)の有無を判定した。CPE陽性ウェル数からReed-Muench法によりTCID50を算出し、ウイルスの力価とした。実験は低濃度条件(図19のL1からL5)及び高濃度条件(図19のH1からH5)について各々5連で実施した。
結果を図19に示す。低濃度条件では5連で行った実験のうち1回分(L3)、高濃度条件では5回実施したすべての回(H1からH5)でウイルスの増殖が観察された。培地中に放出されたウイルスの力価は感染後2日目から3日目に最大となり、その後一旦低下し、感染後7日目以降に再度上昇した。その後、感染後15日目から17日目にかけて第二のピークを迎え、その後低下したものの、感染後22日目でもウイルスの産生は持続していた。上記のようなウイルス力価の再上昇は、性質が一様な培養細胞ではなく、生体由来の組織を用いてウイルス増殖試験を実施した際によく観察される現象である。上記の結果より、本明細書に記載の方法で作製されたヒトES細胞由来鼻腔上皮オルガノイドにSARS-CoV-2が感染すること、細胞内でのウイルス増殖が起こること、及び感染性を有したウイルス粒子の細胞外への放出が生じることが示された。また、力価の再上昇が生じることから、上記オルガノイドは生体由来の組織に近い性質を有していることも示された。鼻腔上皮・嗅上皮オルガノイドは、コロナウイルス感染症モデルとして使用できることが示された。オルガノイドから継続してウイルスが産生されていることから、鼻腔上皮・嗅上皮オルガノイドはコロナウイルスに対する持続的感染モデルとしても使用可能であることが分かった。
[実験9:蛍光抗体法によるヒトES細胞由来鼻腔上皮オルガノイドへのコロナウイルスSARS-CoV-2感染確認]
まず、比較実験1に記載の蛍光抗体法によって感染前の細胞集団の解析を行った。続いて、上記実験8の方法でSARS-CoV-2を感染させた感染から2日後及び11日後のヒトES細胞由来鼻腔上皮オルガノイドを固定し、蛍光抗体法によってSARS-CoV-2の感染を確認した。SARS-CoV-2の検出には、表1-1又は1-2に記載の抗SARS核タンパク質抗体(SARS2 NP、GeneTex社製、GNT-GTX135357)を用い、核の対比染色には1μg/mlのDAPI(ナカライテスク社製)を二次抗体希釈液中に添加した。
まず、比較実験1に記載の蛍光抗体法によって感染前の細胞集団の解析を行った。続いて、上記実験8の方法でSARS-CoV-2を感染させた感染から2日後及び11日後のヒトES細胞由来鼻腔上皮オルガノイドを固定し、蛍光抗体法によってSARS-CoV-2の感染を確認した。SARS-CoV-2の検出には、表1-1又は1-2に記載の抗SARS核タンパク質抗体(SARS2 NP、GeneTex社製、GNT-GTX135357)を用い、核の対比染色には1μg/mlのDAPI(ナカライテスク社製)を二次抗体希釈液中に添加した。
感染前の細胞集団の染色結果を図20に示す。未感染の培養28日目のヒトES細胞由来鼻腔上皮オルガノイドでは、細胞塊の表面に鼻腔上皮(RE)と嗅上皮(OE)が連続した、サイトケラチン18(CK18)陽性の上皮構造が形成されていた。このうち、鼻腔上皮部分はサイトケラチン15(CK15)陽性であり、嗅上皮部分はSix1、Sox2陽性であった。鼻腔上皮(RE)の部分で特に強くSARS-CoV-2の受容体であるACE2を発現していた。
感染から48時間後のヒトES細胞由来鼻腔上皮オルガノイドの染色結果を図21及び図22に示す。鼻腔上皮オルガノイドの最も外側に位置し、Sox2陽性かつ一部の細胞がTuj1陽性の嗅神経である嗅上皮中の細胞の一部に抗SARS核タンパク質抗体染色が陽性の細胞が存在した(図21のA及びB、図22のB)。加えて、サイトケラチン15(KRT15)陽性の上皮組織である鼻腔上皮はSARS-CoV-2ウイルス受容体であるACE2を発現しており、一部の細胞は抗SARS核タンパク質抗体染色が陽性であった(図21のC及びD、図22のA)。加えて、鼻腔上皮オルガノイドの一部の細胞がFoxI1を発現しており、塩類細胞(イオノサイト)又はその前駆細胞が鼻腔上皮オルガノイド中に含まれることが示された。FoxI1陽性細胞の一部はSARS-CoV-2核タンパク質陽性であった(図22のC)。上記の結果から、本明細書に記載の方法で作製されたヒトES細胞由来鼻腔上皮オルガノイドにSARS-CoV-2が感染することが示された。また、コロナウイルスSARS-CoV-2は、鼻腔上皮と嗅上皮それぞれに感染することが示された。本明細書に記載の方法で鼻腔上皮の塩類細胞が製造可能であり、SARS-CoV-2は塩類細胞に感染する可能性が示された。
感染11日後のヒトES細胞由来鼻腔上皮オルガノイドを図23に示す。Sp8陽性の嗅上皮(OE)部分が細胞塊表面に残存していた。加えて、細胞塊内部の細胞も抗SARS核タンパク質抗体染色が陽性であった。細胞塊内部のSARS-CoV-2感染細胞はTuj1陽性であり、中枢神経系の神経細胞であることが示された。これらの結果から、本明細書に記載の方法で作製されたヒトES細胞由来鼻腔上皮オルガノイドを、SARS-CoV-2の鼻腔上皮・嗅上皮から中枢神経系への感染伝播モデルとして使用できることが示された。
[実験10:透過型電子顕微鏡を用いたヒトES細胞由来鼻腔上皮オルガノイドへのSARS-CoV-2感染確認]
実験8に記載の方法でSARS-CoV-2を感染させたヒトES細胞由来鼻腔上皮オルガノイドを電子顕微鏡で観察した。ウイルス感染から48時間後に培地を取り除き、ウイルスに感染させたオルガノイドを2.5%グルタールアルデヒドで氷上で1時間固定した。固定したオルガノイドを0.1Mカコジル酸バッファーで洗浄し、さらに1%四酸化オスミウムで氷上で1時間固定した。オルガノイドを超純水で洗浄後、50%~99%エタノール希釈系列で脱水し、プロピレンオキシドにより置換した。オルガノイドをエポキシ樹脂に包埋後、60℃で2日間重合させた。ウルトラミクロトームを用いて包埋したオルガノイドの50nm厚の超薄切片を薄切し、酢酸ウラン及びクエン酸鉛を用いて電子染色後、透過型電子顕微鏡(日立株式会社製、製品番号HT-7700)によって撮像した。
実験8に記載の方法でSARS-CoV-2を感染させたヒトES細胞由来鼻腔上皮オルガノイドを電子顕微鏡で観察した。ウイルス感染から48時間後に培地を取り除き、ウイルスに感染させたオルガノイドを2.5%グルタールアルデヒドで氷上で1時間固定した。固定したオルガノイドを0.1Mカコジル酸バッファーで洗浄し、さらに1%四酸化オスミウムで氷上で1時間固定した。オルガノイドを超純水で洗浄後、50%~99%エタノール希釈系列で脱水し、プロピレンオキシドにより置換した。オルガノイドをエポキシ樹脂に包埋後、60℃で2日間重合させた。ウルトラミクロトームを用いて包埋したオルガノイドの50nm厚の超薄切片を薄切し、酢酸ウラン及びクエン酸鉛を用いて電子染色後、透過型電子顕微鏡(日立株式会社製、製品番号HT-7700)によって撮像した。
結果を図24に示す。SARS-CoV-2を感染させたヒトES細胞由来鼻腔上皮オルガノイド中の細胞の表面及び細胞内にSARS-CoV-2のウイルス粒子が存在していた。さらに、感染した細胞内に二重膜小胞:double-membrane vesicles(DMV)、二重膜小球:double-membrane spherules (DMS)といった、コロナウイルスを含むある種のウイルスへの感染時に形成される特徴的な細胞内構造が観察された。上記の結果から、本明細書に記載の方法で作製されたヒトES細胞由来鼻腔上皮オルガノイドにSARS-CoV-2等のウイルスが感染すること、及び細胞内でウイルスの複製・増殖が生じることが示された。
[実験11:ヒトES細胞由来嗅上皮・鼻腔上皮オルガノイドを用いたシングルセル解析]
培養28日目のヒトES細胞由来鼻腔上皮オルガノイド、及び実験6に記載の方法でSARS-CoV-2を感染させた感染後2、7、11日目のヒトES細胞由来鼻腔上皮オルガノイドを実験に用いた。1条件あたりオルガノイド4個を15mlチューブ中で10U/mL papain(Worthington Biochemical、LS003119)と500μg/mL DNase I(Roche、10104159001)で37℃15分間処理した。上記処理後に10%ウシ胎児血清含有培地添加により酵素反応を停止し、P1000のマイクロピペットを用いて単細胞に分散後、孔径40μmのセルストレーナーを用いて夾雑物を除去した。上記細胞懸濁液をスイングローターで遠心(1000rpm、5分)し、上清を除いた後に細胞のペレットを0.04% BSA入りのPBSで1×106cells/mLの濃度となるように再度懸濁した。約16,000個の細胞相当の上記懸濁液をChromium Next GEM Single Cell 3’GEM,Library&Gel Bead Kit v3.1(10x Genomics社製、PN-1000121及びPN-1000128)とともにシングルセル解析用のチップChromium Next GEM Chip G Single Cell Kit(10x Genomics社製、PN-1000120)に添加し、キット付属の手順書に従いSingle Index Kit T Set A(10x Genomics社製、PN-1000213)を用いてChromium Controller(10x Genomics社製)によりシングルセル解析用のcDNAライブラリを調製した。調製した各サンプルのcDNAライブラリをNovaSeq S4 2×150bp(Illumina社製)を用いて配列を解読し、得られたデータをCell Ranger software(version 4.0.0)、Seurat v4.0及びR package Seurat(version 4.0.3)を用いて解析した。
培養28日目のヒトES細胞由来鼻腔上皮オルガノイド、及び実験6に記載の方法でSARS-CoV-2を感染させた感染後2、7、11日目のヒトES細胞由来鼻腔上皮オルガノイドを実験に用いた。1条件あたりオルガノイド4個を15mlチューブ中で10U/mL papain(Worthington Biochemical、LS003119)と500μg/mL DNase I(Roche、10104159001)で37℃15分間処理した。上記処理後に10%ウシ胎児血清含有培地添加により酵素反応を停止し、P1000のマイクロピペットを用いて単細胞に分散後、孔径40μmのセルストレーナーを用いて夾雑物を除去した。上記細胞懸濁液をスイングローターで遠心(1000rpm、5分)し、上清を除いた後に細胞のペレットを0.04% BSA入りのPBSで1×106cells/mLの濃度となるように再度懸濁した。約16,000個の細胞相当の上記懸濁液をChromium Next GEM Single Cell 3’GEM,Library&Gel Bead Kit v3.1(10x Genomics社製、PN-1000121及びPN-1000128)とともにシングルセル解析用のチップChromium Next GEM Chip G Single Cell Kit(10x Genomics社製、PN-1000120)に添加し、キット付属の手順書に従いSingle Index Kit T Set A(10x Genomics社製、PN-1000213)を用いてChromium Controller(10x Genomics社製)によりシングルセル解析用のcDNAライブラリを調製した。調製した各サンプルのcDNAライブラリをNovaSeq S4 2×150bp(Illumina社製)を用いて配列を解読し、得られたデータをCell Ranger software(version 4.0.0)、Seurat v4.0及びR package Seurat(version 4.0.3)を用いて解析した。
培養28日目にSARS-CoV-2を感染させた培養30日目、すなわち感染後2日目(2days post infection(dpi))のヒトES細胞由来鼻腔上皮オルガノイドを解析して得られたデータより作成したt分布型確率的近傍埋め込み(t-SNE)のプロット図を図25のAに示す。クラスタリングの結果、上記オルガノイドに含まれる細胞を嗅上皮・鼻腔上皮の細胞集団(NE)と中枢神経系の細胞集団(CNS)に分類できた。さらに、嗅上皮、鼻腔上皮、中枢神経系で発現が高い遺伝子、及びSARS-CoV-2由来転写産物の1細胞ごとの発現量を示したバイオリン図を図25のBに示す。解析の結果、NEは嗅上皮・鼻腔上皮で発現するサイトケラチン18、サイトケラチン19、Six1遺伝子の発現が高い細胞集団であった。CNSは中枢神経系で発現するFoxg1、Irx3、Tbr1、Reelin、Emx1遺伝子の発現が高い細胞集団であった。SARS-CoV-2の感染を示す、SARS-CoV-2由来転写産物である膜(M)タンパク質とスパイク(S)タンパク質は、NEでより多くの発現する細胞が見られたが、CNSでも発現する細胞が観察された。上記の結果より、本発明に記載の方法で製造した細胞集団は、嗅上皮・鼻腔上皮の細胞及び中枢神経系の細胞を含有し、さらにSARS-CoV-2が感染することが示された。
[実験12:ヒトES細胞由来嗅上皮・鼻腔上皮オルガノイドに含まれる細胞のクラスタリング解析]
実験11の培養28日目のヒトES細胞由来鼻腔上皮オルガノイドに含まれる嗅上皮・鼻腔上皮の細胞集団(NE)をさらにクラスタリング解析した。クラスタリングの結果、上記上皮・鼻腔上皮の細胞集団を6つのクラスターに分類できた。6つのクラスターのt分布型確率的近傍埋め込み(t-SNE)のプロット図を図26に示す。さらに、各クラスターにおける嗅上皮を構成する各細胞のマーカー遺伝子の発現について解析し、上記t-SNEプロット図において遺伝子ごとに発現量を反映した色付けを実施した結果を図27に示す。解析の結果、6つのクラスターは各々、神経前駆細胞マーカーであるNeuroD1及びAscl1の発現量が高い集団((1)NPC)、嗅神経マーカーであるSTOML3及びGNG13の発現量が高い集団((2)OSC)、未成熟嗅神経マーカーであるGNG8の発現量が高い集団((3)imOSC)、分泌細胞・杯細胞マーカーであるMUC5ACの発現量が高い集団((4)MUC)、水平基底細胞マーカーであるサイトケラチン5の発現量が高い集団((5)HBC)、支持細胞マーカーであるCYP2A13及びELF5の発現量が高い集団((6)SUS)であった。
実験11の培養28日目のヒトES細胞由来鼻腔上皮オルガノイドに含まれる嗅上皮・鼻腔上皮の細胞集団(NE)をさらにクラスタリング解析した。クラスタリングの結果、上記上皮・鼻腔上皮の細胞集団を6つのクラスターに分類できた。6つのクラスターのt分布型確率的近傍埋め込み(t-SNE)のプロット図を図26に示す。さらに、各クラスターにおける嗅上皮を構成する各細胞のマーカー遺伝子の発現について解析し、上記t-SNEプロット図において遺伝子ごとに発現量を反映した色付けを実施した結果を図27に示す。解析の結果、6つのクラスターは各々、神経前駆細胞マーカーであるNeuroD1及びAscl1の発現量が高い集団((1)NPC)、嗅神経マーカーであるSTOML3及びGNG13の発現量が高い集団((2)OSC)、未成熟嗅神経マーカーであるGNG8の発現量が高い集団((3)imOSC)、分泌細胞・杯細胞マーカーであるMUC5ACの発現量が高い集団((4)MUC)、水平基底細胞マーカーであるサイトケラチン5の発現量が高い集団((5)HBC)、支持細胞マーカーであるCYP2A13及びELF5の発現量が高い集団((6)SUS)であった。
分類された6つのクラスターにおいて、特徴的に発現が高い遺伝子(Differentially Expressed Genes(DEG))を選抜し、遺伝子発現のヒートマップを作製した。クラスター毎のDEG発現量のヒートマップを図28に示す。6つのクラスター各々のDEGを図29及び図30に示す。解析の結果、各クラスターはDEGの発現量において各々異なった特徴的な発現プロファイルを示し、異なる種類の細胞であることが示された。加えて、(2)OSCと(3)imOSCのようにクラスター間でプロファイルが似ている組み合わせが存在し、集団同士の発生・分化上の関係性を示していた。上記の結果から、本発明のヒトES細胞由来鼻腔上皮オルガノイドに含まれる嗅上皮・鼻腔上皮の細胞集団は、少なくとも6種の細胞を含んでおり、それぞれ神経前駆細胞、嗅神経細胞、未成熟嗅神経細胞、分泌細胞・杯細胞、水平基底細胞、支持細胞であることが示された。
[実験13:ヒトES細胞由来嗅上皮・鼻腔上皮オルガノイドとヒト患者検体由来嗅上皮・鼻腔上皮組織の比較]
ヒトES細胞由来鼻腔上皮オルガノイドに含まれる細胞集団をヒトの嗅上皮・鼻腔上皮組織と比較した。ヒト患者検体由来嗅上皮・鼻腔上皮組織のシングルセル解析データのt-SNEプロット図を図31のAに示す。神経前駆細胞(NPC)、嗅神経細胞(OSC)、未成熟嗅神経細胞(imOSC)、分泌細胞・杯細胞(MUC)、水平基底細胞(HBC)、支持細胞(SUS)の細胞集団に加えて、さらにFoxJ1を発現する線毛細胞(CE)の細胞集団が存在していた。
ヒトES細胞由来鼻腔上皮オルガノイドに含まれる細胞集団をヒトの嗅上皮・鼻腔上皮組織と比較した。ヒト患者検体由来嗅上皮・鼻腔上皮組織のシングルセル解析データのt-SNEプロット図を図31のAに示す。神経前駆細胞(NPC)、嗅神経細胞(OSC)、未成熟嗅神経細胞(imOSC)、分泌細胞・杯細胞(MUC)、水平基底細胞(HBC)、支持細胞(SUS)の細胞集団に加えて、さらにFoxJ1を発現する線毛細胞(CE)の細胞集団が存在していた。
上記ヒト患者検体とヒトES細胞由来鼻腔上皮オルガノイドのシングルセル解析データを比較した。図31のBの枠線内に示すとおり、ヒトES細胞由来鼻腔上皮オルガノイドに含まれる細胞は、ヒト患者検体由来の細胞と非常に似通った位置にプロットされた。上記の結果から、本発明のヒトES細胞由来鼻腔上皮オルガノイドを構成している細胞は、ヒト組織と同様の細胞から構成されていることが示された。さらに、ヒトES細胞由来鼻腔上皮オルガノイドが、少数の細胞であるがFoxJ1を発現している線毛細胞も含有していた。
[実験14:ヒトES細胞由来嗅上皮・鼻腔上皮オルガノイドを用いた嗅覚受容体発現のシングルセル解析]
ヒトES細胞由来鼻腔上皮オルガノイドに含まれる嗅神経細胞における嗅覚受容体の発現を、ヒトの嗅上皮・鼻腔上皮組織と比較した。ヒト患者検体由来嗅上皮・鼻腔上皮組織のシングルセル解析データの遺伝子発現ヒートマップを図32のAに示す。ヒト患者検体においてGNG8、GNG13及びSTOML3を発現する嗅神経細胞は、大多数が細胞ごとに異なる1種の嗅覚受容体のみを発現していた。一方で、ヒトES細胞由来鼻腔上皮オルガノイドの嗅神経細胞は一つの細胞に複数の嗅覚受容体が発現していた(図32のB)。上記の結果から、ヒトES細胞由来鼻腔上皮オルガノイドは、嗅覚受容体を発現していること、及びヒト成体の嗅上皮組織と比較して、嗅覚受容体を複数発現する未成熟な嗅神経細胞をより多く含んでいることが示された。
ヒトES細胞由来鼻腔上皮オルガノイドに含まれる嗅神経細胞における嗅覚受容体の発現を、ヒトの嗅上皮・鼻腔上皮組織と比較した。ヒト患者検体由来嗅上皮・鼻腔上皮組織のシングルセル解析データの遺伝子発現ヒートマップを図32のAに示す。ヒト患者検体においてGNG8、GNG13及びSTOML3を発現する嗅神経細胞は、大多数が細胞ごとに異なる1種の嗅覚受容体のみを発現していた。一方で、ヒトES細胞由来鼻腔上皮オルガノイドの嗅神経細胞は一つの細胞に複数の嗅覚受容体が発現していた(図32のB)。上記の結果から、ヒトES細胞由来鼻腔上皮オルガノイドは、嗅覚受容体を発現していること、及びヒト成体の嗅上皮組織と比較して、嗅覚受容体を複数発現する未成熟な嗅神経細胞をより多く含んでいることが示された。
[実験15:ヒトES細胞由来嗅上皮・鼻腔上皮オルガノイドを用いた免疫関連遺伝子発現のシングルセル解析]
培養28日目にSARS-CoV-2を感染させた培養30日目すなわち感染後2日目のヒトES細胞由来鼻腔上皮オルガノイドについて、免疫関連遺伝子の発現をシングルセル解析して得られた遺伝子発現ヒートマップを図33に示す。図33の破線部の拡大図を図34に示す。上記シングルセル解析データにおける個別遺伝子発現のUMAP解析の結果を図35及び図36に示す。解析の結果、ヒトES細胞由来鼻腔上皮オルガノイドに含まれる鼻腔上皮(NRE)及び嗅上皮細胞(OE)の細胞において、SARS-CoV-2由来転写産物であるORF10及びorf1abを発現する細胞が検出された。上記感染細胞の遺伝子発現を解析したところ、感染した鼻腔上皮細胞の一部は、IL32、IL1A、IL6、CXCL8、IFNL1~3及びIFNB1を高発現していた(図34及び図35)。上記の結果は、本発明のヒトES細胞由来嗅上皮・鼻腔上皮オルガノイドはSARS-CoV-2感染時に生じる免疫応答をインビトロで再現可能であることを示している。特に、I型インターフェロンであるIFNB1、III型インターフェロンであるIFNL1~3、及びサイトカイン・インターロイキンであるIL32、IL1A、IL6、CXCL8の発現上昇が観察されたことから、これらの免疫応答を再現可能であることを示している。
培養28日目にSARS-CoV-2を感染させた培養30日目すなわち感染後2日目のヒトES細胞由来鼻腔上皮オルガノイドについて、免疫関連遺伝子の発現をシングルセル解析して得られた遺伝子発現ヒートマップを図33に示す。図33の破線部の拡大図を図34に示す。上記シングルセル解析データにおける個別遺伝子発現のUMAP解析の結果を図35及び図36に示す。解析の結果、ヒトES細胞由来鼻腔上皮オルガノイドに含まれる鼻腔上皮(NRE)及び嗅上皮細胞(OE)の細胞において、SARS-CoV-2由来転写産物であるORF10及びorf1abを発現する細胞が検出された。上記感染細胞の遺伝子発現を解析したところ、感染した鼻腔上皮細胞の一部は、IL32、IL1A、IL6、CXCL8、IFNL1~3及びIFNB1を高発現していた(図34及び図35)。上記の結果は、本発明のヒトES細胞由来嗅上皮・鼻腔上皮オルガノイドはSARS-CoV-2感染時に生じる免疫応答をインビトロで再現可能であることを示している。特に、I型インターフェロンであるIFNB1、III型インターフェロンであるIFNL1~3、及びサイトカイン・インターロイキンであるIL32、IL1A、IL6、CXCL8の発現上昇が観察されたことから、これらの免疫応答を再現可能であることを示している。
SARS-CoV-2由来転写産物であるORF10及びorf1abの発現の有無に関わらず、ヒトES細胞由来鼻腔上皮オルガノイドに含まれる細胞は、一定程度のIFNAR1、IFNGR1、IL1R1といったインターフェロン・インターロイキンの受容体を発現していた(図33アスタリスク)。加えて、大多数のSARS-CoV-2由来転写産物であるSタンパク質を発現していない細胞を含む細胞集団全体で、SARS-CoV-2感染後に、インターフェロン刺激により誘導される遺伝子ISG15の発現が亢進していた(図36)。上記の結果は、本発明に係る細胞集団(細胞塊)において、ウイルスに感染した細胞から分泌されたサイトカインに対する非感染細胞の免疫応答がインビトロで再現されていることを示している。
[実験16:CRISPR-Cas9システムを用いたACE2ノックアウトヒトES細胞株の樹立]
CRISPR-Cas9システムを用いたノックアウトを実施するために、ゲノム上のヒトACE2遺伝子[LocusID(NCBI)59272]の5‘UTR領域(5’-CAAATGATGGAATCAGAACA-3’)及び第2イントロン領域(5’-ACTAAACTTAATTGACCCTG-3’)の配列をそれぞれコードしたガイドRNA発現ベクターを調製した。発現ベクターにはCas-9 sgRNA vector(Addgene、#68463)を用いた。上記2種のガイドRNA発現ベクターをCas9発現ベクター(Cas9-2A-eGFP、Addgene、#44719)とともにヒトES細胞株(KhES-1)にLipofectamine Stem reagent(サーモフィッシャー社製)を用いて同時に遺伝子導入した。導入したプラスミドの模式図を図37Aに示す。導入したガイドRNA及びCas9の機能によりACE2遺伝子の5‘UTR領域及び第2イントロン領域の標的領域においてDNAの二本鎖切断が生じ、細胞の有する非相同末端結合修復(NHEJ)により標的領域の欠失が生じる(図37B)。
CRISPR-Cas9システムを用いたノックアウトを実施するために、ゲノム上のヒトACE2遺伝子[LocusID(NCBI)59272]の5‘UTR領域(5’-CAAATGATGGAATCAGAACA-3’)及び第2イントロン領域(5’-ACTAAACTTAATTGACCCTG-3’)の配列をそれぞれコードしたガイドRNA発現ベクターを調製した。発現ベクターにはCas-9 sgRNA vector(Addgene、#68463)を用いた。上記2種のガイドRNA発現ベクターをCas9発現ベクター(Cas9-2A-eGFP、Addgene、#44719)とともにヒトES細胞株(KhES-1)にLipofectamine Stem reagent(サーモフィッシャー社製)を用いて同時に遺伝子導入した。導入したプラスミドの模式図を図37Aに示す。導入したガイドRNA及びCas9の機能によりACE2遺伝子の5‘UTR領域及び第2イントロン領域の標的領域においてDNAの二本鎖切断が生じ、細胞の有する非相同末端結合修復(NHEJ)により標的領域の欠失が生じる(図37B)。
遺伝子導入実施より2日後にeGFP陽性細胞をセルソーターによって分取し、低密度で播種し、単一の細胞に由来するコロニーをピックアップし、クローニングを実施した。得られたコロニーをCas9標的領域のゲノムPCR及びゲノムシークエンスによって評価し、ゲノムの両アリルにおいてACE2遺伝子のExon1とExon2が欠損したクローン2株(clone #1、#8)を得た。クローニングしたこれら2株を図16に記載の方法で分化誘導を実施し、培養28日目にRIPAバッファーによりライセートサンプル調製を実施し、抗ACE2抗体及びローディングコントロールである抗βアクチン抗体を用いたウエスタンブロットを実施した。その結果、コントロールの野生型KhES-1ではACE2の発現が確認されたが、clone #1及び#8では培養28日目の嗅上皮・鼻腔上皮への分化後もACE2の発現が観察されなかった(図37のC)。上記の結果より、clone #1及び#8がACE2ノックアウトヒトES細胞株として樹立されたことが示された。
[実験17:ACE2ノックアウトヒトES細胞株由来嗅上皮・鼻腔上皮オルガノイドの形成とSARS-CoV-2感染実験]
実験16で樹立したACE2ノックアウトヒトES細胞株Clone #1を、図16に記載の方法で分化誘導を実施し、嗅上皮・鼻腔上皮オルガノイドを作製した。その後、実験8の高濃度条件と同じ方法でSARS-CoV-2を感染させ、感染から2日後に固定し、蛍光抗体法による解析を実施した。染色結果を図38に示す。ACE2ノックアウトヒトES細胞株由来嗅上皮・鼻腔上皮オルガノイドにおいてKRT15陽性の鼻腔上皮(NRE)、Sp8陽性の嗅上皮(OE)が形成されており、ACE2ノックアウト株は親株と同様の嗅上皮・鼻腔上皮への分化能を有していることが示された。嗅上皮様組織及び鼻腔上皮様組織においてACE2の発現は検出されず、ACE2遺伝子がノックアウトされていることが確認された。ACE2ノックアウトヒトES細胞株由来嗅上皮・鼻腔上皮オルガノイドにおいては、実験8と同じ感染条件によってもSARS-CoV-2感染細胞が検出されなかった。従って、SARS-CoV-2がACE2に依存して感染すること、及びACE2ノックアウトヒトES細胞株由来嗅上皮・鼻腔上皮オルガノイドがSARS-CoV-2の感染に対し抵抗性を有することが示された。
実験16で樹立したACE2ノックアウトヒトES細胞株Clone #1を、図16に記載の方法で分化誘導を実施し、嗅上皮・鼻腔上皮オルガノイドを作製した。その後、実験8の高濃度条件と同じ方法でSARS-CoV-2を感染させ、感染から2日後に固定し、蛍光抗体法による解析を実施した。染色結果を図38に示す。ACE2ノックアウトヒトES細胞株由来嗅上皮・鼻腔上皮オルガノイドにおいてKRT15陽性の鼻腔上皮(NRE)、Sp8陽性の嗅上皮(OE)が形成されており、ACE2ノックアウト株は親株と同様の嗅上皮・鼻腔上皮への分化能を有していることが示された。嗅上皮様組織及び鼻腔上皮様組織においてACE2の発現は検出されず、ACE2遺伝子がノックアウトされていることが確認された。ACE2ノックアウトヒトES細胞株由来嗅上皮・鼻腔上皮オルガノイドにおいては、実験8と同じ感染条件によってもSARS-CoV-2感染細胞が検出されなかった。従って、SARS-CoV-2がACE2に依存して感染すること、及びACE2ノックアウトヒトES細胞株由来嗅上皮・鼻腔上皮オルガノイドがSARS-CoV-2の感染に対し抵抗性を有することが示された。
[実験18:ACE2ノックアウトヒトES細胞株由来鼻腔上皮オルガノイドへのコロナウイルスSARS-CoV-2感染・ウイルス増殖試験]
実験16で樹立したACE2ノックアウトヒトES細胞株Clone #1を、図16に記載の方法で分化誘導を実施し、嗅上皮・鼻腔上皮オルガノイドを作製した。その後、実験8に記載の方法で鼻腔上皮オルガノイドへのコロナウイルスSARS-CoV-2感染・ウイルス増殖試験を実施した。実験はウイルス量低濃度条件(図39のL1からL5)及び高濃度条件(図39のH1からH5)について各々5連で実施した。
実験16で樹立したACE2ノックアウトヒトES細胞株Clone #1を、図16に記載の方法で分化誘導を実施し、嗅上皮・鼻腔上皮オルガノイドを作製した。その後、実験8に記載の方法で鼻腔上皮オルガノイドへのコロナウイルスSARS-CoV-2感染・ウイルス増殖試験を実施した。実験はウイルス量低濃度条件(図39のL1からL5)及び高濃度条件(図39のH1からH5)について各々5連で実施した。
その結果、野生型のヒトES細胞株由来鼻腔上皮オルガノイドにSARS-CoV-2を感染させた際に計測された感染後1日目から3日目のウイルスの増殖、力価の上昇は、低濃度条件、高濃度条件のいずれでもACE2ノックアウトヒトES細胞株由来鼻腔上皮オルガノイドへの感染実験では見られず、感染後4日目以降は検出限界以下となった。野生型で生じた感染後10日目以降の力価の再上昇も検出されなかった。従って、SARS-CoV-2がACE2に依存して感染すること、及びACE2ノックアウトヒトES細胞株由来嗅上皮・鼻腔上皮オルガノイドがSARS-CoV-2の感染に対し抵抗性を有することが示された。
[実験19:振盪培養によるヒトiPS細胞由来嗅上皮・鼻腔上皮オルガノイドの長期培養による分化・成熟の誘導]
実験19では、図40に示す工程に従って、嗅上皮を構成する細胞及び鼻腔上皮を構成する細胞を含む細胞集団を製造した。実験19では、実験2と同じように工程(1)からJNK阻害剤を添加し、さらに、工程(3)の途中からアスコルビン酸2リン酸(AA2P)、ニコチンアミド(NAD)、N-アセチル-L-システイン(NAC)を添加して培養し、その後培養28日目から振盪培養を実施した。多能性細胞としてはヒトiPS細胞株1231A3を用いた。具体的な実験操作としては、実験4と同じ方法で28日間培養した後、先太のチップを用いて嗅上皮・鼻腔上皮を含む細胞塊をコニカルチューブに回収した。増殖因子及び阻害剤を添加しない5% KSR gfCDM培地を用いて細胞塊を2回洗浄した後、25mLの10%KSR gfCDM培地を入れた細胞非接着性の培養用75cm2フラスコ(コーニング社製、353133)に96個の細胞塊を移設した。その際の培地には1μM SB431542、100nM EC23、20ng/ml bFGF-TS、10μg/ml Heparin Sodium、20ng/ml EGF、250μM AA2P、1mM NAC、500μM NADを添加した。サンフラワー式シェーカー(Mini-Shaker 3D、バイオサン社製)による5rpmの波動形揺動の条件下で振盪培養を実施した。培養45日目及び59日目に位相差像の観察を実施した。培養59日目の試料を固定して比較実験1に記載の方法で免疫染色を実施した。前記した実験で使用した表1-1又は1-2に記載の抗Six1、Sox2、E-Cadherin、Sp8抗体に加え、神経系の上皮組織及びプラコードで発現する抗N-Cadherin抗体、嗅上皮領域のマーカーである抗サイトケラチン18(CK18)抗体並びに表2に記載の二次抗体を用いて免疫染色を行なった。染色結果を図40に示す。
実験19では、図40に示す工程に従って、嗅上皮を構成する細胞及び鼻腔上皮を構成する細胞を含む細胞集団を製造した。実験19では、実験2と同じように工程(1)からJNK阻害剤を添加し、さらに、工程(3)の途中からアスコルビン酸2リン酸(AA2P)、ニコチンアミド(NAD)、N-アセチル-L-システイン(NAC)を添加して培養し、その後培養28日目から振盪培養を実施した。多能性細胞としてはヒトiPS細胞株1231A3を用いた。具体的な実験操作としては、実験4と同じ方法で28日間培養した後、先太のチップを用いて嗅上皮・鼻腔上皮を含む細胞塊をコニカルチューブに回収した。増殖因子及び阻害剤を添加しない5% KSR gfCDM培地を用いて細胞塊を2回洗浄した後、25mLの10%KSR gfCDM培地を入れた細胞非接着性の培養用75cm2フラスコ(コーニング社製、353133)に96個の細胞塊を移設した。その際の培地には1μM SB431542、100nM EC23、20ng/ml bFGF-TS、10μg/ml Heparin Sodium、20ng/ml EGF、250μM AA2P、1mM NAC、500μM NADを添加した。サンフラワー式シェーカー(Mini-Shaker 3D、バイオサン社製)による5rpmの波動形揺動の条件下で振盪培養を実施した。培養45日目及び59日目に位相差像の観察を実施した。培養59日目の試料を固定して比較実験1に記載の方法で免疫染色を実施した。前記した実験で使用した表1-1又は1-2に記載の抗Six1、Sox2、E-Cadherin、Sp8抗体に加え、神経系の上皮組織及びプラコードで発現する抗N-Cadherin抗体、嗅上皮領域のマーカーである抗サイトケラチン18(CK18)抗体並びに表2に記載の二次抗体を用いて免疫染色を行なった。染色結果を図40に示す。
振盪培養を実施することにより、培養45日目及び59日目においても細胞塊の表面に肥厚した上皮構造が維持されていた。また、免疫染色による解析の結果、上記上皮はSix1、Sox2、E-Cadherin、Sp8、CK18及びN-Cadherin陽性の嗅上皮・鼻腔上皮の組織であった。振盪培養により細胞塊表面の嗅上皮様組織及び鼻腔上皮様組織を維持したまま、オルガノイドの維持及び/又は成熟培養を実施できることがわかった。
[実験20:ヒトiPS細胞からの鼻腔上皮組織、及び嗅窩様構造を形成する嗅上皮組織を含有する細胞集団の製造・分化誘導]
実験20では、図42の上段に示す工程に従って、鼻腔上皮組織、及び嗅窩様構造を形成する嗅上皮組織を含有する細胞集団を製造した。多能性幹細胞として、β-actin遺伝子座にGFP遺伝子を導入し、恒常的にGFPを発現するヒトiPS細胞(hiPS β-actin GFP株、IPSC1030、メルク社より購入)を用いた。多能性幹細胞は、国際公開第2020/039732号に記載の通り、Scientific Reports,4,3594(2014)に記載の方法に準じてフィーダーフリー条件に馴化し、維持培養した。フィーダーフリー培地としてはStemFit培地(AK02N、味の素株式会社製)、フィーダーフリー足場にはLaminin511-E8(株式会社ニッピ製)を用いた。具体的な維持培養操作としては、比較実験1に記載のヒトES細胞の培養と同様に行った。
実験20では、図42の上段に示す工程に従って、鼻腔上皮組織、及び嗅窩様構造を形成する嗅上皮組織を含有する細胞集団を製造した。多能性幹細胞として、β-actin遺伝子座にGFP遺伝子を導入し、恒常的にGFPを発現するヒトiPS細胞(hiPS β-actin GFP株、IPSC1030、メルク社より購入)を用いた。多能性幹細胞は、国際公開第2020/039732号に記載の通り、Scientific Reports,4,3594(2014)に記載の方法に準じてフィーダーフリー条件に馴化し、維持培養した。フィーダーフリー培地としてはStemFit培地(AK02N、味の素株式会社製)、フィーダーフリー足場にはLaminin511-E8(株式会社ニッピ製)を用いた。具体的な維持培養操作としては、比較実験1に記載のヒトES細胞の培養と同様に行った。
培養した多能性幹細胞を分化誘導に用いる際には、播種した6日後にStemFit培地の培地交換と同時に5μM SB431542と300nMSAGを添加して24時間培養した(工程(a)開始)。
調製したサブコンフルエントのヒトiPS細胞を、上記継代時と同様に5mM EDTA/PBSにて処理した。分化誘導用の無血清培地を添加し、ピペッティングを行って培養ディッシュ表面から細胞を剥がし、単一細胞へ分散した。
その後、単一細胞に分散されたヒトiPS細胞を非細胞接着性の96ウェル培養プレートに、1ウェルあたり1.35×104細胞になるように100μlの無血清培地に懸濁し、スイングローター遠心機を用いて細胞を底面に集めた後に、37℃、5%CO2の条件下で浮遊培養した。その際の無血清培地には、5% KSR gfCDMを用いた(工程(1)開始)。
その後、単一細胞に分散されたヒトiPS細胞を非細胞接着性の96ウェル培養プレートに、1ウェルあたり1.35×104細胞になるように100μlの無血清培地に懸濁し、スイングローター遠心機を用いて細胞を底面に集めた後に、37℃、5%CO2の条件下で浮遊培養した。その際の無血清培地には、5% KSR gfCDMを用いた(工程(1)開始)。
浮遊培養開始時(浮遊培養開始後0日目、工程(1)開始)に、上記無血清培地にY27632(終濃度10μM)、IWP-2(終濃度1μM)、SB431542(終濃度1μM)、JNK-IN-8(終濃度1μM)を添加した。
浮遊培養開始後1日目にY27632を含まず、IWP-2、SB431542、JNK-IN-8、BMP4(終濃度0.5nM)を含む無血清培地を1ウェルあたり50μl加えた(工程(2)開始)。
さらに、浮遊培養開始後3日目にY27632とBMP4を含まず、IWP-2、SB431542、JNK-IN-8、K02288(終濃度1μM)、5Z-7-Oxo Zeaenol(終濃度2μM)を含む無血清培地を1ウェルあたり50μl加えた(工程(3)開始)。以降、培養6、10、13、17日目に同様に半量培地交換を行った。培養10日目以降の培地交換の際に、1mM N-アセチル-L-システイン(NAC)、250μM アスコルビン酸2リン酸(AA2P)、500μM ニコチンアミド(NAD)、培養13日目以降の培地交換の際に、EGF(終濃度20ng/ml)を添加した。
上記BMP4、5Z-7-Oxo Zeaenol、K02288、N-アセチル-L-システイン、アスコルビン酸2リン酸、ニコチンアミド及びEGFは最初に添加する際は半量交換で添加する培地に各々2倍、3倍、4倍のいずれかの濃度で添加し、ウェル中の終濃度が記載の濃度となるようにした。以降の培地交換の際は、記載の終濃度で培地に添加した。また、以降の記載において、他の各条件で添加する因子、化合物等も同様の方法で添加した。
浮遊培養開始後22日目に96ウェル培養プレートより細胞集団を回収し、浮遊培養用ディッシュへと移し、倒立蛍光顕微鏡(BIOREVO BZ-X800、キーエンス社製)を用いて偏斜照明観察および蛍光観察を行った(図42のA)。その結果、本発明によりヒトiPS細胞から製造した細胞塊の表面が非神経上皮組織に覆われ、その一部に非神経上皮と連続し、非神経上皮よりも肥厚した嗅上皮様組織が形成され、嗅上皮様組織が細胞塊の内側に陥入し嗅窩様構造を形成していることが分かった。
培養22日目の細胞集団を、比較実験1に記載の方法で固定し、蛍光免疫染色を実施した。一次抗体としては、前記の実施例にて用いたものに加え、表1-1又は1-2に記載の、hiPS β-actin GFP株において恒常発現しているGFPを認識する抗GFP抗体、嗅神経細胞及びその前駆細胞で陽性となる抗Ebf2抗体、Lhx2抗体、嗅上皮、非神経上皮において陽性となる抗βカテニン抗体、サイトケラチン18抗体、EpCAM抗体、嗅上皮および中枢神経系で陽性となるN-Cadherin抗体、嗅上皮様組織において発現する抗Pax6抗体、非神経上皮組織において発現する抗EGFR抗体、基底膜様構造において発現する抗ラミニン抗体、抗コラーゲン4抗体、細胞の基底側の接着面にて陽性となる抗β4インテグリン抗体、細胞の頂端面にて陽性となる抗Ezrin抗体を用いた。蛍光標識二次抗体としては、表2に記載の抗体を用いて多重染色を行い、核の対比染色には1μg/mlのHoechst33342(Sigma Aldrich社製)を二次抗体希釈液中に添加した。同一の枠内は同じ切片の異なる蛍光検出条件による多重蛍光染色像である。
染色結果を図43および図44の上段に示す。また、本製造方法により形成された細胞集団の模式図を図44の下段に示す。培養22日目の細胞塊において、細胞塊の表面にて肥厚した多列上皮である嗅上皮様組織が折れ曲がって中心部がくぼんだ、胚の嗅覚器の原基となる嗅窩様構造を形成していた。嗅上皮様組織と連続して非神経上皮組織が細胞塊の表面を覆っていた。細胞塊の内部は中枢神経系の細胞であり、細胞塊の表面の連続した嗅上皮様組織、嗅窩様構造、非神経上皮組織との間にラミニン、コラーゲン4陽性の基底膜様構造が形成されていた。嗅上皮様組織、嗅窩様構造、非神経上皮組織の細胞塊表面側はEzrin陽性の頂端面であり、頂端面-基底面の細胞極性が形成されていた。嗅上皮様組織の基底膜様構造と接する箇所はβ4インテグリン陽性であった。嗅上皮様組織はE-Cadherin、β-Catenin、サイトケラチン18、N-Cadherin、Pax6、Sox2、Six1、ACE2、Sp8、汎サイトケラチン、EpCAM陽性であり、嗅上皮様組織中にN-CAM、Tuj1、N-Cadherin、Ebf2、Lhx2、Calretinin陽性である嗅神経細胞又はその前駆細胞が存在していた。後に鼻腔上皮組織へと分化し得る非神経上皮組織はE-Cadherin、β-Catenin、CK18、EGFR、ACE2、Six1、汎サイトケラチン陽性であった。中枢神経系組織はN-CAM、Tuj1、N-Cadherin、Pax6、Sox2陽性であった。上記の結果から、本発明に記載の製造法にて、多能性幹細胞より嗅窩様構造を有する細胞集団を製造可能であることが分かった。
[実験21:分割されたマイクロウェルを有する培養器材を用いたヒトiPS細胞からの鼻腔上皮組織を含有する細胞集団の製造・分化誘導]
実験21では、図45の上段に示す工程に従って、分割されたマイクロウェルを有する培養器材を用いて鼻腔上皮組織、を含有する細胞集団を製造した。多能性幹細胞として、ヒトiPS細胞1231A3株を用いた。分化誘導に用いる細胞は、実験20と同様に調製した。
実験21では、図45の上段に示す工程に従って、分割されたマイクロウェルを有する培養器材を用いて鼻腔上皮組織、を含有する細胞集団を製造した。多能性幹細胞として、ヒトiPS細胞1231A3株を用いた。分化誘導に用いる細胞は、実験20と同様に調製した。
事前に35mm EZSPHERE Dish Type 905(旭テクノグラス社製)に後述する分化誘導用の無血清培地を添加し2mlを添加し、1時間程度、CO2インキュベーター中に静置し、マイクロウェル内の気泡の除去を顕微鏡で確認した。
その後、調製したサブコンフルエントのヒトiPS細胞を、上記継代時と同様に5mM EDTA/PBSにて処理した。細胞回収時に分化誘導用の無血清培地を添加し、ピペッティングを行って培養ディッシュ表面から細胞を剥がし、単一細胞へ分散し、事前に調製した35mm EZSPHERE Dishに、1ディッシュあたり1.8×106細胞になるように3mlの無血清培地に懸濁し、37℃、5%CO2の条件下で浮遊培養した。その際の無血清培地には、5% KSR gfCDMを用いた(工程(1)開始)。
その後、調製したサブコンフルエントのヒトiPS細胞を、上記継代時と同様に5mM EDTA/PBSにて処理した。細胞回収時に分化誘導用の無血清培地を添加し、ピペッティングを行って培養ディッシュ表面から細胞を剥がし、単一細胞へ分散し、事前に調製した35mm EZSPHERE Dishに、1ディッシュあたり1.8×106細胞になるように3mlの無血清培地に懸濁し、37℃、5%CO2の条件下で浮遊培養した。その際の無血清培地には、5% KSR gfCDMを用いた(工程(1)開始)。
浮遊培養開始時(浮遊培養開始後0日目、工程(1)開始)に、上記無血清培地にY27632(終濃度10μM)、IWP-2(終濃度1μM)、SB431542(終濃度1μM)、JNK-IN-8(終濃度1μM)を添加した。
浮遊培養開始後1日目に顕微鏡にてマイクロウェル内に細胞凝集体が形成されているのを確認した後に、Y27632を含まず、IWP-2、SB431542、JNK-IN-8、BMP4(終濃度1nM)を含む無血清培地を1ディッシュあたり1ml加えた(工程(2)開始)。
さらに、浮遊培養開始後3日目に、ワイドボアの1000μlピペットチップを用いて細胞凝集体を回収し、10cm浮遊培養用ディッシュへと移送した。その際の培地には、Y27632とBMP4を含まず、IWP-2、SB431542、JNK-IN-8、K02288(終濃度1μM)、5Z-7-Oxo Zeaenol(終濃度2μM)を含む5% KSR gfCDMを12ml用いた(工程(3)開始)。以降、培養6、10、13、17日目にディッシュより6mlの培地を、細胞凝集体を吸わないように回収し、新しい培地を6ml添加する半量培地交換を行った。培養10日目以降の培地交換の際に、1mM N-アセチル-L-システイン(NAC)、250μM アスコルビン酸2リン酸(AA2P)、500μM ニコチンアミド(NAD)、培養13日目以降の培地交換の際に、EGF(終濃度20ng/ml)を添加した。
浮遊培養開始後21日目に倒立蛍光顕微鏡(BIOREVO BZ-X800、キーエンス社製)を用いて偏斜照明観察を行った(図45のA)。その結果、前記96ウェルマイクロウェルプレートを用いた際と同様に、分割されたマイクロウェルを有する培養器材を用いることによって、表面に鼻腔上皮及び嗅上皮様組織を有する細胞塊が製造可能であった。
[実験22:分割されたマイクロウェルを有する培養器材を用いたヒトiPS細胞からの鼻腔上皮組織を含有する細胞集団の製造・分化誘導]
実験22では、図46の上段に示す工程に従って、分割されたマイクロウェルを有する培養器材を用いて鼻腔上皮組織、を含有する細胞集団を製造した。多能性幹細胞として、ヒトiPS細胞1231A3株を用いた。分化誘導に用いる細胞は、実験20と同様に調製した。
実験22では、図46の上段に示す工程に従って、分割されたマイクロウェルを有する培養器材を用いて鼻腔上皮組織、を含有する細胞集団を製造した。多能性幹細胞として、ヒトiPS細胞1231A3株を用いた。分化誘導に用いる細胞は、実験20と同様に調製した。
事前にAggreWell 800, 6-well plate(34821、STEMCELL Technologies社製)のウェルに2mlのAnti-Adherence Rinsing Solution(07010、STEMCELL Technologies社製)を添加し、スイングローター遠心機を用いて遠心し、気泡を除去した。遠心後にRinsing Solutionを除き、後述する分化誘導用の無血清培地によってウェルを洗浄した後、新しい無血清培地5mlを添加し、1時間程度、CO2インキュベーター中に静置し平衡化した。
その後、調製したサブコンフルエントのヒトiPS細胞を、上記継代時と同様に5mM EDTA/PBSにて処理した。細胞回収時に分化誘導用の無血清培地を添加し、ピペッティングを行って培養ディッシュ表面から細胞を剥がし、単一細胞へ分散し、事前に調製したAggreWell 800, 6-well plateに、1ウェルあたり5.4×106細胞になるように平衡化した5mlの無血清培地に懸濁し、37℃、5%CO2の条件下で浮遊培養した。その際の無血清培地には、5% KSR gfCDMを用いた(工程(1)開始)。
その後、調製したサブコンフルエントのヒトiPS細胞を、上記継代時と同様に5mM EDTA/PBSにて処理した。細胞回収時に分化誘導用の無血清培地を添加し、ピペッティングを行って培養ディッシュ表面から細胞を剥がし、単一細胞へ分散し、事前に調製したAggreWell 800, 6-well plateに、1ウェルあたり5.4×106細胞になるように平衡化した5mlの無血清培地に懸濁し、37℃、5%CO2の条件下で浮遊培養した。その際の無血清培地には、5% KSR gfCDMを用いた(工程(1)開始)。
浮遊培養開始時(浮遊培養開始後0日目、工程(1)開始)に、上記無血清培地にY27632(終濃度10μM)、IWP-2(終濃度1μM)、SB431542(終濃度1μM)、JNK-IN-8(終濃度1μM)を添加した。
浮遊培養開始後1日目に顕微鏡にてマイクロウェル内に細胞凝集体が形成されているのを確認した後に、Y27632を含まず、IWP-2、SB431542、JNK-IN-8、BMP4(終濃度1nM)を含む無血清培地を1ウェルあたり1ml加えた(工程(2)開始)。
さらに、浮遊培養開始後3日目に、ワイドボアの1000μlピペットチップを用いて細胞凝集体を37μm Reversible Strainer Large(27250、STEMCELL Technologies社製)に回収し、死細胞とデブリを除去後、10cm浮遊培養用ディッシュへと移送した。その際の培地には、Y27632とBMP4を含まず、IWP-2、SB431542、JNK-IN-8、K02288(終濃度1μM)、5Z-7-Oxo Zeaenol(終濃度2μM)を含む5% KSR gfCDMを12ml用いた(工程(3)開始)。以降、培養6、10、13、17日目にディッシュより6mlの培地を、細胞凝集体を吸わないように回収し、新しい培地を6ml添加する半量培地交換を行った。培養10日目以降の培地交換の際に、1mM N-アセチル-L-システイン(NAC)、250μM アスコルビン酸2リン酸(AA2P)、500μM ニコチンアミド(NAD)、培養13日目以降の培地交換の際に、EGF(終濃度20ng/ml)を添加した。
浮遊培養開始後1、21、50日目に倒立蛍光顕微鏡(BIOREVO BZ-X800、キーエンス社製)を用いて位相差観察及び偏斜照明観察を行った(図46のA)。その結果、前記96ウェルマイクロウェルプレートを用いた際と同様に、分割されたマイクロウェルを有する培養器材を用いることによって、表面に鼻腔上皮及び嗅上皮様組織を有する細胞塊が製造可能であった。
[実験23:ヒトES細胞からの鼻腔上皮を構成する細胞を含有する細胞集団・二次元(2D)オルガノイドの製造及び季節性コロナウイルス感染・増殖実験]
図47の上段に示す培養工程に従って、多能性幹細胞から鼻腔上皮様組織を含む非神経上皮組織を含む細胞集団を接着培養により二次元的に製造した。多能性幹細胞として、ヒトES細胞(KhES-1株、京都大学より入手)を用いた。多能性幹細胞は、国際公開第2020/039732号に記載の通り、Scientific Reports,4,3594(2014)に記載の方法に準じてフィーダーフリー条件で維持培養した。フィーダーフリー培地としてはStemFit培地(AK02N、味の素株式会社製)、フィーダーフリー足場にはLaminin511-E8(株式会社ニッピ製)を用いた。具体的な維持培養操作としては、比較実験1に記載のヒトES細胞の培養と同様に行った。
図47の上段に示す培養工程に従って、多能性幹細胞から鼻腔上皮様組織を含む非神経上皮組織を含む細胞集団を接着培養により二次元的に製造した。多能性幹細胞として、ヒトES細胞(KhES-1株、京都大学より入手)を用いた。多能性幹細胞は、国際公開第2020/039732号に記載の通り、Scientific Reports,4,3594(2014)に記載の方法に準じてフィーダーフリー条件で維持培養した。フィーダーフリー培地としてはStemFit培地(AK02N、味の素株式会社製)、フィーダーフリー足場にはLaminin511-E8(株式会社ニッピ製)を用いた。具体的な維持培養操作としては、比較実験1に記載のヒトES細胞の培養と同様に行った。
培養した多能性幹細胞を分化誘導に用いる際には、播種した6日後にStemFit培地の培地交換と同時にSB431542(TGF-βシグナル伝達経路阻害物質、富士フィルム和光純薬株式会社製、終濃度5μM)とSAG(Shhシグナル経路作用物質、Enzo Life Sciences社製、終濃度300nM)を添加して24時間培養した(工程(a)開始)。
調製したサブコンフルエントのヒトES細胞を、上記継代時と同様に5mM EDTA/PBSにて処理した。分化誘導用の無血清培地を添加し、ピペッティングを行って培養ディッシュ表面から細胞を剥がし、単一細胞へ分散し、回収した。
その後、単一細胞に分散されたヒトES細胞を細胞接着性の平底96ウェルプレート(Corning社製)に、1ウェルあたり1×103細胞になるように100μlの無血清培地に細胞を懸濁して播種し、37℃、5%CO2の条件下で接着培養した。その際の培養プレートは、Laminin511-E8(株式会社ニッピ製)によってコーティングを実施した。また、無血清培地として、F-12+Glutamax培地(Thermo Fisher Scientific社製)とIMDM+Glutamax培地(Thermo Fisher Scientific社製)の体積比1:1混合液に5% Knockout Serum Replacement(Thermo Fisher Scientific社製)、450μM 1-モノチオグリセロール(富士フィルム和光純薬株式会社社製)、1x Chemically defined lipid concentrate(Thermo Fisher Scientific社製)、50unit/mlペニシリン-50μg/mlストレプトマイシン(ナカライテスク株式会社製)を添加した培地を用いた(工程(1)開始)。
その後、単一細胞に分散されたヒトES細胞を細胞接着性の平底96ウェルプレート(Corning社製)に、1ウェルあたり1×103細胞になるように100μlの無血清培地に細胞を懸濁して播種し、37℃、5%CO2の条件下で接着培養した。その際の培養プレートは、Laminin511-E8(株式会社ニッピ製)によってコーティングを実施した。また、無血清培地として、F-12+Glutamax培地(Thermo Fisher Scientific社製)とIMDM+Glutamax培地(Thermo Fisher Scientific社製)の体積比1:1混合液に5% Knockout Serum Replacement(Thermo Fisher Scientific社製)、450μM 1-モノチオグリセロール(富士フィルム和光純薬株式会社社製)、1x Chemically defined lipid concentrate(Thermo Fisher Scientific社製)、50unit/mlペニシリン-50μg/mlストレプトマイシン(ナカライテスク株式会社製)を添加した培地を用いた(工程(1)開始)。
接着培養開始時(接着培養開始後0日目、工程(1)開始)に、上記無血清培地にY27632(終濃度10μM)、IWP-2(終濃度0.5μM)、SB431542(終濃度1μM)を添加した。
接着培養開始後2日目にY27632を含まず、IWP-2、SB431542、BMP4(終濃度0.5nM)を含む無血清培地を1ウェルあたり100μl加えた(工程(2)開始)。
さらに、接着培養開始後3日目にY27632とBMP4を含まず、IWP-2、SB431542、bFGF(終濃度20ng/ml)、Heparin Sodium(終濃度10μg/ml)、LDN-193189(終濃度100nM)を含む無血清培地を用いて半量培地交換を行った(工程(3)開始)。以降、培養2日又は3日毎に同様に半量培地交換を行い、鼻腔上皮を構成する細胞を含有する細胞集団・二次元(2D)オルガノイドを調製した。
上記BMP4、bFGF、Heparin Sodium及びLDN-193189は最初に添加する際は半量交換で添加する培地に各々2倍の濃度で添加し、ウェル中の終濃度が記載の濃度となるようにした。以降の培地交換の際は、記載の終濃度で培地に添加した。
培養開始後47日目にサイトケラチン18(KRT18)およびSP8に対する免疫染色を行い、共焦点レーザー顕微鏡(ライカ社製、TCS SP8)を用いて、観察を行った(図47)。その結果、上記分化誘導法によりサイトケラチン18陽性の鼻腔上皮細胞及びSP8陽性の中枢神経系の細胞、サイトケラチン18、SP8陽性の嗅上皮細胞を含有し、それらが連続した上皮構造を呈し、鼻腔上皮組織を形成している細胞集団・二次元(2D)オルガノイドを調製可能であることが分かった。
[実験24:ヒトES細胞から製造した鼻腔上皮を構成する細胞を含有する細胞集団・二次元オルガノイドへの季節性コロナウイルス感染・増殖実験]
実験23に記載の方法で製造した鼻腔上皮を構成する細胞を含有する細胞集団・二次元(2D)オルガノイドに対し、季節性コロナウイルスの感染・増殖実験を実施した。実験操作としては、ヒトES細胞由来鼻腔上皮2Dオルガノイドに対し、Japanese Journal of Infectious Diseases, 2021, 74.4: 285-292.及びJapanese journal of infectious diseases, 2015, 68.5: 442-445.に記載の方法に準じて季節性コロナウイルス株HCoV-229E株(「229E」と記載する場合がある。)、HCoV-OC43株(「OC43」と記載する場合がある。)、HCoV-NL63株(「NL63」と記載する場合がある。)、HCoV-HKU1株(「HKU1」と記載する場合がある。)の4株(京都府立医科大学及び山形県衛生研究所より入手)を各々感染させ、感染後のウイルス増殖量を経時的に測定した。具体的な感染・増殖実験操作としては、まず、培養28日目のヒトES細胞由来鼻腔上皮2Dオルガノイドに対し、低用量として5×105 copies/well、高用量として5×106 copies/wellの条件で単離した各ウイルスを添加した。次に、感染後1日目から8日目まで1日毎に試料として培地を回収し、培地に含まれるウイルス量をリアルタイムPCR法によって測定した。また併せて、ウイルス感染による細胞変性効果についても観察した。低用量及び高用量ごとに各3連で実験を実施した。陽性対象として、HCoV-229E株ではMRC5細胞、HCoV-OC43株ではHCT-8細胞、HCoV-NL63株ではLLC-MK2-N細胞、HCoV-HKU1株ではVeroE6-TM2細胞を用いたウイルス増殖試験を実施し、ヒトES細胞由来鼻腔上皮2Dオルガノイドを用いた試験と比較した。
実験23に記載の方法で製造した鼻腔上皮を構成する細胞を含有する細胞集団・二次元(2D)オルガノイドに対し、季節性コロナウイルスの感染・増殖実験を実施した。実験操作としては、ヒトES細胞由来鼻腔上皮2Dオルガノイドに対し、Japanese Journal of Infectious Diseases, 2021, 74.4: 285-292.及びJapanese journal of infectious diseases, 2015, 68.5: 442-445.に記載の方法に準じて季節性コロナウイルス株HCoV-229E株(「229E」と記載する場合がある。)、HCoV-OC43株(「OC43」と記載する場合がある。)、HCoV-NL63株(「NL63」と記載する場合がある。)、HCoV-HKU1株(「HKU1」と記載する場合がある。)の4株(京都府立医科大学及び山形県衛生研究所より入手)を各々感染させ、感染後のウイルス増殖量を経時的に測定した。具体的な感染・増殖実験操作としては、まず、培養28日目のヒトES細胞由来鼻腔上皮2Dオルガノイドに対し、低用量として5×105 copies/well、高用量として5×106 copies/wellの条件で単離した各ウイルスを添加した。次に、感染後1日目から8日目まで1日毎に試料として培地を回収し、培地に含まれるウイルス量をリアルタイムPCR法によって測定した。また併せて、ウイルス感染による細胞変性効果についても観察した。低用量及び高用量ごとに各3連で実験を実施した。陽性対象として、HCoV-229E株ではMRC5細胞、HCoV-OC43株ではHCT-8細胞、HCoV-NL63株ではLLC-MK2-N細胞、HCoV-HKU1株ではVeroE6-TM2細胞を用いたウイルス増殖試験を実施し、ヒトES細胞由来鼻腔上皮2Dオルガノイドを用いた試験と比較した。
ウイルス増殖試験の結果を図48、図49及び図50に示す。上記検討の結果、ヒトES細胞由来鼻腔上皮2Dオルガノイドは、気相液相境界面培養法を行うことなく、季節性コロナウイルス株HCoV-229E株、HCoV-OC43株、HCoV-NL63株、HCoV-HKU1株の4株すべての増殖をサポートすることが分かった。特に、HCoV-NL63株及びHCoV-HKU1株は株化培養細胞での増殖のサポートが困難な季節性コロナウイルス株であり、本願に記載の細胞集団及び製造法を用いることにより、効率よく季節性コロナウイルスを分離培養・増殖・調製可能であることが示された(図50)。
Claims (28)
- 鼻腔上皮を構成する細胞の製造方法であって、
Wntシグナル伝達経路阻害物質の存在下で多能性幹細胞を浮遊培養する工程(1)、
BMPシグナル伝達経路作用物質の存在下で、前記工程(1)で培養した細胞を浮遊培養する工程(2)、
FGFシグナル伝達経路作用物質及びBMPシグナル伝達経路阻害物質からなる群より選ばれる少なくとも1つの存在下で、前記工程(2)で培養した細胞を浮遊培養する工程(3)、及び
前記工程(3)で培養した細胞をさらに浮遊培養し、前記鼻腔上皮を構成する細胞を得る工程(4)であって、Wntシグナル伝達経路阻害物質、FGFシグナル伝達経路作用物質及びBMPシグナル伝達経路阻害物質からなる群より選ばれる少なくとも2つの非存在下で前記細胞を浮遊培養する工程を含む、製造方法。 - 前記工程(4)において、Wntシグナル伝達経路阻害物質、FGFシグナル伝達経路作用物質及びBMPシグナル伝達経路阻害物質の非存在下で前記細胞を浮遊培養する、請求項1に記載の製造方法。
- 前記工程(4)において、FGFシグナル伝達経路阻害物質、Shhシグナル伝達経路作用物質、BMPシグナル伝達経路作用物質、Wntシグナル伝達経路作用物質、Notchシグナル伝達経路阻害物質、アクチビン/TGF-βシグナル伝達経路作用物質及びレチノイン酸シグナル伝達経路作用物質からなる群より選ばれる少なくとも1つの存在下で前記細胞を浮遊培養する、請求項1又は2に記載の製造方法。
- 鼻腔上皮を構成する細胞の製造方法であって、
Wntシグナル伝達経路阻害物質の存在下で多能性幹細胞を培養器材上で接着培養する工程(1)、
BMPシグナル伝達経路作用物質の存在下で、前記工程(1)で培養した細胞を接着培養する工程(2)、
FGFシグナル伝達経路作用物質及びBMPシグナル伝達経路阻害物質からなる群より選ばれる少なくとも1つの存在下で、前記工程(2)で培養した細胞を接着培養する工程(3)を含む、製造方法。 - 前記培養器材は、細胞外マトリクス若しくは合成細胞接着分子でコーティングされている培養器材、培地の灌流を行なうための流路を有する培養器材、又は、酸素若しくは培地を透過する膜を有する培養器材である、請求項4に記載の製造方法。
- 前記工程(1)が、前記多能性幹細胞を浮遊培養し、細胞凝集体を形成させる工程であり、
前記工程(2)が、前記細胞凝集体を浮遊培養する工程であり、
前記工程(3)が、前記工程(2)で培養した前記細胞凝集体を細胞凝集体中の細胞が嗅神経前駆細胞に分化するまで浮遊培養する工程であり、
前記工程(4)が前記工程(3)で培養した前記細胞凝集体を前記嗅神経前駆細胞が連続して存在する上皮と、当該上皮上に前記鼻腔上皮とを構成する細胞凝集体を得るまで培養する工程である、請求項1又は請求項2に記載の製造方法。 - 前記工程(3)及び前記工程(4)からなる群より選ばれる少なくとも1つの工程において、EGFシグナル伝達経路作用物質がさらに存在する、請求項1、請求項2、請求項4及び請求項5のいずれか1項に記載の製造方法。
- 前記工程(1)、前記工程(2)、前記工程(3)及び前記工程(4)からなる群より選ばれる少なくとも1つの工程において、TGFβシグナル伝達経路阻害物質がさらに存在する、請求項1、請求項2、請求項4及び請求項5のいずれか1項に記載の製造方法。
- 前記工程(1)、前記工程(2)、前記工程(3)及び前記工程(4)からなる群より選ばれる少なくとも1つの工程において、JNKシグナル伝達経路阻害物質がさらに存在する、請求項1、請求項2、請求項4及び請求項5のいずれか1項に記載の製造方法。
- 前記工程(1)、前記工程(2)、前記工程(3)及び前記工程(4)からなる群より選ばれる少なくとも1つの工程において、TAK1阻害物質がさらに存在する、請求項1、請求項2、請求項4及び請求項5のいずれか1項に記載の製造方法。
- 前記工程(3)及び前記工程(4)からなる群より選ばれる少なくとも1つの工程において、酸化ストレスを軽減する作用を有する物質又はストレス応答シグナル伝達経路に対する阻害物質がさらに存在する、請求項1、請求項2、請求項4及び請求項5のいずれか1項に記載の製造方法。
- 前記工程(3)及び前記工程(4)からなる群より選ばれる少なくとも1つの工程において、揺動しながら細胞を培養する、請求項1、請求項2、請求項4及び請求項5のいずれか1項に記載の製造方法。
- 請求項1、請求項2、請求項4及び請求項5のいずれか1項に記載の製造方法により得られる、鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞を含む細胞集団。
- 鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞を含む細胞集団。
- 前記鼻腔上皮を構成する細胞は、分泌細胞、線毛細胞、基底細胞、塩類細胞、神経内分泌細胞、孤立化学感覚上皮細胞及びクラブ細胞からなる群より選ばれる少なくとも1つを含む、請求項14に記載の細胞集団。
- 基底側と頂端側との極性を有する、請求項14又は請求項15に記載の細胞集団。
- 嗅上皮を構成する細胞又はその前駆細胞をさらに含む、請求項14又は請求項15に記載の細胞集団。
- 中枢神経系を構成する神経系細胞をさらに含む、請求項14又は請求項15に記載の細胞集団。
- 三次元の立体的な細胞集団であって、前記鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞を含む鼻腔上皮様組織と、前記鼻腔上皮様組織によって表面の少なくとも一部が被覆された神経組織とを有し、前記神経組織は、中枢神経系を構成する神経系細胞又はその前駆細胞を含む、請求項14又は請求項15に記載の細胞集団。
- 前記神経組織の表面の少なくとも一部を被覆する嗅上皮様組織をさらに含み、前記嗅上皮様組織は、嗅上皮を構成する細胞又はその前駆細胞を含む、請求項19に記載の細胞集団。
- 前記鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞が培養器材に接着しており、連続した上皮構造により二次元的な鼻腔上皮様組織を形成している、請求項14又は請求項15に記載の細胞集団。
- 前記鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞は、遺伝性疾患又は感染症に関連する遺伝子が欠損又は変異している、請求項14又は請求項15に記載の細胞集団。
- 前記遺伝性疾患又は感染症に関連する遺伝子はACE2である、請求項22に記載の細胞集団。
- 請求項14又は請求項15に記載の細胞集団を用いた、疾患治療用化合物又は対象物質の毒性のスクリーニング方法。
- 請求項14又は請求項15に記載の細胞集団を含む、疾患治療用化合物又は対象物質の毒性のスクリーニング用キット。
- 請求項14又は請求項15に記載の細胞集団を用いた、疾患特異的なバイオマーカーの探索方法。
- 請求項14又は請求項15に記載の細胞集団又はその細胞集団から精製された細胞を含む、移植用細胞集団。
- 請求項14又は請求項15に記載の細胞集団又はその細胞集団から精製された細胞の、ウイルスの分離培養における使用。
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Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN117448271A (zh) * | 2023-12-22 | 2024-01-26 | 上海元戊医学技术有限公司 | 一种诱导多能干细胞分化为中脑多巴胺能神经前体细胞的方法 |
CN117586944A (zh) * | 2024-01-19 | 2024-02-23 | 成都思澍生物科技有限公司 | 一种鸡原始生殖细胞体外无血清扩增培养的方法 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2020039732A1 (ja) * | 2018-08-24 | 2020-02-27 | 住友化学株式会社 | 嗅神経細胞又はその前駆細胞を含む細胞塊、及びその製造方法 |
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2022
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Patent Citations (1)
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---|---|---|---|---|
WO2020039732A1 (ja) * | 2018-08-24 | 2020-02-27 | 住友化学株式会社 | 嗅神経細胞又はその前駆細胞を含む細胞塊、及びその製造方法 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
EIRAKU, MOTOTSUGU: "Olfactory epithelium organoids as model for SARS-CoV2 infection", KYOTO DAIGAKU NIPPON KAGAKU SEN'I KENKYUSHO KOENSHU, JP, vol. 79, no. 3.12, 1 March 2022 (2022-03-01), JP , pages 56 - 59, XP009542499, ISSN: 0368-6280 * |
EIRAKU, MOTOTSUGU: "Self-organized formation of complex organoids from stem cells", KYOTO DAIGAKU NIPPON KAGAKU SEN'I KENKYUSHO KOENSHU, JP, vol. 78, no. 3.02, 1 March 2021 (2021-03-01), JP , pages 8 - 10, XP009542500, ISSN: 0368-6280 * |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN117448271A (zh) * | 2023-12-22 | 2024-01-26 | 上海元戊医学技术有限公司 | 一种诱导多能干细胞分化为中脑多巴胺能神经前体细胞的方法 |
CN117586944A (zh) * | 2024-01-19 | 2024-02-23 | 成都思澍生物科技有限公司 | 一种鸡原始生殖细胞体外无血清扩增培养的方法 |
CN117586944B (zh) * | 2024-01-19 | 2024-04-30 | 成都思澍生物科技有限公司 | 一种鸡原始生殖细胞体外无血清扩增培养的方法 |
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