TW202317750A - 構成鼻腔上皮之細胞之製造方法、及包含構成鼻腔上皮之細胞或其前驅細胞之細胞集團 - Google Patents

構成鼻腔上皮之細胞之製造方法、及包含構成鼻腔上皮之細胞或其前驅細胞之細胞集團 Download PDF

Info

Publication number
TW202317750A
TW202317750A TW111124633A TW111124633A TW202317750A TW 202317750 A TW202317750 A TW 202317750A TW 111124633 A TW111124633 A TW 111124633A TW 111124633 A TW111124633 A TW 111124633A TW 202317750 A TW202317750 A TW 202317750A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
cells
cell
signal transduction
aforementioned
substances
Prior art date
Application number
TW111124633A
Other languages
English (en)
Inventor
中野徳重
永樂元次
野田岳志
Original Assignee
日商住友化學股份有限公司
國立大學法人京都大學
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 日商住友化學股份有限公司, 國立大學法人京都大學 filed Critical 日商住友化學股份有限公司
Publication of TW202317750A publication Critical patent/TW202317750A/zh

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本發明係關於一種構成鼻腔上皮之細胞之製造方法，該製造方法包含下列步驟(1)至(4)：於Wnt訊息傳導路徑抑制物質之存在下懸浮培養多能性幹細胞之步驟(1)；於BMP訊息傳導路徑作用物質之存在下，將在前述步驟(1)所培養之細胞懸浮培養之步驟(2)；在選自由FGF訊息傳導路徑作用物質及BMP訊息傳導路徑抑制物質所組成群組中之至少1個之存在下，將在前述步驟(2)所培養之細胞懸浮培養之步驟(3)；及將在前述步驟(3)所培養之細胞進一步懸浮培養，獲得前述構成鼻腔上皮之細胞之步驟(4)，該步驟(4)係在選自由Wnt訊息傳導路徑抑制物質、FGF訊息傳導路徑作用物質及BMP訊息傳導路徑抑制物質所組成群組中之至少2個的不存在下，將前述細胞懸浮培養之步驟。

Description

構成鼻腔上皮之細胞之製造方法、及包含構成鼻腔上皮之細胞或其前驅細胞之細胞集團
本發明係關於構成鼻腔上皮之細胞之製造方法，及包含構成鼻腔上皮之細胞或其前驅細胞之細胞集團。
在非專利文獻1中，已報導藉由將從小鼠iPS細胞所形成之類胚體(Embryoid body)，與從小鼠採取之嗅上皮或嗅球之初代培養細胞共同培養，而分化誘導出表現一部分嗅神經細胞標記之神經細胞。在非專利文獻2中，已報導從人類多能性幹細胞製造嗅覺基板細胞及嗅神經細胞。再者，本案之發明者係在專利文獻1中，已報導可從人類ES細胞及iPS細胞製造立體的非神經上皮組織及嗅上皮組織。
[先前技術文獻]
[專利文獻]
[專利文獻1] 國際公開第2020/039732號
[非專利文獻]
[非專利文獻1] Int J Clin Exp Pathol 2017;10(7):8072-8081
[非專利文獻2] Stem Cells Dev. 2022 May 20. doi: 10.1089/scd.2021.0257.
然而，在專利文獻1中，未記載有效率地製造鼻腔上皮組織。本發明之目的，係提供一種從多能性幹細胞有效率地製造構成鼻腔上皮之細胞的方法。
本發明者等為了解決上述課題而精心檢討之結果，發現將多能性幹細胞於Wnt訊息傳導路徑抑制物質之存在下培養，添加一次BMP訊息傳導路徑作用物質並培養一定期間後，添加選自由FGF訊息傳導路徑作用物質及BMP訊息傳導路徑抑制物質所組成群組中之至少1個並進行培養，進一步在選自由Wnt訊息傳導路徑抑制物質、FGF訊息傳導路徑作用物質及BMP訊息傳導路徑抑制物質所組成群組中之至少1個的不存在下繼續培養，藉此可有效率地製造構成鼻腔上皮之細胞。培養之繼續較佳是在選自由FGF訊息傳導路徑抑制物質、Shh訊息傳導路徑作用物質、BMP訊息傳導路徑作用物質、Wnt訊息傳導路徑作用物質、Notch訊息傳導路徑抑制物質、活化素(Activin)/TGF-β訊息傳導路徑 作用物質及視網酸訊息傳導路徑作用物質所組成群組中之至少1個之存在下進行。再者，藉由使用將一個孔分割成複數個微孔，並使前述每一個微孔形成1個細胞塊之培養器材，可更有效率地製造包含構成鼻腔上皮之細胞的細胞塊。再者，就其他態樣而言，發現於Wnt訊息傳導路徑抑制物質之存在下，將多能性幹細胞在器材表面接著培養，添加一次BMP訊息傳導路徑作用物質並培養一定期間後，添加選自由FGF訊息傳導路徑作用物質及BMP訊息傳導路徑抑制物質所組成群組中之至少1個並進行培養，藉此亦可有效率地製造構成鼻腔上皮之細胞。
本發明係關於下述所例示之構成鼻腔上皮之細胞之製造方法、包含構成鼻腔上皮之細胞或其前驅細胞之細胞集團、該細胞集團作為疾病模型之使用方法等。
[1]一種構成鼻腔上皮之細胞之製造方法，係包含下列步驟(1)至(4)：
於Wnt訊息傳導路徑抑制物質之存在下，培養多能性幹細胞之步驟(1)，
於BMP訊息傳導路徑作用物質之存在下，培養在前述步驟(1)所培養之細胞之步驟(2)，
在選自由FGF訊息傳導路徑作用物質及BMP訊息傳導路徑抑制物質所組成群組中之至少1個之存在下，培養在前述步驟(2)所培養之細胞之步驟(3)，及
將在前述步驟(3)所培養之細胞進一步培養，而獲得前述構成鼻腔上皮之細胞之步驟(4)，該步驟(4)係在選自由Wnt訊息傳導路徑抑制物質、FGF訊息傳導路徑作用物質及BMP訊息傳導路徑抑制物質所組成群組中之至少2個的不存在下，培養前述細胞之步驟。
[2]如[1]所記載之製造方法，其中，在前述步驟(4)中，在Wnt訊息傳導路徑抑制物質、FGF訊息傳導路徑作用物質及BMP訊息傳導路徑抑制物質之不存在下，培養前述細胞。
[3]如[1]或[2]所記載之製造方法，其中，在前述步驟(4)中，係在選自由FGF訊息傳導路徑抑制物質、Shh訊息傳導路徑作用物質、BMP訊息傳導路徑作用物質、Wnt訊息傳導路徑作用物質、Notch訊息傳導路徑抑制物質、活化素/TGF-β訊息傳導路徑作用物質及視網酸訊息傳導路徑作用物質所組成群組中之至少1個之存在下，培養前述細胞。
[4]一種構成鼻腔上皮之細胞之製造方法，係包含下列步驟(1)至(4)：
於Wnt訊息傳導路徑抑制物質之存在下，培養多能性幹細胞之步驟(1)，該步驟(1)係將前述多能性幹細胞懸浮培養，使細胞凝集物形成之步驟，
於BMP訊息傳導路徑作用物質之存在下，培養在前述步驟(1)所培養之細胞之步驟(2)，該步驟(2)係將前述細胞凝集物懸浮培養之步驟，
在選自由FGF訊息傳導路徑作用物質及BMP訊息傳導路徑抑制物質所組成群組中之至少1個之存在下，培養在前述步驟(2)所培養之細胞之步驟(3)，該步驟(3)係將前述細胞凝集物懸浮培養之步驟，及
將在前述步驟(3)所培養之細胞進一步培養，獲得前述構成鼻腔上皮之細胞之步驟(4)，該步驟(4)係在選自由FGF訊息傳導路徑抑制物質、Shh訊息傳導路徑作用物質、BMP訊息傳導路徑作用物質、Wnt訊息傳導路徑作用物質、Notch訊息傳導路徑抑制物質、活化素/TGF-β訊息傳導路徑作用物質及視網酸訊息傳導路徑作用物質所組成群組中之至少1個之存在下，將前述細胞凝集物懸浮培養之步驟。
[5]如[4]所記載之製造方法，係在形成有至少1個孔之培養器材中實施前述步驟(1)、及步驟(2)之(4)中任一個步驟的懸浮培養，
前述孔係分割成複數個微孔，
針對每一個前述微孔，以形成1個細胞塊之方式實施懸浮培養。
[6]如[5]所記載之製造方法，其中，前述培養器材係前述1個孔具有至少1cm2以上的底面積，
前述孔係至少每1cm2分割成4個以上的微孔。
[7]一種構成鼻腔上皮之細胞之製造方法，係包含下列步驟(1)至(4)：
於Wnt訊息傳導路徑抑制物質之存在下，培養多能性幹細胞之步驟(1)，該步驟(1)係將前述多能性幹細胞在培養器材上進行接著培養之步驟，
於BMP訊息傳導路徑作用物質之存在下，培養在前述步驟(1)所培養之細胞之步驟(2)，該步驟(2)係將前述細胞進行接著培養之步驟，
在選自由FGF訊息傳導路徑作用物質及BMP訊息傳導路徑抑制物質所組成群組中之至少1個之存在下，培養在前述步驟(2)所培養之細胞之步驟(3)，該步驟(3)將前述細胞進行接著培養之步驟，及
將在前述步驟(3)所培養之細胞進一步培養，獲得前述構成鼻腔上皮之細胞之步驟(4)，該步驟(4)係在選自由FGF訊息傳導路徑抑制物質、Shh訊息傳導路徑作用物質、BMP訊息傳導路徑作用物質、Wnt訊息傳導路徑作用物質、Notch訊息傳導路徑抑制物質、活化素/TGF-β訊息傳導路徑作用物質及視網酸訊息傳導路徑作用物質所組成群組中之至少1個之存在下，將前述細胞進行接著培養之步驟。
[8]如[7]所記載之製造方法，其中，前述培養器材係塗覆有細胞外基質或合成細胞接著分子。
[9]如[7]或[8]所記載之製造方法，其中，前述培養器材係具有用以進行培養基灌流之流路，
在選自由前述步驟(1)、前述步驟(2)、前述步驟(3)及前述步驟(4)所組成群組中之至少1個步驟中，在灌流環境下將前述細胞進行接著培養。
[10]如[7]至[9]中任一項所記載之製造方法，其中，前述培養器材係具有可滲透氧或培養基之膜。
[11]一種構成鼻腔上皮之細胞之製造方法，係包含下列步驟(1)至(4)：
於Wnt訊息傳導路徑抑制物質之存在下，培養多能性幹細胞之步驟(1)，該步驟(1)係將前述多能性幹細胞懸浮培養，使細胞凝集物形成之步驟，
於BMP訊息傳導路徑作用物質之存在下，培養在前述步驟(1)所培養之細胞之步驟(2)，該步驟(2)係將前述細胞凝集物懸浮培養之步驟，
在選自由FGF訊息傳導路徑作用物質及BMP訊息傳導路徑抑制物質所組成群組中之至少1個之存在下，培養在前述步驟(2)所培養之細胞之步驟(3)，該步驟(3)係懸浮培養至前述細胞凝集物中分化出嗅神經前驅細胞之步驟，及
將在前述步驟(3)所培養之細胞進一步培養，獲得前述構成鼻腔上皮之細胞之步驟(4)，該步驟(4)係將前述細胞凝集物懸浮培養，而獲得前述嗅神經前驅細胞所存在之上皮、以及在連續之上皮上構成前述鼻腔上皮之細胞之步驟。
[12]如[1]至[11]中任一項所記載之製造方法，其中，前述BMP訊息傳導路徑作用物質係包含選自由BMP2、BMP4、BMP7、BMP13及GDF7所組成群組中之至少1個。
[13]如[1]至[12]中任一項所記載之製造方法，其中，前述步驟(3)中，係在FGF訊息傳導路徑作用物質之存在下培養細胞，
前述FGF訊息傳導路徑作用物質係包含選自由FGF2、FGF3、FGF7、FGF8、FGF10及該等之變異體所組成群組中之至少1個。
[14]如[1]至[13]中任一項所記載之製造方法，其中，前述Wnt訊息傳導路徑抑制物質，係包含對非典型Wnt路徑具有抑制活性的物質。
[15]如[1]至[14]中任一項所記載之製造方法，其中，前述Wnt訊息傳導路徑抑制物質係包含PORCN抑制劑。
[16]如[15]所記載之製造方法，其中，前述PORCN抑制劑係包含選自由IWP-2、IWP-3、IWP-4、IWP-L6、IWP-12、IWP-O1、LGK-974、Wnt-C59、ETC-131、ETC-159、GNF-1331、GNF-6231、Porcn-IN-1、RXC004、CGX1321及該等之衍生物所組成群組中之至少1個。
[17]如[1]至[16]中任一項所記載之製造方法，其中，前述Wnt訊息傳導路徑抑制物質係包含Wnt/JNK訊息傳導路徑抑制物質。
[18]如[17]所記載之製造方法，其中，前述Wnt/JNK訊息傳導路徑抑制物質係包含JNK抑制劑。
[19]如[18]所記載之製造方法，其中，前述JNK抑制劑係包含選自由SP600125、JNK-IN-8、DB07268、IQ-1S、坦茲色替(Tanzisertib)、本它馬莫(Bentamapimod)、BI-78D3、CC-401、TCSJNK 5a、AS601245、CV-65、D-JNK1、ER-358063、ER-409903、ER-417258、CC-359、CC-930、SB203580及該等之衍生物所組成群組中之至少1個。
[20]如[18]或[19]所記載之製造方法，其中，前述JNK抑制劑係包含JNK-IN-8，
在前述JNK-IN-8的濃度為1nM至50μM之培養基中開始前述步驟(1)。
[21]如[17]至[20]中任一項所記載之製造方法，其中，前述Wnt/JNK訊息傳導路徑抑制物質係包含Rac抑制劑。
[22]如[21]所記載之製造方法，其中，前述Rac抑制劑係包含選自由NSC23766、EHop-016、ZCL278、MBQ-167、KRpep-2d、ARS-853、沙利拉席(Salirasib)、ML141、EHT1864及該等之衍生物所組成群組中之至少1個。
[23]如[1]至[22]中任一項所記載之製造方法，其中，前述步驟(3)中，係在BMP訊息傳導路徑抑制物質之存在下培養細胞，
前述BMP訊息傳導路徑抑制物質係包含I型BMP受體抑制劑。
[24]如[23]所記載之製造方法，其中，前述I型BMP受體抑制劑係包含選自由K02288、多索嗎啡(Dorsomorphin)、LDN-193189、LDN-212854、LDN-214117、ML347、DMH1、DMH2、Compound 1、VU5350、OD52、E6201、塞卡替尼(Saracatinib)、BYL719及該等之衍生物所組成群組中之至少1個。
[25]如[1]至[24]中任一項所記載之製造方法，其中，在選自由前述步驟(3)及前述步驟(4)所組成群組中之至少1個步驟中，係更存在有EGF訊息傳導路徑作用物質。
[26]如[1]至[25]中任一項所記載之製造方法，其中，在選自由前述步驟(1)、前述步驟(2)、前述步驟(3)及前述步驟(4)所組成群組中之至少1個步驟中，係更存在有TGFβ訊息傳導路徑抑制物質。
[27]如[26]所記載之製造方法，其中，前述TGFβ訊息傳導路徑抑制物質係包含Alk5/TGFβR1抑制劑。
[28]如[27]所記載之製造方法，其中，前述Alk5/TGFβR1抑制劑係包含選自由SB431542、SB505124、SB525334、LY2157299、GW788388、LY364947、SD-208、EW-7197、A83-01、A77-01、RepSox、BIBF-0775、TP0427736、TGFBR1-IN-1、SM-16、TEW-7197、LY3200882、LY2109761、KRCA0008、GSK 1838705、克唑替尼(Crizotinib)、色瑞替尼(Ceritinib)、ASP 3026、TAE684、AZD3463及該等之衍生物所組成群組中之至少1個。
[29]如[1]至[28]中任一項所記載之製造方法，其中，在選自由前述步驟(1)、前述步驟(2)、前述步驟(3)及前述步驟(4)所組成群組中之至少1個步驟中，係更存在有TAK1抑制物質。
[30]如[29]所記載之製造方法，其中，前述TAK1抑制物質係包含選自由(5Z)-7-側氧基玉米赤黴醇(Oxozeaenol)、N-Des(胺基羰基)AZ-TAK1抑制劑(inhibitor)、他吉尼(Takinib)、NG25及該等之衍生物所組成群組中之至少1個。
[31]如[1]至[30]中任一項所記載之製造方法，其中，在選自由前述步驟(3)及前述步驟(4)所組成群組中之至少1個步驟中，係更存在有具有減輕氧化壓力之作用的物質。
[32]如[31]所記載之製造方法，其中，具有減輕氧化壓力之作用的物質係包含選自由抗壞血酸、N-乙醯基-L-半胱胺酸、菸鹼醯胺及該等之衍生物所組成群組中之至少1個。
[33]如[1]至[32]中任一項所記載之製造方法，其中，在選自由前述步驟(3)及前述步驟(4)所組成群組中之至少1個步驟中，係更存在有針對壓力反應訊息傳導路徑之抑制物質。
[34]如[1]至[33]中任一項所記載之製造方法，其中，在選自由前述步驟(3)及前述步驟(4)所組成群組中之至少1個步驟中，一邊搖動一邊培養細胞。
[35]一種構成鼻腔上皮之細胞之製造方法，係包含下列步驟：
在選自由FGF訊息傳導路徑抑制物質、Shh訊息傳導路徑作用物質、BMP訊息傳導路徑作用物質、Wnt訊息傳導路徑作用物質、Notch訊息傳導路徑抑制物質、活化素/TGF-β訊息傳導路徑作用物質及視網酸訊息傳導路徑作用物質所組成群組中之至少1個之存在下，培養包含嗅神經細胞或其前驅細胞之細胞集團之步驟。
[36]一種包含構成鼻腔上皮之細胞或其前驅細胞之細胞集團，係藉由[1]至[35]中任一項所記載之製造方法所得到者。
[37]一種細胞集團，係包含構成鼻腔上皮之細胞或其前驅細胞。
[38]如[37]所記載之細胞集團，其中，前述構成鼻腔上皮之細胞或其前驅細胞係表現外胚層標記。
[39]如[37]或[38]所記載之細胞集團，其中，前述構成鼻腔上皮之細胞係包含分泌細胞。
[40]如[39]所記載之細胞集團，其中，前述分泌細胞係表現選自由黏液素(Mucins)1、黏液素2、黏液素3、黏液素4、黏液素5AC、黏液素5B、FoxA1、FoxA2、Nkx2.1/TTF-1及SPDEF所組成群組中之至少1個。
[41]如[37]至[40]中任一項所記載之細胞集團，其中，前述構成鼻腔上皮之細胞係包含纖毛細胞。
[42]如[41]所記載之細胞集團，其中，前述纖毛細胞係表現選自由FoxJ1、FoxN4、p73、乙醯基化微管蛋白(Tubulin)及β4-微管蛋白所組成群組中之至少1個。
[43]如[42]或[42]所記載之細胞集團，其中，前述纖毛細胞係在細胞表面具有纖毛結構。
[44]如[37]至[43]中任一項所記載之細胞集團，其中，前述構成鼻腔上皮之細胞係包含基底細胞。
[45]如[44]所記載之細胞集團，其中，前述基底細胞係表現選自由細胞角蛋白(cytokeratin)5、細胞角蛋白14、細胞角蛋白15、p63、△Np63及p75所組成群組中之至少1個。
[46]如[37]至[45]中任一項所記載之細胞集團，其中，前述構成鼻腔上皮之細胞係包含鹽細胞。
[47]如[46]所記載之細胞集團，其中，前述鹽細胞係表現選自由CFTR、Foxi1、液胞型質子ATP酶(ATPase)、Ascl3、Tfcp2l1及DMRT2所組成群組中之至少1個。
[48]如[37]至[47]中任一項所記載之細胞集團，其中，前述構成鼻腔上皮之細胞係包含神經內分泌細胞。
[49]如[48]所記載之細胞集團，其中，前述神經內分泌細胞係表現選自由Ascl1、NeuroD1、嗜鉻粒蛋白A(Chromogranin A)、突觸素(Synaptophisin)及神經特異烯醇化酶(NSE)所組成群組中之至少1個。
[50]如[37]至[49]中任一項所記載之細胞集團，其中，前述構成鼻腔上皮之細胞係包含孤立性化學感受上皮細胞。
[51]如[37]至[50]中任一項所記載之細胞集團，其中，前述構成鼻腔上皮之細胞係包含棒狀細胞(Club cell)。
[52]如[37]至[51]中任一項所記載之細胞集團，其中，前述構成鼻腔上皮之細胞或其前驅細胞係表現病毒受體或病毒感染相關因子。
[53]如[52]所記載之細胞集團，其中，前述病毒受體或前述病毒感染相關因子係包含選自由ACE2、唾液酸α2，6Gal及唾液酸α2，3Gal所組成群組中之至少1個。
[54]如[37]至[53]中任一項所記載之細胞集團，係具有基底側及頂端側之極性。
[55]如[37]至[54]中任一項所記載之細胞集團，其中，前述構成鼻腔上皮之細胞或其前驅細胞係依細胞種類集合。
[56]如[37]至[55]中任一項所記載之細胞集團，係更包含構成嗅上皮之細胞或其前驅細胞。
[57]如[56]所記載之細胞集團，其中，前述構成嗅上皮之細胞係包含嗅神經細胞。
[58]如[37]至[57]中任一項所記載之細胞集團，係更包含構成中樞神經系統之神經系細胞。
[59]如[37]至[58]中任一項所記載之細胞集團，係具有前述包含構成鼻腔上皮之細胞或其前驅細胞之鼻腔上皮樣組織、及藉由前述鼻腔上皮樣組織被覆表面的至少一部分之神經組織，其中，
前述神經組織係包含構成中樞神經系統之神經系細胞或其前驅細胞。
[60]如[59]所記載之細胞集團，係更包含將前述神經組織的表面至少一部分被覆之嗅上皮樣組織，其中，
前述嗅上皮樣組織係包含構成嗅上皮之細胞或其前驅細胞。
[61]如[60]所記載之細胞集團，其中，前述鼻腔上皮樣組織及前述嗅上皮樣組織係連續地形成。
[62]如[61]所記載之細胞集團，其中，前述嗅上皮樣組織係向細胞塊內側陷入，形成嗅窩樣結構。
[63]如[36]至[62]中任一項所記載之細胞集團，其中，前述構成鼻腔上皮之細胞或其前驅細胞之與遺傳性疾病或感染症相關之基因係缺失或變異。
[64]如[63]所記載之細胞集團，其中，前述與遺傳性疾病或感染症相關之基因係ACE2。
[65]一種疾病治療用化合物之篩選方法，係使用[36]至[64]中任一項所記載之細胞集團。
[66]一種疾病治療用化合物之篩選套組，係包含[36]至[64]中任一項所記載之細胞集團。
[67]一種[36]至[64]中任一項所記載之細胞集團之使用方法，該細胞集團係作為鼻腔上皮之疾病模型。
[68]一種對象物質的藥效或毒性之評估方法，係使用[36]至[64]中任一項所記載之細胞集團。
[69]一種對象物質的藥效或毒性之評估套組，係使用[36]至[64]中任一項所記載之細胞集團。
[70]一種疾病特異性生物標記之探索方法，係使用[36]至[64]中任一項所記載之細胞集團。
[71]一種移植用細胞集團，係包含[36]至[64]中任一項所記載之細胞集團或自該細胞集團精製後之細胞。
[72]一種[35]至[64]中任一項所記載之細胞集團或自該細胞集團精製後之細胞之用途，係於病毒之分離培養中使用。
在其他面向中，本發明係關於下述例示之構成鼻腔上皮之細胞之製造方法、包含構成鼻腔上皮之細胞或其前驅細胞之細胞集團、該細胞集團作為疾病模型之使用方法等。
[C1]一種構成鼻腔上皮之細胞之製造方法，係包含下列步驟(1)至(4)：
於Wnt訊息傳導路徑抑制物質之存在下懸浮培養多能性幹細胞之步驟(1)，
於BMP訊息傳導路徑作用物質之存在下，將在前述步驟(1)所培養之細胞懸浮培養之步驟(2)，
在選自由FGF訊息傳導路徑作用物質及BMP訊息傳導路徑抑制物質所組成群組中之至少1個之存在下，將在前述步驟(2)所培養之細胞懸浮培養之步驟(3)，及
將在前述步驟(3)所培養之細胞進一步懸浮培養，獲得前述構成鼻腔上皮之細胞之步驟(4)，該步驟(4)係在選自由Wnt訊息傳導路徑抑制物質、FGF訊息傳導路徑作用物質及BMP訊息傳導路徑抑制物質所組成群組中之至少2個的不存在下，將前述細胞懸浮培養之步驟。
[C2]如[C1]所記載之製造方法，其中，在前述步驟(4)中，在Wnt訊息傳導路徑抑制物質、FGF訊息傳導路徑作用物質及BMP訊息傳導路徑抑制物質之不存在下，將前述細胞懸浮培養。
[C3]如[C1]或[C2]所記載之製造方法，其中，在前述步驟(4)中，係在選自由FGF訊息傳導路徑抑制物質、Shh訊息傳導路徑作用物質、BMP訊息傳導路徑作用物質、Wnt訊息傳導路徑作用物質、Notch訊息傳導路徑抑制物質、活化素/TGF-β訊息傳導路徑作用物質及視網酸訊息傳導路徑作用物質所組成群組中之至少1個之存在下，將前述細胞懸浮培養。
[C4]一種構成鼻腔上皮之細胞之製造方法，係包含下列步驟(1)至(3)：
於Wnt訊息傳導路徑抑制物質之存在下，將多能性幹細胞在培養器材上進行接著培養之步驟(1)，
於BMP訊息傳導路徑作用物質之存在下，將在前述步驟(1)所培養之細胞進行接著培養之步驟(2)，
在選自由FGF訊息傳導路徑作用物質及BMP訊息傳導路徑抑制物質所組成群組中之至少1個之存在下，將在前述步驟(2)所培養之細胞進行接著培養之步驟(3)。
[C5]如[C4]所記載之製造方法，其中，前述培養器材係塗覆有細胞外基質或是合成細胞接著分子之培養器材、具有用以進行培養基灌流的流路之培養器材、或具有可滲透氧或培養基的膜之培養器材。
[C6]如[C1]至[C3]中任一項所記載之製造方法，其中，前述步驟(1)係將前述多能性幹細胞懸浮培養，使細胞凝集物形成之步驟，
前述步驟(2)係將前述細胞凝集物懸浮培養之步驟，
前述步驟(3)係將在前述步驟(2)所培養之前述細胞凝集物懸浮培養至細胞凝集物中的細胞分化成嗅神經前驅細胞為止之步驟，
前述步驟(4)係將在前述步驟(3)所培養之前述細胞凝集物培養至獲得構成上皮及前述鼻腔上皮之細胞凝集物之步驟，其中，在該上皮中，前述嗅神經前驅細胞係連續地存在，且前述鼻腔上皮係位於該上皮上。
[C7]如[C1]至[C6]中任一項所記載之製造方法，其中，在選自由前述步驟(3)及前述步驟(4)所組成群組中之至少1個步驟中，係更存在有EGF訊息傳導路徑作用物質。
[C8]如[C1]至[C7]中任一項所記載之製造方法，其中，在選自由前述步驟(1)、前述步驟(2)、前述步驟(3)及前述步驟(4)所組成群組中之至少1個步驟中，係更存在有TGFβ訊息傳導路徑抑制物質。
[C9]如[C1]至[C8]中任一項所記載之製造方法，其中，在選自由前述步驟(1)、前述步驟(2)、前述步驟(3)及前述步驟(4)所組成群組中之至少1個步驟中，係更存在有JNK訊息傳導路徑抑制物質。
[C10]如[C1]至[C9]中任一項所記載之製造方法，其中，在選自由前述步驟(1)、前述步驟(2)、前述步驟(3)及前述步驟(4)所組成群組中之至少1個步驟中，係更存在有TAK1抑制物質。
[C11]如[C1]至[C10]中任一項所記載之製造方法，其中，在選自由前述步驟(3)及前述步驟(4)所組成群組中之至少1個步驟中，係更存在有具有減輕氧化壓力之作用的物質或針對壓力反應訊息傳導路徑之抑制物質。
[C12]如[C1]至[C11]中任一項所記載之製造方法，其中，在選自由前述步驟(3)及前述步驟(4)所組成群組中之至少1個步驟中，係一邊搖動一邊培養細胞。
[C13]一種包含構成鼻腔上皮之細胞或其前驅細胞之細胞集團，係藉由[C1]至[C12]中任一項所記載之製造方法所得到者。
[C14]一種細胞集團，係包含構成鼻腔上皮之細胞或其前驅細胞。
[C15]如[C14]所記載之細胞集團，其中，前述構成鼻腔上皮之細胞係包含選自由分泌細胞、纖毛細胞、基底細胞、鹽細胞、神經內分泌細胞、孤立性化學感受上皮細胞及棒狀細胞所組成群組中之至少1個。
[C16]如[C14]或[C15]所記載之細胞集團，係具有基底側及頂端側之極性。
[C17]如[C14]至[C16]中任一項所記載之細胞集團，係更包含構成嗅上皮之細胞或其前驅細胞。
[C18]如[C14]至[C17]中任一項所記載之細胞集團，係更包含構成中樞神經系統之神經系細胞。
[C19]如[C14]至[C18]中任一項所記載之細胞集團，係三維立體的細胞集團，具有前述包含構成鼻腔上皮之細胞或其前驅細胞之鼻腔上皮樣組織、及藉由前述鼻腔上皮樣組織被覆表面的至少一部分之神經組織，其中，前述神經組織係包含構成中樞神經系統之神經系細胞或其前驅細胞。
[C20]如[C19]所記載之細胞集團，係更包含將前述神經組織的表面至少一部分被覆之嗅上皮樣組織，其中，前述嗅上皮樣組織係包含構成嗅上皮之細胞或其前驅細胞。
[C21]如[C14]至[C20]中任一項所記載之細胞集團，其中，前述構成鼻腔上皮之細胞或其前驅細胞係與培養器材接著，藉由連續的上皮結構而形成二維的鼻腔上皮樣組織。
[C22]如[C13]至[C21]中任一項所記載之細胞集團，其中，前述構成鼻腔上皮之細胞或其前驅細胞之與遺傳性疾病或感染症相關之基因係缺失或變異。
[C23]如[C22]所記載之細胞集團，其中，前述與遺傳性疾病或感染症相關之基因係ACE2。
[C24]一種疾病治療用化合物或對象物質的毒性之篩選方法，係使用[C13]至[C23]中任一項所記載之細胞集團。
[C25]一種疾病治療用化合物或對象物質的毒性之篩選用套組，係包含[C13]至[C23]中任一項所記載之細胞集團。
[C26]一種疾病特異性生物標記之探索方法，係使用[C13]至[C23]中任一項所記載之細胞集團。
[C27]一種移植用細胞集團，係包含[C13]至[C23]中任一項所記載之細胞集團或自該細胞集團精製後之細胞。
[C28]一種[C13]至[C23]中任一項所記載之細胞集團或自該細胞集團精製後之細胞之用途，係於病毒之分離培養中使用。
根據本發明，可從多能性幹細胞有效率地製造構成鼻腔上皮之細胞。再者，根據本發明，係可提供使用包含構成鼻腔上皮之細胞或其前驅細胞之細胞集團的疾病模型、疾病的治療藥之篩選方法、篩選套組、化合物的藥效或毒性之評估方法及評估套組等。再者，就其他態樣而言，亦可將藉由本發明所製造之鼻腔上皮，提供至包含新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)及季節性冠狀病毒之感染症的研究、病毒之分離培養等。
圖1之A至J係概略地表示包含構成鼻腔上皮之細胞或其前驅細胞之細胞集團的結構之圖。以四角的點線包圍的部分，係形成鼻腔上皮樣組織。圖1所示之細胞集團係具有立體結構。
圖2之A至E係概略地表示包含構成鼻腔上皮之細胞或其前驅細胞之細胞集團的結構之圖。圖2所示之細胞集團係具有平面狀結構。A、B及D係細胞集團之俯視圖及剖面圖，C係細胞集團之俯視圖，E係細胞集團之投影圖及剖面圖。
圖3之A至C係概略地表示包含構成鼻腔上皮之細胞或其前驅細胞之細胞集團的結構之圖。圖3所示之細胞集團，係含有包含構成鼻腔上皮之細胞或其前驅細胞之細胞塊及其他組織之細胞。
圖4之A至F係概略地表示存在於非神經上皮組織之鼻腔上皮樣組織的結構之圖。
圖5之上段係概略地表示在比較實驗1中，從人類ES細胞製作包含非神經上皮組織之細胞塊時的步驟之圖。A係在比較實驗1中，懸浮培養開始28天後之細胞塊之倒立顯微鏡之亮視野觀察影像。B係在比較實驗1中，懸浮培養開始28天後的細胞塊之免疫染色像及其核染色像。C係概略地顯示在比較實驗1中，培養第28天之細胞塊的結構。
圖6之上段係概略地顯示在實驗1中，從人類ES細胞製作包含構成鼻腔上皮之細胞的細胞集團時之步驟。A係在實驗1中，培養開始35天後之細胞集團的倒立顯微鏡之亮視野觀察影像。
圖7係在實驗1中，培養開始35天後之細胞集團的免疫染色像及其核染色像。
圖8之A係在實驗1中，培養開始35天後之細胞集團的免疫染色像及其核染色像。B係概略地顯示在實驗1中，培養第35天之細胞集團的結構之圖。
圖9之上段係概略地顯示在實驗2中，從人類ES細胞製作包含構成鼻腔上皮之細胞的細胞集團時之步驟之圖。A係在實驗2中，培養開始28天後之細胞集團的倒立顯微鏡之亮視野觀察影像。
圖10係在實驗2中，添加JNK抑制劑時之培養開始28天後之細胞集團的免疫染色像及其核染色像。
圖11之上段係概略地顯示在實驗3中，從人類ES細胞製作包含構成鼻腔上皮之細胞的細胞集團時之步驟之圖。A係在實驗3中，培養開始28天後之細胞集團的倒立顯微鏡之亮視野觀察影像。B及C係在實驗3中，培養開始28天後之細胞集團的免疫染色像及其核染色像。D係概略地顯示在實驗3中，培養第28天之細胞集團的結構之圖。
圖12之上段係概略地顯示在實驗4中，從人類iPS細胞製作包含構成鼻腔上皮之細胞的細胞集團時之步驟之圖。A係在實驗4中，培養開始21天後之細胞集團的倒立顯微鏡之亮視野觀察影像。
圖13之上段係概略地顯示在實驗5中，從人類ES細胞製作包含構成鼻腔上皮之細胞的細胞集團時之步驟之圖。A係在實驗5中，培養開始35天後之細胞集團的倒立顯微鏡之亮視野觀察影像。
圖14之A係在實驗5中，培養開始35天後之細胞集團的免疫染色像及其核染色像。B係A中以四角的點線包圍的部分之放大圖。C係拍攝培養開始第45天之細胞集團的動畫時之亮視野像及其放大圖。
圖15係在實驗5中，培養開始42天後之細胞集團之流感病毒受體的免疫染色像及其核染色像。
圖16係概略地顯示在實驗6及之後的實驗中，使用於病毒感染實驗及單細胞解析之從人類ES細胞製作包含構成鼻腔上皮之細胞的細胞集團(源自人類ES細胞之鼻腔上皮類器官(Organoid))時之步驟之圖。
圖17係顯示在實驗6中，使包含構成鼻腔上皮之細胞的細胞集團感染流感病毒，在感染後之每天所測定之病毒力價的圖。
圖18之上段係在實驗7中，感染流感病毒之細胞集團的免疫染色像及其核染色像。下段係上段之圖的一部分放大圖。
圖19係顯示在實驗8中，使包含構成鼻腔上皮之細胞的細胞集團以低濃度或高濃度感染SARS-CoV-2，在感染後之每天所測定之病毒力價的圖。L1至L5係以低病毒量感染後之結果，H1至H5係以高病毒量感染後之結果。
圖20係在實驗9中，病毒感染前之培養第28天之細胞集團的免疫染色像及其核染色像。
圖21之A至D係在實驗9中，SARS-CoV-2的感染2天後之細胞集團的免疫染色像及其核染色像。圖中以四角的點線包圍的部分放大圖係分別示於各圖之右圖。圖中之箭頭係顯示病毒所感染之嗅上皮樣組織或鼻腔上皮樣組織。圖中之星號(＊)係表示表現血管張力素轉化酶2(Angiotensin converting enzyme 2)之嗅上皮樣組織或鼻腔上皮樣組織。
圖22之A至C係在實驗9中，SARS-CoV-2感染2天後之細胞集團的免疫染色像及其核染色像。圖中以四角的點線包圍的部分的放大圖係分別顯示於各圖之右圖。A及B中之箭頭，係顯示病毒所感染之嗅上皮樣組織或鼻腔上皮樣組織。
圖23係在實驗9中，SARS-CoV-2感染11天後之細胞集團的免疫染色像及其核染色像。左圖之A、B的框中包圍部分的放大圖係分別顯示於各個的中央圖及右圖。圖中的星號(＊)係表示表現了SARS-CoV2N蛋白(SARS-N)之類器官內部的中樞神經系統的細胞。
圖24之A至J係在實驗10中，感染SARS-CoV-2之細胞集團的電子顯微鏡影像。B及C係A中以四角包圍的部分之放大圖，E及F係D中以四角包圍的部分之放大圖，H係G中以四角包圍的部分之放大圖，J係I中以四角包圍的部分之放大圖。
圖25係在實驗11中，SARS-CoV-2感染2天後之包含構成鼻腔上皮之細胞的細胞集團的單細胞解析結果。A係分類為嗅上皮/鼻腔上皮之細胞集團(NE)及中樞神經系統之細胞集團(CNS)的t-SNE繪圖。B係鼻腔上皮/嗅上皮的細胞及中樞神經系統的細胞中，包含源自SARS-CoV-2之轉錄產物之各基因表現量的小提琴繪圖(Violin plot)。
圖26係在實驗12中，包含構成鼻腔上皮之細胞的細胞集團所含有之細胞角蛋白18陽性細胞之單細胞解析結果的t-SNE繪圖。
圖27係在實驗12中，包含構成鼻腔上皮之細胞的細胞集團之細胞角蛋白18陽性細胞之單細胞解析結果中之各細胞的標記基因之表現量解析結果。
圖28係在實驗12中，藉由單細胞解析所分類之6個群集(cluster)中，差異表現基因(Differentially Expressed Genes(DEG))之基因表現的熱圖(Heat map)。
圖29係圖28之(1)至(3)所記載之DEG的列表。
圖30係圖28之(4)至(6)所記載之DEG的列表。
圖31之A係在實驗13中，源自人類患者之鼻腔上皮/嗅上皮檢體之單細胞解析的結果。B係將A之解析結果與SARS-CoV-2感染後第2天(培養第30天)之包含構成鼻腔上皮之細胞的細胞集團之單細胞解析結果重疊比較之結果。
圖32之A係在實驗14中，源自人類患者之鼻腔上皮/嗅上皮檢體的單細胞解析中，嗅神經標記及嗅覺受體之表現量解析的結果。B係在實驗14中，SARS-CoV-2感染後第2天之包含構成鼻腔上皮之細胞的細胞集團的單細胞解析中之嗅神經標記及嗅覺受體的表現量解析之結果。
圖33係在實驗15中，針對SARS-CoV-2感染後第2天之包含構成鼻腔上皮之細胞的細胞集團，將免疫相關基因之表現量進行單細胞解析之結果。
圖34係圖33之虛線部分內之放大圖。
圖35係在實驗15中，進行SARS-CoV-2感染後第2天之包含構成鼻腔上皮之細胞的細胞集團之單細胞解析，針對各免疫相關基因解析表現細胞之結果。
圖36係在實驗15中，進行SARS-CoV-2感染後第2、7及11天之包含構成鼻腔上皮之細胞的細胞集團之單細胞解析，針對源自SARS-CoV-2之轉錄產物(S)及免疫相關基因(ISG15)解析表現細胞之結果。
圖37之A係使用在實驗16中用於建立ACE2剔除(knockout)之人類ES細胞株KhES-1之質體載體的模式圖。B係野生型及ACE2剔除KhES-1之基因體上之ACE2區域的結構。C係從野生型及ACE2剔除KhES-1所調製之培養第28 天的嗅上皮/鼻腔上皮類器官中之ACE2表現藉由西方墨點法(Western blot)解析之結果。
圖38係在實驗17中，使從ACE2剔除人類ES細胞株KhES-1所分化誘導之包含構成鼻腔上皮之細胞的細胞集團感染SARS-CoV-2的2天後之免疫染色的結果。左圖中以點線包圍之部分的放大圖係分別顯示於各圖之右圖。
圖39係顯示在實驗18中，使從ACE2剔除人類ES細胞株KhES-1所分化誘導之包含構成鼻腔上皮之細胞的細胞集團以低濃度或高濃度感染SARS-CoV-2，測定感染後每天之病毒力價的圖。L1至L5係以低病毒量感染後之結果，H1至H5係以高病毒量感染後之結果。
圖40之上段係概略地顯示在實驗19中，從人類iPS細胞製作包含構成鼻腔上皮之細胞的細胞塊，進行長期培養時之步驟的圖。A係在培養開始45天後及59天後之細胞塊的倒立顯微鏡之亮視野觀察影像。B係在培養開始59天後之細胞塊的免疫染色像及其核染色像。
圖41之A及B係概略地顯示包含構成鼻腔上皮之細胞或其前驅細胞之細胞集團的結構之圖。以四角的點線包圍的部分係形成了鼻腔上皮樣組織。圖41所示之細胞集團係具有立體結構。
圖42之上段係概略地顯示在實驗20中，從人類iPS細胞製作含有形成鼻腔上皮組織、及嗅窩樣結構之嗅上皮組織的細胞集團時之步驟的圖。A係在實驗20中，培養開始22天後之細胞集團的倒立顯微鏡之亮視野觀察影像。
圖43係在實驗20中，培養開始22天後之細胞集團的免疫染色像及其核染色像。
圖44係在實驗20中，培養開始22天後之細胞集團的免疫染色像及其核染色像。B係概略地顯示在實驗20中，培養第22天之細胞集團的結構之圖。
圖45之上段係概略地顯示在實驗21中，使用了具有經分割之微孔的培養器材從人類iPS細胞製作含有鼻腔上皮組織之細胞集團時之步驟的圖。A係在實驗21中，培養開始21天後之細胞集團的倒立顯微鏡之亮視野觀察影像。
圖46之上段係概略地顯示在實驗22中，使用了具有經分割之微孔的培養器材從人類iPS細胞製作含有鼻腔上皮組織之細胞集團時之步驟的圖。A係在實驗22中，培養開始1天後、21天後及50天後之細胞集團的倒立顯微鏡之亮視野觀察影像。
圖47之上段係概略地顯示在實驗23中，藉由接著培養從人類ES細胞製作含有構成鼻腔上皮之細胞的細胞集團/二維類器官時之步驟的圖。A係在實驗23中，培養開始47天後之使用細胞集團的抗細胞角蛋白18抗體及抗SP8抗體之螢光免疫染色的觀察影像。
圖48之上段係概略地顯示在實驗24中，針對以實驗23所記載之方法所調製之含有源自人類ES細胞之構成鼻腔上皮之細胞的細胞集團/二維類器官，感染季節性冠狀病毒之實驗的程序之圖。A係使季節性冠狀病毒株HCoV-229E感染源自人類ES細胞之鼻腔二維類器官及MRC5細胞株，將感染後第1天至第8天為止的培養基中之病毒含量每1日計測之結果的圖。B係使季節性冠狀病毒株HCoV-OC43感染源自人類ES細胞之鼻腔二維類器官及HCT-8細胞株，將感染後第1天至第8天為止之培養基中的病毒含量每1日計測之結果的圖。
圖49係上段係概略地顯示在實驗24中，針對以實驗23所記載之方法所調製之含有源自人類ES細胞之構成鼻腔上皮之細胞的細胞集團/二維類器官，感 染季節性冠狀病毒之實驗的程序之圖。A係使季節性冠狀病毒株HCoV-NL63感染源自人類ES細胞之鼻腔二維類器官及LLC-MK2-N細胞株，將感染後第1天至第8天為止的培養基中的病毒含量每1日計測之結果的圖。B係使季節性冠狀病毒株HCoV-HKU1感染源自人類ES細胞之鼻腔二維類器官及VeroE6-TM2細胞株，將感染後第1天至第8天為止的培養基中的病毒含量每1日計測之結果的圖。
圖50係顯示在實驗24中，源自人類ES細胞之鼻腔二維類器官及陽性對象之細胞株中的各季節性冠狀病毒株之感染後第3天或第4天之培養基中的病毒含量之圖。
[1.定義]
本說明書中，用語之定義係如下所述。所謂「幹細胞」意指具有分化能力及增殖能力(尤其是，自我複製能力)之未分化的細胞。在幹細胞中，依據分化能力，包含多能性幹細胞(pluripotent stem cell)、多潛能幹細胞(multipotent stem cell)、單能性幹細胞(unipotent stem cell)等。所謂「多能性幹細胞」意指能夠於生物體外(in-vitro)培養，並且，具有可分化成構成生體全部細胞的能力(分化多能性：pluripotency)之幹細胞。全部細胞意指源自外胚層、中胚層及內胚層的三胚層之細胞。所謂「多潛能幹細胞」意指不是可分化為全部的種類，但可分化成複數種組織以及細胞的能力之幹細胞。所謂「單能性幹細胞」意指具有可分化成特定組織或細胞的能力之幹細胞。
多能性幹細胞能夠由受精卵、選殖胚胎、生殖幹細胞、組織內幹細胞、體細胞等誘導。多能性幹細胞可舉例如：胚胎幹細胞(ES細胞：Embryonic stem cell)、EG細胞(Embryonic germ cell)、誘導多能性幹細胞(iPS細胞：induced pluripotent stem cell)等。多能性幹細胞也包含由間葉系幹細胞(mesenchymal stem cell：MSC)所得到的Muse細胞(Multi-lineage differentiating Stress Enduring cell)，及由生殖細胞(例如，精巢)所製作出的GS細胞。
胚胎幹細胞首次建立於1981年，1989年以後也應用於基因剔除(gene knock-out)小鼠的製作。於1998年建立人類胚胎幹細胞，也朝向利用於再生醫學中。ES細胞能夠藉由將內部細胞塊於餵養細胞(Feeder cell)上或含有白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor，LIF)的培養基中培養而製造。ES細胞之製造方法記載於例如：國際公開第96/22362號、國際公開第02/101057號、美國專利第5843780號說明書、美國專利第6200806號說明書、美國專利第6280718號說明書等。胚胎幹細胞能夠由指定的機關入手，又，亦可購入市售品。例如，屬於人類胚胎幹細胞之KhES-1、KhES-2及KhES-3能夠自京都大學再生醫科學研究所入手。人類ES細胞也可舉出利用不經過生體內發育之受精14天以內的人類胚胎而分離或獲得之幹細胞。均為小鼠胚胎幹細胞之EB5細胞能夠自國立研究開發法人理化學研究所入手，D3株能夠自美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)入手可能。屬於ES細胞之一的核移植ES細胞(ntES細胞)係能夠從將體細胞的細胞核移植至細胞核經除去的卵子所作成的選殖胚胎建立。
EG細胞能夠藉由將原始生殖細胞於包含小鼠幹細胞因子(mSCF)、LIF及鹼性纖維母細胞生長因子(bFGF)之培養基中培養而製造(Cell，70：841-847，1992)。
所謂「誘導多能性幹細胞」係藉由將體細胞用周知的方法等初期化(reprogramming)而誘導出多能性的細胞。誘導多能性幹細胞具體可列舉：藉由選自包含Oct3/4、Sox2、Klf4、Myc(c-Myc、N-Myc、L-Myc)、Glis1、Nanog、Sall4、lin28、Esrrb等初期化基因群中之複數個基因的表現，而使分化成纖維母細胞、末梢血液單核球等之體細胞初期化並誘導出多分化能力之細胞。於2006年，山中等人在小鼠細胞中建立出誘導多能性幹細胞(Cell，2006，126(4)pp.663-676)。誘導多能性幹細胞也於2007年在人類纖維母細胞中建立，與胚胎幹細胞同樣地具有多能性和自我複製能力(Cell，2007，131(5)pp.861-872；Science，2007，318(5858)pp.1917-1920；Nat.Biotechnol.，2008，26(1)pp.101-106)。誘導多能性幹細胞除了藉由基因表現所致之直接初期化而製造的方法以外，亦可藉由化合物的添加等而從體細胞誘導為誘導多能性幹細胞(Sciencc，2013，341，pp.651-654，Nature(2022).https：//doi.org/10.1038/s41586-022-04593-5)。
製造誘導多能性幹細胞時所使用的體細胞並沒有特別限定，可列舉：源自組織的纖維母細胞、血球系細胞(例如，末梢血液單核球、T細胞等)、肝細胞、胰臟細胞、腸上皮細胞、平滑肌細胞等。
製造誘導多能性幹細胞時，藉由數種類的基因的表現(例如，Oct3/4、Sox2、Klf4及Myc的4因子)而初期化時，用以使基因表現的手段沒有特別限定。用以表現基因的手段可列舉例如：使用病毒載體(例如，反轉錄病毒載體、慢病毒載體、仙台病毒載體、腺病毒載體、腺相關病毒載體的感染法、使 用質體載體(例如，質體載體、附加型載體(Episomal Vector))的基因導入法(例如，磷酸鈣法、脂質體轉染(lipofection)法、RetroNectin法、電穿孔(electroporation)法)、使用RNA載體的基因導入法(例如，磷酸鈣法、脂質體轉染法、電穿孔法)、蛋白質的直接注入法等。
多能性幹細胞亦可經基因改變。經基因改變之多能性幹細胞係可藉由例如同源重組技術製作。被改變的染色體上的基因可列舉例如：細胞標記基因、組織適合性抗原的基因、基於神經系細胞的障礙的疾病相關基因等。染色體上的標的基因之改變能夠使用下列所記載之方法進行：Manipulating the Mouse Embryo,A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1994)、Gene Targeting,A Practical Approach,IRL Press at Oxford University Press(1993)、Bio-manual series 8,Gene targeting，使用ES細胞之變異小鼠的製作，羊土社(1995)等所記載之方法。
具體而言，例如，將改變的標的基因(例如，細胞標記基因、組織適合性抗原的基因或疾病相關基因等)的基因體基因單離，使用經單離的基因體基因製作用以將標的基因進行同源重組的標的載體。將製作出的標的載體導入至幹細胞，藉由選擇在標的基因和目標載體之間產生同源重組的細胞，而可製作染色體上的基因經改變之幹細胞。
將標的基因的基因體基因單離的方法可列舉下列所記載之周知的方法：Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)或Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons(1987-1997)等。亦能夠使用基因體DNA庫篩選系統(Genome Systems製)、Universal GenomeWalker Kits(Clontech製)等。
用以將標的基因同源重組的標的載體的製作、及同源重組體效率的選別能夠根據下列所記載之方法進行：Gene Targeting,A Practical Approach,IRL Press at Oxford University Press(1993)、Bio-manual series 8,Gene targeting,使用ES細胞之變異小鼠的製作，羊土社(1995)。標的載體亦能夠使用置換(replacement)型或插入(insertion)型的任一種。選別方法能夠使用正向選擇、啟動子選擇、負向選擇或多聚腺苷酸(Poly-A)選擇等方法。從經選別的細胞株中選擇作為目的的同源重組體的方法可舉例如：針對基因體DNA的南方墨點法或PCR法等。
多能性幹細胞也可能使用進行基因體編集的多能性幹細胞。所謂「基因體編集」意指使用核酸酶的部位特異性基因體DNA鏈的切斷、或藉由鹼基的化學變換等原理而企圖改變標的基因或者是基因體區域之技術。部位特異性核酸酶可列舉：鋅指核酸酶(Zing Finger Nuclease，ZFN)、TALEN、CRISPR/Cas9及該等之變法等。藉由使用基因體編集技術，可製作特定的基因缺失之基因剔除細胞株、於特定的基因座人工地插入有其他序列基因敲入(gene knock-in)細胞株等。例如，將編碼血管張力素轉化酶2(ACE2)之區域作為標的並藉由實施基因體編集，可調製不表現ACE2基因(經基因剔除)之多能性幹細胞。就其他態樣而言，以標的疾病中之原因基因、參與基因的解明等為目的，亦可藉由Nature volume 568，pages511-516(2019)等所記載之方法而全面地導入基因變異，進而實施解析該基因的功能、影響等之篩選(CRISPR篩選)。
多能性幹細胞也可使用疾病特異性多能性幹細胞。所謂「疾病特異性多能性幹細胞」意指具有參與疾病發症之基因的變異或遺傳的背景之多能性幹細胞。疾病特異性多能性幹細胞可藉由下列方法製作：從成為對象之疾病發 病的患者或近親者藉由前述方法等建立誘導多能性幹細胞之方法、或將已建立完成的多能性幹細胞的基因體藉由鋅指核酸酶(ZFN)、TALEN、CRISPR等基因體編集技術等而改變之方法。例如，從囊腫纖化症(Cystic fibrosis)的患者所建立的誘導多能性幹細胞，係囊腫纖化症的疾病特異性多能性幹細胞(疾病特異性iPS細胞)。再者，在已建立完成的ES細胞、PS細胞等導入囊腫纖化症患者所發生的已知的基因變異，藉此而製作囊腫纖化症的疾病特異性多能性幹細胞。
「哺乳動物」包含齧齒類、有蹄類、食肉目、兔形目、靈長類等。齧齒類包含小鼠、大鼠、倉鼠、豚鼠等。有蹄類包含豬、牛、山羊、馬、綿羊等。食肉目包含犬、貓等。兔形目包含兔等。所謂「靈長類」意指屬於靈長目之哺乳類動物，靈長類包含狐猴、懶猴、樹鼩等原猴亞目，及猴子、類人猿、人類等類人猿亞目。
本發明中使用的多能性幹細胞係哺乳動物的多能性幹細胞，較佳是齧齒類(例如，小鼠、大鼠)或靈長類(例如，人類、猴子)的多能性幹細胞，最佳是人類的多能性幹細胞。
「細胞接著(cell adhesion)」中，包含細胞與細胞的接著(細胞-細胞接著)及細胞與細胞外基質(基質)的接著(細胞-基質接著)。細胞接著也包含於生物體外(in-vitro)的人工培養環境下生長的對細胞的培養器材等的接著。細胞-細胞接著中所形成的結合為細胞-細胞結合(cell-cell junction)，細胞-基質接著中所形成的結合為細胞-基質結合(cell-substratum junction)。細胞接著的種類可列舉例如：錨定結合(anchoring junction)、間隙結合(communicating junction)、緊密結合(occluding junction)。
細胞-細胞結合可列舉「密著結合(tight junction)」、「接著結合(adherence junction)」。密著結合為比較強的細胞-細胞結合，可產生於上皮細胞。細胞間是否存在密著結合，係例如可藉由使用了針對密著接合的構成成分之抗體(抗密連蛋白(claudin)抗體、抗ZO-1抗體等)之免疫組織化學等手法檢出。
「懸浮培養」意指細胞一邊維持著懸浮且存在於培養液中的狀態一邊進行培養。亦即，懸浮培養係將細胞以不與培養器材及培養器材上的餵養細胞等(以下，亦記載為「培養器材等」)之條件進行，而與以和培養器材等接著之條件所進行的培養(接著培養)區別。更詳細而言，所謂懸浮培養意指在細胞與培養器材等之間，以不形成堅固的細胞-基質結合之條件進行的培養。經培養的細胞是懸浮培養狀態或者是接著培養的判別，係只要為所屬技術領域具有通常知識者即可藉由例如顯微鏡觀察時的培養器材之搖動等而容易地判別。
「接著培養」意指細胞一邊維持且存在著與培養器材等接著的狀態一邊進行培養。在此，所謂細胞與培養器材等接著，意指例如可為在細胞與培養器材等之間有細胞接著之一種的堅固的細胞-基質結合。
懸浮培養中的細胞凝集物中，細胞與細胞進行面接著。懸浮培養中的細胞凝集物中，細胞與培養器材等之間，未形成堅固的細胞-基質結合，細胞-基質結合係幾乎未形成，或者是即便形成其貢獻亦很小。在懸浮培養中的細胞凝集物的內部中，亦可存在內在的細胞-基質結合。所謂「細胞與細胞進行面接著(plane attachment)」意指細胞與細胞以面進行接著。更詳細而言，「細胞與細胞進行面接著」意指某細胞的表面積中與其他細胞的表面進行接著的比率例如為1%以上，較佳為3%以上，更佳為5%以上。細胞的表面係可藉由將膜染色 之試藥(例如，DiI)所進行的染色、細胞接著因子(例如，E-黏附蛋白(E-cadherin)，N-黏附蛋白(N-cadherin)等)的免疫染色等進行觀察。
進行接著培養時所使用的培養器材只要是可進行接著培養者，則沒有特別限定，只要為所屬技術領域具有通常知識者即能夠適當地決定。如此之培養器材可列舉例如：燒瓶、組織培養用燒瓶、皿(dish)、組織培養用皿、多皿(multidish)、微量盤(microplate)、微孔盤(microwell plate)、微細孔(micropore)、多盤(multiplate)、多孔盤(multiwellplate)、細胞培養玻片(Chamber Slides)、玻璃培養皿(Schale)、試管(tube)、托盤、培養袋及器官晶片(organ-on-chip)等生體功能晶片。該等培養器材可為硬質或軟質任一者。細胞接著性的培養器材可使用以提升與細胞之接著性為目的，培養器材的表面經人工性處理者等。人工性處理可列舉例如：經細胞外基質、高分子等進行之塗覆處理、及氣體電漿(gas plasma)處理、正電荷處理等表面加工。細胞所接著之細胞外基質可列舉例如：基底膜標品、層連結蛋白(Laminin)、巢蛋白(entactin)、膠原蛋白(collagen)、明膠等。高分子可列舉例如：聚離胺酸(polylysine)、聚鳥胺酸(polyornithine)等。培養器材的培養面可為平底，亦可為凹凸。
「層連結蛋白」意指由α、β、γ鏈所組成異三聚物(heterotrimer)分子，係次單元(subunit)鏈之組成為不同異型體(isoform)所存在的細胞外基質蛋白質。具體而言，層連結蛋白具有以5種α鏈、4種β鏈以及3種γ鏈之異三聚物組合的約15種異型體。將α鏈(α1至α5)、β鏈(β1至β4)以及γ鏈(γ1至γ4)之各個數字組合，決定出層連結蛋白的名稱。例如，將α5鏈、β1鏈、γ1鏈組合的層連結蛋白稱為層連結蛋白511。
進行懸浮培養時使用的培養器只要是可以「懸浮培養」者則沒有特別限定，只要為所屬技術領域具有通常知識者即能夠適當地決定。如此之培養器材可列舉例如：燒瓶、組織培養用燒瓶、皿、培養皿(petri dish)、組織培養用皿、多皿、微量盤、微孔盤、微細孔、多盤、多孔盤、細胞培養玻片、玻璃培養皿、試管、托盤、培養袋、旋轉燒瓶(spinner flask)及旋轉瓶(roller bottle)。該等之培養器材可為硬質或軟質之任一者。為了可進行懸浮培養，該等培養器材較佳為細胞非接著性。細胞非接著性的培養器材能夠使用培養器的表面沒有經過以提升與細胞的接著性為目的所進行的上述人工性處理者。細胞非接著性的培養器材能夠使用培養器的表面經過以減低與細胞的接著性為目的所進行的人工性處理者。培養器材之培養面可為平底、U底或V底，亦可為凹凸。減低與細胞的接著性之處理可列舉例如：經由2-甲基丙烯醯氧基乙基磷酸膽鹼(2-methacryloyloxyethylphosphorylcholine，MPC)聚合物、聚(2-羥乙基甲基丙烯酸酯)(Poly(2-hydroxyethyl methacrylate)，Poly-HEMA)、聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)等的塗覆所進行之超親水性處理、蛋白質低吸附處理等。
從保護細胞凝集物免於進行懸浮培養時產生的剪斷力等物理性壓力、提升細胞所分泌的增殖因子、細胞介素類的局部濃度、以及促進組織的發達的目的而言，亦可在將細胞凝集物包埋於凝膠中、或封入於物質穿透性的某膠囊後實施懸浮培養(Nature,2013,501.7467：373)。包埋所使用的凝膠或膠囊可以為源自生體或合成高分子製的任一者。於如此之目的中使用的凝膠或膠囊可列舉例如：基質膠(Corning公司製)、PuraMatrix(3D Matrix公司製)、VitroGel 3D(TheWell Bioscience公司製)、膠原蛋白凝膠(新田明膠股份有限公司製)、藻 酸凝膠(PG Research股份有限公司製)、Cell-in-a-Box(Austrianova公司製)等，也可使用市售者作為細胞培養用之水凝膠或包埋培養套組。
使用於細胞培養之培養基能夠以動物細胞培養通常使用之培養基作為基礎培養基進行調製。基礎培養基可列舉例如：Basal Medium Eagle(BME)、BGJb培養基、CMRL 1066培養基、格拉斯哥最低必須培養基(Glasgow Minimum Essential Medium，Glasgow MEM)、Improved MEM Zinc Option、Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium(IMDM)、Medium 199、Eagle最低必須培養基(Eagle Minimum Essential Medium，Eagle MEM)、α改良Eagle最低必須培養基(Alpha Modified Eagle Minimum Essential Medium，αMEM)、Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM)、F-12培養基、DMEM/F12、IMDM/F12、Ham’s培養基、RPMI 1640、Fischer’s培養基、或此等的混合培養基等。
多能性幹細胞的培養中，可使用將上述基礎培養基作為基礎的多能性幹細胞培養用的培養基，較佳為周知的胚胎幹細胞或誘導多能性幹細胞用的培養基、用以在無餵養細胞(feeder-free)下培養多能性幹細胞的培養基(無餵養細胞培養基)等。
「無血清培養基」意指不含有無調整或未精製的血清之培養基。混入有經過精製的源自血液的成分或源自動物組織的成分(例如，增殖因子)的培養基，只要在不含有無調整或未精製的血清的限制下，也包含於無血清培養基。
無血清培養基可以含有血清替代物。血清替代物可列舉例如：適當地含有白蛋白、運鐵蛋白(transferrin)、脂肪酸、膠原蛋白前驅物、微量元素、2-巰基乙醇(2-mercaptoethanol)、3’硫代甘油(3’thiol-glycerol)或此等的等效物等。 所述之血清替代物係能夠藉由例如國際公開第98/30679所記載之方法調製。亦可以利用市售品作為血清替代物。市售的血清替代物可列舉例如：剔除血清替代品(Knockout Serum Replacement，Thermo Fisher Scientific公司製)(以下也記載為「KSR」)、化學性確定的脂質濃縮物(Chemically-defined Lipid concentrated，Thermo Fisher Scientific公司製)、Glutamax(Thermo Fisher Scientific公司製)、B27補充物(Supplement)(Thermo Fisher Scientific公司製)、N2補充物(Supplement)(Thermo Fisher Scientific公司製)等。
於懸浮培養使用的無血清培養基亦可以適當地含有脂肪酸或脂質、胺基酸(例如，非必須胺基酸)、維生素、增殖因子、細胞介素、抗氧化劑、2-巰基乙醇、丙酮酸、緩衝劑、無機鹽類等。
為了迴避調製的煩雜，就無血清培養基而言，亦可以使用適量地(例如，約0.5%至約30%，較佳為約1%至約20%)添加有市售的KSR(Thermo Fisher Scientific公司製)的無血清培養基(例如，於F-12培養基與IMDM培養基的1：1混合液中添加有1×化學性確定的脂質濃縮物(chemically-defined Lipid concentrated)、5%KSR以及450μM 1-單硫代甘油的培養基)。再者，KSR同等品可舉例如揭示於日本特表2001-508302號公報所揭示的培養基。
「血清培養基」意指含有無調整或未精製的血清之培養基。該培養基亦可含有脂肪酸或脂質、胺基酸(例如，非必須胺基酸)、維生素、增殖因子、細胞介素、抗氧化劑、2-巰基乙醇、1-單硫代甘油、丙酮酸、緩衝劑、無機鹽類等。
本發明之培養較佳為在無異種來源(xeno-free)條件下進行。「無異種來源」意指源自與培養對象的細胞生物種相異的生物種的成分已被排除的條件。
本發明中使用的培養基，就迴避混入化學性未確定的成分之觀點而言，較佳為含有成分係化學性經確定的培養基(Chemically defined medium：CDM)。
「基底膜(Basement membrane)結構」意指由細胞外基質構成的薄膜狀結構。基底膜係在生體中形成於上皮細胞的基底側(basal)。基底膜的成分可列舉例如：IV型膠原蛋白、層連結蛋白、硫酸肝素蛋白多醣(heparan sulfate proteoglycan,HSPGs)(珍珠素(perlecan))、巢蛋白(entactin/nidogen)、細胞介素、成長因子等。源自生體的組織中以及以本發明的製造方法等製作出的細胞塊中是否存在有基底膜，係能夠藉由例如PAM染色等組織染色、以及使用針對基底膜的構成成分之抗體(抗層連結蛋白抗體、抗IV型膠原蛋白抗體等)的免疫組織化學等手法檢出。
「基底膜製品」係指將具有基底膜形成能力的期望的細胞播種並培養於其上時，包含具有控制上皮細胞樣的細胞形態、分化、增殖、運動、功能表現等的功能之基底膜構成成分者。在本發明中，進行細胞的接著培養時，能夠於基底膜製品存在下進行培養。在此，「基底膜構成成分」意指動物的組織中，存在於上皮細胞層和間質細胞層等之間成為薄膜狀的細胞外基質分子。基底膜製品可例如藉由將透過基底膜而接著於支撐體上的具有基底膜形成能力之細胞，使用具有該細胞的脂質溶解能力的溶液或鹼性溶液等將該細胞從支撐體除去而製作。基底膜製品可列舉包含：作為基底膜調製物市售的商品，例如，基質 膠(Matrigel，Corning公司製)、Geltrex(Thermo Fisher Scientific公司製)；作為基底膜成分所周知的細胞外基質分子，例如，層連結蛋白、IV型膠原蛋白、硫酸肝素蛋白多醣、巢蛋白等)者。
在細胞或組織的培養中，能夠使用從Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤等組織或細胞萃取、可溶化後的基質膠(Corning公司製)等基底膜製品。同樣地使用於細胞培養的基底膜成分也能夠使用：人類可溶化羊膜(生物資源應用研究所股份有限公司製)、產生於HEK293細胞的人類重組層連結蛋白(BioLamina公司製)、人類重組層連結蛋白片段(Nippi公司製)、人類重組玻連蛋白(vitronectin)(Thermo Fisher Scientific公司製)等。從迴避源自不同生物種的成分混入、以及迴避感染症風險的觀點而言，基底膜標品較佳為使用成分明確的重組蛋白質。
本說明書中，「含有物質X的培養基」、「物質X之存在下」意指添加有外源性(exogenous)物質X的培養基，或者是含有外源性物質X的培養基，及於外源性的物質X的存在下。外源性的物質X係例如與存在於培養基中的細胞或組織將該物質X內源性地(endogenous)表現、分泌或產生之內源性的物質X區別。培養基中的物質X亦可因物質X的分解或培養基的蒸發而引起微量的濃度變化。
本說明書中，物質X的濃度為Y的培養基中的培養開始時較佳，係指培養基中的物質X的濃度為Y時變成均勻的時間點，惟培養容器充分小(例如，96孔盤或者培養液為200μL以下的培養)時，將以使濃度成為Y之方式進行後述的培養基添加操作、半量培養基交換操作或全量培養基交換操作的時間點，解釋成在濃度Y的培養開始時。再者，培養基中物質X的濃度為Y係指包 含：經過一定培養期間之X的平均濃度為Y的情形、以Y濃度含有物質X的期間為培養期間的50%以上的情形、以Y濃度含有物質X的期間係於各步驟預想的培養期間中為最短期間以上的情形等。
本說明書中，「不存在物質X下」意指未添加外源性(exogenous)物質X的培養基或不含有外源性物質X的培養基，或者是不存在外源性物質X的狀態。
本說明書中，「人類蛋白質X」意指蛋白質X係具有在人類生體內自然地表發之蛋白質X的胺基酸序列。
「單離」意指進行將作為目的之成分或細胞以外因子去除之操作，脫離自然地存在的狀態。因此，「經單離的蛋白質X」不包含由培養對象的細胞或組織所產生的細胞或組織以及培養基中所含有的內源性蛋白質X。所謂「經單離的蛋白質X」之純度(蛋白質X於總蛋白質重量中所佔之重量百分率)通常為70%以上，較佳為80%以上，更佳為90%以上，又更佳為99%以上，最佳為100%。
本說明書中，「衍生物」意指針對特定的化合物，該化合物之分子內的一部分藉由與其他官能基或其他原子置換而產生的化合物群。本說明書中，蛋白質之「變異體」意指在可維持原始的蛋白質特性之範圍內，經進行胺基酸殘基的缺失、加成、置換等變異之蛋白質。變異的胺基酸數目沒有特別限制，可列舉：1至4、1至3、1至2、或1個。蛋白質的「變異體」可為具有顯示與原始的蛋白質至少90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、或99.5%以上同一性之胺基酸序列的蛋白質。
本說明書中，「A小時(A日)以後」意指包含A小時(A日)，且從A小時(A日)以後。「B小時(B日)以內」意指包含B小時(B日)，且從B小時(B日)以前。
「餵養細胞」意指培養幹細胞時共存的該幹細胞以外的細胞。使用於多能性幹細胞的未分化維持培養之餵養細胞可列舉例如：小鼠纖維母細胞(MEF)、人類纖維母細胞、SNL細胞等。餵養細胞較佳為經增殖抑制處理。增殖抑制處理可舉出增殖抑制劑(例如，絲裂黴素C(mitomycin C)等)處理或UV照射等。使用於多能性幹細胞的未分化維持培養之餵養細胞係藉由體液因子(humoral factor)(較佳為未分化維持因子)的分泌、或細胞接著用的支架(細胞外基質)的製作，而有助於多能性幹細胞的未分化維持。
本說明書中，餵養細胞不存在下(無餵養，feeder free)係指在不存在餵養細胞下進行培養。所謂餵養細胞不存在下可列舉例如：不添加餵養細胞的條件、或是未實質含有餵養細胞(例如，餵養細胞數相對於全數細胞數的比率為3%以下)的條件。
所謂「細胞凝集物」(cell aggregate)係指細胞所集合形成的塊，且細胞彼此為接著的塊。細胞塊、類胚體(Embryoid body)、球體(Sphere)、球狀體(Spheroid)、類器官(Organoid)也包含於細胞凝集物中。細胞凝集物較佳為細胞彼此面接著。在一部分的態樣中，細胞凝集物的一部分或全部中，細胞彼此細胞接著，例如形成接著結合(adherence junction)。在一部分的態樣中，亦可使兩個以上的細胞凝集物彼此進一步人工地接著或凝集。細胞塊彼此進一步接著或凝集而成的塊、及類組裝體(assembloid)亦包含於細胞凝集物中。細胞凝集物的形態 不限為球狀，亦可為例如：雙球狀、數珠狀、球的集合體狀、Scientific repoits,2021,11.1：1-14.、日本特願2021-078154所記載之紐狀、分枝狀等形態。
「均勻的細胞凝集物」意指培養複數個細胞凝集物時，各細胞凝集物的大小為一定，將細胞凝集物的大小以最大徑的長度進行評估時，均勻的細胞凝集物意指最大徑的長度分散為小。更具體而言，意指複數個細胞凝集物中的75%以上之細胞凝集物中，該最大徑為複數個細胞凝集物之最大徑平均值±100%以內，較佳為最大徑平均值的±50%以內，更佳為最大徑平均值的±20%以內。
「細胞集團」意指由2個以上細胞所構成之細胞群。細胞集團可由一種細胞構成，亦可由複數種細胞構成。構成細胞集團之細胞，係可在培養基中懸浮，亦可與培養器材等接著。再者，構成細胞集團之細胞可為單一細胞，亦可為細胞集團的至少一部分中，細胞彼此細胞接著，而形成細胞塊。在此，「單一細胞」意指例如幾乎不存在細胞彼此的接著(例如，面接著)之細胞。在一部分的態樣中，所謂分散成單一細胞，可舉出幾乎不存在細胞-細胞間結合(例如，接著結合)的狀態。細胞集團可包含細胞凝集物。
「組織」意指細胞集團的結構體，該結構體具有形態或性質相異的複數種類之細胞以一定型式立體地配置成的結構。
所謂「外胚層」表示在生物的早期發育的過程中卵子受精後所形成的3層胚層之中，存在於最外側之胚層。外胚層係根據發育的進行而分化成神經外胚層及表層外胚層，進一步神經外胚層分化成神經管及神經脊。由此等外胚層形成身體的各種器官，由外胚層形成的器官被稱為源自外胚層。例如，由神經管形成腦及脊髓等中樞神經系統的器官或組織。例如，由神經脊形成一部分的中樞神經系細胞、顏面的骨頭及軟骨、感覺神經細胞、自律神經細胞、色素細胞、 間葉系細胞等。由表層外胚層形成表皮、內耳、腦下垂體前葉、包含嗅上皮之上呼吸道組織等。基板及源自基板之組織係源自表層外胚層。多能性幹細胞在分化成外胚層的過程中，表現例如Pax3、Otx2、Sox1等已知為外胚層標記之基因。
所謂「內胚層」表示在生物的早期發育的過程中卵子受精後所形成的3層胚層之中，存在於最內側之胚層。由內胚層可形成例如：消化器官、尿道、咽頭、氣管、支氣管、肺等嗅上皮及鼻腔上皮除外的呼吸器官的大半。多能性幹細胞在分化成內胚層的過程中，表現例如SOX17、HNF-3β/FoxA2、Klf5、GATA4、GATA6、PDX-1等已知為內胚層標記之基因。
所謂「中胚層」表示形成在外胚層與內胚層之間的胚層。由中胚層可形成例如：循環器官、骨骼、肌肉等器官或組織。多能性幹細胞在分化成中胚層的過程中，表現例如T/Brachury、SMA、ABCA4、Nkx2.5、PDGFRα等已知為中胚層標記之基因。
「神經組織」意指藉由發育期或成體期的大腦、中腦、小腦、脊髓、視網膜、感覺神經、末梢神經等神經系細胞所構成的組織。本說明書中，「神經上皮組織」意指神經組織所形成的具有層結構的上皮結構者，神經組織中的神經上皮組織係能夠使用光學顯微鏡藉由亮視野觀察等評估存在量。
「中樞神經系統」係表示神經組織集積，成為情報處理的中心的區域。於脊椎動物中，腦及脊髓包含於中樞神經系統中。中樞神經系統係源自外胚層。
「神經系細胞(Neural cell)」係表示源自外胚層的組織中的表皮系細胞以外的細胞。亦即，神經系細胞中包含：神經系前驅細胞、神經元(neuron)(神經細胞)、神經膠細胞(glia cell)、神經幹細胞、神經元前驅細胞、神經膠前驅 細胞等細胞。神經系細胞也包含後述之構成視網膜組織的細胞(視網膜細胞)、視網膜前驅細胞、視網膜層特異性神經細胞、神經視網膜細胞、視網膜色素上皮細胞。神經系細胞能夠將巢蛋白(Nestin)、βIII微管蛋白(βIII tubulin)(Tuj1)、PSA-NCAM、N-黏附蛋白等作為標記進行鑑定。
神經元係形成神經回路對情報傳導進行貢獻的功能細胞，能夠將TuJ1、Dcx、HuC/D等的幼齡神經細胞標記、以及/或Map2、NeuN等成熟神經細胞標記的表現作為指標進行鑑定。
神經膠細胞可舉例如：星狀神經膠細胞(astrocyte)、寡樹突神經膠細胞(oligodendrocyte)、繆氏神經膠細胞(Muller glial cell)等。星狀神經膠細胞的標記可舉出GFAP，寡樹突神經膠細胞的標記可舉出O4，繆氏神經膠細胞的標記可舉出CRALBP等。
所謂神經幹細胞係具有成為神經細胞以及神經膠細胞的分化能力(多分化能力)、及維持多分化能力的增殖能力(亦稱為「自己複製能力」)的細胞。神經幹細胞的標記可列舉例如：巢蛋白(Nestin)、Sox2、Musashi、Hes家族、CD133等，惟此等標記為前驅細胞整體的標記而無法被認定為神經幹細胞特異性標記。神經幹細胞之數目能夠藉由神經球測定法(Neurosphere assay)或同源細胞測定法(clonal assay)等評估。
神經元前驅細胞係具有增殖能力，產生神經細胞而不產生神經膠細胞之細胞。神經元前驅細胞的標記可列舉例如：Tbr2、Tα1等。亦可將幼齡神經細胞標記(TuJ1、Dcx、HuC/D)陽性且增殖標記(Ki67、pH3、MCM)陽性的細胞鑑定為神經元前驅細胞。所謂神經膠前驅細胞係具有增殖能力，產生神經膠細胞而不產生神經細胞之細胞。
神經系前驅細胞(Neural Precursor cell)係包含神經幹細胞、神經元前驅細胞以及神經膠前驅細胞之前驅細胞的集合體，具有增殖能力和神經元以及神經膠產生能力。神經系前驅細胞係能夠將巢蛋白(Nestin)、GLAST、Sox2、Sox1、Musashi、Pax6等作為標記進行鑑定。亦可將神經系細胞的標記陽性且增殖標記(Ki67、pH3、MCM)陽性的細胞鑑定為神經系前驅細胞。
「視網膜組織」意指在生體視網膜中構成各視網膜層的視細胞(visual cell)、水平細胞、雙極細胞、無軸突神經細胞(amacrine cell)、視網膜神經節細胞、此等的前驅細胞、或視網膜前驅細胞等細胞中之至少複數種類，以層狀立體地排列成的視網膜組織。能夠藉由周知的方法，例如，細胞標記有無表現、以及其程度等確認各別的細胞是否為構成任一視網膜層的細胞。
「視網膜前驅細胞」意指可分化為視細胞、水平細胞、雙極細胞、無軸突神經細胞、視網膜神經節細胞、視網膜色素上皮細胞的任一個成熟的視網膜細胞之前驅細胞。所謂視細胞前驅細胞、水平細胞前驅細胞、雙極細胞前驅細胞、無軸突神經細胞前驅細胞、視網膜節細胞前驅細胞、視網膜色素上皮前驅細胞係指各別賦予決定分化為視細胞、水平細胞、雙極細胞、無軸突神經細胞、視網膜神經節細胞、視網膜色素上皮細胞之前驅細胞。
「視網膜層特異性神經細胞」意指構成視網膜層的細胞且為視網膜層中特異性的神經細胞。視網膜層特異性神經細胞可舉例如：雙極細胞、視網膜神經節細胞、無軸突神經細胞、水平細胞、視細胞、視網膜色素上皮細胞、桿體細胞(stab cell)以及錐體細胞(pyramidal cell)。
「視網膜細胞」中包含上述的視網膜前驅細胞以及視網膜層特異性神經細胞。視網膜細胞標記可列舉例如：於視網膜前驅細胞中表現的Rx(亦稱 為Rax)、Aldh1a3、以及Pax6；於下視丘神經元的前驅細胞中表現但不於視網膜前驅細胞表現的Nkx2.1；於下視丘神經上皮中表現但不於視網膜表現的Sox1；於視細胞的前驅細胞中表現的Crx、Blimp1等。視網膜層特異性神經細胞的標記可列舉例如：於雙極細胞中表現的Chx10、PKCα以及L7；於視網膜神經節細胞中表現的Tuj1以及Brn3；於無軸突神經細胞中表現的鈣網膜蛋白(Calretinin)；於水平細胞中表現的鈣結合蛋白(Calbindin)；於成熟視細胞中表現的視紫質(Rhodopsin)以及恢復蛋白(Recoverin)；於桿體細胞中表現的Nrl；於錐體細胞中表現的Rxr-gamma；於視網膜色素上皮細胞中表現的REP65以及Mitf等。
「大腦組織」意指構成胎兒期或成體的大腦的細胞(例如，大腦神經系前驅細胞(cortical neural precursor cell)、背側大腦神經系前驅細胞、腹側大腦神經系前驅細胞、大腦層結構特異性神經細胞(神經元)、第一層神經元、第二層神經元、第三層神經元、第四層神經元、第五層神經元、第六層神經元、神經膠細胞(星狀神經膠細胞以及寡樹突神經膠細胞)、此等的前驅細胞等)之一種或複數種，並且以層狀立體地配列成的組織。胎兒期的大腦也稱之為前腦或終腦。能夠藉由周知的方法，例如細胞標記有無表現、以及其程度等確認各個細胞的存在。
大腦細胞標記可列舉：於大腦細胞中表現的FoxG1(別名Bf1)；於大腦神經系前驅細胞中表現的Sox2以及巢蛋白；於背側大腦神經系前驅細胞中表現的Pax6以及Emx2；於腹側大腦神經系前驅細胞中表現的Dlx1、Dlx2以及Nkx2.1；於神經元前驅細胞中表現的Tbr2、Nex、Svet1；於第六層神經元中表現的Tbr1；於第五層神經元中表現的Ctip2；於第四層神經元中表現的RORβ；於 第三層神經元或第二層神經元中表現的Cux1或Brn2；於第一層神經元中表現的Reelin等。
「嗅皮質」係接受源自嗅球的單突觸(synapse)性輸入，關於嗅覺情報的處理之大腦的一個區域。於嗅皮質中表現的基因以及標記可列舉：Tbr1、FoxP2、Ctip2、Nor1(NR4a3)、DAARP-32、CUX1、Brn2、CART等。
「大腦基底核」係存在於大腦的一區域的神經核的集合體。大腦基底核所包含的神經核可舉例如：紋狀體(striatum)、蒼白球(globus pallidus)、視丘下核(subthalamic nucleus)、黑質(substantia nigra)等。所謂「大腦基底核原基」係由發育中形成在胚胎腦室內的神經系細胞所構成的結構。大腦基底核原基除了成為成體的大腦基底核的基礎之外，亦產生複數種神經細胞，該等的細胞於發育中遊走於中樞神經系統的各處。
「吻側移動路徑(rostral migratory stream)」係表示從腦室下帶的神經幹細胞所產生的新生神經元遊走於嗅球的現象以及其路徑。於吻側移動路徑移動中的神經元能夠使用例如PSA-NCAM、Dcx等遊走中的神經細胞標記而檢出。
「嗅球」意指存在於大腦的先端部，接受源自存在於嗅上皮的嗅覺受體細胞的輸入，與嗅覺情報的處理相關之中樞神經系統的一個區域。存在於嗅球的細胞係形成層結構，由表層依序稱為：嗅神經層(olfactory nerve layer)、腎絲球體層(glomerular layer)、外網狀層(external plexiform layer)、僧帽細胞層(mitral cell layer)、內網狀層(internal plexiform layer)、顆粒細胞層(granule cell layer)。嗅球的神經細胞中，有作為興奮性神經元的僧帽細胞(mitral cell)及毛叢狀細胞(tufted cell)，有作為抑制性神經元(仲介神經元)的嗅絲球旁體細胞(periglomerular cell)及顆粒細胞(granule cell)。於嗅球表現的基因以及標記可列舉：Arx、Tbr1、Tbr2/EOMES、Tbx21、Iba1等。
「非神經上皮組織」係表示具有上皮結構的組織中神經上皮組織以外的組織。上皮組織亦由外胚層、中胚層、內胚層、營養外胚層中的任一胚層形成。上皮組織中含有上皮、中皮、內皮。非神經上皮組織所含有的組織之例可列舉：表皮、角膜上皮、鼻腔上皮、嗅上皮、口腔上皮、氣管上皮、支氣管上皮、氣道上皮、腎上皮、腎皮質上皮、胎盤上皮等。上皮組織通常藉由各種細胞間結合而連繫，形成具有單層或雙層化的層結構的組織。此等上皮組織有無的確認和存在量的定量係能夠藉由光學顯微鏡進行觀察，或使用針對上皮細胞標記的抗體(抗E-黏附蛋白(E-Cadherin)抗體、抗N-黏附蛋白(N-Cadherin)抗體、抗EpCAM抗體等)之免疫組織化學等手法。
本發明中，「上皮細胞極性(Epithelial polarity)」係表示在上皮細胞內空間形成的構成成分及細胞功能的分布的偏差。例如，角膜上皮細胞係侷限於眼球的最外層，在頂端側(apical)表現用以保持淚液的膜結合型黏液素(MUC-1、4、16)等頂端側特異性蛋白質。再者，角膜上皮細胞係在基底側(basal)表現用以與基底膜接著之α6整合素(Integrin)、β1整合素等基底側特異性蛋白質。
源自生體之組織中及以本發明之製造方法等所製作出的細胞集團中，在上皮細胞及上皮組織中，是否存在上皮細胞極性係可藉由使用蠅虎蕈鹼(Phalloidin)、頂端側標記(抗MUC-1抗體，抗PKC-zeta抗體等)以及基底側標記(抗α6整合素抗體、抗β1整合素抗體等)之免疫組織化學等手法而檢出。
「基板(placode)」主要表示脊椎動物的發育過程中表皮外胚層的一部分肥厚形成的器官之原基。源自基板的組織可列舉：水晶體、嗅上皮、內耳、 三叉神經、腦下垂體等。基板的標記及屬於其前驅組織之前基板區域(preplacode region)的標記可列舉：Six1、Six4、Dlx5、Eya2等。
「嗅上皮基板/嗅基板(Olfactory placode)」係表示在胚胎發育過程中，形成在表皮外胚層的區域的肥厚結構，表現嗅上皮前驅細胞標記，成為將來的嗅上皮之器官的原基(Primordium)。嗅上皮前驅細胞標記可列舉：Pax6、Otx2、FoxG1(別名Bf1)、Sox2、Pou2f1、Sp8、Chd7、N-黏附蛋白、E-黏附蛋白、EpCAM、CK18、PDGFRβ等。
「呼吸器官」係表示從體外攝取氧，向體外排出二氧化羰之參與外呼吸(External Respiration)的器官、臟器。呼吸器官所含有之器官、臟器之例可列舉：鼻腔、咽頭、喉頭、氣管、支氣管、肺、胸腔等。呼吸器官於解剖學的可分為上呼吸道及下呼吸道。鼻孔、鼻腔、鼻咽腔、咽頭、喉頭被分類為上呼吸道。氣管、支氣管、細支氣管、肺被分類為下呼吸道。鼻腔上皮及嗅上皮係上呼吸道組織之一。
「鼻腔」係表示上呼吸道組織之一，存在於從位在顏面中心之外鼻中空之孔(鼻孔)往後的空間。鼻腔係從鼻孔開始，與咽頭上部連結。鼻腔係主要由被稱為嗅部的嗅上皮所存在且感知大氣中氣味物質的部分、被稱為呼吸部之被覆鼻腔上皮的部分、及以角化扁平複層上皮被覆的與皮膚具有同樣性質之部分所構成。
「鼻腔上皮」係表示鼻腔中的上皮組織，主要為後述之嗅上皮以外的區域。鼻腔上皮的功能係有將攝入的空氣加溫，又藉由分泌於表面之黏液及細胞表面的纖毛之作用而去除異物之作為。鼻腔上皮主源自於外胚層性的非神 經上皮，由分泌細胞、纖毛細胞、棒狀細胞、基底細胞、鹽細胞、神經內分泌細胞、孤立性化學感受上皮細胞等細胞所構成。
「分泌細胞」係表示在呼吸器系統的組織中進行黏液或漿液的分泌之細胞。杯狀細胞及腺細胞係屬於分泌細胞。於分泌細胞及其前驅細胞表現之基因及標記可列舉例如：黏液素1、黏液素2、黏液素3、黏液素4、黏液素5AC、黏液素5B、FoxA1、FoxA2、FOXA3、Nkx2.1/TTF-1、SPDEF等。
「纖毛細胞」(亦稱為「纖毛上皮細胞」)係表示形成上皮組織之細胞，且在細胞的表面具有纖毛之細胞。纖毛細胞係存在於呼吸器官系統、腦室、輸卵管等的上皮組織，已知具有藉由纖毛的運動而將液體、體液因子、侵入體內的異物、卵子等往特定的方向進行移送的作用。於纖毛細胞及其前驅細胞表現的基因及標記可列舉：FoxJ1、FoxN4、p73、乙醯基化微管蛋白、β4微管蛋白、DNAI1、DNAH5、SNTN等。將組織或細胞實施蘇木精-伊紅(HE)染色等實施後利用顯微鏡進行觀察，藉由觀察細胞表面的纖毛結構，可確認纖毛細胞及其前驅細胞的存在。例如，亦可根據J.Microsc.,211(2003),pp.103-111所記載之方法，計測纖毛運動頻率：ciliary beating frequency(CBF)的程度，藉此而觀察纖毛細胞的存在。
「纖毛運動」意指於細胞表面之纖毛的動作，在包含人類的哺乳動物之情形，具有在呼吸器官系統中排除細菌及病毒等病原體、在輸卵管中輸送卵子等功能。纖毛運動通常是由有效打擊及回復打擊所構成的波動運動。細胞是否實施纖毛運動係可藉由例如高倍率透鏡，利用顯微鏡拍攝動畫而檢出。
「棒狀細胞」(亦稱為「克氏細胞(Clara cell)」)係表示形成上皮組織之細胞，且具有黏液或漿液成分的分泌、由細胞色素(cytochromc)P450進行之 化合物代謝、細胞介素的分泌、免疫功能的控制等功能之細胞。於棒狀細胞表現之基因及標記可列舉：SCGB1A1、SCGB3A2、CYP2f1、CYP2f2、uroplakin3a、Cldn10、Aox3、Pon1、Cckar等。再者，表現細胞角蛋白4、細胞角蛋白13，並推測參與屏障功能及免疫反應之「Hillock細胞」亦包含於棒狀細胞的子集團。
「基底細胞(basal cell)」係表示存在於上皮之基底層的細胞。基底細胞係具有分裂能力，作為組織幹細胞提供生體組織的長期性維持及傷害時的修復。於鼻腔上皮的基底細胞及其前驅細胞表現的基因及標記可列舉：細胞角蛋白5、細胞角蛋白14、細胞角蛋白15、p63、△Np63、p75等。
鹽細胞(亦稱為「離子細胞：ionocyte」)係表示表現CFTR，且已報導有具有控制黏膜黏液的黏稠性之功能的細胞。於鹽細胞及其前驅細胞表現的基因及標記可列舉：CFTR、Foxi1、液胞型質子ATP酶(vacuolar H+-ATP酶、V-ATP酶)、Ascl3、Tfcp2l1、DMRT2等。
神經內分泌細胞係表示分泌賀爾蒙及胜肽，具有控制生體的發育及恆常性之功能的細胞。於神經內分泌細胞及其前驅細胞表現的基因及標記可列舉：Ascl1、NeuroD1、嗜鉻粒蛋白A、突觸素、神經特異烯醇化酶(NSE)、CALCA等。
孤立性化學感受上皮細胞係表示具有化學物質的感知及生體防禦反應的控制等功能之細胞。毛叢狀(Tuft)細胞、刷毛細胞、微絨毛細胞亦表示同種細胞。於孤立性化學感受上皮細胞表現的基因及標記可列舉：ChAT/Trpm5、Pou2f3/Skn-1a、苦味受體Tas2r、Gnat3、Plcb2、GNG13等。
「嗅上皮」係表示鼻腔中的上皮組織，生體感知氣味情報的嗅覺器官。嗅上皮係被分類為上呼吸道組織。嗅上皮係源自基板的組織之一，表現嗅 覺受體，由感知空氣中的揮發性分子之嗅神經細胞、支撐嗅神經細胞的支持細胞、屬於嗅上皮的幹細胞以及前驅細胞之基底細胞、及分泌黏液的鮑氏腺細胞等細胞所構成。嗅上皮係依形態分類為表層、中間層、基底層，於表層存在有支持細胞，於中間層存在有嗅神經細胞，於基底層存在有基底細胞。鮑氏腺係散布並形成於嗅上皮內分枝管狀的胞狀腺。
「嗅上皮的前驅組織」係包含嗅上皮基板。於嗅上皮以及嗅上皮基板中表現的基因以及標記，除了上述的基板區域以及前基板區域的標記以外，可列舉：Pax6、Otx2、FoxG1(別名Bf1)、Sox2、Pou2f1、Sp8、Chd7、N-黏附蛋白、E-黏附蛋白、EpCAM、CK18、PDGFRβ等。
「嗅覺系組織」意指胎兒期或成體的嗅覺系組織，例如，一種或至少複數種構成嗅上皮的細胞(例如，嗅神經細胞、支持細胞、基底細胞、鮑氏腺細胞、嗅神經鞘細胞以及此等的前驅細胞等)、構成嗅球的細胞、構成嗅皮質的細胞等，以層狀立體地配列成的組織。能夠藉由周知的方法，例如，細胞特異性基因有無表現或者其程度等確認各個細胞的存在。
「嗅神經細胞」(olfactory receptor neuron：ORN)表示位於鼻腔黏膜的嗅上皮中間層的接受嗅覺之神經細胞。嗅神經細胞係藉由位於表面的纖毛的嗅覺受體捕捉空氣中的揮發性分子。嗅神經細胞係雙極性的感覺細胞，利用於末梢側表現的嗅覺受體所捕捉到的嗅覺情報係被傳送至稱作為中樞側的嗅神經絲(Fila olfactoria)之神經軸索。嗅神經絲係以各數十根聚集形成一束，嗅神經意指此等束的全部。嗅神經絲係經過位於頭蓋骨的篩骨篩板之篩骨孔到達腦的嗅球，於該處與僧帽細胞等進行突觸結合，對腦內的嗅覺中樞傳導嗅覺情報。於嗅神經細胞以及前驅細胞中表現的基因以及標記可列舉：環狀核苷酸(nucleotide)感 受性通道α2次單元(subunit)(CNGA2)、環狀核苷酸感受性通道α4次單元(subunit)(CNGA4)、環狀核苷酸感受性通道β1b次單元(subunit)、嗅覺特異性G蛋白質(Golf)腺苷酸環化酶(adenyl cyclase)、嗅標記蛋白(Olfactory Marker protein，OMP)、NCAM、OCAM(NCAM-2)、Ebf1、Ebf2、Ebf3、NeuroD，PGP9.5、神經元特異性烯醇酶(Neuron Specific Enolase，NSE)、生長相關蛋白43(Growth Associated Protein 43，GAP-43/B50)、波形蛋白(vimentin)、Lhx2、Id3、β-微管蛋白III(Tuj)、鈣網膜蛋白、TrkB，Ctip2、Uncx以及嗅覺受體(olfactory receptor：OR)等。
「支持細胞」(Supporting cell/sustentacular cell)意指存在於嗅上皮的最頂端面側之多列圓柱上皮樣的細胞。支持細胞係關於嗅神經細胞等其他細胞的功能的發揮、生存或上皮結構的維持等。嗅上皮的微絨毛細胞(Microvillar cell)係支持細胞的亞型。於支持細胞表現的基因及標記可列舉：Notch2、Notch3、Carbonyl reductase 2(Cbr2)、S-100、Ezrin、Reep6、Sox2、Tyro3、CYP2A6、SUS-1、SUS-4、EPAS1等。
嗅上皮中之「基底細胞」(basal cell)係表示存在於嗅上皮之基底層的細胞。基底細胞係形態地區分為球狀基底細胞(globose basal cell：GBC)及水平基底細胞(horizontal basal cell：HBC)。此等二種細胞之中，球狀基底細胞係恆常地發生細胞分裂，供給新的嗅神經細胞的活動中之前驅細胞、幹細胞。另一方面，水平基底細胞係通常處於細胞分裂的細胞周期為停止狀態，於嗅上皮發生大規模損傷等時才被活化之休眠狀態的幹細胞。於水平基底細胞中表現的基因以及標記可列舉：p63、細胞角蛋白(cytokeratin)5、細胞角蛋白14、ICAM-1等。於 球狀基底細胞中表現的基因以及標記可列舉：GAP43、GBC-1、Lgr5、Ascl1、LSD1、SEC8、c-Kit/CD117、Sox2、Hes1、Id、Bmi1等。
「鮑氏腺細胞」(Bowman’s gland cell)係表示構成鮑氏腺(嗅腺)的細胞。鮑氏腺係存在於嗅上皮的分支的細管狀的組織，具有分泌保護嗅上皮的黏液等功能。於鮑氏腺細胞中表現的基因以及標記可舉例如：Sox9、E-黏附蛋白、水通道蛋白(Aquaporin)5、Ascl3、細胞角蛋白18等。
「嗅神經鞘細胞」(olfactory ensheating glia：OEG)係表示存在於嗅上皮以及嗅球的神經膠細胞的一種。嗅神經鞘細胞釋出BDNF、NGF等神經餵養因子，且與嗅神經的恆常地再生相關的細胞。於嗅神經鞘細胞中表現的基因以及標記可舉列舉：p75NTR、S100β、Sox10、GFAP、BLBP、水通道蛋白1、整合素(Integrin)α7等。
「嗅上皮周緣部」(lateral olfactory epithelium)係表示位於嗅上皮的周圍的區域，且與嗅上皮以外的非神經上皮連續的區域。本發明之「嗅上皮內側部」(medial olfactory epithelium)係表示圍繞於嗅上皮周緣部的嗅上皮的中心區域。已知嗅上皮周緣部和嗅上皮內側部中構成的細胞比率不同(Development,2010,137：2471-2481)。於嗅上皮周緣部高度表現的基因可列舉：Pbx1/2/3、Meis1、βIV微管蛋白。於嗅上皮內側部高度表現的基因可列舉：Tuj1、Ascl1、Sox2。
「性腺激素賀爾蒙釋出賀爾蒙陽性神經細胞」係主要存在於中樞神經系統的下視丘，參與生殖系統器官的控制之性腺激素賀爾蒙(gonadotropin releasing hormone：GnRH)的神經細胞。性腺激素賀爾蒙釋出賀爾蒙陽性神經細胞係於胎生期產生嗅上皮後，移動至中樞神經系統。於性腺激素賀爾蒙釋出賀爾 蒙陽性神經細胞中表現的基因以及標記可列舉：性腺激素賀爾蒙(gonadotropin releasing hormone：GnRH)等。
「嗅窩：Olfactory Pit」係在發育中的胚胎中，嗅上皮基板成為陷入於胚胎的內側而形成之嗅覺系組織的基礎之組織。嗅窩主要由構成將來的嗅上皮之組織、細胞、及與嗅上皮連續形成之鼻腔上皮的組織、細胞所構成。
「骨頭組織」係表示由構成骨頭的細胞、磷酸鈣、I型膠原蛋白等所構成的骨基質。構成骨頭的細胞包含骨頭細胞、破骨細胞、造骨細胞等。
本發明中，所謂「間葉系細胞」係主要源自中胚層以及神經脊，形成結締組織之非上皮性的細胞。該等之細胞中的一部分，係稱為間葉系幹細胞之具有多潛能性的體性幹細胞。以本發明之製造方法所製造之細胞集團以及以本發明之製造方法所製造之組織中是否含有間葉系細胞，係可藉由使用針對Nestin、Vimentin、Cadherin-11、Laminin、CD44等間葉系細胞標記的抗體之免疫組織化學等的手法而檢出。是否含有間葉系幹細胞係可藉由使用針對CD9、CD13、CD29、CD44、CD55、CD59、CD73、CD105、CD140b、CD166、VCAM-1、STRO-1、c-Kit、Sca-1、核幹細胞因子(Nucleostemin)、CDCP1、BMPR2、BMPR1A及BPMR1B等間葉系幹細胞標記之抗體的免疫組織化學等的手法而檢出。
本發明中，所謂「區位(niche)」或「幹細胞區位(Stem cell niche)」意指與幹細胞的增殖、分化、性質的維持等相關之微小環境。生體中之區位的例可列舉：造血幹細胞區位、毛囊幹細胞區位、腸管上皮幹細胞區位、肌肉幹細胞區位、腦下垂體區位、基底細胞區位等。該等之區位中，存在各個之組織特有的幹細胞與提供區位之支持細胞。再者，藉由支持細胞所提供之細胞介素、趨化因 子(Chemokine)、細胞外基質、細胞接著因子、細胞間訊息傳達因子等維持幹細胞。
「受體蛋白質」係表示位於細胞膜、細胞質或細胞核內的蛋白質，與荷爾蒙、細胞介素、細胞增殖因子、化合物等物質結合，引發各種細胞反應的蛋白質。
「嗅覺受體」係表示於嗅神經細胞以及其他細胞中表現，參予化合物等的感知的受體蛋白質。
「病原體」意指具有使成為宿主之生物引起疾病之性質者。病毒、真細菌、菌類、原生動物、寄生蟲、異常普里昂(Prion)蛋白質等蛋白質、核酸等係被視為病原體。
「病毒受體」係病毒感染細胞、組織時進行結合之宿主側的因子。病毒受體通常為蛋白質或糖鏈。例如，已報導血管張力素轉化酶2(Angiotensin-converting enzyme 2：ACE2)係SARS-CoV-2的病毒受體，與SARS-CoV-2之棘(Spike)蛋白結合。唾液酸α2,6Gal已被報導為人類季節性流感病毒(H1N1、H3N2等)的受體。唾液酸α2,3Gal已被報導為人類流感病毒(H5N1等)的受體。其他病毒受體係例如記載於Nature reviews Molecular cell biology 4.1(2003)：57-68等。
「病毒感染相關因子」係表示病毒感染細胞及組織時進行影響之宿主側的因子。例如，已報導TMPRSS2係蛋白質分解酵素的一種，在感染細胞時將SARS-CoV-2的蛋白質進行開裂，而轉變成活性型。
「樣式辨識受體(Pattern recognition receptor，PRRs)」係表示具有辨識病原體等異物之功能的受體。樣式辨識受體可列舉：凝集素(Lectin)、補體、膜受體、細胞質蛋白質等。樣式辨識受體係辨識病原體特有的分子樣式(pathogen- associated molecular patterns；PAMPs)，而發揮功能。病原體特有的分子樣式可列舉：核酸(DNA、RNA)、糖鏈、蛋白質等，樣式辨識受體係與各個固有的標的結合。
「細胞介素」係表示生體使用於細胞間情報傳達之一群蛋白質。細胞介素包含例如：趨化因子、增殖因子、造血因子、干擾素、介白素(Interleukin)、腫瘤壞死因子等。
「免疫」係辨識病原體及病毒等非自己物質、癌細胞等即使源自自己但具有異常而有害的細胞、及異物等，用以排除或無害化之生體所具有的系統。所謂「免疫反應」係免疫進行功能時免疫系統的組織及細胞所顯示的生理反應。
「病毒的分離」係將存在於預想有病毒存在的檢體中之特定病毒進行增殖、鑑定。檢體可列舉例如：包含人類之動物、植物等其他生物的組織、排泄物、分泌物等，或環境中的試料。病毒的分離係可因應成為對象之病毒的種類、特性，而使用培養細胞、動物等。
[2.構成鼻腔上皮之細胞之製造方法]
本發明係提供一種構成鼻腔上皮之細胞之製造方法。
構成鼻腔上皮之細胞之製造方法之一態樣，係包含下列步驟(1)至(4)：
於Wnt訊息傳導路徑抑制物質之存在下，培養多能性幹細胞之步驟(1)，
於BMP訊息傳導路徑作用物質之存在下，培養在前述步驟(1)所培養之細胞之步驟(2)，
在選自由FGF訊息傳導路徑作用物質及BMP訊息傳導路徑抑制物質所組成群組中之至少1個之存在下，培養在前述步驟(2)所培養之細胞之步驟(3)，及
將在前述步驟(3)所培養之細胞進一步培養，獲得前述構成鼻腔上皮之細胞之步驟(4)，該步驟(4)係在選自由Wnt訊息傳導路徑抑制物質、FGF訊息傳導路徑作用物質及BMP訊息傳導路徑抑制物質所組成群組中之至少2個的不存在下，培養前述細胞之步驟。
構成鼻腔上皮之細胞之製造方法之其他一態樣，係包含下列步驟(1)至(4)：
於Wnt訊息傳導路徑抑制物質之存在下，培養多能性幹細胞之步驟(1)，
於BMP訊息傳導路徑作用物質之存在下，培養在前述步驟(1)所培養之細胞之步驟(2)，
在選自由FGF訊息傳導路徑作用物質及BMP訊息傳導路徑抑制物質所組成群組中之至少1個之存在下，培養在前述步驟(2)所培養之細胞之步驟(3)，及
將在前述步驟(3)所培養之細胞進一步培養，獲得前述構成鼻腔上皮之細胞之步驟(4)，該步驟(4)係在選自由FGF訊息傳導路徑抑制物質、Shh訊息傳導路徑作用物質、BMP訊息傳導路徑作用物質、Wnt訊息傳導路徑作用物質、Notch訊息傳導路徑抑制物質、活化素/TGF-β訊息傳導路徑作用物質及視網酸訊息傳導路徑作用物質所組成群組中之至少1個之存在下，培養前述細胞步驟。
構成鼻腔上皮之細胞之製造方法之較佳的其他一態樣，係包含下列步驟(1)至(4)：
於Wnt訊息傳導路徑抑制物質之存在下，培養多能性幹細胞之步驟(1)，該步驟(1)係將前述多能性幹細胞懸浮培養，使細胞凝集物形成之步驟，
於BMP訊息傳導路徑作用物質之存在下，培養在前述步驟(1)所培養之細胞之步驟(2)，該步驟(2)係將前述細胞凝集物懸浮培養之步驟，
在選自由FGF訊息傳導路徑作用物質及BMP訊息傳導路徑抑制物質所組成群組中之至少1個之存在下，培養在前述步驟(2)所培養之細胞之步驟(3)，該步驟(3)係將前述細胞凝集物懸浮培養之步驟，及
將在前述步驟(3)所培養之細胞進一步培養，獲得前述構成鼻腔上皮之細胞之步驟(4)，該步驟(4)係在選自由Wnt訊息傳導路徑抑制物質、FGF訊息傳導路徑作用物質及BMP訊息傳導路徑抑制物質所組成群組中之至少2個的不存在下將前述細胞凝集物懸浮培養之步驟。
構成鼻腔上皮之細胞之製造方法之較佳的其他一態樣，係包含下列步驟(1)至(4)：
於Wnt訊息傳導路徑抑制物質之存在下，培養多能性幹細胞之步驟(1)，該步驟(1)係將前述多能性幹細胞懸浮培養，使細胞凝集物形成之步驟，
於BMP訊息傳導路徑作用物質之存在下，培養在前述步驟(1)所培養之細胞之步驟(2)，該步驟(2)係將前述細胞凝集物懸浮培養之步驟，
在選自由FGF訊息傳導路徑作用物質及BMP訊息傳導路徑抑制物質所組成群組中之至少1個之存在下，培養在前述步驟(2)所培養之細胞之步驟(3)，該步驟(3)係將前述細胞凝集物懸浮培養之步驟，及
將在前述步驟(3)所培養之細胞進一步培養，獲得前述構成鼻腔上皮之細胞之步驟(4)，該步驟(4)係在選自由FGF訊息傳導路徑抑制物質、Shh訊息傳導路徑作用物質、BMP訊息傳導路徑作用物質、Wnt訊息傳導路徑作用物質、Notch訊息傳導路徑抑制物質、活化素/TGF-β訊息傳導路徑作用物質及視網酸訊息傳導路徑作用物質所組成群組中之至少1個之存在下，將前述細胞凝集物懸浮培養之步驟。
構成鼻腔上皮之細胞之製造方法之較佳的其他一態樣，係包含下列步驟(1)至(4)：
於Wnt訊息傳導路徑抑制物質之存在下，培養多能性幹細胞之步驟(1)，該步驟(1)係將前述多能性幹細胞在培養器材上進行接著培養之步驟，
於BMP訊息傳導路徑作用物質之存在下，培養在前述步驟(1)所培養之細胞之步驟(2)，該步驟(2)係將前述細胞進行接著培養之步驟，
在選自由FGF訊息傳導路徑作用物質及BMP訊息傳導路徑抑制物質所組成群組中之至少1個之存在下，培養在前述步驟(2)所培養之細胞之步驟(3)，該步驟(3)係將前述細胞進行接著培養之步驟，及
將在前述步驟(3)所培養之細胞進一步培養，獲得前述構成鼻腔上皮之細胞之步驟(4)，該步驟(4)係在選自由Wnt訊息傳導路徑抑制物質、FGF訊息傳導路徑作用物質及BMP訊息傳導路徑抑制物質所組成群組中之至少2個的不存在下將前述細胞進行接著培養之步驟。
構成鼻腔上皮之細胞之製造方法之較佳的其他一態樣，係包含下列步驟(1)至(4)：
於Wnt訊息傳導路徑抑制物質之存在下，培養多能性幹細胞之步驟(1)，該步驟(1)係將前述多能性幹細胞在培養器材上進行接著培養之步驟，
於BMP訊息傳導路徑作用物質之存在下，培養在前述步驟(1)所培養之細胞之步驟(2)，該步驟(2)係將前述細胞進行接著培養之步驟，
在選自由FGF訊息傳導路徑作用物質及BMP訊息傳導路徑抑制物質所組成群組中之至少1個之存在下，培養在前述步驟(2)所培養之細胞之步驟(3)，該步驟(3)係將前述細胞進行接著培養之步驟，及
將在前述步驟(3)所培養之細胞進一步培養，獲得前述構成鼻腔上皮之細胞之步驟(4)，該步驟(4)係在選自由FGF訊息傳導路徑抑制物質、Shh訊息傳導路徑作用物質、BMP訊息傳導路徑作用物質、Wnt訊息傳導路徑作用物質、Notch訊息傳導路徑抑制物質、活化素/TGF-β訊息傳導路徑作用物質及視網酸訊息傳導路徑作用物質所組成群組中之至少1個之存在下，將前述細胞進行接著培養之步驟。
構成鼻腔上皮之細胞之製造方法之較佳的其他一態樣，係包含下列步驟(1)至(4)：
於Wnt訊息傳導路徑抑制物質之存在下，培養多能性幹細胞之步驟(1)，該步驟(1)係將前述多能性幹細胞懸浮培養，使細胞凝集物形成之步驟，
於BMP訊息傳導路徑作用物質之存在下，培養在前述步驟(1)所培養之細胞之步驟(2)，該步驟(2)係將前述細胞凝集物懸浮培養之步驟，
在選自由FGF訊息傳導路徑作用物質及BMP訊息傳導路徑抑制物質所組成群組中之至少1個之存在下，培養在前述步驟(2)所培養之細胞之步驟(3)，該步驟(3)係懸浮培養至前述細胞凝集物中分化出嗅神經前驅細胞之步驟，及
將在前述步驟(3)所培養之細胞進一步培養，獲得前述構成鼻腔上皮之細胞之步驟(4)，該步驟(4)係將前述細胞凝集物懸浮培養，而獲得前述嗅神經前驅細胞所存在之上皮、以及在連續之上皮上構成前述鼻腔上皮之細胞之步驟。
藉由步驟(1)至步驟(3)，可製造包含嗅神經細胞或其前驅細胞之嗅上皮樣的上皮組織。藉由進行步驟(4)，可將上皮組織分化誘導成包含構成鼻腔上皮之細胞的鼻腔上皮樣之組織。根據本發明之製造方法，可獲得包含構成鼻腔上皮之細胞或其前驅細胞之細胞集團。構成鼻腔上皮之細胞係包含選自由分泌 細胞、纖毛細胞、棒狀細胞、基底細胞、鹽細胞、神經內分泌細胞、孤立性化學感受上皮細胞所組成群組中之至少1種細胞。
上述之製造方法中，亦可藉由與步驟(3)相同的條件繼續進行培養，而獲得構成鼻腔上皮之細胞。
構成鼻腔上皮之細胞之製造方法之較佳的其他一態樣，係包含下列步驟：
在選自由FGF訊息傳導路徑抑制物質、Shh訊息傳導路徑作用物質、BMP訊息傳導路徑作用物質、Wnt訊息傳導路徑作用物質、Notch訊息傳導路徑抑制物質、活化素/TGF-β訊息傳導路徑作用物質及視網酸訊息傳導路徑作用物質所組成群組中之至少1個之存在下，培養包含嗅神經細胞或其前驅細胞之細胞集團的步驟。
含有包含嗅神經細胞之非神經上皮組織的細胞塊，亦可藉由國際公開第2020/039732號之實施例所記載之方法製造。
<步驟(a)>
本實施形態之製造方法中，也可包含步驟(a)，該步驟(a)係在步驟(1)之前，將多能性幹細胞於餵養細胞不存在下，利用包含下列(1)及(2)之培養基進行培養，
1)TGFβ家族訊息傳導路徑抑制物質及音蝟因子(Sonic hedgehog)訊息傳導路徑作用物質所組成群組中之至少1個，
2)未分化維持因子。
將多能性幹細胞在選自由TGFβ家族訊息傳導路徑抑制物質及音蝟因子訊息(Shh)傳導路徑作用物質所組成群組中之至少1個之存在下進行培養後，開始步驟(1)，藉此使多能性幹細胞的狀態改變，變得容易分化，不容易產生細胞死亡，提升構成鼻腔上皮之細胞的製造效率。
本發明之構成鼻腔上皮之細胞之製造方法中，多能性幹細胞較佳為胚胎幹細胞或誘導多能性幹細胞。誘導多能性幹細胞係自指定的機關入手，亦可購入市售品。例如，人類誘導多能性幹細胞株201B7株係可自京都大學入手。HC-6#10株、1231A3株及1383D2株係可自國立研究開發法人理化學研究所入手。hiPSβ-肌動蛋白(actin)GFP株係可自默克公司入手。
TGFβ家族訊息傳導路徑(亦即，TGFβ超級家族訊息傳導路徑)係將轉形增殖因子β(TGFβ)、Nodal/活化素(Activin)、或BMP作為配位基(ligand)，於細胞內藉由Smad家族的物質進行傳導的訊息傳導路徑。
TGFβ家族訊息傳導路徑抑制物質表示抑制TGFβ家族訊息傳導路徑，亦即，藉由Smad家族的物質進行傳導的訊息傳導路徑的物質，具體而言，可列舉：TGFβ訊息傳導路徑抑制物質、Nodal/活化素訊息傳導路徑抑制物質、以及BMP訊息傳導路徑抑制物質。TGFβ家族訊息傳導路徑抑制物質較佳為TGFβ訊息傳導路徑抑制物質。
TGFβ訊息傳導路徑抑制物質只要為抑制起因於TGFβ的訊息傳導路徑的物質即沒有特別限定，可以為核酸、蛋白質、低分子有機化合物的任一種。該物質可列舉例如：直接作用於TGFβ的物質(例如，蛋白質、抗體、適配體等)、抑制編碼TGFβ基因的表現的物質(例如，反義寡核苷酸、siRNA等)、抑制TGFβ受體與TGFβ的結合的物質、抑制起因於藉由TGFβ受體進行之訊息傳導的生理活性的物質(例如，TGFβ受體的抑制劑、Smad的抑制劑等)。作為TGFβ訊息傳導路徑抑制物質所熟知的蛋白質可舉出Lefty等。
TGFβ訊息傳導路徑抑制物質能夠使用所屬技術領域具有通常知識者周知的化合物。具體而言，可舉例如：SB431542(有簡稱為SB431之情形) (4-[4-(3,4-亞甲基二氧基苯基)-5-(2-吡啶基)-1H-咪唑-2-基]苯甲醯胺)、SB505124(2-[4-(1,3-苯并二氧雜環戊烯-5-基)-2-(1,1-二甲基乙基)-1H-咪唑-5-基]-6-甲基吡啶)、SB525334(6-[2-(1,1-二甲基乙基)-5-(6-甲基-2-吡啶基)-1H-咪唑-4-基]喹噁啉)、LY2157299(4-[5,6-二氫-2-(6-甲基-2-吡啶基)-4H-吡咯并[1,2-b]吡唑-3-基]-6-喹啉羧醯胺)、LY2109761(4-[5,6-二氫-2-(2-吡啶基)-4H-吡咯并[1,2-b]吡唑-3-基]-7-[2-(4-嗎啉基)乙氧基]-喹啉)、GW788388(4-{4-[3-(吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-基]-吡啶-2-基}-N-(四氫-2H-吡喃-4-基)苯甲醯胺)、LY364947(4-[3-(2-吡啶基)-1H-吡唑-4-基]喹啉)、SD-208(2-(5-氯-2-氟苯基)蝶呤-4-基)吡啶-4-基胺)、EW-7197(N-(2-氟苯基)-5-(6-甲基-2-吡啶基)-4-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-6-基-1H-咪唑-2-甲胺)、A83-01(3-(6-甲基吡啶-2-基)-4-(4-喹啉基)-1-苯基胺硫甲醯基-1H-吡唑)、RepSox(2-[5-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-基]-1,5-二氮萘)、SM16(4-[4-(1,3-苯并二氧雜環戊烯-5-基)-5-(6-甲基-2-吡啶基)-1H-咪唑-2-基]雙環[2.2.2]辛烷-1-羧醯胺)、R268712(4-[2-氟-5-[3-(6-甲基-2-吡啶基)-1H-吡唑-4-基]苯基]-1H-吡唑-1-乙醇)、IN1130(3-[[5-(6-甲基-2-吡啶基)-4-(6-喹
Figure 111124633-A0202-12-0063-1
啉基)-1H-咪唑-2-基]甲基]苯甲醯胺)、加魯色替(Galunisertib)(4-[5,6-二氫-2-(6-甲基-2-吡啶基)-4H-吡咯并[1,2-b]吡唑-3-基]-6-喹啉羧醯胺)、AZ12799734(4-({4-[(2,6-二甲基吡啶-3-基)氧基]吡啶-2-基}胺基)苯磺醯胺)、A77-01(4-[3-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-基]喹啉)、KRCA 0008(1,1-[(5-氯-2,4-嘧啶二基)雙[亞胺基(3-甲氧基-4,1-伸苯基)-4,1-哌
Figure 111124633-A0202-12-0063-2
二基]]二乙酮)、GSK 1838705(2-[[2-[[1-[(二甲基胺基)乙醯基]-5-(甲基氧基)-2,3-二氫-1H-吲哚-6-基]胺基]-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基]胺基]-6-氟-N-甲基苯甲醯胺)、克唑替尼(Crizotinib)(3-[(1R)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙氧基]-5-[1-(哌啶-4-基)-1H-吡唑-4-基]-2-胺基吡啶)、色瑞替尼(Ceritinib)(5-氯-N2-[2-異丙氧基-5-甲基-4- (4-哌啶基)苯基]-N4-(2-異丙基磺醯基苯基)嘧啶-2,4-二胺)、ASP 3026(N2-[2-甲氧基-4-[4-(4-甲基-1-哌
Figure 111124633-A0202-12-0064-3
基)-1-哌啶基]苯基]-N4-[2-[(1-甲基乙基)碸]、TAE684(5-氯-N2-[2-甲氧基-4-[4-(4-甲基-1-哌
Figure 111124633-A0202-12-0064-4
基)-1-哌啶基]苯基]-N4-[2-[(1-甲基乙基)磺醯基]苯基]-2,4-嘧啶二胺)、AZD3463(N-[4-(4-胺基-1-哌啶基)-2-甲氧基苯基]-5-氯-4-(1H-吲哚-3-基)-2-嘧啶胺)、TP0427736(6-[4-(4-甲基-1,3-噻唑-2-基)-1H-咪唑-5-基]-1,3-苯并噻唑)等Alk5/TGFβR1抑制劑；SIS3(1-(3,4-二氫-6,7-二甲氧基-2(1H)-異喹啉基)-3-(1-甲基-2-苯基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-基)-2-丙烯-1-酮)等SMAD3抑制劑；ITD-1(4-[1,1’-聯苯基]-4-基-1,4,5,6,7,8-六氫-2,7,7-三甲基-5-側氧基-3-喹啉羧酸乙基酯)等受體分解促進劑及此等化合物的衍生物等。此等物質可以單獨亦可組合複數種使用。SB431542係作為TGFβ受體(ALK5)以及活化素受體(ALK4/7)的抑制劑(亦即，TGFβR抑制劑)所周知的化合物。SIS3係於TGFβ受體控制下的抑制屬於細胞內訊息傳導因子SMAD3的磷酸化之TGFβ訊息傳導路徑抑制物質。ITD-1係TGF-βII型受體(TGF-β type II receptor)的蛋白酶體分解促進劑。上述化合物等具有作為TGFβ訊息傳導路徑抑制物質的活性，係記載於例如Expert opinion on investigational drugs,2010,19.1：77-91.等，所屬技術領域具有通常知識者所周知。
TGFβ訊息傳導路徑抑制物質較佳為包含Alk5/TGFβR1抑制劑。Alk5/TGFβR1抑制劑較佳為包含選自由SB431542、SB505124、SB525334、LY2157299、GW788388、LY364947、SD-208、EW-7197、A83-01、RepSox、SM16、R268712、IN1130、加魯舍替(Galunisertib)、AZ12799734、A77-01、KRCA0008、GSK 1838705、克唑替尼(Crizotinib)、色瑞替尼(Ceritinib)、ASP 3026、TAE684、 AZD3463、TP0427736所組成群組中之至少1個，又更佳為包含SB431542、RepSox或A83-01。
培養基中的TGFβ訊息傳導路徑抑制物質的濃度，係能夠在可達成上述效果的範圍中適當地設定。步驟(a)中使用SB431542作為TGFβ傳導路徑抑制物質時，通常使用約1nM至約100μM，較佳為約10nM至100μM，更佳為約10nM至約50μM，又更佳為約100nM至約50μM，特佳為約1μM至約10μM的濃度。再者，使用SB431542以外的TGFβ訊息傳導路徑抑制物質時，較佳為使用與上述濃度的SB431542顯示同等的TGFβ訊息傳導路徑抑制活性的濃度。
所謂Shh傳導路徑作用物質，係可將藉由Shh所媒介的訊息傳導增強的物質。Shh訊息傳導路徑作用物質可列舉例如：屬於Hedgehog家族的蛋白質(例如，Shh、Ihh)、Shh受體、Shh受體促效劑(agonist)、Smo促效劑、嘌嗎啡胺(Purmorphamine)(9-環己基-N-[4-(嗎啉基)苯基]-2-(1-萘基氧基)-9H-嘌呤-6-胺)，GSA-10(4-(1-己基-4-羥基-2-側氧基-1,2-二氫喹啉-3-羧醯胺)苯甲酸丙基)、Hh-Ag1.5、20(S)-羥基膽固醇、SAG(Smoothened促效劑(Smoothened Agonist)：N-甲基-N’-(3-吡啶基苯甲基)-N’-(3-氯苯并[b]噻吩-2-羰基)-1,4-二胺基環己烷)等。該等物質係可單獨或組合複數種使用。所謂上述化合物等具有作為Shh傳導路徑作用物質的活性，係例如記載於Molecular BioSystems,2010,6.1：44-54.，為所屬技術領域具有通常知識者所周知。
Shh訊息傳導路徑作用物質較佳為含有包含由SAG、嘌嗎啡胺、GSA-10所組成的群組中之至少1個，再佳為含有SAG。培養基中的Shh訊息傳導路徑作用物質之濃度，係能夠在可達成上述效果的範圍中適當地設定。於步驟 (a)中，SAG通常以通常為約1nM至約2000nM，較佳為約10nM至約1000nM，更佳為約10nM至約700nM，又更佳為約50nM至約700nM，特佳為約100nM至約600nM，最佳為約100nM至約500nM的濃度使用。再者，使用SAG以外之Shh訊息傳導路徑作用物質時，較佳為使用與上述濃度的SAG顯示同等之Shh訊息傳導促進活性的濃度。Shh傳導促進活性，能夠用所屬技術領域具有通常知識者周知的方法，例如著眼於Gli1基因表現之報導基因測定法(reporter gene assay)決定(Oncogene(2007)26,5163-5168)。
為了可進行未分化維持培養，步驟(a)中所使用的培養基係包含未分化維持因子。未分化維持因子只要是具有抑制多能性幹細胞的分化之物質，則沒有特別限定。所屬技術領域具有通常知識者所汎用之未分化維持因子在始發態多能性幹細胞(primed pluripotent stem cells)(例如，人類ES細胞、人類iPS細胞)時，可列舉：FGF訊息傳導路徑作用物質、TGFβ家族訊息傳導路徑作用物質、胰島素等。FGF訊息傳導路徑作用物質具體可舉出：纖維母細胞增殖因子(例如，bFGF、FGF4及FGF8)。再者，TGFβ家族訊息傳導路徑作用物質可列舉：TGFβ訊息傳導路徑作用物質、Nodal/活化素訊息傳導路徑作用物質。TGFβ訊息傳導路徑作用物質可列舉例如：TGFβ1、TGFβ2。Nodal/活化素訊息傳導路徑作用物質可列舉例如：Nodal、活化素A、活化素B。該等物質係可單獨或組合複數種使用。培養人類多能性幹細胞(例如，人類ES細胞、人類iPS細胞)時，步驟(a)中的培養基較佳為含有bFGF作為未分化維持因子。
未分化維持因子通常是哺乳動物的未分化維持因子。哺乳動物可舉例如上述者。未分化維持因子由於在哺乳動物的物種間能夠具有交差反應性，因此只要能夠維持培養對象的多能性幹細胞的未分化狀態，即可以使用任一種 哺乳動物的未分化維持因子。未分化維持因子較佳為與培養的細胞為同種之哺乳動物的未分化維持因子。例如，人類多能性幹細胞的培養中，使用人類未分化維持因子(例如，bFGF、FGF4、FGF8、EGF、Nodal、活化素A、活化素B、TGFβ1、TGFβ2等)。未分化維持因子較佳為經單離。
未分化維持因子在具有作為培養對象之多能性幹細胞的未分化維持能力的限制下，可使用由任一宿主所生產者或人工合成者。本發明中使用的未分化維持因子較佳為經接受與生體內所產生者同樣修飾者，更佳為以與作為培養對象之多能性幹細胞為同種的細胞中未含有異種成分之條件下所產生者。
本發明之製造方法之一態樣，係包含提供經單離的未分化維持因子之步驟。本發明之製造方法之一態樣，係包含對步驟(a)所使用之培養基中，外源性(或外因性)地添加經單離的未分化維持因子之步驟。步驟(a)所使用之培養基中亦可事先加添有未分化維持因子。
步驟(a)中所使用的培養基中的未分化維持因子濃度，係可維持進行培養之多能性幹細胞的未分化狀態之濃度，只要是所屬技術領域具有通常知識者則可適當地設定。例如，餵養細胞不存在下使用bFGF作為未分化維持因子時，其濃度通常為約4ng/mL至約500ng/mL，較佳為約10ng/mL至約200ng/mL，更佳為約30ng/mL至約150ng/mL。
步驟(a)係在餵養細胞不存在下實施。步驟(a)中的多能性幹細胞之培養，可以在懸浮培養以及接著培養的任一個條件下進行，惟較佳為藉由接著培養進行。餵養細胞不存在下的多能性幹細胞之培養中，為了對多能性幹細胞提供取代餵養細胞的支架，亦可使用適切的基質作為支架。藉由屬於支架的基質，在經表面塗覆後的細胞容器中，接著培養多能性幹細胞。
作為支架使用的基質可列舉：層連結蛋白(Nat Biotechnol.28,611-615(2010))、層連結蛋白片段(Nat Commun 3,1236(2012))、基底膜標品(Nat Biotechnol 19,971-974(2001))、明膠、膠原蛋白、硫酸肝素蛋白多醣(HSPGs)、巢蛋白(entactin)、玻連蛋白(Vitronectin)等。基質較佳為使用層連結蛋白511(Nat Biotechnol 28,611-615(2010))。
層連結蛋白片段，係具有對多能性幹細胞的接著性，只要是於無餵養條件下可進行多能性幹細胞的維持培養者，則沒有特別限定，較佳為E8片段(fragment)。層連結蛋白E8片段係將層連結蛋白511用彈性蛋白酶(Elastase)消化所得到之片段中，鑑定為具有強細胞接著活性的片段者(EMBO J.,3：1463-1468,1984,J.Cell Biol.,105：589-598,1987)。層連結蛋白片段較佳為使用層連結蛋白511的E8片段(Nat Commun 3,1236(2012),Scientific Reports 4,3549(2014))。層連結蛋白E8片段，不需要為層連結蛋白之彈性蛋白酶消化產物，也可以為重組物。亦可以為基因重組動物(蠶等)所產生者。由避免混入未鑑定成分之觀點而言，較佳為使用重組物的層連結蛋白片段。層連結蛋白511之E8片段有市售，例如能夠自Nippi股份有限公司等購入。
由避免混入未鑑定成分之觀點而言，本發明中所使用的層連結蛋白或層連結蛋白片段較佳為經單離者。於步驟(a)的餵養細胞不存在下的多能性幹細胞的培養中，較佳為在藉由單離的層連結蛋白511或層連結蛋白511之E8片段，更佳為藉由層連結蛋白511之E8片段進行過表面塗覆的細胞容器中，將多能性幹細胞接著培養。
於步驟(a)中使用的培養基，只要於無餵養條件下，能夠進行多能性幹細胞的未分化維持培養的培養基(無餵養培養基)，即沒有特別限定。無餵養 培養基已開發/市售許多的合成培養基，可舉例如：Essential 8培養基。Essential 8培養基係於DMEM/F12培養基中，含有L-抗壞血酸-2-磷酸鎂(64mg/l)、硒酸鈉(sodium selenium)(14μg/l)、胰島素(19.4mg/l)、NaHCO3(543mg/l)、運鐵蛋白(transferrin)(10.7mg/l)、bFGF(100ng/mL)、以及TGFβ家族訊息傳導路徑作用物質(TGFβ1(2ng/mL)或Nodal(100ng/mL))(Nature Methods,8,424-429(2011))作為添加劑。市售的無餵養培養基可列舉例如：Essential 8(Thermo Fisher Scientific公司製)、S-medium(DS PHARMA BIOMEDICAL股份有限公司製)、StemPro(Thermo Fisher Scientific公司製)、hESF9、mTeSRl(STEMCELL Technologies公司製)、mTeSR2(STEMCELL Technologies公司製)、TeSR-E8(STEMCELL Technologies公司製)、mTeSR Plus(STEMCELL Technologies公司製)、StemFit(味之素股份有限公司製)、ReproMed iPSC Medium(Reprocell公司製)、NutriStem XF(Biological Industries公司製)、NutriStem V9(Biological Industries公司製)、Cellartis DEF-CS Xeno-Free Culture Medium(TaKaRa-Bio公司製)、Stem-Partner SF(極東製藥公司製)、PluriSTEM Human ES/iPS Cell Medium(默克公司製)、StemSure hPSC Medium △(富士膜和光純藥公司製)、ciKIC iPS medium(關東化學股份有限公司製)、StemMACS iPS-Brew XF,人類(human)(Miltenyi Biotec公司製)、ExCellerate iPSC擴增培養基，無動物成分(ExCellerate iPSC Expansion Medium,Animal Component-Free)(R & D Systems公司製)、STEMium人類多能性幹細胞生長培養基(STEMium Human Pluripotent Stem Cell Growth Medium)(Clini Sciences公司製)、CELRENA Medium(細胞科學研究所公司製)、hPSC Growth Medium DXF(PromoCell公司製)、PSGro hESC/iPSC Medium(System Biosciences公司製)等。藉由於步驟(a)使 用此等培養基，而能夠簡便地實施本發明。StemFit培養基係含有bFGF作為未分化維持成分(Scientific Reports(2014)4,3594)。
步驟(a)中的多能性幹細胞可為始發狀態(Primed state)及初始狀態(Naive-like state)之任一者，較佳為始發狀態。初始狀態的多能性幹細胞，系將始發狀態的多能性幹細胞藉由例如：Cell,2014,158.6：1254-1269.所記載之方法，或市售之ReproNaive(Reprocell公司製)、NaïveCult Induction Kit(STEMCELL Technologies公司製)、RSeT Medium(STEMCELL Technologies公司製)、AlphaSTEM Culture System(Minerva Biotechnologies公司製)等培養基進行處理、培養而獲得者。
於步驟(a)中使用的培養基，可為血清培養基亦可為無血清培養基。由避免混入化學性未確定成分之觀點而言，於步驟(a)中所使用的培養基，較佳為無血清培養基。培養基亦可以含有血清替代物。
於步驟(a)中的多能性幹細胞的培養時間，只要在接續的步驟(1)中使能夠形成的凝集物的品質在提升的效果的範圍中，即沒有特別限定，通常為0.5至144小時，較佳為2至96小時，再佳為6至48小時，更佳為12至48小時，特佳為18至28小時，例如24小時。亦即，步驟(1)開始的0.5至144小時，較佳為於18至28小時前開始步驟(a)，步驟(a)結束後接續進行步驟(1)。
步驟(a)之較佳一態樣中，將人類多能性幹細胞於餵養細胞不存在下，在含有bFGF的無血清培養基中進行接著培養。該接著培養較佳為在表面經塗覆有層連結蛋白511、層連結蛋白511之E8片段或玻連蛋白的細胞容器中實施。該接著培養較佳為使用StemFit作為無餵養培養基實施。
步驟(a)之較佳一態樣中，將人類多能性幹細胞，於餵養細胞不存在下，在含有bFGF的無血清培養基中進行懸浮培養。該懸浮培養中，人類多能性幹細胞可以形成人類多能性幹細胞的凝集物。
步驟(a)及後述的步驟中，培養溫度、CO2濃度等培養條件能夠適當地設定。培養溫度例如約30℃至約40℃，較佳為約37℃。又CO2濃度例如為約1%至約10%，較佳為約5%。
<步驟(1)>
步驟(1)係於Wnt訊息傳導路徑抑制物質之存在下培養多能性幹細胞。
所謂Wnt訊息傳導路徑係將Wnt家族蛋白質作為配位基，主要以Frizzled作為受體之訊息傳導路徑。該訊息路徑可列舉：典型Wnt路徑(canonical Wnt pathway)、非典型Wnt路徑(non-canonical Wntpathway)等。藉由典型Wnt路徑係藉由β-鏈蛋白進行傳導。非典型的Wnt路徑可舉例如：平面細胞極化(planar cell Polarity，PCP)路徑、Wnt/JNK路徑、Wnt/鈣路徑、Wnt-RAP1路徑、Wnt-Ror2路徑、Wnt-PKA路徑、Wnt-GSK3MT路徑、Wnt-aPKC路徑、Wnt-RYK路徑、Wnt-mTOR路徑等。非典型的Wnt路徑中，即便於Wnt以外的其他訊息傳導路徑中也存在有進行活化的共通訊息傳導因子，惟，本發明中該等因子也作為Wnt訊息傳導路徑的構成因子，針對該等因子的抑制物質也包含於Wnt訊息傳導路徑抑制物質。
Wnt訊息傳導路徑抑制物質只要是能夠抑制藉由Wnt家族蛋白質所引發的訊息傳導，即沒有限定。該抑制物質可以為核酸、蛋白質、低分子有機化合物的任一種。該抑制物質可舉例如：抑制Wnt的加工(processing)與細胞外的分泌的物質、直接作用於Wnt的物質(例如，蛋白質、抗體、適配體等)、抑制 編碼Wnt基因的表現的物質(例如，反義寡核苷酸、siRNA等)、抑制Wnt受體與Wnt的結合的物質、抑制起因於藉由Wnt受體進行的訊息傳導的生理活性的物質。
作為Wnt訊息傳導路徑抑制物質所熟知的蛋白質可列舉例如：屬於分泌型Frizzled相關蛋白(secreted Frizzled Related Protein，sFRP)類的蛋白質(sFRP1至5、Wnt抑制因子-1(Wnt Inhibitory Factor-1，WIF-1)、Cerberus)、屬於Dickkopf(Dkk)類的蛋白質(Dkk1至4、Kremen)、APCDD1、APCDD1L、屬於Draxin家族的蛋白質、IGFBP-4、Notum、屬於SOST/硬化蛋白(Sclerostin)家族的蛋白質等。
Wnt訊息傳導路徑抑制物質能夠使用所屬技術領域具有通常知識者所周知的化合物。典型Wnt訊息傳導路徑的抑制物質可列舉例如：Frizzled抑制劑、Dishevelled(Dvl)抑制劑、端錨聚合酶(Tankyrase，TANK)抑制劑、酪蛋白激酶1(Casein kinase 1，CK1)抑制劑、鏈蛋白應答性轉錄抑制劑、p300抑制劑、CREB結合蛋白(CREB-binding protein，CBP)抑制劑、BCL-9抑制劑(Am J Cancer Res.2015；5(8)：2344-2360)等。非典型Wnt路徑的抑制物質可列舉例如：Porcupine(PORCN)抑制劑、鈣/鈣調素依賴性蛋白激酶(Calcium/calmodulin-dependent protein kinase II，CaMKII)抑制劑、(TGF-β活化激酶1(TGF-β-activated kinase 1，TAK1)抑制劑、類Nemo激酶(Nemo-Like Kinase，NLK)抑制劑、LIM激酶抑制劑、雷帕黴素的哺乳動物標的(mammalian target of rapamycin，mTOR)抑制劑、c-Jun NH 2末端激酶(c-Jun NH 2-terminal kinase，JNK)抑制劑、蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)抑制劑、甲硫胺酸胺肽酶(Methionine Aminopeptidase 2，MetAP2)抑制劑、鈣調磷酸酶(Calcineurin)抑制劑、活化T細胞的核因子(nuclear factor of activated T cells，NFAT)抑制劑、ROCK抑制劑等。再者，雖尚未被報告作用機制，惟，Wnt訊息傳導路徑抑制物質可列舉：KY02111(N-(6-氯-2-苯并噻唑基)-3,4-二甲氧基苯丙醯胺)、KY03-I(2-(4-(3,4-二甲氧基苯基)丁醯胺)-6-碘苯并噻唑)。該等物質係可單獨或組合複數種使用。
PORCN抑制劑可列舉例如：IWP-2(N-(6-甲基-2-苯并噻唑基)-2-[(3,4,6,7-四氫-4-側氧基-3-苯基噻吩并[3,2-d]嘧啶-2-基)硫基]-乙醯胺)、IWP-3(2-[[3-(4-氟苯基)-3,4,6,7-四氫-4-側氧基噻吩并[3,2-d]嘧啶-2-基]硫基]-N-(6-甲基-2-苯并噻唑基)-乙醯胺)、IWP-4(N-(6-甲基-2-苯并噻唑基)-2-[[3,4,6,7-四氫-3-(2-甲氧基苯基)-4-側氧基噻吩并[3,2-d]嘧啶-2-基]硫基]-乙醯胺)、IWP-L6(N-(5-苯基-2-吡啶基)-2-[(3,4,6,7-四氫-4-側氧基-3-苯基噻吩并[3,2-d]嘧啶-2-基)硫基]-乙醯胺)、IWP-12(N-(6-甲基-2-苯并噻唑基)-2-[(3,4,6,7-四氫-3,6-二甲基-4-側氧基噻吩并[3,2-d]嘧啶-2-基)硫基]乙醯胺)、LGK-974(2-(2’,3-二甲基-2,4’-聯吡啶-5-基)-N-(5-(吡
Figure 111124633-A0202-12-0073-5
-2-基)吡啶-2-基)乙醯胺)、Wnt-C59(2-[4-(2-甲基吡啶-4-基)苯基]-N-[4-(吡啶-3-基)苯基]乙醯胺)，ETC-159(1,2,3,6-四氫-1,3-二甲基-2,6-二側氧基-N-(6-苯基-3-嗒
Figure 111124633-A0202-12-0073-6
基)-7H-嘌呤-7-乙醯胺)、GNF-6231(N-[5-(4-乙醯基-1-哌
Figure 111124633-A0202-12-0073-7
基)-2-吡啶基]-2’-氟-3-甲基[2,4’-聯吡啶]-5-乙醯胺)及該等之衍生物等。該等物質係可單獨或組合複數種使用。上述化合物等具有作為PORCN抑制劑之活性，係例如記載於Bioorganic & medicinal chemistry letters,2015,25.23：5472-5476.，為所屬技術領域具有通常知識者所周知。
JNK抑制劑可列舉例如：JNK-IN-8((E)-3-(4-(二甲基胺基)丁-2-烯醯胺基)-N-(3-甲基-4-((4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基)胺基)苯基)苯甲醯胺)、SP600125(蒽醌并[1-9-cd]吡唑-6(2H)-酮)、DB07268(2-[[2-[(3-羥基苯基)胺基]-4-嘧啶基]胺 基]苯甲醯胺)、坦茲舍替(Tanzisertib)(反式-4-[[9-[(3S)-四氫-3-呋喃基]-8-[(2,4,6-三氟苯基)胺基]-9H-嘌呤-2-基]胺基]環己醇)、本它馬莫(Bentamapimod)(1,3-苯并噻唑-2-基)[2-[[4-[(嗎啉-4-基)甲基]苯甲基]氧基]嘧啶-4-基]乙腈、TCS JNK 6o(N-(4-胺基-5-氰基-6-乙氧基-2-吡啶基)-2,5-二甲氧基苯乙醯胺)、SU3327(5-[(5-硝基-2-噻唑基)硫基]-1,3,4噻二唑-2-胺)、CEP1347((9S,10R,12R)-5-16-雙[(乙硫基)甲基]-2,3,9,10,11,12-六氫-10-羥基-9-甲基-1-側氧基-9,12-環氧基-1H-二吲哚并[1,2,3-fg：3’,2’,1’-kl]吡咯并[3,4-i][1,6]苯并二氮雜環辛-10-羧酸甲基酯)、c-JUN胜肽、AEG3482(6-苯基咪唑并[2,1-b]-1,3,4-噻二唑-2-磺醯醯胺)、TCS JNK 5a(N-(3-氰基-4,5,6,7-四氫苯并[b]噻吩-2-基)-1-萘羧醯胺)、BI-78D3(4-(2,3-二氫-1,4-苯并二噁英-6-基)-2,4-二氫-5-[(5-硝基-2-噻唑基)硫基]-3H-1,2,4-三唑-3-酮)、IQ-3(11H-茚并[1,2-b]喹
Figure 111124633-A0202-12-0074-9
啉-11-酮O-(2-呋喃基羰基)肟)、SR 3576(3-[4-[[[(3-甲基苯基)胺基]羰基]胺基]-1H-吡唑-1-基]-N-(3,4,5-三甲氧基苯基)苯甲醯胺)、IQ-1S(11H-茚并[1,2-b]喹
Figure 111124633-A0202-12-0074-10
啉-11-酮肟鈉鹽)、JIP-1(153-163)、CC-401(3-[3-[2-(1-哌啶基)乙氧基]苯基]-5-(1H-1,2,4-三唑-5-基)-1H-吲唑二鹽酸鹽)及該等之衍生物等。該等物質係可單獨或組合複數種使用。上述化合物等具有作為JNK抑制劑之活性，係例如記載於J Enzyme Inhib Med Chem.2020；35(1)：574-583.，為所屬技術領域具有通常知識者所周知。
Rac抑制劑可列舉例如：EHT1864(5-(5-(7-(三氟甲基)喹啉-4-基硫基)戊氧基)-2-(N-嗎啉基甲基)-4H-吡喃-4-酮二鹽酸鹽)、NSC23766(N6-[2-[[4-(二乙基胺基)-1-甲基丁基]胺基]-6-甲基-4-嘧啶基]-2-甲基-4,6-喹啉二胺三鹽酸鹽)、EHop-016(N4-(9-乙基-9H-咔唑-3-基)-N2-[3-(4-嗎啉基)丙基]-2,4-嘧啶二胺)、1A-116(N-(3,5-二甲基苯基)-N’-[2-(三氟甲基)苯基]胍)、ZCL278(2-(4-溴-2-氯苯氧基)- N-(4-(N-(4,6-二甲基嘧啶-2-基)胺磺醯基)苯基胺基甲硫醯基)乙醯胺)、MBQ-167(9-乙基-3-(5-苯基-1H-1,2,3-三唑-1-基)-9H-咔唑)、KRpep-2d(錒(actinium)；[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(3R,8R,11S,14S,20S,23S,26S,29S,32S,35S,38S)-8-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-胺基-5-二胺基亞甲胺基(carbamimidamido)-1-側氧基戊烷-2-基]胺基]-5-二胺基亞甲胺基-1-側氧基戊烷-2-基]胺基]-5-二胺基亞甲胺基-1-側氧基戊烷-2-基]胺基]-5-二胺基亞甲胺基-1-側氧基戊烷-2-基]胺甲醯基]-29-[(2R)-丁烷-2-基]-20-(羧甲基)-26-(羥基甲基)-23,32-雙[(4-羥基苯基)甲基]-35-(2-甲基丙基)-2,10,13,19,22,25,28,31,34,37-十側氧基-11-丙烷-2-基-5,6-二硫雜-1,9,12,18,21,24,27,30,33,36-十氮雜三環[36.3.0.014,18]十四烷-3-基]胺基]-5-二胺基亞甲胺基-1-側氧基戊烷-2-基]胺基]-5-二胺基亞甲胺基-1-側氧基戊烷-2-基]胺基]-5-二胺基亞甲胺基-1-側氧基戊烷-2-基]胺基]-5-二胺基亞甲胺基-1-側氧基戊烷-2-基]胺基錒)、ARS-853(1-[3-[4-[2-[[4-氯-2-羥基-5-(1-甲基環丙基)苯基]胺基]乙醯基]-1-哌
Figure 111124633-A0202-12-0075-11
基]-1-吖呾基]-2-丙烯-1-酮)、沙利拉席(Salirasib)(2-(((2E,6E)-3,7,11-三甲基十二-2,6,10-三烯-1-基)硫基)苯甲酸)、ML141(4-(5-(4-甲氧基苯基)-3-苯基-4,5-二氫吡唑-1-基)苯磺醯胺)及該等之衍生物等。該等物質係可單獨或組合複數種使用。上述化合物等具有作為Rac抑制劑之活性，係例如記載於Cancer research,2018,78.12：3101-3111.，為所屬技術領域具有通常知識者所周知。
Wnt訊息傳導路徑抑制物質較佳為含有選自由PORCN抑制劑、KY02111及KY03-I所組成群組中之至少1個，更佳為含有PORCN抑制劑。Wnt訊息傳導路徑抑制物質亦較佳為包含具有對Wnt之非典型Wnt路徑的抑制活性之物質。Wnt訊息傳導路徑抑制物質更佳為包含具有對Wnt/平面細胞極化(PCP)路徑的抑制活性之物質，又更佳為包含具有對Wnt/JNK路徑的抑制活性之物質。 本發明所使用之PORCN抑制劑較佳為包含選自由IWP-2、IWP-3、IWP-4、IWP-L6、IWP-12、LGK-974、Wnt-C59、ETC-159及GNF-6231所組成群組中之至少1個，更佳為包含IWP-2或Wnt-C59，又更佳為包含IWP-2。
較佳為將作為Wnt訊息傳導路徑抑制物質之PORCN抑制劑與其他對Wnt/PCP路徑具有抑制活性之物質組合使用。與PORCN抑制劑組合使用之Wnt/PCP路徑抑制物質較佳為JNK抑制劑或Rac抑制劑。本發明所用之JNK抑制劑較佳為JNK-IN-8。本發明所用之Rac抑制劑較佳為EHT1864。
培養基中的Wnt訊息傳導路徑抑制物質之濃度能夠在可達成上述的效果的範圍中適當地設定。由包含構成鼻腔上皮之細胞或其前驅細胞的細胞塊之製造效率的觀點而言，例如，使用屬於PORCN抑制劑的1種之IWP-2作為Wnt訊息傳導路徑抑制物質時，其濃度通常為約10nM至約50μM，較佳為約10nM至約30μM，又更佳為約100nM至約10μM，最佳為約0.5μM。使用屬於PORCN抑制劑的1種之Wnt-C59時，其濃度通常為約10nM至約30μM，較佳為約20nM至約10μM，更佳為約500nM。使用KY02111時，其濃度通常為約10nM至約50μM，較佳為10nM至約30μM，再佳為約100nM至約10μM，更佳為約5μM。
將作為Wnt訊息傳導路徑抑制物質之PORCN抑制劑與JNK抑制劑組合使用時，例如，使用屬於JNK抑制劑之1種的JNK-IN-8時，其濃度通常為約10nM至約50μM，較佳為約10nM至約30μM，又更佳為約100nM至約10μM，最佳為約1μM。將作為Wnt訊息傳導路徑抑制物質之PORCN抑制劑與Rac抑制劑組合使用時，例如，使用屬於Rac抑制劑之1種的EHT1864時， 其濃度通常為約10nM至約50μM，較佳為約10nM至約30μM，又更佳為約100nM至約10μM，最佳為約1μM。
Wnt訊息傳導路徑抑制物質的添加時期，通常是從步驟(1)的多能性幹細胞之培養開始48小時以內，較佳為24小時以內，更佳為12小時以內，又更佳為與培養開始同時。
在步驟(1)之培養基中，較佳為進一步存在有TGFβ訊息傳導路徑抑制物質。在步驟(1)中所使用之TGFβ訊息傳導路徑抑制物質係可使用與步驟(a)所例示者相同者。步驟(a)及步驟(1)之TGFβ訊息傳導路徑抑制物質可相同亦可不同，較佳為相同。
培養基中的TGFβ訊息傳導路徑抑制物質的濃度，係能夠在可達成上述效果的範圍中適當地設定。使用SB431542作為TGFβ傳導路徑抑制物質時通常為以約1nM至約100μM，較佳為約10nM至約100μM，更佳為約100nM至約50μM，又更佳為約500nM至約10μM的濃度使用。再者，使用SB431542以外的TGFβ訊息傳導路徑抑制物質時，較佳為使用與上述濃度的SB431542顯示同等的TGFβ訊息傳導路徑抑制活性之濃度。
在步驟(1)及之後的步驟中，由抑制分化成中內胚層，使鼻腔上皮樣組織的製造效率提升的觀點而言，亦較佳為添加針對轉形生長因子-β-活化激酶1(Transforming growth factor-β-activated kinase 1，TAK1)的抑制物質。TAK1係將藉由TGFβ、骨形成蛋白質(BMP)、介白素1(IL-1)、TNF-α等所活化的訊息傳達進行媒介之絲裂原活化蛋白激酶激酶激酶(MAP Kinase Kinase Kinase，MAPKKK)家族的絲胺酸蘇胺酸蛋白質激酶(Kinase)。
TAK1抑制物質只要為可抑制TAK1所媒介的訊息傳導者則沒有特別限定。TAK1抑制物質可以為核酸、蛋白質、低分子有機化合物的任一種。該物質可列舉例如：抑制TAK1與基質的結合之物質、抑制TAK1的磷酸化之物質、促進TAK1的去磷酸化的物質、抑制TAK1的轉錄或轉譯的物質、促進TAK1的分解的物質等。
TAK1抑制物質可列舉例如：(5Z)-7-側氧基玉米赤黴醇(Oxozeaenol)((3S,5Z,8S,9S,11E)-3,4,9,10-四氫-8,9,16-三羥基-14-甲氧基-3-甲基-1H-2-苯并氧雜環十四烷(benzoxacyclotetradecin)-1,7(8H)-二酮)、N-Des(胺基羰基)AZ-TAK1抑制劑(3-胺基-5-[4-(4-嗎啉基甲基)苯基]-2-噻吩羧醯胺)、他鈮(Takinib)(N1-(1-丙基-1H-苯并咪唑-2-基)-1,3-苯二羧醯胺)、NG25(N-[4-[(4-乙基-1-哌
Figure 111124633-A0202-12-0078-12
基)甲基]-3-(三氟甲基)苯基]-4-甲基-3-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基氧基)-苯甲醯胺三鹽酸鹽)及該等之衍生物、類似物。該等物質係可單獨或組合複數種使用。
TAK1抑制物質較佳為(5Z)-7-Oxozeaenol。使用(5Z)-7-Oxozeaenol作為步驟(1)中的TAK1抑制物質時，通常為以約1nM至約100μM，較佳為約10nM至約50μM，更佳為約100nM至約25μM，又更佳為約500nM至約10μM的濃度使用。再者，使用(5Z)-7-Oxozeaenol以外的TAK1抑制物質時，較佳為使用與上述濃度的(5Z)-7-Oxozeaenol顯示同等的TAK1抑制活性之濃度。
從控制鼻腔上皮樣組織所含有之細胞的比率之觀點而言，上述TAK1抑制物質係可在步驟(1)及之後的步驟之任意階段進行添加。就一態樣而言，只要是企圖使所得之細胞集團中的構成嗅上皮之細胞的比率，較佳為與步驟(1)的開始同時進行TAK1抑制物質的添加。只要是企圖使所得之細胞集團中的 構成鼻腔上皮之細胞的比率增加，較佳為與步驟(3)的開始同時，或者是在步驟(3)開始的一定期間以內，例如，步驟(3)開始14天以內添加TAK1抑制物質。
在步驟(1)中所使用的培養基，係只要在如上述定義的項目所記載者的限制下，就沒有特別的限定。在步驟(1)中所使用的培養基係可為血清培養基或無血清培養基。從迴避混入化學性未確定的成分之觀點而言，在本發明中較佳為使用無血清培養基。在迴避調製的繁雜度時，較佳為使用市售的例如適量地添加有KSR等血清代替物之無血清培養基。添加於無血清培養基之KSR的量可列舉例如：人類ES細胞時，通常為約1%至約30%，較佳為約2%至約20%。無血清培養基可列舉例如：在IMDM與F-12之1：1的混合液中添加有5%KSR、450μM 1-單硫代甘油及1x化學性確定的脂質濃縮物(Chemically Defined Lipid Concentrate)之培養基、或在GMEM中添加有5%至20%KSR、NEAA、丙酮酸及2-巰基乙醇之培養基。
在步驟(1)的開始時，細胞可為接著狀態或懸浮狀態之任一者。就較佳一態樣而言，使多能性幹細胞分散成單一細胞後使其再凝集，而形成懸浮狀態的細胞凝集物。為此，較佳為在步驟(1)的開始前，進行將在步驟(a)所得到之多能性幹細胞分散成單一細胞之操作(亦稱為步驟(b))。藉由進行分散的操作而獲得之「經分散的細胞」較佳為單一細胞，惟例如可包含由2以上100以下的少數細胞所構成之細胞塊，亦可包含由2以上50以下的細胞所構成之細胞塊。所謂「經分散的細胞」可為例如包含單一細胞為7成以上及細胞塊為3成以下，較佳為包含單一細胞為8成以上及細胞塊為2成以下。就其他一態樣而言，使多能性幹細胞分散成單一細胞後，將其播種至細胞接著性的培養器材，以接著狀態實施培養。
使多能性幹細胞分散之方法可列舉：機械性分散處理、細胞分散液處理、細胞保護劑添加處理，也可將該等處理組合實施。使細胞分散之方法較佳為與細胞保護劑添加處理同時進行細胞分散液處理，接著進行機械性分散處理。
細胞保護劑添加處理所使用之細胞保護劑可列舉：FGF訊息傳導路徑作用物質、肝素(heparin)、Rho相關蛋白質激酶(Rho-associated protein kinase，ROCK)抑制物質、肌凝蛋白(myosin)抑制物質、多胺類、統合性壓力反應(Integrated stress response：ISR)抑制劑、胱天蛋白酶(caspase)抑制劑、血清、或血清代替物等。較佳的細胞保護劑可舉出ROCK抑制物質。為了抑制由分散所誘導之多能性幹細胞(尤其是，人類的多能性幹細胞)的細胞死亡，可將ROCK抑制物質從步驟(1)之培養開始時進行添加。ROCK抑制物質可列舉：Y-27632((R)-(+)-反式-4-(1-胺基乙基)-N-(4-吡啶基)環己烷羧醯胺，二鹽酸鹽)，法舒地爾(Fasudil)(HA1077)(1-(5-異喹啉基磺醯基)高哌
Figure 111124633-A0202-12-0080-13
，鹽酸鹽)、H-1152(5-[[(2S)-六氫-2-甲基-1H-1,4-二氮雜環庚三烯-1-基]磺醯基]-4-甲基-異喹啉，二鹽酸鹽)、HA-1100(羥基法舒地爾)([1-(1-羥基-5-異喹啉磺醯基)高哌
Figure 111124633-A0202-12-0080-14
，鹽酸鹽]、色烷(Chroman)1((3S)-N-[2-[2-(二甲基胺基)乙氧基]-4-(1H-吡唑-4-基)苯基]-6-甲氧基-3,4-二氫-2H-苯并吡喃-3-羧醯胺)、貝魯莫舒地爾(Belumosudil)(KD025，2-[3-[4-[(1H-吲唑-5-基)胺基]喹唑啉-2-基]苯氧基]-N-異丙基乙醯胺)、HSD1590([2-甲氧基-3-(4,5,10-三氮雜四環[7.7.0.02,6.012,16]十六-1(9),2(6),3,7,10,12(16)-六烯-11-基)苯基]硼酸)、CRT0066854((S)-3-苯基-N1-(2-吡啶-4-基-5,6,7,8-四氫苯并[4,5]噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基)丙烷-1,2-二胺)、RKI1447(1-(3-羥基苯甲基)-3-(4-(吡啶-4-基)噻唑-2-基)脲)、利帕舒地爾(Ripasudil)(4-氟-5-[[(2S)-六氫-2-甲基-1H-1,4-二氮雜環庚三烯-1-基]磺醯基]異 喹啉)、GSK269962A(N-[3-[2-(4-胺基-1,2,5-
Figure 111124633-A0202-12-0081-15
二唑-3-基)-1-乙基咪唑并[4,5-c]吡啶-6-基]氧基苯基]-4-(2-嗎啉-4-基乙氧基)苯甲醯胺)、GSK429286A(N-(6-氟-1H-吲唑-5-基)-2-甲基-6-側氧基-4-(4-(三氟甲基)苯基)-1,4,5,6-四氫吡啶-3-羧醯胺)、Y-33075((R)-4-(1-胺基乙基)-N-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基苯甲醯胺)、LX7101(N,N-二甲基胺甲酸3-[[[4-(胺基甲基)-1-(5-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-4-哌啶基]羰基]胺基]苯基酯)、AT13148((αS)-α-(胺基甲基)-α-(4-氯苯基)-4-(1H-吡唑-4-基)苯甲醇)、SAR407899(6-(哌啶-4-基氧基)異喹啉-1(2H)-酮鹽酸鹽)、GSK180736A(4-(4-氟苯基)-N-(1H-吲唑-5-基)-6-甲基-2-側氧基-1,2,3,4-四氫嘧啶-5-羧醯胺)、羥基法舒地爾(hydroxyfasudil)(1-(1-羥基-5-異喹啉磺醯基)高哌
Figure 111124633-A0202-12-0081-16
(homopiperazine)，HCl)、bdp5290(4-氯-1-(4-哌啶基)-N-[3-(2-吡啶基)-1H-吡唑-4-基]-1H-吡唑-3-羧醯胺)、sr-3677(N-[2-[2-(二甲基胺基)乙氧基]-4-(1H-吡唑-4-基)苯基-2,3-二氫-1,4-苯并二噁英-2-羧醯胺鹽酸鹽]、CCG-222740(N-(4-氯苯基)-5,5-二氟-1-(3-(呋喃-2-基)苯甲醯基)哌啶-3-羧醯胺)、ROCK抑制劑-2(N-[(1R)-1-(3-甲氧基苯基)乙基]-4-吡啶-4-基苯甲醯胺)、Rho-激酶(Kinase)-IN-1(N-[1-[(4-甲基硫基苯基)甲基]哌啶-3-基]-1H-吲唑-5-胺)、ZINC00881524(N-(4,5-二氫萘并[1,2-d]噻唑-2-基)-2-(3,4-二甲氧基苯基)乙醯胺)、SB772077B((3S)-1-[[2-(4-胺基-1,2,5-
Figure 111124633-A0202-12-0081-17
二唑-3-基)-1-乙基-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-7-基]羰基]-3-吡咯烷胺二鹽酸鹽)、維洛舒地爾(Verosudil)(N-(1,2-二氫-1-側氧基-6-異喹啉基)-α-(二甲基胺基)-3-噻吩乙醯胺)、GSK-25(4-(4-氯-2-氟苯基)-2-(2-氯吡啶-4-基)-1-(6-氟-1H-吲唑-5-基)-6-甲基-4H-嘧啶-5-羧醯胺)及該等之衍生物等。上述化合物等具有作為ROCK抑制劑之活性係例如記載於J Med Chem.2016 Mar 24；59(6)：2269-300.及Journal of Experimental Pharmacology 2021：13 197-212等，為所屬技術領域具有通常知識 者所周知。細胞保護劑亦可使用調製完成的細胞保護劑。調製完成的細胞保護劑可列舉例如：RevitaCell補充物(Thermo Fisher Scientific公司製)、CloneR、CloneR2(Stemcell Technologies公司製)。該等物質係可單獨或組合複數種使用。步驟(1)中，添加屬於ROCK抑制物質之Y-27632作為細胞保護劑時，通常以成為1nM至100mM，較佳為10nM至10mM，更佳為1μM至100μM的濃度之方式添加於培養環境中。步驟(1)中，添加屬於ROCK抑制物質之Chroman 1作為細胞保護劑，通常以成為10pM至1mM，較佳為100pM至100μM，更佳為1nM至10μM的濃度之方式添加於培養環境中。使用調製完成的細胞保護劑時，以製品中所附加的使用說明書中記載的濃度為中心，例如，可使用其100分之1至100倍的濃度，較佳為其10分之1至10倍的濃度，更佳為其3分之1至3倍的濃度。
細胞分散液處理所使用之細胞分散液可舉出：含有胰蛋白酶(Trypsin)、膠原蛋白酶、玻糖醛酸酶、彈性蛋白酶、鏈蛋白酶(Pronase)、DNase、木瓜酶等酵素及乙二胺四乙酸等螯合劑之至少1個之溶液。市售之細胞分散液，例如，亦可使用TripLE Select(Thermo Fisher Scientific公司製)、TripLE Express(Thermo Fisher Scientific公司製)或Accumax(Innovative Cell Technologies公司製)。步驟(b)中的較佳細胞分散液係添加有5mM的EDTA之磷酸緩衝液，但不限定於此。
機械性分散處理的方法可舉出移液(Pipetting)處理或以刮刀進行的刮削操作。經分散的細胞可懸浮於上述培養基中。
使多能性幹細胞分散之方法可舉出例如：將多能性幹細胞的群落(colony)在ROCK抑制物質之存在下，以乙二胺四乙酸或Accumax處理，進一步藉由移液使其分散之方法。
在步驟(1)中實施懸浮培養時，將經分散的多能性幹細胞之懸濁液播種於非細胞接著性的培養器材中。培養器材為非接著性時，細胞被懸浮培養，複數個多能性幹細胞集合而形成細胞凝集物。
進行懸浮培養時，藉由將經分散的多能性幹細胞播種於如10cm皿之比較大的培養器材中，而可在1個培養器材中同時地形成複數個細胞凝集物。由不容易產生每個細胞凝集物大小偏差的觀點而言，較佳為例如在非細胞接著性的如96孔微量盤之多孔盤(U底、V底)的各孔中，播種一定數量的經分散的多能性幹細胞。將此靜置培養時，藉由細胞迅速地凝集，而可於各孔中形成1個細胞凝集物。例如，藉由在培養器材的表面塗覆超親水性的聚合物等加工，而使培養器材成為非細胞接著性。非細胞接著性的多孔盤可列舉例如：PrimeSurface 96V底盤(MS-9096V，Sumitomo Bakelite股份有限公司製)等。為了更迅速地形成細胞凝集物亦可進行離心操作。藉由將在各孔形成之細胞凝集物從複數個孔回收，而可獲得均勻的細胞凝集物之集團。只要細胞凝集物為均勻，在之後的步驟中，可使各孔及各反復實驗的製造效率更穩定，可製造再現性更加的構成鼻腔上皮之細胞。
就用以從經分散的多能性幹細胞形成細胞凝集物的其他態樣而言，可使用一個孔被分割成複數個微孔，而形成2個以上細胞塊之培養器材。換言之，本實施形態的一側面中，將前述步驟(1)、及步驟(2)至(4)中任意的步驟之懸浮培養，在形成有至少1個孔之培養器材中實施，前述孔係分割成複數個微 孔，針對每一個前述微孔，以形成1個細胞塊之方式實施懸浮培養，可調製與每1個孔所分割之微孔數目相當的細胞塊。上述微孔可列舉：細胞沉降於底面一處而促進細胞凝集物的形成之形成複數個缽、向下的四角錐、凹狀等加工、網格(grid)、隆起等的培養器材；或以容易形成細胞凝集物之方式，僅對底面的一部分經實施可使細胞接著之加工的培養器材等。具有微孔之培養器材的每一孔之培養面積沒有特別限定，但由有效率地生產細胞塊之觀點而言，較佳為底面積大於1cm2(與48孔盤相當)，更佳為大於2cm2(與24孔盤相當)，又更佳為大於4cm2(與12孔盤相當)。如上述之培養器材可列舉例如：類胚體形成盤AggreWell(StemCell Technologies公司製)、PAMCELL(ANK公司製)、球狀體微量盤(Corning 公司製)、NanoCulture Plate/Dish(Organogenix公司製)、Cell-able(東洋合成公司製)、EZSPHERE(AGCTECHNO GLASS公司製)、SPHERICALPLATE 5D(水戶工業公司製)、TASCL(Cymss-Bio公司製)、Scientific reports、2022,12.1：1-11.所記載的微孔袋等，但不限定於此等。
培養器材亦較佳為使用可以各孔內直接置入有細胞凝集物之狀態，將盤全體之培養基一次交換的三維細胞培養容器。如此之三維細胞培養容器可列舉例如：PrimeSurface 96 slite-well plate(Sumitomo Bakelite股份有限公司製)等。此盤中係在96孔的各個上部設置有可使培養基進出的細開口部(狹縫(slite))。狹縫係設定為細胞凝集物不容易通過的寬度，因此可一邊防止細胞凝集物彼此的黏附，一邊進行盤全體之培養基一次交換，可提升操作的效率性及細胞凝集物的品質。
步驟(1)中的多能性幹細胞的濃度(密度)，係能夠以使細胞凝集物更均勻，有效率地形成之方式而適當地設定。例如，使用96孔微孔盤將人類多 能性幹細胞(例如，從步驟(a)所得到之人類iPS細胞)懸浮培養時，以使每1孔通常成為約1×103至約1×105細胞，較佳為約3×103至約5×104細胞，更佳為約4×103至約2×104細胞，又更佳為約4×103至約1.6×104細胞，特佳為約8×103至約1.2×104細胞之方式，將調製好的液添加於各孔中，並將盤靜置，或進行離心使細胞凝集物形成。例如，使用屬於每1皿具有約260個微孔的培養器材之EZSPHERE SP皿35mm Type905將人類多能性幹細胞(例如，從步驟(a)所得到之人類iPS細胞)懸浮培養時，以使每1皿通常成為約1×104至約1×108細胞，較佳為約3×104至約5×107細胞，更佳為約4×104至約2×107細胞，又更佳為約4×104至約1.6×107細胞，特佳為約8×104至約1.2×107細胞之方式，將調製好的液添加於皿中，並將皿靜置而形成細胞凝集物。例如，使用屬於每1孔具有約1800個微孔的培養器材之AggreWell 800，6孔盤將人類多能性幹細胞(例如，從步驟(a)所得到之人類iPS細胞)懸浮培養時，以使每1孔通常成為約1×104至約1×108細胞，較佳為約3×104至約5×107細胞，更佳為約4×104至約2×107細胞，又更佳為約4×104至約1.6×107細胞，特佳為約8×104至約1.2×107細胞之方式，將調製好的液添加於各孔中，將盤離心使細胞凝集物形成。進行播種之細胞數，係可藉由例如利用血球計算盤等進行計數而求得。
為了使細胞凝集物形成所必須的懸浮培養的時間，係可根據所使用之多能性幹細胞而適當地決定，為了形成均勻的細胞凝集物較佳為盡可能短短的時間。經分散的細胞直至形成細胞凝集物為止的步驟，係分成細胞進行集合步驟、及集合後的細胞形成凝集物之步驟。從將經分散的細胞播種的時間點(亦即，懸浮培養開始時)至細胞進行集合為止，例如，在人類多能性幹細胞(人類iPS細胞等)之情形，較佳為約24小時以內，更佳為約12小時以內。從將經分散的 細胞播種的時間點(亦即，懸浮培養開始時)至形成細胞凝集物為止，例如，在人類多能性幹細胞(人類iPS細胞等)之情形，較佳為約72小時以內，更佳為約48小時以內。形成細胞凝集物為止的時間，係可藉由使細胞凝集的用具、或調整離心條件等而適當地調節。
使多能性幹細胞迅速地集合而形成細胞凝集物時，從所形成之凝集物被分化誘導之細胞，係可高再現性地形成上皮樣結構。形成細胞凝集物之實驗性操作可列舉例如：使用孔較小的盤(例如，孔的底面積以平底換算為0.1至2.0cm2左右的盤)或微細孔等而將細胞限制於較小的空間之方法、藉由使用小的離心試管進行短時間離心而使細胞凝集之方法。孔較小的盤可列舉例如：24孔盤(面積以平底換算為1.88cm2左右)、48孔盤(面積以平底換算為1.0cm2左右)、96孔盤(面積以平底換算為0.35cm2左右，內徑為6至8mm左右)、384孔盤。較佳可舉出96孔盤。就從孔上方觀看見時的底面形狀而言，孔較小的盤之形狀可列舉：多角形、長方形、橢圓、真圓，較佳可舉出真圓。就從孔側面觀看時的底面形狀而言，孔較小的盤之形狀較佳為外周部較高且內部較低的凹陷結構，可列舉例如：U底、V底、M底，較佳可舉出U底或V底，最佳為V底。孔較小的盤也可使用細胞培養皿(例如，60mm至150mm皿，培養瓶)的底面具有凹凸或凹坑者。孔較小的盤的底面較佳是使用細胞非接著性的底面，較佳為經細胞非接著性塗覆的底面。就其他態樣而言，例如，形成紐狀的細胞凝集物時，例如，可在剖面為V字狀、U字狀等之具有細長道的培養器材中播種細胞，使細胞凝集物形成。
使細胞凝集物形成的其他手法亦較佳為使用立體印刷機、3D印表機。經分散的單一細胞或由複數個細胞構成的球狀體，懸濁於具有生體適合性之 墨水(生物墨水)，以生物3D印表機(Bio 3D printer)(例如，Cellink公司製BIO X等)輸出，或將細胞塊刺入針中並將其堆疊(Cyfusebio公司製Spike等)之手法，藉此可調製具有期望形態的細胞凝集物。
細胞凝集物已形成係可根據下列進行判斷：細胞凝集物的大小及細胞數、宏觀形態、以組織染色解析進行的微觀形態及其均勻性、分化及未分化標記的表現及其均勻性、分化標記的表現控制及其同期性、分化效率的凝集物間之再現性等。
在步驟(1)的開始時，就其他較佳一態樣而言，係實施接著培養。可將步驟(a)後的培養器材上的多能性幹細胞直接使用於步驟(1)，亦可將多能性幹細胞分散成單一細胞後再度播種於接著性的培養器材。實施多能性幹細胞分散成單一細胞後的再播種時，可將適切的細胞外基質或合成細胞接著分子作為支架使用。藉由支架，可在表面經塗覆的培養器材中將多能性幹細胞進行接著培養。細胞外基質較佳為基質膠或層連結蛋白。合成細胞接著分子可舉出：含有聚-D-離胺酸、RGD序列等細胞接著性的結構域(domain)之合成胜肽等。步驟(1)中的多能性幹細胞的濃度(密度)，係可以使培養器材上形成的組織更均勻，有效率地形成之方式適當地設定。例如，使用96孔平底微孔盤將人類多能性幹細胞(例如，從步驟(a)所得到之人類ES細胞或iPS細胞)接著培養時，以使每1孔通常成為約1×102至約1×105細胞，較佳為約2×102至約5×104細胞，更佳為約5×102至約2×104細胞之方式，將調製好的液添加於各孔中，將盤靜置而使細胞接著，再實施之後之培養操作。在本實施形態的一側面中，只要細胞的播種數以產生分化成鼻腔上皮為限，則沒有特別的限定，從再現細胞間的接著及相互作用之觀點而 言，也可為對培養器材的播種後72小時以內，細胞密度係達到如相當於器材之培養空間的6成以上之次匯合(Subconfluent)的密度。
接著性的培養器材亦較佳為使用經施以微樣式的培養器材。培養器材上的微樣式，係較佳為可由細胞接著性區域及細胞非接著性區域構成，並在細胞接著性區域使細胞進行接著培養。細胞接著性區域及細胞非接著性區域的形狀，只要以可於培養器材上展開可能為限則沒有特別限定。細胞接著性區域與細胞非接著性區域，係可於一個培養器材上形成單一區域，也可形成複數個。以提升接著性的目的而言，細胞接著性區域較佳為經人工處理。經施以微樣式的培養器材可列舉例如：CYTOOchip(CYTOO公司製)，ibidi Micropatterning(ibidi公司製)等。亦可使用PDMS製模具與基質等而調製培養器材。將步驟(a)所得到之多能性幹細胞於經施以微樣式的培養器材上進行培養時，係可例如參照已經報導的方法而進行實施(Nature protocols,11(11),2223-2232.)。對經施以微樣式的培養器材的細胞播種數以產生分化成鼻腔上皮為限，則沒有特別的限定，從再現細胞間的接著與相互作用之觀點而言，亦較佳為對培養器材的播種後72小時以內，細胞密度係達到如相當於器材之微樣式上之培養空間的6成以上之次匯合的密度
培養器材亦較佳為具有用以進行培養基的灌流之流路(微流路)，在步驟(1)及其之後的步驟中，亦可在灌流環境下培養細胞。亦將如此之培養器材稱為微流體晶片(Microfluidic chip)。培養器材(例如，微流體晶片)，也可與其他培養器材(例如，微流體晶片)藉由連結部而接續，該其他培養器材係培養在本發明之製造方法中所培養之細胞以外的細胞或組織。連結部係例如可成為流路。藉此，可再現構成鼻腔上皮之細胞或其前驅細胞及包含該等之細胞集團、以及與 其他細胞或組織之相互作用。與構成鼻腔上皮之細胞或其前驅細胞及包含該等之細胞集團一起培養之其他細胞或組織可列舉例如：氣管、支氣管、肺、肝臟、腦及中樞神經系、血管、肝臟、腎臟、咽喉、口腔上皮、胃、小腸、大腸的細胞及組織等，但不限定於該等。
培養器材係可具有可滲透氧或培養基之膜。培養器材亦可形成化合物、增殖因子等的濃度梯度。膜係例如多孔質膜。在具有如此之膜的培養器材中，係可在以膜隔開的一邊藉由本發明之製造方法培養細胞，在另一邊培養此以外的細胞或組織、餵養細胞等。藉此，可以不會污染構成鼻腔上皮之細胞或其前驅細胞及包含該等之細胞集團、及其他細胞或組織之方式進行培養。
在步驟(1)及之後的步驟中，進行培養基交換操作時，例如可列舉：不捨棄原本的某培養基且添加新培養基的操作(培養基添加操作)、將原本的某培養基捨棄半量左右(原本的某培養基的體積量之30至90%左右，例如，40至60%左右)並添加半量左右(原本的某培養基的體積量之30至90%，例如，40至60%左右)的新培養基的操作(半量培養基交換操作)、將原本的某培養基捨棄全量左右(原本的某培養基的體積量之90%以上)並添加全量左右(原本的某培養基的體積量之90%以上)的新培養基(全量培養基交換操作)。
在某一時間點，添加特定成分時，例如，在計算最終濃度後，也可將原本的某培養基捨棄半量左右，將含有特定成分的濃度高於最終濃度的新培養基添加半量左右之操作(半量培養基交換操作)。在某一時間點，將原本的培養基所含有之成分稀釋使濃度降低時，例如，也可在1日內複數次，較佳為1小時以內複數次(例如，2至3次)進行培養基交換操作。再者，在某一時間點，將原本的培養基所含有之成分稀釋使濃度降低時，也可將細胞或細胞凝集物移至 其他培養容器中。培養基交換操作所使用道具沒有特別的限定，例如可列舉：移液器(Pipetter)、Pipetman(註冊商標)、多通道移液吸管(Multi-channel pipette)、連續分注器等。例如，使用96孔盤作為培養器材時，也可使用多通道移液吸管。
步驟(1)中的培養的時間通常為8小時至6天左右，較佳為12小時至48小時左右。
從細胞分化的方向性控制、以及促進細胞或組織的生存及增殖之觀點而言，也可將步驟(1)至(3)中任一者的1個以上步驟，在Wnt訊息傳導路徑作用物質之存在下進行。如前述，Wnt訊息傳導路徑可舉出典型Wnt路徑，非典型Wnt路徑等。
Wnt訊息傳導路徑作用物質只要是可藉由Wnt家族蛋白質所引發的訊息傳導活化者則沒有限定。Wnt訊息傳導路徑作用物質可以為核酸、蛋白質、低分子有機化合物的任一種。該物質可舉例如：促進Wnt的自己分泌的物質、使Wnt穩定化並抑制分解的物質、Wnt的重組蛋白質、Wnt的部分序列胜肽以及其衍生物或誘導物、作用於Wnt受體使其活化的物質、使Wnt的細胞內訊息傳導機構活化的物質、Wnt的細胞內訊息傳導因子以及其變異體(β-鏈蛋白(Catenin)S33Y等)、使Wnt應答序列下游的基因表現活化的物質等。作為Wnt訊息傳導路徑作用物質所熟知的蛋白質可舉例如：Wnt、R-海綿蛋白(Spongin)等。
使用Wnt的重組蛋白質作為Wnt訊息傳導路徑作用物質時，其來源沒有特別的限定，只要是在對對象細胞具有活性的限制下，可使用源自各種生物的Wnt蛋白質。其中，較佳為源自哺乳動物之Wnt蛋白質。哺乳動物可列舉例如：人類、小鼠、大鼠、牛、豬、兔子等。更佳為源自與本發明之細胞集團的製造中所使用的多能性幹細胞同種之重組蛋白質。哺乳動物之Wnt蛋白質可列 舉例如：Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt9a、Wnt9b、Wnt10a、Wnt10b、Wnt11、Wnt16等，但不限定於此。本發明之細胞集團的製造中，Wnt蛋白質也可組合複數種。本發明之細胞集團的製造中可使用的Wnt之重組蛋白質，係例可字R & D Systems公司、富士膜和光純藥公司入手。
本發明之細胞集團的製造中，從使Wnt之重組蛋白質在培養基中穩定、維持活性之觀點而言，亦較佳為添加Afamin。Afamin已知為屬於白蛋白家族的糖蛋白質，抑制疏水性高的Wnt之蛋白質的凝集及不活化，並維持活性。Afamin之重組蛋白質係可例如自R & D Systems公司入手。Afamin與Wnt之重組蛋白質之混合物係可自MBL Life Science公司入手。
可作為Wnt訊息傳導路徑作用物質使用之R-海綿蛋白(Spongin)係可舉出包含R-海綿蛋白1、R-海綿蛋白2、R-海綿蛋白3及R-海綿蛋白4之屬於R-海綿蛋白家族的蛋白質。R-海綿蛋白家族已知為分泌蛋白質，與Wnt訊息傳導路徑之活化及控制相關。本發明之細胞集團的製造中，可將複數種R-海綿蛋白組合使用。可使用於本發明之細胞集團的製造中的R-海綿蛋白之重組蛋白質，係例如可自R & D Systems公司、富士膜和光純藥公司入手。
Wnt訊息傳導路徑作用物質亦可使用所屬技術領域具有通常知識者所周知的化合物。具有作為Wnt訊息傳導路徑作用物質之活性的化合物可列舉例如：對GSK3β具有抑制活性之化合物、對Wnt脫醯化酵素具有抑制活性之化合物、對AAK1具有抑制活性之化合物等。具有如上述之活性的化合物可列舉例如：氯化鋰、SGCAAK1 1(N-(6-(3-((N,N-二乙基胺磺醯基)胺基)苯基)-1H-吲唑-3-基)環丙烷羧醯胺)、Foxy 5(N-甲醯基-L-甲硫胺醯基-L-α-天冬胺醯基-甘胺 醯基-L-半胱胺醯基-L-α-麩胺醯基-L-白胺酸)、CHIR99021(6-[2-[4-(2,4-二氯苯基)-5-(4-甲基-1H-咪唑-2-基)嘧啶-2-基胺基]乙基腔基]吡啶-3-甲腈)、CHIR98014(N6-[2-[[4-(2,4-二氯苯基)-5-(1H-咪唑-2-基)-2-嘧啶基]胺基]乙基]-3-硝基-2,6-吡啶二胺)、TWS119(3-[6-(3-胺基-苯基)-7H-吡咯并[2,3-D]嘧啶-4-基氧基]-酚)、SB216763(3-(2,4-二氯苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-2,5-二氫-1H-吡咯-2,5-二酮)、SB415286(3-[(3-氯-4-羥基苯基)胺基]-4-(2-硝基苯基)-1H-吡咯-2,5-二酮)、BIO((2Z,3E)-6-溴靛玉紅-3-肟)、AZD2858(3-胺基-6-[4-[(4-甲基-1-哌
Figure 111124633-A0202-12-0092-18
基)磺醯基]苯基]-N-3-吡啶基-吡
Figure 111124633-A0202-12-0092-19
羧醯胺)、AZD1080(2-羥基-3-(5-(N-嗎啉基甲基)吡啶-2-基)-1H-吲哚-5-甲腈)、AR-A014418(N-(4-甲氧基苯甲基)-n-(5-硝基-1,3-噻唑-2-基)脲)、TDZD-8(4-苯甲基-2-甲基-1,2,4-噻二唑烷-3,5-二酮)、LY2090314(7-(2,5-二氫-4-咪唑并[1,2-a]吡啶-3-基-2,5-二側氧基-1H-吡咯-3-基)-9-氟-1,2,3,4-四氫-2-(1-哌啶基羰基)吡咯并[3,2,1-jk][1,4]苯二氮呯)、IM-12(3-(4-氟苯乙基胺基)-1-甲基-4-(2-甲基-1H-吲哚-3-基)-1H-吡咯-2,5-二酮)、靛玉紅(Indirubin)([2,3-二吲哚啉亞基]-2,3-二酮)、必金寧(Bikinin)(4-((5-溴-2-吡啶基)胺基)-4-丁酮酸)、A-1070722(1-(7-甲氧基喹啉-4-基)-3-[6-(三氟甲基)吡啶-2-基]脲)、3F8(5-乙基-7,8-二甲氧基-1H-吡咯并[3,4-c]異喹啉-1,3(2H)-二酮)、肯帕羅酮(Kenpaullone)(9-溴-7,12-二氫-吲哚并[3,2-d][1]苯氮呯-6(5H)-酮)、10Z-己炔二醇(Hymenialdisine)((4Z)-4-(2-胺基-1,5-二氫-5-側氧基-4H-咪唑-4-亞基)-2-溴-4,5,6,7-四氫-吡咯并[2,3-c]氮呯-8(1H)-酮)、靛玉紅-3’-肟(3-[1,3-二氫-3-(羥基亞胺基)-2H-吲哚-2-亞基]-1,3-二氫-2H-吲哚-2-酮)、NSC 693868(1H-吡唑并[3,4-b]喹
Figure 111124633-A0202-12-0092-20
啉-3-胺)、TC-G 24(N-(3-氯-4-甲基苯基)-5-(4-硝基苯基)-1,3,4-
Figure 111124633-A0202-12-0092-21
二唑-2-胺)、TCS 2002(2-甲基-5-[3-[4-(甲基亞磺醯基)苯基]-5-苯并呋喃基]-1,3,4-
Figure 111124633-A0202-12-0092-22
二唑)、TCS 21311(3-[5-[4-(2-羥基-2-甲基-1-側氧基 丙基)-1-哌
Figure 111124633-A0202-12-0093-23
基]-2-(三氟甲基)苯基]-4-(1H-吲哚-3-基)-1H-吡咯-2,5-二酮)、CP21R7(3-(3-胺基苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)吡咯-2,5-二酮)、BML-284(AMBMP鹽酸鹽，N4-(1,3-苯并二氧雜環戊-5-基甲基)-6-(3-甲氧基苯基)-2,4-嘧啶二胺鹽酸鹽)、SKL2001(N-(3-(1H-咪唑-1-基)丙基)-5-(呋喃-2-基)異
Figure 111124633-A0202-12-0093-24
唑-3-羧醯胺)、WAY-262611(1-[4-(2-萘基)-2-嘧啶基]-4-哌啶甲胺)、IIIC3a(9-羧基-3-(二甲基亞胺基(iminio))-6,7-二羥基-10-甲基-3H-啡
Figure 111124633-A0202-12-0093-25
-10-鎓碘化物)、香草酸甲酯(Methyl Vanillate)、IQ-1(2-[(4-乙醯基苯基)偶氮基]-2-(3,4-二氫-3,3-二甲基-1(2H)-異喹啉亞基)乙醯胺)及該等之衍生物等。
步驟(1)中，添加Wnt訊息傳導路徑抑制物質，惟，藉由併用作用點不同的Wnt訊息傳導路徑作用物質及Wnt訊息傳導路徑抑制物質，而僅活化或抑制前述複數種Wnt訊息傳導路徑中之特定路徑。Wnt訊息傳導路徑作用物質，較佳為作用於步驟(1)所添加之Wnt訊息傳導路徑抑制物質的下游因子之物質。進行添加之Wnt訊息傳導路徑作用物質亦較佳為使典型Wnt路徑活化的物質，更佳為藉由屬於細胞內之Wnt訊息傳達因子的β鏈蛋白之分解的抑制、穩定化作用，而使Wnt訊息傳導路徑活化之物質。具有β鏈蛋白之分解的抑制、穩定化作用之物質可列舉例如：GSK3抑制劑及BML-284、SKL2001等。進行添加Wnt訊息傳導路徑作用物質亦較佳為促進或活化β鏈蛋白應答性轉錄(β-catenin responsive transcription：CRT)之物質。
GSK3抑制劑可列舉：CHIR99021、CHIR98014、TWS119、SB216763、SB415286、BIO、AZD2858、AZD1080、AR-A014418、TDZD-8、LY2090314、IM-12、靛玉紅(Indirnbin)、必金寧(Bikinin)、A 1070722,3F8、肯 帕羅酮(Kenpaullone)、10Z-己炔二醇(Hymenialdisine)、靛玉紅-3’-肟、NSC 693868、TC-G 24、TCS 2002、TCS 21311、CP21R7及該等之衍生物等。
較佳的Wnt訊息傳導路徑作用物質與Wnt訊息傳導路徑抑制物質之組合可舉出GSK3抑制劑與PORCN抑制劑。GSK3抑制劑與PORCN抑制劑併用時，典型Wnt路徑被活化，而非典型Wnt路徑被抑制。GSK3抑制劑與PORCN抑制劑併用時，GSK3抑制劑較佳為包含選自由CHIR99021、CHIR98014、SB216763、SB415286、BIO所組成群組中之至少1個，又更佳為包含CHIR99021。GSK3抑制劑與PORCN抑制劑併用時，PORCN抑制劑較佳為包含選自由IWP-2、IWP-3、IWP-4、IWP-L6、IWP-12、LGK-974、ETC-159、GNF-6231、Wnt-C59所組成群組中之至少1個，又更佳為包含IWP-2。再者，亦可將GSK3抑制劑及KY02111或其衍生物等組合使用。具有與GSK3抑制劑作用機制不同之β鏈蛋白之分解的抑制、穩定化作用之物質可列舉例如：BML-284、SKL2001，此等化合物或其衍生物亦可與PORCN抑制劑、KY02111或其衍生物等組合使用。更佳的Wnt訊息傳導路徑作用物質與Wnt訊息傳導路徑抑制物質之組合可舉出：GSK3抑制劑與PORCN抑制劑及JNK抑制劑。將GSK3抑制劑與PORCN抑制劑及JNK抑制劑併用時，JNK抑制劑較佳為包含JNK-IN-8。
培養基中的Wnt訊息傳導路徑作用物質之濃度能夠在可達成上述的效果的範圍中適當地設定。由細胞塊內部的神經系細胞或組織的生存以及增殖的促進的觀點而言，使用CHIR99021作為Wnt訊息傳導路徑作用物質時，通常以約10pM至約10mM，較佳為約100pM至約1mM，再佳為約1nM至約100μM，更佳為約10nM至約30μM，最佳為約100nM至約3μM的濃度使 用。再者，使用CHIR99021以外的Wnt訊息傳導路徑作用物質時，較佳為使用與上述濃度的CHIR99021顯示出同等之Wnt訊息傳導路徑促進活性的濃度。Wnt訊息傳導路徑促進活性係可藉由例如使用了HEK293細胞之Topflash報告基因檢測(Reporter assay)而決定。
步驟(1)及之後的步驟中，從提升參與構成鼻腔上皮之細胞的誘導之嗅上皮樣組織的製造效率的觀點而言，亦較佳為添加促進向基板區域分化之化合物。具有如上述般作用之化合物可列舉例如：美國專利申請公開第2016/0326491號說明書所記載之BRL-54443、啡啉(Phenanthroline)、小白菊內酯(Parthenolide)等。作為促進向基板區域分化之化合物使用BRL-54443時，通常以10nM至100μM，的濃度使用，使用啡啉(Phenanthroline)時通常以10nM至100μM的濃度使用，使用小白菊內酯(Parthenolide)時通常以10nM至100μM的濃度使用。
本發明之製造方法所使用的多能性幹細胞的調製、及步驟(1)及之後的步驟中，以排除作業者間的手藝差異造成的影響、防止源自作業者的異物等之混入、使製造品質穩定、增大生產量的觀點而言，亦較佳為使用自動培養裝置、自動培養機器人、實驗室自動化機器。可在本發明的實施所使用之上述機器可列舉例如：自動培養裝置(Panasonic公司製、川崎重工業公司製、日立製作所公司製、iACE2(ACC-200))、SLAS TECHNOLOGY：Translating Life Sciences Innovation，2020，2472630320972109.所記載之機器人(Robotic Biology Institute股份有限公司製，LabDroid)等，但不限定於此。在使用上述機器實施本發明時，只要是所屬技術領域具有通常知識者，可將本發明所記載之製造方法及步驟，可依據使用的機器進行調節或變更。
本發明之製造方法所使用之多能性幹細胞、及步驟(1)及之後的步驟中，從管理製造品質使其穩定的觀點而言，亦較佳為實施製造物的中間評估。上述中間評估可為消費製造中之細胞塊的一部分所實施之抽樣檢查、及非侵襲性檢查之任一者，較佳為非侵襲的檢查。非侵襲性檢查可列舉例如：以顯微鏡進行之光學觀察、以光學干涉斷層掃描儀(Optical Coherence Tomography：OCT)進行之測定、培養基交換時所回收之培養基中含有的代謝物、核酸、分泌蛋白質的定量等手法。以顯微鏡進行之光學觀察之一態樣亦可舉出例如：使用國際公開第2017/090741號所記載之方法等，將形成在細胞塊的表面之上皮結構、鼻腔上皮、嗅上皮等進行光學性觀察及檢出，進行數值化而評估。上述光學觀察的評估基準，係例如可藉由所屬技術領域具有通常知識者進行之目視判斷、或將拍攝的影像以機械學習進行的模型構築等的手法而適當地設定。評估基準可使用例如：細胞塊表面批覆於上皮之面積的比率、表面的上皮厚度、表面的上皮比率、細胞塊周圍的死細胞、碎片的量等。使用光學干涉斷層掃描儀的評估手法係可例如藉由使用Cell3iMager Estier(SCREEN控股公司製)取得斷層影像、3D影像等，定量細胞塊的斷層面積、體積、真球度、表面粗度、內部空洞體積、表面的上皮厚度等而實施。使用回收的培養基之解析係可例如實施胞泌體(Exosome)解析、代謝體(Metabolomics)解析等。
<步驟(2)>
步驟(2)係於BMP訊息傳導路徑作用物質之存在下，培養在步驟(1)培養後之細胞。在步驟(1)將細胞懸浮培養時，隨後在步驟(2)亦將所形成之細胞凝集物懸浮培養即可。在步驟(1)將細胞接著培養時，隨後在步驟(2)亦將細胞接著培養 即可。在步驟(1)將細胞懸浮培養後，亦可在步驟(2)進行接著培養。在步驟(1)將細胞接著培養後，亦可在步驟(2)進行懸浮培養。
所謂BMP訊息傳導路徑作用物質係可增強藉由BMP媒介的訊息傳導路徑的物質。BMP訊息傳導路徑作用物質可舉例如：BMP2、BMP4及BMP7等BMP蛋白質；GDF7等GDF蛋白質、抗BMP受體抗體、及BMP部分胜肽(peptide)等。該等物質係可單獨或組合複數種使用。從生物學的活性的見解而言，BMP訊息傳導路徑作用物質的定義可舉例：具有針對小鼠前驅軟骨細胞株ATDC5、源自小鼠頭蓋冠之細胞株MC3T3-E1、及源自小鼠橫紋肌之細胞株C2C12等細胞使該等分化為造骨細胞樣細胞的分化誘導能力、以及鹼性磷酸酶產生誘導能力的物質。具有上述活性的物質可舉例如：BMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、BMP-9、BMP-10、BMP-13/GDF-6、BMP-14/GDF-5、GDF-7等。
BMP2蛋白質以及BMP4蛋白質能夠自例如R & D Systems入手；BMP7蛋白質能夠自例如Biolegend公司入手；GDF7蛋白質能夠自例如富士膜和光純藥股份有限公司入手。BMP訊息傳導路徑作用物質較佳為含有選自由BMP2、BMP4、BMP7、BMP13以及GDF7所組成的群組中之至少一個蛋白質，更佳為含有BMP4。
培養基中之BMP訊息傳導路徑作用物質之濃度，係能夠在可達成上述的效果的範圍中適當地設定。由提升構成鼻腔上皮之細胞的製造效率的觀點而言，使用BMP4作為BMP訊息傳導路徑作用物質時，通常以約1pM至約100nM，較佳為約10pM至約50nM，再佳為約25pM至約25nM，更佳為約25pM至約5nM，特佳為約100pM至約5nM，最佳為約500pM至約2nM的濃度 使用。再者，使用BMP4以外之BMP訊息傳導路徑作用物質時，較佳為使用與上述濃度的BMP4顯示出同等之BMP訊息傳導路徑促進活性的濃度。只要為所屬技術領域具有通常知識者，使用例如市售的重組BMP蛋白質等作為BMP訊息傳導路徑作用物質時，可藉由將製品附加文書所記載之活性，例如，藉由將鹼性磷酸酶產生誘導能力對於小鼠前驅軟骨細胞株ATDC5之ED50等的值與上述的BMP4的濃度進行活性比較，而能夠容易地決定添加的BMP訊息傳導路徑作用物質濃度。
BMP訊息傳導路徑作用物質也可使用所屬技術領域具有通常知識者所周知之化合物。BMP訊息傳導路徑作用物質可列舉例如：Smurf1抑制物質、Chk1抑制物質等。具有如上述般活性之化合物可列舉例如：A-01([4-[[4-氯-3-(三氟甲基)苯基]磺醯基]-1-哌
Figure 111124633-A0202-12-0098-26
基][4-(5-甲基-1H-吡唑-1-基)苯基]甲酮(methanone))、PD 407824(9-羥基-4-苯基-吡咯并[3,4-c]咔唑-1,3(2H,6H)-二酮)及該等之衍生物等。
於步驟(2)中使用的培養基，只要含有BMP訊息傳導路徑作用物質，則沒有特別限定。於步驟(2)使用的培養基可舉出在步驟(1)所列舉之培養基。
從提升構成鼻腔上皮之細胞的製造效率的觀點而言，步驟(2)的開始時期，係從步驟(1)的培養開始較佳為0.5小時以後6天以內，更佳為0.5小時以後72小時以內，又更佳為18小時以後60小時以內，也可為24小時以後60小時以內。實施懸浮培養的情形，在Wnt訊息路徑抑制物質存在下，於上述期間開始步驟(2)時，在細胞凝集物的表面形成非神經上皮樣的組織，極有效率地構成鼻腔上皮之細胞或其前驅細胞。
在步驟(1)中進行懸浮培養時，就提升構成鼻腔上皮之細胞的製造效率的觀點而言，步驟(2)的開始時期，較佳為步驟(1)中所形成之細胞凝集物的表層中1成以上10成以下，更佳為3成以上10成以下，又更佳為5成以上10成以下的細胞彼此形成密著結合之時期。細胞凝集物中是否形成密著結合，係可例如藉由使用了抗ZO-1抗體之免疫染色等手法進行判別。
步驟(2)中之於BMP訊息傳導路徑作用物質之存在下的培養開始，可以使用進行過步驟(1)的培養容器，進行上述的培養基交換操作(例如：培養基添加操作、半量培養基交換操作、全量培養基交換操作等)，也可以將細胞移至其他培養容器。
步驟(2)中之含有BMP訊息傳導路徑作用物質的培養基之懸浮培養的期間係能夠適當地設定。步驟(2)中的培養的時間通常為8小時至6天左右，較佳為10小時至108小時左右，更佳為12小時至96小時左右，又更佳為18小時至72小時左右，最佳為24小時至60小時程度。本實施形態之一側面中，步驟(2)中的培養時間通常為8小時至6天左右，較佳為10小時至96小時左右，更佳為12小時至72小時左右，又更佳為14小時至48小時左右，最佳為16小時至36小時左右。
於步驟(2)中，亦較佳為繼續地添加步驟(a)或步驟(1)中使用過的添加物，例如：Wnt訊息傳導路徑抑制物質、Wnt訊息傳導路徑作用物質、TGFβ訊息傳導路徑抑制物質、TAK1抑制物質等。步驟(2)中添加的Wnt訊息傳導路徑抑制物質、Wnt訊息傳導路徑作用物質或TGFβ訊息傳導路徑抑制物質係也可與其之前的步驟中所使用的物質相異，但較佳為相同。關於添加物的濃度以 及種類係能夠適當地調整。該等物質的添加時期，可以與步驟(2)的開始同時也可以不同時。
<步驟(3)>
步驟(3)係在選自由FGF訊息傳導路徑作用物質及BMP訊息傳導路徑抑制物質所組成群組中之至少1個之存在下，培養在步驟(2)培養後之細胞。在步驟(2)將細胞懸浮培養時，隨後在步驟(3)亦將細胞凝集物懸浮培養即可。在步驟(2)將細胞接著培養時，隨後在步驟(3)亦將細胞接著培養即可。在步驟(2)將細胞懸浮培養後，亦可在步驟(3)進行接著培養。在步驟(2)將細胞接著培養後，亦可在步驟(3)進行懸浮培養。
步驟(3)中，在培養基中添加FGF訊息傳導路徑作用物質及BMP訊息傳導路徑抑制物質之至少一者。在本實施形態的一側面中，亦可將FGF訊息傳導路徑作用物質與BMP訊息傳導路徑抑制物質兩者皆添加而將細胞進行培養。
所謂FGF訊息傳導路徑作用物質，只要在可增強藉由FGF(纖維母細胞增殖因子)媒介的訊息傳導路徑增強的物質的限制下，則沒有特別的限定。FGF訊息傳導路徑作用物質可舉例如：FGF1、FGF2(有稱為bFGF之情形)、FGF3、FGF7、FGF8及FGF10等FGF蛋白質；抗FGF受體抗體、以及FGF部分胜肽等。此等的物質可以單獨，亦可將複數種組合使用。
FGF2蛋白質以及FGF8蛋白質能夠自例如富士膜和光純藥股份有限公司入手。FGF訊息傳導路徑作用物質較佳為含有選自由FGF2、FGF3、FGF8及FGF10、以及此等的變異體所組成的群組中之至少一個，再佳為含有FGF2，更佳為含有重組人類FGF2。
培養基中的FGF訊息傳導路徑作用物質之濃度係能夠在可達成上述的效果的範圍中適當地設定。從分化成構成鼻腔上皮之細胞、以及促進細胞的生存及增殖的觀點言，使用FGF2作為FGF訊息傳導路徑作用物質時，通常為以約1pg/ml至約100μg/ml，較佳為約10pg/ml至約50μg/ml，再佳為約100pg/ml至約10μg/ml，更佳為約500pg/ml至約1μg/ml，最佳為約1ng/ml至約200ng/ml的濃度使用。再者，使用FGF2以外的FGF訊息傳導路徑作用物質時，較佳為使用與前述濃度的FGF2顯示出同等之FGF訊息傳導路徑抑制活性的濃度。關於添加之物質的FGF訊息傳導路徑促進活性，係例如可藉由使用3T3細胞之細胞增殖試驗等手法進行測定。
由保持培養基中的FGF蛋白質的活性之目的而言，較佳為於含有FGF蛋白質的培養基中添加肝素、硫酸乙醯肝素(heparan sulfate)。肝素作為鈉鹽能夠自例如富士膜和光純藥股份有限公司入手。培養基中的肝素或硫酸乙醯肝素之濃度能夠在可達成上述的效果的範圍中適當地設定。培養基中的肝素鈉的濃度，通常為以約1ng/ml至約100mg/ml，較佳為約10ng/ml至約50mg/ml，更佳為約100ng/ml至約10mg/ml，又更佳為約500ng/ml至約1mg/ml，最佳為約1μg/ml至約200μg/ml。使用硫酸乙醯肝素時，較佳為與上述濃度的肝素具有同樣的FGF蛋白質保護的活性之濃度。從在37℃等細胞培養環境下保持FGF蛋白質的活性的目的而言，又較佳為使用例如美國專利第8772460號說明書所記載之將FGF2與Thermostable FGF2等FGF的變異體或生物分解性聚合物結合而成的StemBeads FGF2等FGF2緩釋性珠(bead)。Thermostable FGF2能夠自例如HumanZyme公司入手。StemBeads FGF2購入自例如StemCulture公司入手。
BMP訊息傳導路徑抑制物質只要為可抑制藉由BMP族蛋白質引發的訊息傳導者，則沒有特別限定。BMP訊息傳導路徑抑制物質可為核酸、蛋白質、低分子有機化合物的任一種。該物質可列舉例如：抑制BMP的加工和朝細胞外分泌的物質、直接作用於BMP的物質(例如，蛋白質、抗體、適配體等)、抑制編碼BMP基因的表現的物質(例如，反義寡核苷酸、siRNA等)、抑制BMP受體與BMP的結合的物質、抑制起因於藉由BMP受體進行的訊息傳導的生理活性的物質。BMP受體中存在I型BMP受體和II型BMP受體。I型BMP受體已知有：BMPR1A、BMPR1B、ACVR。II型BMP受體已知有：TGF-beta R-II、ActR-II、ActR-IIB、BMPR2、MISR-II。
作為BMP訊息傳導路徑抑制物質所熟知的蛋白質可舉例如：Noggin、Chordin、濾泡抑素(Follistatin)、Gremlin、抑制素(Inhibin)、Twisted Gastrulation、Coco、屬於DAN家族的分泌蛋白質等。由在上述步驟(2)中於培養液中添加BMP訊息傳導路徑作用物質，而更有效地抑制之後的BMP訊息傳導路徑的觀點而言，步驟(3)中的BMP訊息傳導路徑抑制物質較佳為含有抑制比細胞外的BMP的分泌更後面的訊息傳導路徑的物質，例如，抑制BMP受體與BMP的結合的物質、抑制起因於藉由BMP受體進行的訊息傳導的生理活性的物質等，更佳為含有I型BMP受體的抑制劑。
BMP訊息傳導路徑抑制物質亦可使用所屬技術領域具有通常知識者所周知的化合物。BMP訊息傳導路徑抑制物質可舉出例如：I型BMP受體的抑制物質。具有如上述般之活性的化合物可列舉例如：K02288(3-[(6-胺基-5-(3,4,5-三甲氧基苯基)-3-吡啶基]酚，3-[6-胺基-5-(3,4,5-三甲氧基苯基)-3-吡啶基]-酚)、多索嗎啡(Dorsomorphin)(6-[4-[2-(1-哌啶基)乙氧基]苯基]-3-(4-吡啶基)吡唑 并[1,5-a]嘧啶)、LDN-193189(4-[6-[4-(1-哌
Figure 111124633-A0202-12-0103-58
基)苯基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基]喹啉二鹽酸鹽)、LDN-212854(5-[6-[4-(1-哌
Figure 111124633-A0202-12-0103-59
基)苯基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基]喹啉)、LDN-214117(1-(4-(6-甲基-5-(3,4,5-三甲氧基苯基)吡啶-3-基)苯基)哌
Figure 111124633-A0202-12-0103-60
)、ML347(5-[6-(4-甲氧基苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基]喹啉))、DMH1(4-(6-(4-異丙氧基苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)喹啉)、DMH2(4-[6-[4-[2-(4-嗎啉基)乙氧基]苯基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基]-喹啉)等。該等物質係可單獨或組合複數種使用。
BMP訊息傳導路徑抑制物質較佳為I型BMP受體抑制劑，更佳為包含選自由K02288、多索嗎啡(Dorsomorphin)、LDN-193189、LDN-212854、LDN-214117、ML347、DMH1以及DMH2所組成的群組中之至少一個，又更佳為包含K02288。
培養基中的BMP訊息傳導路徑抑制物質之濃度，係能夠在可達成上述的效果的範圍中適當地設定。由構成鼻腔上皮之細胞的形成效率的觀點而言，於步驟(3)中使用K02288作為BMP傳導路徑抑制劑時，通常以約1nM至約100μM，較佳為約10nM至約50μM，更佳為約100nM至約50μM，又更佳為約500nM至約25μM的濃度使用。使用LDN-193189作為BMP傳導路徑抑制劑時，通常為以約1nM至約100μM，較佳為約10nM至約10μM，更佳為約25nM至約1μM，又更佳為約100nM至約500nM的濃度使用。使用LDN-212854作為BMP傳導路徑抑制物質時，通常為以約1nM至約100μM，較佳為約10nM至約10μM，更佳為約25nM至約5μM，又更佳為約250nM至約3μM的濃度使用。使用ML-347作為BMP傳導路徑抑制物質時，通常為以約1nM至約100μM，較佳為約10nM至約50μM，更佳為約100nM至約50μM，又更佳為約1μM至約25μM的濃度使用。使用DMH2作為BMP傳導路徑抑制 物質時，通常為以約1nM至約100μM，較佳為約10nM至約10μM，更佳為約25nM至約5μM，又更佳為約250nM至約3μM的濃度使用。再者，使用K02288以外的BMP訊息傳導路徑抑制物質時，較佳為使用與上述濃度的K02288顯示出同等之BMP訊息傳導路徑抑制活性的濃度。
就構成鼻腔上皮之細胞的形成效率之觀點而言，步驟(3)的開始時期，從步驟(2)的BMP訊息傳導路徑作用物質之添加開始，較佳為0.5小時以後240小時以內，更佳為6小時以後192小時以內，又更佳為9小時以後120小時以內，特佳為12小時以後72小時以內。步驟(3)中的FGF訊息傳導路徑作用物質及BMP訊息傳導路徑抑制物質的添加時期可同時亦可不同時。
就步驟(3)中的一態樣而言，首先，可添加FGF訊息傳導路徑作用物質，之後添加BMP訊息傳導路徑抑制物質。具體而言，例如，可在步驟(2)開始後48小時以內，先添加FGF訊息傳導路徑作用物質，之後，在96小時以內添加BMP訊息傳導路徑抑制物質。或者是，就抑制混入在細胞集團中之未分化細胞的增殖之觀點而言，其他一態樣可列舉例如：可在步驟(2)開始後72小時以後120小時以內，添加FGF訊息傳導路徑作用物質及BMP訊息傳導路徑抑制物質。
就構成鼻腔上皮之細胞的形成效率之觀點而言，步驟(3)的開始時期較佳為在步驟(2)的BMP訊息傳導路徑作用物質之添加後，在細胞凝集物的表面形成非神經上皮組織之前開始。為了調查在細胞凝集物的表面是否有非神經上皮組織形成，可藉由顯微鏡等觀察在細胞凝集物表面是否有上皮樣的組織形成，或是製作細胞凝集物的切片，藉由針對細胞角蛋白、E-黏附蛋白、EpCAM等非神經上皮組織中表現之標記的螢光免疫染色等手法進行。
步驟(3)之培養開始，係可使用進行過步驟(2)之培養容器，進行上述之培養基交換操作(例如，培養基添加操作、半量培養基交換操作、全量培養基交換操作等)，亦可將細胞凝集物移至其他培養容器。
進行懸浮培養時，步驟(3)之培養，係例如可進行至細胞凝集物中分化出鼻腔上皮細胞為止。分化為鼻腔上皮細胞係例如可藉由細胞的免疫染色進行確認，可使用細胞角蛋白15、細胞角蛋白18、及前述構成鼻腔上皮之各種細胞的標記基因等作為標記。或者是，步驟(3)之培養係可進行至分化出嗅神經前驅細胞為止。分化為嗅神經前驅細胞係例如可藉由細胞的免疫染色進行確認，可使用Ebf2、NeuroD、Lhx2、Tuj1、NCAM、鈣網膜蛋白作為標記。
在步驟(3)中所使用的培養基沒有特別的限定，在步驟(1)中所使用的培養基以外，可列舉在Neurobasal添加有B27補充物的培養基、在DMEM/F-12添加有N2補充物的培養基、StemPro NSC SFM無血清人類神經幹細胞培養培養基(Thermo Fisher Scientific公司製)等調製完成的神經細胞培養用之培養基。
在步驟(3)中，亦較佳為繼續地添加步驟(a)、步驟(1)及步驟(2)之任一者的步驟中所用的添加物，例如，Wnt訊息傳導路徑抑制物質、Wnt訊息傳導路徑作用物質、TGFβ訊息傳導路徑抑制物質、TAK1抑制物質等。在步驟(3)添加之Wnt訊息傳導路徑抑制物質、Wnt訊息傳導路徑作用物質、TGFβ訊息傳導路徑抑制物質及TAK1抑制物質，係可與各個步驟(a)、步驟(1)及步驟(2)之任一個步驟中所用的物質相異，但較佳為相同。關於添加物的濃度及種類係可適當地調整。步驟(3)中所使用添加物較佳為包含Wnt訊息傳導路徑抑制物質，又更佳為包含Wnt訊息傳導路徑作用物質、TGFβ訊息傳導路徑抑制物質及TAK1抑制物質。
就鼻腔上皮結構的形成以及細胞的生存及增殖促進之觀點而言，步驟(3)亦較佳為在EGF訊息傳導路徑作用物質之存在下進行。所謂EGF訊息傳導路徑作用物質，係可增強藉由上皮成長因子(EGF)所媒介的訊息傳導路徑之物質。EGF訊息傳導路徑作用物質可列舉例如：EGF、TGF-α、AR(雙調蛋白(Amphiregulin))、EPG、HB-EGF(肝素結合EGF樣增殖因子)、BTC(β細胞素(betacellulin))、及EPR(上皮調節蛋白(Epiregulin))等EGFR配位基蛋白質；NRG(神經調節蛋白(Neuregulin))1至4之ErbB3/4(上皮成長因子受體、HRE)配位基蛋白質、以及阿普洛爾(Alprenolol)、及卡維地洛(Carvedilol)等低分子化合物等。該等物質係可單獨或組合複數種使用。EGF蛋白質係例如能夠自Thermo Fisher Scientific公司及PrimeGene公司入手。HB-EGF蛋白質係例如能夠自R & D Systems公司入手。EGF訊息傳導路徑作用物質較佳為包含EGF。
培養基中的EGF訊息傳導路徑作用物質的濃度，係能夠在可達成上述效果的範圍中適當地設定。使用EGF作為EGF訊息傳導路徑作用物質時，通常為以約1pg/ml至約100μg/ml，較佳為約10pg/ml至約50μg/ml，更佳為約100pg/ml至約10μg/ml，又更佳為約500pg/ml至約1μg/ml，最佳為約1ng/ml至約200ng/ml的濃度使用。再者，使用EGF以外的EGF訊息傳導路徑作用物質時，較佳為使用與上述濃度EGF顯示出同等EGF訊息傳導路徑促進活性之濃度。
就鼻腔上皮樣組織中之細胞的分化傾向的調節以及細胞的生存及增殖促進之觀點而言，步驟(3)亦較佳為在Shh訊息傳導路徑作用物質之存在下進行。Shh訊息傳導路徑作用物質亦可使用在上述步驟(a)所記載者。步驟(3)中的Shh訊息傳導路徑作用物質，係可使用與步驟(a)所使用者相同亦可相異，但 較佳為相同的物質。步驟(3)中的Shh訊息傳導路徑作用物質較佳為包含選自由SAG、嘌嗎啡胺、GSA-10所組成群組所含的至少1個，更佳為包含SAG。培養基中的Shh訊息傳導路徑作用物質的濃度，係能夠在可達成上述效果的範圍中適當地設定。SAG係在步驟(3)中通常為以約1nM至約10μM，較佳為約10nM至約7μM，更佳為約50nM至約5μM，又更佳為約100nM至約3μM，特佳為約300nM至約2μM，最佳為約500nM至約1.5μM的濃度使用。再者，使用SAG以外的Shh訊息傳導路徑作用物質時，較佳為使用與上述濃度的SAG顯示出同等的Shh訊息傳達促進活性之濃度。
就鼻腔上皮樣組織中之細胞的分化傾向的調節之觀點而言，步驟(3)亦較佳為在視網酸訊息傳導路徑作用物質之存在下進行。視網酸傳導路徑作用物質可舉出例如：與視網酸受體(RAR)或視黃醇類X受體(RXR)結合，使下流的轉錄活化之物質等。具有如上述般作用之化合物可列舉例如：全反視網酸(all-trans retinoic acid)、異視網酸、9-順視網酸、TTNPB(4-[(E)-2-[(5,5,8,8-四甲基-5,6,7,8-四氫萘)-2-基]-1-丙烯基]苯甲酸)、Ch55(4-[(E)-3-(3,5-二第三丁基苯基)-3-側氧基-1-丙烯基]苯甲酸)、EC19(3-[2-(5,6,7,8-四氫-5,5,8,8-四甲基-2-萘基)乙炔基]苯甲酸)、EC23(4-[2-(5,6,7,8-四氫-5,5,8,8-四甲基-2-萘基)乙炔基)-苯甲酸)、芬維胺(Fenretinide)(4-羥基苯基視黃醯胺(retinamide))、阿曲汀(Acitretin)((all-e)-9-(4-甲氧基-2,3,6-三甲基苯基)-3,7-二甲基-2,4,6,8-壬四烯(nonatetraen))、曲法洛汀(Trifarotene)、阿達帕林(Adapalene)、AC 261066(4-[4-(2-丁氧基乙氧基-)-5-甲基-2-噻唑基]-2-氟苯甲酸)、AC 55649(4-N-辛基聯苯基-4-羧酸)、AM 580(4-[(5,6,7,8-四氫-5,5,8,8-四甲基-2-萘基)羧醯胺]苯甲酸)、AM80(4-[(5,5,8,8-四甲基-6,7-二氫萘-2-基)胺甲醯基]苯甲酸)、BMS 753(4-[[(2,3-二氫-1,1,3,3-四甲基-2-側氧基-1H- 茚-5-基)羰基]胺基]苯甲酸)、BMS 961(3-氟-4-[(r)-2-羥基-2-(5,5,8,8-四甲基-5,6,7,8-四氫-萘-2-基)-乙醯基胺基]-苯甲酸)、CD1530(4-(6-羥基-7-三環[3.3.1.13,7]癸-1-基-2-萘基)苯甲酸)、CD2314(5-(5,6,7,8-四氫-5,5,8,8-四甲基-2-蒽基)-3-噻吩羧酸)、CD437(2-萘羧酸，6-(4-羥基-3-三環(3.3.1.1(3,7))癸-1-基苯基)、CD271(6-[3-(1-金剛烷基)-4-甲氧基苯基]-2-萘羧酸)及該等之衍生物等。該等物質係可單獨或組合複數種使用。
步驟(3)中的視網酸傳導路徑作用物質較佳為包含EC23。培養基中的視網酸傳導路徑作用物質的濃度，只要是可達成上述效果的範圍，則沒有特別的限定。使用EC23作為視網酸傳導路徑作用物質時，例如，EC23的濃度係約10pM至約30μM，較佳為約100pM至約20μM，更佳為約10nM至約10μM，又更佳為約100nM至約5μM。使用EC23以外的視網酸傳導路徑作用物質時，較佳為使用與上述濃度的EC23顯示出同等的視網酸傳導路徑作用活性之濃度。
就鼻腔上皮樣組織中之細胞的分化傾向的調節之觀點而言，步驟(3)亦較佳為Notch訊息傳導路徑抑制物質之存在下進行。本發明中，所謂Notch訊息傳導路徑係表示藉由屬於在細胞膜上表現的受體之Notch蛋白質與在隣接細胞的膜上表現的Notch配位基(Delta，Jagged等)之直接相互作用，而被活化之訊息傳導路徑。在Notch訊息傳達到之細胞中，Notch蛋白質接受階段性的加工，在膜上被切出的細胞內結構域被運送至細胞核內，而控制下游基因的表現。
Notch訊息傳導路徑抑制物質只要是可抑制藉由Notch所媒介的訊息傳達者，則沒有特別的限定。Notch訊息傳導路徑抑制物質可為核酸、蛋白質、低分子有機化合物之任一者。該物質可列舉例如：功能缺失型的Notch受體 及配位基、抑制Notch的加工(S1切斷)之物質、抑制Notch及Notch配位基的糖鏈修飾之物質、抑制細胞膜移行之物質、抑制Notch的細胞內結構域(NICD)的加工(S2切斷、S3切斷)之物質(γ分泌酶抑制劑)、分解NICD之物質、抑制NICD依存性轉錄之物質等。
Notch訊息傳導路徑抑制物質亦可使用所屬技術領域具有通常知識者所周知之化合物。具有作為Notch訊息傳導路徑抑制物質之活性的化合物可列舉例如：DAPT(N-[N-(3,5-二氟苯乙醯基)-1-丙胺醯基]-S-苯基甘胺酸第三丁基酯)、DBZ((2S)-2-[[2-(3,5-二氟苯基)乙醯基]胺基]-N-[(7S)-5-甲基-6-側氧基-7H-苯并[d][1]苯氮呯-7-基]丙醯胺)、MDL28170(N-[(2S)-3-甲基-1-側氧基-1-[[(2S)-1-側氧基-3-苯基丙烷-2-基]胺基]丁烷-2-基]胺甲酸苯甲基酯)、FLI-06(2,7,7-三甲基-4-(4-硝基苯基)-5-側氧基-1,4,6,8-四氫喹啉-3-羧酸環己基酯)、L-685、458(N-[6-[[1-[(1-胺基-1-側氧基-3-苯基丙烷-2-基)胺基]-4-甲基-1-側氧基戊烷-2-基]胺基]-5-苯甲基-3-羥基-6-側氧基-1-苯基己烷-2-基]胺甲酸第三丁基酯)、CB-103(6-(4-第三丁基苯氧基)吡啶-3-胺)及該等之衍生物等，以及Onco Targets Ther.2013；6：943-955.所記載之物質等。Notch訊息傳導路徑抑制物質較佳為包含DAPT。
培養基中中之Notch訊息抑制物質的濃度，只要是可達成上述效果的範圍，則沒有特別的限定。例如，使用DAPT作為Notch訊息傳導路徑抑制物質時，例如，DAPT的濃度係約100pM至約50μM較佳為約1nM至約30μM，更佳為約100nM至約20μM，又更佳為約1μM至約10μM。使用DAPT以外的Notch訊息傳導路徑抑制物質時，較佳為使用與上述濃度的DAPT顯示出同等Notch訊息傳導路徑抑制活性之濃度。
就鼻腔上皮樣組織中之細胞的分化傾向的調節之觀點而言，亦較佳為將步驟(3)及之後的步驟，在Hippo/YAP訊息傳導路徑調節物質之存在下進行。本發明中，所謂Hippo/YAP訊息傳導路徑，係表示參與細胞增殖或細胞凋亡(Apoptosis)、幹細胞自己複製的控制、器官的大小調節等，由Mst1/2或LATS1/2等構成之激酶連級(cascade)，及藉由轉錄因子YAP/TAZ所控制之訊息傳導路徑。例如，企圖增殖細胞及維持幹細胞的未分化性時，只要是所屬技術領域具有通常知識者，可藉由添加具有抑制Hippo路徑，且促進YAP/TAZ蛋白質的去磷酸化及核內移行之作用的物質、促進由YAP/TAZ所引發之轉錄的物質等而進行。企圖細胞的分化促進時，只要是所屬技術領域具有通常知識者，可藉由添加活化Hippo路徑，且促進由YAP/TAZ蛋白質之磷酸化及泛素-蛋白酶體系統(Ubiquitin-proteasome system)等所致之分解的作用之物質、抑制由YAP/TAZ所引發之轉錄的物質等進行。
Hippo路徑抑制物質只要是抑制上游的激酶連級，或使由YAP/TAZ所引發之下游的標的基因的轉錄/細胞應答亢進者，則沒有特別的限定。Hippo路徑抑制物質可為核酸、蛋白質、低分子有機化合物之任一者。Hippo路徑抑制物質可列舉例如：增殖因子、細胞介素、鞘胺醇-1-磷酸受體2(Sphingosine-1-phosphate receptor 2，S1PR2)活化物質、哺乳類不育20樣激酶(mammalian sterile 20-like kinase，MST)1/2抑制物質、大腫瘤抑制激酶1及2(large tumor suppressor kinase 1 and 2，LATS1/2)抑制物質、膜聯蛋白A2(annexin A2，ANXA2)結合抑制物質，TAZ活化物質等。具有如上述般作用之物質可列舉例如：CYM-5520(1-[2-(1-苯甲基-2,5-二甲基吡咯-3-基)-2-側氧乙基]-6-側氧基吡啶-3-甲腈)、XMU-MP-1(4-[(2,9-二甲基-8-側氧基-6-硫雜-2,9,12,14-四氮雜三環[8.4.0.03,7]十四- 1(14),3(7),4,10,12-戊烯-13-基)胺基]苯磺醯胺)、PY-60(5-苯基-N-(3-(噻唑-2-基)丙基)異
Figure 111124633-A0202-12-0111-61
唑-3-羧醯胺)、GA-017([(E)-2-(1-(2,4-二羥基-3-甲基苯基)丙亞基)-N-(3-羥基苯甲基)肼-1-羧醯胺])、Lats-IN-1(N-(3-苯甲基-1,3-噻唑-2-亞基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-羧醯胺)、IBS008738([3-(4-甲基苯基)-5-[(E)-嗎啉-4-基甲亞基胺基]咪唑-4-基]-苯基甲酮)、TM-25659(2-丁基-5-甲基-6-吡啶-3-基-3-[[4-[2-(2H-四唑-5-基)苯基]苯基]甲基]咪唑并[4,5-b]吡啶)、SBP-3264(N-[1-[5-(3-氯苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基]哌啶-4-基]乙醯胺)、VT02956、TDI-011536及該等之衍生物等。
Hippo路徑活化物質只要是抑制由YAP/TAZ所引發之下游的基因的轉錄/細胞應答者，則沒有特別的限定。Hippo路徑活化物質可為核酸、蛋白質、低分子有機化合物之任一者。Hippo路徑活化物質可列舉例如：TEAD抑制物質、YAP-TEAD結合抑制物質、AMPK活化劑、YAP/TAZ轉錄活性抑制物質、刺激對細胞間及細胞外基質的接著之擬似活化物質等。具有如上述般作用之物質可列舉例如：維替泊芬(Verteporfin)(3-[(23S,24R)-14-乙烯基-22,23-雙(甲氧基羰基)-5-(3-甲氧基-3-氧代丙基)-4,10,15,24-四甲基-25,26,27,28-四氮雜六環[16.6.1.13,6.18,11.113,16.019,24]二十八-1,3,5,7,9,11(27),12,14,16,18(25),19,21-十二烷-9-基]丙酸；3-[(23S,24R)-14-乙烯基-22,23-雙(甲氧基羰基)-9-(3-甲氧基-3-氧代丙基)-4,10,15,24-四甲基-25,26,27,28-四氮雜六環[16.6.1.13,6.18,11.113,16.019,24]二十八-1,3,5,7,9,11(27),12,14,16,18(25),19,21-十二烷-5-基]丙酸)、AICAR(5-胺基-1-[(2R,3R,4S,5R)-3,4-二羥基-5-(羥基甲基)四氫呋喃-2-基]咪唑-4-羧醯胺)、K-975(N-(3-(4-氯苯氧基)-4-甲基苯基)丙烯醯胺)、MYF-01-37(1-[3-甲基-3-[3-(三氟甲基)苯胺基]吡咯烷-1-基]丙-2-烯-1-酮)、TED-347(2-氯-1-[2-[3-(三氟甲基)苯胺基]苯基]乙酮)、VT107(N-[(1S)-1-(6-胺基吡啶-2-基)乙基]-5-[4-(三 氟甲基)苯基]萘-2-羧醯胺)、YAP-TEAD-IN-1((4S)-4-[[(2S)-1-[(2S)-1-[(2S)-2-[[(3S,6S,9S,12S,15S,24S,27S,30S,33S)-15-[[(2S)-2-[[(2S)-1-[(2S)-2-乙醯胺基-3-甲基丁醯基]吡咯烷-2-羰基]胺基]-3-(3-氯苯基)丙醯基]胺基]-6-(4-胺基丁基)-24-苯甲基-3-丁基-9-(3-二胺基亞甲胺基丙基)-27-(羥基甲基)-30-甲基-12-(2-甲基丙基)-2,5,8,11,14,23,26,29,32-九側氧基-18,19-二硫雜-1,4,7,10,13,22,25,28,31-九氮雜雙環[31.3.0]三十六烷-21-羰基]胺基]-6-胺基己醯基]吡咯烷-2-羰基]吡咯烷-2-羰基]胺基]-5-胺基-5-酮戊酸)、Super-TDU((4S)-5-胺基-4-[[(2S)-1-[(2S)-1-[(2S)-6-胺基-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-1-[(2S)-2-[[(2S)-6-胺基-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-1-[(2S)-2-[[(2S,3S)-2-[2-[(3S)-6-胺基-1-[(2S)-1-[(2S)-2-[[(2S)-4-胺基-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2S)-6-胺基-2-[[(2S)-1-[(2S)-4-胺基-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-5-胺基-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-6-胺基-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-3-羧基-2-[[(2S)-3-羧基-2-[[(2S)-2-[2-[(2S)-1-羥基-3-側氧基丙烷-2-基]肼基]-3-甲基丁醯基]胺基]丙醯基]胺基]丙醯基]胺基]-3-(1H-咪唑-5-基)丙醯基]胺基]-3-苯基丙醯基]胺基]丙醯基]胺基]己醯基]胺基]-3-羥基丙醯基]胺基]-4-甲基戊醯基]胺基]乙醯基]胺基]-3-羧基丙醯基]胺基]-3-羥基丁醯基]胺基]-3-(1H-吲哚-3-基)丙醯基]胺基]-4-甲基戊醯基]胺基]-5-側氧基戊醯基]胺基]-3-甲基戊醯基]胺基]乙醯基]胺基]乙醯基]胺基]-3-羥基丙醯基]胺基]乙醯基]胺基]-4-側氧基丁醯基]吡咯烷-2-羰基]胺基]己醯基]胺基]-3-羥基丁醯基]胺基]丙醯基]胺基]-4-側氧基丁醯基]胺基]-3-甲基丁醯基]吡咯烷-2-基]-1,2,6-三側氧基己烷-3-基]肼基]-3-羥基丁醯基]胺基]-3-甲基丁醯基]吡咯烷-2-羰基]胺基]-4-甲基硫基丁醯基]胺基]-5-二胺基亞甲胺基戊醯基]胺基]-4-甲基戊醯基]胺基]-5-二胺基亞甲胺基戊醯基]胺基]己醯基]胺基]- 4-甲基戊醯基]吡咯烷-2-羰基]胺基]-3-羧基丙醯基]胺基]-3-羥基丙醯基]胺基]-3-苯基丙醯基]胺基]-3-苯基丙醯基]胺基]己醯基]吡咯烷-2-羰基]吡咯烷-2-羰基]胺基]-5-酮戊酸)及該等之衍生物等。
上述物質等具有作為Hippo路徑抑制物質及活化物質之活性，係例如記載於Current drug targets,2017,18.4：447-454.，為所屬技術領域具有通常知識者所周知。亦可將上述文獻所記載之物質等作為Hippo路徑抑制物質及活化物質使用。
如前述，就鼻腔上皮樣組織中之細胞的分化傾向的調節之觀點而言，步驟(3)亦較佳為在Wnt訊息傳導路徑作用物質之存在下進行。培養基中的Wnt訊息傳導路徑作用物質的濃度係能夠在可達成上述效果的範圍中適當地設定。就鼻腔上皮樣組織中之細胞的分化傾向的調節之觀點而言，使用CHIR99021作為Wnt訊息傳導路徑作用物質時，通常為以約10pM至約10mM，較佳為約100pM至約1mM，更佳為約1nM至約100μM，又更佳為約10nM至約30μM，最佳為約100nM至約3μM的濃度使用。再者，使用CHIR99021以外的Wnt訊息傳導路徑作用物質時，較佳為使用與上述濃度的CHIR99021顯示出同等的Wnt訊息傳導路徑促進活性之濃度。Wnt訊息傳導路徑促進活性，係例如可利用使用了HEK293細胞之Topflash報告基因檢測而決定。
就鼻腔上皮樣組織中之細胞的分化傾向的調節之觀點而言，亦較佳為將步驟(3)及之後的步驟在活化素/TGF-β訊息傳導路徑作用物質之存在下進行。所謂活化素/TGF-β訊息傳導路徑作用物質，係可增強藉由活化素/TGF-β媒介的訊息傳導路徑。活化素/TGF-β訊息傳導路徑作用物質可列舉例如：活化素及TGF-β等之重組蛋白質；以及木香油內酯(Alantolactone)等使活化素/TGF- β訊息傳導路徑活化之物質等。該等物質係可單獨或組合複數種使用。從生物學的活性之見解而言，活化素/TGF-β訊息傳導路徑作用物質可舉出例如：對源自人類慢性骨髓性白血病之細胞株K562等細胞具有血紅素表現誘導能力之物質。使用人類重組活化素(R & D Systems公司製)作為活化素/TGF-β訊息傳導路徑作用物質時，通常以1pg/ml至1mg/ml，較佳為100pg/ml至10μg/ml，更佳為1ng/ml至100ng/ml範圍的濃度使用。使用人類重組活化素以外的活化素/TGF-β訊息傳導路徑作用物質時，以與所屬技術領域具有通常知識者所周知的前述人類重組活化素添加濃度顯示出同樣的生理活性之濃度添加即可。在較步驟(3)之前的步驟中添加活化素/TGF-β訊息傳導路徑抑制物質時，較佳為例如將細胞凝集物從培養器材回收後，以不含活化素/TGF-β訊息傳導路徑抑制物質之培養基、緩衝液等清洗複數次，將細胞凝集物移設至新培養器材後，添加含有活化素/TGF-β訊息傳導路徑作用物質之培養基。
實施懸浮培養時，在步驟(3)及之後的步驟中，就抑制細胞凝集物彼此的接著、細胞的保護及模擬生體的物理性環境提升鼻腔上皮樣組織的製造效率之觀點而言，亦可在含有增黏劑，且具有黏性之培養基中培養細胞凝集物。
賦予培養基黏性的手段並沒有特別限制，例如，可藉由將作為一般增黏劑所熟知的物質以適當的濃度添加於培養基而實施。增黏劑係可賦予培養基具有上述的適度黏度者，在可賦予該黏度的濃度範圍中，只要為不對細胞造成不良影響(沒有細胞毒性)者，能夠使用任何的增黏劑。增黏劑可列舉例如：果膠、瓜耳膠、黃原膠、羅望子膠、鹿角菜膠、刺槐豆膠、結冷膠、糊精、定優膠(diutan gum)、澱粉、塔拉膠(tara gum)、藻酸、卡特蘭多糖(Curdlan)、酪蛋白鈉、角豆膠、幾丁質(Chintin)、幾丁聚醣(chitosan)、葡萄糖胺(glucosamine)、聚三葡 萄糖(pullulan)、食物纖維以及此等經化學修飾的物質或衍生物；纖維素、瓊脂糖等多糖；甲基纖維素、乙基纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基纖維素、羥乙基甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羥乙基乙基纖維素、羥丙基乙基纖維素、乙基羥乙基纖維素、二羥丙基纖維素、羥乙基羥丙基纖維素等的多糖醚；聚丙烯醯胺、聚乙二醇、以及聚乙烯基吡咯啶酮、乙二醇/丙二醇共聚物、聚伸乙亞胺聚乙烯基甲基醚、聚乙烯醇、聚丙烯酸、順丁烯二酸共聚物等合成高分子；膠原蛋白、明膠、玻尿酸及葡聚醣(Dextran)等生體高分子，或者是模仿此等的人工高分子(例如，彈性蛋白(elastin)樣胜肽等)。較佳為此等增黏劑可單獨使用，也能夠作為數種類增黏劑的混合物使用。再者，可以作為增黏劑使用的水溶性高分子的共聚物使用。較佳可使用甲基纖維素、聚乙二醇、聚乙烯基吡咯啶酮、羧基甲基纖維素或該等的混合物，更佳可使用甲基纖維素。
具有黏性之培養基，在適用為培養環境的37℃條件下，通常可使用具有100mPa‧S以上，較佳為250mPa‧S以上，更佳為500mPa‧S以上，又更佳為1000mPa‧S以上之黏性者。上述黏性係可根據例如日本產業規格(JIS)，使用細管黏度計、落球式黏度計、旋轉黏度計、振動黏度計等進行測定。
添加於培養基中的增黏劑的濃度，只要在可賦予黏性且不具有對細胞之障礙性的限制下，可適當地調製。使用甲基纖維素(4000cP)作為增黏劑時，通常以0.1%至10%，較佳為0.3%至7.5%，又更佳為0.5%至5%的濃度使用。
實施懸浮培養時，在步驟(3)及之後的步驟中，就抑制細胞凝集物彼此的接著/凝集、保護細胞免於源自剪斷力等的物理性刺激、及模擬生體的物理性環境提升鼻腔上皮樣組織的製造效率之觀點而言，亦可添加具有界面活性作用之物質。如此之物質可列舉例如：花生四烯酸、亞麻油酸、亞油酸、肉豆蔻 酸、油酸、棕櫚酸、棕櫚油酸、及硬脂酸等脂肪酸；泊洛沙姆(Pluronic)F-68、及Tween 80等界面活性劑；以及膽固醇。
實施懸浮培養時，就使步驟(3)及之後的步驟中所製造的細胞塊之大小均勻、控制分化誘導的效率之觀點而言，亦較佳為採取如防止所形成的細胞塊的彼此接著之處置。實現上述之手段可列舉例如：國際公開第2016/121737號所記載之溶血磷脂質(lysophospholipids)類的添加、國際公開第2019/131941號所記載之凝血酶(Thrombin)受體促效劑的添加、國際公開第2016/121840號所記載之細胞間接著之抑制物質的添加等手段，但不限定於此等。就防止細胞塊彼此的接著之其他態樣而言，可舉出針對控制細胞接著之Rho訊息傳導路徑的抑制物質的添加。防止細胞塊彼此的接著之Rho訊息傳導路徑抑制物質較佳為ROCK抑制物質。以防止細胞塊彼此的接著為目的，添加屬於ROCK抑制物質之Y-27632或Chroman 1時，可以與作為細胞保護物質使用時同樣的條件進行添加。添加屬於ROCK抑制物質之Y-27632時，通常以成為10nM至10mM，較佳為100nM至1mM，更佳為1μM至100μM的濃度之方式，在培養環境中進行添加。添加屬於ROCK抑制物質之Chroman 1時，通常以成為10pM至1mM，較佳為100pM至100μM，更佳為1nM至10μM的濃度之方式，在培養環境中進行添加。
就至步驟(2)為止實施懸浮培養時，在步驟(3)及之後的步驟中促進所形成知構成鼻腔上皮之細胞的分化成熟之觀點而言，亦較佳為將所形成之細胞凝集物進行接著培養。從懸浮培養移行至接著培養時，可藉由將細胞凝集物直接靜置於細胞培養皿上使其接著，也可實施切割處置、或者是細胞分散處置等，調製較小的細胞凝集物或經單離之細胞的懸濁液，在播種後使其接著。
使細胞接著之培養器材，亦可使用前述之平面的細胞培養皿、或者是Transwell等具有物質滲透性之薄膜狀的細胞培養器材之任一種形態。培養器材係為了促進細胞的接著，也可經基底膜標品、層連結蛋白等細胞外基質、聚-D-離胺酸等合成細胞接著分子等塗覆。
在步驟(3)及之後的步驟中，就促進構成鼻腔上皮之細胞的生存及分化成熟之觀點而言，亦較佳為將細胞凝集物以氣相液相界面培養法進行培養。所謂氣相液相界面培養法(Air liquid interface culture)，係表示細胞或組織之至少一面以暴露於大氣中，或位於極接近位置的條件之培養。為了實施氣相液相界面培養法係可列舉例如：將細胞或組織在多孔性膜上或插入式細胞培養器(Culture insert)內進行培養，將插入式細胞培養器內(內腔側)之培養液取出，僅以插入式細胞培養器外側的孔內之培養液進行培養之方法；將瓊脂糖凝膠等水凝膠置於培養皿內，在其上放置細胞或組織等後一邊從皿內之培養基露出一邊在不乾燥之條件下進行培養之方法；及包埋於瓊脂糖凝膠等後，以振動刀片切片機等將細胞凝集物薄切，在薄膜細胞培養器(Cell insert)內培養薄切片之方法等。以減輕主要由氧所致之暴露於大氣的暴露的毒性為目的，可將PDMS等氧滲透性的膜或板置於細胞或組織等之上，而調節暴露條件。如上述之氣相液相界面培養法係可例如參照Respiratory research 18.1(2017)：195,Sci Rep 6,21472,Nat Neurosci.2019 Apr；22(4)：669-679等而實施。
在步驟(3)及之後的步驟中，就促進構成鼻腔上皮之細胞的生存及分化成熟之觀點而言，亦可包含將細胞凝集物包埋於凝膠中進行培養之步驟。凝膠可列舉例如：使用了瓊脂糖凝膠、甲基纖維素、膠原蛋白、及基質膠等之凝膠，較佳為使用基質膠。
在步驟(3)及之後的步驟之將細胞包埋於凝膠中進行培養之步驟中，可將細胞凝集物直接進行包埋，也可將經分散及單離後之細胞播種於凝膠中。也可使用細胞分選儀(Cell sorter)等，將基底細胞等特定的細胞腫分取後進行播種。就包埋於凝膠中之培養法的另一態樣而言，亦可實施與纖維母細胞、間葉系細胞、血管系細胞等鼻腔上皮以外的細胞一起培養。如上述之凝膠包埋培養係可參照例如Nature 501,373-379(2013)、Nature,499,481-484(2013)、Nat Protoc 14,518-540(2019)、Genes 2020,11,603等而實施。
在步驟(3)及之後的步驟中，就改善細胞之營養及氧供給、改善物質交換之目的而言，亦較佳為實施細胞被物理地搖動之培養方法。如此之培養方法可列舉：振盪培養、旋轉培養、攪拌培養等靜置培養以外的方法。用以實施振盪培養、旋轉培養、攪拌培養等之手段係沒有特別的限定，例如，可藉由將培養著細胞之培養器材設置於旋轉器、振盪器(shaker)等，或將細胞放置於以攪拌器(stirrer)等旋轉著之環境下而實施。振盪培養、旋轉培養、攪拌培養之速度等參數，係只要所屬技術領域具有通常知識者就可在不會對造成細胞障礙之範圍中適當地設定。例如，使用波動形搖動之3D振盪器(例如，Mini-Shaker 3D，Biosan公司製)實施振盪培養時，例如，可在5至60rpm，較佳為5至40rpm，更佳為5至20rpm的範圍中設定振盪速度範圍。使用往復式振盪器(例如，NS-LR，AS ONE公司製)實施振盪培養時，例如，可在15至60rpm，較佳為15至50rpm，更佳為15至45rpm的範圍中設定振盪速度範圍。使用翹板(Seesaw)式振盪器(例如，NS-S，AS ONE公司製)實施振盪培養時，例如，可在5至50rpm，較佳為5至40rpm，更佳為5至30rpm的範圍中設定振盪速度範圍。將細胞凝集物以攪拌培養、旋轉培養進行培養時，例如，亦可將旋轉燒瓶(例如，3152，康寧公司製)設置於磁 性攪拌器上，以目視不會觀察到細胞凝集物沈降之程度的旋轉數實施培養。亦可使用三維旋轉懸浮培養裝置(例如，CellPet CUBE，JTEC公司製；Clinostar，Celvivo公司製)實施培養。以抑制細胞摩擦等物理性障礙之觀點而言，亦較為將前述包埋於凝膠中之細胞凝集物進行振盪培養、旋轉培養或攪拌培養。
在步驟(3)及之後的步驟中，以抑制細胞死亡、促進細胞增殖之觀點而言，亦較佳為在培養基中進一步添加增殖因子。被添加之增殖因子的種類只要在可達成上述目的的限制下，則沒有特別的限定。以所述之目的使用之增殖因子可列舉：類胰島素生長因子(insulin-like growth factor：IGF)、神經成長因子(nerve growth factor：NGF)、源自腦之神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor：BDNF)、神經營養因子3、神經營養因子4/5、睫狀神經營養因子(ciliary neurotrophic factor：CNTF)、血管內皮細胞增殖因子(vesicular endothelial growth factor：VEGF)、源自色素上皮之因子(pigment epithelium-derived factor：PEDF)、肝細胞增殖因子(hepatocyte growth factor：HGF)等。該等增殖因子只要以可達成上述目的之濃度添加即可。
在步驟(3)及之後的步驟中，就抑制細胞死亡、促進細胞的增殖的觀點而言，亦較佳為將源自血小板之成長因子(Platelet-derived growth factor：PDGF)等源自血小板之成長因子受體作用物質添加於培養基中。PDGF存在有A、B、C、D四種基因，形成AA、AB，BB、CC、DD之同源(homo)或特定的組合的異二聚體作用受體進行功能。其中，在含有基板的非神經外胚層中經常表現PDGFRβ，本發明中使用的源自血小板之成長因子受體作用物質較佳為具有針對PDGFRββ或PDGFRαβ的作用。上述源自血小板之成長因子受體作用物質更佳為包含選自由PDGF-AB、PDGF-BB、PDGF-CC以及PDGF-DD所組成的 群組中之至少一個，又更佳為包含選自由PDGF-BB以及PDGF-CC所組成的群組中之至少一個。PDGF-AB、PDGF-BB、PDGF-CC以及PDGF-DD能夠作為重組蛋白質自R & D systems公司、GenScript公司等入手。
在步驟(3)及之後的步驟中，就抑制細胞死亡、促進細胞的增殖的觀點而言，亦較佳為在高氧的環境下進行培養。培養過程中的高氧條件例如：可藉由將培養細胞的培養箱(incubator)與氧氣瓶接續，人工地供給氧而實現。所述之目的中的氧濃度通常為25%至80%，更佳為30%至60%。
在步驟(3)及之後的步驟中，從增加氧供給量於培養細胞凝集物的培養基中的觀點而言，也能夠使用氣體交換效率高的培養器材。如此的培養器材之例可舉例如：細胞培養皿、將盤的底面設成氣體滲透性的膜之Lumox皿(Sarstedt股份有限公司製)、VECELL 96well plate(股份有限公司Vessel製)等。亦較佳為與前述在高氧濃度條件下之培養組合使用。
在步驟(3)及之後的步驟中，就維持細胞凝集物中之上皮組織的結構之觀點而言，亦可在培養基中添加細胞保護劑。在步驟(3)及之後的步驟中所使用的細胞保護劑可列舉：上述之FGF訊息傳導路徑作用物質、肝素、ROCK抑制物質、基底膜標品、肌凝蛋白抑制物質、多胺類、ISR抑制劑、胱天蛋白酶抑制劑、血清、及血清代替物等。肌凝蛋白抑制物質可列舉例如：屬於非肌肉型肌凝蛋白II ATP酶(ATPase)之抑制物質的布雷他汀(Blebbistatin)、屬於肌凝蛋白輕鏈激酶(MLCK)之抑制物質的ML-7、ML-9、W-7、MLCK抑制劑胜肽18及該等之衍生物等。添加之細胞保護劑可與步驟(1)所添加者相同亦可相異，較佳為相同。較佳的細胞保護劑可舉出ROCK抑制物質。在步驟(3)及之後的步驟中，添加屬於ROCK抑制物質之Y-27632作為細胞保護劑時，通常以成為10nM至 10mM，較佳為100nM至1mM，更佳為1μM至100μM的濃度之方式添加於培養環境中。添加屬於ROCK抑制物質之色烷(Chroman)1時，通常以成為10pM至1mM，較佳為100pM至100μM，更佳為1nM至10μM的濃度之方式添加於培養環境中。添加屬於非肌肉型肌凝蛋白II ATP酶之抑制物質的布雷他汀(Blebbistatin)作為細胞保護劑時，通常以成為10nM至10mM，較佳為100nM至1mM，更佳為1μM至100μM的濃度之方式添加於培養環境中。
在步驟(3)及之後的步驟中，亦可添加具有維持細胞保護劑以外的上皮組織的結構之作用的物質。如上述之物質可列舉例如：促進細胞接著之物質、促進基底膜成分的合成之物質、抑制基底膜成分的分解之物質等。促進細胞接著之物質係可為促進細胞-細胞間的接著、細胞-基底膜間的接著、細胞-培養器材間的接著等任一者，也可為促進參與細胞接著之因子的產生者。促進細胞接著之物質可列舉例如：黏接胺(Adhesamine)、黏接胺-RGDS衍生物、Pyrintegrin、生物素三肽-1(Biotin tripeptide-1)、乙醯四肽-3(Acetyl Tetrapeptide-3)、RGDS肽及該等之衍生物等。促進基底膜成分的合成之物質可舉出例如抗壞血酸衍生物等。抗壞血酸衍生物可列舉例如：抗壞血酸磷酸鈉、抗壞血酸磷酸鎂、抗壞血酸2-葡萄糖苷、3-O-乙基抗壞血酸、抗壞血酸四己基癸酸酯、棕櫚酸抗壞血酯、硬脂酸抗壞血酯、抗壞血酸-2磷酸-6棕櫚酸、抗壞血酸辛基甘油酯等。抑制基底膜成分的分解之物質可列舉例如：基質金屬蛋白酶及絲胺酸蛋白酶的抑制劑等。添加屬於促進基底膜成分的合成之物質的抗壞血酸衍生物之一的抗壞血酸2-磷酸時，通常以成為10μg/ml以上1000μg/ml以下，較佳為30μg/ml以上500μg/ml以下，又更佳為50μg/ml以上300μg/ml以下的濃度之方式添加於培養環境中。 添加其他抗壞血酸及抗壞血酸之衍生物等時，只要以成為與上述濃度同程度之莫耳當量之方式添加即可。
在步驟(3)及之後的步驟中，就促進鼻腔上皮或構成嗅上皮之細胞的生存之觀點而言，亦較佳為添加具有減輕氧化壓力之作用的物質。具有如上述般活性之物質可列舉例如：抗氧化物質、具有自由基清除(Free radical scavenger)作用之物質、NADPH氧化酶(Oxidase)抑制物質、環氧合酶(Cyclooxygenase)抑制物質、脂氧合酶(LOX)抑制物質、超氧化物歧化酶(SOD)樣物質、Nrf2活化劑等。具有如上述活性之物質可列舉例如：抗壞血酸、N-乙醯基-L-半胱胺酸、乙酸(±)-α-生育酚(Tocopherol)、香草乙酮(Apocynin)(4’-羥基-3’-甲氧基苯乙酮)、菸鹼醯胺、牛磺酸(2-胺基乙磺酸)、IM-93(1-異丙基-3-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-4-(N,N-二甲基-1,3-丙烷二胺)-1H-吡咯-2,5H-二酮)、咖啡酸(Caffeic Acid)(3,4-二羥基肉桂酸)、雷公藤紅素(Celastrol)(3-羥基-24-正(nor)-2-側氧基-1(10),3,5,7-木栓四-29-烯酸(friedelatetraen-29-oic Acid)；苦瓜素(Tripterin))、依布硒(Ebselen)(2-苯基-1,2-苯并異硒唑(benzisoselenazol)-3(2H)-酮)、(-)-表沒食子兒茶素沒食子酸酯(Epigallocatechin Gallate)((2R,3R)-2-(3,4,5-三羥基苯基)-3,4-二氫-1[2H]-苯并吡喃-3,5,7-三醇-3-(3,4,5-三羥基苯甲酸酯))、EUK-8(N,N’-雙(亞柳基胺基)乙烷-錳(II))、依達拉奉(Edaravone)(3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮)、MnTBAP(Mn(III)四(4-苯甲酸)卟啉氯化物)、降二氫癒創木酸(Nordihydroguaiaretic Acid)、白藜蘆醇(Resveratrol)(反式-3,4,5-三羥基二苯乙烯)及該等之衍生物等，但不限定為該等。亦可使用細胞培養用之調製完成的試藥(例如，抗氧化補充物(supplement)，Sigma Aldrich公司製，A1345)。本發明所用之具有減輕氧化壓力之作用的物質較佳為包含選自由抗壞血酸、N-乙醯基-L-半胱胺酸以及該等之衍生物所組成群組中之 至少1個。抗壞血酸，例如，以其衍生物之抗壞血酸2磷酸而言，可以1M至1nM，較佳為100mM至10nM，更佳為10mM至100nM，又更佳為3mM至1μM的濃度添加於培養基中。N-乙醯基-L-半胱胺酸係例如可以1nM至1M，較佳為10nM至100mM，更佳為100nM至10mM，又更佳為1μM至5mM的濃度添加於培養基中。
在步驟(3)及之後的步驟中，就促進鼻腔上皮或構成嗅上皮之細胞的生存之觀點而言，亦較佳為添加針對壓力反應訊息傳導路徑之抑制物質(抑制針對壓力之細胞內訊息傳達機構的物質)。壓力激活MAP激酶路徑(stress-activated protein kinase：SAPK)係針對壓力之細胞內訊息傳達機構之主要之一。壓力激活MAP激酶路徑的抑制劑可列舉例如：MAP3K抑制劑、MAP2K抑制劑、ASK抑制劑、MEK抑制劑、Akt抑制劑、Rho家族激酶抑制劑、JNK抑制劑、p38抑制劑、MSK抑制劑、STAT抑制劑、NF-κB抑制劑、CAMK抑制劑等。
MEK抑制劑可列舉例如：司美替尼(Selumetinib)(AZD6244,6-(4-溴-2-氯苯胺基)-7-氟-N-(2-羥基乙氧基)-3-甲基苯并咪唑-5-羧醯胺)、米達美替尼(Mirdametinib)(PD0325901，N-[(2R)-2,3-二羥基丙氧基]-3,4-二氟-2-(2-氟-4-碘苯胺基)苯甲醯胺)、曲美替尼(Trametinib)(GSK1120212，N-[3-[3-環丙基-5-(2-氟-4-碘苯胺基)-6,8-二甲基-2,4,7-三側氧基吡啶并[4,3-d]嘧啶-1-基]苯基]乙醯胺)、U0126(1,4-二胺基-2,3-二氰基-1,4-雙(2-胺基苯基硫基)丁二烯)、PD184352(CI-1040，2-(2-氯-4-碘苯胺基)-N-(環丙基甲氧基)-3,4-二氟苯甲醯胺)、PD98059(2-(2-胺基-3-甲氧基苯基)苯并哌喃-4-酮)、BIX 02189(3-[N-[3-[(二甲基胺基)甲基]苯基]-C-苯基亞胺亞甲基]-2-羥基-N,N-二甲基-1H-吲哚-6-羧醯胺)、匹馬昔替布 (Pimasertib)(AS-703026，N-[(2S)-2,3-二羥基丙基]-3-(2-氟-4-碘苯胺基)吡啶-4-羧醯胺)、培利替尼(Pelitinib)(EKB-569，(E)-N-[4-(3-氯-4-氟苯胺基)-3-氰基-7-乙氧基喹啉-6-基]-4-(二甲基胺基)丁-2-烯醯胺)、BIX 02188(3-[N-[3-[(二甲基胺基)甲基]苯基]-C-苯基亞胺亞甲基]-2-羥基-1H-吲哚-6-羧醯胺)、TAK-733(3-[(2R)-2,3-二羥基丙基]-6-氟-5-(2-氟-4-碘苯胺基)-8-甲基吡啶并[2,3-d]嘧啶-4,7-二酮)、AZD8330(2-(2-氟-4-碘苯胺基)-N-(2-羥基乙氧基)-1,5-二甲基-6-側氧基吡啶-3-羧醯胺)、比美替尼(Binimetinib)(MEK162,6-(4-溴-2-氟苯胺基)-7-氟-N-(2-羥基乙氧基)-3-甲基苯并咪唑-5-羧醯胺)、SL-327((Z)-3-胺基-3-(4-胺基苯基)硫基-2-[2-(三氟甲基)苯基]丙-2-烯腈)、瑞法替尼(Refametinib)(RDEA119，N-[3,4-二氟-2-(2-氟-4-碘苯胺基)-6-甲氧基苯基]-1-[(2S)-2,3-二羥基丙基]環丙烷-1-磺醯醯胺)、GDC-0623(5-(2-氟-4-碘苯胺基)-N-(2-羥基乙氧基)咪唑并[1,5-a]吡啶-6-羧醯胺)、BI-847325(3-[3-[N-[4-[(二甲基胺基)甲基]苯基]-C-苯基亞胺亞甲基]-2-羥基-1H-吲哚-6-基]-N-乙基丙-2-烯醯胺)、RO5126766(CH5126766，3-[[3-氟-2-(甲基胺磺醯基胺基)吡啶-4-基]甲基]-4-甲基-7-嘧啶-2-基氧基苯并哌喃-2-酮)、可比替尼(Cobimetinib)(GDC-0973，[3,4-二氟-2-(2-氟-4-碘苯胺基)苯基]-[3-羥基-3-[(2S)-哌啶-2-基]氮呾-1-基]甲酮)及該等之衍生物等。
p38抑制劑可列舉例如：SB203580(4-[4-(4-氟苯基)-2-(4-甲基亞磺醯基苯基)-1H-咪唑-5-基]吡啶)、多馬莫得(Doramapimod)(BIRB 796，1-[5-第三丁基-2-(4-甲基苯基)吡唑-3-基]-3-[4-(2-嗎啉-4-基乙氧基)萘-1-基]脲)、SB202190(FHPI，4-[4-(4-氟苯基)-5-吡啶-4-基-1H-咪唑-2-基]酚)、拉美替尼二甲磺酸鹽(Ralimetinib dimesylate)(5-[2-第三丁基-4-(4-氟苯基)-1H-咪唑-5-基]-3-(2,2-二甲基丙基)咪唑并[4,5-b]吡啶-2-胺；甲磺酸)、VX-702(6-(N-胺甲醯基-2,6-二氟苯胺基)- 2-(2,4-二氟苯基)吡啶-3-羧醯胺)、PH-797804(3-[3-溴-4-[(2,4-二氟苯基)甲氧基]-6-甲基-2-側氧基吡啶-1-基]-N,4-二甲基苯甲醯胺)、奈拉莫得(Neflamapimod)(VX-745，5-(2,6-二氯苯基)-2-(2,4-二氟苯基)硫基嘧啶并[1,6-b]噠
Figure 111124633-A0202-12-0125-57
-6-酮)、TAK-715(N-[4-[2-乙基-4-(3-甲基苯基)-1,3-噻唑-5-基]吡啶-2-基]苯甲醯胺)、PD 169316(4-[4-(4-氟苯基)-2-(4-硝基苯基)-1H-咪唑-5-基]吡啶)、TA-02(4-[2-(2-氟苯基)-4-(4-氟苯基)-1H-咪唑-5-基]吡啶)、SD 0006(1-[4-[3-(4-氯苯基)-4-嘧啶-4-基-1H-吡唑-5-基]哌啶-1-基]-2-羥基乙酮)、帕馬莫得(Pamapimod)(6-(2,4-二氟苯氧基)-2-(1,5-二羥基戊烷-3-基胺基)-8-甲基吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-酮)、BMS-582949(4-[5-(環丙基胺甲醯基)-2-甲基苯胺基]-5-甲基-N-丙基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三
Figure 111124633-A0202-12-0125-62
-6-羧醯胺)、SB239063(4-[4-(4-氟苯基)-5-(2-甲氧基嘧啶-4-基)咪唑-1-基]環己-1-醇)、斯可皮酮(Skepinone)-L(13-(2,4-二氟苯胺基)-5-[(2R)-2,3-二羥基丙氧基]三環[9.4.0.03,8]十五-1(11),3(8),4,6,12,14-六烯-2-酮)、DBM 1285(N-環丙基-4-[4-(4-氟苯基)-2-哌啶-4-基-1,3-噻唑-5-基]嘧啶-2-胺；二鹽酸鹽)、SB 706504(1-氰基-2-[2-[[8-(2,6-二氟苯基)-4-(4-氟-2-甲基苯基)-7-側氧基吡啶并[2,3-d]嘧啶-2-基]胺基]乙基]胍)、SCIO 469(2-[6-氯-5-[(2R,5S)-4-[(4-氟苯基)甲基]-2,5-二甲基哌
Figure 111124633-A0202-12-0125-63
-1-羰基]-1-甲基吲哚-3-基]-N,N-二甲基-2-側氧基乙醯胺)、皮克替尼(Pexmetinib)(1-[5-第三丁基-2-(4-甲基苯基)吡唑-3-基]-3-[[5-氟-2-[1-(2-羥基乙基)吲唑-5-基]氧基苯基]甲基]脲)、UM-164(2-[[6-[4-(2-羥基乙基)哌
Figure 111124633-A0202-12-0125-64
-1-基]-2-甲基嘧啶-4-基]胺基]-N-[2-甲基-5-[[3-(三氟甲基)苯甲醯基]胺基]苯基]-1,3-噻唑-5-羧醯胺)、p38 MAPK抑制劑(4-(2,4-二氟苯基)-8-(2-甲基苯基)-7-氧橋-1,7-萘啶-7-鎓)、p38 MAP激酶抑制劑(Kinase Inhibitor)III(4-[5-(4-氟苯基)-2-甲基氫硫基-1H-咪唑-4-基]-N-(1-苯基乙基)吡啶-2-胺)、p38 MAP激酶抑制劑IV(3,4,6-三氯-2-(2,3,5-三氯-6-羥基苯基) 磺醯基酚)、CAY105571(4-[5-(4-氟苯基)-2-[4-(甲基磺醯基)苯基]-1H-咪唑-4-基]-吡啶)及該等之衍生物等。
JNK抑制劑可舉出例如與步驟(1)所記載者同樣者。本發明所使用之抑制針對壓力之細胞內訊息傳達機構的物質較佳為選自由MEK抑制劑、p38抑制劑、及JNK抑制劑所組成群組中之一者以上。使用SB203580作為p38抑制劑時，通常可以1nM至1mM，較佳為10nM至100μM，更佳為100nM至10μM，又更佳為500nM至5μM的濃度，添加於培養基中。使用PD0325901作為MEK抑制劑時，通常可以1nM至1mM，較佳為10nM至100μM，更佳為100nM至10μM，又更佳為500nM至5μM的濃度，添加於培養基中。使用JNK-IN-8作為JNK抑制劑時，可以與步驟(1)所記載的濃度同樣的濃度，添加於培養基中。使用其他MEK抑制劑、p38抑制劑、JNK抑制劑時，較佳為以與上述抑制劑的添加濃度具有同等抑制活性之濃度進行添加。
<步驟(4)>
步驟(4)係將在步驟(3)培養之細胞進一步培養，而獲得構成鼻腔上皮之細胞。步驟(4)之一形態，係在選自由Wnt訊息傳導路徑抑制物質、FGF訊息傳導路徑作用物質及BMP訊息傳導路徑抑制物質所組成群組中之至少1個，較佳為至少2個不存在下培養細胞。步驟(4)之較佳的一形態，係在Wnt訊息傳導路徑抑制物質、FGF訊息傳導路徑作用物質及BMP訊息傳導路徑抑制物質之不存在下培養細胞。步驟(4)之一形態，係在選自由FGF訊息傳導路徑抑制物質、Shh訊息傳導路徑作用物質、BMP訊息傳導路徑作用物質、Wnt訊息傳導路徑作用物質、Notch訊息傳導路徑抑制物質、活化素/TGF-β訊息傳導路徑作用物質及視網酸訊息傳導路徑作用物質所組成群組中之至少1個之存在下培養細胞。步驟 (4)較佳為在選自由Wnt訊息傳導路徑抑制物質、FGF訊息傳導路徑作用物質及BMP訊息傳導路徑抑制物質所組成群組中之至少2個不存在下，且，在選自由FGF訊息傳導路徑抑制物質、Shh訊息傳導路徑作用物質、BMP訊息傳導路徑作用物質、Wnt訊息傳導路徑作用物質、Notch訊息傳導路徑抑制物質、活化素/TGF-β訊息傳導路徑作用物質及視網酸訊息傳導路徑作用物質所組成群組中之至少1個之存在下培養細胞。
在步驟(3)將細胞懸浮培養時，隨後在步驟(4)繼續將細胞凝集物懸浮培養即可。在步驟(3)將細胞接著培養時，隨後步驟(4)繼續將細胞接著培養即可。在步驟(3)懸浮培養後，亦可在步驟(4)進行接著培養。在步驟(3)接著培養後，亦可在步驟(4)進行懸浮培養。
在步驟(4)中為了在選自由Wnt訊息傳導路徑抑制物質、FGF訊息傳導路徑作用物質及BMP訊息傳導路徑抑制物質所組成群組中之至少1個的不存在下進行懸浮培養，必須將可添加在步驟(3)中之上述物質從培養環境中去除。為此之操作可列舉例如：半量培養基交換操作、全量培養基交換操作。可將上述之培養基交換操作以1天複數次，較佳為1小時以內複數次(例如，2至3次)進行。進行複數次培養基交換操作時之最終回，除了進行步驟(4)之後之培養的培養基以外，就減低細胞培養所花費之費用的觀點而言，例如，可使用生理食鹽水、以及不含KSR及增殖因子等添加物之培養基等。
用以在選自由Wnt訊息傳導路徑抑制物質、FGF訊息傳導路徑作用物質及BMP訊息傳導路徑抑制物質所組成群組中之至少1個的不存在下進行懸浮培養之其他操作可舉出：將細胞回收至其他滅菌完成的容器(15ml試管，懸浮培養用玻璃培養皿等)，以培養基或生理食鹽水等洗淨後，移動至上述物質中 之至少1個不存在下之培養環境中。此時移設後之培養所使用的培養容器，係可為與至步驟(3)為止所使用者為相同之物(96孔盤等)，亦可為其他容器(懸浮培養用皿等)。
在步驟(4)中，當實施在選自由Wnt訊息傳導路徑抑制物質、FGF訊息傳導路徑作用物質及BMP訊息傳導路徑抑制物質所組成群組中之至少1個不存在下的懸浮培養時，就迴避培養基交換操作或細胞凝集物之移設操作的繁雜度之觀點而言，亦較佳為使用可以各孔內置入有細胞凝集物之狀態，直接將盤全體之培養基交換一次的三維細胞培養容器。
在步驟(4)中，藉由將步驟(3)所得到之細胞，在選自由Wnt訊息傳導路徑抑制物質、FGF訊息傳導路徑作用物質及BMP訊息傳導路徑抑制物質所組成群組中之至少1個不存在下進行懸浮培養，可獲得上呼吸道樣組織的形成效率經提升，構成鼻腔上皮之細胞的比率經提升之細胞集團。
就上呼吸道樣組織之形成效率及構成鼻腔上皮之細胞之增殖的促進之觀點而言，步驟(4)的開始時期較佳為在產生一定程度之非神經上皮細胞的分化後實施，具體的時期可為從步驟(3)開始0.5小時以後60天以內，較佳是24小時以後45天以內，更佳為3日以後30天以內。
步驟(4)中的培養期間係可適當地設定。步驟(4)中的培養的時間通常為8小時至200天左右，較佳為10小時至180天左右，更佳為12小時至150天左右，又更佳為14小時至120天左右，最佳為20天至100天左右。
就鼻腔上皮樣組織中之細胞的分化傾向的調節之觀點而言，步驟(4)亦較佳為在FGF訊息傳導路徑抑制物質之存在下進行。FGF訊息傳導路徑抑制物質只要是可抑制由FGF媒介之訊息傳達者，則沒有特別的限制，可為核酸、 蛋白質、低分子有機化合物中之任一者。該物質可列舉例如：與FGF直接結合並捕獲之物質、抑制FGF受體之激酶活性的物質、抑制由FGF活化之細胞內訊息傳達的物質、抑制由FGF刺激所誘導之基因表現的物質等。具有如上述般作用之物質可列舉例如：抗FGF抗體、GP369(抗FGFR2抗體)、SU5402(3-[4-甲基-2-[(2-側氧基-1H-吲哚-3-亞基)甲基]-1H-吡咯-3-基]丙酸)、BGJ398(3-(2,6-二氯-3,5-二甲氧基苯基)-1-[6-[[4-(4-乙基哌
Figure 111124633-A0202-12-0129-65
-1-基)苯基]胺基]嘧啶-4-基]-1-甲基脲)、PD173074(1-(第三丁基)-3-(2-((4-(二乙基胺基)丁基)胺基)-6-(3,5-二甲氧基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-基)脲)、AZD4547(rel-N-[5-[2-(3,5-二甲氧基苯基)乙基]-1H-吡唑-3-基]-4-[(3R,5S)-3,5-二甲基-1-哌
Figure 111124633-A0202-12-0129-66
基]苯甲醯胺)、厄達替尼(Erdafitinib)(N-(3,5-二甲氧基苯基)-N-(1-甲基乙基)-N-[3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)喹
Figure 111124633-A0202-12-0129-67
啉-6-基]乙烷-1,2-二胺)、BYL719((2S)-N1-[4-甲基-5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基乙基)-4-吡啶基]-2-噻唑基]-1,2-吡咯烷二羧醯胺)、GSK2636771(2-甲基-1-[[2-甲基-3-(三氟甲基)苯基]甲基]-6-(4-嗎啉基)-1H-苯并咪唑-4-羧酸)、他利昔布(Taselisib)(2-甲基-2-[4-[2-(5-甲基-2-丙烷-2-基-1,2,4-三唑-3-基)-5,6-二氫咪唑并[1,2-d][1,4]苯二氮呯-9-基]吡唑-1-基]丙醯胺)、卡帕塞替(Capivasertib)(4-胺基-N-[(1S)-1-(4-氯苯基)-3-羥基丙基]-1-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-4-哌啶羧醯胺)、沙帕塞替(Sapanisertib)(2-(((1R,4R)-4-((((4-氯苯基)(苯基)胺甲醯基)氧基)甲基)環己基)甲氧基)乙酸)、達拉非尼(Dabrafenib)(N-[3-[5-(2-胺基-4-嘧啶基)-2-(第三丁基)-4-噻唑基]-2-氟苯基]-2,6-二氟苯磺醯胺)、比美替尼(Binimetinib)(5-[(4-溴-2-氟苯基)胺基]-4-氟-N-(2-羥基乙氧基)-1-甲基-1H-苯并咪唑-6-羧醯胺)、曲美替尼(Trametinib)(N-[3-[3-環丙基-5-[(2-氟-4-碘苯基)胺基]-3,4,6,7-四氫-6,8-二甲基-2,4,7-三側氧基吡啶并[4,3-d]嘧啶-1(2H)-基]苯基]乙醯胺)及該等之衍生物等。
FGF訊息傳導路徑抑制物質的濃度，係能夠在可有效率地製造構成鼻腔上皮之細胞的範圍中適當地設定。使用SU5402作為FGF訊息傳導路徑抑制物質時，步驟(4)中的FGF訊息傳導路徑抑制物質的濃度通常為1nM至100mM，較佳為10nM至10mM，更佳為100nM至1mM。使用PD173074作為FGF訊息傳導路徑抑制物質時，步驟(4)中的FGF訊息傳導路徑抑制物質的濃度係1nM至100mM，較佳為10nM至10mM，更佳為100nM至1mM。使用上述以外的FGF訊息傳導路徑抑制物質時，較佳為使用與上述濃度的SU5402顯示出同等FGF訊息傳導路徑抑制活性之濃度。
就鼻腔上皮樣組織中之細胞的分化傾向的調節之觀點而言，步驟(4)亦較佳為於BMP訊息傳導路徑作用物質之存在下進行。步驟(4)所使用之BMP訊息傳導路徑作用物質，係可與步驟(2)所使用之物質相同一亦可相異，較佳為相同。
就鼻腔上皮樣組織中之細胞的分化傾向的調節之觀點而言，步驟(4)亦較佳為近一步在選自由Shh訊息傳導路徑作用物質、Wnt訊息傳導路徑作用物質、Notch訊息傳導路徑抑制物質、活化素/TGF-β訊息傳導路徑作用物質及視網酸訊息傳導路徑作用物質所組成群組中之至少1個存在下進行。步驟(4)中所使用之上述物質，係可與步驟(a)至步驟(3)所使用之物質相異，較佳為相同。關於添加物的濃度及種類係可適當地調整。
就步驟(4)之其他一態樣而言，係可在步驟(3)細胞凝集物中分化出嗅神經前驅細胞為止進行懸浮培養，在步驟(4)繼續進一步培養，而獲得嗅神經前驅細胞所存在之上皮、以及在連續之相同上皮上構成鼻腔上皮之細胞。更佳為，實施至步驟(3)為止，將細胞凝集物中的非神經上皮組織中形成有嗅神經細 胞及嗅上皮組織之細胞凝集物，作為步驟(4)而實施進一步的培養，藉此在非神經上皮組織中形成構成鼻腔上皮之細胞。此時之培養基可使用不含Wnt訊息傳導路徑抑制物質、FGF訊息傳導路徑作用物質及BMP訊息傳導路徑抑制物質之培養基，也可使用與步驟(3)相同之培養基。
企圖使細胞集團與病原體接觸及形成疾病模型時，亦可在步驟(3)之後進行細胞集團與病原體的接觸。細胞集團與病原體之接觸，係可在不含有選自由Wnt訊息傳導路徑抑制物質、FGF訊息傳導路徑作用物質及BMP訊息傳導路徑抑制物質所組成群組中之至少1個的培養基中進行，也可在與步驟(3)相同之培養基中進行。
步驟(4)中所使用的培養基沒有特別的限定，可使用與步驟(1)至步驟(3)所使用之培養基相同的培養基。也可使用在神經細胞等之培養中已知的培養基，例如，在DMEM/F-12培養基與Neurobasal培養基之1：1混合液中添加有0.5% N2補充物及1% B27補充物之培養基(N2B27培養基)、在Knockout DMEM/F-12培養基中添加有StemPro NSC SFM補充物之培養基(StemPro NSC SFM培養基)、中樞神經系類器官用之培養基(STEMdiff Cerebral Organoid Maturation Kit)、上皮細胞培養用之培養基(PneumoCult ALI medium、CnT-Prime、Epithelial Culture Medium)等。
在步驟(4)中，亦較佳為繼續添加上述步驟之任一步驟中用過的添加物，例如，TGFβ訊息傳導路徑抑制物質、EGF訊息傳導路徑作用物質、具有減輕氧化壓力之作用的物質、針對壓力反應訊息傳導路徑之抑制物質等。在步驟(4)添加之該等物質，係分別可與上述步驟之任一步驟中所使用之物質相同亦可相異，較佳為相同。關於添加物的濃度及種類係可適當地調整。
就上皮組織的成熟促進之觀點而言，步驟(4)中較佳為進一步存在血清。血清沒有特別的限定，可使用在細胞培養中通常被使用的血清。培養基中的血清的濃度，只要在可達成上述效果的範圍內，則沒有特別的限定，例如約1%至20%，較佳為約3%至約15%。
就迴避異種成分及未確定因子的混入之觀點而言，較佳為將步驟(1)至步驟(4)所組成群組中之至少1個步驟，在源自小鼠肉瘤之基底膜標品(基質膠)的不存在下進行。就上皮組織的成長促進之觀點而言，步驟(3)及步驟(4)可在基質膠之存在下進行。培養基中的基底膜標品的濃度，在使用基質膠時，較佳為0.5%以上4%以下，就實驗操作之觀點而言，更佳為0.5%以上1.5%以下。
以生體組織間之相互作用模式或類組裝體的形成為企圖，包含構成鼻腔上皮之細胞或其前驅細胞之細胞凝集物，係可與其他細胞凝集物或組織同時地進行培養。藉此，可形成包含二個以上細胞塊之細胞集團、或包含細胞塊及組織之細胞集團。同時地進行培養之對象，係可為源自生體之組織，亦可為源自培養細胞或幹細胞的細胞凝集物。同時地進行培養之對象較佳為源自幹細胞的細胞凝集物，又更佳為具有將生體內組織一定程度再現之結構之類器官。同時地進行培養之組織係可為源自任意動物種者，較佳為源自之組織。同時地進行培養之組織可為生體的任意組織，較佳為中樞神經系統組織，更佳為包含嗅覺區(嗅球及嗅皮質)之中樞神經系統組織。就其他一態樣而言，同時地進行培養之組織較佳為嗅上皮及鼻腔上皮以外的呼吸器系統組織，可為包含咽喉、氣管、支氣管及肺之任一者的呼吸器系統組織。就其他一態樣而言，同時地進行培養之組織，較佳為對感染鼻腔上皮或嗅上皮之病原體或病毒具有感染感受性之組織，可為中樞神經系統、血管、腎臟、肝臟、小腸或大腸。同時地進行培養之細胞凝集 物較佳為包含構成上述組織之細胞。同時地進行培養之對象，亦可為包含構成上述組織之細胞或其細胞的細胞集團。
同時培養之方法可列舉：在可產生細胞凝集物彼此或細胞凝集物與組織之接著的腔室(compartment)內，投入藉由本發明之製造方法所製造出的細胞凝集物及其他細胞凝集物或組織之方法；將細胞凝集物彼此或細胞凝集物與組織以凝膠等材料接觸之狀態進行固定之方法；將細胞凝集物彼此或細胞凝集物與組織以蓋玻片(Cover glass)等按壓著的狀態進行培養方法；及將不同種類的細胞凝集物分散為各個單細胞後，在同一腔室內使該等進行再凝集之方法等，但未特別的限定。亦可將使用Stem Cell Reports 2017，9，1441-1449.所記載之方法等並藉由本發明之製造方法所製造之細胞凝集物與中樞神經系之組織同時地進行培養，藉此再現嗅神經的投射。
[3.包含構成鼻腔上皮之細胞或其前驅細胞之細胞集團]
本發明中，「細胞」以及「組織」之記載係能夠藉由利用分別與存在於生體內所對應的細胞以及組織同樣標記進行之免疫染色、形狀觀察及其他特定的方法確認其存在，但「細胞」以及「組織」的功能、基因表現、結構等不限於必須與存在於生體內的細胞以及組織相同。
本發明之一實施形態係提供包含構成鼻腔上皮之細胞或其前驅細胞之細胞集團。細胞較佳為三維培養細胞集團。三維培養細胞集團係2個以上細胞集合，形成立體結構。細胞集團係人工地形成之細胞的集團，具有一定的細胞種類、細胞數、形狀及構成。構成本發明之細胞集團之細胞數沒有特別的限定，較佳為30個以上，更佳為500個以上。構成上述細胞集團之細胞數的上限沒有特別的限定，例如可為1×107個以下，亦可為5×106個以下。本發明之細胞集團 之形狀沒有特別的限定，可為球狀、橢圓狀、片狀、一部分摺疊成之褶皺之片狀、一部分經收縮之片狀、內部為空洞(袋狀)狀。本發明之細胞集團較佳為可包含藉由上述之構成鼻腔上皮之細胞的製造方法所製造出的細胞。
以下，將本發明之細胞集團適當地使用圖1、圖2及圖3進行說明。將本發明之細胞集團之一形態示於圖1之A至J及圖41。圖1之A之細胞集團係包含非神經上皮組織及神經組織。圖1所示之細胞集團係三維地形成，通常不與培養器材接著。神經組織較佳為形成球狀。神經組織的表面至少一部分係可被非神經上皮組織被覆。非神經上皮組織係含有包含構成鼻腔上皮之細胞或其前驅細胞之鼻腔上皮樣組織(圖中，以四角點線包圍住的部分)。神經組織的表面較佳為3成以上(圖1之B)，更佳為6成以上，又更佳為8成以上，最佳為全體被非神經上皮組織被覆。非神經上皮組織與神經組織之間的表面至少一部分中亦可形成間隙(圖1之C)。非神經上皮組織亦可經菲薄化(圖1之C)。非神經上皮組織之一部分亦可形成經收縮之結構(圖1之D)。表面之非神經上皮組織可存在隆起，隆起部分亦可成為袋狀(圖1之E)。再者，隆起係可為折疊的褶皺狀。非神經上皮組織係除了鼻腔上皮樣組織以外，亦可包含嗅上皮樣組織(圖1之F)。神經組織之一部分係可被非神經上皮組織被覆，非神經上皮組織的一部可為嗅上皮樣組織(圖1之G)。非神經上皮組織係可在相同上皮組織上具有複數個嗅上皮樣組織及鼻腔上皮樣組織。細胞集團係可具有上述特徵之組合。
就細胞集團之其他一形態而言，神經組織係可不被非神經上皮組織被覆，但神經組織與非神經上皮組織呈現連接或連結之形態(圖1之H、I)。複數個神經組織與複數個非神經上皮組織亦可集合。非神經上皮組織係可產生 彎曲且複雜的隆起(圖1之H)，也可呈現藉由薄的(例如，非神經上皮組織之直徑五分之一以下的厚度)上皮所構成之膨脹的氣球狀(袋狀)的形態(圖1之I)。
就細胞集團之其他一形態而言，神經組織與非神經上皮組織係分離(圖1之J)。包含構成鼻腔上皮之細胞或其前驅細胞之細胞集團，係可指分離的非神經上皮組織。神經組織係例如至少8成的細胞由神經系細胞構成，非神經上皮組織係例如至少8成的細胞由非神經細胞構成。非神經上皮組織係如上述般上皮產生彎曲且複雜的隆起，或呈現氣球狀的形態。
就細胞集團之其他一形態而言，嗅上皮樣組織的一部分係可向細胞塊的內部陷入，形成嗅窩樣的結構(圖41之A及B)。形成嗅窩樣的結構之嗅上皮樣組織較佳為包含嗅神經細胞。形成嗅窩樣的結構之嗅上皮樣組織，係較佳為形成在與非神經上皮組織，更佳為鼻腔上皮組織連續之同一上皮上。形成嗅窩樣的結構之嗅上皮樣組織與非神經上皮組織，更佳為鼻腔上皮組織之接合部中，可形成嗅上皮周緣部樣結構。
細胞集團係可為平面狀之培養細胞集團。細胞集團之其他一形態係在培養器材上平面地形成，包含神經組織及非神經上皮組織。在細胞集團的外緣部形成非神經上皮組織，在內側形成神經組織(圖2之A)。神經組織及非神經上皮組織係分別可由1層細胞形成，亦可由多層(例如，2層至6層)細胞形成。細胞集團之形狀只要在可於培養器材上展開的限制下，則可為任意的形態。較佳為，在細胞集團與培養器材之間形成基底膜結構。本實施形態之其他側面中，上述細胞集團，係可理解為構成鼻腔上皮之細胞或其前驅細胞與培養器材接著，藉由連續的上皮結構形成二維的鼻腔上皮樣組織(以下，亦有記載為「二維類器官」之情形)。
細胞集團之其他一形態，係在微流體晶片上平面地形成，包含神經組織及非神經上皮組織(圖2之B)。微流體晶片係具有流路，進行培養基的灌流。微流體晶片，係可與含有本發明之細胞集團以外的細胞或組織的晶片藉由流路而接續(圖2之C)。被接續之晶片所含有之細胞或組織可列舉例如構成下列之細胞或組織等：咽喉、氣管、支氣管、及肺等呼吸器系統組織；包含腦之中樞神經系統、肝臟、血管、腎臟、口腔上皮、胃、小腸、大腸、以及、生殖器等，但不限定於該等。被接續之晶片所含有之細胞或組織較佳為人類細胞，但以再現由動物向人類之感染症傳播為目的時，亦可與含有人類以外的細胞或組織的晶片接續。
細胞集團之其他一形態，係在施以微樣式的培養器材上平面地形成，包含神經組織及非神經上皮組織(圖2之D)。培養器材上之微樣式係由細胞接著性區域及細胞非接著性區域構成，細胞集團係在細胞接著性區域形成。
細胞集團之其他一形態係在具有物質滲透性之多孔質膜上平面地形成，包含神經組織及非神經上皮組織(圖2之E)。多孔質膜係在培養液中，或與培養液相接。本發明之細胞集團之上部係可被培養液被覆，或與氣相相接。在以多孔質膜隔開的一邊培養本發明之細胞，在另一邊培養其以外的細胞或組織、餵養細胞等。
細胞集團之其他一形態，係二個以上之細胞塊的集合體，且至少1個之細胞塊係包含構成鼻腔上皮之細胞或其前驅細胞(圖3之A)。至少1個細胞塊係可包含構成鼻腔上皮之細胞或其前驅細胞、及構成嗅上皮之細胞或其前驅細胞，亦可為圖1所例示之細胞集團。細胞塊之集合體中，包含構成鼻腔上皮之細胞或其前驅細胞之細胞塊以外之細胞塊，係可為包含構成其他組織之細胞 的細胞塊。其他組織可為神經組織，較佳為包含中樞神經系統的細胞，更佳為包含構成含有嗅覺區(包含嗅球及嗅皮質)的中樞神經系統之細胞。包含構成鼻腔上皮之細胞或其前驅細胞之細胞塊、及包含其他組織之細胞塊，較佳為以細胞間接著或神經細胞間的突觸結合等功能性地連結。就細胞集團之其他一形態而言，包含其他組織之細胞塊，係包含嗅上皮及鼻腔上皮以外的呼吸器系統的細胞或組織(圖3之B)。細胞塊之集合體較佳為設置於用以促進細胞塊彼此的接著之腔室內，或包埋於凝膠中。
細胞集團之其他一形態係可為細胞塊及構成其他組織之細胞的集合體(圖3之C)。細胞塊係包含構成鼻腔上皮之細胞或其前驅細胞，也可進一步包含構成嗅上皮之細胞或其前驅細胞，也可為圖1所例示之細胞集團。構成其他組織之細胞沒有特別的限定，可包含中樞神經系統的細胞，也可包含構成含有嗅覺區之中樞神經系統的細胞，亦可包含嗅上皮及鼻腔上皮以外的呼吸器系統的細胞。細胞塊及其他細胞，係可以細胞間接著或突觸結合等連結。
<非神經上皮組織>
本發明之細胞集團係包含非神經上皮組織。本說明書中，非神經上皮組織係指具有上皮結構之組織，且不含神經上皮組織者。所謂上皮結構係指細胞彼此藉由細胞間結合而連接，形成層之結構。層可為單層，亦可為多層。再者，上皮結構的一部分可為多層。本發明之細胞集團中，非神經上皮組織較佳為5成以上9成以下，更佳為8成以上10成以下，最佳為全體(10成)具有上皮結構。
非神經上皮組織係包含構成鼻腔上皮之細胞或其前驅細胞。構成鼻腔上皮之細胞可列舉：分泌細胞、纖毛細胞、棒狀細胞、基底細胞、鹽細胞、 神經內分泌細胞、孤立性化學感受上皮細胞等。構成鼻腔上皮之細胞係包含該等之細胞的至少1種，較佳為包含複數種細胞。
鼻腔上皮係主要源自外胚層性的非神經上皮，因此，構成鼻腔上皮之細胞或其前驅細胞較佳為表現外胚層標記。所謂構成鼻腔上皮之細胞的前驅細胞係指成熟時成為構成鼻腔上皮之細胞的細胞，亦包含具有分化成構成鼻腔上皮之細胞之能力的細胞。
構成鼻腔上皮之細胞較佳為包含分泌細胞。分泌細胞或其前驅細胞係可定義為表現選自由黏液素1、黏液素2、黏液素3、黏液素4、黏液素5AC、黏液素5B、FoxA1、FoxA2、Nkx2.1/TTF-1及SPDEF所組成群組中之至少1個，較佳是表現FoxA1、FoxA2、Nkx2.1/TTF-1及SPDEF之細胞。
構成鼻腔上皮之細胞較佳為包含纖毛細胞。纖毛細胞係在細胞表面具有纖毛結構。纖毛細胞或其前驅細胞較佳是可定義為表現選自由FoxJ1、FoxN4、p73、乙醯基化微管蛋白及β4微管蛋白所組成群組中之至少1個之細胞及/或在細胞表面具有纖毛之細胞。
構成鼻腔上皮之細胞較佳為包含棒狀細胞。棒狀細胞或其前驅細胞係可定義為表現選自由SCGB1A1、SCGB3A2、Cyp2f2、uroplakin3a、Cldn10、Aox3、Pon1及Cckar所組成群組中之至少1個的細胞。棒狀細胞亦可包含表現選自由細胞角蛋白4及細胞角蛋白13中之至少1個的Hillock細胞。
構成鼻腔上皮之細胞較佳為包含基底細胞。基底細胞係位於非神經上皮組織的基底面，較佳為在基底膜結構上整列。基底細胞或其前驅細胞較佳是可定義為表現選自由細胞角蛋白5、細胞角蛋白14、細胞角蛋白15、p63、△Np63及p75所組成群組中之至少1個的細胞。
構成鼻腔上皮之細胞較佳為包含鹽細胞。鹽細胞或其前驅細胞係可定義為表現CFTR，較佳是表現選自由Foxi1、液胞型質子ATP酶(液泡(vacuolar)H+-ATP酶、V-ATP酶)、Ascl3、Tfcp2l1及DMRT2所組成群組中之至少1個的細胞。
構成鼻腔上皮之細胞較佳為包含神經內分泌細胞。神經內分泌細胞或其前驅細胞係可定義為表現選自由Ascl1、NeuroD1、嗜鉻粒蛋白A、突觸素、神經特異烯醇化酶(NSE)所組成群組中之至少1個的細胞。
構成鼻腔上皮之細胞較佳為包含孤立性化學感受上皮細胞。孤立性化學感受上皮細胞或其前驅細胞係可定義為表現選自由ChAT/Trpm5、Pou2f3/Skn-1a、Tas2r、Gnat3、Plcb2所組成群組中之至少1個的細胞。
將細胞集團之鼻腔上皮樣組織的放大圖示於圖4。構成鼻腔上皮之細胞或其前驅細胞係可存在於與神經組織相接之非神經上皮組織(圖4之A)、不與神經組織相接之非神經上皮組織(圖4之B)、收縮後之非神經上皮組織(圖4之C)、經菲薄化之非神經上皮組織(圖4之D)之任一者中。構成鼻腔上皮之細胞或其前驅細胞較佳為以細胞種類集合。例如，構成鼻腔上皮之細胞或其前驅細胞較佳是每個細胞種類有2個以上細胞是連續的。
非神經上皮組織亦可包含細胞外基質。非神經上皮組織較佳為更包含基底膜結構。基底膜結構較佳為形成於非神經上皮組織與神經組織之間(圖1之A)。基底膜結構亦可形成於培養器材與細胞集團，尤其是，培養器材與非神經上皮組織之間(圖2)。較佳為在基底膜結構上，接著非神經上皮組織所含有之細胞。所謂基底膜結構，係指由細胞外基質構成之薄膜狀的結構，可藉由層連結蛋白的免疫染色進行判斷。基底膜結構較佳為可提供與生體內之基底膜同樣的 非神經上皮組織的結構之維持、非神經上皮組織與神經組織或培養器材之機械性分離、物質的選擇性滲透等。亦較佳為伴隨著基底膜結構的形成，非神經上皮組織具有頂端面及基底面之極性。細胞集團具有三維結構(例如，球狀)時，較佳為細胞集團的外側(表面側)為頂端面，內側為基底面。細胞集團為平面狀時，較佳為培養器材側為基底面，與培養器材相反之側(表面側)為頂端面。非神經上皮組織較佳為在基底側包含基底細胞(圖4之E)。
構成鼻腔上皮之細胞或其前驅細胞較佳為表現與感染症相關之因子，例如，病毒受體、病毒感染相關因子、樣式辨識受體(圖4之F)。病毒受體、病毒感染相關因子可為後述之感染鼻腔上皮之病毒的受體或病毒感染相關因子，例如包含ACE2、唾液酸α2,6Gal、唾液酸α2,3Gal等。
構成鼻腔上皮之細胞或其前驅細胞，係可病毒感染相關因子或者是疾病相關基因缺失或變異。包含如此之細胞之細胞集團，係可例如利用於後述之再生醫療用途的移植用細胞、疾病模型、化合物篩選等中。病毒感染相關因子係例如包含病毒受體，包含ACE2。藉由使病毒感染相關因子缺失或變異，可期待具有對病毒感染之抵抗性。
疾病相關基因係例如與遺傳性疾病或感染症相關之基因。基因缺失或變異之構成鼻腔上皮之細胞或其前驅細胞，係可從由遺傳病的患者建立或施以基因體編集的多能性幹細胞使其分化而獲得。疾病可列舉例如：囊腫性纖維化症(Cystic Fibrosis)、纖毛功能不全症候群、Kartagener氏症候群、黏多醣症、氣喘。其他態樣的疾病相關基因係與鼻腔或上呼吸道的癌症及腫瘤發生相關之基因。如此之疾病相關基因可列舉例如：ABL1、BRAF、DDR、EGFR、EPHA2、ERBB2、ERBB4、FGFR1、FGFR2、FLT1、FLT4、FRK、KDR、KIT、MAPK11、 PDGFRA、PDGFRB、RAF1、RET、TEK、TRNAK2、VEGFA、VEGFB、VEGFC、TP53、CDKN2A、PIK3CA、PTEN、KMT2D、FBXW7、SMARCB1、PREX2、ARID1A、FANCA、IDH2、PRKDC、HRAS、NOTCH2、NOTCH1、NF1、TSC2、EPHA7、CDKN2B、ATRX、ARID2、AKT3、BRCA2、BCL6、ASXL1、AR、及ALK等，但不限定於該等。亦可從鼻腔或上呼吸道組織之正常部及病變部採取細胞，建立iPS細胞，調製本案所記載之構成鼻腔上皮之細胞或其前驅細胞。
細胞集團係除了構成鼻腔上皮之細胞或其前驅細胞以外，亦可包含嗅上皮樣組織。嗅上皮樣組織係包含於非神經上皮組織，較佳為被覆神經組織的表面至少一部分。嗅上皮樣組織係指表現在嗅上皮或其前驅組織(嗅上皮基板)所表現之選自由Six1、Sp8、Sox2、Sox3、Dlx5、Emx2、Pax6、Otx2、PDGFRβ、細胞角蛋白、EpCAM、E-黏附蛋白及N-黏附蛋白所組成群組中之至少1個的區域，較佳為表現Otx2、Sp8、Sox2、EpCAM、E-黏附蛋白及細胞角蛋白。嗅上皮樣組織亦可為上皮組織在非神經上皮組織的外側增厚。
細胞集團也可包含嗅神經細胞或其前驅細胞。嗅神經細胞或其前驅細胞較佳為包含於嗅上皮樣組織。嗅神經細胞或其前驅細胞係可定義為表現屬於神經系細胞之標記的選自由Tuj1、NCAM、N-黏附蛋白、鈣網膜蛋白所組成群組中之至少1個，及於嗅神經細胞或其前驅細胞特異性表現之屬於轉錄因子之選自由Ebf1、Ebf2、Ebf3、NeuroD、Lhx2、Ascl1所組成群組中之至少1個的細胞。嗅上皮樣組織所含有之嗅神經細胞較佳為表現嗅覺受體，更佳為可與侷限在生體內的嗅上皮之嗅神經細胞同樣地接收嗅覺情報，向中樞神經系統傳達情報。所謂嗅神經細胞的前驅細胞係成熟時成為嗅神經細胞之細胞，亦包含具有 分化成嗅神經細胞之能力的細胞。嗅神經細胞的前驅細胞較佳是與存在於嗅上皮基板之神經細胞顯示同樣的性質。
嗅上皮樣組織可更包含構成嗅上皮之細胞或其前驅細胞，較佳為更包含選自由支持細胞、基底細胞及鮑氏腺細胞、以及該等之前驅細胞所組成群組中之至少2種細胞，更佳為包含基底細胞或其前驅細胞。支持細胞或其前驅細胞係指表現選自由HIF2α、Sox2、Hes1、Hes5及Six1所組成群組中之至少1個的細胞。基底細胞或其前驅細胞係指表現選自由p63，Wt1及Lgr5所組成群組中之至少1個的細胞。鮑氏腺細胞或其前驅細胞係指表現選自由細胞角蛋白及Ascl3所組成群組中之至少1個的細胞。嗅上皮樣組織較佳為更包含嗅神經鞘細胞或其前驅細胞。嗅神經鞘細胞或其前驅細胞係指表現選自由S100、Sox10及波形蛋白所組成群組中之至少1個的細胞。嗅神經鞘細胞或其前驅細胞之標記亦可使用例如：Brain Structure and Function 222.4(2017)：1877-1895.所記載之標記。支持細胞、基底細胞、鮑氏腺細胞或者嗅神經鞘細胞或該等之前驅細胞，較佳為與存在於生體內之嗅上皮或嗅上皮基板的支持細胞、基底細胞、鮑氏腺細胞或者嗅神經鞘細胞或該等之前驅細胞顯示同樣的性質。
非神經上皮組織中，所謂構成鼻腔上皮之細胞或其前驅細胞所存在之鼻腔上皮樣組織及嗅上皮樣組織，亦較佳為形成於連續的上皮上。亦較佳為在構成鼻腔上皮之細胞或其前驅細胞所存在之區域與嗅上皮樣組織之間，形成嗅上皮周緣部(圖1之F及G)。嗅上皮周緣部係指表現Pbx、Meis1、Pax6、βIVtubulin所組成群組中之至少1個，較佳為表現Pax6及Pbx之細胞所局限於之區域。
<神經組織>
細胞集團之一實施形態係包含神經系細胞或其前驅細胞，較佳為包含構成中樞神經系統之神經系細胞或其前驅細胞。細胞集團之一實施形態係包含含有神經系細胞或其前驅細胞之神經組織。神經組織較佳為包含構成中樞神經系統之神經系細胞或其前驅細胞。構成中樞神經系統之神經系細胞或其前驅細胞，係可定義為表現選自由Pax6、Bf1、Sp8、Sox1、Sox2、Emx2、Tuj1、N-黏附蛋白所組成群組中之至少1個，且不表現細胞角蛋白之細胞。構成中樞神經系統之神經系細胞或其前驅細胞較佳為表現Pax6、Sox2及Tuj1。構成中樞神經系統之神經系細胞或其前驅細胞，係較佳為與生體內之中樞神經系中的神經細胞、神經膠細胞、神經幹細胞等或該等之前驅細胞顯示同樣的性質。
神經組織係可為表面至少一部分被非神經上皮組織被覆。神經組織可形成上皮結構。上皮結構可在神經組織的一部形成，亦可在全體形成。亦可在非神經上皮組織與神經組織之間的表面至少一部分形成間隙。
神經系細胞或其前驅細胞較佳為包含夠仇視網膜之神經系細胞或其前驅細胞。構成視網膜之神經系細胞或其前驅細胞係可定義為表現選自由Rax、Six3、Chx10、Pax6、Lhx2、Aldh1a3所組成群組中之至少1個的細胞。構成視網膜之神經系細胞或其前驅細胞較佳為Rax及Chx10。構成視網膜之神經系細胞或其前驅細胞較佳為與生體內之視網膜細胞、視網膜前驅細胞、視網膜特異性神經細胞等或該等之前驅細胞顯示同樣的性質。
中樞神經系統較佳為包含大腦。大腦(包含構成大腦之細胞)係指表現選自由Emx家族基因、Otx2、Bf1及Pax6所組成群組中之至少1個的組織。再者，大腦較佳為具有層結構。大腦較佳為包含嗅皮質。嗅皮質係指表現選自由Tbr1、Ctip2及FoxP2所組成群組中之至少1個的組織。大腦較佳為包含大腦基 底核或其原基。大腦基底核或其原基係指表現選自由Dlx家族基因、Gsh2、Nkx2.1及Islet1所組成群組中之至少1個的組織。大腦基底核或其原基較佳為外側基底核原基。外側基底核原基係指表現選自由Er81及Islet1所組成群組中之至少1個的組織。大腦較佳為包含嗅球或其前驅組織。嗅球或其前驅組織係指表現選自由Arx、Tbr1及Tbx21所組成群組中之至少1個的組織。
細胞集團亦可包含釋放性腺刺激賀爾蒙之賀爾蒙陽性神經細胞。釋放性腺刺激賀爾蒙之賀爾蒙陽性神經細胞，係指表現釋放性腺刺激賀爾蒙之賀爾蒙(GnRH)的細胞及其前驅細胞。
與生體的鼻腔組織不同，本發明之細胞集團係通常不形成骨頭組織，但細胞集團中可包含骨頭組織。骨頭組織、骨細胞或其前驅細胞較佳為表現選自由Runx2、Osterix及ATF所組成群組中之至少1個。所形成之細胞集團中是否形成有骨頭組織，係可藉由所屬技術領域具有通常知識者所周知的方法，例如，茜素紅(Alizarin red)染色、鹼性磷酸酶染色、或針對上述骨頭組織特異性基因的免疫染色等手法而判別。
關於檢測所製造之細胞集團中含有的細胞及組織之手法沒有特別的限定，較佳為信賴性及再現性高且可簡便地實施之手法。就一例而言可列舉：以顯微鏡進行之光學性觀察、使用針對各細胞或組織標記的抗體之免疫染色、針對標記基因之即時PCR法(real time PCT)等的基因表現解析、單細胞RNA-Seq解析、以電子顯微鏡進行之細胞種特異性微細結構物的觀察、對小鼠或大鼠等之移植等，較佳為使用針對上述記載的標記之體的免疫染色或單細胞RNA-Seq解析。
免疫染色結果之解釋，係可藉由所屬技術領域具有通常知識者以目視進行之判別，或針對拍攝之影像使用影像解析軟體等的定量性解析等，所屬技術領域具有通常知識者所周知的方法進行。在解釋免疫染色的結果時，例如，參照蛋白質核酸酵素Vol.54 No.2(2009)P185-192等，且必須排除由自體螢光、二次抗體的非特異性吸附，多重染色時之螢光洩漏等所產生之偽陽性。
單細胞RNA-Seq解析之結果，係例如可將所得到之細胞集團的表現譜(Expression profile)與周知數據庫等之生體的組織譜進行比較，從其基因表現、構成之細胞集團的類似性來推定所製造之細胞集團中所含有的細胞及組織。
[4.作為鼻腔上皮疾病模型之使用方法]
本發明之一實施形態係提供使用上述「包含構成鼻腔上皮之細胞或其前驅細胞之細胞集團」的鼻腔上皮之生物體外(in-vitro)疾病模型。更具體而言，包含構成鼻腔上皮之細胞或其前驅細胞之細胞集團，係可作為以病毒及微生物等病原體所致之感染症的疾病模型使用。包含構成鼻腔上皮之細胞或其前驅細胞之細胞集團作為生物體外疾病模型之使用方法，係例如包含：使上述細胞集團與病原體接觸之步驟、及檢測病原體的增殖等確認在鼻腔上皮中之病原體的感染之步驟。再者，藉由解析經感染之細胞，亦可進行病原體之標的細胞的鑑定、宿主因子的解析。包含構成鼻腔上皮之細胞或其前驅細胞之細胞集團作為其他生物體外疾病模型之使用方法，係例如包含：使上述細胞集團與病原體接觸之步驟、接觸評估對象物質之步驟、檢測病原體的增殖之步驟，可作為評估對象物質的藥效評估系統利用。
本發明之作為鼻腔上皮疾病模型的使用方法之一態樣，係包含下述步驟(A)至(C)之作為病原體的感染性評估系統及評估對象物質的藥效評估系統之使用方法。
(A)使包含構成鼻腔上皮之細胞或其前驅細胞之細胞集團與病原體接觸之步驟
(B)檢出病原體之步驟
(C)解析經病原體感染的細胞之步驟
<步驟(A)>
針對使包含構成鼻腔上皮之細胞或其前驅細胞之細胞集團與病原體接觸之步驟(A)進行說明。使包含構成鼻腔上皮之細胞或其前驅細胞之細胞集團與病原體接觸之方法沒有特別的限定，例如，可參照病毒實驗學總論(丸善)、病毒實驗學各論(丸善)、病毒實驗指南(protocol)(Medicalview公司)、Gastroenterology 148,126-36(2015)、及Cell Stem Cell 27,125-36(2020)等進行。使病原體與細胞集團接觸之步驟，較佳為在確保作業者的安全後，可實現再現性良好的病原體與細胞之相互作用。就一態樣而言，可藉由在培養細胞集團之培養基中，直接添加一定量之病原體的懸濁液，而實施步驟(A)，該病原體係生菌數已確定之微生物、力價已確定之病毒。
步驟(A)所使用之細胞集團可直接為細胞塊，亦可為藉由切割等細切成小細胞塊者。或者是，步驟(A)所使用之細胞集團也可為分散後使其接著者。也可從細胞集團精製構成鼻腔上皮之特定細胞。就較佳一態樣而言，在具有與生體類似之結構的細胞集團中，使病原體接觸。
在步驟(A)中進行接觸之病原體沒有特別的限定。病原體係可單獨1種，也可組合2種以上。在步驟(A)中進行接觸之病原體較佳為呼吸器感染症之病原體、或經由鼻腔上皮產生感染的病原體。上述病原體可為例如：冠狀病毒、流感病毒(例如，A型流感病毒、B型流感病毒等)、RS病毒、腺病毒、A群溶連菌、肺炎黴漿菌(Pneumonia mycoplasma)、百日咳菌、副百日咳菌、支氣管敗血症菌、肺炎披衣菌、鸚鵡熱披衣菌等。較佳的呼吸器感染症病原體或產生源自從鼻腔上皮的感染之病原體係冠狀病毒及流感病毒。組合2種以上進行接觸時，該等病原體可同時地接觸，亦可間隔一定的期間再進行接觸。
在步驟(A)中藉由使2種以上的病原體接觸，亦可評估由病原體間之相互作用所致之影響等。如上述之病原體間的相互作用可舉出例如：在病毒學中被稱為「干擾(interference)」之現象等。
步驟(A)中的病原體之接觸條件的培養溫度、CO2濃度等之培養條件係可適當地設定。培養溫度通常為約30℃至約40℃，較佳為約37℃，但可因應病原體的特性而變更該等。CO2濃度係例如約1%至約10%，較佳為約5%。
步驟(A)中，以將評估對象物質的藥效進行評估為目的，亦可將任意的評估對象物質添加在培養環境中。此時的評估對象物質沒有特別的限定，就一態樣而言，可為低分子化合物、抗體、核酸、基因治療用的載體。評估對象物質係可在使細胞集團與病原體接觸之前添加，也可在使細胞集團與病原體接觸之後添加。亦可將評估對象物質與病原體同時添加於培養環境中。
針對檢測病原體之步驟(B)進行說明。藉由檢測培養上清液或細胞中之病原體，可確認病原體對細胞集團之感染。檢測病原體方法沒有特別的限定，例如，可參照病毒實驗學總論(丸善)、病毒實驗學各論(丸善)、病毒實驗指 南(Medicalview公司)、Gastroenterology 148,126-136(2015)、及Cell Stem Cell 27,125-136(2020)等進行。檢測病原體之步驟，較佳是針對成為對象之各病原體進行選擇，但可列舉例如：以病原體特異性抗原作為標的之ELISA法、以病原體特異性鹼基序列作為標的之PCR法、RT-PCR法、定量PCR法、紅血球凝集反應、螢光抗體法等、電子顯微鏡法等手法。
在步驟(A)中，將評估對象物質添加於培養環境中時，亦可藉由在步驟(B)中將對照群(未添加評估對象物質之群)與評估對象物質添加群進行比較，而將評估對象物質的藥效進行評估。包含構成鼻腔上皮之細胞或其前驅細胞之細胞集團，係可使用於病原體感染抑制劑或由病原體感染所致之疾病的治療藥之篩選中。藥效之評估方法沒有特別的限定，較佳為實施可再現性良好地定量性評估之手法，例如除了病原體感染成立之有無以外，評估病原體之增殖性、細胞傷害性、免疫反應等。
針對解析病原體所感染之細胞的步驟(C)進行說明。將接觸過病原體之細胞進行解析之方法沒有特別的限定，係例如可參照病毒實驗學總論(丸善)、病毒實驗學各論(丸善)、病毒實驗指南(Medicalview公司)、Gastroenterology 148,126-136(2015)、及Cell Stem Cell 27,125-136(2020)等進行。步驟(C)係可與步驟(B)同時地進行，也可作為其他步驟進行。步驟(C)中成為解析之對象的病原體通常是細胞內寄生性的病原體，較佳是黴漿菌、病毒、原蟲、真菌、細菌。解析細胞之方法較佳為針對成為對象之各病原體進行選擇，但例如可列舉：將病原體特異性抗原與細胞種特異性抗體併用之免疫染色法、單細胞RNA-seq解析、電子顯微鏡法等手法。在單細胞RNA-seq解析中，例如，藉由解析含有病原體 特異性鹼基序列之細胞的基因表現譜，可鑑定細胞種類。藉由使用上述手法等，可決定未知病原體的向性(tropism)。
接觸過病原體的細胞之中，藉由將經病原體所感染之細胞與未被感染之細胞進行比較，可鑑定病原體的感染及病原體的增殖中必須的因子，例如，病毒受體、病毒感染相關因子、樣式辨識受體等。病毒感染症的疾病模型之情形，構成鼻腔上皮之細胞或其前驅細胞，係表現參與病毒受體或病毒感染之因子。就疾病模型而言，亦可使用上述因子的基因缺失或變異之包含構成鼻腔上皮之細胞或其前驅細胞之細胞集團。基因之缺失或變異等的改變方法沒有特別的限定，例如，可藉由基因體編集進行即可。
包含構成鼻腔上皮之細胞或其前驅細胞之細胞集團，亦可為了感染病毒，而增殖疫苗等的製造所需要的病毒而使用。
包含構成鼻腔上皮之細胞或其前驅細胞之細胞集團作為其他生物體外(in-vitro)疾病模型之使用方法，係例如可包含下列步驟，而作為評估對象物質的藥效評估系統利用：將源自患者之iPS細胞或實施過基因體編集之多能性幹細胞等作為出發原料，調製上述細胞集團之步驟、使評估對象物質與上述細胞集團接觸之步驟、及評估接觸後的上述細胞集團之步驟。
本發明之作為鼻腔上皮疾病模型的使用方法之一態樣，係包含下述步驟(i)至(iv)，作為從源自患者之多能性幹細胞或實施過基因體編集之多能性幹細胞來的鼻腔上皮之製造與解析、及評估對象物質的藥效評估系統之使用方法。
(i)建立源自患者之多能性幹細胞或實施過基因體編集之多能性幹細胞的步驟
(ii)從步驟(i)所建立之上述多能性幹細胞製造包含構成鼻腔上皮之細胞的細胞集團之步驟
(iii)使步驟(ii)所製造之上述細胞集團與評估對象物質進行接觸之步驟
(iv)解析在步驟(iii)中與上述評估對象物質接觸過之上述細胞集團之步驟
<步驟(i)>
針對建立源自患者之多能性幹細胞或實施過基因體編集之多能性幹細胞之步驟(i)進行說明。關於建立源自患者之多能性幹細胞或實施過基因體編集之多能性幹細胞之手法，只要在獲得可用於之後的步驟中製造鼻腔上皮之量及品質的多能性幹細胞之限制下，則沒有特別的限定。就一形態而言，可列舉：將源自患者的多能性幹細胞以外的細胞初期化而獲得多能性幹細胞之方法、操作建立完成的多能性幹細胞的基因體而選殖(Cloning)多能性幹細胞之方法等。通常，較佳為針對源自遺傳性疾病的患者之多能性幹細胞或遺傳病的原因基因，使用實施過基因體編集之多能性幹細胞，但從調查對於病原體之感受性等為目的而言，亦較佳為針對源自感染症及其他疾病的患者之多能性幹細胞或該疾病的相關基因，使用實施過基因體編集之多能性幹細胞。
源自患者之多能性幹細胞可列舉例如：源自囊腫纖化症、纖毛功能不全症候群、Kartagener氏症候群、黏多醣症、氣喘(過敏性炎症)、嗜酸球性副鼻腔炎等患者之多能性幹細胞，但沒有特別的限定。實施過基因體編集之多能性幹細胞可列舉例如：編集遺傳病之原因基因作成功能缺失型者、編集源自遺傳病患者之多能性幹細胞之原因基因而使功能回復者、為了評估基因表現等而組入有螢光蛋白質、螢光酵素等報導子(reporter)者等，但沒有特別的限定。
<步驟(ii)>
針對從在步驟(i)建立之多能性幹細胞製造包含構成鼻腔上皮之細胞的細胞集團之步驟(ii)進行說明。關於從多能性幹細胞製造包含鼻腔上皮之細胞集團的方法，係可藉由本案所記載之步驟(a)、(1)、(2)、(3)及(4)而實施。關於實際之製造條件，亦可考量細胞株之株間差異，而適當地調整細胞的播種數、進行添加之作用物質的添加時期、濃度等。
<步驟(iii)>
針對使在步驟(ii)製造之包含鼻腔上皮之細胞集團與評估對象物質進行接觸之步驟(iii)進行說明。在步驟(iii)中，以將評估對象物質的藥效進行評估為目的，將任意的評估對象物質添加於培養環境中。此時的評估對象物質沒有特別的限定，就一態樣而言，可為低分子化合物、抗體、核酸、基因治療用的載體。
<步驟(iv)>
針對解析在步驟(iii)與評估對象物質接觸過之細胞集團之步驟(iv)進行說明。步驟(iv)中的解析手法只要在可解析評估對象物質的作用之限制下，則沒有特別的限定。可列舉例如：以染色進行之組織的解析、使用西方墨點法等之蛋白質表現的解析；使用即時PCR法、DNA微陣列法、單細胞RNA-Seq法等之基因表現的解析；細胞增殖/細胞死亡測定(assay)、細胞功能評估測定等。藉由進行細胞集團的解析，可評估經接觸之評估對象物質對疾病造成的效果。
[5.疾病治療用化合物之評估用套組或疾病治療用化合物之篩選套組]
本發明之一實施形態，係提供用以實施上述「4.作為鼻腔上皮疾病模型之使用方法」的疾病治療用化合物之評估用套組及疾病治療用化合物之篩選套組。
在評估用套組或篩選套組中，係例如包含：本發明之細胞集團、或從細胞集團分取到的構成鼻腔上皮之細胞或鼻腔上皮樣組織；及為了進行上述步驟(A)至(C)所使用之試藥、培養液、培養器材、解析程式之至少1個，較佳為包含作為陽性(positive)對照或陰性(negative)對照所使用之試藥(化合物)、或鑑定藉由與評估對象物質的接觸而被活化之細胞之試藥。在本套組中，亦可進一步包含記載篩選程序之文書或說明書。
[6.對象物質的藥效或毒性之評估方法及評估套組]
本發明之一實施形態係提供一種使用本發明之細胞集團來評估對象物質的藥效或毒性，尤其是呼吸器官毒性之方法及評估套組。可從細胞集團精製構成鼻腔上皮之特定的細胞或鼻腔上皮樣組織。本實施形態之其他側面中，「對象物質的藥效或毒性之評估方法及評估套組」，亦可理解為「對象物質的藥效或毒性之篩選方法及篩選用套組」。
評估對象物質的藥效或毒性之方法，係可參照上述「4.作為鼻腔上皮疾病模型之使用方法」的步驟(iii)及步驟(iv)進行。評估對象物質的藥效或毒性之方法，係例如包含使細胞集團與評估對象物質接觸之步驟、及解析與評估對象物質接觸後之細胞集團之步驟。評估對象物質沒有特別的限定，就一態樣而言，可為低分子化合物、抗體、核酸、基因治療用之載體。藉由進行細胞集團的解析，可評估經接觸之評估對象物質對細胞造成的效果。
對象物質的藥效或毒性之評估套組，係可與「5.疾病治療用化合物之評估用套組或疾病治療用化合物之篩選套組」所記載之套組相同者。對象物質的藥效或毒性之評估套組係例如包含：本發明之細胞集團、或從細胞集團所分取之構成鼻腔上皮之細胞或者是鼻腔上皮樣組織；包含培養液、培養器材、解析 程式之至少1個，較佳為包含作為陽性對照或陰性對照所使用之試藥(化合物)、或鑑定藉由與評估對象物質的接觸而被活化之細胞之試藥。在本套組中，亦可進一步包含記載篩選程序之文書或說明書。
[7.疾病特異性生物標記之探索方法]
本發明之一實施形態係提供一種使用本發明之細胞集團來探索疾病特異性生物標記之方法。可從細胞集團精製構成鼻腔上皮之特定的細胞或鼻腔上皮樣組織。探索疾病特異性生物標記之方法係例如包含：藉由使細胞集團感染病原體等手法而再現疾病狀態之步驟；及回收疾病狀態經再現之細胞集團、其培養上清液、代謝物、分泌物等，將檢體解析並與對照進行比較，鑑定有變動之生物標記之步驟。成為對象之生物標記較佳為分子生物標記。成為對象之分子生物標記可為蛋白質、核酸、糖鏈、胜肽及低分子化合物，但不限定於此等。成為對象之分子生物標記係可為揮發性，亦可為非揮發性。分子生物標記之探索係例如使用Molecular & Cellular Proteomics 4.2(2005)：182-190、Chembiochem.2014 May 5；15(7)：1040-1048、Angewandte Chemie International Edition,2010,49.32：5426-5445.所記載之方法等進行。
[8.治療藥及疾病之治療方法]
本發明之一實施形態係提供一種基於呼吸器官障礙或感覺器官障礙，較佳為嗅覺系統障礙之疾病的治療藥，該治療藥係包含上述細胞集團或上述細胞集團所含有之細胞或組織。該等之疾病可為人類疾病，亦可為人類以外的動物疾病。細胞集團可作為再生醫療的治療藥使用。例如，對鼻腔上皮組織或嗅上皮組織造成傷害時，可將上述細胞集團作為移植片使用。可從細胞集團精製構成鼻腔上皮之特定的細胞。具體的移植方法可列舉例如：如Stem cell reports,12(6),1354- 1365.所記載，將細胞集團所含有之具有治療效果的細胞，例如，基底細胞精製，將調製成的細胞懸濁液直接對患部投予，例如，藉由滴鼻而移植至嗅上皮的手法；或者是從細胞集團調製片狀的組織，並將患部被覆之方法等。
治療藥可列舉例如：包含本發明之細胞集團或細胞集團所含有之細胞或組織的懸濁液、以及包含該等之移植片(移植用擔體)。懸濁液可列舉例如：將細胞集團懸濁於人工淚液或生理食鹽水而成之液。懸濁液可包含從細胞集團單離出非神經上皮細胞，也可包含促進細胞的接著之因子，例如，細胞外基質或玻尿酸等。
再者，亦可提供一種疾病之治療方法，該治療方法係包含：將本發明之細胞集團所含有之細胞或組織，以治療上必須的有效量，移植到需要進行移植之對象的步驟。藉由治療上有效的細胞量之移植，可回復組織，典型地，可減輕與疾病相關之症狀。
作為疾病之治療藥使用的細胞集團或上述細胞集團所含有之細胞或組織，較佳是對成為對象之疾病具有抵抗性。例如，針對由於SARS-CoV-2的感染所造成的嗅覺障礙，藉由移植本發明之細胞集團所含有之細胞或組織來實施治療時，較佳是進行移植的細胞係對SARS-CoV-2的感染具有抵抗性。如上述之疾病抵抗性的細胞係例如可將下列多能性幹細胞作為材料使用而調製，該多能性幹細胞係將參與病毒感染之基因，例如、ACE2、TMPRSS2、Nrp1等基因藉由基因體編集而使其變異或缺失者。
[9.作為病毒之分離培養所使用之宿主細胞的用途]
本發明之一實施形態係提供一種用於病毒分離之培養方法，該培養方法係使用上述細胞集團或上述細胞集團所含有之細胞或組織。上述病毒可為人類疾 病之原因病毒，也可為人類以外的動物疾病之原因病毒。藉由本發明之方法所分離培養之病毒係例如：上呼吸道感染症、普通感冒、流行性感冒、或新興感染症原因病毒，但不限定於該等。如上述之病毒可列舉例如：鼻病毒、人類冠狀病毒、流感病毒、RS病毒、副流感病毒、腺病毒、腸病毒、人類間質肺炎病毒、波卡病毒(Bocavirus)等。人類冠狀病毒可列舉例如：α冠狀病毒屬之HCoV-NL63、HCoV-229E；β冠狀病毒屬之HCoV-OC43，HCoV-HKU1等。新興感染症之原因病毒可列舉例如：SARS-CoV、MERS-CoV、SARS-CoV2等。
病毒之分離培養所用之細胞集團或上述細胞集團所含有之細胞或者組織，較佳是對成為對象之病毒具有受體。就改善病毒之分離培養的效率之觀點而言，亦可將下述多能性幹細胞作為材料使用，該多能性幹細胞係例如參照Nature microbiology,2019,4.8：1268-1273.等，將參與病毒感染之基因，例如，ACE2、TMPRSS2、Nrp1等基因藉由基因體編集等進行操作，而使表現經增強者。在盡可能排除以生物體外(in vitro)增殖而致之影響或產生之變異，獲得與以生體增殖之臨床檢體等所含有之病毒極為接近之病毒，將該病毒作為檢體之觀點而言，病毒之分離培養所用之細胞集團或上述細胞集團所含有之細胞或者組織，亦較佳是被含有之細胞種類、參與病毒感染之基因等的表現是與生體相近者。
使用本發明之細胞集團或上述細胞集團所含有之細胞的病毒之分離培養之一態樣，亦可參照上述[4.作為鼻腔上皮疾病模型之使用方法]的步驟(A)、(B)及(C)進行。評估病毒是否被分離培養之方法可列舉：觀察經接種病毒之細胞所產生的細胞變性效果(cytopathic effect；CPE)、紅血球凝集抑制試驗、使用 各種抗病毒抗體之中和試驗、將病毒之特定基因的增幅藉由PCR法進行確認，或者是解讀基因之鹼基序列的基因檢查等手法，但不限定於此。
[實施例]
以下列示實施例，更詳細地說明本發明，惟本發明的範圍並不限定於此等者。再者，使用的試藥以及材料只要沒有特別限定能夠由商業入手。本說明書中，細胞之免疫染色結果的判斷基準，係與國際公開第2020/039732號之預備實驗1相同。
[比較實驗1：源自人類ES細胞之含有嗅上皮樣組織及非神經上皮組織的細胞塊之製造/分化誘導]
根據圖5上段所示之培養步驟，從多能性幹細胞製造包含含有嗅上皮樣組織之非神經上皮組織的細胞塊。使用人類ES細胞(KhES-1株，自京都大學入手)作為多能性幹細胞。多能性幹細胞係如國際公開第2020/039732號所記載，以Scientific Reports,4,3594(2014)所記載之方法為基準，以無餵養條件進行維持培養。使用StemFit培養基(AK02N，味之素股份有限公司製)作為無餵養培養基，使用Laminin511-E8(Nippi股份有限公司製)作為無餵養支架。
具體的維持培養操作，係首先將成為次匯合之人類ES細胞，以5mM EDTA/PBS清洗2次後，再以5mM EDTA/PBS37℃處理10分鐘。進行移液，從培養皿表面將細胞剝離，分散成單一細胞。之後，將經分散成單一細胞的人類ES細胞，播種於塗覆有Laminin511-E8之塑膠培養皿，在Y27632(ROCK抑制物質，富士膜和光純藥股份有限公司製，10μM)存在下，以StemFit培養基進行無餵養培養。使用6孔盤(Corning公司製，細胞培養用，培養面積9.5cm2)作為塑膠培養皿時，將經分散成單一細胞的人類ES細胞之播種細胞數設成1.2× 104。在播種1天後，以不含Y27632之StemFit培養基進行全量培養基交換。之後，以1天至2天1次，以不含Y27632之StemFit培養基進行全量培養基交換。播種後7天，培養至成為次匯合(培養面積的6成覆蓋有細胞之程度)為止。
將培養後之多能性幹細胞使用於分化誘導時，在播種6天後與StemFit培養基之培養基交換同時，添加SB431542(TGF-β訊息傳導路徑抑制物質，富士膜和光純藥股份有限公司製，最終濃度5μM，圖5等中記載為「SB431」)及SAG(Shh訊息路徑作用物質，Enzo Life Sciences公司製，最終濃度300nM)並培養24小時(步驟(a)開始)。
將調製後之次匯合的人類ES細胞，與上述繼代時同樣地以5mM EDTA/PBS進行處理。添加分化誘導用之無血清培養基，進行移液並從培養皿表面將細胞剝離，分散成單一細胞。
之後，將經分散成單一細胞的人類ES細胞在非細胞接著性的96孔培養盤(PrimeSurface 96V底盤，MS-9096V，Sumitomo Bakelite股份有限公司製)，以成為每1孔9×103細胞之方式，懸濁於100μl的無血清培養基，在37℃、5%CO2的條件下進行懸浮培養。此時的無血清培養基中，使用在F-12+Glutamax培養基(Thermo Fisher Scientific公司製)與IMDM+Glutamax培養基(Thermo Fisher Scientific公司製)的體積比1：1混合液中，添加有5% Knockout Serum Replacement(Thermo Fisher Scientific公司製)，450μM 1-單硫代甘油(富士膜和光純藥股份有限公司公司製)、1x化學性確定的脂質濃縮物(Chemically defined lipid concentrate)(Thermo Fisher Scientific公司製)、50unit/ml青黴素-50μg/ml鏈黴素(Nacalai Tesque股份有限公司製)之無血清培養基(步驟(1)開始)。之後，該無血清培養基亦稱為5% KSR gfCDM。
在懸浮培養開始時(懸浮培養開始後第0天，步驟(1)開始)，於上述無血清培養基添加Y27632(最終濃度10μM)、IWP-2(Wnt訊息傳導路徑抑制物質，Tocris Bioscience公司製，最終濃度0.5μM)、SB431542(TGF訊息傳導路徑抑制物質，富士膜和光純藥股份有限公司製，最終濃度1μM)。
於懸浮培養開始後第2天，將不含Y27632，且含有IWP-2、SB431542、BMP4(BMP訊息傳導路徑作用物質，R & D Systems公司製，最終濃度0.5nM)之無血清培養基於每1孔添加100μl(步驟(2)開始)。
再者，於懸浮培養開始後第3天，使用不含Y27632及BMP4，且含有IWP-2、SB431542、bFGF-TS(FGF訊息傳導路徑作用物質，HumanZyme公司製，最終濃度20ng/ml)、肝素鈉(Heparin Sodium)(最終濃度10μg/ml)、5Z-7-Oxo Zeaenol(TAK1抑制物質、Cayman Chemicals公司製，最終濃度2μM)之無血清培養基，進行半量培養基交換(步驟(3)開始)。在懸浮培養開始後第6天，使用含有IWP-2、SB431542、bFGF-TS、肝素鈉、5Z-7-Oxo Zeaenol、K02288(BMP訊息傳導路徑抑制物質，Cayman Chemicals公司製，最終濃度1μM)之無血清培養基，進行半量培養基交換。之後，在培養第10、13、17、21、24天同樣進行半量培養基交換。在培養第13天以後之培養基交換時，添加EGF(PrimeGene公司製，最終濃度20ng/ml)。
上述BMP4、bFGF-TS、肝素鈉、5Z-7-Oxo Zeaenol、K02288及EGF係於最初添加時，在以半量交換進行添加之培養基中分別以2倍的濃度添加，孔中的最終濃度係成為如記載的濃度。之後的培養基交換之際，係以記載的最終濃度添加至培養基。再者，在之後的記載中，以其他各條件進行添加之因子、化合物等亦以同樣的方法進行添加。
在懸浮培養開始後第28天，使用倒立顯微鏡(KEYENCE股份有限公司製，BIOREVO)，進行亮視野觀察(圖5之A)。藉由上述分化誘導法形成直徑約600μm左右的球狀的細胞凝集物。
將懸浮培養開始後第28天的細胞凝集物，以粗前端口徑的200μl滴管尖(tip)回收至培養用試管，以PBS進行2次清洗作業後，以4%多聚甲醛磷酸緩衝液(富士膜和光純藥股份有限公司公司製)在室溫固定15分鐘。將固定後的細胞凝集物以PBS清洗3次後，以20%蔗糖/PBS在4℃浸漬一晚浸漬進行凍結保護處理。將凍結保護處理後的凝集物移至冷凍切片包埋模具(Cryomold)<3號>(Sakura Finetek公司製)，將細胞凝集物周圍多餘的20%蔗糖/PBS以微量移液器移除後，包埋於O.C.T Compound(Sakura Finetek公司製)中，在以乾冰冷卻後之鋁加熱塊(Aluminum heat block)上急速凍結，製作出凍結切片製作用之塊體(block)。從包埋了上述凝集物之塊體藉由Leica CM1950 Cryostat(Leica公司製)製作10μm厚的凍結切片，安裝於Crest載玻片(松浪硝子工業股份有限公司製)。將載玻片上的凍結切片周圍以免疫組織化學用PAP Pen(大道產業股份有限公司製)框圍後，以0.2%Triton-X100/TBS在室溫進行10分鐘滲透處理，接著以封阻(blocking)試藥N-102(日油股份有限公司製)及SuperBlock(TBS)封阻緩衝液(Blocking Buffer)(Thermo Fisher Scientific公司製)之體積比1：4混合液在室溫進行30分鐘封阻處理。
關於封阻處理後之凍結切片，將經Antibody Diluent OP Quanto(Thermo Fisher Scientific公司製)稀釋之一次抗體在每1枚載玻片添加250μl，濕箱中以4℃反應一晚。將一次抗體處理後的凍結切片進行3次以0.05% Tween-20/TBS在室溫處理10分鐘之清洗操作後，利用Blocking One Histo(Nacalai Tesque 股份有限公司製)及0.2%Triton-X100/TBS以體積比1：19的比率混合而成之緩衝液將二次抗體稀釋，將稀釋液以每1枚載玻片250μl添加於凍結切片，在室溫反應1時間。將二次抗體處理後之凍結切片進行3次以0.05% Tween-20/TBS在室溫處理10分鐘之清洗操作後，以純水清洗凍結切片一次，之後，使用NEO蓋玻片(松浪硝子工業股份有限公司製)及每1枚載玻片30μl的Prolong Glass(Thermo Fisher Scientific公司製)將凍結切片封入。將封入後之標本在室溫的暗處靜置一晚，使Prolong Glass固化後，以透明的指甲油塗覆蓋玻片的周圍並在室溫的暗處風乾後，進行利用螢光顯微鏡之觀察。標本之觀察及影像的取得係使用正立螢光顯微鏡Axio Imager M2(Carl Zeiss公司製)及附屬軟體之Axio Vision。
作為一次抗體者，係使用表1-1或1-2所記載之將基板及非神經上皮組織染色之抗Six1抗體、將神經視網膜及嗅神經細胞染色之抗Lhx2抗體、將嗅神經細胞及其前驅細胞染色之抗鈣網膜蛋白抗體。使用表2所記載之Alexa488標記之驢抗兔子抗體、CF555標記之驢抗小鼠抗體、Alexa647標記之驢抗山羊抗體作為螢光標識二次抗體進行多重染色，在核的對比染色中將1μg/ml之Hoechst33342(Sigma Aldrich公司製)添加於二次抗體稀釋液中。
將染色結果示於圖5之B。在懸浮培養開始第28天，在細胞塊的外側形成Six1陽性之基板樣的非神經上皮組織。此等的一部分細胞，係Lhx2、鈣網膜蛋白陽性的嗅神經細胞或其未成熟的前驅細胞。根據上述顯示，藉由比較實驗1之培養方法，可製造在細胞塊的外側存在非神經上皮，其一部分為嗅神經細胞之細胞塊。將藉由上述製造法所形成之細胞塊的模式圖示於圖5之C。
[實驗1：源自人類ES細胞之含有構成鼻腔上皮之細胞的細胞集團之製造/分化誘導]
在實驗1中，根據圖6上段所示之步驟，製造包含構成鼻腔上皮之細胞的細胞集團。培養至第28天為止，與比較實驗1以相同的方法培養多能性幹細胞。之後，在Wnt訊息傳導路徑抑制物質、FGF訊息傳導路徑作用物質及BMP訊息傳導路徑抑制物質之不存在下，實施培養細胞步驟(4)。在實驗1中，除了特別記載之操作以外，其餘與比較實驗1進行同樣的操作。
具體而言，使用經維持培養之人類ES細胞，以與比較實驗1相同的方法進行步驟(a)、步驟(1)、步驟(2)及步驟(3)後，在培養第28天從96孔培養盤回收細胞塊至15ml離心試管中，以培養基實施2次清洗後，將細胞塊移至9cm懸浮培養用皿(Sumitomo Bakelite股份有限公司製)。培養基係使用在無血清培養基(5% KSR gfCDM)中，添加有1μM SB431542及20ng/ml EGF者。以每1皿48個之細胞塊在12ml之培養基中進行培養。在培養第35天使用倒立顯微鏡進行亮視野觀察(圖6之A)。培養第35天之細胞集團，係一部分的上皮組織從細胞塊分離。
將培養第35天之細胞集團，以比較實驗1所記載之方法進行固定，實施螢光免疫染色。作為一次抗體者，係使用表1-1或1-2所記載之將神經視網膜及嗅神經細胞染色之抗Lhx2抗體、在嗅神經細胞及其前驅細胞成為陽性之抗Ebf1抗體、在神經系細胞成為陽性之抗Tuj1抗體、將分泌細胞染色之抗MUC5AC抗體、抗MUC5B抗體、在呼吸器官系統的上皮細胞成為陽性之抗FoxA2抗體、在纖毛細胞成為陽性之抗FoxJ1抗體、在鹽細胞成為陽性之抗CFTR抗體、在外胚層的前方區域成為陽性之抗Otx2抗體、在非神經上皮成為陽性之抗Pan Cytokeratin(PanCK)抗體、在基底細胞成為陽性之抗細胞角蛋白5抗體及抗p75抗體、以及在鼻腔上皮、嗅上皮及非神經上皮成為陽性之抗E-黏附蛋白 抗體。使用表2所記載之Alexa488標記之驢抗兔子抗體，CF555標記之驢抗小鼠抗體，Alexa647標記之驢抗山羊抗體作為螢光標識二次抗體進行多重染色，在核的對比染色中將1μg/ml之Hoechst33342(Sigma Aldrich公司製)添加至二次抗體稀釋液中。
染色結果示於圖7及圖8之A。在懸浮培養開始第35天，在非神經上皮組織存在著Lhx2、Ebf1、Tuj1陽性的嗅神經細胞，FoxJ1陽性的纖毛細胞、黏液素5AC、黏液素5B、FoxA2陽性的分泌細胞，CFTR陽性的鹽細胞，細胞角蛋白5、p75、E-黏附蛋白陽性的基底細胞樣細胞。再者，該等之細胞所存在之區域皆為Otx2陽性且泛細胞角蛋白陽性，表示上述細胞為屬於外胚層之非神經系細胞。從上述結果顯示，構成鼻腔上皮之細胞包含於細胞集團中，藉由本發明之製造方法，可製造纖毛細胞、分泌細胞、鹽細胞、基底細胞等構成鼻腔上皮之細胞。將藉由上述製造方法所形成之細胞集團的模式圖示於圖8之B。
細胞集團係具有：1)神經組織，係包含構成中樞神經系統之神經系細胞、及2)非神經上皮組織，係包含含有構成鼻腔上皮之細胞之鼻腔上皮樣組織、及含有嗅神經細胞之嗅上皮樣組織。神經組織係藉由鼻腔上皮樣組織被覆表面的至少一部分。鼻腔上皮樣組織及嗅上皮樣組織，係存在於連續的非神經上皮組織上。細胞集團中，基底細胞係侷限於非神經上皮組織的內側，纖毛細胞係侷限於非神經上皮組織的外側，非神經上皮組織係具有基底側及頂端側之極性。細胞集團中，構成鼻腔上皮之細胞，係根據細胞種集合。
[實驗2：源自人類ES細胞之含有構成鼻腔上皮之細胞的細胞集團之製造/分化誘導]
在實驗2中，根據圖9之上段所示之步驟，製造包含構成鼻腔上皮之細胞的細胞集團。在實驗2中，除了從步驟(1)進一步添加屬於JNK抑制劑之JNK-IN-8以外，其餘係與比較實驗1進行相同的操作。
具體而言，使用經維持培養之人類ES細胞，進行步驟(a)後，在步驟(1)中，將JNK抑制劑JNK-IN-8以最終濃度為300nM或1μM之條件進行添加。在培養基交換之際，以最終濃度成為相同之方式，在進行交換之培養基中添加JNK-IN-8。在培養第28天使用倒立顯微鏡，進行亮視野觀察(圖9之A)。添加有JNK-IN-8之群，尤其是，JNK-IN-8以最終濃度1μM添加之群，係所得到之細胞集團包含接近均勻球形之細胞塊，細胞塊的表面被覆有非神經上皮之比率亦較高。
將培養第28天之細胞集團，以比較實驗1所記載之方法進行固定，實施螢光免疫染色。作為一次抗體者，係使用表1-1或1-2所記載之將前方區域之外胚層染色之抗Otx2抗體、在嗅神經細胞及其前驅細胞成為陽性之抗Ebf1抗體、將含有嗅神經細胞及其前驅細胞之神經細胞染色之抗Tuj1抗體、在基底細胞成為陽性之抗細胞角蛋白5抗體及抗p75抗體。使用表2所記載之Alexa488標記之驢抗兔子抗體、CF555標記之驢抗小鼠抗體、Alexa647標記之驢抗山羊抗體作為螢光標識二次抗體進行多重染色，在核的對比染色中將1μg/ml之Hoechst33342(Sigma Aldrich公司製)添加於二次抗體稀釋液中。
將染色結果示於圖10。與對照進行比較，添加有最終濃度1μM之JNK-IN-8的群，係在所得到之細胞集團的表面更有效率地形成非神經上皮。再者，在添加JNK抑制劑的條件下，亦形成Otx2陽性之外胚層的前方區域的上皮，其中產生Ebf1、Tuj1陽性的嗅神經細胞的分化。再者，在添加JNK抑制劑 的條件下，亦產生細胞角蛋白5及p75陽性的基底細胞的分化，細胞集團係包含構成鼻腔上皮之細胞。從上述結果可知，藉由Wnt/JNK路徑的抑制，可不阻礙嗅上皮及鼻腔上皮區域的形成，調製品質良好的具有非神經上皮之細胞集團。
[實驗3：源自人類ES細胞的含有構成鼻腔上皮之細胞的細胞集團之製造/分化誘導]
在實驗3中，根據圖11之上段所示之步驟，製造包含構成鼻腔上皮之細胞的細胞集團。在實驗3中，除了從步驟(3)開始以使屬於Shh訊息傳導路徑作用物質之SAG最終濃度成為1μM之方式進一步添加以外，其餘係與比較實驗1進行相同的操作。
在培養第28天使用倒立顯微鏡，進行亮視野觀察(圖11之A)。使用表1-1或1-2所記載之抗Fox2A抗體及抗Pan Cytokeratin抗體，以及表2所記載之二次抗體進行免疫染色。將染色結果示於圖11之B及C。與對照進行比較，從步驟(3)之培養第13天添加有最終濃度為1μM之SAG的群，在培養第28天中促進泛細胞角蛋白陽性、FoxA2陽性的非神經上皮組織之形成。從上述結果可知，藉由步驟(3)之Shh訊息傳導路徑的活化，可調製非神經上皮部分更容易分化成鼻腔上皮之細胞塊。將包含導向鼻腔上皮樣組織之非神經上皮組織的細胞塊的模式圖示於圖11之D。
[實驗4：源自人類iPS細胞之含有構成鼻腔上皮之細胞的細胞集團之製造、分化誘導中，具有減輕氧化壓力之作用的物質之效果的檢討]
在實驗4中，根據圖12所示之步驟，製造源自人類iPS細胞1231A3株之包含構成鼻腔上皮之細胞的細胞集團。在實驗4係與實驗2同樣地，從步驟(1)添加JNK抑制劑，再者，從步驟(3)的途中(培養第10天)添加各種具有減輕氧化 壓力之作用的物質(圖12中之「Antioxidants」)，檢討其效果。具有減輕氧化壓力之作用的物質具體而言係：300μM、1mM或3mM N-乙醯基-L-半胱胺酸(NAC)、250μM抗壞血酸2磷酸(AA2P)、500μM菸鹼醯胺(NAD)、10μM乙酸(±)-α-生育酚(αTOA)及1μM IM-93之任一者，或將AA2P、1μM NAC及NAD組合添加。在培養第21天使用倒立顯微鏡，進行亮視野觀察(圖12之A)。在培養第21天之細胞塊中，不添加具有減輕氧化壓力之作用的物質之條件中，有表面形成有鼻腔上皮及嗅上皮之細胞塊，另一方面，存在因細胞死亡而喪失鼻腔上皮及嗅上皮之細胞塊。相對於此，在添加了上述具有減輕氧化壓力之作用的物質的條件中，在鼻腔上皮及嗅上皮區域中細胞死亡被抑制，在細胞塊表面維持由鼻腔上皮樣組織及嗅上皮樣組織。尤其是，將AA2P、NAC、NAD組合添加時，係更維持鼻腔上皮樣組織及嗅上皮樣組織。從該等結果顯示，在含有構成鼻腔上皮之細胞之細胞集團的製造中，添加具有減輕氧化壓力之作用的物質是有效的。
[實驗5：源自人類ES細胞之鼻腔上皮類器官中的流感病毒受體之表現解析]
在實驗5中，首先，根據圖13的上段所示之步驟，製造包含構成鼻腔上皮之細胞的細胞集團。在此製造步驟中，以與比較實驗1相同的方法進行步驟(a)至步驟(3)，獲得含有嗅神經細胞之細胞塊後，進一步繼續培養(步驟(4))。在培養第35天使用倒立顯微鏡，進行細胞集團之亮視野觀察(圖13之A)。將培養第35天之細胞集團固定，使用表1-1或1-2所記載之將非神經上皮組織染色之抗Six1抗體、在纖毛細胞成為陽性之抗FoxJ1抗體及將纖毛染色之抗乙醯基化微管蛋白(AcTub)，以及表2所記載之二次抗體進行免疫染色。將染色結果示於圖14。 在非神經上皮組織中，FoxJ1與Actub在相同細胞進行染色，可知在細胞集團中分化有纖毛細胞。再者，纖毛細胞係集合存在於細胞集團中。可知纖毛係形成在細胞集團之非神經上皮組織的外側，非神經上皮組織係具有極性。此細胞集團亦稱為源自人類ES細胞之鼻腔上皮類器官。再者，在將培養期間延長之培養第45天，使用倒立顯微鏡拍攝動畫。將動畫中之1幀靜止畫面化者示於圖14之C。在動畫中，在細胞集團的表面上皮中觀察到纖毛樣的結構，進一步觀察到其進行纖毛運動。可知藉由本發明之製造方法，可調製在表面的上皮含有具有纖毛運動功能之纖毛細胞的細胞集團。
將鼻腔上皮類器官在培養第42天固定，解析流感病毒受體的表現。為了檢測人類流感病毒受體唾液酸α2,6Gal的表現，將以比較實驗1所記載之方法所調製出之切片、及表1-1或1-2所記載之添加有生物素標記的日本接骨木凝集素(Lectin from Sambucus sieboldiana/SSA-Biotin；J-CHEMICAL，公司製)之抗體稀釋液在4℃反應一晚後，使用表2所記載之Alexa594標記的鏈親和素(Thermo Fisher Scientific公司製)以與抗體染色同樣的手法進行檢測。再者，為了檢測禽流感病毒受體唾液酸α2,3Gal的表現，使用抗Siaα2,3Gal抗體(自家調製，PCT/JP2020/003782所記載之抗體3B1E2)以比較實驗1所記載之方法進行免疫染色。
將染色結果示於圖15。在培養第42天之包含構成鼻腔上皮之細胞的細胞集團中，分別觀察到表現唾液酸α2,6Gal(Siaα2,6Gal)之細胞、及表現唾液酸α2,3Gal(Siaα2,3Gal)之細胞。表現Siaα2,6Gal之細胞，係細胞彼此密接而形成上皮結構之多列上皮狀的細胞。另一方面，表現Siaα2,3Gal之細胞，大多為單層的扁平上皮樣細胞。Siaα2,6及Siaα2,3Gal似乎在不同的細胞中表現。 從上述結果顯示，包含構成鼻腔上皮之細胞的細胞集團感染流感病毒之可能性。再者，顯示分別以Siaα2,6Gal及Siaα2,3Gal作為受體之人類流感病毒及禽流感病毒，係可感染鼻腔上皮及嗅上皮的不同細胞。
[實驗6：對源自人類ES細胞之鼻腔上皮類器官之流感病毒感染及病毒增殖試驗]
將以圖16所記載之方法調製而成之源自人類ES細胞之鼻腔上皮類器官使用於實驗中。具體的製造方法，係除了在步驟(3)中，將作為BMP訊息傳導路徑抑制物質之1μM的LDN-193189(默克公司製)從培養第6天添加、及不添加TAK1抑制劑5z-7側氧基玉米赤黴醇以外，其餘與實驗1相同。在實驗6以後的病毒感染實驗中，使用以本製造條件所調製出的源自人類ES細胞之鼻腔上皮類器官。
使培養開始第28天的源自人類ES細胞之鼻腔上皮類器官感染10,000PFU之H1N1人類流感病毒A/California/04/2009(H1N1pdm)。每24小時將培養基回收，藉由使用HA-MDCK細胞之溶菌斑(Plaque)法，確定各天的病毒之增殖及力價。實驗係以5次實施。
將結果示於圖17。以5次進行的實驗中，在3次中觀察到病毒的增殖。釋放到培養基之病毒的力價係在感染後第2天至第3天成為最大，之後降低。由上述結果顯示，以本說明書所記載之方法所製作之源自人類ES細胞之鼻腔上皮類器官受流感病毒感染、在細胞內產生病毒增殖、及產生具有感染性之病毒粒子釋放到細胞外。所製作之鼻腔上皮類器官，係顯示可作為流感病毒感染症模型使用。
[實驗7：以螢光抗體法進行之對源自人類ES細胞之鼻腔上皮類器官的流感病毒感染確認]
將以實驗6所記載之方法而感染人類流感病毒之源自人類ES細胞之鼻腔上皮類器官，在感染24、48、168或264小時後進行固定，藉由比較實驗1所記載之螢光抗體法來確認人類流感病毒的感染。在流感病毒的檢測中，使用表1-1或1-2所記載之抗流感病毒核蛋白質抗體(Influenza NP，AbCam公司製，ab20343)，在核的對比染色中將1μg/ml之DAPI(Nacalai Tesque公司製)添加於二次抗體稀釋液中。
感染24、48、168及264小時後的鼻腔上皮類器官，均在位於最外側之Sox2陽性的嗅上皮中之細胞一部分中，存在抗流感病毒核蛋白質抗體染色為陽性之細胞。將感染24小時後之染色結果示於圖18。從上述結果可確認，以本說明書所記載之方法所製作之源自人類ES細胞之鼻腔上皮類器官受流感病毒感染。
[實驗8：對源自人類ES細胞之鼻腔上皮類器官之冠狀病毒SARS-CoV-2感染/病毒增殖試驗]
使用以實驗6所記載之方法所調製之培養開始第28天的源自人類ES細胞之鼻腔上皮類器官來實施冠狀病毒感染實驗。對類器官感染病毒之方法，係以5%KSR gfCDM培養基調製病毒液，去除培養中之類器官的培養基，添加病毒液50μL並在37℃，5%CO2培養箱培養1小時。去除病毒液，以200μL 5%KSR gfCDM培養基將上述類器官清洗2次後，添加200μL 5%KSR gfCDM培養基，在CO2培養箱進行培養。病毒感染係以低濃度條件：10,000 TCID50或高濃度條 件：100,000 TCID50之2條件，使用SARS-CoV-2(SARS-CoV-2/Hu/DP/Kng/19-027)進行。
為了病毒力價測定，將每天培養上清液各回收50μL，保存於-80℃。在培養基經回收之孔中，各添加5%KSR gfCDM培養基50μL。病毒之力價係以下述程序進行測定。在96孔盤中播種VeroE6/TMPRSS2細胞，將含有病毒之培養上清以5%FCS DMEM進行10倍階段稀釋並添加。每1稀釋接種於3孔以上。在CO2培養箱，培養4至5天後觀察細胞，判定有無細胞變性效果(CPE)。從CPE陽性孔數藉由Reed-Muench法算出TCID50，作為病毒的力價。實驗係低濃度條件(圖19之L1至L5)及高濃度條件(圖19之H1至H5)各實施5次。
將結果示於圖19。以低濃度條件進行5次的實驗中，觀察到1次(L3)病毒的增殖，以高濃度條件所實施的5次全都(H1至H5)觀察到病毒的增殖。釋放到培養基中之病毒的力價係在感染後第2天至第3天成為最大，之後一度降低，在感染後第7天以後再度上昇。之後，在感染後第15天至第17天迎來第二峰，之後雖然低下，但在感染後第22天仍持續著病毒的產生。如上述之病毒力價的再上昇，不是在性質一樣的培養細胞，而是使用源自生體之組織來實施病毒增殖試驗時經常觀察到的現象。由上述結果顯示，以本說明書所記載之方法所製作之源自人類ES細胞之鼻腔上皮類器官受SARS-CoV-2感染、在細胞內產生病毒增殖、及產生具有感染性之病毒粒子釋放到細胞外。再者，由產生力價的再上昇，亦顯示上述類器官係具有與源自生體之組織接近的性質。顯示鼻腔上皮/嗅上皮類器官可作為冠狀病毒感染症模型使用。從類器官繼續產生病毒，亦可知鼻腔上皮/嗅上皮類器官係可作為針對冠狀病毒之持續性感染模型使用。
[實驗9：以螢光抗體法進行之對源自人類ES細胞之鼻腔上皮類器官的冠狀病毒SARS-CoV-2感染確認]
首先，藉由比較實驗1所記載之螢光抗體法進行感染前之細胞集團的解析。接著，以上述實驗8之方法感染SARS-CoV-2，將感染2天後及11天後之源自人類ES細胞之鼻腔上皮類器官固定，藉由螢光抗體法確認SARS-CoV-2的感染。在SARS-CoV-2的檢測中，使用表1-1或1-2所記載之抗SARS核蛋白質抗體(SARS2 NP，GeneTex公司製，GNT-GTX135357)，在核的對比染色中將1μg/ml之DAPI(Nacalai Tesque公司製)添加於二次抗體稀釋液中。
將感染前之細胞集團之染色結果示於圖20。在未感染之培養第28天的源自人類ES細胞之鼻腔上皮類器官中，在細胞塊的表面中鼻腔上皮(RE)與嗅上皮(OE)連續，形成細胞角蛋白18(CK18)陽性的上皮結構。其中，鼻腔上皮部分係細胞角蛋白15(CK15)陽性，嗅上皮部分係Six1、Sox2陽性。鼻腔上皮(RE)的部分尤其是強力地表現屬於SARS-CoV-2受體之ACE2。
將感染48小時後之源自人類ES細胞之鼻腔上皮類器官的染色結果示於圖21及圖22。在位於鼻腔上皮類器官的最外側，Sox2陽性且一部分細胞為Tuj1陽性的屬於嗅神經之嗅上皮中的細胞一部分中，存在抗SARS核蛋白質抗體染色為陽性之細胞(圖21之A及B、圖22之B)。此外，細胞角蛋白15(KRT15)陽性之屬於上皮組織的鼻腔上皮，係表現屬於SARS-CoV-2病毒受體之ACE2，一部分細胞係抗SARS核蛋白質抗體染色為陽性(圖21之C及D、圖22之A)。再者，鼻腔上皮類器官之一部分細胞表現FoxI1，顯示鼻腔上皮類器官中含有鹽細胞(離子細胞(ionocyte))或其前驅細胞。FoxI1陽性細胞的一部分係SARS-CoV-2核蛋白質陽性(圖22之C)。從上述結果顯示，以本說明書所記載之 方法所製作之源自人類ES細胞之鼻腔上皮類器官受SARS-CoV-2感染。再者，顯示冠狀病毒SARS-CoV-2係分別對鼻腔上皮及嗅上皮感染。顯示以本說明書所記載之方法可製造鼻腔上皮的鹽細胞，SARS-CoV-2係可感染鹽細胞。
將感染11天後之源自人類ES細胞之鼻腔上皮類器官示於圖23。Sp8陽性的嗅上皮(OE)部分殘存於細胞塊表面。此外，細胞塊內部的細胞亦為抗SARS核蛋白質抗體染色呈陽性。細胞塊內部之SARS-CoV-2感染細胞係Tuj1陽性，顯示為中樞神經系統的神經細胞。由該等結果顯示，以本說明書所記載之方法所製作之源自人類ES細胞之鼻腔上皮類器官，可作為SARS-CoV-2從鼻腔上皮/嗅上皮向中樞神經系統的感染傳播模型使用。
[實驗10：使用穿透型電子顯微鏡確認源自人類ES細胞之鼻腔上皮類器官之SARS-CoV-2感染]
將以實驗8所記載之方法感染SARS-CoV-2之源自人類ES細胞之鼻腔上皮類器官利用電子顯微鏡進行觀察。在病毒感染48小時後去除培養基，使經病毒感染之類器官以2.5%戊二醛在冰上固定1小時。將固定後的類器官以0.1M二甲胂酸(Cacodylic acid)緩衝液清洗，再以1%四氧化鋨在冰上固定1小時。將類器官以超純水清洗後，以50%至99%乙醇稀釋系列進行脫水，藉由環氧丙烷進行置換。將類器官包埋於環氧樹脂後，在60℃使其聚合2天。使用超薄切片機(ultramicrotome)將包埋後的類器官薄切為50nm厚的超薄切片，使用乙酸鈾及檸檬酸鉛電子染色後，藉由穿透型電子顯微鏡(日立股份有限公司製，製品編號HT-7700)進行拍攝。
將結果示於圖24。在感染SARS-CoV-2之源自人類ES細胞之鼻腔上皮類器官中的細胞表面及細胞內，存在SARS-CoV-2之病毒粒子。再者，在 受感染之細胞內，觀察到稱為雙膜小泡：double-membrane vesicles(DMV)、雙膜小球：double-membrane spherules(DMS)之包含冠狀病毒之受到某種病毒的感染時所形成之特徵性細胞內結構。如上述結果顯示，以本說明書所記載之方法所製作之源自人類ES細胞之鼻腔上皮類器官受到SARS-CoV-2等病毒感染、及在細胞內產生病毒的複製/增殖。
[實驗11：使用源自人類ES細胞之嗅上皮/鼻腔上皮類器官之單細胞解析]
在實驗使用培養第28天之源自人類ES細胞之鼻腔上皮類器官、及以實驗6所記載之方法感染SARS-CoV-2的感染後第2、7、11天的源自人類ES細胞之鼻腔上皮類器官。將每1條件之4個類器官4個在15ml試管中，以10U/mL木瓜酵素(papain)(Worthington Biochemical，LS003119)及500μg/mL DNase I(Roche，10104159001)在37℃處理15分鐘。在上述處理後，藉由添加含有10%牛胎兒血清之培養基使酵素反應停止，使用P1000之微量移液器(Micropipette)分散成單細胞後，使用孔徑40μm之細胞過濾器(Cell strainer)去除夾雜物。將上述細胞懸濁液以旋翼式轉子(Swinging Rotor)進行離心(1000rpm，5分鐘)，去除上清液後，將細胞的沉澱物(pellet)以成為1×106cells/mL的濃度之方式，以已含有0.04% BSA之PBS再度懸濁。將相當於約16,000個細胞之上述懸濁液添加至Chromium Next GEM Single Cell 3’GEM，Library & Gel Bead Kit v3.1(10x Genomics公司製，PN-1000121及PN-1000128)以及單細胞解析用之晶片Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit(10x Genomics公司製，PN-1000120)，根據套組所附的操作指南，使用Single Index Kit T SetA(10x Genomics公司製，PN-1000213)並藉由Chromium Controller(10x Genomics公司製)，調製出單細胞解析用之CDNA 資料庫(library)。將調製後的各樣品之CDNA資料庫使用NovaSeq S4 2×150bp(Illumina公司製)解讀序列，將所得到之數據使用Cell Ranger software(version 4.0.0)、Seurat v4.0及R package Seurat(version 4.0.3)進行解析。
將在培養第28天感染SARS-CoV-2之培養第30天，亦即，感染後第2天(2days post infection(dpi))之源自人類ES細胞之鼻腔上皮類器官進行解析，從所得到之數據作成t分布隨機近鄰嵌入(t-SNE)的繪圖，將該繪圖示於圖25之A。群集化(Clustering)的結果，將上述類器官所含有之細胞分類為嗅上皮/鼻腔上皮之細胞集團(NE)及中樞神經系統之細胞集團(CNS)。再者，將在嗅上皮、鼻腔上皮、中樞神經系統中表現高之基因、及源自SARS-CoV-2之轉錄產物的顯示每1細胞之表現量之小提琴繪圖示於圖25之B。解析的結果，NE係在嗅上皮/鼻腔上皮表現之細胞角蛋白18、細胞角蛋白19、Six1基因的表現為高之細胞集團。CNS係在中樞神經系統表現之Foxg1、Irx3、Tbr1、Reelin、Emx1基因的表現為高之細胞集團。表示SARS-CoV-2的感染之屬於源自SARS-CoV-2之轉錄產物的膜(M)蛋白質及棘(S)蛋白質，係在NE觀察到較多表現該等之細胞，但CNS中亦觀察到表現該等之細胞。由上述結果顯示，以本發明所記載之方法所製造之細胞集團，係具有嗅上皮/鼻腔上皮的細胞及中樞神經系統的細胞，並進一步受SARS-CoV-2所感染。
[實驗12：源自人類ES細胞之嗅上皮/鼻腔上皮類器官所含有之細胞的群集化解析]
將實驗11之培養第28天之源自人類ES細胞之鼻腔上皮類器官所含有之嗅上皮/鼻腔上皮之細胞集團(NE)進一步進行群集化解析。群集化的結果，將上述上皮/鼻腔上皮之細胞集團分類為6個群集。將6個群集之t分布隨機近鄰嵌入 (t-SNE)繪圖示於圖26。再者，針對各群集中構成嗅上皮之各細胞的標記基因之表現進行解析，將實施了反映上述t-SNE繪圖中各基因表現量之著色的結果示於圖27。解析的結果，6個群集係分別為：屬於神經前驅細胞標記之NeuroD1及Ascl1的表現量高之集團((1)NPC)、屬於嗅神經標記之STOML3及GNG13的表現量高之集團((2)OSC)、屬於未成熟嗅神經標記之GNG8的表現量高之集團((3)imOSC)、屬於分泌細胞/杯狀細胞標記之MUC5AC的表現量高之集團((4)MUC)、屬於水平基底細胞標記之細胞角蛋白5的表現量高之集團((5)HBC)、屬於支持細胞標記之CYP2A13及ELF5的表現量高之集團((6)SUS)。
在經分類之6個群集中，選拔差異表現基因(Differentially Expressed Genes(DEG))，製作基因表現之熱圖。將每個群集之DEG表現量的熱圖示於圖28。將6個群集分別的DEG示於圖29及圖30。解析的結果，各群集係在DEG的表現量中分別顯示不同的特徵性表現譜，顯示出不同種類的細胞。此外，如(2)OSC及(3)imOSC，在群集間存在圖譜(profile)類似之組合，表示集團彼此的發生/分化上的關聯性。從上述結果顯示，本發明之源自人類ES細胞之鼻腔上皮類器官所含有之嗅上皮/鼻腔上皮之細胞集團，係包含至少6種細胞，分別為神經前驅細胞、嗅神經細胞、未成熟嗅神經細胞、分泌細胞/杯狀細胞、水平基底細胞、支持細胞。
[實驗13：源自人類ES細胞之嗅上皮/鼻腔上皮類器官與源自人類患者檢體之嗅上皮/鼻腔上皮組織的比較]
將源自人類ES細胞之鼻腔上皮類器官所含有之細胞集團與人類之嗅上皮/鼻腔上皮組織進行比較。將源自人類患者檢體之嗅上皮/鼻腔上皮組織的單細胞解析數據的t-SNE繪圖示於圖31之A。除了神經前驅細胞(NPC)、嗅神經細胞 (OSC)、未成熟嗅神經細胞(imOSC)、分泌細胞‧杯狀細胞(MUC)、水平基底細胞(HBC)、支持細胞(SUS)之細胞集團以外，進一步存在有表現FoxJ1的纖毛細胞(CE)之細胞集團。
將上述人類患者檢體與源自人類ES細胞之鼻腔上皮類器官之單細胞解析數據進行比較。如圖31之B之框線內所示，源自人類ES細胞之鼻腔上皮類器官所含有之細胞，係繪製在與源自人類患者檢體之細胞非常相似的位置。由上述結果顯示，本發明之源自人類ES細胞的構成鼻腔上皮類器官之細胞，係由與人類組織相同的細胞構成。再者，源自人類ES細胞之鼻腔上皮類器官，亦含有雖然為少數細胞但表現FoxJ1之纖毛細胞。
[實驗14：使用源自人類ES細胞之嗅上皮/鼻腔上皮類器官之嗅覺受體表現的單細胞解析]
將源自人類ES細胞之鼻腔上皮類器官所含有之嗅神經細胞中的嗅覺受體表現，與人類的嗅上皮/鼻腔上皮組織進行比較。將源自人類患者檢體之嗅上皮/鼻腔上皮組織之單細胞解析數據的基因表現熱圖示於圖32之A。人類患者檢體中表現GNG8、GNG13及STOML3之嗅神經細胞中，大多數僅表現因細胞而異之1種嗅覺受體。另一方面，源自人類ES細胞之鼻腔上皮類器官的嗅神經細胞，係一個細胞中表現複數種嗅覺受體(圖32之B)。從上述結果顯示，源自人類ES細胞之鼻腔上皮類器官表現嗅覺受體；及與人類成體之嗅上皮組織比較，包含更多表現複數種嗅覺受體之未成熟的嗅神經細胞。
[實驗15：使用源自人類ES細胞之嗅上皮/鼻腔上皮類器官之免疫相關基因表現的單細胞解析]
針對在培養第28天經SARS-CoV-2感染之培養第30天，亦即，感染後第2天的源自人類ES細胞之鼻腔上皮類器官，將免疫相關基因之表現進行單細胞解析，將所得到之基因表現熱圖示於圖33。將圖33的虛線部分之放大圖示於圖34。將上述單細胞解析數據中個別基因表現之UMAP解析結果示於圖35及圖36。解析的結果，在源自人類ES細胞之鼻腔上皮類器官所含有之鼻腔上皮(NRE)及嗅上皮細胞(OE)的細胞中，檢測到表現屬於源自SARS-CoV-2之轉錄產物之ORF10及orflab的細胞。解析上述感染細胞的基因表現後，經感染之鼻腔上皮細胞的一部分，係高度表現IL32、IL1A、IL6、CXCL8、IFNL1至3及IFNB1(圖34及圖35)。上述結果顯示，本發明之源自人類ES細胞之嗅上皮/鼻腔上皮類器官，係可在生物體外(in-vitro)再現受到SARS-CoV-2感染時所產生的免疫反應。尤其是，由於觀察到屬於I型干擾素之IFNB1、屬於III型干擾素之IFNL1至3、及屬於細胞介素/介白素之IL32、IL1A、IL6、CXCL8的表現上昇，顯示可再現該等之免疫反應。
無關於屬於源自SARS-CoV-2之轉錄產物之ORF10及orflab有無表現，源自人類ES細胞之鼻腔上皮類器官所含有之細胞，係表現一定程度之IFNAR1、IFNGR1、IL1R1等干擾素/介白素之受體(圖33星號)。此外，在包含大多數不表現屬於源自SARS-CoV-2之轉錄產物之S蛋白質的細胞之細胞集團全體中，在SARS-CoV-2感染後，由干擾素刺激所誘導之基因ISG15的表現呈現亢進(圖36)。由上述結果顯示，在本發明之細胞集團(細胞塊)中，在生物體外(in-vitro)再現出非感染細胞針對由受到病毒感染之細胞所分泌之細胞介素產生的免疫反應。
[實驗16：使用CRISPR-Cas9系統之ACE2剔除之人類ES細胞株的建立]
為了實施使用CRISPR-Cas9系統之基因剔除，調製出基因體上分別編碼有人類ACE2基因[LocusID(NCBI)59272]之5‘UTR區域(5’-CAAATGATGGAATCAGAACA-3’)及第2內含子(intron)區域(5’-ACTAAACTTAATTGACCCTG-3’)之序列的引導(guide)RNA表現載體。表現載體係使用Cas-9 sgRNA vector(Addgene，#68463)。在人類ES細胞株(KhES-1)中使用Lipofectamine Stem reagent(Thermo Fisher公司製)，將上述2種引導RNA表現載體與Cas9表現載體(Cas9-2A-eGFP，Addgene，#44719)一起同時地進行基因導入。將導入後之質體(plasmid)的模式圖示於圖37A。在ACE2基因的5‘UTR區域及第2內含子區域之標的區域中，藉由導入之引導RNA及Cas9的功能產生DNA的雙股切斷，藉由細胞具有的非相同末端結合修復(NHEJ)產生標的區域的缺失(圖37B)。
在實施基因導入的2天後，將eGFP陽性細胞藉由細胞分選儀進行分取，以低密度進行播種，將源自單一細胞的群落檢取，實施選殖(Cloning)。將所得到之群落藉由Cas9標的區域的基因體PCR及基因體定序進行評估，獲得在基因體的兩等位基因(alleles)中缺失ACE2基因之Exon1及Exon2的殖株2株(clone #1、#8)。將經選殖之該2株以圖16所記載之方法實施分化誘導，在培養第28天藉由RIPA緩衝液實施溶胞產物(lysate)樣品調製，實施使用抗ACE2抗體及作為內參對照(loading control)之抗β肌動蛋白抗體之西方墨點法。其結果，在對照的野生型KhES-1中確認到ACE2的表現，但在clone #1及#8中即 使在培養第28天分化為嗅上皮/鼻腔上皮後仍未觀察到ACE2的表現(圖37之C)。由上述結果顯示，clone #1及#8係被建立為ACE2剔除之人類ES細胞株。
[實驗17：ACE2剔除之源自人類ES細胞株的嗅上皮/鼻腔上皮類器官之形成及SARS-CoV-2感染實驗]
將實驗16所建立之ACE2剔除之人類ES細胞株Clone #1，以圖16所記載之方法實施分化誘導，製作出嗅上皮/鼻腔上皮類器官。之後，以與實驗8之高濃度條件相同的方法，使其感染SARS-CoV-2，感染2天後進行固定，實施以螢光抗體法進行之解析。將染色結果示於圖38。在ACE2剔除之源自人類ES細胞之嗅上皮/鼻腔上皮類器官中，形成KRT15陽性的鼻腔上皮(NRE)、Sp8陽性的嗅上皮(OE)，ACE2剔除之株係顯示與親株同樣具有分化成嗅上皮/鼻腔上皮之能力。在嗅上皮樣組織及鼻腔上皮樣組織中，沒有檢測到ACE2的表現，確認ACE2基因被基因剔除。在ACE2剔除之源自人類ES細胞之嗅上皮/鼻腔上皮類器官中，即使藉由與實驗8相同的感染條件也未檢測到SARS-CoV-2感染細胞。因此，顯示SARS-CoV-2係依存於ACE2進行感染、及ACE2剔除之源自人類ES細胞之嗅上皮/鼻腔上皮類器官對SARS-CoV-2的感染具有抵抗性。
[實驗18：對ACE2剔除之源自人類ES細胞之鼻腔上皮類器官之冠狀病毒SARS-CoV-2感染/病毒增殖試驗]
將實驗16所建立之ACE2剔除之人類ES細胞株Clone #1，以圖16所記載之方法實施分化誘導，製作出嗅上皮/鼻腔上皮類器官。之後，以實驗8所記載之方法實施對鼻腔上皮類器官之冠狀病毒SARS-CoV-2感染/病毒增殖試驗。實驗係針對病毒量低濃度條件(圖39之L1至L5)及高濃度條件(圖39之H1至H5)分別實施5組。
其結果，使源自野生型人類ES細胞之鼻腔上皮類器官受SARS-CoV-2感染時，計測到之感染後第1天至第3天的病毒增殖、力價的上昇，此是在對ACE2剔除之源自人類ES細胞之鼻腔上皮類器官進行的感染實驗中，無論低濃度條件、高濃度條件之任一者中皆未觀察到，感染後第4天以後成為檢出界限以下。亦沒有檢測到在野生型產生感染後第10天以後的力價再上昇。因此，顯示SARS-CoV-2係依存於ACE2進行感染、及ACE2剔除之源自人類ES細胞之嗅上皮/鼻腔上皮類器官對SARS-CoV-2的感染具有抵抗性。
[實驗19：以振盪培養進行之源自人類iPS細胞的嗅上皮/鼻腔上皮類器官的長期培養所致之分化/成熟的誘導]
在實驗19中，根據圖40所示之步驟，製造構成嗅上皮之細胞及包含構成鼻腔上皮之細胞的細胞集團。在實驗19係與實驗2同樣地從步驟(1)添加JNK抑制劑，再者，從步驟(3)的途中添加抗壞血酸2磷酸(AA2P)、菸鹼醯胺(NAD)、N-乙醯基-L-半胱胺酸(NAC)進行培養，之後培養第28天開始實施振盪培養。使用人類iPS細胞株1231A3作為多能性細胞。具體的實驗操作係在以與實驗4相同之方法培養28天後，使用前端粗的滴管尖將含有嗅上皮/鼻腔上皮之細胞塊回收至錐形試管中。使用未添加增殖因子及抑制劑之5% KSR gfCDM培養基將細胞塊清洗2次後，在置入有25mL的10%KSR gfCDM培養基之細胞非接著性之培養用75cm2燒瓶(康寧公司製，353133)中移入96個細胞塊。此時之培養基中，添加有1μM SB431542、100nM EC23、20ng/ml bFGF-TS、10μg/ml肝素鈉、20ng/ml EGF、250μM AA2P、1mM NAC、500μM NAD。在以旋轉式振盪器(Sunflower shaker)(Mini-Shaker 3D，SanBio公司製)進行之5rpm的波動形搖動之條件下，實施振盪培養。在培養第45天及第59天實施相位差像的觀察。將培養第59天的 試料固定並以比較實驗1所記載之方法實施免疫染色。除了在前述實驗中使用之表1-1或1-2所記載之抗Six1、Sox2、E-黏附蛋白、Sp8抗體以外，使用在神經系統之上皮組織及基板表現的抗N-黏附蛋白抗體、屬於嗅上皮區域之標記之抗細胞角蛋白18(CK18)抗體以及表2所記載之二次抗體進行免疫染色。將染色結果示於圖40。
藉由實施振盪培養，在培養第45天及第59天中，於細胞塊的表面仍維持著肥厚的上皮結構。再者，由免疫染色進行之解析結果，上述上皮係Six1、Sox2、E-黏附蛋白、Sp8、CK18及N-黏附蛋白陽性的嗅上皮/鼻腔上皮的組織。可知藉由振盪培養可維持細胞塊表面的嗅上皮樣組織及鼻腔上皮樣組織，直接實施類器官的維持及/或成熟培養。
[實驗20：源自人類iPS細胞的含有形成鼻腔上皮組織、及嗅窩樣結構之嗅上皮組織的細胞集團之製造/分化誘導]
在實驗20中，根據圖42上段所示之步驟，製造含有形成鼻腔上皮組織、及嗅窩樣結構之嗅上皮組織的細胞集團。多能性幹細胞係使用在β-肌動蛋白基因座導入GFP基因，恆常地表現GFP之人類iPS細胞(hiPS β-肌動蛋白GFP株，IPSC1030，自默克公司購入)。多能性幹細胞係如國際公開第2020/039732號所記載般，以Scientific Reports,4,3594(2014)所記載之方法為準，以無餵養條件進行馴化並維持培養。無餵養培養基係使用StemFit培養基(AK02N，味之素股份有限公司製)，無餵養支架係使用Laminin511-E8(Nippi股份有限公司製)。具體的維持培養操作，係以與比較實驗1所記載之人類ES細胞之培養同樣地進行。
將培養後之多能性幹細胞使用於分化誘導時，在播種6天後與StemFit培養基之培養基交換同時，添加5μM SB431542及300nMSAG並培養24小時(步驟(a)開始)。
將調製出次匯合的人類iPS細胞，以與上述繼代時同樣地利用5mM EDTA/PBS進行處理。添加分化誘導用之無血清培養基，進行移液而從培養皿表面將細胞剝離，分散成單一細胞。
之後，在非細胞接著性的96孔培養盤中，以每1孔成為1.35×104細胞之方式，將經分散成單一細胞的人類iPS細胞在100μl的無血清培養基中懸濁，使用旋翼式轉子離心機將細胞聚集於底面後，在37℃、5%CO2的條件下進行懸浮培養。此時的無血清培養基中使用5% KSR gfCDM(步驟(1)開始)。
在懸浮培養開始時(懸浮培養開始後第0天，步驟(1)開始)，於上述無血清培養基添加Y27632(最終濃度10μM)、IWP-2(最終濃度1μM)、SB431542(最終濃度1μM)、JNK-IN-8(最終濃度1μM)。
在懸浮培養開始後第1天，將不含Y27632且含有IWP-2、SB431542、JNK-IN-8、BMP4(最終濃度0.5nM)之無血清培養基，以每1孔50μl之方式添加(步驟(2)開始)。
再者，在懸浮培養開始後第3天，將不含Y27632及BMP4，且含有IWP-2、SB431542、JNK-IN-8、K02288(最終濃度1μM)、5Z-7-側氧基玉米赤黴醇(最終濃度2μM)之無血清培養基，以每1孔50μl之方式添加(步驟(3)開始)。之後，在培養第6、10、13、17天同樣地進行半量培養基交換。培養第10天以後之培養基交換時，添加1mM N-乙醯基-L-半胱胺酸(NAC)、250μM抗壞 血酸2磷酸(AA2P)、500μM菸鹼醯胺(NAD)，培養第13天以後之培養基交換時，添加EGF(最終濃度20ng/ml)。
上述BMP4、5Z-7-側氧基玉米赤黴醇、K02288、N-乙醯基-L-半胱胺酸、抗壞血酸2磷酸、菸鹼醯胺及EGF在最初添加時，在以半量交換進行添加之培養基中分別以2倍、3倍、4倍之任一種濃度進行添加，使孔中的最終濃度成為記載的濃度之方式進行。以後之培養基交換時，以記載的最終濃度添加於培養基中。再者，之後的記載中，以其他各條件進行添加之因子、化合物等亦以同樣的方法進行添加。
在懸浮培養開始後第22天，從96孔培養盤回收細胞集團，移至懸浮培養用皿，使用倒立螢光顯微鏡(BIOREVO BZ-X800，KEYENCE公司製)進行偏斜照明觀察及螢光觀察(圖42之A)。由其結果可知，藉由本發明從人類iPS細胞所製造之細胞塊的表面係被非神經上皮組織覆蓋，其一部分與非神經上皮連續，形成比非神經上皮更肥厚之嗅上皮樣組織，嗅上皮樣組織陷入至細胞塊內側而形成嗅窩樣結構。
將培養第22天之細胞集團，以比較實驗1所記載之方法固定，實施螢光免疫染色。作為一次抗體者，除了前述實施例所使用者以外，亦使用表1-1或1-2所記載之在hiPS β-肌動蛋白GFP株中恆常地表現之辨識GFP之抗GFP抗體、在嗅神經細胞及其前驅細胞成為陽性之抗Ebf2抗體、Lhx2抗體、在嗅上皮、非神經上皮中成為陽性之抗β鏈蛋白抗體、細胞角蛋白18抗體、EpCAM抗體、在嗅上皮及中樞神經系統中成為陽性之N-黏附蛋白抗體、在嗅上皮樣組織中表現之抗Pax6抗體、在非神經上皮組織中表現之抗EGFR抗體、在基底膜樣結構中表現之抗層連結蛋白抗體、抗膠原蛋白4抗體、在細胞之基底側的接著面 成為陽性之抗β4整合素抗體、在細胞的頂端面成為陽性之抗Ezrin抗體。使用表2所記載之抗體作為螢光標識二次抗體進行多重染色，在核的對比染色中將1μg/ml之Hoechst33342(Sigma Aldrich公司製)添加於二次抗體稀釋液中。同一框內係相同切片以不同螢光檢出條件所致之多重螢光染色像。
將染色結果示於圖43及圖44的上段。再者，將由本製造方法所形成之細胞集團的模式圖示於圖44的下段。在培養第22天之細胞塊中，在細胞塊的表面中，屬於肥厚之多列上皮的嗅上皮樣組織彎曲且中心部分凹陷，形成成為嗅覺器官胚的原基之嗅窩樣結構。與嗅上皮樣組織連續之非神經上皮組織，係被覆細胞塊的表面。細胞塊的內部係中樞神經系統的細胞，細胞塊表面之連續的嗅上皮樣組織、嗅窩樣結構、非神經上皮組織之間，形成有層連結蛋白、膠原蛋白4陽性的基底膜樣結構。嗅上皮樣組織、嗅窩樣結構、非神經上皮組織之細胞塊表面側，係Ezrin陽性的頂端面，形成有頂端面-基底面之細胞極性。嗅上皮樣組織之與基底膜樣結構相接處係β4整合素陽性。嗅上皮樣組織係E-黏附蛋白、β-鏈蛋白、細胞角蛋白18、N-黏附蛋白、Pax6、Sox2、Six1、ACE2、Sp8、汎細胞角蛋白、EpCAM陽性，嗅上皮樣組織中存在著N-CAM、Tuj1、N-黏附蛋白、Ebf2、Lhx2、鈣網膜蛋白陽性之嗅神經細胞或其前驅細胞。之後可分化成鼻腔上皮組織之非神經上皮組織係E-黏附蛋白、β-鏈蛋白、CK18、EGFR、ACE2、Six1、汎細胞角蛋白陽性。中樞神經系組織係N-CAM、Tuj1、N-黏附蛋白、Pax6、Sox2陽性。從上述結果可知，利用本發明所記載之製造法，可從多能性幹細胞製造具有嗅窩樣結構之細胞集團。
[實驗21：使用具有經分割之微孔的培養器材，製造/分化誘導源自人類iPS細胞之含有鼻腔上皮組織的細胞集團]
在實驗21中，根據圖45之上段所示之步驟，使用具有經分割之微孔的培養器材來製造含有鼻腔上皮組織之細胞集團。使用人類iPS細胞1231A3株作為多能性幹細胞。分化誘導所使用之細胞係與實驗20同樣地調製。
事前，在35mm EZSPHERE Dish Type 905(旭TECHNO GLASS公司製)中添加後述之添加分化誘導用之無血清培養基2ml，在CO2培養箱中靜置以1小時左右，以顯微鏡觀察微孔內之氣泡的去除。
之後，將經調製之次匯合的人類iPS細胞，以與上述繼代時同樣地利用5mM EDTA/PBS進行處理。在細胞回收時添加分化誘導用之無血清培養基，進行移液而從培養皿表面將細胞剝離，分散成單一細胞，在事前所調製之35mm EZSPHERE Dish中，以每1皿成為1.8×106細胞之方式，於3ml的無血清培養基中懸濁，在37℃、5%CO2的條件下進行懸浮培養。此時的無血清培養基係使用5% KSR gfCDM(步驟(1)開始)。
懸浮培養開始時(懸浮培養開始後第0天，步驟(1)開始)，於上述無血清培養基中添加Y27632(最終濃度10μM)、IWP-2(最終濃度1μM)、SB431542(最終濃度1μM)、JNK-IN-8(最終濃度1μM)。
在懸浮培養開始後第1天，利用顯微鏡確認微孔內形成細胞凝集物後，將不含Y27632，且含有IWP-2、SB431542、JNK-IN-8、BMP4(最終濃度1nM)之無血清培養基以每1皿1ml之方式添加(步驟(2)開始)。
再者，在懸浮培養開始後第3天，使用寬口徑的1000μl移液滴管尖回收細胞凝集物，移送至10cm懸浮培養用皿。此時之培養基中，使用12ml的不含Y27632及BMP4，且含有IWP-2、SB431542、JNK-IN-8、K02288(最終濃度1μM)、5Z-7-側氧基玉米赤黴醇(最終濃度2μM)之5% KSR gfCDM(步驟 (3)開始)。之後，在培養第6、10、13、17天，進行以不吸取細胞凝集物之方式，從皿回收6ml之培養基，並添加新培養基6ml的半量培養基交換。培養第10天以後之培養基交換時，添加1mM N-乙醯基-L-半胱胺酸(NAC)、250μM抗壞血酸2磷酸(AA2P)、500μM菸鹼醯胺(NAD)，在培養第13天以後之培養基交換時，添加EGF(最終濃度20ng/ml)。
在懸浮培養開始後第21天，使用倒立螢光顯微鏡(BIOREVO BZ-X800，KEYENCE公司製)進行偏斜照明觀察(圖45之A)。其結果，與前述使用96孔微孔盤時同樣地，藉由使用具有經分割之微孔的培養器材，可製造在表面具有鼻腔上皮及嗅上皮樣組織之細胞塊。
[實驗22：使用具有經分割之微孔的培養器材，製造/分化誘導源自人類iPS細胞的含有鼻腔上皮組織之細胞集團]
在實驗22中，根據圖46的上段所示之步驟，使用具有經分割之微孔的培養器材，製造含有鼻腔上皮組織之細胞集團。使用人類iPS細胞1231A3株作為多能性幹細胞。分化誘導所使用之細胞係與實驗20同樣地調製。
事前，在AggreWell 800的6孔盤(34821，STEMCELL Technologies公司製)的孔中添加2ml之抗附著沖洗液(Anti-Adherence Rinsing Solution)(07010，STEMCELL Technologies公司製)，使用旋翼式轉子離心機進行離心，去除氣泡。離心後將沖洗液(Rinsing Solution)去除，藉由後述之分化誘導用的無血清培養基將孔清洗後，添加新的無血清培養基5ml，在CO2培養箱中靜置1小時左右進行平衡化。
之後，將經調製之次匯合的人類iPS細胞，以與上述繼代時同樣地利用5mM EDTA/PBS進行處理。在細胞回收時添加分化誘導用之無血清培養基，進行移液 而從培養皿表面將細胞剝離，分散成單一細胞，在事前所調製之AggreWell 800的6孔盤中，以每1皿成為5.4×106細胞之方式，於平衡化後的5ml的無血清培養基中懸濁，在37℃、5%CO2的條件下進行懸浮培養。此時的無血清培養基係使用5% KSR gfCDM(步驟(1)開始)。
懸浮培養開始時(懸浮培養開始後第0天，步驟(1)開始)，於上述無血清培養基中添加Y27632(最終濃度10μM)、IWP-2(最終濃度1μM)、SB431542(最終濃度1μM)、JNK-IN-8(最終濃度1μM)。
在懸浮培養開始後第1天，利用顯微鏡確認微孔內形成細胞凝集物後，將不含Y27632，且含有IWP-2、SB431542、JNK-IN-8、BMP4(最終濃度1nM)之無血清培養基以每1孔1ml之方式添加(步驟(2)開始)。
再者，在懸浮培養開始後第3天，使用寬口徑的1000μl移液滴管尖回收細胞凝集物回收至37μm Reversible Strainer Large(27250，STEMCELL Technologies公司製)，將死細胞及碎片去除後，移送至10cm懸浮培養用皿。此時之培養基中，使用12ml的不含Y27632及BMP4，且含有IWP-2、SB431542、JNK-IN-8、K02288(最終濃度1μM)、5Z-7-側氧基玉米赤黴醇(最終濃度2μM)之5% KSR gfCDM(步驟(3)開始)。之後，在培養第6、10、13、17天，進行以不吸取細胞凝集物之方式，從皿回收6ml之培養基，並添加新培養基6ml的半量培養基交換。培養第10天以後之培養基交換時，添加1mM N-乙醯基-L-半胱胺酸(NAC)、250μM抗壞血酸2磷酸(AA2P)、500μM菸鹼醯胺(NAD)，在培養第13天以後之培養基交換時，添加EGF(最終濃度20ng/ml)。
在懸浮培養開始後第1、21、50天，使用倒立螢光顯微鏡(BIOREVO BZ-X800，KEYENCE公司製)進行相位差觀察及偏斜照明觀察(圖46 之A)。其結果，與前述使用96孔微孔盤時同樣地，藉由使用具有經分割之微孔的培養器材，可製造在表面具有鼻腔上皮及嗅上皮樣組織之細胞塊。
[實驗23：源自人類ES細胞之含有構成鼻腔上皮之細胞之細胞集團/二維(2D)類器官的製造及季節性冠狀病毒感染/增殖實驗]
根據圖47的上段所示之培養步驟，從多能性幹細胞藉由接著培養二維地製造包含含有鼻腔上皮樣組織之非神經上皮組織的細胞集團。使用人類ES細胞(KhES-1株，自京都大學入手)作為多能性幹細胞。多能性幹細胞係如國際公開第2020/039732號所記載般，以Scientific Reports,4,3594(2014)所記載之方法為準，以無餵養條件進行維持培養。無餵養培養基係使用StemFit培養基(AK02N，味之素股份有限公司製)，無餵養支架係使用Laminin511-E8(Nippi股份有限公司製)。具體的維持培養操作，係與比較實驗1所記載之人類ES細胞之培養同樣地進行。
將培養後之多能性幹細胞使用於分化誘導時，在播種6天後與StemFit培養基之培養基交換同時，添加SB431542(TGF-β訊息傳導路徑抑制物質，富士膜和光純藥股份有限公司製，最終濃度5μM)及SAG(Shh訊息路徑作用物質，Enzo Life Sciences公司製，最終濃度300nM)並培養24小時(步驟(a)開始)。
將經調製之次匯合的人類ES細胞，與上述繼代時同樣地以5mM EDTA/PBS進行處理。添加分化誘導用之無血清培養基，進行移液並從培養皿表面將細胞剝離，分散成單一細胞。
之後，將經分散成單一細胞的人類ES細胞以在細胞接著性的平底96孔培養盤(Corning公司製)中，成為每1孔1×103細胞之方式，懸濁於100μl的無血 清培養基，在37℃、5%CO2的條件下進行接著培養。此時之培養盤，係藉由Laminin511-E8(Nippi股份有限公司製)實施塗覆。再者，無血清培養基，係使用於F-12+Glutamax培養基(Thermo Fisher Scientific公司製)及IMDM+Glutamax培養基(Thermo Fisher Scientific公司製)之體積比1：1混合液中，添加有5% Knockout Serum Replacement(Thermo Fisher Scientific公司製)，450μM 1-單硫代甘油(富士膜和光純藥股份有限公司公司製)、1x化學性確定的脂質濃縮物(Chemically defined lipid concentrate)(Thermo Fisher Scientific公司製)、50unit/ml青黴素-50μg/ml鏈黴素(Nacalai Tesque股份有限公司製)之培養基(步驟(1)開始)。
在接著培養開始時(接著培養開始後第0天，步驟(1)開始)，於上述無血清培養基添加Y27632(最終濃度10μM)，IWP-2(最終濃度0.5μM)、SB431542(最終濃度1μM)。
在接著培養開始後第2天，以每1孔100μl之方式添加不含Y27632，且含有IWP-2、SB431542、BMP4(最終濃度0.5nM)之無血清培養基(步驟(2)開始)。
再者，在接著培養開始後第3天，使用不含Y27632及BMP4，且含有IWP-2、SB431542、bFGF(最終濃度20ng/ml)、肝素鈉(最終濃度10μg/ml)、LDN-193189(最終濃度100nM)之無血清培養基進行半量培養基交換(步驟(3)開始)。之後，每培養2天或3天同樣地進行半量培養基交換，調製出含有構成鼻腔上皮之細胞之細胞集團/二維(2D)類器官。
上述BMP4、bFGF-TS、肝素鈉及LDN-193189係於最初添加時，在以半量交換進行添加之培養基中分別以2倍的濃度進行添加，孔中的最終濃 度係成為如記載的濃度。之後的培養基交換時，係以記載的最終濃度添加至培養基中。
在培養開始後第47天，對細胞角蛋白18(KRT18)及SP8進行免疫染色，使用共焦雷射顯微鏡(Leica公司製，TCS SP8)進行觀察(圖47)。由其結果可知，藉由上述分化誘導法而含有細胞角蛋白18陽性的鼻腔上皮細胞及SP8陽性之中樞神經系統的細胞、細胞角蛋白18及SP8陽性的嗅上皮細胞，該等呈現連續的上皮結構，可調製形成鼻腔上皮組織之細胞集團/二維(2D)類器官。
[實驗24：對從人類ES細胞所製造之含有構成鼻腔上皮之細胞之細胞集團/二維(2D)類器官的季節性冠狀病毒感染/增殖實驗]
對於以實驗23所記載之方法所製造之含有構成鼻腔上皮之細胞之細胞集團/二維(2D)類器官，實施季節性冠狀病毒的感染/增殖實驗。實驗操作係對源自人類ES細胞之鼻腔上皮2D類器官，以Japanese Journal of Infectious Diseases,2021,74.4：285-292.及Japanese journal of infectious diseases,2015,68.5：442-445.所記載之方法為準，分別感染季節性冠狀病毒株HCoV-229E株(有記載為「229E」之情形)、HCoV-OC43株(有記載為「OC43」之情形)、HCoV-NL63株(有記載為「NL63」之情形)、HCoV-HKU1株(有記載為「HKU1」之情形)之4株(自京都府立醫科大學及山形縣衛生研究所入手)，經時地測定感染後的病毒增殖量。具體的感染/增殖實驗操作，首先，針對培養第28天的源自人類ES細胞之鼻腔上皮2D類器官，以作為低用量之5×105copies/well、作為高用量之5×106copies/well的條件，添加經單離的各病毒。接著，在感染後第1天至第8天為止每1日皆回收培養基作為試料，將培養基所含有之病毒量藉由即時PCR法進行測定。此外，亦觀察由病毒感染所致之細胞變性效果。低用量及高用量分別各實施3次實驗。 作為陽性對象者，在HCoV-229E株係實施使用MRC5細胞之病毒增殖試驗，在HCoV-OC43株係實施使用HCT-8細胞之病毒增殖試驗，在HCoV-NL63株係實施使用LLC-MK2-N細胞之病毒增殖試驗，在HCoV-HKU1株係實施使用VeroE6-TM2細胞之病毒增殖試驗，並與使用源自人類ES細胞之鼻腔上皮2D類器官的試驗進行比較。
將病毒增殖試驗之結果示於圖48、圖49及圖50。由上述檢討的結果可知，源自人類ES細胞之鼻腔上皮2D類器官，係未進行氣相液相界面培養法，而支持季節性冠狀病毒株HCoV-229E株、HCoV-OC43株、HCoV-NL63株、HCoV-HKU1株之全部4株的增殖。尤其是，HCoV-NL63株及HCoV-HKU1株係在株化培養細胞中難以支持增殖的季節性冠狀病毒株，顯示出藉由使用本案所記載之細胞集團及製造法，可有效率地將季節性冠狀病毒分離培養/增殖/調製(圖50)。
[表1-1]
Figure 111124633-A0202-12-0191-1
[表1-2]
Figure 111124633-A0202-12-0192-2
[表2]
Figure 111124633-A0202-12-0192-3
[序列表]
Figure 111124633-A0202-12-0193-56

Claims (28)

  1. 一種構成鼻腔上皮之細胞之製造方法，係包含下列步驟(1)至(4)：
    於Wnt訊息傳導路徑抑制物質之存在下懸浮培養多能性幹細胞之步驟(1)，
    於BMP訊息傳導路徑作用物質之存在下，將在前述步驟(1)所培養之細胞懸浮培養之步驟(2)，
    在選自由FGF訊息傳導路徑作用物質及BMP訊息傳導路徑抑制物質所組成群組中之至少1個之存在下，將在前述步驟(2)所培養之細胞懸浮培養之步驟(3)，及
    將在前述步驟(3)所培養之細胞進一步懸浮培養，獲得前述構成鼻腔上皮之細胞之步驟(4)，該步驟(4)係在選自由Wnt訊息傳導路徑抑制物質、FGF訊息傳導路徑作用物質及BMP訊息傳導路徑抑制物質所組成群組中之至少2個的不存在下，將前述細胞懸浮培養之步驟。
  2. 如請求項1所述之製造方法，其中，在前述步驟(4)中，係在Wnt訊息傳導路徑抑制物質、FGF訊息傳導路徑作用物質及BMP訊息傳導路徑抑制物質之不存在下，將前述細胞懸浮培養。
  3. 如請求項1或2所述之製造方法，其中，在前述步驟(4)中，係在選自由FGF訊息傳導路徑抑制物質、Shh訊息傳導路徑作用物質、BMP訊息傳導路徑作用物質、Wnt訊息傳導路徑作用物質、Notch訊息傳導路徑抑制物質、活化素/TGF-β訊息傳導路徑作用物質及視網酸訊息傳導路徑作用物質所組成群組中之至少1個之存在下，將前述細胞懸浮培養。
  4. 一種構成鼻腔上皮之細胞之製造方法，係包含下列步驟(1)至(3)：
    於Wnt訊息傳導路徑抑制物質之存在下，將多能性幹細胞在培養器材上進行接著培養之步驟(1)，
    於BMP訊息傳導路徑作用物質之存在下，將在前述步驟(1)所培養之細胞進行接著培養之步驟(2)，
    在選自由FGF訊息傳導路徑作用物質及BMP訊息傳導路徑抑制物質所組成群組中之至少1個之存在下，將在前述步驟(2)所培養之細胞進行接著培養之步驟(3)。
  5. 如請求項4所述之製造方法，其中，前述培養器材為塗覆有細胞外基質或是合成細胞接著分子之培養器材、具有用以進行培養基灌流的流路之培養器材、或具有可滲透氧或培養基的膜之培養器材。
  6. 如請求項1或2所述之製造方法，其中，前述步驟(1)係將前述多能性幹細胞懸浮培養，使細胞凝集物形成之步驟，
    前述步驟(2)係將前述細胞凝集物懸浮培養之步驟，
    前述步驟(3)係將在前述步驟(2)所培養之前述細胞凝集物懸浮培養至細胞凝集物中的細胞分化成嗅神經前驅細胞為止之步驟，
    前述步驟(4)係將在前述步驟(3)所培養之前述細胞凝集物培養至獲得構成上皮及前述鼻腔上皮之細胞凝集物之步驟，其中，在該上皮中，前述嗅神經前驅細胞係連續地存在，且前述鼻腔上皮係位於該上皮上。
  7. 如請求項1、2、4及5中任一項所述之製造方法，其中，在選自由前述步驟(3)及前述步驟(4)所組成群組中之至少1個步驟中，更存在有EGF訊息傳導路徑作用物質。
  8. 如請求項1、2、4及5中任一項所述之製造方法，其中，在選自由前述步驟(1)、前述步驟(2)、前述步驟(3)及前述步驟(4)所組成群組中之至少1個步驟中，更存在有TGFβ訊息傳導路徑抑制物質。
  9. 如請求項1、2、4及5中任一項所述之製造方法，其中，在選自由前述步驟(1)、前述步驟(2)、前述步驟(3)及前述步驟(4)所組成群組中之至少1個步驟中，更存在有JNK訊息傳導路徑抑制物質。
  10. 如請求項1、2、4及5中任一項所述之製造方法，其中，在選自由前述步驟(1)、前述步驟(2)、前述步驟(3)及前述步驟(4)所組成群組中之至少1個步驟中，更存在有TAK1抑制物質。
  11. 如請求項1、2、4及5中任一項所述之製造方法，其中，在選自由前述步驟(3)及前述步驟(4)所組成群組中之至少1個步驟中，更存在有具有減輕氧化壓力之作用的物質或針對壓力反應訊息傳導路徑之抑制物質。
  12. 如請求項1、2、4及5中任一項所述之製造方法，其中，在選自由前述步驟(3)及前述步驟(4)所組成群組中之至少1個步驟中，一邊搖動一邊培養細胞。
  13. 一種包含構成鼻腔上皮之細胞或其前驅細胞之細胞集團，係藉由請求項1、2、4及5中任一項所述之製造方法所獲得者。
  14. 一種細胞集團，係包含構成鼻腔上皮之細胞或其前驅細胞。
  15. 如請求項14所述之細胞集團，其中，前述構成鼻腔上皮之細胞係包含選自由分泌細胞、纖毛細胞、基底細胞、鹽細胞、神經內分泌細胞、孤立性化學感受上皮細胞及棒狀細胞所組成群組中之至少1個。
  16. 如請求項14或15所述之細胞集團，係具有基底側及頂端側之極性。
  17. 如請求項14或15所述之細胞集團，係更含有構成嗅上皮之細胞或其前驅細胞。
  18. 如請求項14或15所述之細胞集團，係更含有構成中樞神經系統之神經系細胞。
  19. 如請求項14或15所述之細胞集團，係三維立體的細胞集團，具有包含前述構成鼻腔上皮之細胞或其前驅細胞之鼻腔上皮樣組織、及藉由前述鼻腔上皮樣組織被覆表面的至少一部分之神經組織，其中，前述神經組織係包含構成中樞神經系統之神經系細胞或其前驅細胞。
  20. 如請求項19所述之細胞集團，係更含有將前述神經組織的表面至少一部分被覆之嗅上皮樣組織，其中，前述嗅上皮樣組織係包含構成嗅上皮之細胞或其前驅細胞。
  21. 如請求項14或15所述之細胞集團，其中，前述構成鼻腔上皮之細胞或其前驅細胞係與培養器材接著，藉由連續的上皮結構而形成二維的鼻腔上皮樣組織。
  22. 如請求項14或15所述之細胞集團，其中，前述構成鼻腔上皮之細胞或其前驅細胞之與遺傳性疾病或感染症相關之基因係缺失或變異。
  23. 如請求項22所述之細胞集團，其中，前述與遺傳性疾病或感染症相關之基因係ACE2。
  24. 一種疾病治療用化合物或對象物質的毒性之篩選方法，係使用如請求項14或15所述之細胞集團。
  25. 一種疾病治療用化合物或對象物質的毒性之篩選用套組，係包含如請求項14或15所述之細胞集團。
  26. 一種疾病特異性生物標記之探索方法，係使用如請求項14或15所述之細胞集團。
  27. 一種移植用細胞集團，係包含如請求項14或15所述之細胞集團或自該細胞集團精製後之細胞。
  28. 一種如請求項14或15所述之細胞集團或自該細胞集團精製後之細胞之用途，係於病毒之分離培養中使用。
TW111124633A 2021-06-30 2022-06-30 構成鼻腔上皮之細胞之製造方法、及包含構成鼻腔上皮之細胞或其前驅細胞之細胞集團 TW202317750A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2021-108806 2021-06-30
JP2021108806 2021-06-30

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TW202317750A true TW202317750A (zh) 2023-05-01

Family

ID=84692770

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW111124633A TW202317750A (zh) 2021-06-30 2022-06-30 構成鼻腔上皮之細胞之製造方法、及包含構成鼻腔上皮之細胞或其前驅細胞之細胞集團

Country Status (3)

Country Link
JP (1) JPWO2023277135A1 (zh)
TW (1) TW202317750A (zh)
WO (1) WO2023277135A1 (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117448271A (zh) * 2023-12-22 2024-01-26 上海元戊医学技术有限公司 一种诱导多能干细胞分化为中脑多巴胺能神经前体细胞的方法
CN117586944B (zh) * 2024-01-19 2024-04-30 成都思澍生物科技有限公司 一种鸡原始生殖细胞体外无血清扩增培养的方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20210308188A1 (en) * 2018-08-24 2021-10-07 Sumitomo Chemical Company, Limited Cell cluster including olfactory neuron or precursor cell thereof, and method for producing same

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2023277135A1 (zh) 2023-01-05
WO2023277135A1 (ja) 2023-01-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20230365928A1 (en) Cortical interneurons and other neuronal cells produced by the directed differentiation of pluripotent and multipotent cells
US10220117B2 (en) Methods of mammalian retinal stem cell production and applications
JP7352553B2 (ja) 嗅神経細胞又はその前駆細胞を含む細胞塊、及びその製造方法
JP6718431B2 (ja) 中脳ドーパミン作動性ニューロンの生産およびその使用方法
JP7360583B2 (ja) 網膜組織の製造方法
WO2017183732A1 (ja) 網膜組織の製造法
WO2023277135A1 (ja) 鼻腔上皮を構成する細胞の製造方法、及び鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞を含む細胞集団
JP6789814B2 (ja) 腺性下垂体又はその前駆組織の製造方法
JP2023011944A (ja) ヒト人工多能性幹細胞からの皮質ニューロンの分化
JP2023156413A (ja) 背側化シグナル伝達物質又は腹側化シグナル伝達物質による錐体視細胞又は桿体視細胞の増加方法
US20230233617A1 (en) Methods for differentiating stem cells into dopaminergic progenitor cells
CN107075467A (zh) 由干细胞分化肝细胞样细胞
CN111542598A (zh) 多能干细胞聚集抑制剂
WO2019103129A1 (ja) 下垂体組織を含む細胞塊の製造方法及びその細胞塊
JPWO2020100481A1 (ja) 脳オルガノイドの製造方法
WO2022168908A1 (ja) 多能性幹細胞由来の陰窩－絨毛様構造を有する腸管細胞の製造方法及びその用途
WO2023054396A1 (ja) 下垂体組織を含む細胞集団の製造方法及びその細胞集団
WO2023054395A1 (ja) 下垂体ホルモン産生細胞を含む細胞凝集体及びその製造方法
CN118043447A (zh) 包含垂体组织的细胞群的制备方法及该细胞群