JP6789814B2 - 腺性下垂体又はその前駆組織の製造方法 - Google Patents
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Description
即ち、本発明は下記の通りである:
[2]ヒト多能性幹細胞の凝集塊を、骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質及びShhシグナル経路作用物質を含む培地中で浮遊培養することにより、視床下部神経上皮組織及び表皮外胚葉を含むヒト細胞凝集塊を得ること、及び得られた視床下部神経上皮組織及び表皮外胚葉を含むヒト細胞凝集塊を、骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質及びShhシグナル経路作用物質を含む培地中で更に浮遊培養することにより、表皮外胚葉中に下垂体プラコード及び/又はラトケ嚢の形成を誘導し、1)視床下部神経上皮組織、及び2)下垂体プラコード及び/又はラトケ嚢を含むヒト細胞凝集塊を得ることを含む、[1]の製造方法。
[3]更なる浮遊培養に用いる培地がFGF2を更に含む、[2]の製造方法。
[4]1)視床下部神経上皮組織、及び2)下垂体プラコード及び/又はラトケ嚢を含むヒト細胞凝集塊を、Shhシグナル経路作用物質を含む培地中で更に浮遊培養することにより、下垂体プラコード及び/又はラトケ嚢から下垂体ホルモン産生細胞への分化を誘導し、腺性下垂体を含むヒト細胞凝集塊を得ることを含む、[2]又は[3]の製造方法。
[5]更なる浮遊培養に用いる培地がFGF2を更に含む、[4]の製造方法。
[6]更なる浮遊培養に用いる培地がNotchシグナル阻害剤を更に含む、[4]又は[5]の製造方法。
[7]Notchシグナル阻害剤がDAPTである、[6]の製造方法。
[8]下垂体ホルモン産生細胞が、成長ホルモン(GH)産生細胞、プロラクチン(PRL)産生細胞、及び副腎皮質刺激ホルモン(ACTH)産生細胞からなる群から選択される少なくとも1種である、[4]〜[7]のいずれかの製造方法。
[9]骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質がBMP4である、[1]〜[8]のいずれかの製造方法。
[10]Shhシグナル経路作用物質がSAGである、[1]〜[9]のいずれかの製造方法。
[11]視床下部神経上皮組織が腹側視床下部神経上皮組織である、[1]〜[10]のいずれかの製造方法。
[12]多能性幹細胞が胚性幹細胞又は誘導多能性幹細胞である、[1]〜[11]のいずれかの製造方法。
[13]浮遊培養をフィーダー細胞の非存在下で行う、[1]〜[12]のいずれかの製造方法。
[14][1]〜[13]のいずれかの製造方法により得られる細胞凝集塊。
「多能性幹細胞」とは、生体を構成するすべての細胞に分化しうる能力(分化多能性)と、細胞分裂を経て自己と同一の分化能を有する娘細胞を生み出す能力(自己複製能)とを併せ持つ細胞をいう。
(1) Oct3/4, Klf4, Sox2, c-Myc(ここで、Sox2はSox1, Sox3, Sox15, Sox17またはSox18で置換可能である。また、Klf4はKlf1, Klf2またはKlf5で置換可能である。さらに、c-MycはT58A(活性型変異体), N-Myc, L-Mycで置換可能である。)
(2) Oct3/4, Klf4, Sox2
(3) Oct3/4, Klf4, c-Myc
(4) Oct3/4, Sox2, Nanog, Lin28
(5) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, Nanog, Lin28
(6) Oct3/4, Klf4, Sox2, bFGF
(7) Oct3/4, Klf4, Sox2, SCF
(8) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, bFGF
(9) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, SCF
多能性幹細胞の凝集塊は、分散させた多能性幹細胞を、培養器に対して、非接着性の条件下で培養し(即ち、浮遊培養し)、複数の多能性幹細胞を集合させて凝集塊を形成させることにより、得ることができる。
(1)比較的小さな体積(例えば、1ml以下、500μl以下、200μl以下、100μl以下)の培養コンパートメント中に、分散した多能性幹細胞を閉じ込め、該コンパートメント中に1個の凝集塊を形成する方法。好ましくは分散した多能性幹細胞を閉じ込めた後、培養コンパートメントを静置する。培養コンパートメントとしては、マルチウェルプレート(384ウェル、192ウェル、96ウェル、48ウェル、24ウェル等)、マイクロポア、チャンバースライド等におけるウェルや、チューブ、ハンギングドロップ法における培地の液滴等を挙げることができるが、これらに限定されない。該コンパートメントに閉じ込められた分散した多能性幹細胞が、重力にうながされて1箇所に沈殿し、或いは細胞同士が接着することにより、1つの培養コンパートメントにつき、1つの凝集塊が形成される。マルチウェルプレート、マイクロポア、チャンバースライド、チューブ等の底の形状は、分散した多能性幹細胞が1箇所へ沈殿するのが容易となるように、U底又はV底とすることが好ましい。
(2)遠心チューブに分散した多能性幹細胞を入れ、これを遠心し、1箇所に多能性幹細胞を沈殿させることにより、該チューブ中に1個の凝集塊を形成する方法。
本発明は、多能性幹細胞の凝集塊を、骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質及びソニック・ヘッジホッグ(Shh)シグナル経路作用物質を含む培地中で浮遊培養することを含む、腺性下垂体又はその前駆組織を含む細胞凝集塊の製造方法を提供するものである。
第1の培養工程においては、多能性幹細胞の凝集塊を、骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質及びShhシグナル経路作用物質を含む培地中で浮遊培養する。
(1)複数の培養コンパートメントを用意し、1つの培養コンパートメントに1つの多能性幹細胞の凝集塊が含まれるように、質的に均一な、多能性幹細胞の凝集塊の集団を播く。(例えば、96ウェルプレートの各ウェルに1つずつ、多能性幹細胞の凝集塊を入れる。)そして、各培養コンパートメントにおいて、1つの多能性幹細胞の凝集塊を骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質及びShhシグナル経路作用物質を含む培地中で浮遊培養する。
(2)1つの培養コンパートメントに複数の多能性幹細胞の凝集塊が含まれるように、質的に均一な、多能性幹細胞の凝集塊の集団を1つの培養コンパートメントに播く。(例えば、10cmディッシュに、複数の多能性幹細胞の凝集塊を入れる。)そして、該コンパートメントにおいて、複数の多能性幹細胞の凝集塊を骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質及びShhシグナル経路作用物質を含む培地中で浮遊培養する。
第2の培養工程においては、第1の培養工程で得られた視床下部神経上皮組織及び表皮外胚葉を含む細胞凝集塊を、骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質及びShhシグナル経路作用物質を含む培地中で更に浮遊培養することにより、1)視床下部神経上皮組織、及び2)下垂体プラコード及び/又はラトケ嚢を含む細胞凝集塊を得る。骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質及びShhシグナル経路作用物質の作用により、表皮外胚葉から下垂体プラコード及び/又はラトケ嚢への更なる分化が誘導される。
第2の培養工程で得られた1)視床下部神経上皮組織、及び2)下垂体プラコード及び/又はラトケ嚢を含む細胞凝集塊を、Shhシグナル経路作用物質を含む培地中で更に浮遊培養することにより、腺性下垂体を含む細胞凝集塊を得ることができる(第3の培養工程)。第3の培養工程により、下垂体プラコード及び/又はラトケ嚢から、下垂体ホルモン産生細胞への分化が誘導され、下垂体プラコード及び/又はラトケ嚢中に下垂体ホルモン産生細胞が生じ、腺性下垂体が形成される。
更なる局面において、上記により得られた細胞凝集塊から、腺性下垂体又はその前駆組織(下垂体プラコード、ラトケ嚢等)を単離することができる。また、腺性下垂体を、トリプシン等のタンパク質分解酵素及び/又はEDTA等で処理することにより、下垂体ホルモン産生細胞を単離することができる、本発明は上記本発明の方法により得られる細胞凝集塊、腺性下垂体又はその前駆組織、及び下垂体ホルモン産生細胞を提供する。
(方法)
ヒトES細胞 (KhES-1)を常法によりMEF上で維持培養したものを用いた。視床下部組織への分化誘導をモニターするために、視床下部神経上皮のマーカーであるRxの遺伝子へVenus cDNAをノックインしたKhES-1を利用した。無血清浮遊凝集塊培養法(SFEBq法)によりヒトES細胞を分化させるために、Nakanoら(Cell Stem Cell, 2012)の方法により、ヒトES細胞を酵素により単一細胞へ分散させた上、低細胞接着性のV底96穴プレート(住友ベークライト)を用いて再凝集させた。1穴につき、5,000個の細胞を播種し、次の分化培地で5%CO2下に37℃で培養した。gfCDM培地(growth-factor-free Chemically Defined Medium; Watayaら, PNAS, 2008)+ 5% KSR(Invitrogen)。
播種日を分化培養0日として、0日目から3日目まで20 μM Y-27632(ROCK阻害剤;分散時の細胞死抑制剤:Watanabeら、 Nature Biotechnology, 2007)を添加し、培養3日目および6日目には、Y-27632を含まない分化培地で半量培地交換を行った。培養3日目から18日目までは、BMP4(最終濃度5 nM)を培地に添加した。18日目以降は、3日毎にBMP4を含まない培地で半量培地交換を行った。培養6日目以降はSAG(最終濃度2 μM)培地に加えた。18日目以降は、培養時の酸素分圧を40%とした。組織の分化を蛍光抗体法で解析した。
上記の方法で培養したヒトES細胞の凝集塊の内部は、分化培養17日目には、Rx::Venus陽性でChx10(網膜マーカー)陰性の視床下部の神経上皮組織で大きく占められており、一方、表面はE-cadherin陽性の表皮外胚葉が1層の細胞層を作っていた(図1A)。培養24日目には、Rx::Venus陽性の視床下部の多くの部分は、腹側視床下部のマーカーであるNkx2.1を発現していた(図1B)。表皮外胚葉は表皮外胚葉(口腔外胚葉を含む)のマーカーであるpan-cytokeratinを発現していたが、その一部は肥厚し表皮プラコード(下垂体プラコードを含む)の形態を示した(図1C)。
(方法)
実施例1の方法で、腹側視床下部組織と表皮プラコードを同時に含むヒトES細胞由来の細胞凝集塊を形成し、同様な条件で培養27日目あるいは30日目まで培養を継続し、蛍光抗体法で解析した。一部の培養では、培養15日目からはFGF2(最終濃度20 ng/ml)を培地に添加した。
培養27日目および30日目には、pan-cytokeratin陽性の表皮プラコードの肥厚は著明となり、蛍光抗体法による解析では、Lim3、Pitx1およびIsl1/2などの下垂体前駆細胞マーカーを強く発現していた(図2A)。また、これらのマーカーを発現する肥厚したプラコードの一部は、胎児のラトケ嚢の初期形成と同様に、内部に向かって陥入しており(図2B)、また他の一部は、嚢胞を形成していた(図2C)。FGF2の添加により、下垂体プラコードの形成は3割の増加を示した。
(方法)
実施例1の方法で、BMP4の添加の有無による細胞凝集塊の分化への影響を蛍光抗体法で解析した。
BMP4を添加しない場合、培養24日目の凝集塊の表面には、表皮外胚葉は形成されず、神経上皮が全体を占めていた。その神経上皮のほとんどはRx::Venusを発現せず、FoxG1陽性であり、大脳組織が生じていたことが判った(図3a, b)。SAGを添加しない場合は、FoxG1陽性かつPax6陽性の大脳皮質が、SAGを添加した場合は、FoxG1陽性かつNkx2.1陽性の大脳基底核が分化することが判った(図3a-d)。このように、外因性のBMP4は、1)表皮外胚葉を積極的に形成させること、とともに、2)大脳ではなく視床下部(下垂体プラコードの誘導に必須)の神経組織を凝集塊内に分化誘導する、という2つの役割を同時に行うことが、ヒト多能性幹細胞の浮遊凝集塊培養で明らかになった。
(方法)
実施例1の方法で、ヘッジホッグシグナルのアゴニストであるSAGの添加の有無による細胞凝集塊の分化への影響を蛍光抗体法で解析した。
SAGの添加をしない場合も、添加した場合も、どちらにおいても、培養24日目および27日目の凝集塊の表面には、表皮外胚葉が形成され、内部にはRx::Venus陽性の組織が全体を占めていた(図4a, b)。培養6日目からSAGを添加した場合には、実施例1,2のように凝集塊内部に腹側視床下部組織(Rx::Venus陽性、Chx10陰性、Nkx2.1陽性)が形成され、表面には下垂体プラコードが形成された(図4b, d, e)。一方、SAGを添加しない場合は、内部には神経網膜組織(Rx::Venus陽性、Chx10陽性、Nkx2.1陰性)の組織が形成され、表面に下垂体プラコードの形成は認められなかった(図4a, c)。このように、強いヘッジホッグシグナルを正しいタイミングで作用させることで、神経網膜ではなく、腹側視床下部が効率良く形成されることが明らかになった。
(方法)
実施例1、2と同様に、ヒトES細胞の浮遊凝集塊培養で、下垂体プラコードを自己形成させた。培養30日目よりEZ Sphereプレートに凝集塊を移し、40%O2、5%CO2下に37℃での浮遊培養を継続した。培養30日目から45日目は、gfCDM + 10%KSRにSAG (2 μM), FGF2 (20 ng/ml)を添加したものを培地に用いた。培養45日目以降は、同様の培地でKSRの濃度を20%に増加したものを用いて、培養した。内分泌細胞の分化を蛍光体法で解析した。
培養67日目のサンプルにおいて、Pitx1陽性の下垂体組織に、多数のACTH産生細胞が蛍光抗体法で確認された(図5a, b)。同様のACTH陽性細胞は、培養70日目および100日目のサンプルでも確認された(図5c, d)。
実施例5の方法で産生したACTH産生細胞を含む凝集塊を用いて、試験管内のホルモン分泌能を解析した。培養80日目の凝集塊16個を250 μlのHBSS(-)の溶液に入れた1.5 mlのEppendorfチューブを用いて、CRH(1 μg/ml)の存在下あるいは非存在下に37℃、10分間インキュベーションして、培養上清中のACTH濃度をELISA法で定量した。
CRH(1 μg/ml)の存在下のインキュベーション後の培養上清には、非存在下のインキュベーション後の培養上清に比して、5倍以上の濃度のACTHが分泌されていた(図6a)。
(方法)
ヒトES細胞を実施例5の方法(ただしFgf2は添加しない)を用いて分化させたACTH産生細胞に分化させた凝集塊を下垂体摘出術が施されたマウスの腎被膜下に移植した。これらのマウスには下垂体摘出術後にCRH負荷試験を行いACTH分泌能が失われていることを移植前に確認した。
腎被膜下移植したES細胞由来のACTH産生細胞は移植14日後も生着していることが蛍光抗体法で認められた(図7a, b)。対照群(Sham operation)ではCRH負荷後も血漿ACTH値は3 pg/ml未満,corticosterone値は0.2 ng/ml未満であった。一方,移植群ではCRH負荷後ACTH値は50-60 pg/ml,corticosterone値は19 ng/mlであった(図7c, d)。また移植群のCRH負荷後ACTH値は負荷前ACTH値の4倍以上であった(図7c)。
(方法)
ヒトES細胞由来のACTH産生細胞を実施例7と同様に,下垂体摘出術を施したマウス(9週齢)の腎被膜下に移植した。移植マウスの生存および体重変化を経過観察し,対照群(sham operation)と比較しマウスの自発運動についても評価した。マウスの自発運動は,ENV-044(MedAssociates, Georgia)を用いて、マウスが自発的にrunning wheelを1日に何回転させたかを計測した(Running wheel activity test)。また,IRセンサー (MDC-W02(Brain Science Idea, Osaka))を用いて、ケージの中でのマウスの自発的移動距離についても計測した(Home-cage activity test)。
移植群のマウスは,対照群に比し高いレベルの自発的運動を示した(図8a, b)。
また,対照群では,sham operation施行後64日までに全個体が死亡したが,移植群では,その時点 で83%の個体が生存していた(図8c)。さらに,移植群は対照群と比べ術後3および4週の体重減少を来しにくかった(図8d)。
(方法)
実施例5の方法で、ヒトES細胞由来の下垂体プラコードを形成し、長期培養した。培養65日目から74日目までの間、Notchシグナル阻害剤のDAPT(10 μM)を作用させて、その効果をqPCR法で解析した。
DAPT処理分と非処理分をqPCR法で比較すると、培養74日目の凝集塊において、ACTH産生細胞のマーカーであり、ACTH産生の上流制御をする転写因子Tbx19の発現が処理分で8倍以上に上昇していた(図9)。
(方法)
実施例5の方法で、ヒトES細胞由来の下垂体プラコードを形成し、長期培養した。培養67日目あるいは70日目に、内分泌細胞の分化を蛍光抗体法で解析した。
培養67日目のPitx1陽性の下垂体プラコードを解析したところ、ACTH産生細胞に加え、PRL産生細胞が存在していた(図10a)。培養70日目のPitx1陽性の下垂体プラコードを解析したところ、多数のGH産生細胞も検出された(図10b)。
(方法)
分化誘導6日後まで実施例1の培養条件で培養したのち、6日目以降は、3日毎にBMP4を含まない培地で半量培地交換を行い、さらにSAG(最終濃度 1 μM)を6日目から12日目まで培地に加えた。18日目以降は、培養時の酸素分圧を40%とした。組織の分化を蛍光抗体法で解析した。
上記の方法で培養したヒトES細胞の凝集塊の内部は、分化培養24日目には,背側視床下部の神経上皮(Rx::venus陽性,Pax6陽性,Chx10陰性)が腹側視床下部組織(Rx::venus陽性,Nkx2.1陽性,Chx10陰性)とともに認められた(図11a)。さらに分化培養81日目には、背側視床下部の後期マーカーであるOtpの発現も認められた(図11b)。このように実施例1の分化条件よりもBMP4を作用させる期間を短くし、さらにSAGの濃度を下げることで、背側視床下部が効率よく形成されることが明らかになった。
(方法)
実施例10の方法に加え、培養72日目から84日目までハイドロコルチゾン(1 μg/ml)を含む培地で分化させたGH産生細胞を含む凝集塊を用いて、試験管内のホルモン分泌能を解析した。培養84日目の凝集塊33個をHBSS 500 μlに入れた1.5 mlのEppendorfチューブを用いて、凝集塊をGRF(100 ng/ml)の存在下あるいは非存在下に、37℃、30分間インキュベーションして、培養上清中のGH濃度をELISA法で定量した。
GRF存在下のインキュベーション後の培養上清には、非存在下のインキュベーション後の培養上清に比し、6倍以上の濃度のGHが分泌された(図12)。
(方法)
実施例10の方法に加え、培養70日目から84日目までデキサメサゾン(40 ng/ml)を含む培地で分化させたGH産生細胞を含む凝集塊を用いて、試験管内のホルモン分泌能を解析した。培養84日目の凝集塊30個を培地 750 μlに入れた1.5 mlのEppendorfチューブを用いて、凝集塊をGRF (0.1, 1, 10 μg/ml)の存在下に37℃、30分間インキュベーションして、培養上清中のGH濃度をELISA法で定量した。
さらに,ソマトスタチンによるGH分泌抑制能を検討するために、培養98日目の凝集塊18個をソマトスタチン(100 ng/ml)の存在下あるいは非存在下に37℃、90分間インキュベーションしてGRF処理後のGHの放出に対する効果を解析した。
分化培地にデキサメサゾンを加えない場合、培養上清中のGH濃度はGRFでインキュベーションしても極めて低かったのに対し、デキサメサゾンを加えるとGRFに反応して培養上清中のGH分泌が認められた(図13a)。
ソマトスタチン(100 ng/ml)の存在下のプレインキュベーション分は、非存在下のプレインキュベーション分に比して、GHの濃度は約4分の1に低下していた(図13b)
(方法)
実施例13の方法で84日間培養した内分泌細胞の分化を蛍光抗体法で解析した。
培養84日目の下垂体プラコードを解析したところ、GH、PRL産生細胞に加え,TSH産生細胞が存在していた(図14a-c)。
(方法)
実施例8の方法に加え、培養72日目から82日目までNotchシグナル阻害剤のDAPT(10 μM)を作用させた下垂体プラコードの分化を蛍光抗体法で解析した。
下垂体プラコード内にLH産生細胞およびFSH産生細胞が認められた(図15a, b)。
Claims (15)
- (1)分散したヒト多能性幹細胞を迅速に凝集させて、1つの培養コンパートメント中に1つの凝集塊を形成させる工程、
(2)形成されたヒト多能性幹細胞の凝集塊を、BMP4及びSAGを含む無血清培地中で浮遊培養することにより、内部に視床下部神経上皮組織、及びその表面の一部に厚肥した表皮プラコードを含む表皮外胚葉を含むヒト細胞凝集塊を形成させる工程、
(3)得られた視床下部神経上皮組織及びその一部に厚肥した表皮プラコードを含む表皮外胚葉を含むヒト細胞凝集塊を、BMP4及びSAGを含む無血清培地中で更に浮遊培養することにより、表皮外胚葉中に下垂体プラコード及びラトケ嚢の形成を誘導し、1)視床下部神経上皮組織、及び2)下垂体プラコード及びラトケ嚢を含むヒト細胞凝集塊を形成させる工程、及び
(4)1)視床下部神経上皮組織、及び2)下垂体プラコード及びラトケ嚢を含むヒト細胞凝集塊を、SAGを含む培地中で更に37〜70日間浮遊培養することにより、下垂体プラコード及びラトケ嚢から下垂体ホルモン産生細胞への分化を誘導し、腺性下垂体を含むヒト細胞凝集塊を形成させる工程
を含む、内部に1)視床下部神経上皮組織、及び、表面に2)腺性下垂体を含むヒト細胞凝集塊の製造方法。 - 前記腺性下垂体が、成長ホルモン(GH)産生細胞、プロラクチン(PRL)産生細胞及び副腎皮質刺激ホルモン(ACTH)産生細胞を含む、請求項1に記載の製造方法。
- 工程(3)の更なる浮遊培養に用いる培地がFGF2を更に含む、請求項1又は2記載の製造方法。
- 工程(4)の更なる浮遊培養に用いる培地がFGF2を更に含む、請求項1〜3のいずれか1項記載の製造方法。
- 工程(3)及び工程(4)の培地が、Notchシグナル阻害剤を含まないことを特徴とする、請求項1〜4のいずれか1項記載の製造方法。
- Notchシグナル阻害剤がDAPTである、請求項5記載の製造方法。
- 工程(4)の培地が、BMP4を含まないことを特徴とする、請求項1〜6のいずれか1項記載の製造方法。
- 視床下部神経上皮組織が腹側視床下部神経上皮組織である、請求項1〜7のいずれか1項記載の製造方法。
- 多能性幹細胞が胚性幹細胞又は誘導多能性幹細胞である、請求項1〜8のいずれか1項記載の製造方法。
- 浮遊培養をフィーダー細胞の非存在下で行う、請求項1〜9のいずれか1項記載の製造方法。
- 工程(2)及び/又は工程(3)のBMP4の濃度が、1〜10 nMである、請求項1〜10のいずれか1項記載の製造方法。
- 工程(2)〜工程(4)の少なくとも1つの工程のSAGの濃度が、100 nM〜10 μMである、請求項1〜11のいずれか1項記載の製造方法。
- 工程(3)及び/又は工程(4)の酸素分圧が、30〜60%である、請求項1〜12のいずれか1項記載の製造方法。
- 工程(2)において、15〜20日間浮遊培養が行われる、請求項1〜13のいずれか1項記載の製造方法。
- 工程(3)の工程において、6〜12日間浮遊培養が行われる、請求項1〜14のいずれか1項記載の製造方法。
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