JP7465569B2 - ヒト多能性幹細胞から視床下部ニューロンへの分化誘導 - Google Patents
ヒト多能性幹細胞から視床下部ニューロンへの分化誘導 Download PDFInfo
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Description
以下の発明は、主として上記の成果に基づく。
[1]以下のステップ(1)及び(2)を含む、視床下部組織を含む細胞構造体の製造方法:
(1)ヒト多能性幹細胞の凝集塊を、低濃度の骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質及び低濃度のShhシグナル経路作用物質を含む培地中で浮遊培養するステップ、
(2)ステップ(1)で得られた細胞凝集塊を、低濃度のShhシグナル経路作用物質を含む培地中で更に浮遊培養するステップ。
[2]ステップ(2)を高酸素分圧条件下で行う、[1]に記載の製造方法。
[3]以下のステップ(3)を更に含む、[1]又は[2]に記載の製造方法:
(3)ステップ(2)で得られた細胞凝集塊を回収し、細胞凝集塊を構成する細胞を分散培養するステップ。
[4]ステップ(3)を高酸素分圧条件下で行う、[3]に記載の製造方法。
[5]ステップ(1)における前記骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質がBMP4であり、培地中のその濃度が0.1 nM~5.0 nMであり、
ステップ(1)及び(2)における前記Shhシグナル経路作用物質がSAGであり、培地中のその濃度が0.1μM~2.0μMであり、
前記ステップ(1)及び(2)によって背側視床下部組織への分化が誘導される、
[1]~[4]のいずれか一項に記載の製造方法。
[6]前記背側視床下部組織はバゾプレシンニューロン、オキシトシンニューロン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモンニューロン、コルチコトロピン放出ホルモンニューロン及びニューロペプチドYニューロンからなる群より選択される一以上のニューロンを含む、[5]に記載の製造方法。
[7]ステップ(1)における前記骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質がBMP4であり、培地中のその濃度が0.1 nM~3.0 nMであり、
ステップ(1)及び(2)における前記Shhシグナル経路作用物質がSAGであり、培地中のその濃度が0.1μM~2.0μMであり、
前記培地がAkt阻害剤を更に含み、
前記ステップ(1)及び(2)によって腹側視床下部組織への分化が誘導される、[1]~[4]のいずれか一項に記載の製造方法。
[8]前記腹側視床下部組織はアグーチ関連タンパク質ニューロン、プロオピオメラノコルチンニューロン、メラニン凝集ホルモンニューロン及びOrexinニューロンからなる群より選択される一以上のニューロンを含む、[7]に記載の製造方法。
[9]前記浮遊培養をフィーダー細胞の非存在下で行う、[1]~[8]のいずれか一項に記載の製造方法。
[10]ステップ(1)における前記凝集塊が、分散させたヒト多能性幹細胞の浮遊培養によって形成される、[1]~[9]のいずれか一項に記載の製造方法。
[11]前記浮遊培養を無血清凝集浮遊培養法で行う、[10]に記載の製造方法。
[12]以下のステップ(i)~(iii)を含む、視床下部組織と下垂体組織を含む細胞構造体の製造方法:
(i)ヒト多能性幹細胞の凝集塊を、骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質及びShhシグナル経路作用物質を含む培地中で浮遊培養するステップ、
(ii)ステップ(i)で形成された細胞凝集塊を、骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質及びShhシグナル経路作用物質を含む培地中で更に浮遊培養するステップ、
(iii)ステップ(ii)で得られた細胞凝集塊を、下垂体及び視床下部の同時誘導に適した培地中で浮遊培養するステップ
[13]ステップ(ii)及び(iii)を高酸素分圧条件下で行う、[12]に記載の製造方法。
[14]ステップ(ii)とステップ(iii)の間に以下のステップ(a)を行い、ステップ(iii)ではステップ(a)で得られた細胞凝集塊を浮遊培養する、[12]又は[13]に記載の製造方法:
(a)ステップ(ii)で得られた細胞凝集塊を、Shhシグナル経路作用物質を含む培地中で更に浮遊培養するステップ。
[15]ステップ(a)を高酸素分圧条件下で行う、[12]~[14]のいずれか一項に記載の製造方法。
[16]前記浮遊培養をフィーダー細胞の非存在下で行う、[12]~[15]のいずれか一項に記載の製造方法。
[17]ステップ(i)における前記凝集塊が、分散させたヒト多能性幹細胞の浮遊培養によって形成される、[12]~[16]のいずれか一項に記載の製造方法。
[18]骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質がBMP4である、[12]~[17]のいずれか一項に記載の製造方法。
[19]Shhシグナル経路作用物質がSAGである、[12]~[18]のいずれか一項に記載の製造方法。
[20][1]~[19]のいずれか一項に記載の製造方法で得られる細胞構造体。
本発明の第1の局面は、視床下部組織を含む細胞構造体を製造する方法に関する。視床下部は弓状核、室傍核、側室周囲核、視索上核、視索前核、背内側視床下部核、腹内側視床下部核、後核などから構成される。視床下部には神経細胞と内分泌細胞の両方の機能を合わせ持つ細胞群が存在する。視床下部をその位置関係から背側視床下部と腹側視床下部に大別することができる。背側視床下部と腹側視床下部には各々特徴的な神経細胞(視床下部ニューロン)が存在する。視床下部において主に背側寄りに局在を認める神経細胞にはバゾプレシン(AVP)ニューロン、オキシトシン(OXT)ニューロン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン(TRH)ニューロン、コルチコトロピン放出ホルモン(CRH)ニューロン、ニューロペプチドY(NPY)ニューロン等があり、主に腹側寄りに局在を認める神経細胞にはアグーチ関連タンパク質(AgRP)ニューロン、プロオピオメラノコルチン(POMC)ニューロン、メラニン凝集ホルモン(MCH)ニューロン、Orexinニューロン等がある。
(1)ヒト多能性幹細胞の凝集塊を、低濃度の骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質及び低濃度のShhシグナル経路作用物質を含む培地中で浮遊培養するステップ
(2)ステップ(1)で得られた細胞凝集塊を、Shhシグナル経路作用物質を含む培地中で更に浮遊培養するステップ
ステップ(1)では、まず、ヒト多能性幹細胞の凝集塊を用意する。「ヒト多能性幹細胞」とは、生体を構成するすべての細胞に分化しうる能力(分化多能性)と、細胞分裂を経て自己と同一の分化能を有する娘細胞を生み出す能力(自己複製能)とを併せ持つヒト細胞をいう。分化多能性は、評価対象の細胞を、ヌードマウスに移植し、三胚葉(外胚葉、中胚葉、内胚葉)のそれぞれの細胞を含むテラトーマ形成の有無を試験することにより、評価することができる。
(1)比較的小さな体積(例えば、1ml以下、500μl以下、200μl以下、100μl以下)の培養コンパートメント中に、分散したヒト多能性幹細胞を閉じ込め、コンパートメント中に1個の凝集塊を形成させる。好ましくは、分散したヒト多能性幹細胞を閉じ込めた後、培養コンパートメントを静置する。培養コンパートメントとしては、マルチウェルプレート(384ウェル、192ウェル、96ウェル、48ウェル、24ウェル等)、マイクロポア、チャンバースライド等におけるウェルや、チューブ、ハンギングドロップ法における培地の液滴等を挙げることができるが、これらに限定されない。コンパートメントに閉じ込められた、分散したヒト多能性幹細胞が重力の作用で1箇所に沈殿し、或いは細胞同士が接着することにより、1つのコンパートメントにつき1つの凝集塊が形成される。マルチウェルプレート、マイクロポア、チャンバースライド、チューブ等の底の形状は、分散したヒト多能性幹細胞が1箇所へ沈殿するのが容易となるようにU底又はV底であることが好ましい。
(2)分散したヒト多能性幹細胞を遠心チューブに入れて遠心し、1箇所にヒト多能性幹細胞を沈殿させる。チューブ中に1個の凝集塊が形成される。
(A)複数の培養コンパートメントを用意し、1つの培養コンパートメントに1つのヒト多能性幹細胞の凝集塊が含まれるように、質的に均一な、ヒト多能性幹細胞の凝集塊の集団を播く。(例えば、96ウェルプレートの各ウェルにヒト多能性幹細胞の凝集塊を1つずつ入れる。)そして、各培養コンパートメントにおいて、1つのヒト多能性幹細胞の凝集塊を低濃度の骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質及び低濃度のShhシグナル経路作用物質を含む培地中で浮遊培養する。
(B)1つの培養コンパートメントに複数のヒト多能性幹細胞の凝集塊が含まれるように、質的に均一な、ヒト多能性幹細胞の凝集塊の集団を1つの培養コンパートメントに播く。(例えば、10cmディッシュに、複数のヒト多能性幹細胞の凝集塊を入れる。)そして、当該コンパートメントにおいて、複数のヒト多能性幹細胞の凝集塊を低濃度の骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質及び低濃度のShhシグナル経路作用物質を含む培地中で浮遊培養する。
ステップ(1)に続くステップ(2)では、ステップ(1)で得られた細胞凝集塊を、低濃度のShhシグナル経路作用物質を含む培地中で更に浮遊培養する。このステップによって、視床下部組織への更なる分化が誘導される。特に言及しない培養条件(培養方法(好ましくは静置培養が採用される)、フィーダー細胞の使用の可能性(好ましくはフィーダー細胞非存在下で培養する)、使用可能な培養器、使用する基礎培地、Shhシグナル経路作用物質以外の添加物等)についてはステップ(1)と同様である。以下では、ステップ(2)に特徴的な培養条件を説明する。
本発明の製造方法では、好ましくは、ステップ(1)及び(2)に加えて以下のステップ(3)を行う。
(3)ステップ(2)で得られた細胞凝集塊を回収し、細胞凝集塊を構成する細胞を分散培養するステップ
本発明の第2の局面は、視床下部組織と下垂体組織を含む細胞構造体(以下、「ハイブリッド型細胞構造体」とも呼ぶ)の製造方法に関する。本発明の製造方法では、以下のステップ(i)~(iii)を行う。尚、特に言及しない事項については、上記第1の局面と同様であり、対応する説明が援用される。
(i)ヒト多能性幹細胞の凝集塊を、骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質及びShhシグナル経路作用物質を含む培地中で浮遊培養するステップ
(ii)ステップ(i)で形成された細胞凝集塊を、骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質及びShhシグナル経路作用物質を含む培地中で更に浮遊培養するステップ
(iii)ステップ(ii)で得られた細胞凝集塊を、下垂体及び視床下部の同時誘導に適した培地中で浮遊培養するステップ
ステップ(i)では、まず、本発明の第1の局面の場合と同様の手段でヒト多能性幹細胞の凝集塊を用意し、骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質及びShhシグナル経路作用物質を含む培地中で浮遊培養する。
(A)複数の培養コンパートメントを用意し、1つの培養コンパートメントに1つのヒト多能性幹細胞の凝集塊が含まれるように、質的に均一な、ヒト多能性幹細胞の凝集塊の集団を播く。(例えば、96ウェルプレートの各ウェルにヒト多能性幹細胞の凝集塊を1つずつ入れる。)そして、各培養コンパートメントにおいて、1つのヒト多能性幹細胞の凝集塊を骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質及びShhシグナル経路作用物質を含む培地中で浮遊培養する。
(B)1つの培養コンパートメントに複数のヒト多能性幹細胞の凝集塊が含まれるように、質的に均一な、ヒト多能性幹細胞の凝集塊の集団を1つの培養コンパートメントに播く。(例えば、10cmディッシュに、複数のヒト多能性幹細胞の凝集塊を入れる。)そして、当該コンパートメントにおいて、複数のヒト多能性幹細胞の凝集塊を骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質及びShhシグナル経路作用物質を含む培地中で浮遊培養する。
ステップ(i)に続くステップ(ii)では、ステップ(i)で得られた細胞凝集塊を、骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質及びShhシグナル経路作用物質を含む培地中で更に浮遊培養する。このステップによって、視床下部及び下垂体への更なる分化が誘導される。特に言及しない培養条件(培養方法(好ましくは静置培養が採用される)、フィーダー細胞の使用の可能性(好ましくはフィーダー細胞非存在下で培養する)、使用可能な培養器、使用する基礎培地、骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質及びShhシグナル経路作用物質以外の添加物等)についてはステップ(i)と同様である。以下では、ステップ(ii)に特徴的な培養条件を説明する。
ステップ(ii)で得られた細胞凝集塊は更なる浮遊培養に供される。このステップの培養には、下垂体及び視床下部の同時誘導に適した培地が用いられる。換言すれば、培地組成を変更し、下垂体及び視床下部の同時誘導を促す。
(a)ステップ(ii)で得られた細胞凝集塊を、Shhシグナル経路作用物質を含む培地中で更に浮遊培養するステップ
本発明の製造方法により得られた細胞構造体、即ち、背側若しくは腹側の視床下部組織を含む細胞構造体又はハイブリッド型細胞構造体、或いはその一部(細胞構造体を構成する組織又は細胞)は、例えば、移植医療に利用される。「細胞構造体の一部」は、メス等による裁断、タンパク質分解酵素やEDTA等による処理等によって調製することができる。移植医療などへの適用に先立って、調製した細胞を細胞表面マーカー、形態、分泌物質などを指標として精製ないし純化してもよい。
1.ヒトES細胞から視床下部への分化誘導法の検討
(1)既報の方法の適用
Watayaらは、マウスES細胞から視床下部ニューロンへ分化誘導する方法を確立した(Wataya T. et al., Proc Natl Acad Sci USA 105(33): 11796-11801 (2008).)。マウスES細胞を用いた場合には当該方法によってAVPニューロンへ分化することを確認した(図1左)。
凝集塊が形成しなかった原因が栄養不足にあると考え、gfCDMに血清代替物KSRを少量添加し、その効果を検証した。具体的には、gfCDM培地に2%、5%、10%、20%のKSRを混合してSFEBq法を施行した。18日目以降は、培養時の酸素分圧を40%とした。組織の分化を蛍光抗体法で解析した。
終脳へと位置情報がずれた原因はKSRが含む種々の成長因子にあると考え、骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質を添加することにした。具体的には、以下の条件で分化誘導を試みた。SFEBq法施行後6日目より3.0 nM程度の骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質を含む培地にて浮遊培養した。培養15日目の培地交換からは、骨形成因子シグナル伝達活性化物質を含まない培地を用いて半量の培地を交換することにした(従って、培養15日目以降は培地交換の度に骨形成因子シグナル伝達活性化物質の濃度が培地交換前の1/2になる)。培地交換の頻度は3日に1回である。
神経網膜への分化が誘導された原因が腹側化因子の不足にあると考え、腹側化因子のShhシグナル(ShhアゴニストであるSAG)を追加することにした。具体的には、以下の条件で分化誘導を試みた。SFEBq法施行後6日目より少量の骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質(具体的例では1.5~2.0 nM)と少量のSAG(具体例では0.5 μM)を含む培地にて浮遊培養した。12日目より骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質のみ濃度を漸減し、SAGの濃度は維持した。Shhシグナルを加えることで、培養30日目においてRxとPax6が共陽性かつChx10陰性の細胞凝集塊を認め、視床下部前駆細胞へと分化させることが可能になった(図4左)。視床下部前駆細胞の分化効率は80%を超えた(図4右)。
背側視床下部と腹側視床下部を作り分けることを目指し、更に検討した。骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質及びSAGの添加濃度と添加タイミング、Akt阻害剤の添加有無と濃度及びタイミングを検討した。背側視床下部条件としては、(4)の培養条件を採用した。一方、腹側視床下部への分化を促すために、BMP4の最終濃度を1.0 nMに変更した。加えて、Akt阻害剤を最終濃度0.5μMで培養開始6日目から添加した。
背側視床下部誘導条件にて浮遊培養を継続した結果、培養60日目にはOtpとBrn2の発現(一般に、OtpとBrn2陽性の視床下部は、AVPニューロンの前駆状態にあると考えられる)を確認し(図6)、培養103日目でAVP陽性細胞を少数認めた(図7)。誘導効率の向上を目指し、神経発生に有利とされる分散培養を組み入れることにした。具体的には、以下の条件で分化誘導を試みた。細胞凝集塊を分散し、Laminin, Poly-D-Lysine, Matrigelにてコーティングしたガラス板上に2×104~40×104 cells/cm2で細胞を播種し、DFNB培地にNT3、BDNF、CNTF、FBSを添加した培地にて平面培養を行った。尚、3日に1回の頻度で培地交換を行った。
上記条件((6)の欄)で分化誘導し、培養150日目に以下の方法でOXTニューロン、TRHニューロン、CRHニューロン、NPYニューロン、AgRPニューロン、POMCニューロン、MCHニューロン、及びOrexinニューロンを検出した。
視床下部と下垂体は、本来は機能的に不可分なものであることから、視床下部と下垂体が機能的に一体化した構造体は創薬スクリーニング等のツールとして、或いは移植材料として極めて有用である。そこで、視床下部と下垂体が機能的に一体化した構造体の構築を目指し、以下の検討を行った。Ozone Cらは、ヒトES細胞から下垂体への分化誘導方法を報告した(Functional anterior pituitary generated in self-organizing culture of human embryonic stem cells. Ozone C, Suga H, Eiraku M, Kadoshima T, Yonemura S, Takata N, Oiso Y, Tsuji T, Sasai Y. Nat Commun. 2016 Jan 14;7:10351. doi: 10.1038/ncomms10351.)。この方法を再現したところ、報告されている通り、初期の視床下部前駆細胞と下垂体原基とが同時誘導された。しかしながら、視床下部組織は培養途中で分化が停止し、視床下部ホルモンを発現するニューロンにまでは到達しない。そこで、培養前半は背側視床下部誘導条件に準じた条件(但し、骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質とShhシグナル経路作用物質の濃度を高く設定した。また、培養18日目の培地交換からは、骨形成因子シグナル伝達活性化物質を含まない培地を用いて半量の培地を交換することにした)とし、培養後半については、使用する培地の組成を改良し、下垂体のみならず視床下部への分化にも適するようにした。具体的には、上記ステップ(ii)に用いる培地と分散培養に用いる培地を容量比1:1で混合し、血清代替物(例えばKSR)を20%加えたものとし(図17を参照)、浮遊培養を継続した。
以上の検討によって、背側視床下部への分化誘導条件と腹側視床下部への分化誘導条件が見出された。また、視床下部と下垂体を同時に成熟させることにより、視床下部と下垂体が機能的に一体化した構造体の構築を可能にする分化誘導条件も判明した。好適な分化誘導条件の具体例(概要)を図14(背側視床下部)、図15(腹側視床下部)、図16、17(視床下部と下垂体の同時成熟)に示す。
上記検討によって見出された分化誘導条件がヒトiPS細胞から視床下部を誘導すること、及び視床下部と下垂体の同時成熟に有効であることを確認するため、以下の検証実験を行った。
ヒトES細胞を用いた検討によって見出された背側視床下部誘導条件(A.1.(6)の欄を参照)でヒトiPS細胞(201B7株)を培養した。その結果、AVPニューロンの出現が確認された(図18)。
(1)下垂体の成熟化
視床下部と下垂体の同時成熟に有効であった条件(A.2.の欄を参照)でヒトiPS細胞(201B7株)を培養した。培養60日目には下垂体組織と視床下部組織が認められ、下垂体組織にはACTHニューロンが検出された。また、長期培養によって下垂体組織からのACTHの分泌量が増加し(図19)、培養時間の経過に伴って下垂体組織の成熟化が進んでいることが確認された。
培養70日目に下垂体組織と視床下部組織を分離し、下垂体組織のみで培養を継続した場合(図20A)と下垂体組織と視床下部組織を再度隣接させて培養した場合(図20B)で組織の成熟化を比較評価した。培養150日目で培養液中のACTH濃度を測定したところ、下垂体組織と視床下部組織を再度隣接させて培養した場合のACTH濃度が有意に高かった(図20右)。この結果は、二つの組織を隣接した状態で培養することがその成熟化に極めて重要であることを示唆する。
(1)の条件で培養して得られた下垂体組織の機能を評価するため、CRHを用いたACTH刺激試験(図21右)を行った。試験方法は既報(Ozone C et al., Functional anterior pituitary generated in self-organizing culture of human embryonic stem cells. Nat Commun. 2016 Jan 14;7:10351.)の方法に準じた(CRHは5μg/mlで添加)。試験の結果、CRHに反応してACTHが分泌すること、即ち、機能的なACTHニューロンが得られていることが示された(図21左)。尚、蛍光抗体法で解析し、ACTH陽性細胞がCRH-R1陽性であることも確認した(図21中央)。
(1)の条件で培養して得られた下垂体組織の機能を更に評価するため、デキサメサゾンを用いたACTH抑制試験(図22右)を行った。CRH添加による刺激を行う際にデキサメサゾンを500ng/mlで添加し(試験群)、デキサメサゾンを添加しない場合(コンロール群)とACTH分泌量を比較した。試験の結果、デキサメサゾンによってACTHの分泌が抑制された(図22左)。即ち、ステロイドによるネガティブフィードバックが生ずる機能的な下垂体組織が形成されていることが確認された。
(1)の条件で培養して得られた下垂体組織の機能を更に評価するため、CRH-R1阻害薬(Antalarmin、NBI2719)を用いたACTH抑制試験を行った(図23右)。CRH添加による刺激を行う際にCRH-R1阻害薬を10-5Mで添加し(試験群)、CRH-R1阻害薬を添加しない場合(コンロール群)とACTH分泌量を比較した。試験の結果、CRH-R1阻害薬によってACTHの分泌が抑制された(図23左と中央)。この結果は、ACTHニューロン(ACTH陽性細胞)がCRHニューロン(CRH陽性細胞)の制御を受けて機能していることを示唆する。
同時成熟によって得られた構造体の低血糖ストレスへの反応性を評価した(図24右)。低グルコース刺激によるACTH分泌量の変化を調べた結果、低グルコース刺激に反応してACTH分泌量が増大し(図24左)、この反応性はCHRH-R1阻害薬によって減弱した(図24中央)。これらの結果は、同時成熟によって得られた構造体に含まれるACTHニューロン(ACTH陽性細胞)が視床下部の制御を受けて機能していることを示唆するとともに、視床下部と下垂体が機能的に一体化した構造体が形成されていることを裏づける。
Claims (12)
- 以下のステップ(i)~(iv)を含む、視床下部組織と下垂体組織を含む細胞構造体の製造方法:
(i)ヒト多能性幹細胞の凝集塊を、BMP4を用いる場合の0.1nM~10nMに相当する濃度の、BMP4、BMP2、BMP7及びGDF5からなる群より選択される少なくとも1種の骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質、ならびに、Smoothened Agonist (SAG)を用いる場合の100nM~2μMに相当する濃度の、Shh蛋白質、Shh受容体アゴニスト、Purmorphamine、SAG及びHh-Ag1.5からなる群より選択される少なくとも1種のShhシグナル経路作用物質を含む培地中で15~20日間浮遊培養するステップ、
(ii)ステップ(i)で形成された細胞凝集塊を、BMP4 を用いる場合の0.1nM~10nMに相当する濃度の、BMP4、BMP2、BMP7及びGDF5からなる群より選択される少なくとも1種の骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質、ならびに、SAGを用いる場合の100nM~2μMに相当する濃度の、Shh蛋白質、Shh受容体アゴニスト、Purmorphamine、SAG及びHh-Ag1.5からなる群より選択される少なくとも1種のShhシグナル経路作用物質を含む培地中、30%~60%の酸素分圧条件下で6~20日間更に浮遊培養するステップ、
(iii)ステップ(ii)で得られた細胞凝集塊を、SAGを用いる場合の100nM~2μMに相当する濃度の、Shh蛋白質、Shh受容体アゴニスト、Purmorphamine、SAG及びHh-Ag1.5からなる群より選択される少なくとも1種のShhシグナル経路作用物質を含み、骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質を含まない培地中、30%~60%の酸素分圧条件下で10~40日間更に浮遊培養するステップ、
(iv)ステップ(iii)で得られた細胞凝集塊を、下垂体及び視床下部の同時誘導に適した培地中、30%~60%の酸素分圧条件下で50~200日間浮遊培養するステップ、
ここで、前記ステップ(iv)の下垂体及び視床下部の同時誘導に適した培地が、ステップ(iii)に用いる培地と、毛様体神経栄養因子(CNTF)、脳由来神経栄養因子(BDNF)又はLM22A-4、ニューロトロフィン3(NT-3)、ウシ胎児血清又は血清代替物、N2サプリメント、及びB27サプリメントを含む培地との混合培地である。 - 前記浮遊培養をフィーダー細胞の非存在下で行う、請求項1に記載の製造方法。
- ステップ(i)における前記凝集塊が、分散させたヒト多能性幹細胞の浮遊培養によって形成される、請求項1又は2に記載の製造方法。
- 骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質がBMP4である、請求項1~3のいずれか一項に記載の製造方法。
- Shhシグナル経路作用物質がSAGである、請求項1~4のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記ステップ(iv)の下垂体及び視床下部の同時誘導に適した培地が、ステップ(iii)に用いる培地と、毛様体神経栄養因子(CNTF)、脳由来神経栄養因子(BDNF)又はLM22A-4、ニューロトロフィン3(NT-3)、ウシ胎児血清又は血清代替物、N2サプリメント、及びB27サプリメントを含む培地とを容量比1:1で混合した混合培地であり、且つ、該混合培地が血清代替物を含む培地である、請求項1~5のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記ステップ(i)及び(ii)においてBMP4を用いる場合に相当する濃度が1nM~10nMであり、前記ステップ(i)~(iii)においてSAGを用いる場合に相当する濃度が1.0μM~2μMである、請求項1~6のいずれか一項に記載の製造方法。
- 請求項1~7のいずれか一項に記載の製造方法で得られた、次の特徴(ア)及び(イ)を有する、視床下部組織と下垂体組織を含む細胞構造体、
(ア)視床下部組織は、該方法によりヒト多能性幹細胞から分化誘導によって作製されたコルチコトロピン放出ホルモン(CRH)を産生する神経細胞を含み、
(イ)下垂体組織は、該方法によりヒト多能性幹細胞から分化誘導によって作製された副腎皮質刺激ホルモン(ACTH)産生細胞を含む。 - 移植医療に用いられる、請求項8に記載の細胞構造体。
- 移植医療が、視床下部及び/もしくは下垂体の障害に起因する疾患、又は、視床下部及び/もしくは下垂体の障害を伴う疾患の治療である、請求項9に記載の細胞構造体。
- 疾患が、中枢性尿崩症、視床下部性下垂体機能低下症、プラダー症候群、ローレンスムーンビードル症候群、視床下部性肥満、摂食障害、認知機能障害、睡眠障害、汎下垂体機能低下症、下垂体性小人症、副腎皮質機能低下症、部分的下垂体機能低下症、下垂体前葉ホルモン単独欠損症、外傷、放射線治療、又は、切除術による視床下部及び/もしくは下垂体の損傷である、請求項10に記載の細胞構造体。
- 次の工程(1)又は(2)を含む、移植医療用の細胞構造体の一部の製造方法:
(1)請求項8~11のいずれか一項に記載する細胞構造体を裁断することにより、細胞構造体の一部を得る工程、
(2)請求項8~11のいずれか一項に記載する細胞構造体をタンパク質分解酵素もしくはEDTAで処理することにより、細胞構造体の一部を得る工程。
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