CN113046306B - 一种多能干细胞的培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种多能干细胞的培养方法，采用48孔板为培养容器，细胞接种密度为4.5～6.5×105细胞/mL，培养体积为0.4～0.6mL，采用摇床转速为170～190rpm进行培养。本发明从无到有建立了一种适于多能干细胞生长和分化的48孔板悬浮培养体系，且该培养体系可高效地筛选多能干细胞的分化诱导剂。本发明提供的培养方法具有成本低、效率高、可维持较好的细胞形态、增殖倍数稳定、可维持较好的核型和表型、分化过程中实验间差异较小等优点。

Description

一种多能干细胞的培养方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种多能干细胞的培养方法。
背景技术
干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的特殊细胞类群。在体外适当的培养条件下，干细胞可以被大量扩增和分化为具有特定功能的细胞。因此，干细胞可以为临床疾病治疗提供移植所需的细胞。同时，由于药物筛选和安全性检验不直接在人体进行，人的干细胞也成为大规模的新药筛选和药物研究的理想模型。
来源于不同发育阶段和不同组织器官的干细胞在基因表达调控、表观遗传状态、体外增殖和分化潜能等方面都存在很大的差异。一般来讲，根据干细胞增殖能力和分化潜能的不同，可以把干细胞分为全能干细胞(totipotent stem cell)、多能干细胞(pluripotent stem cell)、专能干细胞(multipotent stem cell)和单能干细胞(unipotent stem cell)。
多能干细胞失去了发育为完整个体的能力，但其可以分化为个体的所有细胞类型，进而形成身体的所有组织和器官。因此，多能干细胞在组织分化的研究、药物试验及再生医疗等各种领域中被广泛使用，特别是在诱导性多能干细胞(iPSC)建立以后，该领域的研究取得了显著的发展。
在多能干细胞的应用过程中，首先需要在维持多能干细胞的未分化的状态下进行培养，然后对多能干细胞进行诱导分化，以培养得到目标细胞。
在筛选多能干细胞分化诱导剂过程中，目前采用的筛选体系主要有两种：(1)平面培养分化体系，其缺陷是细胞的大规模扩增受到限制，难以获得足够的细胞数量用于研究，且分化效率低，无法对细胞的生长情况以及分化情况做一个精准评估。(2)大体系悬浮培养体系，其缺陷是体系大，成本高，无法进行大规模药筛。
为了克服现有技术的缺陷，本领域技术人员希望开发一种成本低，且能高效筛选多能干细胞分化诱导剂的体系及方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种多能干细胞的培养方法，在增殖培养过程中，能维持多能干细胞的良好的干性(stemness)，在分化过程中，分化效率高、实验间差异小，而且可以高效地筛选多能干细胞的分化诱导剂，对分化情况进行精准评估。本发明提供的多能干细胞的培养方法克服了现有技术中的缺点：现有筛选体系中平面培养分化体系的分化效率低、无法对细胞的生长情况以及分化情况做精准评估，大体系悬浮培养体系成本高、无法进行大规模药筛等。
为此，第一方面，本发明提供一种多能干细胞的培养方法，采用48孔板为培养容器，细胞接种密度为4.5～6.5×105细胞/mL，培养体积为0.4～0.6mL，采用摇床转速为170～190rpm进行培养。
本领域技术人员知晓，本发明所述的48孔板也称48孔培养板、48孔细胞培养板等，每孔容积约为1.7mL，可选用市售的常见的48孔板，例如Thermo Scientific Nunclon所售的48孔板(货号：150687)，Corning所售的48孔板(货号：3548)等。
关于培养容器，多能干细胞的培养往往采用平面培养或大体系悬浮培养，鲜有采用多孔板进行培养的报道；而且，由于多能干细胞本身的特性，多能干细胞的培养无法直接套用其他已分化细胞的培养体系或方法，例如现有技术中已可以根据一些通用性指导规则利用24孔板、48孔板或96孔板等对部分已分化细胞进行培养，而这些培养方法并不适用于多能干细胞的培养。本发明在研究过程中分别使用96孔板、48孔板进行培养，并同步探索相关的接种密度、培养体积、摇床转速等条件。经实验发现，当采用96孔板时，由于培养体积较小，即使采用市售商业摇床的最高转速，仍无法进行悬浮培养，仅能采取静置培养，且培养效果不佳；当采用48孔板时，对培养条件的要求极为苛刻，必须配合特定的细胞接种密度、培养体积和摇床转速，才能获得较佳的培养效果。
在一些实施方式中，所述细胞接种密度约为4.5×105细胞/mL、5.5×105细胞/mL、6.5×105细胞/mL等。
在优选的实施方式中，所述细胞的接种密度为5.5×105细胞/mL。
在一些实施方式中，所述培养体系为400μL、500μL、600μL等。
在一些实施方式中，所述摇床转速为170rpm、180rpm、190rpm等。
在培养过程中，培养容器、细胞接种密度、培养体积和摇床转速的配合，对细胞的培养情况会产生综合性影响。首先，当采用本发明所述的48孔板，配合培养体积为0.4～0.6mL、摇床转速为170～190rpm时，可以保证各孔之间的培养基不会发生交叉污染；如果相应地改变培养体积和摇床转速，例如减少培养体积同时提高摇床转速，或者增加培养体积同时降低摇床转速，仍可以保持各孔之间不会发生交叉污染，然而，在偏离了本发明保护范围的这两种情况下，对细胞的聚集形态、细胞粒径的均一性均会造成负面影响，在严重的情况下甚至使培养后的细胞无法维持干性。
本发明在研究过程中发现，当应用48孔板进行培养时，多能干细胞的部分生长情况基本符合本领域技术人员的通常认识，例如，提高细胞接种密度、提高摇床转速有利于细胞快速生长，增大培养体积、适当提高转速有利于细胞悬浮等。然而，对于多能干细胞的形态(例如聚集体形态、细胞粒径均一性等)和质量(例如干性维持情况等)，接种密度、培养体积和摇床转速对其的影响较大且无明显的规律可循。当培养体系中的一种参数或多种参数偏离本发明所述的48孔板、接种密度为4.5～6.5×105细胞/mL、培养体积为400～600μL、摇床转速为170～190rpm时，会对多能干细胞的形态和/或质量造成显著负面影响。
在一些实施方式中，本发明所述多能干细胞的培养方法采用以下培养条件：培养温度为36.6±0.5℃，相对湿度为90±5％，CO2浓度为5％(v/v)。
在另一些实施方式中，在本发明所述的多能干细胞培养方法中，每20～28h更换新鲜的培养基；优选为每24h更换新鲜的培养基。
在再一些的实施方式中，根据本发明所述的多能干细胞培养方法，包括以下步骤：
(S1)采用48孔板为培养容器，细胞接种密度为4.5～6.5×105细胞/mL，培养体积为400～600μL，采用摇床转速为170～190rpm进行培养，得到细胞团悬液；
(S2)取步骤(S1)培养得到的细胞团悬液，制备为单细胞悬液；
(S3)取步骤(S2)制备得到的单细胞悬液，至少重复一次步骤(S1)和(S2)进行培养。
在一些实施方式中，步骤(S1)中，培养1～5d。具体的时间可根据所培养的细胞种类进行确定，例如培养1d、2d、3d、4d或5d等。
在一些实施方式中，步骤(S2)包括：取步骤(S1)培养得到的细胞团悬液，依次进行富集细胞团、消化、过滤、离心、重悬和可选的细胞计数，即制备得到所述单细胞悬液。
在一些实施方式中，步骤(S3)中，所述重复次数为选自1～15的整数。本领域技术人员知晓，所述重复次数即为传代培养的代数，可以根据所培养的细胞种类及生长、分化情况进行确定，例如重复步骤(S1)和(S2)的次数为1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次、11次、12次、13次、14次或15次等。
根据本发明所述的多能干细胞的培养方法，所述多能干细胞为胚胎干细胞或诱导性多能干细胞(iPS)。
在一些实施方式中，所述胚胎干细胞为人胚胎干细胞。
本发明的第二方面，提供了所述多能干细胞的培养方法在A1)、A2)、A3)任一方面的应用：
A1)扩增所述多能干细胞；
A2)诱导分化所述多能干细胞；
A3)筛选用于诱导分化所述多能干细胞的诱导剂。
与现有技术相比，本发明的技术方案具有以下显著的进步：
本发明克服了现有技术的偏见，首次采用48孔板对多能干细胞进行培养，从无到有建立了一种适于多能干细胞生长和分化的48孔板悬浮培养体系，且该培养体系可高效地筛选多能干细胞的分化诱导剂。
本发明提供的多能干细胞的培养体系和方法克服了现有技术中平面培养分化体系的分化效率低、无法对细胞的生长情况以及分化情况做精准评估，大体系悬浮培养体系的成本高、无法进行大规模药筛等不足。本发明的技术方案具有以下显著的优势：(1)根据本发明培养的多能干细胞可以维持较好的细胞形态及稳定的增殖倍数，以得到较多的细胞数量用于研究；(2)培养几代后的多能干细胞仍能维持核型正常和较好的细胞表型；(3)培养的多能干细胞在分化过程中细胞团的大小和形状基本保持一致，减少实验间差异；(4)可用此体系进行高通量药物筛选，避免使用价格昂贵的高通量分析仪器，从而显著节省成本。
附图说明
通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。在附图中：
图1：按照本发明的某一培养方法(接种密度5.5×105细胞/mL，培养体系600μL，转速180rpm)对人胚胎干细胞H9进行培养，细胞的聚集形态检测结果；
图2：按照本发明的某一培养方法(接种密度5.5×105细胞/mL，培养体系600μL，转速180rpm)对人胚胎干细胞H9进行培养，免疫荧光检测结果；
图3：按照本发明的某一培养方法(接种密度5.5×105细胞/mL，培养体系600μL，转速180rpm)对人胚胎干细胞H9进行培养，流式细胞术检测结果；
图4：按照本发明的某一培养方法(接种密度5.5×105细胞/mL，培养体系600μL，转速180rpm)对人胚胎干细胞H9进行培养，细胞的核型检测结果；
图5：按照本发明的某一培养方法(接种密度5.5×105细胞/mL，培养体系600μL，转速180rpm)对诱导性多能干细胞(iPS)进行培养，细胞的聚集形态检测结果；
图6：按照本发明的某一培养方法(接种密度5.5×105细胞/mL，培养体系600μL，转速180rpm)对诱导性多能干细胞(iPS)进行培养，流式细胞术检测结果；
图7：按照本发明的某一培养方法(接种密度5.5×105细胞/mL，培养体系600μL，转速180rpm)对诱导性多能干细胞(iPS)进行培养，细胞的核型检测结果；
图8：按照本发明的某一培养方法(接种密度4.5×105细胞/mL，培养体系400μL，转速180rpm)对人胚胎干细胞H9进行培养，细胞的聚集形态检测结果；
图9：按照本发明的某一培养方法(接种密度4.5×105细胞/mL，培养体系500μL，转速180rpm)对人胚胎干细胞H9进行培养，细胞的聚集形态检测结果；
图10：按照本发明的某一培养方法(接种密度4.5×105细胞/mL，培养体系600μL，转速180rpm)对人胚胎干细胞H9进行培养，细胞的聚集形态检测结果；
图11：按照本发明的某一培养方法(接种密度6.5×105细胞/mL，培养体系600μL，转速180rpm)对人胚胎干细胞H9进行培养，细胞的聚集形态检测结果；
图12：按照本发明的某一培养方法(接种密度5.5×105细胞/mL，培养体系600μL，转速170rpm)对人胚胎干细胞H9进行培养，细胞的聚集形态检测结果；
图13：按照本发明的某一培养方法(接种密度5.5×105细胞/mL，培养体系600μL，转速190rpm)对人胚胎干细胞H9进行培养，细胞的聚集形态检测结果；
图14：用本发明所述的培养方法培养和诱导分化人胚胎干细胞H9，SANT1类似化学物库后期筛选的分析结果；
图15：用本发明所述的培养方法培养和诱导分化诱导性多能干细胞(iPS)，LDN1931189类似化学物库后期筛选的分析结果；
图16：采用不同接种密度对人胚胎干细胞H9进行96孔板培养，细胞的聚集形态检测结果；
图17：采用不同接种密度对人胚胎干细胞H9进行96孔板培养，免疫荧光检测结果；
图18：采用不同接种密度对人胚胎干细胞H9进行96孔板培养，流式细胞术检测结果；
图19：采用不同接种密度对人胚胎干细胞H9进行96孔板培养，细胞的核型检测结果；
图20：按照对比例的某一培养方法(接种密度4.5×105细胞/mL，培养体系700μL，转速180rpm)对人胚胎干细胞H9进行培养，细胞的聚集形态检测结果；
图21：按照对比例的某一培养方法(接种密度3.5×105细胞/mL，培养体系600μL，转速180rpm)对人胚胎干细胞H9进行培养，细胞的聚集形态检测结果；
图22：按照对比例的某一培养方法(接种密度5.5×105细胞/mL，培养体系600μL，转速160rpm)对人胚胎干细胞H9进行培养，细胞的聚集形态检测结果。
具体实施方式
下面将参照附图更详细地描述本公开的示例性实施方式。虽然附图中显示了本公开的示例性实施方式，然而应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。
48孔板：Thermo Scientific Nunclon(货号：150687)
96孔板：Thermo Scientific Nunclon(货号：167008)
mTeSR1完全培养基：mTeSR 1 Basal Medium、5×mTeSR 1 Supplement
DE培养基：MCDB131 Basal Medium、1000×Act A、1000x CHIR99021
PGT培养基：MCDB131 Basal Medium、2000×KGF
PP1分化培养基：MCDB131 Basal Medium、2000×KGF、10000×RA、10000×SANT1、10000×LDN
KSR培养基：15％KSR、KO DMEM、L-glutamine、100×non-essential amino acids(NEAA)、1000×β-mercaptoethano
分化培养基：mTeSR with the activin/TGF-b inhibitor SB431542(10mM)andthe BMP inhibitor LDN193189
NIM培养基：DMEM/F12、100×N2 sup-Plement、50×B27 supplement、100×Glutamax、100×NEAA(Gibco)、0.2Mm ascorbic acid
实施例1
本实施例对人胚胎干细胞H9进行动态悬浮培养，并对培养得到的细胞进行相关检测。
多能干细胞动态悬浮培养：
(1)以5.5×105细胞/mL的接种密度将人胚胎干细胞H9接种于48孔板，在轨道摇床进行动态悬浮培养，培养基为mTeSR1完全培养基，培养体系为600μL，转速为180rpm，温度37℃，相对湿度90±5％，5％CO2(v/v)；每培养24h更换新鲜培养基，共培养4d，细胞团粒径为300～400μm，其细胞聚集形态见图1所示。
(2)取出细胞团悬液，经37μm可逆滤器富集细胞团(去除单细胞)，用16mL的Accutase(StemCell)将细胞团反向冲至离心管后置于37℃水浴锅消化15min，期间每间隔5min吹打一次，至出现细胞絮状后加入2倍体积的mTeSR-1培养基终止消化，轻柔混匀后将细胞悬液通过100um筛网过滤(去除细胞絮状)，滤液经离心机(Beckman)RT，200g，4min离心，拨散细胞沉淀，加入含Y-27632的mTeSR-1完全培养基重悬，取适量的细胞悬液通过细胞计数仪(Countstar)进行细胞计数。
(3)取经步骤(2)计数的细胞悬液，重复步骤(1)(2)所述的步骤进行传代培养，共培养4代。
免疫荧光检测：
收集步骤(1)培养得到的细胞团于1.5mL EP管中，PBS润洗3次，加入1mL 4％甲醛固定液室温固定1h，经由低浓度到高浓度的乙醇脱水，1mL二甲苯室温孵育5min，重复3次进行透明并晾干；转移细胞团于石蜡中浸蜡包埋，并对包埋好的样品进行修片、切片和捞片，将得到的切片于42℃烘箱中烘烤过夜，室温下用二甲苯将切片浸泡5min，重复3次进行脱蜡；95％乙醇浸泡切片2min，70％乙醇浸泡切片2min进行复水，将复水后的切片放于100℃的0.1M EDTA(pH 9.0)的抗原修复液中继续加热20min，加热后将切片快速置于冰中冷却10min，200μL的PBS清洗3次后加入200μL的透化液(PBS+0.1％Triton X-100)室温孵育15min，200μL的PBS清洗3次，加入200μL封闭液(PBS+10％Goat Serum)室温孵育1h，加入一抗4℃孵育过夜，加入二抗室温孵育40min，滴加10μL DAPI(Vector，H1200)至完全覆盖细胞表面后，室温孵育10min，用指甲油对切片进行封片处理；使用倒置荧光显微镜进行观察拍照分析，免疫荧光检测结果见图2所示。根据图2，经本发明所述的方法进行培养后，细胞表达Oct4/SSEA4正常，表明维持了很好的干性(stemness)。
流式细胞术分析：
收集步骤(1)培养得到的细胞团，并制备为单细胞悬液，取3×106细胞于EP管中，PBS洗涤2遍，加入1mL Fixation Buffer(BD)固定20min，1×Perm/Wash Buffer(BD)洗涤两遍后，平均分成3份，分别作为unstain组、isotype组和stain组。其中，stain组加入20μL、anti-Oct3/4、anti-SSEA-1、anti-SSEA-4；isotype组加入20μL PerCP-Cy5.5 Mouse IgG1、PE Mouse IgM、Alexa
Figure BDA0002974237400000091
647 Mouse IgG3；unstain不做处理。室温避光孵育30min，1×Perm/Wash Buffer(BD)洗涤2遍，200μL Stain Buffer重悬，使用BD FACSVerse进行检测，检测结果见图3所示。
核型检测：
收集经培养4代后细胞团，并制备为单细胞悬液，按2×105细胞/cm2接种至T25细胞培养瓶中，待细胞生长达对数生长期转交给第三方机构做核型检测，核型检测报告见图4所示。根据图4所示检测报告，经培养4代后细胞的核型正常。
实施例2
本实施例对诱导性多能干细胞(iPS)进行动态悬浮培养，并对培养得到的细胞进行相关检测。除悬浮培养中的步骤(1)外，其他步骤及检测方法同实施例1。本实施例悬浮培养中的步骤(1)为：
以5.5×105细胞/mL的接种密度将诱导性多能干细胞(iPS)接种于48孔板，在轨道摇床进行动态悬浮培养，培养基为mTeSR1完全培养基，培养体系为600μL，转速为180rpm，温度37℃，相对湿度90±5％，5％CO2(v/v)；每培养24h更换新鲜培养基，共培养4d。
经步骤(1)培养得到的细胞的聚集形态见图5所示；流式检测结果见图6所示，根据图6，经本发明所述的方法进行培养后，细胞表达Oct4/SSEA4正常，表明维持了很好的干性。经培养4代后，细胞的核型检测报告见图7所示，根据图7所示检测报告，经培养4代后细胞的核型正常。
实施例3
本实施例对人胚胎干细胞H9进行动态悬浮培养，并对培养得到的细胞进行相关检测：
以4.5×105细胞/mL的接种密度将人胚胎干细胞H9接种于48孔板，在轨道摇床进行动态悬浮培养，培养基为mTeSR1完全培养基，培养体系为400μL，转速为180rpm，温度37℃，相对湿度90±5％，5％CO2(v/v)；每培养24h更换新鲜培养基，共培养4d。
培养得到的细胞的聚集形态见图8所示，可以看出细胞聚集体的大小均一，形态较为圆润。
实施例4
本实施例对人胚胎干细胞H9进行动态悬浮培养，并对培养得到的细胞进行相关检测：
以4.5×105细胞/mL的接种密度将人胚胎干细胞H9接种于48孔板，在轨道摇床进行动态悬浮培养，培养基为mTeSR1完全培养基，培养体系为500μL，转速为180rpm，温度37℃，相对湿度90±5％，5％CO2(v/v)；每培养24h更换新鲜培养基，共培养4d。
培养得到的细胞的聚集形态见图9所示，可以看出细胞聚集体的大小均一，形态较为圆润。
实施例5
以4.5×105细胞/mL的接种密度将人胚胎干细胞H9接种于48孔板，在轨道摇床进行动态悬浮培养，培养基为mTeSR1完全培养基，培养体系为600μL，转速为180rpm，温度37℃，相对湿度90±5％，5％CO2(v/v)；每培养24h更换新鲜培养基，共培养4d。
培养得到的细胞的聚集形态见图10所示，可以看出细胞聚集体的大小均一，形态圆润。
实施例6
以6.5×105细胞/mL的接种密度将人胚胎干细胞H9接种于48孔板，在轨道摇床进行动态悬浮培养，培养基为mTeSR1完全培养基，培养体系为600μL，转速为180rpm，温度37℃，相对湿度90±5％，5％CO2(v/v)；每培养24h更换新鲜培养基，共培养4d。
培养得到的细胞的聚集形态见图11所示，可以看出细胞聚集体的大小较为均一，形态圆润。
实施例7
以5.5×105细胞/mL的接种密度将人胚胎干细胞H9接种于48孔板，在轨道摇床进行动态悬浮培养，培养基为mTeSR1完全培养基，培养体系为600μL，转速为170rpm，温度37℃，相对湿度90±5％，5％CO2(v/v)；每培养24h更换新鲜培养基，共培养4d。
培养得到的细胞的聚集形态见图12所示，可以看出细胞聚集体的大小较为均一，形态圆润。
实施例8
以5.5×105细胞/mL的接种密度将人胚胎干细胞H9接种于48孔板，在轨道摇床进行动态悬浮培养，培养基为mTeSR1完全培养基，培养体系为600μL，转速为190rpm，温度37℃，相对湿度90±5％，5％CO2(v/v)；每培养24h更换新鲜培养基，共培养4d。
培养得到的细胞的聚集形态见图13所示，可以看出出现了个别较大的细胞聚集体，但大多数细胞聚集体仍具有较好的均一性，且形态较为圆润。
实施例9
本实施例将人胚胎干细胞H9诱导分化为胰腺祖细胞，并进行诱导剂筛选。
多能干细胞培养与诱导分化：
以5.5×105细胞/mL的接种密度将人胚胎干细胞H9接种于48孔板，在轨道摇床进行动态悬浮培养，培养基为mTeSR1完全培养基，培养体系为600μL，转速为180rpm，温度37℃，相对湿度90±5％，5％CO2(v/v)；每培养24h更换新鲜培养基，共培养3d。然后更换培养基继续培养，具体为：将培养基更换为DE培养基(S1)培养3d，然后将培养基更换为PGT培养基(S2)培养2d，然后将培养基更换为PP1分化培养基(S3)继续培养。
SANT1类似化学物库筛选：
前期筛选：在上述培养过程中，在更换为PP1分化培养基(S3)时分组建库，各组分别加入10μM的不同的SANT1类似化学物，同时以加入0.25μM SANT1的组作为阳性对照组。在用PP1分化培养基(S3)培养2d后，通过贝克曼流式细胞仪对各组细胞进行检测，分析PDX1的表达。前期命中筛选物如表1所示。
表1
Figure BDA0002974237400000111
Figure BDA0002974237400000121
后期筛选：
将表1的前期筛选的命中候选化学物分别按0μM、1μM、5μM、10μM、50μM的工作液浓度加入到PP1分化培养基(S3)中，用所得到的培养基对原肠管细胞进行培养，分化到第3天时，将48孔板的细胞转移到96孔板固定并分析PDX1的表达，分析结果如图14所示。根据图14的分析结果，5μM的环巴胺具有较好的替代效果，可作为将人胚胎干细胞H9诱导分化为胰腺祖细胞的诱导剂。
实施例10
本实施例将诱导性多能干细胞(iPS)诱导分化为神经祖细胞，并进行诱导剂筛选。
多能干细胞培养与诱导分化：
以5.5×105细胞/mL的接种密度将诱导性多能干细胞(iPS)接种于48孔板，在轨道摇床进行动态悬浮培养，培养基为mTeSR1完全培养基，培养体系为600μL，转速为180rpm，温度37℃，相对湿度90±5％，5％CO2(v/v)；每培养24h更换新鲜培养基，共培养3d。然后更换培养基继续培养，具体为：将培养基更换为分化培养基(S1)培养6d，然后将培养基更换为KSR培养基(S2)培养3d，然后将培养基更换为NIM培养基(S3)培养5d。
LDN1931189类似化学物库筛选：
前期：在上述培养过程中，在更换为NIM培养基(S3)时分组建库，各组分别加入10μM的不同的LDN1931189类似化学物，同时以加入5.0μM LDN1931189的组作为阳性对照组。在用NIM培养基(S3)培养5d后，通过贝克曼流式细胞仪对各组细胞进行检测，分析OTX1/2的表达。前期命中筛选物如表2所示。
表2
Figure BDA0002974237400000122
Figure BDA0002974237400000131
后期：将表2的前期筛选的命中候选化学物分别按0μM、1μM、5μM、10μM、50μM的工作液浓度加入到NIM培养基(S3)中，用所得到的培养基对皮质祖细胞进行培养，分化至第6天时，将48孔板的细胞转移到96孔板固定并分析OTX1/2的表达，分析结果如图15所示。根据图15的分析结果，10μM的DMH-1具有较好的替代效果，可作为将诱导性多能干细胞(iPS)诱导分化为神经细胞的诱导剂。
对比例1
本对比例对人胚胎干细胞H9于96孔板进行静置培养，并对培养得到的细胞进行相关检测。除用以下步骤(1)替换实施例1中所述的步骤(1)外，其他步骤及检测方法同实施例1：
(1)取密度为1×105细胞/mL的人胚胎干细胞H9细胞悬液(通过将600μL密度为3.33×105细胞/mL的细胞悬液加1400μL培养基制备得到)，按照表3中的培养体系，将其接种于96孔板，按照以下培养条件进行静置培养：培养基为mTeSR1完全培养基，温度37℃，相对湿度90±5％，5％CO2(v/v)；每培养24h更换新鲜培养基，共培养4d。
表3
Figure BDA0002974237400000132
经步骤(1)培养得到的细胞的聚集形态见图16所示，发现粒径出现明显的差异；综合比较后，选择细胞数为3000细胞数/孔的组进行后续免疫荧光检测、流式检测和核型检测。免疫荧光检测的结果如图17所示，可见该体系培养的细胞SSEA4表达不明显，未能很好地维持多能干细胞的干性。流式检测结果见图18所示，根据图18，Oct4/SSEA4阳性细胞群出现拖尾、分群现象，表明培养得到的细胞不纯，有其他细胞。经培养4代后，细胞的核型检测报告见图19所示，根据图19所示检测报告，经培养4代后细胞的核型异常。
对比例2
以4.5×105细胞/mL的接种密度将人胚胎干细胞H9接种于48孔板，在轨道摇床进行动态悬浮培养，培养基为mTeSR1完全培养基，培养体系为700μL，转速为180rpm，温度37℃，相对湿度90±5％，5％CO2(v/v)；每培养24h更换新鲜培养基，共培养4d。
培养得到的细胞的聚集形态见图20所示，可以看出当培养体积增大为700μL时，细胞聚集体大小不一，有明显较大的细胞团出现。
对比例3
以3.5×105细胞/mL的接种密度将人胚胎干细胞H9接种于48孔板，在轨道摇床进行动态悬浮培养，培养基为mTeSR1完全培养基，培养体系为600μL，转速为180rpm，温度37℃，相对湿度90±5％，5％CO2(v/v)；每培养24h更换新鲜培养基，共培养4d。
培养得到的细胞的聚集形态见图21所示，可以看出细胞聚集体的大小均一性非常差，且有融合现象出现。
对比例4
以5.5×105细胞/mL的接种密度将人胚胎干细胞H9接种于48孔板，在轨道摇床进行动态悬浮培养，培养基为mTeSR1完全培养基，培养体系为600μL，转速为160rpm，温度37℃，相对湿度90±5％，5％CO2(v/v)；每培养24h更换新鲜培养基，共培养4d。
培养得到的细胞的聚集形态见图22所示，可以看出细胞数较少，不能很好地成团，且细胞团粒径大小不均一。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (8)

1.一种多能干细胞的培养方法，其特征在于，采用48孔板为培养容器，细胞接种密度为4.5~6.5×105细胞/mL，培养体积为0.4~0.6 mL，采用摇床转速为170~190 rpm进行培养；培养温度为36.5±0.5℃，相对湿度为90±5%，CO2浓度为5%（v/v）。
2.如权利要求1所述的多能干细胞的培养方法，其特征在于，每20~28 h更换新鲜的培养基。
3.如权利要求1所述的多能干细胞的培养方法，其特征在于，所述多能干细胞为胚胎干细胞或诱导性多能干细胞。
4.如权利要求1~3任一项所述的多能干细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
（S1）采用48孔板为培养容器，细胞接种密度为4.5~6.5×105细胞/mL，培养体积为0.4~0.6 mL，采用摇床转速为170~190 rpm进行培养，得到细胞团悬液；
（S2）取步骤（S1）培养得到的细胞团悬液，制备为单细胞悬液；
（S3）取步骤（S2）制备得到的单细胞悬液，至少重复一次步骤（S1）和（S2）进行培养。
5.如权利要求4所述的多能干细胞的培养方法，其特征在于，步骤（S2）包括：取步骤（S1）培养得到的细胞团悬液，依次进行富集细胞团、消化、过滤、离心、重悬和细胞计数，即制备得到所述单细胞悬液。
6.如权利要求4所述的多能干细胞的培养方法，其特征在于，步骤（S1）中，培养时间为1~5 d。
7.如权利要求4所述的多能干细胞的培养方法，其特征在于，步骤（S3）中，重复次数为选自1~15的整数。
8.权利要求1~7任一项所述的多能干细胞的培养方法在A1）、A2）、A3）任一方面的应用：
A1）扩增所述多能干细胞；
A2）诱导分化所述多能干细胞；
A3）筛选用于诱导分化所述多能干细胞的诱导剂。
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