CN111206015B

CN111206015B - 一种利用fact ⅲ微载体体外扩增精原干细胞的三维动态培养方法

Info

Publication number: CN111206015B
Application number: CN202010314524.3A
Authority: CN
Inventors: 张秀娟; 陈金平; 白银山; 张守全; 王承民
Original assignee: Guangdong Institute of Applied Biological Resources
Current assignee: Institute of Zoology of Guangdong Academy of Sciences
Priority date: 2020-04-21
Filing date: 2020-04-21
Publication date: 2020-07-31
Anticipated expiration: 2040-04-21
Also published as: AU2021201392A1; AU2021201392B2; CN111206015A

Abstract

本发明提供了一种利用FACT Ⅲ微载体体外扩增精原干细胞的三维动态培养方法。该方法利用转壁氏生物反应器（RCCS）构建三维动态培养环境，选择FACTⅢ微载体为支架材料，建立了能支持小鼠睾丸SSCs体外快速增殖和维持其未分化特性的三维动态培养体系。该三维动态培养体系下，SSCs在RCCS中培养一周后，表现出极优的增殖效果，尤其在体外培养17‑22d获得SSCs得到快速增殖，增殖的SSCs细胞仍保留着其未分化状态的生物学特性和功能。本发明方法具有操作简单，培养成本低，重复性好，培养成功率高，无需传代，可避免饲养层细胞污染等明显优势，提供了一种可靠的SSC体外培养技术方案。

Description

一种利用FACT Ⅲ微载体体外扩增精原干细胞的三维动态培养方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种利用FACT Ⅲ微载体体外扩增精原干细胞的三维动态培养方法。

背景技术

精原干细胞（spermatogonial stem cells，SSCs）是位于睾丸曲精细管基膜处的雄性生殖系干细胞，具有维持自我更新和定向精子分化潜能的成体干细胞，在体外培养过程中也可以自发的去分化转变成为多能干细胞，成为干细胞机制研究和再生医学临床应用的理想种子细胞。

人和动物体内的成体干细胞数量非常少，成年小鼠睾丸中SSCs占所有生殖细胞的0.03%，将成体干细胞应用到临床医学，迫切需要解决的问题就是如何在体外大规模扩增这些干细胞，足够的干细胞的数量和质量才能达到临床治疗的要求。然而，目前SSCs通常采用的二维平面培养的方法，也就是传统的贴壁式培养，这种培养方法成本高（如已经报道建系使用的Stempro-34 SFM无血清培养体系）、需要添加饲养层细胞、SSCs细胞生长缓慢，容易造成自然分化，尤其是目前在很多物种中还未建立起有效的体外增殖方案，而且这种SSCs呈贴壁状态生长，因为其有限的表面积不能支持SSCs长期生长，面临着细胞增殖缓慢，真正可用未分化SSCs细胞数量非常少等诸如的技术瓶颈。因此，体外快速大规模扩增获得功能性SSCs仍是亟待解决的关键技术问题，三维培养是更接近机体环境的一种培养方式，是目前工艺生产广泛应用的技术。

由生物反应器提供的三维动态培养环境，已成功的应用于胚胎干细胞（embryonicstem cells, ESCs）和诱导多潜能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPSCs）的增殖和分化培养，可显著地增强干细胞增殖和分化的能力，提高干细胞培养效率，进而促使干细胞的研究和应用更加标准化。然而，SSCs作为生殖系的成体干细胞，三维动态培养环境下的增殖培养是否能为SSCs生物学研究以及临床上雄性不育和再生医学提供可替代的培养方案，有待开发。

微载体培养技术是目前进行规模化扩增的一种有效方法，其极大的比表面积在很小的空间里贴附更多的细胞，从而可以培养出大量的细胞满足组织工程的细胞数量的要求。将三维动态培养和微载体培养技术相结合，这种培养方式避免了传统二维平面常规方法的缺点，如培养多次消化传代、操作繁琐和耗时长等。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用FACT Ⅲ微载体体外扩增精原干细胞的三维动态培养方法。

本发明通过大量相关试验，最终筛选出精原干细胞（SSCs）可在转壁式细胞培养系统（rotary cell culture system, RCCS）中的高效生长的生物支架材料（FACTⅢ微载体），支持SSCs在无饲养层细胞添加条件下体外快速扩增的三维动态培养方案，SSCs数量可在培养一周后出现倍增，扩增的SSCs保持未分化特性和定向诱导分化能力，为精原干细胞培养提供了一个理想的增殖环境，能实现规模化扩增。该培养模式下体外增殖的SSCs较好地维持了其未分化状态、表达干细胞标记和诱导分化能力等生物学特性，为进一步深入开展SSC的生物学特性、男性不育以及再生医学方面的应用研究提供种子细胞。

本发明是通过以下技术方案予以实现的：

一种利用FACT Ⅲ微载体体外扩增精原干细胞的三维动态培养方法，包括以下步骤：

将DMEM完全培养基加至转壁氏细胞培养系统中，加入经预处理的FACT Ⅲ 微载体；将原代精原干细胞接种至FACT Ⅲ 微载体上培养，获得精原干细胞；

所述的预处理是：用多聚赖氨酸溶液和层黏蛋白溶液对FACT Ⅲ 微载体包被处理，再用DMEM完全培养基浸泡的。

优选，是将DMEM完全培养基加至经灭菌的转壁氏细胞培养系统的高纵横比型容器中，按接种密度为10~20 μg/mL加入经预处理的FACT Ⅲ 微载体；将采用反复差速贴壁法纯化后的原代精原干细胞以2~7.5×10⁵个/mL密度接种至FACT Ⅲ 微载体上，静态培养30~60min，然后调整转壁氏细胞培养系统的转速至10~12 rpm/min，培养一段时间后，逐渐增加转速，继续培养，获得精原干细胞。

优选，所述的DMEM完全培养基组成为：DMEM不完全培养基(Gibco公司，货号11885084)中添加1% v/v的必需氨基酸溶液(Gibco公司，货号11130051)、1% v/v的非必需氨基酸溶液(Gibco公司，货号11140050)、1% v/v维生素溶液(Gibco公司，货号11120052)、55 µM β-巯基乙醇溶液、2 mM L-谷氨酰胺、2 mM丙酮酸钠、5 wt% FCS、1%v/v的双抗溶液(Gibco公司，货号15140-122)、20 ng/mL rmbFGF因子、20 ng/mL rrGDNF因子和10³U/ mLmLIF因子。

所述的FACT Ⅲ 微载体的预处理步骤为：按照接种密度为10~20 μg/mL准确称量FACT Ⅲ 微载体，将FACT Ⅲ微载体用无菌PBS溶液进行洗涤，并浸泡过夜，于120℃高压灭菌30 min；将灭菌后的FACT Ⅲ 微载体转移至15 mL无菌离心管中先后用其5倍体积的10-20 ng/mL多聚赖氨酸溶液和5-20 μg/mL层黏蛋白溶液进行包被处理，将包被处理后的FACTⅢ微载体在DMEM完全培养基中浸泡过夜，即得。

所述的原代精原干细胞是通过以下方法获得：取出生后5~7天的雄性昆明小鼠睾丸，去掉睾丸白膜，先以1 mg/mL Ⅳ型胶原酶和20 µg/mL的DNAseⅠ联合消化，然后以0.25%胰酶-0.01%EDTA和20 µg/mL的DNAaseⅠ联合消化，用含10 wt% FBS的DMEM不完全培养基终止消化，用60 µm细胞筛过滤，于低温离心机1000 rpm离心6 min，重悬细胞，获得含原代精原干细胞的睾丸单细胞悬液。

所述的采用反复差速贴壁法纯化方法的具体步骤为：将含原代精原干细胞的睾丸单细胞悬液接种至0.1 wt%明胶包被的培养瓶中，37℃、5% CO₂的培养箱中培养8~10 h，因体细胞贴壁速度快且牢固而将未贴壁的悬浮细胞接种至新的明胶包被培养瓶中，37℃、5%CO₂的培养箱中培养8~10 h，如此共重复3次，收集未贴壁的细胞及悬液，1000 rpm/min，离心5 min，通过细胞涂片鉴定其纯化效率可达到平均85.06%，即获得纯度达85%以上的原代精原干细胞群体。

所述的静态培养30~60 min是在37℃下、5% CO₂的培养箱中静态培养30~60 min。

所述的培养一段时间是在RCCS中起始旋转速度10~12 rpm/min转速下培养7天。

所述的逐渐增加转速是以30 rpm/min为调整上限，使生成的细胞聚集体处于相对静止状态，防止自由落体运动对细胞造成损伤。

所述的精原干细胞培养过程中需更换培养液，具体是培养的第3 d全量换液，以后每3 d半量换液。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明利用转壁氏生物反应器（RCCS）构建三维动态培养环境，优化选择FACT Ⅲ微载体为支架材料，以雄性小鼠睾丸内的SSCs为培养对象，通过大量培养体系统优化试验，最后建立了能支持小鼠睾丸SSCs体外快速增殖和维持其未分化特性的三维动态培养体系。试验证明在FACT Ⅲ微载体和RCCS的优化三维动态培养体系下，可支持原代SSCs在无饲养层细胞添加的情况下的有效增殖。

该三维动态培养体系下，同时以传统常规二维平面静态培养为对照，SSCs在RCCS中培养一周后，表现出极优的增殖效果，尤其在体外培养17-22d获得SSCs得到快速增殖，增殖的SSCs细胞仍保留着其未分化状态的生物学特性和功能，如碱性磷酸酶检测AP呈强阳性、克隆形成和诱导分化成精子细胞能力。本发明方法具有操作简单，培养成本低，重复性好，培养成功率高，无需传代，可避免饲养层细胞污染等明显优势，提供了一种可靠的SSC体外培养技术方案，可为进一步深入开展SSC的生物学特性、男性不育以及再生医学方面的应用研究提供理想的种子细胞。

附图说明

图1为建立SSCs体外扩增的三维动态培养技术流程图。

图2为三维动态培养体系下SSCs增殖的形态学观察。

图3为不同培养体系下SSCs的增殖比较。

图4为三维动态培养22天增殖的SSCs AP活性检测呈强阳性。

图5为三维动态培养6天和14天增殖的SSCs表达三个精原干细胞标志分子。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

转壁氏生物反应器（RCCS）购于美国宇航局生命中心的Synthecon公司；FACT Ⅲ微载体购于美国EQUL公司；重组小鼠bFGF（Recombinant Mouse FGF basic, rmbFGF）、重组大鼠GDNF（Recombinant Rat GDNF, rrGDNF）购于 R & D Systems 公司；mLIF因子购于Chemicon公司。

下述实施例建立SSCs体外快速扩增的三维动态培养技术流程图如图1所示。

实施例1

1、材料的准备

（1）SSCs培养基（DMEM完全培养基）配方为：DMEM不完全培养基(Gibco公司，货号11885084)中添加1% v/v的必需氨基酸溶液(Gibco公司，货号11130051)、1% v/v的非必需氨基酸溶液(Gibco公司，货号11140050)、1% v/v维生素溶液(Gibco公司，货号11120052)、55 µM β-巯基乙醇溶液、2 mM L-谷氨酰胺、2 mM丙酮酸钠、5 wt% FCS、1%v/v的双抗溶液(Gibco公司，货号15140-122)、20 ng/mL rmbFGF因子、20 ng/mL rrGDNF因子和10³U/ mLmLIF因子。配制：将上述培养基各组分混合，溶解，过滤除菌，即得。

本发明的SSCs培养基为改良的培养液，在基础培养液中添加生长因子，可显著提高SSCs的体外增殖。

（2）转壁氏细胞培养系统（RCCS）的准备：

本发明使用的转壁氏细胞培养系统（RCCS）的组成包括：A、电源开关(控制器)，B、单转子主机，C、培养器。高纵横比型容器（HARV），规格有1 mL、2 mL、4 mL、10 mL、50 mL。

RCCS培养前消毒、灭菌和调试步骤为：

HARV培养容器用75% v/v的酒精溶液浸泡过夜消毒并晾干；用纱布包裹置于湿压灭菌器中高压灭菌110℃高压30 min；培养前，HARV容器注满SSCs培养基，调试仪器。

2、获取高纯度的精原干细胞

（1）原代精原干细胞的获得：取出生后5~7天的雄性昆明小鼠睾丸，去掉睾丸白膜，将生精小管组织转移至10 mL离心管，加入10倍体积的PBS 反复洗涤3次，弃上清，加入10倍体积的PBS配制的浓度为1 mg/mL Ⅳ型胶原酶和浓度为20 µg/mL的DNAseⅠ，在37℃水浴锅联合消化6 min，期间不时震荡离心管或用移液枪小心反复吹吸，以保证曲精细管的完整性，600 rpm离心5 min，去上清液后，加入5倍体积的PBS配制的0.25%胰酶-0.01%EDTA和浓度为20 µg/mL的DNAaseⅠ，在37℃水浴锅联合消化 8 min，用等量的含10 wt% FBS的DMEM不完全培养基终止消化，离心，重悬细胞，获得含原代精原干细胞的睾丸单细胞悬液。

（2）反复差速贴壁法纯化：将含原代精原干细胞的睾丸单细胞悬液接种至0.1wt%明胶包被的培养瓶中，37℃、5% CO₂的培养箱中培养8 h，体细胞贴壁牢固而将未贴壁的悬浮细胞接种至新的明胶包被培养瓶中，37℃、5% CO₂的培养箱中培养10 h，如此共重复3次，收集未贴壁的细胞及悬液，1000 rpm/min，离心5 min，通过细胞涂片鉴定其纯化效率可达到平均85.06%，即获得纯度达85%以上的原代精原干细胞群体。用台盼蓝拒染法检测细胞存活率，结果显示，精原干细胞的细胞活性大于95%。

3、FACT Ⅲ微载体预处理

按照接种密度为10 μg/mL准确称量FACT Ⅲ 微载体，将FACT Ⅲ 微载体用无菌PBS溶液进行洗涤，并浸泡过夜，于120℃高压灭菌30 min；将灭菌后的FACT Ⅲ 微载体转移至15 mL无菌离心管中先后用其5倍体积的10 ng/mL多聚赖氨酸溶液和10 μg/mL层黏蛋白溶液进行包被处理；将包被处理后的FACT Ⅲ微载体在DMEM完全培养基中浸泡过夜，取出，即得预处理的FACT Ⅲ微载体。

实验证明，经上述步骤处理后的FACT III微载体与SSCs拥有极好的生物相容性。

4、SSCs的三维动态培养

（1）将采用反复差速贴壁法纯化后的原代精原干细胞（无饲养层细胞添加）按照SSCs接种密度约为2.55×10⁵个/mL接种至FACT Ⅲ 微载体上，37℃下静态培养60 min；

（2）调整转壁氏细胞培养系统的转速至10 rpm/min，培养7d后，逐渐增加转速，转速是以30 rpm/min为调整上限，使生成的细胞聚集体处于相对静止状态，防止自由落体运动对细胞造成损伤，继续培养，整个培养过程中，需避免生成气泡，且需更换培养液，具体是培养的第3 d全量换液，以后每3 d半量换液，并在整个培养过程取样检测。

对照试验1：采用传统常规二维平面静态培养SSCs，具体步骤为：将采用反复差速贴壁法纯化后的原代精原干细胞放入六孔培养皿中，SSCs接种密度约为2.55×10⁵个/mL，每孔添加DMEM完全培养基1 mL，培养的第3 d全量换液，以后每3 d多半量换液，并在整个培养过程取样检测。

对照试验2：SSCs在转壁氏细胞培养系统中直接培养，无预处理的FACT Ⅲ 微载体添加，具体步骤为：往消毒、灭菌和调试后的转壁氏细胞培养系统中的HARV容器加入2 mLSSCs培养基（DMEM完全培养基），然后将采用反复差异贴壁法纯化后的原代精原干细胞放入HARV容器中，SSCs接种密度约为2.55×10⁵个/mL，37℃下静态培养60 min；调整转壁氏细胞培养系统的转速至10 rpm/min，结果显示，三维旋转培养仅3天，细胞活力明显下降，降低到约只有30%左右。

对照试验3：采用Stempro-34 SFM培养基（Gibco公司，货号10639011）等替换本发明的SSCs DMEM完全培养基对SSCs进行二维平面静态培养，除了培养基不同外，其余步骤及参数均与上述SSCs的二维平面静态培养步骤相同。

5、FACT Ⅲ微载体与SSCs的生物相容性

上述步骤4的SSCs的三维动态培养过程中，在培养3 d时，首次换液取样观察，在FACT Ⅲ微载体周围布满了球形细胞，培养液中仍有大量悬浮的细胞，常规二维平面静态培养（对照）的SSCs已紧紧的贴在支持细胞上；继续培养7 d时，8~10个FACT Ⅲ微载体由于细胞总量的增加和细胞外基质的分泌和联系，在三维旋转培养过程当中，紧密的联系在一起，而此时二维平面静态培养（对照）有典型的SSCs克隆出现，但是，目的细胞数量观察有所降低；培养10 d时，三维旋转培养可以看到更多的FACT Ⅲ微载体聚在一起，微载体表层和微载体之间布满了更多的细胞，而此时在二维平面静态培养（对照）中，SSCs与微载体毫无联系，SSCs的数量极显著降低。此证明FAC TIII微载体与SSCs有极好的生物相容性，支持了SSCs的体外增殖。

6、三维动态培养体系下SSCs增殖的形态学观察

上述步骤4的SSCs的三维动态培养过程中，培养3 d取样观察，FACT Ⅲ微载体上大多呈单个存在，上面有贴附的精原干细胞，培养液中有形成的细胞聚集体(图2A)；随着培养时间的延长，FACT Ⅲ微载体之间由于细胞的联系发生聚集，旋转培养12天和22天，更多的FACT Ⅲ微载体因细胞间的相互联系而聚在一起(图2B)，形成较大直径的细胞-微载体聚集体(图2C)；旋转培养35天，细胞-微载体聚集体直径大的有3-4 mm，一般都在1-2 mm(图2D)，三维动态培养17天和22天形成的细胞-微载体聚集体，经胰酶消化成的单个细胞折光性强，细胞活性高(图2E和2F)。

7、不同培养体系下SSCs的增殖比较

上述步骤4的SSCs的三维动态培养过程中， FAC TIII微载体的三维动态培养SSCs22 d，SSCs经历了维持-慢速增殖-快速增殖的过程，其中在培养的7 d到12 d有个缓慢增殖阶段，在培养17 d到22 d进入快速增殖状态。而以二维平面静态培养和Stempro-34 SFM培养为对照，发现从培养1周后，FAC TIII微载体的三维动态培养SSCs开始显现出了增殖优势，显著高于其他两种培养体系（P<0.05），结果如图3所示。

8、三维动态培养体系下增殖的SSCs的生物学特性和功能分析

在上述步骤4的SSCs的三维动态培养过程中，对不同培养阶段增殖的SSCs未分化特性进行了监控，按照碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase, AP)活性检测试剂盒方法（武汉博士德生工公司，货号AR1023）检测三维动态培养的各个阶段增殖的SSCs的AP活性，结果表明：培养增殖的SSCs AP活性呈强阳性（图4）。

采用RT-PCR扩增方法检测增殖SSCs的三个标志基因的表达情况，关键步骤如下：1）于低温离心机1000 rpm离心10 min收集细胞，按照TIANGEN 公司总RNA提取试剂盒说明方法操作获得总RNA。2）第一链cDNA合成按照TAKARA公司反转录试剂盒（6210A）进行操作，PCR仪反应程序：42℃孵育60 min；70℃保持15 min；再降至4℃转移至-20℃冰箱保存。3）精原干细胞标记基因PCR扩增，包括Oct4、GFRa1和Bcl6b，以β-actin 作为内参控制基因；20 µL反应体系里包括0.6 µL cDNA模板，上下游引物(引物浓度为10 µM，精原干细胞标记基因引物信息详见表1)各0.4 µL，PCR mix 10 µL，Tap酶0.4 µL，其余用双蒸水补齐。PCR仪反应程序：94℃ 5 min；36个循环（94℃ 30s， 56℃ 30s和72℃ 45s）；72℃ 10 min。

表1. 精原干细胞标志基因和内参基因的引物信息

RT-PCR检测结果表明，增殖的SSCs同时表达三个标志基因：Oct4、GFRa1和Bcl6b，见图5；进一步对增殖的SSCs进行功能分析，发现仍具有克隆形成能力和诱导分化成精子细胞功能，以上结果均表明在本发明三维动态培养体系下培养增殖的SSCs较好地维持了其生物学特征，处于未分化状态和具有向精子方向诱导分化的能力。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种利用FACTⅢ微载体体外扩增精原干细胞的三维动态培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

将DMEM完全培养基加至经灭菌的转壁氏细胞培养系统的高纵横比型容器中，按接种密度为10～20μg/mL加入经预处理的FACTⅢ微载体；将采用反复差速贴壁法纯化后的原代精原干细胞以2～7.5×10⁵个/mL密度接种至FACTⅢ微载体上，在37℃下、5％CO₂的培养箱中静态培养30～60min，然后调整转壁氏细胞培养系统的转速至10～12rpm/min，在10～12rpm/min转速下培养7天后，逐渐增加转速，以30rpm/min为调整上限，使生成的细胞聚集体处于相对静止状态，防止自由落体运动对细胞造成损伤，继续培养，获得精原干细胞；

所述的FACTⅢ微载体预处理的具体步骤为：将FACTⅢ微载体用无菌PBS溶液进行洗涤，并浸泡过夜，于120℃高压灭菌30min；将灭菌后的FACTⅢ微载体转移至15mL无菌离心管中先后用其5倍体积的10-20ng/mL多聚赖氨酸溶液和5-20μg/mL层黏蛋白溶液进行包被处理，将包被处理后的FACTⅢ微载体在DMEM完全培养基中浸泡过夜，即得；

所述的原代精原干细胞是通过以下方法获得：取出生后5～7天的雄性昆明小鼠睾丸，去掉睾丸白膜，先以1mg/mLⅣ型胶原酶和20μg/mL的DNAseⅠ联合消化，然后以0.25％胰酶-0.01％EDTA和20μg/mL的DNAaseⅠ联合消化，用含10wt％FBS的DMEM不完全培养基终止消化，用60μm细胞筛过滤，于低温离心机1000rpm离心6min，重悬细胞，获得含原代精原干细胞的睾丸单细胞悬液；

所述的DMEM完全培养基组成为：DMEM不完全培养基中添加1％v/v的必需氨基酸溶液、1％v/v的非必需氨基酸溶液、1％v/v维生素溶液、55μMβ-巯基乙醇溶液、2mM L-谷氨酰胺、2mM丙酮酸钠、5wt％FCS、1％v/v的双抗溶液、20ng/mL rmbFGF因子、20ng/mL rrGDNF因子和10³U/mL mLIF因子；

所述的采用反复差速贴壁法纯化方法的具体步骤为：将含原代精原干细胞的睾丸单细胞悬液接种至0.1wt％明胶包被的培养瓶中，37℃、5％CO₂的培养箱中培养8～10h，因体细胞贴壁速度快且牢固而将未贴壁的悬浮细胞接种至新的明胶包被培养瓶中，37℃、5％CO₂的培养箱中培养8～10h，如此共重复3次，收集未贴壁的细胞及悬液，1000rpm/min，离心5min，获得纯化的原代精原干细胞；

所述的精原干细胞培养过程中需更换培养液，具体是培养的第3d全量换液，以后每3d半量换液。