JP5252411B2 - 細胞培養担体および細胞の培養方法 - Google Patents
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Description
本発明は、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や成体多能性幹細胞等の多能性を有する未分化な細胞の培養技術、特に、継代培養等に好適な培養担体およびこれを用いた細胞の培養方法に関する。
近年、ヒト骨髄液からの幹細胞の分離、目的とする組織細胞への分化・誘導、３次元培養技術、足場材料の開発等の進歩に伴い、細胞培養によって幹細胞から皮膚、骨、軟骨、血管、心臓弁、靭帯等の組織を作製することが可能となり、一部では、既に臨床応用が開始されている。
一方、ＥＳ細胞に代表される未分化細胞は、他のすべての組織細胞に分化することができる全能性を有する細胞であることから、再生医療への応用が期待されている細胞である。
このため、未分化細胞から組織細胞への分化誘導法の研究が盛んに進められている。
前記ＥＳ細胞を再生医療の目的で使用するためには、核を除外した卵子と他の個体の体細胞の核とを融合して作製されるＥＳ細胞株を大量に増殖させる技術が必要である。
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前記ＥＳ細胞を再生医療の目的で使用するためには、核を除外した卵子と他の個体の体細胞の核とを融合して作製されるＥＳ細胞株を大量に増殖させる技術が必要である。
現在のところ、マウスＥＳ細胞は、ＬＩＦ（白血病阻害因子）存在下で、かつ、ＳＴＯ（マウス胎児繊維芽細胞）等に代表されるフィーダ細胞上で共培養することにより、未分化性を維持することができることが確認されている（例えば、非特許文献１参照）。
また、最近では、ヒト胚盤胞期胚からも、多分化能を有し、長期間未分化のままで細胞分裂可能なヒトＥＳ細胞株の樹立が報告されつつある。
また、最近では、ヒト胚盤胞期胚からも、多分化能を有し、長期間未分化のままで細胞分裂可能なヒトＥＳ細胞株の樹立が報告されつつある。
従来、上記のようなＥＳ細胞等に代表される未分化な細胞を増殖または維持するための一般的な培養担体としては、プラスチックシャーレ上に、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、マトリゲル等の生体内成分をコーティングしたものに、マウス由来やヒト組織由来の支持細胞を増殖させたものが用いられている。
一方、特許文献１には、球状細胞塊の大量培養に適した培養担体として、ガラス等の無機材料、ステンレス鋼等の金属材料、合成樹脂、ゴム等からなる基板表面上に、アレイ状やハニカム状に規則配列された種細胞を凝集させて保持する細胞培養セルを備えた細胞培養チップが開示されている。
特開２００５−２７５９８号公報
Li Cui, Katsunori Sasaki, The Journal of Histochemistry and Cytochemistry, 2004, 52, p.1447-1457
しかしながら、上記のような培養担体でＥＳ細胞を増殖させた場合、細胞は扁平なコロニー（細胞塊）を形成し、それが巨大化するにつれて、ＥＳ細胞が有している未分化状態が消失していく。
このため、例えば、マウスＥＳ細胞を継代培養するためには、顕微鏡下でＥＳ細胞コロニーを観察し、ある程度の大きさになったところで、トリプシン処理によりコロニーを培養担体から剥離して細胞単独に分離し、他の担体に継代することによって、ＥＳ細胞を増殖し、維持していく方法が採用されている。
この方法においては、得られるＥＳ細胞コロニーのサイズ制御が難しく、得られるＥＳ細胞コロニーのサイズが一定とならない。このため、継代培養するタイミングの判断が難しく、タイミングを誤ると、分化した細胞と未分化細胞とが混在してしまうという課題を有していた。
このため、例えば、マウスＥＳ細胞を継代培養するためには、顕微鏡下でＥＳ細胞コロニーを観察し、ある程度の大きさになったところで、トリプシン処理によりコロニーを培養担体から剥離して細胞単独に分離し、他の担体に継代することによって、ＥＳ細胞を増殖し、維持していく方法が採用されている。
この方法においては、得られるＥＳ細胞コロニーのサイズ制御が難しく、得られるＥＳ細胞コロニーのサイズが一定とならない。このため、継代培養するタイミングの判断が難しく、タイミングを誤ると、分化した細胞と未分化細胞とが混在してしまうという課題を有していた。
また、ヒトやサル等の霊長類のＥＳ細胞の場合は、マウスＥＳ細胞と異なり、コロニー化している培養細胞を培養担体から剥離するためにトリプシン処理を行い、単独細胞とすると、該細胞は生存することができない。
このため、霊長類の細胞の維持は、短時間のコラゲナーゼ・トリプシンによる酵素処理後、ピペッティングを行い、ＥＳ細胞コロニーを細分化させて、他の担体に撒き直す等の方法により行われている。
このようにして採取されたＥＳ細胞コロニーから培養された細胞塊は、サイズが不均一であり、これを用いた分化誘導も不均一になりやすいという課題を有していた。
このため、霊長類の細胞の維持は、短時間のコラゲナーゼ・トリプシンによる酵素処理後、ピペッティングを行い、ＥＳ細胞コロニーを細分化させて、他の担体に撒き直す等の方法により行われている。
このようにして採取されたＥＳ細胞コロニーから培養された細胞塊は、サイズが不均一であり、これを用いた分化誘導も不均一になりやすいという課題を有していた。
本発明は、上記技術的課題を解決するためになされたものであり、ヒトＥＳ細胞等の未分化細胞を、均一なサイズに効率的に増殖させることができ、かつ、その未分化状態を保持しつつ細胞を培養できる細胞培養担体および細胞の培養方法を提供することを目的とするものである。
本発明に係る細胞培養担体は、底面が半球状である複数の凹部が、ジルコニア、イットリア、チタニア、アルミナ、シリカ、ハイドロキシアパタイトおよびβ−リン酸三カルシウムのうちの少なくともいずれか１種のセラミックスからなる基材表面にマトリックス状に規則的に配列され、前記凹部及び前記基材表面が気孔径１０ｎｍ以上２０００ｎｍの多孔体からなり、かつ、前記凹部は、径が１０μｍ以上１０００μｍ以下、深さが３０μｍ以上１０００μｍ以下であることを特徴とする。
上記のような培養担体を用いれば、未分化細胞の分化・誘導を促進することがなく、生体安全性が高く、ＥＳ細胞等の未分化細胞コロニーのサイズ制御が可能となり、培養細胞の培養担体からの剥離（回収）も容易であり、操作性にも優れ、効率的な培養を行うことができる。
上記のような培養担体を用いれば、未分化細胞の分化・誘導を促進することがなく、生体安全性が高く、ＥＳ細胞等の未分化細胞コロニーのサイズ制御が可能となり、培養細胞の培養担体からの剥離（回収）も容易であり、操作性にも優れ、効率的な培養を行うことができる。
特に、前記培養担体が、マウスＥＳ細胞の培養に用いられる場合は、凹部の径は１００μｍ以上４００μｍ以下、深さは５０μｍ以上４００μｍ以下であり、また、ヒトＥＳ細胞の培養に用いられる場合は、凹部の径は２５０μｍ以上１０００μｍ以下、深さは１２５μｍ以上１０００μｍ以下であることが好ましい。
本発明に係る細胞の培養方法は、上記のような培養担体を用いて、未分化細胞を該培養担体の凹部の少なくとも１ヶ所に撒種して培養し、未分化な状態のままで増殖した細胞塊を得ることを特徴とする。
上記のような本発明に係る培養担体を用いて未分化細胞を培養することにより、未分化細胞を分化させることなく、効率的に大量培養することができる。
上記のような本発明に係る培養担体を用いて未分化細胞を培養することにより、未分化細胞を分化させることなく、効率的に大量培養することができる。
さらに、本発明に係る細胞の培養方法は、上記において培養して得られた細胞塊を単一細胞または細胞小集団に分離し、前記培養担体から剥離して得られた未分化細胞を用いて、上記培養方法を繰り返すことにより継代培養を行うことを特徴とする。
上記のような本発明に係る培養担体を用いれば、同様の培養操作を容易に繰り返し行うことができ、効率的な継代培養を行うことができる。
上記のような本発明に係る培養担体を用いれば、同様の培養操作を容易に繰り返し行うことができ、効率的な継代培養を行うことができる。
前記継代培養方法においては、細胞塊の分離は、酵素処理およびピペッティングにより容易に行うことができる。
培養細胞が剥離しやすい本発明に係る培養担体を用いることにより、長時間のトリプシン処理を要することなく、培養細胞の培養担体からの剥離および分離操作を容易に行うことができ、効率化が図られる。
培養細胞が剥離しやすい本発明に係る培養担体を用いることにより、長時間のトリプシン処理を要することなく、培養細胞の培養担体からの剥離および分離操作を容易に行うことができ、効率化が図られる。
さらに、本発明に係る他の態様の細胞の培養方法は、上記において得られた細胞塊を前記培養担体から細胞塊の状態のまま剥離し、この未分化細胞の細胞塊を用いて浮遊培養を行うことを特徴とする。
このように、前記未分化細胞の細胞塊は、継代培養に限らず、浮遊培養にも好適に適用することができ、この浮遊培養により、ＥＳ細胞から胚様体（ＥＢ：embryoid body）を容易に得ることができる。
このように、前記未分化細胞の細胞塊は、継代培養に限らず、浮遊培養にも好適に適用することができ、この浮遊培養により、ＥＳ細胞から胚様体（ＥＢ：embryoid body）を容易に得ることができる。
前記細胞培養担体からの細胞塊の剥離は、ピペッティングのみで行うことができる。
本発明に係る培養担体を用いることにより、トリプシン処理によらなくても、培養担体からの剥離が容易となり、酵素処理によるダメージのない複数の均一な細胞塊を得ることができる。
本発明に係る培養担体を用いることにより、トリプシン処理によらなくても、培養担体からの剥離が容易となり、酵素処理によるダメージのない複数の均一な細胞塊を得ることができる。
上記方法により培養して得られた未分化細胞においては、未分化マーカーの発現を維持したまま、培養することが可能である。
上述したとおり、本発明に係る細胞培養担体は、その基材表面の所定の凹部が物理的隔壁を形成するため、該凹部内において未分化の状態を保持したまま、未分化細胞の培養を行うことができ、また、培養された細胞塊の取り扱いも容易となる。
また、前記培養担体は、凹部表面が多孔体により構成されていることにより、培養細胞塊を培養担体から容易に剥離することができ、均一なサイズの培養細胞を簡便に得ることができる。
さらに、上記培養担体を用いた本発明に係る細胞の培養方法によれば、フィーダ細胞を用いることなく、未分化細胞を、未分化な状態を保持したまま、効率的に大量継代培養することができる。
したがって、本発明は、ＥＳ細胞や成体多能性幹細胞等の多能性を有する未分化な細胞の培養技術の発展、ひいては、生体組織の再生治療への応用に貢献し得るものである。
また、前記培養担体は、凹部表面が多孔体により構成されていることにより、培養細胞塊を培養担体から容易に剥離することができ、均一なサイズの培養細胞を簡便に得ることができる。
さらに、上記培養担体を用いた本発明に係る細胞の培養方法によれば、フィーダ細胞を用いることなく、未分化細胞を、未分化な状態を保持したまま、効率的に大量継代培養することができる。
したがって、本発明は、ＥＳ細胞や成体多能性幹細胞等の多能性を有する未分化な細胞の培養技術の発展、ひいては、生体組織の再生治療への応用に貢献し得るものである。
以下、本発明についてより詳細に説明する。
本発明に係る未分化細胞用培養担体は、表面が多孔体からなる複数の凹部が、基材表面にマトリックス状に配列されているものである。
なお、ここでいうマトリックス状とは、行方向および列方向に配列されていることを意味し、特に、行方向と列方向とが、ほぼ直交していることが好ましい。
このような形状の培養担体を用いることにより、基材表面に形成された凹部内のみで細胞を増殖させることが可能となり、ＥＳ細胞等の未分化細胞コロニーのサイズ制御を行うことができる。
すなわち、ＥＳ細胞等は、培養されて凹部の大きさに達すると増殖を鈍化させる性質があり、常時観察していなくても、所望の大きさの細胞塊を得ることができる。未分化を維持することができる大きさの凹部を用いることにより、サイズが制御された未分化細胞の増殖が容易になる。
本発明に係る未分化細胞用培養担体は、表面が多孔体からなる複数の凹部が、基材表面にマトリックス状に配列されているものである。
なお、ここでいうマトリックス状とは、行方向および列方向に配列されていることを意味し、特に、行方向と列方向とが、ほぼ直交していることが好ましい。
このような形状の培養担体を用いることにより、基材表面に形成された凹部内のみで細胞を増殖させることが可能となり、ＥＳ細胞等の未分化細胞コロニーのサイズ制御を行うことができる。
すなわち、ＥＳ細胞等は、培養されて凹部の大きさに達すると増殖を鈍化させる性質があり、常時観察していなくても、所望の大きさの細胞塊を得ることができる。未分化を維持することができる大きさの凹部を用いることにより、サイズが制御された未分化細胞の増殖が容易になる。
また、前記凹部の表面を多孔体により構成することにより、培養細胞が培養担体の凹部内へ付着しやすく、かつ、剥離しやすくなる。このため、培養細胞を回収する際、特に、ヒトＥＳ細胞等において好ましくない、長時間の酵素処理を要することなく、ピペッティングにより容易に剥離することが可能となる。
また、培養担体への培養細胞の付着面積を小さくする観点から、前記凹部のみならず、基材表面も含む培養担体全体が、多孔体からなることがより好ましい。
これにより、培養細胞の該培養担体に対する付着および剥離を、より効率的に行うことができる。
これにより、培養細胞の該培養担体に対する付着および剥離を、より効率的に行うことができる。
なお、前記凹部は、規則的に配列されていることが好ましい。
このように、前記凹部が規則的に配列されていることにより、機械的にピペッティング等を行うことが可能となり、均一な大きさの細胞塊が得られることから、培養細胞の効率的かつ均等な量産が可能となる。
このように、前記凹部が規則的に配列されていることにより、機械的にピペッティング等を行うことが可能となり、均一な大きさの細胞塊が得られることから、培養細胞の効率的かつ均等な量産が可能となる。
前記凹部は、径が１０μｍ以上１０００μｍ以下、深さが３０μｍ以上１０００μｍ以下であることが好ましい。
通常、ＥＳ細胞コロニーは、ある一定のサイズ以上になると、未分化状態を失うため、未分化状態を保持する観点から、凹部は上記範囲内のサイズであることが好ましい。
また、前記多孔体は、気孔径が１０ｎｍ以上２０００ｎｍであることが好ましい。
このような多孔体とすることにより、培養担体の凹部内に培養細胞が付着しやすくなり、かつ、ピペッティングにより容易に剥離することができる。
通常、ＥＳ細胞コロニーは、ある一定のサイズ以上になると、未分化状態を失うため、未分化状態を保持する観点から、凹部は上記範囲内のサイズであることが好ましい。
また、前記多孔体は、気孔径が１０ｎｍ以上２０００ｎｍであることが好ましい。
このような多孔体とすることにより、培養担体の凹部内に培養細胞が付着しやすくなり、かつ、ピペッティングにより容易に剥離することができる。
前記凹部の形状は、特に限定されるものではなく、基材表面に上記サイズでの加工が可能である限り、種々の形状とすることができる。
特に、本発明に係る細胞培養担体から剥離した細胞塊を浮遊培養に用いる場合には、剥離性および形成するコロニーの形状等の観点から、底面が半球状であることが好ましい。
なお、本発明においては、凹部のサイズを径と深さで表現しているが、本発明でいう凹部の径は、開口面が多角形状である場合、培養担体の基材表面の凹部の開口面積を円に置き換えた場合の直径である。また、深さは、凹部の最も深い部分の深さである。
特に、本発明に係る細胞培養担体から剥離した細胞塊を浮遊培養に用いる場合には、剥離性および形成するコロニーの形状等の観点から、底面が半球状であることが好ましい。
なお、本発明においては、凹部のサイズを径と深さで表現しているが、本発明でいう凹部の径は、開口面が多角形状である場合、培養担体の基材表面の凹部の開口面積を円に置き換えた場合の直径である。また、深さは、凹部の最も深い部分の深さである。
また、前記凹部のサイズは、培養される細胞の大きさに対して１倍以上１００倍以下の径であることが好ましい。
上記のようなサイズの凹部内で増殖した細胞塊は、サイズの均一化が図られ、また、ピペッティング等による回収が容易であり、効率的な培養を行うことができる。
なお、細胞の大きさの１倍の大きさの凹部は、未分化状態を維持することはできるが、増殖の余地があまりなく、また、細胞は、凹部から突出しない方が好ましいことから、２倍以上の径であることがより好ましい。
また、未分化の確実性を高めるため、２５倍以下であることがより好ましい。
上記のようなサイズの凹部内で増殖した細胞塊は、サイズの均一化が図られ、また、ピペッティング等による回収が容易であり、効率的な培養を行うことができる。
なお、細胞の大きさの１倍の大きさの凹部は、未分化状態を維持することはできるが、増殖の余地があまりなく、また、細胞は、凹部から突出しない方が好ましいことから、２倍以上の径であることがより好ましい。
また、未分化の確実性を高めるため、２５倍以下であることがより好ましい。
ＥＳ細胞１個の大きさは直径約１０μｍであり、細胞が凹部外で増殖することを防止するため、凹部の径は１０μｍ以上、深さは３０μｍ以上であることが好ましい。
一方、前記凹部のサイズが大きすぎると、増殖した未分化細胞の細胞塊が大きくなりすぎ、細胞が分化するおそれがあるため、該凹部の径は１０００μｍ以下、深さは１０００μｍ以下であることが好ましい。
一方、前記凹部のサイズが大きすぎると、増殖した未分化細胞の細胞塊が大きくなりすぎ、細胞が分化するおそれがあるため、該凹部の径は１０００μｍ以下、深さは１０００μｍ以下であることが好ましい。
特に、前記培養担体をマウスＥＳ細胞の培養に用いる場合は、凹部の径は１００μｍ以上４００μｍ以下、深さは５０μｍ以上４００μｍ以下であることが好ましい。
凹部の径が１００μｍ未満、深さが５０μｍ未満である場合、該凹部はマウスＥＳ細胞の増殖空間としては狭すぎて、培養液交換時のピペッティング操作等において、培養した細胞を吸い込みやすくなる等の不都合が生じる。
より好ましくは、凹部の径は２００μｍ以上、深さは１００μｍ以上である。
一方、凹部の径が４００μｍを超える場合、深さが４００μｍを超える場合は、該凹部はマウスＥＳ細胞の増殖空間としては大きすぎて、好ましいＥＳ細胞コロニーを形成することができない。
凹部の径が１００μｍ未満、深さが５０μｍ未満である場合、該凹部はマウスＥＳ細胞の増殖空間としては狭すぎて、培養液交換時のピペッティング操作等において、培養した細胞を吸い込みやすくなる等の不都合が生じる。
より好ましくは、凹部の径は２００μｍ以上、深さは１００μｍ以上である。
一方、凹部の径が４００μｍを超える場合、深さが４００μｍを超える場合は、該凹部はマウスＥＳ細胞の増殖空間としては大きすぎて、好ましいＥＳ細胞コロニーを形成することができない。
また、前記培養担体をヒトＥＳ細胞の培養に用いる場合は、凹部の径は２５０μｍ以上１０００μｍ以下、深さは１２５μｍ以上１０００μｍ以下であることが好ましい。
ヒトやサル等の霊長類のＥＳ細胞の場合は、上述したように、トリプシン処理を行い、細胞を単独にすると、細胞は生存することができない。このため、細胞が複数結合した細胞塊の状態で存在させる必要があることから、凹部のサイズは、マウスＥＳ細胞より大きい上記範囲内であることが好ましい。
ヒトやサル等の霊長類のＥＳ細胞の場合は、上述したように、トリプシン処理を行い、細胞を単独にすると、細胞は生存することができない。このため、細胞が複数結合した細胞塊の状態で存在させる必要があることから、凹部のサイズは、マウスＥＳ細胞より大きい上記範囲内であることが好ましい。
本発明に係る培養担体の基材としては、非金属無機材質が好ましく、特に、セラミックスまたはガラスが好適に用いられる。具体的な材質としては、生体安全性の高い、ジルコニア、イットリア、チタニア、アルミナ、シリカ、アルミナ−シリカ、ハイドロキシアパタイト、β−リン酸三カルシウム等が挙げられるが、これらの中でも、生体安定性が確認されている、アルミナ、ジルコニア、ハイドロキシアパタイト、β−リン酸三カルシウム、チタニアがより好ましい。特に、ジルコニアまたはハイドロキシアパタイトが好ましい。
また、本発明に係る細胞の培養方法は、上記のような本発明に係る培養担体を用いて、未分化細胞を該培養担体の凹部の少なくとも１ヶ所に撒種して培養し、未分化な状態のままで増殖した細胞塊を得ることを特徴とするものである。
上記のような特定の形状を有する培養担体を用いることにより、未分化細胞を分化させることなく、均一なサイズで、効率的に大量培養することができ、細胞塊を培養担体から容易に剥離することができる。
上記のような特定の形状を有する培養担体を用いることにより、未分化細胞を分化させることなく、均一なサイズで、効率的に大量培養することができ、細胞塊を培養担体から容易に剥離することができる。
従来の細胞の培養方法においては、例えば、ゼラチンコートした６ウェルプレートの穴に、マイトマイシン処理したＭＥＦ（マウス胚性繊維芽細胞）等によるフィーダ細胞層を形成し、この上に、ＥＳ細胞を滴下して培養していた。このような方法では、培養後、培養担体からピペッティング等でＥＳ細胞培養を回収する際、フィーダ細胞も混入する場合があった。
これに対して、上記のような本発明に係る培養担体を、フィーダ細胞上に載置し、その培養担体上で未分化細胞を培養することにより、培養細胞とフィーダ細胞との混合を防止することができる。
さらに、本発明に係る細胞の培養方法においては、フィーダ細胞を用いなくても、ＥＳ細胞を容易に培養することができる。
これに対して、上記のような本発明に係る培養担体を、フィーダ細胞上に載置し、その培養担体上で未分化細胞を培養することにより、培養細胞とフィーダ細胞との混合を防止することができる。
さらに、本発明に係る細胞の培養方法においては、フィーダ細胞を用いなくても、ＥＳ細胞を容易に培養することができる。
また、上記における初期（１次）培養により得られた細胞塊を単一細胞または細胞小集団に分離し、得られた未分化細胞を用いて、上記培養方法と同様にして、２次培養、３次培養、……と繰り返すことにより継代培養を行うことができる。
本発明において培養する細胞は、ＥＳ細胞等に代表される未分化細胞である。
未分化細胞とは、自分自身と同じ細胞に増殖する能力と、分化誘導因子の付与により決まった組織細胞に分化する能力とを有している、未分化の状態にある細胞であり、一旦、他の組織細胞に分化すると、未分化な状態に戻ることはできない。具体的には、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、間葉系幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、肝臓幹細胞、膵臓幹細胞、皮膚幹細胞等が挙げられる。
本発明においては、これらの未分化細胞のうち、ＥＳ細胞、間葉系幹細胞を用いることが好ましい。
未分化細胞とは、自分自身と同じ細胞に増殖する能力と、分化誘導因子の付与により決まった組織細胞に分化する能力とを有している、未分化の状態にある細胞であり、一旦、他の組織細胞に分化すると、未分化な状態に戻ることはできない。具体的には、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、間葉系幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、肝臓幹細胞、膵臓幹細胞、皮膚幹細胞等が挙げられる。
本発明においては、これらの未分化細胞のうち、ＥＳ細胞、間葉系幹細胞を用いることが好ましい。
本発明によれば、前記未分化細胞は、フィーダ細胞に代表される支持細胞を介することなく、上記のようなセラミックスからなる培養担体上に、直接、撒種して培養することが可能であり、また、そのようにすることが好ましい。
セラミックス培養担体に直接撒種することにより、培養する未分化細胞への他の細胞由来の危機因子の混入が防止される。
セラミックス培養担体に直接撒種することにより、培養する未分化細胞への他の細胞由来の危機因子の混入が防止される。
また、本発明に係る培養方法において用いられる培地は、特に限定されるものではなく、培養する細胞に応じて、適宜選択することができる。例えば、ＭＥＭ、α−ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、イーグル培地等が好適に用いられる。
これらの培地には、一般に、ＦＢＳ（fetal bovine serum；ウシ胎児血清）、ＫＳＲ（KnockOutTM Serum Replacement）、ＬＩＦ（leukemia inhibitory factor；白血病阻害因子）、ｂＦＧＦ（basic fibroblast growth factor）等が添加され、さらに、増殖補助のため、非必須アミノ酸、ピルビン酸、メルカプトエタノール等を添加することが好ましい。
これらの培地には、一般に、ＦＢＳ（fetal bovine serum；ウシ胎児血清）、ＫＳＲ（KnockOutTM Serum Replacement）、ＬＩＦ（leukemia inhibitory factor；白血病阻害因子）、ｂＦＧＦ（basic fibroblast growth factor）等が添加され、さらに、増殖補助のため、非必須アミノ酸、ピルビン酸、メルカプトエタノール等を添加することが好ましい。
継代培養を行う際には、前記培養担体にＥＳ細胞を撒種し、凹部内が増殖した細胞により埋め尽くされた後、別の培養担体にＥＳ細胞を撒き替える。
この撒き替えの際、細胞塊を培養担体から引き離し、単一細胞再または細胞小集団に分離する必要があるが、これは、短時間のトリプシン等の酵素処理または数回のピペッティングにより行うことができる。
この撒き替えの際、細胞塊を培養担体から引き離し、単一細胞再または細胞小集団に分離する必要があるが、これは、短時間のトリプシン等の酵素処理または数回のピペッティングにより行うことができる。
上記方法により培養して得られた未分化細胞は、アルカリフォスファターゼに代表される未分化マーカーの発現を維持しているものであることが好ましい。
これらが確認されることにより、ＥＳ細胞が未分化状態であることが分かる。すなわち、未分化状態であると発現し、分化すると発現しなくなる抗原を染色し、アルカリフォスファターゼ等の未分化マーカーが発現していることを確認することにより、未分化状態であることを確認することができる。
本発明に係る細胞の培養方法によれば、上記のような特性を維持した状態で継代培養することができる。
これらが確認されることにより、ＥＳ細胞が未分化状態であることが分かる。すなわち、未分化状態であると発現し、分化すると発現しなくなる抗原を染色し、アルカリフォスファターゼ等の未分化マーカーが発現していることを確認することにより、未分化状態であることを確認することができる。
本発明に係る細胞の培養方法によれば、上記のような特性を維持した状態で継代培養することができる。
また、上記において得られた細胞塊は、前記培養担体から細胞塊の状態のまま剥離し、この未分化細胞の細胞塊を用いて浮遊培養を行うこともできる。
このように、本発明により得られる未分化細胞の細胞塊は、継代培養に限らず、浮遊培養にも好適に適用することができ、この浮遊培養により、ＥＳ細胞から胚様体（ＥＢ）を容易に得ることができる。
このように、本発明により得られる未分化細胞の細胞塊は、継代培養に限らず、浮遊培養にも好適に適用することができ、この浮遊培養により、ＥＳ細胞から胚様体（ＥＢ）を容易に得ることができる。
なお、上述したように、ヒト、サル等の霊長類のＥＳ細胞は、トリプシン処理によって、細胞塊が完全に分離されると、生存することができなくなる。これに対して、本発明に係る培養担体を用いれば、培養細胞が剥離しやすくなるため、トリプシン等の酵素処理によらなくても、ピペッティングのみにより、細胞塊の状態のまま培養担体から剥離することができる。そして、この細胞塊ごとに浮遊培養を行うことにより、均一なサイズの胚様体（ＥＢ）を容易に形成することができる。
以下、本発明を実施例に基づいてさらに具体的に説明するが、本発明は、下記実施例により制限されるものではない。
［実施例１］
２４ウェルプレートの穴に、径が２５０μｍの半球状の凹部がマトリックス状に配列しているアルミナセラミックス多孔体からなる培養担体を無菌状態で入れた。図１に、前記アルミニウムセラミックス多孔体の電子顕微鏡写真（２００００倍）に示す。
この培養担体に、３．０×１０4個／ｍｌのマウスＥＳ細胞１ｍｌを撒種し、ＫＳＲ、ＬＩＦ、ピルビン酸、非必須アミノ酸、メルカプトエタノールを含んだＤＭＥＭにおいて、５％ＣＯ2インキュベータ内で、３７℃で３日間培養した。
［実施例１］
２４ウェルプレートの穴に、径が２５０μｍの半球状の凹部がマトリックス状に配列しているアルミナセラミックス多孔体からなる培養担体を無菌状態で入れた。図１に、前記アルミニウムセラミックス多孔体の電子顕微鏡写真（２００００倍）に示す。
この培養担体に、３．０×１０4個／ｍｌのマウスＥＳ細胞１ｍｌを撒種し、ＫＳＲ、ＬＩＦ、ピルビン酸、非必須アミノ酸、メルカプトエタノールを含んだＤＭＥＭにおいて、５％ＣＯ2インキュベータ内で、３７℃で３日間培養した。
さらに、培養後のＥＳ細胞コロニーについて、アルカリフォスファターゼ組織染色キット（８６−Ｒ；ＳＩＧＭＡ社製）を用いて、下記の操作により、アルカリフォスファターゼ染色を行い、未分化状態を調べた。
２４ウェルプレート内の培地を吸引除去し、ＰＢＳバッファーを用いて洗浄後、アルデヒド溶液で固定処理を行った。さらに、この固定処理した担体と染色液とを１５ｍｌチューブに入れ、室温で３０〜６０分間静置して染色した。
図２に、染色後の細胞の顕微鏡写真（５０倍）を示す。
図２の顕微鏡写真に示された染色状況から、培養されたマウスＥＳ細胞は、ほぼ均一なコロニーを形成しており、その未分化性は、アルカリフォスファターゼ活性により確認された。
２４ウェルプレート内の培地を吸引除去し、ＰＢＳバッファーを用いて洗浄後、アルデヒド溶液で固定処理を行った。さらに、この固定処理した担体と染色液とを１５ｍｌチューブに入れ、室温で３０〜６０分間静置して染色した。
図２に、染色後の細胞の顕微鏡写真（５０倍）を示す。
図２の顕微鏡写真に示された染色状況から、培養されたマウスＥＳ細胞は、ほぼ均一なコロニーを形成しており、その未分化性は、アルカリフォスファターゼ活性により確認された。
また、図３に、上記によりアルカリフォスファターゼ染色した培養細胞を、トリプシン処理を行わずに、ピペッティングにより回収した後の培養担体の顕微鏡写真（５０倍）を示す。
図３の顕微鏡写真から分かるように、培養したマウスＥＳ細胞コロニーは、トリプシン処理を行わなくても、ピペッティングによって、培養担体から容易に剥離することができ、壊れるとなく、ほぼ完全に回収することができた。
図３の顕微鏡写真から分かるように、培養したマウスＥＳ細胞コロニーは、トリプシン処理を行わなくても、ピペッティングによって、培養担体から容易に剥離することができ、壊れるとなく、ほぼ完全に回収することができた。
［比較例１］
径が２５０μｍの半球状の凹部がマトリックス状に配列しているアルミナセラミックス緻密体を培養担体として用い、実施例１と同様にして、マウスＥＳ細胞の培養を行った。図４に、前記アルミニウムセラミックス緻密体の電子顕微鏡写真（２００００倍）に示す。
また、図５に、培養細胞のアルカリフォスファターゼ染色後の顕微鏡写真（５０倍）を示す。
図５の顕微鏡写真に示された染色状況から、培養されたマウスＥＳ細胞は、均一ではないものの、コロニーを形成しており、その未分化性は、アルカリフォスファターゼ活性により確認された。
径が２５０μｍの半球状の凹部がマトリックス状に配列しているアルミナセラミックス緻密体を培養担体として用い、実施例１と同様にして、マウスＥＳ細胞の培養を行った。図４に、前記アルミニウムセラミックス緻密体の電子顕微鏡写真（２００００倍）に示す。
また、図５に、培養細胞のアルカリフォスファターゼ染色後の顕微鏡写真（５０倍）を示す。
図５の顕微鏡写真に示された染色状況から、培養されたマウスＥＳ細胞は、均一ではないものの、コロニーを形成しており、その未分化性は、アルカリフォスファターゼ活性により確認された。
また、図６に、上記によりアルカリフォスファターゼ染色した培養細胞を、トリプシン処理を行わずに、ピペッティングにより回収した後の培養担体の顕微鏡写真（５０倍）を示す。
図６の顕微鏡写真から分かるように、培養したマウスＥＳ細胞コロニーは、ピペッティングによって、培養担体から剥離することができないものもあり、一部は培養担体に付着したまま残存した。
図６の顕微鏡写真から分かるように、培養したマウスＥＳ細胞コロニーは、ピペッティングによって、培養担体から剥離することができないものもあり、一部は培養担体に付着したまま残存した。
［比較例２］
凹部のない平坦なジルコニアセラミックスを培養担体として用い、実施例１と同様にして、マウスＥＳ細胞の培養を行った。図７に、前記該培養担体の電子顕微鏡写真（１００倍）を示す。
また、図８に、培養細胞のアルカリフォスファターゼ染色後の顕微鏡写真（５０倍）を示す。
図８の顕微鏡写真に示された染色状況から、培養されたマウスＥＳ細胞のコロニーは、形が歪んでおり、巨大化していた。また、アルカリフォスファターゼ染色の程度が劣り、未分化性が低下している傾向が認められた。
凹部のない平坦なジルコニアセラミックスを培養担体として用い、実施例１と同様にして、マウスＥＳ細胞の培養を行った。図７に、前記該培養担体の電子顕微鏡写真（１００倍）を示す。
また、図８に、培養細胞のアルカリフォスファターゼ染色後の顕微鏡写真（５０倍）を示す。
図８の顕微鏡写真に示された染色状況から、培養されたマウスＥＳ細胞のコロニーは、形が歪んでおり、巨大化していた。また、アルカリフォスファターゼ染色の程度が劣り、未分化性が低下している傾向が認められた。
［実施例２］
ゼラチンコートした２４ウェルプレートの穴に、マイトマイシン処理したＭＥＦ（マウス胚性繊維芽細胞）２．５×１０5個／ｍｌの細胞懸濁液により、フィーダ細胞層を形成した。この上に、径が８００μｍの半球状の凹部がマトリックス状に配列しているジルコニアセラミックス多孔体からなる培養担体を浸漬させた。図９に、該培養担体の電子顕微鏡写真（２００倍）を示す。
予め継代されたヒトＥＳ細胞をコラゲナーゼ−トリプシン溶液で処理した後、ピペッティングを行い、直径約２００μｍの細胞塊が含まれる細胞懸濁液４００個／ｍｌを、前記培養担体に撒種し、ｂＦＧＦ（basic fibroblast growth factor）、ＫＳＲ、ピルビン酸、非必須アミノ酸を含んだＤＭＥＭにおいて、５％ＣＯ2インキュベータ内で、３７℃で５日間培養した。
ゼラチンコートした２４ウェルプレートの穴に、マイトマイシン処理したＭＥＦ（マウス胚性繊維芽細胞）２．５×１０5個／ｍｌの細胞懸濁液により、フィーダ細胞層を形成した。この上に、径が８００μｍの半球状の凹部がマトリックス状に配列しているジルコニアセラミックス多孔体からなる培養担体を浸漬させた。図９に、該培養担体の電子顕微鏡写真（２００倍）を示す。
予め継代されたヒトＥＳ細胞をコラゲナーゼ−トリプシン溶液で処理した後、ピペッティングを行い、直径約２００μｍの細胞塊が含まれる細胞懸濁液４００個／ｍｌを、前記培養担体に撒種し、ｂＦＧＦ（basic fibroblast growth factor）、ＫＳＲ、ピルビン酸、非必須アミノ酸を含んだＤＭＥＭにおいて、５％ＣＯ2インキュベータ内で、３７℃で５日間培養した。
さらに、培養後のヒトＥＳ細胞コロニーについて、アルカリフォスファターゼ組織染色キット（８６−Ｒ；ＳＩＧＭＡ社製）を用いて、下記の操作により、アルカリフォスファターゼ染色を行い、未分化状態を調べた。
２４ウェルプレート内の培地を吸引除去し、ＰＢＳバッファーを用いて洗浄後、アルデヒド溶液で固定処理を行った。さらに、この固定処理した担体と染色液とを１５ｍｌチューブに入れ、室温で３０〜６０分間静置して染色した。
図１０に、染色後の細胞の顕微鏡写真（２００倍）を示す。
図１０の顕微鏡写真に示された染色状況から、培養されたヒトＥＳ細胞は、ジルコニアセラミックス培養担体の凹部内で細胞コロニーを形成していることが認められ、また、そのＥＳ細胞コロニーの未分化性は、アルカリフォスファターゼ活性により確認された。
２４ウェルプレート内の培地を吸引除去し、ＰＢＳバッファーを用いて洗浄後、アルデヒド溶液で固定処理を行った。さらに、この固定処理した担体と染色液とを１５ｍｌチューブに入れ、室温で３０〜６０分間静置して染色した。
図１０に、染色後の細胞の顕微鏡写真（２００倍）を示す。
図１０の顕微鏡写真に示された染色状況から、培養されたヒトＥＳ細胞は、ジルコニアセラミックス培養担体の凹部内で細胞コロニーを形成していることが認められ、また、そのＥＳ細胞コロニーの未分化性は、アルカリフォスファターゼ活性により確認された。
［実施例３］
実施例１と同様にして、マウスＥＳ細胞を３日間培養した。
培養後、ＤＭＥＭをアスピレータで吸引し、ＦＢＳ、ピルビン酸、非必須アミノ酸、メルカプトエタノールを含んだＩＭＤＭにおいて、ピペッティングにより、培養担体の凹部内で培養されたマウスＥＳ細胞コロニーを剥離した。
図１１に、培養細胞のアルカリフォスファターゼ染色後の顕微鏡写真（５０倍）を示す。また、図１２に、上記によりアルカリフォスファターゼ染色した培養細胞を、ピペッティングにより回収した後の培養担体の顕微鏡写真（５０倍）を示す。
図１１の顕微鏡写真に示された染色状況から、培養されたマウスＥＳ細胞は、ほぼ均一なコロニーを形成しており、その未分化性は、アルカリフォスファターゼ活性により確認された。また、図１２の顕微鏡写真から分かるように、培養したマウスＥＳ細胞コロニーは、トリプシン処理を行わなくても、ピペッティングによって、培養担体から容易に剥離することができ、壊れるとなく、ほぼ完全に回収することができた。
実施例１と同様にして、マウスＥＳ細胞を３日間培養した。
培養後、ＤＭＥＭをアスピレータで吸引し、ＦＢＳ、ピルビン酸、非必須アミノ酸、メルカプトエタノールを含んだＩＭＤＭにおいて、ピペッティングにより、培養担体の凹部内で培養されたマウスＥＳ細胞コロニーを剥離した。
図１１に、培養細胞のアルカリフォスファターゼ染色後の顕微鏡写真（５０倍）を示す。また、図１２に、上記によりアルカリフォスファターゼ染色した培養細胞を、ピペッティングにより回収した後の培養担体の顕微鏡写真（５０倍）を示す。
図１１の顕微鏡写真に示された染色状況から、培養されたマウスＥＳ細胞は、ほぼ均一なコロニーを形成しており、その未分化性は、アルカリフォスファターゼ活性により確認された。また、図１２の顕微鏡写真から分かるように、培養したマウスＥＳ細胞コロニーは、トリプシン処理を行わなくても、ピペッティングによって、培養担体から容易に剥離することができ、壊れるとなく、ほぼ完全に回収することができた。
また、図１３に、凹部から剥離した前記マウスＥＳ細胞コロニーを非接触プレート上に移した直後の顕微鏡写真（１００倍）を示す。
図１３の顕微鏡写真から、直径１５０〜２００μｍの球状のマウスＥＳ細胞コロニーが浮遊していることが確認された。
図１３の顕微鏡写真から、直径１５０〜２００μｍの球状のマウスＥＳ細胞コロニーが浮遊していることが確認された。
次に、凹部から剥離したマウスＥＳ細胞コロニーを、細胞非接着分子がコーティングされた６ｃｍシャーレに移し、５％ＣＯ2インキュベータ内で３７℃５日間、浮遊培養し、マウスＥＢを形成した。
図１４に、培養後のマウスＥＢの顕微鏡写真（１００倍）を示す。
図１４に示す顕微鏡写真から、直径３００μｍの球状のマウスＥＢが浮遊していることが確認された。
さらに、マウスＥＢからｍＲＮＡを回収し、ＲＴ−ＰＣＲ法によるＤＮＡ化およびＰＣＲ法によりＤＮＡ断片の増幅を行い、未分化、外胚葉、中胚葉、内胚葉特有のマーカーの発現を確認したところ、ＥＢが、外胚葉、中胚葉、内胚葉に分化していることが確認された。
図１４に、培養後のマウスＥＢの顕微鏡写真（１００倍）を示す。
図１４に示す顕微鏡写真から、直径３００μｍの球状のマウスＥＢが浮遊していることが確認された。
さらに、マウスＥＢからｍＲＮＡを回収し、ＲＴ−ＰＣＲ法によるＤＮＡ化およびＰＣＲ法によりＤＮＡ断片の増幅を行い、未分化、外胚葉、中胚葉、内胚葉特有のマーカーの発現を確認したところ、ＥＢが、外胚葉、中胚葉、内胚葉に分化していることが確認された。
Claims (9)
- 底面が半球状である複数の凹部が、ジルコニア、イットリア、チタニア、アルミナ、シリカ、ハイドロキシアパタイトおよびβ−リン酸三カルシウムのうちの少なくともいずれか１種のセラミックスからなる基材表面にマトリックス状に規則的に配列され、前記凹部及び前記基材表面が気孔径１０ｎｍ以上２０００ｎｍの多孔体からなり、かつ、前記凹部は、径が１０μｍ以上１０００μｍ以下、深さが３０μｍ以上１０００μｍ以下であることを特徴とする細胞培養担体。
- 前記凹部の径が１００μｍ以上４００μｍ以下、深さが５０μｍ以上４００μｍ以下であり、マウスＥＳ細胞の培養に用いられていることを特徴とする請求項１に記載の細胞培養担体。
- 前記凹部の径が２５０μｍ以上１０００μｍ以下、深さが１２５μｍ以上１０００μｍ以下であり、ヒトＥＳ細胞の培養に用いられることを特徴とする請求項１に記載の細胞培養担体。
- 請求項１から請求項３までのいずれかに記載の培養担体を用いて、未分化細胞を前記培養担体の凹部の少なくとも１ヶ所に撒種して培養し、未分化な状態のままで増殖した細胞塊を得ることを特徴とする細胞の培養方法。
- 請求項４記載の培養方法を行い、培養して得られた前記細胞塊を単一細胞または細胞小集団に分離し、前記培養担体から剥離して得られた未分化細胞を用いて、請求項４記載の培養方法を繰り返すことにより継代培養を行うことを特徴とする細胞の培養方法。
- 前記細胞塊の分離が、酵素処理およびピペッティングにより行われることを特徴とする請求項５記載の細胞の培養方法。
- 請求項４記載の培養方法を行い、得られた細胞塊を前記培養担体から細胞塊の状態のまま剥離し、この未分化細胞の細胞塊を用いて浮遊培養を行うことを特徴とする細胞の培養方法。
- 前記細胞培養担体からの細胞塊の剥離を、ピペッティングのみで行うことを特徴とする請求項７記載の細胞の培養方法。
- 培養して得られた未分化細胞が、未分化マーカーの発現を維持しているものであることを特徴とする請求項４から請求項８までのいずれかに記載の細胞の培養方法。
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