WO2020036096A1 - 細胞懸濁液の製造方法 - Google Patents

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WO2020036096A1
WO2020036096A1 PCT/JP2019/030912 JP2019030912W WO2020036096A1 WO 2020036096 A1 WO2020036096 A1 WO 2020036096A1 JP 2019030912 W JP2019030912 W JP 2019030912W WO 2020036096 A1 WO2020036096 A1 WO 2020036096A1
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WO
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cells
pluripotent stem
substrate
stem cells
cell
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Application number
PCT/JP2019/030912
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English (en)
French (fr)
Inventor
久野豪士
今泉裕
Original Assignee
東ソー株式会社
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Application filed by 東ソー株式会社 filed Critical 東ソー株式会社
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a cell suspension, which does not require a cell identification operation using a microscope, is excellent in mass productivity, and can produce a highly pure suspension of pluripotent stem cells.
  • Pluripotent stem cells such as embryonic stem cells (ES cells) and induced pluripotent stem cells (iPS cells) have the ability to differentiate into various tissues of the living body (pluripotency), and are cells in the field of regenerative medicine. As a source, great attention is being paid. To apply pluripotent stem cells to regenerative medicine, first grow the required number of pluripotent stem cells in an undifferentiated state, and then collect the pluripotent stem cells as a cell suspension in a liquid It is essential.
  • ES cells embryonic stem cells
  • iPS cells induced pluripotent stem cells
  • Patent Literature 1 discloses a method in which high-frequency vibration is applied from the outside of a culture vessel to selectively remove cells from an adhesive surface inside the culture vessel. ing.
  • the method disclosed in Patent Document 1 selectively exfoliates cells from a part of the region, and requires an operation of observing and identifying cells with a microscope, which enhances mass productivity of a cell suspension. is not.
  • An object of the present invention is to provide a method for producing a cell suspension, which does not require a cell identification operation using a microscope, is excellent in mass productivity, and can produce a highly pure suspension of pluripotent stem cells. is there.
  • the present inventors have conducted intensive studies and found that a method for producing a cell suspension having a step of selectively detaching only undifferentiated cells without removing differentiated cells is described above. The inventors have found that the problem can be solved, and have completed the present invention.
  • a method for producing a cell suspension containing undifferentiated pluripotent stem cells comprising the following steps (1) and (2): (1) A step in which pluripotent stem cells are adhered to a culture substrate in a liquid medium and cultured. (2) Undifferentiated cultured in step (1) with at least a part of the differentiated cells adhered to the substrate by the step consisting of a plurality of combinations of the following [a] to [c] or the following step [c] Separating the pluripotent stem cells from the substrate.
  • ⁇ A a step of bringing a pluripotent stem cell into contact with an intercellular binding dissociation solution to dissociate intercellular binding
  • [B] A step of applying an external stress to selectively detach undifferentiated pluripotent stem cells.
  • [C] A step of cooling the substrate at a temperature and for a time at which the culture substrate has temperature responsiveness and undifferentiated pluripotent stem cells are selectively detached.
  • the external stress in the step [b] at which the undifferentiated pluripotent stem cells are selectively detached and the temperature and time in the step [c] are determined by performing the step (2) under a plurality of detachment conditions.
  • the undifferentiation rate of the cells contained in the suspension is measured by a flow cytometer, and the condition with the highest undifferentiation rate is selected, or the cells on the culture substrate are subjected to phase contrast microscopy before and after the step (2). It is determined by observing and selecting the conditions under which undifferentiated pluripotent stem cells selectively detach from the substrate.
  • the step [a] is a step of contacting an intercellular binding dissociation solution containing a chelating agent for 1 second to 30 minutes, or a step of contacting an intercellular binding dissociation solution containing trypsin for 1 second to 10 minutes.
  • the culture substrate of the step [c] has a polymer layer having a product of the layer thickness ⁇ the content ratio of the temperature-responsive component of 5 to 100 nm, [1] to [4]. ] The method for producing a cell suspension according to any one of [1] to [10].
  • [6] The method according to any one of [1] to [5], wherein the culture substrate in the step [c] is a block copolymer having a content of the temperature-responsive component of 75 wt% or more.
  • [7] The cell suspension according to any one of [1] to [6], wherein in the steps [b] and [c], the pluripotent stem cells are detached in the presence of a liquid medium. Production method.
  • the present invention it is possible to provide a method for producing a cell suspension, which does not require cell sorting by a microscope, is excellent in mass productivity, and can produce a highly pure suspension of pluripotent stem cells.
  • the present embodiment an embodiment for implementing the present invention (hereinafter, simply referred to as “the present embodiment”) will be described in detail.
  • the following embodiment is an exemplification for describing the present invention, and is not intended to limit the present invention to the following contents.
  • the present invention can be appropriately modified and implemented within the spirit of the invention.
  • LCST Lower Critical Solution Temperature
  • a temperature-responsive polymer dissolves in water at a temperature lower than LCST, it becomes insoluble in water at a temperature higher than LCST.
  • the temperature-responsive polymer When the temperature-responsive polymer is water-insoluble, it has no LCST, but has a response temperature at which the degree of hydrophilicity / hydrophobicity changes with temperature change.
  • the “undifferentiation rate” of the cells contained in the cell suspension refers to how many of the cells contained in the cell suspension are undifferentiated pluripotent stem cells. Shows the ratio of When the undifferentiation rate is high, it means that the purity of the pluripotent stem cells contained in the cell suspension is high, which is preferable.
  • the undifferentiation rate of the cell suspension can be determined by fluorescently staining the undifferentiated marker of the cells contained in the cell suspension and calculating the ratio of the stained cells by a flow cytometer.
  • the type of pluripotent stem cells is not particularly limited, but for example, ES cells, iPS cells, and nuclear transplanted ES cells (ntES cells) can be used, and iPS cells are particularly preferable.
  • the animal from which the pluripotent stem cells are derived is not particularly limited, but may be, for example, a mammal. Examples of mammals include rodents (mouse, rat, etc.) and primates (monkey, human, etc.), and may be experimental animals or companion animals. In the present invention, it is preferably derived from a primate, and particularly preferably derived from a human.
  • the term “differentiated cells” refers to cells that have been converted into cells other than pluripotent stem cells due to differentiation of the pluripotent stem cells.
  • a method for producing a cell suspension containing undifferentiated pluripotent stem cells wherein the method for producing a cell suspension of the present invention includes the following steps (1) and (2).
  • (1) A step in which pluripotent stem cells are adhered to a culture substrate in a liquid medium and cultured.
  • ⁇ A a step of bringing a pluripotent stem cell into contact with an intercellular binding dissociation solution to dissociate intercellular binding.
  • [B] A step of applying an external stress to selectively detach undifferentiated pluripotent stem cells.
  • [C] A step of cooling the substrate at a temperature and for a time at which the culture substrate has temperature responsiveness and undifferentiated pluripotent stem cells are selectively detached.
  • the external stress in the step [b] at which the undifferentiated pluripotent stem cells are selectively detached and the temperature and time in the step [c] are determined by performing the step (2) under a plurality of detachment conditions.
  • the undifferentiation rate of the cells contained in the suspension is measured by a flow cytometer, and the condition with the highest undifferentiation rate is selected, or the cells on the culture substrate are subjected to phase contrast microscopy before and after step (2). It is determined by observing and selecting the conditions under which undifferentiated pluripotent stem cells selectively detach from the substrate.
  • pluripotent stem cells are adhered to a culture substrate in a liquid medium and cultured.
  • the method for culturing pluripotent stem cells on a culture substrate is not particularly limited, but feeder-free culture is preferred.
  • culturing is preferably performed under conditions effective to maintain undifferentiation, such as culturing in the presence of an appropriate liquid medium.
  • a medium effective for maintaining undifferentiated pluripotent stem cells for example, known as a factor for maintaining undifferentiated pluripotent stem cells, insulin, transferrin, selenium, ascorbic acid, A medium to which one or more of sodium bicarbonate, basic fibroblast growth factor, transforming growth factor ⁇ (TGF ⁇ ), CCL2, activin, and 2-mercaptomethanol are added can be suitably used. Insulin, transferrin, selenium, ascorbic acid, sodium bicarbonate, basic fibroblast growth factor, transforming growth factor ⁇ (TGF ⁇ ) are particularly suitable for maintaining the undifferentiation of pluripotent stem cells. It is more preferable to use a medium containing the medium, and it is most preferable to use a medium to which basic fibroblast growth factor has been added.
  • the type of medium to which the basic fibroblast growth factor has been added is not particularly limited.
  • commercially available products include DMEM (Sigma-Aldrich Co., LLC) and Ham's F12 (Sigma-Aldrich Co., LLC).
  • D-MEM / Ham's F12 (Sigma-Aldrich Co., LLC), Primate ES Cell Medium (REPROCELL), StemFit AK02N (Ajinomoto), StemFit AK03 (Ajinomoto) MTeSR1 (manufactured by STEMCELL TECHNOLOGIES), TeSR-E8 (manufactured by STEMCELL TECHNOLOGIES), ReproNive (manufactured by REPROCELL), ReproXF (manufactured by REPROCELL) EPROCELL), ReproFF (manufactured by REPROCELL), ReproFF2 (manufactured by REPROCELL), NutriStem (manufactured by Biologic Industries), iSTEM (manufactured by Takara Bio Inc.), GS2-M (manufactured by Takara Bio Inc.) Co., Ltd.), hPSC ⁇ Growth ⁇ Medium ⁇ DXF (PromoCell Co., Ltd
  • a Rho-binding kinase inhibitor is further added to the medium containing the basic fibroblast growth factor. It is preferable to use a prepared medium. In particular, when human pluripotent stem cells are used and the Rho-binding kinase inhibitor is added in a state where the cell density of human pluripotent stem cells is low, survival of human pluripotent stem cells can be maintained. May be effective.
  • Rho-binding kinase inhibitors include, for example, (R)-(+)-trans-N- (4-pyridyl) -4- (1-aminoethyl) -cyclohexanecarboxamide.2HCl.H2O (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) Y-27632), 1- (5-isoquinolinesulfonyl) homopiperazine @ Hydrochloride (HA1077, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) can be used.
  • the concentration of the Rho-binding kinase inhibitor added to the medium is a range that is effective for maintaining the survival of human pluripotent stem cells and does not affect the undifferentiated state of human pluripotent stem cells, It is preferably from 1 ⁇ M to 50 ⁇ M, more preferably from 3 ⁇ M to 20 ⁇ M, even more preferably from 5 ⁇ M to 15 ⁇ M, and most preferably from 8 ⁇ M to 12 ⁇ M.
  • the method of seeding the pluripotent stem cells is not particularly limited.
  • the method is performed by injecting a cell suspension into the substrate. I can do it.
  • the cell density at the time of seeding is not particularly limited, but is preferably 1.0 ⁇ 10 2 to 1.0 ⁇ 10 6 cells / cm 2 so that the cells can be maintained and proliferated.
  • 5.0 ⁇ 10 2 to 5.0 ⁇ 10 5 cells / cm 2 are more preferable, 1.0 ⁇ 10 3 to 2.0 ⁇ 10 5 cells / cm 2 are particularly preferable, and 1.2 ⁇ 10 3 to 1 0.0 ⁇ 10 5 cells / cm 2 are most preferred.
  • the culture temperature for culturing the pluripotent stem cells on the substrate in the step (1) is not particularly limited, but is preferably 30 to 42 ° C. because it is suitable for cell growth ability, physiological activity and function maintenance. Is preferably 32 to 40 ° C., more preferably 36 to 38 ° C., and most preferably 37 ° C.
  • the first medium exchange 22 it is preferable to perform the first medium exchange 22 to 26 hours after the start of the culture. It is preferable that the medium be replaced a second time 48 to 72 hours after that, and then the medium be replaced every 24 to 48 hours. During this time, the pluripotent stem cells proliferate and form a cell mass called a colony. The culture is continued until the size of the colony becomes about 1 mm, and then the process proceeds to the step (2).
  • the step (1) is carried out while at least a part of the differentiated cells is adhered to the substrate by the step comprising a plurality of combinations of the above [a] to [c] or only the step [c].
  • the undifferentiated pluripotent stem cells cultured in the step are detached from the substrate.
  • Examples of the combination of [a] to [c] include a combination of [a] and [b], a combination of [a] and [c], a combination of [b] and [c], and all of [a] to [c].
  • a combination of [a] and [b], a combination of [a] and [c], and a combination of [b] and [b] because they are suitable for increasing the mass productivity of the cell suspension.
  • the combination of [c] or only [c] is preferred. Further, since it is suitable for increasing the undifferentiation rate, a combination of [a] and [c], a combination of [b] and [c], and only [c] are more preferable, and [a] and [c] And [c] alone are particularly preferred. Furthermore, the combination of [a] and [c] is most preferable because the cell suspension to be prepared is in a state suitable for use in undifferentiated maintenance culture or spheroid formation. By detaching the undifferentiated pluripotent stem cells from the substrate while keeping the differentiated cells adhered to the substrate, the undifferentiation rate of the cells contained in the cell suspension can be increased.
  • a step of selecting cells is unnecessary, mass production of a cell suspension can be improved when a large-area culture substrate is used.
  • the undifferentiation rate of the cells contained in the cell suspension cannot be increased.
  • a step of selecting the cells is required, so that when a large-area culture substrate is used, the mass productivity of the cell suspension can be reduced. May cause a decrease.
  • pluripotent stem cells are suitable for reducing damage to cells, increasing the survival rate of pluripotent stem cells, and maintaining pluripotency. Is preferably removed in the presence of a liquid medium.
  • cell scraping refers to an operation of peeling cells from a substrate by rubbing the surface of the substrate with a cell scraper.
  • the pluripotent stem cells are brought into contact with an intercellular binding dissociation solution to dissociate intercellular bonds.
  • Pluripotent stem cells proliferate in the state of colonies, so that cells form bonds and adhere to each other, and easily form a state in which they are difficult to peel from the substrate.
  • the dissociation of intercellular bonds does not significantly affect the releasability from the substrate. For this reason, by dissociating the intercellular bonds, undifferentiated pluripotent stem cells can be preferentially detached from the substrate with priority, and the undifferentiation rate of the cells contained in the cell suspension can be increased.
  • trypsin refers to “EC.3.4.21.4” of a protease that is secreted from the pancreas or a protease that has properties equivalent to those of the protease.
  • examples of commercially available products include Trypsin (trademark), TrypLE (trademark) SELECT, and TrypLE (trademark) EXPRES (all manufactured by Thermo Fisher).
  • the time for contacting the pluripotent stem cells cultured on the substrate with the intercellular binding dissociation solution containing trypsin is suitable for selectively exerting the action of trypsin only on undifferentiated pluripotent stem cells. For this reason, it is preferably 1 second to 10 minutes, more preferably 30 seconds to 5 minutes, particularly preferably 1 minute to 4 minutes, and most preferably 1 minute to 2 minutes.
  • the temperature of the intercellular binding dissociation solution at the time of contacting is preferably 10 to 40 ° C., more preferably 20 to 40 ° C., and particularly preferably 30 to 40 ° C. because it is suitable for activating trypsin. Preferably, 37 ° C. is most preferred.
  • a solution containing a chelating agent can also be suitably used.
  • it may contain only the chelating agent, or may contain both the chelating agent and the aforementioned trypsin.
  • the chelating agent is not particularly limited except that it is a chelating agent.
  • ethylenediaminetetraacetic acid ethylenediamine, ethylenediaminetetramethylenephosphonic acid, glycoletherdiaminetetraacetic acid, nitrilotriacetic acid, diethylenetriaminepentaacetic acid, N- (2 -Hydroxyethyl) ethylenediamine-N, N ′, N′-triacetic acid, triethylenetetramine-N, N, N ′, N ′′, N ′ ′′, N ′ ′′-hexaacetic acid, 1,3-propane Diamine-N, N, N ', N'-tetraacetic acid, 1,3-diamino-2-propanol-N, N, N', N'-tetraacetic acid, N- (2-hydroxyethyl) iminodiacetic acid, N, N-di (2-hydroxyethyl) glycine, glycol ether diaminetetraacetic acid, dicarboxy
  • a chelating agent that forms a chelate with a divalent metal ion is preferable, a chelating agent that forms a chelate with a divalent metal ion is more preferable, a chelating agent that forms a chelate with a calcium ion is particularly preferable, and ethylenediaminetetraacetic acid is most preferable.
  • the time for contacting the pluripotent stem cells cultured on the substrate with the intercellular binding dissociator containing a chelating agent is, if the intercellular binding dissociator does not contain trypsin, undifferentiated pluripotent stem cells Only from 1 second to 30 minutes, more preferably from 30 seconds to 20 minutes, particularly preferably from 1 minute to 10 minutes, and from 2 minutes to 10 minutes. Most preferred.
  • an external stress is applied to selectively detach undifferentiated pluripotent stem cells.
  • the undifferentiation rate of the cells contained in the cell suspension can be increased by applying an external stress that selectively detaches the undifferentiated pluripotent stem cells. Further, since it is suitable for increasing the mass productivity of the cell suspension, it is preferable that the external stress does not act on a specific region of the culture environment, but acts uniformly on the entire culture environment.
  • the step of applying the external stress is not particularly limited, but includes a step of causing convection in the culture solution, a step of applying vibration to the substrate, and a step of applying pressure to the back surface of the culture surface, wherein the substrate is a porous substrate. Or a combination of a plurality of these.
  • the adhesive strength of the cells to the substrate varies depending on the substrate used, so the optimal flow rate or flow rate varies depending on the type of the substrate.
  • the flow rate is preferably 0.1 to 10 mL / s, more preferably 0.2 to 8 mL / s, particularly preferably 0.4 to 6 mL / s, and most preferably 0.6 to 4 mL / s.
  • an optimal flow rate is obtained by preparing a cell suspension under a plurality of flow rate or flow rate conditions and comparing the undifferentiation rate of cells contained in the cell suspension. Can be determined.
  • the cells on the culture substrate can be observed by a phase contrast microscope before and after the step (2), and the conditions under which undifferentiated pluripotent stem cells can be selectively detached from the substrate can be selected.
  • the method for generating convection in the culture solution is not particularly limited.For example, a method in which forced convection is generated inside the culture solution by pipetting the culture solution or using a pump or a stirring blade. Can be mentioned.
  • pipetting refers to an operation of generating convection in a culture environment by repeating suction and discharge of a culture solution using an instrument such as a pipetteman.
  • the vibration that the undifferentiated pluripotent stem cells selectively peel off depends on the type of the substrate.
  • the substrate is a non-porous substrate of polystyrene
  • it is preferably 50 to 100 dB, more preferably 50 to 90 dB, particularly preferably 50 to 80 dB, and most preferably 50 to 70 dB.
  • the optimum vibration can be determined by preparing the cell suspension under a plurality of vibration conditions as in the case of the flow rate described above.
  • the cells on the culture substrate can be observed by a phase contrast microscope before and after the step (2), and the conditions under which undifferentiated pluripotent stem cells can be selectively detached from the substrate can be selected.
  • the method of applying vibration to the substrate is not particularly limited, and examples thereof include tapping, a method of bringing a vibration generator such as a standing wave generator into contact with the substrate, and a method of applying ultrasonic waves to the substrate.
  • tapping refers to an operation of vibrating the culture environment by hitting the culture vessel or the like.
  • the pressure of the substrate Depending on the type, when the substrate is a porous substrate of polyethylene terephthalate, it is preferably 0.001 to 1 MPa, more preferably 0.005 to 0.5 MPa, particularly preferably 0.01 to 0.2 MPa. 0.02 to 0.1 MPa is most preferable.
  • the optimal pressure can be determined by preparing the cell suspension under a plurality of pressure conditions, as in the case of the flow rate described above. .
  • the cells on the culture substrate can be observed by a phase contrast microscope before and after the step (2), and the conditions under which undifferentiated pluripotent stem cells can be selectively detached from the substrate can be selected.
  • the method of applying pressure to the back surface of the culture surface is not particularly limited, and examples thereof include a method of applying pressure to the surface opposite to the surface on which the pluripotent stem cells exist by a pump or the like.
  • the culture substrate has a temperature response, and the substrate is cooled at a temperature and for a time at which undifferentiated pluripotent stem cells are selectively detached.
  • the cooling temperature and cooling time at which the undifferentiated pluripotent stem cells selectively peel off vary depending on the type of the substrate, but the layer thickness x
  • the cell suspension was performed under a plurality of cooling conditions as in the case of the flow rate described above.
  • the optimal cooling temperature and cooling time can be determined.
  • the cells on the culture substrate can be observed by a phase contrast microscope before and after the step (2), and the conditions under which undifferentiated pluripotent stem cells can be selectively detached from the substrate can be selected. The longer the cell is released from the substrate, the longer the cell is cooled at a lower temperature for a longer period of time.
  • the “layer thickness” of the layer made of the temperature-responsive polymer refers to the length of the layer made of the temperature-responsive polymer from the interface closest to the substrate to the interface closest to the surface in the direction outside the substrate surface.
  • a cross-sectional image is measured by a transmission electron microscope using an ultra-thin section of a culture substrate prepared by a microtome, and the distance of 10 points selected at random is measured. , Can be calculated by averaging.
  • the layer thickness is in the range of 10 nm or less, it can be measured using an ellipsometer.
  • the “content ratio of the temperature-responsive component” indicates the weight ratio of the temperature-responsive monomer unit contained in the temperature-responsive polymer.
  • the optimum conditions of the step [c] vary depending on not only the type of the base material used but also the conditions of the step [a].
  • the time for contacting the cell-binding dissociation solution containing trypsin in step [a] is 1
  • the contacting time of the cell-binding dissociation solution containing only the chelating agent for 2 minutes to 4 minutes is preferably 2 minutes to 10 minutes.
  • the substrate having temperature responsiveness examples include a substrate having on its surface a layer made of a temperature-responsive polymer having a response temperature in the range of 0 ° C. to 50 ° C.
  • the LCST is preferably in the range of 0 ° C. to 50 ° C., more preferably 5 ° C. to 35 ° C., particularly preferably 10 ° C. to 25 ° C., and particularly preferably 15 ° C. to 25 ° C., because it is suitable for increasing the survival rate. Is most preferred.
  • the monomer unit constituting the temperature-responsive polymer is not particularly limited, and examples thereof include (meth) acrylamide compounds such as acrylamide and methacrylamide; N, N-diethylacrylamide, N-ethylacrylamide, Nn -Propylacrylamide, Nn-propylmethacrylamide, N-isopropylacrylamide, N-isopropylmethacrylamide, N-cyclopropylacrylamide, N-cyclopropylmethacrylamide, N-ethoxyethylacrylamide, N-ethoxyethylmethacrylamide, N N-alkyl-substituted (meth) acrylamide derivatives such as -tetrahydrofurfurylacrylamide and N-tetrahydrofurfuryl methacrylamide; N, N-dimethyl (meth) acrylamide, N, N-ethylmethyl N, N-dialkyl-substituted (meth) acrylamide derivatives such as
  • the product of the layer thickness of the layer made of the temperature-responsive polymer and the content ratio of the temperature-responsive component is 5 nm or more because it is suitable for peeling and recovering many undifferentiated pluripotent stem cells from the substrate. Is preferably 10 nm or more, more preferably 20 nm or more, and most preferably 30 nm or more. Moreover, since only the undifferentiated pluripotent stem cells are selectively detached, and the differentiated cells are not detached and are left on the substrate, which is suitable for increasing the purity of the cell suspension, the thickness is preferably 1,000 nm or less, The thickness is more preferably 100 nm or less, particularly preferably 50 nm or less, and most preferably 25 nm or less.
  • the structure of the copolymer is suitable for controlling the response temperature of the temperature-responsive polymer, the structure of the copolymer is preferably a block copolymer.
  • the monomer unit of the water-insoluble polymer is not particularly limited, and examples thereof include styrene, 2-hydroxyphenyl acrylate, 2-hydroxyphenyl methacrylate, 3-hydroxyphenyl acrylate, 3-hydroxyphenyl methacrylate, Hydroxyphenyl acrylate, 4-hydroxyphenyl methacrylate, N- (2-hydroxyphenyl) acrylamide, N- (2-hydroxyphenyl) methacrylamide, N- (3-hydroxyphenyl) acrylamide, N- (3-hydroxyphenyl) methacryl Amide, N- (4-hydroxyphenyl) acrylamide, N- (4-hydroxyphenyl) methacrylamide, n-butyl acrylate, n-butyl methacrylate, isobutyl acrylate, isobutyl Tacrylate, t-butyl acrylate, t-butyl methacrylate, n-hexyl acrylate, n-hexyl methacrylate, n-o
  • the content ratio of the temperature-responsive component in the copolymer is preferably 50 wt% or more, more preferably 70 wt% or more, and more preferably 80 wt%, since it is suitable for selectively exfoliating undifferentiated pluripotent stem cells.
  • the above is particularly preferable, and 90 wt% or more is most preferable.
  • the structural unit ratio of the temperature-responsive polymer is preferably 95% by weight or less, more preferably 90% by weight or less. , 85 wt% or less, and most preferably, 80 wt% or less.
  • the molecular weight of the temperature-responsive polymer is not particularly limited, but is preferably from 1,000 to 1,000,000 in terms of number average molecular weight, because it is suitable for increasing the strength of the layer made of the temperature-responsive polymer. More preferably, it is from 500,000 to 500,000, particularly preferably from 5,000 to 300,000, most preferably from 10,000 to 200,000.
  • a method of forming a layer made of a temperature-responsive polymer on the surface of a substrate (1) a method of coating a substrate with a temperature-responsive polymer by chemical bonding to form a layer, and (2) The method of coating and forming a layer by physical interaction can be performed alone or in combination. That is, (1) UV irradiation, electron beam irradiation, gamma ray irradiation, plasma treatment, corona treatment, or the like can be used as a method by chemical bonding. Furthermore, when the temperature-responsive polymer and the base material have appropriate reactive functional groups, generally used organic reactions such as a radical reaction, an anion reaction, and a cation reaction can be used.
  • a matrix having good compatibility with a temperature-responsive polymer and good coatability as a medium, coating, brushing, dip coating, spin coating, bar coding,
  • Various commonly known methods such as flow coating, spray coating, roll coating, air knife coating, blade coating, gravure coating, microgravure coating, and slot die coating can be used.
  • the shape of the substrate is not particularly limited, and may be a planar shape such as a plate or a film, or may be a fiber, a porous particle, a porous membrane, or a hollow fiber. Further, a container (cell culture dish such as a Petri dish, a flask, a plate, or the like) generally used for cell culture or the like may be used. From the viewpoint of easiness of the culturing operation, a porous membrane having a planar shape such as a plate or a film or a flat membrane is preferable.
  • the substrate is a porous substrate because it is suitable for enhancing the detachability of pluripotent stem cells, and the pore size of the porous substrate is smaller than that of the pluripotent stem cells to be cultured. Is preferred.
  • the substrate is a porous substrate, the releasability of pluripotent stem cells can be enhanced.
  • the pore size of the porous substrate is smaller than that of the pluripotent stem cells, the pluripotent stem cell adhesiveness and proliferation can be enhanced.
  • nutrients can be easily distributed to the cells during culture, and the undifferentiated maintenance rate of pluripotent stem cells in subculture can be increased.
  • the pore size is more preferably 8 ⁇ m or less, particularly preferably 3 ⁇ m or less, and most preferably 1 ⁇ m or less.
  • the pore diameter is preferably 0.01 ⁇ m or more, more preferably 0.05 ⁇ m or more, and more preferably 0.1 ⁇ m or more, since it is suitable for enhancing the detachability of pluripotent stem cells. Is particularly preferred, and most preferably 0.2 ⁇ m or more.
  • the “pore diameter” of the porous substrate in the present invention refers to the average value of the diameter of the pores of the porous substrate along the in-plane direction of the porous substrate, It can be calculated by measuring the diameter of 20 or more pores in a laser microscope image, a scanning electron microscope image, or a transmission electron microscope image, and calculating an average value.
  • the pore density of the pores of the porous substrate is preferably from 10 to 10 10 cells / cm 2 , since it is suitable for enhancing the proliferation and detachability of pluripotent stem cells.
  • 10 3 to 10 9 / cm 2 is more preferable, and particularly preferably from 10 5 to 10 9 / cm 2, and most preferably 10 5 to 10 7 / cm 2.
  • the pore density of the pores of the porous substrate is 10 7 / cm 2 or less. It is preferable that the number is not more than 10 6 / cm 2 , more preferably not more than 10 5 / cm 2 , and most preferably not more than 10 4 / cm 2 .
  • the “pore density” of the pores of the porous substrate refers to the number of pores present per substrate area of the porous substrate, and the laser microscopic image or scanning of the porous substrate.
  • the number of pores can be calculated by calculating the number of pores in a square region having a side length of 200 times or more the pore diameter of the pores of the porous substrate.
  • the “substrate area” of the porous substrate refers to the surface area of one main surface of the porous substrate assuming that the porous substrate has no pores.
  • the porosity of the porous substrate is preferably from 0.01 to 30%, more preferably from 0.01 to 20%, since the porosity is suitable for enhancing the detachability of pluripotent stem cells. , 0.01 to 5%, particularly preferably 0.01 to 1.5%.
  • the “porosity” of the porous substrate is a value obtained by dividing the total area of the pore portions by the substrate area with respect to one principal surface of the porous substrate, and is based on the area ratio. Indicate how much voids are present on the material surface, and in a laser microscope image, a scanning electron microscope image, and a transmission electron microscope image of the porous substrate, the pore size of the pores of the porous substrate is 200 times or more. It can be measured by observing a square area whose length is one side.
  • the porosity is preferably 10% or less, more preferably 7% or less, particularly preferably 4% or less, since it is suitable for enabling observation of pluripotent stem cells with a phase contrast microscope. % Is most preferred.
  • the porosity is preferably 0.1% or more, since the porosity is suitable for promptly permeating the components contained in the medium and distributing nutrients to the cells uniformly. Is more preferably 1% or more, particularly preferably 5% or more, and most preferably 10% or more.
  • the cell suspension produced by the method for producing a cell suspension of the present invention is suitable for use in culturing undifferentiated stem cells for undifferentiated maintenance or for producing spheroids for inducing differentiation.
  • the undifferentiation rate of the cells contained in the liquid is preferably 70% or more, more preferably 80% or more, particularly preferably 90% or more, and most preferably 95% or more.
  • the undifferentiation rate can be measured with a flow cytometer after staining the undifferentiated marker.
  • the cell recovery rate of the cell suspension produced by the cell suspension production method of the present invention is preferably 20% or more, and more preferably 40% or more, since it is suitable for enhancing the mass productivity of the cell suspension. Is more preferably 60% or more, and most preferably 80% or more.
  • the cell recovery rate indicates the ratio of cells detached in step (2) of the present invention / total cells cultured.
  • ⁇ Polymer composition Proton nuclear magnetic resonance spectroscopy ( 1 H-NMR) spectrum analysis using a nuclear magnetic resonance measuring device (trade name: JNM-GSX400, manufactured by JEOL Ltd.) or a nuclear magnetic resonance measuring device (manufactured by Bruker Japan, Inc.) It was obtained from carbon nuclear magnetic resonance spectroscopy ( 13 C-NMR) spectrum analysis using trade name AVANCE III HD500).
  • ⁇ Molecular weight and molecular weight distribution of polymer The weight average molecular weight (Mw), number average molecular weight (Mn) and molecular weight distribution (Mw / Mn) were measured by gel permeation chromatography (GPC).
  • the GPC apparatus uses HLC-8320GPC manufactured by Tosoh Corporation, the column uses two TSKgel Super AWM-H manufactured by Tosoh Corporation, the column temperature is set to 40 ° C., and the eluent contains 10 mM sodium trifluoroacetate.
  • the measurement was performed using N, N-dimethylformamide containing 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-isopropanol or 10 mM lithium bromide.
  • the measurement sample was prepared at 1.0 mg / mL and measured.
  • polymethyl methacrylate of a known molecular weight manufactured by Polymer Laboratories
  • Example 1 As a substrate, a polystyrene dish (manufactured by Corning Incorporated) having a layer formed of a temperature-responsive polymer was used, and human iPS cells 201B7 were seeded at a density of 1300 cells / cm 2 at 37 ° C. and a CO 2 concentration of 5 %. As a medium, StemFitAK02N (manufactured by Ajinomoto Co., Inc.) was added at 0.2 mL / cm 2 .
  • Y-27632 manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • iMatrix-511 solution manufactured by Nippi Corporation
  • a cell-bound dissociation solution obtained by adding ethylenediaminetetraacetic acid to phosphate-buffered saline at a concentration of 5 ⁇ 10 ⁇ 3 mol / L is placed in a dish. And treated at 25 ° C. for 2 minutes. After removing the intercellular binding dissociation solution and adding a medium containing Y-27632 to the dish, the cells were separated by cooling at 15 ° C. for 10 minutes. It was observed that the undifferentiated cells were selectively detached, and could be recovered as a cell suspension.
  • the synthesis and coating of the temperature-responsive polymer were performed by the following methods.
  • reaction solvent was diluted with acetone, poured into hexane (500 mL), and the precipitated pale yellow solid was recovered and dried under reduced pressure to obtain a copolymer of N-isopropylacrylamide and n-butyl methacrylate.
  • the temperature-responsive polymer had a response temperature of 32 ° C., a constitutional unit ratio of 4 wt% of n-butyl methacrylate, 96 wt% of N-isopropylacrylamide, and a molecular weight of Mn 70,000.
  • the thickness of the coating of the temperature-responsive polymer on the polystyrene dish was 30 nm.
  • Example 2 In Example 1, the washing with phosphate buffered saline and the operation of adding the intercellular binding dissociation solution into the dish were not performed, and after cooling at 15 ° C. for 10 minutes, the substrate was tapped 20 times and vibrated. , And a cell suspension was prepared in the same manner as in Example 1 except for the above.
  • Undifferentiated cells were selectively detached and recovered as a cell suspension.
  • Example 3 Using a polystyrene dish (manufactured by Corning Incorporated) in which a layer made of a temperature-responsive polymer was not formed as the base material, the operation of cooling at 15 ° C. for 10 minutes was not performed, and the flow rate was changed to about 1.2 mL / s. Convection was given by performing pipetting operation 20 times, and the rest was prepared in the same manner as in Example 1 to prepare a cell suspension. Undifferentiated cells were selectively detached and recovered as a cell suspension.
  • Example 4 Co-culture of human iPS cell 201B7 strain and human iPS cell 201B7 strain-derived mesoderm cells as differentiated cells using a polystyrene dish (manufactured by Corning Incorporated) in which a layer made of a temperature-responsive polymer is not formed as a base material is described below. Was performed in the manner described above.
  • the human iPS cell 201B7 strain was seeded at a density of 260 cells / cm 2 , and cultured at 37 ° C. in a CO 2 concentration of 5% environment for 4 days.
  • As a medium StemFitAK02N (manufactured by Ajinomoto Co., Inc.) was added at 0.2 mL / cm 2 .
  • Y-27632 manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • iMatrix-511 solution manufactured by Nippi Corporation
  • a cell-binding dissociation solution obtained by adding 0.5 ⁇ TrypLE SELECT and ethylenediaminetetraacetic acid to a phosphate buffered saline at a concentration of 5 ⁇ 10 ⁇ 3 mol / L was added to the dish. Treated at 25 ° C. for 2 minutes. After removing the intercellular binding dissociation solution, a medium at 15 ° C. to which Y-27632 was added was added to the dish, and the dish was cooled at room temperature for 5 minutes. Then, pipetting was performed 20 times at a flow rate of about 1.2 mL / s. By doing so, convection was given, the cells were detached, and the cell suspension was recovered.
  • the ratio of “the number of cells contained in the cell suspension / the total number of cultured cells” was determined as the cell recovery rate.
  • the total number of cultured cells indicates the sum of the number of cells contained in the cell suspension and the number of cells detached with a cell scraper.
  • Example 5 Using a substrate coated with the same temperature-responsive polymer as in Example 1 by the following method, co-culture of human iPS cell 201B7 and mesodermal cells and preparation of a cell suspension were performed as in Example 4. Was.
  • a 0.2 wt% ethanol solution of a copolymer of N-isopropylacrylamide and n-butyl methacrylate was spin-coated on a polystyrene dish (manufactured by Corning Incorporated) at 2000 rpm to coat a temperature-responsive polymer.
  • Example 6 Using a substrate coated with the same temperature-responsive polymer as in Example 1 by the following method, co-culture of human iPS cell 201B7 and mesodermal cells and preparation of a cell suspension were performed as in Example 4. Was.
  • a 0.4 wt% ethanol solution of a copolymer of N-isopropylacrylamide and n-butyl methacrylate was spin-coated at 2,000 rpm on a polystyrene dish (manufactured by Corning Incorporated) to coat a temperature-responsive polymer.
  • Example 7 Co-culture of human iPS cell 201B7 strain and mesoderm cells and preparation of a cell suspension were performed in the same manner as in Example 4 using the same base material as in Example 1.
  • Example 8 Using a substrate coated with the same temperature-responsive polymer as in Example 1 by the following method, co-culture of human iPS cell 201B7 and mesoderm cells and preparation of a cell suspension were performed as in Example 4. Was.
  • a 0.8 wt% ethanol solution of a copolymer of N-isopropylacrylamide and n-butyl methacrylate was spin-coated on a polystyrene dish (manufactured by Corning Incorporated) at 2000 rpm to coat a temperature-responsive polymer.
  • Example 9 Co-culture of human iPS cell 201B7 and mesoderm cells and preparation of a cell suspension were performed in the same manner as in Example 7 except for using the following temperature-responsive polymer.
  • Example 10 Co-culture of human iPS cell 201B7 and mesoderm cells and preparation of a cell suspension were performed in the same manner as in Example 7 except for using the following temperature-responsive polymer.
  • Example 11 Co-culture of human iPS cell 201B7 and mesoderm cells and preparation of a cell suspension were performed in the same manner as in Example 7 except for using the following temperature-responsive polymer.
  • Example 12 Co-culture of human iPS cell line 201B7 and mesodermal cells was performed in the same manner as in Example 4. After the cultivation, the medium was not removed and cooled at room temperature for 15 minutes, followed by pipetting 20 times to prepare a cell suspension. All the cells that were not detached were scraped by rubbing the substrate surface with a cell scraper, and the cell recovery rate was determined.
  • Example 13 Co-culture of the human iPS cell 201B7 strain and mesodermal cells was performed in the same manner as in Example 7. After the culture, the cells were cooled at room temperature for 15 minutes without removing the medium or treating with the intercellular binding dissociation solution, and pipetting was performed 20 times to prepare a cell suspension. Further, the cell recovery rate was determined in the same manner as in Example 4.
  • Example 14 Co-culture of human iPS cell line 201B7 and mesodermal cells was performed in the same manner as in Example 9. After the culture, the cells were cooled at room temperature for 15 minutes without removing the medium or treating with the intercellular binding dissociation solution, and pipetting was performed 20 times to prepare a cell suspension. Further, the cell recovery rate was determined in the same manner as in Example 4.
  • Example 15 Co-culture of human iPS cell 201B7 strain and mesodermal cells was performed in the same manner as in Example 10. After the culture, the cells were cooled at room temperature for 15 minutes without removing the medium or treating with the intercellular binding dissociation solution, and pipetting was performed 20 times to prepare a cell suspension. Further, the cell recovery rate was determined in the same manner as in Example 4.
  • Example 16 Co-culture of human iPS cell 201B7 strain and mesodermal cells was performed in the same manner as in Example 11. After the culture, the cells were cooled at room temperature for 15 minutes without removing the medium or treating with the intercellular binding dissociation solution, and pipetting was performed 20 times to prepare a cell suspension. Further, the cell recovery rate was determined in the same manner as in Example 4.
  • Example 2 In Example 1, cooling was not performed at 15 ° C. for 10 minutes, and the other conditions were the same as in Example 1. The cells did not detach and no cell suspension was obtained.
  • Example 3 In Example 2, the same operation as in Example 2 was performed, except that the operation of cooling at 15 ° C. for 10 minutes and hitting the base material 20 times to apply vibration was not performed. The cells did not detach and no cell suspension was obtained.
  • Example 4 In Example 3, the pipetting operation was performed 20 times to obtain a flow rate of about 1.2 mL / s, and the operation of giving convection was not performed.
  • the undifferentiation rate of the recovered cells was measured by a flow cytometer, and as a result, the undifferentiation rate was 82.2%, indicating that a large amount of differentiated cells was contained.

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Abstract

顕微鏡による細胞の識別作業が不要であり、量産性に優れ、高純度の多能性幹細胞の懸濁液を製造可能な、細胞懸濁液の製造方法を提供する。　以下の（１）～（２）の工程を経ることを特徴とする、未分化の多能性幹細胞を含む細胞懸濁液の製造方法。 （１）液体培地中で多能性幹細胞を培養基材に接着させ、培養する工程。 （２）下記［ａ］～［ｃ］の複数の組合せからなる工程、又は下記［ｃ］工程によって、分化細胞の少なくとも一部を基材に接着させたまま、（１）工程で培養した未分化の多能性幹細胞を基材から剥離する工程。　［ａ］多能性幹細胞に細胞間結合乖離液を接触させ、細胞間結合を乖離させる工程。　［ｂ］未分化の多能性幹細胞が選択的に剥離する外部応力を加える工程。　［ｃ］培養基材が温度応答性を有するものであり、未分化の多能性幹細胞が選択的に剥離する温度及び時間で基材を冷却する工程。

Description

細胞懸濁液の製造方法
　本発明は、顕微鏡による細胞の識別作業が不要であり、量産性に優れ、高純度の多能性幹細胞の懸濁液を製造可能な、細胞懸濁液の製造方法に関するものである。
　胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）などの多能性幹細胞は、生体の様々な組織に分化する能力（分化万能性）を持つ細胞であり、再生医療分野における細胞ソースとして、大きな注目が寄せられている。多能性幹細胞を再生医療に応用するには、まず必要な数の多能性幹細胞を未分化状態で増殖させた後に、多能性幹細胞を液体に懸濁させた細胞懸濁液として回収することが必須である。
　従来、高純度の多能性幹細胞の細胞懸濁液を作製する際には、次のような工程が必要であった。まず、分化した細胞（純度の低い細胞）を取り除くために、顕微鏡で観察して細胞を識別し、分化した細胞が存在する領域に印を付け、印を付けた領域をセルスクレーパーと呼ばれる棒状の器具を使用して擦ることにより、分化した細胞のみを基材から剥離させ、取り除く。次に、セルスクレーパーで基材全体を擦ることにより、基材上の全ての細胞を剥離させ、回収する。しかしながら、このような従来の多能性幹細胞の細胞懸濁液の作製方法では、基材上の一部の領域から手作業で分化した細胞を取り除くため、分化した細胞の除去に多大な時間を要し、量産性に乏しいという問題があった。また、分化した細胞を除去する際、除外する必要のない未分化の細胞までもが除外されるか、細胞を傷つける原因となっていた。さらには、未分化の細胞を回収する際にも、基材全体をセルスクレーパーで擦る必要があることから、大面積の基材を用いて大量の細胞懸濁液を作製するのは困難であった。
　分化した細胞を選択的に除去する別の方法として、特許文献１では、培養容器の外部から高周波振動を加えることにより、培養容器内部の接着面から領域選択的に細胞を剥離させる方法が開示されている。しかしながら、特許文献１の方法では、一部の領域から選択的に細胞を剥離させるものであり、顕微鏡で細胞を観察して識別する作業が必要であり、細胞懸濁液の量産性を高めるものではない。
国際公開第２０１４／０１７４８１号
　本発明の目的は、顕微鏡による細胞の識別作業が不要であり、量産性に優れ、高純度の多能性幹細胞の懸濁液を製造可能な、細胞懸濁液の製造方法を提供することにある。
　本発明者らは、以上の点を鑑み、鋭意研究を重ねた結果、分化した細胞を取り除くことなく、未分化の細胞のみを選択的に剥離させる工程を有する細胞懸濁液の製造方法が上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち本発明は、以下の［１］乃至［７］に存する。
［１］以下の（１）～（２）の工程を経ることを特徴とする、未分化の多能性幹細胞を含む細胞懸濁液の製造方法。
（１）液体培地中で多能性幹細胞を培養基材に接着させ、培養する工程。
（２）下記［ａ］～［ｃ］の複数の組合せからなる工程又は下記［ｃ］工程によって、分化細胞の少なくとも一部を基材に接着させたまま、（１）工程で培養した未分化の多能性幹細胞を基材から剥離する工程。
　［ａ］多能性幹細胞に細胞間結合乖離液を接触させ、細胞間結合を乖離させる工程。
　［ｂ］未分化の多能性幹細胞が選択的に剥離する外部応力を加える工程。
　［ｃ］培養基材が温度応答性を有するものであり、未分化の多能性幹細胞が選択的に剥離する温度及び時間で基材を冷却する工程。
　ここで、未分化の多能性幹細胞が選択的に剥離する［ｂ］工程の外部応力及び［ｃ］工程の温度及び時間は、複数の剥離条件で（２）工程を行い、製造された細胞懸濁液に含まれる細胞の未分化率をフローサイトメーターにより測定し、未分化率が最も高い条件を選択するか、又は培養基材上の細胞を位相差顕微鏡により（２）工程の前後で観察し、未分化の多能性幹細胞が選択的に基材から剥離する条件を選択することにより決定される。
［２］　前記［ａ］工程が、キレート剤を含有する細胞間結合乖離液を１秒～３０分間接触させる工程、又はトリプシンを含有する細胞間結合乖離液を１秒～１０分間接触させる工程であることを特徴とする、［１］に記載の細胞懸濁液の製造方法。
［３］　前記［ｂ］工程が、０．１～１０ｍＬ／ｓの流量で対流を与える工程であることを特徴とする、［１］又は［２］に記載の細胞懸濁液の製造方法。
［４］　前記［ｃ］工程が、０～３０℃の温度で１秒～６０分間冷却する工程であることを特徴とする、［１］～［３］のいずれかに記載の細胞懸濁液の製造方法。
［５］　前記［ｃ］工程の培養基材が、層厚×温度応答性成分の含有割合の積が５～１００ｎｍである高分子による層を有することを特徴とする、［１］～［４］のいずれかに記載の細胞懸濁液の製造方法。
［６］　前記［ｃ］工程の培養基材が、温度応答性成分の含有割有が７５ｗｔ％以上であるブロック共重合体であることを特徴とする、［１］～［５］のいずれかに記載の細胞懸濁液の製造方法。
［７］　前記［ｂ］及び［ｃ］工程において、多能性幹細胞を液体培地存在下で剥離することを特徴とする、［１］～［６］のいずれかに記載の細胞懸濁液の製造方法。
　本発明によって、顕微鏡による細胞の選別作業が不要であり、量産性に優れ、高純度の多能性幹細胞の懸濁液を製造可能な、細胞懸濁液の製造方法を提供することができる。
　以下、本発明を実施するための形態（以下、単に「本実施の形態」という。）について詳細に説明する。以下の本実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明を以下の内容に限定する趣旨ではない。本発明は、その趣旨の範囲内で適宜に変形して実施できる。
　本明細書において、「温度応答性高分子」とは、温度変化によって親水性／疎水性の程度が変化する高分子を示す。また、水分子の存在下で高分子の温度を低温から高温へ昇温していく場合に、ある温度を境に高分子の親水性／疎水性の程度がより疎水性に変化し、水溶性から水不溶性に変化する温度応答性高分子が存在し、この境界温度を「下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ；Ｌｏｗｅｒ　Ｃｒｉｔｉｃａｌ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ　Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）」という。一般に、温度応答性高分子がＬＣＳＴ未満の温度において水に溶解する場合、ＬＣＳＴ以上の温度では水に不溶となる。温度応答性高分子が水不溶性である場合には、ＬＣＳＴを有しないが、温度変化によって親水性／疎水性の程度が変化する応答温度を有する。
　また、本明細書において、細胞懸濁液に含まれる細胞の「未分化率」とは、細胞懸濁液に含まれる細胞の内、どの程度の細胞が未分化の多能性幹細胞であるかの割合を示す。未分化率が高い場合、細胞懸濁液に含まれる多能性幹細胞の純度が高いことを意味し、好ましいものである。なお、細胞懸濁液の未分化率は、細胞懸濁液に含まれる細胞の未分化マーカーを蛍光染色し、染色された細胞の割合をフローサイトメーターにより算出することで求めることができる。
　本発明において、多能性幹細胞の種類は特に限定されるものではないが、例えば、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、核移植ＥＳ細胞（ｎｔＥＳ細胞）を用いることができ、特に好ましくはｉＰＳ細胞である。また、多能性幹細胞の由来動物は特に限定されるものではないが、例えば、哺乳動物由来であることができる。哺乳動物の例には、げっ歯類（マウス、ラット等）、霊長類（サル、ヒト等）が含まれ、また実験動物であってもよく、コンパニオンアニマルであってもよい。本発明において、好ましくは霊長類由来であり、特に好ましくはヒト由来である。
　本発明において「分化細胞」とは、多能性幹細胞が分化することで多能性幹細胞以外の細胞へと変化した細胞を示す。
　本発明の細胞懸濁液の製造方法は、以下の（１）～（２）の工程を経ることを特徴とする、未分化の多能性幹細胞を含む細胞懸濁液の製造方法。
（１）液体培地中で多能性幹細胞を培養基材に接着させ、培養する工程。
（２）下記［ａ］～［ｃ］の複数の組合せからなる工程又は下記［ｃ］工程によって、分化細胞の少なくとも一部を基材に接着させたまま、（１）工程で培養した未分化の多能性幹細胞を基材から剥離する工程。
　［ａ］多能性幹細胞に細胞間結合乖離液を接触させ、細胞間結合を乖離させる工程。
　［ｂ］未分化の多能性幹細胞が選択的に剥離する外部応力を加える工程。
　［ｃ］培養基材が温度応答性を有するものであり、未分化の多能性幹細胞が選択的に剥離する温度及び時間で基材を冷却する工程。
　ここで、未分化の多能性幹細胞が選択的に剥離する［ｂ］工程の外部応力及び［ｃ］工程の温度及び時間は、複数の剥離条件で（２）工程を行い、製造された細胞懸濁液に含まれる細胞の未分化率をフローサイトメーターにより測定し、未分化率が最も高い条件を選択するか、又は培養基材上の細胞を位相差顕微鏡により（２）工程の前後で観察し、未分化の多能性幹細胞が選択的に基材から剥離する条件を選択することにより決定される。
　本発明の（１）工程では、液体培地中で多能性幹細胞を培養基材に接着させ、培養する。多能性幹細胞を培養基材上で培養する方法としては、特に限定はないが、フィーダーフリー培養が好ましい。フィーダーフリーで培養を行う際、未分化性を維持させるのに有効な条件で培養することが好ましく、例えば、適切な液体培地の存在下で培養を行うことなどが挙げられる。多能性幹細胞の未分化性を維持させるのに有効な培地としては、例えば、多能性幹細胞の未分化性を維持するための因子として知られている、インスリン、トランスフェリン、セレニウム、アスコルビン酸、炭酸水素ナトリウム、塩基性線維芽細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）、ＣＣＬ２、アクチビン、２－メルカプトメタノールのうち１つ以上を添加した培地を好適に用いることができる。多能性幹細胞の未分化性を維持するのに特に好適であることから、インスリン、トランスフェリン、セレニウム、アスコルビン酸、炭酸水素ナトリウム、塩基性線維芽細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）を含有する培地を用いることがさらに好ましく、塩基性線維芽細胞増殖因子を添加した培地を用いることが最も好ましい。
　前記塩基性線維芽細胞増殖因子を添加した培地の種類に特に制限はないが、例えば、市販品としては、ＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｏ．　ＬＬＣ製）、Ｈａｍ’ｓ　Ｆ１２（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｏ．　ＬＬＣ製）、Ｄ－ＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ　Ｆ１２（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｏ．　ＬＬＣ製）、Ｐｒｉｍａｔｅ　ＥＳ　Ｃｅｌｌ　Ｍｅｄｉｕｍ（（株）ＲＥＰＲＯＣＥＬＬ製）、ＳｔｅｍＦｉｔ　ＡＫ０２Ｎ（味の素（株）製）、ＳｔｅｍＦｉｔ　ＡＫ０３（味の素（株）製）、ｍＴｅＳＲ１（ＳＴＥＭＣＥＬＬ　ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ製）、ＴｅＳＲ－Ｅ８（ＳＴＥＭＣＥＬＬ　ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ製）、ＲｅｐｒｏＮａｉｖｅ（（株）ＲＥＰＲＯＣＥＬＬ製）、ＲｅｐｒｏＸＦ（（株）ＲＥＰＲＯＣＥＬＬ製）、ＲｅｐｒｏＦＦ（（株）ＲＥＰＲＯＣＥＬＬ製）、ＲｅｐｒｏＦＦ２（（株）ＲＥＰＲＯＣＥＬＬ製）、ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ（バイオロジカルインタストリーズ社製）、ｉＳＴＥＭ（タカラバイオ（株）製）、ＧＳ２－Ｍ（タカラバイオ（株）製）、ｈＰＳＣ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｍｅｄｉｕｍ　ＤＸＦ（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ（株）製）等を挙げることができる。多能性幹細胞の未分化状態を維持するのに好適であることから、Ｐｒｉｍａｔｅ　ＥＳ　Ｃｅｌｌ　Ｍｅｄｉｕｍ（（株）ＲＥＰＲＯＣＥＬＬ製）、ＳｔｅｍＦｉｔ　ＡＫ０２Ｎ（味の素（株）製）又はＳｔｅｍＦｉｔ　ＡＫ０３（味の素（株）製）が好ましく、ＳｔｅｍＦｉｔ　ＡＫ０２Ｎ（味の素（株）製）又はＳｔｅｍＦｉｔ　ＡＫ０３（味の素（株）製）がさらに好ましく、ＳｔｅｍＦｉｔ　ＡＫ０２Ｎ（味の素（株）製）が特に好ましい。
　前記（１）工程で用いる培地としてはまた、多能性幹細胞の生存を維持するのに好適であることから、前記塩基性線維芽細胞増殖因子を添加した培地にさらにＲｈｏ結合キナーゼ阻害剤を添加した培地を用いることが好ましい。特にヒトの多能性幹細胞を用いる場合であって、ヒトの多能性幹細胞の細胞密度が低い状態において、Ｒｈｏ結合キナーゼ阻害剤が添加されていると、ヒトの多能性幹細胞の生存維持に効果的な場合がある。Ｒｈｏ結合キナーゼ阻害剤としては、例えば、（Ｒ）－（＋）－ｔｒａｎｓ－Ｎ－（４－ｐｙｒｉｄｙｌ）－４－（１－ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）－ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ・２ＨＣｌ・Ｈ２Ｏ（和光純薬工業（株）製Ｙ－２７６３２）、１－（５－Ｉｓｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ）ｈｏｍｏｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ　Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（和光純薬工業（株）製ＨＡ１０７７）を用いることができる。培地に添加されるＲｈｏ結合キナーゼ阻害剤の濃度としては、ヒトの多能性幹細胞の生存維持に有効な範囲であってヒトの多能性幹細胞の未分化状態に影響を与えない範囲であり、好ましくは１μＭ～５０μＭであり、より好ましくは３μＭ～２０μＭであり、さらに好ましくは５μＭ～１５μＭであり、最も好ましくは８μＭ～１２μＭである。
　前記（１）工程で多能性幹細胞を基材上で培養する際の、多能性幹細胞の播種方法に特に制限はないが、例えば、前記基材に細胞懸濁液を注入することで行うことが出来る。播種の際の細胞密度は特に制限はないが、細胞を維持することができ、かつ増殖させることができるように、１．０×１０２～１．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２が好ましく、５．０×１０２～５．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２がさらに好ましく、１．０×１０３～２．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２が特に好ましく、１．２×１０３～１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２が最も好ましい。
　前記（１）工程で多能性幹細胞を基材上で培養する際の、培養温度に特に制限はないが、細胞の増殖能や生理活性，機能維持に好適であることから、３０～４２℃が好ましく、３２～４０℃がさらに好ましく、３６～３８℃が特に好ましく、３７℃が最も好ましい。
　また、培養を開始して２２～２６時間後に、最初の培地交換を行うことが好ましい。その４８～７２時間後に２度目の培地交換を行い、その後、２４～４８時間毎に培地交換を行うことが好ましい。この間、多能性幹細胞は増殖し、コロニーと呼ばれる細胞塊を形成する。コロニーの大きさが１ｍｍ前後になるまで培養を継続させ、その後、（２）工程に移行する。
　前記（２）工程では、前記［ａ］～［ｃ］の複数の組合せからなる工程、又は前記［ｃ］工程のみによって、分化細胞の少なくとも一部を基材に接着させたまま、（１）工程で培養した未分化の多能性幹細胞を基材から剥離する。［ａ］～［ｃ］の組み合わせとしては、［ａ］と［ｂ］の組み合わせ、［ａ］と［ｃ］の組み合わせ、［ｂ］と［ｃ］の組み合わせ、［ａ］～［ｃ］全ての組み合わせを挙げることができ、細胞懸濁液の量産性を高めるのに好適であることから、［ａ］と［ｂ］の組み合わせ、［ａ］と［ｃ］の組み合わせ、［ｂ］と［ｃ］の組み合わせ、又は［ｃ］のみが好ましい。また、未分化率を高めるのに好適であることから、［ａ］と［ｃ］の組み合わせ、又は［ｂ］と［ｃ］の組み合わせ、［ｃ］のみがさらに好ましく、［ａ］と［ｃ］の組み合わせ、［ｃ］のみが特に好ましい。さらに、作製される細胞懸濁液が未分化維持培養又はスフェロイド形成に用いるために好適な状態となることから、［ａ］と［ｃ］の組み合わせが最も好ましい。分化細胞を基材に接着させたまま未分化の多能性幹細胞を基材から剥離することによって、細胞懸濁液に含まれる細胞の未分化率を高めることができる。また、細胞を選別する工程が不要であることから、大面積の培養基材を使用した場合に、細胞懸濁液の量産性を高めることができる。分化細胞を含めて全ての細胞を基材から剥離する場合、細胞懸濁液に含まれる細胞の未分化率を高めることができない。また、分化細胞を含めて全ての細胞を基材から剥離する場合、細胞を選別する工程が必要であることから、大面積の培養基材を使用した場合に、細胞懸濁液の量産性を低下させる原因となる。
　前記［ｂ］及び［ｃ］工程において、細胞へのダメージを低減し、多能性幹細胞の生存率を高め、また、分化多能性を維持するために好適であることから、多能性幹細胞を液体培地存在下で剥離することが好ましい。
　本発明の細胞懸濁液の製造方法は、セルスクレーピングを行わないことが好ましい。セルスクレーピングを行わないことによって、大面積の培養基材を使用した場合に細胞の剥離に要する時間を短縮することができ、細胞懸濁液の量産性を高めることができる。また、セルスクレーピングを行わないことにより、未分化の多能性幹細胞を選択的に剥離することができ、細胞懸濁液の純度を高めることができる。ここで、本発明において「セルスクレーピング」とは、セルスクレーパーを用いて基材表面を擦ることにより細胞を基材から剥離する操作を示す。
　前記［ａ］工程では、多能性幹細胞に細胞間結合乖離液を接触させ、細胞間結合を乖離させる。多能性幹細胞はコロニーの状態で増殖するため、細胞同士で結合を形成して互いに接着し合い、基材から剥離しにくい状態を形成しやすい。一方、分化細胞の多くはコロニーを形成しないことから、細胞間結合の乖離は基材からの剥離性にあまり影響しない。このために、細胞間結合を乖離させることにより、未分化の多能性幹細胞を優先して基材から剥離しやすく、細胞懸濁液に含まれる細胞の未分化率を高めることができる。
　前記細胞間結合乖離液としては、例えば、トリプシンを含有する液体を好適に用いることができる。ここで、本発明において「トリプシン」とは、膵臓から分泌されるタンパク質分解酵素の「ＥＣ．３．４．２１．４」、又は該タンパク質分解酵素と同等の特性を有する分解酵素を示す。市販品としては例えば、Ｔｒｙｐｓｉｎ（商標）、ＴｒｙｐＬＥ（商標）ＳＥＬＥＣＴ、ＴｒｙｐＬＥ（商標）ＥＸＰＲＥＳ（いずれもサーモフィッシャー社製）等を挙げることができる。基材上で培養された多能性幹細胞と、トリプシンを含有する細胞間結合乖離液を接触させる時間としては、未分化の多能性幹細胞のみに選択的にトリプシンの作用を及ぼすのに好適であることから、１秒～１０分間が好ましく、３０秒～５分間がさらに好ましく、１分～４分間が特に好ましく、１分～２分間が最も好ましい。また、接触させる際の細胞間結合乖離液の温度としては、トリプシンを活性化させるのに好適であることから、１０～４０℃が好ましく、２０～４０℃がさらに好ましく、３０～４０℃が特に好ましく、３７℃が最も好ましい。
　前記細胞間結合乖離液としてはまた、キレート剤を含有するものも好適に用いることができる。この場合、キレート剤のみを含有するものであってもよいし、キレート剤と前述のトリプシンを共に含有するものであってもよい。前記キレート剤としては、キレート剤であること以外に特に限定はないが、例えば、エチレンジアミン四酢酸、エチレンジアミン、エチレンジアミンテトラメチレンホスホン酸、グリコールエーテルジアミン四酢酸、ニトリロトリ酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸、Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）エチレンジアミン－Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－三酢酸、トリエチレンテトラミン－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’，Ｎ’’’－六酢酸、１，３－プロパンジアミン－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸、１，３－ジアミノ－２－プロパノール－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸、Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）イミノ二酢酸、Ｎ，Ｎ－ジ（２－ヒドロキシエチル）グリシン、グリコールエーテルジアミン四酢酸、ジカルボキシメチルグルタミン酸、エチレンジアミン－Ｎ，Ｎ’－ジコハク酸、２，３－ジヒドロキシ安息香酸、イミノ二酢酸、エチドロン酸、クエン酸、ムギネ酸、ビピリジン、ポルフィリン、フェナントロリン、ポルフィリン、クラウンエーテル、サイクレン、１８－クラウン－６、デフェロキサミン、ドータオクトレオテート、ニコチアナミン、ジメルカプロール、シデロホア等を挙げることができる。細胞を単一細胞又は数個～数十個の細胞の凝集塊とするのに好適であり、また、細胞の生存率及び選択剥離の選択制を高めるのに好適であることから、１～４価の金属イオンとキレートを形成するキレート剤が好ましく、２価の金属イオンとキレートを形成するキレート剤がさらに好ましく、カルシウムイオンとキレートを形成するキレート剤が特に好ましく、エチレンジアミン四酢酸が最も好ましい。基材上で培養された多能性幹細胞と、キレート剤を含有する細胞間結合乖離液を接触させる時間としては、トリプシンを含有しない細胞間結合乖離液である場合、未分化の多能性幹細胞のみに選択的に細胞剥離作用を及ぼすのに好適であることから、１秒～３０分間が好ましく、３０秒～２０分間がさらに好ましく、１分～１０分間が特に好ましく、２分～１０分間が最も好ましい。
　前記［ｂ］工程では、未分化の多能性幹細胞が選択的に剥離する外部応力を加える。未分化の多能性幹細胞が選択的に剥離する外部応力を加えることにより、細胞懸濁液に含まれる細胞の未分化率を高めることができる。また、細胞懸濁液の量産性を高めるのに好適であることから、外部応力は培養環境の特定の領域に作用させるものではなく、培養環境の全体に均一に作用させることが好ましい。
　前記外部応力を加える工程としては特に限定はないが、培養液に対流を生じさせる工程、基材に振動を加える工程、基材が多孔質基材であり、培養面の裏面に圧力を加える工程のいずれか、又はこれらの複数の組み合わせであることが好ましい。
　前記培養液に対流を生じさせる工程としては、使用する基材によって細胞の基材への接着強度が変化するため、最適な流量又は流速は基材の種類によって変化するが、例えば基材がポリスチレン基材の場合、流量として０．１～１０ｍＬ／ｓが好ましく、０．２～８ｍＬ／ｓがさらに好ましく、０．４～６ｍＬ／ｓが特に好ましく、０．６～４ｍＬ／ｓが最も好ましい。また、基材がポリスチレン基材以外の場合にも、複数の流量又は流速条件で細胞懸濁液を作製し、細胞懸濁液に含まれる細胞の未分化率を比較することによって、最適な流速を決定することができる。また、培養基材上の細胞を位相差顕微鏡により（２）工程の前後で観察し、未分化の多能性幹細胞が選択的に基材から剥離する条件を選択することができる。
　前記培養液へ対流を生じさせる方法としては特に限定はないが、例えば、培養液をピペッティングすることや、ポンプ又は撹拌翼を用いることにより機械的に培養液内部に強制対流を発生させる方法を挙げることができる。ここで、本発明において「ピペッティング」とは、ピペットマン等の器具を用いて培養液の吸引及び吐出を繰り返すことにより、培養環境に対流を生じさせる操作を示す。
　前記振動を基材に加える工程としては、使用する基材によって細胞の基材への接着強度が変化するため、未分化の多能性幹細胞が選択的に剥離する振動は、基材の種類によって変化するが、基材がポリスチレンの非多孔質基材の場合、５０～１００ｄＢが好ましく、５０～９０ｄＢがさらに好ましく、５０～８０ｄＢが特に好ましく、５０～７０ｄＢが最も好ましい。また、基材がポリスチレン以外の場合は、前述の流量の場合と同様に、複数の振動条件で細胞懸濁液を作製することによって、最適な振動を決定することができる。また、培養基材上の細胞を位相差顕微鏡により（２）工程の前後で観察し、未分化の多能性幹細胞が選択的に基材から剥離する条件を選択することができる。
　基材に振動を加える方法としては、特に限定はないが、タッピングや、定常波発生装置等の振動発生装置を基材に接触させる方法、基材に超音波を当てる方法等を挙げることができる。ここで、本発明において「タッピング」とは、培養容器を叩く等により培養環境に振動を与える操作を示す。
　前記圧力を培養面の裏面に加える工程としては、使用する基材によって細胞の基材への接着強度が変化するため、未分化の多能性幹細胞が選択的に剥離する圧力は、基材の種類によって変化するが、基材がポリエチレンテレフタレートの多孔質基材の場合、０．００１～１ＭＰａが好ましく、０．００５～０．５ＭＰａがさらに好ましく、０．０１～０．２ＭＰａが特に好ましく、０．０２～０．１ＭＰａが最も好ましい。また、基材がポリエチレンテレフタレート以外の多孔質基材の場合は、前述の流量の場合と同様に、複数の圧力条件で細胞懸濁液を作製することによって、最適な圧力を決定することができる。また、培養基材上の細胞を位相差顕微鏡により（２）工程の前後で観察し、未分化の多能性幹細胞が選択的に基材から剥離する条件を選択することができる。
　培養面の裏面に圧力を加える方法としては、特に限定はないが、多能性幹細胞の存在する面とは逆側の面に、ポンプ等により圧力を加える方法等を挙げることができる。
　前記［ｃ］工程は、培養基材が温度応答性を有するものであり、未分化の多能性幹細胞が選択的に剥離する温度及び時間で基材を冷却する。
　使用する基材によって細胞の基材への接着強度が変化するため、未分化の多能性幹細胞が選択的に剥離する冷却温度及び冷却時間は、基材の種類によって変化するが、層厚×温度応答性成分の含有割合の積が３０ｎｍの温度応答性高分子による層を有する基材の場合、０～３０℃の温度で１秒～６０分間冷却することが好ましく、２～２５℃の温度で１秒～６０分間冷却することがさらに好ましく、２～２０℃の温度で１秒～６０分間冷却することが特に好ましく、２～１０℃の温度で１秒～６０分間冷却することが最も好ましい。また、層厚×温度応答性成分の含有割合の積が３０ｎｍの温度応答性高分子による層を有する基材以外の場合は、前述の流量の場合と同様に、複数の冷却条件で細胞懸濁液を作製することによって、最適な冷却温度及び冷却時間を決定することができる。また、培養基材上の細胞を位相差顕微鏡により（２）工程の前後で観察し、未分化の多能性幹細胞が選択的に基材から剥離する条件を選択することができる。より低温で長時間冷却するほど細胞が基材から剥離しやすくなることから、細胞の剥離量が少ない場合には低温で長時間の冷却、細胞懸濁液に含まれる細胞の未分化率が低い場合には温度を上げるか短時間の冷却とすることが好ましい。ここで、本発明において温度応答性高分子による層の「層厚」とは、温度応答性高分子による層の最も基材側の界面から最も表面側の界面までの基材面外方向の長さを示し、層厚が１０ｎｍを超える範囲ではミクロトームにより作製した培養基材の超薄切片を用いて断面像を透過型電子顕微鏡によって測定し、無作為に選んだ１０点の該距離を測定し、平均することで算出することができる。また、層厚が１０ｎｍ以下の範囲ではエリプソメーターを用いて測定することができる。また、本発明において「温度応答性成分の含有割合」とは、温度応答性高分子に含まれる温度応答性の単量体単位の重量割合を示す。
　また、［ｃ］工程の前に［ａ］工程を設ける場合、使用する基材の種類だけでなく、［ａ］工程の条件によっても最適な［ｃ］工程の条件も変化する。層厚×温度応答性成分の含有割合の積が３０ｎｍの温度応答性高分子による層を有する基材の場合、［ａ］工程でトリプシンを含有する細胞間結合乖離液を接触させる時間としては１分～４分間、キレート剤のみを含有する細胞間結合乖離液を接触させる時間としては２分～１０分間が好ましい。
　前記温度応答性を有する基材としては、応答温度が０℃～５０℃の範囲にある温度応答性高分子による層を表面に有する基材を挙げることができ、剥離後の多能性幹細胞の生存率を高めるのに好適であることから、ＬＣＳＴが０℃～５０℃の範囲にあることが好ましく、５℃～３５℃がさらに好ましく、１０℃～２５℃が特に好ましく、１５℃～２５℃が最も好ましい。
　前記温度応答性高分子を構成する単量体単位としては特に制限はないが、例えば、アクリルアミド、メタクリルアミド等の（メタ）アクリルアミド化合物；Ｎ，Ｎ－ジエチルアクリルアミド、Ｎ－エチルアクリルアミド、Ｎ－ｎ－プロピルアクリルアミド、Ｎ－ｎ－プロピルメタクリルアミド、Ｎ－イソプロピルアクリルアミド、Ｎ－イソプロピルメタクリルアミド、Ｎ－シクロプロピルアクリルアミド、Ｎ－シクロプロピルメタクリルアミド、Ｎ－エトキシエチルアクリルアミド、Ｎ－エトキシエチルメタクリルアミド、Ｎ－テトラヒドロフルフリルアクリルアミド、Ｎ－テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド等のＮ　アルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体；Ｎ，Ｎ－ジメチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ－エチルメチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジエチルアクリルアミド等のＮ，Ｎ－ジアルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体；１－（１－オキソ－２－プロペニル）－ピロリジン、１－（１－オキソ－２－プロペニル）－ピペリジン、４－（１－オキソ－２－プロペニル）－モルホリン、１－（１－オキソ－２－メチル－２－プロペニル）－ピロリジン、１－（１－オキソ－２－メチル－２－プロペニル）－　ピペリジン、４－（１－オキソ－２－メチル－２－プロペニル）－モルホリン等の環状基を有する（メタ）アクリルアミド誘導体；メチルビニルエーテル等のビニルエーテルを挙げることができ、ＬＣＳＴを０～５０℃とするのに好適であることから、Ｎ，Ｎ－ジエチルアクリルアミド、Ｎ－ｎ－プロピルアクリルアミド、Ｎ－イソプロピルアクリルアミド、Ｎ－ｎ－プロピルメタクリルアミド、Ｎ－エトキシエチルアクリルアミド、Ｎ－テトラヒドロフルフリルアクリルアミド、Ｎ－テトラヒドロフルフリルメタクリルアミドが好ましく、Ｎ，Ｎ－ジエチルアクリルアミド、Ｎ－イソプロピルアクリルアミドがさらに好ましく、Ｎ－イソプロピルアクリルアミドが特に好ましい。
　前記温度応答性高分子による層の層厚×温度応答性成分の含有割合の積としては、基材から多くの未分化の多能性幹細胞を剥離回収するのに好適であることから、５ｎｍ以上が好ましく、１０ｎｍ以上がさらに好ましく、２０ｎｍ以上が特に好ましく、３０ｎｍ以上が最も好ましい。また、未分化の多能性幹細胞のみを選択的に剥離し、分化細胞を剥離せず基材に残すことで細胞懸濁液の純度を高めるのに好適であることから、１０００ｎｍ以下が好ましく、１００ｎｍ以下がさらに好ましく、５０ｎｍ以下が特に好ましく、２５ｎｍ以下が最も好ましい。
　前記温度応答性高分子の単量体単位とその他の単量体単位との共重合体を用いる方法においては、共重合体を強固に基材に固定化させるのに好適であることから、少なくとも水に不溶の高分子の単量体単位を含むことが好ましい。また、温度応答性高分子の応答温度の制御に好適であることから、共重合体の構造としてはブロック共重合体であることが好ましい。
　前記水に不溶の高分子の単量体単位としては特に制限はないが、例えば、スチレン、２－ヒドロキシフェニルアクリレート、２－ヒドロキシフェニルメタクリレート、３－ヒドロキシフェニルアクリレート、３－ヒドロキシフェニルメタクリレート、４－ヒドロキシフェニルアクリレート、４－ヒドロキシフェニルメタクリレート、Ｎ－（２－ヒドロキシフェニル）アクリルアミド、Ｎ－（２－ヒドロキシフェニル）メタクリルアミド、Ｎ－（３－ヒドロキシフェニル）アクリルアミド、Ｎ－（３－ヒドロキシフェニル）メタクリルアミド、Ｎ－（４－ヒドロキシフェニル）アクリルアミド、Ｎ－（４－ヒドロキシフェニル）メタクリルアミド、ｎ－ブチルアクリレート、ｎ－ブチルメタクリレート、イソブチルアクリレート、イソブチルメタクリレート、ｔ－ブチルアクリレート、ｔ－ブチルメタクリレート、ｎ－ヘキシルアクリレート、ｎ－ヘキシルメタクリレート、ｎ－オクチルアクリレート、ｎ－オクチルメタクリレート、ｎ－デシルアクリレート、ｎ－デシルメタクリレート、ｎ－ドデシルアクリレート、ｎ－ドデシルメタクリレート、ｎ－テトラデシルアクリレート、ｎ－テトラデシルメタクリレートを挙げることができる。
　前記共重合体における温度応答性成分の含有割合は、未分化の多能性幹細胞を選択的に剥離するのに好適であることから、５０ｗｔ％以上が好ましく、７０ｗｔ％以上がさらに好ましく、８０ｗｔ％以上が特に好ましく、９０ｗｔ％以上が最も好ましい。また、共重合体を基材へ強固に固定化するのに好適であることから、温度応答性高分子の構成単位比率が９５ｗｔ％以下であることが好ましく、９０ｗｔ％以下であることがさらに好ましく、８５ｗｔ％以下であることが特に好ましく、８０ｗｔ％以下であることが最も好ましい。
　前記温度応答性高分子の分子量としては特に制限はないが、温度応答性高分子による層の強度を高めるのに好適であることから、数平均分子量で１０００～１００万であることが好ましく、２０００～５０万であることがさらに好ましく、５０００～３０万であることが特に好ましく、１万～２０万であることが最も好ましい。
　本発明の基材表面に温度応答性高分子による層を形成させる方法としては、基材に温度応答性高分子を、（１）化学的な結合によって被覆させ層を形成させる方法、（２）物理的な相互作用によって被覆させ層を形成させる方法、を単独または併用して行うことができる。すなわち、（１）化学的な結合による方法としては、紫外線照射、電子線照射、ガンマ線照射、プラズマ処理、コロナ処理等を用いることができる。さらに、温度応答性高分子と基材が適当な反応性官能基を有する場合は、ラジカル反応、アニオン反応、カチオン反応等の一般に用いられる有機反応を利用することができる。（２）物理的な相互作用による方法としては、温度応答性高分子との相溶性が良く、塗工性のよいマトリックスを媒体とし、塗布、はけ塗り、ディップコーティング、スピンコーティング、バーコーディング、流し塗り、スプレー塗装、ロール塗装、エアーナイフコーティング、ブレードコーティング、グラビアコーティング、マイクログラビアコーティング、スロットダイコーティングなど通常知られている各種の方法を用いることが可能である。
　基材の形状としては特に制限はなく、板、フィルムのような平面形状であってもよいし、ファイバー、多孔質粒子、多孔質膜、中空糸であってもよい。また、一般に細胞培養等に用いられる容器（ペトリ皿等の細胞培養皿、フラスコ、プレート等）であっても差し支えない。培養操作の容易性から、板、フィルムのような平面形状、又は平膜の多孔質膜であることが好ましい。
　本発明において、多能性幹細胞の剥離性を高めるのに好適であることから、基材が多孔質基材であり、多孔質基材の孔径が培養する多能性幹細胞よりも小さなものであることが好ましい。基材が多孔質基材であることにより、多能性幹細胞の剥離性を高めることができる。また、多孔質基材の孔径が多能性幹細胞よりも小さなものであることにより、多能性幹細胞接着性及び増殖性を高めることができる。さらに、基材が多孔質基材であることにより、培養中に細胞へ栄養が行き渡りやすく、継代培養において多能性幹細胞の未分化維持率を高めることができる。また、多能性幹細胞接着性及び増殖性を高めるのに好適であることから、前記孔径が８μｍ以下であることがさらに好ましく、３μｍ以下であることが特に好ましく、１μｍ以下であることが最も好ましい。さらに、多能性幹細胞の剥離性を高めるのに好適であることから、前記細孔径が０．０１μｍ以上であることが好ましく、０．０５μｍ以上であることがさらに好ましく、０．１μｍ以上であることが特に好ましく、０．２μｍ以上であることが最も好ましい。ここで、本発明において多孔質基材の「孔径」とは、多孔質基材が有する細孔の、多孔質基材の面内方向に沿った直径の平均値を示し、多孔質基材のレーザー顕微鏡像や走査型電子顕微鏡像、透過型電子顕微鏡像において２０点以上の細孔について該直径を測定し、平均値を求めることによって算出することができる。
　本発明において、多能性幹細胞の増殖性及び剥離性を高めるのに好適であることから、多孔質基材の細孔の孔密度が、１０～１０１０個／ｃｍ２であることが好ましく、１０３～１０９個／ｃｍ２がさらに好ましく、１０５～１０９個／ｃｍ２が特に好ましく、１０５～１０７個／ｃｍ２が最も好ましい。また、多孔質基材の透明性を高め、顕微鏡による細胞の観察を容易とするのに好適であることから、多孔質基材の細孔の細孔密度が、１０７個／ｃｍ２以下であることが好ましく、１０６個／ｃｍ２以下であることがさらに好ましく、１０５個／ｃｍ２以下であることが特に好ましく、１０４個／ｃｍ２以下であることが最も好ましい。ここで、本発明において多孔質基材の細孔の「孔密度」とは、多孔質基材の基材面積当たりに存在する細孔の数を示し、多孔質基材のレーザー顕微鏡像や走査型電子顕微鏡像、透過型電子顕微鏡像において、多孔質基材の細孔の孔径の２００倍以上の長さを一辺とする正方形の領域において細孔の数を求めることで算出することができる。なお、本発明において多孔質基材の「基材面積」とは、多孔質基材に細孔が存在しないと仮定した場合の、多孔質基材の一主面の表面積を示す。
　本発明において、多能性幹細胞の剥離性を高めるのに好適であることから、多孔質基材の空隙率が０．０１～３０％であることが好ましく、０．０１～２０％がさらに好ましく、０．０１～５％が特に好ましく、０．０１～１．５％が最も好ましい。ここで、本発明において多孔質基材の「空隙率」とは、多孔質基材の表面の一主面について、細孔部分の合計面積を基材面積で割った値で、面積割合で基材面にどの程度の空隙が存在するのかを示し、多孔質基材のレーザー顕微鏡像や走査型電子顕微鏡像、透過型電子顕微鏡像において、多孔質基材の細孔の孔径の２００倍以上の長さを一辺とする正方形の領域を観察することによって測定することができる。
　前記空隙率としてはまた、位相差顕微鏡による多能性幹細胞の観察を可能とするのに好適であることから、１０％以下が好ましく、７％以下がさらに好ましく、４％以下が特に好ましく、２％以下が最も好ましい。
　さらに、前記空隙率としては、培地中に含まれる成分を迅速に透過させ、細胞へ万遍なく栄養を行き渡らせるのに好適であることから、空隙率が０．１％以上であることが好ましく、１％以上がさらに好ましく、５％以上が特に好ましく、１０％以上が最も好ましい。
　本発明の細胞懸濁液の製造方法により製造される細胞懸濁液は、多能性幹細胞の未分化維持培養又は分化誘導用のスフェロイドの作製に用いるのに好適であることから、細胞懸濁液に含まれる細胞の未分化率が７０％以上であることが好ましく、８０％以上がさらに好ましく、９０％以上が特に好ましく、９５％以上が最も好ましい。未分化率は未分化マーカーを染色してフローサイトメーターにより測定することができる。
　本発明の細胞懸濁液の製造方法により製造される細胞懸濁液の細胞回収率は、細胞懸濁液の量産性を高めるのに好適であることから、２０％以上が好ましく、４０％以上がさらに好ましく、６０％以上が特に好ましく、８０％以上が最も好ましい。ここで、細胞回収率とは、本発明の（２）工程で剥離した細胞／培養した全細胞の割合を示す。
　以下、本発明を実施するための形態を挙げて本発明について詳細に説明するが、本発明を説明するための例示であり、本発明を以下の内容に限定する趣旨ではない。また本発明の要旨の範囲内で適宜に変更して実施することができる。なお、断りのない限り、試薬は市販品を用いた。
＜重合体の組成＞
　核磁気共鳴測定装置（日本電子（株）製、商品名ＪＮＭ－ＧＳＸ４００）を用いたプロトン核磁気共鳴分光（１Ｈ－ＮＭＲ）スペクトル分析、又は核磁気共鳴測定装置（ブルカージャパン（株）製、商品名ＡＶＡＮＣＥＩＩＩＨＤ５００）を用いたカーボン核磁気共鳴分光（１３Ｃ－ＮＭＲ）スペクトル分析より求めた。
＜重合体の分子量、分子量分布＞
　重量平均分子量（Ｍｗ）、数平均分子量（Ｍｎ）および分子量分布（Ｍｗ／Ｍｎ）は、ゲル・パーミエーション・クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって測定した。ＧＰＣ装置は東ソー（株）製　ＨＬＣ－８３２０ＧＰＣを用い、カラムは東ソー（株）製　ＴＳＫｇｅｌ　Ｓｕｐｅｒ　ＡＷＭ－Ｈを２本用い、カラム温度を４０℃に設定し、溶離液は１０ｍＭトリフルオロ酢酸ナトリウムを含む１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロー２－イソプロパノールまたは１０ｍＭ臭化リチウムを含むＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミドを用いて測定した。測定試料は１．０ｍｇ／ｍＬで調製して測定した。分子量の検量線は、分子量既知のポリメタクリル酸メチル（ポリマーラボラトリーズ製）を用いた。
［実施例１］
　基材としてポリスチレンディッシュ（Ｃｏｒｎｉｎｇ　Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ製）に温度応答性高分子による層が形成されたものを用い、ヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株を１３００個／ｃｍ２の密度で播種し、３７℃、ＣＯ２濃度５％の環境下で培養した。培地はＳｔｅｍＦｉｔＡＫ０２Ｎ（味の素（株）製）を０．２ｍＬ／ｃｍ２加えた。また、細胞播種から２４時間後までは、前記培地にＹ－２７６３２（和光純薬工業（株）製）（濃度１０μＭ）とｉＭａｔｒｉｘ－５１１溶液（（株）ニッピ製）（２．５μＬ／ｍＬ）を添加した培地を使用して培養した。
　細胞播種から２４時間後、９６時間後、１４４時間後に、位相差顕微鏡で細胞の様子を観察し、いずれの場合においても細胞接着ならびに増殖を確認し、新しい培地に交換を行った。細胞播種から１４４時間後の培地交換の後、細胞はコロニー状で基材に存在していることを確認した。
　培地を除去してリン酸緩衝生理食塩水で洗浄後、リン酸緩衝生理食塩水にエチレンジアミン四酢酸を５×１０－３ｍｏｌ／Ｌの濃度となるように加えた細胞間結合乖離液をディッシュ内に加え、２５℃で２分間処理した。細胞間結合乖離液を除去してＹ－２７６３２を添加した培地をディッシュ内に加えた後、１５℃で１０分間冷却を行うことで細胞を剥離させた。未分化の細胞が選択的に剥離する様子が観察され、細胞懸濁液として回収できた。
　なお、温度応答性高分子の合成及びコーティングは以下の方法で行った。
　試験管に、４－シアノ－４－［（ドデシルスルファニルチオカルボニル）スルファニル］ペンタノイックアシッド０．４０ｇ（０．１ｍｍｏｌ）、ｎ－ブチルメタクリレート７．１１ｇ（５０ｍｍｏｌ）、アゾビス（イソブチロニトリル）３３ｍｇ（０．２ｍｍｏｌ）を加え、１，４－ジオキサン５０ｍＬに溶解した。窒素バブリングにより３０分脱気を行った後、７０℃で２４時間反応させた。反応終了後、反応溶媒をロータリーエバポレーターにて減圧留去し、反応溶液を濃縮した。濃縮液をメタノール２５０ｍＬに注ぎ、析出した黄色油状物質を回収して減圧乾燥し、ｎ－ブチルメタクリレート重合体を得た。
　試験管に、前記ｎ－ブチルメタクリレート重合体０．９ｇ（０．３ｍｍｏｌ）、Ｎ－イソプロピルアクリルアミド８．１４ｇ（７２ｍｍｏｌ）、アゾビスイソブチロニトリル５ｍｇ（０．０３ｍｍｏｌ）を加え、１，４－ジオキサン１５ｍＬに溶解させた。窒素バブリングにより３０分脱気を行った後、６５℃で１７時間反応させた。反応終了後、反応溶媒をアセトンで希釈し、ヘキサン５００ｍＬに注ぎ、析出した淡黄色固体を回収して減圧乾燥し、Ｎ－イソプロピルアクリルアミドとｎ－ブチルメタクリレートの共重合体を得た。
　ポリスチレンディッシュ上にＮ－イソプロピルアクリルアミドとｎ－ブチルメタクリレートの共重合体の０．６ｗｔ％エタノール溶液を２０００ｒｐｍでスピンコートし、温度応答性高分子を被覆した。
　温度応答性高分子の応答温度は３２℃、構成単位比率はｎ－ブチルメタクリレート４ｗｔ％、Ｎ－イソプロピルアクリルアミド９６ｗｔ％、分子量はＭｎ７万であった。ポリスチレンディッシュ上への温度応答性高分子の被覆の層厚は３０ｎｍであった。
［実施例２］
　実施例１においてリン酸緩衝生理食塩水での洗浄及び細胞間結合乖離液をディッシュ内に加える操作を行わず、また、１５℃で１０分間冷却を行った後に基材を２０回タッピングして振動を与える操作を行い、その他は実施例１と同様にして細胞懸濁液を作製した。未分化の細胞が選択的に剥離し、細胞懸濁液として回収できた。
［実施例３］
　基材として温度応答性高分子による層を形成していないポリスチレンディッシュ（Ｃｏｒｎｉｎｇ　Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ製）を用い、１５℃で１０分間冷却する操作を行わず、代わりに約１．２ｍＬ／ｓの流量となるようピペッティング操作を２０回行うことで対流を与え、その他は実施例１と同様にして細胞懸濁液を作製した。未分化の細胞が選択的に剥離し、細胞懸濁液として回収できた。
［実施例４］
　基材として温度応答性高分子による層を形成していないポリスチレンディッシュ（Ｃｏｒｎｉｎｇ　Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ製）を用い、ヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株と、分化細胞としてヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株由来中胚葉細胞との共培養を以下の方法で行った。
　ヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株を２６０個／ｃｍ２の密度で播種し、３７℃、ＣＯ２濃度５％の環境下で４日間培養した。培地はＳｔｅｍＦｉｔＡＫ０２Ｎ（味の素（株）製）を０．２ｍＬ／ｃｍ２加えた。また、細胞播種から２４時間後までは、前記培地にＹ－２７６３２（和光純薬工業（株）製）（濃度１０μＭ）とｉＭａｔｒｉｘ－５１１溶液（（株）ニッピ製）（２．５μＬ／ｍＬ）を添加した培地を使用して培養した。培養４日間培養した時点でヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株由来中胚葉細胞を２２２０個／ｃｍ２の密度で播種し、さらに３日間共培養した。
　細胞播種から２４時間後、９６時間後、１４４時間後に、位相差顕微鏡で細胞の様子を観察し、いずれの場合においても細胞接着ならびに増殖を確認し、新しい培地に交換を行った。細胞播種から１４４時間後の培地交換の後、細胞はコロニー状で基材に存在していることを確認した。また、コロニーの周囲に中胚葉細胞が存在していることを確認した。
　培地を除去後、リン酸緩衝生理食塩水に０．５×ＴｒｙｐＬＥ　ＳＥＬＥＣＴ、エチレンジアミン四酢酸を５×１０－３ｍｏｌ／Ｌの濃度となるように加えた細胞間結合乖離液をディッシュ内に加え、２５℃で２分間処理した。細胞間結合乖離液を除去してＹ－２７６３２を添加した１５℃の培地をディッシュ内に加えて室温で５分間冷却した後、約１．２ｍＬ／ｓの流量となるようピペッティング操作を２０回行うことで対流を与え、細胞を剥離させ、細胞懸濁液を回収した。また、剥離しなかった細胞は基材表面をセルスクレーパーで擦ることにより全ての細胞を剥離し、別の容器に回収して細胞数を計測した。細胞回収率として、「細胞懸濁液に含まれる細胞数／培養した全細胞数」の割合を求めた。ここで、培養した全細胞は、細胞懸濁液に含まれる細胞数とセルスクレーパーで剥離した細胞数の合計を示す。
　冷却及びピペッティング操作により回収した細胞の未分化率をフローサイトメーターで測定したところ、未分化率は９９．５％であり、分化細胞はほとんど含まれておらず、純度の高いものであった。また、細胞回収率は３３．８％であった。
［実施例５］
　実施例１と同様の温度応答性高分子を以下の方法で被覆した基材を用い、実施例４と同様にヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株と中胚葉細胞の共培養及び細胞懸濁液の作製を行った。
　ポリスチレンディッシュ（Ｃｏｒｎｉｎｇ　Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ製）上にＮ－イソプロピルアクリルアミドとｎ－ブチルメタクリレートの共重合体の０．２ｗｔ％エタノール溶液を２０００ｒｐｍでスピンコートし、温度応答性高分子を被覆した。
　冷却及びピペッティング操作により回収した細胞の未分化率をフローサイトメーターで測定したところ、未分化率は９９．７％であり、分化細胞はほとんど含まれておらず、純度の高いものであった。また、細胞回収率は４８．２％であった。
［実施例６］
　実施例１と同様の温度応答性高分子を以下の方法で被覆した基材を用い、実施例４と同様にヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株と中胚葉細胞の共培養及び細胞懸濁液の作製を行った。
　ポリスチレンディッシュ（Ｃｏｒｎｉｎｇ　Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ製）上にＮ－イソプロピルアクリルアミドとｎ－ブチルメタクリレートの共重合体の０．４ｗｔ％エタノール溶液を２０００ｒｐｍでスピンコートし、温度応答性高分子を被覆した。
　冷却及びピペッティング操作により回収した細胞の未分化率をフローサイトメーターで測定したところ、未分化率は９９．２％であり、分化細胞はほとんど含まれておらず、純度の高いものであった。また、細胞回収率は５２．０％であった。
［実施例７］
　実施例１と同様の基材を用い、実施例４と同様にヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株と中胚葉細胞の共培養及び細胞懸濁液の作製を行った。
　冷却及びピペッティング操作により回収した細胞の未分化率をフローサイトメーターで測定したところ、未分化率は９８．２％であり、分化細胞はほとんど含まれておらず、純度の高いものであった。また、細胞回収率は７８．９％であった。
［実施例８］
　実施例１と同様の温度応答性高分子を以下の方法で被覆した基材を用い、実施例４と同様にヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株と中胚葉細胞の共培養及び細胞懸濁液の作製を行った。
　ポリスチレンディッシュ（Ｃｏｒｎｉｎｇ　Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ製）上にＮ－イソプロピルアクリルアミドとｎ－ブチルメタクリレートの共重合体の０．８ｗｔ％エタノール溶液を２０００ｒｐｍでスピンコートし、温度応答性高分子を被覆した。
　冷却及びピペッティング操作により回収した細胞の未分化率をフローサイトメーターで測定したところ、未分化率は９８．７％であり、分化細胞はほとんど含まれておらず、純度の高いものであった。また、細胞回収率は８５．２％であった。
［実施例９］
　以下の温度応答性高分子を用い、その他は実施例７と同様にヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株と中胚葉細胞の共培養及び細胞懸濁液の作製を行った。
　試験管に、４－シアノ－４－［（ドデシルスルファニルチオカルボニル）スルファニル］ペンタノイックアシッド０．４０ｇ（０．１ｍｍｏｌ）、ｎ－ブチルメタクリレート７．１１ｇ（５０ｍｍｏｌ）、アゾビス（イソブチロニトリル）３３ｍｇ（０．２ｍｍｏｌ）を加え、１，４－ジオキサン５０ｍＬに溶解した。窒素バブリングにより３０分脱気を行った後、７０℃で２４時間反応させた。反応終了後、反応溶媒をロータリーエバポレーターにて減圧留去し、反応溶液を濃縮した。濃縮液をメタノール２５０ｍＬに注ぎ、析出した黄色油状物質を回収して減圧乾燥し、ｎ－ブチルメタクリレート重合体を得た。
　試験管に、前記ｎ－ブチルメタクリレート重合体０．９ｇ（０．３ｍｍｏｌ）、Ｎ－イソプロピルアクリルアミド２．６５ｇ（２３ｍｍｏｌ）、アゾビスイソブチロニトリル５ｍｇ（０．０３ｍｍｏｌ）を加え、１，４－ジオキサン１５ｍＬに溶解させた。窒素バブリングにより３０分脱気を行った後、６５℃で１７時間反応させた。反応終了後、反応溶媒をアセトンで希釈し、ヘキサン５００ｍＬに注ぎ、析出した固体を回収して減圧乾燥した。また、アセトンに再度溶解させ、純水５００ｍＬに注ぎ、析出した固体を回収して減圧乾燥し、Ｎ－イソプロピルアクリルアミドとｎ－ブチルメタクリレートの共重合体を得た。
　冷却及びピペッティング操作により回収した細胞の未分化率をフローサイトメーターで測定したところ、未分化率は９９．４％であり、分化細胞はほとんど含まれておらず、純度の高いものであった。また、細胞回収率は７２．７％であった。
［実施例１０］
　以下の温度応答性高分子を用い、その他は実施例７と同様にヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株と中胚葉細胞の共培養及び細胞懸濁液の作製を行った。
　試験管に、４－シアノ－４－［（ドデシルスルファニルチオカルボニル）スルファニル］ペンタノイックアシッド０．４０ｇ（０．１ｍｍｏｌ）、ｎ－ブチルメタクリレート７．１１ｇ（５０ｍｍｏｌ）、アゾビス（イソブチロニトリル）３３ｍｇ（０．２ｍｍｏｌ）を加え、１，４－ジオキサン５０ｍＬに溶解した。窒素バブリングにより３０分脱気を行った後、７０℃で２４時間反応させた。反応終了後、反応溶媒をロータリーエバポレーターにて減圧留去し、反応溶液を濃縮した。濃縮液をメタノール２５０ｍＬに注ぎ、析出した黄色油状物質を回収して減圧乾燥し、ｎ－ブチルメタクリレート重合体を得た。
　試験管に、前記ｎ－ブチルメタクリレート重合体０．９ｇ（０．３ｍｍｏｌ）、Ｎ－イソプロピルアクリルアミド０．８３ｇ（７．３ｍｍｏｌ）、アゾビスイソブチロニトリル５ｍｇ（０．０３ｍｍｏｌ）を加え、１，４－ジオキサン１５ｍＬに溶解させた。窒素バブリングにより３０分脱気を行った後、６５℃で１７時間反応させた。反応終了後、反応溶媒をアセトンで希釈し、ヘキサン５００ｍＬに注ぎ、析出した固体を回収して減圧乾燥した。また、アセトンに再度溶解させ、純水５００ｍＬに注ぎ、析出した固体を回収して減圧乾燥し、Ｎ－イソプロピルアクリルアミドとｎ－ブチルメタクリレートの共重合体を得た。
　冷却及びピペッティング操作により回収した細胞の未分化率をフローサイトメーターで測定したところ、未分化率は９９．７％であり、分化細胞はほとんど含まれておらず、純度の高いものであった。また、細胞回収率は６３．５％であった。
［実施例１１］
　以下の温度応答性高分子を用い、その他は実施例７と同様にヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株と中胚葉細胞の共培養及び細胞懸濁液の作製を行った。
　試験管に、４－シアノ－４－［（ドデシルスルファニルチオカルボニル）スルファニル］ペンタノイックアシッド０．４０ｇ（０．１ｍｍｏｌ）、ｎ－ブチルメタクリレート７．１１ｇ（５０ｍｍｏｌ）、アゾビス（イソブチロニトリル）３３ｍｇ（０．２ｍｍｏｌ）を加え、１，４－ジオキサン５０ｍＬに溶解した。窒素バブリングにより３０分脱気を行った後、７０℃で２４時間反応させた。反応終了後、反応溶媒をロータリーエバポレーターにて減圧留去し、反応溶液を濃縮した。濃縮液をメタノール２５０ｍＬに注ぎ、析出した黄色油状物質を回収して減圧乾燥し、ｎ－ブチルメタクリレート重合体を得た。
　試験管に、前記ｎ－ブチルメタクリレート重合体０．９ｇ（０．３ｍｍｏｌ）、Ｎ－イソプロピルアクリルアミド０．２６ｇ（２．４ｍｍｏｌ）、アゾビスイソブチロニトリル５ｍｇ（０．０３ｍｍｏｌ）を加え、１，４－ジオキサン１５ｍＬに溶解させた。窒素バブリングにより３０分脱気を行った後、６５℃で１７時間反応させた。反応終了後、反応溶媒をアセトンで希釈し、ヘキサン５００ｍＬに注ぎ、析出した固体を回収して減圧乾燥した。また、アセトンに再度溶解させ、純水５００ｍＬに注ぎ、析出した固体を回収して減圧乾燥し、Ｎ－イソプロピルアクリルアミドとｎ－ブチルメタクリレートの共重合体を得た。
　冷却及びピペッティング操作により回収した細胞の未分化率をフローサイトメーターで測定したところ、未分化率は９８．９％であり、分化細胞はほとんど含まれておらず、純度の高いものであった。また、細胞回収率は５５．０％であった。
［実施例１２］
　実施例４と同様の方法でヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株と中胚葉細胞の共培養を行った。培養後、培地の除去を行わず、そのまま室温で１５分間冷却し、ピペッティングを２０回行うことにより細胞懸濁液を作製した。また、剥離しなかった細胞は基材表面をセルスクレーパーで擦ることにより全ての細胞を剥離し、細胞回収率を求めた。
　冷却及びピペッティング操作により回収した細胞の未分化率をフローサイトメーターで測定したところ、未分化率は９４．５％であり、分化細胞はほとんど含まれておらず、純度の高いものであった。また、細胞回収率は２３．２％であった。
［実施例１３］
　実施例７と同様の方法でヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株と中胚葉細胞の共培養を行った。培養後、培地の除去や細胞間結合乖離液での処理を行わず、そのまま室温で１５分間冷却し、ピペッティング操作を２０回行うことにより細胞懸濁液を作製した。また、実施例４と同様にして細胞回収率を求めた。
　冷却及びピペッティング操作により回収した細胞の未分化率をフローサイトメーターで測定したところ、未分化率は９６．５％であり、分化細胞はほとんど含まれておらず、純度の高いものであった。また、細胞回収率は６８．５％であった。
［実施例１４］
　実施例９と同様の方法でヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株と中胚葉細胞の共培養を行った。培養後、培地の除去や細胞間結合乖離液での処理を行わず、そのまま室温で１５分間冷却し、ピペッティング操作を２０回行うことにより細胞懸濁液を作製した。また、実施例４と同様にして細胞回収率を求めた。
　冷却及びピペッティング操作により回収した細胞の未分化率をフローサイトメーターで測定したところ、未分化率は９８．２％であり、分化細胞はほとんど含まれておらず、純度の高いものであった。また、細胞回収率は６１．９％であった。
［実施例１５］
　実施例１０と同様の方法でヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株と中胚葉細胞の共培養を行った。培養後、培地の除去や細胞間結合乖離液での処理を行わず、そのまま室温で１５分間冷却し、ピペッティング操作を２０回行うことにより細胞懸濁液を作製した。また、実施例４と同様にして細胞回収率を求めた。
　冷却及びピペッティング操作により回収した細胞の未分化率をフローサイトメーターで測定したところ、未分化率は９７．８％であり、分化細胞はほとんど含まれておらず、純度の高いものであった。また、細胞回収率は４４．１％であった。
［実施例１６］
　実施例１１と同様の方法でヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株と中胚葉細胞の共培養を行った。培養後、培地の除去や細胞間結合乖離液での処理を行わず、そのまま室温で１５分間冷却し、ピペッティング操作を２０回行うことにより細胞懸濁液を作製した。また、実施例４と同様にして細胞回収率を求めた。
　冷却及びピペッティング操作により回収した細胞の未分化率をフローサイトメーターで測定したところ、未分化率は９６．６％であり、分化細胞はほとんど含まれておらず、純度の高いものであった。また、細胞回収率は２１．７％であった。
［比較例１］
　基材としてポリスチレンディッシュ（Ｃｏｒｎｉｎｇ　Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ製）を用い、実施例１と同様にして多能性幹細胞を培養した後、リン酸緩衝生理食塩水にエチレンジアミン四酢酸を５×１０－３ｍｏｌ／Ｌの濃度となるように加えた細胞間結合乖離液をディッシュ内に加え、２５℃で２分間処理し、基材表面をセルスクレーパーで擦って細胞懸濁液を作製した。全ての細胞が剥離した。
［比較例２］
　実施例１において１５℃で１０分間冷却を行わず、その他は実施例１と同様に行った。細胞は剥離せず、細胞懸濁液は得られなかった。
［比較例３］
　実施例２において１５℃で１０分間冷却及び基材を２０回叩いて振動を与える操作を行わず、その他は実施例２と同様に行った。細胞は剥離せず、細胞懸濁液は得られなかった。
［比較例４］
　実施例３において約１．２ｍＬ／ｓの流速となるようピペッティング操作を２０回行うことで対流を与える操作を行わず、その他は実施例３と同様に行った。細胞は剥離せず、細胞懸濁液は得られなかった。
［比較例５］
　実施例４と同様にヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株と中胚葉細胞の共培養を行った後、細胞間結合乖離液による処理を実施例４と同様に行い、また基材表面をセルスクレーパーで擦って全ての細胞を剥離して細胞懸濁液を作製した。
　回収した細胞の未分化率をフローサイトメーターで測定したところ、未分化率は８２．２％であり、分化細胞が多く含まれるものであった。
［比較例６］
　実施例４と同様にヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株と中胚葉細胞の共培養を行った後、細胞間結合乖離液による処理は行わず、また基材表面をセルスクレーパーで擦って全ての細胞を剥離して細胞懸濁液を作製した。
　回収した細胞の未分化率をフローサイトメーターで測定したところ、未分化率は８２．２％であり、分化細胞が多く含まれるものであった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　本発明を詳細に、また特定の実施態様を参照して説明したが、本発明の本質と範囲を逸脱することなく、様々な変更や修正を加えることができることは当業者にとって明らかである。
　なお、２０１８年８月１７日に出願された日本特許出願２０１８－１５３５５３号及び、２０１９年７月１日に出願された日本特許出願２０１９－１２２９７９号の明細書、特許請求の範囲及び要約書の全内容をここに引用し、本発明の明細書の開示として、取り入れるものである。

Claims (7)

  1. 以下の（１）～（２）の工程を経ることを特徴とする、未分化の多能性幹細胞を含む細胞懸濁液の製造方法。
    （１）液体培地中で多能性幹細胞を培養基材に接着させ、培養する工程。
    （２）下記［ａ］～［ｃ］の複数の組合せからなる工程、又は下記［ｃ］工程によって、分化細胞の少なくとも一部を基材に接着させたまま、（１）工程で培養した未分化の多能性幹細胞を基材から剥離する工程。
    　［ａ］多能性幹細胞に細胞間結合乖離液を接触させ、細胞間結合を乖離させる工程。
    　［ｂ］未分化の多能性幹細胞が選択的に剥離する外部応力を加える工程。
    　［ｃ］培養基材が温度応答性を有するものであり、未分化の多能性幹細胞が選択的に剥離する温度及び時間で基材を冷却する工程。
    　ここで、未分化の多能性幹細胞が選択的に剥離する［ｂ］工程の外部応力及び［ｃ］工程の温度及び時間は、複数の剥離条件で（２）工程を行い、製造された細胞懸濁液に含まれる細胞の未分化率をフローサイトメーターにより測定し、未分化率が最も高い条件を選択するか、又は培養基材上の細胞を位相差顕微鏡により（２）工程の前後で観察し、未分化の多能性幹細胞が選択的に基材から剥離する条件を選択することにより決定される。
  2. 前記［ａ］工程が、キレート剤を含有する細胞間結合乖離液を１秒～３０分間接触させる工程、又はトリプシンを含有する細胞間結合乖離液を１秒～１０分間接触させる工程であることを特徴とする、請求項１に記載の細胞懸濁液の製造方法。
  3. 前記［ｂ］工程が、０．１～１０ｍＬ／ｓの流量で対流を与える工程であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の細胞懸濁液の製造方法。
  4. 前記［ｃ］工程が、０～３０℃の温度で１秒～６０分間冷却する工程であることを特徴とする、請求項１～３のいずれかに記載の細胞懸濁液の製造方法。
  5. 前記［ｃ］工程の培養基材が、層厚×温度応答性成分の含有割合の積が５～１００ｎｍである高分子による層を有することを特徴とする、請求項１～４のいずれかに記載の細胞懸濁液の製造方法。
  6. 前記［ｃ］工程の培養基材が、温度応答性成分の含有割有が７５ｗｔ％以上であるブロック共重合体であることを特徴とする、請求項１～５のいずれかに記載の細胞懸濁液の製造方法。
  7. 前記［ｂ］及び［ｃ］工程において、多能性幹細胞を液体培地存在下で剥離することを特徴とする、請求項１～６のいずれかに記載の細胞懸濁液の製造方法。
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