JP2019080561A - 多能性幹細胞培養用の多孔質基材及び多能性幹細胞の未分化維持培養方法 - Google Patents
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Abstract
Description
[ラミニン吸着率試験]
リン酸緩衝生理食塩水1mLに対して0.5mg/mLの濃度のラミニン511−E8フラグメント溶液を2〜2.5μL添加した溶液を、多孔質基材の基材面積における単位面積当たりの量で0.2mL/cm2多孔質基材上に滴下し、37℃で24時間静置した時、下記式より求めたラミニン吸着率。
本発明の培養基材は、培養した多能性幹細胞から作製した細胞懸濁液を未分化維持培養又は分化誘導用のスフェロイドの作製に用いるのに好適であることから、継代培養した多能性幹細胞の未分化維持率が70%以上であることが好ましく、80%以上がさらに好ましく、90%以上が特に好ましく、95%以上が最も好ましい。未分化維持率は未分化マーカーを染色した細胞を用いてフローサイトメーターにより測定することができる。
[多孔質基材の細孔の孔径及び細孔密度の測定]
多孔質基材の細孔の観察はレーザー顕微鏡((株)キーエンス製VK−X)により行い、無作為に選んだ20点の細孔の直径を測定することにより孔径を算出した。また、80μmを一辺とする正方形の領域の細孔数を求めることにより、細孔密度を算出した。
[実施例1]
多孔質基材として孔径0.4μm、細孔密度1.9×106個/cm2の円柱状の細孔を有する空隙率0.24%の多孔質膜(Corning Incorporated製、商品名Falcon(登録商標)カルチャーインサート、材質:ポリエチレンテレフタレート)を用い、ヒトiPS細胞201B7株を1300個/cm2の密度で播種し、37℃、CO2濃度5%の環境下で培養した。培地はStemFitAK02N(味の素(株)製)を用いた。また、細胞播種から24時間後までは、前記培地にY−27632(和光純薬工業(株)製)(濃度10μM)とiMatrix−511溶液((株)ニッピ製)(培地に対して2.5μL/mL)を添加し培養した。
[実施例2]
実施例1と同様にして細胞を培養し、細胞播種から144時間後の培地交換の後、細胞播種面の裏面から窒素圧により加圧した。細胞は剥離し、凝集塊として回収出来た。
[実施例3]
試験管に、4−シアノ−4−[(ドデシルスルフォニルチオカルボニル)スルファニル]ペンタノイックアシッド0.40g(0.1mmol)、n−ブチルメタクリレート7.11g(50mmol)、アゾビス(イソブチロニトリル)33mg(0.2mmol)を加え、1,4−ジオキサン50mLに溶解した。窒素バブリングにより30分脱気を行った後、65℃で24時間反応させた。反応終了後、反応溶媒をロータリーエバポレーターにて減圧留去し、反応溶液を濃縮した。濃縮液をメタノール250mLに注ぎ、析出した黄色油状物質を回収して減圧乾燥し、n−ブチルメタクリレート重合体を得た。
[実施例4]
実施例3で合成したN−イソプロピルアクリルアミドとn−ブチルメタクリレートのブロック共重合体をエタノールに溶解させ、0.6wt%溶液とした。孔径0.05μm、孔密度6.0×108個/cm2の細孔を有する空隙率1.2%の多孔質膜(it4ip製、商品名ipPORE、材質:ポリカーボネート)を直径3.2cm、内径1.6cmのリングで挟むことにより固定化した。多孔質膜にプラズマ照射(流入ガスは空気、20Paガス圧下、導電電流20mA、1分間照射)を行い、さらにブロック共重合体を溶解させたエタノール溶液を30μL滴下し、2000rpmで60秒間スピンコートした。室温で1時間乾燥し、ブロック共重合体が被覆された基材を作製した。
[実施例5]
実施例3で合成したN−イソプロピルアクリルアミドとn−ブチルメタクリレートのブロック共重合体をエタノールに溶解させ、0.6wt%溶液とした。孔径0.1μm、孔密度6.0×108個/cm2の細孔を有する空隙率4.7%の多孔質膜(it4ip製、商品名ipPORE、材質:ポリエチレンテレフタレート)を直径3.2cm、内径1.6cmのリングで挟むことにより固定化した。多孔質膜にプラズマ照射(流入ガスは空気、20Paガス圧下、導電電流20mA、1分間照射)を行い、さらにブロック共重合体を溶解させたエタノール溶液を30μL滴下し、2000rpmで60秒間スピンコートした。室温で1時間乾燥し、ブロック共重合体が被覆された基材を作製した。
[実施例6]
実施例3で合成したN−イソプロピルアクリルアミドとn−ブチルメタクリレートのブロック共重合体をエタノールに溶解させ、0.6wt%溶液とした。孔径0.2μm、孔密度5.0×108個/cm2の細孔を有する空隙率15.7%の多孔質膜(it4ip製、商品名ipPORE、材質:ポリエチレンテレフタレート)を直径3.2cm、内径1.6cmのリングで挟むことにより固定化した。多孔質膜にプラズマ照射(流入ガスは空気、20Paガス圧下、導電電流20mA、1分間照射)を行い、さらにブロック共重合体を溶解させたエタノール溶液を30μL滴下し、2000rpmで60秒間スピンコートした。室温で1時間乾燥し、ブロック共重合体が被覆された基材を作製した。
[実施例7]
実施例3で合成したN−イソプロピルアクリルアミドとn−ブチルメタクリレートのブロック共重合体をエタノールに溶解させ、0.6wt%溶液とした。孔径0.4μm、孔密度1.5×108個/cm2の細孔を有する空隙率18.8%の多孔質膜(it4ip製、商品名ipPORE、材質:ポリエチレンテレフタレート)を直径3.2cm、内径1.6cmのリングで挟むことにより固定化した。多孔質膜にプラズマ照射(流入ガスは空気、20Paガス圧下、導電電流20mA、1分間照射)を行い、さらにブロック共重合体を溶解させたエタノール溶液を30μL滴下し、2000rpmで60秒間スピンコートした。室温で1時間乾燥し、ブロック共重合体が被覆された基材を作製した。
[実施例8]
実施例3で合成したN−イソプロピルアクリルアミドとn−ブチルメタクリレートのブロック共重合体をエタノールに溶解させ、0.6wt%溶液とした。孔径0.45μm、孔密度4.0×106個/cm2の細孔を有する空隙率0.6%の多孔質膜(it4ip製、商品名ipPORE、材質:ポリエチレンテレフタレート)を直径3.2cm、内径1.6cmのリングで挟むことにより固定化した。多孔質膜にプラズマ照射(流入ガスは空気、20Paガス圧下、導電電流20mA、1分間照射)を行い、さらにブロック共重合体を溶解させたエタノール溶液を30μL滴下し、2000rpmで60秒間スピンコートした。室温で1時間乾燥し、ブロック共重合体が被覆された基材を作製した。
[実施例9]
実施例3で合成したN−イソプロピルアクリルアミドとn−ブチルメタクリレートのブロック共重合体をエタノールに溶解させ、0.6wt%溶液とした。孔径0.6μm、孔密度4.0×107個/cm2の細孔を有する空隙率11.3%の多孔質膜(it4ip製、商品名ipPORE、材質:ポリカーボネート)を直径3.2cm、内径1.6cmのリングで挟むことにより固定化した。多孔質膜にプラズマ照射(流入ガスは空気、20Paガス圧下、導電電流20mA、1分間照射)を行い、さらにブロック共重合体を溶解させたエタノール溶液を30μL滴下し、2000rpmで60秒間スピンコートした。室温で1時間乾燥し、ブロック共重合体が被覆された基材を作製した。
[実施例10]
実施例3で合成したN−イソプロピルアクリルアミドとn−ブチルメタクリレートのブロック共重合体をエタノールに溶解させ、0.6wt%溶液とした。孔径0.8μm、孔密度4.0×107個/cm2の細孔を有する空隙率20.1%の多孔質膜(it4ip製、商品名ipPORE、材質:ポリエチレンテレフタレート)を直径3.2cm、内径1.6cmのリングで挟むことにより固定化した。多孔質膜にプラズマ照射(流入ガスは空気、20Paガス圧下、導電電流20mA、1分間照射)を行い、さらにブロック共重合体を溶解させたエタノール溶液を30μL滴下し、2000rpmで60秒間スピンコートした。室温で1時間乾燥し、ブロック共重合体が被覆された基材を作製した。
[実施例11]
実施例3で合成したN−イソプロピルアクリルアミドとn−ブチルメタクリレートのブロック共重合体をエタノールに溶解させ、0.6wt%溶液とした。孔径2μm、孔密度3.0×106個/cm2の細孔を有する空隙率9.4%の多孔質膜(it4ip製、商品名ipPORE、材質:ポリエチレンテレフタレート)を直径3.2cm、内径1.6cmのリングで挟むことにより固定化した。多孔質膜にプラズマ照射(流入ガスは空気、20Paガス圧下、導電電流20mA、1分間照射)を行い、さらにブロック共重合体を溶解させたエタノール溶液を30μL滴下し、2000rpmで60秒間スピンコートした。室温で1時間乾燥し、ブロック共重合体が被覆された基材を作製した。
[実施例12]
実施例3で合成したN−イソプロピルアクリルアミドとn−ブチルメタクリレートのブロック共重合体をエタノールに溶解させ、0.6wt%溶液とした。孔径5μm、孔密度4.0×105個/cm2の細孔を有する空隙率7.9%の多孔質膜(it4ip製、商品名ipPORE、材質:ポリカーボネート)を直径3.2cm、内径1.6cmのリングで挟むことにより固定化した。多孔質膜にプラズマ照射(流入ガスは空気、20Paガス圧下、導電電流20mA、1分間照射)を行い、さらにブロック共重合体を溶解させたエタノール溶液を30μL滴下し、2000rpmで60秒間スピンコートした。室温で1時間乾燥し、ブロック共重合体が被覆された基材を作製した。
[実施例13]
実施例3で合成したN−イソプロピルアクリルアミドとn−ブチルメタクリレートのブロック共重合体をエタノールに溶解させ、0.6wt%溶液とした。孔径10μm、孔密度1.0×105個/cm2の細孔を有する空隙率7.9%の多孔質膜(it4ip製、商品名ipPORE、材質:ポリエチレンテレフタレート)を直径3.2cm、内径1.6cmのリングで挟むことにより固定化した。多孔質膜にプラズマ照射(流入ガスは空気、20Paガス圧下、導電電流20mA、1分間照射)を行い、さらにブロック共重合体を溶解させたエタノール溶液を30μL滴下し、2000rpmで60秒間スピンコートした。室温で1時間乾燥し、ブロック共重合体が被覆された基材を作製した。
[実施例14]
実施例3で合成したN−イソプロピルアクリルアミドとn−ブチルメタクリレートのブロック共重合体をエタノールに溶解させ、0.6wt%溶液とした。孔径0.2μmの細孔を有する多孔質膜(帝人(株)製、商品名ミライム、材質:ポリエチレン)を直径3.2cm、内径1.6cmのリングで挟むことにより固定化した。多孔質膜にプラズマ照射(流入ガスは空気、20Paガス圧下、導電電流20mA、1分間照射)を行い、さらにブロック共重合体を溶解させたエタノール溶液を30μL滴下し、2000rpmで60秒間スピンコートした。室温で1時間乾燥し、ブロック共重合体が被覆された基材を作製した。
[実施例15]
実施例3で作製したブロック共重合体が被覆された基材に培地StemFitAK02N(味の素(株)製)を0.2mL/cm2加え、さらにヒトiPS細胞201B7株を260個/cm2、iMatrix−511溶液((株)ニッピ製)を2.5μL/mLの濃度で加えた。37℃、CO2濃度5%の環境下で培養した。また、細胞播種から24時間後までは、培地にY−27632(和光純薬工業(株)製)(濃度10μM)を添加した。
[比較例1]
培養基材として非多孔質基材であるポリスチレンシャーレを用い、その他は実施例1と同様にして培養を行った。細胞播種から144時間後の培地交換の後、培地にピペッティングを行うことで対流を発生させたが、細胞は剥離せず、回収することはできなかった。
[比較例2]
基材にブロック共重合体を被覆せず、直径3.5cmのディッシュ(Corning Incorporated製、材質:ポリスチレン)をそのまま用いた。
[継代培養及び未分化維持率評価]
前記ブロック共重合体が被覆された基材に培地StemFitAK02N(味の素(株)製)を0.2mL/cm2加え、さらにヒトiPS細胞201B7株を1300個/cm2、iMatrix−511溶液((株)ニッピ製)を2.5μL/mLの濃度で加えた。37℃、CO2濃度5%の環境下で培養した。また、細胞播種から24時間後までは、培地にY−27632(和光純薬工業(株)製)(濃度10μM)を添加した。
11 平坦部
12 細孔
20 培地
Claims (12)
- 平坦部及び細孔を有する平膜であり、前記細孔の孔径が培養する多能性幹細胞よりも小さなものであることを特徴とする、多能性幹細胞培養用の多孔質基材。
- 細孔の孔径が、0.01〜10μmであることを特徴とする、請求項1に記載の多能性幹細胞培養用の多孔質基材。
- 空隙率が、0.01〜60%であることを特徴とする、請求項1又は請求項2に記載の多能性幹細胞培養用の多孔質基材。
- 細孔が、独立した円柱状の形状であることを特徴とする、請求項1〜請求項3のいずれかに記載の多孔質基材。
- 多孔質基材が、表面に水に対する応答温度が0℃〜50℃の範囲にある温度応答性高分子による層を有することを特徴とする、請求項1〜請求項4のいずれかに記載の多能性幹細胞培養用の多孔質基材。
- 多孔質基材が、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート及びポリカーボネートからなる群から選択される少なくとも1種類の材料であることを特徴とする請求項1〜請求項5のいずれかに記載の多能性幹細胞培養用の多孔質基材。
- 多能性幹細胞が人工多能性幹細胞であることを特徴とする、請求項1〜請求項6のいずれかに記載の多能性幹細胞培養用の多孔質基材。
- マトリゲル、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン及びコラーゲンからなる群から選択される少なくとも1種類の生体由来物質が表面に吸着していることを特徴とする、請求項1〜請求項7のいずれかに記載の多能性幹細胞培養用の多孔質基材。
- 多孔質基材を用いる細胞培養方法であって、下記[1]〜[3]工程を経ることを特徴とする多能性幹細胞の未分化維持培養方法。
[1]請求項1〜7のいずれかに記載の多孔質基材に、マトリゲル、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン及びコラーゲンからなる群から選択される少なくとも1種類の生体由来物質を添加する工程、及び、多孔質基材に多能性幹細胞を播種する工程。
[2]前記多孔質基材に播種された多能性幹細胞を増殖させる工程。
[3]前記増殖させた多能性幹細胞を外部刺激によって多孔質基材から剥離する工程。 - 前記[3]工程が、培養液に対流を生じさせる工程、多孔質基材の細胞播種面の裏面に圧力を加える工程及び多孔質基材に振動を加える工程からなる群から選択される少なくとも1種類の工程であることを特徴とする、請求項10に記載の多能性幹細胞の未分化維持培養方法。
- 前記[1]工程の多孔質基材が、請求項5に記載の多孔質基材であり、前記[3]工程が、培養液を冷却する工程であることを特徴とする、請求項10又は請求項11に記載の多能性幹細胞の未分化維持培養方法。
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