WO2022230734A1 - 細胞培養基材及びその製造方法、多能性幹細胞の分化誘導方法、並びに細胞培養キット - Google Patents

細胞培養基材及びその製造方法、多能性幹細胞の分化誘導方法、並びに細胞培養キット Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a cell culture substrate, a method for producing the same, a method for inducing differentiation of pluripotent stem cells, and a cell culture kit.
  • Pluripotent stem cells such as embryonic stem cells (ES cells) and induced pluripotent stem cells (iPS cells) are cells that have the ability to differentiate into various tissues of the body (pluripotency), and are widely used in the fields of regenerative medicine and innovation. It has received a great deal of attention as a cell source for drug screening. In order to apply pluripotent stem cells to regenerative medicine and drug discovery screening, it is necessary to differentiate pluripotent stem cells into target cells. be. In addition, although pluripotent stem cells can differentiate into various cells, it is known that the optimal size of cell aggregates differs depending on the type of cells after differentiation. It is desirable to create uniform cell clumps.
  • a conventionally known method is to allow pluripotent stem cells to spontaneously form aggregates by using a substrate to which pluripotent stem cells do not adhere (see, for example, Patent Document 1. ). Although this method is excellent in mass productivity of cell aggregates, there is a problem that cell aggregates of uniform size cannot be obtained.
  • Patent Document 2 As a method of forming cell aggregates of uniform size, a method of using a cell culture substrate having fine unevenness on the surface is known (see, for example, Patent Document 2).
  • a cell culture substrate provided with fine unevenness as disclosed in Patent Document 2 has a problem that it is not suitable for mass production and is not suitable for use in forming a large amount of cell aggregates.
  • cells are forcibly aggregated within fine unevenness, there is a problem that dead cells are likely to be mixed into the cell aggregates.
  • air bubbles are likely to be trapped in the fine unevenness on the surface, and there is a problem that it is necessary to remove the air bubbles before starting the culture.
  • the inventors have found. In order to remove air bubbles, it is usually necessary to repeatedly aspirate and discharge the culture medium using a pipettor, resulting in poor workability.
  • the present invention comprises a substrate and a layer containing a hydrophilic polymer having a layer thickness of 5 to 2000 nm covering at least part of the surface of the substrate, and the hydrophilic polymer is a phosphorylcholine group or a hydroxyl group. and having the following (A) region and the following (B) region, and the uneven height at the boundary between the (A) region and the (B) region is 1 to 500 nm.
  • A An island-shaped region with an area of 0.001 to 5 mm 2 having cell adhesion and cell proliferation
  • B A region adjacent to (A) region and having no cell adhesion or cell proliferation
  • the present invention also includes the steps of (1) coating at least part of the surface of a substrate with a composition containing a UV-reactive hydrophilic polymer to form a layer containing the hydrophilic polymer, (2) A step of irradiating the layer containing the hydrophilic polymer with UV to fix the layer containing the hydrophilic polymer on the surface of the substrate, and (3) the surface of the layer containing the fixed hydrophilic polymer.
  • the method for producing the above cell culture substrate comprising the step of performing plasma treatment on a part of and forming the (A) region in the plasma-treated part.
  • the present invention also provides (1′) a base material formed from a polymer containing an aromatic hydrocarbon group in a repeating unit, performing a plasma treatment on the surface of the base material, and applying the above ( A) forming a region; (2′) coating at least part of the surface of the substrate with a composition containing a UV-reactive hydrophilic polymer to form a layer containing the hydrophilic polymer; (3′) a step of irradiating a portion of the layer containing the hydrophilic polymer with UV to fix a portion of the layer containing the hydrophilic polymer on the surface of the substrate; (4′) A method for producing a cell culture substratum, comprising a step of washing the hydrophilic polymer with a solvent to dissolve the hydrophilic polymer that is not immobilized on the surface and removing it from the surface of the substratum. Regarding.
  • the present invention further comprises (i) the step of seeding pluripotent stem cells on the cell culture substrate, (ii) culturing the pluripotent stem cells, and forming a hemisphere with a height/diameter ratio of 0.2 to 0.8.
  • the present invention relates to a method for inducing differentiation of pluripotent stem cells, comprising the steps of forming a cell aggregate having a shape and (iii) inducing differentiation of the cell aggregate to form a cell aggregate of trigerm layer cells.
  • the present invention relates to a cell culture kit comprising the cell culture substrate, a block copolymer containing a water-insoluble block segment and a temperature-responsive block segment, or a coating agent containing the block copolymer.
  • a cell culture substrate that can form cell aggregates, can increase the survival rate of cells in the cell aggregates, and eliminates the need for air bubble removal during culture, and its A manufacturing method can be provided. According to the present invention, it is also possible to provide a method for inducing differentiation of pluripotent stem cells using the cell culture substrate.
  • FIG. 1 is a schematic diagram (cross-sectional view) of a cell culture substratum according to one embodiment.
  • FIG. 1 is a schematic diagram (perspective view) of a substrate having a layer containing a hydrophilic polymer formed on the surface thereof after step (1) in the manufacturing method according to one embodiment.
  • FIG. 3 is a schematic diagram (perspective view) of a cell culture substratum after step (3) in the manufacturing method according to one embodiment.
  • Fig. 2 is a schematic diagram (perspective view) of a cell culture substratum after step (4) in the production method according to one embodiment.
  • Fig. 4 shows phase-contrast microscope images of cells on "day 0 of differentiation", "day 43 of differentiation” and “day 64 of differentiation” in a test of inducing differentiation of human iPS cells into intestinal epithelial cells (Example 8).
  • cell aggregate means a three-dimensional aggregate of cells formed by aggregating a plurality of cells.
  • the shape of the three-dimensional aggregate may be an ellipsoidal shape such as a sphere, or may be a shape such as a hemispherical shape. These shapes may be shapes with gaps formed by folding sheet-like cells, or hollow shapes.
  • temperature responsiveness indicates that the degree of hydrophilicity/hydrophobicity changes with temperature changes. Furthermore, the boundary temperature at which the degree of hydrophilicity/hydrophobicity changes is referred to as "response temperature”.
  • biologically derived substance means a substance that exists in the body of an organism, and a chemically synthesized substance that is equivalent to the said substance.
  • Substances existing in living organisms may be natural products, or may be artificially synthesized by genetic recombination technology or the like.
  • substances derived from living organisms for example, nucleic acids, proteins and polysaccharides, which are basic materials that make up living organisms, and nucleotides, nucleosides, amino acids, and various sugars that are constituents thereof, as well as lipids, vitamins, and hormones. is mentioned.
  • cell adhesiveness indicates ease of adhesion to a substrate or a cell culture substrate at a culture temperature
  • has cell adhesiveness means that cells adhere to a substrate or a cell culture substrate at a culture temperature. It shows that it is possible to adhere to a cell culture substrate directly or via a biological substance.
  • having no cell adhesiveness means that cells cannot adhere to the substrate or the cell culture substrate at the culture temperature.
  • cell proliferative indicates the ease with which cells proliferate at the culture temperature, and “having cell proliferative properties” indicates that cells can proliferate at the culture temperature. Moreover, “having no cell proliferation” indicates that cells cannot proliferate at the culture temperature. “High cell proliferative” means proliferating to a larger number of cells when compared during the same culture period.
  • tridermal cells means at least one selected from the group consisting of endoderm cells, ectoderm cells and mesoderm cells.
  • the cell culture substratum according to the present embodiment comprises a substrate and a layer containing a hydrophilic polymer with a layer thickness of 5 to 2000 nm covering at least part of the surface of the substrate.
  • the hydrophilic polymer contains a phosphorylcholine group or a hydroxyl group.
  • the cell culture substratum according to the present embodiment has the following (A) region and the following (B) region, and the uneven height at the boundary between the (A) region and the (B) region is 1 to 500 nm. .
  • A An island-shaped region with an area of 0.001 to 5 mm 2 having cell adhesiveness and cell proliferation
  • B A region adjacent to the (A) region and having no cell proliferation
  • FIG. 1 is a schematic diagram (cross-sectional view) of a cell culture substrate according to one embodiment.
  • the cell culture substratum 10 shown in FIG. 1 comprises a substrate 1 and a layer 2 containing a hydrophilic polymer covering the surface of the substrate 1 (the layer thickness is, for example, 5 to 2000 nm).
  • a and B indicate the (A) area and the (B) area, respectively.
  • H indicates the height of unevenness at the boundary between the (A) region and the (B) region.
  • the layer thickness of the layer 2 containing the hydrophilic polymer is defined as the thickness of the area (B) (the area indicated by B in FIG.
  • the surface of the (A) region is a layer containing a hydrophilic polymer, but the surface of the (A) region is not limited to this. may be the base material 1.
  • the substrate used for the cell culture substrate according to the present embodiment is not particularly limited, but is selected from the group consisting of polystyrene, polyethylene, polyethylene terephthalate, polycarbonate, cycloolefin polymer, cellulose acetate, nitrocellulose and polyvinylidene fluoride. It is preferably formed from at least one type, more preferably formed from at least one type selected from the group consisting of polystyrene, polyethylene terephthalate, polycarbonate and cycloolefin polymer, polystyrene, More preferably, it is formed from at least one selected from polyethylene terephthalate and polycarbonate, and most preferably from polystyrene or polycarbonate.
  • cycloolefin polymers include ZEONEX (manufactured by Nippon Zeon Co., Ltd.), ZEONOR (manufactured by Nippon Zeon Co., Ltd.), and ARTON (manufactured by JSR Corporation).
  • the refractive index of the substrate measured at the D-line is 1.4 to 1.6. 1.45 to 1.6 is more preferred, and 1.5 to 1.55 is particularly preferred.
  • the thickness of the substrate is preferably 0.5 mm or less, more preferably 0.4 mm or less, particularly preferably 0.3 mm or less, and most preferably 0.2 mm or less.
  • the thickness of the substrate is preferably 0.01 mm or more, more preferably 0.05 mm or more, because it is suitable for suppressing the entire observation range from being out of focus due to bending of the substrate during microscopic observation. , 0.1 mm or more is particularly preferred, and 0.15 mm or more is most preferred.
  • the refractive index and thickness of the substrate measured by the D line are preferably 1.4 to 1.6 and 0.01 mm to 0.5 mm, respectively, and 1.45 to 1.6. and 0.05 mm to 0.4 mm, more preferably 1.45 to 1.55 and 0.1 mm to 0.3 mm, respectively, and 1.5 to 1.55 and 0.3 mm. It is particularly preferable to be 15 mm or more and 0.2 mm or less. When the refractive index and thickness of the base material are within these ranges, the phase contrast image of cells becomes clearer.
  • excitation wavelengths 350 nm, 488 nm, and 647 nm (when irradiated with excitation light having these wavelengths)
  • the fluorescence intensity (autofluorescence intensity) of the substrate is preferably smaller than the fluorescence intensity (autofluorescence intensity) of a 1.2 mm-thick polystyrene plate excited with light having the same excitation wavelength.
  • Fluorescent dyes excited at excitation wavelengths of 350 nm, 488 nm, and 647 nm are frequently used in fluorescence observation of cells. When the autofluorescence intensity of the substrate at these wavelengths is below a certain value, a clear fluorescence image of cells can be obtained.
  • the shape of the substrate is not particularly limited, and may be a planar shape such as a plate or film, or may be a shape such as a fiber, porous particles, porous membrane, hollow fiber, or the like. Moreover, the shape of the substrate may be the shape of a container generally used for cell culture (cell culture dish such as Petri dish, flask, plate, bag, etc.). From the viewpoint of easiness of culture operation, the shape of the substrate is preferably a planar shape such as a plate or film, or a planar porous membrane shape.
  • the layer thickness of the layer containing the hydrophilic polymer is 5 to 2000 nm.
  • the layer thickness of the hydrophilic polymer layer is 5 to 2000 nm, it is possible to adhere and proliferate cells only to the (A) region, and to collect cells to the (A) region by cell migration. It is easy to use and can increase the cell viability of cell aggregates. If the layer thickness is less than 5 nm, the cells grow also in the region (B), making it impossible to form cell aggregates. When the layer thickness exceeds 2000 nm, cells cannot migrate, and thus the viability of cells contained in cell aggregates is reduced.
  • the "layer thickness" of the hydrophilic polymer layer refers to the interface ((A) area ) indicates the length in the out-of-plane direction.
  • a cross-sectional image is measured by a transmission electron microscope using an ultra-thin section of the cell culture substrate prepared by a microtome, and the distance of 10 randomly selected points is measured and averaged. can be calculated by In addition, when the layer thickness is in the range of 10 nm or less, it can be measured using an ellipsometer.
  • the layer thickness is more preferably 10 nm or more, still more preferably 50 nm or more, and most preferably 100 nm or more, since it is suitable for suppressing adhesion of cells to the region (B).
  • the layer thickness is more preferably 1000 nm or less, more preferably 500 nm or less, because it is suitable for increasing the cell viability of the cell aggregate by collecting cells in the (A) region due to cell migration. is more preferable, and 200 nm or less is most preferable.
  • a hydrophilic polymer contains a phosphorylcholine group or a hydroxyl group.
  • a phosphorylcholine group or a hydroxyl group in the hydrophilic polymer, it is possible to make the region coated with the hydrophilic polymer a region to which cells do not adhere.
  • the region can be made into a region having cell adhesiveness and cell proliferation property simply by performing weak plasma treatment for a short period of time. Therefore, it is difficult for hydrolyzed polymer decomposition products to contaminate cells.
  • the type of hydrophilic polymer is not particularly limited except that it contains a phosphorylcholine group or a hydroxyl group.
  • BIOSURFINE (R)-AWP Toyo Gosei Kogyo Co., Ltd.
  • commercially available substrates coated with a hydrophilic polymer include PrimeSurface (R) (manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd.), EZ-BindShut (R) (manufactured by AGC Techno Glass Co., Ltd.), and EZ-BindShutII. (R) (manufactured by AGC Techno Glass Co., Ltd.) and the like can be preferably used.
  • the hydrophilic polymer preferably contains a compound represented by the following general formula (1), a compound represented by the following general formula (2), or a compound represented by the following general formula (3).
  • R 1 and R 2 each independently represent a hydrogen atom or a methyl group
  • R 3 represents a hydrogen atom or any organic group
  • m and n each independently represent a positive integer. .
  • R 4 , R 5 and R 6 each independently represent a hydrogen atom or a methyl group
  • R 7 represents a hydrogen atom or any organic group
  • x, y and z each independently Indicates a positive integer.
  • R 8 R and 9 each independently represent a hydrogen atom or a methyl group
  • R 10 represents a hydrogen atom or any organic group
  • a and b each independently represent a positive integer. .
  • R 3 R 7 and R 10 are suitable for immobilizing a hydrophilic polymer on a substrate. Therefore, they are preferably hydrophobic groups or UV-reactive functional groups, respectively.
  • the hydrophobic group linear or cyclic alkyl groups such as methyl group, ethyl group, propyl group, butyl group and cyclohexyl group can be preferably used.
  • the UV-reactive functional group includes an azide group, an acrylate group, a methacrylate group, an epoxy group, and the like, and the azide group can be preferably used.
  • the (A) area is an island-shaped area having cell adhesiveness and cell proliferation and having an area of 0.001 to 5 mm 2 . Due to the island-shaped region having an area of 0.001 to 5 mm 2 , cell aggregates having a uniform particle size can be formed when the cells are cultured.
  • the area is preferably 0.005 to 1 mm 2 , and more preferably 0.01 to 0.5 mm 2 . Preferably, an area of 0.015 to 0.25 mm 2 is more preferred, and an area of 0.02 to 0.2 mm 2 is most preferred.
  • the (A) region is an island-shaped region means that the (A) region exists independently of regions other than the (A) region. Since the (A) region has an island-like shape having cell adhesion and cell proliferation properties, viable cells are concentrated in the (A) region, so that cell aggregates can be produced. (A) If the region is not island-shaped, for example, if it has a striped structure, cell aggregates cannot be produced.
  • the shape of the islands is not particularly limited, and can be appropriately set according to the shape of the target cell aggregate. can be mentioned.
  • the shape of the islands is preferably circular, elliptical, or polygonal, more preferably circular, elliptical, or rectangular, and more preferably circular, elliptical, or square, because it is suitable for producing cell aggregates having a shape close to a sphere. is more preferred, and a circle or an ellipse is most preferred.
  • the standard deviation/average area of the area (A) is preferably 80% or less, more preferably 50% or less. It is preferably 20% or less, more preferably 5% or less.
  • the aspect ratio of the island shape is preferably 5 or less, more preferably 2 or less, still more preferably 1.5 or less, further preferably 1.1, since it is suitable for producing cell aggregates having a shape close to a sphere.
  • the “aspect ratio” indicates the ratio of the maximum diameter (major diameter) to the minimum diameter (minor diameter) of the shape.
  • the area of the region (A) is 0.005 to 0.005. 2 mm 2
  • the number of (A) regions is preferably 200 to 1000/cm 2 based on the total area of (A) regions and (B) regions
  • the area of (A) regions is preferably more preferably 0.01 to 0.15 mm 2 and the number of (A) regions is 250 to 800/cm 2 based on the total area of (A) regions and (B) regions
  • the area of (A) regions is 0.02 to 0.1 mm 2
  • the number of (A) regions is 300 to 600/cm 2 based on the total area of (A) regions and (B) regions. It is more preferable that the area of (A) regions is 0.03 to 0.05 mm 2 and the number of (A) regions is based on the total area of (A) regions and (B) regions,
  • the area of the (A) region is 0.2 to 2 mm 2 and ( A)
  • the number of regions is preferably 3 to 15/cm 2 based on the total area of (A) regions and (B) regions, and the area of (A) regions is 0.3 to 1.5 mm 2 , and the number of (A) regions is 4 to 12/cm 2 based on the total area of (A) regions and (B) regions, and the area of (A) regions is more preferably 0.4 to 1 mm 2 and the number of (A) regions is 5 to 10/cm 2 based on the total area of (A) regions and (B) regions; )
  • the area of the regions is 0.5 to 0.7 mm 2 and the number of (A) regions is 6 to 8/cm 2 based on the total area of the (A) regions and (B) regions. is most preferred.
  • the minimum distance between the (A) regions is preferably 500 to 10000 ⁇ m, more preferably 1000 to 8000 ⁇ m, because it is suitable for increasing the oxygen concentration around the cells and increasing the viability of cell aggregates. More preferably 2000 to 5000 ⁇ m, most preferably 3000 to 4000 ⁇ m.
  • the region (A) region for example, after forming a layer containing a hydrophilic polymer on the substrate surface, part of the surface of the layer containing the hydrophilic polymer is modified by corona treatment, UV treatment or plasma treatment. can be formed by The modification is preferably performed by plasma treatment. Since the (A) region is a region in which the surface of the layer containing the hydrophilic polymer is modified by plasma treatment or the like, the (A) region becomes a region having cell adhesiveness and cell proliferation. Since the region (A) can be patterned by short-time plasma treatment or the like, the mass productivity of cell culture substrates can be enhanced.
  • the ratio of the peak intensity of 287 eV in the C1s spectrum / the peak intensity of 285 eV in the C1s spectrum of the XPS measurement for the region (B) It is preferably 0.05 or more greater than the ratio of peak intensity at 287 eV/peak intensity at 285 eV.
  • the difference in cell proliferation between the (A) region and the (B) region can be increased, it is possible to grow a large number of cells in the (A) region, and evenly in the (A) region. It becomes easier to form large cell aggregates.
  • the ratio of peak intensity at 287 eV/peak intensity at 285 eV in the C1s spectrum of XPS measurement for region (A) is It is more preferably 0.07 or more, still more preferably 0.1 or more, and most preferably 0.15 or more than the ratio of peak intensity at 287 eV/peak intensity at 285 eV in the C1s spectrum.
  • the method for adjusting the ratio of peak intensity at 287 eV/peak intensity at 285 eV in the C1s spectrum of XPS measurement to the above range is not particularly limited, but is formed on the surface of the base material and includes a layer containing a hydrophilic polymer.
  • a method of applying plasma treatment, corona treatment, UV treatment, or the like to only a portion (the portion to be the (A) region) is preferred, and a method of applying plasma treatment or corona treatment is more preferred, and a method of applying plasma treatment is preferred. Especially preferred.
  • a mask prepared by laser processing is used to cover the layer containing a hydrophilic polymer formed on the surface of the base material, and the mask is formed.
  • a method of applying a plasma treatment or the like from above can be mentioned.
  • Conditions such as plasma intensity and plasma irradiation time can be appropriately adjusted so that the difference falls within the range described above. It becomes easy to fall within the range described above.
  • the (A) region may have temperature responsiveness because it is suitable for exfoliating the cultured cell aggregates.
  • the response temperature is preferably 50° C. or less, and 35° C. or less because the cells can be cultured at a temperature close to body temperature when culturing cells on the cell culture substrate. is more preferred.
  • the response temperature is particularly preferably 25° C. or lower because it is suitable for suppressing detachment of cells when performing operations such as medium exchange during culture.
  • the response temperature is preferably 4° C. or higher, more preferably 10° C. or higher, and further 15° C. or higher. preferable.
  • a highly temperature responsive It may further comprise a layer containing molecules.
  • a layer containing a temperature-responsive polymer with a layer thickness of 1 to 100 nm, the properties of the regions (A) and (B) formed on the surface of the layer containing the hydrophilic polymer are not impaired.
  • (A) can be provided with temperature responsiveness. Since it is suitable for imparting temperature responsiveness to the (A) region without impairing the respective characteristics of the (A) region and the (B) region, the layer thickness of the layer containing the temperature responsive polymer is 3. ⁇ 50 nm is more preferred, 5 to 40 nm is even more preferred, and 10 to 35 nm is most preferred.
  • a suitable layer thickness of the temperature-responsive polymer that can be collected by exfoliating the cells after culturing without impairing cell proliferation properties varies depending on the cells to be cultured. It is possible to appropriately adjust within the range.
  • the temperature-responsive polymer is preferably a block copolymer having water-insoluble block segments and temperature-responsive block segments.
  • a block copolymer As the temperature-responsive polymer, it is possible to increase the mass productivity of the cell culture substrate and to suppress contamination of the produced cell aggregates with the temperature-responsive polymer.
  • the structural unit ratio of the temperature-responsive block segment contained in the temperature-responsive polymer is preferably 70 wt% or more, and 80 wt% or more, because it is suitable for rapidly detaching cell aggregates from the cell culture substrate. More preferably, 90 wt % or more is particularly preferred, and 92 wt % or more is most preferred.
  • the temperature-responsive polymer is a block copolymer having a water-insoluble block segment and a temperature-responsive block segment
  • a solution containing the temperature-responsive polymer is dropped onto the surface of the cell culture substrate and dried.
  • Temperature responsiveness can be imparted to the surface of the cell culture substratum by a simple method of
  • the layer formed at this time has the preferred layer thickness of the temperature-responsive polymer described above, even if the entire surface of the layer containing the hydrophilic polymer is coated with the temperature-responsive polymer, the above (A ) region and (B) region are less likely to impair their respective properties.
  • a researcher who conducts culture When using a cell culture kit having a cell culture substrate of the present invention and a coating agent containing a temperature-responsive polymer that is a block copolymer or the block copolymer, a researcher who conducts culture
  • the layer thickness of the temperature-responsive polymer can be easily adjusted according to the type.
  • the coating agent may contain a solvent.
  • Solvents that can be contained in the coating agent include, for example, water, organic solvents, and mixtures thereof.
  • organic solvents include alcohols such as methanol, ethanol, 1-propanol, 2-propanol, 1-butanol; acetonitrile, formamide, N,N-dimethylformamide, dimethylsulfoxide, tetrahydrofuran, 1,4-dioxane, methyl ethyl ketone. etc. can be mentioned. It is preferable to use a mixed solvent of water and alcohols because it is suitable for making the film thickness of the coating uniform.
  • the content of the block copolymer having a water-insoluble block segment and a temperature-responsive block segment is 0.1 to 50% by weight, 0.2 to 10% by weight, or 0.2% to 10% by weight, based on the total weight of the coating agent. It can be 5-5% by weight.
  • the coating agent may contain components other than the block copolymer having the water-insoluble block segment and the temperature-responsive block segment and the solvent.
  • Other components include components for enhancing cell adhesiveness, such as polymers consisting only of water-insoluble block segments.
  • Examples of monomer units constituting the temperature-responsive block segment include (meth)acrylamide compounds such as acrylamide and methacrylamide; N,N-diethylacrylamide, N-ethylacrylamide, Nn-propylacrylamide, Nn - propylmethacrylamide, N-isopropylacrylamide, N-isopropylmethacrylamide, N-cyclopropylacrylamide, N-cyclopropylmethacrylamide, Nt-butylacrylamide, N-ethoxyethylacrylamide, N-ethoxyethylmethacrylamide, N - N-alkyl-substituted (meth)acrylamide derivatives such as tetrahydrofurfuryl acrylamide and N-tetrahydrofurfuryl methacrylamide; N,N-dimethyl(meth)acrylamide, N,N-ethylmethylacrylamide, N,N-diethylacrylamide and the like N,N-dialkyl-sub
  • Examples of monomer units constituting the water-insoluble block segment include n-butyl acrylate, n-butyl methacrylate, isobutyl acrylate, isobutyl methacrylate, t-butyl acrylate, t-butyl methacrylate, n-hexyl acrylate, and n-hexyl.
  • Methacrylate, n-octyl acrylate, n-octyl methacrylate, n-decyl acrylate, n-decyl methacrylate, n-dodecyl acrylate, n-dodecyl methacrylate, n-tetradecyl acrylate, n-tetradecyl methacrylate and the like can be mentioned.
  • those having a reactive group are preferable.
  • structures having an aromatic ring are preferred because they are suitable for increasing cell proliferation, such as 2-hydroxyphenyl acrylate, 2-hydroxyphenyl methacrylate, 3-hydroxyphenyl acrylate, 3-hydroxyphenyl methacrylate, 4 - hydroxyphenyl acrylate, 4-hydroxyphenyl methacrylate, N-(2-hydroxyphenyl) acrylamide, N-(2-hydroxyphenyl) methacrylamide, N-(3-hydroxyphenyl) acrylamide, N-(3-hydroxyphenyl) Methacrylamide, N-(4-hydroxyphenyl)acrylamide, N-(4-hydroxyphenyl)methacrylamide, styrene and the like can be mentioned.
  • the water-insoluble block segment may also contain repeating units that control the response temperature of the block copolymer.
  • the repeating unit that controls the response temperature of the block copolymer include hydrophilic or hydrophobic components, and are not particularly limited. -Those having an amino group such as diethylaminoethyl acrylate, 2-diethylaminoethyl methacrylate, N-[3-(dimethylamino)propyl]acrylamide; N-(3-sulfopropyl)-N-methacryloyloxyethyl-N,N - with betaine such as dimethylammonium betaine, N-methacryloyloxyethyl-N, N-dimethylammonium- ⁇ -N-methylcarboxybetaine; hydroxyethyl acrylate, hydroxyethyl methacrylate, N-(2-hydroxyethyl)acrylamide, Polyethylene glycol monoacrylate, polyethylene glycol monomethacrylate, poly
  • the (B) region is adjacent to the (A) region and does not have cell adhesion or cell proliferation.
  • the (B) region is a region adjacent to the (A) region and having no cell proliferation, when the cells are cultured, cell aggregates are formed only in the (A) region, and the (A) region It is possible to form a state in which no cells are present around part or all of it.
  • the region (B) preferably has neither cell proliferation nor cell adhesiveness, since this is suitable for uniformizing the size and shape of the cell aggregates to be produced.
  • the shape of the (B) region is not limited except that it is adjacent to the (A) region, but since it is suitable for producing cell aggregates of uniform size and shape, It is preferable that the (B) region is adjacent to 20% or more of the length of the line, more preferably 50% or more, and still more preferably 80% or more, and the entire circumference of the (A) region is the (B) region. is most preferred. Moreover, since it is suitable for increasing the mass productivity of the cell culture substrate, it is preferable that the region (A) has an island shape and the region (B) has a sea-island structure.
  • the area ratio of the (A) region and the (B) region is not particularly limited, but since it is suitable for increasing the number of cell aggregates that can be produced per unit area of the cell culture substrate, (A )
  • the area of the region is preferably 10% or more, more preferably 30% or more, still more preferably 50% or more, and 70% or more of the total area of the (A) region and the (B) region. Most preferred.
  • ( B) The area of the region is preferably 20% or more, more preferably 40% or more, still more preferably 60% or more, and 80% or more of the total area of the (A) region and the (B) region. is most preferred.
  • the height of the unevenness at the boundary between the (A) region and the (B) region (the out-of-plane distance between the surface of the (A) region and the surface of the (B) region) is 1 to 500 nm.
  • the height of the unevenness is 500 nm or less, the number of dead cells captured by the unevenness can be suppressed, and the number of dead cells mixed in the cell aggregates can be reduced. Thereby, it is possible to increase the cell viability of the cell aggregates. Also, if the height of the irregularities is 500 nm or less, air bubbles are less likely to adhere to the irregularities.
  • the height of the unevenness is 1 nm or more, living cells that spontaneously migrate on the cell culture substrate gather in the (A) region, so that the cell viability of the cell aggregate can be increased.
  • the height of the irregularities is more preferably 400 nm or less, still more preferably 100 nm or less, and most preferably 50 nm or less, because it is suitable for increasing the cell viability of the formed cell aggregates.
  • the cell culture substratum may have a layer containing a biological substance on its surface, if necessary.
  • the layer containing the biological substance may be present on the entire surface of the cell culture substratum, or may be present only on the surface of the region (A).
  • the biological substance is not particularly limited, and examples thereof include matrigel, laminin, fibronectin, vitronectin, and collagen.
  • These biological substances may be natural products or artificially synthesized by genetic recombination technology, etc. Fragments cleaved with restriction enzymes, etc., and substances equivalent to these biological substances may be chemically synthesized. Synthetic proteins, synthetic peptides, or the like synthesized synthetically may also be used.
  • Matrigel commercially available products such as Matrigel (manufactured by Corning Incorporated) and Geltrex (manufactured by Thermo Fisher Scientific) can be suitably used due to their easy availability.
  • laminin is not particularly limited, for example, laminin 511, laminin 521, and laminin 511-E8, which are reported to exhibit high activity against ⁇ 6 ⁇ 1 integrin expressed on the surface of human iPS cells. Fragments and the like can be used.
  • Laminin may be a natural product, may be artificially synthesized by genetic recombination technology or the like, or may be a synthetic protein or synthetic peptide obtained by chemically synthesizing a substance equivalent to laminin. good.
  • Commercially available products such as iMatrix-511 (manufactured by Nippi Co., Ltd.) can be preferably used because of their easy availability.
  • Vitronectin may be a natural product, may be artificially synthesized by genetic recombination technology or the like, or may be a synthetic protein or synthetic peptide obtained by chemically synthesizing a substance equivalent to vitronectin. good.
  • Commercially available products such as vitronectin, human plasma-derived (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), synthemax (manufactured by Corning Incorporated), and Vitronectin (VTN-N) (manufactured by Thermo Fisher Scientific) are preferably used. be able to.
  • Fibronectin may be a natural product, may be artificially synthesized by genetic recombination technology or the like, or may be a synthetic protein or synthetic peptide obtained by chemically synthesizing a substance equivalent to fibronectin. good.
  • Commercially available fibronectin solution, human plasma-derived (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), Retronectin (manufactured by Takara Bio Inc.), and the like, which are commercially available, can be preferably used.
  • the type of collagen is not particularly limited, but for example, type I collagen, type IV collagen, or the like can be used.
  • Collagen may be a natural product, may be artificially synthesized by gene recombination technology or the like, or may be a synthetic peptide obtained by chemically synthesizing a substance equivalent to collagen.
  • Commercially available products such as Collagen I, Human (manufactured by Corning Incorporated), Collagen IV, Human (manufactured by Corning Incorporated), etc. can be preferably used because of their easy availability.
  • the biological substance is preferably immobilized on the cell culture substrate by non-covalent bonding.
  • non-covalent bond means electrostatic interaction, water-insoluble interaction, hydrogen bond, ⁇ - ⁇ interaction, dipole-dipole interaction, London dispersion force, other van der Waals interactions, etc. , indicates binding forces other than covalent bonds derived from intermolecular forces. Immobilization of the biological substance to the block copolymer may be by a single binding force or by a combination of multiple binding forces.
  • the method for immobilizing the biological substance is not particularly limited. It is possible to suitably use a method of adding a biological substance to the cell culture substrate to adsorb and immobilize the biological substance to the cell culture substrate.
  • a partition plate for example, a plate having a through hole having a cross-sectional area in the in-plane direction of 0.05 to 100 cm 2 . Structures may be provided to separate each cell clump.
  • the cell culture substrate according to this embodiment may be sterilized.
  • the method of sterilization is not particularly limited, autoclave sterilization, UV sterilization, ⁇ -ray sterilization, ethylene oxide gas sterilization, and the like can be used.
  • High-pressure steam sterilization, UV sterilization, and ethylene oxide gas sterilization are preferable from the viewpoint of suppressing modification of the block copolymer.
  • UV sterilization or ethylene oxide gas sterilization is more preferable.
  • Ethylene oxide gas sterilization is preferable from the viewpoint of being excellent in mass productivity.
  • the cells to be cultured using the cell culture substrate according to this embodiment are not particularly limited as long as they can adhere to the surface before stimulation by temperature drop is applied.
  • various cell lines such as Chinese hamster ovary-derived CHO cells, mouse connective tissue L929, human embryonic kidney-derived HEK293 cells, and human cervical cancer-derived HeLa cells
  • the epithelium that constitutes each tissue and organ in vivo cells endothelial cells, contractile skeletal muscle cells, smooth muscle cells, cardiomyocytes, neuronal cells that make up the nervous system, glial cells, fibroblasts, hepatic parenchymal cells involved in metabolism in the body, non-hepatic non-parenchymal cells,
  • Adipocytes and cells with differentiation potential include stem cells that exist in various tissues such as mesenchymal stem cells, bone marrow cells, and Muse cells, as well as pluripotent stem cells such as ES cells and iPS cells (pluripotent cells).
  • stem cells are differentiated from them, and the like. From the viewpoint of cell proliferation and exfoliation in the cell culture substrate according to one embodiment, stem cells or pluripotent stem cells are preferred, mesenchymal stem cells or pluripotent stem cells are more preferred, and pluripotent stem cells are even more preferred. , iPS cells are most preferred.
  • the cell culture substrate according to the present embodiment can be suitably used for inducing differentiation from pluripotent stem cells to trigerm layer cells, as described in the examples below.
  • the cell culture substrate according to this embodiment can also be suitably used for inducing differentiation from pluripotent stem cells to intestinal epithelial cells. Therefore, the cell culture substrate according to the present embodiment may be for inducing differentiation from pluripotent stem cells to trigerm layer cells, or may be for inducing differentiation from pluripotent stem cells to intestinal epithelial cells. .
  • the cell culture substratum according to the present embodiment can be produced, for example, by a production method comprising the following steps (1), (2) and (3). This manufacturing method is excellent in mass productivity.
  • step (3) corona treatment or UV treatment can be performed instead of plasma treatment.
  • Step (1) A step of coating at least part of the surface of a substrate with a composition containing a UV-reactive hydrophilic polymer to form a layer containing the hydrophilic polymer.
  • Step (2) A step of irradiating the layer containing the hydrophilic polymer with UV light to immobilize the layer containing the hydrophilic polymer on the surface of the substrate by a chemical reaction.
  • Step (3) A step of subjecting a portion of the surface of the layer containing the immobilized hydrophilic polymer to plasma treatment to form the (A) region on the plasma-treated portion.
  • the cell culture substratum according to this embodiment can also be produced by a production method comprising the following steps (1'), (2'), (3') and (4').
  • Step (1′) Using a base material formed from a polymer containing an alicyclic hydrocarbon group or an aromatic hydrocarbon group in a repeating unit, performing plasma treatment on the surface of the base material, and a step of forming the region (A);
  • Step (2′) A step of coating at least part of the surface of the substrate with a composition containing a UV-reactive hydrophilic polymer to form a layer containing the hydrophilic polymer.
  • Step (3') A step of irradiating a portion of the layer containing the hydrophilic polymer with UV to fix a portion of the layer containing the hydrophilic polymer on the surface of the substrate.
  • Step (4') A step of washing the hydrophilic polymer with a solvent to dissolve the hydrophilic polymer that is not immobilized on the surface and removing it from the surface of the substrate.
  • the manufacturing method according to the present embodiment includes step (1), step (2) and step (3), or step (1′), step (2′), step (3′) and step (4′).
  • step (4) may be further included as necessary.
  • Step (4) After step (3) or (4′), a plate having through holes with a cross-sectional area in the in-plane direction of 0.05 to 100 cm 2 is coated with a layer containing a hydrophilic polymer as a substrate. A step of bonding the surface to the base material.
  • the manufacturing method according to one embodiment may further include the following step (5) after the step (3) or (4′).
  • step (5) is preferably performed after step (3) or (4′) and before step (4).
  • step (5) After step (3) or (4′), the surface of the layer containing the hydrophilic polymer that has been subjected to the plasma treatment is coated with a composition containing the temperature-responsive polymer to improve the temperature-responsive A step of forming a layer containing a polymer.
  • step (1) at least part of the surface of the substrate is coated with a composition containing a UV-reactive hydrophilic polymer to form a layer containing the hydrophilic polymer.
  • a composition containing a UV-reactive hydrophilic polymer to form a layer containing the hydrophilic polymer.
  • Examples of methods for applying a composition containing a hydrophilic polymer include application, brush coating, dip coating, spin coating, bar coating, flow coating, spray coating, roll coating, air knife coating, blade coating, and gravure coating. , microgravure coating, slot die coating, and other commonly known methods can be used.
  • FIG. 2 is a schematic diagram (perspective view) of a substrate having a layer containing a hydrophilic polymer formed on the surface after step (1).
  • a layer 2 containing a hydrophilic polymer is formed on the entire surface of the substrate 1 .
  • step (2) UV irradiation is performed on the layer 2 containing the hydrophilic polymer to immobilize the layer containing the hydrophilic polymer on the surface of the substrate.
  • a chemical reaction occurs between the hydrophilic polymers or between the hydrophilic polymer and the base material, and the layer containing the hydrophilic polymer forms the surface of the base material.
  • the hydrophilic polymer is contained when the composition containing the temperature-responsive polymer is applied in step (5) described later.
  • a layer containing a temperature-responsive polymer can be formed without deforming the layer.
  • the area (A) formed on a part of the surface of the layer containing the hydrophilic polymer in step (3) described later It can also keep its shape.
  • step (3) a part of the surface of the layer containing the immobilized hydrophilic polymer is plasma-treated to form the (A) region in the plasma-treated part.
  • a suitable plasma treatment method can be appropriately adjusted depending on the type and layer thickness of the hydrophilic polymer used, but the plasma irradiation time is preferably 5 seconds to 30 minutes, more preferably 5 seconds to 10 minutes, and 10 seconds. ⁇ 5 minutes is particularly preferred, and 15 seconds to 1 minute is most preferred.
  • the method of patterning the region (A) is not particularly limited, but the desired portion (unmasked portion) can be patterned by plasma treatment while being covered with a metal mask, a silicon mask, a surface protective film, or the like. ) to perform plasma treatment.
  • FIG. 3 is a schematic diagram (perspective view) of the cell culture substratum after step (3).
  • circular regions regions indicated by A.
  • the region indicated by A has cell adhesiveness and cell proliferation properties by modifying the surface of the layer 2 containing the hydrophilic polymer by plasma treatment.
  • a region other than the circular region corresponds to, for example, a portion where plasma processing is not performed because it is protected by a metal mask or the like.
  • the area indicated by B does not have cell adhesiveness or cell proliferation because the surface is layer 2 containing a hydrophilic polymer.
  • a polymer substrate containing an alicyclic hydrocarbon group or an aromatic hydrocarbon group is used as a repeating unit, the surface of the substrate is subjected to plasma treatment, and the plasma-treated portion is coated with the above ( A) forming a region;
  • the plasma treatment conditions are preferably 1 second to 10 minutes, more preferably 1 second to 5 minutes, more preferably 1 second to 1 minute at a gas pressure of 1 to 30 pascals, using air, nitrogen or oxygen as an introduced gas. Especially preferred.
  • the alicyclic hydrocarbon group includes a cycloalkyl group, more specifically a cyclopropyl group, a cyclobutyl group, a cyclopentyl group, a cyclohexyl group, a cycloheptyl group, a cyclooctyl group, a cyclononyl group, and the like.
  • An aromatic hydrocarbon group means a group obtained by removing one or more hydrogen atoms directly bonded to a carbon atom constituting a ring from an aromatic hydrocarbon.
  • the aromatic hydrocarbon group is a group obtained by removing one or more hydrogen atoms directly bonded to the carbon atoms forming the ring from benzene, which is a monocyclic aromatic hydrocarbon, naphthalene, which is a polycyclic aromatic hydrocarbon, and the like. is mentioned.
  • the substrate surface may be coated with a component suitable for cell culture.
  • Polymer materials such as polycarboxystyrene can be suitably used as components suitable for cell culture.
  • step (2') at least part of the surface of the substrate is coated with a composition containing a UV-reactive hydrophilic polymer to form a layer containing the hydrophilic polymer.
  • a composition containing a UV-reactive hydrophilic polymer to form a layer containing the hydrophilic polymer.
  • step (3') part of the layer containing the hydrophilic polymer is irradiated with UV to fix part of the layer containing the hydrophilic polymer on the surface of the base material.
  • UV irradiated by irradiating a partial area of the layer with UV
  • only the UV-irradiated area of the layer containing the hydrophilic polymer is immobilized on the surface of the substrate.
  • a quartz mask or the like having a region not having UV transparency formed by chromium vapor deposition or the like in a desired pattern is placed on the substrate, and the A method of UV irradiation from above can be mentioned.
  • step (4') the hydrophilic polymer is washed with a solvent, and the hydrophilic polymer that is not immobilized on the surface is dissolved and removed from the surface of the substrate. By removing the non-immobilized hydrophilic polymer, the substrate surface can be exposed to form the (A) region.
  • the solvent used in step (4′) is suitable for removing compounds produced by the self-reaction of the UV-reactive hydrophilic polymer, such as compounds containing nitrene derived from an azide group. , water and alcohol. By washing with a mixed solvent of water and alcohol, it is possible to reduce the hydrophilic polymer-derived components remaining in the (A) region, and increase the cell adhesiveness and cell proliferation of the (A) region. can be done.
  • the above alcohol is preferably a lower alcohol such as methanol, ethanol, 2-propanol, t-butanol, isobutanol, pentanol, hexanol, and more preferably methanol or ethanol.
  • the alcohol content is preferably 50 to 95%, more preferably 50 to 90%, particularly preferably 60 to 90%, and most preferably 70 to 90%.
  • step (4) after step (3) or (4′), a plate having through holes with a cross-sectional area in the in-plane direction of 0.05 to 100 cm 2 is attached to the hydrophilic polymer-containing layer of the substrate.
  • the surface coated with is attached to the base material.
  • a plate having through-holes with a cross-sectional area in the in-plane direction of 0.05 to 100 cm 2 By laminating a plate having through-holes with a cross-sectional area in the in-plane direction of 0.05 to 100 cm 2 to a substrate, a plate having a space for containing a culture medium can be produced with high mass productivity.
  • FIG. 4 is a schematic diagram (perspective view) of the cell culture substratum after step (4).
  • the cell culture substratum 11 shown in FIG. 4 for example, the cell culture substratum 10 shown in FIG . It is combined.
  • step (5) after step (3) or (4′), the surface of the hydrophilic polymer-containing layer that has been plasma-treated is coated with a composition containing a temperature-responsive polymer, A layer containing a responsive polymer is formed.
  • the layer containing the temperature-responsive polymer with a layer thickness of 100 nm or less, molecules of the temperature-responsive polymer are formed on the surface of the region (A) formed in step (3) or (4′).
  • the chains are easily coated in a sparse state, which is suitable for imparting temperature responsiveness while maintaining the function of the (A) region (having cell adhesiveness and cell proliferation).
  • the layer thickness of the layer containing the temperature-responsive polymer to 1 nm or more, sufficient temperature responsiveness is imparted, and a cell culture substrate capable of rapidly forming cell aggregates is manufactured. It is possible and preferable.
  • the same method as the method of applying the composition containing the hydrophilic polymer described above can be suitably used.
  • the composition containing a temperature-responsive polymer As a method of coating with a composition containing a temperature-responsive polymer, it is also preferable to coat the entire surface of the cell culture substrate with the temperature-responsive substance.
  • the mass productivity of the cell culture substratum can be enhanced by coating using a commonly used coating method without patterning.
  • the temperature-responsive property is imparted to the region (A), and the temperature-responsive polymer is also applied to the region (B). covered.
  • the region (B) with the temperature-responsive polymer, the cell adhesiveness of the region (B) can be reduced.
  • the present invention also relates to a method of inducing differentiation of pluripotent stem cells.
  • the differentiation induction method according to this embodiment includes the following steps (i) to (iii).
  • the method for inducing differentiation according to this embodiment is preferably used for inducing differentiation from pluripotent stem cells to trigerm layer cells.
  • a step of inducing differentiation of the cell aggregates to form cell aggregates of trigerminal cells
  • the (i) step uses the cell culture substrate according to the present invention described above, and is a step of seeding pluripotent stem cells in the cell culture substrate.
  • seeding cells means that a medium in which cells are dispersed (hereinafter referred to as "cell suspension”) is coated on a cell culture substrate, or injected into a cell culture substrate. It shows contacting the suspension with the cell culture substrate.
  • culturing is performed under conditions effective for maintaining the undifferentiated state of the pluripotent stem cells.
  • Conditions effective for maintaining undifferentiation are not particularly limited. For example, it is performed in the presence of a liquid medium.
  • effective media for maintaining the undifferentiated state of pluripotent stem cells include insulin, transferrin, selenium, ascorbic acid, which are known factors for maintaining the undifferentiated state of pluripotent stem cells.
  • a medium supplemented with one or more of sodium bicarbonate, basic fibroblast growth factor, transforming growth factor ⁇ (TGF ⁇ ), CCL2, activin, and 2-mercaptomethanol can be preferably used.
  • Insulin, transferrin, selenium, ascorbic acid, sodium bicarbonate, basic fibroblast growth factor, transforming growth factor beta (TGF ⁇ ) are particularly suitable for maintaining the undifferentiated nature of pluripotent stem cells. It is more preferred to use a medium containing the medium, and most preferred to use a medium supplemented with basic fibroblast growth factor.
  • the type of medium to which the basic fibroblast growth factor is added is not particularly limited. ), D-MEM/Ham's F12 (manufactured by Sigma-Aldrich Co. LLC), Primate ES Cell Medium (manufactured by REPROCELL Co., Ltd.), StemFit AK02N (manufactured by Ajinomoto Co., Inc.), StemFit AK03 (manufactured by Ajinomoto Co., Ltd.) ), mTeSR1 (manufactured by STEMCELL TECHNOLOGIES), TeSR-E8 (manufactured by STEMCELL TECHNOLOGIES), ReproNaive (manufactured by REPROCELL), ReproXF (manufactured by REPROCELL), ReproFF (manufactured by REPROCELL), ReproFF2 (manufactured by ) REPROCELL), NutriStem (Biological Industries), iSTEM (Takara Bio Inc
  • ES Cell Medium manufactured by REPROCELL Co., Ltd.
  • StemFit AK02N manufactured by Ajinomoto Co., Inc.
  • StemFit AK03 manufactured by Ajinomoto Co., Ltd.
  • Primate ES Cell Medium manufactured by REPROCELL Co., Ltd.
  • StemFit AK02N manufactured by Ajinomoto Co., Inc.
  • StemFit AK03 manufactured by Ajinomoto Co., Ltd.
  • StemFit AK02N manufactured by Ajinomoto Co.
  • StemFit AK03 manufactured by Ajinomoto Co.
  • StemFit AK02N manufactured by Ajinomoto Co.
  • the method for seeding pluripotent stem cells is not particularly limited, but for example, it can be carried out by injecting a cell suspension into a cell culture substrate.
  • the cell density during seeding is not particularly limited, but is 1.0 ⁇ 10 2 to 1.0 ⁇ 10 6 cells/cm 2 so that pluripotent stem cells can be maintained and proliferated. is preferred, 5.0 ⁇ 10 2 to 5.0 ⁇ 10 5 cells/cm 2 is more preferred, 1.0 ⁇ 10 3 to 2.0 ⁇ 10 5 cells/cm 2 is even more preferred, and 1.2 ⁇ 10 3 to 1.0 ⁇ 10 5 cells/cm 2 are most preferred.
  • a Rho-binding kinase inhibitor is further added to the medium supplemented with the above basic fibroblast growth factor, since it is suitable for maintaining the survival of pluripotent stem cells. It is preferable to use a culture medium prepared with Especially when using human pluripotent stem cells, when the cell density of human pluripotent stem cells is low, if a Rho-binding kinase inhibitor is added, the survival and maintenance of human pluripotent stem cells can be effective.
  • Rho-binding kinase inhibitors examples include (R)-(+)-trans-N-(4-pyridyl)-4-(1-aminoethyl)-cyclohexanecarboxamide ⁇ 2HCl ⁇ H2O (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). Y-27632), 1-(5-Isoquinolinesulfonyl) homopiperazine Hydrochloride (HA1077 manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) can be used.
  • the concentration of the Rho-binding kinase inhibitor added to the medium is within a range that is effective for maintaining the survival of human pluripotent stem cells and does not affect the undifferentiated state of human pluripotent stem cells, It is preferably 1 ⁇ M to 50 ⁇ M, more preferably 3 ⁇ M to 20 ⁇ M, even more preferably 5 ⁇ M to 15 ⁇ M, most preferably 8 ⁇ M to 12 ⁇ M.
  • the pluripotent stem cells begin to adhere to the cell culture substrate.
  • the seeded pluripotent stem cells are cultured to form hemispherical cell aggregates with a height/diameter ratio of 0.2 to 0.8.
  • the “height” may be, for example, the maximum diameter of cells in the substrate out-of-plane direction of the cell culture substrate.
  • the “diameter” may be, for example, the maximum diameter of cells in the in-plane direction of the cell culture substrate.
  • the culture temperature is preferably 30 to 42°C, more preferably 32 to 40°C, and further Preferably 36-38°C, most preferably 37°C.
  • the first medium exchange 22 to 26 hours After starting the step. After 48 to 72 hours, the medium is replaced for the second time, and thereafter, preferably, the medium is replaced every 24 to 48 hours. During this time, the pluripotent stem cells proliferate and form flat masses of cells called colonies.
  • a colony is a state in which cells are two-dimensionally adhered to a cell culture substrate. Cultivation is continued until the size of the colony reaches about the size of the region (A), and the culture is further continued to form a three-dimensional cell aggregate.
  • the shape of the three-dimensional cell aggregates is preferably hemispherical with a height/diameter ratio of 0.2 to 0.8.
  • the height/diameter ratio is determined by observing multiple cell clumps under a microscope, calculating the values, and averaging the values.
  • pluripotent stem cells can be efficiently induced to differentiate into trigerm layer cells.
  • the height/diameter ratio is more preferably 0.3 to 0.7, more preferably 0.4 to 0.6, because it is suitable for increasing the efficiency of inducing differentiation into trigerm layer cells. preferable.
  • the cell aggregates are induced to differentiate to form cell aggregates of trigerminal cells.
  • the step (iii) may be performed after the step (ii) or may be performed in parallel with the step (ii). That is, after the seeded pluripotent stem cells adhere to the cell culture substrate, the steps (ii) and (iii) may be started immediately to induce differentiation while forming cell aggregates.
  • a trigerm layer cell indicates either an endoderm cell, a mesoderm cell, or an ectoderm cell.
  • the cells are cultured in a medium containing a differentiation-inducing factor.
  • the differentiation-inducing factor in step (iii) preferably contains an endoderm-inducing factor because it is suitable for increasing the efficiency of inducing differentiation into endoderm cells.
  • an endoderm-inducing factor one or more selected from the group consisting of Wnt protein, bone morphogenetic protein (BMP), insulin-like growth factor and activin because it is suitable for increasing the efficiency of induction of differentiation into embryoid bodies
  • Wnt3a, BMP4, IGFI, and activin A are preferred.
  • the differentiation-inducing factor in step (iii) preferably contains a mesoderm-inducing factor because it is suitable for increasing the efficiency of inducing differentiation into mesodermal cells.
  • the mesoderm-inducing factor is a single or multiple differentiation-inducing factors selected from the group consisting of GSK3 ⁇ inhibitors, bone morphogenetic proteins (BMPs), and activins because they are suitable for increasing the efficiency of differentiation induction into embryoid bodies. and particularly preferably activin A, CHIR99021 (GSK3 ⁇ inhibitor), or BMP4.
  • the differentiation-inducing factor in step (iii) preferably contains an ectodermal-inducing factor because it is suitable for increasing the efficiency of inducing differentiation into ectodermal cells.
  • the ectodermal inducing factor preferably contains any of Noggin (BMP inhibitor), dorsomorphin (BMP inhibitor), SB431542 (TGF- ⁇ inhibitor), activin inhibitor, BMP inhibitor and TGF It is more preferred to contain a - ⁇ inhibitor.
  • the concentration of the differentiation-inducing factor to be added to the medium is not particularly limited, but it is preferably 1000 to 500 ng/mL, more preferably 500 to 100 ng/mL, because it is suitable for increasing the efficiency of differentiation induction into trigerminal cells. and most preferably 100 ng/mL or less.
  • the medium containing the differentiation-inducing factor it is preferable to replace the medium containing the differentiation-inducing factor every 24 hours during the culture in order to sufficiently advance differentiation induction. By exchanging the medium within 24 hours, it is possible to prevent a shortage of the differentiation-inducing factor in the medium and uniformly differentiate all pluripotent stem cells.
  • the method for inducing differentiation of pluripotent stem cells may further include the following step (iv).
  • the differentiation induction method including the step is preferably used to induce differentiation from pluripotent stem cells to intestinal epithelial cells.
  • the intestinal epithelial cells preferably have one or more of enterocytes, goblet cells, enteroendocrine cells, Paneth cells and intestinal epithelial stem cells, and enterocytes, goblet cells, enteroendocrine cells, Paneth cells and intestinal epithelial stem cells. It is more preferable to include all of Intestinal epithelial cells have unique markers.
  • enterocyte markers include CDX2 and VIL1, goblet cell marker MUC2, enteroendocrine cell marker CGA, Paneth cell marker DEFA6, and intestinal epithelial stem cell marker LGR5.
  • the cell culture substratum according to the present invention does not have an uneven structure with a high height in the out-of-plane direction of the substratum on its surface, bubbles are less likely to adhere to the surface of the cell culture substratum when the medium is brought into contact with the substratum.
  • the number of attached bubbles is preferably 10% or less, more preferably 5% or less, further preferably 3% or less, and 1% or less with respect to the number of regions (A). is most preferred.
  • the adhered cells spontaneously aggregate compared to the formation of cell aggregates using a conventional fine uneven structure.
  • the cell viability of the formed cell aggregates is preferably 70% or higher, more preferably 80% or higher, still more preferably 85% or higher, and most preferably 90% or higher.
  • Y-27632 manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • concentration 10 ⁇ M concentration 10 ⁇ M
  • the layer thickness of the polymer (hydrophilic polymer and temperature-responsive polymer) coated on the substrate can be determined from the surface area of the substrate, the concentration of the polymer in the solution, and the volume of the solution dropped onto the substrate. It was obtained by calculating the amount of coating per unit area assuming that the specific gravity is 1.
  • composition of the temperature-responsive polymer is determined by proton nuclear magnetic resonance spectroscopy ( 1 H-NMR) spectroscopy using a nuclear magnetic resonance spectrometer (manufactured by JEOL Ltd., trade name JNM-GSX400), or nuclear magnetic resonance spectroscopy. It was obtained by carbon nuclear magnetic resonance spectroscopy ( 13 C-NMR) using a measurement device (manufactured by Bruker, product name: AVANCEIIIHD500).
  • the GPC apparatus uses HLC-8320GPC manufactured by Tosoh Corporation, the column uses two TSKgel Super AWM-H manufactured by Tosoh Corporation, the column temperature is set to 40 ° C., and the eluent contains 10 mM sodium trifluoroacetate. Measured using 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-isopropanol or N,N-dimethylformamide containing 10 mM lithium bromide. A measurement sample was prepared and measured at 1.0 mg/mL. Polymethyl methacrylate (manufactured by Polymer Laboratories Ltd.) with a known molecular weight was used for the molecular weight calibration curve.
  • the substrate was irradiated with light having excitation wavelengths of 350 nm, 488 nm, and 647 nm, respectively, with an exposure time of 0.4 seconds, and fluorescence images were taken.
  • the RGB values of these images were obtained, and fluorescence intensity was defined as the R value at an excitation wavelength of 350 nm, the G value at an excitation wavelength of 488 nm, and the B value at an excitation wavelength of 647 nm.
  • a similar measurement was performed on a polystyrene plate with a thickness of 1.2 mm.
  • Example 1 A water/ethanol solution containing polyvinyl alcohol (BIOSURFINE (R)-AWP, manufactured by Toyo Gosei Co., Ltd.) having an azide group as a hydrophilic polymer at a solid content concentration of 0.06 wt% was added to polystyrene with a diameter of 3.5 cm. (PS) 0.8 mL was dropped onto a dish (base material), dried under reduced pressure at room temperature, and then UV-irradiated to cure the hydrophilic polymer to form a hydrophilic polymer layer.
  • PS polystyrene with a diameter of 3.5 cm.
  • a metal mask having a plurality of circular holes with a diameter of 0.2 mm is placed on the hydrophilic polymer layer, and a plasma irradiation apparatus (manufactured by Vacuum Device Co., Ltd., trade name Plasma Ion Bombarder PIB-20) is used to apply metal.
  • Plasma treatment under 20 Pa gas pressure, 20 mA conduction current, 30 seconds of irradiation time
  • a region (B) was formed in a portion masked with a metal mask.
  • Table 2 shows the structure and evaluation results of the produced cell culture substratum.
  • the layer thickness of the hydrophilic polymer layer was 600 nm
  • the area of the region (A) was 0.03 mm 2
  • the height of the unevenness at the boundary between the regions (A) and (B) was 32 nm. rice field.
  • Example 2 A cell culture substrate was produced in the same manner as in Example 1 except that the plasma irradiation time in Example 1 was changed to 10 minutes.
  • Table 2 shows the structure and evaluation results of the produced cell culture substratum.
  • the layer thickness of the hydrophilic polymer layer was 600 nm
  • the area of the region (A) was 0.03 mm 2
  • the height of the unevenness at the boundary between the regions (A) and (B) was 85 nm. rice field.
  • Example 3 A cell culture substrate was produced in the same manner as in Example 1, except that the gas pressure for plasma treatment in Example 1 was changed to 13 Pa and the plasma irradiation time was changed to 20 minutes.
  • Table 2 shows the structure and evaluation results of the produced cell culture substratum.
  • the layer thickness of the hydrophilic polymer layer was 600 nm
  • the area of the region (A) was 0.03 mm 2
  • the height of the unevenness at the boundary between the regions (A) and (B) was 452 nm. rice field.
  • Example 4 An ethanol solution containing a polymer containing a phosphorylcholine group as a hydrophilic polymer (Lipidure-CM5210, manufactured by NOF Corporation) at a solid content concentration of 0.01 wt% was placed in a polystyrene dish (base material) with a diameter of 3.5 cm. 0.08 mL was added dropwise and dried under reduced pressure at room temperature to form a hydrophilic polymer layer.
  • Lipidure-CM5210 manufactured by NOF Corporation
  • a metal mask having a plurality of circular holes with a diameter of 0.2 mm is placed on the hydrophilic polymer layer, and a plasma irradiation apparatus (manufactured by Vacuum Device Co., Ltd., trade name Plasma Ion Bombarder PIB-20) is used to apply metal.
  • Plasma treatment under 20 Pa gas pressure, 20 mA conduction current, 30 seconds of irradiation time
  • a region (B) was formed in a portion masked with a metal mask.
  • Table 2 shows the structure and evaluation results of the produced cell culture substratum.
  • the layer thickness of the hydrophilic polymer layer was 10 nm
  • the area of the region (A) was 0.03 mm 2
  • the height of the unevenness at the boundary between the regions (A) and (B) was 23 nm. rice field.
  • Example 5 A cell culture substrate was produced in the same manner as in Example 4, except that the solid content concentration of the hydrophilic polymer was changed to 0.05 wt%.
  • Table 2 shows the structure and evaluation results of the produced cell culture substratum.
  • the layer thickness of the hydrophilic polymer layer was 50 nm
  • the area of the region (A) was 0.03 mm 2
  • the height of the unevenness at the boundary between the regions (A) and (B) was 21 nm. rice field.
  • Example 6 A cell culture substrate was produced in the same manner as in Example 1, except that the solid content concentration of the hydrophilic polymer was changed to 0.15 wt%.
  • Table 2 shows the structure and evaluation results of the produced cell culture substratum.
  • the layer thickness of the hydrophilic polymer was 1500 nm
  • the area of the region (A) was 0.03 mm 2
  • the height of the unevenness at the boundary between the regions (A) and (B) was 34 nm.
  • Example 7 In the same manner as in Example 1, except that a polyethylene terephthalate (PET) film (Lumirror, manufactured by Toray Industries, Inc.) (substrate) with a film thickness of 188 ⁇ m was used instead of the polystyrene (PS) dish with a diameter of 3.5 cm. A cell culture substrate was produced. The culture was carried out by cutting out the prepared cell culture substratum and fixing it in a petri dish.
  • PET polyethylene terephthalate
  • PS polystyrene
  • Table 2 shows the structure and evaluation results of the produced cell culture substratum.
  • the layer thickness of the hydrophilic polymer was 600 nm
  • the area of the region (A) was 0.03 mm 2
  • the height of the unevenness at the boundary between the regions (A) and (B) was 38 nm.
  • Example 8 A cell culture substrate was produced in the same manner as in Example 1, except that a metal mask having a plurality of circular holes with a diameter of 1.5 mm was used instead of a metal mask having a plurality of circular holes with a diameter of 0.2 mm. .
  • Table 2 shows the structure and evaluation results of the produced cell culture substratum.
  • the layer thickness of the hydrophilic polymer was 600 nm
  • the area of the (A) region was 1.76 mm 2
  • the uneven height at the boundary between the (A) region and the (B) region was 35 nm.
  • human iPS cells were induced to differentiate into intestinal epithelial cells.
  • 1.0 mL/dish of 1% Vitronectin (VTN-N) Recombinant Human Protein solution (manufactured by Gibco) was added to the cell culture substrate and allowed to stand at 25° C. for 1 hour. After 1 hour, the 1% VTN solution was removed, 2.0 mL/dish of StemFit AK02N (manufactured by Ajinomoto Co., Inc.), an undifferentiated maintenance medium, was added, and human iPS cell 201B7 strain was added to 3900 cells/cm 2 . The cells were seeded and cultured at 37°C with a CO2 concentration of 5%.
  • Y-27632 manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • concentration 10 ⁇ M concentration 10 ⁇ M
  • the composition of the medium for inducing differentiation into intestinal epithelial cells is 85% KnockOut DMEM (manufactured by ThermoFisher), 15% KnockOut Serum Replacement XenoFree (manufactured by ThermoFisher), 0.1 mM non-essential amino acids (manufactured by Sigma-Aldrich), 2 mM Gluta Max-I.
  • ThermoFisher 20 ng / mL basic fibroblast growth factor (bFGF, manufactured by PEPRO TECH), 50 ⁇ g / mL L (+) -ascorbic acid (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 10 ng / mL heregulin - ⁇ -1 (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 200 ng/mL Long (R) R3IGF-I (manufactured by Sigma-Aldrich), 1% penicillin-streptomycin solution ( ⁇ 100) (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) ).
  • the time point at which the differentiation-inducing medium was added was defined as "differentiation day 0". Thereafter, the differentiation-inducing medium was replaced every 72 hours of culture until "64th day of differentiation”.
  • Fig. 5 shows phase-contrast microscope images of cells on "day 0 of differentiation", “day 43 of differentiation” and “day 64 of differentiation”. As shown in FIG. 5, cyst formation derived from the small intestine was confirmed on “43rd day of differentiation”, and the cysts detached from the cell culture substrate on "64th day of differentiation”.
  • the differentiation-inducing medium was removed from the dish, 2.0 mL/dish of PBS( ⁇ ) was added, and the dish was washed. After washing, 1.0 mL/dish of cell detachment solution was added to the dish, and the dish was allowed to stand for 5 minutes in an environment of 37° C. and a CO 2 concentration of 5%. After allowing to stand for a predetermined time, the cell detachment solution was removed, 1.0 mL/dish of a differentiation-inducing medium was added, and the cells were dispersed. The obtained cell suspension was collected, and the number of cells was counted using a Luna automatic cell counter (manufactured by Logos Biosystems).
  • a housekeeping gene marker GPDH
  • an intestinal cell marker CDX2
  • an absorptive epithelial marker VIL1
  • an intestinal stem cell marker LGR5
  • Relative expression levels of stem cell marker mRNAs were quantified. Healthy adult small intestine tissue (R1234226-50, BioChain Institute) was used as a positive control.
  • Example 9 An ethanol solution containing a polymer (Lipidure-CM5210, manufactured by NOF Corporation) containing a phosphorylcholine group and a UV-reactive functional group as a hydrophilic polymer at a solid content concentration of 0.05 wt% was poured into a 3.5 cm diameter 0.08 mL was added dropwise to a polystyrene dish (substrate) and dried under reduced pressure at room temperature to form a hydrophilic polymer layer.
  • a polymer Lipidure-CM5210, manufactured by NOF Corporation
  • a metal mask having a plurality of circular holes with a diameter of 0.2 mm is placed on the hydrophilic polymer layer, and a plasma irradiation apparatus (manufactured by Vacuum Device Co., Ltd., trade name Plasma Ion Bombarder PIB-20) is used to apply metal.
  • Plasma treatment under 20 Pa gas pressure, 20 mA conduction current, 30 seconds of irradiation time
  • a region (B) was formed in a portion masked with a metal mask.
  • Table 2 shows the structure and evaluation results of the produced cell culture substratum.
  • the layer thickness of the hydrophilic polymer layer was 50 nm
  • the area of the region (A) was 0.03 mm 2
  • the height of the unevenness at the boundary between the regions (A) and (B) was 33 nm. rice field.
  • Example 10 A block copolymer having a water-insoluble block segment and a temperature-responsive block segment ( temperature-responsive polymer) to prepare a cell culture substrate. Specifically, in a test tube, 0.40 g (0.1 mmol) of 4-cyano-4-[(dodecylsulfanylthiocarbonyl)sulfanyl]pentanoic acid, 7.11 g (50 mmol) of n-butyl methacrylate, azobis ( 33 mg (0.2 mmol) of isobutyronitrile) was added and dissolved in 50 mL of 1,4-dioxane. After degassing by nitrogen bubbling for 30 minutes, reaction was carried out at 70° C. for 24 hours.
  • reaction solvent was distilled off under reduced pressure using a rotary evaporator to concentrate the reaction solution.
  • the concentrate was poured into 250 mL of methanol, and the precipitated yellow oily substance was collected and dried under reduced pressure to obtain an n-butyl methacrylate polymer.
  • the structural unit ratio of the block copolymer was 4 wt% n-butyl methacrylate and 96 wt% N-isopropylacrylamide, and the number average molecular weight (Mn) of the block copolymer was 77,000.
  • the layer thickness of the block copolymer (temperature-responsive polymer) layer was obtained from a calibration curve obtained by directly coating the block copolymer (temperature-responsive polymer) onto a polystyrene dish. As a result, the layer thickness of the block copolymer (temperature-responsive polymer) layer was 25 nm.
  • Table 2 shows the structure and evaluation results of the produced cell culture substratum.
  • the layer thickness of the hydrophilic polymer layer was 600 nm
  • the area of the region (A) was 0.03 mm 2
  • the height of the unevenness at the boundary between the regions (A) and (B) was 4 nm. rice field.
  • Example 11 The surface of the cell culture substratum prepared in the same manner as in Example 1 (the side on which the layer containing the hydrophilic polymer is formed) is coated with water-insoluble monomer units and temperature-responsive monomer units. It was coated with a random copolymer to prepare a cell culture substrate.
  • the reaction solvent was diluted with acetone, poured into 500 mL of hexane, and the precipitated solid was collected and dried under reduced pressure. Further, it was dissolved again in acetone and poured into 500 mL of pure water, and the precipitated solid was recovered and dried under reduced pressure to obtain a random copolymer of N-isopropylacrylamide and n-butyl methacrylate.
  • the resulting random copolymer was dissolved in ethanol at 0.5 wt % and spin-coated at 2000 rpm onto the surface of the cell culture substrate (the side on which the layer containing the hydrophilic polymer was formed).
  • the structural unit ratio of the random copolymer was 54 wt% n-butyl methacrylate and 46 wt% N-isopropylacrylamide, and the number average molecular weight (Mn) of the random copolymer was 158,000.
  • the layer thickness of the random copolymer layer was obtained from a calibration curve when the random copolymer was directly coated on a polystyrene dish. As a result, the layer thickness of the random copolymer layer was 25 nm.
  • the random copolymer layer does not correspond to the layer made of the temperature-responsive polymer, it is listed in the column of the layer made of the temperature-responsive polymer in Table 2 for convenience.
  • Table 2 shows the structure and evaluation results of the produced cell culture substratum.
  • the layer thickness of the hydrophilic polymer layer was 600 nm
  • the area of the region (A) was 0.03 mm 2
  • the height of the unevenness at the boundary between the regions (A) and (B) was 4 nm. rice field.
  • Example 12 A polyethylene terephthalate (PET) film (Cosmoshine, manufactured by Toyobo Co., Ltd.) having a film thickness of 180 ⁇ m was subjected to plasma treatment (under a gas pressure of 20 Pa, a conductive current of 20 mA, and an irradiation time of 30 seconds).
  • a water/ethanol solution containing polyvinyl alcohol (BIOSURFINE (R)-AWP, manufactured by Toyo Gosei Kogyo Co., Ltd.) having an azide group as a hydrophilic polymer at a solid concentration of 0.1 wt% is applied to the PET film for plasma treatment. The surface was spin coated at 2000 rpm.
  • a quartz mask having a plurality of circular chromium-deposited regions with a diameter of 0.2 mm was placed on the hydrophilic polymer layer, and UV irradiation was performed from above the quartz mask for 10 seconds using a high-pressure mercury lamp.
  • a region ((A) region) having cell adhesiveness and cell proliferation properties was formed.
  • a region (B) was formed in the UV-irradiated portion.
  • This PET film was attached to a well plate (plate having through-holes) with a hollow bottom.
  • Table 2 shows the structure and evaluation results of the produced cell culture substratum.
  • the layer thickness of the hydrophilic polymer layer was 50 nm
  • the area of the region (A) was 0.03 mm 2
  • the height of the unevenness at the boundary between the regions (A) and (B) was 50 nm. rice field.
  • Table 3 shows the results of evaluating the culture of human iPS cells on these cell culture substrates and comparing them. It was found that the use of a water/ethanol mixed solvent in the washing step can enhance the cell adhesiveness and cell proliferation in the (A) region.
  • Example 2 As the base material of Example 12, instead of the PET film, a PS plate with a thickness of 1.2 mm, a polycarbonate (PC) film with a thickness of 0.1 mm (Iupilon, manufactured by Mitsubishi Gas Co., Ltd.), a polyethylene (PE) film, polypropylene (PP) film and a Permanox slide chamber (manufactured by ThermoScientific) were used to prepare a cell culture substrate in the same manner as in Example 12.
  • PC polycarbonate
  • PE polyethylene
  • PP polypropylene
  • Permanox slide chamber manufactured by ThermoScientific
  • Example 1 A cell culture substrate was produced in the same manner as in Example 4, except that the solid content concentration of the hydrophilic polymer was changed to 0.003 wt%.
  • Table 2 shows the structure and evaluation results of the produced cell culture substratum.
  • the layer thickness of the hydrophilic polymer layer was 3 nm
  • the area of the plasma-treated region was 0.03 mm 2
  • the unevenness height at the boundary between the plasma-treated region and the non-plasma-treated region was 25 nm. Met.
  • Example 2 A cell culture substrate was produced in the same manner as in Example 4, except that the solid content concentration of the hydrophilic polymer was changed to 3 wt %.
  • Table 2 shows the structure and evaluation results of the produced cell culture substratum.
  • the layer thickness of the hydrophilic polymer layer was 3000 nm
  • the area of the plasma-treated region was 0.03 mm 2
  • the unevenness height at the boundary between the plasma-treated region and the non-plasma-treated region was 38 nm. Met.
  • Table 2 shows the structure and evaluation results of the produced cell culture substratum.
  • the produced cell culture substrate does not have a hydrophilic polymer layer, the area of the plasma-treated region (region not covered with the surface protective film) is 0.03 mm 2 , the plasma-treated region (with the surface protective film The unevenness height at the boundary between the uncovered area) and the area covered with the surface protective film was about 58 ⁇ m.
  • Example 5 A cell culture substrate was produced in the same manner as in Example 1, except that the plasma treatment was not performed. Table 2 shows the structure and evaluation results of the produced cell culture substratum. A human iPS cell culture evaluation was performed on this cell culture substrate, but the cells did not adhere or proliferate, so no cell aggregates were formed.
  • Example 6 A cell culture substratum was produced in the same manner as in Example 1, except that no hydrophilic polymer was used (no hydrophilic polymer layer was formed). Table 2 shows the structure and evaluation results of the produced cell culture substratum. Human iPS cell culture evaluation was performed on this cell culture substrate, and the cells adhered and proliferated on the entire surface of the cell culture substrate, and no cell aggregates were formed.

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Abstract

基材と、該基材の表面の少なくとも一部を被覆する層厚５～２０００ｎｍの親水性高分子を含有する層と、を備え、親水性高分子は、ホスホリルコリン基又は水酸基を含み、下記（Ａ）領域及び下記（Ｂ）領域を有し、（Ａ）領域と（Ｂ）領域の境界における凹凸高さは１～５００ｎｍである、細胞培養基材。 （Ａ）細胞接着性及び細胞増殖性を有する面積０．００１～５ｍｍ２の島状の領域 （Ｂ）前記（Ａ）領域に隣接し、細胞接着性又は細胞増殖性を有しない領域

Description

細胞培養基材及びその製造方法、多能性幹細胞の分化誘導方法、並びに細胞培養キット
　本発明は、細胞培養基材及びその製造方法、多能性幹細胞の分化誘導方法、並びに細胞培養キットに関する。
　胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）などの多能性幹細胞は、生体の様々な組織に分化する能力（分化万能性）を持つ細胞であり、再生医療分野や創薬スクリーニングのための細胞ソースとして大きな注目が寄せられている。多能性幹細胞を再生医療や創薬スクリーニングに応用するには、多能性幹細胞から目的の細胞へと分化させる必要があるが、その際、多能性幹細胞の細胞凝集塊を形成する必要がある。また、多能性幹細胞は様々な細胞へと分化することができるが、分化後の細胞の種類によって最適な細胞凝集塊のサイズが異なることが知られており、サイズを制御し、更にサイズの均一な細胞凝集塊を作成することが望ましい。
　細胞凝集塊を形成する方法として従来、多能性幹細胞が接着しない基材を用いることで多能性幹細胞に自発的に凝集体を形成させる方法が知られている（例えば、特許文献１参照。）。この方法は細胞凝集塊の量産性に優れるものの、均一なサイズの細胞凝集塊を得ることができないという問題があった。
　サイズの均一な細胞凝集塊を形成する方法として、表面に微細な凹凸を設けた細胞培養基材を使用する方法が知られている（例えば、特許文献２参照。）。
特開平８－１４０６７３号公報 特開２０１５－０７３５２０号公報
　特許文献２に開示されるような微細な凹凸を設けた細胞培養基材は量産性に乏しく、大量の細胞凝集塊を形成する用途には不向きであるという問題があった。また、微細な凹凸内で細胞を強制的に凝集させることから、死細胞が細胞凝集塊の中に混入しやすいという問題があった。また、微細凹凸を有する細胞培養基材に培地を接触させた際に、表面の微細凹凸に気泡が取り込まれやすく、培養を開始する前に気泡の除去作業が必要であるという課題があることを本発明者らは見出した。気泡を除去するためには通常、ピペッターを用いて培地の吸引と吐出を繰り返す必要があり、作業性に劣るという問題があった。
　本発明の課題は、細胞凝集塊を形成可能であるとともに、細胞凝集塊中の細胞の生存率を高くすることが可能であり、培養時の気泡除去作業を不要にする細胞培養基材及びその製造方法を提供することにある。本発明の他の課題は、三胚葉細胞への分化誘導効率に優れる、該細胞培養基材を用いた多能性幹細胞の分化誘導方法を提供することにある。
　本発明は、基材と、該基材の表面の少なくとも一部を被覆する層厚５～２０００ｎｍの親水性高分子を含有する層と、を備え、上記親水性高分子は、ホスホリルコリン基又は水酸基を含み、下記（Ａ）領域及び下記（Ｂ）領域を有し、（Ａ）領域と（Ｂ）領域の境界における凹凸高さは１～５００ｎｍである、細胞培養基材に関する。
（Ａ）細胞接着性及び細胞増殖性を有する面積０．００１～５ｍｍ２の島状の領域
（Ｂ）（Ａ）領域に隣接し、細胞接着性又は細胞増殖性を有しない領域
　本発明はまた、（１）基材の表面の少なくとも一部をＵＶ反応性の親水性高分子を含有する組成物で被覆し、親水性高分子を含有する層を形成する工程、（２）親水性高分子を含有する層にＵＶ照射を行い、親水性高分子を含有する層を基材の表面に固定化する工程、及び（３）固定化した親水性高分子を含有する層の表面の一部にプラズマ処理を行い、プラズマ処理を行った部分に（Ａ）領域を形成する工程を備える、上記細胞培養基材の製造方法に関する。
　本発明はまた、（１’）繰り返し単位に芳香族炭化水素基を含む高分子から形成される基材を用い、上記基材の表面にプラズマ処理を行い、プラズマ処理を行った部分に上記（Ａ）領域を形成する工程、（２’）上記基材の表面の少なくとも一部をＵＶ反応性の親水性高分子を含有する組成物で被覆し、上記親水性高分子を含有する層を形成する工程、（３’）上記親水性高分子を含有する層の一部にＵＶ照射を行い、上記親水性高分子を含有する層の一部を上記基材の表面に固定化する工程、及び（４’）上記親水性高分子を溶媒で洗浄し、表面に固定化されていない親水性高分子を溶解させて上記基材の表面から除去する工程を備える、上記細胞培養基材の製造方法に関する。
　本発明は更に、（ｉ）上記細胞培養基材に多能性幹細胞を播種する工程、（ｉｉ）多能性幹細胞を培養し、高さ／直径の比が０．２～０．８の半球状の細胞凝集塊を形成する工程、及び（ｉｉｉ）細胞凝集塊を分化誘導し、三胚葉細胞の細胞凝集塊を形成する工程を含む、多能性幹細胞の分化誘導方法に関する。
　本発明は加えて、上記細胞培養基材と、水不溶性ブロックセグメント及び温度応答性ブロックセグメントを含むブロック共重合体若しくは上記ブロック共重合体を含有するコーティング剤とを含む、細胞培養キットに関する。
　本発明によれば、細胞凝集塊を形成可能であるとともに、細胞凝集塊中の細胞の生存率を高くすることが可能であり、培養時の気泡除去作業を不要にする細胞培養基材及びその製造方法を提供することができる。本発明によればまた、該細胞培養基材を用いた多能性幹細胞の分化誘導方法を提供することができる。
一実施形態に係る細胞培養基材の模式図（断面図）である。 一実施形態に係る製造方法における工程（１）後の表面に親水性高分子を含有する層が形成された基材の模式図（斜視図）である。 一実施形態に係る製造方法における工程（３）後の細胞培養基材の模式図（斜視図）である。 一実施形態に係る製造方法における工程（４）後の細胞培養基材の模式図（斜視図）である。 ヒトｉＰＳ細胞の腸上皮細胞への分化誘導試験（実施例８）における“分化０日目”、“分化４３日目”及び“分化６４日目”の細胞の位相差顕微鏡画像である。
　以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。なお、本発明は、以下の実施形態に限定されるものではなく、上述した効果が得られる範囲内で以下の実施形態を変形して実施することができる。
　本明細書において、「細胞凝集塊」とは、複数の細胞が集まって形成される細胞の三次元凝集塊を意味する。三次元凝集塊の形状は、球状等の楕円体の形状であってもよく、半球状等の形状であってもよい。これらの形状は、シート状の細胞が折りたたまれることで形成される隙間のある形状であってもよく、中空の形状であってもよい。
　本明細書において、「温度応答性」とは、温度変化によって親水性／疎水性の程度が変化することを示す。さらに、親水性／疎水性の程度が変化する境界温度を「応答温度」と表記する。
　本明細書において、「生体由来物質」とは、生物の体内に存在する物質、及び当該物質と同等の物質であって、化学的に合成した物質を意味する。生物の体内に存在する物質は、天然物であってもよく、遺伝子組み換え技術等で人工的に合成したものであってもよい。生体由来物質に特に限定はないが、例えば、生体を構成する基本材料である核酸、タンパク質及び多糖、及びこれらの構成要素であるヌクレオチド、ヌクレオシド、アミノ酸、及び各種の糖、並びに脂質、ビタミン及びホルモンが挙げられる。
　本明細書において、「細胞接着性」とは、培養温度における基材又は細胞培養基材への接着しやすさを示し、「細胞接着性を有する」とは、細胞が培養温度において基材又は細胞培養基材に直接又は生体由来物質を介して接着可能であることを示す。また、「細胞接着性を有しない」とは、培養温度において細胞が基材又は細胞培養基材に接着できないことを示す。
　本明細書において、「細胞増殖性」とは、培養温度における細胞の増殖しやすさを示し、「細胞増殖性を有する」とは、培養温度において細胞が増殖可能であることを示す。また、「細胞増殖性を有しない」とは、培養温度において細胞が増殖できないことを示す。「細胞増殖性が高い」とは、同一の培養期間で比較した際により多くの細胞へと増殖することを示す。
　本明細書において、「三胚葉細胞」とは、内胚葉細胞、外胚葉細胞及び中胚葉細胞からなる群より選択される少なくとも一種を意味する。
　本実施形態に係る細胞培養基材は、基材と、基材の表面の少なくとも一部を被覆する層厚５～２０００ｎｍの親水性高分子を含有する層と、を備える。ここで、親水性高分子は、ホスホリルコリン基又は水酸基を含む。また、本実施形態に係る細胞培養基材は、下記（Ａ）領域及び下記（Ｂ）領域を有し、かつ（Ａ）領域と（Ｂ）領域の境界における凹凸高さが１～５００ｎｍである。
（Ａ）細胞接着性及び細胞増殖性を有する面積０．００１～５ｍｍ２の島状の領域
（Ｂ）（Ａ）領域に隣接し、細胞増殖性を有しない領域
　図１は、一実施形態に係る細胞培養基材の模式図（断面図）である。図１に示す細胞培養基材１０は、基材１と、基材１の表面を被覆する親水性高分子を含有する層２（層厚は、例えば、５～２０００ｎｍである。）を備える。図１中、Ａ及びＢは、それぞれ（Ａ）領域及び（Ｂ）領域を示す。また、図１中、Ｈは（Ａ）領域と（Ｂ）領域の境界における凹凸高さを示す。なお、親水性高分子を含有する層２の層厚とは、基材１と親水性高分子を含有する層２が接する面から、（Ｂ）領域（図１中、Ｂで示す領域）の面までの距離を意味する。また、図１に示す細胞培養基材１０は、（Ａ）領域の表面が親水性高分子を含有する層となっているが、これに限られるものではなく、例えば、（Ａ）領域の表面が基材１となっていてもよい。
　本実施形態に係る細胞培養基材に用いられる基材としては、特に限定はないが、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、シクロオレフィンポリマー、セルロースアセテート、ニトロセルロース及びポリフッ化ビニリデンからなる群から選択される少なくとも１種類から形成されるものであることが好ましく、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート及びシクロオレフィンポリマーからなる群から選択される少なくとも１種類から形成されるものであることがより好ましく、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート及びポリカーボネートから選択される少なくとも１種類から形成されるものであることが更に好ましく、ポリスチレン又はポリカーボネートから形成されるものであることが最も好ましい。シクロオレフィンポリマーの市販品としては、ＺＥＯＮＥＸ（日本ゼオン（株）製）、ＺＥＯＮＯＲ（日本ゼオン（株）製）、ＡＲＴＯＮ（ＪＳＲ（株）製）を挙げることができる。
　細胞培養基材上で培養した細胞を高倍率の位相差顕微鏡で観察するのに好適であることから、Ｄ線（波長５８９ｎｍ）で測定した基材の屈折率は１．４～１．６が好ましく、１．４５～１．６がさらに好ましく、１．５～１．５５が特に好ましい。基材の屈折率がこれらの範囲にあることで細胞の位相差顕微鏡観察における球面収差を小さくすることができ、明瞭な位相差像を得ることができる。また、球面収差を小さくするため、基材の厚みは０．５ｍｍ以下が好ましく、０．４ｍｍ以下がさらに好ましく、０．３ｍｍ以下が特に好ましく、０．２ｍｍ以下が最も好ましい。一方、顕微鏡観察時に基材がたわむことで観察範囲全体にピントが合わなくなることを抑制するのに好適であることから、基材の厚みは０．０１ｍｍ以上が好ましく、０．０５ｍｍ以上がさらに好ましく、０．１ｍｍ以上が特に好ましく、０．１５ｍｍ以上が最も好ましい。
　Ｄ線（波長５８９ｎｍ）で測定した基材の屈折率及び厚さは、それぞれ１．４～１．６及び０．０１ｍｍ以上０．５ｍｍ以下であることが好ましく、それぞれ１．４５～１．６及び０．０５ｍｍ以上０．４ｍｍ以下であることがより好ましく、それぞれ１．４５～１．５５及び０．１ｍｍ以上０．３ｍｍ以下であることが更に好ましく、１．５～１．５５及び０．１５ｍｍ以上０．２ｍｍ以下であることが特に好ましい。基材の屈折率及び厚さがこれらの範囲にあると、細胞の位相差像がより明瞭になる。
　細胞培養基材上で培養した細胞を高倍率の蛍光顕微鏡で観察するのに好適であることから、励起波長３５０ｎｍ、４８８ｎｍ、及び６４７ｎｍにおける（これらの波長を有する励起光をそれぞれ照射した場合の）基材の蛍光強度（自家蛍光強度）が、同じ励起波長を有する光で励起された厚み１．２ｍｍのポリスチレン板の蛍光強度（自家蛍光強度）よりも小さなものであることが好ましく、厚み１．２ｍｍのポリスチレン板の蛍光強度の８０％以下がさらに好ましく、厚み１．２ｍｍのポリスチレン板の蛍光強度の５０％以下が特に好ましく、厚み１．２ｍｍのポリスチレン板の蛍光強度の１０％以下が最も好ましい。励起波長３５０ｎｍ、４８８ｎｍ、及び６４７ｎｍで励起される蛍光色素は細胞の蛍光観察において頻用される。これらの波長における基材の自家蛍光強度が一定値以下であることで、細胞の明瞭な蛍光像を得ることができる。
　基材の形状としては、特に制限はなく、板、フィルムのような平面形状であってもよいし、ファイバー、多孔質粒子、多孔質膜、中空糸等の形状であってもよい。また、基材の形状は、一般に細胞培養等に用いられる容器（ペトリ皿等の細胞培養皿、フラスコ、プレート、バッグ等）の形状であってもよい。培養操作の容易性から、基材の形状は、板、フィルムのような平面形状、又は平膜の多孔質膜の形状であることが好ましい。
　親水性高分子を含有する層の層厚は、５～２０００ｎｍである。親水性高分子による層の層厚が５～２０００ｎｍであることにより、（Ａ）領域のみに細胞を接着及び増殖させることが可能であり、また、細胞の遊走により（Ａ）領域に細胞を集めやすく、細胞凝集塊の細胞生存率を高めることができる。層厚が５ｎｍ未満の場合、（Ｂ）領域にも細胞が増殖するため、細胞凝集塊を形成することができない。層厚が２０００ｎｍを超える場合、細胞が遊走できないため、細胞凝集塊に含まれる細胞の生存率が低下する。ここで、親水性高分子による層の「層厚」とは、基材と親水性高分子による層の界面から、親水性高分子による層の基材とは逆側の界面（（Ａ）領域を除く。）までの面外方向の長さを示す。層厚が１０ｎｍを超える範囲ではミクロトームにより作製した細胞培養基材の超薄切片を用いて断面像を透過型電子顕微鏡によって測定し、無作為に選んだ１０点の該距離を測定し、平均することで算出することができる。また、層厚が１０ｎｍ以下の範囲ではエリプソメーターを用いて測定することができる。（Ｂ）領域に細胞が接着するのを抑制するのに好適であるため、層厚が１０ｎｍ以上であることがより好ましく、５０ｎｍ以上であることが更に好ましく、１００ｎｍ以上であることが最も好ましい。また、細胞の遊走により（Ａ）領域に細胞を集めることで細胞凝集塊の細胞生存率を高めるのに好適であることから、層厚が１０００ｎｍ以下であることがより好ましく、５００ｎｍ以下であることが更に好ましく、２００ｎｍ以下であることが最も好ましい。
　親水性高分子は、ホスホリルコリン基又は水酸基を含む。親水性高分子がホスホリルコリン基又は水酸基を含むことにより、親水性高分子が被覆された領域を細胞が接着しない領域とすることが可能である。加えて、このような親水性高分子は完全に分解除去される必要が無いので、短時間の弱いプラズマ処理を行うだけで、その領域を細胞接着性及び細胞増殖性を有する領域とすることができ、細胞に親水性高分子の分解物が混入しにくい。ホスホリルコリン基又は水酸基を含むこと以外に、親水性高分子の種類に特に限定はないが、市販品としては例えば、Ｌｉｐｉｄｕｒｅ（Ｒ）ＣＭ５２０６（日油（株）製）、Ｌｉｐｉｄｕｒｅ（Ｒ）ＣＭ２００１（日油（株）製）、ＢＩＯＳＵＲＦＩＮＥ（Ｒ）－ＡＷＰ（東洋合成工業（株）製）等を挙げることができる。また、親水性高分子が被覆済みの市販品の基材としては、ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ（Ｒ）（住友ベークライト（社）製）、ＥＺ－ＢｉｎｄＳｈｕｔ（Ｒ）（ＡＧＣテクノグラス（社）製）、ＥＺ－ＢｉｎｄＳｈｕｔＩＩ（Ｒ）（ＡＧＣテクノグラス（社）製）等を好適に用いることができる。
　親水性高分子は下記一般式（１）で表される化合物、下記一般式（２）で表される化合物、又は下記一般式（３）で表される化合物を含むことが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 ［一般式（１）中、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立に水素原子又はメチル基を示し、Ｒ３は水素原子又は任意の有機基を示し、ｍ及びｎはそれぞれ独立に正の整数を示す。］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 ［一般式（２）中、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６はそれぞれ独立に水素原子又はメチル基を示し、Ｒ７は水素原子又は任意の有機基を示し、ｘ、ｙ及びｚはそれぞれ独立に正の整数を示す。］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 ［一般式（３）中、Ｒ８Ｒ及び９はそれぞれ独立に水素原子又はメチル基を示し、Ｒ１０は水素原子又は任意の有機基を示し、ａ及びｂはそれぞれ独立に正の整数を示す。］
　親水性高分子が上記一般式（１）で表される化合物、上記一般式（２）で表される化合物、又は上記一般式（３）で表される化合物を含むことで、細胞を接着及び増殖させやすくなり、（Ａ）領域において均一な形状の細胞凝集塊を形成させるのに好適である。上記一般式（１）、上記一般式（２）、又は上記一般式（３）において、Ｒ３Ｒ７、及びＲ１０は、親水性高分子を基材に固定化するのに好適であることから、それぞれ、疎水性基又はＵＶ反応性の官能基であることが好ましい。疎水性基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、シクロヘキシル基等の直鎖又は環状アルキル基等を好適に用いることができる。また、ＵＶ反応性の官能基としては、アジド基、アクリレート基、メタクリレート基、エポキシ基等が挙げられ、アジド基を好適に用いることができる。
　（Ａ）領域は、細胞接着性及び細胞増殖性を有する面積０．００１～５ｍｍ２の島状の領域である。面積０．００１～５ｍｍ２の島状の領域であることにより、細胞を培養した際に、均一粒径の細胞凝集塊を形成可能である。また、多能性幹細胞の分化誘導等の用途に適した細胞凝集塊を形成するのに好適であることから、面積０．００５～１ｍｍ２が好ましく、面積０．０１～０．５ｍｍ２がより好ましく、面積０．０１５～０．２５ｍｍ２が更に好ましく、面積０．０２～０．２ｍｍ２が最も好ましい。
　（Ａ）領域が島状の領域であるとは、（Ａ）領域が（Ａ）領域以外の領域から独立した状態で存在していることを示す。（Ａ）領域が細胞接着性及び細胞増殖性を有する島状であることにより、（Ａ）領域に生細胞が集中して存在するようになるため、細胞凝集塊を製造することができる。（Ａ）領域が島状ではない場合、例えば、ストライプ構造等の場合、細胞凝集塊が製造できない。島状の形状としては特に限定はなく、目的とする細胞凝集塊の形状に応じて適宜設定可能であるが、例えば、円、楕円、多角形、又は直線及び曲線で形成される閉じた形状等を挙げることができる。また、球に近い形状の細胞凝集塊を製造するのに好適であることから、島状の形状として、円、楕円又は多角形が好ましく、円、楕円又は長方形がより好ましく、円、楕円又は正方形が更に好ましく、円又は楕円が最も好ましい。
　均一なサイズ及び形状の細胞凝集塊を製造するのに好適であることから、（Ａ）領域の面積の標準偏差／平均面積が８０％以下であることが好ましく、５０％以下であることがより好ましく、２０％以下であることが更に好ましく、５％以下であることが最も好ましい。
　球に近い形状の細胞凝集塊を製造するのに好適であることから、島状の形状のアスペクト比としては５以下が好ましく、２以下がより好ましく、１．５以下が更に好ましく、１．１以下が最も好ましい。ここで、「アスペクト比」とは、形状の最大径（長径）と最小径（短径）の比である長径／短径を示す。
　また、多能性幹細胞を培養して内胚葉細胞又は外胚葉細胞へと分化誘導するのに適した細胞凝集塊の形成に好適であるため、（Ａ）領域の面積が０．００５～０．２ｍｍ２であり、かつ（Ａ）領域の数が、（Ａ）領域及び（Ｂ）領域の合計面積を基準として、２００～１０００個／ｃｍ２であることが好ましく、（Ａ）領域の面積が０．０１～０．１５ｍｍ２であり、かつ（Ａ）領域の数が、（Ａ）領域及び（Ｂ）領域の合計面積を基準として、２５０～８００個／ｃｍ２であることがより好ましく、（Ａ）領域の面積が０．０２～０．１ｍｍ２であり、かつ（Ａ）領域の数が、（Ａ）領域及び（Ｂ）領域の合計面積を基準として、３００～６００個／ｃｍ２であることが更に好ましく、（Ａ）領域の面積が０．０３～０．０５ｍｍ２であり、かつ（Ａ）領域の数が、（Ａ）領域及び（Ｂ）領域の合計面積を基準として、３００～４００個／ｃｍ２であることが最も好ましい。
　多能性幹細胞を培養して中胚葉細胞へと分化誘導するのに適した細胞凝集塊の形成に好適であるため、（Ａ）領域の面積が、０．２～２ｍｍ２であり、かつ（Ａ）領域の数が、（Ａ）領域及び（Ｂ）領域の合計面積を基準として、３～１５個／ｃｍ２であることが好ましく、（Ａ）領域の面積が０．３～１．５ｍｍ２であり、かつ（Ａ）領域の数が、（Ａ）領域及び（Ｂ）領域の合計面積を基準として、４～１２個／ｃｍ２であることがより好ましく、（Ａ）領域の面積が０．４～１ｍｍ２であり、かつ（Ａ）領域の数が、（Ａ）領域及び（Ｂ）領域の合計面積を基準として、５～１０個／ｃｍ２であることが更に好ましく、（Ａ）領域の面積が０．５～０．７ｍｍ２であり、かつ（Ａ）領域の数が、（Ａ）領域及び（Ｂ）領域の合計面積を基準として、６～８個／ｃｍ２であることが最も好ましい。
　また、細胞の周囲の酸素濃度を高め、細胞凝集塊の生存率を高めるのに好適であることから、（Ａ）領域同士の最小距離が、５００～１００００μｍであることが好ましく、１０００～８０００μｍであることがより好ましく、２０００～５０００μｍであることが更に好ましく、３０００～４０００μｍであることが最も好ましい。
　（Ａ）領域は、例えば、基材表面に親水性高分子を含有する層を形成した後、親水性高分子を含有する層の表面の一部をコロナ処理、ＵＶ処理又はプラズマ処理により改質することで形成することができる。当該改質は、プラズマ処理により行うことが好ましい。（Ａ）領域が、親水性高分子を含有する層の表面がプラズマ処理等により改質された領域であることにより、（Ａ）領域は、細胞接着性及び細胞増殖性を有する領域となる。短時間のプラズマ処理等で（Ａ）領域をパターニングできるため、細胞培養基材の量産性を高めることができる。
　また、（Ａ）領域についてのＸＰＳ（Ｘ線光電子分光法）を測定した際の、Ｃ１ｓスペクトルにおける２８７ｅＶのピーク強度／２８５ｅＶのピーク強度の比が、（Ｂ）領域についてのＸＰＳ測定のＣ１ｓスペクトルにおける２８７ｅＶのピーク強度／２８５ｅＶのピーク強度の比よりも０．０５以上大きなものであることが好ましい。この場合、（Ａ）領域と（Ｂ）領域との細胞増殖性の差を大きくすることができるため、（Ａ）領域で多くの細胞を増殖させることが可能であり、（Ａ）領域において均一な細胞凝集塊を形成しやすくなる。均一な細胞凝集塊を形成するのにより好適であることから、（Ａ）領域についてのＸＰＳ測定のＣ１ｓスペクトルにおける２８７ｅＶのピーク強度／２８５ｅＶのピーク強度の比が、（Ｂ）領域についてのＸＰＳ測定のＣ１ｓスペクトルにおける２８７ｅＶのピーク強度／２８５ｅＶのピーク強度の比よりも、０．０７以上大きいことがより好ましく、０．１以上大きいことが更に好ましく、０．１５以上大きいことが最も好ましい。
　ＸＰＳ測定のＣ１ｓスペクトルにおける２８７ｅＶのピーク強度／２８５ｅＶのピーク強度の比を上述した範囲に調整する方法としては、特に限定はないが、基材表面に形成された親水性高分子を含有する層の一部（（Ａ）領域となる予定の部分）のみに、プラズマ処理、コロナ処理、ＵＶ処理等を施す方法が好ましく、プラズマ処理又はコロナ処理がを施す方法が更に好ましく、プラズマ処理を施す方法が特に好ましい。（Ａ）領域となる予定の部分のみにプラズマ処理等を施す方法としては、レーザー加工で作製したマスクで、基材表面に形成された親水性高分子を含有する層を被覆して、マスクの上からプラズマ処理等を施す方法が挙げられる。（Ａ）領域についてのＸＰＳ測定のＣ１ｓスペクトルにおける２８７ｅＶのピーク強度／２８５ｅＶのピーク強度の比と、（Ｂ）領域についてのＸＰＳ測定のＣ１ｓスペクトルにおける２８７ｅＶのピーク強度／２８５ｅＶのピーク強度の比との差が上述した範囲に収まるように、プラズマ強度、プラズマ照射時間等の条件を適宜調整することが可能であるが、プラズマ処理の場合、導入ガスとして酸素及び窒素を含む気体を使用することで、上述した範囲に収まりやすくなる。
　（Ａ）領域は、培養した細胞凝集塊を剥離するために好適であることから、温度応答性を有していてもよい。（Ａ）領域が温度応答性を有する場合、細胞培養基材上で細胞を培養する際に、体温に近い温度で細胞を培養可能であることから、応答温度５０℃以下が好ましく、３５℃以下がより好ましい。また、培養中に培地交換等の作業を行う際に細胞が剥離してしまうことを抑制するのに好適であることから、応答温度は、２５℃以下が特に好ましい。さらに、細胞にダメージを与えない温度での冷却操作によって細胞凝集塊を形成することが可能であることから、応答温度は、４℃以上が好ましく、１０℃以上がより好ましく、１５℃以上が更に好ましい。
　（Ａ）領域が温度応答性を有する場合、例えば、親水性高分子を含有する層の表面（（Ａ）領域及び（Ｂ）領域を含む表面）に、層厚１～１００ｎｍの温度応答性高分子を含有する層を更に備えていてもよい。層厚１～１００ｎｍの温度応答性高分子を含有する層を有することで、親水性高分子を含有する層の表面に形成した（Ａ）領域及び（Ｂ）領域のそれぞれの特性を損なうことなく、（Ａ）領域に温度応答性を付与することができる。（Ａ）領域及び（Ｂ）領域のそれぞれの特性を損なうことなく、（Ａ）領域に温度応答性を付与するのに好適のため、温度応答性高分子を含有する層の層厚は、３～５０ｎｍであることがより好ましく、５～４０ｎｍであることが更に好ましく、１０～３５ｎｍであることが最も好ましい。細胞増殖性を損なうことなく、さらに培養後に細胞を温度応答性によって剥離して回収可能な好適な温度応答性高分子の層厚は、培養する細胞によっても変化し、上で例示した層厚の範囲で適宜調整することが可能である。
　温度応答性高分子は、水不溶性ブロックセグメント及び温度応答性ブロックセグメントを有するブロック共重合体であることが好ましい。温度応答性高分子がこのようなブロック共重合体であることにより、細胞培養基材の量産性を高めるとともに、製造される細胞凝集塊への温度応答性高分子の混入を抑制することができる。温度応答性高分子に含まれる温度応答性ブロックセグメントの構成単位比率は、細胞培養基材から細胞凝集塊を迅速に剥離するのに好適であることから、７０ｗｔ％以上が好ましく、８０ｗｔ％以上が更に好ましく、９０ｗｔ％以上が特に好ましく、９２ｗｔ％以上が最も好ましい。
　また、温度応答性高分子が水不溶性ブロックセグメント及び温度応答性ブロックセグメントを有するブロック共重合体であることにより、細胞培養基材の表面に温度応答性高分子を含有する溶液を滴下して乾燥するという簡便な手法で、細胞培養基材の表面に温度応答性を付与できる。また、この時形成した層が前述の好ましい温度応答性高分子の層厚であることにより、親水性高分子を含有する層の表面全体に温度応答性高分子を被覆しても、上記（Ａ）領域及び（Ｂ）領域のそれぞれの特性を損なうことがより少なくなる。本発明の細胞培養基材と、ブロック共重合体である温度応答性高分子若しくは上記ブロック共重合体を含有するコーティング剤とを有する細胞培養キットを用いる場合は、培養を実施する研究者が細胞の種類に応じて、簡便に温度応答性高分子の層厚を調整可能である。
　コーティング剤は、溶媒を含有していてよい。コーティング剤に含まれ得る溶媒としては、例えば、水、有機溶媒又はこれらの混合液を挙げることができる。有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、１－プロパノール、２－プロパノール、１－ブタノール等のアルコール類；アセトニトリル、ホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、テトラヒドロフラン、１，４－ジオキサン、メチルエチルケトン等を挙げることができる。コーティングの膜厚を均一にするのに好適であることから、水とアルコール類の混合溶媒を用いることが好ましい。コーティング剤の全質量を基準とした、水不溶性ブロックセグメント及び温度応答性ブロックセグメントを有するブロック共重合体の含有量は、０．１～５０重量％、０．２～１０重量％、又は０．５～５重量％とすることができる。
　コーティング剤は、水不溶性ブロックセグメント及び温度応答性ブロックセグメントを有するブロック共重合体及び溶媒以外の、その他の成分を含有していてよい。その他の成分としては、細胞接着性を高めるための成分が挙げられ、例えば、水不溶性ブロックセグメントのみからなる高分子を挙げることができる。
　温度応答性ブロックセグメントを構成する単量体単位としては例えば、アクリルアミド、メタクリルアミド等の（メタ）アクリルアミド化合物；Ｎ，Ｎ－ジエチルアクリルアミド、Ｎ－エチルアクリルアミド、Ｎ－ｎ－プロピルアクリルアミド、Ｎ－ｎ－プロピルメタクリルアミド、Ｎ－イソプロピルアクリルアミド、Ｎ－イソプロピルメタクリルアミド、Ｎ－シクロプロピルアクリルアミド、Ｎ－シクロプロピルメタクリルアミド、Ｎ－ｔ－ブチルアクリルアミド、Ｎ－エトキシエチルアクリルアミド、Ｎ－エトキシエチルメタクリルアミド、Ｎ－テトラヒドロフルフリルアクリルアミド、Ｎ－テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド等のＮ－アルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体；Ｎ，Ｎ－ジメチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ－エチルメチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジエチルアクリルアミド等のＮ，Ｎ－ジアルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体；１－（１－オキソ－２－プロペニル）－ピロリジン、１－（１－オキソ－２－プロペニル）－ピペリジン、４－（１－オキソ－２－プロペニル）－モルホリン、１－（１－オキソ－２－メチル－２－プロペニル）－ピロリジン、１－（１－オキソ－２－メチル－２－プロペニル）－ピペリジン、４－（１－オキソ－２－メチル－２－プロペニル）－モルホリン等の環状基を有する（メタ）アクリルアミド誘導体；メチルビニルエーテル等のビニルエーテル；Ｎ－プロリンメチルエステルアクリルアミド等のプロリン誘導体を挙げることができ、応答温度を０～５０℃とするのに好適であることから、Ｎ，Ｎ－ジエチルアクリルアミド、Ｎ－ｎ－プロピルアクリルアミド、Ｎ－イソプロピルアクリルアミド、Ｎ－ｎ－プロピルメタクリルアミド、Ｎ－エトキシエチルアクリルアミド、Ｎ－テトラヒドロフルフリルアクリルアミド、Ｎ－テトラヒドロフルフリルメタクリルアミドが好ましく、Ｎ－ｎ－プロピルアクリルアミド、Ｎ－イソプロピルアクリルアミドが更に好ましく、Ｎ－イソプロピルアクリルアミドが特に好ましい。また、培養操作における培地交換の際に室温の培地を用いる場合においては、ブロック共重合体の応答温度を室温よりも低い温度とするのに好適であることから、Ｎ－ｎ－プロピルアクリルアミド、Ｎ－プロリンメチルエステルアクリルアミドが好ましい。
　水不溶性ブロックセグメントを構成する単量体単位としては、例えば、ｎ－ブチルアクリレート、ｎ－ブチルメタクリレート、イソブチルアクリレート、イソブチルメタクリレート、ｔ－ブチルアクリレート、ｔ－ブチルメタクリレート、ｎ－ヘキシルアクリレート、ｎ－ヘキシルメタクリレート、ｎ－オクチルアクリレート、ｎ－オクチルメタクリレート、ｎ－デシルアクリレート、ｎ－デシルメタクリレート、ｎ－ドデシルアクリレート、ｎ－ドデシルメタクリレート、ｎ－テトラデシルアクリレート、ｎ－テトラデシルメタクリレート等を挙げることができる。また、ブロック共重合体を基材に強固に固定化するために好適であることから、反応性基を有するものが好ましく、例えば、４－アジドフェニルアクリレート、４－アジドフェニルメタクリレート、２－（（４－アジドベンゾイル）オキシ）エチルアクリレート、２－（（４－アジドベンゾイル）オキシ）エチルメタクリレート等を挙げることができる。さらに、細胞増殖性を高めるのに好適であることから、芳香環を有する構造が好ましく、例えば、２－ヒドロキシフェニルアクリレート、２－ヒドロキシフェニルメタクリレート、３－ヒドロキシフェニルアクリレート、３－ヒドロキシフェニルメタクリレート、４－ヒドロキシフェニルアクリレート、４－ヒドロキシフェニルメタクリレート、Ｎ－（２－ヒドロキシフェニル）アクリルアミド、Ｎ－（２－ヒドロキシフェニル）メタクリルアミド、Ｎ－（３－ヒドロキシフェニル）アクリルアミド、Ｎ－（３－ヒドロキシフェニル）メタクリルアミド、Ｎ－（４－ヒドロキシフェニル）アクリルアミド、Ｎ－（４－ヒドロキシフェニル）メタクリルアミド、スチレン等を挙げることができる。
　水不溶性ブロックセグメントはまた、ブロック共重合体の応答温度を制御する繰り返し単位を含んでいてもよい。ブロック共重合体の応答温度を制御する繰り返し単位としては、親水性又は疎水性の成分を挙げることができ、特に限定はないが例えば、２－ジメチルアミノエチルアクリレート、２－ジメチルアミノエチルメタクリレート、２－ジエチルアミノエチルアクリレート、２－ジエチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ－［３－（ジメチルアミノ）プロピル］アクリルアミド等のアミノ基を有するもの；Ｎ－（３－スルホプロピル）－Ｎ－メタクロイルオキシエチル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムベタイン、Ｎ－メタクリロイルオキシエチル－Ｎ、Ｎ－ジメチルアンモニウム－α－Ｎ－メチルカルボキシベタイン等のベタインを有するもの；ヒドロキシエチルアクリレート、ヒドロキシエチルメタクリレート、Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）アクリルアミド、ポリエチレングリコールモノアクリレート、ポリエチレングリコールモノメタクリレート、ポリプロピレングリコールモノアクリレート、ポリプロピレングリコールモノメタクリレート、メトキシポリエチレングリコールモノアクリレート、メトキシポリエチレングリコールモノメタクリレート、ジエチレングリコールモノメチルエーテルアクリレート、ジエチレングリコールモノメチルエーテルメタクリレート、ジエチレングリコールモノエチルエーテルアクリレート、ジエチレングリコールモノエチルエーテルメタクリレート、２－メトキシエチルアクリレート、２－メトキシエチルメタクリレート、２－エトキシエチルアクリレート、２－エトキシエチルメタクリレート、３－ブトキシエチルアクリレート、３－ブトキシエチルメタクリレート、３－ブトキシエチルアクリルアミド、フルフリルアクリレート、フルフリルメタクリレート、テトラヒドロフルフリルアクリレート、テトラヒドロフルフリルメタクリレート等のポリエチレングリコール基、メトキシエチル基を有するもの；メトキシメチルアクリレート、メトキシメチルメタクリレート、２－エトキシメチルアクリレート、２－エトキシメチルメタクリレート、３－ブトキシメチルアクリレート、３－ブトキシメチルメタクリレート、３－ブトキシメチルアクリルアミド等のアクリレート基を有するもの；２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、２－アクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、３－（メタ）アクリロイルオキシプロピルホスホリルコリン、４－（メタ）アクリロイルオキシブチルホスホリルコリン、６－（メタ）アクリロイルオキシヘキシルホスホリルコリン、１０－（メタ）アクリロイルオキシデシルホスホリルコリン、ω－（メタ）アクリロイル（ポリ）オキシエチレンホスホリルコリン、２－アクリルアミドエチルホスホリルコリン、３－アクリルアミドプロピルホスホリルコリン、４－アクリルアミドブチルホスホリルコリン、６－アクリルアミドヘキシルホスホリルコリン、１０－アクリルアミドデシルホスホリルコリン、ω－（メタ）アクリルアミド（ポリ）オキシエチレンホスホリルコリン等のホスホリルコリン基を有するものを挙げることができる。
　（Ｂ）領域は、（Ａ）領域に隣接し、細胞接着性又は細胞増殖性を有しない。（Ｂ）領域が、（Ａ）領域に隣接し、細胞増殖性を有しない領域であると、細胞を培養した際に、（Ａ）領域のみに細胞凝集塊を形成し、（Ａ）領域の一部又は全部の周囲に細胞が存在しない状態を形成することが可能である。また、製造される細胞凝集塊のサイズ及び形状を均一化するのに好適であることから、（Ｂ）領域が細胞増殖性だけでなく細胞接着性も有しないものであることが好ましい。
　（Ｂ）領域の形状としては、（Ａ）領域に隣接すること以外に限定はないが、均一なサイズ及び形状の細胞凝集塊を製造するのに好適であることから、（Ａ）領域の境界線の２０％以上の長さに（Ｂ）領域が隣接していることが好ましく、５０％以上がより好ましく、８０％以上が更に好ましく、（Ａ）領域の周囲が全て（Ｂ）領域であることが最も好ましい。また、細胞培養基材の量産性を高めるのに好適であることから、（Ａ）領域が島状で（Ｂ）領域が海状の海島構造であることが好ましい。
　（Ａ）領域及び（Ｂ）領域の面積比としては、特に限定はないが、細胞培養基材の単位面積当たりに製造可能な細胞凝集塊の数量を高めるのに好適であることから、（Ａ）領域の面積が、（Ａ）領域及び（Ｂ）領域の面積の合計に対して、１０％以上であることが好ましく、３０％以上がより好ましく、５０％以上が更に好ましく、７０％以上が最も好ましい。また、複数の（Ａ）領域の間に十分な距離を設け、複数の（Ａ）領域の細胞凝集塊が融合して不均一な形状となることを抑制するのに好適であることから、（Ｂ）領域の面積が、（Ａ）領域及び（Ｂ）領域の面積の合計に対して、２０％以上であることが好ましく、４０％以上がより好ましく、６０％以上が更に好ましく、８０％以上が最も好ましい。
　（Ａ）領域と（Ｂ）領域の境界における凹凸高さ（（Ａ）領域の面と（Ｂ）領域の面の面外方向の距離）は、１～５００ｎｍである。凹凸高さが５００ｎｍ以下であることで、凹凸によって捕捉される死細胞の数を抑制し、細胞凝集塊に混入する死細胞の数を低減させることができる。これにより、細胞凝集塊の細胞生存率を高めることが可能である。また、凹凸高さが５００ｎｍ以下であれば、凹凸部分に気泡が付着しにくい。これにより、気泡を除去するために脱気を行ったりピペッターを用いて培地の吐出と吸引を繰り返したりする必要がなくなり、操作性が向上する。凹凸高さが１ｎｍ以上であることで、細胞培養基材上で自発的に移動（遊走）した生細胞が（Ａ）領域に集まるため、細胞凝集塊の細胞生存率を高めることが可能である。形成される細胞凝集塊の細胞生存率を高めるのに好適であることから、凹凸高さ４００ｎｍ以下がより好ましく、１００ｎｍ以下が更に好ましく、５０ｎｍ以下が最も好ましい。
　細胞培養基材は、必要に応じて生体由来物質を含有する層を表面に備えていてもよい。生体由来物質を含有する層は、細胞培養基材の表面全体に存在していてもよく、（Ａ）領域の表面のみに存在していてもよい。生体由来物質としては特に限定はないが、例えば、マトリゲル、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲン等を挙げることができる。
　これら生体由来物質は、天然物であってもよく、遺伝子組み換え技術等で人工的に合成したものであってもよく、制限酵素等で切断した断片や、これら生体由来物質と同等の物質を化学的に合成した合成タンパク質又は合成ペプチド等であってもよい。
　マトリゲルとしては、入手容易性から、市販品の、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ　Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ製）、Ｇｅｌｔｒｅｘ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）等を好適に用いることができる。
　ラミニンの種類は特に限定されるものではないが、例えば、ヒトｉＰＳ細胞の表面に発現しているα６β１インテグリンに対して高活性を示すことが報告されているラミニン５１１、ラミニン５２１、ラミニン５１１－Ｅ８フラグメント等を用いることができる。ラミニンは、天然物であってもよく、遺伝子組み換え技術等で人工的に合成したものであってもよく、また、ラミニンと同等の物質を化学的に合成した合成タンパク質又は合成ペプチドであってもよい。入手容易性から、市販品であるｉＭａｔｒｉｘ－５１１（（株）ニッピ製）等を好適に用いることができる。
　ビトロネクチンは、天然物であってもよく、遺伝子組み換え技術等で人工的に合成したものであってもよく、また、ビトロネクチンと同等の物質を化学的に合成した合成タンパク質又は合成ペプチドであってもよい。入手容易性から、市販品である、ビトロネクチン，ヒト血漿由来（和光純薬工業（株）製）、ｓｙｎｔｈｅｍａｘ（Ｃｏｒｎｉｎｇ　Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ製）、Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ（ＶＴＮ－Ｎ）（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）等を好適に用いることができる。
　フィブロネクチンは、天然物であってもよく、遺伝子組み換え技術等で人工的に合成したものであってもよく、また、フィブロネクチンと同等の物質を化学的に合成した合成タンパク質又は合成ペプチドであってもよい。入手容易性から、市販品である、フィブロネクチン溶液、ヒト血漿由来（和光純薬工業（株）製）、Ｒｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎ（タカラバイオ（株）製）等を好適に用いることができる。
　コラーゲンの種類は特に限定されるものではないが、例えば、ｔｙｐｅＩコラーゲンやｔｙｐｅＩＶコラーゲン等を用いることができる。コラーゲンは、天然物であってもよく、遺伝子組み換え技術等で人工的に合成したものであってもよく、また、コラーゲンと同等の物質を化学的に合成した合成ペプチドであってもよい。入手容易性から、市販品である、コラーゲンＩ，ヒト（Ｃｏｒｎｉｎｇ　Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ製）、コラーゲンＩＶ，ヒト（Ｃｏｒｎｉｎｇ　Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ製）等を好適に用いることができる。
　生体由来物質の変性を抑制することができ、細胞増殖性を高めることができる観点から、生体由来物質は非共有結合により細胞培養基材上に固定化されていることが好ましい。ここで、「非共有結合」とは、静電相互作用、水不溶性相互作用、水素結合、π－π相互作用、双極子－双極子相互作用、ロンドン分散力、その他のファンデルワールス相互作用等、分子間力に由来する共有結合以外の結合力を示す。生体由来物質のブロック共重合体への固定化は、単一の結合力によるものであっても、複数の組み合わせであってもよい。
　生体由来物質の固定化方法は特に限定されるものではないが、例えば、細胞培養基材に生体由来物質の溶液を所定時間塗布することで固定化させる方法や、細胞を培養する際に培養液中に生体由来物質を添加することで生体由来物質を細胞培養基材に吸着させ固定化する方法を好適に用いることができる。
　本実施形態に係る細胞培養基材は、必要に応じて、基材上に仕切り板（例えば、面内方向の断面積が０．０５～１００ｃｍ２の貫通孔を有する板）を設ける等により、各細胞凝集塊を区分するための構造を設けてもよい。
　本実施形態に係る細胞培養基材は、滅菌を施してあってもよい。滅菌の方法に特に限定はないが、高圧蒸気滅菌、ＵＶ滅菌、γ線滅菌、エチレンオキシドガス滅菌等を用いることができる。ブロック共重合体の変性を抑制する観点からは、高圧蒸気滅菌、ＵＶ滅菌、エチレンオキシドガス滅菌が好ましい。基材の変形を抑制する観点からは、ＵＶ滅菌又はエチレンオキシドガス滅菌が更に好ましい。量産性に優れるという観点からは、エチレンオキシドガス滅菌が好ましい。
　本実施形態に係る細胞培養基材を用いて培養される細胞としては、温度降下による刺激付与前の表面に接着可能なものであれば特に限定されるものではない。例えばチャイニーズハムスター卵巣由来ＣＨＯ細胞やマウス結合組織Ｌ９２９、ヒト胎児腎臓由来ＨＥＫ２９３細胞やヒト子宮頸部癌由来ＨｅＬａ細胞等の種々の株化細胞に加え、例えば生体内の各組織、臓器を構成する上皮細胞や内皮細胞、収縮性を示す骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、神経系を構成するニューロン細胞、グリア細胞、繊維芽細胞、生体の代謝に関与する肝実質細胞、肝非実質細胞や脂肪細胞、分化能を有する細胞として、間葉系幹細胞、骨髄細胞、Ｍｕｓｅ細胞のように種々の組織に存在する幹細胞、更にはＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞等の分化多能性を有する幹細胞（多能性幹細胞）、それらから分化誘導した細胞等が挙げられる。一実施形態に係る細胞培養基材における細胞の増殖性及び剥離性の観点から、幹細胞又は多能性幹細胞が好ましく、間葉系幹細胞又は多能性幹細胞がより好ましく、多能性幹細胞が更に好ましく、ｉＰＳ細胞が最も好ましい。
　本実施形態に係る細胞培養基材は、後述する実施例に記載するとおり、多能性幹細胞から三胚葉細胞への分化誘導に好適に使用することができる。本実施形態に係る細胞培養基材はまた、多能性幹細胞から腸上皮細胞への分化誘導に好適に使用することができる。したがって、本実施形態に係る細胞培養基材は、多能性幹細胞から三胚葉細胞への分化誘導用であってもよく、多能性幹細胞から腸上皮細胞への分化誘導用であってもよい。
　本実施形態に係る細胞培養基材は、例えば、下記工程（１）、工程（２）及び工程（３）を備える製造方法により製造することができる。この製造方法は、量産性に優れる。なお、工程（３）では、プラズマ処理に代えてコロナ処理又はＵＶ処理を行うこともできる。
　工程（１）基材の表面の少なくとも一部をＵＶ反応性の親水性高分子含有する組成物で被覆し、親水性高分子を含有する層を形成する工程。
　工程（２）親水性高分子を含有する層にＵＶ照射を行い、親水性高分子を含有する層を、化学反応により、基材の表面に固定化する工程。
　工程（３）固定化した親水性高分子を含有する層の表面の一部にプラズマ処理を行い、プラズマ処理を行った部分に（Ａ）領域を形成する工程。
　本実施形態に係る細胞培養基材はまた、下記工程（１’）、工程（２’）、工程（３’）及び工程（４‘）を備える製造方法によっても製造することができる。
　工程（１’）繰り返し単位に脂環式炭化水素基又は芳香族炭化水素基を含む高分子から形成される基材を用い、基材の表面にプラズマ処理を行い、プラズマ処理を行った部分に上記（Ａ）領域を形成する工程。
　工程（２’）基材の表面の少なくとも一部をＵＶ反応性の親水性高分子を含有する組成物で被覆し、上記親水性高分子を含有する層を形成する工程。
　工程（３’）上記親水性高分子を含有する層の一部にＵＶ照射を行い、上記親水性高分子を含有する層の一部を上記基材の表面に固定化する工程。
　工程（４’）上記親水性高分子を溶媒で洗浄し、表面に固定化されていない親水性高分子を溶解させて基材の表面から除去する工程。
　本実施形態に係る製造方法は、工程（１）、工程（２）及び工程（３）、又は、工程（１’）、工程（２’）、工程（３’）及び工程（４’）に加えて、必要に応じて、下記工程（４）を更に備えるものであってもよい。
　工程（４）工程（３）又は（４’）の後に、面内方向の断面積が０．０５～１００ｃｍ２の貫通孔を有する板を、基材の親水性高分子を含有する層で被覆した面側で基材と貼り合わせる工程。
　また、一実施形態に係る製造方法は、工程（３）又は（４’）の後に、下記工程（５）を更に備えていてもよい。なお、工程（４）を実施する場合は、工程（５）は、工程（３）又は（４’）の後、かつ工程（４）の前に実施することが好ましい。
　工程（５）工程（３）又は（４’）の後に、プラズマ処理を行った親水性高分子を含有する層の表面を、温度応答性高分子を含有する組成物で被覆し、温度応答性高分子を含有する層を形成する工程。
　工程（１）では、基材の表面の少なくとも一部をＵＶ反応性の親水性高分子を含有する組成物で被覆し、親水性高分子を含有する層を形成する。親水性高分子を含有する層を形成することで、細胞接着性及び細胞増殖性を有しない状態とすることができる。親水性高分子を含有する層を形成する方法としては、特に限定はないが、例えば、親水性高分子を含有する組成物を基材の表面の少なくとも一部に塗布することで形成する方法が挙げられる。親水性高分子を含有する組成物の塗布方法としては、例えば、塗布、はけ塗り、ディップコーティング、スピンコーティング、バーコーディング、流し塗り、スプレー塗装、ロール塗装、エアーナイフコーティング、ブレードコーティング、グラビアコーティング、マイクログラビアコーティング、スロットダイコーティングなど通常知られている各種の方法を用いることができる。
　図２は、工程（１）後の表面に親水性高分子を含有する層が形成された基材の模式図（斜視図）である。図２では、基材１の表面の一面全てに親水性高分子を含有する層２が形成されている。
　工程（２）では、親水性高分子を含有する層２にＵＶ照射を行い、親水性高分子を含有する層を基材の表面に固定化する。ＵＶ反応性の親水性高分子にＵＶ照射を行うことで、親水性高分子同士、又は親水性高分子と基材との化学反応が起こり、親水性高分子を含有する層が基材の表面に固定化される。親水性高分子を含有する層が基材表面に固定化されることによって、後述する工程（５）で温度応答性高分子を含有する組成物を塗布した際に、親水性高分子を含有する層を変形させることなく、温度応答性高分子を含有する層を形成することができる。また、親水性高分子を含有する層が基材表面に固定化されることによって、後述する工程（３）で親水性高分子を含有する層の表面の一部に形成した（Ａ）領域の形状を保つこともできる。
　工程（３）では、固定化した親水性高分子を含有する層の表面の一部にプラズマ処理を行い、プラズマ処理を行った部分に（Ａ）領域を形成する。好適なプラズマ処理方法は、使用する親水性高分子の種類や層厚によって適宜調整可能であるが、プラズマ照射時間は、５秒～３０分が好ましく、５秒～１０分が更に好ましく、１０秒～５分が特に好ましく、１５秒～１分が最も好ましい。また、（Ａ）領域のパターニングの方法としては、特に限定はないが、メタルマスクやシリコンマスク、表面保護フィルム等で被覆した状態でプラズマ処理を行うことにより、所望の部分（マスクされていない部分）にプラズマ処理を行う方法が挙げられる。
　図３は、工程（３）後の細胞培養基材の模式図（斜視図）である。図３に示す細胞培養基材１０では、等間隔に配置された円の形状の領域（Ａで示した領域。例えば、当該領域の面積は０．００１～５ｍｍ２である。）がプラズマ処理を行った部分に該当する。Ａで示した領域は、親水性高分子を含有する層２の表面がプラズマ処理により改質されることにより、細胞接着性及び細胞増殖性を有するようになる。また、円の形状の領域以外の領域（Ｂで示した領域。）は、例えば、メタルマスク等により保護されることでプラズマ処理が行われていない部分に該当する。Ｂで示した領域は、表面が親水性高分子を含有する層２であるため、細胞接着性又は細胞増殖性を有しない。
　工程（１’）では、繰り返し単位に脂環式炭化水素基又は芳香族炭化水素基を含む高分子基材を用い、基材の表面にプラズマ処理を行い、プラズマ処理を行った部分に上記（Ａ）領域を形成する。脂環式炭化水素基又は芳香族炭化水素基を含む高分子基材の表面にプラズマ処理を行うことで、基材表面を細胞の培養に適した構造に変化させることができる。プラズマ処理の条件としては、導入ガスとして空気、窒素又は酸素を用い、１～３０パスカルのガス圧において、１秒～１０分が好ましく、１秒～５分がさらに好ましく、１秒～１分が特に好ましい。脂環式炭化水素基としては、シクロアルキル基が挙げられ、より具体的には、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロへプチル基、シクロオクチル基、シクロノニル基等が挙げられる。芳香族炭化水素基は、芳香族炭化水素から環を構成する炭素原子に直接結合する水素原子を１個以上除いた基を意味する。芳香族炭化水素基としては、単環式芳香族炭化水素であるベンゼン、多環式芳香族炭化水素であるナフタレン等から環を構成する炭素原子に直接結合する水素原子を１個以上除いた基が挙げられる。
　また、上記工程（１’）に変えて、細胞の培養に適した成分を基材表面にコーティングしてもよい。細胞の培養に適した成分としては、ポリカルボキシスチレン等の高分子材料を好適に用いることができる。
　工程（２’）では、基材の表面の少なくとも一部をＵＶ反応性の親水性高分子を含有する組成物で被覆し、上記親水性高分子を含有する層を形成する。塗布方法としては、前述の工程（１）と同様の方法を好適に用いることができる。
　工程（３’）では、上記親水性高分子を含有する層の一部にＵＶ照射を行い、上記親水性高分子を含有する層の一部を上記基材の表面に固定化する。層の一部の領域にＵＶ照射を行うことで、親水性高分子を含有する層のＵＶ照射された領域だけが基材の表面に固定化される。親水性高分子を含有する層の一部にＵＶ照射を行う方法としては、所望のパターンでクロム蒸着等によりＵＶ透過性を有しない領域を形成した石英マスク等を基材の上に置き、その上からＵＶ照射する方法を挙げることができる。
　工程（４’）では、上記親水性高分子を溶媒で洗浄し、表面に固定化されていない親水性高分子を溶解させて基材の表面から除去する。固定化されていない親水性高分子を除去することで基材表面を露出させ、（Ａ）領域を形成することができる。工程（４’）で使用する溶媒としては、ＵＶ反応性の親水性高分子の自己反応によって副生する化合物、例えばアジド基由来のニトレンを含有する化合物等を除去するのに好適であることから、水とアルコールを含有することが好ましい。水とアルコールの混合溶媒を用いて洗浄することで、（Ａ）領域に残留する親水性高分子由来成分を低減することが可能で、（Ａ）領域の細胞接着性及び細胞増殖性を高めることができる。上記アルコールとしては低級アルコールが好ましく、例えば、メタノール、エタノール、２－プロパノール、ｔ－ブタノール、イソブタノール、ペンタノール、ヘキサノールが好ましく、メタノール又はエタノールがさらに好ましい。また、上記アルコールの含有量としては、５０～９５％が好ましく、５０～９０％がさらに好ましく、６０～９０％が特に好ましく、７０～９０％が最も好ましい。
　工程（４）では、工程（３）又は（４’）の後に、面内方向の断面積が０．０５～１００ｃｍ２の貫通孔を有する板を、基材の親水性高分子を含有する層で被覆した面側で基材と貼り合わせる。面内方向の断面積が０．０５～１００ｃｍ２の貫通孔を有する板を基材と貼り合わせることにより、培地を入れるための空間を有するプレートを高い量産性で作製可能である。図４は、工程（４）後の細胞培養基材の模式図（斜視図）である。図４に示す細胞培養基材１１は、例えば、図３に示す細胞培養基材１０等に仕切り板２０（面内方向の断面積が０．０５～１００ｃｍ２の貫通孔を有する板）を貼り合わせたものである。
　工程（５）では、工程（３）又は（４’）の後に、プラズマ処理を行った親水性高分子を含有する層の表面を、温度応答性高分子を含有する組成物で被覆し、温度応答性高分子を含有する層を形成する。この際、温度応答性高分子を含有する層の層厚を１００ｎｍ以下で形成することによって、工程（３）又は（４’）で形成した（Ａ）領域の表面に温度応答性高分子の分子鎖が疎な状態で被覆されやすく、（Ａ）領域の機能（細胞接着性及び細胞増殖性を有する）を維持しながら温度応答性を付与するのに好適である。また、温度応答性高分子を含有する層の層厚を１ｎｍ以上とすることで、充分な温度応答性を付与し、細胞凝集塊の形成を迅速に行うことが可能な細胞培養基材を製造することができ、好適である。
　温度応答性高分子を含有する組成物で被覆する方法としては、前述の親水性高分子を含有する組成物の塗布方法と同様の方法を好適に用いることができる。
　温度応答性高分子を含有する組成物で被覆する方法としてはまた、細胞培養基材の全面に温度応答性物質を被覆することが好ましい。温度応答性高分子を含有する組成物の被覆に際し、パターニングを行うことなく、通常用いられる塗工方法を用いて被覆することにより、細胞培養基材の量産性を高めることができる。また、細胞培養基材の全面に温度応答性高分子を含有する組成物を被覆することによって、（Ａ）領域に温度応答性を付与するとともに、（Ｂ）領域にも温度応答性高分子が被覆される。（Ｂ）領域に温温度応答性高分子が被覆されることにより、（Ｂ）領域の細胞接着性を低下させることができる。
　本発明は、また多能性幹細胞の分化誘導方法にも関する。
　本実施形態に係る分化誘導方法は、以下の（ｉ）～（ｉｉｉ）工程を含む。本実施形態に係る分化誘導方法は、多能性幹細胞から三胚葉細胞への分化誘導に好適に使用される。
（ｉ）本発明に係る細胞培養基材に多能性幹細胞を播種する工程。
（ｉｉ）播種された多能性幹細胞を培養し、高さ／直径の比が０．２～０．８の半球状の細胞凝集塊を形成する工程。
（ｉｉｉ）上記細胞凝集塊を分化誘導し、三胚葉細胞の細胞凝集塊を形成する工程。
　（ｉ）工程は、上述した本発明に係る細胞培養基材を用いるものであり、当該細胞培養基材に多能性幹細胞を播種する工程である。「細胞を播種する」とは、細胞が分散した培地（以下、「細胞懸濁液」と表記する。）を細胞培養基材上に塗布、又は、細胞培養基材に注入する等により、細胞懸濁液と細胞培養基材とを接触させることを示す。細胞増殖性の領域を有する細胞培養基材を用いることにより、後述する（ｉｉ）工程で細胞を培養することができる。細胞培養基材が細胞増殖性の領域を有していない場合、（ｉｉ）工程で細胞を培養することができない。
　上記（ｉ）工程においては、多能性幹細胞の未分化性を維持させるのに有効な条件で、培養が実施される。未分化性を維持させるのに有効な条件としては、特に制限はないが、例えば、培養開始時の多能性幹細胞の密度を下記播種の際の細胞密度として記載した好ましい範囲とすること、適切な液体培地の存在下で行うことなどが挙げられる。多能性幹細胞の未分化性を維持させるのに有効な培地としては、例えば、多能性幹細胞の未分化性を維持するための因子として知られている、インスリン、トランスフェリン、セレニウム、アスコルビン酸、炭酸水素ナトリウム、塩基性線維芽細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）、ＣＣＬ２、アクチビン、２－メルカプトメタノールのうち１つ以上を添加した培地を好適に用いることができる。多能性幹細胞の未分化性を維持するのに特に好適であることから、インスリン、トランスフェリン、セレニウム、アスコルビン酸、炭酸水素ナトリウム、塩基性線維芽細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）を含有する培地を用いることがより好ましく、塩基性線維芽細胞増殖因子を添加した培地を用いることが最も好ましい。
　上記塩基性線維芽細胞増殖因子を添加した培地の種類に特に制限はないが、例えば、市販品としては、ＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｏ．　ＬＬＣ製）、Ｈａｍ’ｓ　Ｆ１２（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｏ．　ＬＬＣ製）、Ｄ－ＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ　Ｆ１２（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｏ．　ＬＬＣ製）、Ｐｒｉｍａｔｅ　ＥＳ　Ｃｅｌｌ　Ｍｅｄｉｕｍ（（株）ＲＥＰＲＯＣＥＬＬ製）、ＳｔｅｍＦｉｔ　ＡＫ０２Ｎ（味の素（株）製）、ＳｔｅｍＦｉｔ　ＡＫ０３（味の素（株）製）、ｍＴｅＳＲ１（ＳＴＥＭＣＥＬＬ　ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ製）、ＴｅＳＲ－Ｅ８（ＳＴＥＭＣＥＬＬ　ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ製）、ＲｅｐｒｏＮａｉｖｅ（（株）ＲＥＰＲＯＣＥＬＬ製）、ＲｅｐｒｏＸＦ（（株）ＲＥＰＲＯＣＥＬＬ製）、ＲｅｐｒｏＦＦ（（株）ＲＥＰＲＯＣＥＬＬ製）、ＲｅｐｒｏＦＦ２（（株）ＲＥＰＲＯＣＥＬＬ製）、ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ（バイオロジカルインタストリーズ社製）、ｉＳＴＥＭ（タカラバイオ（株）製）、ＧＳ２－Ｍ（タカラバイオ（株）製）、ｈＰＳＣ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｍｅｄｉｕｍ　ＤＸＦ（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ（株）製）等を挙げることができる。多能性幹細胞の未分化状態を維持するのに好適であることから、Ｐｒｉｍａｔｅ　ＥＳ　Ｃｅｌｌ　Ｍｅｄｉｕｍ（（株）ＲＥＰＲＯＣＥＬＬ製）、ＳｔｅｍＦｉｔ　ＡＫ０２Ｎ（味の素（株）製）又はＳｔｅｍＦｉｔ　ＡＫ０３（味の素（株）製）が好ましく、ＳｔｅｍＦｉｔ　ＡＫ０２Ｎ（味の素（株）製）又はＳｔｅｍＦｉｔ　ＡＫ０３（味の素（株）製）がより好ましく、ＳｔｅｍＦｉｔ　ＡＫ０２Ｎ（味の素（株）製）が特に好ましい。
　上記（ｉ）工程において、多能性幹細胞の播種方法に特に制限はないが、例えば、細胞培養基材に細胞懸濁液を注入することで行うことが出来る。播種の際の細胞密度は特に制限はないが、多能性幹細胞を維持することができ、かつ増殖させることができるように、１．０×１０２～１．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２が好ましく、５．０×１０２～５．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２がより好ましく、１．０×１０３～２．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２が更に好ましく、１．２×１０３～１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２が最も好ましい。
　上記（ｉ）工程で用いる培地としてはまた、多能性幹細胞の生存を維持するのに好適であることから、上記塩基性線維芽細胞増殖因子を添加した培地に更にＲｈｏ結合キナーゼ阻害剤を添加した培地を用いることが好ましい。特にヒトの多能性幹細胞を用いる場合であって、ヒトの多能性幹細胞の細胞密度が低い状態において、Ｒｈｏ結合キナーゼ阻害剤が添加されていると、ヒトの多能性幹細胞の生存維持に効果的な場合がある。Ｒｈｏ結合キナーゼ阻害剤としては、例えば、（Ｒ）－（＋）－ｔｒａｎｓ－Ｎ－（４－ｐｙｒｉｄｙｌ）－４－（１－ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）－ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ・２ＨＣｌ・Ｈ２Ｏ（和光純薬工業（株）製Ｙ－２７６３２）、１－（５－Ｉｓｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ）ｈｏｍｏｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ　Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（和光純薬工業（株）製ＨＡ１０７７）を用いることができる。培地に添加されるＲｈｏ結合キナーゼ阻害剤の濃度としては、ヒトの多能性幹細胞の生存維持に有効な範囲であってヒトの多能性幹細胞の未分化状態に影響を与えない範囲であり、好ましくは１μＭ～５０μＭであり、より好ましくは３μＭ～２０μＭであり、更に好ましくは５μＭ～１５μＭであり、最も好ましくは８μＭ～１２μＭである。
　上記（ｉ）工程を開始するとまもなく、多能性幹細胞は細胞培養基材に接着し始める。
　（ｉｉ）工程では、播種された多能性幹細胞を培養し、高さ／直径の比が０．２～０．８の半球状の細胞凝集塊を形成する。「高さ」は、例えば、細胞培養基材の基材面外方向における細胞の直径の最大値であってよい。「直径」は、例えば、細胞培養基材の基材面内方向における細胞の直径の最大値であってよい。
　（ｉｉ）工程での培養は、多能性幹細胞の増殖能や生理活性，機能維持に好適であることから、培養温度としては、好ましくは３０～４２℃、より好ましくは３２～４０℃、更に好ましくは３６～３８℃、最も好ましくは３７℃である。
　（ｉｉ）工程を開始して２２～２６時間後に、最初の培地交換を行うことが好ましい。その４８～７２時間後に２度目の培地交換を行い、その後、２４～４８時間毎に培地交換を行うことが好ましい。この間、多能性幹細胞は増殖し、コロニーと呼ばれる平たい細胞塊を形成する。コロニーは細胞培養基材に細胞が２次元的に接着した状態である。コロニーの大きさが（Ａ）領域のサイズ程度になるまで培養を継続させ、更に培養を継続することで、３次元的な細胞凝集塊を形成する。３次元的な細胞凝集塊の形状は、高さ／直径の比が０．２～０．８の半球状であることが好ましい。高さ／直径の比は、顕微鏡により複数の細胞凝集塊を観察して値を算出し、平均することで求められる。高さ／直径の比が０．２～０．８の半球状の細胞凝集塊を形成することにより、多能性幹細胞から三胚葉細胞への分化誘導を効率的に行うことができる。また、三胚葉細胞への分化誘導効率を高めるのに好適であることから、高さ／直径の比が０．３～０．７であることがより好ましく、０．４～０．６が更に好ましい。
　（ｉｉｉ）工程では、上記細胞凝集塊（多能性幹細胞の細胞凝集塊）を分化誘導し、三胚葉細胞の細胞凝集塊を形成する。なお、（ｉｉｉ）工程は、（ｉｉ）工程の後に行ってもよいし、（ｉｉ）工程と並行して行ってもよい。すなわち、播種した多能性幹細胞が細胞培養基材に接着後、すぐに（ｉｉ）工程及び（ｉｉｉ）工程を開始し、細胞凝集塊を形成しつつ分化誘導を行ってもよい。なお、三胚葉細胞とは、内胚葉細胞、中胚葉細胞、外胚葉細胞のいずれかを示す。（ｉｉｉ）工程では、分化誘導因子を含む培地中で細胞を培養する。
　内胚葉細胞への分化誘導効率を高めるのに好適のため、（ｉｉｉ）工程における分化誘導因子が、内胚葉誘導因子を含有することが好ましい。内胚葉誘導因子としては、胚様体への分化誘導効率を高めるのに好適のため、Ｗｎｔタンパク質、Ｂｏｎｅ　ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ（ＢＭＰ）、インスリン様成長因子及びアクチビンからなる群より選択される単一又は複数の分化誘導因子であることが好ましく、特にＷｎｔ３ａ、ＢＭＰ４、ＩＧＦＩ、アクチビンＡのいずれかを含有することが好ましい。
　中胚葉細胞への分化誘導効率を高めるのに好適のため、（ｉｉｉ）工程における分化誘導因子が、中胚葉誘導因子を含有することが好ましい。中胚葉誘導因子としては、胚様体への分化誘導効率を高めるのに好適のため、ＧＳＫ３β阻害剤、Ｂｏｎｅ　ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ（ＢＭＰ）及びアクチビンからなる群より選択される単一又は複数の分化誘導因子であることが好ましく、特にアクチビンＡ、ＣＨＩＲ９９０２１（ＧＳＫ３β阻害剤）、ＢＭＰ４のいずれかを含有することが好ましい。
　外胚葉細胞への分化誘導効率を高めるのに好適のため、（ｉｉｉ）工程における分化誘導因子が、外胚葉誘導因子を含有することが好ましい。上記外胚葉誘導因子としては、Ｎｏｇｇｉｎ（ＢＭＰ阻害剤）、ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ（ＢＭＰ阻害剤）、ＳＢ４３１５４２（ＴＧＦ－β阻害剤）、アクチビン阻害剤、のいずれかを含有することが好ましく、ＢＭＰ阻害剤及びＴＧＦ－β阻害剤を含有することがより好ましい。
　分化誘導因子の培地への添加濃度については特に限定されないが、三胚葉細胞への分化誘導効率を高めるのに好適のため、好ましくは１０００～５００ｎｇ／ｍＬであり、より好ましくは５００～１００ｎｇ／ｍＬであり、最も好ましくは１００ｎｇ／ｍＬ以下である。
　分化誘導因子を含む培地は、充分に分化誘導を進行させるために、培養中は２４時ごとに交換することが好ましい。２４時間以内に培地を交換することで、培地中の分化誘導因子が不足することを防ぎ、均一に全ての多能性幹細胞を分化させることができる。
　本実施形態に係る多能性幹細胞の分化誘導方法は、以下の（ｉｖ）工程を更に有していてもよい。（ｉｖ）工程を含む場合の分化誘導方法は、多能性幹細胞から腸上皮細胞への分化誘導に好適に使用される。
　（ｉｖ）Ｗｎｔタンパク質、Ｂｏｎｅ　ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ（ＢＭＰ）、インスリン様成長因子及びアクチビンからなる群より選択される少なくとも一種の分化誘導因子を含む培地中で細胞凝集塊を培養し、腸上皮細胞が有するマーカーを発現させる工程。
　腸上皮細胞は、腸細胞、杯細胞、腸管内分泌細胞、パネート細胞及び腸上皮幹細胞のいずれか又は複数の細胞を有するのが好ましく、腸細胞、杯細胞、腸管内分泌細胞、パネート細胞及び腸上皮幹細胞をすべて含むことがより好ましい。腸上皮細胞は特有のマーカーを有する。例えば、腸細胞マーカーとして、ＣＤＸ２及びＶＩＬ１、杯細胞マーカーとしてＭＵＣ２、腸管内分泌細胞マーカーとしてＣＧＡ、パネート細胞マーカーとしてＤＥＦＡ６、腸上皮幹細胞マーカーとしてＬＧＲ５が挙げられる。
　本発明に係る細胞培養基材は、基材面外方向の高さが高い凹凸構造を表面に有しないことから、培地を接触させた際に気泡が細胞培養基材表面に付着しづらい。本発明に係る細胞培養基材は、例えば、気泡の付着数が、（Ａ）領域の数に対して１０％以下が好ましく、５％以下がより好ましく、３％以下が更に好ましく、１％以下が最も好ましい。
　本発明に係る細胞培養基材を用いて形成される細胞凝集塊は、従来の微細凹凸構造を利用した細胞凝集塊形成と比較して、接着した細胞が自発的に集合することから、高い細胞生存率を有する。例えば、生存率５０％細胞を用いた場合、形成される細胞凝集塊の細胞生存率として７０％以上が好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上が更に好ましく、９０％以上が最も好ましい。
　以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明する。ただし、本発明は、以下の実施例により限定されるものではない。なお、断りのない限り、試薬は市販品を用いた。
＜（Ａ）領域の面積の測定＞
　レーザー顕微鏡（キーエンス（株）製、製品名ＶＫ－Ｘ２００）を用いて、細胞培養基材の表面の画像を取得した。得られた画像を使用して、解析ソフトＶＫ－Ｘ　Ｖｉｅｗｅｒ上で２０点の（Ａ）領域の面積を求め、それらの面積を平均して（Ａ）領域の面積とした。
＜（Ａ）領域と（Ｂ）領域の境界における凹凸高さの測定＞
　レーザー顕微鏡（キーエンス（株）製、製品名ＶＫ－Ｘ２００）を用いてレーザー走査モードにより、細胞培養基材の面外方向の厚みを測定することで、境界における凹凸高さを測定した。
＜気泡付着評価＞
　細胞培養基材に培地ＳｔｅｍＦｉｔＡＫ０２Ｎ（味の素（株）製）を加え、顕微鏡で観察することにより気泡の付着の有無を確認した。
＜細胞凝集塊の評価＞
（細胞凝集塊の培養）
　細胞培養基材に培地ＳｔｅｍＦｉｔＡＫ０２Ｎ（味の素（株）製）を０．２ｍＬ／ｃｍ２加え、ｉＭａｔｒｉｘ－５１１溶液（（株）ニッピ製）を２．５μＬ／ｍＬの濃度で加えた。死細胞を混合することで全細胞に対する生存細胞の割合（細胞生存率）が５０％となるように調整したヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株を用い、１５０００個（生細胞及び死細胞の合計細胞数）／ｃｍ２となるように播種し、３７℃、ＣＯ２濃度５％の環境下で培養した。また、細胞を播種してから２４時間後までは、培地にＹ－２７６３２（和光純薬工業（株）製）（濃度１０μＭ）を添加した。培養開始から１日後又は２日後に細胞凝集塊の形成の有無を確認した。
（冷却による細胞凝集塊の剥離）
　細胞凝集塊の形成を確認後、室温で３０分間冷却することで細胞凝集塊の剥離を確認した。
（細胞生存率の評価）
　細胞凝集塊の形成を確認後、ＴｒｙｐＬＥ－ＥＤＴＡ溶液（ＴｒｙｐＬＥ　ｓｅｌｅｃｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ製）と０．５ｍＭ　ＥＤＴＡ溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）の１：１混合物）で細胞を処理した後にセルスクレーパーを用いて細胞をシングルセルで剥離回収し、トリパンブルーにより染色することで細胞生存率を測定した。
＜親水性高分子及び温度応答性高分子の層厚の測定＞
　基材に被覆された重合体（親水性高分子及び温度応答性高分子）の層厚は、基材の表面積、溶液中の高分子の濃度、基材に滴下した溶液体積から、高分子の比重を１として単位面積当たりの被覆量を計算することで求めた。
＜温度応答性高分子の組成の測定＞
　温度応答性高分子の組成は、核磁気共鳴測定装置（日本電子（株）製、商品名ＪＮＭ－ＧＳＸ４００）を用いたプロトン核磁気共鳴分光（１Ｈ－ＮＭＲ）スペクトル分析、又は、核磁気共鳴測定装置（ブルカー製、製品名ＡＶＡＮＣＥＩＩＩＨＤ５００）を用いたカーボン核磁気共鳴分光（１３Ｃ－ＮＭＲ）スペクトル分析より求めた。
＜温度応答性高分子の分子量及び分子量分布の測定＞
　重量平均分子量（Ｍｗ）、数平均分子量（Ｍｎ）及び分子量分布（Ｍｗ／Ｍｎ）は、ゲル・パーミエーション・クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって測定した。ＧＰＣ装置は東ソー（株）製　ＨＬＣ－８３２０ＧＰＣを用い、カラムは東ソー（株）製　ＴＳＫｇｅｌ　Ｓｕｐｅｒ　ＡＷＭ－Ｈを２本用い、カラム温度を４０℃に設定し、溶離液は１０ｍＭトリフルオロ酢酸ナトリウムを含む１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロー２－イソプロパノール、又は１０ｍＭ臭化リチウムを含むＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミドを用いて測定した。測定試料は１．０ｍｇ／ｍＬで調製して測定した。分子量の検量線は、分子量既知のポリメタクリル酸メチル（Ｐｏｌｙｍｅｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｌｔｄ．製）を用いた。
＜基材の自家蛍光強度評価＞
　基材に対し露光時間０．４秒で、３５０ｎｍ、４８８ｎｍ、及び６４７ｎｍの励起波長をそれぞれ有する光を照射し、蛍光画像を撮影した。これらの画像のＲＧＢ値を求め、励起波長３５０ｎｍではＲ値、励起波長４８８ｎｍではＧ値、励起波長６４７ｎｍではＢ値を蛍光強度とした。厚み１．２ｍｍのポリスチレン板で同様の測定を行い、厚み１．２ｍｍのポリスチレン板での値に対する相対値を、各基材の蛍光強度として表４に示した。
［実施例１］
　親水性高分子としてアジド基を有するポリビニルアルコール（ＢＩＯＳＵＲＦＩＮＥ（Ｒ）－ＡＷＰ、東洋合成工業（株）製）を固形分濃度０．０６ｗｔ％で含有する水／エタノール溶液を、直径３．５ｃｍのポリスチレン（ＰＳ）ディッシュ（基材）に０．８ｍＬ滴下し、室温で減圧乾燥した後、ＵＶ照射することで親水性高分子を硬化させ、親水性高分子の層を形成した。直径０．２ｍｍの円形の穴を複数有するメタルマスクを、親水性高分子の層上に置き、プラズマ照射装置（（株）真空デバイス製、商品名プラズマイオンボンバーダＰＩＢ－２０）を用いてメタルマスクの上からプラズマ処理（２０Ｐａガス圧下、導電電流２０ｍＡ、照射時間３０秒間）を行うことで、プラズマ処理した部分に細胞接着性及び細胞増殖性を有する領域（（Ａ）領域）を形成した。また、メタルマスクでマスクした部分に（Ｂ）領域を形成した。
　作製した細胞培養基材の構成及び評価結果を表２に示す。作製した細胞培養基材は親水性高分子の層の層厚が６００ｎｍ、（Ａ）領域の面積が０．０３ｍｍ２、（Ａ）領域と（Ｂ）領域の境界における凹凸高さが３２ｎｍであった。
　この細胞培養基材上でヒトｉＰＳ細胞の培養評価を行い、培養開始から２日後に細胞凝集塊の形成を確認した。目視判定では、形成された細胞凝集塊のサイズは均一であった。細胞凝集塊の高さ／直径の比は０．５と推定された。また、細胞凝集塊に含まれる細胞の生存率は８９％であり、高い細胞生存率であった。また、培地添加時に気泡は細胞培養基材に付着していなかった。
［実施例２］
　実施例１におけるプラズマ照射時間を１０分間に変更したこと以外は実施例１と同様にして細胞培養基材を作製した。
　作製した細胞培養基材の構成及び評価結果を表２に示す。作製した細胞培養基材は親水性高分子の層の層厚が６００ｎｍ、（Ａ）領域の面積が０．０３ｍｍ２、（Ａ）領域と（Ｂ）領域の境界における凹凸高さが８５ｎｍであった。
　この細胞培養基材上でヒトｉＰＳ細胞の培養評価を行い、培養開始から２日後に細胞凝集塊の形成を確認した。目視判定では、形成された細胞凝集塊のサイズは均一であった。細胞凝集塊の高さ／直径の比は０．５と推定された。また、細胞凝集塊に含まれる細胞の生存率は９１％であり、高い細胞生存率であった。また、培地添加時に気泡は細胞培養基材に付着していなかった。
［実施例３］
　実施例１におけるプラズマ処理のガス圧を１３Ｐａに変更したこと、及びプラズマ照射時間を２０分間に変更したこと以外は実施例１と同様にして細胞培養基材を作製した。
　作製した細胞培養基材の構成及び評価結果を表２に示す。作製した細胞培養基材は親水性高分子の層の層厚が６００ｎｍ、（Ａ）領域の面積が０．０３ｍｍ２、（Ａ）領域と（Ｂ）領域の境界における凹凸高さが４５２ｎｍであった。
　この細胞培養基材上でヒトｉＰＳ細胞の培養評価を行い、培養開始から２日後に細胞凝集塊の形成を確認した。目視判定では、形成された細胞凝集塊のサイズは均一であった。細胞凝集塊の高さ／直径の比は０．５と推定された。また、細胞凝集塊に含まれる細胞の生存率は７８％であり、高い細胞生存率であった。また、培地添加時に気泡は細胞培養基材に付着していなかった。
［実施例４］
　親水性高分子としてホスホリルコリン基を含有するポリマー（Ｌｉｐｉｄｕｒｅ－ＣＭ５２１０、日油（株）製）を固形分濃度０．０１ｗｔ％で含有するエタノール溶液を、直径３．５ｃｍのポリスチレンディッシュ（基材）に０．０８ｍＬ滴下し、室温で減圧乾燥し、親水性高分子の層を形成した。直径０．２ｍｍの円形の穴を複数有するメタルマスクを、親水性高分子の層上に置き、プラズマ照射装置（（株）真空デバイス製、商品名プラズマイオンボンバーダＰＩＢ－２０）を用いてメタルマスクの上からプラズマ処理（２０Ｐａガス圧下、導電電流２０ｍＡ、照射時間３０秒間）を行うことで、プラズマ処理した部分に細胞接着性及び細胞増殖性を有する領域（（Ａ）領域）を形成した。また、メタルマスクでマスクした部分に（Ｂ）領域を形成した。
　作製した細胞培養基材の構成及び評価結果を表２に示す。作製した細胞培養基材は親水性高分子の層の層厚が１０ｎｍ、（Ａ）領域の面積が０．０３ｍｍ２、（Ａ）領域と（Ｂ）領域の境界における凹凸高さが２３ｎｍであった。
　この細胞培養基材上でヒトｉＰＳ細胞の培養評価を行い、培養開始から２日後に細胞凝集塊の形成を確認した。目視判定では、形成された細胞凝集塊のサイズは均一であった。細胞凝集塊の高さ／直径の比は０．５と推定された。また、細胞凝集塊に含まれる細胞の生存率は８７％であり、高い細胞生存率であった。また、培地添加時に気泡は細胞培養基材に付着していなかった。
［実施例５］
　親水性高分子の固形分濃度を０．０５ｗｔ％に変更したこと以外は実施例４と同様にして細胞培養基材を作製した。
　作製した細胞培養基材の構成及び評価結果を表２に示す。作製した細胞培養基材は親水性高分子の層の層厚が５０ｎｍ、（Ａ）領域の面積が０．０３ｍｍ２、（Ａ）領域と（Ｂ）領域の境界における凹凸高さが２１ｎｍであった。
　この細胞培養基材上でヒトｉＰＳ細胞の培養評価を行い、培養開始から２日後に細胞凝集塊の形成を確認した。目視判定では、形成された細胞凝集塊のサイズは均一であった。細胞凝集塊の高さ／直径の比は０．５と推定された。また、細胞凝集塊に含まれる細胞の生存率は９２％であり、高い細胞生存率であった。また、培地添加時に気泡は細胞培養基材に付着していなかった。
［実施例６］
　親水性高分子の固形分濃度を０．１５ｗｔ％に変更したこと以外は実施例１と同様にして細胞培養基材を作製した。
　作製した細胞培養基材の構成及び評価結果を表２に示す。作製した細胞培養基材は親水性高分子の層厚が１５００ｎｍ、（Ａ）領域の面積が０．０３ｍｍ２、（Ａ）領域と（Ｂ）領域の境界における凹凸高さが３４ｎｍであった。
　この細胞培養基材上でヒトｉＰＳ細胞の培養評価を行い、培養開始から２日後に細胞凝集塊の形成を確認した。目視判定では、形成された細胞凝集塊のサイズは均一であった。細胞凝集塊の高さ／直径の比は０．５と推定された。また、細胞凝集塊に含まれる細胞の生存率は８５％であり、高い細胞生存率であった。また、培地添加時に気泡は細胞培養基材に付着していなかった。
［実施例７］
　直径３．５ｃｍのポリスチレン（ＰＳ）ディッシュに代えて、膜厚１８８μｍのポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）フィルム（ルミラー、東レ（株）製）（基材）を使用したこと以外は実施例１と同様にして細胞培養基材を作製した。なお、培養は作製した細胞培養基材を切り抜いたものをシャーレの中に固定化して実施した。
　作製した細胞培養基材の構成及び評価結果を表２に示す。作製した細胞培養基材は親水性高分子の層厚が６００ｎｍ、（Ａ）領域の面積が０．０３ｍｍ２、（Ａ）領域と（Ｂ）領域の境界における凹凸高さが３８ｎｍであった。
　この細胞培養基材上でヒトｉＰＳ細胞の培養評価を行い、培養開始から２日後に細胞凝集塊の形成を確認した。目視判定では、形成された細胞凝集塊のサイズは均一であった。細胞凝集塊の高さ／直径の比は０．５と推定された。また、細胞凝集塊に含まれる細胞の生存率は８４％であり、高い細胞生存率であった。また、培地添加時に気泡は細胞培養基材に付着していなかった。
［実施例８］
　直径０．２ｍｍの円形の穴を複数有するメタルマスクに代えて、直径１．５ｍｍの円形の穴を複数有するメタルマスクを使用したこと以外は実施例１と同様にして細胞培養基材を作製した。
　作製した細胞培養基材の構成及び評価結果を表２に示す。作製した細胞培養基材は親水性高分子の層厚が６００ｎｍ、（Ａ）領域の面積が１．７６ｍｍ２、（Ａ）領域と（Ｂ）領域の境界における凹凸高さが３５ｎｍであった。
　この細胞培養基材上でヒトｉＰＳ細胞の培養評価を行い、培養開始から２日後に細胞凝集塊の形成を確認した。目視判定では、形成された細胞凝集塊のサイズは均一であった。細胞凝集塊の高さ／直径の比は０．５と推定された。また、細胞凝集塊に含まれる細胞の生存率は８９％であり、高い細胞生存率であった。また、培地添加時に気泡は細胞培養基材に付着していなかった。
　この細胞培養基材を用い、ヒトｉＰＳ細胞の腸上皮細胞への分化誘導を行った。細胞培養基材に１％　Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ（ＶＴＮ－Ｎ）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｈｕｍａｎ　Ｐｒｏｔｅｉｎ溶液（Ｇｉｂｃｏ製）を１．０ｍＬ／ディッシュ加え、１時間、２５℃で静置した。１時間後１％ＶＴＮ溶液を除去し、未分化性維持培地であるＳｔｅｍＦｉｔＡＫ０２Ｎ（味の素（株）製）を２．０ｍＬ／ディッシュ加え、更にヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株を３９００個／ｃｍ２となるように播種し、３７℃、ＣＯ２濃度５％の環境下で培養した。また、細胞の播種から２４時間後までは、培地にＹ－２７６３２（富士フィルム和光純薬（株）製）（濃度１０μＭ）を添加した。位相差顕微鏡観察により、細胞培養基材上に接着した複数の円形の胚様体を確認した。
　細胞の播種から２４時間後、下記分化誘導培地を２．０ｍＬ／ディッシュ加え、分化誘導を開始した。
腸上皮細胞への分化誘導培地の組成は、８５％　ＫｎｏｃｋＯｕｔ　ＤＭＥＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ製）、１５％ＫｎｏｃｋＯｕｔ　Ｓｅｒｕｍ　Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ　ＸｅｎｏＦｒｅｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ製）、０．１ｍＭ　非必須アミノ酸（シグマ・アルドリッチ製）、２ｍＭ　Ｇｌｕｔａ　Ｍａｘ－Ｉ　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ製）、２０ｎｇ／ｍＬ　塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ、ＰＥＰＲＯ　ＴＥＣＨ製）、５０μｇ／ｍＬ　Ｌ（＋）－アスコルビン酸（富士フィルム和光純薬（株））、１０ｎｇ／ｍＬ　ヘレグリン－β－１（富士フィルム和光純薬（株））、２００ｎｇ／ｍＬ　Ｌｏｎｇ（Ｒ）Ｒ３ＩＧＦ－Ｉ（シグマ・アルドリッチ製）、１％　ペニシリン－ストレプトマイシン溶液（×１００）（富士フィルム和光純薬（株））である。分化誘導培地を添加した時点を“分化０日目”とした。その後、“分化６４日目”まで培養７２時間おきに分化誘導培地を交換した。
　図５は、“分化０日目”、“分化４３日目”及び“分化６４日目”の細胞の位相差顕微鏡画像である。図５に示すとおり、“分化４３日目”に小腸由来ののう胞形成を確認し、また、“分化６４日目”にのう胞が細胞培養基材から剥離した。
　“分化６４日目”において、ディッシュ内の上記分化誘導培地を除去し、ＰＢＳ（－）を２．０ｍＬ／ディッシュ加え、洗浄した。洗浄後、ディッシュに細胞剥離液を１．０ｍＬ／ディッシュ加え、３７℃、ＣＯ２濃度５％の環境下で５分間静置させた。所定時間静置させた後に、細胞剥離液を除去し、分化誘導培地を１．０ｍＬ／ディッシュ加え、細胞を分散させた。得られた細胞懸濁液を回収し、Ｌｕｎａ自動細胞計数装置（ロゴスバイオシステムズ製）を用いて細胞数を計測した。
　腸上皮細胞への分化誘導を評価するために、ハウスキーピング遺伝子マーカー（ＧＡＰＤＨ）、腸細胞マーカー（ＣＤＸ２）、吸収上皮マーカー（ＶＩＬ１）、腸幹細胞マーカー（ＬＧＲ５）を採用し、腸細胞マーカー及び腸幹細胞マーカーのｍＲＮＡの相対発現レベルを定量した。陽性対照として健常成人の小腸組織（Ｒ１２３４２２６－５０、ＢｉｏＣｈａｉｎＩｎｓｔｉｔｕｔｅ）を使用した。
　細胞数計測で回収した“分化６４日目”の細胞を、１．５ｍＬサンプルチューブにそれぞれ１．０×１０６個／チューブ分取した。遠心分離（室温、８００×ｇ、５分）を行い、上澄み液を除去した。ＲＮｅａｓｙ　Ｐｌｕｓ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を使用して、細胞からＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡの濃度をＱｕｂｉｔ４　Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒで測定し、１μｇ／６μＬになるようにＲＮａｓｅ―ｆｒｅｅ　Ｗａｔｅｒ（タカラバイオ（株）製）で濃度調製した。逆転写反応には、ＲｅｖｅｒＴｒａ　Ａｃｅ　ｑＲＴ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ　ｗｉｔｈ　ｇＤＮＡ　Ｒｅｍｏｖｅｒ（東洋紡（株）製）を使用した。１μＬの５倍希釈ｃＤＮＡ（逆転写産物の１／１００に相当）に対して、オリゴｄＴプライマー、下記表１に示す塩基配列を有するプライマー（ＩＮＴＥＧＲＡＴＥＤ　ＤＮＡ　ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社製）及びＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ　Ｐｒｏｂｅ　ｑＰＣＲ　Ｍｉｘ（東洋紡（株）製）を用いてリアルタイムＰＣＲ解析をＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ３リアルタイムＰＣＲシステム（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（株）製）で解析した。その結果、“分化６４日目”の細胞において腸組織由来のＣＤＸ２、ＶＩＬ１及びＬＧＲ５が発現していることを確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
［実施例９］
　親水性高分子としてホスホリルコリン基及びＵＶ反応性の官能基を含有するポリマー（Ｌｉｐｉｄｕｒｅ－ＣＭ５２１０、日油（株）製）を固形分濃度０．０５ｗｔ％で含有するエタノール溶液を、直径３．５ｃｍのポリスチレンディッシュ（基材）に０．０８ｍＬ滴下し、室温で減圧乾燥し、親水性高分子の層を形成した。直径０．２ｍｍの円形の穴を複数有するメタルマスクを、親水性高分子の層上に置き、プラズマ照射装置（（株）真空デバイス製、商品名プラズマイオンボンバーダＰＩＢ－２０）を用いてメタルマスクの上からプラズマ処理（２０Ｐａガス圧下、導電電流２０ｍＡ、照射時間３０秒間）を行うことで、プラズマ処理した部分に細胞接着性及び細胞増殖性を有する領域（（Ａ）領域）を形成した。また、メタルマスクでマスクした部分に（Ｂ）領域を形成した。
　作製した細胞培養基材の構成及び評価結果を表２に示す。作製した細胞培養基材は親水性高分子の層の層厚が５０ｎｍ、（Ａ）領域の面積が０．０３ｍｍ２、（Ａ）領域と（Ｂ）領域の境界における凹凸高さが３３ｎｍであった。
　この細胞培養基材上でヒトｉＰＳ細胞の培養評価を行い、培養開始から２日後に細胞凝集塊の形成を確認した。目視判定では、形成された細胞凝集塊のサイズは均一であった。細胞凝集塊の高さ／直径の比は０．５と推定された。また、細胞凝集塊に含まれる細胞の生存率は８６％であり、高い細胞生存率であった。また、培地添加時に気泡は細胞培養基材に付着していなかった。
［実施例１０］
　実施例１と同様にして作製した細胞培養基材の表面（親水性高分子を含有する層が形成されている側）を、水不溶性ブロックセグメント及び温度応答性ブロックセグメントを有するブロック共重合体（温度応答性高分子）で被覆し、細胞培養基材を作製した。具体的には、試験管に、４－シアノ－４－［（ドデシルスルファニルチオカルボニル）スルファニル］ペンタノイックアシッド０．４０ｇ（０．１ｍｍｏｌ）、ｎ－ブチルメタクリレート７．１１ｇ（５０ｍｍｏｌ）、アゾビス（イソブチロニトリル）３３ｍｇ（０．２ｍｍｏｌ）を加え、１，４－ジオキサン５０ｍＬに溶解した。窒素バブリングにより３０分脱気を行った後、７０℃で２４時間反応させた。反応終了後、反応溶媒をロータリーエバポレーターにて減圧留去し、反応溶液を濃縮した。濃縮液をメタノール２５０ｍＬに注ぎ、析出した黄色油状物質を回収して減圧乾燥し、ｎ－ブチルメタクリレート重合体を得た。
　試験管に、得られた上記ｎ－ブチルメタクリレート重合体０．９ｇ（０．３ｍｍｏｌ）、Ｎ－イソプロピルアクリルアミド８．１４ｇ（７２ｍｍｏｌ）、アゾビスイソブチロニトリル５ｍｇ（０．０３ｍｍｏｌ）を加え、１，４－ジオキサン１５ｍＬに溶解させた。窒素バブリングにより３０分脱気を行った後、６５℃で１７時間反応させた。反応終了後、反応溶媒をアセトンで希釈し、ヘキサン５００ｍＬに注ぎ、析出した固体を回収して減圧乾燥した。また、アセトンに再度溶解させ、純水５００ｍＬに注ぎ、析出した固体を回収して減圧乾燥し、Ｎ－イソプロピルアクリルアミドとｎ－ブチルメタクリレートのブロック共重合体を得た。合成したブロック共重合体をエタノールに０．５ｗｔ％で溶解し、細胞培養基材の表面（親水性高分子を含有する層が形成されている側）に２０００ｒｐｍでスピンコートした。
　なお、ブロック共重合体の構成単位比率はｎ－ブチルメタクリレート４ｗｔ％、Ｎ－イソプロピルアクリルアミド９６ｗｔ％であり、ブロック共重合体の数平均分子量（Ｍｎ）は、７．７万であった。ブロック共重合体（温度応答性高分子）層の層厚は、ポリスチレンディッシュ上へブロック共重合体（温度応答性高分子）を直接被覆した場合の検量線から求めた。その結果、ブロック共重合体（温度応答性高分子）層の層厚は、２５ｎｍであった。
　作製した細胞培養基材の構成及び評価結果を表２に示す。作製した細胞培養基材は親水性高分子の層の層厚が６００ｎｍ、（Ａ）領域の面積が０．０３ｍｍ２、（Ａ）領域と（Ｂ）領域の境界における凹凸高さが４ｎｍであった。
　この細胞培養基材上でヒトｉＰＳ細胞の培養評価を行い、培養開始から２日後に細胞凝集塊の形成を確認した。目視判定では、形成された細胞凝集塊のサイズは均一であった。細胞凝集塊の高さ／直径の比は０．５と推定された。細胞凝集塊は細胞培養基材を冷却することで剥離した。また、細胞凝集塊に含まれる細胞の生存率は８８％であり、高い細胞生存率であった。また、培地添加時に気泡は細胞培養基材に付着していなかった。
［実施例１１］
　実施例１と同様にして作製した細胞培養基材の表面（親水性高分子を含有する層が形成されている側）を、水不溶性の単量体単位と温度応答性の単量体単位からなるランダム共重合体で被覆し、細胞培養基材を作製した。具体的には、試験管に、４－シアノ－４－［（ドデシルスルファニルチオカルボニル）スルファニル］ペンタノイックアシッド０．４０ｇ（０．１ｍｍｏｌ）、ｎ－ブチルメタクリレート７．１１ｇ（５０ｍｍｏｌ）、アゾビス（イソブチロニトリル）３３ｍｇ（０．２ｍｍｏｌ）、Ｎ－イソプロピルアクリルアミド５．６５ｇ（５０ｍｍｏｌ）、アゾビスイソブチロニトリル５ｍｇ（０．０３ｍｍｏｌ）を加え、１，４－ジオキサン１５ｍＬに溶解させた。窒素バブリングにより３０分脱気を行った後、７０℃で２４時間反応させた。反応終了後、反応溶媒をアセトンで希釈し、ヘキサン５００ｍＬに注ぎ、析出した固体を回収して減圧乾燥した。また、アセトンに再度溶解させ、純水５００ｍＬに注ぎ、析出した固体を回収して減圧乾燥し、Ｎ－イソプロピルアクリルアミドとｎ－ブチルメタクリレートのランダム共重合体を得た。得られたランダム共重合体をエタノールに０．５ｗｔ％で溶解し、細胞培養基材の表面（親水性高分子を含有する層が形成されている側）に２０００ｒｐｍでスピンコートした。
　なお、ランダム共重合体の構成単位比率はｎ－ブチルメタクリレート５４ｗｔ％、Ｎ－イソプロピルアクリルアミド４６ｗｔ％であり、ランダム共重合体の数平均分子量（Ｍｎ）は、１５．８万であった。ランダム共重合体層の層厚は、ポリスチレンディッシュ上へランダム共重合体を直接被覆した場合の検量線から求めた。その結果、ランダム共重合体層の層厚は、２５ｎｍであった。なお、ランダム共重合体層は、温度応答性高分子による層には該当しないが、表２では、便宜上、温度応答性高分子による層の欄に記載している。
　作製した細胞培養基材の構成及び評価結果を表２に示す。作製した細胞培養基材は親水性高分子の層の層厚が６００ｎｍ、（Ａ）領域の面積が０．０３ｍｍ２、（Ａ）領域と（Ｂ）領域の境界における凹凸高さが４ｎｍであった。
　この細胞培養基材上でヒトｉＰＳ細胞の培養評価を行い、培養開始から２日後に細胞凝集塊の形成を確認した。目視判定では、形成された細胞凝集塊のサイズは均一であった。細胞凝集塊の高さ／直径の比は０．５と推定された。細胞凝集塊は細胞培養基材を冷却することでは剥離しなかった。また、細胞凝集塊に含まれる細胞の生存率は８５％であり、高い細胞生存率であった。また、培地添加時に気泡は細胞培養基材に付着していなかった。
［実施例１２］
　膜厚１８０μｍのポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）フィルム（コスモシャイン、東洋紡（株）製）にプラズマ処理（２０Ｐａガス圧下、導電電流２０ｍＡ、照射時間３０秒間）を行った。親水性高分子としてアジド基を有するポリビニルアルコール（ＢＩＯＳＵＲＦＩＮＥ（Ｒ）－ＡＷＰ、東洋合成工業（株）製）を固形分濃度０．１ｗｔ％で含有する水／エタノール溶液を、上記ＰＥＴフィルムのプラズマ処理面に２０００ｒｐｍでスピンコートした。直径０．２ｍｍの円形のクロム蒸着領域を複数有する石英マスクを、親水性高分子の層上に置き、高圧水銀灯を用いて石英マスクの上から１０秒間ＵＶ照射を行った。水／エタノール＝２０／８０の混合溶媒で洗浄し、ＵＶ未照射の親水性ポリマーを溶解除去することで、細胞接着性及び細胞増殖性を有する領域（（Ａ）領域）を形成した。また、ＵＶ照射部分に（Ｂ）領域を形成した。このＰＥＴフィルムを底面が底抜けしているウェルプレート（貫通孔を有する板）と貼り合わせた。
　作製した細胞培養基材の構成及び評価結果を表２に示す。作製した細胞培養基材は親水性高分子の層の層厚が５０ｎｍ、（Ａ）領域の面積が０．０３ｍｍ２、（Ａ）領域と（Ｂ）領域の境界における凹凸高さが５０ｎｍであった。
　この細胞培養基材上でヒトｉＰＳ細胞の培養評価を行い、培養開始から２日後に細胞凝集塊の形成を確認した。目視判定では、形成された細胞凝集塊のサイズは均一であった。細胞凝集塊の高さ／直径の比は０．５と推定された。また、細胞凝集塊に含まれる細胞の生存率は９０％であり、高い細胞生存率であった。また、培地添加時に気泡は細胞培養基材に付着していなかった。
［参考例１］
　実施例１２の洗浄工程で用いる溶媒として、水／エタノール＝２０／８０の混合溶媒の代わりに、純水、水／エタノール＝８０／２０の混合溶媒、水／エタノール＝５０／５０の混合溶媒、エタノールを用いて、その他は実施例１２と同様にして細胞培養基材を作製した。
　これらの細胞培養基材上でヒトｉＰＳ細胞の培養評価を行い比較した結果を表３に示す。洗浄工程で水／エタノール混合溶媒を用いることで（Ａ）領域の細胞接着性及び細胞増殖性を高めることが可能とわかった。
［参考例２］
　実施例１２の基材として、ＰＥＴフィルムの代わりに厚み１．２ｍｍのＰＳ板、厚み０．１ｍｍのポリカーボネート（ＰＣ）フィルム（ユーピロン、三菱ガス（株）製）、ポリエチレン（ＰＥ）フィルム、ポリプロピレン（ＰＰ）フィルム、パーマノックススライドチャンバー（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）を用い、その他は実施例１２と同様にして細胞培養基材を作製した。
　これらの細胞培養基材上でヒトｉＰＳ細胞の培養評価を行い、培養した細胞を拡大倍率４０倍で位相差観察した。また、蛍光染色して細胞を観察し、比較した結果を表４に示す。基材が脂環式炭化水素基又は芳香族炭化水素基を構成単位に含む高分子を有することで（Ａ）領域の細胞増殖性に優れることがわかった。また、基材の屈折率が１．４～１．６、厚みが０．０１～０．５ｍｍであることで、細胞の明瞭な位相差像を得られることがわかった。さらに、基材の自家蛍光が低いことで、細胞の明瞭な蛍光像を得られることがわかった。
［比較例１］
　親水性高分子の固形分濃度を０．００３ｗｔ％に変更したこと以外は実施例４と同様にして細胞培養基材を作製した。
　作製した細胞培養基材の構成及び評価結果を表２に示す。作製した細胞培養基材は親水性高分子の層の層厚が３ｎｍ、プラズマ処理した領域の面積が０．０３ｍｍ２、プラズマ処理した領域とプラズマ処理していない領域の境界における凹凸高さが２５ｎｍであった。
　この細胞培養基材上でヒトｉＰＳ細胞の培養評価を行ったが、細胞培養基材の全面で細胞が接着及び増殖し、細胞凝集塊は形成されなかった。
［比較例２］
　親水性高分子の固形分濃度を３ｗｔ％に変更したこと以外は実施例４と同様にして細胞培養基材を作製した。
　作製した細胞培養基材の構成及び評価結果を表２に示す。作製した細胞培養基材は親水性高分子の層の層厚が３０００ｎｍ、プラズマ処理した領域の面積が０．０３ｍｍ２、プラズマ処理した領域とプラズマ処理していない領域の境界における凹凸高さが３８ｎｍであった。
　この細胞培養基材上でヒトｉＰＳ細胞の培養評価を行ったが、細胞は接着及び増殖しなかったため、細胞凝集塊は形成されなかった。
［比較例３］
　直径３．５ｃｍのポリスチレン（ＰＳ）ディッシュの内面をプラズマ照射装置（（株）真空デバイス製、商品名プラズマイオンボンバーダＰＩＢ－２０）を用いてプラズマ処理（２０Ｐａガス圧下、導電電流２０ｍＡ、照射時間３０秒間）した。親水性高分子としてアジド基を有するポリビニルアルコール（ＢＩＯＳＵＲＦＩＮＥ（Ｒ）－ＡＷＰ、東洋合成工業（株）製）を固形分濃度０．０８ｗｔ％で含有するエタノール溶液を、プラズマ処理したＰＳディッシュに０．８ｍＬ滴下し、室温で減圧乾燥し、親水性高分子の膜を形成した。直径０．２ｍｍの円形の黒色パターンを複数有するクロムマスクを親水性高分子の膜上に置き、ＵＶ照射することで親水性高分子の一部を硬化させた。次いで、純水で複数回洗浄することにより未硬化の親水性高分子を除去した。作製した細胞培養基材の構成及び評価結果を表２に示す。
　この細胞培養基材上でヒトｉＰＳ細胞の培養評価を行い、培養開始から１日後に細胞凝集塊の形成を確認したが、細胞凝集塊に含まれる細胞の生存率は６５％であり、細胞生存率が低いものであった。
［比較例４］
　直径３．５ｃｍのポリスチレン（ＰＳ）ディッシュの内面をプラズマ照射装置（（株）真空デバイス製、商品名プラズマイオンボンバーダＰＩＢ－２０）を用いてプラズマ処理（２０Ｐａガス圧下、導電電流２０ｍＡ、照射時間３０秒間）した。表面保護フィルム（日東電工（株）製、Ｅ－ＭＡＳＫ）にレーザー加工により直径０．２ｍｍの円形の穴を複数形成し、この表面保護フィルムをプラズマ処理したＰＳディッシュの内面に貼り付けた。
　作製した細胞培養基材の構成及び評価結果を表２に示す。作製した細胞培養基材は親水性高分子の層を有さず、プラズマ処理した領域（表面保護フィルムで被覆されていない領域）の面積が０．０３ｍｍ２、プラズマ処理した領域（表面保護フィルムで被覆されていない領域）と表面保護フィルムで被覆されている領域の境界における凹凸高さが約５８μｍであった。
　この細胞培養基材上でヒトｉＰＳ細胞の培養評価を行い、培養開始から１日後に細胞凝集塊の形成を確認したが、細胞凝集塊に含まれる細胞の生存率は５３％であり、細胞生存率が低いものであった。また、培地添加時に細胞培養基材に気泡が付着していた。
［比較例５］
　プラズマ処理を実施しなかったこと以外は実施例１と同様にして細胞培養基材を作製した。作製した細胞培養基材の構成及び評価結果を表２に示す。この細胞培養基材上でヒトｉＰＳ細胞の培養評価を行ったが、細胞は接着及び増殖しなかったため、細胞凝集塊は形成されなかった。
［比較例６］
　親水性高分子を使用しなかったこと（親水性高分子の層を形成しなかったこと）以外は実施例１と同様にして細胞培養基材を作製した。作製した細胞培養基材の構成及び評価結果を表２に示す。この細胞培養基材上でヒトｉＰＳ細胞の培養評価を行ったが、細胞培養基材の全面で細胞が接着及び増殖し、細胞凝集塊は形成されなかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　Ａ…（Ａ）領域、Ｂ…（Ｂ）領域、Ｈ…（Ａ）領域と（Ｂ）領域の境界における凹凸高さ、１…基材、２…親水性高分子を含有する層、１０，１１…細胞培養基材、２０…仕切り板。

Claims (21)

  1. 　基材と、前記基材の表面の少なくとも一部を被覆する層厚５～２０００ｎｍの親水性高分子を含有する層と、を備え、
    　前記親水性高分子は、ホスホリルコリン基又は水酸基を含み、
    　下記（Ａ）領域及び下記（Ｂ）領域を有し、
    　前記（Ａ）領域と前記（Ｂ）領域の境界における凹凸高さは１～５００ｎｍである、細胞培養基材。
    （Ａ）細胞接着性及び細胞増殖性を有する面積０．００１～５ｍｍ２の島状の領域
    （Ｂ）前記（Ａ）領域に隣接し、細胞接着性又は細胞増殖性を有しない領域
  2. 　前記親水性高分子が、下記一般式（１）で表される化合物、下記一般式（２）で表される化合物、又は下記一般式（３）で表される化合物を含む、請求項１に記載の細胞培養基材。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     ［一般式（１）中、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立に水素原子又はメチル基を示し、Ｒ３は水素原子又は任意の有機基を示し、ｍ及びｎはそれぞれ独立に正の整数を示す。］
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     ［一般式（２）中、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６はそれぞれ独立に水素原子又はメチル基を示し、Ｒ７は水素原子又は任意の有機基を示し、ｘ、ｙ及びｚはそれぞれ独立に正の整数を示す。］
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     ［一般式（３）中、Ｒ８及びＲ９はそれぞれ独立に水素原子又はメチル基を示し、Ｒ１０は水素原子又は任意の有機基を示し、ａ及びｂはそれぞれ独立に正の整数を示す。］
  3. 　前記親水性高分子が、ＵＶ反応性の官能基又はＵＶ反応後の残基を有する単量体単位を含む、請求項１又は２に記載の細胞培養基材。
  4. 　前記（Ａ）領域についてのＸＰＳ測定のＣ１ｓスペクトルにおける２８７ｅＶのピーク強度／２８５ｅＶのピーク強度の比が、前記（Ｂ）領域についてのＸＰＳ測定のＣ１ｓスペクトルにおける２８７ｅＶのピーク強度／２８５ｅＶのピーク強度の比よりも０．０５以上大きい、請求項１～３のいずれか一項に記載の細胞培養基材。
  5. 　前記親水性高分子を含有する層の表面に、層厚１～１００ｎｍの温度応答性高分子を含有する層を更に備え、
    　前記温度応答性高分子は、水不溶性ブロックセグメント及び温度応答性ブロックセグメントを含むブロック共重合体である、請求項１～４のいずれか一項に記載の細胞培養基材。
  6. 　前記水不溶性ブロックセグメント及び前記温度応答性ブロックセグメントの総重量に対する前記温度応答性ブロックセグメントの重量の割合が９０重量％超である、請求項５に記載の細胞培養基材。
  7. 　前記基材の屈折率が１．４～１．６であり、且つ、前記基材の厚みが０．０１～０．５ｍｍである、請求項１～６のいずれか一項に記載の細胞培養基材。
  8. 　励起波長３５０ｎｍ、４８８ｎｍ、及び６４７ｎｍでそれぞれ励起された前記基材の蛍光強度が、同じ励起波長で励起された、厚み１．２ｍｍのポリスチレン板の蛍光強度よりも小さい、請求項１～７のいずれか一項に記載の細胞培養基材。
  9. 　前記（Ａ）領域の面積が、０．００５～０．２ｍｍ２であり、
    　前記（Ａ）領域の数が、前記（Ａ）領域及び前記（Ｂ）領域の合計面積を基準として、２００～１０００個／ｃｍ２である、請求項１～８のいずれか一項に記載の細胞培養基材。
  10. 　前記（Ａ）領域の面積が、０．２～２ｍｍ２であり、
    　前記（Ａ）領域の数が、前記（Ａ）領域及び前記（Ｂ）領域の合計面積を基準として、３～１５個／ｃｍ２である、請求項１～９のいずれか一項に記載の細胞培養基材。
  11. 　前記（Ａ）領域同士の最小距離が、５００～１００００μｍである、請求項１～１０のいずれか一項に記載の細胞培養基材。
  12. 　多能性幹細胞から三胚葉細胞への分化誘導用である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の細胞培養基材。
  13. 　前記基材がポリカーボネート又はシクロオレフィンポリマーから形成される、請求項１～１２のいずれか一項に記載の細胞培養基材。
  14. 　（１）基材の表面の少なくとも一部をＵＶ反応性の親水性高分子を含有する組成物で被覆し、前記親水性高分子を含有する層を形成する工程、
    　（２）前記親水性高分子を含有する層にＵＶ照射を行い、前記親水性高分子を含有する層を前記基材の表面に固定化する工程、及び
    　（３）固定化した前記親水性高分子を含有する層の表面の一部にプラズマ処理を行い、プラズマ処理を行った部分に前記（Ａ）領域を形成する工程
    を備える、請求項１～１３のいずれか一項に記載の細胞培養基材の製造方法。
  15. 　（１’）繰り返し単位に脂環式炭化水素基又は芳香族炭化水素基を含む高分子から形成される基材を用い、前記基材の表面にプラズマ処理を行い、プラズマ処理を行った部分に前記（Ａ）領域を形成する工程、
    　（２’）前記基材の表面の少なくとも一部をＵＶ反応性の親水性高分子を含有する組成物で被覆し、前記親水性高分子を含有する層を形成する工程、
    　（３’）前記親水性高分子を含有する層の一部にＵＶ照射を行い、前記親水性高分子を含有する層の一部を前記基材の表面に固定化する工程、及び
    　（４’）前記親水性高分子を溶媒で洗浄し、表面に固定化されていない親水性高分子を溶解させて前記基材の表面から除去する工程
    を備える、請求項１～１３のいずれか一項に記載の細胞培養基材の製造方法。
  16. 　前記工程（４’）で使用する溶媒が、水及びアルコールを含有する、請求項１５に記載の細胞培養基材の製造方法。
  17. 　（４）前記工程（３）又は（４’）の後に、面内方向の断面積が０．０５～１００ｃｍ２の貫通孔を有する板を、前記基材の前記親水性高分子を含有する層で被覆した面側で前記基材と貼り合わせる工程を更に備える、請求項１４～１６のいずれか一項に記載の製造方法。
  18. 　（５）前記工程（３）又は（４’）の後に、プラズマ処理を行った前記親水性高分子を含有する層の表面を、温度応答性高分子を含有する組成物で被覆し、前記温度応答性高分子を含有する層を形成する工程を更に備える、請求項１４～１７のいずれか一項に記載の製造方法。
  19. 　（ｉ）請求項１～１３のいずれか一項に記載の細胞培養基材に多能性幹細胞を播種する工程、
    　（ｉｉ）前記多能性幹細胞を培養し、高さ／直径の比が０．２～０．８の半球状の細胞凝集塊を形成する工程、及び
    　（ｉｉｉ）前記細胞凝集塊を分化誘導し、三胚葉細胞の細胞凝集塊を形成する工程
    を含む、多能性幹細胞の分化誘導方法。
  20. 　下記（ｉｖ）に示される工程を更に備える、請求項１９に記載の多能性幹細胞の分化誘導方法。
    　（ｉｖ）Ｗｎｔタンパク質、Ｂｏｎｅ　ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ、インスリン様成長因子及びアクチビンからなる群より選択される少なくとも一種の分化誘導因子を含む培地中で細胞凝集塊を培養し、腸上皮細胞が有するマーカーを発現させる工程
  21. 　請求項１～１３のいずれか一項に記載の細胞培養基材と、水不溶性ブロックセグメント及び温度応答性ブロックセグメントを含むブロック共重合体若しくは前記ブロック共重合体を含有するコーティング剤とを含む、細胞培養キット。
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