JPH08140673A

JPH08140673A - スフェロイドの作製方法

Info

Publication number: JPH08140673A
Application number: JP6308185A
Authority: JP
Inventors: Kanetomo Kobayashi; 謙友小林; Michiko Tsuchida; 路子土田; Manabu Yamazaki; 学山崎; Yuichi Mori; 森　　有一
Original assignee: WR Grace and Co Conn; WR Grace and Co
Current assignee: WR Grace and Co Conn; WR Grace and Co
Priority date: 1994-11-17
Filing date: 1994-11-17
Publication date: 1996-06-04

Abstract

(57)【要約】【目的】所望のサイズ（所望の細胞数）のスフェロイド
を簡単かつ安価に大量生産する方法を提供すること。【構成】（Ａ）細胞に対して接着性を持たない、ゾルー
ゲル転移を示すゲル化物質を含有する培養液がゾル状態
にあるとき、細胞シートまたはスフェロイド前駆体を前
記培養液に浮遊させる工程、（Ｂ）その培養液を直ちに
ゲル化させる工程、（Ｃ）ゲル中で細胞シートまたはス
フェロイド前駆体を培養する工程、の３つの工程から成
るスフェロイドの作製方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、サイズのコントロール
されたスフェロイド（機能細胞集合体）を大量に作製す
るのに適した培養方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】今日、細胞培養技術は、バイオテクノロ
ジーを支える上での重要な基礎技術の１つであると共
に、インターフェロンなどの細胞産生物の生産や、薬剤
の毒性及び薬理活性評価のシュミレーターとして既に広
く利用されており、今後その重要性はますます高まるも
のと考えられている。この様に、広く利用されている細
胞培養技術ではあるが、従来の細胞培養法［単層（２次
元）培養法］には、いくつかの問題点があった。その１
つは、細胞が生体内で有している特異的な機能を長期間
維持することができない点であり、もう１つは、生体内
と同等な３次元組織を再構築する事ができない、という
点であった。

【０００３】これらの問題点を解決するための培養方法
として、スフェロイド培養法が、非常に注目を集めてい
る。スフェロイド培養法では、細胞が３次元集合体を形
成しているため、単層培養法と比較して、細胞の特異的
な機能を長期間維持でき、かつ、生体内と類似の３次元
構造を作ることができる。この特性を生かし、１）薬剤
の毒性及び薬理活性評価用のシュミレーター、２）ハイ
ブリッド型人工臓器、３）バイオリアクターなどの分野
で、スフェロイド培養法を利用した研究開発が活発に行
われている。

【０００４】しかしながら、従来のスフェロイド作製法
は、細胞非接着性基質［たとえば、アガロース、寒天な
どをコートした培養皿など(Ｊ．Ｃａｒｌｓｓｏｎａ
ｎｄＪ．Ｍ．Ｙｕｎｈａｓ，ｐ．ｐ．１−２３．ＲＲ
ＣＲ９５；ＳｐｈｅｒｏｉｄｓｉｎＣａｎｃｅｒＲ
ｅｓｅａｒｃｈ. Ｅｄｓ; Ｈ．Ａｃｋｅｒ, Ｊ. Ｃａｒ
ｌｓｓｏｎ，Ｒ．ＤｕｒａｎｄａｎｄＲ．Ｍ．Ｓｕ
ｔｈｅｒｌａｎｄ,Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ,
１９８４)]、または、細胞半接着性基質［たとえば、プ
ロテオグリカンをコートした培養皿、陽性荷電を付与し
た培養皿など、（Ｎ．Ｋｏｉｄｅｅｔａｌ．，Ｅｘ
ｐ．ＣｅｌｌＲｅｓ., １８６,２２７,１９９０）］
上で細胞を培養し、細胞が偶発的、または、自発的に凝
集して、スフェロイドを形成するものであった。従っ
て、スフェロイドを形成する細胞の種類は主に癌細胞、
胎児細胞、肝細胞などの凝集しやすい細胞種に限定さ
れ、かつ、スフェロイドの大きさをコントロールするこ
とはできず、形成されるスフェロイドの大きさは非常に
広い分布を持っていた。スフェロイドの大きさは、スフ
ェロイドを構成する細胞の数に依存する（Ｍ．Ｙａｍａ
ｚａｋｉｅｔａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉ
ｏｅｎｇ., ４４,３８.１９９４）。従って、従来のス
フェロイド作製法では、細胞数が制御されたスフェロイ
ドを作ることはできなかった。

【０００５】以下には細胞数が制御されたスフェロイド
の必要性を述べる。生体は細胞の集合体であるが、毛細
血管が全身をくまなく覆っているために、生体のどの部
分の細胞も、栄養分と酸素の補給、老廃物の除去という
点において、十分な状態に保たれている。しかしなが
ら、現在、作製することのできるスフェロイドの大多数
は、生体の毛細血管に当たる、輸送のための管腔構造を
持たない。従って、大きなスフェロイド（例えば１ｍｍ
以上）においては、スフェロイドの中心部の細胞と外表
面の細胞では、酸素と栄養分の補給、老廃物の除去にお
いて大きな差がでてくると考えられる。スフェロイドを
或大きさ（例えば４００μｍ）以下にすれば、スフェロ
イドを構成するすべての細胞をほぼ同じ状態にすること
が可能である。また、同じ大きさのスフェロイドを大量
に生産することができれば、各々のスフェロイド内の細
胞の状態を同じくすることができる。

【０００６】この様なサイズコントロールされた（細胞
数が制御された）スフェロイドを多量に製造することが
できれば、従来の単層培養法に代わる応用分野を開発す
ることもできる。例えば、薬剤の毒性及び薬理活性評価
用シュミレーターを例にとってみると、従来の単層培養
法では、細胞の生または死によってのみ、薬剤の毒性ま
たは薬理活性を評価してきた。従って、細胞死に至らな
いような毒性を正確に評価することができなかった。し
かしながら、スフェロイドを用いることにより、スフェ
ロイドの生死は勿論のこと、スフェロイド内の細胞の有
する特異的な機能の向上または低下、更に、スフェロイ
ドが形成する生体と類似の３次元構造に対する組織学的
な検査等により、従来法に代わる、非常に感度の高い薬
剤の毒性及び薬理活性評価用シュミレーターになると考
えられる。仮にこの様な新しい評価方法が開発される
と、動物代替法として、現在行われている動物実験を大
幅に削減できるものと期待される。

【０００７】なお、肝細胞スフェロイドをアルギン酸カ
ルシウムゲルでカプセル化して培養する例がすでに示さ
れている（Ｈ．Ｔａｋａｂａｔａｋｅｅｔａｌ，．
Ａｒｔｉｆ．Ｏｒｇａｎｓ．１５，４７４，１９９
１）。これは従来法（細胞半接着性基質を用いる）によ
り作製されたスフェロイドをゲル中に包埋して培養する
方法で、本発明のサイズコントロールされたスフェロイ
ドをゲル中で作製する方法とは根本的に異なるものであ
る。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】細胞数が制御されたス
フェロイドの作製方法として、本発明者らは、特開平４
−２７８０８３号公報と特開平４−２７８０７５号公報
に記載される方法を提案した。これらの方法は、温度感
応性高分子化合物と細胞接着性物質の混合物を細胞培養
基材として用い、かつ細胞の接着、増殖できる面積を制
御することにより、細胞数が制御されたスフェロイドを
大量生産する事ができるという画期的なものであった。
しかしながら、これらの方法に記載された培養基材より
回収される多数の細胞シートを、そのままシャーレ、フ
ラスコ、トレーなどで培養したり、また、回転培養法、
還流培養法及び、浮遊培養法などの既存の大量培養法に
応用すると、回収した細胞シートがスフェロイドを形成
する過程において、お互いに接着、凝集して大きなスフ
ェロイドになってしまい、目的とする細胞数が制御され
たスフェロイドをうまく作製することができない、と言
う欠点を有していた。そこで本発明はこれらの欠点を改
良した、スフェロイド作製方法を提供することを目的と
している。

【０００９】

【課題を解決するための手段】上記目的は、（Ａ）細胞
に対して接着性を持たない、ゾル−ゲル転移を示すゲル
化物質を含有する培養液がゾル状態にあるとき、細胞シ
ートまたはスフェロイド前駆体を前記培養液に浮遊させ
る工程、（Ｂ）その培養液を直ちにゲル化させる工程、
（Ｃ）ゲル中で細胞シートまたはスフェロイド前駆体を
培養する工程、の３つの工程から成るスフェロイド作製
方法によって達成された。

【００１０】細胞に対して接着性を持たない、ゾル−ゲ
ル転移を示すゲル化物質とは、そのゲル化物質を含有す
る溶液の温度変化、またはイオン濃度の変化などの環境
変化により、その溶液に、ゾル−ゲル転移をおこさせる
ような物質である。ゾル−ゲル転移を示すゲル化物質
は、培養する細胞に毒性を示さないようなもので、且
つ、細胞に接着性のないものであればどのようなもので
もよい。たとえば、寒天（アガー）、アガロース、デン
プン（アミロースとアミロペクチン）、セルロース誘導
体（ニトロセルロース、セルロースブチレート、メチル
セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースな
ど）、ジェランガム、カラギーナン、アルギン酸塩など
をあげることができる。上記ゾル−ゲル転移を示すゲル
化物質は単体で使用しても良いし、また、この中のいく
つかを混合して使用しても良い。ここにあげたのは当に
ゾル−ゲル転移を示すゲル化物質の例でありこれらに限
定されるものではない。コラーゲン、ゼラチンなど細胞
に対して接着性を持つゾル−ゲル転移を示すゲル化物質
は、たとえ毒性がなくてもこれには含まれない。なぜな
らば、これらゲルの中では、細胞シートがゲル化物質と
接着してしまい、細胞シートが自由に収縮できないた
め、スフェロイドを形成できないからである。アガー、
アガロース、アルギン酸塩が、すでに細胞培養に広く使
用されている点から特に望ましい。

【００１１】上記ゾル−ゲル転移を示すゲル化物質の培
養液中の濃度は特に限定されるものではない。なぜな
ら、その濃度は、形成されるゲルの強度を左右し、その
ゲル強度は、細胞シートのスフェロイド形成能に影響を
与えるからである。即ち、細胞の種類、細胞シートの大
きさなどにより、細胞シートがスフェロイドを形成する
ための最適なゲル強度が異なるためである。また、ゾル
−ゲル転移を示すゲル化物質の種類によっても、同じ濃
度のゲルの強度は異なるためである。しかしながら、一
般にゾル−ゲル転移を示すゲル化物質の培養液中の濃度
は、０．０１％（ｗ／ｖ）から５．０％（ｗ／ｖ）の範
囲である。この濃度以下ではゲル化能力がなくなってし
まうし、また、この濃度以上では、形成されるゲルの強
度が強すぎて、細胞シートまたはスフェロイド前駆体
が、そのゲル中でスフェロイドを形成することができな
くなるので適さない。

【００１２】ここで用いる培養液は、細胞シートまたは
スフェロイド前駆体を培養するのに適した細胞培養液で
有れば、何れのものを用いても良い。

【００１３】ここで言う細胞シートとは、細胞数の制御
された細胞シートを指す。また、スフェロイド前駆体と
は細胞シートが収縮してスフェロイドになる過程の状態
を指す。細胞シートの大きさは、０．０１ｃｍ²から１
０ｃｍ²で、細胞数は５０から１０⁶個、最終的なスフェ
ロイドの大きさで、５０μｍから１５００μｍの範囲に
含まれるものとするのが好ましい。ただし、細胞シート
またはスフェロイド前駆体を構成する細胞の種類は、複
数であってもよく、特に限定されない。

【００１４】前記ゾル−ゲル転移を示すゲル化物質を含
有する培養液は、ゾル状態で、多数の細胞シートまたは
スフェロイド前駆体と混合される。その後、ゲル化工程
で、培養液の温度、イオン濃度などを変えることによ
り、前記培養液はゾル状態からゲル状態になる。培養液
のゲル化により、細胞シートまたはスフェロイド前駆体
は、その位置で固定され、互いに接着、凝集することが
なくなる。その結果、次の培養工程で、１つ１つの細胞
シートまたはスフェロイド前駆体は独立して自由に収縮
し、最終的に目的とするサイズのスフェロイドを形成す
る。従って、一度に多数の細胞シートまたはスフェロイ
ド前駆体より、多数のサイズコントロールされたスフェ
ロイドを作製することができる。この培養工程では、ゲ
ル化した培養液に、前記ゲル化剤を含有しない培養液を
さらに添加する事も可能である。

【００１５】

【実施例】以下に実施例を示し、本発明をさらに具体的
に説明する。本発明の範囲は特許請求の範囲により限定
されるものであり、以下の実施例により限定されるもの
ではない。

【００１６】１．ポリマー・コラーゲンコートディッシ
ュの作製０．５％（ｗ／ｖ）牛真皮ペプシン可溶化タイプＩコラ
ーゲン溶液（ｐＨ３）（ＫＯＫＥＮＣＥＬＬＧＥＮ
Ｉ−ＰＣ,（株）高研製）と０．５％（ｗ／ｖ）ポリ−
Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（以下ＰＮＩＰＡＡ
ｍ、Ｍｎ＝３．５×１０⁶、モノマーより自家合成した）
水溶液（塩酸でｐＨ３に調整、この溶液はオートクレー
ブ処理後再溶解したもの）を、コラーゲンとＰＮＩＰＡ
Ａｍの混合比１対１９になるように混合し、キャスティ
ング溶液を調製した。このキャスティング溶液の４００
μｌを、市販のφ３５ｍｍディッシュ（Ｆａｌｃｏｎ
３００１、日本ベクトン製）に分注し、すばやく均一に
のばしてコーティングした。その後、１０℃のインキュ
ベーター内で約５時間乾燥させた。乾燥後のコート層の
厚みは約２μｍであった。乾燥後、紫外線照射装置（Ｘ
Ｘ−１００、波長２５４ｎｍ、フナコシ製）で紫外線を
照射した。紫外線の照射量は２０００Ｊ／ｍ²とした。
この条件が、線維芽細胞に対し、最も優れた細胞の接
着、増殖性と剥離性を示すことは事前に確認した。な
お、紫外線照射は直径５ｍｍの穴のあいたマスクを使用
して行った。これにより、回収された細胞シートは最終
的に２５０〜３００μｍのサイズのスフェロイドにな
る。これら一連の操作は無菌環境で行われた。

【００１７】２．培養用ゲルの調製０．１５ｇアガー（ＤＩＦＣＯ社製）を３０ｍｌの滅
菌水に混和後、オートクレーブ処理（１２１℃，１５分
間）をし０．５％アガー水溶液とした。この溶液の温度
を約４０℃に保ち、通常の２倍濃度の最少必須培地（Ｍ
ｉｎｉｍｕｍＥｓｓｅｎｔｉａｌＭｅｄｉｕｍ／２０
％牛胎児血清、日水製薬製、以下各々ＭＥＭ，ＦＢＳ）
と１対１で混和し０．２５％アガー／ＭＥＭ（１０％Ｆ
ＢＳ）を調製した。同様の方法で０．３％アガー／ＭＥ
Ｍ（１０％ＦＢＳ）を調製した。又、アガロース（Ｓ
ＩＧＭＡ社製）を用い０．１２５％アガロース／ＭＥＭ
（１０％ＦＢＳ）、０．２５％アガロース／ＭＥＭ（１
０％ＦＢＳ）、０．３％アガロース／ＭＥＭ（１０％Ｆ
ＢＳ）を上記の方法で調製した。

【００１８】３．ゲルコートディッシュの作製細胞シートを回収する前に細胞培養用ディッシュ（Ｆａ
ｌｃｏｎ３００１日本ベクトン製）に上記のゾルを各
々１ｍｌずつ加え４℃の冷蔵庫内で３０分間静置しゲル
化させ、５種類のゲルコートディッシュ［０．２５％ア
ガー／ＭＥＭ（１０％ＦＢＳ）コートディッシュ、０．
３％アガー／ＭＥＭ（１０％ＦＢＳ）コートディッシ
ュ、０．１２５％アガロース／ＭＥＭ（１０％ＦＢＳ）
コートディッシュ、０．２５％アガロース／ＭＥＭ（１
０％ＦＢＳ）コートディッシュ、０．３％アガロース／
ＭＥＭ（１０％ＦＢＳ）コートディッシュ］を作製し
た。このコートは、細胞シートが直接ディッシュに接着
しないようにするために行われた。

【００１９】４．ゲル内での細胞シートの状態の確認ヒト男性胎児肺由来の線維芽細胞（ＴＩＧ−７）を最少
必須培地（ＭＥＭ，１０％ＦＢＳ含有、日水製薬製）を
用いて、最終細胞濃度が約２×１０⁵細胞／ｍｌになる
ように細胞分散液を調製し、上記のポリマー・コラーゲ
ンコートディッシュに細胞分散液を２ｍｌずつ注入し
た。これを素早く３７℃の炭酸ガスインキュベーター
（５％炭酸ガス）内に移し３日間静置培養した。

【００２０】その後、インキュベーターよりディッシュ
を取り出し氷上で培養液の温度を下げ、細胞シートを回
収し、燐酸緩衝液（ＰＢＳ）中で細胞シートを洗浄し
た。先に作製した５種類のゲルコートディッシュに新た
に各々のゾル溶液１ｍｌを加えこのゾルが固まらないう
ちに細胞シートをこの上に移した。さらにゾル溶液を１
ｍｌ加え、４℃冷蔵庫中に移し３０分間静置しゲル化を
確認した。その後、ゲル化物質を含有しない新鮮な培養
液１ｍｌをゲルの上に加えた。これを３７℃の炭酸ガス
インキュベーター（５％炭酸ガス）内に移し静置し、４
日間の培養を行った。用いた５種類のゲル中で、０．３
％アガー／ＭＥＭ（１０％ＦＢＳ）と０．３％アガロー
ス／ＭＥＭ（１０％ＦＢＳ）中での細胞シートの培養開
始直後と培養日数２日目の位相差顕微鏡写真を図１から
４に示す。

【００２１】用いたゲル中で、どの細胞シートも培養日
数２日目にはスフェロイドを形成していた。また、ゲル
中で細胞シートが移動することは全くなかった。この結
果は、ゲル中で細胞シートからスフェロイドを形成させ
ることにより、多数の細胞シートが接着、凝集すること
なく、目的とするサイズ（２００〜３５０μｍ）のスフ
ェロイドになることを示していた。

【００２２】比較例比較例として回収した細胞シートを浮遊培養用ディッシ
ュ（Ｆａｌｃｏｎ１００８日本ベクトン製）上と、
０．２％（ｗ／ｖ）牛真皮ペプシン可溶化タイプＩコラ
ーゲン中性溶液（ｐＨ７．４）／ＭＥＭ（ＫＯＫＥＮ
ＣＥＬＬＧＥＮ，（株）高研製）中で培養した。このゲ
ルには最終濃度が１０％になるようにＦＢＳを加えた。

【００２３】浮遊培養用ディッシュ上では、培養日数２
日目に細胞シートはスフェロイドを形成していた。しか
し、細胞シートはディッシュ内の培養液中に浮遊してい
るだけなので、容易に他の細胞シートと接着、凝集して
しまい、目的とするサイズ（２００〜３００μｍ）のス
フェロイドにはならなかった。一方、コラーゲンゲル中
の細胞シートはほとんど収縮せず、培養日数７日目にも
スフェロイドを形成しなかった。

【００２４】

【発明の効果】本発明のスフェロイド作製方法を用いる
ことにより、目的とするサイズ（目的とする細胞数）の
スフェロイドを簡単に大量生産することができるように
なった。また本発明は、何ら特殊な培養装置を必要とし
ないため非常に経済的でもある。

【図面の簡単な説明】

【図１】０．３％アガー／ＭＥＭ（１０％ＦＢＳ）中の
培養開始直後の細胞シートの拡大写真である（倍率、８
５倍）。

【図２】０．３％アガー／ＭＥＭ（１０％ＦＢＳ）中で
形成されたスフェロイド（サイズ約３００μｍ）の拡大
写真である（培養日数２日）（倍率、８５倍）。

【図３】０．３％アガロース／ＭＥＭ（１０％ＦＢＳ）
中の培養開始直後の細胞シートの拡大写真である（倍
率、８５倍）。

【図４】０．３％アガロース／ＭＥＭ（１０％ＦＢＳ）
中で形成されたスフェロイド（サイズ約２５０μｍ）の
拡大写真である（培養日数２日）（倍率、８５倍）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者土田路子神奈川県海老名市上今泉2113 海老名アパートＣ−204 (72)発明者山崎学神奈川県秦野市鶴巻北２−５−37−405 (72)発明者森有一神奈川県横浜市金沢区釜利谷町1642−212 Ｂ−４

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】（Ａ）細胞に対して接着性を持たない、ゾ
ルーゲル転移を示すゲル化物質を含有する培養液がゾル
状態にあるとき、細胞シートまたはスフェロイド前駆体
を前記培養液に浮遊させる工程、（Ｂ）その培養液を直ちにゲル化させる工程、（Ｃ）ゲル中で細胞シートまたはスフェロイド前駆体を
培養する工程、の３つの工程から成るスフェロイドの作
製方法。
【請求項２】前記細胞に対して接着性を持たない、ゾル
ーゲル転移を示すゲル化物質が、寒天（アガー）、アガ
ロース、アルギン酸塩の何れかである請求項１記載のス
フェロイドの作製方法。