CN105308169B - 细胞培养器 - Google Patents

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Abstract

本发明提供细胞培养容器、使用了该细胞培养容器的细胞凝集块的制造方法以及该细胞培养容器的制造方法，所述细胞培养容器的特征在于，在表面上涂覆有下述共聚物，所述共聚物包含：包含下述式(a)表示的有机基团的重复单元和包含下述式(b)表示的有机基团的重复单元(式中，Ua1、Ua2、Ub1、Ub2及Ub3、以及An－如说明书及权利要求书中所记载的那样)。

Description

细胞培养器
技术领域
本发明涉及细胞培养器、该细胞培养器的制造方法及使用了该细胞培养器的细胞凝集块(也称为细胞球(sphere))的制造方法。本发明尤其涉及特征在于在表面上涂覆有具有抑制生物材料尤其是细胞附着的能力的共聚物的细胞培养容器及其制造方法。
背景技术
近年来，用于使在动物、植物体内发挥不同作用的各种器官、组织及细胞在机体外增殖或维持的技术不断发展。使上述器官、组织在机体外增殖或维持分别被称为器官培养、组织培养，使从器官、组织分离的细胞在机体外增殖、分化或维持被称为细胞培养。细胞培养是在培养基中使分离的细胞在机体外增殖、分化或维持的技术，对于详细分析机体内的各种器官、组织、细胞的功能及结构是不可缺少的。另外，利用该技术培养的细胞和/或组织已在化学物质、医药品等的药效及毒性评价、酶、细胞增殖因子、抗体等有用物质的大量生产、修复因疾病、缺损而丧失的器官、组织、细胞的再生医疗、植物的品种改良、基因重组作物的制成等多种领域中被利用。
来源于动物的细胞根据其形状主要可分为悬浮细胞和贴壁细胞。悬浮细胞是生长·增殖不需要固定位置的细胞，贴壁细胞是生长·增殖需要固定位置的细胞，构成机体的大部分细胞是后者的贴壁细胞。作为贴壁细胞的培养方法，已知单层培养、分散培养、包埋培养、微载体培养、及细胞凝集块(细胞球)培养等。
尤其是，近年来，伴随着再生医疗领域的发展，作为在更接近机体内的环境中培养的方法，细胞球培养受到关注，报道了多种适于该培养的培养基组合物、培养基添加剂(例如，参见专利文献1 及2)。另外，认为细胞球培养中，来自培养容器(基材)的刺激是影响培养结果的重要因素，人们需要在不存在来自培养容器的刺激的三维环境或完全的悬浮状态下培养细胞(尤其是细胞凝集块)(例如，参见专利文献3)。
现有技术文献
专利文献
[专利文献1]国际公开第2014/017513号公报
[专利文献2]国际公开第2013/144372号公报
[专利文献3]日本特开2008－61609号公报
发明内容
发明所要解决的课题
本发明的目的在于提供细胞培养器、该细胞培养器的制造方法及使用了该细胞培养器的细胞凝集块的制造方法。尤其是，本发明的目的在于提供特征在于在表面涂覆有具有抑制生物材料尤其是细胞附着的能力的共聚物的细胞培养容器、该细胞培养容器的制造方法及使用了该细胞培养容器的细胞凝集块的制造方法。
以往，为了在三维环境中或完全的悬浮状态下培养细胞(尤其是细胞凝集块)，存在细胞附着于容器表面(壁面)、以及细胞培养容器所带有的涂层溶出到培养液这样的问题。虽然带有基于亲水性化合物的涂层的细胞培养容器能改善细胞在容器表面(壁面)上的附着，但依然存在细胞培养容器所带有的涂层向培养液的溶出等问题。另外，还存在以下这样的问题：基于亲水性化合物的涂层相对于放射线的耐性不充分，在涂覆后不能利用放射线灭菌的情况很多，需要进行无菌生产。
用于解决课题的手段
本申请的发明人着眼于作为具有抑制多种生物材料附着的能力的涂覆材料而受到期待的具有磷酸酯基的聚合物，进行了深入研究。结果发现，用包含特定的有机基团的共聚物涂覆表面的至少一部分而得到的细胞培养容器，不仅抑制细胞在容器表面(壁面)上附着，而且，涂层可在容器表面上牢固地固着，因此，作为涂层的向培养液的溶出、放射线耐性得到改善的细胞培养容器是有用的，从而完成了本发明。
即，本发明如下所述：
1.细胞培养容器，其特征在于，在表面上涂覆有下述共聚物，所述共聚物包含：包含下述式(a)表示的有机基团的重复单元和包含下述式(b)表示的有机基团的重复单元；
Figure BDA0000869773050000031
(式中，Ua1、Ua2、Ub1、Ub2及Ub3各自独立地表示氢原子、或碳原子数1～5的直链或支链烷基，而且An－表示选自卤化物离子、无机酸根离子、氢氧化物离子及异硫氰酸根离子中的阴离子。)
2.上述项1所述的细胞培养容器，其中，包含上述式(a)表示的有机基团的重复单元及包含上述式(b)表示的有机基团的重复单元分别为由下述式(A)及(B)表示的单体衍生的重复单元；
Figure BDA0000869773050000032
(式中，Ta、Tb、Ua1、Ua2、Ub1、Ub2及Ub3各自独立地表示氢原子、或碳原子数1～5的直链或支链烷基，Qa及Qb各自独立地表示单键、酯键或酰胺键，Ra及Rb各自独立地表示可被卤原子取代的、碳原子数1～10的直链或支链亚烷基，An－表示选自卤化物离子、无机酸根离子、氢氧化物离子及异硫氰酸根离子中的阴离子，而且m 表示0～6的整数。)
3.上述项2所述的细胞培养容器，其中，m为1，Ra及Rb各自独立地表示亚乙基或亚丙基；
4.上述项1～3中任一项所述的细胞培养容器，其中，上述共聚物还包含由下述式(C)或(D)表示的单体衍生的交联结构；
Figure BDA0000869773050000041
(式中，Tc、Td及Ud各自独立地表示氢原子、或碳原子数1～5 的直链或支链烷基，Rc及Rd各自独立地表示可被卤原子取代的、碳原子数1～10的直链或支链亚烷基。)
5.上述项4所述的细胞培养容器，其中，Tc及Td各自独立地表示氢原子或甲基，Ud表示氢原子，Rc及Rd各自独立地表示亚乙基或亚丙基；
6.细胞培养容器的制造方法，包括以下工序：
将下述共聚物涂覆于容器表面的至少一部分上的工序，所述共聚物包含：包含下述式(a)表示的有机基团的重复单元和包含下述式(b)表示的有机基团的重复单元；以及
于－200℃～200℃干燥经涂覆的容器的工序；
Figure BDA0000869773050000042
Figure BDA0000869773050000051
(式中，Ua1、Ua2、Ub1、Ub2及Ub3各自独立地表示氢原子、或碳原子数1～5的直链或支链烷基，而且An－表示选自卤化物离子、无机酸根离子、氢氧化物离子及异硫氰酸根离子中的阴离子。)
7.上述项6所述的制造方法，其中，包含上述式(a)表示的有机基团的重复单元及包含上述式(b)表示的有机基团的重复单元分别为由下述式(A)及(B)表示的单体衍生的重复单元；
Figure BDA0000869773050000052
(式中，Ta、Tb、Ua1、Ua2、Ub1、Ub2及Ub3各自独立地表示氢原子、或碳原子数1～5的直链或支链烷基，Qa及Qb各自独立地表示单键、酯键或酰胺键，Ra及Rb各自独立地表示可被卤原子取代的、碳原子数1～10的直链或支链亚烷基，An－表示选自卤化物离子、无机酸根离子、氢氧化物离子及异硫氰酸根离子中的阴离子，而且m 表示0～6的整数。)
8.上述项6或7所述的制造方法，其中，使用包含共聚物的清漆实施涂覆工序；
9.上述项8所述的制造方法，其中，包含共聚物的清漆预先经 pH调节；
10.上述项6～9中任一项所述的制造方法，其中，还包括在干燥工序前和/或干燥工序后对经涂覆的细胞培养容器进行洗涤的工序；
11.上述项10所述的制造方法，其中，干燥工序后的洗涤使用选自水和含有电解质的水溶液中的至少1种溶剂来实施；
12.上述项6～11中任一项所述的制造方法，其中，还包括在干燥后利用放射线处理进行灭菌的工序；
13.细胞凝集块的制造方法，其特征在于，使用利用上述项1～ 5中任一项所述的细胞培养容器或上述项6～12中任一项所述的制造方法制造的细胞培养容器；
14.上述项13所述的细胞凝集块的制造方法，其特征在于，细胞培养容器中的培养基包含多糖类，所述多糖类形成纳米纤维，具有使细胞或组织悬浮的效果；
15.上述项14所述的细胞凝集块的制造方法，其特征在于，多糖类为脱酰基化结冷胶。
发明的效果
本发明的细胞培养容器通过使用用包含特定的有机基团的共聚物涂覆表面的至少一部分而成的容器，可抑制细胞附着到容器表面(壁面)上。本发明的细胞培养容器是用包含式(a)表示的阴离子、式(b)表示的阳离子的共聚物涂覆容器表面的至少一部分而得到的，因此可认为，通过该阳离子及阴离子的静电平衡，容器元件的表面保持电中性，可防止细胞的附着。另一方面，通过涂层中的该阳离子及阴离子形成离子键(离子络合)，从而成为能对容器基材种类没有选择性地固着于玻璃、纤维、无机粒子或树脂(合成树脂及天然树脂)等，并且，固着后相对于水系溶剂(水、磷酸缓冲液(PBS)、醇等)的耐久性优异的涂层。另外，上述涂层的放射线耐性也优异，可利用放射线进行灭菌。即，通过本发明，可提供除了抑制细胞的附着之外、相对于溶剂、放射线的耐久性也优异的细胞培养容器。
附图说明
[图1]表示试验例1中得到的使用用表面处理剂L1涂覆过的平底培养板培养的HepG2细胞的凝集块的显微镜照片(倍率：40倍)。
[图2](a)表示试验例3中得到的使用用表面处理剂L1涂覆过的平底培养板、使用未添加脱酰基化结冷胶的培养基培养的HepG2 细胞的凝集块的显微镜照片(倍率：40倍)。(b)表示试验例3 中得到的使用用表面处理剂L1涂覆过的平底培养板、使用添加有脱酰基化结冷胶的培养基培养的HepG2细胞的凝集块的显微镜照片 (倍率：40倍)。
具体实施方式
《细胞培养容器》
本发明的第一方式为细胞培养容器，其特征在于，在表面上涂覆有下述共聚物，所述共聚物包含：包含下述式(a)表示的有机基团的重复单元和包含下述式(b)表示的有机基团的重复单元。
Figure BDA0000869773050000071
(式中，Ua1、Ua2、Ub1、Ub2及Ub3各自独立地表示氢原子、或碳原子数1～5的直链或支链烷基，而且An－表示选自卤化物离子、无机酸根离子、氢氧化物离子及异硫氰酸根离子中的阴离子。)
＜细胞＞
本发明中的细胞是指构成动物或植物的最基本的单位，作为其要素，在细胞膜的内部具有细胞质和各种细胞器。此时，细胞内部可包含内含DNA的核，也可不包含内含DNA的核。例如，本发明中的来源于动物的细胞包括精子、卵子等生殖细胞，构成机体的体细胞，干细胞(多能干细胞等)，前体细胞，从机体分离出的癌细胞，从机体分离、且获得不死能力、并可在体外稳定维持的细胞(细胞株)，从机体分离、且人为改变基因而得到的细胞，从机体分离、且人为更换了核的细胞等。作为构成机体的体细胞的例子，包括但不限于成纤维细胞、骨髓细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞、嗜中性粒细胞、红细胞、血小板、巨噬细胞、单核细胞、骨细胞、骨髓细胞、周皮细胞、树突状细胞、角质化细胞、脂肪细胞、间质细胞、上皮细胞、表皮细胞、内皮细胞、血管内皮细胞、肝实质细胞、软骨细胞、卵丘细胞、神经细胞、神经胶质细胞、神经元、少突胶质细胞、小胶质细胞、星形胶质细胞、心脏细胞、食道细胞、肌肉细胞(例如，平滑肌细胞或骨骼肌细胞)、胰岛β细胞细胞、黑素细胞、定向造血干细胞(例如，来源于脐带血的CD34阳性细胞)、及单核细胞等。该体细胞例如包括从皮肤、肾脏、脾脏、肾上腺、肝脏、肺、卵巢、胰脏、子宫、胃、结肠、小肠、大肠、膀胱、前列腺、精巢、胸腺、肌肉、结缔组织、骨、软骨、血管组织、血液(包括脐带血)、骨髓、心脏、眼、脑或神经组织等任意的组织采集的细胞。干细胞是指兼有复制自身的能力和分化成其他多种系统的细胞的能力的细胞，作为其例子，包括但不限于胚胎干细胞(ES细胞)、胚胎肿瘤细胞、胚性生殖干细胞、诱导多能干细胞(iPS细胞)、神经干细胞、造血干细胞、间充质干细胞、肝干细胞、胰干细胞、肌干细胞、生殖干细胞、肠干细胞、癌干细胞、毛囊干细胞等。作为多能干细胞，可举出上述干细胞中的ES细胞、胚性生殖干细胞、iPS 细胞。前体细胞是指处于从上述干细胞分化成特定的体细胞、生殖细胞中途的阶段的细胞。癌细胞是指从体细胞派生的获得无限增殖能力的细胞。细胞株是指利用机体外的人为操作而获得无限的增殖能力的细胞。
作为癌细胞株的例子，不受以下列举的例子的限制，作为人乳癌细胞株，可举出HBC－4、BSY－1、BSY－2、MCF－7、MCF－ 7/ADR RES、HS578T、MDA－MB－231、MDA－MB－435、MDA －N、BT－549、T47D，作为人子宫颈癌细胞株，可举出HeLa，作为人肺癌细胞株，可举出A549、EKVX、HOP－62、HOP－92、NCI －H23、NCI－H226、NCI－H322M、NCI－H460、NCI－H522、DMS273、DMS114，作为人大肠癌细胞株，可举出Caco－2、COLO －205、HCC－2998、HCT－15、HCT－116、HT－29、KM－12、SW －620、WiDr，作为人前列腺癌细胞株，可举出DU－145、PC－3、 LNCaP，作为人中枢神经系统癌细胞株，可举出U251、SF－295、 SF－539、SF－268、SNB－75、SNB－78、SNB－19，作为人卵巢癌细胞株，可举出OVCAR－3、OVCAR－4、OVCAR－5、OVCAR－8、SK－OV－3、IGROV－1，作为人肾癌细胞株，可举出RXF－ 631L、ACHN、UO－31、SN－12C、A498、CAKI－1、RXF－393L、 786－0、TK－10，作为人胃癌细胞株，可举出MKN45、MKN28、St－4、MKN－1、MKN－7、MKN－74，作为皮肤癌细胞株，可举出LOX－IMVI、LOX、MALME－3M、SK－MEL－2、SK－MEL－ 5、SK－MEL－28、UACC－62、UACC－257、M14，作为白血病细胞株，可举出CCRF－CRM、K562、MOLT－4、HL－60TB、RPMI8226、 SR、UT7/TPO、Jurkat等。作为细胞株的例子，包括但不限于HEK293 (人源胚胎肾细胞)、MDCK、MDBK、BHK、C－33A、AE－1、 3D9、Ns0/1、NIH3T3、PC12、S2、Sf9、Sf21、High Five(注册商标)、Vero等。作为肝细胞株的例子，不受以下列举的例子的限制，可举出HepG2、Hep3B、HepaRG(注册商标)、JHH7、HLF、HLE、PLC/PRF/5、WRL68、HB611、SK－HEP－1、HuH－4、HuH－7等。
本发明中的来源于植物的细胞包括从植物体的各组织分离出的细胞，还包括人为地从该细胞除去细胞壁而得到的原生质体。
＜容器＞
构成本发明的细胞培养容器的涂覆有共聚物的容器可以是本技术领域中使用的任意形态的容器类，例如，可举出细胞的培养中通常使用的培养皿、烧瓶、塑料袋、Teflon(注册商标)袋、培养皿、 Petri培养皿、组织培养用培养皿、多用途培养皿、微孔培养板、微孔板、多用途培养板、多孔培养板、细胞培养玻片、细胞培养烧瓶、旋转式烧瓶、管、浅盘、培养袋、摇瓶等。可优选举出6～1536孔的多孔培养板及培养皿。
作为容器的原材料，典型地，可使用玻璃或树脂。从加工容易性、经济性等方面考虑，优选使用树脂。树脂可以是天然树脂或合成树脂中的任何，作为天然树脂，例如，可举出纤维素、三乙酸纤维素(CTA)、硫酸葡聚糖经固定化而成的纤维素等，作为合成树脂，例如，可举出聚丙烯腈(PAN)、聚酯类-多聚物合塑体(PEPA)、聚苯乙烯(PS)、聚砜(PSF)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚乙烯醇(PVA)、聚氨酯(PU)、乙烯－乙烯醇(EVAL)、聚乙烯(PE)、聚酯(PE)、聚丙烯(PP)、聚偏氟乙烯(PVDF)、各种离子交换树脂或聚醚砜(PES)等。在制造本发明的细胞培养容器时，以使得共聚物存在于该容器的表面的至少一部分上的方式进行涂覆时，不需要高温下的处理，因此，也可应用耐热性低的树脂等。
＜共聚物＞
本发明的细胞培养容器的特征在于，用特定的共聚物涂覆容器的表面的至少一部分。本发明涉及的共聚物包含：包含下述式(a) 表示的有机基团的重复单元和包含下述式(b)表示的有机基团的重复单元。
Figure BDA0000869773050000101
(式中，Ua1、Ua2、Ub1、Ub2及Ub3各自独立地表示氢原子、或碳原子数1～5的直链或支链烷基，而且An－表示选自卤化物离子、无机酸根离子、氢氧化物离子及异硫氰酸根离子中的阴离子。)
本发明涉及的共聚物只要是含有包含上述式(a)表示的有机基团的重复单元和包含上述式(b)表示的有机基团的重复单元的共聚物即可，没有特别限制。该共聚物优选为对包含上述式(a)表示的有机基团的单体和包含上述式(b)表示的有机基团的单体进行自由基聚合而得到的聚合物，但也可使用进行缩聚、加聚反应而得到的聚合物。作为共聚物的例子，可举出烯烃反应而得的乙烯基聚合聚合物、聚酰胺、聚酯、聚碳酸酯、聚氨酯等，这些中，特别优选链烯反应而得的乙烯基聚合聚合物或使(甲基)丙烯酸酯化合物聚合而得的(甲基)丙烯酸类聚合物。需要说明的是，本发明中，(甲基)丙烯酸酯化合物的含义表示丙烯酸酯化合物和甲基丙烯酸酯化合物二者。例如，(甲基)丙烯酸是指丙烯酸及甲基丙烯酸。
优选地，包含上述式(a)表示的有机基团的单体及包含上述式 (b)表示的有机基团的单体分别为下述式(A)及(B)表示的单体。
Figure BDA0000869773050000111
(式中，Ta、Tb、Ua1、Ua2、Ub1、Ub2及Ub3各自独立地表示氢原子、或碳原子数1～5的直链或支链烷基，Qa及Qb各自独立地表示单键、酯键或酰胺键，Ra及Rb各自独立地表示可被卤原子取代的、碳原子数1～10的直链或支链亚烷基，An－表示选自卤化物离子、无机酸根离子、氢氧化物离子及异硫氰酸根离子中的阴离子，而且m 表示0～6的整数。)
因此，由式(A)及(B)表示的单体衍生的重复单元分别由下述式(a1)及(b1)表示。
Figure BDA0000869773050000112
Figure BDA0000869773050000121
(式中，Ta、Tb、Ua1、Ua2、Ub1、Ub2及Ub3、Qa及Qb、Ra及Rb、 An－以及m与上文所述的含义相同。)
本发明中，作为“碳原子数1～5的直链或支链烷基”，例如，可举出甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、1－甲基丁基、2－甲基丁基、3－甲基丁基、1，1 －二甲基丙基、1，2－二甲基丙基、2，2－二甲基丙基或1－乙基丙基。
本发明中，“酯键”是指－C(＝O)－O－或－O－C(＝O) －，“酰胺键”是指－NHC(＝O)－或－C(＝O)NH－。
本发明中，“可被卤原子取代的、碳原子数1～10的直链或支链亚烷基”是指碳原子数1～10的直链或支链亚烷基、或被1个以上的卤原子取代的碳原子数1～10的直链或支链亚烷基。此处，“碳原子数1～10的直链或支链亚烷基”为从前文所述的烷基再进一步去掉1个氢原子而得到的2价的有机基团，例如，可举出亚甲基、亚乙基、亚丙基、三亚甲基、四亚甲基、1－甲基亚丙基、2－甲基亚丙基、二甲基亚乙基、乙基亚乙基、五亚甲基、1－甲基－四亚甲基、2－甲基－四亚甲基、1，1－二甲基－三亚甲基、1，2－二甲基－三亚甲基、2，2－二甲基－三亚甲基、1－乙基－三亚甲基、六亚甲基、八亚甲基及十亚甲基等。这些中，优选亚乙基、亚丙基、八亚甲基及十亚甲基，更优选碳原子数1～5的直链或支链亚烷基，例如，亚乙基、亚丙基、三亚甲基、四亚甲基，特别优选亚乙基或亚丙基。“被1个以上的卤原子取代的碳原子数1～10的直链或支链亚烷基”是指上述亚烷基中的1个以上的任意的氢原子被卤原子取代而得到的基团，特别优选亚乙基或亚丙基的氢原子的一部分或全部被卤原子取代而得到的基团。
本发明中，作为“卤原子”，可举出氟原子、氯原子、溴原子或碘原子。
本发明中，“卤化物离子”是指卤原子的阴离子，可举出氟化物离子、氯化物离子、溴化物离子、碘化物离子，优选为氯化物离子。
本发明中，“无机酸根离子”是指碳酸根离子、硫酸根离子、磷酸根离子、磷酸氢根离子、磷酸二氢根离子、硝酸根离子、高氯酸根离子或硼酸根离子。
作为上述An－优选的是，卤化物离子、硫酸根离子、磷酸根离子、氢氧化物离子及异硫氰酸根离子，特别优选的是卤化物离子。
式(A)及(B)中，Ta及Tb优选各自独立地为氢原子、甲基或乙基，更优选各自独立地为氢原子或甲基。
式(a)、式(b)、式(A)及(B)中，Ua1、Ua2、Ub1、Ub2及Ub3优选各自独立地为氢原子、甲基或乙基。式(a)及式(A) 中，Ua1及Ua2更优选为氢原子。式(b)及(B)中，Ub1、Ub2(及 Ub3)更优选为甲基或乙基，特别优选为甲基。
式(A)及(B)中，Qa及Qb优选各自独立地为酯键(－C(＝ O)－O－或－O－C(＝O)－)或酰胺键(－NHC(＝O)－或－ C(＝O)NH－)，更优选各自独立地为－C(＝O)－O－或－C(＝O)NH－，特别优选为－C(＝O)－O－。
式(A)及(B)中，Ra及Rb优选各自独立地为可被卤原子取代的、碳原子数1～3的直链或支链亚烷基，更优选各自独立地为亚乙基或亚丙基，或被1个氯原子取代的亚乙基或亚丙基，特别优选为亚乙基或亚丙基。
式(A)及(B)中，m优选表示0～3的整数，更优选表示1 或2的整数，特别优选为1。
作为上述式(A)的具体例，可举出乙烯基膦酸、(甲基)丙烯酸磷酰氧基乙酯、(甲基)丙烯酸3－氯－2－磷酰氧基丙酯、(甲基)丙烯酸磷酰氧基丙酯、(甲基)丙烯酸磷酰氧基甲酯、磷酰氧基聚氧乙二醇单(甲基)丙烯酸酯、磷酰氧基聚氧丙二醇单(甲基) 丙烯酸酯等，这些中，可优选使用乙烯基膦酸、甲基丙烯酸磷酰氧基乙酯(＝磷酸2－(甲基丙烯酰基氧基)乙酯)。
乙烯基膦酸、甲基丙烯酸磷酰氧基乙酯(＝磷酸2－(甲基丙烯酰基氧基)乙酯)及磷酰氧基聚氧乙二醇单甲基丙烯酸酯的结构式分别由下述式(A－1)～式(A－3)表示。
Figure BDA0000869773050000141
在合成上述化合物时，有时包含后述的通式(C)或(D)表示那样的具有2个官能团的(甲基)丙烯酸酯化合物。
作为上述式(B)的具体例，可举出(甲基)丙烯酸二甲基氨基乙酯、(甲基)丙烯酸二乙基氨基乙酯、(甲基)丙烯酸二甲基氨基丙酯、(甲基)丙烯酸2－(叔丁基氨基)乙酯、甲基丙烯酰基胆碱氯化物等，这些中，可优选使用(甲基)丙烯酸二甲基氨基乙酯、甲基丙烯酰基胆碱氯化物或(甲基)丙烯酸2－(叔丁基氨基)乙酯。
丙烯酸二甲基氨基乙酯(＝丙烯酸2－(二甲基氨基)乙酯)、甲基丙烯酸二甲基氨基乙酯(＝甲基丙烯酸2－(二甲基氨基)乙酯)、甲基丙烯酰基胆碱氯化物及甲基丙烯酸2－(叔丁基氨基)乙酯(＝甲基丙烯酸2－(叔丁基氨基)乙酯的结构式分别由下述式(B－1)～式(B－4)表示。
Figure BDA0000869773050000151
上述共聚物中，包含式(a)表示的有机基团的重复单元(或式 (a1)表示的重复单元)的比例为20摩尔％～80摩尔％、优选为30 摩尔％～70摩尔％、进一步优选为40摩尔％～60摩尔％。需要说明的是，本发明涉及的共聚物可包含2种以上的包含式(a)表示的有机基团的重复单元(或式(a1)表示的重复单元)。
上述共聚物中，包含式(b)表示的有机基团的重复单元(或式 (b1)表示的重复单元)的比例可以是从全部共聚物中减去上述式 (a)(或式(a1))的比例后剩余的部分全部，也可以是从全部共聚物中减去上述式(a)(或式(a1))和下文中记载的第3成分的总比例后剩余的部分。需要说明的是，本发明涉及的共聚物可包含2 种以上的包含式(b)表示的有机基团的重复单元(或式(b1)表示的重复单元)。
本发明涉及的共聚物可进一步共聚任选的第3成分。例如，共聚具有2个以上的官能团的(甲基)丙烯酸酯化合物作为第3成分，聚合物的一部分可部分三维交联。作为这样的第3成分，例如，可举出下述式(C)或(D)表示的2官能性单体。
Figure BDA0000869773050000161
(式中，Tc、Td及Ud各自独立地表示氢原子、或碳原子数1～5 的直链或支链烷基，Rc及Rd各自独立地表示可被卤原子取代的、碳原子数1～10的直链或支链亚烷基。)
即，本发明涉及的共聚物优选为包含由这样的2官能性单体衍生的交联结构的共聚物。
式(C)及(D)中，Tc及Td优选各自独立地为氢原子、甲基或乙基，更优选各自独立地为氢原子或甲基。
式(C)及(D)中，Ud优选为氢原子、甲基或乙基，更优选为氢原子。
式(C)及(D)中，Rc及Rd优选各自独立地为可被卤原子取代的、碳原子数1～3的直链或支链亚烷基，更优选各自独立地为亚乙基或亚丙基，或被1个氯原子取代的亚乙基或亚丙基，特别优选为亚乙基或亚丙基。
作为式(C)表示的2官能性单体，可优选举出乙二醇二(甲基) 丙烯酸酯、三乙二醇二(甲基)丙烯酸酯、丙二醇二(甲基)丙烯酸酯等。作为式(D)表示的2官能性单体，可优选举出磷酸双(甲基丙烯酰基氧基甲酯)、磷酸双[2－(甲基丙烯酰基氧基)乙酯]、磷酸双[2－(甲基丙烯酰基氧基)丙酯]等。
任选的第3成分可以是3官能性单体。关于作为上述第3成分的3官能性单体，例如，可举出三丙烯酸氧次膦基三(氧基－2，1 －乙烷二基)酯(Triacrylic acidphosphinylidynetris(oxy－2，1－ ethanediyl)ester)。
这些中，特别优选下述式(C－1)表示的乙二醇二(甲基)丙烯酸酯及下述式(D－1)表示的磷酸双[2－(甲基丙烯酰基氧基) 乙酯]。
Figure BDA0000869773050000171
共聚物中，可包含1种或2种以上的上述第三成分。上述中，优选式(D)表示的2官能性单体，特别优选式(D－1)表示的2 官能性单体。
上述共聚物中的第三成分、例如由上述式(C)或(D)表示的 2官能性单体衍生的交联结构的比例为0摩尔％～50摩尔％。
＜共聚物的制造方法＞
作为本发明涉及的共聚物的合成方法，可利用常规的作为丙烯酸类聚合物或甲基丙烯酸类聚合物等的合成方法的自由基聚合、阴离子聚合、阳离子聚合等方法合成。其方式可以是溶液聚合、悬浮聚合、乳液聚合、本体聚合等各种方法。
作为反应用溶剂，可以是水、磷酸缓冲液或乙醇等醇或将它们组合而成的混合溶剂，优选包含水或乙醇。进一步优选地，包含10 质量％以上100质量％以下的水或乙醇。进一步优选地，包含50质量％以上100质量％以下的水或乙醇。进一步优选地，包含80质量％以上100质量％以下的水或乙醇。进一步优选地，包含90质量％以上100质量％以下的水或乙醇。优选地，水和乙醇合计为100质量％。
作为反应浓度，例如优选使包含上述式(a)表示的有机基团的单体和包含上述式(b)表示的有机基团的单体在反应溶剂中的浓度为0.01质量％～4质量％。浓度为4质量％以上时，例如由于式(a) 表示的磷酸基所具有的强缔合性，有时共聚物在反应溶剂中发生凝胶化。浓度为0.01质量％以下时，得到的清漆的浓度过低，因此，难以制成用于得到膜厚足够厚的涂覆膜的涂覆膜形成用组合物。浓度更优选为0.01质量％～3质量％，例如为3质量％或2质量％。
本发明涉及的共聚物的合成中，例如可在制成式(1)所记载的酸性磷酸酯单体(半盐)后，进行聚合而制作共聚物。
Figure BDA0000869773050000181
含磷酸基的单体是容易缔合的单体，因此，当将其向反应系中滴加时，为了能快速地分散，可每次少量地向反应溶剂中滴加。此外，对于反应溶剂而言，为了提高单体及聚合物的溶解性，可进行加热(例如40℃～100℃)。
为了使聚合反应高效进行，优选使用聚合引发剂。作为聚合引发剂的例子，可使用2，2’－偶氮双(异丁腈)、2，2’－偶氮双 (2－甲基丁腈)、2，2’－偶氮双(2，4－二甲基戊腈)、4，4’－偶氮双(4－氰基戊酸)、2，2’－偶氮双(4－甲氧基－2，4－二甲基戊腈)、1，1’－偶氮双(环己烷－1－甲腈)、1－[(1－氰基－1－甲基乙基)偶氮]甲酰胺、2，2’－偶氮双[2－(2－咪唑啉－2－基)丙烷]二盐酸盐、2，2’－偶氮双[2－(2－咪唑啉－2－基) 丙烷]、2，2’－偶氮双(2－甲基丙脒)二盐酸盐、2，2’－偶氮双 [2－甲基－N－(2－羟基乙基)丙酰胺](和光纯药株式会社制：VA －086，10小时半衰期温度：86℃)、过氧化苯甲酰(BPO)、2，2’－偶氮双[N－(2－羧基乙基)－2－甲基丙脒]n－水合物(和光纯药株式会社制：VA－057，10小时半衰期温度：57℃)、4，4’－偶氮双(4－氰基戊酸)(和光纯药株式会社制：V－501)、2，2’－偶氮双[2－(2－咪唑烷－2－基)丙烷]二盐酸盐(和光纯药株式会社制：VA－044，10小时半衰期温度：44℃)、2，2’－偶氮双 [2－(2－咪唑烷－2－基)丙烷]二硫酸盐二水合物(和光纯药株式会社制：VA－046B，10小时半衰期温度：46℃)、2，2’－偶氮双 [2－(2－咪唑烷－2－基)丙烷](和光纯药株式会社制：VA－061， 10小时半衰期温度：61℃)、2，2’－偶氮双(2－脒基丙烷)二盐酸盐(和光纯药株式会社制：V－50，10小时半衰期温度：56℃)、过二硫酸或叔丁基过氧化氢等，这些中，考虑离子平衡、在水中的溶解性，优选使用2，2’－偶氮双[2－甲基－N－(2－羟基乙基) 丙酰胺]、2，2’－偶氮双[N－(2－羧基乙基)－2－甲基丙脒]n－水合物、4，4’－偶氮双(4－氰基戊酸)、2，2’－偶氮双[2－(2 －咪唑烷－2－基)丙烷]二盐酸盐、2，2’－偶氮双[2－(2－咪唑烷－2－基)丙烷]二硫酸盐二水合物、2，2’－偶氮双[2－(2－咪唑烷－2－基)丙烷]、2，2’－偶氮双(2－脒基丙烷)二盐酸盐或过二硫酸中的任何。
作为聚合引发剂的添加量，相对于聚合中使用的单体的总重量，为0.05质量％～10质量％。
对于反应条件而言，通过利用油浴等将反应容器加热至50℃～ 200℃，进行1小时～48小时搅拌，更优选加热至80℃～150℃，进行5小时～30小时搅拌，从而使得聚合反应得以进行，得到本发明涉及的共聚物。反应气氛优选为氮气气氛。作为反应步骤，可以将所有反应物质全部放入室温的反应溶剂中，然后加热至上述温度，进行聚合，也可以逐次少量地向经预先加热的溶剂中滴加反应物质的混合物的全部或一部分。
例如，作为后者的反应步骤，将包含上述式(A)及(B)表示的化合物、溶剂及聚合引发剂的混合物滴加至保持为比该聚合引发剂的10小时半衰期温度高的温度的溶剂中，进行反应(聚合)。通过采用上述反应步骤和温度条件，可使上述式(A)或式(B)表示的化合物在反应溶剂中的浓度为例如0.01质量％～10质量％。此时，即使浓度超过4质量％，也会在反应前，滴加相及反应相成为透明均匀，可抑制反应后的共聚物在反应溶剂中凝胶化。
本发明涉及的共聚物的分子量可以为数千至数百万的程度，优选为5，000～5，000，000。进一步优选为10，000～2，000，000。另外，可以是无规共聚物、嵌段共聚物、接枝共聚物中的任何，用于制造该共聚物的共聚反应自身没有特别限制，可使用利用自由基聚合、离子聚合、光聚合、大分子单体、乳液聚合的聚合等在已知的溶液中合成的方法。对于上述共聚物而言，根据目标用途，可单独使用本发明的共聚物中的任何，也可混合多种共聚物，并且改变其比率地使用。
如上所述地制造的各种共聚物可以是二维聚合物也可以是三维聚合物，为在含有水的溶液中分散的状态。即，优选在含有上述这些聚合物的清漆中，不发生不均匀的凝胶化、白浊沉淀，优选为透明的清漆、分散胶体状的清漆、或溶胶。
《细胞培养容器的制造方法》
本发明的第二方式为细胞培养容器的制造方法，包括以下工序：
将下述共聚物涂覆于容器表面的至少一部分的工序，所述共聚物包含：包含下述式(a)表示的有机基团的重复单元和包含下述式 (b)表示的有机基团的重复单元；以及
于－200℃～200℃干燥经涂覆的细胞培养容器的工序；
Figure BDA0000869773050000201
(式中，Ua1、Ua2、Ub1、Ub2及Ub3、以及An－与上文所述的含义相同)。
＜涂覆工序＞
本发明的细胞培养容器的制造方法的涂覆工序中，将共聚物涂覆于容器的表面的至少一部分上。例如，容器为圆底的多孔培养板时，可以仅涂覆在孔的凹陷部分，但也可涂覆培养板整体。此处，容器及共聚物分别为上文中的＜容器＞及＜共聚物＞项中的说明所示的那样。
涂覆工序没有特别限制，可利用能使得容器与共聚物接触的、本领域技术人员已知的任何涂覆手段(例如，涂布、浸渍等)来实施。例如，可通过将包含共聚物的清漆涂布于容器、或在包含共聚物的清漆中浸渍容器而实施。优选通过在包含共聚物的清漆中浸渍容器而实施。
包含共聚物的清漆可通过将上述的＜共聚物的制造方法＞项中得到的共聚物以所期望的浓度溶解到适当的溶剂中来制备，或也可将在所述制造方法中得到的含有共聚物的反应溶液直接作为清漆使用或稀释成所期望的固态成分浓度后作为清漆使用。作为清漆中含有的溶剂，可举出水、磷酸缓冲液(PBS)、醇。作为醇，可举出碳数2～6的醇、例如，乙醇、丙醇、异丙醇、1－丁醇、2－丁醇、异丁醇、叔丁醇、1－戊醇、2－戊醇、3－戊醇、1－庚醇、2－庚醇、 2，2－二甲基－1－丙醇(＝新戊醇)、2－甲基－1－丙醇、2－甲基－1－丁醇、2－甲基－2－丁醇(＝叔戊醇)、3－甲基－1－丁醇、 3－甲基－3－戊醇、环戊醇、1－己醇、2－己醇、3－己醇、2，3－二甲基－2－丁醇、3，3－二甲基－1－丁醇、3，3－二甲基－2－丁醇、2－乙基－1－丁醇、2－甲基－1－戊醇、2－甲基－2－戊醇、2 －甲基－3－戊醇、3－甲基－1－戊醇、3－甲基－2－戊醇、3－甲基－3－戊醇、4－甲基－1－戊醇、4－甲基－2－戊醇、4－甲基－3 －戊醇及环己醇，可单独使用或使用它们组合而成的混合溶剂，优选从水、PBS及乙醇中选择。为了将共聚物溶解，一定含有水。
作为清漆中的共聚物的浓度，为0.01～4质量％，进一步优选为 0.01～3质量％、进一步优选为0.01～2质量％、进一步优选为0.01～ 1质量％。共聚物的浓度为0.01质量％以下时，无法形成膜厚足够厚的涂层，为4质量％以上时，清漆的保存稳定性变差，可能会发生溶解物的析出、凝胶化。
需要说明的是，在清漆中，除了上述共聚物和溶剂之外，根据需要，也可在不损害得到的涂层的性能的范围内添加其他物质。作为其他物质，可举出防腐剂、表面活性剂、提高与基材(容器)的密合性的底漆、防霉剂及糖类等。
为了调节清漆中的共聚物的离子平衡，包含共聚物的清漆可预先经pH调节。pH调节例如可通过向包含共聚物的清漆中添加pH 调节剂、使清漆的pH为3.5～8.5、优选为4.0～8.0而实施。可使用的pH调节剂的种类及其量可根据清漆中的共聚物的浓度、共聚物的阴离子与阳离子的存在比等适当选择。作为pH调节剂的例子，可举出氨、二乙醇胺、吡啶、N－甲基－D－葡萄糖胺、三(羟基甲基) 氨基甲烷等有机胺；氢氧化钾、氢氧化钠等碱金属氢氧化物；氯化钾、氯化钠等碱金属卤化物；硫酸、磷酸、盐酸、碳酸等无机酸或其碱金属盐；胆碱等季铵阳离子；或它们的混合物(例如，磷酸缓冲生理盐水等缓冲液)。这些中，优选氨、二乙醇胺、N－甲基－D －葡萄糖胺、三(羟基甲基)氨基甲烷、氢氧化钠及胆碱，特别优选氨、二乙醇胺、氢氧化钠及胆碱。
使这样的包含共聚物的清漆与容器接触，在其表面的至少一部分形成涂层。涂层优选遍及容器的整个表面地形成。
需要说明的是，在涂覆工序之前，可针对容器的表面实施已知的UV/臭氧处理而将其洗涤。所述洗涤工序可使用市售的UV/臭氧清洁器等实施。
＜干燥·洗涤·灭菌工序＞
在涂覆工序后，于－200℃～200℃的温度将经涂覆的容器干燥。通过干燥，不仅得以除去上述涂覆膜形成用组合物中的溶剂，而且，本发明涉及的共聚物的式(a)及式(b)彼此间形成离子键，完全固着于基体。本发明的血液滤器的涂层的膜厚优选为
Figure BDA0000869773050000221
进一步优选为
Figure BDA0000869773050000222
本发明人发现，通过本发明的细胞培养容器的制造方法，不需要高温下的处理，通过低温下的处理，即可在容器的表面上形成具有所期望的特性的涂层，而且，即使是数十～数百
Figure BDA0000869773050000231
程度薄的膜厚，耐久性也优异。
干燥例如可于室温(10℃～35℃、例如25℃)实施，但为了更快速地形成涂覆膜，例如也可于40℃～50℃实施。另外，也可利用冷冻干燥法于极低温～低温(－200℃～－30℃左右)实施。冷冻干燥也被称为真空冷冻干燥，通常是用制冷剂将想要干燥的物质冷却，在真空状态下，利用升华而除去溶剂的方法。作为在冷冻干燥中使用的常规的制冷剂，可举出干冰和甲醇的混合介质(－78℃)、液氮(－196℃)等。更优选的干燥温度为10℃～180℃，更优选的干燥温度为25℃～150℃。
需要说明的是，在干燥工序之前和/或之后，可用乙醇等碳原子数1～5的醇和/或水对经涂覆的容器的表面进行洗涤。上述洗涤工序可于0℃～60℃、优选25℃(室温)～40℃的温度，实施30分钟～ 48小时、优选1～24小时。
此外，在干燥工序后，为了除去残留于该涂层的杂质、未反应的单体等，进一步地为了调节膜中的共聚物的离子平衡，也可使用选自水和含有电解质的水溶液中的至少1种溶剂，利用流水洗涤或超声洗涤等进行洗涤。此处，也可在例如40℃～95℃的范围内，加热包含水或电解质的水溶液。包含电解质的水溶液优选为PBS及生理盐水(仅含有氯化钠)、Dulbecco磷酸缓冲生理盐水、Tris缓冲生理盐水、HEPES缓冲生理盐水及veronal缓冲生理盐水，特别优选为PBS。
即使用醇、水、及PBS等洗涤，在容器的表面上形成的涂覆也不溶出，保持原状态地牢固地固着于基材(即，容器)。形成的涂层具有抑制包括细胞在内的多种生物材料附着的能力。因此，本发明的细胞培养容器除了抑制细胞的附着之外，相对于溶剂、放射线的耐久性也优异。
根据需要，为了对经涂覆的容器进行灭菌，可实施放射线、电子束、环氧乙烷、高压釜等已知的灭菌处理。
《细胞凝集块的制造方法》
本发明的第三方式是细胞凝集块的制造方法，其特征在于，使用本发明的细胞培养容器及利用本发明的制造方法得到的细胞培养容器(以下将两者统称为“本发明的细胞培养容器”)。使用本发明的细胞培养容器时，可抑制细胞凝集块附着在容器的表面(壁面)上，并且，可抑制涂层溶出至培养液，因此，可在不存在来自容器的刺激的状态下，培养细胞凝集块。优选使用具有以下特征的培养基培养细胞凝集块：在本发明的细胞培养容器中，包含多糖类(尤其是脱酰基化结冷胶)，所述多糖类具有使细胞或组织悬浮的效果。这样的培养基的具体组成、培养方法例如在国际公开第2014/017513 号公报中公开。
[实施例]
以下，示出关于本发明的培养容器及其制造方法的合成例、实施例及试验例，但它们是为了进一步详细地说明本发明而示出的，本发明不受它们的限制。
＜原料组成的测定方法＞
包含含磷化合物的原料的各含磷化合物的浓度(质量％)测定通过31P－NMR进行。使用下述标准物质，算出原料中含有的各含磷化合物的绝对浓度(绝对质量％)。
(测定条件)
·模式：反门控去耦模式(定量模式)
·装置：varian 400MHz
·溶剂：CD3OD(氘代甲醇)(30重量％)
·转速：0Hz
·数据点：64000
·翻转角(flip angle)：90°
·等待时间：70s
·累积次数：16次，n＝4，
·标准物质：三甲基磷酸+D2O(制备75％TMP溶液)
＜合成例1＞表面处理剂L1的制备：
向甲基丙烯酸磷酰氧基乙酯(制品名：Phosmer M、uni－chemical 公司制，干固法100℃·1小时时的不挥发成分：91.8％，甲基丙烯酸磷酰氧基乙酯(44.2质量％)、磷酸双[2－(甲基丙烯酰基氧基) 乙酯](28.6质量％)、其他物质(27.2质量％)的混合物)6.00g中添加纯水12.40g，将其充分溶解，将乙醇12.40g、甲基丙烯酸2－(二甲基氨基)乙酯4.12g(东京化成工业株式会社制)、2、2’－偶氮 (2－甲基－N－(2－羟基乙基)丙酰胺)(制品名：VA－086、和光纯药公司制)0.10g保持在20℃以下，并依次向所得物中添加，导入至滴液漏斗。另一方面，将纯水471.13g、乙醇37.20g添加到带有冷凝管的三颈瓶中，一边流通氮气流并进行搅拌一边升温至回流温度。维持该状态，同时，安装导入了混合液的滴液漏斗，用0.5小时将混合液滴加至纯水和乙醇的沸腾液内。滴加后，维持环境24小时，在该状态下进行加热搅拌，由此，得到固态成分约2质量％的透明聚合液506.05g。得到的透明液体的利用GFC测得的重均分子量为约 810，000。然后，向含有共聚物的清漆1.00g中添加纯水0.9g、乙醇0.1g，充分搅拌，制备表面处理剂L1(固态成分1质量％)。
＜合成例2＞表面处理剂L2的制备：
向甲基丙烯酸磷酰氧基乙酯(制品名：Phosmer M、uni－chemical 株式会社公司制，干固法100℃·1小时时的不挥发成分：91.8％，甲基丙烯酸磷酰氧基乙酯(44.2质量％)、磷酸双[2－(甲基丙烯酰基氧基)乙酯](28.6质量％)、其他物质(27.2质量％)的混合物) 10.00g中添加纯水68.88g，将其充分溶解，将乙醇29.52g、甲基丙烯酸2－(二甲基氨基)乙酯7.63g(东京化成工业株式会社制)、2，2’－偶氮双[N－(2－羧基乙基)－2－甲基丙脒](制品名：VA－ 057，和光纯药工业株式会社制)0.09g保持在20℃以下，并依次向所得物中添加，导入至滴液漏斗。另一方面，将纯水373.89g、乙醇 29.52g添加到带有冷凝管的三颈瓶中，一边流通氮气流并进行搅拌一边升温至回流温度。维持该状态，同时，安装导入了混合液的滴液漏斗，用0.5小时将混合液滴加至纯水和乙醇的沸腾液内。滴加后，维持环境24小时，在该状态下进行加热搅拌，由此，得到固态成分约3.5质量％的透明聚合液509.60g。得到的透明液体的利用GFC测得的重均分子量为约280，000。然后，向含有共聚物的清漆1.00g 中添加纯水1.56g、乙醇0.94g，充分搅拌，制备表面处理剂L2(固态成分1质量％)。
＜实施例1＞
依次实施以下的各处理工序，制备本发明的细胞培养容器。
处理1：使用筛孔尺寸为0.22μm的滤器，过滤合成例1或2中制成的表面处理剂(L1或L2)，然后，以200μL(固态成分1质量％)/孔的量向96孔细胞培养板(下述试验例参照)的孔中添加，于室温静置1小时，然后除去剩余的表面处理剂。
处理2：使用烘箱(Advantec Toyo Kaisha，Ltd.制，干燥机FC －612)，于50度干燥1夜。
处理3：γ射线灭菌
＜方法－1＞：通常条件
将经涂覆的96孔滴定板(titer plate)放入到由具有遮光·防湿·隔氧性的铝/PET层压膜形成的带拉链不透气性包装容器(制品名： Lamizip AL－22，生产日本公司制)中，在大气气氛下密封，放置约24小时以上，然后，照射15kGy的γ射线进行灭菌。
＜方法－2＞：真空条件
将经涂覆的96孔滴定板放入到由具有遮光·防湿·隔氧性的铝 /PET层压膜形成的带拉链不透气性包装容器(制品名：Lamizip AL －22，生产日本公司制)中，使用真空封口机(vacuum sealer)，在真空下加热密封，放置约24小时以上，然后，照射15kGy的γ射线进行灭菌。
＜方法－3＞：抗氧化剂·干燥剂一同包装·真空条件
将经涂覆的96孔滴定板、干燥剂(制品名：硅胶Mix(silica gel Mix)，丰田化工公司制)、和脱氧剂(制品名：Sequl AP－500， NISSO FINE CO.，LTD.制)放入到由具有遮光·防湿·隔氧性的铝 /PET层压膜形成的带拉链不透气性包装容器(制品名：Lamizip AL －22，生产日本公司制)中，用真空封口机在真空下加热密封，放置约24小时以上，然后，照射15kGy的γ射线进行灭菌。
处理4：将透过筛孔尺寸为0.22μm的滤器而得到的超纯水(Milli －Q水)200μL添加到各孔中后，除去全部量。实施3次该处理。
＜试验例1：涂覆了表面处理剂的细胞培养板的抑制细胞贴壁的效果1＞
(涂覆培养板的制备)
利用实施例1所示的涂覆法，用表面处理剂L1或L2涂覆平底 96孔细胞培养板(BDBiosciences公司制，#351172)的孔。此时，γ射线灭菌方法使用＜方法－1＞。作为阴性对照，使用未进行涂覆处理的培养板。作为阳性对照的样品，使用市售的细胞低贴壁培养板(Corning公司制，#3474)。
(细胞的制备)
就细胞而言，使用人源胚胎肾细胞株Hek293(DS Pharma Biomedical公司制)、人肝癌细胞株HepG2(DS Pharma Biomedical 公司制)、小鼠巨噬细胞细胞株RAW264.7(DSPharma Biomedical 公司制)。
用于培养这些细胞的培养基使用了Hek293：含有10％(v/v)FBS 的EMEM培养基(WAKO公司制)、HepG2：含有10％(v/v)FBS 的DMEM培养基(WAKO公司制)、RAW264.7：含有10％(v/v) FBS的DMEM/F－12培养基(Sigma公司制)。在37℃的CO2培养箱内，在保持5％二氧化碳浓度的状态下，使用直径10cm的培养皿 (培养基10mL)，静置培养细胞2天以上。接下来，用5ml的PBS 洗涤该细胞，然后，添加胰蛋白酶－EDTA溶液(Invitrogen公司制) 1mL，剥落细胞，分别用上述的培养基10mL悬浮。将该悬浮液离心分离(久保田商事株式会社制，型号5900，1500rpm/3分钟，室温) 后，除去上清液，添加上述的培养基，制备细胞悬浮液。
(细胞附着实验)
针对在上文中制备的培养板，添加各100μL各细胞悬浮液，成为2×104个细胞/孔，然后，在保持5％二氧化碳浓度的状态下，于 37℃在CO2培养箱内静置4天。
(细胞附着的观察)
培养4天后，针对用表面处理剂L1或L2涂覆过的平底96孔滴定板、阴性对照、阳性对照，利用倒置显微镜(Olympus Corporation 制，CKX31)观察细胞的附着，基于观察结果进行比较。其结果示于下述表1。另外，作为细胞观察的代表例，使用用表面处理剂L1 涂覆的培养板培养的HepG2细胞的显微镜照片(倍率：40倍)示于图1。
表1
Figure BDA0000869773050000281
如表1及图1所示，实施了L1及L2处理的培养板与阳性对照同样，无论是哪种细胞，均显示细胞未附着。此时，如图1所示，
未附着的细胞形成了细胞凝集块(球体)。
＜试验例2：涂覆了表面处理剂的细胞培养板的抑制细胞贴壁的效果2＞
(涂覆培养板的制备)
利用实施例1所示的涂覆法，用表面处理剂L1涂覆平底96孔细胞培养板(BDBiosciences公司制，#351172)的孔。此时，γ射线灭菌方法使用＜方法－1＞＜方法－2＞＜方法－3＞。作为阴性对照，使用未进行涂覆处理的培养板。
(细胞的制备)
就细胞而言，使用人源胚胎肾细胞株Hek293(DS Pharma Biomedical公司制)。在该细胞的培养中，使用了含有10％(v/v) FBS的EMEM培养基(WAKO公司制)。在37℃的CO2培养箱内，在保持为5％二氧化碳浓度的状态下，使用直径10cm的培养皿(培养基10mL)，静置培养细胞2天以上。接下来，用5ml的PBS洗涤该细胞，然后，添加胰蛋白酶－EDTA溶液(Invitrogen公司制) 1mL，剥落细胞，分别用上述的培养基10mL悬浮。将该悬浮液离心分离(久保田商事株式会社制，型号5900，1500rpm/3分钟，室温) 后，除去上清液，添加上述的培养基，制备细胞悬浮液。
(细胞附着实验)
针对在上文中制备的培养板，添加各100μL的Hek293细胞悬浮液，成为2×104个细胞/孔。然后，在保持5％二氧化碳浓度的状态下，于37℃在CO2培养箱内静置4天。
(细胞附着的观察)
培养4天后，针对用表面处理剂L1涂覆过的平底96孔滴定板及阴性对照，利用倒置显微镜(Olympus Corporation制，CKX31) 观察细胞的附着，基于观察结果进行比较。其结果示于下述表2。
表2
γ射线灭菌方法 <方法－1> <方法－2> <方法－3> 阴性对照
细胞在孔上的附着 无 无 无 有
如表2所示，实施了L1处理后进行了γ射线灭菌处理的培养板，显示Hek293细胞未附着。此时，未附着的细胞在孔内形成细胞凝集块(球体)。
＜试验例3：涂覆了表面处理剂的细胞培养板的抑制细胞贴壁的效果3＞
(涂覆培养板的制备)
利用实施例1所示的涂覆法，用表面处理剂L1或L2涂覆U字底96孔细胞培养板(BDBiosciences公司制，#353227)的孔。此时，未实施γ射线灭菌。作为阴性对照，使用未进行涂覆处理的培养板。作为阳性对照的样品，使用市售的细胞低贴壁培养板 (SumitomoBakelite Co.，Ltd.制，#MS－9096U)。
(细胞的制备)
就细胞而言，使用人肝癌细胞株HepG2(DS Pharma Biomedical 公司制)。该细胞的培养中，使用了含有10％(v/v)FBS的DMEM 培养基(WAKO公司制)。在37℃CO2培养箱内，在保持为5％二氧化碳浓度的状态下，使用直径10cm的培养皿(培养基10mL)，静置培养细胞2天以上。接下来，用5ml的PBS洗涤该细胞，然后，添加胰蛋白酶－EDTA溶液(Invitrogen公司制)1mL，剥落细胞，分别用上述的培养基10mL悬浮。将该悬浮液离心分离(久保田商事株式会社制，型号5900，1500rpm/3分钟，室温)后，除去上清液，使用上述的培养基或添加了终浓度为0.015％(w/v)的脱酰基化结冷胶的培养基，分别制备细胞悬浮液。此处，添加了0.015％(w/v)的脱酰基结冷胶的培养基按照以下方式制备。即，以0.3％(w/v)的浓度，将脱酰基化结冷胶(KELCOGEL CG－LA，三晶株式会社制) 悬浮于超纯水(Milli－Q水)，然后，一边在90℃下进行加热，一边进行搅拌，使其溶解，于121℃，针对该水溶液进行20分钟高压釜灭菌。在充分搅拌的同时，将该溶液添加至含有10％(v/v)FBS 的DMEM培养基(WAKO公司制)中，使得成为终浓度0.015％(w/v) 的脱酰基化结冷胶。
(细胞附着实验)
针对在上文中制备的培养板，添加各100μL的各细胞悬浮液，成为2×103个细胞/孔。然后，在保持5％二氧化碳浓度的状态下，于37℃在CO2培养箱内静置5天。
(细胞附着的观察)
培养5天后，针对用表面处理剂L1或L2涂覆过的U字底96 孔滴定板、阴性对照、阳性对照，利用倒置显微镜(Olympus Corporation制，CKX31)观察细胞的附着，基于观察结果进行比较。其结果示于下述表3。另外，作为细胞观察的代表例，使用用表面处理剂L1涂覆过的培养板培养的HepG2细胞的显微镜照片(倍率： 40倍)示于图2。
表3
Figure BDA0000869773050000311
如表3及图2所示，实施了L1及L2处理的培养板与阳性对照同样，无论是哪种细胞，均显示细胞未附着。此时，如图2所示，未附着的细胞在孔底的中央附近形成了细胞凝集块(球体)。此外还显示，使用了添加有脱酰基化结冷胶的培养基时，与未添加脱酰基化结冷胶的培养基相比细胞凝集块的尺寸变小，而且分散。
产业上的可利用性
对于本发明的细胞培养容器而言，在表面的至少一部分涂覆有包含特定的有机基团的共聚物。上述涂层不仅抑制细胞在容器表面 (壁面)上附着，而且，涂层可在容器表面上牢固地固着，因此，抑制涂层向培养液中溶出、放射线耐性得到改善。因此，本发明的细胞培养容器可在不存在来自容器的刺激的状态下，培养细胞凝集块，在这方面是有利的。

Claims (16)

1.抑制细胞向容器表面附着的细胞培养容器，其特征在于，在表面上涂覆有下述共聚物，所述共聚物包含：包含下述式(a)表示的有机基团的重复单元和包含下述式(b)表示的有机基团的重复单元，
所述共聚物是通过将包含下述式(a)表示的有机基团的单体与包含下述式(b)表示的有机基团的单体于50℃～200℃进行共聚而得到的，
Figure FDA0002210469130000011
式中，
Ua1及Ua2为氢原子，Ub1、Ub2及Ub3各自独立地表示氢原子、或碳原子数1～5的直链或支链烷基，而且An－表示选自卤化物离子、无机酸根离子、氢氧化物离子及异硫氰酸根离子中的阴离子，
其中，遍及容器整个表面而形成有涂层，所述涂层的膜厚为
Figure FDA0002210469130000012
Figure FDA0002210469130000013
并且所述容器是通过实施仅包括于－200℃～180℃进行干燥的步骤的干燥工序而得到的。
2.如权利要求1所述的细胞培养容器，其中，包含所述式(a)及(b)表示的有机基团的重复单元分别为由下述式(A)及(B)表示的单体衍生的重复单元，
Figure FDA0002210469130000014
Figure FDA0002210469130000021
式中，
Ta、Tb、Ub1、Ub2及Ub3各自独立地表示氢原子、或碳原子数1～5的直链或支链烷基，Ua1及Ua2为氢原子，Qa及Qb各自独立地表示单键、酯键或酰胺键，Ra及Rb各自独立地表示可被卤原子取代的、碳原子数1～10的直链或支链亚烷基，An－表示选自卤化物离子、无机酸根离子、氢氧化物离子及异硫氰酸根离子中的阴离子，而且m表示0～6的整数。
3.如权利要求2所述的细胞培养容器，其中，m为1，Ra及Rb各自独立地表示亚乙基或亚丙基。
4.如权利要求1～3中任一项所述的细胞培养容器，其中，所述共聚物还包含由下述式(C)或(D)表示的单体衍生的交联结构，
Figure FDA0002210469130000022
式中，
Tc、Td及Ud各自独立地表示氢原子、或碳原子数1～5的直链或支链烷基，Rc及Rd各自独立地表示可被卤原子取代的、碳原子数1～10的直链或支链亚烷基。
5.如权利要求4所述的细胞培养容器，其中，Tc及Td各自独立地表示氢原子或甲基，Ud表示氢原子，Rc及Rd各自独立地表示亚乙基或亚丙基。
6.细胞培养容器的制造方法，所述细胞培养容器抑制细胞向容器表面的附着，所述制造方法包括以下工序：
将下述共聚物涂覆于容器整个表面上的工序，所述共聚物包含：包含下述式(a)表示的有机基团的重复单元和包含下述式(b)表示的有机基团的重复单元，
所述共聚物是通过将包含下述式(a)表示的有机基团的单体与包含下述式(b)表示的有机基团的单体于50℃～200℃进行共聚而得到的；以及
干燥工序，所述干燥工序仅包括于－200℃～180℃干燥经涂覆的细胞培养容器的步骤；
Figure FDA0002210469130000031
式中，Ua1及Ua2为氢原子，Ub1、Ub2及Ub3各自独立地表示氢原子、或碳原子数1～5的直链或支链烷基，而且An－表示选自卤化物离子、无机酸根离子、氢氧化物离子及异硫氰酸根离子中的阴离子，
并且，涂层的膜厚为
Figure FDA0002210469130000033
7.如权利要求6所述的制造方法，其中，包含所述式(a)表示的有机基团的重复单元及包含所述式(b)表示的有机基团的重复单元分别为由下述式(A)及(B)表示的单体衍生的重复单元，
Figure FDA0002210469130000032
式中，
Ta、Tb、Ub1、Ub2及Ub3各自独立地表示氢原子、或碳原子数1～5的直链或支链烷基，Ua1及Ua2为氢原子，Qa及Qb各自独立地表示单键、酯键或酰胺键，Ra及Rb各自独立地表示可被卤原子取代的、碳原子数1～10的直链或支链亚烷基，An－表示选自卤化物离子、无机酸根离子、氢氧化物离子及异硫氰酸根离子中的阴离子，而且m表示0～6的整数。
8.如权利要求6或7所述的制造方法，其中，使用包含共聚物的清漆实施涂覆工序。
9.如权利要求8所述的制造方法，其中，包含共聚物的清漆预先经pH调节。
10.如权利要求6或7所述的制造方法，其中，还包括在干燥工序前和/或干燥工序后对经涂覆的细胞培养容器进行洗涤的工序。
11.如权利要求8所述的制造方法，其中，还包括在干燥工序前和/或干燥工序后对经涂覆的细胞培养容器进行洗涤的工序。
12.如权利要求9所述的制造方法，其中，还包括在干燥工序前和/或干燥工序后对经涂覆的细胞培养容器进行洗涤的工序。
13.如权利要求10所述的制造方法，其中，干燥工序后的洗涤使用选自水和含有电解质的水溶液中的至少1种来实施。
14.细胞凝集块的制造方法，其特征在于，使用利用权利要求1～5中任一项所述的细胞培养容器或权利要求6或7所述的制造方法制造的细胞培养容器。
15.如权利要求14所述的细胞凝集块的制造方法，其特征在于，细胞培养容器中的培养基包含具有使细胞或组织悬浮的效果的多糖类。
16.如权利要求15所述的细胞凝集块的制造方法，其特征在于，多糖类为脱酰基化结冷胶。
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