JP6965878B2 - 細胞培養容器 - Google Patents

Description

本発明は、細胞培養容器、その製造方法及びそれを用いた細胞凝集塊（スフェアともいう）の製造方法に関する。特に本発明は、細胞の付着抑制能を有する共重合体が表面にコーティングされていることを特徴とする、細胞培養容器及びその製造方法に関するものである。

近年、動物や植物体内で異なった役割を果たしている様々な器官、組織、及び細胞を生体外にて増殖又は維持させるための技術が発展してきている。これらの器官、組織を生体外にて増殖又は維持することは、それぞれ器官培養、組織培養と呼ばれており、器官、組織から分離された細胞を生体外にて増殖、分化又は維持することは細胞培養と呼ばれている。細胞培養は、分離した細胞を培地中で生体外にて増殖、分化又は維持する技術であり、生体内の各種器官、組織、細胞の機能及び構造を詳細に解析するために不可欠なものとなっている。また、当該技術により培養された細胞及び／又は組織は、化学物質、医薬品等の薬効及び毒性評価や、酵素、細胞増殖因子、抗体等の有用物質の大量生産、疾患や欠損により失われた器官、組織、細胞を補う再生医療、植物の品種改良、遺伝子組み換え作物の作成等の様々な分野で利用されている。

動物由来の細胞は、その性状から浮遊細胞と接着細胞に大きく２分される。浮遊細胞は、生育・増殖に足場を必要としない細胞であり、接着細胞は、生育・増殖に足場を必要とする細胞であるが、生体を構成する大部分の細胞は後者の接着細胞である。接着細胞の培養方法としては、単層培養、分散培養、包埋培養、マイクロキャリア培養、及び細胞凝集塊（スフェア）培養等が知られている。

特に近年では、再生医療分野の発展に伴い、より生体内に近い環境での培養方法としてスフェア培養が注目され、その培養に適した培地組成物や、培地添加剤が種々報告されている（例えば、特許文献１及び２参照）。またスフェア培養では、培養容器（基材）からの刺激が、培養の結果を左右する重要な要因であると考えられており、細胞（特に、細胞凝集塊）を培養容器からの刺激のない、三次元環境又は完全な浮遊状態にて培養することが求められている（例えば、特許文献３参照）。

本発明者らは、様々な生体物質の付着抑制能を有するコーティング材料として期待されているリン酸エステル基を有するポリマーに注目し、検討を重ねた。その結果、特定のアニオン性基とカチオン性基を含む共重合体で表面の少なくとも一部がコーティングされた細胞培養容器が、細胞の容器表面（内部表面）への付着を抑制すると共に、コーティングが容器表面に強固に固着しうることから、コーティングの培養液への溶出や放射線耐性が改善された細胞培養容器として有用であることを報告した（例えば、特許文献４参照）。

国際公開第２０１４／０１７５１３号公報 国際公開第２０１３／１４４３７２号公報 特開２００８−６１６０９号公報 国際公開第２０１４／０１９６６５２号公報

本発明は、細胞培養容器、その製造方法及びそれを用いた細胞凝集塊の製造方法を提供することを目的とする。特に本発明は、細胞の付着抑制能を有する共重合体が表面にコーティングされていることを特徴とする、細胞培養容器、その製造方法及びそれを用いた細胞凝集塊の製造方法を提供することを目的とする。

従来、細胞（特に、細胞凝集塊）を三次元環境又は完全な浮遊状態にて培養するために、細胞の容器表面への付着、及び細胞培養容器に付されたコーティングの培養液への溶出という問題があった。また、細胞培養により生産・分泌される／培地に含まれるタンパク質の容器表面への付着という問題もあった。親水性化合物によるコーティングが付された細胞培養容器は、容器表面への細胞付着を改善しうるが、細胞培養容器に付されたコーティングの培養液への溶出やタンパク質の容器表面への付着等の問題が依然としてあった。

本発明者らは、引き続きリン酸エステル基を有するポリマーに注目し、鋭意検討を重ねた。その結果、特定のアニオン性基とカチオン性基に加え、特定の疎水性基を含む共重合体で表面の少なくとも一部がコーティングされた細胞培養容器が、細胞に加え、タンパク質の容器表面への付着を抑制すると共に、コーティングが容器表面に強固に固着しうることから、コーティングの培養液への溶出が改善された細胞培養容器として有用であることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は以下のとおりである：

１．下記式（ａ）で表される基を含む繰り返し単位と、下記式（ｂ）で表される基を含む繰り返し単位と、下記式（ｃ）で表される基を含む繰り返し単位とを含む共重合体：

［式中、
Ｕ^ａ１、Ｕ^ａ２、Ｕ^ｂ１、Ｕ^ｂ２及びＵ^ｂ３は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し；
Ｒ^ｃは、炭素原子数１乃至１８の直鎖若しくは分岐アルキル基、炭素原子数３乃至１０の脂環式炭化水素基、炭素原子数６乃至１０のアリール基、炭素原子数７乃至１５のアラルキル基又は炭素原子数７乃至１５のアリールオキシアルキル基（ここで、前記アリール部分は、ハロゲン原子で置換されていてもよい炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基で置換されていてもよい）を表し；
Ａｎ⁻は、ハロゲン化物イオン、無機酸イオン、水酸化物イオン及びイソチオシアネートイオンからなる群から選ばれる陰イオンを表す］
が表面にコーティングされていることを特徴とする、細胞培養容器。

２．上記式（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）で表される基を含む繰り返し単位が、それぞれ、下記式（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）：

［式中、
Ｔ^ａ、Ｔ^ｂ、Ｔ^ｃ、Ｕ^ａ１、Ｕ^ａ２、Ｕ^ｂ１、Ｕ^ｂ２及びＵ^ｂ３は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し；
Ｑ^ａ及びＱ^ｂは、それぞれ独立して、単結合、エステル結合又はアミド結合を表し、Ｑ^ｃは、単結合、エーテル結合又はエステル結合を表し；
Ｒ^ａ及びＲ^ｂは、それぞれ独立して、ハロゲン原子で置換されていてもよい炭素原子数１乃至１０の直鎖又は分岐アルキレン基を表し、Ｒ^ｃは、炭素原子数１乃至１８の直鎖若しくは分岐アルキル基、炭素原子数３乃至１０の脂環式炭化水素基、炭素原子数６乃至１０のアリール基、炭素原子数７乃至１５のアラルキル基又は炭素原子数７乃至１５のアリールオキシアルキル基（ここで、前記アリール部分は、ハロゲン原子で置換されていてもよい炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基で置換されていてもよい）を表し；Ａｎ⁻は、ハロゲン化物イオン、無機酸イオン、水酸化物イオン及びイソチオシアネートイオンからなる群から選ばれる陰イオンを表し；
ｍは、０乃至６の整数を表す］
で表されるモノマーから誘導される繰り返し単位である、上記１に記載の細胞培養容器。

３．ｍが１であり、Ｒ^ａ及びＲ^ｂが、それぞれ独立して、エチレン基又はプロピレン基を表す、上記２に記載の細胞培養容器。

４．上記共重合体が、さらに下記式（Ｄ）又は（Ｅ）：

（式中、
Ｔ^ｄ、Ｔ^ｅ及びＵ^ｅは、それぞれ独立して、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し；
Ｒ^ｄ及びＲ^ｅは、それぞれ独立して、ハロゲン原子で置換されていてもよい炭素原子数１乃至１０の直鎖又は分岐アルキレン基を表し；
ｎは、１乃至６の整数を表わす）
で表されるモノマーから誘導される架橋構造を含む、上記１乃至３何れかに記載の細胞培養容器。

５．Ｔ^ｄ及びＴ^ｅが、それぞれ独立して、水素原子又はメチル基を表し、Ｕ^ｅが、水素原子を表し、Ｒ^ｄ及びＲ^ｅが、それぞれ独立して、エチレン基又はプロピレン基を表す、上記４に記載の細胞培養容器。

６．タンパク質の付着抑制能を有する、上記１乃至５何れかに記載の細胞培養容器。

７．下記式（ａ）で表される基を含む繰り返し単位と、下記式（ｂ）で表される基を含む繰り返し単位と、下記式（ｃ）で表される基を含む繰り返し単位とを含む共重合体：

［式中、
Ｕ^ａ１、Ｕ^ａ２、Ｕ^ｂ１、Ｕ^ｂ２及びＵ^ｂ３は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し；
Ｒ^ｃは、炭素原子数１乃至１８の直鎖若しくは分岐アルキル基、炭素原子数３乃至１０の脂環式炭化水素基、炭素原子数６乃至１０のアリール基、炭素原子数７乃至１５のアラルキル基又は炭素原子数７乃至１５のアリールオキシアルキル基（ここで、前記アリール部分は、ハロゲン原子で置換されていてもよい炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基で置換されていてもよい）を表し；
Ａｎ⁻は、ハロゲン化物イオン、無機酸イオン、水酸化物イオン及びイソチオシアネートイオンからなる群から選ばれる陰イオンを表す］
を、容器の表面の少なくとも一部にコーティングする工程
を含む、細胞培養容器の製造方法。

８．上記式（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）で表される基を含む繰り返し単位が、それぞれ、下記式（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）：

［式中、
Ｔ^ａ、Ｔ^ｂ、Ｔ^ｃ、Ｕ^ａ１、Ｕ^ａ２、Ｕ^ｂ１、Ｕ^ｂ２及びＵ^ｂ３は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し；
Ｑ^ａ及びＱ^ｂは、それぞれ独立して、単結合、エステル結合又はアミド結合を表し、Ｑ^ｃは、単結合、エーテル結合又はエステル結合を表し；
Ｒ^ａ及びＲ^ｂは、それぞれ独立して、ハロゲン原子で置換されていてもよい炭素原子数１乃至１０の直鎖又は分岐アルキレン基を表し、Ｒ^ｃは、炭素原子数１乃至１８の直鎖若しくは分岐アルキル基、炭素原子数３乃至１０の脂環式炭化水素基、炭素原子数６乃至１０のアリール基、炭素原子数７乃至１５のアラルキル基又は炭素原子数７乃至１５のアリールオキシアルキル基（ここで、前記アリール部分は、ハロゲン原子で置換されていてもよい炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基で置換されていてもよい）を表し；Ａｎ⁻は、ハロゲン化物イオン、無機酸イオン、水酸化物イオン及びイソチオシアネートイオンからなる群から選ばれる陰イオンを表し；
ｍは、０乃至６の整数を表す］
で表されるモノマーから誘導される繰り返し単位である、上記７に記載の製造方法。

９．コーティング工程が、共重合体を含むワニスを用いて実施される、上記７又は８に記載の製造方法。

１０．共重合体を含むワニスが、予めｐＨ調整されている、上記９に記載の製造方法。

１１．さらに、コーティングされた細胞培養容器を、乾燥工程前及び／又は後に、洗浄する工程を含む、上記７乃至１０何れかに記載の製造方法。

１２．乾燥工程後の洗浄が、水及び電解質を含む水溶液からなる群より選ばれる少なくとも１種の溶媒を用いて実施される、上記１１に記載の製造方法。

１３．上記１乃至６何れかに記載の細胞培養容器又は上記７乃至１２何れかに記載の製造方法により製造された細胞培養容器を用いることを特徴とする、細胞凝集塊の製造方法。

本発明の細胞培養容器は、式（ａ）で表されるアニオンと、式（ｂ）で表されるカチオンと、式（ｃ）で表される疎水性基を含む共重合体で表面の少なくとも一部がコーティングされることによって、容器表面への細胞やタンパク質の付着を抑制することができる。該カチオン及びアニオンの静電気的バランスにより、容器の表面が電気的に中性に保たれ、細胞やタンパク質の付着を防ぐことができると考えられる。一方、コーティング中の該カチオン及びアニオンがイオン結合（イオンコンプレックス）を形成することで、ガラス、繊維、無機粒子又は樹脂（合成樹脂及び天然樹脂）等、容器の基材の種類を選ばず固着することができ、さらに固着後は水系溶媒（水、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）、アルコール等）への耐久性に優れたコーティングとなる。

また、共重合体に式（ｃ）で示される疎水性基を導入することで、タンパク質の付着抑制能が向上し、かつプラスチックなどの樹脂との密着性がよく、固着後の水系溶媒に対する耐久性がより優れたコーティングとなる。
すなわち、本発明により、細胞に加え、タンパク質の容器表面への付着を抑制すると共に、溶媒への耐久性にも優れた細胞培養容器を提供することができる。

培養４日間後、実施例１、比較例１、陰性対照、陽性対照のプレートに対する細胞の付着を倒立型顕微鏡により観察した結果を示す。

１．用語の説明
本発明において用いられる用語は、他に特に断りのない限り、以下の定義を有する。

本発明において、「ハロゲン原子」は、フッ素原子、塩素原子、臭素原子又はヨウ素原子を意味する。

本発明において、「アルキル基」は、直鎖若しくは分岐の、飽和脂肪族炭化水素の１価の基を意味する。「炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基」としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓ−ブチル基、t−ブチル基、ｎ−ペンチル基、１−メチルブチル基、２−メチルブチル基、３−メチルブチル基、１，１−ジメチルプロピル基、１，２−ジメチルプロピル基、２，２−ジメチルプロピル基又は１−エチルプロピル基が挙げられる。「炭素原子数１乃至１８の直鎖若しくは分岐アルキル基」としては、上記炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基の例に加え、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、ヘキサデシル基、ヘプタデシル基又はオクタデシル基、あるいはそれらの異性体が挙げられる。

本発明において、「ハロゲン原子で置換されていてもよい炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基」は、上記炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を意味するか、あるいは１以上の上記ハロゲン原子で置換された上記炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を意味する。「炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基」の例は、上記のとおりである。一方「１以上のハロゲン原子で置換された炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基」は、上記炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基の１以上の任意の水素原子が、ハロゲン原子で置き換えられているものを意味し、例としては、フルオロメチル基、ジフルオロメチル基、トリフルオロメチル基、クロロメチル基、ジクロロメチル基、トリクロロメチル基、ブロモメチル基、ヨードメチル基、２，２，２−トリフルオロエチル基、２，２，２−トリクロロエチル基、ペルフルオロエチル基、ペルフルオロブチル基、又はペルフルオロペンチル基等が挙げられる。

本発明において、「エステル結合」は、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−若しくは−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−を意味し、「アミド結合」は、−ＮＨＣ（＝Ｏ）−若しくは−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−を意味し、「エーテル結合」は、−Ｏ−を意味する。

本発明において、「ハロゲン原子で置換されていてもよい炭素原子数１乃至１０の直鎖若しくは分岐アルキレン基」は、炭素原子数１乃至１０の直鎖若しくは分岐アルキレン基、あるいは１以上のハロゲン原子で置換された炭素原子数１乃至１０の直鎖若しくは分岐アルキレン基を意味する。ここで、「アルキレン基」は、上記アルキル基に対応する２価の有機基を意味する。「炭素原子数１乃至１０の直鎖若しくは分岐アルキレン基」の例としては、メチレン基、エチレン基、プロピレン基、トリメチレン基、テトラメチレン基、１−メチルプロピレン基、２−メチルプロピレン基、ジメチルエチレン基、エチルエチレン基、ペンタメチレン基、１−メチル−テトラメチレン基、２−メチル−テトラメチレン基、１，１−ジメチル−トリメチレン基、１，２−ジメチル−トリメチレン基、２，２−ジメチル−トリメチレン基、１−エチル−トリメチレン基、ヘキサメチレン基、オクタメチレン基及びデカメチレン基等が挙げられ、これらの中で、エチレン基、プロピレン基、オクタメチレン基及びデカメチレン基が好ましく、例えば、エチレン基、プロピレン基、トリメチレン基、テトラメチレン基等の炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキレン基がより好ましく、特にエチレン基又はプロピレン基が好ましい。「１以上のハロゲン原子で置換された炭素原子数１乃至１０の直鎖若しくは分岐アルキレン基」は、上記アルキレン基の１以上の任意の水素原子が、ハロゲン原子で置き換えられているものを意味し、特に、エチレン基又はプロピレン基の水素原子の一部又は全部がハロゲン原子で置き換えられているものが好ましい。

本発明において、「炭素原子数３乃至１０の脂環式炭化水素基」は、炭素原子数３乃至１０の、単環式若しくは多環式の、飽和若しくは部分不飽和の、脂肪族炭化水素の１価の基を意味する。この中でも、炭素原子数３乃至１０の、単環式若しくは二環式の、飽和脂肪族炭化水素の１価の基が好ましく、例えば、シクロプロピル基、シクロブチル基又はシクロヘキシル基等の炭素原子数３乃至１０のシクロアルキル基、あるいはビシクロ［３．２．１］オクチル基、ボルニル基、イソボルニル基等の炭素原子数４乃至１０のビシクロアルキル基が挙げられる。

本発明において、「炭素原子数６乃至１０のアリール基」は、炭素原子数６乃至１０の、単環式若しくは多環式の、芳香族炭化水素の１価の基を意味し、例えば、フェニル基、ナフチル基又はアントリル基等が挙げられる。「炭素原子数６乃至１０のアリール基」は、１以上の上記「ハロゲン原子で置換されていてもよい炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基」で置換されていてもよい。

本発明において、「炭素原子数７乃至１５のアラルキル基」は、基−Ｒ−Ｒ’（ここで、Ｒは、上記「炭素原子数１乃至５のアルキレン基」を表し、Ｒ’は、上記「炭素原子数６乃至１０のアリール基」を表す）を意味し、例えば、ベンジル基、フェネチル基、又はα−メチルベンジル基等が挙げられる。「炭素原子数７乃至１５のアラルキル基」のアリール部分は、１以上の上記「ハロゲン原子で置換されていてもよい炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基」で置換されていてもよい。

本発明において、「炭素原子数７乃至１５のアリールオキシアルキル基」は、基−Ｒ−Ｏ−Ｒ’（ここで、Ｒは、上記「炭素原子数１乃至５のアルキレン基」を表し、Ｒ’は、上記「炭素原子数６乃至１０のアリール基」を表す）を意味し、例えば、フェノキシメチル基、フェノキシエチル基、又はフェノキシプロピル基等が挙げられる。「炭素原子数７乃至１５のアリールオキシアルキル基」のアリール部分は、１以上の上記「ハロゲン原子で置換されていてもよい炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基」で置換されていてもよい。

本発明において、「ハロゲン化物イオン」とは、フッ化物イオン、塩化物イオン、臭化物イオン又はヨウ化物イオンを意味する。
本発明において、「無機酸イオン」とは、炭酸イオン、硫酸イオン、リン酸イオン、リン酸水素イオン、リン酸二水素イオン、硝酸イオン、過塩素酸イオン又はホウ酸イオンを意味する。
上記Ａｎ⁻として好ましいのは、ハロゲン化物イオン、硫酸イオン、リン酸イオン、水酸化物イオン及びイソチオシアネートイオンであり、特に好ましいのはハロゲン化物イオンである。

本発明において、（メタ）アクリレート化合物とは、アクリレート化合物とメタクリレート化合物の両方を意味する。例えば（メタ）アクリル酸は、アクリル酸とメタクリル酸を意味する。

細胞の付着抑制能を有するとは、例えば、実施例に記載した方法で行う細胞数測定試薬による、コーティング無しと比較した場合の相対吸光度（ＷＳＴ Ｏ．Ｄ．４５０ｎｍ）（％）（実施例の吸光度（ＷＳＴ Ｏ．Ｄ．４５０ｎｍ）／比較例の吸光度（ＷＳＴ Ｏ．Ｄ．４５０ｎｍ）×１００）が５０％以下、好ましくは３０％以下、さらに好ましくは２０％以下であることを意味する。

タンパク質の付着抑制能を有するとは、例えば、実施例に記載した方法で行うＱＣＭ−Ｄ測定にて、コーティング膜無しと比較した場合の相対単位面積当たりの質量（％）（実施例の単位面積当たりの質量（ｎｇ／ｃｍ^２）／比較例の単位面積当たりの質量（ｎｇ／ｃｍ^２）×１００）が５０％以下、好ましくは３０％以下、さらに好ましくは２０％以下であることを意味する。

本発明において、タンパク質としてはフィブリノゲン、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒトアルブミン、各種グロブリン、β−リポ蛋白質、各種抗体（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ）、ペルオキシダーゼ、各種補体、各種レ クチン、フィブロネクチン、リゾチーム、フォン・ヴィレブランド因子（ｖＷＦ）、血清γ−グロブリン、ペプシン、卵白アルブミン、インシュリン、ヒストン、リボヌクレアーゼ、コラーゲン、シトクロームｃ等が挙げられ、特に血清に含まれるタンパク質（アルブミン及びグロブリン）に対して特に高い付着抑制能を有する。

２．本発明の説明
≪細胞培養容器≫
本発明の第一の態様は、下記式（ａ）で表される基を含む繰り返し単位と、下記式（ｂ）で表される基を含む繰り返し単位と、下記式（ｃ）で表される基を含む繰り返し単位とを含む共重合体：

［式中、
Ｕ^ａ１、Ｕ^ａ２、Ｕ^ｂ１、Ｕ^ｂ２及びＵ^ｂ３は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し；
Ｒ^ｃは、炭素原子数１乃至１８の直鎖若しくは分岐アルキル基、炭素原子数３乃至１０の脂環式炭化水素基、炭素原子数６乃至１０のアリール基、炭素原子数７乃至１５のアラルキル基又は炭素原子数７乃至１５のアリールオキシアルキル基（ここで、前記アリール部分は、ハロゲン原子で置換されていてもよい炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基で置換されていてもよい）を表し；
Ａｎ⁻は、ハロゲン化物イオン、無機酸イオン、水酸化物イオン及びイソチオシアネートイオンからなる群から選ばれる陰イオンを表す］が表面の少なくとも一部にコーティングされていることを特徴とする、細胞培養容器である。

＜細胞＞
本発明における細胞とは、動物又は植物を構成する最も基本的な単位であり、その要素として細胞膜の内部に細胞質と各種の細胞小器官をもつものである。この際、ＤＮＡを内包する核は、細胞内部に含まれても含まれなくてもよい。例えば、本発明における動物由来の細胞には、精子や卵子などの生殖細胞、生体を構成する体細胞、幹細胞（多能性幹細胞等）、前駆細胞、生体から分離された癌細胞、生体から分離され不死化能を獲得して体外で安定して維持される細胞（細胞株）、生体から分離され人為的に遺伝子改変が成された細胞、生体から分離され人為的に核が交換された細胞等が含まれる。生体を構成する体細胞の例としては、以下に限定されるものではないが、線維芽細胞、骨髄細胞、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、好中球、赤血球、血小板、マクロファージ、単球、骨細胞、骨髄細胞、周皮細胞、樹状細胞、ケラチノサイト、脂肪細胞、間葉細胞、上皮細胞、表皮細胞、内皮細胞、血管内皮細胞、肝実質細胞、軟骨細胞、卵丘細胞、神経系細胞、グリア細胞、ニューロン、オリゴデンドロサイト、マイクログリア、星状膠細胞、心臓細胞、食道細胞、筋肉細胞（たとえば、平滑筋細胞又は骨格筋細胞）、膵臓ベータ細胞、メラニン細胞、造血前駆細胞（例えば、臍帯血由来のＣＤ３４陽性細胞）、及び単核細胞等が含まれる。当該体細胞は、例えば皮膚、腎臓、脾臓、副腎、肝臓、肺、卵巣、膵臓、子宮、胃、結腸、小腸、大腸、膀胱、前立腺、精巣、胸腺、筋肉、結合組織、骨、軟骨、血管組織、血液（臍帯血を含む）、骨髄、心臓、眼、脳又は神経組織などの任意の組織から採取される細胞が含まれる。幹細胞とは、自分自身を複製する能力と他の複数系統の細胞に分化する能力を兼ね備えた細胞であり、その例としては、以下に限定されるものではないが、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性腫瘍細胞、胚性生殖幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、筋幹細胞、生殖幹細胞、腸幹細胞、癌幹細胞、毛包幹細胞などが含まれる。多能性幹細胞としては、前記幹細胞のうち、ＥＳ細胞、胚性生殖幹細胞、ｉＰＳ細胞が挙げられる。前駆細胞とは、前記幹細胞から特定の体細胞や生殖細胞に分化する途中の段階にある細胞である。癌細胞とは、体細胞から派生して無限の増殖能を獲得した細胞である。細胞株とは、生体外での人為的な操作により無限の増殖能を獲得した細胞である。
がん細胞株の例としては、以下に限定されるものではないが、ヒト乳がん細胞株としてＨＢＣ−４、ＢＳＹ−１、ＢＳＹ−２、ＭＣＦ−７、ＭＣＦ−７／ＡＤＲ ＲＥＳ、ＨＳ５７８Ｔ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５、ＭＤＡ−Ｎ、ＢＴ−５４９、Ｔ４７Ｄ、ヒト子宮頸がん細胞株としてＨｅＬａ、ヒト肺がん細胞株としてＡ５４９、ＥＫＶＸ、ＨＯＰ−６２、ＨＯＰ−９２、ＮＣＩ−Ｈ２３、ＮＣＩ−Ｈ２２６、ＮＣＩ−Ｈ３２２Ｍ、ＮＣＩ−Ｈ４６０、ＮＣＩ−Ｈ５２２、ＤＭＳ２７３、ＤＭＳ１１４、ヒト大腸がん細胞株としてＣａｃｏ−２、ＣＯＬＯ−２０５、ＨＣＣ−２９９８、ＨＣＴ−１５、ＨＣＴ−１１６、ＨＴ−２９、ＫＭ−１２、ＳＷ−６２０、ＷｉＤｒ、ヒト前立腺がん細胞株としてＤＵ−１４５、ＰＣ−３、ＬＮＣａＰ、ヒト中枢神経系がん細胞株としてＵ２５１、ＳＦ−２９５、ＳＦ−５３９、ＳＦ−２６８、ＳＮＢ−７５、ＳＮＢ−７８、ＳＮＢ−１９、ヒト卵巣がん細胞株としてＯＶＣＡＲ−３、ＯＶＣＡＲ−４、ＯＶＣＡＲ−５、ＯＶＣＡＲ−８、ＳＫ−ＯＶ−３、ＩＧＲＯＶ−１、ヒト腎がん細胞株としてＲＸＦ−６３１Ｌ、ＡＣＨＮ、ＵＯ−３１、ＳＮ−１２Ｃ、Ａ４９８、ＣＡＫＩ−１、ＲＸＦ−３９３Ｌ、７８６−０、ＴＫ−１０、ヒト胃がん細胞株としてＭＫＮ４５、ＭＫＮ２８、Ｓｔ−４、ＭＫＮ−１、ＭＫＮ−７、ＭＫＮ−７４、皮膚がん細胞株としてＬＯＸ−ＩＭＶＩ、ＬＯＸ、ＭＡＬＭＥ−３Ｍ、ＳＫ−ＭＥＬ−２、ＳＫ−ＭＥＬ−５、ＳＫ−ＭＥＬ−２８、ＵＡＣＣ−６２、ＵＡＣＣ−２５７、Ｍ１４、白血病細胞株としてＣＣＲＦ−ＣＲＭ、Ｋ５６２、ＭＯＬＴ−４、ＨＬ−６０ＴＢ、ＲＰＭＩ８２２６、ＳＲ、ＵＴ７／ＴＰＯ、Ｊｕｒｋａｔ等が挙げられる。細胞株の例としては、以下に限定されるものではないが、ＨＥＫ２９３（ヒト胎児腎細胞）、ＭＤＣＫ、ＭＤＢＫ、ＢＨＫ、Ｃ−３３Ａ、ＡＥ−１、３Ｄ９、Ｎｓ０／１、ＮＩＨ３Ｔ３、ＰＣ１２、Ｓ２、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ（登録商標）、Ｖｅｒｏ等が含まれる。肝細胞株の例としては、以下に限定されるものではないが、ＨｅｐＧ２、Ｈｅｐ３Ｂ、ＨｅｐａＲＧ（登録商標）、ＪＨＨ７、ＨＬＦ、ＨＬＥ、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５、ＷＲＬ６８、ＨＢ６１１、ＳＫ−ＨＥＰ−１、ＨｕＨ−４、ＨｕＨ−７等が挙げられる。

本発明における植物由来の細胞には、植物体の各組織から分離した細胞が含まれ、当該細胞から細胞壁を人為的に除いたプロトプラストも含まれる。

＜容器＞
本発明の細胞培養容器を構成する、共重合体がコーティングされる容器は、当技術分野で使用され得る任意の形態の容器類であればよく、例えば、細胞の培養に一般的に用いられるシャーレ、フラスコ、プラスチックバック、テフロン（登録商標）バック、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウエルプレート、マルチプレート、マルチウェルプレート、チャンバースライド、細胞培養フラスコ、スピナーフラスコ、チューブ、トレイ、培養バック、ローラーボトル等が挙げられる。好ましくは、６〜１５３６穴のマルチウェルプレート及びシャーレが挙げられる。

容器の素材としては、典型的には、ガラス又は樹脂を用いることができる。加工容易性や経済性等の点から、樹脂を用いるのが好ましい。樹脂は、天然樹脂又は合成樹脂いずれでもよく、天然樹脂としては、例えば、セルロース、三酢酸セルロース（ＣＴＡ）、デキストラン硫酸を固定化したセルロース等を挙げることができ、合成樹脂としては、例えば、ポリアクリロニトリル（ＰＡＮ）、ポリエステル系ポリマーアロイ（ＰＥＰＡ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリスルホン（ＰＳＦ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン（ＰＵ）、エチレンビニルアルコール（ＥＶＡＬ）、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリエステル、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、超高分子量ポリエチレン（ＵＨＰＥ）、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン樹脂（ＡＢＳ）、テフロン（登録商標）、シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）（例えば、ＺＥＯＮＯＲ（登録商標）、ＺＥＯＮＥＸ（登録商標）（日本ゼオン（株）製））又は各種イオン交換樹脂又は等を挙げることができる。本発明の細胞培養容器の製造では、共重合体を、該容器の表面の少なくとも一部に存在するようにコーティングする際に、高温での処理を要しないため、耐熱性が低い樹脂等も適用可能である。

＜共重合体＞
本発明の細胞培養容器は、容器の表面の少なくとも一部が、特定の共重合体でコーティングされていることを特徴とする。本発明に係る共重合体は、下記式（ａ）で表される基を含む繰り返し単位と、下記式（ｂ）で表される基を含む繰り返し単位と、下記式（ｃ）で表される基を含む繰り返し単位とを含む共重合体：

［式中、
Ｕ^ａ１、Ｕ^ａ２、Ｕ^ｂ１、Ｕ^ｂ２及びＵ^ｂ３は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し；
Ｒ^ｃは、炭素原子数１乃至１８の直鎖若しくは分岐アルキル基、炭素原子数３乃至１０の脂環式炭化水素基、炭素原子数６乃至１０のアリール基、炭素原子数７乃至１５のアラルキル基又は炭素原子数７乃至１５のアリールオキシアルキル基（ここで、前記アリール部分は、ハロゲン原子で置換されていてもよい炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基で置換されていてもよい）を表し；
Ａｎ⁻は、ハロゲン化物イオン、無機酸イオン、水酸化物イオン及びイソチオシアネートイオンからなる群から選ばれる陰イオンを表す］である。

本発明に係る共重合体は、上記式（ａ）で表される基を含む繰り返し単位と、上記式（ｂ）で表される基を含む繰り返し単位と、上記式（ｃ）で表される基を含む繰り返し単位とを含む共重合体であれば、特に制限は無い。なお、本発明において、上記式（ｃ）で表される基を含む繰り返し単位は、上記式（ａ）で表される基を含む繰り返し単位及び上記式（ｂ）で表される基を含む繰り返し単位とは異なる。該共重合体は、上記式（ａ）で表される基を含むモノマーと、上記式（ｂ）で表される基を含むモノマーと、上記式（ｃ）で表される基を含むモノマーとをラジカル重合して得られたものが望ましいが、重縮合、重付加反応させたものも使用できる。共重合体の例としては、オレフィンが反応したビニル重合ポリマー、ポリアミド、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリウレタン等が挙げられるが、これらの中でも特にオレフィンが反応したビニル重合ポリマー又は（メタ）アクリレート化合物を重合させた（メタ）アクリルポリマーが望ましい。

好ましくは、上記式（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）で表される基を含むモノマーは、それぞれ、下記式（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）：

［式中、
Ｔ^ａ、Ｔ^ｂ、Ｔ^ｃ、Ｕ^ａ１、Ｕ^ａ２、Ｕ^ｂ１、Ｕ^ｂ２及びＵ^ｂ３は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し；
Ｑ^ａ及びＱ^ｂは、それぞれ独立して、単結合、エステル結合又はアミド結合を表し、Ｑ^ｃは、単結合、エーテル結合又はエステル結合を表し；
Ｒ^ａ及びＲ^ｂは、それぞれ独立して、ハロゲン原子で置換されていてもよい炭素原子数１乃至１０の直鎖又は分岐アルキレン基を表し、Ｒ^ｃは、炭素原子数１乃至１８の直鎖若しくは分岐アルキル基、炭素原子数３乃至１０の脂環式炭化水素基、炭素原子数６乃至１０のアリール基、炭素原子数７乃至１５のアラルキル基又は炭素原子数７乃至１５のアリールオキシアルキル基（ここで、前記アリール部分は、ハロゲン原子で置換されていてもよい炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基で置換されていてもよい）を表し；Ａｎ⁻は、ハロゲン化物イオン、無機酸イオン、水酸化物イオン及びイソチオシアネートイオンからなる群から選ばれる陰イオンを表し；
ｍは、０乃至６の整数を表す］で表されるモノマーである。したがって、式（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）で表されるモノマーから誘導される繰り返し単位は、それぞれ、下記式（ａ１）、（ｂ１）及び（ｃ１）：

（式中、Ｔ^ａ、Ｔ^ｂ、Ｔ^ｃ、Ｕ^ａ１、Ｕ^ａ２、Ｕ^ｂ１、Ｕ^ｂ２及びＵ^ｂ３、Ｑ^ａ、Ｑ^ｂ及びＱ^ｃ、Ｒ^ａ、Ｒ^ｂ及びＲ^ｃ、Ａｎ⁻並びにｍは、上記と同義である）で表される。

Ｔ^ａ、Ｔ^ｂ及びＴ^ｃは、好ましくは、それぞれ独立して、水素原子、メチル基又はエチル基であり、より好ましくは、それぞれ独立して、水素原子又はメチル基である。

Ｕ^ａ１、Ｕ^ａ２、Ｕ^ｂ１、Ｕ^ｂ２及びＵ^ｂ３は、好ましくは、それぞれ独立して、水素原子、メチル基、エチル基又はｔ−ブチル基である。Ｕ^ａ１及びＵ^ａ２は、より好ましくは、水素原子である。Ｕ^ｂ１、Ｕ^ｂ２（及びＵ^ｂ３）は、より好ましくは、メチル基又はエチル基であり、特に好ましくはメチル基である。

Ｑ^ａ及びＱ^ｂは、好ましくは、それぞれ独立して、エステル結合（−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−若しくは−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−）又はアミド結合（−ＮＨＣ（＝Ｏ）−若しくは−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−）であり、より好ましくは、それぞれ独立して、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−又は−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−であり、特に好ましくは、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−である。Ｑ^Ｃは、好ましくは、エーテル結合又はエステル結合（−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−若しくは−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−）であり、より好ましくは、−Ｏ−又は−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−であり、特に好ましくは、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−である。

Ｒ^ａ及びＲ^ｂは、好ましくは、それぞれ独立して、ハロゲン原子で置換されていてもよい炭素原子数１乃至３の直鎖又は分岐アルキレン基であり、より好ましくは、それぞれ独立して、エチレン基若しくはプロピレン基であるか、あるいは１つの塩素原子で置換されたエチレン基若しくはプロピレン基であり、特に好ましくは、エチレン基若しくはプロピレン基である。Ｒ^ｃは、好ましくは、炭素原子数４乃至８の直鎖若しくは分岐アルキル基又は炭素原子数３乃至８の脂環式炭化水素基であり、より好ましくは、炭素原子数４乃至６の直鎖若しくは分岐アルキル基又は炭素原子数３乃至６の脂環式炭化水素基であり、特に好ましくは、ブチル基又はシクロヘキシル基である。

上記Ａｎ⁻として好ましいのは、ハロゲン化物イオン、硫酸イオン、リン酸イオン、水酸化物イオン及びイソチオシアネートイオンであり、特に好ましいのはハロゲン化物イオンである。

式（Ａ）及び（Ｂ）において、ｍは、好ましくは０乃至３の整数を表し、より好ましくは１又は２の整数を表し、特に好ましくは１である。

上記式（Ａ）の具体例としては、ビニルホスホン酸、アシッドホスホオキシエチル（メタ）アクリレート、３−クロロ−２−アシッドホスホオキシプロピル（メタ）アクリレート、アシッドホスホオキシプロピル（メタ）アクリレート、アシッドホスホオキシメチル（メタ）アクリレート、アシッドホスホオキシポリオキシエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、アシッドホスホオキシポリオキシプロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート等が挙げられるが、この中でもビニルホスホン酸、アシッドホスホオキシエチルメタクリレート（＝リン酸２−（メタクリロイルオキシ）エチル）が好ましく用いられる。

ビニルホスホン酸、アシッドホスホオキシエチルメタクリレート（＝リン酸２−（メタクリロイルオキシ）エチル）、アシッドホスホオキシポリオキシエチレングリコールモノメタクリレート及びアシッドホスホオキシポリオキシプロピレングリコールモノメタクリレートの構造式は、それぞれ下記式（Ａ−１）〜式（Ａ−４）で表される。

これらの化合物は、合成時において、後述する一般式（Ｄ）又は（Ｅ）で表されるような、２つの官能基を有する（メタ）アクリレート化合物を含む場合がある。

上記式（Ｂ）の具体例としては、ジメチルアミノエチル（メタ）アクリレート、ジエチルアミノエチル（メタ）アクリレート、ジメチルアミノプロピル（メタ）アクリレート、２−（ｔ−ブチルアミノ）エチル（メタ）アクリレート、メタクロイルコリンクロリド等が挙げられるが、この中でもジメチルアミノエチル（メタ）アクリレート、メタクロイルコリンクロリド又は２−（ｔ−ブチルアミノ）エチル（メタ）アクリレートが好ましく用いられる。

ジメチルアミノエチルアクリレート（＝アクリル酸２−（ジメチルアミノ）エチル）、ジエチルアミノエチルメタクリレート（＝メタクリル酸２−（ジエチルアミノ）エチル）、ジメチルアミノエチルメタクリレート（＝メタクリル酸２−（ジメチルアミノ）エチル）、メタクロイルコリンクロリド及び２−（ｔ−ブチルアミノ）エチルメタクリレート（＝メタクリル酸２−（ｔ−ブチルアミノ）エチル）の構造式は、それぞれ下記式（Ｂ−１）〜式（Ｂ−５）で表される。

上記式（Ｃ）の具体例としては、ブチル（メタ）アクリレート、２−エチルヘキシル（メタ）アクリレート、ラウリル（メタ）アクリレート、ステアリル（メタ）アクリレート等の（メタ）アクリル酸の直鎖若しくは分岐アルキルエステル類；シクロヘキシル（メタ）アクリレート、イソボルニル（メタ）アクリレート等の（メタ）アクリル酸の環状アルキルエステル類；ベンジル（メタ）アクリレート、フェネチル（メタ）アクリレート等の（メタ）アクリル酸のアラルキルエステル類；スチレン、メチルスチレン、クロロメチルスチレン等のスチレン系モノマー；メチルビニルエーテル、ブチルビニルエーテル等のビニルエーテル系モノマー；酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル等のビニルエステル系モノマーが挙げられる。この中でもブチル（メタ）アクリレート又はシクロヘキシル（メタ）アクリレートが好ましく用いられる。

ブチルメタクリレート（＝メタクリル酸ブチル）及びシクロヘキシルメタクリレート（＝メタクリル酸シクロヘキシル）の構造式は、それぞれ下記式（Ｃ−１）及び式（Ｃ−２）で表される。

本発明に係る共重合体中に含まれる式（ａ）で表される基を含む繰り返し単位（又は式（ａ１）で表される繰り返し単位）の割合は、３モル％乃至８０モル％であり、好ましくは３．５モル％乃至５０モル％であり、さらに好ましくは４モル％乃至４０モル％である。なお、本発明に係る共重合体は、２種以上の式（ａ）で表される基を含む繰り返し単位（又は式（ａ１）で表される繰り返し単位）を含んでいてもよい。

本発明に係る共重合体に含まれる式（ｂ）で表される基を含む繰り返し単位（又は式（ｂ１）で表される繰り返し単位）の割合は、３モル％乃至８０モル％であり、好ましくは５モル％乃至７０モル％であり、さらに好ましくは８モル％乃至６５モル％である。なお、本発明に係る共重合体は、２種以上の式（ｂ）で表される基を含む繰り返し単位（又は式（ｂ１）で表される繰り返し単位）を含んでいてもよい。

本発明に係る共重合体に含まれる式（ｃ）で表される基を含む繰り返し単位（又は式（ｃ１）で表される繰り返し単位）の割合は、全共重合体に対して上記式（ａ）及び式（ｂ）を差し引いた残部全てでも良いし、上記式（ａ）及び式（ｂ）と下記に記述する第４成分との合計割合を差し引いた残部であってもよいが、例えば１モル％乃至９０モル％であり、好ましくは３モル％乃至８８モル％であり、さらに好ましくは５モル％乃至８７モル％である。なお、本発明に係る共重合体は、２種以上の式（ｃ）で表される基を含む繰り返し単位（又は式（ｃ１）で表される繰り返し単位）を含んでいてもよい。

本発明に係る共重合体中における上記式（ａ１）、式（ｂ１）及び式（ｃ１）で表され繰り返し単位の割合の組み合わせは、
好ましくは、
式（ａ１）：３モル％乃至８０モル％、式（ｂ１）：３モル％乃至８０モル％、式（ｃ１）：１モル％乃至９０モル％、
より好ましくは、
式（ａ１）：３．５モル％乃至５０モル％、式（ｂ１）：５モル％乃至７０モル％、式（ｃ１）：３モル％乃至８８モル％、
さらに好ましくは、
式（ａ１）：４モル％乃至４０モル％、式（ｂ１）：８モル％乃至６５モル％、式（ｃ１）：５モル％乃至８７モル％、
である。

さらに本発明に係る共重合体は、任意の第４成分が共重合していてもよい。例えば、第４成分として２以上の官能基を有する（メタ）アクリレート化合物が共重合しており、ポリマーの一部が部分的に３次元架橋していてもよい。そのような第４成分として、例えば、下記式（Ｄ）又は（Ｅ）：

［式中、Ｔ^ｄ、Ｔ^ｅ及びＵ^ｅは、それぞれ独立して、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、Ｒ^ｄ及びＲ^ｅは、それぞれ独立して、ハロゲン原子で置換されていてもよい炭素原子数１乃至１０の直鎖若しくは分岐アルキレン基を表し；ｎは、１乃至６の整数を表す］で表される２官能性モノマーが挙げられる。すなわち本発明に係る共重合体は、好ましくは、このような２官能性モノマーから誘導される架橋構造を含むものである。

式（Ｄ）及び（Ｅ）において、Ｔ^ｄ及びＴ^ｅは、好ましくは、それぞれ独立して、水素原子、メチル基又はエチル基であり、より好ましくは、それぞれ独立して、水素原子又はメチル基である。

式（Ｅ）において、Ｕ^ｅは、好ましくは、水素原子、メチル基又はエチル基であり、より好ましくは、水素原子である。

式（Ｄ）において、Ｒ^ｄは、好ましくは、ハロゲン原子で置換されていてもよい炭素原子数１乃至３の直鎖若しくは分岐アルキレン基であり、より好ましくは、それぞれ独立して、エチレン基若しくはプロピレン基であるか、あるいは１つの塩素原子で置換されたエチレン基若しくはプロピレン基であり、特に好ましくは、エチレン基若しくはプロピレン基である。また式（Ｄ）において、ｎは、好ましくは、１乃至５の整数を表し、特に好ましくは１である。

式（Ｅ）において、Ｒ^ｅは、好ましくは、ハロゲン原子で置換されていてもよい炭素原子数１乃至３の直鎖若しくは分岐アルキレン基であり、より好ましくは、それぞれ独立して、エチレン基若しくはプロピレン基であるか、あるいは１つの塩素原子で置換されたエチレン基若しくはプロピレン基であり、特に好ましくは、エチレン基若しくはプロピレン基である。また式（Ｅ）において、ｎは、好ましくは、１乃至５の整数を表し、特に好ましくは１である。

式（Ｄ）で表される２官能性モノマーは、好ましくは、エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、トリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、プロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、又は上記式（Ａ−３）由来の２官能性モノマー等が挙げられる。
式（Ｅ）で表される２官能性モノマーは、好ましくは、リン酸ビス（メタクリロイルオキシメチル）、リン酸ビス［（２−メタクリロイルオキシ）エチル］、リン酸ビス［３−（メタクリロイルオキシ）プロピル］、又は上記式（Ａ−３）由来の２官能性モノマーが挙げられる。

任意の第４成分は、３官能性モノマーであってもよい。そのような第４成分としての３官能性モノマーとしては、例えば、トリアクリル酸ホスフィニリジントリス（オキシ−２，１−エタンジイル）が挙げられる。

これら第４成分の中でも、特に、エチレングリコールジメタクリレート、上記式（Ａ−３）及び（Ａ−４）由来の２官能性モノマーのうち、エチレングリコール及びプロピレングリコールの繰り返し単位を有するジメタクリレート、リン酸ビス［２−（メタクリロイルオキシ）エチル］並びに上記式（Ａ−３）及び（Ａ−４）由来の２官能性モノマーのうち、リン酸エステル基を介してエチレングリコール及びプロピレングリコールの繰り返し単位を有するジメタクリレートが好ましく、その構造式は、それぞれ、下記式（Ｄ−１）〜（Ｄ−３）及び式（Ｅ−１）〜（Ｅ−３）で表される。

共重合体には、これらの第４成分の１種又は２種以上が含まれていてもよい。
上記共重合体中における第４成分、例えば、上記式（Ｄ）又は（Ｅ）で表される２官能性モノマーから誘導される架橋構造の割合は、０モル％乃至５０モル％である。

式（Ａ）で表される化合物の、上記共重合体を形成するモノマー全体に対する割合は、３モル％乃至８０モル％であり、好ましくは３．５モル％乃至５０モル％であり、さらに好ましくは４モル％乃至４０モル％である。また、式（Ａ）で表される化合物は、２種以上であってもよい。
式（Ｂ）で表される化合物の、上記共重合体を形成するモノマー全体に対する割合は、３モル％乃至８０モル％であり、好ましくは５モル％乃至７０モル％であり、さらに好ましくは８モル％乃至６５モル％である。また、式（Ｂ）で表される化合物は、２種以上であってもよい。
式（Ｃ）で表される化合物の、上記共重合体を形成するモノマー全体に対する割合は、上記式（Ａ）及び（Ｂ）の割合を差し引いた残部全てでも良いし、上記式（Ａ）及び（Ｂ）と上記第４成分との合計割合を差し引いた残部であってもよいが、例えば１モル％乃至９０モル％であり、好ましくは３モル％乃至８８モル％であり、さらに好ましくは５モル％乃至８７モル％である。また、式（Ｃ）で表される化合物は、２種以上であってもよい。

本発明に係る共重合体は、さらに任意の第５成分として、エチレン性不飽和モノマー、又は多糖類若しくはその誘導体が共重合していてもよい。エチレン性不飽和モノマーの例としては、（メタ）アクリル酸及びそのエステル；酢酸ビニル；ビニルピロリドン；エチレン；ビニルアルコール；並びにそれらの親水性の官能性誘導体からなる群より選択される１種又は２種以上のエチレン性不飽和モノマーを挙げることができる。多糖類又はその誘導体の例としては、ヒドロキシアルキルセルロース（例えば、ヒドロキシエチルセルロース又はヒドロキシプロピルセルロース）等のセルロース系高分子、デンプン、デキストラン、カードランを挙げることができる。

親水性の官能性誘導体とは、親水性の官能基又は構造を有するエチレン性不飽和モノマーを指す。親水性の官能性基又は構造の例としては、ベタイン構造；アミド構造；アルキレングリコール残基；アミノ基；並びにスルフィニル基等が挙げられる。

ベタイン構造は、第４級アンモニウム型の陽イオン構造と、酸性の陰イオン構造との両性中心を持つ化合物の一価又は二価の基を意味し、例えば、ホスホリルコリン基：

を挙げることができる。そのような構造を有するエチレン性不飽和モノマーの例としては、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）等を挙げることができる。

アミド構造は、下記式：

［ここで、Ｒ^１６、Ｒ^１７及びＲ^１８は、互いに独立して、水素原子又は有機基（例えば、メチル基、ヒドロキシメチル基又はヒドロキシエチル基等）である］
で表される基を意味する。そのような構造を有するエチレン性不飽和モノマーの例としては、（メタ）アクリルアミド、Ｎ−（ヒドロキシメチル）（メタ）アクリルアミド等を挙げることができる。さらに、そのような構造を有するモノマー又はポリマーは、例えば、特開２０１０−１６９６０４号公報等に開示されている。

アルキレングリコール残基は、アルキレングリコール（ＨＯ−Ａｌｋ−ＯＨ；ここでＡｌｋは、炭素原子数１乃至１０のアルキレン基である）の片側端末又は両端末の水酸基が他の化合物と縮合反応した後に残るアルキレンオキシ基（−Ａｌｋ−Ｏ−）を意味し、アルキレンオキシ単位が繰り返されるポリ（アルキレンオキシ）基も包含する。そのような構造を有するエチレン性不飽和モノマーの例としては、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、メトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート等を挙げることができる。さらに、そのような構造を有するモノマー又はポリマーは、例えば、特開２００８−５３３４８９号公報等に開示されている。

アミノ基は、式：−ＮＨ_２、−ＮＨＲ^１９又は−ＮＲ^２０Ｒ^２１［ここで、Ｒ^１９、Ｒ^２０及びＲ^２１は、互いに独立して、有機基（例えば、炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基等）である］で表される基を意味する。本発明におけるアミノ基には、４級化又は塩化されたアミノ基を包含する。そのような構造を有するエチレン性不飽和モノマーの例としては、ジメチルアミノエチル（メタ）アクリレート、２−（ｔ−ブチルアミノ）エチル（メタ）アクリレート、メタクリロイルコリンクロリド等を挙げることができる。

スルフィニル基は、下記式：

［ここで、Ｒ^２２は、有機基（例えば、炭素原子数１乃至１０の有機基、好ましくは、１個以上のヒドロキシ基を有する炭素原子数１乃至１０のアルキル基等）である］
で表される基を意味する。そのような構造を有するポリマーとして、特開２０１４−４８２７８号公報等に開示された共重合体を挙げることができる。

＜共重合体の製造方法＞
本発明に係る共重合体は、一般的なアクリルポリマー又はメタクリルポリマー等の合成方法であるラジカル重合、アニオン重合、カチオン重合などの方法により合成することができる。その形態は溶液重合、懸濁重合、乳化重合、塊状重合など種々の方法が可能である。

反応用溶媒としては、水、リン酸緩衝液又はエタノール等のアルコール又はこれらを組み合わせた混合溶媒でもよいが、水又はエタノールを含むことが望ましい。さらには水又はエタノールを１０質量％以上１００質量％以下含むことが好ましい。さらには水又はエタノールを５０質量％以上１００質量％以下含むことが好ましい。さらには水又はエタノールを８０質量％以上１００質量％以下含むことが好ましい。さらには水又はエタノールを９０質量％以上１００質量％以下含むことが好ましい。好ましくは水とエタノールの合計が１００質量％である。

反応濃度としては、例えば、上記式（ａ）で表される基を含むモノマーと、上記式（ｂ）で表される基を含むモノマーと、上記式（ｃ）で表される基を含むモノマーとの反応溶媒中の濃度を、０．０１質量％乃至４質量％とすることが好ましい。濃度が４質量％超であると、例えば式（ａ）で表されるリン酸基の有する強い会合性により共重合体が反応溶媒中でゲル化してしまう場合がある。濃度０．０１質量％未満では、得られたワニスの濃度が低すぎるため、十分な膜厚のコーティング膜を得るためのコーティング膜形成用組成物の作成が困難である。濃度が、０．０１質量％乃至３質量％、例えば３質量％又は２質量％であることがより好ましい。

本発明に係る共重合体の合成においては、上記式（ａ）で表される基を含むモノマーと、上記式（ｂ）で表される基を含むモノマーとを、例えば式（１）に記載の塩とした後、上記式（ｃ）で表される基を含むモノマーと重合して共重合体を作製してもよい。

リン酸基含有モノマーは会合し易いモノマーのため、反応系中に滴下されたとき、速やかに分散できるように反応溶媒中に少量ずつ滴下してもよい。さらに、反応溶媒はモノマー及びポリマーの溶解性を上げるために加温（例えば４０℃乃至１００℃）してもよい。

重合反応を効率的に進めるためには、重合開始剤を使用することが望ましい。重合開始剤の例としては、２，２′−アゾビス（イソブチロニトリル）、２，２′−アゾビス（２−メチルブチロニトリル）、２，２′−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）（和光純薬工業(株)製；ＶＡ−０６５、１０時間半減期温度；５１℃）、４，４′−アゾビス（４−シアノ吉草酸）、２，２′−アゾビス（４−メトキシ−２，４−ジメチルバレロニトリル）、１，１′−アゾビス（シクロヘキサン−１−カルボニトリル）、１−［（１−シアノ−１−メチルエチル）アゾ］ホルムアミド、２，２′−アゾビス［２−（２−イミダゾリン−２−イル）プロパン］、２，２′−アゾビス（２−メチルプロピオンアミジン）二塩酸塩、２，２′−アゾビス［２−メチル−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）プロピオンアミド］（和光純薬工業(株)製：ＶＡ−０８６、１０時間半減期温度；８６℃）、過酸化ベンゾイル（ＢＰＯ）、２，２′−アゾビス［Ｎ−（２−カルボキシエチル）−２−メチルプロピオンアミジン］ｎ−水和物（和光純薬工業(株)製：ＶＡ−０５７、１０時間半減期温度；５７℃）、４，４′−アゾビス（４−シアノペンタン酸）（和光純薬工業(株)製：Ｖ−５０１）、２，２′−アゾビス［２−（２−イミダゾリン−２−イル）プロパン］二塩酸塩（和光純薬工業(株)製：ＶＡ−０４４、１０時間半減期温度；４４℃）、２，２′−アゾビス［２−（２−イミダゾリン−２−イル）プロパン］二硫酸塩二水和物（和光純薬工業(株)製：ＶＡ−０４６Ｂ、１０時間半減期温度；４６℃）、２，２′−アゾビス［２−（２−イミダゾリン−２−イル）プロパン］（和光純薬工業(株)製：ＶＡ−０６１、１０時間半減期温度；６１℃）、２，２′−アゾビス（２−アミジノプロパン）二塩酸塩（和光純薬工業(株)製：Ｖ−５０、１０時間半減期温度；５６℃）、ペルオキソ二硫酸又はｔ−ブチルヒドロペルオキシド等が用いられるが、この中でもイオンバランス、水への溶解性を考慮して２，２′−アゾビス［２−メチル−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）プロピオンアミド］、２，２′−アゾビス［Ｎ−（２−カルボキシエチル）−２−メチルプロピオンアミジン］ｎ−水和物、４，４′−アゾビス（４−シアノペンタン酸）、２，２′−アゾビス［２−（２−イミダゾリン−２−イル）プロパン］二塩酸塩、２，２′−アゾビス［２−（２−イミダゾリン−２−イル）プロパン］二硫酸塩二水和物、２，２′−アゾビス［２−（２−イミダゾリン−２−イル）プロパン］、２，２′−アゾビス（２−アミジノプロパン）二塩酸塩又はペルオキソ二硫酸の何れかを用いることが望ましい。

重合開始剤の添加量としては、重合に用いられるモノマーの合計重量に対し、０．０５質量％〜１０質量％である。

反応条件は反応容器をオイルバス等で５０℃乃至２００℃に加熱し、1時間乃至４８時間、より好ましくは８０℃乃至１５０℃、５時間乃至３０時間攪拌を行うことで、重合反応が進み本発明に係る共重合体が得られる。反応雰囲気は窒素雰囲気が好ましい。反応手順としては、全反応物質を室温の反応溶媒に全て入れてから、上記温度に加熱して重合させてもよいし、あらかじめ加温した溶媒中に、反応物質の混合物の全部又は一部を少々ずつ滴下してもよい。

例えば、後者の反応手順としては、上記式（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）で表される化合物、溶媒及び重合開始剤を含む混合物を、該重合開始剤の１０時間半減期温度より高い温度に保持した溶媒中に滴下し、反応（重合）させる。かかる反応手順と温度条件を採用することにより、上記式（Ａ）、式（Ｂ）又は式（Ｃ）で表される化合物の反応溶媒中の濃度を、例えば、０．０１質量％乃至１０質量％とすることができる。この場合、濃度が４質量％を超えても、反応前に滴下相及び反応相が透明均一な溶液となり、反応後の共重合体の反応溶媒中でのゲル化を抑制することができる。

本発明に係る共重合体の分子量は、数千から数百万程度であれば良く、好ましくは５，０００乃至５，０００，０００である。さらに好ましくは、１０，０００乃至２，０００，０００である。また、ランダム共重合体、ブロック共重合体、グラフト共重合体のいずれでも良く、該共重合体を製造するための共重合反応それ自体には特別の制限はなく、ラジカル重合やイオン重合や光重合、乳化重合を利用した重合等の公知の溶液中で合成される方法を使用できる。これらは目的の用途によって、本発明の共重合体のうちいずれかを単独使用することもできるし、複数の共重合体を混合し、且つその比率は変えて使用することもできる。

このようにして製造される種々の共重合体は、２次元ポリマーでも３次元ポリマーであってもよく、水を含有する溶液に分散した状態である。つまり、これらのポリマーを含むワニスでは、不均一なゲル化や白濁沈殿が出来ることは好ましくはなく、透明なワニス、分散コロイド状のワニス、又はゾルであるのが好ましい。

本発明の細胞培養容器は、上記共重合体が、容器の表面の少なくとも一部にコーティングされていることを特徴とし、細胞及び培養液と接触しうる容器の内部表面にコーティングされていることが好ましく、容器の表面全体にするコーティングされていることがより好ましい。細胞培養容器への上記共重合体のコーティングは、公知の手段により、具体的には、後述の項目≪細胞培養容器の製造方法≫及び実施例で述べる手段により、形成できる。本発明の細胞培養容器のコーティングの厚さは、容器の形状や目的に応じて適宜選択されるが、１０〜１０００Åが好ましく、１０〜５００Åがより好ましくはであり、１０〜３００Åが特に好ましい。本発明の細胞培養容器は、そのようなコーティングにより、細胞やタンパク質に対する優れた付着抑制能を有する。

≪細胞培養容器の製造方法≫
本発明の第二の態様は、下記式（ａ）で表される基を含む繰り返し単位と、下記式（ｂ）で表される基を含む繰り返し単位と、下記式（ｃ）で表される基を含む繰り返し単位とを含む共重合体：

（式中、Ｕ^ａ１、Ｕ^ａ２、Ｕ^ｂ１、Ｕ^ｂ２及びＵ^ｂ３、Ｒ^ｃ並びにＡｎ⁻は、上記と同義である）を、容器の表面の少なくとも一部にコーティングする工程
を含む、細胞培養容器の製造方法である。

＜コーティング工程＞
本発明の細胞培養容器の製造方法のコーティング工程では、共重合体を、容器の表面の少なくとも一部にコーティングする。例えば、容器が丸底のマルチウェルプレートである場合、ウェルのくぼみの部分のみをコーティングしてもよいが、プレート全体をコーティングしてもよい。ここで、容器及び共重合体は、それぞれ前述の項目＜容器＞及び＜共重合体＞で述べた通りである。

コーティング工程は、特に限定はなく、容器と共重合体を接触させることができる、当業者に公知の何れかのコーティング手段（例えば、塗布、浸漬等）により実施すればよい。例えば、共重合体を含むワニスを容器に塗布することにより、あるいは共重合体を含むワニスに容器を浸漬することにより実施することができる。好ましくは、共重合体を含むワニスに容器を浸漬することにより実施する。

共重合体を含むワニスは、前述の項目＜共重合体の製造方法＞で得られた共重合体を、適切な溶媒に所望の濃度で溶解することにより調製してもよく、あるいはかかる製造方法で得られた共重合体を含む反応溶液を、そのまま又は所望の固形分濃度に希釈した後、ワニスとして使用してもよい。ワニスに含まれる溶媒としては、水、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）、アルコールが挙げられる。アルコールとしては、炭素数２乃至６のアルコール、例えば、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール、イソブタノール、ｔ−ブタノール、１−ペンタノール、２−ペンタノール、３−ペンタノール、１−ヘプタノール、２−ヘプタノール、２，２−ジメチル−１−プロパノール（＝ネオペンチルアルコール）、２−メチル−１−プロパノール、２−メチル−１−ブタノール、２−メチル−２−ブタノール（＝ｔ−アミルアルコール）、３−メチル−１−ブタノール、３−メチル−３−ペンタノール、シクロペンタノール、１−ヘキサノール、２−ヘキサノール、３−ヘキサノール、２，３−ジメチル−２−ブタノール、３，３−ジメチル−１−ブタノール、３，３−ジメチル−２−ブタノール、２−エチル−１−ブタノール、２−メチル−１−ペンタノール、２−メチル−２−ペンタノール、２−メチル−３−ペンタノール、３−メチル−１−ペンタノール、３−メチル−２−ペンタノール、３−メチル−３−ペンタノール、４−メチル−１−ペンタノール、４−メチル−２−ペンタノール、４−メチル−３−ペンタノール及びシクロヘキサノールが挙げられ、単独又はそれらの組み合わせの混合溶媒を用いてもよいが、水、ＰＢＳ及びエタノールから選ばれるのが好ましい。共重合体の溶解のため、水を必ず含む。

ワニス中の共重合体の濃度としては、０．０１乃至４質量％、さらに望ましくは０．０１乃至３質量％、さらに望ましくは０．０１乃至２質量％、さらに望ましくは０．０１乃至１質量％である。共重合体の濃度が０．０１質量％未満であると、十分な膜厚のコーティングが形成できず、４質量％超であると、ワニスの保存安定性が悪くなり、溶解物の析出やゲル化が起こる可能性がある。

なおワニスには、上記共重合体と溶媒の他に、必要に応じて得られるコーティングの性能を損ねない範囲で他の物質を添加することもできる。他の物質としては、防腐剤、界面活性剤、基材（容器）との密着性を高めるプライマー、防かび剤及び糖類等が挙げられる。

ワニス中の共重合体のイオンバランスを調節するために、共重合体を含むワニスは、予めｐＨ調整されていてもよい。ｐＨ調整は、例えば、共重合体を含むワニスにｐＨ調整剤を添加し、ワニスのｐＨを３．５〜８．５、好ましくは４．０〜８．０とすることにより実施してもよい。使用しうるｐＨ調整剤の種類及びその量は、ワニス中の共重合体の濃度や、共重合体のアニオンとカチオンの存在比等に応じて適宜選択される。ｐＨ調整剤の例としては、アンモニア、ジエタノールアミン、ピリジン、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン等の有機アミン；水酸化カリウム、水酸化ナトリウム等のアルカリ金属水酸化物；塩化カリウム、塩化ナトリウム等のアルカリ金属ハロゲン化物；硫酸、リン酸、塩酸、炭酸等の無機酸又はそのアルカリ金属塩；コリン等の４級アンモニウムカチオン；あるいはこれらの混合物（例えば、リン酸緩衝生理食塩水等の緩衝液）を挙げることができる。これらの中でも、アンモニア、ジエタノールアミン、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、水酸化ナトリウム及びコリンが好ましく、特にアンモニア、ジエタノールアミン、水酸化ナトリウム及びコリンが好ましい。

そのような共重合体を含むワニスを、容器に接触させて、その表面の少なくとも一部にコーティングを形成する。コーティングは、容器の表面全体にわたって形成されるのが望ましい。

なお、コーティング工程の前に、容器の表面を、公知のＵＶ／オゾン処理に付して洗浄してもよい。かかる洗浄工程は、市販のＵＶ／オゾンクリーナー等を用いて実施することができる。

＜乾燥・洗浄・滅菌工程＞
コーティング工程後、好ましくはコーティングされた容器を−２００℃乃至２００℃の温度にて乾燥させる。乾燥により、上記コーティング膜形成用組成物中の溶媒を取り除くと共に、本発明に係る共重合体の式（ａ）及び式（ｂ）同士がイオン結合を形成して基体へ完全に固着する。本発明の細胞培養容器のコーティングの膜厚は、１０〜１０００Åが好ましく、１０〜５００Åがより好ましく、１０〜３００Åが特に好ましい。本発明者らは、本発明の細胞培養容器の製造方法では、高温での処理を要さず、低温での処理により、所望の特性を有するコーティングが容器の表面に形成され、しかも数十乃至数百Å程度の薄い膜厚にも係らず、耐久性に優れると共に、細胞やタンパク質に対する優れた付着抑制能を有することを見出した。

乾燥は、例えば、室温（１０℃乃至３５℃、例えば２５℃）で実施することができるが、より迅速にコーティング膜を形成させるために、例えば４０℃乃至５０℃にて実施してもよい。またフリーズドライ法による極低温〜低温（−２００℃乃至−３０℃前後）で実施してもよい。フリーズドライは真空凍結乾燥と呼ばれ、通常乾燥させたいものを冷媒で冷却し、真空状態にて溶媒を昇華により除く方法である。フリーズドライで用いられる一般的な冷媒は、ドライアイスとメタノールを混合媒体（−７８℃）、液体窒素（−１９６℃）等が挙げられる。より好ましい乾燥温度は１０℃乃至１８０℃、さらに好ましい乾燥温度は２５℃乃至１５０℃である。

なお、乾燥工程の前及び／又は後に、コーティングされた容器の表面を、エタノール等の炭素原子数１乃至５のアルコール及び／又は水で洗浄してもよい。かかる洗浄工程は、０℃乃至６０℃、好ましくは２５℃（室温）乃至４０℃の温度で、３０分乃至４８時間、好ましくは１乃至２４時間実施することができる。

さらに乾燥工程後、該コーティングに残存する不純物、未反応モノマー等を除去するため、さらには膜中の共重合体のイオンバランスを調節するために、水及び電解質を含む水溶液からなる群より選ばれる少なくとも１種の溶媒を用い、流水洗浄又は超音波洗浄等で洗浄してもよい。ここで水又は電解質を含む水溶液は例えば４０℃乃至９５℃の範囲で加温されたものでもよい。電解質を含む水溶液は、ＰＢＳ及び生理食塩水（塩化ナトリウムのみ含むもの）、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水、トリス緩衝生理食塩水、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水及びベロナール緩衝生理食塩水が好ましく、ＰＢＳが特に好ましい。

アルコール、水、及びＰＢＳ等で洗浄しても、容器の表面に形成されたコーティングは、溶出せずに基材（すなわち、容器）に強固に固着したままである。形成されたコーティングは、細胞やタンパク質を含む様々な生体物質の付着抑制能を有する。したがって、本発明の細胞培養容器は、細胞やタンパク質の付着抑制に加え、溶媒への耐久性にも優れたものである。

必要に応じて、コーティングされた容器を滅菌するために、放射線、電子線、エチレンオキサイド、オートクレーブ等の公知の滅菌処理を施してもよい。

≪細胞凝集塊の製造方法≫
本発明の第三の態様は、本発明の細胞培養容器及び本発明の製造方法により得られた細胞培養容器（以下、両者を合わせて「本発明の細胞培養容器」という）を用いることを特徴とする、細胞凝集塊の製造方法である。本発明の細胞培養容器を用いると、細胞凝集塊の容器の表面への付着が抑制され、かつコーティングの培養液への溶出が抑制されることから、容器からの刺激のない状態で細胞凝集塊を培養することができる。細胞凝集塊は、好ましくは、本発明の細胞培養容器中で細胞又は組織を浮遊させる効果を有する多糖類（特に、脱アシル化ジェランガム）を含むことを特徴とする培地を用いて培養される。そのような培地の具体的な組成や、培養方法は、例えば、国際公開第２０１４／０１７５１３号公報に開示されている。

以下に、本発明の培養容器及びその製造方法に関する合成例、実施例及び試験例を示すが、これらは本発明をさらに詳細に説明するために示されるものであって、本発明はこれらに限定されるものではない。

＜原料組成の測定方法＞
リン含有化合物を含む原料の、各リン含有化合物の濃度（質量％）測定は、^３１Ｐ−ＮＭＲにより行った。下記標準物質を用いて原料中に含まれる各リン含有化合物の絶対濃度（絶対質量％）を算出した。

(測定条件)
・モード：逆ゲートデカップリングモード（定量モード）
・装置：varian 400 MHz
・溶媒：CD₃OD（重メタノール）（30重量％）
・回転数：0 Hz
・データポイント：64000
・フリップ角：90°
・待ち時間：70 s
・積算回数：16回，n=4，
・標準物質：トリメチルリン酸+D₂O （75％TMP溶液を調製）

＜合成例１＞
アシッドホスホオキシエチルメタクリレート（製品名；ホスマーＭ、ユニケミカル（株）製、乾固法１００℃・１時間における不揮発分：９１．８％、アシッドホスホオキシエチルメタクリレート（４４．２質量％）、リン酸ビス［２−（メタクリロイルオキシ）エチル］（２８．６質量％）、その他の物質（２７．２質量％）の混合物）７．００ｇに純水１６．０５ｇを加え十分に溶解した。次いで、エタノール４８．１６ｇ、メタクリル酸２−（ジエチルアミノ）エチル９．４１ｇ（東京化成工業（株）製）、メタクリル酸ブチル１．３４ｇ（東京化成工業（株）製）、２，２’−アゾビス（Ｎ−（２−カルボキシエチル）−２−メチルプロピオンアミジン）ｎ−水和物（ＶＡ−０５７、和光純薬工業（株）製）０．０９ｇを、２０℃以下に保ちながら、ホスマーＭの水溶液に順に加えた。十分に攪拌して均一となった上記全てのものが入った混合液を、滴下ロートに導入した。一方で、別途純水９６．３１ｇを冷却管付きの３つ口フラスコに加えて窒素フローし、撹拌しながらリフラックス温度まで昇温した。この状態を維持しつつ、上記混合液を導入した滴下ロートを３つ口フラスコにセットし、２時間かけて混合液を純水とエタノールの沸騰液内に滴下した。滴下後、２４時間上記環境を維持した状態で加熱撹拌することで固形分約１０質量％の共重合体含有ワニス１７８．３５ｇを得た。

＜比較合成例１＞
アシッドホスホオキシエチルメタクリレート（製品名；ホスマーＭ、ユニケミカル（株）製、乾固法１００℃・１時間における不揮発分：９１．８％、アシッドホスホオキシエチルメタクリレート（４４．２質量％）、リン酸ビス［２−（メタクリロイルオキシ）エチル］（２８．６質量％）、その他の物質（２７．２質量％）の混合物）２８．００ｇを６０℃に維持しながら撹拌し、メタクリル酸２−（ジメチルアミノ）エチル２１．３７ｇを滴下した。そこに純水１３３．９６ｇ、次いで、エタノール４４．６５ｇ、（東京化成工業（株）製）、２，２’−アゾビス（Ｎ−（２−カルボキシエチル）−２−メチルプロピオンアミジン）ｎ−水和物（ＶＡ−０５７、和光純薬工業（株）製）０．２５ｇを、２０℃以下に保ちながら順に加えた。十分に攪拌して均一となった上記全てのものが入った混合液を、滴下ロートに導入した。一方で、別途純水２６７．９３ｇを冷却管付きの３つ口フラスコに入れ、これを窒素フローし、撹拌しながらリフラックス温度まで昇温した。この状態を維持しつつ、上記混合液を導入した滴下ロートを３つ口フラスコにセットし、２時間かけて混合液を純水とエタノールの沸騰液内に滴下した。滴下後、２４時間上記環境を維持した状態で加熱撹拌することで固形分約９．７０質量％の共重合体含有ワニス４９６．１６ｇを得た。得られた透明液体のＧＦＣにおける重量平均分子量は約２８０，０００であった。

＜調製例１＞
（シリコンウェハの準備）
半導体評価用の市販のシリコンウェハをそのまま用いた。

（ＱＣＭセンサー（ＰＳ）の作成）
Ａｕ蒸着された水晶振動子（Q-Sense，ＱＳＸ３０４）を、ＵＶ／オゾン洗浄装置（ＵＶ２５３Ｅ、フィルジェン株式会社製）を用いて１０分間洗浄し、直後に２−アミノエタンチオール（東京化成工業（株）製）０．０７７２ｇをエタノール１０００ｍｌに溶解した溶液中に２４時間浸漬した。エタノールでセンサー表面を洗浄後自然乾燥し、ポリスチレン（ＰＳ）（Aldrich社製）１．００ｇをトルエン９９．００ｇに溶解したワニスをスピンコーターにて３５００ｒｐｍ／３０ｓｅｃで膜センサー側にスピンコートし、１２０℃／１ｍｉｎ乾燥することでＱＣＭセンサー（ＰＳ）とした。

（コーティングの調製）
上記合成例１で得られた共重合体含有ワニス５．００ｇに、純水３１．５ｇ、エタノール１．３５ｇ、１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液（１Ｎ）（関東化学（株）社製）０．２４ｇを加えて十分に攪拌し、コーティング膜形成組成物を調製した。ｐＨは７．３であった。得られたコーティング膜形成組成物中に、上記シリコンウェハをディップし、オーブンにて４５℃、２４時間乾燥させた。その後、コーティング膜上に付着している未硬化の膜形成用組成物をＰＢＳと純水で十分に洗浄を行って、コーティング膜が形成されたシリコンウェハを得た。上記シリコンウェハを用いて光学式干渉膜厚計でコーティング膜の膜厚を確認したところ９０Åであった。
また、上記コーティング膜形成用組成物を３５００ｒｐｍ／３０ｓｅｃでＱＣＭセンサー（ＰＳ）にスピンコートし、乾燥工程として４５℃のオーブンで２４時間ベークした。その後、洗浄工程として過剰についた未硬化のコーティング膜形成用組成物をＰＢＳと超純水にて各２回ずつ洗浄し、表面処理済ＱＣＭセンサー（ＰＳ）を得た。

＜調製例２＞
上記ＱＣＭセンサー（ＰＳ）をそのまま用いた。

＜調製例３＞
上記比較合成例１で得られた共重合体含有ワニス４５．００ｇに、純水２６５．９２ｇ、エタノール１２５．５８ｇ、１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液（１Ｎ）（関東化学（株）社製）８．１８ｇを加えて十分に攪拌し、コーティング膜形成用組成物を調製した。実施例と同様の方法にて、コーティング膜が形成されたシリコンウェハ、又は表面処理済ＱＣＭセンサー（ＰＳ）を得た。上記シリコンウェハを用いて光学式干渉膜厚計でコーティング膜の膜厚を確認したところ４４Åであった。

＜試験例１：タンパク質付着抑制効果＞
調製例１〜３で得た表面処理済ＱＣＭセンサー（ＰＳ）を散逸型水晶振動子マイクロバランスＱＣＭ−Ｄ（Ｅ４、Q-Sense）に取り付け、周波数の変化が１時間で１Ｈｚ以下となる安定したベースラインを確立するまでＰＢＳを流した。次に、安定したベースラインの周波数を０Ｈｚとして約１０分間ＰＢＳを流した。引き続き、41010 - Basal Medium Eagle (BME), no Glutamine（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製）に１５wt％のウシ血清(FBS)、L-Glutamine、抗生物質としてペニシリンとストレプトマイシンを添加した溶液を約３０分流し、その後再びＰＢＳを約２０分流した後の１１次オーバートーンの吸着誘起周波数のシフト（Δｆ）を読み取った。分析のためにQ-Tools（Q-Sense）を使用して、吸着誘起周波数のシフト（Δｆ）を、Sauerbrey式で説明される吸着誘起周波数のシフト（Δｆ）を単位面積当たりの質量（ng／cm²）と換算したものを生体物質の付着量として下記の表１に示す。本発明に係る合成例１の共重合体をコーティングとして用いた調製例１は、コーティングなしの調製例２及び比較合成例１の共重合体をコーティングとして用いた調製例３と比較し、１桁低い各種タンパク質吸着量を示した。

＜実施例１＞
以下の各処理工程を順番に実施し、本発明における細胞培養容器を調製した。
処理１：合成例１で調製した共重合体含有ワニスを、メッシュサイズが０．２２μｍのフィルターを用いてろ過した後、９６穴細胞培養プレート（ＢＤバイオサイエンス社製、＃３５１１７２）のウェルに２００μＬ（固形分１質量％）／ウェルとなるよう添加し、室温にて１時間静置後、過剰のワニスを除去した。

処理２：オーブン（アドバンテック東洋株式会社製、乾燥機ＦＣ−６１２）を用いて５０℃で１晩乾燥させた。その後、滅菌水を１ウェルあたり２００μＬ添加後、除去して洗浄を行った。同様に、さらに２回洗浄を行い、コーティングされた細胞培養容器を得た。

＜比較例１＞
実施例１で使用した、合成例１で調製した共重合体含有ワニスを、比較合成例１で調製した共重合体含有ワニスに代えた以外は、実施例１と同様にして、コーティングされた細胞培養容器を得た。

＜試験例２：細胞付着抑制効果＞
（コーティングプレートの調製）
実施例１及び比較例１で得られたコーティングされた細胞培養容器を用いた。陽性対照のサンプルとしては、市販の細胞低接着プレート（コーニング社製、＃３４７４）を用いた。陰性対照としては、コーティングを施していない９６穴細胞培養プレート（ＢＤバイオサイエンス社製、＃３５１１７２）を用いた。

（細胞の調製）
細胞は、マウス胚線維芽細胞Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２（ＤＳファーマバイオメディカル社製）を用いた。細胞の培養に用いた培地は、１０％ＦＢＳ（HyClone社製）とＬ−グルタミン−ペニシリン−ストレプトマイシン安定化溶液（Sigma-Aldrich社製）を含むＢＭＥ培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用いた。細胞は、３７℃／ＣＯ_２インキュベーター内にて５％二酸化炭素濃度を保った状態で、直径１０ｃｍのシャーレ（培地１０ｍＬ）を用いて２日間以上静置培養した。引き続き、本細胞をＰＢＳ５ｍｌで洗浄した後、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（インビトロジェン社製）１ｍＬを添加して細胞を剥がし、上記の培地１０ｍＬにてそれぞれ懸濁した。本懸濁液を遠心分離（株式会社トミー精工製、型番ＬＣ−２００、１０００ｒｐｍ／３分、室温）後、上清を除き、上記の培地を添加して細胞懸濁液を調製した。

（細胞付着実験）
上記にて調製したプレートに対して、それぞれの細胞懸濁液を２×１０^３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように各１００μＬ加えた。その後、５％二酸化炭素濃度を保った状態で、３７℃で４日間ＣＯ_２インキュベーター内にて静置した。

（細胞付着の観察）
培養４日間後、実施例１のプレート、比較例１のプレート、陽性対照、及び陰性対照のプレートに対する細胞の付着を倒立型顕微鏡（オリンパス社製、ＣＫＸ３１）による観察（倍率：４倍）に基づき比較した。実施例１のプレート、比較例１のプレート、及び陽性対照のプレートで、細胞の付着はほとんど見られなかった。各プレートの結果（培養４日間後）を図１に示す。また、Cell Counting Kit-8溶液（同仁化学研究所製）を１ウェル当たり１０μＬ添加し、３７℃で２時間ＣＯ_２インキュベーター内にて静置した。その後、吸光度計（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ社製、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ）で４５０ｎｍの吸光度を測定した。各測定値は、それぞれ培地のみを添加したウェルでの測定値を差し引いた。その結果を表２に示す。

上記の通り、陰性対照以外はいずれのプレートでも細胞が付着しないことが示された。この際、付着しなかった細胞は細胞凝集塊（スフェロイド）を形成していた。

本発明の細胞培養容器は、特定の基を含む共重合体で表面の少なくとも一部がコーティングされている。かかるコーティングは、細胞やタンパク質の容器表面への付着を抑制すると共に、コーティングが容器表面に強固に固着しうることから、コーティングの培養液への溶出の抑制が改善されている。したがって、本発明の細胞培養容器は、容器からの刺激のない状態で細胞凝集塊を培養することができる点で有利である。

Claims (9)

1. 下記式（ａ１）で表される繰り返し単位と、下記式（ｂ１）で表される繰り返し単位と、下記式（ｃ１）で表される繰り返し単位とを含む共重合体：
   

   

   
   ［式中、
   Ｔ^ａ、Ｔ^ｂ、Ｔ^ｃ、Ｕ^ａ１、Ｕ^ａ２、Ｕ^ｂ１、Ｕ^ｂ２及びＵ^ｂ３は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し；
   Ｑ^ａ及びＱ^ｂは、それぞれ独立して、単結合、エステル結合又はアミド結合を表し、Ｑ^ｃは、単結合、エーテル結合又はエステル結合を表し；
   Ｒ^ａ及びＲ^ｂは、それぞれ独立して、ハロゲン原子で置換されていてもよい炭素原子数１乃至１０の直鎖又は分岐アルキレン基を表し、Ｒ^ｃは、炭素原子数１乃至１８の直鎖若しくは分岐アルキル基、炭素原子数３乃至１０の脂環式炭化水素基、炭素原子数６乃至１０のアリール基、炭素原子数７乃至１５のアラルキル基又は炭素原子数７乃至１５のアリールオキシアルキル基（ここで、前記アリール部分は、ハロゲン原子で置換されていてもよい炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基で置換されていてもよい）を表し；
   Ａｎ⁻は、ハロゲン化物イオン、無機酸イオン、水酸化物イオン及びイソチオシアネートイオンからなる群から選ばれる陰イオンを表し；
   ｍは、０乃至６の整数を表す］
   が表面にコーティングされていることを特徴とする、細胞培養容器。
2. ｍが１であり、Ｒ^ａ及びＲ^ｂが、それぞれ独立して、エチレン基又はプロピレン基を表す、請求項１に記載の細胞培養容器。
3. 上記共重合体が、さらに下記式（Ｄ）又は（Ｅ）：
   

   

   
   ［式中、
   Ｔ^ｄ、Ｔ^ｅ及びＵ^ｅは、それぞれ独立して、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、
   Ｒ^ｄ及びＲ^ｅは、それぞれ独立して、ハロゲン原子で置換されていてもよい炭素原子数１乃至１０の直鎖又は分岐アルキレン基を表し；
   ｎは、１乃至６の整数を表わす］
   で表されるモノマーから誘導される架橋構造を含む、請求項１又は２に記載の細胞培養容器。
4. Ｔ^ｄ及びＴ^ｅが、それぞれ独立して、水素原子又はメチル基を表し、Ｕ^ｅが、水素原子を表し、Ｒ^ｄ及びＲ^ｅが、それぞれ独立して、エチレン基又はプロピレン基を表す、請求項３に記載の細胞培養容器。
5. タンパク質の付着抑制能を有する、請求項１乃至４何れかに記載の細胞培養容器。
6. 下記式（ａ１）で表される繰り返し単位と、下記式（ｂ１）で表される繰り返し単位と、下記式（ｃ１）で表される繰り返し単位とを含む共重合体：
   

   

   
   ［式中、
   Ｔ^ａ、Ｔ^ｂ、Ｔ^ｃ、Ｕ^ａ１、Ｕ^ａ２、Ｕ^ｂ１、Ｕ^ｂ２及びＵ^ｂ３は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し；
   Ｑ^ａ及びＱ^ｂは、それぞれ独立して、単結合、エステル結合又はアミド結合を表し、Ｑ^ｃは、単結合、エーテル結合又はエステル結合を表し；
   Ｒ^ａ及びＲ^ｂは、それぞれ独立して、ハロゲン原子で置換されていてもよい炭素原子数１乃至１０の直鎖又は分岐アルキレン基を表し、Ｒ^ｃは、炭素原子数１乃至１８の直鎖若しくは分岐アルキル基、炭素原子数３乃至１０の脂環式炭化水素基、炭素原子数６乃至１０のアリール基、炭素原子数７乃至１５のアラルキル基又は炭素原子数７乃至１５のアリールオキシアルキル基（ここで、前記アリール部分は、ハロゲン原子で置換されていてもよい炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基で置換されていてもよい）を表し；
   Ａｎ⁻は、ハロゲン化物イオン、無機酸イオン、水酸化物イオン及びイソチオシアネートイオンからなる群から選ばれる陰イオンを表し；
   ｍは、０乃至６の整数を表す］
   を、容器の表面の少なくとも一部にコーティングする工程
   を含む、細胞培養容器の製造方法。
7. コーティング工程が、共重合体を含むワニスを用いて実施される、請求項６に記載の製造方法。
8. 共重合体を含むワニスが、予めｐＨ調整されている、請求項７に記載の製造方法。
9. 請求項１乃至５何れか１項に記載の細胞培養容器又は請求項６乃至８何れか１項に記載の製造方法により製造された細胞培養容器を用いることを特徴とする、細胞凝集塊の製造方法。

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