KR20190013856A - 세포 배양 용기 - Google Patents

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KR20190013856A
KR20190013856A KR1020187036960A KR20187036960A KR20190013856A KR 20190013856 A KR20190013856 A KR 20190013856A KR 1020187036960 A KR1020187036960 A KR 1020187036960A KR 20187036960 A KR20187036960 A KR 20187036960A KR 20190013856 A KR20190013856 A KR 20190013856A
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KR1020187036960A
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요시오미 히로이
나츠키 아베
다이토 니시노
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닛산 가가쿠 가부시키가이샤
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Abstract

본 발명은, 하기 식 (a) 로 나타내는 기를 포함하는 반복 단위와, 하기 식 (b) 로 나타내는 기를 포함하는 반복 단위와, 하기 식 (c) 로 나타내는 기를 포함하는 반복 단위를 포함하는 공중합체가 표면에 코팅되어 있는 것을 특징으로 하는, 세포 배양 용기, 그 제조 방법 및 그것을 사용한 세포 응집괴의 제조 방법을 제공한다 (식 중, Ua1, Ua2, Ub1, Ub2 및 Ub3, Rc 그리고 An- 는, 명세서 및 특허청구의 범위에 기재된 바와 같다).
Figure pct00027

Description

세포 배양 용기
본 발명은, 세포 배양 용기, 그 제조 방법 및 그것을 사용한 세포 응집괴 (스페어라고도 한다) 의 제조 방법에 관한 것이다. 특히 본 발명은, 세포의 부착 억제능을 갖는 공중합체가 표면에 코팅되어 있는 것을 특징으로 하는, 세포 배양 용기 및 그 제조 방법에 관한 것이다.
최근, 동물이나 식물체 내에서 상이한 역할을 하고 있는 여러 가지 기관, 조직, 및 세포를 생체 외에서 증식 또는 유지시키기 위한 기술이 발전해 오고 있다. 이들 기관, 조직을 생체 외에서 증식 또는 유지하는 것은, 각각 기관 배양, 조직 배양이라고 불리고 있으며, 기관, 조직으로부터 분리된 세포를 생체 외에서 증식, 분화 또는 유지하는 것은 세포 배양이라고 불리고 있다. 세포 배양은, 분리한 세포를 배지 중에서 생체 외에서 증식, 분화 또는 유지하는 기술이고, 생체 내의 각종 기관, 조직, 세포의 기능 및 구조를 상세하게 해석하기 위해서 불가결한 것으로 되어 있다. 또, 당해 기술에 의해 배양된 세포 및/또는 조직은, 화학 물질, 의약품 등의 약효 및 독성 평가나, 효소, 세포 증식 인자, 항체 등의 유용 물질의 대량 생산, 질환이나 결손에 의해 없어진 기관, 조직, 세포를 보충하는 재생 의료, 식물의 품종 개량, 유전자 재조합 작물의 제조 등의 여러 가지 분야에서 이용되고 있다.
동물 유래의 세포는, 그 성상으로부터 부유 세포와 접착 세포로 크게 2 분된다. 부유 세포는, 생육·증식에 족장 (足場) 을 필요로 하지 않는 세포이고, 접착 세포는, 생육·증식에 족장을 필요로 하는 세포이지만, 생체를 구성하는 대부분의 세포는 후자의 접착 세포이다. 접착 세포의 배양 방법으로는, 단층 배양, 분산 배양, 포매 (包埋) 배양, 마이크로 캐리어 배양, 및 세포 응집괴 (스페어) 배양 등이 알려져 있다.
특히 최근에는, 재생 의료 분야의 발전에 수반하여, 보다 생체 내에 가까운 환경에서의 배양 방법으로서 스페어 배양이 주목받고, 그 배양에 적합한 배지 조성물이나, 배지 첨가제가 여러 가지 보고되고 있다 (예를 들어, 특허문헌 1 및 2 참조). 또 스페어 배양에서는, 배양 용기 (기재) 로부터의 자극이, 배양의 결과를 좌우하는 중요한 요인이라고 생각되고 있으며, 세포 (특히, 세포 응집괴) 를 배양 용기로부터의 자극이 없는, 삼차원 환경 또는 완전한 부유 상태에서 배양하는 것이 요구되고 있다 (예를 들어, 특허문헌 3 참조).
본 발명자들은 여러 가지 생체 물질의 부착 억제능을 갖는 코팅 재료로서 기대되고 있는 인산에스테르기를 갖는 폴리머에 주목하여, 검토를 거듭하였다. 그 결과, 특정한 아니온성기와 카티온성기를 포함하는 공중합체에서 표면의 적어도 일부가 코팅된 세포 배양 용기가, 세포의 용기 표면 (내부 표면) 에의 부착을 억제함과 함께, 코팅이 용기 표면에 강고하게 고착 (固着) 될 수 있으므로, 코팅의 배양액으로의 용출이나 방사선 내성이 개선된 세포 배양 용기로서 유용한 것을 보고하였다 (예를 들어, 특허문헌 4 참조).
국제 공개 제2014/017513호 국제 공개 제2013/144372호 일본 공개특허공보 2008-61609호 국제 공개 제2014/0196652호
본 발명은, 세포 배양 용기, 그 제조 방법 및 그것을 사용한 세포 응집괴의 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 특히 본 발명은, 세포의 부착 억제능을 갖는 공중합체가 표면에 코팅되어 있는 것을 특징으로 하는 세포 배양 용기, 그 제조 방법 및 그것을 사용한 세포 응집괴의 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
종래, 세포 (특히, 세포 응집괴) 를 삼차원 환경 또는 완전한 부유 상태에서 배양하기 위해, 세포의 용기 표면에의 부착, 및 세포 배양 용기에 부착된 코팅의 배양액으로의 용출이라는 문제가 있었다. 또, 세포 배양에 의해 생산·분비되는/배지에 포함되는 단백질의 용기 표면에의 부착이라는 문제도 있었다. 친수성 화합물에 의한 코팅이 부착된 세포 배양 용기는, 용기 표면으로의 세포 부착을 개선할 수 있지만, 세포 배양 용기에 부착된 코팅의 배양액으로의 용출이나 단백질의 용기 표면에의 부착 등의 문제가 여전히 있었다.
본 발명자들은, 계속해서 인산에스테르기를 갖는 폴리머에 주목하여, 예의 검토를 거듭하였다. 그 결과, 특정한 아니온성기와 카티온성기에 더하여, 특정한 소수성기를 포함하는 공중합체로 표면의 적어도 일부가 코팅된 세포 배양 용기가, 세포에 더하여, 단백질의 용기 표면에의 부착을 억제함과 함께, 코팅이 용기 표면에 강고하게 고착될 수 있으므로, 코팅의 배양액으로의 용출이 개선된 세포 배양 용기로서 유용한 것을 알아내어, 본 발명을 완성시켰다.
즉, 본 발명은 이하와 같다 :
1. 하기 식 (a) 로 나타내는 기를 포함하는 반복 단위와, 하기 식 (b) 로 나타내는 기를 포함하는 반복 단위와, 하기 식 (c) 로 나타내는 기를 포함하는 반복 단위를 포함하는 공중합체 :
[화학식 1]
Figure pct00001
[식 중,
Ua1, Ua2, Ub1, Ub2 및 Ub3 은, 각각 독립적으로, 수소 원자 또는 탄소 원자수 1 내지 5 의 직사슬 혹은 분기 알킬기를 나타내고 ;
Rc 는, 탄소 원자수 1 내지 18 의 직사슬 혹은 분기 알킬기, 탄소 원자수 3 내지 10 의 지환식 탄화수소기, 탄소 원자수 6 내지 10 의 아릴기, 탄소 원자수 7 내지 15 의 아르알킬기 또는 탄소 원자수 7 내지 15 의 아릴옥시알킬기 (여기서, 상기 아릴 부분은, 할로겐 원자로 치환되어 있어도 되는 탄소 원자수 1 내지 5 의 직사슬 혹은 분기 알킬기로 치환되어 있어도 된다) 를 나타내고 ;
An- 는, 할로겐화물 이온, 무기산 이온, 수산화물 이온 및 이소티오시아네이트 이온으로 이루어지는 군에서 선택되는 음이온을 나타낸다]
가 표면에 코팅되어 있는 것을 특징으로 하는, 세포 배양 용기.
2. 상기 식 (a), (b) 및 (c) 로 나타내는 기를 포함하는 반복 단위가, 각각, 하기 식 (A), (B) 및 (C) :
[화학식 2]
Figure pct00002
[식 중,
Ta, Tb, Tc, Ua1, Ua2, Ub1, Ub2 및 Ub3 은, 각각 독립적으로, 수소 원자 또는 탄소 원자수 1 내지 5 의 직사슬 혹은 분기 알킬기를 나타내고 ;
Qa 및 Qb 는, 각각 독립적으로, 단결합, 에스테르 결합 또는 아미드 결합을 나타내고, Qc 는, 단결합, 에테르 결합 또는 에스테르 결합을 나타내고 ;
Ra 및 Rb 는, 각각 독립적으로, 할로겐 원자로 치환되어 있어도 되는 탄소 원자수 1 내지 10 의 직사슬 또는 분기 알킬렌기를 나타내고, Rc 는, 탄소 원자수 1 내지 18 의 직사슬 혹은 분기 알킬기, 탄소 원자수 3 내지 10 의 지환식 탄화수소기, 탄소 원자수 6 내지 10 의 아릴기, 탄소 원자수 7 내지 15 의 아르알킬기 또는 탄소 원자수 7 내지 15 의 아릴옥시알킬기 (여기서, 상기 아릴 부분은, 할로겐 원자로 치환되어 있어도 되는 탄소 원자수 1 내지 5 의 직사슬 혹은 분기 알킬기로 치환되어 있어도 된다) 를 나타내고 ;
An- 는, 할로겐화물 이온, 무기산 이온, 수산화물 이온 및 이소티오시아네이트 이온으로 이루어지는 군에서 선택되는 음이온을 나타내고 ;
m 은, 0 내지 6 의 정수 (整數) 를 나타낸다]
로 나타내는 모노머로부터 유도되는 반복 단위인, 상기 1 에 기재된 세포 배양 용기.
3. m 이 1 이고, Ra 및 Rb 가, 각각 독립적으로, 에틸렌기 또는 프로필렌기를 나타내는, 상기 2 에 기재된 세포 배양 용기.
4. 상기 공중합체가, 추가로 하기 식 (D) 또는 (E) :
[화학식 3]
Figure pct00003
(식 중,
Td, Te 및 Ue 는, 각각 독립적으로, 수소 원자 또는 탄소 원자수 1 내지 5 의 직사슬 혹은 분기 알킬기를 나타내고 ;
Rd 및 Re 는, 각각 독립적으로, 할로겐 원자로 치환되어 있어도 되는 탄소 원자수 1 내지 10 의 직사슬 또는 분기 알킬렌기를 나타내고 ;
n 은, 1 내지 6 의 정수를 나타낸다)
로 나타내는 모노머로부터 유도되는 가교 구조를 포함하는, 상기 1 내지 3 중 어느 하나에 기재된 세포 배양 용기.
5. Td 및 Te 가, 각각 독립적으로, 수소 원자 또는 메틸기를 나타내고, Ue 가, 수소 원자를 나타내고, Rd 및 Re 가, 각각 독립적으로, 에틸렌기 또는 프로필렌기를 나타내는, 상기 4 에 기재된 세포 배양 용기.
6. 단백질의 부착 억제능을 갖는, 상기 1 내지 5 중 어느 하나에 기재된 세포 배양 용기.
7. 하기 식 (a) 로 나타내는 기를 포함하는 반복 단위와, 하기 식 (b) 로 나타내는 기를 포함하는 반복 단위와, 하기 식 (c) 로 나타내는 기를 포함하는 반복 단위를 포함하는 공중합체 :
[화학식 4]
[식 중,
Ua1, Ua2, Ub1, Ub2 및 Ub3 은, 각각 독립적으로, 수소 원자 또는 탄소 원자수 1 내지 5 의 직사슬 혹은 분기 알킬기를 나타내고 ;
Rc 는, 탄소 원자수 1 내지 18 의 직사슬 혹은 분기 알킬기, 탄소 원자수 3 내지 10 의 지환식 탄화수소기, 탄소 원자수 6 내지 10 의 아릴기, 탄소 원자수 7 내지 15 의 아르알킬기 또는 탄소 원자수 7 내지 15 의 아릴옥시알킬기 (여기서, 상기 아릴 부분은, 할로겐 원자로 치환되어 있어도 되는 탄소 원자수 1 내지 5 의 직사슬 혹은 분기 알킬기로 치환되어 있어도 된다) 를 나타내고 ;
An- 는, 할로겐화물 이온, 무기산 이온, 수산화물 이온 및 이소티오시아네이트 이온으로 이루어지는 군에서 선택되는 음이온을 나타낸다]
를, 용기의 표면 중 적어도 일부에 코팅하는 공정
을 포함하는, 세포 배양 용기의 제조 방법.
8. 상기 식 (a), (b) 및 (c) 로 나타내는 기를 포함하는 반복 단위가, 각각, 하기 식 (A), (B) 및 (C) :
[화학식 5]
Figure pct00005
[식 중,
Ta, Tb, Tc, Ua1, Ua2, Ub1, Ub2 및 Ub3 은, 각각 독립적으로, 수소 원자 또는 탄소 원자수 1 내지 5 의 직사슬 혹은 분기 알킬기를 나타내고 ;
Qa 및 Qb 는, 각각 독립적으로, 단결합, 에스테르 결합 또는 아미드 결합을 나타내고, Qc 는, 단결합, 에테르 결합 또는 에스테르 결합을 나타내고 ;
Ra 및 Rb 는, 각각 독립적으로, 할로겐 원자로 치환되어 있어도 되는 탄소 원자수 1 내지 10 의 직사슬 또는 분기 알킬렌기를 나타내고, Rc 는, 탄소 원자수 1 내지 18 의 직사슬 혹은 분기 알킬기, 탄소 원자수 3 내지 10 의 지환식 탄화수소기, 탄소 원자수 6 내지 10 의 아릴기, 탄소 원자수 7 내지 15 의 아르알킬기 또는 탄소 원자수 7 내지 15 의 아릴옥시알킬기 (여기서, 상기 아릴 부분은, 할로겐 원자로 치환되어 있어도 되는 탄소 원자수 1 내지 5 의 직사슬 혹은 분기 알킬기로 치환되어 있어도 된다) 를 나타내고 ;
An- 는, 할로겐화물 이온, 무기산 이온, 수산화물 이온 및 이소티오시아네이트 이온으로 이루어지는 군에서 선택되는 음이온을 나타내고 ;
m 은, 0 내지 6 의 정수를 나타낸다]
로 나타내는 모노머로부터 유도되는 반복 단위인, 상기 7 에 기재된 제조 방법.
9. 코팅 공정이, 공중합체를 포함하는 바니시를 사용하여 실시되는, 상기 7 또는 8 에 기재된 제조 방법.
10. 공중합체를 포함하는 바니시가 미리 pH 조정되어 있는, 상기 9 에 기재된 제조 방법.
11. 추가로, 코팅된 세포 배양 용기를, 건조 공정 전 및/또는 후에, 세정하는 공정을 포함하는, 상기 7 내지 10 중 어느 하나에 기재된 제조 방법.
12. 건조 공정 후의 세정이, 물 및 전해질을 포함하는 수용액으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 용매를 사용하여 실시되는, 상기 11 에 기재된 제조 방법.
13. 상기 1 내지 6 중 어느 하나에 기재된 세포 배양 용기 또는 상기 7 내지 12 중 어느 하나에 기재된 제조 방법에 의해 제조된 세포 배양 용기를 사용하는 것을 특징으로 하는, 세포 응집괴의 제조 방법.
본 발명의 세포 배양 용기는, 식 (a) 로 나타내는 아니온과, 식 (b) 로 나타내는 카티온과, 식 (c) 로 나타내는 소수성기를 포함하는 공중합체로 표면의 적어도 일부가 코팅됨으로써, 용기 표면으로의 세포나 단백질의 부착을 억제할 수 있다. 그 카티온 및 아니온의 정전기적 밸런스에 의해, 용기의 표면이 전기적으로 중성으로 유지되어, 세포나 단백질의 부착을 방지할 수 있는 것으로 생각된다. 한편, 코팅 중의 그 카티온 및 아니온이 이온 결합 (이온 콤플렉스) 을 형성함으로써, 유리, 섬유, 무기 입자 또는 수지 (합성 수지 및 천연 수지) 등, 용기의 기재의 종류를 선택하지 않고 고착할 수 있고, 추가로 고착 후에는 수계 용매 (물, 인산 완충액 (PBS), 알코올 등) 에 대한 내구성이 우수한 코팅이 된다.
또, 공중합체에 식 (c) 로 나타내는 소수성기를 도입함으로써, 단백질의 부착 억제능이 향상되고, 또한 플라스틱 등의 수지와의 밀착성이 양호하고, 고착 후의 수계 용매에 대한 내구성이 보다 우수한 코팅이 된다.
즉, 본 발명에 의해, 세포에 더하여, 단백질의 용기 표면에의 부착을 억제함과 함께, 용매에 대한 내구성도 우수한 세포 배양 용기를 제공할 수 있다.
도 1 은, 배양 4 일간 후, 실시예 1, 비교예 1, 음성 대조, 양성 대조의 플레이트에 대한 세포의 부착을 도립형 현미경에 의해 관찰한 결과를 나타낸다.
1. 용어의 설명
본 발명에 있어서 사용되는 용어는, 그 밖에 특별히 언급하지 않는 한, 이하의 정의를 갖는다.
본 발명에 있어서, 「할로겐 원자」 는, 불소 원자, 염소 원자, 브롬 원자 또는 요오드 원자를 의미한다.
본 발명에 있어서, 「알킬기」 는, 직사슬 혹은 분기의 포화 지방족 탄화수소의 1 가의 기를 의미한다. 「탄소 원자수 1 내지 5 의 직사슬 혹은 분기 알킬기」 로는, 예를 들어, 메틸기, 에틸기, n-프로필기, 이소프로필기, n-부틸기, 이소부틸기, s-부틸기, t-부틸기, n-펜틸기, 1-메틸부틸기, 2-메틸부틸기, 3-메틸부틸기, 1,1-디메틸프로필기, 1,2-디메틸프로필기, 2,2-디메틸프로필기 또는 1-에틸프로필기를 들 수 있다. 「탄소 원자수 1 내지 18 의 직사슬 혹은 분기 알킬기」 로는, 상기 탄소 원자수 1 내지 5 의 직사슬 혹은 분기 알킬기의 예에 더하여, 헥실기, 헵틸기, 옥틸기, 노닐기, 데실기, 운데실기, 도데실기, 트리데실기, 테트라데실기, 펜타데실기, 헥사데실기, 헵타데실기 또는 옥타데실기, 혹은 그들의 이성체를 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 「할로겐 원자로 치환되어 있어도 되는 탄소 원자수 1 내지 5 의 직사슬 혹은 분기 알킬기」 는, 상기 탄소 원자수 1 내지 5 의 직사슬 혹은 분기 알킬기를 의미하거나, 혹은 1 이상의 상기 할로겐 원자로 치환된 상기 탄소 원자수 1 내지 5 의 직사슬 혹은 분기 알킬기를 의미한다. 「탄소 원자수 1 내지 5 의 직사슬 혹은 분기 알킬기」 의 예는, 상기한 바와 같다. 한편 「1 이상의 할로겐 원자로 치환된 탄소 원자수 1 내지 5 의 직사슬 혹은 분기 알킬기」 는, 상기 탄소 원자수 1 내지 5 의 직사슬 혹은 분기 알킬기의 1 이상의 임의의 수소 원자가, 할로겐 원자로 치환되어 있는 것을 의미하고, 예로는, 플루오로메틸기, 디플루오로메틸기, 트리플루오로메틸기, 클로로메틸기, 디클로로메틸기, 트리클로로메틸기, 브로모메틸기, 요오드메틸기, 2,2,2-트리플루오로에틸기, 2,2,2-트리클로로에틸기, 퍼플루오로에틸기, 퍼플루오로부틸기, 또는 퍼플루오로펜틸기 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 「에스테르 결합」 은, -C(=O)-O- 혹은 -O-C(=O)- 를 의미하고, 「아미드 결합」 은, -NHC(=O)- 혹은 -C(=O)NH- 를 의미하고, 「에테르 결합」 은, -O- 를 의미한다.
본 발명에 있어서, 「할로겐 원자로 치환되어 있어도 되는 탄소 원자수 1 내지 10 의 직사슬 혹은 분기 알킬렌기」 는, 탄소 원자수 1 내지 10 의 직사슬 혹은 분기 알킬렌기, 혹은 1 이상의 할로겐 원자로 치환된 탄소 원자수 1 내지 10 의 직사슬 혹은 분기 알킬렌기를 의미한다. 여기서, 「알킬렌기」 는, 상기 알킬기에 대응하는 2 가의 유기기를 의미한다. 「탄소 원자수 1 내지 10 의 직사슬 혹은 분기 알킬렌기」 의 예로는, 메틸렌기, 에틸렌기, 프로필렌기, 트리메틸렌기, 테트라메틸렌기, 1-메틸프로필렌기, 2-메틸프로필렌기, 디메틸에틸렌기, 에틸에틸렌기, 펜타메틸렌기, 1-메틸-테트라메틸렌기, 2-메틸-테트라메틸렌기, 1,1-디메틸-트리메틸렌기, 1,2-디메틸-트리메틸렌기, 2,2-디메틸-트리메틸렌기, 1-에틸-트리메틸렌기, 헥사메틸렌기, 옥타메틸렌기 및 데카메틸렌기 등을 들 수 있고, 이들 중에서, 에틸렌기, 프로필렌기, 옥타메틸렌기 및 데카메틸렌기가 바람직하고, 예를 들어, 에틸렌기, 프로필렌기, 트리메틸렌기, 테트라메틸렌기 등의 탄소 원자수 1 내지 5 의 직사슬 혹은 분기 알킬렌기가 보다 바람직하고, 특히 에틸렌기 또는 프로필렌기가 바람직하다. 「1 이상의 할로겐 원자로 치환된 탄소 원자수 1 내지 10 의 직사슬 혹은 분기 알킬렌기」 는, 상기 알킬렌기의 1 이상의 임의의 수소 원자가, 할로겐 원자로 치환되어 있는 것을 의미하고, 특히, 에틸렌기 또는 프로필렌기의 수소 원자의 일부 또는 전부가 할로겐 원자로 치환되어 있는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 「탄소 원자수 3 내지 10 의 지환식 탄화수소기」 는, 탄소 원자수 3 내지 10 의 단고리형 혹은 다고리형의 포화 혹은 부분 불포화의 지방족 탄화수소의 1 가의 기를 의미한다. 이 중에서도, 탄소 원자수 3 내지 10 의 단고리형 혹은 2 고리형의 포화 지방족 탄화수소의 1 가의 기가 바람직하고, 예를 들어, 시클로프로필기, 시클로부틸기 또는 시클로헥실기 등의 탄소 원자수 3 내지 10 의 시클로알킬기, 혹은 비시클로[3.2.1]옥틸기, 보르닐기, 이소보르닐기 등의 탄소 원자수 4 내지 10 의 비시클로알킬기를 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 「탄소 원자수 6 내지 10 의 아릴기」 는, 탄소 원자수 6 내지 10 의 단고리형 혹은 다고리형의 방향족 탄화수소의 1 가의 기를 의미하고, 예를 들어, 페닐기, 나프틸기 또는 안트릴기 등을 들 수 있다. 「탄소 원자수 6 내지 10 의 아릴기」 는, 1 이상의 상기 「할로겐 원자로 치환되어 있어도 되는 탄소 원자수 1 내지 5 의 직사슬 혹은 분기 알킬기」 로 치환되어 있어도 된다.
본 발명에 있어서, 「탄소 원자수 7 내지 15 의 아르알킬기」 는, 기 -R-R' (여기서, R 은, 상기 「탄소 원자수 1 내지 5 의 알킬렌기」 를 나타내고, R' 는, 상기 「탄소 원자수 6 내지 10 의 아릴기」 를 나타낸다) 를 의미하고, 예를 들어, 벤질기, 페네틸기, 또는 α-메틸벤질기 등을 들 수 있다. 「탄소 원자수 7 내지 15 의 아르알킬기」 의 아릴 부분은, 1 이상의 상기 「할로겐 원자로 치환되어 있어도 되는 탄소 원자수 1 내지 5 의 직사슬 혹은 분기 알킬기」 로 치환되어 있어도 된다.
본 발명에 있어서, 「탄소 원자수 7 내지 15 의 아릴옥시알킬기」 는, 기 -R-O-R' (여기서, R 은, 상기 「탄소 원자수 1 내지 5 의 알킬렌기」 를 나타내고, R' 는, 상기 「탄소 원자수 6 내지 10 의 아릴기」 를 나타낸다) 를 의미하고, 예를 들어, 페녹시메틸기, 페녹시에틸기, 또는 페녹시프로필기 등을 들 수 있다. 「탄소 원자수 7 내지 15 의 아릴옥시알킬기」 의 아릴 부분은, 1 이상의 상기 「할로겐 원자로 치환되어 있어도 되는 탄소 원자수 1 내지 5 의 직사슬 혹은 분기 알킬기」 로 치환되어 있어도 된다.
본 발명에 있어서, 「할로겐화물 이온」 이란, 불화물 이온, 염화물 이온, 브롬화물 이온 또는 요오드화물 이온을 의미한다.
본 발명에 있어서, 「무기산 이온」 이란, 탄산 이온, 황산 이온, 인산 이온, 인산수소 이온, 인산이수소 이온, 질산 이온, 과염소산 이온 또는 붕산 이온을 의미한다.
상기 An- 로서 바람직한 것은, 할로겐화물 이온, 황산 이온, 인산 이온, 수산화물 이온 및 이소티오시아네이트 이온이고, 특히 바람직한 것은 할로겐화물 이온이다.
본 발명에 있어서, (메트)아크릴레이트 화합물이란, 아크릴레이트 화합물과 메타크릴레이트 화합물의 양방을 의미한다. 예를 들어 (메트)아크릴산은, 아크릴산과 메타크릴산을 의미한다.
세포의 부착 억제능을 갖는이란, 예를 들어, 실시예에 기재한 방법으로 실시하는 세포수 측정 시약에 의한 코팅 없음과 비교했을 경우의 상대 흡광도 (WST O. D. 450 ㎚) (％) (실시예의 흡광도 (WST O. D. 450 ㎚)/비교예의 흡광도 (WST O. D. 450 ㎚) × 100) 가 50 ％ 이하, 바람직하게는 30 ％ 이하, 더욱 바람직하게는 20 ％ 이하인 것을 의미한다.
단백질의 부착 억제능을 갖는이란, 예를 들어, 실시예에 기재한 방법으로 실시하는 QCM-D 측정에서, 코팅막 없음과 비교했을 경우의 상대 단위 면적당의 질량 (％) (실시예의 단위 면적당의 질량 (ng/㎠)/비교예의 단위 면적당의 질량 (ng/㎠) × 100) 이 50 ％ 이하, 바람직하게는 30 ％ 이하, 더욱 바람직하게는 20 ％ 이하인 것을 의미한다.
본 발명에 있어서, 단백질로는 피브리노겐, 소 혈청 알부민 (BSA), 인간 알부민, 각종 글로블린, β-리포 단백질, 각종 항체 (IgG, IgA, IgM), 퍼옥시다아제, 각종 보체, 각종 렉틴, 피브로넥틴, 리소자임, 폰·빌레브란트 인자 (vWF), 혈청 γ-글로블린, 펩신, 난백 알부민, 인슐린, 히스톤, 리보뉴클레아제, 콜라겐, 시토크롬 c 등을 들 수 있고, 특히 혈청에 포함되는 단백질 (알부민 및 글로블린) 에 대해 특히 높은 부착 억제능을 갖는다.
2. 본 발명의 설명
≪세포 배양 용기≫
본 발명의 제 1 양태는, 하기 식 (a) 로 나타내는 기를 포함하는 반복 단위와, 하기 식 (b) 로 나타내는 기를 포함하는 반복 단위와, 하기 식 (c) 로 나타내는 기를 포함하는 반복 단위를 포함하는 공중합체 :
[화학식 6]
Figure pct00006
[식 중,
Ua1, Ua2, Ub1, Ub2 및 Ub3 은, 각각 독립적으로, 수소 원자 또는 탄소 원자수 1 내지 5 의 직사슬 혹은 분기 알킬기를 나타내고 ;
Rc 는, 탄소 원자수 1 내지 18 의 직사슬 혹은 분기 알킬기, 탄소 원자수 3 내지 10 의 지환식 탄화수소기, 탄소 원자수 6 내지 10 의 아릴기, 탄소 원자수 7 내지 15 의 아르알킬기 또는 탄소 원자수 7 내지 15 의 아릴옥시알킬기 (여기서, 상기 아릴 부분은, 할로겐 원자로 치환되어 있어도 되는 탄소 원자수 1 내지 5 의 직사슬 혹은 분기 알킬기로 치환되어 있어도 된다) 를 나타내고 ;
An- 는, 할로겐화물 이온, 무기산 이온, 수산화물 이온 및 이소티오시아네이트 이온으로 이루어지는 군에서 선택되는 음이온을 나타낸다] 가 표면의 적어도 일부에 코팅되어 있는 것을 특징으로 하는, 세포 배양 용기이다.
<세포>
본 발명에 있어서의 세포란, 동물 또는 식물을 구성하는 가장 기본적인 단위이고, 그 요소로서 세포막의 내부에 세포질과 각종 세포 소기관을 갖는 것이다. 이 때, DNA 를 내포하는 핵은, 세포 내부에 포함되어도 되고 포함되지 않아도 된다. 예를 들어, 본 발명에 있어서의 동물 유래의 세포에는, 정자나 난자 등의 생식 세포, 생체를 구성하는 체세포, 줄기세포 (다능성 줄기세포 등), 전구 세포, 생체로부터 분리된 암세포, 생체로부터 분리되어 불사화능 (不死化能) 을 획득하여 체외에서 안정적으로 유지되는 세포 (세포주), 생체로부터 분리되어 인위적으로 유전자 개변이 이루어진 세포, 생체로부터 분리되어 인위적으로 핵이 교환된 세포 등이 포함된다. 생체를 구성하는 체세포의 예로는, 이하에 한정되는 것은 아니지만, 선유아 세포, 골수 세포, B 림프구, T 림프구, 호중구, 적혈구, 혈소판, 매크로파지, 단구, 골세포, 골수 세포, 주피 세포, 수지상 세포, 케라티노사이트, 지방세포, 간엽세포, 상피세포, 표피세포, 내피세포, 혈관내피세포, 간실질세포, 연골세포, 난구세포, 신경계 세포, 글리아세포, 뉴런, 올리고덴드로사이트, 마이크로글리아, 성상교세포, 심장세포, 식도세포, 근육세포 (예를 들어, 평활근세포 또는 골격근세포), 췌장베타세포, 멜라닌세포, 조혈전구세포 (예를 들어, 제대혈 유래의 CD34 양성 세포), 및 단핵 세포 등이 포함된다. 당해 체세포는, 예를 들어 피부, 신장, 비장, 부신, 간장, 폐, 난소, 췌장, 자궁, 위, 결장, 소장, 대장, 방광, 전립선, 정소, 흉선, 근육, 결합 조직, 뼈, 연골, 혈관 조직, 혈액 (제대혈을 포함한다), 골수, 심장, 눈, 뇌 또는 신경 조직 등의 임의의 조직으로부터 채취되는 세포가 포함된다. 줄기세포란, 자기 자신을 복제하는 능력과 다른 복수 계통의 세포로 분화되는 능력을 겸비한 세포이고, 그 예로는, 이하에 한정되는 것은 아니지만, 배성 줄기세포 (ES 세포), 배성 종양 세포, 배성 생식 줄기세포, 인공 다능성 줄기세포 (iPS 세포), 신경 줄기세포, 조혈 줄기세포, 간엽계 줄기세포, 간 줄기세포, 췌 줄기세포, 근 줄기세포, 생식 줄기세포, 장 줄기세포, 암 줄기세포, 모포 줄기세포 등이 포함된다. 다능성 줄기세포로는, 상기 줄기세포 중, ES 세포, 배성 생식 줄기세포, iPS 세포를 들 수 있다. 전구 세포란, 상기 줄기세포로부터 특정한 체세포나 생식 세포로 분화되는 도중의 단계에 있는 세포이다. 암세포란, 체세포로부터 파생하여 무한의 증식능을 획득한 세포이다. 세포주란, 생체 외에서의 인위적인 조작에 의해 무한의 증식능을 획득한 세포이다.
암세포주의 예로는, 이하에 한정되는 것은 아니지만, 인간 유방암 세포주로서 HBC-4, BSY-1, BSY-2, MCF-7, MCF-7/ADR RES, HS578T, MDA-MB-231, MDA-MB-435, MDA-N, BT-549, T47D, 인간 자궁 경부암 세포주로서 HeLa, 인간 폐암 세포주로서 A549, EKVX, HOP-62, HOP-92, NCI-H23, NCI-H226, NCI-H322M, NCI-H460, NCI-H522, DMS273, DMS114, 인간 대장암 세포주로서 Caco-2, COLO-205, HCC-2998, HCT-15, HCT-116, HT-29, KM-12, SW-620, WiDr, 인간 전립선암 세포주로서 DU-145, PC-3, LNCaP, 인간 중추 신경계암 세포주로서 U251, SF-295, SF-539, SF-268, SNB-75, SNB-78, SNB-19, 인간 난소암 세포주로서 OVCAR-3, OVCAR-4, OVCAR-5, OVCAR-8, SK-OV-3, IGROV-1, 인간 신장암 세포주로서 RXF-631L, ACHN, UO-31, SN-12C, A498, CAKI-1, RXF-393L, 786-0, TK-10, 인간 위암 세포주로서 MKN45, MKN28, St-4, MKN-1, MKN-7, MKN-74, 피부암 세포주로서 LOX-IMVI, LOX, MALME-3M, SK-MEL-2, SK-MEL-5, SK-MEL-28, UACC-62, UACC-257, M14, 백혈병 세포주로서 CCRF-CRM, K562, MOLT-4, HL-60TB, RPMI8226, SR, UT7/TPO, Jurkat 등을 들 수 있다. 세포주의 예로는, 이하에 한정되는 것은 아니지만, HEK293 (인간 태아 신세포), MDCK, MDBK, BHK, C-33A, AE-1, 3D9, Ns0/1, NIH3T3, PC12, S2, Sf9, Sf21, High Five (등록상표), Vero 등이 포함된다. 간세포주의 예로는, 이하에 한정되는 것은 아니지만, HepG2, Hep3B, HepaRG (등록상표), JHH7, HLF, HLE, PLC/PRF/5, WRL68, HB611, SK-HEP-1, HuH-4, HuH-7 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서의 식물 유래의 세포에는, 식물체의 각 조직으로부터 분리된 세포가 포함되고, 당해 세포로부터 세포벽을 인위적으로 제거한 프로토플래스트도 포함된다.
<용기>
본 발명의 세포 배양 용기를 구성하는, 공중합체가 코팅되는 용기는, 당 기술 분야에서 사용될 수 있는 임의의 형태의 용기류이면 되고, 예를 들어, 세포의 배양에 일반적으로 사용되는 샬레, 플라스크, 플라스틱 백, 테플론 (등록상표) 백, 디쉬, 페트리 디쉬, 조직 배양용 디쉬, 멀티 디쉬, 마이크로 플레이트, 마이크로 웰 플레이트, 멀티 플레이트, 멀티 웰 플레이트, 챔버 슬라이드, 세포 배양 플라스크, 스피너 플라스크, 튜브, 트레이, 배양 백, 롤러 보틀 등을 들 수 있다. 바람직하게는, 6 ∼ 1536 구멍의 멀티 웰 플레이트 및 샬레를 들 수 있다.
용기의 소재로는, 전형적으로는, 유리 또는 수지를 사용할 수 있다. 가공 용이성이나 경제성 등의 점에서, 수지를 사용하는 것이 바람직하다. 수지는, 천연 수지 또는 합성 수지 중 어느 것이어도 되고, 천연 수지로는, 예를 들어, 셀룰로오스, 삼아세트산셀룰로오스 (CTA), 덱스트란황산을 고정화시킨 셀룰로오스 등을 들 수 있고, 합성 수지로는, 예를 들어, 폴리아크릴로니트릴 (PAN), 폴리에스테르계 폴리머 알로이 (PEPA), 폴리스티렌 (PS), 폴리술폰 (PSF), 폴리에틸렌테레프탈레이트 (PET), 폴리메틸메타크릴레이트 (PMMA), 폴리비닐알코올 (PVA), 폴리우레탄 (PU), 에틸렌비닐알코올 (EVAL), 폴리에틸렌 (PE), 폴리에스테르, 폴리프로필렌 (PP), 폴리불화비닐리덴 (PVDF), 폴리에테르술폰 (PES), 폴리카보네이트 (PC), 폴리염화비닐 (PVC), 폴리테트라플루오로에틸렌 (PTFE), 초고분자량 폴리에틸렌 (UHPE), 폴리디메틸실록산 (PDMS), 아크릴로니트릴-부타디엔-스티렌 수지 (ABS), 테플론 (등록상표), 시클로올레핀 폴리머 (COP) (예를 들어, ZEONOR (등록상표), ZEONEX (등록상표) (닛폰 제온 (주) 제조)) 또는 각종 이온 교환 수지 또는 등을 들 수 있다. 본 발명의 세포 배양 용기의 제조에서는, 공중합체를, 그 용기의 표면의 적어도 일부에 존재하도록 코팅할 때, 고온에서의 처리를 필요로 하지 않기 때문에, 내열성이 낮은 수지 등도 적용 가능하다.
<공중합체>
본 발명의 세포 배양 용기는, 용기의 표면의 적어도 일부가, 특정한 공중합체로 코팅되어 있는 것을 특징으로 한다. 본 발명에 관련된 공중합체는, 하기 식 (a) 로 나타내는 기를 포함하는 반복 단위와, 하기 식 (b) 로 나타내는 기를 포함하는 반복 단위와, 하기 식 (c) 로 나타내는 기를 포함하는 반복 단위를 포함하는 공중합체 :
[화학식 7]
Figure pct00007
[식 중,
Ua1, Ua2, Ub1, Ub2 및 Ub3 은, 각각 독립적으로, 수소 원자 또는 탄소 원자수 1 내지 5 의 직사슬 혹은 분기 알킬기를 나타내고 ;
Rc 는, 탄소 원자수 1 내지 18 의 직사슬 혹은 분기 알킬기, 탄소 원자수 3 내지 10 의 지환식 탄화수소기, 탄소 원자수 6 내지 10 의 아릴기, 탄소 원자수 7 내지 15 의 아르알킬기 또는 탄소 원자수 7 내지 15 의 아릴옥시알킬기 (여기서, 상기 아릴 부분은, 할로겐 원자로 치환되어 있어도 되는 탄소 원자수 1 내지 5 의 직사슬 혹은 분기 알킬기로 치환되어 있어도 된다) 를 나타내고 ;
An- 는, 할로겐화물 이온, 무기산 이온, 수산화물 이온 및 이소티오시아네이트 이온으로 이루어지는 군에서 선택되는 음이온을 나타낸다] 이다.
본 발명에 관련된 공중합체는, 상기 식 (a) 로 나타내는 기를 포함하는 반복 단위와, 상기 식 (b) 로 나타내는 기를 포함하는 반복 단위와, 상기 식 (c) 로 나타내는 기를 포함하는 반복 단위를 포함하는 공중합체이면, 특별히 제한은 없다. 또한, 본 발명에 있어서, 상기 식 (c) 로 나타내는 기를 포함하는 반복 단위는, 상기 식 (a) 로 나타내는 기를 포함하는 반복 단위 및 상기 식 (b) 로 나타내는 기를 포함하는 반복 단위와는 상이하다. 그 공중합체는, 상기 식 (a) 로 나타내는 기를 포함하는 모노머와, 상기 식 (b) 로 나타내는 기를 포함하는 모노머와, 상기 식 (c) 로 나타내는 기를 포함하는 모노머를 라디칼 중합하여 얻어진 것이 바람직하지만, 중축합, 중부가 반응시킨 것도 사용할 수 있다. 공중합체의 예로는, 올레핀이 반응한 비닐 중합 폴리머, 폴리아미드, 폴리에스테르, 폴리카보네이트, 폴리우레탄 등을 들 수 있지만, 이들 중에서도 특히 올레핀이 반응한 비닐 중합 폴리머 또는 (메트)아크릴레이트 화합물을 중합시킨 (메트)아크릴 폴리머가 바람직하다.
바람직하게는, 상기 식 (a), (b) 및 (c) 로 나타내는 기를 포함하는 모노머는, 각각, 하기 식 (A), (B) 및 (C) :
[화학식 8]
Figure pct00008
[식 중,
Ta, Tb, Tc, Ua1, Ua2, Ub1, Ub2 및 Ub3 은, 각각 독립적으로, 수소 원자 또는 탄소 원자수 1 내지 5 의 직사슬 혹은 분기 알킬기를 나타내고 ;
Qa 및 Qb 는, 각각 독립적으로, 단결합, 에스테르 결합 또는 아미드 결합을 나타내고, Qc 는, 단결합, 에테르 결합 또는 에스테르 결합을 나타내고 ;
Ra 및 Rb 는, 각각 독립적으로, 할로겐 원자로 치환되어 있어도 되는 탄소 원자수 1 내지 10 의 직사슬 또는 분기 알킬렌기를 나타내고, Rc 는, 탄소 원자수 1 내지 18 의 직사슬 혹은 분기 알킬기, 탄소 원자수 3 내지 10 의 지환식 탄화수소기, 탄소 원자수 6 내지 10 의 아릴기, 탄소 원자수 7 내지 15 의 아르알킬기 또는 탄소 원자수 7 내지 15 의 아릴옥시알킬기 (여기서, 상기 아릴 부분은, 할로겐 원자로 치환되어 있어도 되는 탄소 원자수 1 내지 5 의 직사슬 혹은 분기 알킬기로 치환되어 있어도 된다) 를 나타내고 ;
An- 는, 할로겐화물 이온, 무기산 이온, 수산화물 이온 및 이소티오시아네이트 이온으로 이루어지는 군에서 선택되는 음이온을 나타내고 ;
m 은, 0 내지 6 의 정수를 나타낸다] 로 나타내는 모노머이다. 따라서, 식 (A), (B) 및 (C) 로 나타내는 모노머로부터 유도되는 반복 단위는, 각각, 하기 식 (a1), (b1) 및 (c1) :
[화학식 9]
Figure pct00009
(식 중, Ta, Tb, Tc, Ua1, Ua2, Ub1, Ub2 및 Ub3, Qa, Qb 및 Qc, Ra, Rb 및 Rc, An- 그리고 m 은, 상기와 동일한 의미이다) 로 나타낸다.
Ta, Tb 및 Tc 는, 바람직하게는, 각각 독립적으로, 수소 원자, 메틸기 또는 에틸기이고, 보다 바람직하게는, 각각 독립적으로, 수소 원자 또는 메틸기이다.
Ua1, Ua2, Ub1, Ub2 및 Ub3 은, 바람직하게는, 각각 독립적으로, 수소 원자, 메틸기, 에틸기 또는 t-부틸기이다. Ua1 및 Ua2 는, 보다 바람직하게는, 수소 원자이다. Ub1, Ub2 (및 Ub3) 는, 보다 바람직하게는, 메틸기 또는 에틸기이고, 특히 바람직하게는 메틸기이다.
Qa 및 Qb 는, 바람직하게는, 각각 독립적으로, 에스테르 결합 (-C(=O)-O- 혹은 -O-C(=O)-) 또는 아미드 결합 (-NHC(=O)- 혹은 -C(=O)NH-) 이고, 보다 바람직하게는, 각각 독립적으로, -C(=O)-O- 또는 -C(=O)NH- 이고, 특히 바람직하게는, -C(=O)-O-이다. Qc 는, 바람직하게는, 에테르 결합 또는 에스테르 결합 (-C(=O)-O- 혹은 -O-C(=O)-) 이고, 보다 바람직하게는, -O- 또는 -C(=O)-O-이고, 특히 바람직하게는, -C(=O)-O-이다.
Ra 및 Rb 는, 바람직하게는, 각각 독립적으로, 할로겐 원자로 치환되어 있어도 되는 탄소 원자수 1 내지 3 의 직사슬 또는 분기 알킬렌기이고, 보다 바람직하게는, 각각 독립적으로, 에틸렌기 혹은 프로필렌기이거나, 혹은 1 개의 염소 원자로 치환된 에틸렌기 혹은 프로필렌기이고, 특히 바람직하게는, 에틸렌기 혹은 프로필렌기이다. Rc 는, 바람직하게는, 탄소 원자수 4 내지 8 의 직사슬 혹은 분기 알킬기 또는 탄소 원자수 3 내지 8 의 지환식 탄화수소기이고, 보다 바람직하게는, 탄소 원자수 4 내지 6 의 직사슬 혹은 분기 알킬기 또는 탄소 원자수 3 내지 6 의 지환식 탄화수소기이고, 특히 바람직하게는, 부틸기 또는 시클로헥실기이다.
상기 An- 로서 바람직한 것은, 할로겐화물 이온, 황산 이온, 인산 이온, 수산화물 이온 및 이소티오시아네이트 이온이고, 특히 바람직한 것은 할로겐화물 이온이다.
식 (A) 및 (B) 에 있어서, m 은, 바람직하게는 0 내지 3 의 정수를 나타내고, 보다 바람직하게는 1 또는 2 의 정수를 나타내고, 특히 바람직하게는 1 이다.
상기 식 (A) 의 구체예로는, 비닐포스폰산, 애시드포스포옥시에틸(메트)아크릴레이트, 3-클로로-2-애시드포스포옥시프로필(메트)아크릴레이트, 애시드포스포옥시프로필(메트)아크릴레이트, 애시드포스포옥시메틸(메트)아크릴레이트, 애시드포스포옥시폴리옥시에틸렌글리콜모노(메트)아크릴레이트, 애시드포스포옥시폴리옥시프로필렌글리콜모노(메트)아크릴레이트 등을 들 수 있지만, 이 중에서도 비닐포스폰산, 애시드포스포옥시에틸메타크릴레이트 (=인산2-(메타크릴로일옥시)에틸) 이 바람직하게 사용된다.
비닐포스폰산, 애시드포스포옥시에틸메타크릴레이트 (=인산2-(메타크릴로일옥시)에틸), 애시드포스포옥시폴리옥시에틸렌글리콜모노메타크릴레이트 및 애시드포스포옥시폴리옥시프로필렌글리콜모노메타크릴레이트의 구조식은, 각각 하기 식 (A-1) ∼ 식 (A-4) 로 나타낸다.
[화학식 10]
Figure pct00010
이들 화합물은, 합성시에 있어서, 후술하는 일반식 (D) 또는 (E) 로 나타내는 바와 같은, 2 개의 관능기를 갖는 (메트)아크릴레이트 화합물을 포함하는 경우가 있다.
상기 식 (B) 의 구체예로는, 디메틸아미노에틸(메트)아크릴레이트, 디에틸아미노에틸(메트)아크릴레이트, 디메틸아미노프로필(메트)아크릴레이트, 2-(t-부틸아미노)에틸(메트)아크릴레이트, 메타크릴로일콜린클로라이드 등을 들 수 있지만, 이 중에서도 디메틸아미노에틸(메트)아크릴레이트, 메타크릴로일콜린클로라이드 또는 2-(t-부틸아미노)에틸(메트)아크릴레이트가 바람직하게 사용된다.
디메틸아미노에틸아크릴레이트 (=아크릴산2-(디메틸아미노)에틸), 디에틸아미노에틸메타크릴레이트 (=메타크릴산2-(디에틸아미노)에틸), 디메틸아미노에틸메타크릴레이트 (=메타크릴산2-(디메틸아미노)에틸), 메타크릴로일콜린클로라이드 및 2-(t-부틸아미노)에틸메타크릴레이트 (=메타크릴산2-(t-부틸아미노)에틸) 의 구조식은, 각각 하기 식 (B-1) ∼ 식 (B-5) 로 나타낸다.
[화학식 11]
Figure pct00011
상기 식 (C) 의 구체예로는, 부틸(메트)아크릴레이트, 2-에틸헥실(메트)아크릴레이트, 라우릴(메트)아크릴레이트, 스테아릴(메트)아크릴레이트 등의 (메트)아크릴산의 직사슬 혹은 분기 알킬에스테르류 ; 시클로헥실(메트)아크릴레이트, 이소보르닐(메트)아크릴레이트 등의 (메트)아크릴산의 고리형 알킬에스테르류 ; 벤질(메트)아크릴레이트, 페네틸(메트)아크릴레이트 등의 (메트)아크릴산의 아르알킬에스테르류 ; 스티렌, 메틸스티렌, 클로로메틸스티렌 등의 스티렌계 모노머 ; 메틸비닐에테르, 부틸비닐에테르 등의 비닐에테르계 모노머 ; 아세트산비닐, 프로피온산비닐 등의 비닐에스테르계 모노머를 들 수 있다. 이 중에서도 부틸(메트)아크릴레이트 또는 시클로헥실(메트)아크릴레이트가 바람직하게 사용된다.
부틸메타크릴레이트 (=메타크릴산부틸) 및 시클로헥실메타크릴레이트 (=메타크릴산시클로헥실) 의 구조식은, 각각 하기 식 (C-1) 및 식 (C-2) 로 나타낸다.
[화학식 12]
Figure pct00012
본 발명에 관련된 공중합체 중에 포함되는 식 (a) 로 나타내는 기를 포함하는 반복 단위 (또는 식 (a1) 로 나타내는 반복 단위) 의 비율은, 3 몰％ 내지 80 몰％ 이고, 바람직하게는 3.5 몰％ 내지 50 몰％ 이고, 더욱 바람직하게는 4 몰％ 내지 40 몰％ 이다. 또한, 본 발명에 관련된 공중합체는, 2 종 이상의 식 (a) 로 나타내는 기를 포함하는 반복 단위 (또는 식 (a1) 로 나타내는 반복 단위) 를 포함하고 있어도 된다.
본 발명에 관련된 공중합체에 포함되는 식 (b) 로 나타내는 기를 포함하는 반복 단위 (또는 식 (b1) 로 나타내는 반복 단위) 의 비율은, 3 몰％ 내지 80 몰％ 이고, 바람직하게는 5 몰％ 내지 70 몰％ 이고, 더욱 바람직하게는 8 몰％ 내지 65 몰％ 이다. 또한, 본 발명에 관련된 공중합체는, 2 종 이상의 식 (b) 로 나타내는 기를 포함하는 반복 단위 (또는 식 (b1) 로 나타내는 반복 단위) 를 포함하고 있어도 된다.
본 발명에 관련된 공중합체에 포함되는 식 (c) 로 나타내는 기를 포함하는 반복 단위 (또는 식 (c1) 로 나타내는 반복 단위) 의 비율은, 전체 공중합체에 대하여 상기 식 (a) 및 식 (b) 를 뺀 잔부 모두이어도 되고, 상기 식 (a) 및 식 (b) 와 하기에 기술하는 제 4 성분의 합계 비율을 뺀 잔부이어도 되지만, 예를 들어 1 몰％ 내지 90 몰％ 이고, 바람직하게는 3 몰％ 내지 88 몰％ 이고, 더욱 바람직하게는 5 몰％ 내지 87 몰％ 이다. 또한, 본 발명에 관련된 공중합체는, 2 종 이상의 식 (c) 로 나타내는 기를 포함하는 반복 단위 (또는 식 (c1) 로 나타내는 반복 단위) 을 포함하고 있어도 된다.
본 발명에 관련된 공중합체 중에 있어서의 상기 식 (a1), 식 (b1) 및 식 (c1) 로 나타내는 반복 단위의 비율의 조합은,
바람직하게는,
식 (a1) : 3 몰％ 내지 80 몰％, 식 (b1) : 3 몰％ 내지 80 몰％, 식 (c1) : 1 몰％ 내지 90 몰％,
보다 바람직하게는,
식 (a1) : 3.5 몰％ 내지 50 몰％, 식 (b1) : 5 몰％ 내지 70 몰％, 식 (c1) : 3 몰％ 내지 88 몰％,
더욱 바람직하게는,
식 (a1) : 4 몰％ 내지 40 몰％, 식 (b1) : 8 몰％ 내지 65 몰％, 식 (c1) : 5 몰％ 내지 87 몰％
이다.
또한 본 발명에 관련된 공중합체는, 임의의 제 4 성분이 공중합되어 있어도 된다. 예를 들어, 제 4 성분으로서 2 이상의 관능기를 갖는 (메트)아크릴레이트 화합물이 공중합되어 있고, 폴리머의 일부가 부분적으로 3 차원 가교되어 있어도 된다. 그러한 제 4 성분으로서 예를 들어, 하기 식 (D) 또는 (E) :
[화학식 13]
Figure pct00013
[식 중, Td, Te 및 Ue 는, 각각 독립적으로, 수소 원자 또는 탄소 원자수 1 내지 5 의 직사슬 혹은 분기 알킬기를 나타내고, Rd 및 Re 는, 각각 독립적으로, 할로겐 원자로 치환되어 있어도 되는 탄소 원자수 1 내지 10 의 직사슬 혹은 분기 알킬렌기를 나타내고 ; n 은, 1 내지 6 의 정수를 나타낸다] 로 나타내는 2 관능성 모노머를 들 수 있다. 즉 본 발명에 관련된 공중합체는, 바람직하게는, 이와 같은 2 관능성 모노머로부터 유도되는 가교 구조를 포함하는 것이다.
식 (D) 및 (E) 에 있어서, Td 및 Te 는, 바람직하게는, 각각 독립적으로, 수소 원자, 메틸기 또는 에틸기이고, 보다 바람직하게는, 각각 독립적으로, 수소 원자 또는 메틸기이다.
식 (E) 에 있어서, Ue 는, 바람직하게는, 수소 원자, 메틸기 또는 에틸기이고, 보다 바람직하게는, 수소 원자이다.
식 (D) 에 있어서, Rd 는, 바람직하게는, 할로겐 원자로 치환되어 있어도 되는 탄소 원자수 1 내지 3 의 직사슬 혹은 분기 알킬렌기이고, 보다 바람직하게는, 각각 독립적으로, 에틸렌기 혹은 프로필렌기이거나, 혹은 1 개의 염소 원자로 치환된 에틸렌기 혹은 프로필렌기이고, 특히 바람직하게는, 에틸렌기 혹은 프로필렌기이다. 또 식 (D) 에 있어서, n 은, 바람직하게는, 1 내지 5 의 정수를 나타내고, 특히 바람직하게는 1 이다.
식 (E) 에 있어서, Re 는, 바람직하게는, 할로겐 원자로 치환되어 있어도 되는 탄소 원자수 1 내지 3 의 직사슬 혹은 분기 알킬렌기이고, 보다 바람직하게는, 각각 독립적으로, 에틸렌기 혹은 프로필렌기이거나, 혹은 1 개의 염소 원자로 치환된 에틸렌기 혹은 프로필렌기이고, 특히 바람직하게는, 에틸렌기 혹은 프로필렌기이다. 또 식 (E) 에 있어서, n 은, 바람직하게는, 1 내지 5 의 정수를 나타내고, 특히 바람직하게는 1 이다.
식 (D) 로 나타내는 2 관능성 모노머는, 바람직하게는, 에틸렌글리콜디(메트)아크릴레이트, 트리에틸렌글리콜디(메트)아크릴레이트, 프로필렌글리콜디(메트)아크릴레이트, 또는 상기 식 (A-3) 유래의 2 관능성 모노머 등을 들 수 있다.
식 (E) 로 나타내는 2 관능성 모노머는, 바람직하게는, 인산비스(메타크릴로일옥시메틸), 인산비스[(2-메타크릴로일옥시)에틸], 인산비스[3-(메타크릴로일옥시)프로필], 또는 상기 식 (A-3) 유래의 2 관능성 모노머를 들 수 있다.
임의의 제 4 성분은, 3 관능성 모노머이어도 된다. 그러한 제 4 성분으로서의 3 관능성 모노머로는, 예를 들어, 트리아크릴산포스피닐리딘트리스(옥시-2,1-에탄디일) 을 들 수 있다.
이들 제 4 성분 중에서도, 특히, 에틸렌글리콜디메타크릴레이트, 상기 식 (A-3) 및 (A-4) 유래의 2 관능성 모노머 중, 에틸렌글리콜 및 프로필렌글리콜의 반복 단위를 갖는 디메타크릴레이트, 인산비스[2-(메타크릴로일옥시)에틸] 그리고 상기 식 (A-3) 및 (A-4) 유래의 2 관능성 모노머 중, 인산에스테르기를 개재하여 에틸렌글리콜 및 프로필렌글리콜의 반복 단위를 갖는 디메타크릴레이트가 바람직하고, 그 구조식은, 각각, 하기 식 (D-1) ∼ (D-3) 및 식 (E-1) ∼ (E-3) 으로 나타낸다.
[화학식 14]
Figure pct00014
공중합체에는, 이들 제 4 성분의 1 종 또는 2 종 이상이 포함되어 있어도 된다.
상기 공중합체 중에 있어서의 제 4 성분, 예를 들어, 상기 식 (D) 또는 (E) 로 나타내는 2 관능성 모노머로부터 유도되는 가교 구조의 비율은, 0 몰％ 내지 50 몰％ 이다.
식 (A) 로 나타내는 화합물의, 상기 공중합체를 형성하는 모노머 전체에 대한 비율은, 3 몰％ 내지 80 몰％ 이고, 바람직하게는 3.5 몰％ 내지 50 몰％ 이고, 더욱 바람직하게는 4 몰％ 내지 40 몰％ 이다. 또, 식 (A) 로 나타내는 화합물은, 2 종 이상이어도 된다.
식 (B) 로 나타내는 화합물의, 상기 공중합체를 형성하는 모노머 전체에 대한 비율은, 3 몰％ 내지 80 몰％ 이고, 바람직하게는 5 몰％ 내지 70 몰％ 이고, 더욱 바람직하게는 8 몰％ 내지 65 몰％ 이다. 또, 식 (B) 로 나타내는 화합물은, 2 종 이상이어도 된다.
식 (C) 로 나타내는 화합물의, 상기 공중합체를 형성하는 모노머 전체에 대한 비율은, 상기 식 (A) 및 (B) 의 비율을 뺀 잔부 모두이어도 되고, 상기 식 (A) 및 (B) 와 상기 제 4 성분의 합계 비율을 뺀 잔부이어도 되지만, 예를 들어 1 몰％ 내지 90 몰％ 이고, 바람직하게는 3 몰％ 내지 88 몰％ 이고, 더욱 바람직하게는 5 몰％ 내지 87 몰％ 이다. 또, 식 (C) 로 나타내는 화합물은, 2 종 이상이어도 된다.
본 발명에 관련된 공중합체는, 추가로 임의의 제 5 성분으로서, 에틸렌성 불포화 모노머, 또는 다당류 혹은 그 유도체가 공중합되어 있어도 된다. 에틸렌성 불포화 모노머의 예로는, (메트)아크릴산 및 그 에스테르 ; 아세트산비닐 ; 비닐피롤리돈 ; 에틸렌 ; 비닐알코올 ; 그리고 그들의 친수성의 관능성 유도체로 이루어지는 군에서 선택되는 1 종 또는 2 종 이상의 에틸렌성 불포화 모노머를 들 수 있다. 다당류 또는 그 유도체의 예로는, 하이드록시알킬셀룰로오스 (예를 들어, 하이드록시에틸셀룰로오스 또는 하이드록시프로필셀룰로오스) 등의 셀룰로오스계 고분자, 전분, 덱스트란, 커드란을 들 수 있다.
친수성의 관능성 유도체란, 친수성의 관능기 또는 구조를 갖는 에틸렌성 불포화 모노머를 가리킨다. 친수성의 관능성기 또는 구조의 예로는, 베타인 구조 ; 아미드 구조 ; 알킬렌글리콜 잔기 ; 아미노기 ; 그리고 술피닐기 등을 들 수 있다.
베타인 구조는, 제 4 급 암모늄형의 양이온 구조와, 산성의 음이온 구조의 양성 중심을 갖는 화합물의 1 가 또는 2 가의 기를 의미하고, 예를 들어, 포스포릴콜린기 :
[화학식 15]
Figure pct00015
를 들 수 있다. 그러한 구조를 갖는 에틸렌성 불포화 모노머의 예로는, 2-메타크릴로일옥시에틸포스포릴콜린 (MPC) 등을 들 수 있다.
아미드 구조는, 하기 식 :
[화학식 16]
Figure pct00016
[여기서, R16, R17 및 R18 은, 서로 독립적으로, 수소 원자 또는 유기기 (예를 들어, 메틸기, 하이드록시메틸기 또는 하이드록시에틸기 등) 이다]
으로 나타내는 기를 의미한다. 그러한 구조를 갖는 에틸렌성 불포화 모노머의 예로는, (메트)아크릴아미드, N-(하이드록시메틸)(메트)아크릴아미드 등을 들 수 있다. 또한 그러한 구조를 갖는 모노머 또는 폴리머는, 예를 들어, 일본 공개특허공보 2010-169604호 등에 개시되어 있다.
알킬렌글리콜 잔기는, 알킬렌글리콜 (HO-Alk-OH ; 여기서 Alk 는, 탄소 원자수 1 내지 10 의 알킬렌기이다) 의 편측 단말 또는 양 단말의 수산기가 다른 화합물과 축합 반응한 후에 남는 알킬렌옥시기 (-Alk-O-) 를 의미하고, 알킬렌옥시 단위가 반복되는 폴리(알킬렌옥시)기도 포함한다. 그러한 구조를 갖는 에틸렌성 불포화 모노머의 예로는, 2-하이드록시에틸(메트)아크릴레이트, 메톡시폴리에틸렌글리콜(메트)아크릴레이트 등을 들 수 있다. 또한 그러한 구조를 갖는 모노머 또는 폴리머는, 예를 들어, 일본 공개특허공보 2008-533489호 등에 개시되어 있다.
아미노기는, 식 : -NH2, -NHR19 또는 -NR20R21 [여기서, R19, R20 및 R21 은, 서로 독립적으로, 유기기 (예를 들어, 탄소 원자수 1 내지 5 의 직사슬 혹은 분기 알킬기 등) 이다] 로 나타내는 기를 의미한다. 본 발명에 있어서의 아미노기에는, 4 급화 또는 염화된 아미노기를 포함한다. 그러한 구조를 갖는 에틸렌성 불포화 모노머의 예로는, 디메틸아미노에틸(메트)아크릴레이트, 2-(t-부틸아미노)에틸(메트)아크릴레이트, 메타크릴로일콜린클로라이드 등을 들 수 있다.
술피닐기는, 하기 식 :
[화학식 17]
Figure pct00017
[여기서, R22 는, 유기기 (예를 들어, 탄소 원자수 1 내지 10 의 유기기, 바람직하게는, 1 개 이상의 하이드록시기를 갖는 탄소 원자수 1 내지 10 의 알킬기 등) 이다]
으로 나타내는 기를 의미한다. 그러한 구조를 갖는 폴리머로서, 일본 공개특허공보 2014-48278호 등에 개시된 공중합체를 들 수 있다.
<공중합체의 제조 방법>
본 발명에 관련된 공중합체는, 일반적인 아크릴 폴리머 또는 메타크릴 폴리머 등의 합성 방법인 라디칼 중합, 아니온 중합, 카티온 중합 등의 방법에 의해 합성할 수 있다. 그 형태는 용액 중합, 현탁 중합, 유화 중합, 괴상 중합 등 여러 가지 방법이 가능하다.
반응용 용매로는, 물, 인산 완충액 또는 에탄올 등의 알코올 또는 이들을 조합한 혼합 용매이어도 되지만, 물 또는 에탄올을 포함하는 것이 바람직하다. 나아가서는 물 또는 에탄올을 10 질량％ 이상 100 질량％ 이하 포함하는 것이 바람직하다. 나아가서는 물 또는 에탄올을 50 질량％ 이상 100 질량％ 이하 포함하는 것이 바람직하다. 나아가서는 물 또는 에탄올을 80 질량％ 이상 100 질량％ 이하 포함하는 것이 바람직하다. 나아가서는 물 또는 에탄올을 90 질량％ 이상 100 질량％ 이하 포함하는 것이 바람직하다. 바람직하게는 물과 에탄올의 합계가 100 질량％ 이다.
반응 농도로는, 예를 들어, 상기 식 (a) 로 나타내는 기를 포함하는 모노머와, 상기 식 (b) 로 나타내는 기를 포함하는 모노머와, 상기 식 (c) 로 나타내는 기를 포함하는 모노머의 반응 용매 중의 농도를, 0.01 질량％ 내지 4 질량％ 로 하는 것이 바람직하다. 농도가 4 질량％ 초과이면, 예를 들어 식 (a) 로 나타내는 인산기가 갖는 강한 회합성에 의해 공중합체가 반응 용매 중에서 겔화되어 버리는 경우가 있다. 농도 0.01 질량％ 미만에서는, 얻어진 바니시의 농도가 지나치게 낮기 때문에, 충분한 막두께의 코팅막을 얻기 위한 코팅막 형성용 조성물의 제조가 곤란하다. 농도가 0.01 질량％ 내지 3 질량％, 예를 들어 3 질량％ 또는 2 질량％ 인 것이 보다 바람직하다.
본 발명에 관련된 공중합체의 합성에 있어서는, 상기 식 (a) 로 나타내는 기를 포함하는 모노머와, 상기 식 (b) 로 나타내는 기를 포함하는 모노머를, 예를 들어 식 (1) 에 기재된 염으로 한 후, 상기 식 (c) 로 나타내는 기를 포함하는 모노머와 중합하여 공중합체를 제조해도 된다.
[화학식 18]
Figure pct00018
인산기 함유 모노머는 회합하기 쉬운 모노머이기 때문에, 반응계 중에 적하되었을 때, 신속하게 분산될 수 있도록 반응 용매 중에 소량씩 적하해도 된다. 또한 반응 용매는 모노머 및 폴리머의 용해성을 높이기 위해서 가온 (예를 들어 40 ℃ 내지 100 ℃) 해도 된다.
중합 반응을 효율적으로 진행시키기 위해서는, 중합 개시제를 사용하는 것이 바람직하다. 중합 개시제의 예로는, 2,2'-아조비스(이소부티로니트릴), 2,2'-아조비스(2-메틸부티로니트릴), 2,2'-아조비스(2,4-디메틸발레로니트릴) (와코우 순약 공업 (주) 제조 ; VA-065, 10 시간 반감기 온도 ; 51 ℃), 4,4'-아조비스(4-시아노발레르산), 2,2'-아조비스(4-메톡시-2,4-디메틸발레로니트릴), 1,1'-아조비스(시클로헥산-1-카르보니트릴), 1-[(1-시아노-1-메틸에틸)아조]포름아미드, 2,2'-아조비스[2-(2-이미다졸린-2-일)프로판], 2,2'-아조비스(2-메틸프로피온아미딘) 2 염산염, 2,2'-아조비스[2-메틸-N-(2-하이드록시에틸)프로피온아미드] (와코우 순약 공업 (주) 제조 : VA-086, 10 시간 반감기 온도 ; 86 ℃), 과산화벤조일 (BPO), 2,2'-아조비스[N-(2-카르복시에틸)-2-메틸프로피온아미딘]n-수화물 (와코우 순약 공업 (주) 제조 : VA-057, 10 시간 반감기 온도 ; 57 ℃), 4,4'-아조비스(4-시아노펜탄산) (와코우 순약 공업 (주) 제조 : V-501), 2,2'-아조비스[2-(2-이미다졸린-2-일)프로판] 2 염산염 (와코우 순약 공업 (주) 제조 : VA-044, 10 시간 반감기 온도 ; 44 ℃), 2,2'-아조비스[2-(2-이미다졸린-2-일)프로판] 2 황산염 2 수화물 (와코우 순약 공업 (주) 제조 : VA-046B, 10 시간 반감기 온도 ; 46 ℃), 2,2'-아조비스[2-(2-이미다졸린-2-일)프로판] (와코우 순약 공업 (주) 제조 : VA-061, 10 시간 반감기 온도 ; 61 ℃), 2,2'-아조비스(2-아미디노프로판) 2 염산염 (와코우 순약 공업 (주) 제조 : V-50, 10 시간 반감기 온도 ; 56 ℃), 퍼옥소 2 황산 또는 t-부틸하이드로퍼옥사이드 등이 사용되지만, 이 중에서도 이온 밸런스, 물에 대한 용해성을 고려하여 2,2'-아조비스[2-메틸-N-(2-하이드록시에틸)프로피온아미드], 2,2'-아조비스[N-(2-카르복시에틸)-2-메틸프로피온아미딘]n-수화물, 4,4'-아조비스(4-시아노펜탄산), 2,2'-아조비스[2-(2-이미다졸린-2-일)프로판] 2 염산염, 2,2'-아조비스[2-(2-이미다졸린-2-일)프로판] 2 황산염 2 수화물, 2,2'-아조비스[2-(2-이미다졸린-2-일)프로판], 2,2'-아조비스(2-아미디노프로판) 2 염산염 또는 퍼옥소 2 황산 중 어느 것을 사용하는 것이 바람직하다.
중합 개시제의 첨가량으로는, 중합에 사용되는 모노머의 합계 중량에 대하여, 0.05 질량％ ∼ 10 질량％ 이다.
반응 조건은 반응 용기를 오일 배스 등으로 50 ℃ 내지 200 ℃ 로 가열하고, 1 시간 내지 48 시간, 보다 바람직하게는 80 ℃ 내지 150 ℃, 5 시간 내지 30 시간 교반을 실시함으로써, 중합 반응이 진행되어 본 발명에 관련된 공중합체가 얻어진다. 반응 분위기는 질소 분위기가 바람직하다. 반응 순서로는, 전체 반응 물질을 실온의 반응 용매에 모두 넣고 나서, 상기 온도로 가열하여 중합시켜도 되고, 미리 가온한 용매 중에, 반응 물질의 혼합물의 전부 또는 일부를 조금씩 적하해도 된다.
예를 들어, 후자의 반응 순서로는, 상기 식 (A), (B) 및 (C) 로 나타내는 화합물, 용매 및 중합 개시제를 포함하는 혼합물을, 그 중합 개시제의 10 시간 반감기 온도보다 높은 온도로 유지한 용매 중에 적하하여, 반응 (중합) 시킨다. 이러한 반응 순서와 온도 조건을 채용함으로써, 상기 식 (A), 식 (B) 또는 식 (C) 로 나타내는 화합물의 반응 용매 중의 농도를, 예를 들어, 0.01 질량％ 내지 10 질량％ 로 할 수 있다. 이 경우, 농도가 4 질량％ 를 초과해도, 반응 전에 적하상 및 반응상이 투명 균일한 용액이 되어, 반응 후의 공중합체의 반응 용매 중에서의 겔화를 억제할 수 있다.
본 발명에 관련된 공중합체의 분자량은, 수천 내지 수백만 정도이면 되고, 바람직하게는 5,000 내지 5,000,000 이다. 더욱 바람직하게는, 10,000 내지 2,000,000 이다. 또, 랜덤 공중합체, 블록 공중합체, 그래프트 공중합체 중 어느 것이어도 되고, 그 공중합체를 제조하기 위한 공중합 반응 그 자체에는 특별한 제한은 없고, 라디칼 중합이나 이온 중합이나 광 중합, 유화 중합을 이용한 중합 등의 공지된 용액 중에서 합성되는 방법을 사용할 수 있다. 이들은 목적으로 하는 용도에 의해, 본 발명의 공중합체 중 어느 것을 단독 사용할 수도 있고, 복수의 공중합체를 혼합하고, 또한 그 비율은 바꾸어 사용할 수도 있다.
이와 같이 하여 제조되는 여러 가지 공중합체는, 2 차원 폴리머이어도 되고 3 차원 폴리머이어도 되고, 물을 함유하는 용액에 분산된 상태이다. 요컨대, 이들 폴리머를 포함하는 바니시에서는, 불균일한 겔화나 백탁 침전이 생기는 것은 바람직하지 않고, 투명한 바니시, 분산 콜로이드상의 바니시, 또는 졸인 것이 바람직하다.
본 발명의 세포 배양 용기는, 상기 공중합체가, 용기의 표면의 적어도 일부에 코팅되어 있는 것을 특징으로 하고, 세포 및 배양액과 접촉할 수 있는 용기의 내부 표면에 코팅되어 있는 것이 바람직하고, 용기의 표면 전체에 코팅되어 있는 것이 보다 바람직하다. 세포 배양 용기에의 상기 공중합체의 코팅은, 공지된 수단에 의해, 구체적으로는, 후술하는 항목 ≪세포 배양 용기의 제조 방법≫ 및 실시예에서 서술하는 수단에 의해 형성할 수 있다. 본 발명의 세포 배양 용기의 코팅의 두께는, 용기의 형상이나 목적에 따라 적절히 선택되지만, 10 ∼ 1000 Å 이 바람직하고, 10 ∼ 500 Å 이 보다 바람직하고, 10 ∼ 300 Å 이 특히 바람직하다. 본 발명의 세포 배양 용기는, 그러한 코팅에 의해, 세포나 단백질에 대한 우수한 부착 억제능을 갖는다.
≪세포 배양 용기의 제조 방법≫
본 발명의 제 2 양태는, 하기 식 (a) 로 나타내는 기를 포함하는 반복 단위와, 하기 식 (b) 로 나타내는 기를 포함하는 반복 단위와, 하기 식 (c) 로 나타내는 기를 포함하는 반복 단위를 포함하는 공중합체 :
[화학식 19]
Figure pct00019
(식 중, Ua1, Ua2, Ub1, Ub2 및 Ub3, Rc 그리고 An- 는 상기와 동일한 의미이다) 를, 용기의 표면의 적어도 일부에 코팅하는 공정을 포함하는, 세포 배양 용기의 제조 방법이다.
<코팅 공정>
본 발명의 세포 배양 용기의 제조 방법의 코팅 공정에서는, 공중합체를, 용기의 표면의 적어도 일부에 코팅한다. 예를 들어, 용기가 환저 (丸底) 의 멀티 웰 플레이트인 경우, 웰의 오목부 부분만을 코팅해도 되지만, 플레이트 전체를 코팅해도 된다. 여기서, 용기 및 공중합체는, 각각 전술한 항목 <용기> 및 <공중합체> 에서 서술한 바와 같다.
코팅 공정은, 특별히 한정은 없고, 용기와 공중합체를 접촉시킬 수 있는, 당업자에게 공지된 어느 코팅 수단 (예를 들어, 도포, 침지 등) 에 의해 실시하면 된다. 예를 들어, 공중합체를 포함하는 바니시를 용기에 도포함으로써, 혹은 공중합체를 포함하는 바니시에 용기를 침지시킴으로써 실시할 수 있다. 바람직하게는, 공중합체를 포함하는 바니시에 용기를 침지시킴으로써 실시한다.
공중합체를 포함하는 바니시는, 전술한 항목 <공중합체의 제조 방법> 에서 얻어진 공중합체를, 적절한 용매에 원하는 농도로 용해시킴으로써 조제해도 되고, 혹은 이러한 제조 방법으로 얻어진 공중합체를 포함하는 반응 용액을, 그대로 또는 원하는 고형분 농도로 희석시킨 후, 바니시로서 사용해도 된다. 바니시에 포함되는 용매로는, 물, 인산 완충액 (PBS), 알코올을 들 수 있다. 알코올로는, 탄소수 2 내지 6 의 알코올, 예를 들어, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 1-부탄올, 2-부탄올, 이소부탄올, t-부탄올, 1-펜탄올, 2-펜탄올, 3-펜탄올, 1-헵탄올, 2-헵탄올, 2,2-디메틸-1-프로판올(=네오펜틸알코올), 2-메틸-1-프로판올, 2-메틸-1-부탄올, 2-메틸-2-부탄올(=t-아밀알코올), 3-메틸-1-부탄올, 3-메틸-3-펜탄올, 시클로펜탄올, 1-헥산올, 2-헥산올, 3-헥산올, 2,3-디메틸-2-부탄올, 3,3-디메틸-1-부탄올, 3,3-디메틸-2-부탄올, 2-에틸-1-부탄올, 2-메틸-1-펜탄올, 2-메틸-2-펜탄올, 2-메틸-3-펜탄올, 3-메틸-1-펜탄올, 3-메틸-2-펜탄올, 3-메틸-3-펜탄올, 4-메틸-1-펜탄올, 4-메틸-2-펜탄올, 4-메틸-3-펜탄올 및 시클로헥산올을 들 수 있고, 단독 또는 그들의 조합의 혼합 용매를 사용해도 되지만, 물, PBS 및 에탄올에서 선택되는 것이 바람직하다. 공중합체의 용해를 위해, 물을 반드시 포함한다.
바니시 중의 공중합체의 농도로는, 0.01 내지 4 질량％, 더욱 바람직하게는 0.01 내지 3 질량％, 더욱 바람직하게는 0.01 내지 2 질량％, 더욱 바람직하게는 0.01 내지 1 질량％ 이다. 공중합체의 농도가 0.01 질량％ 미만이면, 충분한 막두께의 코팅을 형성할 수 없고, 4 질량％ 초과이면, 바니시의 보존 안정성이 나빠져, 용해물의 석출이나 겔화가 일어날 가능성이 있다.
또한 바니시에는, 상기 공중합체와 용매 외에, 필요에 따라 얻어지는 코팅의 성능을 저해시키지 않는 범위에서 다른 물질을 첨가할 수도 있다. 다른 물질로는, 방부제, 계면 활성제, 기재 (용기) 와의 밀착성을 높이는 프라이머, 곰팡이 방지제 및 당류 등을 들 수 있다.
바니시 중의 공중합체의 이온 밸런스를 조절하기 위해, 공중합체를 포함하는 바니시는, 미리 pH 조정되어 있어도 된다. pH 조정은, 예를 들어, 공중합체를 포함하는 바니시에 pH 조정제를 첨가하여, 바니시의 pH 를 3.5 ∼ 8.5, 바람직하게는 4.0 ∼ 8.0 으로 함으로써 실시해도 된다. 사용할 수 있는 pH 조정제의 종류 및 그 양은, 바니시 중의 공중합체의 농도나, 공중합체의 아니온과 카티온의 존재비 등에 따라 적절히 선택된다. pH 조정제의 예로는, 암모니아, 디에탄올아민, 피리딘, N-메틸-D-글루카민, 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄 등의 유기 아민 ; 수산화칼륨, 수산화나트륨 등의 알칼리 금속 수산화물 ; 염화칼륨, 염화나트륨 등의 알칼리 금속 할로겐화물 ; 황산, 인산, 염산, 탄산 등의 무기산 또는 그 알칼리 금속염 ; 콜린 등의 4 급 암모늄 카티온 ; 혹은 이들의 혼합물 (예를 들어, 인산 완충 생리 식염수 등의 완충액) 을 들 수 있다. 이들 중에서도, 암모니아, 디에탄올아민, N-메틸-D-글루카민, 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄, 수산화나트륨 및 콜린이 바람직하고, 특히 암모니아, 디에탄올아민, 수산화나트륨 및 콜린이 바람직하다.
그러한 공중합체를 포함하는 바니시를, 용기에 접촉시켜, 그 표면의 적어도 일부에 코팅을 형성한다. 코팅은, 용기의 표면 전체에 걸쳐서 형성되는 것이 바람직하다.
또한, 코팅 공정 전에, 용기의 표면을, 공지된 UV/오존 처리에 제공하여 세정해도 된다. 이러한 세정 공정은, 시판되는 UV/오존 클리너 등을 사용하여 실시할 수 있다.
<건조·세정·멸균 공정>
코팅 공정 후, 바람직하게는 코팅된 용기를 -200 ℃ 내지 200 ℃ 의 온도로 건조시킨다. 건조에 의해, 상기 코팅막 형성용 조성물 중의 용매를 제거함과 함께, 본 발명에 관련된 공중합체의 식 (a) 및 식 (b) 끼리가 이온 결합을 형성하여 기체에 완전히 고착된다. 본 발명의 세포 배양 용기의 코팅의 막두께는, 10 ∼ 1000 Å 이 바람직하고, 10 ∼ 500 Å 이 보다 바람직하고, 10 ∼ 300 Å 이 특히 바람직하다. 본 발명자들은, 본 발명의 세포 배양 용기의 제조 방법에서는, 고온에서의 처리를 필요로 하지 않고, 저온에서의 처리에 의해, 원하는 특성을 갖는 코팅이 용기의 표면에 형성되고, 또한 수십 내지 수백 Å 정도의 얇은 막두께에도 불구하고, 내구성이 우수함과 함께, 세포나 단백질에 대한 우수한 부착 억제능을 갖는 것을 알아내었다.
건조는, 예를 들어, 실온 (10 ℃ 내지 35 ℃, 예를 들어 25 ℃) 에서 실시할 수 있지만, 보다 신속하게 코팅막을 형성시키기 위해, 예를 들어 40 ℃ 내지 50 ℃ 에서 실시해도 된다. 또 프리즈 드라이법에 의한 극저온 ∼ 저온 (-200 ℃ 내지 -30 ℃ 전후) 에서 실시해도 된다. 프리즈 드라이는 진공 동결 건조라고 불리며, 통상 건조시키고자 하는 것을 냉매로 냉각시키고, 진공 상태에서 용매를 승화에 의해 제거하는 방법이다. 프리즈 드라이에서 사용되는 일반적인 냉매는, 드라이아이스와 메탄올을 혼합 매체 (-78 ℃), 액체 질소 (-196 ℃) 등을 들 수 있다. 보다 바람직한 건조 온도는 10 ℃ 내지 180 ℃, 더욱 바람직한 건조 온도는 25 ℃ 내지 150 ℃ 이다.
또한, 건조 공정의 전 및/또는 후에, 코팅된 용기의 표면을, 에탄올 등의 탄소 원자수 1 내지 5 의 알코올 및/또는 물로 세정해도 된다. 이러한 세정 공정은, 0 ℃ 내지 60 ℃, 바람직하게는 25 ℃ (실온) 내지 40 ℃ 의 온도에서, 30 분 내지 48 시간, 바람직하게는 1 내지 24 시간 실시할 수 있다.
또한 건조 공정 후, 그 코팅에 잔존하는 불순물, 미반응 모노머 등을 제거하기 위해, 나아가서는 막 중의 공중합체의 이온 밸런스를 조절하기 위해, 물 및 전해질을 포함하는 수용액으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 용매를 사용하여, 유수 세정 또는 초음파 세정 등으로 세정해도 된다. 여기서 물 또는 전해질을 포함하는 수용액은 예를 들어 40 ℃ 내지 95 ℃ 의 범위에서 가온된 것이어도 된다. 전해질을 포함하는 수용액은, PBS 및 생리 식염수 (염화나트륨만 포함하는 것), 둘베코 인산 완충 생리 식염수, 트리스 완충 생리 식염수, HEPES 완충 생리 식염수 및 베로날 완충 생리 식염수가 바람직하고, PBS 가 특히 바람직하다.
알코올, 물 및 PBS 등으로 세정해도, 용기의 표면에 형성된 코팅은, 용출되지 않고 기재 (즉, 용기) 에 강고하게 고착된 채로 있다. 형성된 코팅은, 세포나 단백질을 포함하는 여러 가지 생체 물질의 부착 억제능을 갖는다. 따라서, 본 발명의 세포 배양 용기는, 세포나 단백질의 부착 억제에 더하여, 용매에 대한 내구성도 우수한 것이다.
필요에 따라, 코팅된 용기를 멸균하기 위해, 방사선, 전자선, 에틸렌옥사이드, 오토클레이브 등의 공지된 멸균 처리를 실시해도 된다.
≪세포 응집괴의 제조 방법≫
본 발명의 제 3 양태는, 본 발명의 세포 배양 용기 및 본 발명의 제조 방법에 의해 얻어진 세포 배양 용기 (이하, 양자를 합하여 「본 발명의 세포 배양 용기」 라고 한다) 를 사용하는 것을 특징으로 하는, 세포 응집괴의 제조 방법이다. 본 발명의 세포 배양 용기를 사용하면, 세포 응집괴의 용기의 표면에의 부착이 억제되고, 또한 코팅의 배양액으로의 용출이 억제되므로, 용기로부터의 자극이 없는 상태에서 세포 응집괴를 배양할 수 있다. 세포 응집괴는, 바람직하게는, 본 발명의 세포 배양 용기 중에서 세포 또는 조직을 부유시키는 효과를 갖는 다당류 (특히, 탈아실화 젤란검) 를 포함하는 것을 특징으로 하는 배지를 사용하여 배양된다. 그러한 배지의 구체적인 조성이나, 배양 방법은, 예를 들어, 국제 공개 제2014/017513호에 개시되어 있다.
실시예
이하에, 본 발명의 배양 용기 및 그 제조 방법에 관한 합성예, 실시예 및 시험예를 나타내지만, 이들은 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기 위해서 나타내는 것으로서, 본 발명은 이들에 한정되는 것은 아니다.
<원료 조성의 측정 방법>
인 함유 화합물을 포함하는 원료의, 각 인 함유 화합물의 농도 (질량％) 측정은, 31P-NMR 에 의해 실시하였다. 하기 표준 물질을 사용하여 원료 중에 포함되는 각 인 함유 화합물의 절대 농도 (절대 질량％) 를 산출하였다.
(측정 조건)
·모드 : 역게이트 디커플링 모드 (정량 모드)
·장치 : varian 400 ㎒
·용매 : CD3OD (중메탄올) (30 중량％)
·회전수 : 0 ㎐
·데이터 포인트 : 64000
·플립각 : 90°
·대기 시간 : 70 s
·적산 횟수 : 16 회, n = 4,
·표준 물질 : 트리메틸인산 + D2O (75 ％ TMP 용액을 조제)
<합성예 1>
애시드포스포옥시에틸메타크릴레이트 (제품명 ; 포스머 M, 유니 케미컬 (주) 제조, 건고법 100 ℃·1 시간에 있어서의 불휘발분 : 91.8 ％, 애시드포스포옥시에틸메타크릴레이트 (44.2 질량％), 인산비스[2-(메타크릴로일옥시)에틸] (28.6 질량％), 그 밖의 물질 (27.2 질량％) 의 혼합물) 7.00 g 에 순수 16.05 g 을 첨가하고충분히 용해시켰다. 이어서, 에탄올 48.16 g, 메타크릴산2-(디에틸아미노)에틸 9.41 g (도쿄 화성 공업 (주) 제조), 메타크릴산부틸 1.34 g (도쿄 화성 공업 (주) 제조), 2,2'-아조비스(N-(2-카르복시에틸)-2-메틸프로피온아미딘) n-수화물 (VA-057, 와코우 순약 공업 (주) 제조) 0.09 g 을, 20 ℃ 이하로 유지하면서, 포스머 M 의 수용액에 순서대로 첨가하였다. 충분히 교반하여 균일해진 상기 모든 것이 들어간 혼합액을, 적하 깔때기에 도입하였다. 한편, 별도로 순수 96.31 g 을 냉각관이 부착된 3 구 플라스크에 첨가하여 질소 플로우하고, 교반하면서 리플럭스 온도까지 승온시켰다. 이 상태를 유지하면서, 상기 혼합액을 도입한 적하 깔때기를 3 구 플라스크에 세트하고, 2 시간에 걸쳐 혼합액을 순수와 에탄올의 비등액 내에 적하하였다. 적하 후, 24 시간 상기 환경을 유지한 상태에서 가열 교반함으로써 고형분 약 10 질량％ 의 공중합체 함유 바니시 178.35 g 을 얻었다.
<비교 합성예 1>
애시드포스포옥시에틸메타크릴레이트 (제품명 ; 포스머 M, 유니 케미컬 (주) 제조, 건고법 100 ℃·1 시간에 있어서의 불휘발분 : 91.8 ％, 애시드포스포옥시에틸메타크릴레이트 (44.2 질량％), 인산비스[2-(메타크릴로일옥시)에틸] (28.6 질량％), 그 밖의 물질 (27.2 질량％) 의 혼합물) 28.00 g 을 60 ℃ 로 유지하면서 교반하고, 메타크릴산2-(디메틸아미노)에틸 21.37 g 을 적하하였다. 거기에 순수 133.96 g, 이어서, 에탄올 44.65 g, (도쿄 화성 공업 (주) 제조), 2,2'-아조비스(N-(2-카르복시에틸)-2-메틸프로피온아미딘) n-수화물 (VA-057, 와코우 순약 공업 (주) 제조) 0.25 g 을, 20 ℃ 이하로 유지하면서 순서대로 첨가하였다. 충분히 교반하여 균일해진 상기 모든 것이 들어간 혼합액을, 적하 깔때기에 도입하였다. 한편, 별도로 순수 267.93 g 을 냉각관이 부착된 3 구 플라스크에 넣고, 이것을 질소 플로우하고, 교반하면서 리플럭스 온도까지 승온시켰다. 이 상태를 유지하면서, 상기 혼합액을 도입한 적하 깔때기를 3 구 플라스크에 세트하고, 2 시간에 걸쳐 혼합액을 순수와 에탄올의 비등액 내에 적하하였다. 적하 후, 24 시간 상기 환경을 유지한 상태에서 가열 교반함으로써 고형분 약 9.70 질량％ 의 공중합체 함유 바니시 496.16 g 을 얻었다. 얻어진 투명 액체의 GFC 에 있어서의 중량 평균 분자량은 약 280,000 이었다.
<조제예 1>
(실리콘 웨이퍼의 준비)
반도체 평가용의 시판되는 실리콘 웨이퍼를 그대로 사용하였다.
(QCM 센서 (PS) 의 제조)
Au 증착된 수정 진동자 (Q-Sense, QSX304) 를, UV/오존 세정 장치 (UV253E, 필젠 주식회사 제조) 를 사용하여 10 분간 세정하고, 직후에 2-아미노에탄티올 (도쿄 화성 공업 (주) 제조) 0.0772 g 을 에탄올 1000 ㎖ 에 용해시킨 용액 중에 24 시간 침지시켰다. 에탄올로 센서 표면을 세정 후 자연 건조시키고, 폴리스티렌 (PS) (Aldrich 사 제조) 1.00 g 을 톨루엔 99.00 g 에 용해시킨 바니시를 스핀 코터로 3500 rpm/30 sec 로 막 센서측에 스핀 코트하고, 120 ℃／1 min 건조시킴으로써 QCM 센서 (PS) 로 하였다.
(코팅의 조제)
상기 합성예 1 에서 얻어진 공중합체 함유 바니시 5.00 g 에, 순수 31.5 g, 에탄올 1.35 g, 1 ㏖/ℓ 수산화나트륨 수용액 (1 N) (칸토 화학 (주) 사 제조) 0.24 g 을 첨가하고 충분히 교반하여, 코팅막 형성 조성물을 조제하였다. pH 는 7.3 이었다. 얻어진 코팅막 형성 조성물 중에, 상기 실리콘 웨이퍼를 딥하고, 오븐으로 45 ℃, 24 시간 건조시켰다. 그 후, 코팅막 상에 부착되어 있는 미경화의 막 형성용 조성물을 PBS 와 순수로 충분히 세정을 실시하여, 코팅막이 형성된 실리콘 웨이퍼를 얻었다. 상기 실리콘 웨이퍼를 사용하여 광학식 간섭 막후계로 코팅막의 막두께를 확인한 결과 90 Å 이었다.
또, 상기 코팅막 형성용 조성물을 3500 rpm/30 sec 로 QCM 센서 (PS) 에 스핀 코트하고, 건조 공정으로서 45 ℃ 의 오븐에서 24 시간 베이크하였다. 그 후, 세정 공정으로서 과잉으로 붙은 미경화의 코팅막 형성용 조성물을 PBS 와 초순수로 각 2 회씩 세정하여, 표면 처리가 끝난 QCM 센서 (PS) 를 얻었다.
<조제예 2>
상기 QCM 센서 (PS) 를 그대로 사용하였다.
<조제예 3>
상기 비교 합성예 1 에서 얻어진 공중합체 함유 바니시 45.00 g 에, 순수 265.92 g, 에탄올 125.58 g, 1 ㏖/ℓ 수산화나트륨 수용액 (1 N) (칸토 화학 (주) 사 제조) 8.18 g 을 첨가하고 충분히 교반하여, 코팅막 형성용 조성물을 조제하였다. 실시예와 동일한 방법으로, 코팅막이 형성된 실리콘 웨이퍼, 또는 표면 처리가 끝난 QCM 센서 (PS) 를 얻었다. 상기 실리콘 웨이퍼를 사용하여 광학식 간섭 막후계로 코팅막의 막두께를 확인한 결과 44 Å 이었다.
<시험예 1 : 단백질 부착 억제 효과>
조제예 1 ∼ 3 에서 얻은 표면 처리가 끝난 QCM 센서 (PS) 를 산일형 (散逸型) 수정 진동자 마이크로 밸런스 QCM-D (E4, Q-Sense) 에 장착하고, 주파수의 변화가 1 시간에 1 ㎐ 이하가 되는 안정적인 베이스라인을 확립할 때까지 PBS 를 흘렸다. 다음으로, 안정적인 베이스라인의 주파수를 0 ㎐ 로 하여 약 10 분간 PBS 를 흘렸다. 계속해서, 41010 - Basal Medium Eagle (BME), no Glutamine (서모 피셔 사이언티픽 주식회사 제조) 에 15 wt％ 의 소 혈청 (FBS), L-Glutamine, 항생 물질로서 페니실린과 스트렙토마이신을 첨가한 용액을 약 30 분 흘리고, 그 후 다시 PBS 를 약 20 분 흘린 후의 11 차 오버톤의 흡착 야기 주파수의 시프트 (Δf) 를 판독하였다. 분석을 위해 Q-Tools (Q-Sense) 를 사용하여, 흡착 야기 주파수의 시프트 (Δf) 를, Sauerbrey 식으로 설명되는 흡착 야기 주파수의 시프트 (Δf) 를 단위 면적당의 질량 (ng/㎠) 으로 환산한 것을 생체 물질의 부착량으로 하여 하기의 표 1 에 나타낸다. 본 발명에 관련된 합성예 1 의 공중합체를 코팅으로서 사용한 조제예 1 은, 코팅 없음의 조제예 2 및 비교 합성예 1 의 공중합체를 코팅으로서 사용한 조제예 3 과 비교하여, 1 자릿수 낮은 각종 단백질 흡착량을 나타냈다.
Figure pct00020
<실시예 1>
이하의 각 처리 공정을 차례로 실시하여, 본 발명에 있어서의 세포 배양 용기를 조제하였다.
처리 1 : 합성예 1 에서 조제한 공중합체 함유 바니시를, 메시 사이즈가 0.22 ㎛ 인 필터를 사용하여 여과한 후, 96 구멍 세포 배양 플레이트 (BD 바이오 사이언스사 제조, #351172) 의 웰에 200 ㎕ (고형분 1 질량％)/웰이 되도록 첨가하고, 실온에서 1 시간 가만히 정지시킨 후, 과잉된 바니시를 제거하였다.
처리 2 : 오븐 (어드밴텍 토요 주식회사 제조, 건조기 FC-612) 을 사용하여 50 ℃ 에서 하룻밤 건조시켰다. 그 후, 멸균수를 1 웰당 200 ㎕ 첨가 후, 제거하여 세정을 실시하였다. 동일하게, 추가로 2 회 세정을 실시하여, 코팅된 세포 배양 용기를 얻었다.
<비교예 1>
실시예 1 에서 사용한, 합성예 1 에서 조제한 공중합체 함유 바니시를, 비교 합성예 1 에서 조제한 공중합체 함유 바니시로 대신한 것 이외에는, 실시예 1 과 동일하게 하여, 코팅된 세포 배양 용기를 얻었다.
<시험예 2 : 세포 부착 억제 효과>
(코팅 플레이트의 조제)
실시예 1 및 비교예 1 에서 얻어진 코팅된 세포 배양 용기를 사용하였다. 양성 대조의 샘플로는, 시판되는 세포 저접착 플레이트 (코닝사 제조, #3474) 를 사용하였다. 음성 대조로는, 코팅을 실시하지 않은 96 구멍 세포 배양 플레이트 (BD 바이오 사이언스사 제조, #351172) 를 사용하였다.
(세포의 조제)
세포는, 마우스배 선유아 세포 C3H10T1/2 (DS 파마 바이오메디컬사 제조) 를 사용하였다. 세포의 배양에 사용한 배지는, 10 ％ FBS (HyClone 사 제조) 와 L-글루타민-페니실린-스트렙토마이신 안정화 용액 (Sigma-Aldrich 사 제조) 을 포함하는 BME 배지 (서모 피셔 사이언티픽사 제조) 를 사용하였다. 세포는, 37 ℃／CO2 인큐베이터 내에서 5 ％ 이산화탄소 농도를 유지한 상태에서, 직경 10 ㎝ 의 샬레 (배지 10 ㎖) 를 사용하여 2 일간 이상 정치 배양하였다. 계속해서, 본 세포를 PBS 5 ㎖ 로 세정한 후, 트립신-EDTA 용액 (인비트로젠사 제조) 1 ㎖ 를 첨가하고 세포를 벗겨, 상기의 배지 10 ㎖ 에서 각각 현탁하였다. 본 현탁액을 원심분리 (주식회사 토미 정공 제조, 형번 LC-200, 1000 rpm/3 분, 실온) 후, 상청을 제거하고, 상기의 배지를 첨가하여 세포 현탁액을 조제하였다.
(세포 부착 실험)
상기에서 조제한 플레이트에 대해, 각각의 세포 현탁액을 2 × 103 cells/well 이 되도록 각 100 ㎕ 첨가하였다. 그 후, 5 ％ 이산화탄소 농도를 유지한 상태에서, 37 ℃ 에서 4 일간 CO2 인큐베이터 내에서 가만히 정지시켰다.
(세포 부착의 관찰)
배양 4 일간 후, 실시예 1 의 플레이트, 비교예 1 의 플레이트, 양성 대조, 및 음성 대조의 플레이트에 대한 세포의 부착을 도립형 현미경 (올림푸스사 제조, CKX31) 에 의한 관찰 (배율 : 4 배) 에 기초하여 비교하였다. 실시예 1 의 플레이트, 비교예 1 의 플레이트, 및 양성 대조의 플레이트에서, 세포의 부착은 거의 볼 수 없었다. 각 플레이트의 결과 (배양 4 일간 후) 를 도 1 에 나타낸다. 또, Cell Counting Kit-8 용액 (도진 화학 연구소 제조) 을 1 웰당 10 ㎕ 첨가하고, 37 ℃ 에서 2 시간 CO2 인큐베이터 내에서 가만히 정지시켰다. 그 후, 흡광도계 (MolecularDevices 사 제조, SpectraMax) 로 450 ㎚ 의 흡광도를 측정하였다. 각 측정값은, 각각 배지만을 첨가한 웰에서의 측정값을 빼었다. 그 결과를 표 2 에 나타낸다.
Figure pct00021
상기와 같이, 음성 대조 이외에는 어느 플레이트에서도 세포가 부착되지 않는 것이 나타났다. 이 때, 부착되지 않았던 세포는 세포 응집괴 (스페로이드) 를 형성하고 있었다.
산업상 이용가능성
본 발명의 세포 배양 용기는, 특정한 기를 포함하는 공중합체로 표면의 적어도 일부가 코팅되어 있다. 이러한 코팅은, 세포나 단백질의 용기 표면에의 부착을 억제함과 함께, 코팅이 용기 표면에 강고하게 고착될 수 있으므로, 코팅의 배양액으로의 용출의 억제가 개선되고 있다. 따라서, 본 발명의 세포 배양 용기는, 용기로부터의 자극이 없는 상태에서 세포 응집괴를 배양할 수 있는 점에서 유리하다.

Claims (13)

  1. 하기 식 (a) 로 나타내는 기를 포함하는 반복 단위와, 하기 식 (b) 로 나타내는 기를 포함하는 반복 단위와, 하기 식 (c) 로 나타내는 기를 포함하는 반복 단위를 포함하는 공중합체 :
    [화학식 1]
    Figure pct00022

    [식 중,
    Ua1, Ua2, Ub1, Ub2 및 Ub3 은, 각각 독립적으로, 수소 원자 또는 탄소 원자수 1 내지 5 의 직사슬 혹은 분기 알킬기를 나타내고 ;
    Rc 는, 탄소 원자수 1 내지 18 의 직사슬 혹은 분기 알킬기, 탄소 원자수 3 내지 10 의 지환식 탄화수소기, 탄소 원자수 6 내지 10 의 아릴기, 탄소 원자수 7 내지 15 의 아르알킬기 또는 탄소 원자수 7 내지 15 의 아릴옥시알킬기 (여기서, 상기 아릴 부분은, 할로겐 원자로 치환되어 있어도 되는 탄소 원자수 1 내지 5 의 직사슬 혹은 분기 알킬기로 치환되어 있어도 된다) 를 나타내고 ;
    An- 는, 할로겐화물 이온, 무기산 이온, 수산화물 이온 및 이소티오시아네이트 이온으로 이루어지는 군에서 선택되는 음이온을 나타낸다]
    가 표면에 코팅되어 있는 것을 특징으로 하는, 세포 배양 용기.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 식 (a), (b) 및 (c) 로 나타내는 기를 포함하는 반복 단위가, 각각, 하기 식 (A), (B) 및 (C) :
    [화학식 2]
    Figure pct00023

    [식 중,
    Ta, Tb, Tc, Ua1, Ua2, Ub1, Ub2 및 Ub3 은, 각각 독립적으로, 수소 원자 또는 탄소 원자수 1 내지 5 의 직사슬 혹은 분기 알킬기를 나타내고 ;
    Qa 및 Qb 는, 각각 독립적으로, 단결합, 에스테르 결합 또는 아미드 결합을 나타내고, Qc 는, 단결합, 에테르 결합 또는 에스테르 결합을 나타내고 ;
    Ra 및 Rb 는, 각각 독립적으로, 할로겐 원자로 치환되어 있어도 되는 탄소 원자수 1 내지 10 의 직사슬 또는 분기 알킬렌기를 나타내고, Rc 는, 탄소 원자수 1 내지 18 의 직사슬 혹은 분기 알킬기, 탄소 원자수 3 내지 10 의 지환식 탄화수소기, 탄소 원자수 6 내지 10 의 아릴기, 탄소 원자수 7 내지 15 의 아르알킬기 또는 탄소 원자수 7 내지 15 의 아릴옥시알킬기 (여기서, 상기 아릴 부분은, 할로겐 원자로 치환되어 있어도 되는 탄소 원자수 1 내지 5 의 직사슬 혹은 분기 알킬기로 치환되어 있어도 된다) 를 나타내고 ; An- 는, 할로겐화물 이온, 무기산 이온, 수산화물 이온 및 이소티오시아네이트 이온으로 이루어지는 군에서 선택되는 음이온을 나타내고 ;
    m 은, 0 내지 6 의 정수를 나타낸다]
    로 나타내는 모노머로부터 유도되는 반복 단위인, 세포 배양 용기.
  3. 제 2 항에 있어서,
    m 이 1 이고, Ra 및 Rb 가, 각각 독립적으로, 에틸렌기 또는 프로필렌기를 나타내는, 세포 배양 용기.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 공중합체가, 추가로 하기 식 (D) 또는 (E) :
    [화학식 3]
    Figure pct00024

    [식 중,
    Td, Te 및 Ue 는, 각각 독립적으로, 수소 원자 또는 탄소 원자수 1 내지 5 의 직사슬 혹은 분기 알킬기를 나타내고 ;
    Rd 및 Re 는, 각각 독립적으로, 할로겐 원자로 치환되어 있어도 되는 탄소 원자수 1 내지 10 의 직사슬 또는 분기 알킬렌기를 나타내고 ;
    n 은, 1 내지 6 의 정수를 나타낸다]
    로 나타내는 모노머로부터 유도되는 가교 구조를 포함하는, 세포 배양 용기.
  5. 제 4 항에 있어서,
    Td 및 Te 가, 각각 독립적으로, 수소 원자 또는 메틸기를 나타내고, Ue 가, 수소 원자를 나타내고, Rd 및 Re 가, 각각 독립적으로, 에틸렌기 또는 프로필렌기를 나타내는, 세포 배양 용기.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    단백질의 부착 억제능을 갖는, 세포 배양 용기.
  7. 하기 식 (a) 로 나타내는 기를 포함하는 반복 단위와, 하기 식 (b) 로 나타내는 기를 포함하는 반복 단위와, 하기 식 (c) 로 나타내는 기를 포함하는 반복 단위를 포함하는 공중합체 :
    [화학식 4]
    Figure pct00025

    [식 중,
    Ua1, Ua2, Ub1, Ub2 및 Ub3 은, 각각 독립적으로, 수소 원자 또는 탄소 원자수 1 내지 5 의 직사슬 혹은 분기 알킬기를 나타내고 ;
    Rc 는, 탄소 원자수 1 내지 18 의 직사슬 혹은 분기 알킬기, 탄소 원자수 3 내지 10 의 지환식 탄화수소기, 탄소 원자수 6 내지 10 의 아릴기, 탄소 원자수 7 내지 15 의 아르알킬기 또는 탄소 원자수 7 내지 15 의 아릴옥시알킬기 (여기서, 상기 아릴 부분은, 할로겐 원자로 치환되어 있어도 되는 탄소 원자수 1 내지 5 의 직사슬 혹은 분기 알킬기로 치환되어 있어도 된다) 를 나타내고 ;
    An- 는, 할로겐화물 이온, 무기산 이온, 수산화물 이온 및 이소티오시아네이트 이온으로 이루어지는 군에서 선택되는 음이온을 나타낸다]
    를, 용기의 표면의 적어도 일부에 코팅하는 공정을 포함하는, 세포 배양 용기의 제조 방법.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 식 (a), (b) 및 (c) 로 나타내는 기를 포함하는 반복 단위가, 각각, 하기 식 (A), (B) 및 (C) :
    [화학식 5]
    Figure pct00026

    [식 중,
    Ta, Tb, Tc, Ua1, Ua2, Ub1, Ub2 및 Ub3 은, 각각 독립적으로, 수소 원자 또는 탄소 원자수 1 내지 5 의 직사슬 혹은 분기 알킬기를 나타내고 ;
    Qa 및 Qb 는, 각각 독립적으로, 단결합, 에스테르 결합 또는 아미드 결합을 나타내고, Qc 는, 단결합, 에테르 결합 또는 에스테르 결합을 나타내고 ;
    Ra 및 Rb 는, 각각 독립적으로, 할로겐 원자로 치환되어 있어도 되는 탄소 원자수 1 내지 10 의 직사슬 또는 분기 알킬렌기를 나타내고, Rc 는, 탄소 원자수 1 내지 18 의 직사슬 혹은 분기 알킬기, 탄소 원자수 3 내지 10 의 지환식 탄화수소기, 탄소 원자수 6 내지 10 의 아릴기, 탄소 원자수 7 내지 15 의 아르알킬기 또는 탄소 원자수 7 내지 15 의 아릴옥시알킬기 (여기서, 상기 아릴 부분은, 할로겐 원자로 치환되어 있어도 되는 탄소 원자수 1 내지 5 의 직사슬 혹은 분기 알킬기로 치환되어 있어도 된다) 를 나타내고 ; An- 는, 할로겐화물 이온, 무기산 이온, 수산화물 이온 및 이소티오시아네이트 이온으로 이루어지는 군에서 선택되는 음이온을 나타내고 ;
    m 은, 0 내지 6 의 정수를 나타낸다]
    로 나타내는 모노머로부터 유도되는 반복 단위인, 세포 배양 용기의 제조 방법.
  9. 제 7 항 또는 제 8 항에 있어서,
    코팅 공정이, 공중합체를 포함하는 바니시를 사용하여 실시되는, 세포 배양 용기의 제조 방법.
  10. 제 9 항에 있어서,
    공중합체를 포함하는 바니시가, 미리 pH 조정되어 있는, 세포 배양 용기의 제조 방법.
  11. 제 7 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
    추가로, 코팅된 세포 배양 용기를, 건조 공정 전 및/또는 후에, 세정하는 공정을 포함하는, 세포 배양 용기의 제조 방법.
  12. 제 11 항에 있어서,
    건조 공정 후의 세정이, 물 및 전해질을 포함하는 수용액으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 용매를 사용하여 실시되는, 세포 배양 용기의 제조 방법.
  13. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 기재된 세포 배양 용기 또는 제 7 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 기재된 제조 방법에 의해 제조된 세포 배양 용기를 사용하는 것을 특징으로 하는, 세포 응집괴의 제조 방법.
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