KR102358722B1

KR102358722B1 - 세포 배양기

Info

Publication number: KR102358722B1
Application number: KR1020157037029A
Authority: KR
Inventors: 아야코 오타니; 다이토 니시노; 요시오미 히로이; 다카히로 기시오카; 도모유키 오자와
Original assignee: 닛산 가가쿠 가부시키가이샤
Priority date: 2013-06-07
Filing date: 2014-06-09
Publication date: 2022-02-04
Also published as: US11345827B2; CN105308169A; CN112552769A; EP3006529A1; US20160115435A1; EP3006529B1; WO2014196652A1; KR20160015309A; KR20160015306A; JP6481611B2; JPWO2014196650A1; US10774234B2; SG10202011272UA; WO2014196650A1; CA2914618A1; EP3006554B1; TW201512333A; KR102292139B1; CN112625535A; EP3006529A4

Abstract

본 발명은, 하기 식 (a) 로 나타내는 유기기를 포함하는 반복 단위와, 하기 식 (b) 로 나타내는 유기기를 포함하는 반복 단위를 포함하는 공중합체가 표면에 코팅되어 있는 것을 특징으로 하는, 세포 배양 용기, 그 제조 방법 및 그것을 사용한 세포 응집괴의 제조 방법을 제공한다.

(식 중, U^a1, U^a2, U^b1, U^b2 및 U^b3, 그리고 An^- 는, 명세서 및 특허 청구 범위에 기재된 바와 같다)

Description

세포 배양기 {CELL CULTIVATOR}

본 발명은, 세포 배양기, 그 제조 방법 및 그것을 사용한 세포 응집괴(塊) (스피어라고도 한다) 의 제조 방법에 관한 것이다. 특히 본 발명은, 생체 물질, 특히 세포의 부착 억제능을 갖는 공중합체가 표면에 코팅되어 있는 것을 특징으로 하는, 세포 배양 용기 및 그 제조 방법에 관한 것이다.

최근, 동물이나 식물체 안에서 상이한 역할을 하고 있는 여러 가지 기관, 조직, 및 세포를 생체 밖에서 증식 혹은 유지시키기 위한 기술이 발전해 오고 있다. 이들 기관, 조직을 생체 밖에서 증식 혹은 유지하는 것은, 각각 기관 배양, 조직 배양이라 불리고 있고, 기관, 조직으로부터 분리된 세포를 생체 밖에서 증식, 분화 혹은 유지하는 것은 세포 배양이라 불리고 있다. 세포 배양은, 분리한 세포를 배지 중에서 생체 밖에서 증식, 분화 혹은 유지하는 기술이고, 생체 안의 각종 기관, 조직, 세포의 기능 및 구조를 상세하게 해석하기 위해서 불가결한 것이 되어 있다. 또, 당해 기술에 의해 배양된 세포 및/또는 조직은, 화학 물질, 의약품 등의 약효 및 독성 평가나, 효소, 세포 증식 인자, 항체 등의 유용 물질의 대량 생산, 질환이나 결손에 의해 상실된 기관, 조직, 세포를 보충하는 재생 의료, 식물의 품종 개량, 유전자 조작 작물의 제조 등 여러 가지 분야에서 이용되고 있다.

동물 유래의 세포는, 그 성상으로부터 부유 세포와 접착 세포로 크게 2 분 된다. 부유 세포는, 생육·증식에 족장 (足場) 을 필요로 하지 않는 세포이고, 접착 세포는, 생육·증식에 족장을 필요로 하는 세포이지만, 생체를 구성하는 대부분의 세포는 후자의 접착 세포이다. 접착 세포의 배양 방법으로는, 단층 배양, 분산 배양, 포매 배양, 마이크로캐리어 배양, 및 세포 응집괴 (스피어) 배양 등이 알려져 있다.

특히 최근에는, 재생 의료 분야의 발전에 수반하여, 보다 생체 안에 가까운 환경에서의 배양 방법으로서 스피어 배양이 주목받고, 그 배양에 적절한 배지 조성물이나, 배지 첨가제가 여러 가지 보고되어 있다 (예를 들어, 특허문헌 1 및 2 참조). 또 스피어 배양에서는, 배양 용기 (기재) 로부터의 자극이, 배양의 결과를 좌우하는 중요한 요인이라고 생각되고 있어, 세포 (특히, 세포 응집괴) 를 배양 용기로부터의 자극이 없는, 삼차원 환경 또는 완전한 부유 상태에서 배양하는 것이 요구되고 있다 (예를 들어, 특허문헌 3 참조).

국제 공개 제2014/017513호 국제 공개 제2013/144372호 일본 공개특허공보 2008-61609호

본 발명은, 세포 배양기, 그 제조 방법 및 그것을 사용한 세포 응집괴의 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 특히 본 발명은, 생체 물질, 특히 세포의 부착 억제능을 갖는 공중합체가 표면에 코팅되어 있는 것을 특징으로 하는, 세포 배양 용기, 그 제조 방법 및 그것을 사용한 세포 응집괴의 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

종래, 세포 (특히, 세포 응집괴) 를 삼차원 환경 또는 완전한 부유 상태에서 배양하기 위해서, 세포의 용기 표면 (벽면) 에 대한 부착, 및 세포 배양 용기에 형성된 코팅의 배양액으로의 용출이라는 문제가 있었다. 친수성 화합물에 의한 코팅이 형성된 세포 배양 용기는, 용기 표면 (벽면) 에 대한 세포 부착을 개선할 수 있지만, 세포 배양 용기에 형성된 코팅의 배양액으로의 용출 등의 문제가 여전히 있었다. 또 친수성 화합물에 의한 코팅은, 방사선에 대한 내성이 충분하지 않아, 코팅 후에 방사선으로 멸균할 수 없는 것이 많아, 무균적인 생산이 필요해진다는 문제도 있었다.

본 발명자들은, 여러 가지 생체 물질의 부착 억제능을 갖는 코팅 재료로서 기대되고 있는 인산에스테르기를 갖는 폴리머에 주목하고, 예의 검토하였다. 그 결과, 특정 유기기를 포함하는 공중합체로 표면의 적어도 일부가 코팅된 세포 배양 용기가, 세포의 용기 표면 (벽면) 에 대한 부착을 억제함과 함께, 코팅이 용기 표면에 강고하게 고착할 수 있으므로, 코팅의 배양액으로의 용출이나 방사선 내성이 개선된 세포 배양 용기로서 유용한 것을 찾아내어, 본 발명을 완성시켰다.

즉, 본 발명은 이하와 같다 :

1. 하기 식 (a) 로 나타내는 유기기를 포함하는 반복 단위와, 하기 식 (b) 로 나타내는 유기기를 포함하는 반복 단위를 포함하는 공중합체 :

[화학식 1]

(식 중, U^a1, U^a2, U^b1, U^b2 및 U^b3 은, 각각 독립적으로, 수소 원자 또는 탄소 원자수 1 내지 5 의 직사슬 혹은 분기 알킬기를 나타내고, 그리고 An^- 는, 할로겐화물 이온, 무기산 이온, 수산화물 이온 및 이소티오시아네이트 이온으로 이루어지는 군에서 선택되는 음이온을 나타낸다) 가 표면에 코팅되어 있는 것을 특징으로 하는, 세포 배양 용기 ;

2. 상기 식 (a) 및 (b) 로 나타내는 유기기를 포함하는 반복 단위가, 각각, 하기 식 (A) 및 (B) :

[화학식 2]

(식 중, T^a, T^b, U^a1, U^a2, U^b1, U^b2 및 U^b3 은, 각각 독립적으로, 수소 원자 또는 탄소 원자수 1 내지 5 의 직사슬 혹은 분기 알킬기를 나타내고, Q^a 및 Q^b 는, 각각 독립적으로, 단결합, 에스테르 결합 또는 아미드 결합을 나타내고, R^a 및 R^b 는, 각각 독립적으로, 할로겐 원자로 치환되어 있어도 되는 탄소 원자수 1 내지 10 의 직사슬 또는 분기 알킬렌기를 나타내고, An^- 는, 할로겐화물 이온, 무기산 이온, 수산화물 이온 및 이소티오시아네이트 이온으로 이루어지는 군에서 선택되는 음이온을 나타내고, 그리고 m 은, 0 내지 6 의 정수를 나타낸다) 로 나타내는 모노머로부터 유도되는 반복 단위인, 상기 1 에 기재된 세포 배양 용기 ;

3. m 이 1 이고, R^a 및 R^b 가, 각각 독립적으로, 에틸렌기 또는 프로필렌기를 나타내는, 상기 2 에 기재된 세포 배양 용기 ;

4. 상기 공중합체가, 추가로 하기 식 (C) 또는 (D) :

[화학식 3]

(식 중, T^c, T^d 및 U^d 는, 각각 독립적으로, 수소 원자 또는 탄소 원자수 1 내지 5 의 직사슬 혹은 분기 알킬기를 나타내고, R^c 및 R^d 는, 각각 독립적으로, 할로겐 원자로 치환되어 있어도 되는 탄소 원자수 1 내지 10 의 직사슬 또는 분기 알킬렌기를 나타낸다) 로 나타내는 모노머로부터 유도되는 가교 구조를 포함하는, 상기 1 내지 3 중 어느 하나에 기재된 세포 배양 용기 ;

5. T^c 및 T^d 가, 각각 독립적으로, 수소 원자 또는 메틸기를 나타내고, U^d 가, 수소 원자를 나타내고, R^c 및 R^d 가, 각각 독립적으로, 에틸렌기 또는 프로필렌기를 나타내는, 상기 4 에 기재된 세포 배양 용기 ;

6. 하기 식 (a) 로 나타내는 유기기를 포함하는 반복 단위와, 하기 식 (b) 로 나타내는 유기기를 포함하는 반복 단위를 포함하는 공중합체 :

[화학식 4]

(식 중, U^a1, U^a2, U^b1, U^b2 및 U^b3 은, 각각 독립적으로, 수소 원자 또는 탄소 원자수 1 내지 5 의 직사슬 혹은 분기 알킬기를 나타내고, 그리고 An^- 는, 할로겐화물 이온, 무기산 이온, 수산화물 이온 및 이소티오시아네이트 이온으로 이루어지는 군에서 선택되는 음이온을 나타낸다) 를, 용기의 표면의 적어도 일부에 코팅하는 공정 ; 및

코팅된 용기를 -200 ℃ 내지 200 ℃ 에서 건조시키는 공정

을 포함하는, 세포 배양 용기의 제조 방법 ;

8. 상기 식 (a) 및 (b) 로 나타내는 유기기를 포함하는 반복 단위가, 각각, 하기 식 (A) 및 (B) :

[화학식 5]

(식 중, T^a, T^b, U^a1, U^a2, U^b1, U^b2 및 U^b3 은, 각각 독립적으로, 수소 원자 또는 탄소 원자수 1 내지 5 의 직사슬 혹은 분기 알킬기를 나타내고, Q^a 및 Q^b 는, 각각 독립적으로, 단결합, 에스테르 결합 또는 아미드 결합을 나타내고, R^a 및 R^b 는, 각각 독립적으로, 할로겐 원자로 치환되어 있어도 되는 탄소 원자수 1 내지 10 의 직사슬 또는 분기 알킬렌기를 나타내고, An^- 는, 할로겐화물 이온, 무기산 이온, 수산화물 이온 및 이소티오시아네이트 이온으로 이루어지는 군에서 선택되는 음이온을 나타내고, 그리고 m 은, 0 내지 6 의 정수를 나타낸다) 로 나타내는 모노머로부터 유도되는 반복 단위인, 상기 6 에 기재된 제조 방법 ;

8. 코팅 공정이, 공중합체를 포함하는 바니시를 이용하여 실시되는, 상기 6 또는 7 에 기재된 제조 방법 ;

9. 공중합체를 포함하는 바니시가, 미리 pH 조정되어 있는, 상기 8 에 기재된 제조 방법 ;

10. 추가로, 코팅된 세포 배양 용기를, 건조 공정 전 및/또는 후에, 세정하는 공정을 포함하는, 상기 6 내지 9 중 어느 하나에 기재된 제조 방법 ;

11. 건조 공정 후의 세정이, 물 및 전해질을 포함하는 수용액으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 용매를 이용하여 실시되는, 상기 10 에 기재된 제조 방법 ;

12. 추가로, 코팅된 세포 배양 용기를, 건조 후에, 방사선 처리로 멸균하는 공정을 포함하는, 상기 6 내지 11 중 어느 하나에 기재된 제조 방법 ;

13. 상기 1 내지 5 중 어느 하나에 기재된 세포 배양 용기 또는 상기 6 내지 12 중 어느 하나에 기재된 제조 방법에 의해 제조된 세포 배양 용기를 사용하는 것을 특징으로 하는, 세포 응집괴의 제조 방법 ;

14. 세포 배양 용기 중의 배지가, 나노 파이버 형성하여 세포 또는 조직을 부유시키는 효과를 갖는 다당류를 포함하는 것을 특징으로 하는, 상기 13 에 기재된 세포 응집괴의 제조 방법 ;

15. 다당류가 탈아실화 젤란검인 것을 특징으로 하는, 상기 14 에 기재된 세포 응집괴의 제조 방법.

본 발명의 세포 배양 용기는, 특정 유기기를 포함하는 공중합체로 표면의 적어도 일부가 코팅된 용기를 사용함으로써, 용기 표면 (벽면) 에 대한 세포의 부착을 억제할 수 있다. 본 발명의 세포 배양 용기는, 용기 표면의 적어도 일부가 식 (a) 로 나타내는 아니온, 식 (b) 로 나타내는 카티온을 포함하는 공중합체로 코팅되어 있으므로, 그 카티온 및 아니온의 정전기적 밸런스에 의해, 용기 소자의 표면이 전기적으로 중성으로 유지되어, 세포의 부착을 방지할 수 있다고 생각된다. 한편, 코팅 중의 그 카티온 및 아니온이 이온 결합 (이온 컴플렉스) 을 형성함으로써, 유리, 섬유, 무기 입자 또는 수지 (합성 수지 및 천연 수지) 등, 용기의 기재의 종류를 불문하고 고착할 수 있고, 또한 고착 후에는 수계 용매 (물, 인산 완충액 (PBS), 알코올 등) 에 대한 내구성이 우수한 코팅이 된다. 또 이러한 코팅은, 방사선 내성도 우수하여, 방사선에 의한 멸균이 가능해진다. 즉, 본 발명에 의해, 세포의 부착 억제에 추가로, 용매나 방사선에 대한 내구성도 우수한 세포 배양 용기를 제공할 수 있다.

도 1 은 시험예 1 에서 얻어진, 표면 처리제 L1 로 코팅한 평저 플레이트에서 배양한 HepG2 세포의 응집괴의 현미경 사진 (배율 : 40 배) 을 나타낸다.
도 2 의 (a) 는, 시험예 3 에서 얻어진, 표면 처리제 L1 로 코팅한 평저 플레이트에서, 탈아실화 젤란검을 첨가하지 않은 배지를 이용하여 배양한 HepG2 세포의 응집괴의 현미경 사진 (배율 : 40 배) 을 나타낸다. (b) 는, 시험예 3 에서 얻어진, 표면 처리제 L1 로 코팅한 평저 플레이트에서, 탈아실화 젤란검을 첨가한 배지를 이용하여 배양한 HepG2 세포의 응집괴의 현미경 사진 (배율 : 40 배) 을 나타낸다.

≪세포 배양 용기≫

본 발명의 제 1 양태는, 하기 식 (a) 로 나타내는 유기기를 포함하는 반복 단위와, 하기 식 (b) 로 나타내는 유기기를 포함하는 반복 단위를 포함하는 공중합체 :

[화학식 6]

(식 중, U^a1, U^a2, U^b1, U^b2 및 U^b3 은, 각각 독립적으로, 수소 원자 또는 탄소 원자수 1 내지 5 의 직사슬 혹은 분기 알킬기를 나타내고, 그리고 An^- 는, 할로겐화물 이온, 무기산 이온, 수산화물 이온 및 이소티오시아네이트 이온으로 이루어지는 군에서 선택되는 음이온을 나타낸다) 가 표면에 코팅되어 있는 것을 특징으로 하는, 세포 배양 용기이다.

＜세포＞

본 발명에 있어서의 세포란, 동물 혹은 식물을 구성하는 가장 기본적인 단위이고, 그 요소로서 세포막의 내부에 세포질과 각종 세포 소기관을 갖는 것이다. 이때, DNA 를 내포하는 핵은, 세포 내부에 포함되어도 되고 포함되지 않아도 된다. 예를 들어, 본 발명에 있어서의 동물 유래의 세포에는, 정자나 난자 등의 생식세포, 생체를 구성하는 체세포, 줄기세포 (다능성 줄기세포 등), 전구세포, 생체로부터 분리된 암세포, 생체로부터 분리되고 불사화능을 획득하여 체외에서 안정적으로 유지되는 세포 (세포주), 생체로부터 분리되고 인위적으로 유전자 개변이 이루어진 세포, 생체로부터 분리되고 인위적으로 핵이 교환된 세포 등이 포함된다. 생체를 구성하는 체세포의 예로는, 이하에 한정되는 것은 아니지만, 선유아세포, 골수세포, B 림프구, T 림프구, 호중구, 적혈구, 혈소판, 매크로파지, 단구, 골세포, 골수세포, 주피세포, 수상세포, 케라티노사이트, 지방세포, 간엽세포, 상피세포, 표피세포, 내피세포, 혈관내피세포, 간실질세포, 연골세포, 난구세포, 신경계 세포, 글리아세포, 뉴런, 올리고덴드로사이트, 마이크로글리아, 성상교세포, 심장세포, 식도세포, 근육세포 (예를 들어, 평활근세포 또는 골격근세포), 췌장베타세포, 멜라닌세포, 조혈전구세포 (예를 들어, 제대혈 유래의 CD34 양성 세포), 및 단핵세포 등이 포함된다. 당해 체세포는, 예를 들어 피부, 신장, 비장, 부신, 간장, 폐, 난소, 췌장, 자궁, 위, 결장, 소장, 대장, 방광, 전립선, 정소, 흉선, 근육, 결합 조직, 뼈, 연골, 혈관 조직, 혈액 (제대혈을 포함한다), 골수, 심장, 눈, 뇌 또는 신경 조직 등의 임의의 조직으로부터 채취되는 세포가 포함된다. 줄기세포란, 자기 자신을 복제하는 능력과 다른 복수 계통의 세포로 분화하는 능력을 겸비한 세포이고, 그 예로는, 이하에 한정되는 것은 아니지만, 배성 줄기세포 (ES 세포), 배성 종양세포, 배성 생식 줄기세포, 인공 다능성 줄기세포 (iPS 세포), 신경 줄기세포, 조혈 줄기세포, 간엽계 줄기세포, 간 줄기세포, 췌 줄기세포, 근 줄기세포, 생식 줄기세포, 장 줄기세포, 암 줄기세포, 모포 줄기세포 등이 포함된다. 다능성 줄기세포로는, 상기 줄기세포 중, ES 세포, 배성 생식 줄기세포, iPS 세포를 들 수 있다. 전구세포란, 상기 줄기세포로부터 특정 체세포나 생식세포로 분화하는 도중의 단계에 있는 세포이다. 암 세포란, 체세포로부터 파생되어 무한의 증식능을 획득한 세포이다. 세포주란, 생체 밖에서의 인위적인 조작에 의해 무한의 증식능을 획득한 세포이다.

암 세포주의 예로는, 이하에 한정되는 것은 아니지만, 인간 유암 세포주로서 HBC-4, BSY-1, BSY-2, MCF-7, MCF-7/ADR RES, HS578T, MDA-MB-231, MDA-MB-435, MDA-N, BT-549, T47D, 인간 자궁경암 세포주로서 HeLa, 인간 폐암 세포주로서 A549, EKVX, HOP-62, HOP-92, NCI-H23, NCI-H226, NCI-H322M, NCI-H460, NCI-H522, DMS273, DMS114, 인간 대장암 세포주로서 Caco-2, COLO-205, HCC-2998, HCT-15, HCT-116, HT-29, KM-12, SW-620, WiDr, 인간 전립선암 세포주로서 DU-145, PC-3, LNCaP, 인간 중추신경계암 세포주로서 U251, SF-295, SF-539, SF-268, SNB-75, SNB-78, SNB-19, 인간 난소암 세포주로서 OVCAR-3, OVCAR-4, OVCAR-5, OVCAR-8, SK-OV-3, IGROV-1, 인간 신암 세포주로서 RXF-631L, ACHN, UO-31, SN-12C, A498, CAKI-1, RXF-393L, 786-0, TK-10, 인간 위암 세포주로서 MKN45, MKN28, St-4, MKN-1, MKN-7, MKN-74, 피부암 세포주로서 LOX-IMVI, LOX, MALME-3M, SK-MEL-2, SK-MEL-5, SK-MEL-28, UACC-62, UACC-257, M14, 백혈병 세포주로서 CCRF-CRM, K562, MOLT-4, HL-60TB, RPMI8226, SR, UT7/TPO, Jurkat 등을 들 수 있다. 세포주의 예로는, 이하에 한정되는 것은 아니지만, HEK293 (인간 태아 신세포), MDCK, MDBK, BHK, C-33A, AE-1, 3D9, Ns0/1, NIH3T3, PC12, S2, Sf9, Sf21, High Five (등록상표), Vero 등이 포함된다. 줄기세포주의 예로는, 이하에 한정되는 것은 아니지만, HepG2, Hep3B, HepaRG (등록상표), JHH7, HLF, HLE, PLC/PRF/5, WRL68, HB611, SK-HEP-1, HuH-4, HuH-7 등을 들 수 있다.

본 발명에 있어서의 식물 유래 세포에는, 식물체의 각 조직으로부터 분리한 세포가 포함되고, 당해 세포로부터 세포벽을 인위적으로 제거한 프로토플라스트도 포함된다.

＜용기＞

본 발명의 세포 배양 용기를 구성하는, 공중합체가 코팅되는 용기는, 당 기술 분야에서 사용될 수 있는 임의의 형태의 용기류이면 되고, 예를 들어 세포의 배양에 일반적으로 사용되는 샬레, 플라스크, 플라스틱 백, 테플론 (등록상표) 백, 디쉬, 페트리 디쉬, 조직 배양용 디쉬, 멀티 디쉬, 마이크로 플레이트, 마이크로 웰 플레이트, 멀티 플레이트, 멀티 웰 플레이트, 챔버 슬라이드, 세포 배양 플라스크, 스피너 플라스크, 튜브, 트레이, 배양 백, 롤러 보틀 등을 들 수 있다. 바람직하게는, 6 ∼ 1536 웰의 멀티 웰 플레이트 및 샬레를 들 수 있다.

용기의 소재로는, 전형적으로는, 유리 또는 수지를 사용할 수 있다. 가공 용이성이나 경제성 등의 점에서, 수지를 사용하는 것이 바람직하다. 수지는, 천연 수지 또는 합성 수지 어느 것이라도 되고, 천연 수지로는, 예를 들어 셀룰로오스, 3아세트산셀룰로오스 (CTA), 덱스트란황산을 고정화한 셀룰로오스 등을 들 수 있고, 합성 수지로는, 예를 들어 폴리아크릴로니트릴 (PAN), 폴리에스테르계 폴리머 알로이 (PEPA), 폴리스티렌 (PS), 폴리술폰 (PSF), 폴리에틸렌테레프탈레이트 (PET), 폴리메틸메타크릴레이트 (PMMA), 폴리비닐알코올 (PVA), 폴리우레탄 (PU), 에틸렌비닐알코올 (EVAL), 폴리에틸렌 (PE), 폴리에스테르 (PE), 폴리프로필렌 (PP), 폴리불화비닐리덴 (PVDF), 각종 이온 교환 수지 또는 폴리에테르술폰 (PES) 등을 들 수 있다. 본 발명의 세포 배양 용기의 제조에서는, 공중합체를, 그 용기의 표면의 적어도 일부에 존재하도록 코팅할 때에, 고온에서의 처리를 필요로 하지 않기 때문에, 내열성이 낮은 수지 등도 적용 가능하다.

＜공중합체＞

본 발명의 세포 배양 용기는, 용기의 표면의 적어도 일부가, 특정 공중합체로 코팅되어 있는 것을 특징으로 한다. 본 발명에 관련된 공중합체는, 하기 식 (a) 로 나타내는 유기기를 포함하는 반복 단위와, 하기 식 (b) 로 나타내는 유기기를 포함하는 반복 단위를 포함하는 공중합체 :

[화학식 7]

(식 중, U^a1, U^a2, U^b1, U^b2 및 U^b3 은, 각각 독립적으로, 수소 원자 또는 탄소 원자수 1 내지 5 의 직사슬 혹은 분기 알킬기를 나타내고, 그리고 An^- 는, 할로겐화물 이온, 무기산 이온, 수산화물 이온 및 이소티오시아네이트 이온으로 이루어지는 군에서 선택되는 음이온을 나타낸다) 이다.

본 발명에 관련된 공중합체는, 상기 식 (a) 로 나타내는 유기기를 포함하는 반복 단위와, 상기 식 (b) 로 나타내는 유기기를 포함하는 반복 단위를 포함하는 공중합체이면, 특별히 제한은 없다. 그 공중합체는, 상기 식 (a) 로 나타내는 유기기를 포함하는 모노머와, 상기 식 (b) 로 나타내는 유기기를 포함하는 모노머를 라디칼 중합하여 얻어진 것이 바람직하지만, 중축합, 중부가 반응시킨 것도 사용할 수 있다. 공중합체의 예로는, 올레핀이 반응한 비닐 중합 폴리머, 폴리아미드, 폴리에스테르, 폴리카보네이트, 폴리우레탄 등을 들 수 있지만, 이들 중에서도 특히 올레핀이 반응한 비닐 중합 폴리머 또는 (메트)아크릴레이트 화합물을 중합시킨 (메트)아크릴 폴리머가 바람직하다. 또한, 본 발명에 있어서, (메트)아크릴레이트 화합물이란, 아크릴레이트 화합물과 메타크릴레이트 화합물의 양방을 의미한다. 예를 들어 (메트)아크릴산은, 아크릴산 및 메타크릴산을 의미한다.

바람직하게는, 상기 식 (a) 및 (b) 로 나타내는 유기기를 포함하는 모노머는, 각각, 하기 식 (A) 및 (B) :

[화학식 8]

(식 중, T^a, T^b, U^a1, U^a2, U^b1, U^b2 및 U^b3 은, 각각 독립적으로, 수소 원자 또는 탄소 원자수 1 내지 5 의 직사슬 혹은 분기 알킬기를 나타내고, Q^a 및 Q^b 는, 각각 독립적으로, 단결합, 에스테르 결합 또는 아미드 결합을 나타내고, R^a 및 R^b 는, 각각 독립적으로, 할로겐 원자로 치환되어 있어도 되는 탄소 원자수 1 내지 10 의 직사슬 또는 분기 알킬렌기를 나타내고, An^- 는, 할로겐화물 이온, 무기산 이온, 수산화물 이온 및 이소티오시아네이트 이온으로 이루어지는 군에서 선택되는 음이온을 나타내고, 그리고 m 은 0 내지 6 의 정수를 나타낸다) 로 나타내는 모노머이다. 따라서, 식 (A) 및 (B) 로 나타내는 모노머로부터 유도되는 반복 단위는, 각각, 하기 식 (a1) 및 (b1) :

[화학식 9]

(식 중, T^a, T^b, U^a1, U^a2, U^b1, U^b2 및 U^b3, Q^a 및 Q^b, R^a 및 R^b, A^n- 그리고 m 은, 상기와 동의이다) 로 나타낸다.

본 발명에 있어서, 「탄소 원자수 1 내지 5 의 직사슬 또는 분기 알킬기」로는, 예를 들어 메틸기, 에틸기, n-프로필기, 이소프로필기, n-부틸기, 이소부틸기, s-부틸기, t-부틸기, n-펜틸기, 1-메틸부틸기, 2-메틸부틸기, 3-메틸부틸기, 1,1-디메틸프로필기, 1,2-디메틸프로필기, 2,2-디메틸프로필기 또는 1-에틸프로필기를 들 수 있다.

본 발명에 있어서, 「에스테르 결합」은, -C(=O)-O- 혹은 -O-C(=O)- 를 의미하고, 「아미드 결합」은, -NHC(=O)- 혹은 -C(=O)NH- 를 의미한다.

본 발명에 있어서, 「할로겐 원자로 치환되어 있어도 되는 탄소 원자수 1 내지 10 의 직사슬 또는 분기 알킬렌기」는, 탄소 원자수 1 내지 10 의 직사슬 또는 분기 알킬렌기, 혹은 1 이상의 할로겐 원자로 치환된 탄소 원자수 1 내지 10 의 직사슬 또는 분기 알킬렌기를 의미한다. 여기서, 「탄소 원자수 1 내지 10 의 직사슬 또는 분기 알킬렌기」는, 상기 알킬기로부터 추가로 수소 원자가 1 개 제거된 2 가의 유기기이고, 예를 들어 메틸렌기, 에틸렌기, 프로필렌기, 트리메틸렌기, 테트라메틸렌기, 1-메틸프로필렌기, 2-메틸프로필렌기, 디메틸에틸렌기, 에틸에틸렌기, 펜타메틸렌기, 1-메틸-테트라메틸렌기, 2-메틸-테트라메틸렌기, 1,1-디메틸-트리메틸렌기, 1,2-디메틸-트리메틸렌기, 2,2-디메틸-트리메틸렌기, 1-에틸-트리메틸렌기, 헥사메틸렌기, 옥타메틸렌기 및 데카메틸렌기 등을 들 수 있다. 이들 중에서, 에틸렌기, 프로필렌기, 옥타메틸렌기 및 데카메틸렌기가 바람직하고, 탄소 원자수 1 내지 5 의 직사슬 또는 분기 알킬렌기, 예를 들어 에틸렌기, 프로필렌기, 트리메틸렌기, 테트라메틸렌기가 보다 바람직하며, 특히 에틸렌기 또는 프로필렌기가 바람직하다. 「1 이상의 할로겐 원자로 치환된 탄소 원자수 1 내지 10 의 직사슬 또는 분기 알킬렌기」는, 그러한 알킬렌기의 1 이상의 임의의 수소 원자가, 할로겐 원자로 치환되어 있는 것을 의미하고, 특히 에틸렌기 또는 프로필렌기의 수소 원자의 일부 또는 전부가 할로겐 원자로 치환되어 있는 것이 바람직하다.

본 발명에 있어서, 「할로겐 원자」는, 불소 원자, 염소 원자, 브롬 원자 또는 요오드 원자를 들 수 있다.

본 발명에 있어서, 「할로겐화물 이온」은, 할로겐 원자의 아니온을 의미하고, 불화물 이온, 염화물 이온, 브롬화물 이온, 요오드화물 이온을 들 수 있고, 바람직하게는, 염화물 이온이다.

본 발명에 있어서, 「무기산 이온」이란, 탄산 이온, 황산 이온, 인산 이온, 인산수소 이온, 인산2수소 이온, 질산 이온, 과염소산 이온 또는 붕산 이온을 의미한다.

상기 An^- 로서 바람직한 것은, 할로겐화물 이온, 황산 이온, 인산 이온, 수산화물 이온 및 이소티오시아네이트 이온이고, 특히 바람직한 것은 할로겐화물 이온이다.

식 (A) 및 (B) 에 있어서, T^a 및 T^b 는, 바람직하게는, 각각 독립적으로, 수소 원자, 메틸기 또는 에틸기이고, 보다 바람직하게는, 각각 독립적으로, 수소 원자 또는 메틸기이다.

식 (a), 식 (b), 식 (A) 및 (B) 에 있어서, U^a1, U^a2, U^b1, U^b2 및 U^b3 은, 바람직하게는, 각각 독립적으로, 수소 원자, 메틸기 또는 에틸기이다. 식 (a) 및 식 (A) 에 있어서, U^a1 및 U^a2 는, 보다 바람직하게는, 수소 원자이다. 식 (b) 및 (B) 에 있어서, U^b1, U^b2 (및 U^b3) 는, 보다 바람직하게는 메틸기 또는 에틸기이고, 특히 바람직하게는 메틸기이다.

식 (A) 및 (B) 에 있어서, Q^a 및 Q^b 는, 바람직하게는, 각각 독립적으로, 에스테르 결합 (-C(=O)-O- 혹은 -O-C(=O)-) 또는 아미드 결합 (-NHC(=O)- 혹은 -C(=O)NH-) 이고, 보다 바람직하게는, 각각 독립적으로, -C(=O)-O- 또는 -C(=O)NH- 이고, 특히 바람직하게는 -C(=O)-O- 이다.

식 (A) 및 (B) 에 있어서, R^a 및 R^b 는, 바람직하게는, 각각 독립적으로, 할로겐 원자로 치환되어 있어도 되는 탄소 원자수 1 내지 3 의 직사슬 또는 분기 알킬렌기이고, 보다 바람직하게는, 각각 독립적으로, 에틸렌기 혹은 프로필렌기이거나, 혹은 1 개의 염소 원자로 치환된 에틸렌기 혹은 프로필렌기이며, 특히 바람직하게는, 에틸렌기 혹은 프로필렌기이다.

식 (A) 및 (B) 에 있어서, m 은, 바람직하게는 0 내지 3 의 정수를 나타내고, 보다 바람직하게는 1 또는 2 의 정수를 나타내고, 특히 바람직하게는 1 이다.

상기 식 (A) 의 구체예로는, 비닐포스폰산, 애시드포스포옥시에틸(메트)아크릴레이트, 3-클로로-2-애시드포스포옥시프로필(메트)아크릴레이트, 애시드포스포옥시프로필(메트)아크릴레이트, 애시드포스포옥시메틸(메트)아크릴레이트, 애시드포스포옥시폴리옥시에틸렌글리콜모노(메트)아크릴레이트, 애시드포스포옥시폴리옥시프로필렌글리콜모노(메트)아크릴레이트 등을 들 수 있지만, 이 중에서도 비닐포스폰산, 애시드포스포옥시에틸메타크릴레이트 (=인산2-(메타크릴로일옥시)에틸) 가 바람직하게 사용된다.

비닐포스폰산, 애시드포스포옥시에틸메타크릴레이트 (=인산2-(메타크릴로일옥시)에틸) 및 애시드포스포옥시폴리옥시에틸렌글리콜모노메타크릴레이트의 구조식은, 각각 하기 식 (A-1) ∼ 식 (A-3) 으로 나타낸다.

[화학식 10]

이들 화합물은, 합성 시에 있어서, 후술하는 일반식 (C) 또는 (D) 로 나타내는 바와 같은, 2 개의 관능기를 갖는 (메트)아크릴레이트 화합물을 포함하는 경우가 있다.

상기 식 (B) 의 구체예로는, 디메틸아미노에틸(메트)아크릴레이트, 디에틸아미노에틸(메트)아크릴레이트, 디메틸아미노프로필(메트)아크릴레이트, 2-(t-부틸아미노)에틸(메트)아크릴레이트, 메타크로일콜린클로라이드 등을 들 수 있지만, 이 중에서도 디메틸아미노에틸(메트)아크릴레이트, 메타크로일콜린클로라이드 또는 2-(t-부틸아미노)에틸(메트)아크릴레이트가 바람직하게 사용된다.

디메틸아미노에틸아크릴레이트 (=아크릴산2-(디메틸아미노)에틸), 디메틸아미노에틸메타크릴레이트 (=메타크릴산2-(디메틸아미노)에틸), 메타크로일콜린클로라이드 및 2-(t-부틸아미노)에틸메타크릴레이트 (=메타크릴산2-(t-부틸아미노)에틸의 구조식은, 각각 하기 식 (B-1) ∼ 식 (B-4) 로 나타낸다.

[화학식 11]

상기 공중합체 중에 있어서의 식 (a) 로 나타내는 유기기를 포함하는 반복 단위 (또는 식 (a1) 로 나타내는 반복 단위) 의 비율은, 20 몰％ 내지 80 몰％ 이고, 바람직하게는 30 몰％ 내지 70 몰％ 이며, 더 바람직하게는 40 몰％ 내지 60 몰％ 이다. 또한, 본 발명에 관련된 공중합체는, 2 종 이상의 식 (a) 로 나타내는 유기기를 포함하는 반복 단위 (또는 식 (a1) 로 나타내는 반복 단위) 를 포함하고 있어도 된다.

상기 공중합체 중에 있어서의 식 (b) 로 나타내는 유기기를 포함하는 반복 단위 (또는 식 (b1) 로 나타내는 반복 단위) 의 비율은, 전체 공중합체에 대해 상기 식 (a) (또는 식 (a1)) 의 비율을 뺀 잔부 전부여도 되고, 상기 식 (a) (또는 식 (a1)) 와 하기에 기술하는 제 3 성분의 합계 비율을 뺀 잔부여도 된다. 또한, 본 발명에 관련된 공중합체는, 2 종 이상의 식 (b) 로 나타내는 유기기를 포함하는 반복 단위 (또는 식 (b1) 로 나타내는 반복 단위) 를 포함하고 있어도 된다.

또한 본 발명에 관련된 공중합체는, 임의의 제 3 성분이 공중합하고 있어도 된다. 예를 들어, 제 3 성분으로서 2 이상의 관능기를 갖는 (메트)아크릴레이트 화합물이 공중합하고 있고, 폴리머의 일부가 부분적으로 3 차원 가교하고 있어도 된다. 그러한 제 3 성분으로서, 예를 들어 하기 식 (C) 또는 (D) :

[화학식 12]

(식 중, T^c, T^d 및 U^d 는, 각각 독립적으로, 수소 원자 또는 탄소 원자수 1 내지 5 의 직사슬 혹은 분기 알킬기를 나타내고, R^c 및 R^d 는, 각각 독립적으로, 할로겐 원자로 치환되어 있어도 되는 탄소 원자수 1 내지 10 의 직사슬 또는 분기 알킬렌기를 나타낸다) 로 나타내는 2 관능성 모노머를 들 수 있다. 즉 본 발명에 관련된 공중합체는, 바람직하게는, 이와 같은 2 관능성 모노머로부터 유도되는 가교 구조를 포함하는 것이다.

식 (C) 및 (D) 에 있어서, T^c 및 T^d 는, 바람직하게는, 각각 독립적으로, 수소 원자, 메틸기 또는 에틸기이고, 보다 바람직하게는, 각각 독립적으로, 수소 원자 또는 메틸기이다.

식 (C) 및 (D) 에 있어서, U^d 는, 바람직하게는, 수소 원자, 메틸기 또는 에틸기이고, 보다 바람직하게는, 수소 원자이다.

식 (C) 및 (D) 에 있어서, R^c 및 R^d 는, 바람직하게는, 각각 독립적으로, 할로겐 원자로 치환되어 있어도 되는 탄소 원자수 1 내지 3 의 직사슬 또는 분기 알킬렌기이고, 보다 바람직하게는, 각각 독립적으로, 에틸렌기 혹은 프로필렌기이거나, 혹은 1 개의 염소 원자로 치환된 에틸렌기 혹은 프로필렌기이며, 특히 바람직하게는, 에틸렌기 혹은 프로필렌기이다.

식 (C) 로 나타내는 2 관능성 모노머는, 바람직하게는, 에틸렌글리콜디(메트)아크릴레이트, 트리에틸렌글리콜디(메트)아크릴레이트, 프로필렌글리콜디(메트)아크릴레이트 등을 들 수 있다. 식 (D) 로 나타내는 2 관능성 모노머는, 바람직하게는, 인산비스(메타크릴로일옥시메틸), 인산비스[2-(메타크릴로일옥시)에틸], 인산비스[2-(메타크릴로일옥시)프로필] 등을 들 수 있다.

임의의 제 3 성분은, 3 관능성 모노머여도 된다. 그러한 제 3 성분으로서의 3 관능성 모노머로는, 예를 들어 트리아크릴산포스피닐리딘트리스(옥시-2,1-에탄디일) 을 들 수 있다.

이들 중에서도, 특히, 하기 식 (C-1) 로 나타내는 에틸렌글리콜디(메트)아크릴레이트 및 하기 식 (D-1) 로 나타내는 인산비스[2-(메타크릴로일옥시)에틸] 이 바람직하다.

[화학식 13]

공중합체에는, 이들 제 3 성분의 1 종 또는 2 종 이상이 포함되어 있어도 된다. 상기 중에서도, 식 (D) 로 나타내는 2 관능성 모노머가 바람직하고, 특히 식 (D-1) 로 나타내는 2 관능성 모노머가 바람직하다.

상기 공중합체 중에 있어서의 제 3 성분, 예를 들어 상기 식 (C) 또는 (D) 로 나타내는 2 관능성 모노머로부터 유도되는 가교 구조의 비율은, 0 몰％ 내지 50 몰％ 이다.

＜공중합체의 제조 방법＞

본 발명에 관련된 공중합체의 합성 방법으로는, 일반적인 아크릴 폴리머 또는 메타크릴 폴리머 등의 합성 방법인 라디칼 중합, 아니온 중합, 카티온 중합 등의 방법에 의해 합성할 수 있다. 그 형태는 용액 중합, 현탁 중합, 유화 중합, 괴상 중합 등 여러 가지 방법이 가능하다.

반응용 용매로는, 물, 인산 완충액 또는 에탄올 등의 알코올 또는 이들을 조합한 혼합 용매여도 되지만, 물 또는 에탄올을 포함하는 것이 바람직하다. 나아가서는 물 또는 에탄올을 10 질량％ 이상 100 질량％ 이하 포함하는 것이 바람직하다. 나아가서는 물 또는 에탄올을 50 질량％ 이상 100 질량％ 이하 포함하는 것이 바람직하다. 나아가서는 물 또는 에탄올을 80 질량％ 이상 100 질량％ 이하 포함하는 것이 바람직하다. 나아가서는 물 또는 에탄올을 90 질량％ 이상 100 질량％ 이하 포함하는 것이 바람직하다. 바람직하게는 물과 에탄올의 합계가 100 질량％ 이다.

반응 농도로는, 예를 들어 상기 식 (a) 로 나타내는 유기기를 포함하는 모노머와, 상기 식 (b) 로 나타내는 유기기를 포함하는 모노머의 반응 용매 중의 농도를, 0.01 질량％ 내지 4 질량％ 로 하는 것이 바람직하다. 농도가 4 질량％ 이상이면, 예를 들어 식 (a) 로 나타내는 인산기가 갖는 강한 회합성에 의해 공중합체가 반응 용매 중에서 겔화하는 경우가 있다. 농도 0.01 질량％ 이하에서는, 얻어진 바니시의 농도가 지나치게 낮기 때문에, 충분한 막두께의 코팅막을 얻기 위한 코팅막 형성용 조성물의 제조가 곤란하다. 농도가, 0.01 질량％ 내지 3 질량％, 예를 들어 3 질량％ 또는 2 질량％ 인 것이 보다 바람직하다.

본 발명에 관련된 공중합체의 합성에 있어서는, 예를 들어 식 (1) 에 기재된 산성 인산에스테르 단량체 (하프염) 를 제조한 후, 중합하여 공중합체를 제작해도 된다.

[화학식 14]

인산기 함유 모노머는 회합하기 쉬운 모노머이기 때문에, 반응계 중에 적하되었을 때, 신속하게 분산할 수 있도록 반응 용매 중에 소량씩 적하해도 된다. 또한, 반응 용매는 모노머 및 폴리머의 용해성을 높이기 위해서 가온 (예를 들어 40 ℃ 내지 100 ℃) 해도 된다.

중합 반응을 효율적으로 진행시키기 위해서는, 중합 개시제를 사용하는 것이 바람직하다. 중합 개시제의 예로는, 2,2'-아조비스(이소부티로니트릴), 2,2'-아조비스(2-메틸부티로니트릴), 2,2'-아조비스(2,4-디메틸발레로니트릴), 4,4'-아조비스(4-시아노발레르산), 2,2'-아조비스(4-메톡시-2,4-디메틸발레로니트릴), 1,1'-아조비스(시클로헥산-1-카르보니트릴), 1-[(1-시아노-1-메틸에틸)아조]포름아미드, 2,2'-아조비스[2-(2-이미다졸린-2-일)프로판]2염산염, 2,2'-아조비스[2-(2-이미다졸린-2-일)프로판], 2,2'-아조비스(2-메틸프로피온아미딘)2염산염, 2,2'-아조비스[2-메틸-N-(2-하이드록시에틸)프로피온아미드](와코 쥰야쿠 (주) 제조 : VA-086, 10 시간 반감기 온도 ; 86 ℃), 과산화벤조일 (BPO), 2,2'-아조비스[N-(2-카르복시에틸)-2-메틸프로피온아미딘]n-수화물 (와코 쥰야쿠 (주) 제조 : VA-057, 10 시간 반감기 온도 ; 57 ℃), 4,4'-아조비스(4-시아노펜탄산)(와코 쥰야쿠 (주) 제조 : V-501), 2,2'-아조비스[2-(2-이미다졸리딘-2-일)프로판]2염산염 (와코 쥰야쿠 (주) 제조 : VA-044, 10 시간 반감기 온도 ; 44 ℃), 2,2'-아조비스[2-(2-이미다졸리딘-2-일)프로판]2황산염2수화물 (와코 쥰야쿠 (주) 제조 : VA-046B, 10 시간 반감기 온도 ; 46 ℃), 2,2'-아조비스[2-(2-이미다졸리딘-2-일)프로판] (와코 쥰야쿠 (주) 제조 : VA-061, 10 시간 반감기 온도 ; 61 ℃), 2,2'-아조비스(2-아미디노프로판)2염산염 (와코 쥰야쿠 (주) 제조 : V-50, 10 시간 반감기 온도 ; 56 ℃), 퍼옥소2황산 또는 t-부틸하이드로퍼옥사이드 등이 사용되지만, 이 중에서도 이온 밸런스, 물에 대한 용해성을 고려하여 2,2'-아조비스[2-메틸-N-(2-하이드록시에틸)프로피온아미드], 2,2'-아조비스[N-(2-카르복시에틸)-2-메틸프로피온아미딘]n-수화물, 4,4'-아조비스(4-시아노펜탄산), 2,2'-아조비스[2-(2-이미다졸리딘-2-일)프로판]2염산염, 2,2'-아조비스[2-(2-이미다졸리딘-2-일)프로판]2황산염2수화물, 2,2'-아조비스[2-(2-이미다졸리딘-2-일)프로판], 2,2'-아조비스(2-아미디노프로판)2염산염 또는 퍼옥소2황산 중 어느 것을 사용하는 것이 바람직하다.

중합 개시제의 첨가량으로는, 중합에 사용되는 모노머의 합계 중량에 대하여, 0.05 질량％ ∼ 10 질량％ 이다.

반응 조건은 반응 용기를 오일 배스 등에서 50 ℃ 내지 200 ℃ 로 가열하고, 1 시간 내지 48 시간, 보다 바람직하게는 80 ℃ 내지 150 ℃, 5 시간 내지 30 시간 교반을 실시함으로써, 중합 반응이 진행되어 본 발명에 관련된 공중합체가 얻어진다. 반응 분위기는 질소 분위기가 바람직하다. 반응 순서로는, 전체 반응 물질을 실온의 반응 용매에 모두 넣고 나서, 상기 온도로 가열하여 중합시켜도 되고, 미리 가온한 용매 중에, 반응 물질의 혼합물의 전부 또는 일부를 조금씩 적하해도 된다.

예를 들어, 후자의 반응 순서로는, 상기 식 (A) 및 (B) 로 나타내는 화합물, 용매 및 중합 개시제를 포함하는 혼합물을, 그 중합 개시제의 10 시간 반감기 온도보다 높은 온도로 유지한 용매 중에 적하하고, 반응 (중합) 시킨다. 이러한 반응 순서와 온도 조건을 채용함으로써, 상기 식 (A) 또는 식 (B) 로 나타내는 화합물의 반응 용매 중의 농도를, 예를 들어 0.01 질량％ 내지 10 질량％ 로 할 수 있다. 이 경우, 농도가 4 질량％ 를 초과하여도, 반응 전에 적하상 및 반응상이 투명 균일한 용액이 되고, 반응 후의 공중합체의 반응 용매 중에서의 겔화를 억제할 수 있다.

본 발명에 관련된 공중합체의 분자량은, 수천 내지 수백만 정도이면 되고, 바람직하게는 5,000 내지 5,000,000 이다. 더 바람직하게는, 10,000 내지 2,000,000 이다. 또, 랜덤 공중합체, 블록 공중합체, 그래프트 공중합체 중 어느 것이어도 되고, 그 공중합체를 제조하기 위한 공중합 반응 그 자체에는 특별한 제한은 없고, 라디칼 중합이나 이온 중합이나 광 중합, 매크로머, 유화 중합을 이용한 중합 등의 공지된 용액 중에서 합성되는 방법을 사용할 수 있다. 이들은 목적의 용도에 따라, 본 발명의 공중합체 중 어느 것을 단독 사용할 수도 있고, 복수의 공중합체를 혼합하고, 또한 그 비율은 변경하여 사용할 수도 있다.

이와 같이 하여 제조되는 여러 가지 공중합체는, 2 차원 폴리머여도 되고 3 차원 폴리머여도 되고, 물을 함유하는 용액에 분산된 상태이다. 요컨대, 이들 폴리머를 포함하는 바니시에서는, 불균일한 겔화나 백탁 침전이 생기는 것은 바람직하지는 않고, 투명한 바니시, 분산 콜로이드상의 바니시, 또는 졸인 것이 바람직하다.

≪세포 배양 용기의 제조 방법≫

본 발명의 제 2 양태는, 하기 식 (a) 로 나타내는 유기기를 포함하는 반복 단위와, 하기 식 (b) 로 나타내는 유기기를 포함하는 반복 단위를 포함하는 공중합체 :

[화학식 15]

(식 중, U^a1, U^a2, U^b1, U^b2 및 U^b3, 그리고 An^- 는, 상기와 동의이다) 를, 용기의 표면의 적어도 일부에 코팅하는 공정 ; 및

코팅된 용기를 -200 ℃ 내지 200 ℃ 에서 건조시키는 공정

을 포함하는, 세포 배양 용기의 제조 방법이다.

＜코팅 공정＞

본 발명의 세포 배양 용기의 제조 방법의 코팅 공정에서는, 공중합체를, 용기의 표면의 적어도 일부에 코팅한다. 예를 들어, 용기가 환저 (丸底) 의 멀티 웰 플레이트인 경우, 웰의 오목한 부분만을 코팅해도 되지만, 플레이트 전체를 코팅해도 된다. 여기서, 용기 및 공중합체는, 각각 전술한 항목 ＜용기＞ 및 ＜공중합체＞ 에서 서술한 바와 같다.

코팅 공정은, 특별히 한정은 없고, 용기와 공중합체를 접촉시킬 수 있는, 당업자에게 공지인 어떠한 코팅 수단 (예를 들어, 도포, 침지 등) 에 의해 실시하면 된다. 예를 들어, 공중합체를 포함하는 바니시를 용기에 도포함으로써, 혹은 공중합체를 포함하는 바니시에 용기를 침지함으로써 실시할 수 있다. 바람직하게는, 공중합체를 포함하는 바니시에 용기를 침지함으로써 실시한다.

공중합체를 포함하는 바니시는, 전술한 항목 ＜공중합체의 제조 방법＞ 에서 얻어진 공중합체를, 적절한 용매에 원하는 농도로 용해함으로써 조제해도 되고, 혹은 이러한 제조 방법으로 얻어진 공중합체를 포함하는 반응 용액을, 그대로 또는 원하는 고형분 농도로 희석한 후, 바니시로서 사용해도 된다. 바니시에 포함되는 용매로는, 물, 인산 완충액 (PBS), 알코올을 들 수 있다. 알코올로는, 탄소수 2 내지 6 의 알코올, 예를 들어 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 1-부탄올, 2-부탄올, 이소부탄올, t-부탄올, 1-펜탄올, 2-펜탄올, 3-펜탄올, 1-헵탄올, 2-헵탄올, 2,2-디메틸-1-프로판올 (=네오펜틸알코올), 2-메틸-1-프로판올, 2-메틸-1-부탄올, 2-메틸-2-부탄올 (=t-아밀알코올), 3-메틸-1-부탄올, 3-메틸-3-펜탄올, 시클로펜탄올, 1-헥산올, 2-헥산올, 3-헥산올, 2,3-디메틸-2-부탄올, 3,3-디메틸-1-부탄올, 3,3-디메틸-2-부탄올, 2-에틸-1-부탄올, 2-메틸-1-펜탄올, 2-메틸-2-펜탄올, 2-메틸-3-펜탄올, 3-메틸-1-펜탄올, 3-메틸-2-펜탄올, 3-메틸-3-펜탄올, 4-메틸-1-펜탄올, 4-메틸-2-펜탄올, 4-메틸-3-펜탄올 및 시클로헥산올을 들 수 있고, 단독 또는 그들의 조합인 혼합 용매를 사용해도 되지만, 물, PBS 및 에탄올에서 선택되는 것이 바람직하다. 공중합체의 용해를 위해서, 물을 반드시 포함한다.

바니시 중의 공중합체의 농도로는, 0.01 내지 4 질량％, 더 바람직하게는 0.01 내지 3 질량％, 더 바람직하게는 0.01 내지 2 질량％, 더 바람직하게는 0.01 내지 1 질량％ 이다. 공중합체의 농도가 0.01 질량％ 이하이면, 충분한 막두께의 코팅을 형성할 수 없고, 4 질량％ 이상이면, 바니시의 보존 안정성이 나빠져, 용해물의 석출이나 겔화가 일어날 가능성이 있다.

또한 바니시에는, 상기 공중합체와 용매 외에, 필요에 따라 얻어지는 코팅의 성능을 저해하지 않는 범위에서 다른 물질을 첨가할 수도 있다. 다른 물질로는, 방부제, 계면활성제, 기재 (용기) 와의 밀착성을 높이는 프라이머, 곰팡이 방지제 및 당류 등을 들 수 있다.

바니시 중의 공중합체의 이온 밸런스를 조절하기 위해서, 공중합체를 포함하는 바니시는, 미리 pH 조정되어 있어도 된다. pH 조정은, 예를 들어 공중합체를 포함하는 바니시에 pH 조정제를 첨가하여, 바니시의 pH 를 3.5 ∼ 8.5, 바람직하게는 4.0 ∼ 8.0 으로 함으로써 실시해도 된다. 사용할 수 있는 pH 조정제의 종류 및 그 양은, 바니시 중의 공중합체의 농도나, 공중합체의 아니온과 카티온의 존재비 등에 따라 적절히 선택된다. pH 조정제의 예로는, 암모니아, 디에탄올아민, 피리딘, N-메틸-D-글루카민, 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄 등의 유기 아민 ; 수산화칼륨, 수산화나트륨 등의 알칼리 금속 수산화물 ; 염화칼륨, 염화나트륨 등의 알칼리 금속 할로겐화물 ; 황산, 인산, 염산, 탄산 등의 무기산 또는 그 알칼리 금속염 ; 콜린 등의 4 급 암모늄 카티온 ; 혹은 이들의 혼합물 (예를 들어, 인산 완충 생리식염수 등의 완충액) 을 들 수 있다. 이들 중에서도, 암모니아, 디에탄올아민, N-메틸-D-글루카민, 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄, 수산화나트륨 및 콜린이 바람직하고, 특히 암모니아, 디에탄올아민, 수산화나트륨 및 콜린이 바람직하다.

그러한 공중합체를 포함하는 바니시를, 용기에 접촉시켜, 그 표면의 적어도 일부에 코팅을 형성한다. 코팅은, 용기의 표면 전체에 걸쳐서 형성되는 것이 바람직하다.

또한, 코팅 공정 전에, 용기의 표면을, 공지된 UV/오존 처리에 적용해 세정해도 된다. 이러한 세정 공정은, 시판되는 UV/오존 클리너 등을 이용하여 실시할 수 있다.

＜건조·세정·멸균 공정＞

코팅 공정 후, 코팅된 용기를 -200 ℃ 내지 200 ℃ 의 온도에서 건조시킨다. 건조에 의해, 상기 코팅막 형성용 조성물 중의 용매를 제거함과 함께, 본 발명에 관련된 공중합체의 식 (a) 및 식 (b) 끼리가 이온 결합을 형성하여 기체에 완전히 고착된다. 본 발명의 혈액 필터의 코팅의 막두께는, 바람직하게는 10 ∼ 1000 Å 이고, 더 바람직하게는 10 ∼ 500 Å 이다. 본 발명자들은, 본 발명의 세포 배양 용기의 제조 방법에서는, 고온에서의 처리를 필요로 하지 않고, 저온에서의 처리에 의해, 원하는 특성을 갖는 코팅이 용기의 표면에 형성되고, 또한 수십 내지 수백 Å 정도의 얇은 막두께에도 불구하고, 내구성이 우수한 것을 알아냈다.

건조는, 예를 들어 실온 (10 ℃ 내지 35 ℃, 예를 들어 25 ℃) 에서 실시할 수 있지만, 보다 신속히 코팅막을 형성시키기 위해서, 예를 들어 40 ℃ 내지 50 ℃ 에서 실시해도 된다. 또 프리즈 드라이법에 의한 극저온 ∼ 저온 (-200 ℃ 내지 -30 ℃ 전후) 에서 실시해도 된다. 프리즈 드라이는 진공 동결 건조로 불리고, 통상 건조시키고 싶은 것을 냉매로 냉각하고, 진공 상태에서 용매를 승화에 의해 제거하는 방법이다. 프리즈 드라이에서 사용되는 일반적인 냉매는, 드라이아이스와 메탄올을 혼합 매체 (-78 ℃), 액체 질소 (-196 ℃) 등을 들 수 있다. 보다 바람직한 건조 온도는 10 ℃ 내지 180 ℃, 보다 바람직한 건조 온도는 25 ℃ 내지 150 ℃ 이다.

또한, 건조 공정의 전 및/또는 후에, 코팅된 용기의 표면을, 에탄올 등의 탄소 원자수 1 내지 5 의 알코올 및/또는 물로 세정해도 된다. 이러한 세정 공정은, 0 ℃ 내지 60 ℃, 바람직하게는 25 ℃ (실온) 내지 40 ℃ 의 온도에서, 30 분 내지 48 시간, 바람직하게는 1 내지 24 시간 실시할 수 있다.

또한 건조 공정 후, 그 코팅에 잔존하는 불순물, 미반응 모노머 등을 제거하기 위해, 나아가서는 막 중의 공중합체의 이온 밸런스를 조절하기 위해서, 물 및 전해질을 포함하는 수용액으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 용매를 이용하여, 유수 세정 또는 초음파 세정 등으로 세정해도 된다. 여기서 물 또는 전해질을 포함하는 수용액은 예를 들어 40 ℃ 내지 95 ℃ 의 범위에서 가온된 것이어도 된다. 전해질을 포함하는 수용액은, PBS 및 생리식염수 (염화나트륨만 포함하는 것), 둘베코 인산 완충 생리식염수, 트리스 완충 생리식염수, HEPES 완충 생리식염수 및 베로날 완충 생리식염수가 바람직하고, PBS 가 특히 바람직하다.

알코올, 물, 및 PBS 등으로 세정해도, 용기의 표면에 형성된 코팅은, 용출되지 않고 기재 (즉, 용기) 에 강고하게 고착된 채이다. 형성된 코팅은, 세포를 포함하는 여러 가지 생체 물질의 부착 억제능을 갖는다. 따라서, 본 발명의 세포 배양 용기는, 세포의 부착 억제에 추가로, 용매나 방사선에 대한 내구성도 우수한 것이다.

필요에 따라, 코팅된 용기를 멸균하기 위해서, 방사선, 전자선, 에틸렌옥사이드, 오토클레이브 등의 공지된 멸균 처리를 실시해도 된다.

≪세포 응집괴의 제조 방법≫

본 발명의 제 3 양태는, 본 발명의 세포 배양 용기 및 본 발명의 제조 방법에 의해 얻어진 세포 배양 용기 (이하, 양자를 합쳐 「본 발명의 세포 배양 용기」라고 한다) 를 사용하는 것을 특징으로 하는, 세포 응집괴의 제조 방법이다. 본 발명의 세포 배양 용기를 사용하면 세포 응집괴의 용기의 표면 (벽면) 에 대한 부착이 억제되고, 또한 코팅의 배양액으로의 용출이 억제되므로, 용기로부터의 자극이 없는 상태에서 세포 응집괴를 배양할 수 있다. 세포 응집괴는, 바람직하게는, 본 발명의 세포 배양 용기 중에서 세포 또는 조직을 부유시키는 효과를 갖는 다당류 (특히, 탈아실화 젤란검) 를 포함하는 것을 특징으로 하는 배지를 이용하여 배양된다. 그러한 배지의 구체적인 조성이나, 배양 방법은, 예를 들어 국제 공개 제 2014/017513호에 개시되어 있다.

실시예

이하에, 본 발명의 배양 용기 및 그 제조 방법에 관한 합성예, 실시예 및 시험예를 나타내지만, 이들은 본 발명을 더 상세하게 설명하기 위해서 나타내는 것이고, 본 발명은 이들에 한정되는 것은 아니다.

＜원료 조성의 측정 방법＞

인 함유 화합물을 포함하는 원료의, 각 인 함유 화합물의 농도 (질량％) 측정은, ³¹P-NMR 에 의해 실시하였다. 하기 표준 물질을 이용하여 원료 중에 포함되는 각 인 함유 화합물의 절대 농도 (절대 질량％) 를 산출하였다.

(측정 조건)

· 모드 : 역게이트 디커플링 모드 (정량 모드)

· 장치 : varian 400 ㎒

· 용매 : CD₃OD (중메탄올) (30 중량％)

· 회전수 : 0 ㎐

· 데이터 포인트 : 64000

· 플립각 : 90°

· 대기 시간 : 70 s

· 적산 횟수 : 16 회, n = 4,

· 표준 물질 : 트리메틸인산 + D₂O (75 ％ TMP 용액을 조제)

＜합성예 1＞ 표면 처리제 L1 의 조제 :

애시드포스포옥시에틸메타아크릴레이트 (제품명 ; 포스머 M, 유니 케미칼사 제조, 건고법 100 ℃·1 시간에 있어서의 불휘발분 : 91.8 ％, 애시드포스포옥시에틸메타크릴레이트 (44.2 질량％), 인산비스[2-(메타크릴로일옥시)에틸] (28.6 질량％), 기타 물질 (27.2 질량％) 의 혼합물) 6.00 g 에 순수 12.40 g 을 첨가하여 충분히 용해하고, 에탄올 12.40 g, 메타크릴산2-(디메틸아미노)에틸 4.12 g (토쿄 화성 공업 (주) 사 제조), 2,2'-아조(2-메틸-N-(2-하이드록시에틸)프로피온아미드) (제품명 ; VA-086, 와코 쥰야쿠사 제조) 0.10 g 을 20 ℃ 이하로 유지하면서 순서대로 첨가하여 적하 깔때기에 도입하였다. 한편으로, 순수 471.13 g, 에탄올 37.20 g 을 냉각관이 부착된 3 구 플라스크에 첨가하여 질소 플로우하고, 교반하면서 리플럭스 온도까지 승온시켰다. 이 상태를 유지하면서, 혼합액을 도입한 적하 깔때기를 세트하고, 0.5 시간으로 혼합액을 순수와 에탄올의 비등액 내에 적하하였다. 적하 후, 24 시간 환경을 유지한 상태에서 가열 교반함으로써 고형분 약 2 질량％ 의 투명 중합액 506.05 g 을 얻었다. 얻어진 투명 액체의 GFC 에 있어서의 중량 평균 분자량은 약 810,000 이었다. 그 후, 공중합체 함유 바니시 1.00 g 에, 순수 0.9 g, 에탄올 0.1 g 을 첨가해 충분히 교반하여, 표면 처리제 L1 (고형분 1 질량％) 을 조제하였다.

＜합성예 2＞ 표면 처리제 L2 의 조제 :

애시드포스포옥시에틸메타아크릴레이트 (제품명 ; 포스머 M, 유니케미칼 (주) 사 제조, 건고법 100 ℃·1 시간에 있어서의 불휘발분 : 91.8 ％, 애시드포스포옥시에틸메타크릴레이트 (44.2 질량％), 인산비스[2-(메타크릴로일옥시)에틸] (28.6 질량％), 기타 물질 (27.2 질량％) 의 혼합물) 10.00 g 에 순수 68.88 g 을 첨가하여 충분히 용해하고, 에탄올 29.52 g, 메타크릴산2-(디메틸아미노)에틸 7.63 g (토쿄 화성 공업 (주) 사 제조), 2,2'-아조비스[N-(2-카르복시에틸)-2-메틸프로피온아미딘] (제품명 ; VA-057, 와코 쥰야쿠 공업 (주) 사 제조) 0.09 g 을 20 ℃ 이하로 유지하면서 순서대로 첨가하여 적하 깔때기에 도입하였다. 한편으로, 순수 373.89 g, 에탄올 29.52 g 을 냉각관이 부착된 3 구 플라스크에 첨가하여 질소 플로우하고, 교반하면서 리플럭스 온도까지 승온시켰다. 이 상태를 유지하면서, 혼합액을 도입한 적하 깔때기를 세트하고, 0.5 시간으로 혼합액을 순수와 에탄올의 비등액 내에 적하하였다. 적하 후, 24 시간 환경을 유지한 상태에서 가열 교반함으로써 고형분 약 3.5 질량％ 의 투명 중합액 509.60 g 을 얻었다. 얻어진 투명 액체의 GFC 에 있어서의 중량 평균 분자량은 약 280,000 이었다. 그 후, 공중합체 함유 바니시 1.00 g 에, 순수 1.56 g, 에탄올 0.94 g 을 첨가해 충분히 교반하여, 표면 처리제 L2 (고형분 1 질량％) 를 조제하였다.

＜실시예 1＞

이하의 각 처리 공정을 차례로 실시하여, 본 발명에 있어서의 세포 배양 용기를 조제하였다.

처리 1 : 합성예 1 혹은 2 에서 제작한 표면 처리제 (L1 또는 L2) 를, 메시 사이즈가 0.22 ㎛ 인 필터를 이용하여 여과한 후, 96 웰 세포 배양 플레이트 (하기 시험예 참조) 의 웰에 200 ㎕ (고형분 1 질량％)/웰이 되도록 첨가하고, 실온에서 1 시간 정치 후, 잉여의 표면 처리제를 제거하였다.

처리 2 : 오븐 (아드반텍 토요 주식회사 제조, 건조기 FC-612) 을 이용하여 50 도에서 하룻밤 건조시켰다.

처리 3 : γ 선 멸균

＜방법-1＞ : 통상 조건

코팅이 끝난 96 웰 타이터 플레이트를 차광·방습·산소 배리어성을 갖는 알루미늄/PET 라미네이트 필름으로 이루어지는 척이 부착된 가스 불투과성 포장 용기 (제품명 ; 라미집 AL-22, 생산 닛폰사 제조) 에 넣고, 대기 분위기하에서 밀봉하여, 약 24 시간 이상 방치하고 나서 감마선을 15 kGy 조사해 멸균을 실시하였다.

＜방법-2＞ : 진공 조건

코팅이 끝난 96 웰 타이터 플레이트를 차광·방습·산소 배리어성을 갖는 알루미늄/PET 라미네이트 필름으로 이루어지는 척이 부착된 가스 불투과성 포장 용기 (제품명 ; 라미집 AL-22, 생산 닛폰사 제조) 에 넣고, 베큠 실러를 이용하여 진공하에서 가열 밀봉하여, 약 24 시간 이상 방치하고 나서 감마선을 15 kGy 조사해 멸균을 실시하였다.

＜방법-3＞ : 산화 방지제·건조제 동봉·진공 조건

코팅이 끝난 96 웰 타이터 플레이트와, 건조제 (제품명 ; 실리카 겔 Mix, 토요타 화공사 제조) 와, 탈산소제 (제품명 ; 세큘 AP-500, 닛소 파인사 제조) 를 차광·방습·산소 배리어성을 갖는 알루미늄/PET 라미네이트 필름으로 이루어지는 척이 부착된 가스 불투과성 포장 용기 (제품명 ; 라미집 AL-22, 생산 닛폰사 제조) 에 넣고, 베큠 실러를 이용하여 진공하에서 가열 밀봉하여, 약 24 시간 이상 방치하고 나서 감마선을 15 kGy 조사해 멸균을 실시하였다. ;

처리 4 : 메시 사이즈가 0.22 ㎛ 인 필터를 투과시킨 초순수 (Milli-Q 수) 200 ㎕ 를 각 웰에 첨가한 후, 전체량을 제거. 본 처리를 3 회 실시하였다.

＜시험예 1 : 표면 처리제를 코팅한 세포 배양 플레이트의 세포 접착 억제 효과 1＞

(코팅 플레이트의 조제)

실시예 1 에 나타낸 코팅법에 의해 평저 96 웰 세포 배양 플레이트 (BD 바이오사이언스사 제조, ＃351172) 의 웰을, 표면 처리제 L1 또는 L2 로 코팅하였다. 이때, γ 선 멸균 방법은 ＜방법-1＞ 을 사용하였다. 음성 대상으로는, 코팅 처리를 하지 않은 플레이트를 사용하였다. 양성 대조의 샘플로는, 시판되는 세포 저접착 플레이트 (코닝사 제조, ＃3474) 를 사용하였다.

(세포의 조제)

세포는, 인간 태아 신세포주 Hek293 (DS 파마바이오메디칼사 제조), 인간 간암 세포주 HepG2 (DS 파마바이오메디칼사 제조), 마우스 매크로파지 세포주 RAW264.7 (DS 파마바이오메디칼사 제조) 을 사용하였다.

그들 세포의 배양에 사용한 배지는, Hek293 : 10 ％ (v/v) FBS 를 포함하는 EMEM 배지 (WAKO 사 제조), HepG2 : 10 ％ (v/v) FBS 를 포함하는 DMEM 배지 (WAKO사 제조), RAW264.7 : 10 ％ (v/v) FBS 를 포함하는 DMEM/F-12 배지 (시그마사 제조) 를 사용하였다. 세포는, 37 ℃ CO₂ 인큐베이터 내에서 5 ％ 이산화탄소 농도를 유지한 상태에서, 직경 10 ㎝ 의 샬레 (배지 10 ㎖) 를 이용하여 2 일간 이상 정치 배양하였다. 계속해, 본 세포를 PBS 5 ㎖ 로 세정한 후, 트립신-EDTA 용액 (인비트로젠사 제조) 1 ㎖ 를 첨가해 세포를 벗기고, 상기 배지 10 ㎖ 로 각각 현탁하였다. 본 현탁액을 원심분리 (쿠보타 상사 주식회사 제조, 제품번호 5900, 1500 rpm/3 분, 실온) 후, 상청을 제거하고, 상기 배지를 첨가하여 세포 현탁액을 조제하였다.

(세포 부착 실험)

상기에서 조제한 플레이트에 대하여, 각각의 세포 현탁액을 2 × 10⁴ cells/well 이 되도록 각 100 ㎕ 첨가하였다. 그 후, 5 ％ 이산화탄소 농도를 유지한 상태에서, 37 ℃ 에서 4 일간 CO₂ 인큐베이터 내에서 정치하였다.

(세포 부착의 관찰)

배양 4 일간 후, 표면 처리제 L1 또는 L2 로 코팅한 평저 96 웰 타이터 플레이트, 음성 대조, 양성 대조에 대한 세포의 부착을 도립형 현미경 (올림푸스사 제조, CKX31) 에 의한 관찰에 근거하여 비교하였다. 그 결과를 하기 표 1 에 나타낸다. 또, 세포 관찰의 대표예로서 표면 처리제 L1 로 코팅한 플레이트에서 배양한 HepG2 세포의 현미경 사진 (배율 : 40 배) 을 도 1 에 나타낸다.

표 1 및 도 1 과 같이, L1 및 L2 처리를 실시한 플레이트는, 양성 대조와 마찬가지로 어느 세포의 경우도 세포가 부착되지 않은 것이 나타났다. 이때, 도 1 과 같이, 부착되지 않은 세포는 세포 응집괴 (스페로이드) 를 형성하고 있었다.

＜시험예 2 : 표면 처리제를 코팅한 세포 배양 플레이트의 세포 접착 억제 효과 2＞

(코팅 플레이트의 조제)

실시예 1 에 나타낸 코팅법에 의해 평저 96 웰 세포 배양 플레이트 (BD 바이오사이언스사 제조, ＃351172) 의 웰을, 표면 처리제 L1 로 코팅하였다. 이때, γ 선 멸균 방법은 ＜방법-1＞＜방법-2＞＜방법-3＞ 을 사용하였다. 음성 대상으로는, 코팅 처리를 하지 않은 플레이트를 사용하였다.

(세포의 조제)

세포는, 인간 태아 신세포주 Hek293 (DS 파마바이오메디칼사 제조) 을 사용하였다. 본 세포의 배양에는, 10 ％ (v/v) FBS 를 포함하는 EMEM 배지 (WAKO 사 제조) 를 사용하였다. 세포는, 37 ℃ CO₂ 인큐베이터 내에서 5 ％ 이산화탄소 농도를 유지한 상태에서, 직경 10 ㎝ 의 샬레 (배지 10 ㎖) 를 이용하여 2 일간 이상 정치 배양하였다. 계속해, 본 세포를 PBS 5 ㎖ 로 세정한 후, 트립신-EDTA 용액 (인비트로젠사 제조) 1 ㎖ 를 첨가해 세포를 벗기고, 상기 배지 10 ㎖ 로 각각 현탁하였다. 본 현탁액을 원심분리 (쿠보타 상사 주식회사 제조, 제품번호 5900, 1500 rpm/3 분, 실온) 후, 상청을 제거하고, 상기 배지를 첨가하여 세포 현탁액을 조제하였다.

(세포 부착 실험)

상기에서 조제한 플레이트에 대하여, Hek293 세포 현탁액을 2 × 10⁴ cells/well 이 되도록 각 100 ㎕ 첨가하였다. 그 후, 5 ％ 이산화탄소 농도를 유지한 상태에서, 37 ℃ 에서 4 일간 CO₂ 인큐베이터 내에서 정치하였다.

(세포 부착의 관찰)

배양 4 일간 후, 표면 처리제 L1 로 코팅한 평저 96 웰 타이터 플레이트 및 음성 대조에 대한 세포의 부착을 도립형 현미경 (올림푸스사 제조, CKX31) 에 의한 관찰에 근거하여 비교하였다. 그 결과를 하기 표 2 에 나타낸다.

표 2 와 같이, L1 처리를 실시한 후에 γ 선 멸균 처리를 실시한 플레이트는, Hek293 세포가 부착되지 않는 것이 나타났다. 이때, 부착되지 않은 세포는 웰 내에서 세포 응집괴 (스페로이드) 를 형성하고 있었다.

＜시험예 3 : 표면 처리제를 코팅한 세포 배양 플레이트의 세포 접착 억제 효과 3＞

(코팅 플레이트의 조제)

실시예 1 에 나타낸 코팅법에 의해 U 자 바닥 96 웰 세포 배양 플레이트 (BD 바이오사이언스사 제조, ＃353227) 의 웰을, 표면 처리제 L1 또는 L2 로 코팅하였다. 이때, γ 선 멸균은 실시하지 않았다. 음성 대상으로는, 코팅 처리를 하지 않은 플레이트를 사용하였다. 양성 대조의 샘플로는, 시판되는 세포 저접착 플레이트 (스미토모 베이클라이트사 제조, ＃MS-9096U) 를 사용하였다.

(세포의 조제)

세포는, 인간 간암 세포주 HepG2 (DS 파마바이오메디칼사 제조) 를 사용하였다. 본 세포의 배양에는, 10 ％ (v/v) FBS 를 포함하는 DMEM 배지 (WAKO 사 제조) 를 사용하였다. 세포는, 37 ℃ CO₂ 인큐베이터 내에서 5 ％ 이산화탄소 농도를 유지한 상태에서, 직경 10 ㎝ 의 샬레 (배지 10 ㎖) 를 이용하여 2 일간 이상 정치 배양하였다. 계속해, 본 세포를 PBS 5 ㎖ 로 세정한 후, 트립신-EDTA 용액 (인비트로젠사 제조) 1 ㎖ 를 첨가하여 세포를 벗기고, 상기 배지 10 ㎖ 로 각각 현탁하였다. 본 현탁액을 원심분리 (쿠보타 상사 주식회사 제조, 제품번호 5900, 1500 rpm/3 분, 실온) 후, 상청을 제거하고, 상기 배지 혹은 종농도 0.015 ％ (w/v) 의 탈아실화 젤란검을 첨가한 배지를 이용하여 세포 현탁액을 각각 조제하였다. 여기서, 0.015 ％ (w/v) 의 탈아실 젤란검을 첨가한 배지는 이하와 같이 조제하였다. 즉, 탈아실화 젤란검 (KELCOGEL CG-LA, 산쇼 주식회사 제조) 을 0.3 ％ (w/v) 가 되도록 초순수 (Milli-Q 수) 에 현탁한 후, 90 ℃ 에서 가열하면서의 교반에 의해 용해하고, 본 수용액을 121 ℃ 에서 20 분 오토클레이브 멸균하였다. 본 용액을 10 ％ (v/v) FBS 를 포함하는 DMEM 배지 (WAKO 사 제조) 에 종농도 0.015 ％ (w/v) 의 탈아실화 젤란검이 되도록 충분히 교반하면서 첨가하였다.

(세포 부착 실험)

상기에서 조제한 플레이트에 대하여, 각각의 세포 현탁액을 2 × 10³ cells/well 이 되도록 각 100 ㎕ 첨가하였다. 그 후, 5 ％ 이산화탄소 농도를 유지한 상태에서, 37 ℃ 에서 5 일간 CO₂ 인큐베이터 내에서 정치하였다.

(세포 부착의 관찰)

배양 5 일간 후, 표면 처리제 L1 또는 L2 로 코팅한 U 자 바닥 96 웰 타이터 플레이트, 음성 대조, 양성 대조에 대한 세포의 부착을 도립형 현미경 (올림푸스사 제조, CKX31) 에 의한 관찰에 근거하여 비교하였다. 그 결과를 하기 표 3 에 나타낸다. 또, 세포 관찰의 대표예로서 표면 처리제 L1 로 코팅한 플레이트에서 배양한 HepG2 세포의 현미경 사진 (배율 : 40 배) 을 도 2 에 나타낸다.

표 3 및 도 2 와 같이, L1 및 L2 처리를 실시한 플레이트는, 양성 대조와 마찬가지로 어느 세포의 경우도 세포가 부착되지 않는 것이 나타났다. 이때, 도 2 와 같이, 부착되지 않은 세포는 웰 바닥의 중앙 부근에서 세포 응집괴 (스페로이드) 를 형성하고 있었다. 또한, 탈아실화 젤란검을 첨가한 배지를 사용하면 무첨가에 비하여 세포 응집괴의 크기가 작아지고, 또한 분산되는 것도 나타났다.

산업상 이용가능성

본 발명의 세포 배양 용기는, 특정 유기기를 포함하는 공중합체로 표면의 적어도 일부가 코팅되어 있다. 이러한 코팅은, 세포의 용기 표면 (벽면) 에 대한 부착을 억제함과 함께, 코팅이 용기 표면에 강고하게 고착할 수 있으므로, 코팅의 배양액으로의 용출의 억제나 방사선 내성이 개선되어 있다. 따라서, 본 발명의 세포 배양 용기는, 용기로부터의 자극이 없는 상태에서 세포 응집괴를 배양할 수 있는 점에서 유리하다.

Claims

하기 식 (a) 로 나타내는 유기기를 포함하는 반복 단위와, 하기 식 (b) 로 나타내는 유기기를 포함하는 반복 단위를 포함하는 공중합체 :
[화학식 1]

(식 중,
U^a1, U^a2, U^b1, U^b2 및 U^b3 은, 각각 독립적으로, 수소 원자 또는 탄소 원자수 1 내지 5 의 직사슬 혹은 분기 알킬기를 나타내고, 그리고 An^- 는, 할로겐화물 이온, 무기산 이온, 수산화물 이온 및 이소티오시아네이트 이온으로 이루어지는 군에서 선택되는 음이온을 나타냄)
가 표면에 코팅되고, -200 ℃ ~ 180 ℃ 에서 건조시킨 것인 것을 특징으로 하는, 세포의 용기 표면에 대한 부착이 억제된 세포 배양 용기.
제 1 항에 있어서,
상기 식 (a) 및 (b) 로 나타내는 유기기를 포함하는 반복 단위가, 각각, 하기 식 (A) 및 (B) :
[화학식 2]

(식 중,
T^a, T^b, U^a1, U^a2, U^b1, U^b2 및 U^b3 은, 각각 독립적으로, 수소 원자 또는 탄소 원자수 1 내지 5 의 직사슬 혹은 분기 알킬기를 나타내고, Q^a 및 Q^b 는, 각각 독립적으로, 단결합, 에스테르 결합 또는 아미드 결합을 나타내고, R^a 및 R^b 는, 각각 독립적으로, 할로겐 원자로 치환되어 있어도 되는 탄소 원자수 1 내지 10 의 직사슬 또는 분기 알킬렌기를 나타내고, An^- 는, 할로겐화물 이온, 무기산 이온, 수산화물 이온 및 이소티오시아네이트 이온으로 이루어지는 군에서 선택되는 음이온을 나타내고, 그리고 m 은, 0 내지 6 의 정수를 나타냄)
로 나타내는 모노머로부터 유도되는 반복 단위인, 세포 배양 용기.
제 2 항에 있어서,
m 이 1 이고, R^a 및 R^b 가, 각각 독립적으로, 에틸렌기 또는 프로필렌기를 나타내는, 세포 배양 용기.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 공중합체가, 추가로 하기 식 (C) 또는 (D) :
[화학식 3]

(식 중,
T^c, T^d 및 U^d 는, 각각 독립적으로, 수소 원자 또는 탄소 원자수 1 내지 5 의 직사슬 혹은 분기 알킬기를 나타내고, R^c 및 R^d 는, 각각 독립적으로, 할로겐 원자로 치환되어 있어도 되는 탄소 원자수 1 내지 10 의 직사슬 또는 분기 알킬렌기를 나타냄)
로 나타내는 모노머로부터 유도되는 가교 구조를 포함하는, 세포 배양 용기.
제 4 항에 있어서,
T^c 및 T^d 가, 각각 독립적으로, 수소 원자 또는 메틸기를 나타내고, U^d 가, 수소 원자를 나타내고, R^c 및 R^d 가, 각각 독립적으로, 에틸렌기 또는 프로필렌기를 나타내는, 세포 배양 용기.
하기 식 (a) 로 나타내는 유기기를 포함하는 반복 단위와, 하기 식 (b) 로 나타내는 유기기를 포함하는 반복 단위를 포함하는 공중합체 :
[화학식 4]

(식 중, U^a1, U^a2, U^b1, U^b2 및 U^b3 은, 각각 독립적으로, 수소 원자 또는 탄소 원자수 1 내지 5 의 직사슬 혹은 분기 알킬기를 나타내고, 그리고 An^- 는, 할로겐화물 이온, 무기산 이온, 수산화물 이온 및 이소티오시아네이트 이온으로 이루어지는 군에서 선택되는 음이온을 나타냄)
를, 용기의 표면의 적어도 일부에 코팅하는 공정 ; 및
코팅된 세포 배양 용기를 -200 ℃ 내지 180 ℃ 에서 건조시키는 공정을 포함하는, 세포의 용기 표면에 대한 부착이 억제된 세포 배양 용기의 제조 방법.
제 6 항에 있어서,
상기 식 (a) 및 (b) 로 나타내는 유기기를 포함하는 반복 단위가, 각각, 하기 식 (A) 및 (B) :
[화학식 5]

(식 중,
T^a, T^b, U^a1, U^a2, U^b1, U^b2 및 U^b3 은, 각각 독립적으로, 수소 원자 또는 탄소 원자수 1 내지 5 의 직사슬 혹은 분기 알킬기를 나타내고, Q^a 및 Q^b 는, 각각 독립적으로, 단결합, 에스테르 결합 또는 아미드 결합을 나타내고, R^a 및 R^b 는, 각각 독립적으로, 할로겐 원자로 치환되어 있어도 되는 탄소 원자수 1 내지 10 의 직사슬 또는 분기 알킬렌기를 나타내고, An^- 는, 할로겐화물 이온, 무기산 이온, 수산화물 이온 및 이소티오시아네이트 이온으로 이루어지는 군에서 선택되는 음이온을 나타내고, 그리고 m 은, 0 내지 6 의 정수를 나타냄)
로 나타내는 모노머로부터 유도되는 반복 단위인, 제조 방법.
제 6 항에 있어서,
코팅 공정이, 공중합체를 포함하는 바니시를 이용하여 실시되는, 제조 방법.
제 8 항에 있어서,
공중합체를 포함하는 바니시가, 미리 pH 조정되어 있는, 제조 방법.
제 6 항에 있어서,
추가로, 코팅된 세포 배양 용기를, 건조 공정 전 및/또는 후에, 세정하는 공정을 포함하는, 제조 방법.
제 10 항에 있어서,
건조 공정 후의 세정이, 물 및 전해질을 포함하는 수용액으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 용매를 이용하여 실시되는, 제조 방법.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 기재된 세포 배양 용기 또는 제 6 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 기재된 제조 방법에 의해 제조된 세포 배양 용기를 사용하는 것을 특징으로 하는, 세포 응집괴(塊)의 제조 방법.
제 12 항에 있어서,
세포 배양 용기 중의 배지가, 세포 또는 조직을 부유시키는 효과를 갖는 다당류를 포함하는 것을 특징으로 하는, 세포 응집괴의 제조 방법.
제 13 항에 있어서,
다당류가 탈아실화 젤란검인 것을 특징으로 하는, 세포 응집괴의 제조 방법.