CN112567021A - 作为细胞培养的基底膜使用的聚合物的制造方法及细胞培养容器 - Google Patents

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Abstract

提供作为细胞培养的基底膜使用的聚合物的制造方法、细胞培养的基底膜形成剂、基底膜及细胞培养容器的制造方法。作为细胞培养的基底膜使用的聚合物的制造方法，其包括下述工序：制备工序，制备含有下式(I)表示的单体、自由基聚合引发剂及有机溶剂的混合物；及聚合工序，将所述混合物升温、搅拌，使单体聚合从而制备聚合物。[式(I)中，Ua1及Ua2各自独立地表示氢原子或者碳原子数1至5的直链或支链烷基，Ra1表示氢原子或者碳原子数1至5的直链或支链烷基，Ra2表示碳原子数1至5的直链或支链亚烷基]。

Description

作为细胞培养的基底膜使用的聚合物的制造方法及细胞培养 容器
技术领域
本发明涉及作为细胞培养的基底膜使用的聚合物的制造方法及具有所述基底膜的细胞培养容器的制造。
背景技术
甲基丙烯酸2-N,N-二甲基氨基乙酯(DMAEMA)的聚合物即聚(甲基丙烯酸2-N,N-二甲基氨基乙酯)(PDMAEMA)作为具有约32℃的浊点的温度响应性聚合物而为人所知。
以往的PDMAEMA的制造方法中，制备含有DMAEMA的混合物(制备工序)，然后向该混合物照射紫外线(照射工序)而使DMAEMA进行自由基聚合，由此制造PDMAEMA。
此处，也存在将键合于PDMAEMA的侧链的、含有阳离子性的2-N,N-二甲基氨基乙基的酯基的一部分通过水解转化为阴离子性的羧基来制造改变了物性的来源于PDMAEMA的聚合物的需求。
然而，使用上述以往的PDMAEMA的制造方法制造具有阳离子性的2-N,N-二甲基氨基乙基及阴离子性的羧基的来源于PDMAEMA的聚合物的情况下，存在下述问题：通过向在侧链介由酯基而具有阳离子性的2-N,N-二甲基氨基乙基的DMAEMA照射紫外线使其进行自由基聚合后，由于需要通过将酯基的一部分水解来产生阴离子性的羧基，制造所需要的工序较多，并且水解的比率难以控制，进而难以控制分子量。
为了解决上述问题，专利文献1中，报道了通过在水存在下向DMAEMA照射紫外线使其进行自由基聚合来制造具有阳离子性官能团及阴离子性官能团的、来源于聚(甲基丙烯酸2-N,N-二甲基氨基乙酯)的聚合物(例如，参见专利文献1)。
然而，使用上述PDMAEMA的制造方法的情况下，仍然存在难以控制阳离子性官能团与阴离子性官能团的比例、并且难以控制分子量的课题，还存在作为阴离子性官能团仅能使用将DMAEMA水解而得的甲基丙烯酸的问题。
专利文献2中，报道了通过在不存在水的条件下向DMAEMA照射紫外线来制备PDMAEMA，然后引入阴离子性单体并进行紫外线照射来制造具有DMAEMA嵌段排列和DMAEMA与阴离子性单体的无规排列的聚合物。上述制造方法中能够赋予阴离子性官能团的选择性(例如，参见专利文献2)。
然而，使用上述的制造方法的情况下，仍然难以控制阳离子性官能团与阴离子性官能团的比例，并且难以控制分子量、分子量分布。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2014-162865号公报
专利文献2：日本特开2017-14323号公报
非专利文献
非专利文献1：Wetering P等，J Controlled Release 49,p59-69,1997.
非专利文献2：Wetering P等，Macromolecules 31,p8063-8068,1998.
发明内容
发明所要解决的课题
本发明的目的为，不依赖于紫外线这样的光照射，从具有阳离子性官能团的单体、优选还具有阴离子性官能团的单体在控制分子量、分子量分布的情况下、优选在控制阳离子性官能团与阴离子性官能团的比例的情况下简便地制造来源于聚(甲基丙烯酸2-N,N-二甲基氨基乙酯)的聚合物，以及提供含有上述聚合物的细胞培养的基底膜、细胞培养的基底膜形成剂及细胞培养容器。
用于解决课题的手段
即，本发明如下所述：
[1]
作为细胞培养的基底膜使用的聚合物的制造方法，其包括下述工序：
制备工序，制备含有下式(I)表示的单体、自由基聚合引发剂及有机溶剂的混合物；及
聚合工序，将所述混合物升温、搅拌，使单体聚合从而制备聚合物，
[化学式1]
Figure BDA0002940668610000031
[式(I)中，
Ua1及Ua2各自独立地表示氢原子或者碳原子数1至5的直链或支链烷基，Ra1表示氢原子或者碳原子数1至5的直链或支链烷基，Ra2表示碳原子数1至5的直链或支链亚烷基]。
[2]
如[1]所述的聚合物的制造方法，其中，在所述混合物中还含有式(II)表示的单体，
[化学式2]
Figure BDA0002940668610000032
[式(II)中，
Rb表示氢原子或者碳原子数1至5的直链或支链烷基]。
[3]
如[1]或[2]所述的聚合物的制造方法，其中，在所述混合物中还含有具有2个以上碳-碳不饱和键的单体。
[4]
如[3]所述的聚合物的制造方法，其中，所述具有2个以上碳-碳不饱和键的单体为下式(III)表示的单体，
[化学式3]
Figure BDA0002940668610000041
[式(III)中，
Rc及Rd各自独立地表示氢原子或者碳原子数1至5的直链或支链烷基，Re表示碳原子数1至5的直链或支链亚烷基，n表示1～50的数字]。
[5]
如[1]～[4]中任一项所述的聚合物的制造方法，其中，所述聚合物中的来自式(I)表示的单体的单元/来自式(II)表示的单体的单元的摩尔比为100/0～50/50。
[6]
如[1]～[5]中任一项所述的聚合物的制造方法，其中，聚合物的重均分子量(Mn)为20,000～1,000,000，且聚合物的重均分子量(Mw)与所述数均分子量(Mn)之比(Mw/Mn)为1.01～10.00。
[7]
如[1]～[6]中任一项所述的聚合物的制造方法，其中，所述聚合物作为用于在使细胞粘附后使其剥离而得到细胞凝集块的细胞培养的基底膜使用。
[8]
细胞培养的基底膜形成剂的制造方法，其包括将通过[1]～[7]中任一项所述的制造方法得到的聚合物、与含水溶液混合的工序。
[9]
细胞培养的基底膜的制造方法，其包括将通过[8]所述的制造方法得到的细胞培养的基底膜形成剂涂布于容器或基板的表面并进行干燥的工序。
[10]
如[9]所述的细胞培养的基底膜的制造方法，其中，在所述涂布·干燥工序之前，还包括将含有下述共聚物和溶剂的涂覆膜形成用组合物涂布于容器或基板的表面并进行干燥的工序，所述共聚物含有包含下式(a)表示的有机基团的重复单元、和包含下式(b)表示的有机基团的重复单元：
[化学式4]
Figure BDA0002940668610000051
Figure BDA0002940668610000052
或者
Figure BDA0002940668610000053
[式(a)、式(b)中，
Ua11、Ua12、Ub11、Ub12及Ub13各自独立地表示氢原子或者碳原子数1至5的直链或支链烷基，An-表示选自由卤化物离子、无机酸根离子、氢氧化物离子及异硫氰酸根离子组成的组中的阴离子]。
[11]
如[9]所述的细胞培养的基底膜的制造方法，其中，所述容器或基板具有抑制细胞附着的能力。
[12]
细胞培养容器的制造方法，其包括将通过[8]所述的制造方法得到的细胞培养的基底膜形成剂涂布于容器或基板的表面并进行干燥的工序。
[13]
如[12]所述的细胞培养容器的制造方法，其中，在所述涂布·干燥工序之前，还包括将含有下述共聚物和溶剂的涂覆膜形成用组合物涂布于容器或基板的表面并进行干燥的工序，所述共聚物含有包含下式(a)表示的有机基团的重复单元、和包含下式(b)表示的有机基团的重复单元，
[化学式5]
Figure BDA0002940668610000061
Figure BDA0002940668610000062
或者
Figure BDA0002940668610000063
[式(a)、式(b)中，
Ua11、Ua12、Ub11、Ub12及Ub13各自独立地表示氢原子或者碳原子数1至5的直链或支链烷基，An-表示选自由卤化物离子、无机酸根离子、氢氧化物离子及异硫氰酸根离子组成的组中的阴离子]。
[14]
如[12]所述的细胞培养容器的制造方法，其中，所述容器或基板具有抑制细胞附着的能力。
[15]
细胞凝集块的制造方法，其中，使用含有来自下式(I)表示的单体的单元的聚合物作为细胞培养的基底膜，
[化学式6]
Figure BDA0002940668610000071
[式(I)中，
Ua1及Ua2各自独立地表示氢原子或者碳原子数1至5的直链或支链烷基，Ra1表示氢原子或者碳原子数1至5的直链或支链烷基，Ra2表示碳原子数1至5的直链或支链亚烷基]。
[16]
如[15]所述的细胞凝集块的制造方法，其中，所述聚合物为还含有来自式(II)表示的单体的单元的共聚物，
[化学式7]
Figure BDA0002940668610000072
[式(II)中，
Rb表示氢原子或者碳原子数1至5的直链或支链烷基]。
[17]
下述聚合物的、作为用于在使细胞粘附后使其剥离而得到细胞凝集块的细胞培养的基底膜的用途，所述聚合物含有来自下式(I)表示的单体的单元，
[化学式8]
Figure BDA0002940668610000081
[式(I)中，
Ua1及Ua2各自独立地表示氢原子或者碳原子数1至5的直链或支链烷基，Ra1表示氢原子或者碳原子数1至5的直链或支链烷基，Ra2表示碳原子数1至5的直链或支链亚烷基]。
[18]
如[17]所述的作为用于在使细胞粘附后使其剥离而得到细胞凝集块的细胞培养的基底膜的用途，其中，所述聚合物为还含有来自式(II)表示的单体的单元的共聚物，
[化学式9]
Figure BDA0002940668610000082
[式(II)中，
Rb表示氢原子或者碳原子数1至5的直链或支链烷基]。
发明效果
根据本申请发明，能够不依赖于紫外线这样的光照射而从具有阳离子性官能团的单体、优选还具有阴离子性官能团的单体在控制分子量、分子量分布的情况下、进而在任意控制阳离子性官能团与阴离子性官能团的比例的情况下简便地制造来源于聚(甲基丙烯酸2-N,N-二甲基氨基乙酯)的聚合物。通过在控制分子量的情况下制造，能够容易地提高针对基材的涂布性。
附图说明
[图1]为示出实施例2的(涂布膜的表面形状观察)中、合成例3及合成例8的聚合物的利用触针式膜厚仪的表面形状测定结果的图。
[图2]为实施例4的(4-3.细胞附着实验)中、观察具有合成例3及合成例4的聚合物作为基底膜的聚合物涂覆板上的粘附细胞的情况而得的照片。
[图3]为实施例4的(4-4.细胞凝集块的观察)中、观察具有合成例3及合成例4的聚合物作为基底膜的聚合物涂覆板上的细胞凝集块的情况而得的照片。
[图4]为实施例5的(5-3.细胞附着实验)中、观察具有合成例1、10、11及12的聚合物作为基底膜的聚合物涂覆皿中的细胞的情况而得的照片。
[图5]为实施例5的(5-4.细胞凝集块的观察)中、观察具有合成例1、10、11及12的聚合物作为基底膜的聚合物涂覆皿中的细胞凝集块的情况而得的照片。
具体实施方式
[作为细胞培养的基底膜使用的聚合物]
本申请的作为细胞培养的基底膜使用的聚合物是通过将下式(I)表示的阳离子性单体聚合而得到的，
[化学式10]
Figure BDA0002940668610000091
[式(I)中，
Ua1、Ua2各自独立地表示氢原子或者碳原子数1至5的直链或支链烷基，Ra1表示氢原子或者碳原子数1至5的直链或支链烷基，Ra2表示碳原子数1至5的直链或支链亚烷基]。
上述聚合物优选为通过将下式(II)表示的阴离子性单体与上述式(I)表示的阳离子性单体一同进行聚合而得到的共聚物，
[化学式11]
Figure BDA0002940668610000101
[式(II)中，
Rb表示氢原子或者碳原子数1至5的直链或支链烷基]。
本说明书中，只要没有其他定义，则作为“碳原子数1至5的直链或支链烷基”，可举出例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、1-甲基丁基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、2,2-二甲基丙基或1-乙基丙基。
Ra1及Rb优选各自独立地选自氢原子及甲基。
Ua1及Ua2优选各自独立地选自氢原子、甲基、乙基、正丙基、异丙基及正丁基，优选为甲基或乙基，最优选甲基。
本说明书中，只要没有其他定义，则作为“碳原子数1至5的直链或支链亚烷基”，可举出例如亚甲基、亚乙基、亚丙基、三亚甲基、四亚甲基、1-甲基亚丙基、2-甲基亚丙基、二甲基亚乙基、乙基亚乙基、五亚甲基、1-甲基-四亚甲基、2-甲基-四亚甲基、1,1-二甲基-三亚甲基、1,2-二甲基-三亚甲基、2,2-二甲基-三亚甲基、1-乙基-三亚甲基等。上述之中，作为Ra2，优选选自亚乙基及亚丙基。
因此，作为上述式(I)表示的阳离子性单体，可举出甲基丙烯酸2-N,N-二甲基氨基乙酯、N-异丙基丙烯酰胺等，优选甲基丙烯酸2-N,N-二甲基氨基乙酯。作为上述式(II)表示的阴离子性单体，可举出丙烯酸、甲基丙烯酸等，优选甲基丙烯酸。
上述聚合物中的来自式(I)表示的单体的单元/来自式(II)表示的单体的单元的摩尔比为100/0～50/50。优选为98/2～50/50。更优选为98/2～60/40，特别优选为98/2～70/30。
这是因为，式(II)的摩尔比为51以上时，聚合物的阴离子性变得过强，细胞的粘附力降低。
(具有2个以上碳-碳不饱和键的单体)
上述聚合物可以是进一步将具有2个以上碳-碳不饱和键的单体与式(I)/式(II)表示的单体一同进行聚合而得到的聚合物。所谓具有2个以上碳-碳不饱和键的单体，具体而言，为具有2个以上碳-碳双键的单体，例如可举出多官能丙烯酸酯化合物、多官能丙烯酰胺化合物、多官能聚酯、或异戊二烯化合物等。
作为优选具体例，可举出下式(III)～(V)表示的单体。
[化学式12]
Figure BDA0002940668610000111
[化学式13]
Figure BDA0002940668610000112
[化学式14]
Figure BDA0002940668610000113
式(III)～(V)中，Rc及Rd各自独立地表示氢原子或者碳原子数1至5的直链或支链烷基，Re表示碳原子数1至5的直链或支链亚烷基，n表示1～50的数字。上述之中，优选式(III)表示的单体。
相对于上述聚合物总体而言的式(III)～(V)表示的单体的摩尔比优选为0～5.0％。进一步优选为0～3.0％。
这是因为，式(III)～(V)的摩尔比为5.0％以上时，存在过度交联所引起的聚合物量化导致在制造中凝胶化、使制造变得困难的可能性。
Rc及Rd优选各自独立地选自氢原子及甲基。
Re优选选自亚甲基、亚乙基及亚丙基，最优选亚乙基。
n为1～50的数字，n优选为1～30的数字，n优选为1～10的数字。
相对于上述聚合物总体而言的式(II)表示的单体所占的摩尔％的值、与相对于上述制备工序时的单体投料量总体而言的式(II)表示的单体所占的摩尔％的值之差为0～10摩尔％。对于本申请的聚合物而言，基于后述的制造方法，单体投料比与制得的聚合物的实测值之差少，为0～10摩尔％。进一步优选为0～8摩尔％。
上述聚合物的数均分子量(Mn)为20,000～1,000,000，进一步优选为50,000～800,000。
上述聚合物的重均分子量(Mw)与上述数均分子量(Mn)之比(Mw/Mn)为1.01～10.00，优选为1.2～8.0，优选为1.4～6.0，优选为1.5～5.0，优选为1.6～4.5。
上述数均分子量(Mn)和数均分子量(Mn)可通过例如实施例中记载的凝胶过滤色谱法(Gel Filtration Chromatography)求出。
通过利用本申请的聚合物，能够在使细胞粘附后使其剥离而形成细胞凝集块。需要说明的是，所谓细胞凝集块，表示由于细胞凝集而形成的结构体，不限于球状、环状等这样的形状。与以往在细胞低粘附板上通过非粘附培养制作的细胞凝集块相比，在通过规定粘附面积来调节细胞凝集块的大小(能制造任意大小的细胞凝集块)等方面是有利的。
[作为细胞培养的基底膜形成剂使用的聚合物的制造方法]
本申请的聚合物可通过热聚合法来制造。例如将上述式(I)的单体溶解于有机溶剂中，添加自由基聚合引发剂，根据需要而在之后加入上述式(II)、进而根据需要加入具有2个以上碳-碳不饱和键的单体(式(III)～(V)表示的单体等)制成混合物后，充分地搅拌使其变得均匀，然后在氮气气流下升温至例如51℃以上、例如51～180℃、51～150℃、51～130℃、51～100℃、例如溶剂的回流温度(例如四氢呋喃为66～85℃)，搅拌例如1～48小时，由此可得到聚合物(聚合物)。可将得到的聚合物通过再沉淀、透析进行纯化。
一实施方式中，可通过包括下述工序的制造方法进行制备：将上述式(I)的单体溶解于溶剂中，添加聚合引发剂，根据需要而在之后加入上述式(II)的单体，在溶剂中按两种化合物的合计浓度为0.01质量％至40质量％使其反应(聚合)。
作为上述聚合中使用的有机溶剂，可举出例如四氢呋喃、1,4-二氧杂环己烷等醚溶剂、甲醇、乙醇、异丙醇等碳原子数1至4的脂肪族醇溶剂、甲苯等芳香族烃溶剂或者它们的混合溶剂。
为了使聚合反应高效地进行，期望使用自由基聚合引发剂。作为自由基聚合引发剂的例子，可举出1,1’-偶氮双(1-环己烷甲酸)二甲酯(VE-073，FUJIFILM Wako PureChemical Corporation制)、2,2’-偶氮双(2,4-二甲基戊腈)(V-65，FUJIFILM Wako PureChemical Corporation制)、2,2’-偶氮双(异丁腈)(AIBN，FUJIFILM Wako Pure ChemicalCorporation制)、2,2’-偶氮双[N-(2-羧基乙基)-2-甲基丙脒]n水合物(VA-057，FUJIFILMWako Pure Chemical Corporation制)、2,2’-(N-丁基-2-甲基丙酰胺)(VAm-110，FUJIFILMWako Pure Chemical Corporation制)等偶氮聚合引发剂。
作为聚合引发剂的添加量，相对于聚合中使用的单体的合计重量而言，为0.05质量％～5质量％。
聚合引发剂的使用不仅能实现聚合反应的高效化，还能通过末端官能团的修饰来调节聚合物物性。
[细胞培养的基底膜形成剂的制造方法]
通过本身已知的方法将含水溶液与上述聚合物混合，可制造细胞培养的基底膜形成剂。
所谓含水溶液，可举出水、生理盐水或磷酸缓冲溶液等含有盐的水溶液、或者将水或含有盐的水溶液与醇组合而得的混合溶剂。作为醇，可举出碳原子数2至6的醇、例如乙醇、丙醇、异丙醇、1-丁醇、2-丁醇、异丁醇、叔丁醇、1-戊醇、2-戊醇、3-戊醇、1-庚醇、2-庚醇、2,2-二甲基-1-丙醇(＝新戊醇)、2-甲基-1-丙醇、2-甲基-1-丁醇、2-甲基-2-丁醇(＝叔戊醇)、3-甲基-1-丁醇、3-甲基-3-戊醇、环戊醇、1-己醇、2-己醇、3-己醇、2,3-二甲基-2-丁醇、3,3-二甲基-1-丁醇、3,3-二甲基-2-丁醇、2-乙基-1-丁醇、2-甲基-1-戊醇、2-甲基-2-戊醇、2-甲基-3-戊醇、3-甲基-1-戊醇、3-甲基-2-戊醇、3-甲基-3-戊醇、4-甲基-1-戊醇、4-甲基-2-戊醇、4-甲基-3-戊醇及环己醇，可单独使用或使用它们的组合的混合溶剂。
此外，对于基底膜形成剂而言，除了上述共聚物和溶剂之外，还可根据需要而在不损害得到的基底膜的性能的范围内添加其他物质。作为其他物质，可举出pH调节剂、交联剂、防腐剂、表面活性剂、提高与容器或基板的密合性的底漆、防霉剂及糖类等。
[细胞培养的基底膜的制造方法、细胞培养容器的制造方法、细胞培养容器]
通过将上述细胞培养的基底膜形成剂涂布于容器或基板的表面并进行干燥，可制造细胞培养的基底膜、包含该基底膜的细胞培养容器。此处，所谓“表面”，是指与细胞或细胞培养液等内容物接触的面。
作为容器或基板，例如，可举出细胞的培养中通常使用的陪替氏培养皿(PetriDish)、组织培养用皿、多皿等培养皿或皿、细胞培养瓶、旋转瓶等烧瓶、塑料袋、特氟龙(注册商标)袋、培养袋等袋、微量板、微孔板、多板、多孔板等板、腔室载玻片(chamber slide)、管、盘、滚瓶等瓶等。优选可举出培养皿或皿、板、盘。
另外，容器或基板的材质可举出例如玻璃、金属、含有金属的化合物或含有半金属的化合物、活性炭或树脂。金属可举出典型金属：(碱金属：Li、Na、K、Rb、Cs；碱土金属：Ca、Sr、Ba、Ra)、镁族元素：Be、Mg、Zn、Cd、Hg；铝族元素：Al、Ga、In；稀土类元素：Y、La、Ce、Pr、Nd、Sm、Eu；锡族元素：Ti、Zr、Sn、Hf、Pb、Th；铁族元素：Fe、Co、Ni；酸土元素：V、Nb、Ta、铬族元素：Cr、Mo、W、U；锰族元素：Mn、Re；贵金属：Cu、Ag、Au；铂族元素：Ru、Rh、Pd、Os、Ir、Pt等。含有金属的化合物或含有半金属的化合物可举出例如基本成分为金属氧化物、通过高温下的热处理而烧结成的烧结体即陶瓷、硅这样的半导体、金属氧化物或半金属氧化物(硅氧化物、氧化铝等)、金属碳化物或半金属碳化物、金属氮化物或半金属氮化物(硅氮化物等)、金属硼化物或半金属硼化物等无机化合物的成型体等无机固体材料、铝、镍钛、不锈钢(SUS304、SUS316、SUS316L等)。
作为树脂，可以是天然树脂或其衍生物、或者合成树脂中的任一者，作为天然树脂或其衍生物，可优选使用纤维素、三乙酸纤维素(CTA)、硝基纤维素(NC)、固定了硫酸葡聚糖的纤维素等，作为合成树脂，可优选使用聚丙烯腈(PAN)、聚酯系聚合物合金(PEPA)、聚苯乙烯(PS)、聚砜(PSF)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚乙烯醇(PVA)、聚氨酯(PU)、乙烯乙烯醇(EVAL)、聚乙烯(PE)、聚酯、聚丙烯(PP)、聚偏二氟乙烯(PVDF)、聚醚砜(PES)、聚碳酸酯(PC)、聚氯乙烯(PVC)、聚四氟乙烯(PTFE)、超聚合物量聚乙烯(UHPE)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯树脂(ABS)或特氟龙(注册商标)。本发明的细胞培养容器的制造中，在将聚合物以存在于容器或基板的表面的至少一部分的方式进行涂覆时，不需要高温下的处理，因此也可应用耐热性低的树脂等。
容器或基板的材质可以是1种，也可以是2种以上的组合。这些材质中，优选为玻璃、硅、硅氧化物、聚苯乙烯(PS)、聚丙烯(PP)、聚醚砜(PES)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚碳酸酯(PC)、聚氯乙烯(PVC)、特氟龙(注册商标)、环烯烃聚合物(COP)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)或不锈钢(SUS304、SUS316、SUS316L等)单独、或选自它们中的组合，特别优选为玻璃、聚苯乙烯(PS)、聚丙烯(PP)、不锈钢(SUS304、SUS316、SUS316L等)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)。
作为本申请的细胞培养的基底膜形成剂的涂布的方式，可使用例如喷墨法(inkjet method)、丝网印刷法、狭缝涂布法、辊对辊(roll to roll)法等，优选使用喷墨法或丝网印刷等印刷技术实施。
作为其他涂布方法，可使用例如将该容器浸渍于上述基底膜形成剂中、将基底膜形成剂添加至容器中并静置规定时间、或将涂覆剂涂布于容器或基板的表面等方法，容器、作为一个方式的细胞培养容器的情况下，通过将基底膜形成剂添加至容器中并静置规定时间的方法来实施。添加可通过例如将容器的总容积的0.5至1倍量的基底膜形成剂使用注射器等添加来实施。静置根据容器或基板的材质、细胞培养的基底膜形成剂的种类而适宜选择时间、温度实施，例如，可于10至80℃实施1分钟至24小时、优选5分钟至3小时。由此，可制造在容器的表面的至少一部分、优选在容器的整个表面范围内具有细胞培养的基底膜的细胞培养容器。
另外，通过该方法得到的容器或基板的表面的细胞培养的基底膜可在使其与上述容器或基板的表面的至少一部分接触的工序后、优选在添加细胞培养的基底膜形成剂并静置规定时间的工序后，不经由干燥工序而直接作为细胞培养容器使用，或者在使用水或供于细胞培养的试样的媒介物(例如，水、缓冲液、培养基等)的清洗后作为细胞培养容器使用。
即，可在与上述容器或基板的表面的至少一部分接触的工序后、优选在添加细胞培养的基底膜形成剂并静置规定时间的工序后，在48小时以内、优选24小时以内、进一步优选12小时以内、进一步优选6小时以内、进一步优选3小时以内、进一步优选1小时以内不经由干燥工序而直接作为细胞培养容器使用，或者在使用水或供于细胞培养的试样的媒介物(例如，水、缓冲液、培养基等，特别优选培养基(例如，DMEM培养基(杜氏改良Eagle培养基))清洗后作为细胞培养容器使用。
容器可供于干燥工序。干燥工序在大气下或真空下、优选于-200℃至200℃的温度范围内实施。通过干燥工序去除上述基底膜形成剂中的溶剂，从而完全固定于基体。
基底膜也可利用例如室温(10℃至35℃，优选为20℃至30℃、例如25℃)的干燥而形成，为了更快速地形成基底膜，可于例如40℃至50℃进行干燥。干燥温度低于-200℃时，必须使用非常规的制冷剂，欠缺通用性，并且，为了使溶剂升华，干燥需要长时间，效率差。干燥温度高于200℃时，会发生聚合物的热分解。更优选的干燥温度为10℃至180℃，更优选的干燥温度为20℃至150℃。
本申请的细胞培养的基底膜可经由以上的简便的工序而制造。
另外，为了消除在细胞培养的基底膜中残留的杂质、未反应单体等，可实施利用选自水及含有电解质的水溶液中的至少1种溶剂进行清洗的工序。清洗期望为流水清洗或超声波清洗等。上述水及含有电解质的水溶液可以是例如在40℃至95℃的范围内经加热的水或含有电解质的水溶液。含有电解质的水溶液优选为PBS、生理盐水(仅含有氯化钠的水溶液)、杜氏磷酸盐缓冲生理盐水(Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline)、Tris缓冲生理盐水、HEPES缓冲生理盐水及Veronal缓冲生理盐水，特别优选为PBS。固定后，即使用水、PBS及醇等清洗，涂覆膜也不会溶出，牢固地固定于基体。
对于本申请的细胞培养的基底膜的膜厚而言，最大膜厚和最小膜厚为1～1000nm的范围，优选为5～500nm的范围。
在上述基底膜的涂布·干燥工序前，可对容器或基板施以细胞的附着抑制处理。具有抑制细胞附着的能力的容器或基板可经由例如涂布已知的具有抑制细胞附着的能力的涂覆膜形成用组合物的工序来制造。优选包括将下述涂覆膜形成用组合物作为具有抑制细胞附着的能力的涂覆膜形成组合物涂布于容器或基板的表面并进行干燥的工序，所述涂覆膜形成用组合物含有：
共聚物，其含有包含下式(a)表示的有机基团的重复单元、和包含下式(b)表示的有机基团的重复单元；和
溶剂，
[化学式15]
Figure BDA0002940668610000181
Figure BDA0002940668610000182
或者
Figure BDA0002940668610000183
[式(a)、式(b)中，
Ua11、Ua12、Ub11、Ub12及Ub13各自独立地表示氢原子或者碳原子数1至5的直链或支链烷基，An-表示选自由卤化物离子、无机酸根离子、氢氧化物离子及异硫氰酸根离子组成的组中的阴离子]。
碳原子数1至5的直链或支链烷基如上所述。
上述涂覆膜形成用组合物可使用例如WO2014/196650中记载的涂覆膜形成用组合物。
作为上述涂覆膜形成用组合物的涂布方法，没有特别限制，可使用通常的旋涂、浸渍涂布、溶剂流延法等涂布法。
上述涂覆膜的干燥工序在大气下或真空下、于-200℃至180℃的温度范围内实施。通过干燥工序，去除上述涂覆膜形成用组合物中的溶剂，并且上述共聚物的式(a)及式(b)彼此形成离子键而完全固定于基体。
上述涂覆膜也可利用例如室温(10℃至35℃，例如25℃)的干燥而形成，为了更快速地形成涂覆膜，可于例如40℃至50℃进行干燥。另外，也可利用基于冷冻干燥(freezedrying)法的极低温～低温(-200℃至-30℃左右)下的干燥工序。冷冻干燥被称为真空冷冻干燥，通常是用制冷剂将想要干燥的物体冷却，在真空状态下通过升华而将溶剂除去的方法。关于冷冻干燥中可使用的常规制冷剂，可举出干冰与甲醇的混合介质(-78℃)、液氮(-196℃)等。
干燥温度为-200℃以下时，必须使用非常规的制冷剂，欠缺通用性，并且，为了使溶剂升华，干燥需要长时间，效率差。干燥温度为200℃以上时，涂覆膜表面的离子键合反应过度进行，该表面丧失亲水性，无法发挥抑制生物材料附着的能力。更优选的干燥温度为10℃至180℃。进一步优选的干燥温度为25℃至150℃。
干燥后，为了消除在该涂覆膜上残留的杂质、未反应的单体等，进而为了调节膜中的共聚物的离子平衡，期望利用选自水及含有电解质的水溶液中的1种以上溶剂，通过流水清洗或超声波清洗等进行清洗。上述水及含有电解质的水溶液可以是例如在40℃至95℃的范围内经加热的水或含有电解质的水溶液。含有电解质的水溶液优选为PBS、生理盐水(仅含有氯化钠的水溶液)、杜氏磷酸盐缓冲生理盐水(Dulbecco’s Phosphate BufferedSaline)、Tris缓冲生理盐水、HEPES缓冲生理盐水及Veronal缓冲生理盐水，特别优选为PBS。固定后，即使用水、PBS及醇等清洗，涂覆膜也会不溶出，牢固地固定于基体。即使在形成的涂覆膜上附着有生物材料，也可随后通过水洗等容易地将其除去，形成有上述涂覆膜的基体表面具有抑制生物材料附着的能力。
上述涂覆膜的膜厚优选为5～1000nm，进一步优选为5～500nm。
另外，作为上述细胞培养容器，可使用市售的经过细胞低粘附处理的细胞培养皿、具有抑制细胞附着的能力的细胞培养器，可使用例如日本特开2008-61609号公报中记载的细胞培养容器，但不限于这些。
所谓具有抑制细胞附着的能力，是指通过例如WO2016/093293的实施例中记载的方法进行的、利用荧光显微镜与无涂覆膜、或无细胞低吸附处理进行比较的情况下的相对吸光度(WST O.D.450nm)(％)((实施例的吸光度(WST O.D.450nm))/(比较例的吸光度(WSTO.D.450nm)))为50％以下，优选为30％以下，进一步优选为20％以下。
[细胞凝集块的制造方法]
本申请的细胞凝集块的制造方法是在由含有来自下式(I)表示的单体的单元的聚合物得到的细胞培养的基底膜上，通过本身已知的方法、例如实施例中记载的方法来实施的细胞凝集块的制造方法，
[化学式16]
Figure BDA0002940668610000201
[式(I)中，
Ua1、Ua2各自独立地表示氢原子或者碳原子数1至5的直链或支链烷基，Ra1表示氢原子或者碳原子数1至5的直链或支链烷基，Ra2表示碳原子数1至5的直链或支链亚烷基]。
上述细胞培养的基底膜优选为由与来自式(I)表示的单体的单元一同、含有来自下式(II)表示的单体的单元的共聚物得到的基底膜，
[化学式17]
Figure BDA0002940668610000202
[式(II)中，
Rb表示氢原子或者碳原子数1至5的直链或支链烷基]。
实施例
以下，给出实施例更详细地具体说明本发明，但本发明不限于这些实施例。
＜分子量的测定方法＞
下述合成例所示的重均分子量是基于凝胶过滤色谱法(Gel FiltrationChromatography)(以下，简称为GFC)的结果。
(测定条件)
·装置：HLC-8320GPC(Tosoh(株)制)
·GFC色谱柱：TSKgel G6000+3000PWXL-CP
·流速：1.0ml/min
·洗脱液：含有盐的水/有机混合溶剂
·柱温：40℃
·检测器：RI
·进样浓度：聚合物固态成分为0.05质量％
·进样量：100μL
·标准曲线：三次拟合曲线
·标准试样：聚环氧乙烷(Agilent公司制)×10种
＜合成例1＞基于热聚合的作为细胞培养的基底膜形成剂使用的聚合物的制造(1)
向甲基丙烯酸2-(二甲基氨基)乙酯(东京化成工业(株)制)9.00g中加入四氢呋喃27.04g，充分地溶解。然后一边保持为20℃以下，一边向上述四氢呋喃溶液中添加1,1’-偶氮双(1-环己烷甲酸)二甲酯(VE-073，FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation制)0.01g。将充分搅拌至均匀的含有上述全部物质的混合液添加至带有冷凝管的三颈瓶中，在氮气气流下，一边搅拌一边升温至回流温度。在将上述环境维持了24小时的状态下加热搅拌，由此得到聚合物作为反应产物。使反应产物在作为不良溶剂的己烷中再沉淀，通过过滤回收析出物并进行减压干燥。使得到的粉体溶解于纯水中，将溶液移至透析管中。实施透析72小时，将反应产物纯化。
将含有反应产物的溶液使用玻璃纤维制的1.0μm过滤器(AS ONE公司制，型号：SYGF0605MNXX104)过滤，将得到的滤液冷冻干燥，由此得到了温度响应性均聚物(收量：6.4g，收率：71％)。基于GFC得到的该聚合物的重均分子量为250,000，多分散度为2.0(合成例聚合物1)。
＜合成例2＞基于热聚合的作为细胞培养的基底膜形成剂使用的聚合物的制造(2)
向甲基丙烯酸2-(二甲基氨基)乙酯(东京化成工业(株)制)9.00g中加入四氢呋喃37.10g，充分地溶解。然后一边保持为20℃以下，一边向上述四氢呋喃溶液中添加1,1’-偶氮双(1-环己烷甲酸)二甲酯(VE-073，FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation制)0.02g、甲基丙烯酸(东京化成工业(株)制)0.26g。将充分搅拌至均匀的含有上述全部物质的混合液添加至带有冷凝管的三颈瓶中，在氮气气流下，一边搅拌一边升温至回流温度。在将上述环境维持了24小时的状态下加热搅拌，由此得到聚合物作为反应产物。使反应产物在作为不良溶剂的己烷中再沉淀，通过过滤回收析出物并进行减压干燥。使得到的粉体溶解于纯水中，将溶液移至透析管中。实施透析72小时，将反应产物纯化。
将含有反应产物的溶液使用玻璃纤维制的1.0μm过滤器(AS ONE公司制，型号：SYGF0605MNXX104)过滤，将得到的滤液冷冻干燥，由此得到了温度响应性聚合物(收量：6.6g，收率：71％)。基于GFC得到的该聚合物的重均分子量为24,000，多分散度为2.0(合成例聚合物2)。
＜合成例3＞基于热聚合的作为细胞培养的基底膜形成剂使用的聚合物的制造(3)
向甲基丙烯酸2-(二甲基氨基)乙酯(东京化成工业(株)制)10.00g中加入四氢呋喃41.94g，充分地溶解。然后一边保持为20℃以下，一边向上述四氢呋喃溶液中添加1,1’-偶氮双(1-环己烷甲酸)二甲酯(VE-073，FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation制)0.01g、甲基丙烯酸(东京化成工业(株)制)0.48g。将充分搅拌至均匀的含有上述全部物质的混合液添加至带有冷凝管的三颈瓶中，在氮气气流下，一边搅拌一边升温至回流温度。在将上述环境维持了24小时的状态下加热搅拌，由此得到聚合物作为反应产物。使反应产物在作为不良溶剂的己烷中再沉淀，通过过滤回收析出物并进行减压干燥。使得到的粉体溶解于纯水中，将溶液移至透析管中。实施透析72小时，将反应产物纯化。
将含有反应产物的溶液使用玻璃纤维制的1.0μm过滤器(AS ONE公司制，型号：SYGF0605MNXX104)过滤，将得到的滤液冷冻干燥，由此得到了温度响应性聚合物(收量：7.3g，收率：69％)。基于GFC得到的该聚合物的重均分子量为290,000，多分散度为1.9(合成例聚合物3)。
＜合成例4＞基于热聚合的作为细胞培养的基底膜形成剂使用的聚合物的制造(4)
向甲基丙烯酸2-(二甲基氨基)乙酯(东京化成工业(株)制)9.00g中加入四氢呋喃38.26g，充分地溶解。然后一边保持为20℃以下，一边向上述四氢呋喃溶液中添加1,1’-偶氮双(1-环己烷甲酸)二甲酯(VE-073，FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation制)0.02g、甲基丙烯酸(东京化成工业(株)制)0.55g。将充分搅拌至均匀的含有上述全部物质的混合液添加至带有冷凝管的三颈瓶中，在氮气气流下，一边搅拌一边升温至回流温度。在将上述环境维持了24小时的状态下加热搅拌，由此得到聚合物作为反应产物。使反应产物在作为不良溶剂的己烷中再沉淀，通过过滤回收析出物并进行减压干燥。使得到的粉体溶解于纯水中，将溶液移至透析管中。实施透析72小时，将反应产物纯化。
将含有反应产物的溶液使用玻璃纤维制的1.0μm过滤器(AS ONE公司制，型号：SYGF0605MNXX104)过滤，将得到的滤液冷冻干燥，由此得到了温度响应性聚合物(收量：7.2g，收率：75％)。基于GFC得到的该聚合物的重均分子量为250,000，多分散度为1.9(合成例聚合物4)。
＜合成例5＞基于热聚合的作为细胞培养的基底膜形成剂使用的聚合物的制造(5)
向甲基丙烯酸2-(二甲基氨基)乙酯(东京化成工业(株)制)9.00g中加入四氢呋喃41.00g，充分地溶解。然后一边保持为20℃以下，一边向上述四氢呋喃溶液中添加1,1’-偶氮双(1-环己烷甲酸)二甲酯(VE-073，FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation制)0.02g、甲基丙烯酸(东京化成工业(株)制)1.23g。将充分搅拌至均匀的含有上述全部物质的混合液添加至带有冷凝管的三颈瓶中，在氮气气流下，一边搅拌一边升温至回流温度。在将上述环境维持了24小时的状态下加热搅拌，由此得到聚合物作为反应产物。使反应产物在作为不良溶剂的己烷中再沉淀，通过过滤回收析出物并进行减压干燥。使得到的粉体溶解于纯水中，将溶液移至透析管中。实施透析72小时，将反应产物纯化。
将含有反应产物的溶液使用玻璃纤维制的1.0μm过滤器(AS ONE公司制，型号：SYGF0605MNXX104)过滤，将得到的滤液冷冻干燥，由此得到了温度响应性聚合物(收量：5.8g，收率：57％)。基于GFC得到的该聚合物的重均分子量为270,000，多分散度为2.1(合成例聚合物5)。
＜合成例6＞基于热聚合的作为细胞培养的基底膜形成剂使用的聚合物的制造(6)
向甲基丙烯酸2-(二甲基氨基)乙酯(东京化成工业(株)制)9.00g中加入四氢呋喃44.58g，充分地溶解。然后一边保持为20℃以下，一边向上述四氢呋喃溶液中添加1,1’-偶氮双(1-环己烷甲酸)二甲酯(VE-073，FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation制)0.03g、甲基丙烯酸(东京化成工业(株)制)2.11g。将充分搅拌至均匀的含有上述全部物质的混合液添加至带有冷凝管的三颈瓶中，在氮气气流下，一边搅拌一边升温至回流温度。在将上述环境维持了24小时的状态下加热搅拌，由此得到聚合物作为反应产物。使反应产物在作为不良溶剂的己烷中再沉淀，通过过滤回收析出物并进行减压干燥。使得到的粉体溶解于纯水中，将溶液移至透析管中。实施透析72小时，将反应产物纯化。
将含有反应产物的溶液使用玻璃纤维制的1.0μm过滤器(AS ONE公司制，型号：SYGF0605MNXX104)过滤，将得到的滤液冷冻干燥，由此得到了温度响应性聚合物(收量：9.6g，收率：86％)。基于GFC得到的该聚合物的重均分子量为270,000，多分散度为2.4(合成例聚合物6)。
＜合成例7＞基于热聚合的作为细胞培养的基底膜形成剂使用的聚合物的制造(7)
向甲基丙烯酸2-(二甲基氨基)乙酯(东京化成工业(株)制)10.00g中加入四氢呋喃41.94g，充分地溶解。然后一边保持为20℃以下，一边向上述四氢呋喃溶液中添加1,1’-偶氮双(1-环己烷甲酸)二甲酯(VE-073，FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation制)0.01g、甲基丙烯酸(东京化成工业(株)制)0.48g、聚乙二醇二甲基丙烯酸酯(n＝约4)(东京化成工业(株)制)0.21g。将充分搅拌至均匀的含有上述全部物质的混合液添加至带有冷凝管的三颈瓶中，在氮气气流下，一边搅拌一边升温至回流温度。在将上述环境维持了24小时的状态下加热搅拌，由此得到聚合物作为反应产物。使反应产物在作为不良溶剂的己烷中再沉淀，通过过滤回收析出物并进行减压干燥。使得到的粉体溶解于纯水中，将溶液移至透析管中。实施透析72小时，将反应产物纯化。
将含有反应产物的溶液使用玻璃纤维制的1.0μm过滤器(AS ONE公司制，型号：SYGF0605MNXX104)过滤，将得到的滤液冷冻干燥，由此得到了温度响应性聚合物。基于GFC得到的该聚合物的重均分子量为660,000，多分散度为3.8(合成例聚合物7)。
＜合成例8＞基于热聚合的作为细胞培养的基底膜形成剂使用的聚合物的制造(8)
向甲基丙烯酸2-(二甲基氨基)乙酯(东京化成工业(株)制)10.00g中加入乙醇43.30g，充分地溶解。然后一边保持为20℃以下，一边向上述乙醇溶液中加入1,1’-偶氮双(1-环己烷甲酸)二甲酯(VE-073，FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation制)0.31g、甲基丙烯酸(东京化成工业(株)制)0.48g。将充分搅拌至均匀的含有上述全部物质的混合液添加至带有冷凝管的三颈瓶中，在氮气气流下，一边搅拌一边升温至回流温度。在将上述环境维持了24小时的状态下加热搅拌，由此得到聚合物作为反应产物。使反应产物在作为不良溶剂的己烷中再沉淀，通过过滤回收析出物并进行减压干燥。使得到的粉体溶解于纯水中，将溶液移至透析管中。实施透析72小时，将反应产物纯化。
将含有反应产物的溶液使用玻璃纤维制的1.0μm过滤器(AS ONE公司制，型号：SYGF0605MNXX104)过滤，将得到的滤液冷冻干燥，由此得到了温度响应性聚合物。基于GFC得到的该聚合物的重均分子量为88,000，多分散度为2.4(合成例聚合物8)。
＜合成例9＞基于热聚合的作为细胞培养的基底膜形成剂使用的聚合物的制造(9)
向甲基丙烯酸2-(二甲基氨基)乙酯(东京化成工业(株)制)10.00g中加入四氢呋喃41.94g，充分地溶解。然后一边保持为20℃以下，一边向上述四氢呋喃溶液中添加1,1’-偶氮双(1-环己烷甲酸)二甲酯(VE-073，FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation制)0.01g、甲基丙烯酸(东京化成工业(株)制)0.48g。将充分搅拌至均匀的含有上述全部物质的混合液添加至带有冷凝管的三颈瓶中，在氮气气流下，一边搅拌一边升温至60℃。在将上述环境维持了24小时的状态下加热搅拌，由此得到聚合物作为反应产物。使反应产物在作为不良溶剂的己烷中再沉淀，通过过滤回收析出物并进行减压干燥。使得到的粉体溶解于纯水中，将溶液移至透析管中。实施透析72小时，将反应产物纯化。
将含有反应产物的溶液使用玻璃纤维制的1.0μm过滤器(AS ONE公司制，型号：SYGF0605MNXX104)过滤，将得到的滤液冷冻干燥，由此得到了温度响应性聚合物。基于GFC得到的该聚合物的重均分子量为140,000，多分散度为2.5(合成例聚合物9)。
＜合成例10＞基于热聚合的作为细胞培养的基底膜形成剂使用的聚合物的制造(10)
向甲基丙烯酸2-(二甲基氨基)乙酯(东京化成工业(株)制)10.00g中加入乙醇31.46g，充分地溶解。然后一边保持为20℃以下，一边向上述乙醇溶液中加入1,1’-偶氮双(1-环己烷甲酸)二甲酯(VE-073，FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation制)0.01g、甲基丙烯酸(东京化成工业(株)制)0.48g。将充分搅拌至均匀的含有上述全部物质的混合液添加至带有冷凝管的三颈瓶中，在氮气气流下，一边搅拌一边升温至回流温度。在将上述环境维持了24小时的状态下加热搅拌，由此得到聚合物作为反应产物。使反应产物在作为不良溶剂的己烷中再沉淀，通过过滤回收析出物并进行减压干燥。使得到的粉体溶解于纯水中，将溶液移至透析管中。实施透析72小时，将反应产物纯化。
将含有反应产物的溶液使用玻璃纤维制的1.0μm过滤器(AS ONE公司制，型号：SYGF0605MNXX104)过滤，将得到的滤液冷冻干燥，由此得到了温度响应性聚合物。基于GFC得到的该聚合物的重均分子量为770,000，多分散度为4.1(合成例聚合物10)。
＜合成例11＞基于热聚合的作为细胞培养的基底膜形成剂使用的聚合物的制造(11)
向甲基丙烯酸2-(二甲基氨基)乙酯(东京化成工业(株)制)10.00g中加入乙醇43.90g，充分地溶解。然后一边保持为20℃以下，一边向上述乙醇溶液中加入1,1’-偶氮双(1-环己烷甲酸)二甲酯(VE-073，FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation制)0.01g、甲基丙烯酸(东京化成工业(株)制)0.97g。将充分搅拌至均匀的含有上述全部物质的混合液添加至带有冷凝管的三颈瓶中，在氮气气流下，一边搅拌一边升温至回流温度。在将上述环境维持了24小时的状态下加热搅拌，由此得到聚合物作为反应产物。使反应产物在作为不良溶剂的己烷中再沉淀，通过过滤回收析出物并进行减压干燥。使得到的粉体溶解于纯水中，将溶液移至透析管中。实施透析72小时，将反应产物纯化。
将含有反应产物的溶液使用玻璃纤维制的1.0μm过滤器(AS ONE公司制，型号：SYGF0605MNXX104)过滤，将得到的滤液冷冻干燥，由此得到了温度响应性聚合物。基于GFC得到的该聚合物的重均分子量为660,000，多分散度为3.6(合成例聚合物11)。
＜合成例12＞基于热聚合的作为细胞培养的基底膜形成剂使用的聚合物的制造(10)
向甲基丙烯酸2-(二甲基氨基)乙酯(东京化成工业(株)制)10.00g中加入乙醇70.00g，充分地溶解。然后一边保持为20℃以下，一边向上述乙醇溶液中加入1,1’-偶氮双(1-环己烷甲酸)二甲酯(VE-073，FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation制)0.01g、甲基丙烯酸(东京化成工业(株)制)2.35g。将充分搅拌至均匀的含有上述全部物质的混合液添加至带有冷凝管的三颈瓶中，在氮气气流下，一边搅拌一边升温至回流温度。在将上述环境维持了24小时的状态下加热搅拌，由此得到聚合物作为反应产物。使反应产物在作为不良溶剂的己烷中再沉淀，通过过滤回收析出物并进行减压干燥。使得到的粉体溶解于纯水中，将溶液移至透析管中。实施透析72小时，将反应产物纯化。
将含有反应产物的溶液使用玻璃纤维制的1.0μm过滤器(AS ONE公司制，型号：SYGF0605MNXX104)过滤，将得到的滤液冷冻干燥，由此得到了温度响应性聚合物。基于GFC得到的该聚合物的重均分子量为570,000，多分散度为3.6(合成例聚合物12)。
＜比较合成例1＞基于光聚合的聚合物的制造(1)
向容量为30mL的软质玻璃制的透明小瓶中加入甲基丙烯酸2-(二甲基氨基)乙酯(东京化成工业(株)制)10.00g、及水500μL，充分地搅拌使其变得均匀。然后，通过向该混合物(液体)吹扫氮气15分钟来将该混合物脱氧。
然后，针对该反应物，使用高压汞灯(USHIO公司制，型号：UM-102)，以基于照度计、365nm处的照度成为0.1mW/cm2的方式调节距离，于约25℃照射紫外线19小时，由此使上述反应物聚合。反应物在5小时后带有粘性，在18小时后固化(凝胶化)，得到聚合物作为反应产物。该反应产物对于2-丙醇呈难溶性，仅将一部分溶解后的部分移至透析管中。需要说明的是，溶解液为拉丝粘性体，操作困难。然后，实施透析72小时，将反应产物纯化。
将含有反应产物的溶液使用玻璃纤维制的1.0μm过滤器(AS ONE公司制，型号：SYGF0605MNXX104)过滤，将得到的滤液冷冻干燥，由此得到了比较合成例聚合物1(收量：1.5g，收率：15％)。
＜比较合成例2＞基于光聚合的聚合物的制造(2)
向容量为30mL的软质玻璃制的透明小瓶(vial)中加入甲基丙烯酸2-(二甲基氨基)乙酯(东京化成工业(株)制)10.00g、及水1000μL，充分地搅拌使其变得均匀。然后，通过向该混合物(液体)吹扫氮气15分钟来将该混合物脱氧。
然后，针对该反应物，使用高压汞灯(USHIO公司制，型号：UM-102)，以基于照度计、365nm处的照度成为0.1mW/cm2的方式调节距离，于约25℃照射紫外线19小时，由此使上述反应物聚合。反应物在5小时后带有粘性，在18小时后固化，得到聚合物作为反应产物。该反应产物对于2-丙醇呈难溶性，仅将一部分溶解而得的溶液移至透析管中。需要说明的是，溶解液为拉丝粘性体，操作困难。然后，实施透析72小时，将反应产物纯化。
将含有反应产物的溶液使用玻璃纤维制的1.0μm过滤器(AS ONE公司制，型号：SYGF0605MNXX104)过滤，将得到的滤液冷冻干燥，由此得到了比较合成例聚合物2(收量：2.6g，收率：26％)。
＜比较合成例3＞基于光聚合的聚合物的制造(3)
向容量为30mL的软质玻璃制的透明小瓶中加入甲基丙烯酸2-(二甲基氨基)乙酯(东京化成工业(株)制)10.00g、及水500μL，充分地搅拌使其变得均匀。然后，通过向该混合物(液体)吹扫氮气15分钟来将该混合物脱氧。
然后，针对该反应物，使用高压汞灯(USHIO公司制，型号：UM-102)，以基于照度计、365nm处的照度成为0.1mW/cm2的方式调节距离，于约25℃照射紫外线19小时，由此使上述反应物聚合。反应物在5小时后带有粘性，在18小时后固化，得到聚合物作为反应产物。该反应产物对于2-丙醇呈难溶性，仅将一部分溶解而得的溶液移至透析管中。需要说明的是，溶解液为拉丝粘性体，操作困难。然后，实施透析72小时，将反应产物纯化。
将含有反应产物的溶液使用玻璃纤维制的1.0μm过滤器(AS ONE公司制，型号：SYGF0605MNXX104)过滤，将得到的滤液冷冻干燥，由此得到了比较合成例聚合物3(收量：3.3g，收率：33％)。
＜实施例1＞(聚合物的利用1H-NMR测定的组成分析)
使用核磁共振装置(BRUKER公司制，型号：ASCEnd500)，以重水(D2O)作为标准物质测定了合成例聚合物1～12、比较合成例聚合物1～3的核磁共振谱(NMR)。下文示出合成例聚合物1～合成例聚合物6中共通的代表性峰。
1H-NMR(D2O中)δ0.8-1.2(br,-CH2-C(CH3)-),1.6-2.0(br,-CH2-C(CH3)-),2.2-2.4(br,-N(CH3)2),2.5-2.7(br,-CH2-N(CH3)2),4.0-4.2(br,-O-CH2-).
此处，由主链的甲基-CH2-C(CH3)-(δ0.8-1.2)的质子数(DMAEMA的均聚物的情况下，每1分子单体为3个)A、和侧链的-O-CH2-基(δ4.0-4.2)的甲基质子数(DMAEMA的均聚物的情况下，每1分子单体为2个)B算出侧链所具有的氨基的官能团数、与侧链的羧基的官能团数之比。
结果，关于通过热聚合合成的合成例1至12的甲基丙烯酸2-(二甲基氨基)乙酯(以下简称为“DM”)/甲基丙烯酸(以下简称为“MA”)的组成比，合成例1的情况下为100/0，合成例2的情况下为95/5，合成例3的情况下为95/5，合成例4的情况下为88/12，合成例5的情况下为82/18，合成例6的情况下为76/24，合成例7的情况下为89/11，合成例8～10的情况下为92/8，合成例11的情况下为85/15，合成例12的情况下为70/30。关于通过光聚合合成的比较合成例的情况，比较合成例1、2、3全部中为99/1，DM与MA的比率控制是困难的。由上述的结果确认到，通过热聚合合成的聚合物中，较之通过光聚合合成的聚合物而言，能够控制DM与MA的比率，进而能够以高收率得到聚合物。
详细结果示于表1。
就合成例1～12中合成的聚合物而言，能够在重均分子量Mw的范围为88,000～770,000这样的宽泛范围内各自创出。另外，分子量分布(PDI)的范围为1.9～4.1，能够从小分布至较大分布而各自创出。另外，任一聚合物均可在未凝胶化的情况下合成。另一方面，通过光聚合合成本聚合物的情况下，分子量的控制、将分子量分布控制为较小范围是困难的。例如日本专利公报(日本专利第5746240号)中，记载了通过与比较合成例1同样的方法合成的情况下PDI＝3.0，通过与比较合成例21同样的方法合成的情况下PDI＝4.3，通过与比较合成例3同样的方法合成的情况下PDI＝7.4。另外，在通过光聚合合成时全部聚合物均发生凝胶化，不仅分子量难以控制，反应自身的控制也是困难的。分子量分布变得极大时，也可能导致低分子量成分的溶出、聚合物量成分的析出。基于上述情况，通过使用热聚合来合成聚合物，较之通过光聚合合成的情况而言，能够在控制分子量、分子量分布的同时，稳定地制造聚合物。
[表1]
Figure BDA0002940668610000321
＜实施例2＞涂布膜的表面形状测定
将分子量不同的实施例聚合物3、8分别使用灭菌水以浓度成为0.5mg/mL的方式溶解，制造细胞培养的基底膜形成剂。使用喷墨装置(MICROJET公司制，型号：LaboJet-600)，以200nL各自涂布于经六甲基二硅氮烷处理的硅基板。将其于室温干燥5分钟使膜固化后，使用微细形状测定仪((株)小坂研究所制，型号：ET-4000A)，测定涂布膜的表面形状。测定条件为测定力100μN、输送速度0.05mm/sec。
合成例聚合物3(Mw＝290,000)的情况下，涂布膜的周边部隆起，内部呈平坦的形状。另一方面，合成例聚合物8(Mw＝88,000)的情况下，除了涂布膜周边部的隆起以外，在中心部也观测到隆起。可知涂布膜的截面形状根据聚合物的分子量及分子量分布而发生变化。
＜实施例3＞用于制造细胞培养的基底膜形成剂的聚合物水溶液的制造
将合成例聚合物1～合成例聚合物12分别使用灭菌水以浓度成为1mg/mL的方式溶解，制造聚合物水溶液1～12。
＜实施例4：细胞凝集块制造试验＞
(4-1.细胞低粘附板的制备)
按照WO2014/196650的实施例30中记载的制造方法，从含有共聚物的清漆制备涂覆溶液。将制得的涂覆溶液以成为500μL(固态成分为0.5质量％)/孔的方式添加至12孔细胞培养板(BD BIOSCIENCES公司制，#351143)的孔中，于室温静置1小时后，除去过量的涂覆溶液。使用烘箱(Advantec Toyo Kaisha Ltd.制，干燥机FC-612)于50℃干燥一夜。然后，以每1孔为500μL添加灭菌水后，将其除去并进行清洗。同样地进一步清洗2次，于50℃干燥一夜，得到细胞低粘附板。
(细胞培养的基底膜形成剂的制造、作为细胞培养的基底膜使用的聚合物涂覆板的制备)
将从合成例聚合物3及合成例聚合物4得到的1mg/mL的聚合物水溶液使用灭菌水稀释，使其成为100μg/mL，制造细胞培养的基底膜形成剂3及4。向上述细胞低粘附板上以各1μL滴加制得的聚合物水溶液，将其于室温干燥30分钟，由此得到作为用于试验的细胞培养的基底膜使用的聚合物涂覆板。
(4-2.细胞的制备)
细胞使用了来源于人骨髓的间充质干细胞(PromoCell公司制)。用于细胞的培养的培养基使用了间充质干细胞增殖培养基Mesenchymal Stem Cell Growth Medium2(PromoCell公司制)。使用直径为10cm的培养皿(10mL培养基)，在37℃/CO2培养箱内，在保持5％二氧化碳浓度的状态下，将细胞静置培养2天以上。然后，将本细胞使用HepesBSS溶液(PromoCell公司制)4ml清洗后，添加胰蛋白酶-EDTA溶液(PromoCell公司制)4mL，于室温静置5分钟。添加胰蛋白酶中和溶液(Trypsin Neutralizing Solution)(PromoCell公司制)4mL，将细胞剥离并回收。将本悬浮液离心分离(TOMY SEIKO CO.,LTD.制，型号LC-230，200×g/3分钟，室温)后，除去上清液，添加上述的培养基，制备细胞悬浮液。
(4-3.细胞附着实验)
向通过上述制备的板中添加各500μL细胞悬浮液，使得成为5.9×105个细胞/孔(1.75×105个细胞/cm2)。然后，在保持5％二氧化碳浓度的状态下，于37℃/CO2培养箱内静置3.5小时。静置后，除去非粘附细胞和培养基，用PBS清洗，由此使得仅粘附细胞残留于孔上。清洗后，添加500μL/孔的新培养基，使用倒置研究型显微镜IX73(奥林巴斯公司制)观察粘附细胞的情况，进行拍摄。结果，如图2所示，确认到细胞附着至涂覆了细胞培养的基底膜形成剂3、细胞培养的基底膜形成剂4的部位。
(4-4.细胞凝集块的观察)
将如上所述地实施了试验的板于37℃/CO2培养箱内继续静置1天。静置后，使用倒置研究型显微镜IX73(奥林巴斯公司制)，观察细胞的情况。结果，如图3所示，确认到粘附于细胞培养的基底膜形成剂3和细胞培养的基底膜形成剂4上的细胞从板剥落而凝集，形成了细胞凝集块(球体)。由此显示，含有本申请的聚合物的基底膜作为细胞培养容器的基底膜有用。
＜实施例5：细胞凝集块制造试验＞
(5-1.细胞培养的基底膜形成剂的制造及作为细胞培养的基底膜使用的聚合物涂覆板的制备)
将从合成例1、合成例10、合成例11及合成例12得到的1mg/mL的聚合物水溶液使用灭菌水稀释，使其成为50μg/mL，制造细胞培养的基底膜形成剂5、6、7及8。向细胞低粘附皿(住友BAKELITE株式会社制，#MS-9035X)上以各1μL滴加制得的聚合物水溶液，将其于50℃干燥30分钟，由此得到作为用于试验的细胞培养的基底膜使用的聚合物涂覆皿。
(5-2.细胞的制备)
细胞使用了来源于人骨髓的间充质干细胞(PromoCell公司制)。用于细胞的培养的培养基使用了间充质干细胞增殖培养基Mesenchymal Stem Cell Growth Medium2(PromoCell公司制)。使用直径为10cm的培养皿(10mL培养基)，在37℃/CO2培养箱内，在保持5％二氧化碳浓度的状态下，将细胞静置培养2天以上。然后，将本细胞使用HepesBSS溶液(PromoCell公司制)4ml清洗后，添加胰蛋白酶-EDTA溶液(PromoCell公司制)4mL，于室温静置5分钟。添加胰蛋白酶中和溶液(Trypsin Neutralizing Solution)(PromoCell公司制)4mL，将细胞剥离并回收。将本悬浮液离心分离(TOMY SEIKO CO.,LTD.制，型号LC-230，200×g/3分钟，室温)后，除去上清液，添加上述的培养基，制备细胞悬浮液。
(5-3.细胞附着实验)
向通过上述制备的板中添加细胞悬浮液，使得成为2.7×106个细胞/3mL/皿(3×105个细胞/cm2)。然后，在保持5％二氧化碳浓度的状态下，于37℃/CO2培养箱内静置2小时。静置后，除去非粘附细胞和培养基，用PBS清洗，由此使得仅粘附细胞残留于孔上。清洗后，添加2mL/皿的新培养基，使用EVOS FL Auto(Thermo Fisher Scientific公司制)观察粘附细胞的情况，进行拍摄。结果，如图4所示，确认到细胞附着至涂覆了细胞培养的基底膜形成剂5、细胞培养的基底膜形成剂6、细胞培养的基底膜形成剂7及细胞培养的基底膜形成剂8的部位。
(5-4.细胞凝集块的观察)
对如上所述地实施了试验的板继续使用EVOS FL Auto进行延时拍摄。延时拍摄在37℃/5％CO2条件下，针对同一视野以各1小时的间隔进行拍摄。结果，如图5所示，确认到粘附于细胞培养的基底膜形成剂5、细胞培养的基底膜形成剂6、基底膜形成剂7、及基底膜形成剂8上的细胞从板剥落而凝集，形成了细胞凝集块(球体)。由此显示，含有本申请的聚合物的基底膜作为细胞培养容器的基底膜有用。
产业上的可利用性
通过本发明的制造方法得到的聚合物可作为细胞培养的基底膜形成剂使用。使用本发明的基底膜形成剂，可制造细胞培养的基底膜、包含其的细胞培养容器。

Claims (18)

1.作为细胞培养的基底膜使用的聚合物的制造方法，其包括下述工序：
制备工序，制备含有下式(I)表示的单体、自由基聚合引发剂及有机溶剂的混合物；及
聚合工序，将所述混合物升温、搅拌，使单体聚合从而制备聚合物，
[化学式1]
Figure FDA0002940668600000011
式(I)中，
Ua1及Ua2各自独立地表示氢原子或者碳原子数1至5的直链或支链烷基，Ra1表示氢原子或者碳原子数1至5的直链或支链烷基，Ra2表示碳原子数1至5的直链或支链亚烷基。
2.如权利要求1所述的聚合物的制造方法，其中，在所述混合物中还含有式(II)表示的单体，
[化学式2]
Figure FDA0002940668600000012
式(II)中，
Rb表示氢原子或者碳原子数1至5的直链或支链烷基。
3.如权利要求1或2所述的聚合物的制造方法，其中，在所述混合物中还含有具有2个以上碳-碳不饱和键的单体。
4.如权利要求3所述的聚合物的制造方法，其中，所述具有2个以上碳-碳不饱和键的单体为下式(III)表示的单体，
[化学式3]
Figure FDA0002940668600000021
式(III)中，
Rc及Rd各自独立地表示氢原子或者碳原子数1至5的直链或支链烷基，Re表示碳原子数1至5的直链或支链亚烷基，n表示1～50的数字。
5.如权利要求1～4中任一项所述的聚合物的制造方法，其中，所述聚合物中的来自式(I)表示的单体的单元/来自式(II)表示的单体的单元的摩尔比为100/0～50/50。
6.如权利要求1～5中任一项所述的聚合物的制造方法，其中，聚合物的重均分子量(Mn)为20,000～1,000,000，且聚合物的重均分子量(Mw)与所述数均分子量(Mn)之比(Mw/Mn)为1.01～10.00。
7.如权利要求1～6中任一项所述的聚合物的制造方法，其中，所述聚合物作为用于在使细胞粘附后使其剥离而得到细胞凝集块的细胞培养的基底膜使用。
8.细胞培养的基底膜形成剂的制造方法，其包括将通过权利要求1～7中任一项所述的制造方法得到的聚合物、与含水溶液混合的工序。
9.细胞培养的基底膜的制造方法，其包括将通过权利要求8所述的制造方法得到的细胞培养的基底膜形成剂涂布于容器或基板的表面并进行干燥的工序。
10.如权利要求9所述的细胞培养的基底膜的制造方法，其中，在所述涂布·干燥工序之前，还包括将含有下述共聚物和溶剂的涂覆膜形成用组合物涂布于容器或基板的表面并进行干燥的工序，所述共聚物含有包含下式(a)表示的有机基团的重复单元、和包含下式(b)表示的有机基团的重复单元，
[化学式4]
Figure FDA0002940668600000031
式(a)、式(b)中，
Ua11、Ua12、Ub11、Ub12及Ub13各自独立地表示氢原子或者碳原子数1至5的直链或支链烷基，An-表示选自由卤化物离子、无机酸根离子、氢氧化物离子及异硫氰酸根离子组成的组中的阴离子。
11.如权利要求9所述的细胞培养的基底膜的制造方法，其中，所述容器或基板具有抑制细胞附着的能力。
12.细胞培养容器的制造方法，其包括将通过权利要求8所述的制造方法得到的细胞培养的基底膜形成剂涂布于容器或基板的表面并进行干燥的工序。
13.如权利要求12所述的细胞培养容器的制造方法，其中，在所述涂布·干燥工序之前，还包括将含有下述共聚物和溶剂的涂覆膜形成用组合物涂布于容器或基板的表面并进行干燥的工序，所述共聚物含有包含下式(a)表示的有机基团的重复单元、和包含下式(b)表示的有机基团的重复单元，
[化学式5]
Figure FDA0002940668600000041
式(a)、式(b)中，
Ua11、Ua12、Ub11、Ub12及Ub13各自独立地表示氢原子或者碳原子数1至5的直链或支链烷基，An-表示选自由卤化物离子、无机酸根离子、氢氧化物离子及异硫氰酸根离子组成的组中的阴离子。
14.如权利要求12所述的细胞培养容器的制造方法，其中，所述容器或基板具有抑制细胞附着的能力。
15.细胞凝集块的制造方法，其中，使用含有来自下式(I)表示的单体的单元的聚合物作为细胞培养的基底膜，
[化学式6]
Figure FDA0002940668600000042
式(I)中，
Ua1及Ua2各自独立地表示氢原子或者碳原子数1至5的直链或支链烷基，Ra1表示氢原子或者碳原子数1至5的直链或支链烷基，Ra2表示碳原子数1至5的直链或支链亚烷基。
16.如权利要求15所述的细胞凝集块的制造方法，其中，所述聚合物为还含有来自式(II)表示的单体的单元的共聚物，
[化学式7]
Figure FDA0002940668600000051
式(II)中，
Rb表示氢原子或者碳原子数1至5的直链或支链烷基。
17.下述聚合物的、作为用于在使细胞粘附后使其剥离而得到细胞凝集块的细胞培养的基底膜的用途，所述聚合物含有来自下式(I)表示的单体的单元，
[化学式8]
Figure FDA0002940668600000052
式(I)中，
Ua1及Ua2各自独立地表示氢原子或者碳原子数1至5的直链或支链烷基，Ra1表示氢原子或者碳原子数1至5的直链或支链烷基，Ra2表示碳原子数1至5的直链或支链亚烷基。
18.如权利要求17所述的作为用于在使细胞粘附后使其剥离而得到细胞凝集块的细胞培养的基底膜的用途，其中，所述聚合物为还含有来自所述式(I)和式(II)表示的单体的单元的共聚物，
[化学式9]
Figure FDA0002940668600000053
式(II)中，
Rb表示氢原子或者碳原子数1至5的直链或支链烷基。
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