WO2020040247A1 - 細胞培養の下地膜として使用するポリマーの製造方法及び細胞培養容器 - Google Patents

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linear
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康平 鈴木
佳臣 広井
菜月 安部
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日産化学株式会社
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    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a polymer used as a base film for cell culture and a method for producing a cell culture container provided with the base film.
  • PDMAEMA Poly (2-N, N-dimethylaminoethyl methacrylate)
  • DMAEMA 2-N, N-dimethylaminoethyl methacrylate
  • a mixture containing DMAEMA is prepared (preparation step), and then the mixture is irradiated with ultraviolet rays (irradiation step) to radically polymerize DMAEMA, thereby producing PDMAEMA.
  • Patent Document 1 discloses a method in which DMAEMA is irradiated with ultraviolet light in the presence of water to cause radical polymerization, thereby obtaining a poly (2-N, N-dimethylaminoethyl) having a cationic functional group and an anionic functional group. Production of polymers derived from (methacrylate) has been reported (for example, see Patent Document 1).
  • PDMAEMA is prepared by irradiating DMAEMA with ultraviolet light in the absence of water, followed by introducing an anionic monomer and irradiating with ultraviolet light to form a DMAEMA block sequence and a random arrangement of DMAEMA and anionic monomer.
  • the production of polymers having is reported.
  • selectivity of an anionic functional group can be imparted (for example, see Patent Document 2).
  • the present invention provides a method for producing poly (2-N, N-dimethylaminoethyl methacrylate) from a monomer having a cationic functional group and preferably a monomer having an anionic functional group, without relying on light irradiation such as ultraviolet light.
  • Derived polymers can be easily produced while controlling the molecular weight and molecular weight distribution, preferably while controlling the ratio of cationic functional groups to anionic functional groups.
  • a cell culture container preferably while controlling the ratio of cationic functional groups to anionic functional groups.
  • R a2 represents a linear or branched alkylene group having 1 to 5 carbon atoms]
  • the monomer having two or more carbon-carbon unsaturated bonds is represented by the following formula (III): [Where, R c and R d each independently represent a linear or branched alkyl group having a hydrogen atom or a 1 to 5 carbon atoms, R e represents a linear or branched alkylene group with 1 to 5 carbon atoms , N represents a number from 1 to 50], wherein the monomer is represented by [3].
  • the weight average molecular weight (Mn) of the polymer is 20,000 to 1,000,000, and the ratio (Mw / Mn) of the weight average molecular weight (Mw) of the polymer to the number average molecular weight (Mn) is 1
  • a method for producing a base film forming agent for cell culture comprising a step of mixing the polymer obtained by the production method according to any one of [1] to [7] and an aqueous solution.
  • a method for producing a base film for cell culture comprising a step of applying the agent for forming a base film for cell culture obtained by the production method according to [8] to the surface of a container or a substrate and drying.
  • a method for producing a cell culture container comprising a step of applying and drying the base film forming agent for cell culture obtained by the production method according to [8] on the surface of a container or a substrate.
  • the polymer further comprises a compound of formula (II): [Where, R b represents a hydrogen atom or a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms], and is a copolymer containing a unit derived from a monomer represented by the formula [15]. Method.
  • the polymer further comprises a compound of formula (II): [Where, R b represents a hydrogen atom or a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms], and is a copolymer containing a unit derived from a monomer represented by the formula (17). Used as a base film of cell culture to obtain cell aggregates after peeling.
  • a poly (2-N, N-dimethylaminoethyl) is formed from a monomer having a cationic functional group and preferably a monomer further having an anionic functional group regardless of irradiation with light such as ultraviolet rays.
  • a polymer derived from (methacrylate) can be easily produced while controlling the molecular weight and the molecular weight distribution, and further arbitrarily controlling the ratio of the cationic functional group to the anionic functional group. By manufacturing while controlling the molecular weight, coatability on a substrate can be easily improved.
  • FIG. 10 is a diagram showing the results of surface shape measurement of a polymer of Synthesis Examples 3 and 8 using a contact needle film thickness meter in Example 2 (observation of surface shape of coating film).
  • 11 is a photograph of observation of the state of adherent cells in a polymer coating plate provided with the polymers of Synthesis Examples 3 and 4 as a base film in (4-3. Cell adhesion experiment) in Example 4.
  • 5 is a photograph of observation of cell aggregates in a polymer coating plate provided with the polymers of Synthesis Examples 3 and 4 as a base film in Example 4 (4-4. Observation of cell aggregates).
  • 5 is a photograph showing the state of cells in a polymer coating dish provided with the polymers of Synthesis Examples 1, 10, 11, and 12 as a base film in (5-3.
  • FIG. 9 is a photograph of observation of cell aggregates in a polymer-coated dish provided with the polymers of Synthesis Examples 1, 10, 11, and 12 as a base film in Example 5 (5-4. Observation of cell aggregates).
  • the polymer used as the base film of the cell culture of the present application is: The following formula (I):
  • U a1 and U a2 each independently represent a hydrogen atom or a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms
  • R a1 represents a hydrogen atom or a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms
  • R a2 represents a straight-chain or branched alkylene group having 1 to 5 carbon atoms
  • the above-mentioned polymer together with the cationic monomer represented by the above formula (I), has the following formula (II): [Where, R b represents a hydrogen atom or a straight-chain or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms.], And is preferably a copolymer obtained by polymerizing an anionic monomer represented by the formula:
  • the “linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms” includes, for example, methyl group, ethyl group, n-propyl group, isopropyl group, n-butyl group, Isobutyl, s-butyl, t-butyl, n-pentyl, 1-methylbutyl, 2-methylbutyl, 3-methylbutyl, 1,1-dimethylpropyl, 1,2-dimethylpropyl, 2 , 2-dimethylpropyl group or 1-ethylpropyl group.
  • R a1 and R b are each independently selected from a hydrogen atom and a methyl group.
  • U a1 and U a2 are each independently preferably selected from a hydrogen atom, a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, an isopropyl group and an n-butyl group, and are preferably a methyl group or an ethyl group.
  • a methyl group is most preferred.
  • examples of “a linear or branched alkylene group having 1 to 5 carbon atoms” include, for example, a methylene group, an ethylene group, a propylene group, a trimethylene group, a tetramethylene group, a 1-methyl Propylene group, 2-methylpropylene group, dimethylethylene group, ethylethylene group, pentamethylene group, 1-methyl-tetramethylene group, 2-methyl-tetramethylene group, 1,1-dimethyl-trimethylene group, 1,2- Examples include a dimethyl-trimethylene group, a 2,2-dimethyl-trimethylene group, a 1-ethyl-trimethylene group, and the like.
  • Ra2 is preferably selected from an ethylene group and a propylene group.
  • examples of the cationic monomer represented by the above formula (I) include 2-N, N-dimethylaminoethyl methacrylate and N-isopropylacrylamide, and 2-N, N-dimethylaminoethyl methacrylate is preferable.
  • examples of the anionic monomer represented by the above formula (II) include acrylic acid and methacrylic acid, and methacrylic acid is preferable.
  • the molar ratio of the unit derived from the monomer represented by the formula (I) / the unit derived from the monomer represented by the formula (II) in the polymer is 100/0 to 50/50. Preferably it is 98/2 to 50/50. It is more preferably from 98/2 to 60/40, and particularly preferably from 98/2 to 70/30. This is because when the molar ratio of the formula (II) is 51 or more, the anionicity of the polymer becomes excessive and the adhesive strength of the cells decreases.
  • the polymer may be a polymer obtained by polymerizing a monomer represented by the formula (I) / formula (II) and a monomer having two or more carbon-carbon unsaturated bonds.
  • the monomer having two or more carbon-carbon unsaturated bonds is, specifically, a monomer having two or more carbon-carbon double bonds, for example, a polyfunctional acrylate compound, a polyfunctional acrylamide compound, a polyfunctional Examples include polyester and isoprene compounds.
  • Preferred specific examples include monomers represented by the following formulas (III) to (V).
  • R c and R d each independently represent a hydrogen atom or a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, and Re is a linear or branched alkylene having 1 to 5 carbon atoms. And n represents a number from 1 to 50.
  • a monomer represented by the formula (III) is preferable.
  • the molar ratio of the monomers represented by the formulas (III) to (V) to the whole polymer is preferably 0 to 5.0%. More preferably, it is 0 to 3.0%. If the molar ratio of the formulas (III) to (V) is not less than 5.0%, gelation may occur during the production due to excessively high molecular weight due to excessive crosslinking, which may make the production difficult.
  • R c and R d are each independently selected from a hydrogen atom and a methyl group.
  • Re is preferably selected from a methylene group, an ethylene group and a propylene group, and most preferably an ethylene group.
  • n is a number of 1 to 50, preferably n is a number of 1 to 30, and n is preferably a number of 1 to 10.
  • the difference between the monomer charge ratio and the actually measured value of the polymer produced by the production method described below is small, and is 0 to 10 mol%. More preferably, it is 0 to 8 mol%.
  • the number average molecular weight (Mn) of the polymer is from 20,000 to 1,000,000, more preferably from 50,000 to 800,000.
  • the ratio (Mw / Mn) between the weight average molecular weight (Mw) and the number average molecular weight (Mn) of the polymer is from 1.01 to 10.00, preferably from 1.2 to 8.0, It is preferably from 1.4 to 6.0, more preferably from 1.5 to 5.0, and preferably from 1.6 to 4.5.
  • the number average molecular weight (Mn) and the number average molecular weight (Mn) can be determined by, for example, Gel Filtration Chromatography described in Examples.
  • Mn number average molecular weight
  • the polymer of the present application it is possible to form a cell aggregate by detaching the cells after adhering them.
  • the cell aggregate indicates a structure formed as a result of cell aggregation, and is not limited in shape such as a sphere or a ring.
  • the size of cell clumps can be adjusted by defining the adhesion area (cell clumps of any size can be manufactured). There is a merit.
  • the polymer of the present application can be produced by a thermal polymerization method.
  • a monomer of the above formula (I) is dissolved in an organic solvent, a radical polymerization initiator is added, and then, if necessary, the above formula (II) and, if necessary, two or more carbon-carbon unsaturated bonds.
  • a radical polymerization initiator is added, and then, if necessary, the above formula (II) and, if necessary, two or more carbon-carbon unsaturated bonds.
  • the mixture is sufficiently stirred to be uniform, and then subjected to, for example, 51 ° C. or higher, for example, 51 to 180 ° C. while flowing nitrogen.
  • the temperature is raised to 51 to 150 ° C., 51 to 130 ° C., 51 to 100 ° C., for example, the reflux temperature of the solvent (for example, 66 to 85 ° C. for tetrahydrofuran), and the mixture is stirred for, for example, 1 to 48 hours to obtain a polymer. Is obtained.
  • the obtained polymer may be purified by reprecipitation and dialysis.
  • the monomer of formula (I) is dissolved in a solvent, a polymerization initiator is added, and then, if necessary, the monomer of formula (II) is dissolved in the solvent at a total concentration of both compounds of 0.1. It can be prepared by a production method including a step of causing a reaction (polymerization) at from 01% by mass to 40% by mass.
  • organic solvent used in the polymerization examples include ether solvents such as tetrahydrofuran and 1,4-dioxane; aliphatic alcohol solvents having 1 to 4 carbon atoms such as methanol, ethanol and isopropanol; and aromatic hydrocarbon solvents such as toluene.
  • ether solvents such as tetrahydrofuran and 1,4-dioxane
  • aliphatic alcohol solvents having 1 to 4 carbon atoms such as methanol, ethanol and isopropanol
  • aromatic hydrocarbon solvents such as toluene.
  • a mixed solvent thereof may be used.
  • radical polymerization initiator examples include dimethyl 1,1′-azobis (1-cyclohexanecarboxylate) (VE-073, manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and 2,2′-azobis (2,4- Dimethylvaleronitrile) (V-65, manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 2,2′-azobis (isobutyronitrile) (AIBN, manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 2,2 ′ -Azobis [N- (2-carboxyethyl) -2-methylpropionamidine] n hydrate (VA-057, manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 2,2 '-(N-butyl-2- Azo polymerization initiators such as methylpropionamide) (VAm-110, manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
  • the amount of the polymerization initiator to be added is 0.05% by mass to 5% by mass based on the total weight of the monomers used for the polymerization.
  • the use of the polymerization initiator not only increases the efficiency of the polymerization reaction, but also allows adjustment of the physical properties of the polymer by modifying the terminal functional group.
  • a base film forming agent for cell culture By mixing the polymer with an aqueous solution by a method known per se, a base film forming agent for cell culture can be produced.
  • the aqueous solution include a salt-containing aqueous solution such as water, physiological saline or a phosphate buffer solution, or a mixed solvent obtained by combining water or a salt-containing aqueous solution with an alcohol.
  • alcohols having 2 to 6 carbon atoms such as ethanol, propanol, isopropanol, 1-butanol, 2-butanol, isobutanol, t-butanol, 1-pentanol, 2-pentanol, and 3-pentanol.
  • the mixed solvent of a combination You may use the mixed solvent of a combination.
  • other substances can be added to the base film forming agent as needed, as long as the performance of the base film obtained is not impaired.
  • Other substances include a pH adjuster, a cross-linking agent, a preservative, a surfactant, a primer for increasing the adhesion to a container or a substrate, a fungicide, a saccharide, and the like.
  • the base film forming agent for cell culture is applied to the surface of a container or a substrate and dried to prepare a base film for cell culture and a cell culture container containing the base film.
  • the “surface” refers to a surface in contact with a cell or a content such as a cell culture solution.
  • Examples of the container or the substrate include petri dishes, tissue culture dishes, dishes and multi-dish petri dishes or dishes generally used for cell culture, cell culture flasks, flasks such as spinner flasks, plastic bags, Teflon (registered trademark) A) Bags such as bags and culture bags, plates such as microplates, microwell plates, multiplates, and multiwell plates, chamber slides, tubes, trays, and bottles such as roller bottles.
  • a petri dish or dish, a plate, or a tray is used.
  • examples of the material of the container or the substrate include glass, metal, metal-containing compound or semimetal-containing compound, activated carbon, and resin.
  • Metals are typical metals: (alkali metals: Li, Na, K, Rb, Cs; alkaline earth metals: Ca, Sr, Ba, Ra), magnesium group elements: Be, Mg, Zn, Cd, Hg; aluminum group Element: Al, Ga, In; Rare earth element: Y, La, Ce, Pr, Nd, Sm, Eu; Tin group element: Ti, Zr, Sn, Hf, Pb, Th; Iron group element: Fe, Co, Ni Soil element: V, Nb, Ta, Chromium group element: Cr, Mo, W, U; Manganese group element: Mn, Re; Noble metal: Cu, Ag, Au; Platinum group element: Ru, Rh, Pd, Os , Ir, Pt and the like.
  • the metal-containing compound or the metalloid-containing compound is, for example, a ceramic, a semiconductor such as silicon, a metal oxide or a metalloid oxide (silicon), which is a sintered body that is a sintered body that is a metal oxide as a basic component and that is sintered by heat treatment at a high temperature.
  • Oxides, alumina, etc. inorganic solid materials such as metal carbides or metalloid carbides, metal nitrides or metalloid nitrides (silicon nitrides, etc.), moldings of inorganic compounds such as metal borides or metalloid borides, Examples include aluminum, nickel titanium, and stainless steel (SUS304, SUS316, SUS316L, and the like).
  • the resin may be a natural resin or a derivative thereof, or a synthetic resin.
  • the natural resin or a derivative thereof include cellulose, cellulose triacetate (CTA), nitrocellulose (NC), and cellulose having immobilized dextran sulfate.
  • the resin include polyacrylonitrile (PAN), polyester polymer alloy (PEPA), polystyrene (PS), polysulfone (PSF), polyethylene terephthalate (PET), polymethyl methacrylate (PMMA), polyvinyl alcohol (PVA), and polyurethane (PU).
  • EVAL Ethylene vinyl alcohol
  • PE polyethylene
  • PP polypropylene
  • PVDF polyvinylidene fluoride
  • PES polyether sulfone
  • P polycarbonate
  • PVC Polyvinyl chloride
  • PTFE polytetrafluoroethylene
  • UHPE ultrahigh molecular weight polyethylene
  • PDMS polydimethylsiloxane
  • ABS acrylonitrile-butadiene-styrene resin
  • Teflon registered trademark
  • the material of the container or the substrate may be one kind or a combination of two or more kinds.
  • glass silicon, silicon oxide, polystyrene (PS), polypropylene (PP), polyethersulfone (PES), polyethylene terephthalate (PET), polycarbonate (PC), polyvinyl chloride (PVC), Teflon (registered trademark), cycloolefin polymer (COP), polydimethylsiloxane (PDMS) or stainless steel (SUS304, SUS316, SUS316L, etc.) alone or a combination selected from these, preferably glass, polystyrene (PS), Particularly preferred are polypropylene (PP), stainless steel (SUS304, SUS316, SUS316L, etc.) and polydimethylsiloxane (PDMS).
  • an ink jet method for example, an ink jet method, a screen printing method, a slit coating method, a roll-to-roll method, and the like can be used. It is done with the printing technology.
  • the container is immersed in the base film forming agent, the base film forming agent is added to the container and allowed to stand for a predetermined time, or a coating agent is applied to the surface of the container or the substrate.
  • the method is performed by adding a base film-forming agent to the container and allowing it to stand for a predetermined time.
  • the addition can be performed, for example, by adding a base film forming agent in an amount of 0.5 to 1 times the total volume of the container using a syringe or the like.
  • the standing is performed by appropriately selecting the time and temperature according to the material of the container or the substrate and the type of the base film forming agent for cell culture.
  • 1 minute to 24 hours preferably 5 minutes to 3 hours, It is performed at 10 to 80 ° C.
  • a cell culture container having a cell culture base film on at least a part of, preferably, the entire surface of the container.
  • the base film for cell culture on the surface of the container or the substrate obtained by such a method is preferably added with an agent for forming a base film of the cell culture, After the step of standing for a period of time, as it is without a drying step, or after washing with water or a medium of a sample to be subjected to cell culture (eg, water, buffer, medium, etc.), Can be used.
  • an agent for forming a base film of the cell culture eg, water, buffer, medium, etc.
  • a base film forming agent for cell culture and standing for a predetermined time within 48 hours, preferably within 24 hours, More preferably within 12 hours, more preferably within 6 hours, more preferably within 3 hours, even more preferably within 1 hour, without any drying step, or as it is, or water or a medium of a sample subjected to cell culture (for example, , Water, a buffer, a medium, etc., particularly preferably after washing with a medium (eg, DMEM medium (Dulbecco's modified Eagle medium)), and then used as a cell culture vessel.
  • a medium eg, DMEM medium (Dulbecco's modified Eagle medium)
  • the container may be subjected to a drying step.
  • the drying step is performed in the atmosphere or under vacuum, preferably at a temperature in the range of -200 ° C to 200 ° C.
  • the solvent in the base film forming agent is removed, whereby the base film is completely fixed to the substrate.
  • the base film can be formed, for example, by drying at room temperature (10 ° C. to 35 ° C., preferably 20 ° C. to 30 ° C., for example, 25 ° C.). You may dry at ⁇ 50 degreeC. If the drying temperature is lower than -200 ° C., an unusual refrigerant must be used, and versatility is lacking, and drying takes a long time due to solvent sublimation, resulting in poor efficiency. If the drying temperature is higher than 200 ° C., thermal decomposition of the polymer occurs. A more preferable drying temperature is 10 ° C to 180 ° C, and a more preferable drying temperature is 20 ° C to 150 ° C.
  • the base film for cell culture of the present application is manufactured through the above simple steps. Further, in order to remove impurities, unreacted monomers, and the like remaining on the base film of the cell culture, a step of washing with at least one solvent selected from water and an aqueous solution containing an electrolyte may be performed. Washing is preferably performed by running water washing or ultrasonic washing. The aqueous solution containing water and the electrolyte may be heated, for example, in the range of 40 ° C. to 95 ° C.
  • the aqueous solution containing the electrolyte is preferably PBS, saline (containing only sodium chloride), Dulbecco's phosphate buffered saline, Tris buffered saline, HEPES buffered saline, and veronal buffered saline. Particularly preferred. After fixation, the coating film does not elute and remains firmly fixed to the substrate even when washed with water, PBS, alcohol, or the like.
  • the thickness of the base film for the cell culture of the present application is such that the maximum thickness and the minimum thickness are in the range of 1 to 1000 nm, preferably in the range of 5 to 500 nm.
  • the container or the substrate may have been subjected to a treatment for suppressing cell adhesion before the step of applying and drying the base film.
  • the container or substrate having the ability to inhibit cell adhesion can be produced, for example, through a step of applying a known composition for forming a coating film having the ability to inhibit cell adhesion.
  • the coating film forming composition having the ability to inhibit cell adhesion includes a repeating unit containing an organic group represented by the following formula (a) and a repeating unit containing an organic group represented by the following formula (b) Copolymer: [Where, U a11 , U a12 , U b11 , U b12 and U b13 each independently represent a hydrogen atom or a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, and An ⁇ represents a halide ion or an inorganic acid.
  • the straight-chain or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms is the same as described above.
  • the composition for forming a coating film for example, the composition for forming a coating film described in WO2014 / 196650 can be used.
  • the method for applying the composition for forming a coating film is not particularly limited, and an ordinary coating method such as spin coating, dip coating, and solvent casting is used.
  • the drying step of the coating film is performed in the range of -200 ° C to 180 ° C under the atmosphere or under vacuum.
  • the solvent in the composition for forming a coating film is removed, and the copolymers (a) and (b) form an ionic bond with each other to completely adhere to the substrate.
  • the coating film can be formed, for example, by drying at room temperature (10 ° C. to 35 ° C., for example, 25 ° C.). In order to form the coating film more quickly, the coating film is dried at 40 ° C. to 50 ° C. You may. Further, a drying process at a very low temperature to a low temperature (about -200 ° C. to about ⁇ 30 ° C.) by a freeze drying method may be used. Freeze-drying is called vacuum freeze-drying, which is a method of cooling what is usually desired to be dried with a refrigerant and removing the solvent by sublimation under vacuum. Typical refrigerants used in freeze drying include a mixed medium of dry ice and methanol ( ⁇ 78 ° C.), liquid nitrogen ( ⁇ 196 ° C.), and the like.
  • drying temperature is -200 ° C. or lower, an unusual refrigerant must be used, and versatility is lacking, and drying takes a long time due to solvent sublimation, resulting in poor efficiency.
  • the drying temperature is 200 ° C. or higher, the ionic bonding reaction on the surface of the coating film proceeds excessively, the surface loses hydrophilicity, and the ability to inhibit biological substance adhesion is not exhibited.
  • a more preferable drying temperature is 10 ° C to 180 ° C, and a more preferable drying temperature is 25 ° C to 150 ° C.
  • At least one solvent selected from water and an aqueous solution containing an electrolyte in order to remove impurities remaining on the coating film, unreacted monomers, etc. after drying, and to adjust the ion balance of the copolymer in the film. It is desirable to wash with running water washing or ultrasonic washing.
  • the aqueous solution containing water and the electrolyte may be heated, for example, in the range of 40 ° C. to 95 ° C.
  • the aqueous solution containing the electrolyte is preferably PBS, saline (containing only sodium chloride), Dulbecco's phosphate buffered saline, Tris buffered saline, HEPES buffered saline, and veronal buffered saline. Particularly preferred.
  • the coating film does not elute and remains firmly fixed to the substrate even when washed with water, PBS, alcohol, or the like. Even if the biological material adheres, the formed coating film can be easily removed by washing with water or the like, and the surface of the substrate on which the coating film is formed has an ability to suppress the adhesion of the biological material.
  • the thickness of the coating film is preferably from 5 to 1,000 nm, more preferably from 5 to 500 nm.
  • cell culture vessel a commercially available cell culture dish having a low cell adhesion treatment or a cell culture vessel having a cell adhesion suppressing ability may be used, for example, as described in JP-A-2008-61609.
  • Cell culture vessels can be used, but are not limited thereto.
  • Having the ability to inhibit cell adhesion refers to, for example, the relative absorbance (WST@OD.450 nm) as compared to the absence of a coating film by a fluorescence microscope performed by the method described in the example of WO2016 / 092933 or the absence of a low cell adsorption treatment. ) (%) ((Absorbance of example (WST@OD.450 nm)) / (absorbance of comparative example (WST@OD.450 nm))) is 50% or less, preferably 30% or less, more preferably 20% or less. % Or less.
  • U a1 and U a2 each independently represent a hydrogen atom or a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, and R a1 represents a hydrogen atom or a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms.
  • R a2 represents a straight-chain or branched alkylene group having 1 to 5 carbon atoms] on a base film for cell culture obtained from a polymer containing a unit derived from a monomer represented by the following formula:
  • This is a method for producing a cell aggregate by a known method, for example, a method described in Examples.
  • the base film for the cell culture described above, together with a unit derived from the monomer represented by the formula (I) has the following formula (II):
  • R b represents a hydrogen atom or a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms.
  • the base film is obtained from a copolymer containing a unit derived from a monomer represented by the formula:
  • GFC Gel Filtration Chromatography
  • the polymer was obtained as a reaction product by heating and stirring while maintaining the above environment for 24 hours.
  • the reaction product was reprecipitated with hexane, a poor solvent, and the precipitate was collected by filtration and dried under reduced pressure.
  • the obtained powder was dissolved in pure water, and the solution was transferred to a dialysis tube. Dialysis was performed for 72 hours to purify the reaction product.
  • the solution containing the reaction product was filtered through a glass fiber 1.0 ⁇ m filter (manufactured by AS ONE Corporation, model number: SYGF0605MNXX104), and the obtained filtrate was lyophilized to obtain a temperature-responsive homopolymer (yield). : 6.4 g, yield: 71%).
  • the weight average molecular weight of this polymer measured by GFC was 250,000, and the polydispersity was 2.0 (Synthesis example polymer 1).
  • the solution was added to the above tetrahydrofuran solution.
  • the polymer was obtained as a reaction product by heating and stirring while maintaining the above environment for 24 hours.
  • the reaction product was reprecipitated with hexane, a poor solvent, and the precipitate was collected by filtration and dried under reduced pressure.
  • the obtained powder was dissolved in pure water, and the solution was transferred to a dialysis tube. Dialysis was performed for 72 hours to purify the reaction product.
  • a solution containing the reaction product was filtered through a glass fiber 1.0 ⁇ m filter (manufactured by AS ONE Corporation, model number: SYGF0605MNXX104), and the obtained filtrate was lyophilized to obtain a temperature-responsive polymer (yield: 6.6 g, yield: 71%).
  • the weight average molecular weight of this polymer measured by GFC was 24,000, and the polydispersity was 2.0 (Synthesis example polymer 2).
  • the solution was added to the above tetrahydrofuran solution.
  • the polymer was obtained as a reaction product by heating and stirring while maintaining the above environment for 24 hours.
  • the reaction product was reprecipitated with hexane, a poor solvent, and the precipitate was collected by filtration and dried under reduced pressure.
  • the obtained powder was dissolved in pure water, and the solution was transferred to a dialysis tube. Dialysis was performed for 72 hours to purify the reaction product.
  • a solution containing the reaction product was filtered through a glass fiber 1.0 ⁇ m filter (manufactured by AS ONE Corporation, model number: SYGF0605MNXX104), and the obtained filtrate was lyophilized to obtain a temperature-responsive polymer (yield: 7.3 g, yield: 69%).
  • the weight average molecular weight of this polymer measured by GFC was 290,000, and the polydispersity was 1.9 (Synthesis example polymer 3).
  • the solution was added to the above tetrahydrofuran solution.
  • the polymer was obtained as a reaction product by heating and stirring while maintaining the above environment for 24 hours.
  • the reaction product was reprecipitated with hexane, a poor solvent, and the precipitate was collected by filtration and dried under reduced pressure.
  • the obtained powder was dissolved in pure water, and the solution was transferred to a dialysis tube. Dialysis was performed for 72 hours to purify the reaction product.
  • a solution containing the reaction product was filtered through a glass fiber 1.0 ⁇ m filter (manufactured by AS ONE Corporation, model number: SYGF0605MNXX104), and the obtained filtrate was lyophilized to obtain a temperature-responsive polymer (yield: 7.2 g, yield: 75%).
  • the weight average molecular weight of this polymer measured by GFC was 250,000, and the polydispersity was 1.9 (Synthesis example polymer 4).
  • the solution was added to the above tetrahydrofuran solution.
  • the polymer was obtained as a reaction product by heating and stirring while maintaining the above environment for 24 hours.
  • the reaction product was reprecipitated with hexane, a poor solvent, and the precipitate was collected by filtration and dried under reduced pressure.
  • the obtained powder was dissolved in pure water, and the solution was transferred to a dialysis tube. Dialysis was performed for 72 hours to purify the reaction product.
  • a solution containing the reaction product was filtered through a glass fiber 1.0 ⁇ m filter (manufactured by AS ONE Corporation, model number: SYGF0605MNXX104), and the obtained filtrate was lyophilized to obtain a temperature-responsive polymer (yield: 5.8 g, yield: 57%).
  • the weight average molecular weight of this polymer measured by GFC was 270,000, and the polydispersity was 2.1 (Synthesis polymer 5).
  • the solution was added to the above tetrahydrofuran solution.
  • the polymer was obtained as a reaction product by heating and stirring while maintaining the above environment for 24 hours.
  • the reaction product was reprecipitated with hexane, a poor solvent, and the precipitate was collected by filtration and dried under reduced pressure.
  • the obtained powder was dissolved in pure water, and the solution was transferred to a dialysis tube. Dialysis was performed for 72 hours to purify the reaction product.
  • a solution containing the reaction product was filtered through a glass fiber 1.0 ⁇ m filter (manufactured by AS ONE Corporation, model number: SYGF0605MNXX104), and the obtained filtrate was lyophilized to obtain a temperature-responsive polymer (yield: 9.6 g, yield: 86%).
  • the weight average molecular weight of this polymer measured by GFC was 270,000, and the polydispersity was 2.4 (Synthesis example polymer 6).
  • the polymer was obtained as a reaction product by heating and stirring while maintaining the above environment for 24 hours.
  • the reaction product was reprecipitated with hexane, a poor solvent, and the precipitate was collected by filtration and dried under reduced pressure.
  • the obtained powder was dissolved in pure water, and the solution was transferred to a dialysis tube. Dialysis was performed for 72 hours to purify the reaction product.
  • the solution containing the reaction product was filtered through a glass fiber 1.0 ⁇ m filter (manufactured by AS ONE Corporation, model number: SYGF0605MNXX104), and the obtained filtrate was freeze-dried to obtain a temperature-responsive polymer.
  • the weight average molecular weight of this polymer measured by GFC was 660,000, and the polydispersity was 3.8 (Synthesis example polymer 7).
  • the polymer was obtained as a reaction product by heating and stirring while maintaining the above environment for 24 hours.
  • the reaction product was reprecipitated with hexane, a poor solvent, and the precipitate was collected by filtration and dried under reduced pressure.
  • the obtained powder was dissolved in pure water, and the solution was transferred to a dialysis tube. Dialysis was performed for 72 hours to purify the reaction product.
  • the solution containing the reaction product was filtered through a glass fiber 1.0 ⁇ m filter (manufactured by AS ONE Corporation, model number: SYGF0605MNXX104), and the obtained filtrate was freeze-dried to obtain a temperature-responsive polymer.
  • the weight average molecular weight of this polymer measured by GFC was 88,000, and the polydispersity was 2.4 (Synthesis example polymer 8).
  • the solution was added to the above tetrahydrofuran solution.
  • the mixed solution containing all of the above, which had been sufficiently stirred to be uniform, was added to a three-necked flask equipped with a cooling tube, and nitrogen flow was performed.
  • the polymer was obtained as a reaction product by heating and stirring while maintaining the above environment for 24 hours.
  • the reaction product was reprecipitated with hexane, a poor solvent, and the precipitate was collected by filtration and dried under reduced pressure.
  • the obtained powder was dissolved in pure water, and the solution was transferred to a dialysis tube. Dialysis was performed for 72 hours to purify the reaction product.
  • the solution containing the reaction product was filtered through a glass fiber 1.0 ⁇ m filter (manufactured by AS ONE Corporation, model number: SYGF0605MNXX104), and the obtained filtrate was freeze-dried to obtain a temperature-responsive polymer.
  • the weight average molecular weight of this polymer measured by GFC was 140,000, and the polydispersity was 2.5 (Synthesis example polymer 9).
  • the polymer was obtained as a reaction product by heating and stirring while maintaining the above environment for 24 hours.
  • the reaction product was reprecipitated with hexane, a poor solvent, and the precipitate was collected by filtration and dried under reduced pressure.
  • the obtained powder was dissolved in pure water, and the solution was transferred to a dialysis tube. Dialysis was performed for 72 hours to purify the reaction product.
  • the solution containing the reaction product was filtered through a glass fiber 1.0 ⁇ m filter (manufactured by AS ONE Corporation, model number: SYGF0605MNXX104), and the obtained filtrate was freeze-dried to obtain a temperature-responsive polymer.
  • the weight average molecular weight of this polymer measured by GFC was 770,000, and the polydispersity was 4.1 (Synthesis polymer 10).
  • the polymer was obtained as a reaction product by heating and stirring while maintaining the above environment for 24 hours.
  • the reaction product was reprecipitated with hexane, a poor solvent, and the precipitate was collected by filtration and dried under reduced pressure.
  • the obtained powder was dissolved in pure water, and the solution was transferred to a dialysis tube. Dialysis was performed for 72 hours to purify the reaction product.
  • the solution containing the reaction product was filtered through a glass fiber 1.0 ⁇ m filter (manufactured by AS ONE Corporation, model number: SYGF0605MNXX104), and the obtained filtrate was freeze-dried to obtain a temperature-responsive polymer.
  • the weight average molecular weight of this polymer measured by GFC was 660,000, and the polydispersity was 3.6 (Synthesis polymer 11).
  • the polymer was obtained as a reaction product by heating and stirring while maintaining the above environment for 24 hours.
  • the reaction product was reprecipitated with hexane, a poor solvent, and the precipitate was collected by filtration and dried under reduced pressure.
  • the obtained powder was dissolved in pure water, and the solution was transferred to a dialysis tube. Dialysis was performed for 72 hours to purify the reaction product.
  • the solution containing the reaction product was filtered through a glass fiber 1.0 ⁇ m filter (manufactured by AS ONE Corporation, model number: SYGF0605MNXX104), and the obtained filtrate was freeze-dried to obtain a temperature-responsive polymer.
  • the weight average molecular weight of this polymer measured by GFC was 570,000, and the polydispersity was 3.6 (Synthesis example polymer 12).
  • reaction product was polymerized by irradiating with ultraviolet light at about 25 ° C. for 19 hours.
  • the reaction product became viscous after 5 hours and solidified (gelled) after 18 hours, and a polymer was obtained as a reaction product.
  • the reaction product was poorly soluble in 2-propanol, and only a part of the reaction product was transferred to a dialysis tube.
  • the solution was a stringy viscous material and was difficult to handle.
  • reaction product was polymerized by irradiating with ultraviolet light at about 25 ° C. for 19 hours.
  • the reaction product became viscous after 5 hours and solidified after 18 hours to obtain a polymer as a reaction product.
  • the reaction product was poorly soluble in 2-propanol, and only a partially dissolved solution was transferred to a dialysis tube. The solution was a stringy viscous material and was difficult to handle. Then, dialysis was performed for 72 hours to purify the reaction product.
  • the solution containing the reaction product was filtered through a glass fiber 1.0 ⁇ m filter (manufactured by AS ONE Corporation, model number: SYGF0605MNXX104), and the obtained filtrate was lyophilized to obtain Polymer 2 of Comparative Synthesis Example (yield). : 2.6 g, yield: 26%).
  • reaction product was polymerized by irradiating with ultraviolet light at about 25 ° C. for 19 hours.
  • the reaction product became viscous after 5 hours and solidified after 18 hours to obtain a polymer as a reaction product.
  • the reaction product was poorly soluble in 2-propanol, and only a partially dissolved solution was transferred to a dialysis tube. The solution was a stringy viscous material and was difficult to handle. Then, dialysis was performed for 72 hours to purify the reaction product.
  • the solution containing the reaction product was filtered through a glass fiber 1.0 ⁇ m filter (manufactured by AS ONE Corporation, model number: SYGF0605MNXX104), and the obtained filtrate was lyophilized to obtain Polymer 3 of Comparative Synthesis Example (yield). : 3.3 g, yield: 33%).
  • Example 1> Composition analysis by 1H-NMR measurement of polymer
  • the nuclear magnetic resonance spectra (NMR) of the synthetic examples Polymers 1 to 12 and Comparative Synthetic Examples Polymers 1 to 3 were measured by using a nuclear magnetic resonance apparatus (manufactured by BRUKER, model number: ASCEnd500) with heavy water (D 2 O) as a standard substance.
  • D 2 O heavy water
  • the ratio was 99/1 in all of Comparative Synthesis Examples 1, 2, and 3, and it was difficult to control the ratio of DM and MA. From the above results, it was confirmed that in the polymer synthesized by thermal polymerization, the ratio of DM to MA can be controlled, and the polymer can be obtained in higher yield, as compared with the polymer synthesized by photopolymerization. Table 1 shows the detailed results.
  • Example polymers 3 and 8 having different molecular weights were respectively dissolved in sterilized water so as to have a concentration of 0.5 mg / mL to prepare a base film forming agent for cell culture.
  • an inkjet device manufactured by MICROJET, model number: LaboJet-600
  • 200 nL was applied to the silicon substrate treated with hexamethyldisilazane.
  • the surface shape of the coated film was measured using a fine shape measuring device (manufactured by Kosaka Laboratory Co., Ltd., model number: ET-4000A).
  • the measuring conditions were a measuring force of 100 ⁇ N and a feeding speed of 0.05 mm / sec.
  • the periphery of the coating film was raised, and the inside became flat.
  • a swell was observed at the center in addition to the swell at the periphery of the coating film. It was found that the cross-sectional shape of the coating film changed depending on the molecular weight and molecular weight distribution of the polymer.
  • Example 3 Production of Polymer Aqueous Solution for Production of Base Film Forming Agent for Cell Culture Synthesis
  • Polymer 1 to Synthesis Example 12 were each dissolved in sterile water to a concentration of 1 mg / mL, and polymer aqueous solutions 1 to 12 were dissolved. Was manufactured.
  • Example 4 Cell aggregate production test> (4-1. Preparation of low cell adhesion plate)
  • a coating solution was prepared from a copolymer-containing varnish according to the manufacturing method described in Example 30 of WO 2014/196650.
  • the prepared coating solution was added to a well of a 12-well cell culture plate (# 351143, manufactured by BD Bioscience) at a concentration of 500 ⁇ L (solid content: 0.5% by mass) / well, and allowed to stand at room temperature for 1 hour. The excess coating solution was removed.
  • the resultant was dried at 50 ° C. overnight using an oven (manufactured by Advantech Toyo Co., Ltd., dryer FC-612). Thereafter, 500 ⁇ L of sterilized water was added per well, and then removed and washed. Similarly, the plate was washed twice more and dried at 50 ° C. overnight to obtain a low cell adhesion plate.
  • the cells used were human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (PromoCell).
  • a mesenchymal stem cell growth medium MesenchymalStemCell Growth Medium2 was used.
  • the cells were statically cultured for 2 days or more using a petri dish (diameter: 10 mL) having a diameter of 10 cm in a state where the concentration of 5% carbon dioxide was maintained in a 37 ° C./CO 2 incubator.
  • the cells were washed with 4 ml of Hepes BSS solution (manufactured by PromoCell), 4 ml of trypsin-EDTA solution (manufactured by PromoCell) was added, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 5 minutes. 4 mL of TrypsinNeutralizing Solution (PromoCell) was added to detach the cells, and the cells were collected. This suspension was centrifuged (manufactured by Tommy Seiko Co., Ltd., model number LC-230, 200 ⁇ g / 3 minutes, room temperature), the supernatant was removed, and the above medium was added to prepare a cell suspension. .
  • Example 5 Cell aggregate production test> (5-1. Production of base film forming agent for cell culture and preparation of polymer coating plate used as base film for cell culture) The 1 mg / mL polymer aqueous solution obtained from Synthesis Example 1, Synthesis Example 10, Synthesis Example 11, and Synthesis Example 12 was diluted with sterile water to 50 ⁇ g / mL, and the base film forming agents for cell culture 5, 6, 7 and 8 were produced. The prepared polymer aqueous solution was dropped onto a low cell adhesion dish (Sumitomo Bakelite Co., Ltd., # MS-9035X) in 1 ⁇ L portions and dried at 50 ° C. for 30 minutes to obtain a polymer coating used as a base film for cell culture used in the test. Got a dish.
  • a low cell adhesion dish Suditomo Bakelite Co., Ltd., # MS-9035X
  • the cells used were human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (PromoCell).
  • a mesenchymal stem cell growth medium MesenchymalStemCell Growth Medium2 was used.
  • the cells were statically cultured for 2 days or more using a petri dish (diameter: 10 mL) having a diameter of 10 cm in a state where the concentration of 5% carbon dioxide was maintained in a 37 ° C./CO 2 incubator.
  • the cells were washed with 4 ml of Hepes BSS solution (manufactured by PromoCell), 4 ml of trypsin-EDTA solution (manufactured by PromoCell) was added, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 5 minutes. 4 mL of TrypsinNeutralizing Solution (PromoCell) was added to detach the cells, and the cells were collected. This suspension was centrifuged (manufactured by Tommy Seiko Co., Ltd., model number LC-230, 220 ⁇ g / 3 minutes, room temperature), the supernatant was removed, and the above medium was added to prepare a cell suspension. .
  • the cell suspension was added to the plate prepared above so as to have a density of 2.7 ⁇ 10 6 cells / 3 mL / dish (3 ⁇ 10 5 cells / cm 2 ). Then, it was left still in a 37 ° C./CO 2 incubator for 2 hours while keeping the 5% carbon dioxide concentration. After standing, the non-adherent cells and the medium were removed, and the cells were washed with PBS, leaving only the adherent cells on the wells. After washing, a fresh medium was added at 2 mL / dish, and the state of the adherent cells was observed and photographed using EVOS FL Auto (manufactured by ThermoFisher Scientific). As a result, as shown in FIG. 4, the base film forming agent 5 for cell culture, the base film forming agent 6 for cell culture, the base film forming agent 7 for cell culture, and Of the cells was confirmed.
  • the polymer obtained by the production method of the present invention can be used as a base film forming agent for cell culture.
  • a base film for cell culture and a cell culture container containing the same can be produced.

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Abstract

細胞培養の下地膜として使用するポリマーの製造方法、細胞培養の下地膜形成剤、下地膜及び細胞培養容器の製造方法を提供すること。　下記式（Ｉ）： ［式中、 Ｕａ１及びＵａ２は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、Ｒa１は、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、Ｒa２は、炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキレン基を表す］で表されるモノマー、ラジカル重合開始剤及び有機溶媒を含む混合物を調製する調製工程、及び前記混合物を昇温、撹拌し、モノマーを重合させ重合体を調製する重合工程 を含む、細胞培養の下地膜として使用するポリマーの製造方法、である。

Description

細胞培養の下地膜として使用するポリマーの製造方法及び細胞培養容器
　本発明は、細胞培養の下地膜として使用するポリマーの製造方法及び前記下地膜を備える細胞培養容器の製造に関する。
　２－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）の重合体である、ポリ（２－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノエチルメタクリレート）（ＰＤＭＡＥＭＡ）は、約３２℃の曇点を有する温度応答性ポリマーとして知られている。
　従来のＰＤＭＡＥＭＡの製造方法では、ＤＭＡＥＭＡを含む混合物を調製して（調製工程）、その後、この混合物に紫外線を照射して（照射工程）ＤＭＡＥＭＡをラジカル重合させることによって、ＰＤＭＡＥＭＡを製造する。
　ここで、ＰＤＭＡＥＭＡの側鎖に結合する、カチオン性の２－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノエチル基を含むエステル基の一部を、加水分解によりアニオン性のカルボキシル基に変換することによって、物性を変化させたＰＤＭＡＥＭＡ由来のポリマーを製造する需要も存在していた。
　しかしながら、上記従来のＰＤＭＡＥＭＡの製造方法を用いて、カチオン性の２－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノエチル基、及びアニオン性のカルボキシル基を有するＰＤＭＡＥＭＡ由来のポリマーを製造する場合、側鎖にエステル基を介してカチオン性の２－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノエチル基を有するＤＭＡＥＭＡを、紫外線を照射によりラジカル重合させた後、エステル基の一部を加水分解することによって、アニオン性のカルボキシル基を生じさせる必要があり、製造に要する工程が多い、また加水分解の比率の制御が困難、さらに分子量制御が困難という問題があった。
　かかる問題を解決するため、特許文献１では、ＤＭＡＥＭＡを水存在下で紫外線照射しラジカル重合させることによって、カチオン性官能基及びアニオン性官能基を有する、ポリ（２－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノエチルメタクリレート）由来のポリマーの製造が報告されている（例えば、特許文献１参照）。
　しかしながら、上記ＰＤＭＡＥＭＡの製造方法を用いた場合でも、カチオン性官能基とアニオン性官能基の割合を制御するのが困難、また分子量の制御が困難という課題があり、さらにアニオン性官能基としてＤＭＡＥＭＡを加水分解したメタクリル酸のみしか使用できないという問題があった。
　特許文献２では、ＤＭＡＥＭＡを水の非存在下で紫外線照射することによって、ＰＤＭＡＥＭＡを調製し、引き続きアニオン性モノマーを導入して紫外線照射することによって、ＤＭＡＥＭＡブロック配列とＤＭＡＥＭＡとアニオン性モノマーのランダム配列を有するポリマーの製造が報告されている。上記製造方法ではアニオン性官能基の選択性を付与できる（例えば、特許文献２参照）。
　しかしながら、上記の製造方法を用いた場合でもカチオン性官能基とアニオン性官能基の割合を制御するのは困難であり、また分子量や分子量分布の制御が困難であった。
特開２０１４－１６２８６５号公報 特開２０１７－１４３２３号公報
Wetering P et al, J Controlled Release 49, p59-69, 1997. Wetering P at al, Macromolecules 31, p8063-8068, 1998.
　本発明は、紫外線のような光照射に拠らず、カチオン性官能基を有するモノマーと、好ましくはさらにアニオン性官能基を有するモノマーとから、ポリ（２－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノエチルメタクリレート）由来のポリマーを、分子量や分子量分布を制御しながら、好ましくはカチオン性官能基とアニオン性官能基の割合を制御しながら簡便に製造すること、さらに上記ポリマーを含む細胞培養の下地膜、細胞培養の下地膜形成剤及び細胞培養容器を提供することを目的とする。
　すなわち、本発明は、以下のとおりである：
［１］
　下記式（Ｉ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
［式中、
　Ｕａ１及びＵａ２は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、Ｒa１は、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、Ｒa２は、炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキレン基を表す］で表されるモノマー、ラジカル重合開始剤及び有機溶媒を含む混合物を調製する調製工程、及び前記混合物を昇温、撹拌し、モノマーを重合させ重合体を調製する重合工程
を含む、細胞培養の下地膜として使用するポリマーの製造方法。
［２］
　さらに式（ＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
［式中、
　Ｒｂは、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表す］で表されるモノマーを上記混合物中に含む、［１］に記載のポリマーの製造方法。
［３］
　さらに２つ以上の炭素－炭素不飽和結合を有するモノマーを上記混合物中に含む、［１］又は［２］に記載のポリマーの製造方法。
［４］
　上記２つ以上の炭素－炭素不飽和結合を有するモノマーが、下記式（ＩＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
［式中、
　Ｒｃ及びＲｄは、それぞれ独立して、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、Ｒeは、炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキレン基を表し、ｎは１～５０の数を表す］で表されるモノマーである、［３］に記載のポリマーの製造方法。
［５］
　前記ポリマー中の式（Ｉ）で表されるモノマー由来の単位／式（ＩＩ）で表されるモノマー由来の単位のモル比が、１００／０～５０／５０である、［１］～［４］何れか一項に記載のポリマーの製造方法。
［６］
　ポリマーの重量平均分子量（Ｍｎ）が、２０，０００～１，０００，０００であり、かつポリマーの重量平均分子量（Ｍｗ）と前記数平均分子量（Ｍｎ）との比（Ｍｗ／Ｍｎ）が、１．０１～１０．００である、［１］～［５］何れか１項に記載のポリマーの製造方法。
［７］
　細胞を接着させた後に剥離させて、細胞凝集塊を得るための細胞培養の下地膜として使用するポリマーである、［１］～［６］いずれか１項記載のポリマーの製造方法。
［８］
　［１］～［７］何れか１項に記載の製造方法により得られるポリマーと、含水溶液を混合する工程を含む、細胞培養の下地膜形成剤の製造方法。
［９］
　［８］記載の製造方法により得られる細胞培養の下地膜形成剤を、容器又は基板の表面に塗布し乾燥する工程を含む、細胞培養の下地膜の製造方法。
［１０］
　上記の塗布・乾燥工程前に、下記式（ａ）で表される有機基を含む繰り返し単位と、下記式（ｂ）で表される有機基を含む繰り返し単位とを含む共重合体：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
［式中、
　Ｕａ１１、Ｕａ１２、Ｕｂ１１、Ｕｂ１２及びＵｂ１３は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、Ａｎ－は、ハロゲン化物イオン、無機酸イオン、水酸化物イオン及びイソチオシアネートイオンからなる群から選ばれる陰イオンを表す］
と、溶媒とを含むコーティング膜形成用組成物を容器又は基板の表面に塗布し乾燥する工程をさらに含む、［９］に記載の細胞培養の下地膜の製造方法。
［１１］
　上記容器又は基板が、細胞の付着抑制能を有する、［９］に記載の細胞培養の下地膜の製造方法。
［１２］
　［８］に記載の製造方法により得られた細胞培養の下地膜形成剤を、容器又は基板の表面に塗布し乾燥する工程を含む、細胞培養容器の製造方法。
［１３］
　上記塗布・乾燥工程前に、下記式（ａ）で表される有機基を含む繰り返し単位と、下記式（ｂ）で表される有機基を含む繰り返し単位とを含む共重合体：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
　［式中、
　Ｕａ１１、Ｕａ１２、Ｕｂ１１、Ｕｂ１２及びＵｂ１３は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、Ａｎ－は、ハロゲン化物イオン、無機酸イオン、水酸化物イオン及びイソチオシアネートイオンからなる群から選ばれる陰イオンを表す］
と、溶媒とを含むコーティング膜形成用組成物を容器又は基板の表面に塗布し乾燥する工程をさらに含む、［１２］に記載の細胞培養容器の製造方法。
［１４］
　上記容器又は基板が、細胞の付着抑制能を有する、［１２］に記載の細胞培養容器の製造方法。
［１５］
　下記式（Ｉ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
［式中、
　Ｕａ１及びＵａ２は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、Ｒa１は、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、Ｒa２は、炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキレン基を表す］で表されるモノマー由来の単位を含む重合体を細胞培養の下地膜として使用する、細胞凝集塊の製造方法。
［１６］
　上記重合体が、さらに式（ＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
［式中、
　Ｒｂは、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表す］で表されるモノマー由来の単位を含む共重合体である、［１５］に記載の細胞凝集塊の製造方法。
［１７］
　下記式（Ｉ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
［式中、
　Ｕａ１及びＵａ２は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、Ｒa１は、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、Ｒa２は、炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキレン基を表す］で表されるモノマー由来の単位を含む重合体の、細胞を接着させた後に剥離させて、細胞凝集塊を得るための細胞培養の下地膜としての使用。
［１８］
　上記重合体が、さらに式（ＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
［式中、
　Ｒｂは、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表す］で表されるモノマー由来の単位を含む共重合体である、［１７］に記載の、細胞を接着させた後に剥離させて、細胞凝集塊を得るための細胞培養の下地膜としての使用。
　本願発明によれば、紫外線のような光照射に拠らず、カチオン性官能基を有するモノマーと、好ましくはさらにアニオン性官能基を有するモノマーとから、ポリ（２－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノエチルメタクリレート）由来のポリマーを、分子量や分子量分布を制御しながら、さらにはカチオン性官能基とアニオン性官能基の割合を任意に制御しながら簡便に製造することができる。分子量を制御しながら製造することで、基材に対する塗布性を容易に向上させることができる。
実施例２の（塗布膜の表面形状観察）にて、合成例３及び合成例８のポリマーの接触針膜厚計による表面形状測定結果を示す図である。 実施例４の（４－３．細胞付着実験）にて、合成例３及び合成例４のポリマーを下地膜として備えるポリマーコーティングプレートにおける接着細胞の様子を観察した写真である。 実施例４の（４－４．細胞凝集塊の観察）にて、合成例３及び合成例４のポリマーを下地膜として備えるポリマーコーティングプレートにおける細胞凝集塊の様子を観察した写真である。 実施例５の（５－３．細胞付着実験）にて、合成例１、１０、１１及び１２のポリマーを下地膜として備えるポリマーコーティングディッシュにおける細胞の様子を観察した写真である。 実施例５の（５－４．細胞凝集塊の観察）にて、合成例１、１０、１１及び１２のポリマーを下地膜として備えるポリマーコーティングディッシュにおける細胞凝集塊の様子を観察した写真である。
［細胞培養の下地膜として使用するポリマー］
　本願の細胞培養の下地膜として使用するポリマーは、
　下記式（Ｉ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
［式中、
　Ｕａ１、Ｕａ２は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、Ｒa１は、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、Ｒa２は、炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキレン基を表す］で表されるカチオン性モノマーを重合することで得られる。
上記ポリマーは、上記式（Ｉ）で表されるカチオン性モノマーと共に、下記式（ＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
［式中、
　Ｒｂは、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表す］で表されるアニオン性モノマーを重合することで得られる共重合体であることが好ましい。
　本明細書において、他に定義のない限り、「炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基」としては、例えばメチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｓ－ブチル基、t－ブチル基、ｎ－ペンチル基、１－メチルブチル基、２－メチルブチル基、３－メチルブチル基、１，１－ジメチルプロピル基、１，２－ジメチルプロピル基、２，２－ジメチルプロピル基又は１－エチルプロピル基が挙げられる。
　Ｒa１及びＲｂは、それぞれ独立して、水素原子及びメチル基から選ばれることが好ましい。
　Ｕａ１及びＵａ２は、それぞれ独立して、水素原子、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基及びｎ－ブチル基から選ばれることが好ましいが、メチル基又はエチル基であることが好ましく、メチル基が最も好ましい。　
　本明細書において、他に定義のない限り、「炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキレン基」としては、例えばメチレン基、エチレン基、プロピレン基、トリメチレン基、テトラメチレン基、１－メチルプロピレン基、２－メチルプロピレン基、ジメチルエチレン基、エチルエチレン基、ペンタメチレン基、１－メチル－テトラメチレン基、２－メチル－テトラメチレン基、１，１－ジメチル－トリメチレン基、１，２－ジメチル－トリメチレン基、２，２－ジメチル－トリメチレン基、１－エチル－トリメチレン基等が挙げられる。これらの中で、Ｒa２としてはエチレン基及びプロピレン基から選ばれることが好ましい。 
　したがって、上記式（Ｉ）で表されるカチオン性モノマーとしては、２－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ－イソプロピルアクリルアミドなどが挙げられ、２－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノエチルメタクリレートが好ましい。上記式（ＩＩ）で表されるアニオン性モノマーとしては、アクリル酸、メタクリル酸などが挙げられ、メタクリル酸が好ましい。
　前記ポリマー中の式（Ｉ）で表されるモノマー由来の単位／式（ＩＩ）で表されるモノマー由来の単位のモル比が、１００／０～５０／５０である。好ましくは９８／２～５０／５０である。より好ましくは９８／２～６０／４０であり、特に好ましくは９８／２～７０／３０である。
　式（ＩＩ）のモル比が５１以上であると、ポリマーのアニオン性が過剰となり、細胞の接着力が低下するためである。
（２つ以上の炭素―炭素不飽和結合を有するモノマー）
　上記ポリマーは、式（Ｉ）／式（ＩＩ）で表されるモノマーと共に、さらに２つ以上の炭素－炭素不飽和結合を有するモノマーとを重合することで得られるポリマーであってもよい。２つ以上の炭素－炭素不飽和結合を有するモノマーとは、具体的には、２つ以上の炭素－炭素二重結合を有するモノマーであり、例えば多官能アクリレート化合物、多官能アクリルアミド化合物、多官能ポリエステル、又はイソプレン化合物などが挙げられる。
　好ましい具体例としては下記式（ＩＩＩ）～（Ｖ）で表されるモノマーが挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
　式中、Ｒｃ及びＲｄは、それぞれ独立して、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、Ｒeは、炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキレン基を表し、ｎは１～５０の数を表す。これらの中で、式（ＩＩＩ）で表されるモノマーであることが好ましい。
　前記ポリマー全体に対する式（ＩＩＩ）～（Ｖ）で表されるモノマーのモル比は、０～５．０％であることが好ましい。さらに好ましくは０～３．０％である。
　式（ＩＩＩ）～（Ｖ）のモル比が５．０％以上であると、過度な架橋による高分子量化により、製造中にゲル化して製造を困難にする恐れがあるためである。
　Ｒｃ及びＲｄは、それぞれ独立して、水素原子及びメチル基から選ばれることが好ましい。
　Ｒｅはメチレン基、エチレン基及びプロピレン基から選ばれることが好ましく、エチレン基が最も好ましい。
　ｎは１～５０の数であるが、ｎは１～３０の数であることが好ましく、ｎは１～１０の数であることが好ましい。
　前記ポリマー全体に対する式（ＩＩ）で表されるモノマーの占めるモル％の値と、前記調製工程時のモノマー仕込み量全体に対する式（ＩＩ）で表される単量体の占めるモル％の値の差が、０～１０モル％である。本願のポリマーは後述する製造方法により、モノマー仕込み比と、製造されたポリマーの実測値との差が少なく、０～１０モル％である。さらに好ましくは０～８モル％である。
　前記ポリマーの数平均分子量（Ｍｎ）は、２０，０００～１，０００，０００であり、５０，０００～８００，０００であることがさらに好ましい。
　前記ポリマーの重量平均分子量（Ｍｗ）と前記数平均分子量（Ｍｎ）との比（Ｍｗ／Ｍｎ）が、１．０１～１０．００であり、１．２～８．０であることが好ましく、１．４～６．０であることが好ましく、１．５～５．０であることが好ましく、１．６～４．５であることが好ましい。
　前記数平均分子量（Ｍｎ）と数平均分子量（Ｍｎ）は、例えば実施例に記載のGel Filtration Chromatographyにより求めることができる。
　本願のポリマーを利用することで、細胞を接着させた後に剥離させて細胞凝集塊を形成させることが可能である。なお細胞凝集塊とは、細胞が凝集した結果形成する構造体を示し、球状やリング状などのように形状が限定されない。従来の細胞低接着プレート上での非接着培養により作製される細胞凝集塊と比較し、接着面積の規定による細胞凝集塊のサイズ調整（任意の大きさの細胞凝集塊が製造できる）などの点でメリットがある。
［細胞培養の下地膜形成剤として使用するポリマーの製造方法］
　本願のポリマーは、熱重合法により製造することができる。例えば上記式（Ｉ）のモノマーを有機溶媒に溶解し、ラジカル重合開始剤を添加、必要に応じて次いで上記式（ＩＩ）、さらに必要に応じて２つ以上の炭素－炭素不飽和結合を有するモノマー（式（ＩＩＩ）～（Ｖ）で表されるモノマー等）を加え混合物とした後、十分に攪拌して均一とした後、窒素フローしながら、例えば５１℃以上、例えば５１～１８０℃、５１～１５０℃、５１～１３０℃、５１～１００℃、例えば溶媒のリフラックス温度（例えばテトラヒドロフランでは６６～８５℃）に昇温して、例えば１～４８時間攪拌することで重合体（ポリマー）が得られる。得られたポリマーを再沈殿、透析により精製してもよい。
　一の実施態様では、上記式（Ｉ）のモノマーを溶媒に溶解し、重合開始剤を添加、必要に応じて次いで上記式（ＩＩ）のモノマーを、溶媒中で、両化合物の合計濃度０．０１質量％乃至４０質量％にて反応（重合）させる工程を含む製造方法により調製することができる。
　上記重合において使用する有機溶媒としては、例えばテトラヒドロフラン、１，４－ジオキサンなどのエーテル溶媒、メタノール、エタノール、イソプロパノールなどの炭素原子数１乃至４の脂肪族アルコール溶媒、トルエンなどの芳香族炭化水素溶媒あるいはその混合溶媒が挙げられる。
　重合反応を効率的に進めるためには、ラジカル重合開始剤を使用することが望ましい。ラジカル重合開始剤の例としては、ジメチル　１，１’－アゾビス（１－シクロヘキサンカルボキシレート）（ＶＥ－０７３、富士フイルム和光純薬（株）製）、２，２’－アゾビス（２，４－ジメチルバレロニトリル）（Ｖ－６５、富士フイルム和光純薬（株）製）、２，２’－アゾビス（イソブチロニトリル）（ＡＩＢＮ、富士フイルム和光純薬（株）製）、２，２’－アゾビス［Ｎ－（２－カルボキシエチル）－２－メチルプロピオンアミジン］ｎ水和物（ＶＡ-０５７、富士フイルム和光純薬（株）製）、２，２’－（Ｎ－ブチル－２－メチルプロピオンアミド）（ＶＡｍ-１１０、富士フイルム和光純薬（株）製）などのアゾ重合開始剤が挙げられる。
　重合開始剤の添加量としては、重合に用いられるモノマーの合計重量に対し、０．０５質量％～５質量％である。
　重合開始剤の使用は、重合反応の効率化のみならず、末端官能基の修飾によるポリマー物性の調整が可能となる。
［細胞培養の下地膜形成剤の製造方法］
　前記ポリマーに、自体公知の方法にて含水溶液を混合させることで、細胞培養の下地膜形成剤が製造できる。
　含水溶液とは、水、生理食塩水又はリン酸緩衝溶液などの塩含有水溶液、あるいは水又は塩含有水溶液とアルコールとを組み合わせた混合溶媒が挙げられる。アルコールとしては、炭素原子数２乃至６のアルコール、例えば、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、１－ブタノール、２－ブタノール、イソブタノール、ｔ－ブタノール、１－ペンタノール、２－ペンタノール、３－ペンタノール、１－ヘプタノール、２－ヘプタノール、２，２－ジメチル－１－プロパノール（＝ネオペンチルアルコール）、２－メチル－１－プロパノール、２－メチル－１－ブタノール、２－メチル－２－ブタノール（＝ｔ－アミルアルコール）、３－メチル－１－ブタノール、３－メチル－３－ペンタノール、シクロペンタノール、１－ヘキサノール、２－ヘキサノール、３－ヘキサノール、２，３－ジメチル－２－ブタノール、３，３－ジメチル－１－ブタノール、３，３－ジメチル－２－ブタノール、２－エチル－１－ブタノール、２－メチル－１－ペンタノール、２－メチル－２－ペンタノール、２－メチル－３－ペンタノール、３－メチル－１－ペンタノール、３－メチル－２－ペンタノール、３－メチル－３－ペンタノール、４－メチル－１－ペンタノール、４－メチル－２－ペンタノール、４－メチル－３－ペンタノール及びシクロヘキサノールが挙げられ、単独で又はそれらの組み合わせの混合溶媒を用いてもよい。
　さらに下地膜形成剤は、上記共重合体と溶媒の他に、必要に応じて得られる下地膜の性能を損ねない範囲で他の物質を添加することもできる。他の物質としては、ｐＨ調整剤、架橋剤、防腐剤、界面活性剤、容器又は基板との密着性を高めるプライマー、防カビ剤及び糖類等が挙げられる。
［細胞培養の下地膜の製造方法、細胞培養容器の製造方法、細胞培養容器］
　前記細胞培養の下地膜形成剤を、容器又は基板の表面に塗布し乾燥することにより、細胞培養の下地膜、該下地膜を含む細胞培養容器が製造できる。ここで「表面」とは、細胞又は細胞培養液などの内容物と接する面を指す。
　容器又は基板としては、例えば、細胞の培養に一般的に用いられるペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュなどのシャーレ又はディッシュ、細胞培養フラスコ、スピナーフラスコなどのフラスコ、プラスチックバッグ、テフロン（登録商標）バッグ、培養バッグなどのバッグ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マルチプレート、マルチウェルプレートなどのプレート、チャンバースライド、チューブ、トレイ、ローラーボトルなどのボトル等が挙げられる。好ましくは、シャーレ又はディッシュ、プレート、トレイが挙げられる。
　また、容器又は基板の材質は、例えば、ガラス、金属、金属含有化合物若しくは半金属含有化合物、活性炭又は樹脂を挙げることができる。金属は、典型金属：（アルカリ金属：Li、Na、K、Rb、Cs；アルカリ土類金属：Ca、Sr、Ba、Ra）、マグネシウム族元素：Be、Mg、Zn、Cd、Hg；アルミニウム族元素：Al、Ga、In；希土類元素：Y、La、Ce、Pr、Nd、Sm、Eu；スズ族元素：Ti、Zr、Sn、Hf、Pb、Th；鉄族元素：Fe、Co、Ni；土酸元素：V、Nb、Ta、クロム族元素：Cr、Mo、W、U；マンガン族元素：Mn、Re；貴金属：Cu、Ag、Au；白金族元素：Ru、Rh、Pd、Os、Ir、Pt等が挙げられる。金属含有化合物若しくは半金属含有化合物は、例えば基本成分が金属酸化物で、高温での熱処理によって焼き固めた焼結体であるセラミックス、シリコンのような半導体、金属酸化物若しくは半金属酸化物（シリコン酸化物、アルミナ等）、金属炭化物若しくは半金属炭化物、金属窒化物若しくは半金属窒化物（シリコン窒化物等）、金属ホウ化物若しくは半金属ホウ化物等の無機化合物の成形体等の無機固体材料、アルミニウム、ニッケルチタン、ステンレス（ＳＵＳ３０４、ＳＵＳ３１６、ＳＵＳ３１６Ｌ等）が挙げられる。
　樹脂としては、天然樹脂若しくはその誘導体、又は合成樹脂いずれでもよく、天然樹脂若しくはその誘導体としては、セルロース、三酢酸セルロース（ＣＴＡ）、ニトロセルロース（ＮＣ）、デキストラン硫酸を固定化したセルロース等、合成樹脂としてはポリアクリロニトリル（ＰＡＮ）、ポリエステル系ポリマーアロイ（ＰＥＰＡ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリスルホン（ＰＳＦ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン（ＰＵ）、エチレンビニルアルコール（ＥＶＡＬ）、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリエステル、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、超高分子量ポリエチレン（ＵＨＰＥ）、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、アクリロニトリル－ブタジエン－スチレン樹脂（ＡＢＳ）又はテフロン（登録商標）が好ましく用いられる。本発明の細胞培養容器の製造では、重合体を、容器又は基板の表面の少なくとも一部に存在するようにコーティングする際に、高温での処理を要しないため、耐熱性が低い樹脂等も適用可能である。
　容器又は基板の材質は１種類であっても２種類以上の組み合わせであってもよい。これらの材質の中において、ガラス、シリコン、シリコン酸化物、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、テフロン（登録商標）、シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）若しくはステンレス（ＳＵＳ３０４、ＳＵＳ３１６、ＳＵＳ３１６Ｌ等）単独、又はこれらから選ばれる組み合わせであることが好ましく、ガラス、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ステンレス（ＳＵＳ３０４、ＳＵＳ３１６、ＳＵＳ３１６Ｌ等）、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）であることが特に好ましい。
　本願の細胞培養の下地膜形成剤の塗布の方式としては、例えばインクジェット法、スクリーン印刷法、スリットコート法、ロール・トゥー・ロール法等を用いることが出来るが、好ましくはインクジェット法又はスクリーン印刷等の印刷技術で行われる。
　別の塗布方法としては、例えば該容器を上記下地膜形成剤に浸漬する、下地膜形成剤を容器に添加し、所定の時間静置する、又はコーティング剤を容器又は基板の表面に塗布する等の方法が用いられるが、容器、一態様として細胞培養容器の場合は、下地膜形成剤を容器に添加し、所定の時間静置する方法によって行われる。添加は、例えば、容器の全容積の０．５乃至１倍量の下地膜形成剤を、シリンジ等を用いて添加することによって行うことができる。静置は、容器又は基板の材質や細胞培養の下地膜形成剤の種類に応じて、時間や温度を適宜選択して実施されるが、例えば、１分から２４時間、好ましくは５分から３時間、１０乃至８０℃で実施される。これにより、容器の表面の少なくとも一部に、好ましくは全体にわたって、細胞培養の下地膜を有する細胞培養容器を製造することができる。
　また、かかる方法により得られる容器又は基板の表面の細胞培養の下地膜は、上記容器又は基板の表面の少なくとも一部と接触させる工程後、好ましくは細胞培養の下地膜形成剤を添加し、所定の時間静置する工程後、乾燥工程を経ずにそのまま、あるいは水又は細胞培養に付される試料の媒質（例えば、水、緩衝液、培地等）を用いての洗浄後に、細胞培養容器として使用することができる。
　すなわち、上記容器又は基板の表面の少なくとも一部と接触させる工程後、好ましくは細胞培養の下地膜形成剤を添加し、所定の時間静置する工程後、４８時間以内、好ましくは２４時間以内、さらに好ましくは１２時間以内、さらに好ましくは６時間以内、さらに好ましくは３時間以内、さらに好ましくは１時間以内に乾燥工程を経ずにそのまま、あるいは水又は細胞培養に付される試料の媒質（例えば、水、緩衝液、培地等、特に好ましくは培地（例えば、ＤＭＥＭ培地（ダルベッコ改変イーグル培地））を用いての洗浄後に、細胞培養容器として使用することができる。
　容器は、乾燥工程に付してもよい。乾燥工程は、大気下又は真空下にて、好ましくは、温度－２００℃乃至２００℃の範囲内で行なう。乾燥工程により、上記下地膜形成剤中の溶媒を取り除くことで、基体へ完全に固着する。
　下地膜は、例えば室温（１０℃乃至３５℃、好ましくは２０℃乃至３０℃、例えば２５℃）での乾燥でも形成することができるが、より迅速に下地膜を形成させるために、例えば４０℃乃至５０℃にて乾燥させてもよい。乾燥温度が－２００℃未満であると、一般的ではない冷媒を使用しなければならず汎用性に欠けることと、溶媒昇華のために乾燥に長時間を要し効率が悪い。乾燥温度が２００℃超であると、ポリマーの熱分解が生じる。より好ましい乾燥温度は１０℃乃至１８０℃、より好ましい乾燥温度は２０℃乃至１５０℃である。
　本願の細胞培養の下地膜は、以上の簡便な工程を経て製造される。
　また、細胞培養の下地膜に残存する不純物、未反応モノマー等を無くすために、水及び電解質を含む水溶液から選ばれる少なくとも１種の溶媒で洗浄する工程を実施してもよい。洗浄は、流水洗浄又は超音波洗浄等が望ましい。上記水及び電解質を含む水溶液は例えば４０℃乃至９５℃の範囲で加温されたものでもよい。電解質を含む水溶液は、ＰＢＳ、生理食塩水（塩化ナトリウムのみを含むもの）、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水、トリス緩衝生理食塩水、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水及びベロナール緩衝生理食塩水が好ましく、ＰＢＳが特に好ましい。固着後は水、ＰＢＳ及びアルコール等で洗浄してもコーティング膜は溶出せずに基体に強固に固着したままである。
　本願の細胞培養の下地膜の膜厚は、最大膜厚と最小膜厚が１～１０００ｎｍの範囲であり、好ましくは５～５００ｎｍの範囲である。
　上記下地膜の塗布・乾燥工程前に、容器又は基板が細胞の付着抑制処理を施されたものであってよい。細胞の付着抑制能を有する容器又は基板は、例えば公知の細胞の付着抑制能を持つコーティング膜形成用組成物を塗布する工程を経て製造出来る。細胞の付着抑制能を有するコーティング膜形成組成物としては、下記式（ａ）で表される有機基を含む繰り返し単位と、下記式（ｂ）で表される有機基を含む繰り返し単位とを含む共重合体：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
　［式中、
　Ｕａ１１、Ｕａ１２、Ｕｂ１１、Ｕｂ１２及びＵｂ１３は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、Ａｎ－は、ハロゲン化物イオン、無機酸イオン、水酸化物イオン及びイソチオシアネートイオンからなる群から選ばれる陰イオンを表す］
と、溶媒とを含むコーティング膜形成用組成物を容器又は基板の表面に塗布し乾燥する工程を含むことが好ましい。
　炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基は、上述のものと同一である。
　上記コーティング膜形成用組成物は例えば、ＷＯ２０１４／１９６６５０に記載されているコーティング膜形成用組成物が使用できる。
　上記コーティング膜形成用組成物の塗布方法としては、特に制限は無く、通常のスピンコート、ディップコート、溶媒キャスト法等の塗布法が用いられる。
　上記コーティング膜の乾燥工程は、大気下又は真空下にて、温度－２００℃乃至１８０℃の範囲内で行なう。乾燥工程により、上記コーティング膜形成用組成物中の溶媒を取り除くと共に、上記共重合体の式（ａ）及び式（ｂ）同士がイオン結合を形成して基体へ完全に固着する。
　上記コーティング膜は、例えば室温（１０℃乃至３５℃、例えば２５℃）での乾燥でも形成することができるが、より迅速にコーティング膜を形成させるために、例えば４０℃乃至５０℃にて乾燥させてもよい。またフリーズドライ法による極低温～低温（－２００℃乃至－３０℃前後）での乾燥工程を用いてもよい。フリーズドライは真空凍結乾燥と呼ばれ、通常乾燥させたいものを冷媒で冷却し、真空状態にて溶媒を昇華により除く方法である。フリーズドライで用いられる一般的な冷媒は、ドライアイスとメタノールを混合媒体（－７８℃）、液体窒素（－１９６℃）等が挙げられる。
　乾燥温度が－２００℃以下であると、一般的ではない冷媒を使用しなければならず汎用性に欠けることと、溶媒昇華のために乾燥に長時間を要し効率が悪い。乾燥温度が２００℃以上であると、コーティング膜表面のイオン結合反応が進みすぎて該表面が親水性を失い、生体物質付着抑制能が発揮されない。より好ましい乾燥温度は１０℃乃至１８０℃、より好ましい乾燥温度は２５℃乃至１５０℃である。
　乾燥後、該コーティング膜上に残存する不純物、未反応モノマー等を無くすため、さらには膜中の共重合体のイオンバランスを調節するために、水及び電解質を含む水溶液から選ばれる１以上の溶媒で流水洗浄又は超音波洗浄等で洗浄することが望ましい。上記水及び電解質を含む水溶液は例えば４０℃乃至９５℃の範囲で加温されたものでもよい。電解質を含む水溶液は、ＰＢＳ、生理食塩水（塩化ナトリウムのみを含むもの）、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水、トリス緩衝生理食塩水、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水及びベロナール緩衝生理食塩水が好ましく、ＰＢＳが特に好ましい。固着後は水、ＰＢＳ及びアルコール等で洗浄してもコーティング膜は溶出せずに基体に強固に固着したままである。形成されたコーティング膜は生体物質が付着してもその後水洗等にて容易に除去することができ、上記コーティング膜が形成された基体表面は、生体物質の付着抑制能を有する。
　上記コーティング膜の膜厚は、好ましくは５～１０００ｎｍであり、さらに好ましくは５～５００ｎｍである。
　また、上記細胞培養容器として、市販の細胞低接着処理済みの細胞培養皿、細胞の付着抑制能を有する細胞培養器を使用してもよい、例えば特開２００８－６１６０９号公報に記載されている細胞培養容器が使用できるが、これに限定されるものではない。
　細胞の付着抑制能を有するとは、例えばＷＯ２０１６/０９３２９３の実施例に記載した方法で行う蛍光顕微鏡によるコーティング膜無し、又は細胞低吸着処理無しと比較した場合の相対吸光度（ＷＳＴ　Ｏ．Ｄ．４５０ｎｍ）（％）（（実施例の吸光度（ＷＳＴ　Ｏ．Ｄ．４５０ｎｍ））／（比較例の吸光度（ＷＳＴ　Ｏ．Ｄ．４５０ｎｍ）））が５０％以下、好ましくは３０％以下、さらに好ましくは２０％以下であることを意味する。
［細胞凝集塊の製造方法］
　本願の細胞凝集塊の製造方法は、下記式（Ｉ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
［式中、
　Ｕａ１、Ｕａ２は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、Ｒa１は、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、Ｒa２は、炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキレン基を表す］で表されるモノマー由来の単位を含む重合体より得た細胞培養の下地膜の上で、それ自体公知の方法、例えば実施例に記載の方法で行う細胞凝集塊の製造方法である。
　上記細胞培養の下地膜は、式（Ｉ）で表されるモノマー由来の単位と共に、下記式（ＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
［式中、
　Ｒｂは、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表す］で表されるモノマー由来の単位を含む共重合体より得た下地膜であることが好ましい。
　以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳しく具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
＜分子量の測定方法＞
　下記合成例に示す重量平均分子量はGel Filtration Chromatography（以下、ＧＦＣと略称する）による結果である。
（測定条件）
・装置：ＨＬＣ－８３２０ＧＰＣ（東ソー（株）製）
・ＧＦＣカラム：TSKgel G６０００+３０００PWXL-CP
・流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
・溶離液：塩含有の水／有機混合溶媒
・カラム温度：４０℃
・検出器：ＲＩ
・注入濃度：ポリマー固形分０．０５質量％
・注入量：１００μＬ
・検量線：三次近似曲線
・標準試料：ポリエチレンオキサイド（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）×１０種
＜合成例１＞熱重合による細胞培養の下地膜形成剤として使用するポリマーの製造（１）
 メタクリル酸２－（ジメチルアミノ）エチル（東京化成工業（株）製）９．００ｇにテトラヒドロフラン２７．０４ｇを加え十分に溶解した。次いでジメチル　１，１’－アゾビス（１－シクロヘキサンカルボキシレート）（ＶＥ－０７３、富士フイルム和光純薬（株）製）０．０１ｇを、２０℃以下に保ちながら、上記テトラヒドロフラン溶液に加えた。十分に攪拌して均一となった上記全てのものが入った混合液を冷却管付きの３つ口フラスコに加えて窒素フローし、撹拌しながらリフラックス温度まで昇温した。２４時間上記環境を維持した状態で加熱撹拌することで重合体が反応生成物として得られた。反応生成物を貧溶媒であるヘキサンで再沈殿させ、析出物を濾過により回収し減圧乾燥させた。得られた紛体を純水に溶解させ、溶液を透析チューブに移した。透析を７２時間行い、反応生成物を精製した。
　反応生成物を含む溶液をグラスファイバー製の１．０μｍフィルター（アズワン社製、型番：ＳＹＧＦ０６０５ＭＮＸＸ１０４）で濾過し、得られた濾液を凍結乾燥させることにより、温度応答性ホモポリマーが得られた（収量：６．４ｇ、収率：７１％）。ＧＦＣによるこのポリマーの重量平均分子量は２５０，０００、多分散度は２．０であった（合成例ポリマー１）。
＜合成例２＞熱重合による細胞培養の下地膜形成剤として使用するポリマーの製造（２）
 メタクリル酸２－（ジメチルアミノ）エチル（東京化成工業（株）製）９．００ｇにテトラヒドロフラン３７．１０ｇを加え十分に溶解した。次いでジメチル　１，１’－アゾビス（１－シクロヘキサンカルボキシレート）（ＶＥ－０７３、富士フイルム和光純薬（株）製）０．０２ｇ、メタクリル酸（東京化成工業（株）製）０．２６ｇを、２０℃以下に保ちながら、上記テトラヒドロフラン溶液に加えた。十分に攪拌して均一となった上記全てのものが入った混合液を冷却管付きの３つ口フラスコに加えて窒素フローし、撹拌しながらリフラックス温度まで昇温した。２４時間上記環境を維持した状態で加熱撹拌することで重合体が反応生成物として得られた。反応生成物を貧溶媒であるヘキサンで再沈殿させ、析出物を濾過により回収し減圧乾燥させた。得られた紛体を純水に溶解させ、溶液を透析チューブに移した。透析を７２時間行い、反応生成物を精製した。
　反応生成物を含む溶液をグラスファイバー製の１．０μｍフィルター（アズワン社製、型番：ＳＹＧＦ０６０５ＭＮＸＸ１０４）で濾過し、得られた濾液を凍結乾燥させることにより、温度応答性ポリマーが得られた（収量：６．６ｇ、収率：７１％）。ＧＦＣによるこのポリマーの重量平均分子量は２４，０００、多分散度は２.０であった（合成例ポリマー２）。
＜合成例３＞熱重合による細胞培養の下地膜形成剤として使用するポリマーの製造（３）
 メタクリル酸２－（ジメチルアミノ）エチル（東京化成工業（株）製）１０．００ｇにテトラヒドロフラン４１．９４ｇを加え十分に溶解した。次いでジメチル　１，１’－アゾビス（１－シクロヘキサンカルボキシレート）（ＶＥ－０７３、富士フイルム和光純薬（株）製）０．０１ｇ、メタクリル酸（東京化成工業（株）製）０．４８ｇを、２０℃以下に保ちながら、上記テトラヒドロフラン溶液に加えた。十分に攪拌して均一となった上記全てのものが入った混合液を冷却管付きの３つ口フラスコに加えて窒素フローし、撹拌しながらリフラックス温度まで昇温した。２４時間上記環境を維持した状態で加熱撹拌することで重合体が反応生成物として得られた。反応生成物を貧溶媒であるヘキサンで再沈殿させ、析出物を濾過により回収し減圧乾燥させた。得られた紛体を純水に溶解させ、溶液を透析チューブに移した。透析を７２時間行い、反応生成物を精製した。
　反応生成物を含む溶液をグラスファイバー製の１．０μｍフィルター（アズワン社製、型番：ＳＹＧＦ０６０５ＭＮＸＸ１０４）で濾過し、得られた濾液を凍結乾燥させることにより、温度応答性ポリマーが得られた（収量：７．３ｇ、収率：６９％）。ＧＦＣによるこのポリマーの重量平均分子量は２９０，０００、多分散度は１．９であった（合成例ポリマー３）。
＜合成例４＞熱重合による細胞培養の下地膜形成剤として使用するポリマーの製造（４）
 メタクリル酸２－（ジメチルアミノ）エチル（東京化成工業（株）製）９．００ｇにテトラヒドロフラン３８．２６ｇを加え十分に溶解した。次いでジメチル　１，１’－アゾビス（１－シクロヘキサンカルボキシレート）（ＶＥ－０７３、富士フイルム和光純薬（株）製）０．０２ｇ、メタクリル酸（東京化成工業（株）製）０．５５ｇを、２０℃以下に保ちながら、上記テトラヒドロフラン溶液に加えた。十分に攪拌して均一となった上記全てのものが入った混合液を冷却管付きの３つ口フラスコに加えて窒素フローし、撹拌しながらリフラックス温度まで昇温した。２４時間上記環境を維持した状態で加熱撹拌することで重合体が反応生成物として得られた。反応生成物を貧溶媒であるヘキサンで再沈殿させ、析出物を濾過により回収し減圧乾燥させた。得られた紛体を純水に溶解させ、溶液を透析チューブに移した。透析を７２時間行い、反応生成物を精製した。
　反応生成物を含む溶液をグラスファイバー製の１．０μｍフィルター（アズワン社製、型番：ＳＹＧＦ０６０５ＭＮＸＸ１０４）で濾過し、得られた濾液を凍結乾燥させることにより、温度応答性ポリマーが得られた（収量：７．２ｇ、収率：７５％）。ＧＦＣによるこのポリマーの重量平均分子量は２５０，０００、多分散度は１．９であった（合成例ポリマー４）。
＜合成例５＞熱重合による細胞培養の下地膜形成剤として使用するポリマーの製造（５）
 メタクリル酸２－（ジメチルアミノ）エチル（東京化成工業（株）製）９．００ｇにテトラヒドロフラン４１．００ｇを加え十分に溶解した。次いでジメチル　１，１’－アゾビス（１－シクロヘキサンカルボキシレート）（ＶＥ－０７３、富士フイルム和光純薬（株）製）０．０２ｇ、メタクリル酸（東京化成工業（株）製）１．２３ｇを、２０℃以下に保ちながら、上記テトラヒドロフラン溶液に加えた。十分に攪拌して均一となった上記全てのものが入った混合液を冷却管付きの３つ口フラスコに加えて窒素フローし、撹拌しながらリフラックス温度まで昇温した。２４時間上記環境を維持した状態で加熱撹拌することで重合体が反応生成物として得られた。反応生成物を貧溶媒であるヘキサンで再沈殿させ、析出物を濾過により回収し減圧乾燥させた。得られた紛体を純水に溶解させ、溶液を透析チューブに移した。透析を７２時間行い、反応生成物を精製した。
　反応生成物を含む溶液をグラスファイバー製の１．０μｍフィルター（アズワン社製、型番：ＳＹＧＦ０６０５ＭＮＸＸ１０４）で濾過し、得られた濾液を凍結乾燥させることにより、温度応答性ポリマーが得られた（収量：５．８ｇ、収率：５７％）。ＧＦＣによるこのポリマーの重量平均分子量は２７０，０００、多分散度は２．１であった（合成例ポリマー５）。
＜合成例６＞熱重合による細胞培養の下地膜形成剤として使用するポリマーの製造（６）
 メタクリル酸２－（ジメチルアミノ）エチル（東京化成工業（株）製）９．００ｇにテトラヒドロフラン４４．５８ｇを加え十分に溶解した。次いでジメチル　１，１’－アゾビス（１－シクロヘキサンカルボキシレート）（ＶＥ－０７３、富士フイルム和光純薬（株）製）０．０３ｇ、メタクリル酸（東京化成工業（株）製）２．１１ｇを、２０℃以下に保ちながら、上記テトラヒドロフラン溶液に加えた。十分に攪拌して均一となった上記全てのものが入った混合液を冷却管付きの３つ口フラスコに加えて窒素フローし、撹拌しながらリフラックス温度まで昇温した。２４時間上記環境を維持した状態で加熱撹拌することで重合体が反応生成物として得られた。反応生成物を貧溶媒であるヘキサンで再沈殿させ、析出物を濾過により回収し減圧乾燥させた。得られた紛体を純水に溶解させ、溶液を透析チューブに移した。透析を７２時間行い、反応生成物を精製した。
　反応生成物を含む溶液をグラスファイバー製の１．０μｍフィルター（アズワン社製、型番：ＳＹＧＦ０６０５ＭＮＸＸ１０４）で濾過し、得られた濾液を凍結乾燥させることにより、温度応答性ポリマーが得られた（収量：９．６ｇ、収率：８６％）。ＧＦＣによるこのポリマーの重量平均分子量は２７０，０００、多分散度は２．４であった（合成例ポリマー６）。
＜合成例７＞熱重合による細胞培養の下地膜形成剤として使用するポリマーの製造（７）
 メタクリル酸２－（ジメチルアミノ）エチル（東京化成工業（株）製）１０．００ｇにテトラヒドロフラン４１．９４ｇを加え十分に溶解した。次いでジメチル　１，１’－アゾビス（１－シクロヘキサンカルボキシレート）（ＶＥ－０７３、富士フイルム和光純薬（株）製）０．０１ｇ、メタクリル酸（東京化成工業（株）製）０．４８ｇ、ポリエチレングリコールジメタクリレート（ｎ＝約４）（東京化成工業（株）製）０．２１ｇを、２０℃以下に保ちながら、上記テトラヒドロフラン溶液に加えた。十分に攪拌して均一となった上記全てのものが入った混合液を冷却管付きの３つ口フラスコに加えて窒素フローし、撹拌しながらリフラックス温度まで昇温した。２４時間上記環境を維持した状態で加熱撹拌することで重合体が反応生成物として得られた。反応生成物を貧溶媒であるヘキサンで再沈殿させ、析出物を濾過により回収し減圧乾燥させた。得られた紛体を純水に溶解させ、溶液を透析チューブに移した。透析を７２時間行い、反応生成物を精製した。
　反応生成物を含む溶液をグラスファイバー製の１．０μｍフィルター（アズワン社製、型番：ＳＹＧＦ０６０５ＭＮＸＸ１０４）で濾過し、得られた濾液を凍結乾燥させることにより、温度応答性ポリマーが得られた。ＧＦＣによるこのポリマーの重量平均分子量は６６０，０００、多分散度は３．８であった（合成例ポリマー７）。
＜合成例８＞熱重合による細胞培養の下地膜形成剤として使用するポリマーの製造（８）
 メタクリル酸２－（ジメチルアミノ）エチル（東京化成工業（株）製）１０．００ｇにエタノール４３．３０ｇを加え十分に溶解した。次いでジメチル　１，１’－アゾビス（１－シクロヘキサンカルボキシレート）（ＶＥ－０７３、富士フイルム和光純薬（株）製）０．３１ｇ、メタクリル酸（東京化成工業（株）製）０．４８ｇを、２０℃以下に保ちながら、上記エタノール溶液に加えた。十分に攪拌して均一となった上記全てのものが入った混合液を冷却管付きの３つ口フラスコに加えて窒素フローし、撹拌しながらリフラックス温度まで昇温した。２４時間上記環境を維持した状態で加熱撹拌することで重合体が反応生成物として得られた。反応生成物を貧溶媒であるヘキサンで再沈殿させ、析出物を濾過により回収し減圧乾燥させた。得られた紛体を純水に溶解させ、溶液を透析チューブに移した。透析を７２時間行い、反応生成物を精製した。
　反応生成物を含む溶液をグラスファイバー製の１．０μｍフィルター（アズワン社製、型番：ＳＹＧＦ０６０５ＭＮＸＸ１０４）で濾過し、得られた濾液を凍結乾燥させることにより、温度応答性ポリマーが得られた。ＧＦＣによるこのポリマーの重量平均分子量は８８，０００、多分散度は２．４であった（合成例ポリマー８）。
＜合成例９＞熱重合による細胞培養の下地膜形成剤として使用するポリマーの製造（９）
 メタクリル酸２－（ジメチルアミノ）エチル（東京化成工業（株）製）１０．００ｇにテトラヒドロフラン４１．９４ｇを加え十分に溶解した。次いでジメチル　１，１’－アゾビス（１－シクロヘキサンカルボキシレート）（ＶＥ－０７３、富士フイルム和光純薬（株）製）０．０１ｇ、メタクリル酸（東京化成工業（株）製）０．４８ｇを、２０℃以下に保ちながら、上記テトラヒドロフラン溶液に加えた。十分に攪拌して均一となった上記全てのものが入った混合液を冷却管付きの３つ口フラスコに加えて窒素フローし、撹拌しながら６０℃まで昇温した。２４時間上記環境を維持した状態で加熱撹拌することで重合体が反応生成物として得られた。反応生成物を貧溶媒であるヘキサンで再沈殿させ、析出物を濾過により回収し減圧乾燥させた。得られた紛体を純水に溶解させ、溶液を透析チューブに移した。透析を７２時間行い、反応生成物を精製した。
　反応生成物を含む溶液をグラスファイバー製の１．０μｍフィルター（アズワン社製、型番：ＳＹＧＦ０６０５ＭＮＸＸ１０４）で濾過し、得られた濾液を凍結乾燥させることにより、温度応答性ポリマーが得られた。ＧＦＣによるこのポリマーの重量平均分子量は１４０，０００、多分散度は２．５であった（合成例ポリマー９）。
＜合成例１０＞熱重合による細胞培養の下地膜形成剤として使用するポリマーの製造（１０）
 メタクリル酸２－（ジメチルアミノ）エチル（東京化成工業（株）製）１０．００ｇにエタノール３１．４６ｇを加え十分に溶解した。次いでジメチル　１，１’－アゾビス（１－シクロヘキサンカルボキシレート)（ＶＥ－０７３、富士フイルム和光純薬（株）製）０．０１ｇ、メタクリル酸（東京化成工業（株）製）０．４８ｇを、２０℃以下に保ちながら、上記エタノール溶液に加えた。十分に攪拌して均一となった上記全てのものが入った混合液を冷却管付きの３つ口フラスコに加えて窒素フローし、撹拌しながらリフラックス温度まで昇温した。２４時間上記環境を維持した状態で加熱撹拌することで重合体が反応生成物として得られた。反応生成物を貧溶媒であるヘキサンで再沈殿させ、析出物を濾過により回収し減圧乾燥させた。得られた紛体を純水に溶解させ、溶液を透析チューブに移した。透析を７２時間行い、反応生成物を精製した。
　反応生成物を含む溶液をグラスファイバー製の１．０μｍフィルター（アズワン社製、型番：ＳＹＧＦ０６０５ＭＮＸＸ１０４）で濾過し、得られた濾液を凍結乾燥させることにより、温度応答性ポリマーが得られた。ＧＦＣによるこのポリマーの重量平均分子量は７７０，０００、多分散度は４．１であった（合成例ポリマー１０）。
＜合成例１１＞熱重合による細胞培養の下地膜形成剤として使用するポリマーの製造（１１）
 メタクリル酸２－（ジメチルアミノ）エチル（東京化成工業（株）製）１０．００ｇにエタノール４３．９０ｇを加え十分に溶解した。次いでジメチル　１，１’－アゾビス（１－シクロヘキサンカルボキシレート)（ＶＥ－０７３、富士フイルム和光純薬（株）製）０．０１ｇ、メタクリル酸（東京化成工業（株）製）０．９７ｇを、２０℃以下に保ちながら、上記エタノール溶液に加えた。十分に攪拌して均一となった上記全てのものが入った混合液を冷却管付きの３つ口フラスコに加えて窒素フローし、撹拌しながらリフラックス温度まで昇温した。２４時間上記環境を維持した状態で加熱撹拌することで重合体が反応生成物として得られた。反応生成物を貧溶媒であるヘキサンで再沈殿させ、析出物を濾過により回収し減圧乾燥させた。得られた紛体を純水に溶解させ、溶液を透析チューブに移した。透析を７２時間行い、反応生成物を精製した。
　反応生成物を含む溶液をグラスファイバー製の１．０μｍフィルター（アズワン社製、型番：ＳＹＧＦ０６０５ＭＮＸＸ１０４）で濾過し、得られた濾液を凍結乾燥させることにより、温度応答性ポリマーが得られた。ＧＦＣによるこのポリマーの重量平均分子量は６６０，０００、多分散度は３．６であった（合成例ポリマー１１）。
＜合成例１２＞熱重合による細胞培養の下地膜形成剤として使用するポリマーの製造（１０）
 メタクリル酸２－（ジメチルアミノ）エチル（東京化成工業（株）製）１０．００ｇにエタノール７０．００ｇを加え十分に溶解した。次いでジメチル　１,１'-アゾビス(１-シクロヘキサンカルボキシレート)（ＶＥ－０７３、富士フイルム和光純薬（株）製）０．０１ｇ、メタクリル酸（東京化成工業（株）製）２．３５ｇを、２０℃以下に保ちながら、上記エタノール溶液に加えた。十分に攪拌して均一となった上記全てのものが入った混合液を冷却管付きの３つ口フラスコに加えて窒素フローし、撹拌しながらリフラックス温度まで昇温した。２４時間上記環境を維持した状態で加熱撹拌することで重合体が反応生成物として得られた。反応生成物を貧溶媒であるヘキサンで再沈殿させ、析出物を濾過により回収し減圧乾燥させた。得られた紛体を純水に溶解させ、溶液を透析チューブに移した。透析を７２時間行い、反応生成物を精製した。
反応生成物を含む溶液をグラスファイバー製の１．０μｍフィルター（アズワン社製、型番：ＳＹＧＦ０６０５ＭＮＸＸ１０４）で濾過し、得られた濾液を凍結乾燥させることにより、温度応答性ポリマーが得られた。ＧＦＣによるこのポリマーの重量平均分子量は５７０，０００、多分散度は３．６であった（合成例ポリマー１２）。
＜比較合成例１＞光重合によるポリマーの製造（１）
　容量３０ｍＬの軟質ガラス製の透明なバイアル瓶に、メタクリル酸２－（ジメチルアミノ）エチル（東京化成工業（株）製）１０．００ｇ、及び水５００μＬを加えて、十分に攪拌して均一にした。そして、この混合物（液体）に対して窒素ガスを１５分間パージすることにより、この混合物を脱酸素した。
　その後、この反応物に対して、高圧水銀ランプ（ＵＳＨＩＯ社製、型番：ＵＭ-１０２）を用いて、照度計にて３６５nmにおける照度が０．１mW/cm2となるように距離を調整して約２５℃で１９時間紫外線照射することにより、上記反応物を重合させた。反応物は、５時間後に粘性を帯び１８時間後に固化（ゲル化）して、重合体が反応生成物として得られた。この反応生成物は２－プロパノールに対して難溶性であり、一部溶解した部分のみを透析チューブに移した。なお溶解液は糸引き粘性体であり取り扱いが困難だった。そして、透析を７２時間行い、反応生成物を精製した。 
　反応生成物を含む溶液をグラスファイバー製の１．０μｍフィルター（アズワン社製、型番：ＳＹＧＦ０６０５ＭＮＸＸ１０４）で濾過し、得られた濾液を凍結乾燥させることにより、比較合成例ポリマー１が得られた（収量：１．５ｇ、収率：１５％）。
＜比較合成例２＞光重合によるポリマーの製造（２）
　容量３０ｍＬの軟質ガラス製の透明なバイアル瓶に、メタクリル酸２－（ジメチルアミノ）エチル（東京化成工業（株）製）１０．００ｇ、及び水１０００μＬを加えて、十分に攪拌して均一にした。そして、この混合物（液体）に対して窒素ガスを１５分間パージすることにより、この混合物を脱酸素した。
　その後、この反応物に対して、高圧水銀ランプ（ＵＳＨＩＯ社製、型番：ＵＭ-１０２）を用いて、照度計にて３６５nmにおける照度が０．１mW/cm2となるように距離を調整して約２５℃で１９時間紫外線照射することにより、上記反応物を重合させた。反応物は、５時間後に粘性を帯び１８時間後に固化して、重合体が反応生成物として得られた。この反応生成物は２－プロパノールに対して難溶性であり、一部溶解した溶液のみを透析チューブに移した。なお溶解液は糸引き粘性体であり取り扱いが困難だった。そして、透析を７２時間行い、反応生成物を精製した。 
　反応生成物を含む溶液をグラスファイバー製の１．０μｍフィルター（アズワン社製、型番：ＳＹＧＦ０６０５ＭＮＸＸ１０４）で濾過し、得られた濾液を凍結乾燥させることにより、比較合成例ポリマー２が得られた（収量：２．６ｇ、収率：２６％）。
＜比較合成例３＞光重合によるポリマーの製造（３）
　容量３０ｍＬの軟質ガラス製の透明なバイアル瓶に、メタクリル酸２－（ジメチルアミノ）エチル（東京化成工業（株）製）１０．００ｇ、及び水５００μＬを加えて、十分に攪拌して均一にした。そして、この混合物（液体）に対して窒素ガスを１５分間パージすることにより、この混合物を脱酸素した。
　その後、この反応物に対して、高圧水銀ランプ（ＵＳＨＩＯ社製、型番：ＵＭ-１０２）を用いて、照度計にて３６５nmにおける照度が０．１mW/cm2となるように距離を調整して約２５℃で１９時間紫外線照射することにより、上記反応物を重合させた。反応物は、５時間後に粘性を帯び１８時間後に固化して、重合体が反応生成物として得られた。この反応生成物は２－プロパノールに対して難溶性であり、一部溶解した溶液のみを透析チューブに移した。なお溶解液は糸引き粘性体であり取り扱いが困難だった。そして、透析を７２時間行い、反応生成物を精製した。 
　反応生成物を含む溶液をグラスファイバー製の１．０μｍフィルター（アズワン社製、型番：ＳＹＧＦ０６０５ＭＮＸＸ１０４）で濾過し、得られた濾液を凍結乾燥させることにより、比較合成例ポリマー３が得られた（収量：３．３ｇ、収率：３３％）。
＜実施例１＞（ポリマーの１Ｈ－ＮＭＲ測定による組成解析）
　合成例ポリマー１～１２、比較合成例ポリマー１～３の核磁気共鳴スペクトル（ＮＭＲ）を、核磁気共鳴装置（ＢＲＵＫＥＲ社製、型番：ＡＳＣＥｎｄ５００）を用いて、重水（Ｄ２Ｏ）を標準物質として測定した。下記には、合成例ポリマー１～合成例ポリマー６に共通する代表的なピークを示す。 
　1H-NMR (in D2O) δ 0.8-1.2 (br, -CH2-C(CH3)-), 1.6-2.0 (br, -CH2-C(CH3)-), 2.2-2.4 (br, -N(CH3)2), 2.5-2.7 (br, -CH2-N(CH3)2), 4.0-4.2 (br, -O-CH2-). 
　ここで、主鎖のメチル基-CH2-C(CH3)-（δ 0.8-1.2）のプロトン数（ＤＭＡＥＭＡのホモポリマーの場合はモノマー１分子につき３個）Ａと、側鎖の-O-CH2-基（δ 4.0-4.2）のメチルプロトン数（ＤＭＡＥＭＡのホモポリマーの場合はモノマー１分子につき２個）Ｂとから、側鎖が有するアミノ基の官能基数と、側鎖のカルボキシル基の官能基数との比を算出した。 
　その結果、熱重合で合成した合成例１から１２のメタクリル酸２－（ジメチルアミノ）エチル（以下、「ＤＭ」と略す）／メタクリル酸（以下、「ＭＡ」と略す）の組成比について、合成例１の場合は１００／０、合成例２の場合は９５／５、合成例３の場合は９５／５、合成例４の場合は８８／１２、合成例５の場合は８２／１８、合成例６の場合は７６／２４、合成例７の場合は８９／１１、合成例８～１０の場合は９２／８、合成例１１の場合は８５／１５、合成例１２の場合は７０／３０、となった。光重合で合成した比較合成例の場合について、比較合成例１、２、３の全てにおいて９９／１となりＤＭとＭＡの比率の制御が困難であった。上記の結果から、熱重合により合成したポリマーでは、光重合により合成したポリマーと比較して、ＤＭとＭＡの比率が制御でき、さらに高収率でポリマーを得られることが確認された。 
　詳細な結果を表１に示す。 
　合成例１～１２で合成したポリマーについて、重量平均分子量Ｍｗの範囲は８８，０００～７７０，０００と幅広い範囲で作り分けることが可能だった。また分子量分布（ＰＤＩ）の範囲は、１．９～４．１となっており、小さい分布から比較的大きな分布まで作り分けることが可能だった。またいずれのポリマーもゲル化することなく合成できた。一方、光重合にて本ポリマーを合成した場合は分子量の制御や分子量分布を小さい領域で制御することが難しい。例えば特許公報（特許第５７４６２４０号）では比較合成例１と同様の方法で合成した場合はＰＤＩ＝３．０、比較合成例２と同様の方法で合成した場合はＰＤＩ＝４．３、比較合成例３と同様の方法で合成した場合はＰＤＩ＝７．４、となることが記されている。また光重合では合成時に全てのポリマーがゲル化してしまい、分子量だけでなく反応自体の制御が難しい。分子量分布が極端に大きくなると、低分子量成分の溶出や高分子量成分の析出も懸念される。これらを踏まえると熱重合を用いてポリマーを合成することで、光重合で合成した場合と比較して、分子量や分子量分布を制御しつつ、安定にポリマーを製造できる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000027
＜実施例２＞ 塗布膜の表面形状測定
　分子量の異なる実施例ポリマー３、８をそれぞれ滅菌水で０．５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように溶解させ、細胞培養の下地膜形成剤を製造した。インクジェット装置（ＭＩＣＲＯＪＥＴ社製、型番：ＬａｂｏＪｅｔ－６００）を用いて、ヘキサメチルジシラザン処理したシリコン基板に２００ｎＬずつ塗布した。室温で5分間乾燥させて膜を硬化後に、微細形状測定機（（株）小坂研究所製、型番：ＥＴ-４０００Ａ）を用いて、塗布膜の表面形状を測定した。測定条件は測定力１００μＮ、送り速さ０．０５ｍｍ／ｓｅｃとした。
　合成例ポリマー３（Ｍｗ＝２９０，０００）では塗布膜の周辺部が盛り上がっており、内部は平坦な形状となった。一方で合成例ポリマー８（Ｍｗ＝８８，０００）では、塗布膜周辺部の盛り上がりに加え中心部にも盛り上がりが観測された。ポリマーの分子量及び分子量分布により、塗布膜の断面形状が変化することが分かった。
＜実施例３＞ 細胞培養の下地膜形成剤製造用のポリマー水溶液の製造
　合成例ポリマー１～合成例ポリマー１２をそれぞれ滅菌水で１ｍｇ／ｍＬの濃度となるように溶解させ、ポリマー水溶液１～１２を製造した。
＜実施例４：細胞凝集塊製造試験＞
（４－１．細胞低接着プレートの調製）
　ＷＯ２０１４／１９６６５０の実施例３０に記載の製造方法に従って、共重合体含有ワニスからコーティング溶液を調製した。調製したコーティング溶液を、１２穴細胞培養プレート（ＢＤバイオサイエンス社製、＃３５１１４３）のウェルに５００μＬ（固形分０．５質量％）／ウェルとなるよう添加し、室温にて１時間静置後、過剰のコーティング溶液を除去した。オーブン（アドバンテック東洋（株）製、乾燥機ＦＣ－６１２）を用いて５０℃で一晩乾燥させた。その後、滅菌水を１ウェルあたり５００μＬ添加後、除去して洗浄を行った。同様にさらに２回洗浄を行い、５０℃で一晩乾燥させて細胞低接着プレートを得た。
（細胞培養の下地膜形成剤の製造、細胞培養の下地膜として使用するポリマーコーティングプレートの調製）
　合成例ポリマー３及合成例ポリマー４から得られた１ｍｇ／ｍLのポリマー水溶液を滅菌水で１００μｇ／ｍＬになるよう希釈して、細胞培養の下地膜形成剤３及び４を製造した。製造したポリマー水溶液を上記細胞低接着プレート上へ１μＬずつ滴下し、室温で３０分間乾燥させることにより、試験に用いる細胞培養の下地膜として使用するポリマーコーティングプレートを得た。
（４－２．細胞の調製）
　細胞は、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社製）を用いた。細胞の培養に用いた培地は、間葉系幹細胞増殖培地ＭｅｓｅｎｃｈｙｍａｌＳｔｅｍＣｅｌｌＧｒｏｗｔｈＭｅｄｉｕｍ２（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社製）を用いた。細胞は、３７℃／ＣＯ２インキュベーター内にて５％二酸化炭素濃度を保った状態で、直径１０ｃｍのシャーレ（培地１０ｍＬ）を用いて２日間以上静置培養した。引き続き、本細胞をＨｅｐｅｓＢＳＳ溶液（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社製）４ｍｌで洗浄した後、トリプシン－ＥＤＴＡ溶液（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社製）４ｍＬを添加して室温で５分間静置した。ＴｒｙｐｓｉｎＮｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇＳｏｌｕｔｉｏｎ（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社製）を４ｍＬ添加して細胞を剥がし、回収した。本懸濁液を遠心分離（（株）トミー精工製、型番ＬＣ－２３０、２００×ｇ／３分、室温）後、上清を除き、上記の培地を添加して細胞懸濁液を調製した。
（４－３．細胞付着実験）
　上記にて調製したプレートに対して、細胞懸濁液を５．９×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（１．７５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）となるように各５００μＬ加えた。その後、５％二酸化炭素濃度を保った状態で、３７℃／ＣＯ２インキュベーター内にて３．５時間静置した。静置後、非接着細胞と培地を除去し、ＰＢＳで洗浄することで接着細胞のみをウェル上へ残した。洗浄後、新しい培地を５００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、倒立型リサーチ顕微鏡ＩＸ７３（オリンパス（株）製）を用いて接着細胞の様子を観察、撮影した。その結果、図２に示すように、細胞培養の下地膜形成剤３、細胞培養の下地膜形成剤４をコーティングした箇所への細胞の付着が確認された。
（４－４．細胞凝集塊の観察）
上記にて試験したプレートを３７℃／ＣＯ２インキュベーター内にてさらに１日間静置した。静置後、倒立型リサーチ顕微鏡ＩＸ７３（オリンパス（株）製）を用いて、細胞の様子を観察した。その結果、図３に示すように細胞培養の下地膜形成剤３と細胞培養の下地膜形成剤４上に接着した細胞がプレートから剥がれて凝集し、細胞凝集塊（スフェロイド）を形成していることが確認された。このことから、本願のポリマーを含む下地膜は、細胞培養容器の下地膜として有用であることが示された。
＜実施例５：細胞凝集塊製造試験＞
（５－１．細胞培養の下地膜形成剤の製造及び細胞培養の下地膜として使用するポリマーコーティングプレートの調製）
　合成例１、合成例１０、合成例１１及び合成例１２から得られた１ｍｇ／ｍLのポリマー水溶液を滅菌水で５０μｇ／ｍＬになるよう希釈して、細胞培養の下地膜形成剤５、６、７及び８を製造した。製造したポリマー水溶液を細胞低接着ディッシュ（住友ベークライト社製，＃ＭＳ-９０３５Ｘ）上へ１μＬずつ滴下し、５０℃で３０分間乾燥させることにより、試験に用いる細胞培養の下地膜として使用するポリマーコーティングディッシュを得た。
（５－２．細胞の調製）
　細胞は、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社製）を用いた。細胞の培養に用いた培地は、間葉系幹細胞増殖培地ＭｅｓｅｎｃｈｙｍａｌＳｔｅｍＣｅｌｌＧｒｏｗｔｈＭｅｄｉｕｍ２（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社製）を用いた。細胞は、３７℃／ＣＯ２インキュベーター内にて５％二酸化炭素濃度を保った状態で、直径１０ｃｍのシャーレ（培地１０ｍＬ）を用いて２日間以上静置培養した。引き続き、本細胞をＨｅｐｅｓＢＳＳ溶液（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社製）４ｍｌで洗浄した後、トリプシン－ＥＤＴＡ溶液（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社製）４ｍＬを添加して室温で５分間静置した。ＴｒｙｐｓｉｎＮｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇＳｏｌｕｔｉｏｎ（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社製）を４ｍＬ添加して細胞を剥がし、回収した。本懸濁液を遠心分離（（株）トミー精工製、型番ＬＣ－２３０、２２０×ｇ／３分、室温）後、上清を除き、上記の培地を添加して細胞懸濁液を調製した。
（５－３．細胞付着実験）
　上記にて調製したプレートに対して、細胞懸濁液を２．７×１０６ｃｅｌｌｓ／３ｍＬ／ｄｉｓｈ（３×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）となるように加えた。その後、５％二酸化炭素濃度を保った状態で、３７℃／ＣＯ２インキュベーター内にて２時間静置した。静置後、非接着細胞と培地を除去し、ＰＢＳで洗浄することで接着細胞のみをウェル上へ残した。洗浄後、新しい培地を２ｍＬ／ｄｉｓｈ添加し、ＥＶＯＳ　ＦＬ　Ａｕｔｏ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて接着細胞の様子を観察、撮影した。その結果、図４に示すように、細胞培養の下地膜形成剤５、細胞培養の下地膜形成剤６、細胞培養の下地膜形成剤７及び細胞培養の下地膜形成剤８をコーティングした箇所への細胞の付着が確認された。
（５－４．細胞凝集塊の観察）
　上記にて試験したプレートを、引き続きＥＶＯＳ　ＦＬ　Ａｕｔｏを用いてタイムラプス撮影した。タイムラプス撮影は３７℃／５％ＣＯ２条件下で、同一視野をそれぞれ１時間おきに撮影した。その結果、図５に示すように細胞培養の下地膜形成剤５、細胞培養の下地膜形成剤６、下地膜形成剤７、及び下地膜形成剤８上に接着した細胞がプレートから剥がれて凝集し、細胞凝集塊（スフェロイド）を形成していることが確認された。このことから、本願のポリマーを含む下地膜は、細胞培養容器の下地膜として有用であることが示された。
　本発明の製造方法で得られるポリマーは、細胞培養の下地膜形成剤として使用できる。本発明の下地膜形成剤を用いて、細胞培養の下地膜、それを含む細胞培養容器が製造できる。

Claims (18)

  1. 　下記式（Ｉ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
    ［式中、
    　Ｕａ１及びＵａ２は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、Ｒa１は、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、Ｒa２は、炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキレン基を表す］で表されるモノマー、ラジカル重合開始剤及び有機溶媒を含む混合物を調製する調製工程、及び前記混合物を昇温、撹拌し、モノマーを重合させ重合体を調製する重合工程
    を含む、細胞培養の下地膜として使用するポリマーの製造方法。
  2. 　さらに式（ＩＩ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
    ［式中、
    　Ｒｂは、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表す］で表されるモノマーを上記混合物中に含む、請求項１に記載のポリマーの製造方法。
  3. 　さらに２つ以上の炭素－炭素不飽和結合を有するモノマーを上記混合物中に含む、請求項１又は２に記載のポリマーの製造方法。
  4. 　上記２つ以上の炭素－炭素不飽和結合を有するモノマーが、下記式（ＩＩＩ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
    ［式中、
    　Ｒｃ及びＲｄは、それぞれ独立して、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、Ｒeは、炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキレン基を表し、ｎは１～５０の数を表す］で表されるモノマーである、請求項３に記載のポリマーの製造方法。
  5. 　前記ポリマー中の式（Ｉ）で表されるモノマー由来の単位／式（ＩＩ）で表されるモノマー由来の単位のモル比が、１００／０～５０／５０である、請求項１～４何れか一項に記載のポリマーの製造方法。
  6. 　ポリマーの重量平均分子量（Ｍｎ）が、２０，０００～１，０００，０００であり、かつポリマーの重量平均分子量（Ｍｗ）と前記数平均分子量（Ｍｎ）との比（Ｍｗ／Ｍｎ）が、１．０１～１０．００である、請求項１～５何れか１項に記載のポリマーの製造方法。
  7. 　細胞を接着させた後に剥離させて、細胞凝集塊を得るための細胞培養の下地膜として使用するポリマーである、請求項１～６いずれか１項記載のポリマーの製造方法。
  8. 　請求項１～７何れか１項に記載の製造方法により得られるポリマーと、含水溶液を混合する工程を含む、細胞培養の下地膜形成剤の製造方法。
  9. 　請求項８記載の製造方法により得られる細胞培養の下地膜形成剤を、容器又は基板の表面に塗布し乾燥する工程を含む、細胞培養の下地膜の製造方法。
  10. 　上記の塗布・乾燥工程前に、下記式（ａ）で表される有機基を含む繰り返し単位と、下記式（ｂ）で表される有機基を含む繰り返し単位とを含む共重合体：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
    ［式中、
    　Ｕａ１１、Ｕａ１２、Ｕｂ１１、Ｕｂ１２及びＵｂ１３は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、Ａｎ－は、ハロゲン化物イオン、無機酸イオン、水酸化物イオン及びイソチオシアネートイオンからなる群から選ばれる陰イオンを表す］
    と、溶媒とを含むコーティング膜形成用組成物を容器又は基板の表面に塗布し乾燥する工程をさらに含む、請求項９に記載の細胞培養の下地膜の製造方法。
  11. 　上記容器又は基板が、細胞の付着抑制能を有する、請求項９に記載の細胞培養の下地膜の製造方法。
  12. 　請求項８に記載の製造方法により得られた細胞培養の下地膜形成剤を、容器又は基板の表面に塗布し乾燥する工程を含む、細胞培養容器の製造方法。
  13. 　上記塗布・乾燥工程前に、下記式（ａ）で表される有機基を含む繰り返し単位と、下記式（ｂ）で表される有機基を含む繰り返し単位とを含む共重合体：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
    　［式中、
    　Ｕａ１１、Ｕａ１２、Ｕｂ１１、Ｕｂ１２及びＵｂ１３は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、Ａｎ－は、ハロゲン化物イオン、無機酸イオン、水酸化物イオン及びイソチオシアネートイオンからなる群から選ばれる陰イオンを表す］
    と、溶媒とを含むコーティング膜形成用組成物を容器又は基板の表面に塗布し乾燥する工程をさらに含む、請求項１２に記載の細胞培養容器の製造方法。
  14. 　上記容器又は基板が、細胞の付着抑制能を有する、請求項１２に記載の細胞培養容器の製造方法。
  15. 　下記式（Ｉ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
    ［式中、
    　Ｕａ１及びＵａ２は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、Ｒa１は、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、Ｒa２は、炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキレン基を表す］で表されるモノマー由来の単位を含む重合体を細胞培養の下地膜として使用する、細胞凝集塊の製造方法。
  16. 　上記重合体が、さらに式（ＩＩ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
    ［式中、
    　Ｒｂは、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表す］で表されるモノマー由来の単位を含む共重合体である、請求項１５に記載の細胞凝集塊の製造方法。
  17. 　下記式（Ｉ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
    ［式中、
    　Ｕａ１及びＵａ２は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、Ｒa１は、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、Ｒa２は、炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキレン基を表す］で表されるモノマー由来の単位を含む重合体の、細胞を接着させた後に剥離させて、細胞凝集塊を得るための細胞培養の下地膜としての使用。
  18. 　上記重合体が、さらに上記式（Ｉ）と、式（ＩＩ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
    ［式中、
    　Ｒｂは、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表す］で表されるモノマー由来の単位を含むとの共重合体である、請求項１７に記載の、細胞を接着させた後に剥離させて、細胞凝集塊を得るための細胞培養の下地膜としての使用。
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