WO2023027079A1 - 細胞構造体製造装置 - Google Patents

Abstract

細胞構造体の製造の際に、細胞構造体の寸法を適切に制御することのできる細胞構造体製造装置を提供する。　細胞構造体を製造するための細胞構造体製造装置であって、基板を供給する基板供給部であって、前記基板の少なくとも１つの表面が、細胞の付着抑制能を有する、基板供給部と、前記基板の上に、下地膜を形成する下地膜形成部であって、前記下地膜形成部が、前記基板の上に下地膜形成用組成物を塗布する下地膜形成用塗布機構を含み、前記下地膜が細胞接着性を有する、下地膜形成部と、前記下地膜を含む前記基板の上に細胞を播種する播種部とを含む、細胞構造体製造装置である。

Description

細胞構造体製造装置

　本発明は、スフェロイドのような細胞構造体を製造するための細胞構造体製造装置に関する。

　細胞凝集塊、細胞塊又はスフェロイドのような細胞構造体は、創薬研究、又は細胞治療及び再生治療に利用できると考えられている。

　細胞構造体のような細胞の立体構造の製造方法として、例えば、特許文献１には、１つの細胞塊を収容する収容凹部が多数形成された収容プレートと、上記細胞塊を突き刺して貫通する針状体を複数本備えた支持体と、負圧発生手段に接続されて上記細胞塊を吸着保持する吸引ノズルと、該吸引ノズルを上記収容プレートと支持体との間で移動かつ昇降させる移動手段と、上記吸引ノズルの吸引動作及び上記移動手段の動作を制御する制御手段とを備える立体構造体製造装置が記載されている。

　また、特許文献２には、細長く先端が尖った複数のニードルと、ニードルの先端で細胞塊を穿刺して貫通して穿刺後にニードルを上昇させる穿刺部と、ベース部と、制御部と、を備える細胞構造体製造装置が記載されている。

　また、特許文献３及び４には、細胞塊を収容する収容容器と、上記細胞塊を突き刺して貫通する針状体を複数本配置した支持体と、上記細胞塊を吸着保持する吸引ノズルと、上記吸引ノズルを移動させるノズル移動手段と、上記吸引ノズルの吸引動作及び上記ノズル移動手段の作動を制御する制御手段とを備える細胞立体構造物製造装置が記載されている。

　また、特許文献５には、複数の細胞塊を培養容器内の載置面に平面的に配置し、上記細胞塊が培養されて相互に融合した細胞塊シートを作製するための細胞塊シート製造装置が記載されている。

　また、細胞培養を効率的に行うための下地膜形成剤として、様々な材料が提案されている。例えば、特許文献６には、細胞培養の下地膜として使用するポリマーの製造方法及び細胞培養容器が開示されている。

　特許文献７には、生体物質の付着抑制能を有するイオンコンプレックス材料のコーティング膜が記載されている。

特許第５８９６１０４号公報 特許第６３３４８３７号公報 特許第６６６３５５５号公報 特許第６６６３５５６号公報 特許第６８８０３８４号公報 国際公開第２０２０／０４０２４７号 国際公開第２０１４／１９６６５０号

　本明細書において、細胞構造体とは、細胞同士が自己集合・凝集化した細胞の集合体である。なお、細胞構造体は、一般的には、細胞凝集塊、細胞塊、スフェロイド、スフェア、又はオルガノイドといわれる場合がある。細胞構造体には、生体様構造が構築されることから、細胞構造体の細胞の機能を長期間維持でき、生理的機能が向上することが報告されている。そのため、細胞構造体の、創薬研究における、又は細胞治療や再生治療における利用についての期待が高まっている。

　また、細胞構造体を簡便かつ迅速に、均一かつ大量に製造するための技術は、再生医療の実用化、及び創薬試験の効率化のために重要である。しかしながら、従来の細胞低接着性培養皿（例えば、マルチウェルプレート）を用いた浮遊細胞のランダムな凝集化現象を利用する製造方法では、１ウェルに１個のスフェロイドしか形成しない。そのため、操作性及び量産性に優れないという問題があった。

　また、細胞構造体が、球状スフェロイドの場合、スフェロイドの直径が大きすぎると、球状スフェロイド中の細胞の一部が死ぬ恐れがある。また、スフェロイドの直径が小さすぎると、スフェロイドによる治療効果などの効果が低くなる。したがって、スフェロイドなどの細胞構造体の寸法を適切に制御することは、細胞構造体の製造の歩留まりを向上させるために、重要な技術である。従来の製造方法では、スフェロイドの直径の誤差は、４０％程度になる場合がある。細胞構造体の製造の歩留まりを向上させるために、スフェロイドの直径の誤差は、好ましくは２０％以内であることが求められている。

　また、細胞構造体の製造の際に、細胞培養のために用いる下地膜は、細胞の下地膜への均一な接着のために、一般的に、生体由来の血清を用いる必要がある。生体由来の血清を用いる場合、個体差による増殖能力をはじめとする品質のばらつきの問題、及び人以外の動物由来血清を用いる場合のアレルギー発生やウイルス混入など安全性のリスクが発生するなどの問題がある。

　そこで本発明は、細胞構造体の製造の際に、細胞構造体の寸法を適切に制御することのできる細胞構造体製造装置を提供することを目的とする。

　また、本発明は、生体由来の血清を用いなくても均質で高品質な細胞構造体を製造することができ、操作性及び量産性に優れ、細胞構造体の寸法を適切に制御することのできる細胞構造体製造装置を提供することを目的とする。

　上記課題を解決するため、本発明は以下の構成を有する。

（構成１）
　本発明の構成１は、細胞構造体を製造するための細胞構造体製造装置であって、
　基板を供給する基板供給部であって、前記基板の少なくとも１つの表面が、細胞の付着抑制能を有する、基板供給部と、
　前記基板の上に、下地膜を形成する下地膜形成部であって、前記下地膜形成部が、前記基板の上に下地膜形成用組成物を塗布する下地膜形成用塗布機構を含み、前記下地膜が細胞接着性を有する、下地膜形成部と、
　前記下地膜を含む前記基板の上に細胞を播種する播種部と
を含む、細胞構造体製造装置である。

（構成２）
　本発明の構成２は、前記基板供給部が、原料基板の少なくとも１つの表面の少なくとも一部に、細胞の付着抑制能を有するコーティング膜を形成するコーティング膜形成部を更に含み、
　前記コーティング膜形成部が、コーティング膜形成用組成物を前記基板の表面に塗布するコーティング膜形成用塗布機構を含み、
　前記下地膜形成用塗布機構が、前記基板の前記コーティング膜の少なくとも一部の表面に、前記下地膜形成用組成物を塗布することを含む、構成１の細胞構造体製造装置である。

（構成３）
　本発明の構成３は、前記コーティング膜形成用組成物が、下記式（Ａ）で表される繰り返し単位（Ａ）、及び下記式（Ｂ）で表される繰り返し単位（Ｂ）を有する共重合体を含む、構成２の細胞構造体製造装置である。

（式中、Ｒ^１～Ｒ^３は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素原子数１～５のアルキル基を表し、Ｘ^１及びＸ^２は、それぞれ独立して、単結合、エステル結合、エーテル結合、アミド結合又は酸素原子で中断されてもよい炭素原子数１～５のアルキレン基を表す。）

（構成４）
　本発明の構成４は、前記下地膜形成用塗布機構及び前記コーティング膜形成用塗布機構から選択される少なくとも１つが、点描式の塗布機構である、構成１～３の何れかの細胞構造体製造装置である。

（構成５）
　本発明の構成５は、前記基板が、略平滑な表面を有する、構成１～４の何れかの細胞構造体製造装置である。

（構成６）
　本発明の構成６は、前記基板の表面が、凹凸を有する、構成１～４の何れかの細胞構造体製造装置である。

（構成７）
　本発明の構成７は、前記基板又は前記原料基板が可撓性を有し、前記基板供給部が巻取式の基板カセット又は原料基板カセットを含み、前記基板が前記基板カセットから供給され、又は前記原料基板が前記原料基板カセットから供給される、構成１～６の何れかの細胞構造体製造装置である。

（構成８）
　本発明の構成８は、前記細胞構造体製造装置が、前記下地膜を含む前記基板の上に付着した細胞を培養する凝集培養部を更に含む、構成１～７の何れかの細胞構造体製造装置である。

（構成９）
　本発明の構成９は、前記細胞構造体のサイズ誤差が２０％以内である、構成１～８の何れかの細胞構造体製造装置である。

（構成１０）
　本発明の構成１０は、前記細胞構造体製造装置が、前記細胞構造体製造装置の内部を気密な閉鎖空間にすることが可能な気密機構を有し、前記気密機構が、前記閉鎖空間の内部を無菌環境に維持することが可能である、構成１～９の何れかの細胞構造体製造装置である。

（構成１１）
　本発明の構成１１は、前記下地膜形成用組成物が、下記式（Ｉ）：

［式中、
Ｕａ１及びＵａ２は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、Ｒa１は、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、Ｒa２は、炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキレン基を表す］で表されるモノマーから誘導される繰り返し単位、及び、下記式（ＩＩ）：

［式中、
Ｒｂは、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表す］で表されるモノマーから誘導される繰り返し単位を含む共重合体を含む、構成１～１０の何れかの細胞構造体製造装置である。

（構成１２）
　本発明の構成１２は、前記下地膜形成用組成物が、細胞接着性物質を更に含む、構成１１の細胞構造体製造装置である。

　本発明によれば、細胞構造体の製造の際に、細胞構造体の寸法を適切に制御することのできる細胞構造体製造装置を提供することができる。

　また、本発明によれば、生体由来の血清を用いなくても均質で高品質な細胞構造体を製造することができ、操作性及び量産性に優れ、細胞構造体の寸法を適切に制御することのできる細胞構造体製造装置を提供することができる。

本実施形態の細胞構造体製造装置の一例を示す模式図である。 基板の表面に下地膜パターンを形成した一例を示す断面模式図である。 本実施形態の細胞構造体製造装置の別の態様の一例を示す平面模式図である。 実験例Ａ１の細胞付着試験の顕微鏡観察結果の写真である。 比較実験例Ａ３の細胞付着試験の顕微鏡観察結果の写真である。 試験例Ｂ１の細胞接着確認試験に付された、実験例Ｂ１～３、比較実験例Ｂ１及び２で作製した細胞凝集塊製造用基板の様子を撮影した実体顕微鏡写真である。 試験例Ｂ２の細胞接着・細胞凝集塊形成確認試験に付された、実験例Ｂ４及び６で作製した細胞凝集塊製造用基板の様子を、それぞれ、２時間後及び２日後に撮影した実体顕微鏡写真である。 試験例Ｂ３の細胞接着確認試験に付された、実験例Ｂ５及び比較実験例Ｂ３で作製した細胞凝集塊製造用基板の様子を撮影した実体顕微鏡写真である。 試験例Ｂ４の細胞接着確認試験に付された、実験例Ｂ７で作製した細胞凝集塊製造用基板の様子を撮影した実体顕微鏡写真である。 実験例Ｂ８～Ｂ１２の細胞凝集塊製造用基板を用いて、細胞凝集塊（スフェロイド）を形成したときの様子を、それぞれ、２時間後及び３日後に撮影した実態顕微鏡写真である。 実験例Ｂ８～Ｂ１０の細胞凝集塊製造用基板を用いて形成したスフェロイドのサイズ評価結果を示す図である。 実験例Ｂ８～Ｂ１２の細胞凝集塊製造用基板を用いて形成したスフェロイドの、塗布直径と、平均スフェロイド直径及びスフェロイド誤差との関係を表として示す図である。 実験例Ｂ８～Ｂ１２の細胞凝集塊製造用基板を用いてスフェロイドを形成したときの、塗布面積とスフェロイド直径の関係を示す図である。 実験例Ｂ８～Ｂ１２の細胞凝集塊製造用基板を用いてスフェロイドを形成したときの、塗布面積とスフェロイド体積の関係を示す図である。 試験例Ｂ６の細胞接着・細胞凝集塊形成確認試験に付された、比較実験例Ｂ４で作製した細胞凝集塊製造用基板の様子を、２時間後及び２日後に撮影した実体顕微鏡写真である。 試験例Ｂ７の細胞接着・細胞凝集塊形成確認試験に付された、比較実験例Ｂ５で作製した細胞凝集塊製造用基板の様子を、２時間後及び２日後に撮影した実体顕微鏡写真である。

　以下、本発明の実施形態について、図面を参照しながら具体的に説明する。なお、以下の実施形態は、本発明を具体化する際の形態であって、本発明をその範囲内に限定するものではない。

　本明細書において、基板又は膜の「上に」とは、その基板又は膜の上面に直接接触する場合だけでなく、その基板や膜の上面に直接接触しない場合も含む。例えば、「基板の上に膜Ａを形成する」とは、基板の表面に直接膜Ａを形成することを意味する他に、基板の表面に形成された他の膜の表面に膜Ａを形成することを含む。すなわち、基板又は膜の「上に」とは、基板又は膜と、対象物（膜）との間に他の膜が存在している場合を含む。また、「上に」とは、必ずしも鉛直方向における上側を意味するだけではない。「上に」とは、基板及び膜などの相対的な位置関係を示しているに過ぎない。

　本実施形態の細胞構造体製造装置１０について、図１を参照して説明する。

　本実施形態は、細胞構造体１を製造するための細胞構造体製造装置１０である。本実施形態の細胞構造体製造装置１０は、基板供給部２０と、下地膜形成部４０と、播種部５０とを含む。本実施形態の細胞構造体製造装置１０の基板供給部２０は、コーティング膜形成部３０を更に含むことができる。

＜基板供給部２０＞
　基板供給部２０は、基板８０を供給する。本明細書において、基板８０とは、その表面が細胞５６の付着抑制能を有する平面状（板状又はフィルム状）の構造体である。なお、本明細書では、表面が細胞５６の付着抑制能を有しない平面状（板状又はフィルム状）の構造体のことを、原料基板８２という。原料基板８２の表面に、細胞５６の付着抑制能を有するコーティング膜８４を形成することにより、基板８０を得ることができる。

　本明細書において、細胞５６の付着抑制能を有する表面とは、その表面において顕微鏡観察により細胞５６の付着及び伸展が見られず、その表面以外の部分でスフェロイドなどの細胞構造体１が形成されることを意味する。

　又は、細胞５６の付着抑制能を有するとは、ＡＴＰａｓｓａｙによるコーティング無しと比較した場合の発光強度（％）（コーティング膜８４上の付着細胞の発光強度）／（コーティング無のウェル上の付着細胞の発光強度）が５０％以下、好ましくは３０％以下、更に好ましくは１０％以下であることを意味する。

　本実施形態では、基板８０の少なくとも１つの表面が、細胞５６の付着抑制能を有する。この結果、基板８０（又は基板８０のコーティング膜８４）が露出している部分に、細胞５６が付着することを抑制することができる。

　本実施形態の細胞構造体製造装置１０に用いる基板８０又は原料基板８２は、可撓性を有することが好ましい。また、本実施形態の細胞構造体製造装置１０は、基板供給部２０が巻取式の基板カセット又は原料基板カセット２２を含むことが好ましい。

　図１に示す細胞構造体製造装置１０の基板供給部２０の例では、原料基板８２が可撓性を有し、原料基板８２が巻取式の原料基板８２カセット２２から供給される。同様に、細胞５６の付着抑制能を有する基板８０を用いる場合には、基板供給部２０が巻取式の基板カセットを含むことができる。巻取式の基板カセット又は原料基板カセット２２を用いることにより、細胞構造体１の製造を連続的に行うことができる。

　本実施形態の細胞構造体製造装置１０では、図３に示すようなバッチ式の製造方法を採用することができる。この場合には、原料基板８２（又は基板８０）の形状は、所定の寸法の矩形であることができる。この場合、所定の形状の原料基板８２を、バッチ式のコーティング膜形成部３０に入れて、原料基板８２の表面にコーティング膜８４を形成し、コーティング膜形成部３０から取り出される。このようにして、細胞５６の付着抑制能を有するコーティング膜８４を形成した矩形の基板８０を得ることができる。その後、所定の寸法の基板８０に対して、下地膜形成部４０及び播種部５０における所定の処理をすることができる。また、図３に示す製造方法を採用する場合、原料基板８２又は基板８０の搬送を容易にする点から、原料基板８２又は基板８０は、可撓性を有しないことが好ましい。

　本実施形態の細胞構造体製造装置１０に用いる基板８０（又は原料基板８２）は、略平滑な表面を有することが好ましい。略平滑な表面の基板８０（又は原料基板８２）を用いることにより、後述する下地膜９０を、任意の場所に任意の寸法で形成することができる。下地膜９０の寸法を制御することにより、得られる細胞構造体１の寸法を制御することができる。

　本実施形態の細胞構造体製造装置１０に用いる基板８０（又は原料基板８２）の表面は、凹凸を有することができる。基板８０（又は原料基板８２）の表面が適切な凹凸を有することにより、後述する下地膜９０を形成する場所を特定することができる。下地膜９０を形成する場所の場所決めを容易にすることができる。下地膜９０は、基板８０（又は原料基板８２）の表面の凹凸のうち、凹部に形成することができる。下地膜９０が形成される凹部の寸法を制御することにより、得られる細胞構造体１の寸法を適切な寸法とすることができる。したがって、基板８０（又は原料基板８２）の表面が適切な凹凸を、適切な寸法として、下地膜９０を凹部に形成することにより、得られる細胞構造体１の寸法を適切な寸法とすることができる。基板８０（又は原料基板８２）の表面が適切な凹凸を有する場合、原料基板８２又は基板８０は、可撓性を有しないことができる。

　原料基板８２の材質としては、例えば、ガラス、金属、金属含有化合物若しくは半金属含有化合物、活性炭又は樹脂を挙げることができる。金属としては、典型金属：（アルカリ金属：Ｌｉ、Ｎａ、Ｋ、Ｒｂ、Ｃｓ；アルカリ土類金属：Ｃａ、Ｓｒ、Ｂａ、Ｒａ）、マグネシウム族元素：Ｂｅ、Ｍｇ、Ｚｎ、Ｃｄ、Ｈｇ；アルミニウム族元素：Ａｌ、Ｇａ、Ｉｎ；希土類元素：Ｙ、Ｌａ、Ｃｅ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ｓｍ、Ｅｕ；スズ族元素：Ｔｉ、Ｚｒ、Ｓｎ、Ｈｆ、Ｐｂ、Ｔｈ；鉄族元素：Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ；土酸元素：Ｖ、Ｎｂ、Ｔａ、クロム族元素：Ｃｒ、Ｍｏ、Ｗ、Ｕ；マンガン族元素：Ｍｎ、Ｒｅ；貴金属：Ｃｕ、Ａｇ、Ａｕ；白金族元素：Ｒｕ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ｏｓ、Ｉｒ、Ｐｔ等が挙げられる。金属含有化合物若しくは半金属含有化合物としては、例えば基本成分が金属酸化物で、高温での熱処理によって焼き固めた焼結体であるセラミックス、シリコンのような半導体、金属酸化物若しくは半金属酸化物（シリコン酸化物、アルミナ等）、金属炭化物若しくは半金属炭化物、金属窒化物若しくは半金属窒化物（シリコン窒化物等）、金属ホウ化物若しくは半金属ホウ化物等の無機化合物の成形体等の無機固体材料、アルミニウム、ニッケルチタン、ステンレス（ＳＵＳ３０４、ＳＵＳ３１６、ＳＵＳ３１６Ｌ等）が挙げられる。

　原料基板８２の材料として用いることのできる樹脂としては、天然樹脂若しくはその誘導体、又は合成樹脂いずれでもよく、天然樹脂若しくはその誘導体としては、セルロース、三酢酸セルロース（ＣＴＡ）、ニトロセルロース（ＮＣ）、デキストラン硫酸を固定化したセルロース等、合成樹脂としてはポリアクリロニトリル（ＰＡＮ）、ポリイミド（ＰＩ）、ポリエステル系ポリマーアロイ（ＰＥＰＡ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリスルホン（ＰＳＦ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン（ＰＵ）、エチレンビニルアルコール（ＥＶＡＬ）、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリエステル、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、超高分子量ポリエチレン（ＵＨＰＥ）、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、アクリロニトリル－ブタジエン－スチレン樹脂（ＡＢＳ）又はテフロン（登録商標）が好ましく用いられる。

　本実施形態の細胞構造体製造装置１０による細胞構造体１の製造では、下地膜９０を形成する際に、高温での処理を要しない。そのため、原料基板８２として、耐熱性が低い樹脂等も適用可能である。

　原料基板８２の材質は１種類であっても２種類以上の組み合わせであってもよい。本実施形態では、例えば、細胞構造体１を大量製造するために、原料基板８２の材料として、ベルトコンベアーのように巻き取り（ロール方式）できるような柔軟性（可撓性）を有する材料を用いることができる。上記ロール方式に用いられる基板８０の材質としては、合成樹脂、及び天然高分子が挙げられる。

　また、原料基板８２は、いわゆる細胞培養器で使用される基板８０であってもよい。細胞５６の培養に一般的に用いられるペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュなどのシャーレ又はディッシュ、細胞培養フラスコ、スピナーフラスコ、多段フラスコなどのフラスコ、プラスチックバッグ、テフロン（登録商標）バッグ、培養バッグなどのバッグ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マルチプレート、マルチウェルプレートなどのプレート、チャンバースライド、チューブ、トレイ、及びローラーボトルなどのボトル等が挙げられる。

＜コーティング膜形成部３０＞
　図１に示すように、基板供給部２０は、コーティング膜形成部３０を有することができる。コーティング膜形成部３０は、原料基板８２の少なくとも１つの表面の少なくとも一部に、細胞５６の付着抑制能を有するコーティング膜８４を形成するように構成される。

　原料基板８２は、一般的に細胞５６の付着抑制能を有しない。そのため、コーティング膜形成部３０において、原料基板８２の少なくとも１つの表面に、細胞５６の付着抑制能を有するコーティング膜８４を形成することにより、付着抑制能を有する基板８０を得ることができる。

　コーティング膜形成部３０は、コーティング膜形成用塗布機構３２を含む。コーティング膜形成用塗布機構３２による塗布方法は、例えば、スピンコート法、インクジェット法、スクリーン印刷法、フレキソ印刷、グラビア印刷法、オフセット印刷法、バーコート法、スリットコート法、ロール・トゥー・ロール法、ディップコート法、溶媒キャスト法、パッド印刷法、及びスプレー法等から選択することができる。コーティング膜形成用塗布機構３２により、コーティング膜形成用組成物３８を、所定のパターンになるように、基板８０の表面の少なくとも一部に塗布することができる。なお、コーティング膜形成用塗布機構３２により、コーティング膜形成用組成物３８を、原料基板８２の全面に塗布することができる。また、後述する下地膜９０の塗布及び所定の寸法の細胞構造体１の形成が適切に行われるように、コーティング膜形成用組成物３８を、所定のパターンになるように塗布することができる。なお、所定の寸法の細胞構造体１の形成を行うためには、下地膜９０の寸法が重要である。下地膜９０の寸法の自由度を得るために、コーティング膜形成用塗布機構３２は、コーティング膜形成用組成物３８を、原料基板８２の全面に塗布することが好ましい。ただし、コーティング膜８４の形成が不要である部分があらかじめ決まっている場合には、不要である部分にコーティング膜８４を形成しないように、所定のパターンになるように塗布することができる。これにより、コーティング膜形成用組成物３８の使用量を削減することができる。

　本実施形態の細胞構造体製造装置１０において、コーティング膜形成用塗布機構３２は、点描式の塗布機構、例えばインクジェットプリンターによるインクジェット法であることが好ましい。コーティング膜形成用組成物３８の塗布のために点描式の塗布機構を用いることにより、所定のパターン形状となるように、コーティング膜形成用組成物３８を塗布することができる。また、点描式の塗布機構のノズルの走査速度及び／又は繰り返し点描回数を制御することにより、コーティング膜８４の膜厚を、所望の膜厚にすることができる。

　図１に示す例では、コーティング膜形成部３０において、コーティング膜形成用組成物タンク３４からコーティング膜形成用組成物３８がコーティング膜形成用塗布機構３２（例えば、インクジェットプリンター）に供給される。コーティング膜形成用組成物３８は、基板８０の全面に（又は所定のパターン形状となるように）、コーティング膜形成用塗布機構３２から射出される。なお、コーティング膜形成用塗布機構３２のノズルが所定の動きをすることが可能なように、コーティング膜形成用塗布機構３２はノズルの駆動機能を有することができる。

　コーティング膜形成用組成物３８の具体例については、後述する。

＜コーティング膜乾燥機構３６＞
　本実施形態の細胞構造体製造装置１０は、必要に応じて、コーティング膜乾燥機構３６を含むことができる。コーティング膜形成用組成物３８が溶媒を含む場合には、コーティング膜形成用組成物３８の塗布後、コーティング膜乾燥機構３６により、溶媒を気化させて、コーティング膜形成用組成物３８のコーティング膜８４を形成することができる。コーティング膜乾燥機構３６は、例えば、ヒーター及び／又は送風機であることができる。

　乾燥は、例えば、大気下又は真空下にて、－２００℃～２００℃の範囲内の温度で行うことができる。コーティング膜８４は、例えば室温（１０℃～３５℃、例えば２５℃）での乾燥でも形成することができる。より迅速にコーティング膜８４を形成させるために、例えば４０℃～１００℃にて乾燥させてもよい。乾燥温度としては、特に制限されない。乾燥温度は、原料基板８２のガラス転移点より低温が好ましく、例えば１０℃～１８０℃であり、より好ましい乾燥温度は２０℃～１００℃である。乾燥時間としては、特に制限されないが、例えば、１分間～２４時間である。

＜下地膜形成部４０＞
　図１に示すように、本実施形態の細胞構造体製造装置１０は、下地膜９０を形成するための下地膜形成部４０を有する。下地膜形成部４０は、基板８０の上に下地膜形成用組成物４８を塗布する下地膜形成用塗布機構４２を含む。下地膜９０は、細胞接着性を有するので、下地膜９０の表面に細胞５６を付着させることができる。

　基板８０の表面の少なくとも一部は、細胞５６の付着抑制能を有する。細胞５６の付着抑制能を有する表面の上に、細胞５６の付着抑制能を有する表面の一部が露出するように下地膜９０を形成することができる。これにより、細胞５６の付着抑制能を有する基板８０の表面から細胞５６を退け、下地膜９０を形成した部分に細胞５６が集まるようにすることができる。この結果、細胞構造体１を製造することができる。

　下地膜形成部４０は、下地膜形成用塗布機構４２を含む。下地膜形成用塗布機構４２による塗布方法は、例えば、スピンコート法、インクジェット法、スクリーン印刷法、スリットコート法、ロール・トゥー・ロール法、ディップコート法、溶媒キャスト法、パッド印刷法、及びスプレー法等から選択することができる。下地膜形成用塗布機構４２により、下地膜形成用組成物４８を、所定のパターンになるように、基板８０（又はコーティング膜８４）の表面の少なくとも一部に塗布することができる。なお、本明細書では、下地膜形成用組成物４８を、塗布することにより形成した所定の形状のパターンのことを、「下地膜パターン９０ａ」という。

　本実施形態の細胞構造体製造装置１０において、地膜形成用塗布機構は、点描式の塗布機構、例えばインクジェットプリンターによるインクジェット法であることが好ましい。下地膜形成用組成物４８の塗布のために点描式、若しくは、点描式の連続による線描、若しくは面描の塗布機構を用いることにより、所定の下地膜パターン９０ａの形状となるように、下地膜形成用組成物４８を塗布することができる。また、点描式の塗布機構のノズルの走査速度及び／又は繰り返し点描回数を制御することにより、下地膜パターン９０ａの膜厚を、所望の膜厚にすることができる。

　図１に示す例では、下地膜形成用塗布機構４２において、下地膜形成用組成物タンク４４から下地膜形成用組成物４８が下地膜形成用塗布機構４２（例えば、インクジェットプリンター）に供給される。下地膜形成用組成物４８は、所定の形状の下地膜パターン９０ａとなるように、下地膜形成用塗布機構４２から射出される。なお、下地膜形成用塗布機構４２のノズルが所定の動きをすることが可能なように、下地膜形成用塗布機構４２はノズルの駆動機能を有することができる。

　別の塗布方法としては、例えば場合により下地膜パターン９０ａの非形成箇所を保護した基板８０を下地膜形成用組成物４８に浸漬することができる。また、下地膜形成用組成物４８を、場合により下地膜パターン９０ａの非形成箇所を保護した基板８０（容器）に添加し、所定の時間静置するという方法を用いることができる。なお、基板８０が細胞培養容器の場合には、下地膜形成用組成物４８を、場合により下地膜パターン９０ａの非形成箇所を保護した容器に添加し、所定の時間静置する方法によって行うことができる。添加は、例えば、容器の全容積の０．５～１倍量の下地膜形成用組成物４８を、シリンジ等を用いて添加することによって行うことができる。静置は、容器又は基板８０の材質や細胞培養の下地膜形成剤の種類に応じて、時間や温度を適宜選択して実施される。例えば、静置時間は、１分から２４時間、好ましくは５分から３時間であり、静置温度は、１０～８０℃であることができる。これにより、基板８０に下地膜パターン９０ａを適切に形成することができる。

　所定の寸法の細胞構造体１の形成を行うためには、下地膜形成用組成物４８を塗布した面積が重要である。本発明者らは、細胞構造体１がスフェロイドの場合、下地膜パターン９０ａの面積と、スフェロイドの直径との間に強い直線的な相関関係があることを見出した。

　下地膜形成用組成物４８のパターン（下地膜パターン９０ａ）の形状は、任意である。下地膜パターン９０ａの形状は、円形、三角形及び四角形などの多角形、星形、又は十字形などであることができる。細胞５６が細胞構造体１になるように集合することの容易性から、下地膜パターン９０ａは、円形（ドットパターン又はスポット）であることが好ましい。

　下地膜形成用組成物４８の下地膜パターン９０ａが円形のドットパターン（スポット）の場合、下地膜９０のドットパターンの総面積の割合、各ドットパターンの直径やドットパターン間の間隔は、用いる細胞５６や基板８０の種類、細胞凝集塊の所望のサイズ等に応じて、所定の範囲から適宜選択することができる。基板８０の表面積に対する下地膜９０のドットパターンの総面積の割合は、３０％以上、４０％以上、５０％以上であることが好ましく、かつ９９％以下であることが好ましい。下地膜９０の各ドットパターンの直径は、例えば、５０～５０００μｍであってもよく、場合によっては３００～３０００μｍであってもよい。下地膜９０の各ドットパターンの中心間の間隔は、例えば、１００～６０００μｍであってもよく、必要に応じて１５０～４０００μｍ又は１５０～３００μｍであってもよい。

　本実施形態では、細胞５６の付着抑制能を有する基板８０の上に、細胞５６が接着し得る独立したマイクロサイズの領域（ドットパターン）を、高密度で、好ましくは規則的に配することにより、均一なサイズのスフェロイドを一つの基板８０（容器）で一度に複数形成できる。

　下地膜９０の膜厚としては、例えば、１～１０００ｎｍであり、好ましくは５～５００ｎｍ、好ましくは５～３００ｎｍ、好ましくは５～２００ｎｍ、好ましくは５～１５０ｎｍ、好ましくは１０～１５０ｎｍである。

　また、上述の方法により得られる基板８０の表面の下地膜パターン９０ａは、乾燥工程を経ずにそのまま、あるいは水又は細胞培養に付される試料の媒質（例えば、水、緩衝液、培地等）を用いての洗浄後に、細胞構造体１の製造用の下地膜９０付きの基板８０として使用することができる。

　すなわち、上記基板８０の表面の下地膜パターン９０ａの形成後、４８時間以内、好ましくは２４時間以内、更に好ましくは１２時間以内、更に好ましくは６時間以内、更に好ましくは３時間以内、更に好ましくは１時間以内に乾燥工程を経ずにそのまま、あるいは水又は細胞培養に付される試料の媒質（例えば、水、緩衝液、培地等、特に好ましくは培地（例えば、ＤＭＥＭ培地（ダルベッコ改変イーグル培地））を用いての洗浄後に、細胞構造体１の製造用の下地膜９０付きの基板８０として使用することができる。

　下地膜形成用組成物４８の具体例については、後述する。

＜下地膜乾燥機構４６＞
　本実施形態の細胞構造体製造装置１０は、必要に応じて、下地膜乾燥機構４６を含むことができる。下地膜形成用組成物４８が溶媒を含む場合には、下地膜パターン９０ａの形成後、下地膜乾燥機構４６により、溶媒を気化させることができる。下地膜乾燥機構４６は、例えば、ヒーター及び／又は送風機であることができる。

　下地膜９０の乾燥は、上述のコーティング膜８４の乾燥と同様の条件で行うことができる。

　具体的には、下地膜９０を有する基板８０の乾燥工程は、大気下又は真空下にて、好ましくは、－２００℃～２００℃の温度範囲内で行うことができる。乾燥工程により、上記の下地膜形成用組成物４８中の溶媒を取り除くことで、基板８０又はコーティング膜８４の表面へ、完全に固着することができる。

　下地膜パターン９０ａは、例えば室温（１０℃～３５℃、好ましくは２０℃～３０℃、例えば２５℃）での乾燥でも形成することができる。より迅速にスポットを形成させるために、例えば４０℃～８０℃にて乾燥させてもよい。乾燥温度が－２００℃未満であると、一般的ではない冷媒を使用しなければならず汎用性に欠けることと、溶媒昇華のために乾燥に長時間を要し効率が悪い。乾燥温度が２００℃超であると、ポリマーの熱分解が生じる。また、原料基板８２のガラス転移点より低温が好ましく、より好ましい乾燥温度は１０℃～１８０℃、より好ましい乾燥温度は２０℃～１００℃である。本実施形態の細胞構造体製造用の下地膜パターン９０ａを付した基板８０は、以上の簡便な工程を経て製造される。

　また、下地膜パターン９０ａに残存する不純物、未固着のポリマー等を無くすために、水及び電解質を含む水溶液から選ばれる少なくとも１種の溶媒で洗浄する工程（洗浄工程）を実施してもよい。洗浄は、流水洗浄又は超音波洗浄等が望ましい。上記水及び電解質を含む水溶液は例えば４０℃～９５℃の範囲で加温されたものでもよい。電解質を含む水溶液は、ＰＢＳ、生理食塩水（塩化ナトリウムのみを含むもの）、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水、トリス緩衝生理食塩水、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水及びベロナール緩衝生理食塩水が好ましく、ＰＢＳが特に好ましい。固着後は水、ＰＢＳ及びアルコール等で洗浄してもコーティング膜８４は溶出せずに基体に強固に固着したままである。

　本実施形態の下地膜９０（又は下地膜パターン９０ａ）の膜厚は、最大膜厚と最小膜厚が１～１０００ｎｍの範囲であり、好ましくは５～５００ｎｍの範囲である。

＜播種部５０＞
　図１に示すように、本実施形態の細胞構造体製造装置１０は、下地膜９０を含む基板８０の上に細胞５６を播種するための播種部５０を有する。播種部５０は、下地膜９０の上に細胞５６を播種するための細胞播種機構５２を含む。

　図２に示すように、基板８０の表面のうち、下地膜パターン９０ａが形成されていない部分には、細胞５６の付着抑制能を有するコーティング膜８４が形成されているか、又は細胞５６の付着抑制能を有する基板８０の表面が露出している。細胞接着性を有する下地膜パターン９０ａの上に、細胞５６を播種することにより、細胞５６が下地膜パターン９０ａの上に集まり、細胞構造体１を得ることができる。なお、細胞５６は、下地膜パターン９０ａに隣接するコーティング膜８４（又は基板８０）の部分にも播種することができる。コーティング膜８４（又は基板８０）の表面は、細胞５６の付着抑制能を有するので、コーティング膜８４（又は基板８０）の部分に播種した細胞５６は、隣接する下地膜パターン９０ａに集まり、細胞構造体１の一部となることができる。

　播種部５０は、細胞播種機構５２を含む。細胞播種機構５２は、例えば、滴下式のノズルを含む装置、インクジェットプリンターによる印刷のような点描式の塗布機構、スクリーン印刷装置、パッド印刷装置、スプレー装置などの装置から選択することができる。細胞５６に傷が生じることを防止するために、細胞播種機構５２は、滴下式のノズルを含む装置であることが好ましい。細胞播種機構５２により、下地膜パターン９０ａ（及び下地膜パターン９０ａに隣接するコーティング膜８４又は基板８０の部分）に、細胞５６を播種することができる。

　図１に示す例では、播種部５０において、細胞タンク５４から細胞５６が細胞播種機構５２（例えば滴下式のノズルを含む装置）に供給される。細胞５６は、下地膜パターン９０ａ（及び下地膜パターン９０ａするコーティング膜８４又は基板８０の部分）に、細胞播種機構５２から滴下される。なお、細胞播種機構５２のノズルが所定の動きをすることが可能なように、細胞播種機構５２はノズルの駆動機能を有することができる。

　播種された細胞５６は、所定時間をかけて集まり、下地膜パターン９０ａの上で所定の形状の細胞構造体１、例えばスフェロイドになることができる。

　本実施形態における細胞５６とは、動物又は植物を構成する最も基本的な単位であり、その要素として細胞膜の内部に細胞質と各種の細胞小器官を持つものである。この際、ＤＮＡを内包する核は、細胞５６内部に含まれても含まれなくてもよい。例えば、本実施形態における動物由来の細胞５６には、精子や卵子などの生殖細胞、生体を構成する体細胞、幹細胞（多能性幹細胞等）、前駆細胞、生体から分離された癌細胞、生体から分離され不死化能を獲得して体外で安定して維持される細胞（細胞株）、生体から分離され人為的に遺伝子改変が成された細胞、生体から分離され人為的に核が交換された細胞等が含まれる。生体を構成する体細胞の例としては、以下に限定されるものではないが、線維芽細胞、骨髄細胞、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、好中球、赤血球、血小板、マクロファージ、単球、骨細胞、骨髄細胞、周皮細胞、樹状細胞、ケラチノサイト、脂肪細胞、間葉細胞、上皮細胞、表皮細胞、内皮細胞、血管内皮細胞、肝実質細胞、軟骨細胞、卵丘細胞、神経系細胞、グリア細胞、ニューロン、オリゴデンドロサイト、マイクログリア、星状膠細胞、心臓細胞、食道細胞、筋肉細胞（たとえば、平滑筋細胞又は骨格筋細胞）、膵臓ベータ細胞、メラニン細胞、造血前駆細胞（例えば、臍帯血由来のＣＤ３４陽性細胞）、及び単核細胞等が含まれる。当該体細胞は、例えば皮膚、腎臓、脾臓、副腎、肝臓、肺、卵巣、膵臓、子宮、胃、結腸、小腸、大腸、膀胱、前立腺、精巣、胸腺、筋肉、結合組織、骨、軟骨、血管組織、血液（臍帯血を含む）、骨髄、心臓、心筋、眼、脳又は神経組織などの任意の組織から採取される細胞が含まれる。更に当該体細胞は、幹細胞又は前駆細胞から分化誘導された細胞が含まれる。

　幹細胞とは、自分自身を複製する能力と他の複数系統の細胞に分化する能力を兼ね備えた細胞であり、その例としては、以下に限定されるものではないが、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性腫瘍細胞、胚性生殖幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、筋幹細胞、生殖幹細胞、腸幹細胞、癌幹細胞、及び毛包幹細胞などが含まれる。多能性幹細胞としては、前記幹細胞のうち、ＥＳ細胞、胚性生殖幹細胞、及びｉＰＳ細胞が挙げられる。前駆細胞とは、前記幹細胞から特定の体細胞や生殖細胞に分化する途中の段階にある細胞である。癌細胞とは、体細胞から派生して無限の増殖能を獲得した細胞である。細胞株とは、生体外での人為的な操作により無限の増殖能を獲得した細胞である。これらの中でも、本実施形態における細胞５６として、線維芽細胞、及び幹細胞がより好ましい。また、幹細胞の中でも多能性幹細胞がより好ましい。

＜凝集培養部６０＞
　図１に示すように、本実施形態の細胞構造体製造装置１０は、必要に応じて、下地膜９０を含む基板８０の上に付着した細胞５６を凝集及び／又は培養するための凝集培養部６０を更に含むことができる。細胞５６が凝集することにより、所望の細胞構造体１を形成することができる。

　図１では図示していないが、凝集培養部６０は所定の培養液を含むことが好ましい。凝集培養部６０が所定の培養液を含むことにより、培養液中で細胞５６を培養することができる。細胞５６の培養液としては、公知のものを用いることができる。本実施形態の細胞構造体製造装置１０が凝集培養部６０を含むことにより、播種した細胞５６が細胞に安定な環境下で細胞構造体１を形成することができる。なお、凝集培養部６０は、培養液を含む培養液槽であることができる。本実施形態の細胞構造体製造装置１０において、細胞５６を播種した可撓性の基板８０の進行方法を下方又は斜め下方に変更し、培養液を含む培養液槽に基板８０を浸漬するように構成することができる。

＜細胞構造体採集部７０＞
　図１に示すように、本実施形態の細胞構造体製造装置１０は、必要に応じて、得られた細胞構造体１を採取するための細胞構造体採集部７０を更に含むことができる。細胞構造体１は、細胞構造体採集部７０の細胞構造体採集機構７２により、下地膜９０を含む基板８０から剥離され、採集される。なお、細胞構造体１の基板８０からの剥離は、培養液などの細胞構造体１に対して無害な溶液中で行うことが好ましい。

　細胞構造体１の用途によっては、細胞構造体製造装置１０が細胞構造体採集部７０を有さずに、下地膜９０を含む基板８０の上に細胞構造体１が載置された状態で、細胞構造体１としての製品とすること可能である。

＜気密機構＞
　本実施形態の細胞構造体製造装置１０では、細胞構造体製造装置１０の内部を気密な閉鎖空間にすることが可能な気密機構を有することが好ましい。この場合、細胞構造体製造装置１０の気密機構は、閉鎖空間の内部を無菌環境に維持することが可能である。

　本実施形態の細胞構造体製造装置１０において、外気に解放された状態でコーティング膜８４の形成及び／又は下地膜９０の形成を行う場合には、外気から予期せぬ雑菌が混入する可能性がある。雑菌の繁殖を避けるため、外気に解放された細胞構造体製造装置１０の場合には、細胞構造体１の製造工程に、殺菌工程及び／又は洗浄工程を適宜、追加する必要が生じる。一方、細胞構造体製造装置１０の所定の気密機構により、閉鎖空間の内部を無菌環境に維持することが可能な構成であることにより、洗浄工程及び滅菌工程を不要にすることができる。

＜洗浄工程及び滅菌工程＞
　細胞構造体製造装置１０が気密機構を有しない場合には、各工程において、雑菌などによる汚染が生じる可能性がある。その場合には、各工程の終了後、例えば、原料基板カセット２２からの原料基板８２の取り出し後、コーティング膜８４の形成後、及び／又は下地膜９０の形成後に、洗浄装置による洗浄工程及び／又は滅菌工程を行うことが好ましい。コーティング膜８４及び／又は下地膜９０の形成後に洗浄工程を行うことにより、形成したコーティング膜８４及び／又は下地膜９０のうち、過剰な膜を除去することができる。また、滅菌工程を行うことにより、付着した雑菌を除去することができる。

　洗浄工程としては、コーティング膜８４及び／又は下地膜９０が洗浄される工程であれば、特に制限されない。洗浄工程は、例えば、コーティング膜８４及び／又は下地膜９０に残存する不純物、未反応モノマー等をコーティング膜８４から除去するために行われる。

　洗浄は、公知の方法で行うことができる。洗浄に用いる溶媒としては、水、電解質を含む水溶液などが挙げられる。溶媒は通常室温（例えば１０～３５℃）で用いられる。溶媒は、例えば４０℃～９５℃の範囲に加温されたものでもよい。電解質を含む水溶液は、ＰＢＳ、生理食塩水（塩化ナトリウムのみを含むもの）、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水、トリス緩衝生理食塩水、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水及びベロナール緩衝生理食塩水が好ましく、ＰＢＳが特に好ましい。本実施形態のコーティング膜８４は、水、ＰＢＳ及びアルコール等で洗浄しても溶出せずに基材に強固に固着したままである。

　また、コーティング膜８４及び／又は下地膜９０に対して、細胞培養に用いられる試料の媒質（例えば、水、緩衝液、培地等）を用いて洗浄を行ってもよい。好ましい媒質は、培地であり、より好ましい媒質は、ＢＭＥ培地（イーグル基礎培地）、ＤＭＥＭ培地（ダルベッコ改変イーグル培地）である。

　コーティング膜８４及び／又は下地膜９０は、放射線照射による滅菌工程を経ることが好ましい。滅菌工程は、通常、周囲温度（例えば、約０℃～約４０℃、好ましくは約１０℃～約３０℃、より好ましくは約２５℃）で実施される。照射される放射線としては、滅菌を行うことができれば限定されないが、γ線、Ｘ線又は電子線照射が好ましい。より好ましくはγ線又は電子線、更に好ましくはγ線である。γ線の照射線量は、例えば、通常の滅菌工程で採用されている線量でよく、例えば、５～４０ｋＧｙ程度の照射で十分であり、好ましくは、１０～２５ｋＧｙがよい。

＜細胞構造体１の寸法制御＞
　本実施形態の細胞構造体製造装置１０は、細胞構造体１のサイズ誤差（寸法誤差）が２０％以内であることが好ましく、１５％以内であることがより好ましく、１０％以内であることが更に好ましい。

　細胞構造体１のサイズ誤差とは、細胞構造体１を１００個以上製造したときの寸法の標準偏差を、平均寸法で除した値を意味する。本実施形態の細胞構造体製造装置１０を用いるならば、下地膜パターン９０ａを所定の寸法で形成することができるので、細胞構造体１の寸法を容易に制御することができる。そのため、本実施形態の細胞構造体製造装置１０を用いて細胞構造体１を製造した場合、従来と比べて、細胞構造体１のサイズ誤差を小さくすることができる。

　細胞構造体１が、球状スフェロイドの場合、スフェロイドの直径が大きすぎると、球状スフェロイド中の細胞５６の一部が死ぬ恐れがある。また、スフェロイドの直径が小さすぎると、スフェロイドによる治療効果などの効果が低くなる。したがって、スフェロイドなどの細胞構造体１の寸法を適切に制御することにより、細胞構造体１の製造の歩留まりを向上させることができる。そのため、細胞構造体１の量産性を向上することができる。

＜バッチ式の細胞構造体製造装置１０＞
　図３に、本実施形態の細胞構造体製造装置１０の別な態様の平面模式図を示す。図３に示す細胞構造体製造装置１０は、バッチ式の製造方法を採用する場合の、各部の配置図を平面模式図として示す。

　図３に示す細胞構造体製造装置１０では、原料基板８２（又は基板８０）の形状は、所定の寸法の矩形である。原料基板８２（又は基板８０）は、基板供給部２０に載置される。原料基板８２は、例えばロボットのような移動機構１２により、基板供給部２０から取り出される。原料基板８２（又は基板８０）の方向の変更が必要な場合には、回転機構１４により回転される。原料基板８２（又は基板８０）は、上述の図１に示す実施形態での説明と同様に、コーティング膜形成部３０、及び下地膜形成部４０において、所定の処理を行い、播種部５０にて播種される。必要に応じて凝集培養部６０で培養された後、細胞構造体採集部７０にて、細胞構造体１は採取される。なお、このとき、細胞構造体１は、基板８０に載置された状態で、採取されることができる。

＜細胞構造体１の製造方法＞
　本実施形態の細胞構造体製造装置１０による細胞構造体１の製造方法では、少なくとも、播種部５０において、下地膜９０（下地膜パターン９０ａ）が配置された基板８０の上に細胞５６が播種される工程を含む。細胞構造体１の製造方法は、更に必要に応じてその他の工程を含む。

　例えば、所定の寸法及び形状の下地膜９０が配置されたコーティング膜８４の上に細胞５６が播種されることで、コーティング膜８４の細胞付着抑制機能により、細胞５６の接着、伸展増殖が抑制される。この結果、良好な細胞構造体１（例えば、三次元細胞凝集塊のようなスフェロイド）を得ることができる。

　例えば、基板８０は、細胞付着抑制が可能なコーティング膜８４と、コーティング膜８４上に配置された細胞接着性を有するドットパターンの下地膜９０（下地膜パターン９０ａ）とを有する細胞播種面を有することができる。そのような細胞播種面に細胞５６が播種されることで、ドットパターンの下地膜パターン９０ａ上で選択的に細胞５６が培養される。その結果、所定の寸法の細胞構造体１（例えば、三次元細胞凝集塊のようなスフェロイド）を得ることができる。

＜コーティング膜形成用組成物３８＞
　次に、本実施形態の細胞構造体製造装置１０に用いることのできるコーティング膜形成用組成物３８について説明する。本実施形態では、下記のコーティング膜形成用組成物３８（「本実施形態のコーティング膜形成用組成物」という場合がある。）を用いることが好ましい。本実施形態のコーティング膜形成用組成物を用いることにより、生体物質の付着抑制が可能でありかつリン酸緩衝生理食塩水に溶解しにくいコーティング膜８４、及び生体物質の付着抑制が可能でありかつリン酸緩衝生理食塩水に溶解しにくいコーティング膜８４を形成することが可能である。

　本実施形態のコーティング膜形成用組成物は、下記式（Ａ）で表される繰り返し単位（Ａ）、及び下記式（Ｂ）で表される繰り返し単位（Ｂ）を有する共重合体を含むことが好ましい。

（式中、Ｒ^１～Ｒ^３は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素原子数１～５のアルキル基を表し、Ｘ^１及びＸ^２は、それぞれ独立して、単結合、エステル結合、エーテル結合、アミド結合又は酸素原子で中断されてもよい炭素原子数１～５のアルキレン基を表す。）

　更に具体的には、本実施形態のコーティング膜形成用組成物は以下の通りである。

　［１］　共重合体を含有し、生体物質の付着抑制に用いられるコーティング膜形成用組成物であって、
　前記共重合体が、非水溶性であり、
　前記共重合体が、上記式（Ａ）で表される繰り返し単位（Ａ）、及び上記式（Ｂ）で表される繰り返し単位（Ｂ）を有し、
　前記共重合体における前記繰り返し単位（Ａ）と前記繰り返し単位（Ｂ）とのモル比率（Ａ：Ｂ）が、８９：１１～５０：５０である、
コーティング膜形成用組成物。

　［２］　Ｒ^１及びＲ^２が水素原子であり、Ｒ^３がメチル基であり、Ｘ^１及びＸ^２が単結合である、［１］のコーティング膜形成用組成物。

　［３］　前記共重合体の粘度平均重合度が、２００～３，０００である、［１］又は［２］のコーティング膜形成用組成物。

　［４］　前記共重合体における全繰り返し単位中の前記繰り返し単位（Ａ）と前記繰り返し単位（Ｂ）の合計のモル％が、９９．５モル％以上である、［１］～［３］の何れかのコーティング膜形成用組成物。

　［５］　前記共重合体が、アジド基を有さない、［１］～［４］の何れかのコーティング膜形成用組成物。

　［６］　溶媒を含有する、［１］～［５］の何れかのコーティング膜形成用組成物。

　［７］　前記溶媒が、アルコールを含有する、［６］のコーティング膜形成用組成物。

　本実施形態によれば、生体物質の付着抑制が可能でありかつリン酸緩衝生理食塩水に溶解しにくいコーティング膜、及び生体物質の付着抑制が可能でありかつリン酸緩衝生理食塩水に溶解しにくいコーティング膜を形成可能なコーティング膜形成用組成物を提供することができる。

　本実施形態のコーティング膜形成用組成物は、生体物質の付着抑制に用いられる。コーティング膜形成用組成物は、共重合体を少なくとも含有し、更に必要に応じて、溶媒などのその他の成分を含有する。なお、本実施形態のコーティング膜形成用組成物は、リン酸緩衝生理食塩水に溶解しにくいコーティング膜を形成可能である。本実施形態のコーティング膜形成用組成物の用途は、生体物質の付着抑制に用いられる限り、特に制限されず、リン酸緩衝生理食塩水に接触するコーティング膜の形成に制限されるものではない。

＜＜共重合体＞＞
　共重合体は、非水溶性である。ここで、「水溶性」とは、２５℃の水１００ｇに対して１．０ｇ以上溶解可能であることをいう。「非水溶性」とは、「水溶性」に該当しないこと、即ち、２５℃の水１００ｇに対する溶解性が１．０ｇ未満であることをいう。

　共重合体は、下記式（Ａ）で表される繰り返し単位（Ａ）、及び下記式（Ｂ）で表される繰り返し単位（Ｂ）を有する。共重合体における繰り返し単位（Ａ）と繰り返し単位（Ｂ）とのモル比率（Ａ：Ｂ）は、８９：１１～５０：５０である。

（式中、Ｒ^１～Ｒ^３は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素原子数１～５のアルキル基を表し、Ｘ^１及びＸ^２は、それぞれ独立して、単結合、エステル結合、エーテル結合、アミド結合又は酸素原子で中断されてもよい炭素原子数１～５のアルキレン基を表す。）

　共重合体は、２種以上の繰り返し単位（Ａ）を有していてもよい。共重合体は、２種以上の繰り返し単位（Ｂ）を有していてもよい。共重合体は、１種類の繰り返し単位（Ａ）及び１種類の繰り返し単位（Ｂ）を有することが好ましい。

　炭素原子数１～５のアルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｓ－ブチル基、t－ブチル基、ｎ－ペンチル基、１－メチルブチル基、２－メチルブチル基、３－メチルブチル基、１，１－ジメチルプロピル基、１，２－ジメチルプロピル基、２，２－ジメチルプロピル基、及び１－エチルプロピル基などが挙げられる。Ｒ^１～Ｒ^３は、それぞれ独立して、水素原子、メチル基、又はエチル基が好ましい。

　上記「エステル結合」は、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－又は－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－を意味し、「エーテル結合」は、－Ｏ－を意味し、「アミド結合」は、－ＮＨＣ（＝Ｏ）－又は－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ－を意味する。

　炭素原子数１～５のアルキレン基は、酸素原子で中断されてもよい。炭素原子数１～５のアルキレン基としては、メチレン基、エチレン基、プロピレン基、トリメチレン基、テトラメチレン基、１－メチルプロピレン基、２－メチルプロピレン基、ジメチルエチレン基、エチルエチレン基、ペンタメチレン基、１－メチル－テトラメチレン基、２－メチル－テトラメチレン基、１，１－ジメチル－トリメチレン基、１，２－ジメチル－トリメチレン基、２，２－ジメチル－トリメチレン基、及び１－エチル－トリメチレン基が挙げられる。上記Ｘ^１及びＸ^２は、メチレン基、エチレン基、又はプロピレン基が好ましい。「酸素原子で中断されていてもよい」とは、炭素原子数１～５のアルキレン基の１つ又は２以上の炭素－炭素結合間がエーテル結合を介して結合していることをいう。

　共重合体は、例えば、Ｒ^１及びＲ^２が水素原子であり、Ｒ^３がメチル基であり、Ｘ^１及びＸ^２が単結合である共重合体が好ましい。

　繰り返し単位（Ａ）と繰り返し単位（Ｂ）とのモル比率（Ａ：Ｂ）は、８９：１１～５０：５０である。共重合体における、繰り返し単位（Ａ）と繰り返し単位（Ｂ）との合計のモル数を１００とした場合、繰り返し単位（Ａ）と繰り返し単位（Ｂ）とのモル比率（Ａ：Ｂ）は、（１００－ｍ）：ｍで表すことができる。その場合、ｍの範囲は、１１～５０である。そして、ｍの下限は、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０であってよい。ｍの上限は、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３８、３７、３６、又は３５であってよい。ｍの範囲としては、例えば、１２～４９、１２～４８、１５～４８、２０～４９、２０～４５、２２～４９、又は２２～４５である。

　共重合体における全繰り返し単位中の繰り返し単位（Ａ）と繰り返し単位（Ｂ）の合計のモル％としては、特に制限されないが、９０モル％以上が好ましく、９５モル％以上がより好ましく、９９．５モル％以上がより一層好ましく、１００％が特に好ましい。

　本実施形態においては、リン酸緩衝生理食塩水に溶解しにくいコーティング膜を得るために、共重合体における繰り返し単位（Ａ）と繰り返し単位（Ｂ）とのモル比率を特定の範囲にしている。そのため、本実施形態においては共重合体を架橋させることなく、リン酸緩衝生理食塩水に溶解しにくいコーティング膜が得られる。よって、共重合体は、共重合体を架橋させるための感光基を有する必要がない。即ち、共重合体は感光基を有さないことが好ましい。感光基としては、例えば、アジド基が挙げられる。

　本実施形態においては、共重合体は、共重合体を架橋させるための感光基を有する必要がない。そのため、コーティング膜を形成する際に、共重合体を架橋させるための光照射を行う必要がない。よって、コーティング膜を形成する際の工程を簡素にすることができる。

　共重合体の粘度平均重合度（以下、「重合度」ということがある）は、特に制限されないが、本実施形態の効果を好適に得る観点から、２００～３，０００が好ましく、２００～２，５００がより好ましく、２００～２，０００が特に好ましい。

　粘度平均重合度は、共重合体を完全けん化した状態で測定される。完全けん化して得られるポリビニルアルコールの「粘度平均重合度」は、イオン交換水を溶媒としたオストワルド粘度計により３０℃で測定した際の極限粘度［η］（ｇ／ｄＬ）から、下記式により算出される値である。
　ｌｏｇ（Ｐ）＝１．６１３×ｌｏｇ（［η］×１０^４／８．２９）

　上記式で、Ｐは粘度平均重合度を示す。粘度平均重合度は、ＪＩＳ　Ｋ　６７２６にしたがって求めることができる。

　共重合体を製造する方法としては、特に制限されないが、例えば、下記式（Ｃ）で表される化合物を重合してホモポリマーを製造し、得られたホモポリマーを公知のけん化反応により部分加水分解して、共重合体を得る方法が挙げられる。

（式中、Ｒ^１、Ｒ^３、及びＸ^１は上記と同義である。）

　また、共重合体を製造する方法としては、例えば、下記式（Ｃ）で表される化合物と下記式（Ｄ）で表される化合物とを共重合して、共重合体を得る方法が挙げられる。

（式中、Ｒ^１～Ｒ^３、Ｘ^１、及びＸ^２は上記と同義である。）

　共重合体は、ランダムコポリマーであってもよいし、ブロックコポリマーであってもよい。共重合体としては、市販品を使用してもよい。共重合体の市販品としては、具体的にはポリ酢酸ビニル（日本酢ビ・ポバール製、商品名ＪＭＲ－１０Ｌ（登録商標））が挙げられる。

　コーティング膜形成用組成物中の膜形成成分における共重合体の含有量としては、特に制限されないが、８０質量％以上が好ましく、９０質量％以上がより好ましく、９５質量％以上が特に好ましい。なお膜形成成分とは、組成物の全成分から溶媒成分を除いた成分を指す。

　コーティング膜形成用組成物における共重合体の含有量としては、特に制限されないが、所望の膜厚のコーティング膜を形成しやすい観点から、０．１～１０質量％が好ましく、０．１～８質量％がより好ましく、０．１～５質量％が特に好ましい。

＜＜溶媒＞＞
　溶媒としては、例えば、水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、アルコール、及び水溶性有機溶媒（ただしアルコールを除く。）などが挙げられる。

　アルコールとしては、炭素原子数２～６のアルコールが挙げられる。アルコールとしては、例えば、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、１－ブタノール、２－ブタノール、イソブタノール、ｔ－ブタノール、１－ペンタノール、２－ペンタノール、３－ペンタノール、１－ヘプタノール、２－ヘプタノール、２，２－ジメチル－１－プロパノール（ネオペンチルアルコール）、２－メチル－１－プロパノール、２－メチル－１－ブタノール、２－メチル－２－ブタノール（ｔ－アミルアルコール）、３－メチル－１－ブタノール、３－メチル－３－ペンタノール、シクロペンタノール、１－ヘキサノール、２－ヘキサノール、３－ヘキサノール、２，３－ジメチル－２－ブタノール、３，３－ジメチル－１－ブタノール、３，３－ジメチル－２－ブタノール、２－エチル－１－ブタノール、２－メチル－１－ペンタノール、２－メチル－２－ペンタノール、２－メチル－３－ペンタノール、３－メチル－１－ペンタノール、３－メチル－２－ペンタノール、３－メチル－３－ペンタノール、４－メチル－１－ペンタノール、４－メチル－２－ペンタノール、４－メチル－３－ペンタノール及びシクロヘキサノールが挙げられる。これらは１種を単独で又は２種以上を組み合わせて使用することができる。

　水溶性有機溶媒とは、水及びアルコールと任意の割合で混ぜることが可能であり、混ぜた後に分離が起こらない有機溶媒を指す。水溶性有機溶媒としては、例えば、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノエチルエーテル、メチルセロソルブアセテート、エチルセロソルブアセテート、ジエチレングリコールモノメチルエーテル、ジエチレングリコールモノエチルエーテル、プロピレングリコール、プロピレングリコールモノメチルエーテル、プロピレングリコールモノエチルエーテル、プロピレングリコールモノメチルエーテルアセテート、及びプロピレングリコールプロピルエーテルアセテートが挙げられる。これらは１種を単独で又は２種以上を組み合わせて使用することができる。

　コーティング膜形成用組成物には、溶媒として、水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、アルコール又は水溶性有機溶媒を単独で用いてもよい。コーティング膜形成用組成物には、溶媒として、水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、アルコール及び水溶性有機溶媒の２種以上を組み合わせて用いてもよい。共重合体の溶解性の観点から、溶媒は、水、アルコール、水溶性有機溶媒及びそれらの２種以上の組み合わせから選ばれるのが好ましく、水、エタノール、水溶性有機溶媒及びそれらの２種以上の組み合わせから選ばれるのがより好ましい。

　溶媒の組み合わせとしては、以下の組み合わせが好ましい。
　・水及びアルコール
　・水、アルコール及び水溶性有機溶媒
　・アルコール及び水溶性有機溶媒

　溶媒の組み合わせとしては、以下の組み合わせがより好ましい。
　・水及びエタノール
　・水、エタノール及びプロピレングリコールモノメチルエーテル
　・エタノール及びプロピレングリコールモノメチルエーテル

　コーティング膜形成用組成物における、水：アルコールの混合比（質量比）は、例えば、１：９９～７０：３０であり、１：９９～５０：５０である。

　コーティング膜形成用組成物における、水：アルコール：水溶性有機溶媒の混合比（質量比（Ａ：Ｂ：Ｃ））は、例えば、５～３０：６５～９２：１～３０（ただし、Ａ＋Ｂ＋Ｃは１００）である。

　コーティング膜形成用組成物における、アルコール：水溶性有機溶媒の混合比（質量比）は、例えば、１：９９～９７：３である。

　コーティング膜形成用組成物における溶媒の含有量としては、特に制限されないが、所望の膜厚のコーティング膜を形成しやすい観点から、９０質量％以上が好ましく、９２質量％以上がより好ましく、９５質量％以上が特に好ましい。

＜＜その他の成分＞＞
　コーティング膜形成用組成物は、必要に応じて、その他の成分を含有することもできる。その他の成分としては、例えば、ｐＨ調整剤、防腐剤、界面活性剤、防カビ剤、糖類等が挙げられる。

　細胞５６の付着抑制能を有するとは、顕微鏡観察により細胞５６の付着及び伸展が見られず、細胞凝集塊（スフェロイド）が形成することを意味する。

　又は、細胞５６の付着抑制能を有するとは、ＡＴＰａｓｓａｙによるコーティング無しと比較した場合の発光強度（％）（コーティング膜上の付着細胞の発光強度）／（コーティング無のウェル上の付着細胞の発光強度）が５０％以下、好ましくは３０％以下、更に好ましくは１０％以下であることを意味する。

＜＜コーティング膜８４＞＞
　本実施形態のコーティング膜形成用組成物のコーティング膜８４（「本実施形態のコーティング膜」という場合がある。）は、上述の本実施形態のコーティング膜形成用組成物を塗布して得られる。言い換えれば、本実施形態のコーティング膜は、本実施形態のコーティング膜形成用組成物の塗布膜である。本実施形態のコーティング膜は、生体物質の付着抑制に用いられる。

　なお、本実施形態のコーティング膜は、リン酸緩衝生理食塩水に溶解しにくいことを特徴とする。本実施形態のコーティング膜形成用組成物の用途は、生体物質の付着抑制に用いられる限り、特に制限されず、リン酸緩衝生理食塩水に接触する用途に制限されるものではない。

　本実施形態のコーティング膜においては、リン酸緩衝生理食塩水に溶解しにくいコーティング膜を得るために、共重合体における繰り返し単位（Ａ）と繰り返し単位（Ｂ）とのモル比率を特定の範囲にしている。そのため、本実施形態のコーティング膜においては共重合体を架橋させることなく、リン酸緩衝生理食塩水に溶解しにくいコーティング膜が得られる。よって、本実施形態のコーティング膜において、共重合体は架橋されていなくてもよい。そして、本実施形態のコーティング膜を形成する際の工程を簡素にすることができる。

　本実施形態のコーティング膜における共重合体の含有量としては、特に制限されないが、８０質量％以上が好ましく、９０質量％以上がより好ましく、９５質量％以上が特に好ましい。

＜＜コーティング膜の膜厚＞＞
　本実施形態のコーティング膜の膜厚としては、特に制限されないが、例えば、１～１００００ｎｍであり、５～１０００ｎｍが好ましく、１０～５００ｎｍがより好ましく、２０～３００ｎｍがより一層好ましく、５０～２５０ｎｍが更により一層好ましく、１００～２５０ｎｍが特に好ましい。なお、この膜厚は、他の種類のコーティング膜においても適用することができる。

＜＜コーティング膜形成用組成物３８の別の実施形態＞＞
　本実施形態のコーティング膜８４の別の実施形態として、下記のものを用いることができる。

　本実施形態のコーティング膜８４の別の実施形態として、例えば、国際公開第２０１４／１９６６５０号に記載されているコーティング膜形成用組成物を使用することができる。上記コーティング膜形成組成物としては、下記式（ａ）で表される有機基を含む繰り返し単位と、下記式（ｂ）で表される有機基を含む繰り返し単位とを含む共重合体（Ｐ）：

　［式中、
　Ｕ^ａ１１、Ｕ^ａ１２、Ｕ^ｂ１１、Ｕ^ｂ１２及びＵ^ｂ１３は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素原子数１～５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、Ａｎ^－は、ハロゲン化物イオン、無機酸イオン、水酸化物イオン及びイソチオシアネートイオンからなる群から選ばれる陰イオンを表す］
と、溶媒とを含むコーティング膜形成用組成物を容器又は基板の表面に塗布し乾燥する工程を含むことが好ましい。上記コーティング膜は、基板表面の少なくとも一部に含めばよいが、細胞凝集塊を製造する表面（すなわち本実施形態のスポットが存在する表面）全体に渡って、あるいは基板表面全体に渡って塗布されていることが好ましい。

　国際公開第２０１４／１９６６５０号及び国際公開第２０１６／０９３２９３号の全開示は、参照として本願に援用される。

　細胞５６の付着抑制能を有するとは、顕微鏡観察により細胞５６の付着及び伸展が見られず、細胞凝集塊（スフェロイド）が形成することを意味する。又は、ＡＴＰａｓｓａｙによるコーティング無しと比較した場合の発光強度（％）（コーティング膜上の付着細胞の発光強度）／（コーティング無のウェル上の付着細胞の発光強度）が５０％以下、好ましくは３０％以下、更に好ましくは１０％以下であることを意味する。

　本実施形態の別のコーティング膜として、エチレン性不飽和モノマー、又は多糖類若しくはその誘導体が共重合したものを用いてもよい。エチレン性不飽和モノマーの例としては、（メタ）アクリル酸及びそのエステル；酢酸ビニル；ビニルピロリドン；エチレン；ビニルアルコール；並びにそれらの親水性の官能性誘導体からなる群より選択される１種又は２種以上のエチレン性不飽和モノマーを挙げることができる。多糖類又はその誘導体の例としては、ヒドロキシアルキルセルロース（例えば、ヒドロキシエチルセルロース又はヒドロキシプロピルセルロース）等のセルロース系高分子、デンプン、デキストラン、カードランを挙げることができる。

　親水性の官能性誘導体とは、親水性の官能基又は構造を有するエチレン性不飽和モノマーを指す。親水性の官能性基又は構造の例としては、ベタイン構造；アミド構造；アルキレングリコール残基；アミノ基；並びにスルフィニル基等が挙げられる。

　ベタイン構造は、第４級アンモニウム型の陽イオン構造と、酸性の陰イオン構造との両性中心を持つ化合物の一価又は二価の基を意味し、例えば、ホスホリルコリン基：

を挙げることができる。そのような構造を有するエチレン性不飽和モノマーの例としては、２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）等を挙げることができる。

　アミド構造は、下記式：

［ここで、Ｒ^１６、Ｒ^１７及びＲ^１８は、互いに独立して、水素原子又は有機基（例えば、メチル基、ヒドロキシメチル基又はヒドロキシエチル基等）である］
で表される基を意味する。そのような構造を有するエチレン性不飽和モノマーの例としては、（メタ）アクリルアミド、Ｎ－（ヒドロキシメチル）（メタ）アクリルアミド、Ｎ－イソプロピル（メタ）アクリルアミド等を挙げることができる。更に、そのような構造を有するモノマー又はポリマーは、例えば、特開２０１０－１６９６０４号公報等に開示されている。

　アルキレングリコール残基は、アルキレングリコール（ＨＯ－Ａｌｋ－ＯＨ；ここでＡｌｋは、炭素原子数１～１０のアルキレン基である）の片側端末又は両端末の水酸基が他の化合物と縮合反応した後に残るアルキレンオキシ基（－Ａｌｋ－Ｏ－）を意味し、アルキレンオキシ単位が繰り返されるポリ（アルキレンオキシ）基も包含する。そのような構造を有するエチレン性不飽和モノマーの例としては、２－ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、メトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート等を挙げることができる。更に、そのような構造を有するモノマー又はポリマーは、例えば、特開２００８－５３３４８９号公報等に開示されている。

　アミノ基は、式：－ＮＨ_２、－ＮＨＲ^１９又は－ＮＲ^２０Ｒ^２１［ここで、Ｒ^１９、Ｒ^２０及びＲ^２１は、互いに独立して、有機基（例えば、炭素原子数１～５の直鎖若しくは分岐アルキル基等）である］で表される基を意味する。本発明におけるアミノ基には、４級化又は塩化されたアミノ基を包含する。そのような構造を有するエチレン性不飽和モノマーの例としては、ジメチルアミノエチル（メタ）アクリレート、２－（ｔ－ブチルアミノ）エチル（メタ）アクリレート、メタクリロイルコリンクロリド等を挙げることができる。

　スルフィニル基は、下記式：

［ここで、Ｒ^２２は、有機基（例えば、炭素原子数１～１０の有機基、好ましくは、１個以上のヒドロキシ基を有する炭素原子数１～１０のアルキル基等）である］
で表される基を意味する。そのような構造を有するポリマーとして、特開２０１４－４８２７８号公報等に開示された共重合体を挙げることができる。

　本実施形態のコーティング膜によれば、生体物質の付着抑制が可能でありかつリン酸緩衝生理食塩水に溶解しにくいコーティング膜、及び生体物質の付着抑制が可能でありかつリン酸緩衝生理食塩水に溶解しにくいコーティング膜を形成することができる。実施形態のコーティング膜は、本実施形態の細胞構造体製造装置１０に用いるコーティング膜８４として、好ましく用いることができる。

＜下地膜形成用組成物４８＞
　次に、本実施形態の細胞構造体製造装置１０に用いることのできる下地膜形成用組成物４８について説明する。本実施形態では、下記の下地膜形成用組成物４８（「本実施形態の下地膜形成用組成物」という場合がある。）を用いることが好ましい。本実施形態の下地膜形成用組成物を用いることにより、動物由来の血清不含培養条件において、前記下地膜９０に対する細胞５６の均一な接着を実現できるため、良質な細胞構造体１を製造することができる。これより本実施形態の下地膜形成用組成物を用いることで、再生医療分野で用いられる均質で高品質な細胞構造体１の量産化を達成することができる。

　本実施形態の下地膜形成用組成物は、下記式（Ｉ）：

［式中、
Ｕａ１及びＵａ２は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、Ｒa１は、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、Ｒa２は、炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキレン基を表す］で表されるモノマーから誘導される繰り返し単位、及び、下記式（ＩＩ）：

［式中、
Ｒｂは、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表す］で表されるモノマーから誘導される繰り返し単位を含む共重合体を含むことが好ましい。

　更に具体的には、本実施形態の下地膜形成用組成物は以下の通りである。

［１］　上記式（Ｉ）［式中、Ｕ^ａ１及びＵ^ａ２は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素原子数１～５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、Ｒ^a１は、水素原子又は炭素原子数１～５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、Ｒ^a２は、炭素原子数１～５の直鎖若しくは分岐アルキレン基を表す］で表されるモノマーから誘導される繰り返し単位を含むポリマー、細胞接着性物質、及び溶媒を含む、下地膜形成用組成物。

［２］　上記ポリマーが、更に上記式（ＩＩ）［式中、Ｒ^ｂは、水素原子又は炭素原子数１～５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表す］で表されるモノマーから誘導される繰り返し単位を含む、［１］の下地膜形成用組成物。

［３］　前記ポリマーと、細胞接着性物質の重量比が、１００：０．１～１００：１００である、［１］又は［２］の下地膜形成用組成物。

［４］　前記細胞接着性物質が、糖タンパク質を含む、［１］～［３］何れかの下地膜形成用組成物。

＜＜下地膜形成用組成物４８＞＞
　本実施形態の下地膜形成用組成物は、下記式（Ｉ）：

［式中、
　Ｕ^ａ１及びＵ^ａ２は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素原子数１～５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、Ｒ^a１は、水素原子又は炭素原子数１～５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、Ｒ^a２は、炭素原子数１～５の直鎖若しくは分岐アルキレン基を表す］で表されるモノマーから誘導される繰り返し単位を含むポリマー、細胞接着性物質及び溶媒を含む。

（ポリマー）
　本実施形態の下地膜形成用組成物が含むポリマーは、上記式（Ｉ）表されるモノマーから誘導される繰り返し単位を含むポリマーである。
　上記ポリマーは、上記式（Ｉ）で表されるカチオン性モノマーと共に、下記式（ＩＩ）：

［式中、
　Ｒ^ｂは、水素原子又は炭素原子数１～５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表す］で表されるアニオン性モノマーを重合することで得られるポリマーであることが好ましい。

　本明細書において、他に定義のない限り、「炭素原子数１～５の直鎖若しくは分岐アルキル基」としては、例えばメチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｓ－ブチル基、t－ブチル基、ｎ－ペンチル基、１－メチルブチル基、２－メチルブチル基、３－メチルブチル基、１，１－ジメチルプロピル基、１，２－ジメチルプロピル基、２，２－ジメチルプロピル基又は１－エチルプロピル基が挙げられる。

　Ｒ^a１及びＲ^ｂは、それぞれ独立して、水素原子及びメチル基から選ばれることが好ましい。Ｕ^ａ１及びＵ^ａ２は、それぞれ独立して、水素原子、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基及びｎ－ブチル基から選ばれることが好ましいが、メチル基又はエチル基であることが好ましく、メチル基が最も好ましい。

　本明細書において、他に定義のない限り、「炭素原子数１～５の直鎖若しくは分岐アルキレン基」としては、例えばメチレン基、エチレン基、プロピレン基、トリメチレン基、テトラメチレン基、１－メチルプロピレン基、２－メチルプロピレン基、ジメチルエチレン基、エチルエチレン基、ペンタメチレン基、１－メチル－テトラメチレン基、２－メチル－テトラメチレン基、１，１－ジメチル－トリメチレン基、１，２－ジメチル－トリメチレン基、２，２－ジメチル－トリメチレン基、及び１－エチル－トリメチレン基等が挙げられる。これらの中で、Ｒ^a２としてはエチレン基及びプロピレン基から選ばれることが好ましい。

　したがって、上記式（Ｉ）で表されるカチオン性モノマーとしては、２－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノエチルメタクリレート、及びＮ，Ｎ－ジメチルアミノメチルメタクリレートなどが挙げられ、２－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノエチルメタクリレートが好ましい。上記式（ＩＩ）で表されるアニオン性モノマーとしては、アクリル酸、メタクリル酸などが挙げられ、メタクリル酸が好ましい。

　前記ポリマー中の式（Ｉ）で表されるモノマー由来の単位／式（ＩＩ）で表されるモノマー由来の単位のモル比が、１００／０～５０／５０である。好ましくは９８／２～５０／５０である。より好ましくは９８／２～６０／４０であり、特に好ましくは９８／２～７０／３０である。式（ＩＩ）のモル比が５０以下であると、ポリマーのアニオン性による細胞５６の接着力低下を抑制できる。

（２つ以上の炭素―炭素不飽和結合を有するモノマー）
　上記ポリマーは、式（Ｉ）／式（ＩＩ）で表されるモノマーと共に、更に２つ以上の炭素－炭素不飽和結合を有するモノマーとを重合することで得られるポリマーであってもよい。２つ以上の炭素－炭素不飽和結合を有するモノマーとは、具体的には、２つ以上の炭素－炭素二重結合を有するモノマーであり、例えば多官能アクリレート化合物、多官能アクリルアミド化合物、多官能ポリエステル、又はイソプレン化合物などが挙げられる。

　好ましい具体例としては下記式（ＩＩＩ）～（Ｖ）で表されるモノマーが挙げられる。

　式中、Ｒ^ｃ及びＲ^ｄは、それぞれ独立して、水素原子又は炭素原子数１～５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、Ｒ^eは、炭素原子数１～５の直鎖若しくは分岐アルキレン基を表し、ｎは１～５０の数を表す。これらの中で、式（ＩＩＩ）で表されるモノマーであることが好ましい。

　前記ポリマー全体に対する式（ＩＩＩ）～（Ｖ）で表されるモノマーのモル比は、好ましくは０～５０％であり、更に好ましくは２～２５％である。
　式（ＩＩＩ）～（Ｖ）のモル比が５０％以下であると、過度な架橋による高分子量化による製造中の固形分のゲル化を抑制でき、製造を容易にできる。

　Ｒ^ｃ及びＲ^ｄは、それぞれ独立して、水素原子及びメチル基から選ばれることが好ましい。

　Ｒ^ｅはメチレン基、エチレン基及びプロピレン基から選ばれることが好ましく、エチレン基が最も好ましい。

　ｎは１～５０の数である。ｎは１～３０の数であることが好ましく、ｎは１～１０の数であることが好ましい。

　前記ポリマー全体に対する式（ＩＩ）で表されるモノマーの占めるモル％の値と、前記調製工程時のモノマー仕込み量全体に対する式（ＩＩ）で表される単量体の占めるモル％の値の差は、０～１０モル％である。本実施形態のポリマーは後述する製造方法により、モノマー仕込み比と、製造されたポリマーの実測値との差が少なく、０～１０モル％であり、更に好ましくは０～８モル％である。

　前記ポリマーの数平均分子量（Ｍｎ）は、２０，０００～１，０００，０００であり、５０，０００～８００，０００であることが更に好ましい。前記ポリマーの重量平均分子量（Ｍｗ）と前記数平均分子量（Ｍｎ）との比（Ｍｗ／Ｍｎ）が、１．０１～１０．００であり、１．２～８．０であることが好ましく、１．４～６．０であることが好ましく、１．５～５．０であることが好ましく、１．６～４．５であることが好ましい。前記数平均分子量（Ｍｎ）と数平均分子量（Ｍｎ）は、例えば実施例に記載のGel Filtration Chromatographyにより求めることができる。

　本実施形態のポリマーを細胞培養の下地膜９０として利用することで、細胞５６を接着させた後に剥離させて細胞構造体１（細胞凝集塊のようなスフェロイド）を形成させることが可能である。なお細胞構造体１とは、細胞５６が凝集した結果形成する構造体を示し、球状やリング状などのように形状が限定されない。従来の細胞低接着プレート上での非接着培養により作製される細胞凝集塊と比較し、接着面積の規定による細胞構造体１のサイズ調整（任意の大きさの細胞凝集塊が製造できる）などの点でメリットがある。

　国際公開第２０２０／０４０２４７号、特願２０２０－０２８１２０号明細書に記載の全開示は、参照として本願に援用される。

（細胞接着性物質）
　本実施形態の下地膜形成用組成物は、細胞接着性物質を更に含むことが好ましい。下地膜形成用組成物４８が細胞接着性物質を含むことにより、細胞５６の接着、伸展、増殖及び分化を促進することができる。その結果、所望の細胞構造体１の形成を容易にできる。

　細胞接着性物質としては、細胞外基質（ＥＣＭ）タンパク質、糖タンパク質、ペプチドなどの生物由来物質や、合成化合物（低分子、高分子）等の公知の物質を使用することができる。細胞接着性物質は、生物由来物質でない化合物、例えば合成化合物（低分子、高分子）であることが好ましい。低分子とは、例えば重量平均分子量が２，０００以下の化合物であり、高分子とは、例えば重量平均分子量が２，０００以上であり、上限は例えば１，０００，０００である。

　細胞外基質（ＥＣＭ）タンパク質の例としては、コラーゲン（例えばメルク社のＩ型コラーゲン（品番Ｃ９７９１、Ｃ７６６１、Ｃ１８０９、Ｃ２２４９、Ｃ２１２４）、ＩＩ型コラーゲン（品番Ｃ９３０１）、ＩＶ型コラーゲン（品番Ｃ０５４３、Ｃ５５３３）、エラスチン（例えばメルク社品番：Ｅ１６２５、Ｅ６５２７）、フィブロネクチン（例えばメルク社品番Ｆ１１４１、Ｆ０６３５、Ｆ２５１８、Ｆ０８９５、Ｆ４７５９、Ｆ２００６）、ラミニン（例えばメルク社品番：Ｌ６７２４、Ｌ２０２０、Ｌ４５４４）、ラミニン断片（例えばマトリクソーム社製：８９２０１１）、及びビトロネクチン（例えばＶＴＮ－Ｎ（ギブコ社）、Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ, Ｈｕｍａｎ, Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ, Ａｎｉｍａｌ Ｆｒｅｅ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社）、メルク社品番：Ｖ０１３２、Ｖ９８８１、Ｖ８３７９、０８－１２６、ＳＲＰ３１８６）が挙げられる。

　細胞接着性物質が、糖タンパク質であることが好ましい。具体的にはビトロネクチン、インテグリン、カドヘリン、フィブロネクチン、ラミニン、テネイシン、オスチオポンチン及び骨シアロタンパク質から選ばれることが好ましい。また、アミノ酸配列としてＲＧＤ配列を持つタンパク質であることが好ましい。

　ペプチドの例としては、ＥＣＭペプチド（Ｋｏｌｌｏｄｉｓ　Ｂｉｏ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社のＭＡＰＴｒｉｘ（登録商標）、ＲＧＤペプチド（富士フイルム和光純薬社製：１８０－０１５３１）が挙げられる。

　合成化合物（高分子）の例としては、ポリリジン（例えばメルク社製品：Ｐ４７０７、Ｐ４８３２、Ｐ７２８０、Ｐ９１５５，Ｐ６４０７，Ｐ６２８２，Ｐ７４０５，Ｐ５８９９）、及びポリオルニチン（例えばメルク社品番Ｐ４９７５）が挙げられる。合成化合物（低分子）の例としてはアドヘサミン（例えば長瀬産業社製：ＡＤ－０００００－０２０１）、合成環状ＲＧＤペプチド（例えばＩＲＩＳ　ＢＩＯＴＥＣＨ社製：ＬＳ－３９２０．００１０）が挙げられる。

　本実施形態の下地膜形成用組成物中の、前記ポリマーと、細胞接着性物質の比（質量基準）は、細胞培養が可能な下地膜形成用組成物４８が形成できれば制限はない。ただし、前記ポリマーと、細胞接着性物質の比（質量基準）は、１００：０．１～１００：１００であることが好ましい。細胞接着性物質が０．１以上であると、細胞接着性が十分に発揮され、細胞接着性物質が１００以下であると、細胞接着後の細胞５６の凝集（細胞構造体１の形成）を容易にできる。

　本実施形態の下地膜形成用組成物は、溶媒を含む。前記溶媒としては、前記ポリマーを溶解できるものであれば限定されないが、水を含む含水溶液であることが好ましい。

　含水溶液とは、水、生理食塩水又はリン酸緩衝溶液などの塩含有水溶液、あるいは水又は塩含有水溶液とアルコールとを組み合わせた混合溶媒が挙げられる。アルコールとしては、炭素原子数２～６のアルコール、例えば、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、１－ブタノール、２－ブタノール、イソブタノール、ｔ－ブタノール、１－ペンタノール、２－ペンタノール、３－ペンタノール、１－ヘプタノール、２－ヘプタノール、２，２－ジメチル－１－プロパノール（＝ネオペンチルアルコール）、２－メチル－１－プロパノール、２－メチル－１－ブタノール、２－メチル－２－ブタノール（＝ｔ－アミルアルコール）、３－メチル－１－ブタノール、３－メチル－３－ペンタノール、シクロペンタノール、１－ヘキサノール、２－ヘキサノール、３－ヘキサノール、２，３－ジメチル－２－ブタノール、３，３－ジメチル－１－ブタノール、３，３－ジメチル－２－ブタノール、２－エチル－１－ブタノール、２－メチル－１－ペンタノール、２－メチル－２－ペンタノール、２－メチル－３－ペンタノール、３－メチル－１－ペンタノール、３－メチル－２－ペンタノール、３－メチル－３－ペンタノール、４－メチル－１－ペンタノール、４－メチル－２－ペンタノール、４－メチル－３－ペンタノール及びシクロヘキサノールが挙げられ、単独で又はそれらの組み合わせの混合溶媒を用いてもよい。
　含水溶液中の水の含有量は、例えば５０質量％～１００質量％、８０質量％～１００質量％、９０質量％～１００質量％である。

　更に下地膜形成用組成物４８は、上記ポリマー、細胞接着性物質及び溶媒の他に、必要に応じて得られる下地膜９０の性能を損ねない範囲で他の物質を添加することもできる。他の物質としては、ｐＨ調整剤、架橋剤、防腐剤、界面活性剤、容器又は基板８０との密着性を高めるプライマー、防カビ剤及び糖類等が挙げられる。

　以下、実施例として、本実施形態の細胞構造体製造装置１０に用いることのできるコーティング膜形成用組成物３８及び下地膜形成用組成物４８について具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

＜コーティング膜形成用組成物３８＞
　まず、コーティング膜形成用組成物３８の実験例Ａ１について説明する。

＜実験例Ａ１＞
（コーティング膜形成用組成物３８の調製）
　ポリ酢酸ビニル（日本酢ビ・ポバール製　ＪＭＲ－１０Ｌ（登録商標）（重合度２５０，けん化度３５．８％））を水／エタノール（３／７質量比）で１０ｍｇ／ｇの濃度となるように溶解させ、コーティング膜形成用組成物３８を調製した。得られたコーティング膜形成用組成物３８は透明かつ均一であった。

（ＨＭＤＳ処理済みシリコンウェハ上のコーティング膜８４の形成）
　上記で得られたコーティング膜形成用組成物３８を１５００ｒｐｍ／６０秒でＨＭＤＳ（１，１，１，３，３，３－ヘキサメチルジシラザン）処理済みシリコンウェハにスピンコートし、乾燥工程として７０℃のオーブンで２４時間乾燥し、ＨＭＤＳ処理済みシリコンウェハ上にコーティング膜８４を得た。分光エリプソメーターを用いてＨＭＤＳ処理済みシリコンウェハ上のコーティング膜８４の膜厚を測定した。その後、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で充分に洗浄を行った後５０℃のオーブンで１時間乾燥し、分光エリプソメーターを用いてＨＭＤＳ処理済みシリコンウェハ上のコーティング膜８４の膜厚を測定した。塗布後膜厚に対するＰＢＳ洗浄後の膜厚から残膜率を算出した。

（細胞培養用コーティングプレートの作製）
　上記で得られたコーティング膜形成用組成物３８を用いて、以下の（ｉ）又は（ｉｉ）の方法で、細胞培養用コーティングプレートを作製した。

（ｉ）（実験例Ａ１、２、比較実験例Ａ１、２、５、６）
　上記で得られたコーティング膜形成用組成物３８を、９６穴細胞培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、＃３５１１７２、容積０．３７ｍＬ、ポリスチレン製）の別々のウェルに２００μＬ／ウェルとなるよう添加し、室温にて１時間静置後、過剰の組成物を除去した。
　その後、オーブンを用いて７０℃で２４時間乾燥した。
　その後、コーティングした各ウェルを２５０μＬの純水で３回洗浄し、５０℃のオーブンを用いて１時間乾燥後、試験に用いた。

（ｉｉ）（実験例Ａ３～２０、比較実験例Ａ３、４）
　上記で得られたコーティング膜形成用組成物３８を、２４穴細胞培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、＃３５１１４７、容積１ｍＬ、ポリスチレン製）の別々のウェルに８００μＬ／ウェルとなるよう添加し、室温にて１時間静置後、過剰の組成物を除去した。
　その後、オーブンを用いて７０℃で２４時間乾燥した。
　その後、コーティングした各ウェルを１．５ｍＬの純水で３回洗浄し、５０℃のオーブンを用いて１時間乾燥後、試験に用いた。

（細胞の調製）
　細胞は、マウス胚線維芽細胞（ＤＳファーマバイオメディカル社製）を用いた。細胞の培養に用いた培地は、１０％ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）とＬ－グルタミン－ペニシリン－ストレプトマイシン安定化溶液（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を含むＢＭＥ培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用いた。細胞は、３７℃／ＣＯ_２インキュベーター内にて５％二酸化炭素濃度を保った状態で、直径１０ｃｍのシャーレ（培地１０ｍＬ）を用いて２日間以上静置培養した。引き続き、本細胞をＰＢＳ５ｍＬで洗浄した後、０．２５ｗ／ｖ％トリプシン－１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＥＤＴＡ溶液（富士フイルム和光純薬（株）製）１ｍＬを添加して細胞を剥がし、上記の培地１０ｍＬにてそれぞれ懸濁した。本懸濁液を遠心分離（株式会社トミー精工製、型番ＬＣ－２００、１０００ｒｐｍ／３ｍｉｎ、室温）後、上清を除き、上記の培地を添加して細胞懸濁液を調製した。

（細胞付着実験）
　上記にて調製したプレートの各ウェルに対して、それぞれの細胞懸濁液を９６穴細胞培養プレートでは１×１０^４ｃｅｌｌｓ／ウェルになるように各１５０μＬ、２４穴細胞培養プレートでは５×１０^４ｃｅｌｌｓ／ウェルになるように各０．５ｍＬ加えた。その後、５％二酸化炭素濃度を保った状態で、３７℃で３日間ＣＯ_２インキュベーター内にて静置した。培養３日間後、上記にて調製したプレートの各ウェルに対する細胞の付着を倒立型顕微鏡（オリンパス社製、ＣＫＸ３１）による観察（倍率：４倍）に基づき比較した。
　観察結果を以下の評価基準で評価し、細胞接着抑制効果を確認した。
〔評価基準〕
　〇：基材底面への細胞の付着及び伸展が見られず、ウェル内で細胞凝集塊（スフェロイド）が形成した状態を示す。
　×：基材底面に細胞が付着し伸展している状態を示す。
　図４に実験例Ａ１の細胞付着試験の顕微鏡観察結果の写真を示した。
　実験例Ａ１のコーティング膜形成用組成物３８から得られたコーティング膜８４は、基材表面を親水化することによっていずれも細胞５６の付着及び伸展が見られず、ウェル内で細胞凝集塊（スフェロイド）の形成が観察された。

（タンパク質付着抑制試験用コーティングプレートの作製）
　上記で得られたコーティング膜形成用組成物３８を、９６穴細胞培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、＃９０１７、容積０．３６ｍＬ、ポリスチレン製）の別々のウェルに５ｗｅｌｌずつ１５０μＬ／ｗｅｌｌとなるよう添加し、室温にて１時間浸漬後排液し、オーブンを用いて５０℃で２４時間乾燥した。その後、コーティングした各ウェルを２００μＬの純水で３回ずつ洗浄し、７０℃のオーブンを用いて１時間乾燥後、試験に用いた。
　陰性対照として、コーティングを施していない９６穴細胞培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、＃９０１７、容積０．３６ｍＬ、ポリスチレン製）のウェルを用いた。

（ＩｇＧ－ＨＲＰ希釈溶液の調製）
　ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体ＨＲＰコンジュゲート（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ社製）をＰＢＳで１ｍｇ／ｇの濃度になるように希釈し、ＩｇＧ－ＨＲＰ希釈液を調製した。

（タンパク質付着実験）
　上記にて調製したプレートの各ウェル、陰性対照に対して、それぞれにＩｇＧ－ＨＲＰ希釈液を１００μＬ／ｗｅｌｌずつ加え、３０分間室温にて静置した。３０分後ＩｇＧ－ＨＲＰ希釈液を排液し、各ウェルを２００μＬのＰＢＳで３回ずつ洗浄した。ＴＭＢ溶液（ｓｅｒａ　ｃａｒｅ社製、ＳｕｒｅＢｌｕｅ）を１００μＬ／ｗｅｌｌずつ加え、１分後にＴＭＢ　ＳＴＯＰ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｓｅｒａ　ｃａｒｅ社製）を１００μＬ／ｗｅｌｌずつ加えた。マイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ社製、ｉｎｆｉｎｉｔｅ　Ｍ２００ＰＲＯ）を用い、４５０ｎｍ及び６５０ｎｍにおける吸光度を測定した。４５０ｎｍにおける吸光度から６５０ｎｍにおける吸光度を引いた値を算出し、５ウェルの平均吸光度を得た。陰性対照のウェルにおける平均吸光度をタンパク質吸着率１００％とし、上記で得られたコーティング膜形成用組成物３８をコーティングしたウェルのタンパク質吸着率を算出した。

＜実験例Ａ２、比較実験例Ａ１～２＞
　ポリ酢酸ビニルの重合度及びけん化度、並びに各溶媒組成を表１の記載に変更した以外は実験例Ａ１と同様に操作し、コーティング膜形成用組成物３８を調製した。得られたコーティング膜形成用組成物３８は透明かつ均一であった。
　得られたコーティング膜形成用組成物３８について、実験例Ａ１と同様に操作し、ＨＭＤＳ処理済みシリコンウェハ上にコーティング膜８４を形成し、かつ細胞培養用コーティングプレート、及びタンパク質付着抑制試験用コーティングプレートを作製した。
　実験例Ａ１と同様にして、残膜率を求めた。
　実験例Ａ１と同様にして、細胞付着実験を行った。
　実験例Ａ１と同様にして、タンパク質付着実験を行った。

＜実験例Ａ３～１１、比較実験例Ａ３～４＞
　ポリ酢酸ビニルの重合度及びけん化度、並びに各溶媒組成を表１の記載に変更した以外は実験例Ａ１と同様に操作し、コーティング膜形成用組成物３８を調製した。得られたコーティング膜形成用組成物３８は透明かつ均一であった。
　得られたコーティング膜形成用組成物３８について、実験例Ａ１と同様に操作し、ＨＭＤＳ処理済みシリコンウェハ上にコーティング膜８４を形成した。
　また、上記（ｉｉ）の方法で、細胞培養用コーティングプレートを作製した。
　また、実験例Ａ１と同様に操作しタンパク質付着抑制試験用コーティングプレートを作製した。
　実験例Ａ１と同様にして、残膜率を求めた。
　実験例Ａ１と同様にして、細胞付着実験を行った。
　実験例Ａ１と同様にして、タンパク質付着実験を行った。
　図５に比較実験例Ａ３の細胞付着試験の顕微鏡観察結果の写真を示した。
　比較実験例Ａ３のコーティング膜形成用組成物３８から得られたコーティング膜８４では、基材表面が十分に親水化されず、細胞はプレート底面に付着し伸展していた。

＜実験例Ａ１２～２０＞
　ポリ酢酸ビニルの重合度及びけん化度、並びに各溶媒組成を表１の記載に変更した以外は実験例Ａ３と同様にして、ＨＭＤＳ処理済みシリコンウェハ上、細胞培養用プレート上、及びタンパク質付着抑制試験用コーティングプレート上にコーティング膜８４を形成した。その後、γ線（２５ｋＧｙ）を照射した。
　実験例Ａ１と同様にして、残膜率を求めた。
　実験例Ａ１と同様にして、細胞付着実験を行った。
　実験例Ａ１と同様にして、タンパク質付着実験を行った。

＜実験例Ａ２１＞
（コーティング膜形成用組成物の調製）
　濃度を３ｍｇ／ｇとなるように溶解した以外は実験例Ａ２０と上記と同様に操作し、コーティング膜形成用組成物を調製した。得られたコーティング膜形成用組成物は透明かつ均一であった。

（インクジェットによる細胞培養用コーティングプレートの作製）
　インクジェット装置（セイコーエプソン（株）製、Ｒ＆Ｄ用インクジェット装置）、及びインクジェットヘッド（セイコーエプソン（株）製、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ　Ｃｏｒｅ　ヘッド　Ｓ８００－Ａ１）を用いて、７９ｍｍ×１２１ｍｍのサイズを有するポリスチレン基板に、上記にて調製したコーティング膜形成用組成物を直径１８ｍｍの真円状に適量塗布した。７０℃のオーブンで２４時間乾燥した。底なし２４ウェルプレート（シーエステック社製）へ貼り付け、細胞培養用コーティングプレートを作製した。

（細胞の調製）
　細胞は、ヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞ＡＤＳＣ（セルソース（株）製）を用いた。細胞の培養に用いた培地は、Ｌ－グルタミン－ペニシリン－ストレプトマイシン安定化溶液（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を含む低血清培地Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｍｅｄｉｕｍ　２培地（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社製）を用いた。細胞は、３７℃／ＣＯ２インキュベーター内にて５％二酸化炭素濃度を保った状態で、直径１０ｃｍのシャーレ（培地１０ｍＬ）を用いて２日間以上静置培養した。引き続き、本細胞をＰＢＳ５ｍＬで洗浄した後、ＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔ　Ｅｎｚｙｍｅ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）１ｍＬを添加して細胞を剥がし、上記の培地１０ｍＬにてそれぞれ懸濁した。本懸濁液を遠心分離（（株）トミー精工製、型番ＬＣ－２００、１０００ｒｐｍ／３分、室温）後、上清を除き、上記の培地を添加して細胞懸濁液を調製した。

（細胞付着実験）
　上記の方法で調製した細胞懸濁液を使用する以外は実験例１と同様にして、細胞付着実験を行った。
　実験例Ａ２１のコーティング膜形成用組成物３８から得られたコーティング膜８４は、基材表面を親水化することによっていずれも細胞５６の付着及び伸展が見られず、ウェル内で細胞凝集塊（スフェロイド）の形成が観察された。

＜比較実験例Ａ５＞
　特開２００３－２９２４７７号公報の合成例５及び実験例Ａ３にしたがって、感光性ポリビニルアルコールを得た。得られた感光性ポリビニルアルコールをエタノールで５ｍｇ／ｇの濃度となるように溶解させ、コーティング膜形成用組成物３８を調製した。
　なお、ポリビニルアルコールとしては、ゴーセノールＥＧ－３０Ｐ（三菱ケミカル社製、けん化度は８６．３－６９．０）を用いた。
　得られたコーティング膜形成用組成物３８について、実験例Ａ１と同様に操作し、ＨＭＤＳ処理済みシリコンウェハ上にコーティング膜８４を形成し、かつ細胞培養用コーティングプレートを作製した。
　実験例Ａ１と同様にして、残膜率を求めた。
　実験例Ａ１と同様にして、細胞付着実験を行った。

＜比較実験例Ａ６＞
　比較実験例Ａ５において、ＨＭＤＳ処理済みシリコンウェハ上にコーティング膜８４を形成し、かつ細胞培養用コーティングプレートを作製する際に、乾燥工程の後に、超高圧水銀灯（紫外線照度２０ｍＷ／ｃｍ^２：ＵＴ－１５０（ＵＳＨＩＯ製照度計））にて、５秒露光した以外は、比較実験例Ａ５と同様にして、ＨＭＤＳ処理済みシリコンウェハ上にコーティング膜８４を形成し、かつ細胞培養用コーティングプレートを作製した。
　実験例Ａ１と同様にして、残膜率を求めた。
　実験例Ａ１と同様にして、細胞付着実験を行った。

　表１中、ＥｔＯＨはエタノールを表し、ＰＧＭＥはプロピレングリコールモノメチルエーテルを表す。

　実験例Ａ１～２０及び比較実験例Ａ１～４におけるポリ酢酸ビニルのけん化度は、繰り返し単位（Ａ）と繰り返し単位（Ｂ）とのモル比率（Ａ：Ｂ）に相当する。
　例えば、けん化度３５．８モル％のポリ酢酸ビニルのモル比率（Ａ：Ｂ）は、６４．２：３５．８である。
　また、例えば、けん化度６５．４モル％のポリ酢酸ビニルのモル比率（Ａ：Ｂ）は、３４．６：６５．４である。

　実験例Ａ１～２０、及び比較実験例Ａ３～４で用いたポリ酢酸ビニルは、いずれも非水溶性であった。
　比較実験例Ａ１～２で用いたポリ酢酸ビニルは、いずれも水溶性であった。
　比較実験例Ａ５で用いた感光性ポリビニルアルコールは、水溶性であった。

　実験例Ａ１～２０のコーティング膜形成用組成物３８から得られたコーティング膜８４は、比較実験例Ａ１、２、及び５のコーティング膜形成用組成物３８から得られたコーティング膜８４に比べ、ＰＢＳによる洗浄後も残膜率が高かった。
　実験例Ａ１～２０のコーティング膜形成用組成物３８から得られたコーティング膜８４は、いずれも細胞の付着及び伸展が見られず、ウェル内で細胞凝集塊（スフェロイド）の形成が観察された。一方、比較実験例Ａ３、４、及び５のコーティング膜形成用組成物３８から得られたコーティング膜８４では、細胞はプレート底面に付着し伸展していた。また、比較実験例Ａ５のコーティング膜形成用組成物３８から得られたコーティング膜８４が実験例Ａと同程度の残膜率、及び細胞接着抑制効果を得るには、紫外線照射が必要であった。
　実験例Ａ１～２０のコーティング膜形成用組成物３８から得られたコーティング膜８４は、比較実験例Ａ３及びコーティング膜８４なしの基板８０に比べ、タンパク質付着率が低かった。

　以上の結果から、実験例Ａ１～２０のコーティング膜形成用組成物３８から得られたコーティング膜８４は、細胞５６の付着抑制能を有することは明らかである。したがって、このコーティング膜形成用組成物３８は、本実施形態の細胞構造体製造装置１０のコーティング膜形成部３０において、コーティング膜８４を形成するためのコーティング膜形成用組成物３８として好ましく用いることができる。

＜下地膜形成用組成物４８＞
　以下、実験例Ｂ及び比較実験例Ｂをにより、下地膜形成用組成物をより具体的に説明するが、下地膜形成用組成物は下記の実験例Ｂに限定されるものではない。以下の実験例Ｂ及び比較実験例Ｂでは、基板８０の上に、下地膜形成用組成物４８を用いて下地膜９０を形成したものを、細胞凝集塊製造用基板という。また、実験例Ｂ及び比較実験例Ｂで用いた下地膜形成用組成物４８のことを、下地膜形成剤という。

＜重量平均分子量の測定方法＞
下記合成例に示す重量平均分子量はGel Filtration Chromatography（以下、ＧＦＣと略称する）による結果である。
（測定条件）
・装置：HLC-8320GPC（東ソー（株）製）
・ＧＦＣカラム：TSKgel G 6000 + 3000 PWXL-CP
・流速：１．０mL／min
・溶離液：塩含有の水／有機混合溶媒
・カラム温度：４０℃
・検出器：ＲＩ
・注入濃度：ポリマー固形分０．０５質量％
・注入量：１００μL
・検量線：三次近似曲線
・標準試料：ポリエチレンオキサイド（Agilent社製）×１０種

＜合成例１＞
　メタクリル酸２－（ジメチルアミノ）エチル（東京化成工業（株）製）２４．００g、メタクリル酸（東京化成工業（株）製）１．４６g、エチレングリコールジメタクリレート（東京化成工業（株）製）５．０９g、ジメチル　１，１′－アゾビス（１－シクロヘキサンカルボキシレート）（ＶＥ－０７３、富士フイルム和光純薬（株）製）０．３１g、２－プロパノール１１１．０９gを混合し、リフラックス温度とした２－プロパノール１６６．６２gに対して滴下重合することでポリマーを合成した。反応生成物を貧溶媒であるヘキサンで再沈殿させ、析出物を濾過により回収し減圧乾燥させた。
　ＧＦＣによるこのポリマーの重量平均分子量は２２８，０００であった（以下、「合成例ポリマー１」と称す）。

＜合成例２＞
　メタクリル酸２－（ジメチルアミノ）エチル（東京化成工業（株）製）８．００g、メタクリル酸（東京化成工業（株）製）１．８８g、エチレングリコールジメタクリレート（東京化成工業（株）製）１．９８g、ジメチル　１，１′－アゾビス（１－シクロヘキサンカルボキシレート）（ＶＥ－０７３、富士フイルム和光純薬（株）製）０．１２g、２－プロパノール４３．１０gを混合し、リフラックス温度とした２－プロパノール６４．６５ｇに対して滴下重合することでポリマーを合成した。反応生成物を貧溶媒であるヘキサンで再沈殿させ、析出物を濾過により回収し減圧乾燥させた。
　ＧＦＣによるこのポリマーの重量平均分子量は４３８，０００であった（以下、「合成例ポリマー２」と称す）。

＜実験例Ｂ１＞
　上記合成例１で得られたポリマー０．００２５gに、純水９９．５g、０．５mg／mLビトロネクチンＶＴＮ－Ｎ（ギブコ社）０．５mLを加えて十分に攪拌し、下地膜形成剤を調製した。インクジェット装置（（株）マイクロジェット製、型番：LaboJet-600）、及びインクジェットヘッド（型番：500-S-C）を用いて、細胞５６の付着抑制能を有する培養ディッシュ（直径：３５mm）（住友ベークライト株式会社、MS9035X）の培養表面に、下地膜形成剤を適量塗布した。７０℃の恒温乾燥機で１日間乾燥させて細胞凝集塊製造用基板を調製した。

＜実験例Ｂ２＞
　上記合成例１で得られたポリマー０．００２５gに、純水９９g、０．５mg／mLビトロネクチンＶＴＮ－Ｎ（ギブコ社）１mLを加えて十分に攪拌し、下地膜形成剤を調製した。実験例Ｂ１と同様にインクジェット装置を用いて下地膜形成剤を塗布して乾燥させ、細胞凝集塊製造用基板を調製した。

＜実験例Ｂ３＞
　上記合成例２で得られたポリマー０．００５gに、純水９９g、０．５mg／mLビトロネクチンＶＴＮ－Ｎ（ギブコ社）１．０mLを加えて十分に攪拌し、下地膜形成剤を調製した。実験例Ｂ１と同様にインクジェット装置を用いて下地膜形成剤を塗布して乾燥させ、細胞凝集塊製造用基板を調製した。

＜実験例Ｂ４＞
　上記合成例１で得られたポリマー０．００５gに、純水９９g、０．５mg／mLビトロネクチンＶＴＮ－Ｎ（ギブコ社）１．０mLを加えて十分に攪拌し、下地膜形成剤を調製した。実験例Ｂ１と同様にインクジェット装置を用いて下地膜形成剤を塗布して乾燥させ、細胞凝集塊製造用基板を調製した。

＜実験例Ｂ５＞
　上記合成例１で得られたポリマー０．０１５gに、純水９４g、０．５mg／mLビトロネクチンＶＴＮ－Ｎ（ギブコ社）６．０mLを加えて十分に攪拌し、下地膜形成剤を調製した。インクジェット装置（（株）マイクロジェット製、型番：LaboJet-600）、及びインクジェットヘッド（型番：IJHBS-1000）を用いて、細胞５６の付着抑制能を有する培養プレート（住友ベークライト株式会社、PrimeSurface（登録商標）プレート24F、型番： MS-90240）の培養表面に、下地膜形成剤を適量塗布した。７０℃の恒温乾燥機で１日間乾燥させて細胞凝集塊製造用基板を調製した。ガンマ線を２５ｋＧｙ照射することで滅菌を行った。

＜実験例Ｂ６＞
　上記合成例１で得られたポリマー０．００５gに、純水９８g、０．５mg／mLビトロネクチンＶＴＮ－Ｎ（ギブコ社）２．０mLを加えて十分に攪拌し、下地膜形成剤を調製した。インクジェット装置（（株）マイクロジェット製、型番：LaboJet-600）、及びインクジェットヘッド（型番：IJHBS-1000）を用いて、細胞５６の付着抑制能を有する培養プレート（住友ベークライト株式会社、PrimeSurface（登録商標）プレート24F、型番： MS-90240）の培養表面に、下地膜形成剤を適量塗布した。７０℃の恒温乾燥機で１日間乾燥させて細胞凝集塊製造用基板を調製した。ガンマ線を２５ｋＧｙ照射することで滅菌を行った。

＜実験例Ｂ７＞
　上記合成例１で得られたポリマー０．００５gに、純水３１．３g、０．５mg／mLビトロネクチンＶＴＮ－Ｎ（ギブコ社）２．０mLを加えて十分に攪拌し、下地膜形成剤を調製した。インクジェット装置（（株）マイクロジェット製、型番：LaboJet-600）、及びインクジェットヘッド（型番：200-S-C）を用いて、細胞５６の付着抑制能を有する培養プレート（住友ベークライト株式会社、PrimeSurface（登録商標）プレート24F、型番： MS-90240）の培養表面に、下地膜形成剤を適量塗布した。７０℃の恒温乾燥機で１日間乾燥させて細胞凝集塊製造用基板を調製した。ガンマ線を２５ｋＧｙ照射することで滅菌を行った。

＜実験例Ｂ８＞
上記合成例１で得られたポリマー０．００５gに、滅菌水６２．７g、滅菌水で０．５mg／mLに希釈したRecombinant Human Vitronectin（Peprotech社製）４．００gを加えて十分に攪拌し、下地膜形成剤を調製した。細胞５６の付着抑制能を有するシート（実験例Ａ２１で作製した細胞の付着抑制能を有するシート）の培養表面に、インクジェット装置（セイコーエプソン（株）製、Ｒ＆Ｄ用インクジェット装置）、及びインクジェットヘッド（セイコーエプソン（株）製、Precision Core ヘッド S800-A1）を用いて、実験例Ｂ８で調製した下地膜形成剤をスポット直径１７０μｍ、スポット中心間間隔２５０μｍとなるように適量塗布した。７０℃の恒温乾燥機で１日間乾燥させた。底なし２４ウェルプレート（シーエステック社製）へ貼り付け、細胞凝集塊製造用基板を調製した。ガンマ線を２５ｋＧｙ照射することで滅菌を行った。

＜実験例Ｂ９＞
上記実験例Ｂ８で下地膜形成剤のスポット直径を２５０μｍ、スポット中心間間隔を３５０μｍとした以外は実験例Ｂ８と同様の操作を行い、細胞凝集塊形成用基板を作製した。

＜実験例Ｂ１０＞
上記実験例Ｂ８で下地膜形成剤のスポット直径を４００μｍ、スポット中心間間隔を５００μｍとした以外は実験例Ｂ８と同様の操作を行い、細胞凝集塊形成用基板を作製した。

＜実験例Ｂ１１＞
上記実験例Ｂ８で下地膜形成剤のスポット直径を７００μｍ、スポット中心間間隔を８００μｍとした以外は実験例Ｂ８と同様の操作を行い、細胞凝集塊形成用基板を作製した。

＜実験例Ｂ１２＞
上記実験例Ｂ８で下地膜形成剤のスポット直径を９００μｍ、スポット中心間間隔を１０００μｍとした以外は実験例Ｂ８と同様の操作を行い、細胞凝集塊形成用基板を作製した。

＜比較実験例Ｂ１＞
　上記合成例１で得られたポリマー０．００２５gに、純水１００．０gを加えて十分に攪拌し、下地膜形成剤を調製した。実験例Ｂ１と同様にインクジェット装置を用いて下地膜形成剤を塗布して乾燥させ、細胞凝集塊製造用基板を調製した。

＜比較実験例Ｂ２＞
　上記合成例２で得られたポリマー０．００５gに、純水１００．０gを加えて十分に攪拌し、下地膜形成剤を調製した。実験例Ｂ１と同様にインクジェット装置を用いて下地膜形成剤を塗布して乾燥させ、細胞凝集塊製造用基板を調製した。

＜比較実験例Ｂ３＞
　上記合成例１で得られたポリマー０．００５gに、純水３３．３gを加えて十分に攪拌し、下地膜形成剤１０を調製した。インクジェット装置（（株）マイクロジェット製、型番：LaboJet-600）、及びインクジェットヘッド（型番：200-S-C）を用いて、細胞５６の付着抑制能を有する培養ディッシュ（直径：３５mm）（住友ベークライト株式会社、MS9035X）の培養表面に、下地膜形成剤を適量塗布した。７０℃の恒温乾燥機で１日間乾燥させて細胞凝集塊製造用基板を調製した。ガンマ線を２５ｋＧｙ照射することで滅菌を行った。

＜比較実験例Ｂ４＞
　純水４．８g、０．５mg／mLビトロネクチンＶＴＮ－Ｎ（ギブコ社）０．２mLを加えて十分に攪拌し、下地膜形成剤１１を調製した。実験例Ｂ１と同様にインクジェット装置を用いて下地膜形成剤を塗布して乾燥させ、細胞凝集塊製造用基板を調製した。

＜比較実験例Ｂ５＞
　純水２．１g、０．５mg／mLビトロネクチンＶＴＮ－Ｎ（ギブコ社）１．２mLを加えて十分に攪拌し、下地膜形成剤１２を調製した。実験例Ｂ１と同様にインクジェット装置を用いて下地膜形成剤１２を塗布して乾燥させ、細胞凝集塊製造用基板を調製した。

＜試験例Ｂ１：実験例Ｂ１～３、比較実験例Ｂ１～２のＦＢＳ不含培地でのマウス線維芽細胞での細胞接着確認試験＞
（細胞５６の調製）
　細胞５６は、マウス胎児線維芽細胞（C3H10T1／T2細胞：ＤＳファーマバイオメディカル（株）製）を用いた。細胞の培養には、基礎培地となるＢＭＥ培地（Gibco社製）に対しＦＢＳ（Sigma-Aldrich社製）を１０％、Glutamine／Penicillin／Streptmycin（Gibco社製）を１％となるように添加した培地を用いた。細胞は、３７℃／ＣＯ_２インキュベーター内にて５％二酸化炭素濃度を保った状態で、直径１０ｃｍのシャーレ（培地１０ｍＬ）を用いて２日間以上静置培養した。引き続き、本細胞をＰＢＳ溶液（富士フイルム和光純薬（株）製）３mLで洗浄した後、トリプシン－ＥＤＴＡ溶液（PromoCell社製）３mLを添加して室温で３分間静置し細胞を剥離した。ＦＢＳ（ウシ血清）及びGlutamine／Penicillin／Streptmycin不含のＢＭＥ培地を７mL添加して細胞５６を回収した。本懸濁液を遠心分離（（株）トミー精工製、型番LC-230、２００×g／３分、室温）後、上清を除き、上記の培地を添加して細胞懸濁液を調製した。

（細胞接着確認試験）
　実験例Ｂ１～３、比較実験例Ｂ１、２で作製した細胞凝集塊製造用基板に対して、細胞懸濁液を２．０mL加えた。細胞密度は実験例Ｂ１、実験例Ｂ２、比較実験例Ｂ１については１．５×１０^５cells／cm²、実験例Ｂ３、比較実験例Ｂ２については３．０×１０^５cells／cm²となるように播種した。その後、５％二酸化炭素濃度を保った状態で、３７℃／ＣＯ_２インキュベーター内にて２時間静置した。静置後、非接着細胞と培地を除去し、ＰＢＳで洗浄することで接着細胞のみをウェル上へ残した。洗浄後、新しい培地を２．０ｍＬ添加し、実体顕微鏡ＳＺＸ１６（オリンパス（株）製）を用いて接着細胞の様子を観察、撮影した。その結果、図６に示すように、実験例Ｂ１～３及び比較実験例Ｂ１、２で作製した基板８０上の下地膜９０部分への選択的な細胞の接着が確認された。実験例Ｂ１～３については細胞接着に間隙はなく均一な接着が起きていた。一方で比較実験例Ｂ１～２については細胞接着に間隙があり、不均一に細胞接着していることがわかった。
　上記より下地膜形成剤中に細胞５６の接着や伸展を促進する添加物を含有することで、血清（ＦＢＳ）不含の培地中において下地膜９０の上に均一な細胞接着を達成できることがわかった。

＜試験例Ｂ２：実験例Ｂ４、６のＦＢＳ不含培地でのマウス線維芽細胞での細胞接着、細胞凝集塊形成確認試験＞
（細胞５６の調製）
　試験例Ｂ１と同様の方法で細胞５６の調製を実施した。
（細胞接着確認試験）
　実験例Ｂ４、６で作製した細胞凝集塊製造用基板に対して、細胞懸濁液を３．０×１０^５cells／cm²となるように２．０mL加えた。その後、５％二酸化炭素濃度を保った状態で、３７℃／ＣＯ_２インキュベーター内にて２時間静置した。静置後、非接着細胞と培地を除去し、ＰＢＳで洗浄することで接着細胞のみをウェル上へ残した。洗浄後、新しい培地を２．０ｍＬ添加し、実体顕微鏡ＳＺＸ１６（オリンパス（株）製）を用いて接着細胞の様子を観察、撮影した。更に翌日細胞凝集塊形成の有無を観察、撮影した。その結果、図７に示すように、作製した基板８０上の下地膜９０部分への選択的な細胞５６の接着が確認された。また細胞接着に間隙はなく均一な接着が起きていた。更に２日後の時点では接着した細胞５６がシャーレから剥がれて凝集し、細胞凝集塊（スフェロイド）を形成していることが確認された。上記より細胞５６の接着や伸展を促進する添加物を含有した下地膜９０において均一な細胞接着後に細胞５６が剥離し細胞凝集塊を形成可能であることがわかった。

＜試験例Ｂ３：実験例Ｂ５、比較実験例Ｂ３のヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞を用いた無血清培地での細胞接着確認試験＞
（細胞５６の調製）
　細胞５６は、ヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞（ＡＤＳＣ：セルソース（株）製）を用いた。細胞の培養には、低血清培地Mesenchymal Stem Cell Growth Medium 2（タカラバイオ（株）製：血清濃度２％）を用いた。細胞は、３７℃／ＣＯ_２インキュベーター内にて５％二酸化炭素濃度を保った状態で、直径１０ｃｍのシャーレ（培地１０ｍＬ）を用いて２日間以上静置培養した。引き続き、本細胞をＰＢＳ溶液（富士フイルム和光純薬（株）製）３mLで洗浄した後、トリプシン－ＥＤＴＡ溶液（PromoCell社製）３mLを添加して室温で３分間静置し細胞を剥離した。無血清培地のMesenchymal Stem Cell Growth Medium DXF培地を７mL添加して細胞５６を回収した。本懸濁液を遠心分離（（株）トミー精工製、型番LC-230、２００×g／３分、室温）後、上清を除き、上記の培地を添加して細胞懸濁液を調製した。

（細胞接着確認試験）
　実験例Ｂ５、比較実験例Ｂ３で作製した細胞凝集塊製造用基板に対して、細胞懸濁液を３．０×１０^５cells／cm²となるように２．０mL加えた。その後、５％二酸化炭素濃度を保った状態で、３７℃／ＣＯ_２インキュベーター内にて２時間静置した。静置後、非接着細胞と培地を除去し、ＰＢＳで洗浄することで接着細胞のみをウェル上へ残した。洗浄後、新しい培地を２．０mL添加し、実体顕微鏡ＳＺＸ１６（オリンパス（株）製）を用いて接着細胞５６の様子を観察、撮影した。その結果、図８に示すように、実験例Ｂ５の場合には作製した基板８０上の下地膜９０部分への選択的な細胞５６の接着が確認された。また細胞接着に間隙はなく均一な接着が起きていた。一方で比較実験例Ｂ３については細胞接着に間隙があり、不均一に細胞接着していることがわかった。
　上記より下地膜形成剤中に細胞５６の接着や伸展を促進する添加物を含有することで、ＡＤＳＣを用いた場合でも、無血清培地中において下地膜９０上に均一な細胞接着を達成できることがわかった。

＜試験例Ｂ４：実験例Ｂ７のヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞を用いた低血清培地での細胞接着確認試験＞
（細胞５６の調製）
　試験例Ｂ３において細胞剥離後の培養液を低血清培地のMesenchymal Stem Cell Growth　Medium 2培地に変えた以外は同様の方法で細胞５６の調製を実施した。
（細胞接着確認試験）
　実験例Ｂ７で作製した細胞凝集塊製造用基板に対して、試験例Ｂ３と同様の方法で細胞接着確認試験を実施した。その結果、図９に示すように、作製した基板８０上の下地膜９０部分への選択的な細胞５６の接着が確認された。また細胞接着に間隙はなく均一な接着が起きていた。
　上記より下地膜形成剤中に細胞５６の接着や伸展を促進する添加物を含有することで、ＡＤＳＣを用いた場合で、低血清培地中においても下地膜９０上に均一な細胞接着を達成できることがわかった。

＜試験例Ｂ５：実験例Ｂ８～Ｂ１２のヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞を用いた無血清培地でのスフェロイド直径確認試験＞
（細胞５６の調製）
　試験例Ｂ３に記載の方法で細胞懸濁液を調製した。
（細胞接着、スフェロイド形成確認試験）
　実験例Ｂ８～Ｂ１２で作製した細胞凝集塊製造用基板に対して、細胞懸濁液を２.９×１０^５～６．０×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように１．０mL加えた。その後、５％二酸化炭素濃度を保った状態で、３７℃／ＣＯ_２インキュベーター内にて２時間静置した。静置後、実体顕微鏡ＳＺＸ１６（オリンパス（株）製）を用いて接着細胞の様子を観察、撮影した。更に３日後にＣｅｌｌ３ｉｍａｇｅｒ ｄｕｏｓ（（株）スクリーンホールディングス）を用いて細胞凝集塊形成の有無を観察、撮影した。その結果、図１０に示すように、作製した基板上の下地膜部分への選択的な細胞の接着が確認された。また細胞接着に間隙はなく均一な接着が起きていた。また細胞接着直径は、塗布直径と同等の大きさであった。更に３日後の時点では接着した細胞がシャーレから剥がれて凝集し、細胞凝集塊（スフェロイド）を形成していることが確認された。

（スフェロイドのサイズ分布の評価）
　上記試験で実験例Ｂ８～Ｂ１０の細胞凝集塊製造用基板にてスフェロイドを形成したウェルをＣｅｌｌ３ｉｍａｇｅｒ ｄｕｏｓで撮影し、サイズ評価を行った。その結果図１１に示すようにそれぞれスフェロイド直径１００μｍ、１２０μｍ、１５０μｍにピークトップを持っていた。またスフェロイド直径の分布が小さいことから、均一なスフェロイドが形成していることが分かった。

（スフェロイドのサイズ誤差、塗布直径とスフェロイド直径、体積の確認）
　上記試験で実験例Ｂ８～Ｂ１２の細胞凝集塊製造用基板にてスフェロイドを形成したウェルをＣｅｌｌ３ｉｍａｇｅｒ ｄｕｏｓで撮影した。画像処理ソフトＩｍａｇｅＪを用いてランダムに選択した５０個以上のスフェロイドの直径を測定し、平均スフェロイド直径、サイズ誤差を算出した。その結果を図１２に示す。図１２に示すように、下地膜の塗布直径の増加に伴い平均スフェロイド直径が増加した。またサイズ誤差は３～１３％と小さく均一なスフェロイドが形成したことが分かった。

　実験例Ｂ８～Ｂ１２の細胞凝集塊形成用の下地膜の塗布面積とスフェロイド直径の関係をグラフ化した。その結果を図１３に示す。図１３に示すように、累乗近似の関係式に分布することが示された。これは理論式から考えても矛盾のない結果である。更に下地膜の塗布面積とスフェロイドの体積の関係を算出しグラフ化した結果を図１４に示す。その結果、下地膜の塗布面積とスフェロイド体積は直線関係にあることが示された。相関係数R²＝0.9989であることから強い相関があることが示された。以上より下地膜の塗布面積を制御することでスフェロイド直径やスフェロイド体積を制御可能であることが示された。

＜試験例Ｂ６：比較実験例Ｂ４（ポリマー不含で添加物のみ）のＦＢＳ不含培地でのマウス線維芽細胞での細胞接着、細胞凝集塊形成確認試験＞
（細胞５６の調製）
　試験例Ｂ１と同様の方法で細胞５６の調製を実施した。
（細胞接着確認試験）
　比較実験例Ｂ４で作製した細胞凝集塊製造用基板に対して、試験例Ｂ２と同様の方法で細胞接着、細胞凝集塊形成確認試験を実施した。その結果、図１５に示すように、作製した基板８０上の下地膜９０部分への細胞接着は確認されなかった。上記よりポリマー不含で細胞５６の接着や伸展を促進する添加物のみを含有する下地膜９０において、細胞接着が達成できないことがわかった。これよりポリマーと添加物を組み合わせることで初めて細胞接着効果が表れることがわかった。

＜試験例Ｂ７：比較実験例Ｂ５（ポリマー不含で添加物のみ）のＦＢＳ含有培地でのマウス線維芽細胞での細胞接着、細胞凝集塊形成確認試験＞
（細胞５６の調製）
　細胞剥離後の培養液をＦＢＳ（ウシ血清）１０％及びGlutamine／Penicillin／Streptmycin１％含有したＢＭＥ培地に変えた以外は、試験例Ｂ１と同様の方法で細胞５６の調製を実施した。
（細胞接着確認試験）
　比較実験例Ｂ５で作製した細胞凝集塊製造用基板に対して、試験例Ｂ２と同様の方法で細胞接着、細胞凝集塊形成確認試験を実施した。その結果、図１６に示すように、作製した基板８０上の下地膜９０部分への選択的な細胞５６の接着が確認された。また細胞接着に間隙はなく均一な接着が起きていた。更に２日後の時点では接着した細胞５６がシャーレ上に接着したままであることが確認された。上記よりポリマー不含で細胞５６の接着や伸展を促進する添加物のみを含有する下地膜９０において、血清培地中では均一な細胞接着は達成されるものの、その後剥離しないため細胞凝集塊の形成ができないことがわかった。

　以上の結果から、実験例Ｂ１～１２により得られた下地膜形成用組成物４８から得られた下地膜９０を有する細胞凝集塊製造用基板を用いるならば、下地膜９０部分への選択的な細胞５６の接着を行うことができることが明らかである。したがって、この下地膜形成用組成物４８は、本実施形態の細胞構造体製造装置１０の下地膜形成部４０において、下地膜９０を形成するための下地膜形成用組成物４８として好ましく用いることができる。

　１　細胞構造体
　１０　細胞構造体製造装置
　１２　移動機構
　１４　回転機構
　２０　基板供給部
　２２　原料基板カセット
　３０　コーティング膜形成部
　３２　コーティング膜形成用塗布機構
　３４　コーティング膜形成用組成物タンク
　３６　コーティング膜乾燥機構
　３８　コーティング膜形成用組成物
　４０　下地膜形成部
　４２　下地膜形成用塗布機構
　４４　下地膜形成用組成物タンク
　４６　下地膜乾燥機構
　４８　下地膜形成用組成物
　５０　播種部
　５２　細胞播種機構
　５４　細胞タンク
　５６　細胞
　６０　凝集培養部
　７０　細胞構造体採集部
　７２　細胞構造体採集機構
　８０　基板
　８２　原料基板
　８４　コーティング膜
　９０　下地膜
　９０ａ　下地膜パターン

Claims (12)

1. 　細胞構造体を製造するための細胞構造体製造装置であって、
   　基板を供給する基板供給部であって、前記基板の少なくとも１つの表面が、細胞の付着抑制能を有する、基板供給部と、
   　前記基板の上に、下地膜を形成する下地膜形成部であって、前記下地膜形成部が、前記基板の上に下地膜形成用組成物を塗布する下地膜形成用塗布機構を含み、前記下地膜が細胞接着性を有する、下地膜形成部と、
   　前記下地膜を含む前記基板の上に細胞を播種する播種部と
   を含む、細胞構造体製造装置。
2. 　前記基板供給部が、原料基板の少なくとも１つの表面の少なくとも一部に、細胞の付着抑制能を有するコーティング膜を形成するコーティング膜形成部を更に含み、
   　前記コーティング膜形成部が、コーティング膜形成用組成物を前記基板の表面に塗布するコーティング膜形成用塗布機構を含み、
   　前記下地膜形成用塗布機構が、前記基板の前記コーティング膜の少なくとも一部の表面に、前記下地膜形成用組成物を塗布することを含む、請求項１に記載の細胞構造体製造装置。
3. 　前記コーティング膜形成用組成物が、下記式（Ａ）で表される繰り返し単位（Ａ）、及び下記式（Ｂ）で表される繰り返し単位（Ｂ）を有する共重合体を含む、請求項２に記載の細胞構造体製造装置。
   

   

   
   （式中、Ｒ^１～Ｒ^３は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素原子数１～５のアルキル基を表し、Ｘ^１及びＸ^２は、それぞれ独立して、単結合、エステル結合、エーテル結合、アミド結合又は酸素原子で中断されてもよい炭素原子数１～５のアルキレン基を表す。）
4. 　前記下地膜形成用塗布機構及び前記コーティング膜形成用塗布機構から選択される少なくとも１つが、点描式の塗布機構である、請求項１～３の何れか１項に記載の細胞構造体製造装置。
5. 　前記基板が、略平滑な表面を有する、請求項１～４の何れか１項に記載の細胞構造体製造装置。
6. 　前記基板の表面が、凹凸を有する、請求項１～４の何れか１項に記載の細胞構造体製造装置。
7. 　前記基板又は前記原料基板が可撓性を有し、前記基板供給部が巻取式の基板カセット又は原料基板カセットを含み、前記基板が前記基板カセットから供給され、又は前記原料基板が前記原料基板カセットから供給される、請求項１～６の何れか１項に記載の細胞構造体製造装置。
8. 　前記細胞構造体製造装置が、前記下地膜を含む前記基板の上に付着した細胞を凝集又は培養させる凝集培養部を更に含む、請求項１～７の何れか１項に記載の細胞構造体製造装置。
9. 　前記細胞構造体のサイズ誤差が２０％以内である、請求項１～８の何れか１項に記載の細胞構造体製造装置。
10. 　前記細胞構造体製造装置が、前記細胞構造体製造装置の内部を気密な閉鎖空間にすることが可能な気密機構を有し、前記気密機構が、前記閉鎖空間の内部を無菌環境に維持することが可能である、請求項１～９の何れか１項に記載の細胞構造体製造装置。
11. 　前記下地膜形成用組成物が、下記式（Ｉ）：
    

    

    
    ［式中、
    　Ｕ^ａ１及びＵ^ａ２は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、Ｒ^a１は、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、Ｒ^a２は、炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキレン基を表す］で表されるモノマーから誘導される繰り返し単位、及び、下記式（ＩＩ）：
    

    

    
    ［式中、
    　Ｒ^ｂは、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表す］で表されるモノマーから誘導される繰り返し単位を含む共重合体を含む、請求項１～１０の何れか１項に記載の細胞構造体製造装置。
12. 　前記下地膜形成用組成物が、細胞接着性物質を更に含む、請求項１１に記載の細胞構造体製造装置。

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