JPH0690738A - 培養用器具及びその製造方法 - Google Patents
培養用器具及びその製造方法Info
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- JPH0690738A JPH0690738A JP24352292A JP24352292A JPH0690738A JP H0690738 A JPH0690738 A JP H0690738A JP 24352292 A JP24352292 A JP 24352292A JP 24352292 A JP24352292 A JP 24352292A JP H0690738 A JPH0690738 A JP H0690738A
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- Japan
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- culture
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 長期保存と滅菌が可能で、かつ長期培養時に
おいて陽電荷の効果が持続し、初代培養、神経系細胞の
培養において細胞形態、機能維持が良好な培養用器具を
提供する。 【構成】 表面に水酸基を有するか、または表面処理に
より水酸基を導入した基材表面に、１級アミノシランカ
ップリング剤を反応させて、培養面に１級アミノシラン
（アミノ基密度０．１〜２ｎｍｏｌ／ｃｍ2 ）を形成さ
せる。
おいて陽電荷の効果が持続し、初代培養、神経系細胞の
培養において細胞形態、機能維持が良好な培養用器具を
提供する。 【構成】 表面に水酸基を有するか、または表面処理に
より水酸基を導入した基材表面に、１級アミノシランカ
ップリング剤を反応させて、培養面に１級アミノシラン
（アミノ基密度０．１〜２ｎｍｏｌ／ｃｍ2 ）を形成さ
せる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、基材表面に陽電荷を付
与した、細胞の初代培養や神経系細胞の培養に適した培
養用容器、及びその製造方法に関するものである。
与した、細胞の初代培養や神経系細胞の培養に適した培
養用容器、及びその製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】一般に市販されているシャーレ、フラス
コ、マルチプレート等の細胞培養器具は、主としてポリ
スチレン成形品の表面に低温プラズマ処理、コロナ放電
処理等を施し、親水性を付与したものである。これらの
細胞培養器具は、足場依存性の細胞は、株化細胞、初代
細胞を問わず、線維芽細胞、平滑筋細胞、血管内皮細
胞、角膜細胞等の培養に広く用いられている。又、血液
系細胞として、株化したリンパ球であるＮＳ−１，ＭＯ
ＬＴ−４，ＨＵＴ ７８，ＭＴ−４，Ｊｕｒｋａｔ等、
いわゆる足場非依存性の浮遊細胞等にも広く使用されて
いる。
コ、マルチプレート等の細胞培養器具は、主としてポリ
スチレン成形品の表面に低温プラズマ処理、コロナ放電
処理等を施し、親水性を付与したものである。これらの
細胞培養器具は、足場依存性の細胞は、株化細胞、初代
細胞を問わず、線維芽細胞、平滑筋細胞、血管内皮細
胞、角膜細胞等の培養に広く用いられている。又、血液
系細胞として、株化したリンパ球であるＮＳ−１，ＭＯ
ＬＴ−４，ＨＵＴ ７８，ＭＴ−４，Ｊｕｒｋａｔ等、
いわゆる足場非依存性の浮遊細胞等にも広く使用されて
いる。
【０００３】しかし、細胞の種類によっては、これらの
細胞培養器具上では細胞の接着や増殖は認められるもの
の、細胞の接着伸展が悪かったり、増殖形態が悪かった
りする。特に、初代培養においてはそれが顕著である。
そこで、細胞の接着伸展及び増殖促進の目的でコラーゲ
ン、ゼラチンといった細胞外マトリックスやファイブロ
ネクチン、ラミニン、ビトロネクチンといった接着因子
等を培養面にコートし、細胞の接着性、増殖性を付与し
たりする。
細胞培養器具上では細胞の接着や増殖は認められるもの
の、細胞の接着伸展が悪かったり、増殖形態が悪かった
りする。特に、初代培養においてはそれが顕著である。
そこで、細胞の接着伸展及び増殖促進の目的でコラーゲ
ン、ゼラチンといった細胞外マトリックスやファイブロ
ネクチン、ラミニン、ビトロネクチンといった接着因子
等を培養面にコートし、細胞の接着性、増殖性を付与し
たりする。
【０００４】また、細胞の初代培養における３次元培養
や神経系細胞初代培養においては、基材表面をプラスに
チャージ、即ち陽電荷を付与すると細胞の機能維持に有
効であることが分かってきており、神経系細胞の初代培
養には、予め基材表面にポリリジン、ポリオルニチン、
ポリエチレンイミン等をコートしたり、アンモニアプラ
ズマによりアミノ基等を導入して基材表面をプラスにチ
ャージさせた培養容器が使用されている。又、ラットの
肝細胞の初代培養においては細胞塊を形成し、それによ
り細胞の機能が高まるという報告もある。
や神経系細胞初代培養においては、基材表面をプラスに
チャージ、即ち陽電荷を付与すると細胞の機能維持に有
効であることが分かってきており、神経系細胞の初代培
養には、予め基材表面にポリリジン、ポリオルニチン、
ポリエチレンイミン等をコートしたり、アンモニアプラ
ズマによりアミノ基等を導入して基材表面をプラスにチ
ャージさせた培養容器が使用されている。又、ラットの
肝細胞の初代培養においては細胞塊を形成し、それによ
り細胞の機能が高まるという報告もある。
【０００５】しかし、ポリリジンやポリオルニチンは安
定性が悪く、普通、コート後の有効期間は室温で２週
間、冷蔵で１カ月程度である。また上記のような不安定
さからも判るように、コート後滅菌を施すことが出来な
いため、無菌的な操作によりコートをしなければならな
い。そのため、主に神経系細胞の培養を目的として、コ
マーシャルベースでポリリジンやポリオルニチンをコー
トした培養用容器を販売しようとした場合、生産面及び
流通面でのコストが高くつくことになる。
定性が悪く、普通、コート後の有効期間は室温で２週
間、冷蔵で１カ月程度である。また上記のような不安定
さからも判るように、コート後滅菌を施すことが出来な
いため、無菌的な操作によりコートをしなければならな
い。そのため、主に神経系細胞の培養を目的として、コ
マーシャルベースでポリリジンやポリオルニチンをコー
トした培養用容器を販売しようとした場合、生産面及び
流通面でのコストが高くつくことになる。
【０００６】ポリエチレンイミンもポリリジンやポリオ
ルニチンの代替としてコートされるが、ポリエチレンイ
ミンは細胞毒性が強く、吸着後の洗浄を念入りに行わな
いと、培養中にポリエチレンイミンが培地中に解け出し
て、細胞に悪い影響を与えることになる。
ルニチンの代替としてコートされるが、ポリエチレンイ
ミンは細胞毒性が強く、吸着後の洗浄を念入りに行わな
いと、培養中にポリエチレンイミンが培地中に解け出し
て、細胞に悪い影響を与えることになる。
【０００７】上記のポリリジン、ポリオルニチン、ポリ
エチレンイミンはいずれも、コート方法は吸着方法であ
り、基材に吸着させただけであるから長期間培養した場
合にはコート物が基材より解け出し、効力が薄れてく
る。長期に亘り培養した場合、その効果は２週間程度で
ある。
エチレンイミンはいずれも、コート方法は吸着方法であ
り、基材に吸着させただけであるから長期間培養した場
合にはコート物が基材より解け出し、効力が薄れてく
る。長期に亘り培養した場合、その効果は２週間程度で
ある。
【０００８】そこで、このような解け出しによる効力の
減退を少なくする目的や安定性付与の目的で、アンモニ
アプラズマにより基材表面にアミノ基を導入した培養容
器もあるが、神経系細胞の初代培養においては、細胞の
初期接着性は、上記のポリリジン、ポリオルニチン、ポ
リエチレンイミンコートと同等であるが、長期培養にお
ける細胞の形態維持効果は不十分であり、むしろ劣る。
また、アンモニアプラズマによる処理を行う場合、プラ
ズマ処理装置のチャンバーを腐食させる問題がある。
減退を少なくする目的や安定性付与の目的で、アンモニ
アプラズマにより基材表面にアミノ基を導入した培養容
器もあるが、神経系細胞の初代培養においては、細胞の
初期接着性は、上記のポリリジン、ポリオルニチン、ポ
リエチレンイミンコートと同等であるが、長期培養にお
ける細胞の形態維持効果は不十分であり、むしろ劣る。
また、アンモニアプラズマによる処理を行う場合、プラ
ズマ処理装置のチャンバーを腐食させる問題がある。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、基材表面に
陽電荷を持たせ、かつそれが安定で滅菌が可能であり、
細胞の初代培養や神経系細胞の培養において、細胞の機
能及び形態を長期にわたり維持できる培養用器具を提供
することを目的とするものである。
陽電荷を持たせ、かつそれが安定で滅菌が可能であり、
細胞の初代培養や神経系細胞の培養において、細胞の機
能及び形態を長期にわたり維持できる培養用器具を提供
することを目的とするものである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】上記の目的を達成するた
めに鋭意研究を重ねた結果、本発明者らは、基材表面に
１級アミノシランを形成させると、神経突起の伸長が良
好であり、その効果は長期培養においても維持し、かつ
長期保存してもその効果が失われず、しかも、処理後滅
菌を施しても効果が変わらないことを見いだし、また、
ラット肝細胞の初代培養においては細胞塊を形成し、そ
の機能が長期にわたり接続することを見いだし、本発明
を完成するに至った。
めに鋭意研究を重ねた結果、本発明者らは、基材表面に
１級アミノシランを形成させると、神経突起の伸長が良
好であり、その効果は長期培養においても維持し、かつ
長期保存してもその効果が失われず、しかも、処理後滅
菌を施しても効果が変わらないことを見いだし、また、
ラット肝細胞の初代培養においては細胞塊を形成し、そ
の機能が長期にわたり接続することを見いだし、本発明
を完成するに至った。
【００１１】即ち本発明は、表面に水酸基を有するか、
もしくは予め物理化学的手段による酸化処理により水酸
基を導入したプラスチック成形品の表面に、一般式 ＮＨ2−Ｒ−Ｓｉ−ＸnＹ3-n （式中、Ｘ及びＹはアルコキシ基又はクロル基、アセト
キシ基、アセチルアミノ基、プロペノキシ基等の加水分
解性基、ｎは２又は３、Ｒは −[（ＣＨ2)x−ＮＨ]m−（ＣＨ2)y− または −ＣＯＮＨ−[（ＣＨ2)x−ＮＨ]m−（ＣＨ2)y ｘ，ｙはそれぞれ０または２０以下の整数、ｍは０また
は１０以下の整数である。）で表される１級アミノシラ
ンカップリング剤を反応させて、該成形品の表面に１級
アミノシランを形成させ、０．１〜２ｎｍｏｌ／ｃｍ2
の密度のアミノ基を導入し、陽電荷を付与したことを特
徴とする培養用器具、及びその製造方法である。
もしくは予め物理化学的手段による酸化処理により水酸
基を導入したプラスチック成形品の表面に、一般式 ＮＨ2−Ｒ−Ｓｉ−ＸnＹ3-n （式中、Ｘ及びＹはアルコキシ基又はクロル基、アセト
キシ基、アセチルアミノ基、プロペノキシ基等の加水分
解性基、ｎは２又は３、Ｒは −[（ＣＨ2)x−ＮＨ]m−（ＣＨ2)y− または −ＣＯＮＨ−[（ＣＨ2)x−ＮＨ]m−（ＣＨ2)y ｘ，ｙはそれぞれ０または２０以下の整数、ｍは０また
は１０以下の整数である。）で表される１級アミノシラ
ンカップリング剤を反応させて、該成形品の表面に１級
アミノシランを形成させ、０．１〜２ｎｍｏｌ／ｃｍ2
の密度のアミノ基を導入し、陽電荷を付与したことを特
徴とする培養用器具、及びその製造方法である。
【００１２】本発明において使用する基材の種類は特に
限定しないが、ハンドリング等を考慮した場合、プラス
チックであることが望ましい。また、細胞培養の過程で
顕微鏡により観察する必要があることから、透明である
ことが必要で、このような条件に適したプラスチック材
料としては、ポリスチレン樹脂、ポリカーボネート樹
脂、ポリエステル樹脂、ＴＰＸ樹脂等が挙げられる。
限定しないが、ハンドリング等を考慮した場合、プラス
チックであることが望ましい。また、細胞培養の過程で
顕微鏡により観察する必要があることから、透明である
ことが必要で、このような条件に適したプラスチック材
料としては、ポリスチレン樹脂、ポリカーボネート樹
脂、ポリエステル樹脂、ＴＰＸ樹脂等が挙げられる。
【００１３】また、ガラスやポリビニルアセテート共重
合体のケン化物のようにそれ自身が水酸基を有するもの
はそのまま使用できるが、表面に所要量の水酸基を持た
ないプラスチック成形品では、酸化処理等の方法により
水酸基を導入することが必要である。そのための物理化
学的酸化処理方法としては、紫外線照射、電子線照射、
γ線照射、コロナ放電、低周波又は高周波低温プラズマ
放電処理等があるが、この中でも簡便且つ形状に制限さ
れないで、酸化反応試薬の廃棄処理に問題がなく、且つ
水酸基の導入密度を調節しやすい低周波又は高周波低温
プラズマ放電処理が望ましい。
合体のケン化物のようにそれ自身が水酸基を有するもの
はそのまま使用できるが、表面に所要量の水酸基を持た
ないプラスチック成形品では、酸化処理等の方法により
水酸基を導入することが必要である。そのための物理化
学的酸化処理方法としては、紫外線照射、電子線照射、
γ線照射、コロナ放電、低周波又は高周波低温プラズマ
放電処理等があるが、この中でも簡便且つ形状に制限さ
れないで、酸化反応試薬の廃棄処理に問題がなく、且つ
水酸基の導入密度を調節しやすい低周波又は高周波低温
プラズマ放電処理が望ましい。
【００１４】本発明に用いる１級アミノシランカップリ
ング剤としては、一般式 ＮＨ2−Ｒ−Ｓｉ−ＸnＹ3-n （式中、Ｘ及びＹはアルコキシ基又はクロル基、アセト
キシ基、アセチルアミノ基、プロペノキシ基等の加水分
解性基、ｎは２又は３、Ｒは −[（ＣＨ2)x−ＮＨ]m−（ＣＨ2)y− または −ＣＯＮＨ−[（ＣＨ2)x−ＮＨ]m−（ＣＨ2)y ｘ，ｙはそれぞれ０または２０以下の整数、ｍは０また
は１０以下の整数である。）で表わされ、例えば、γ−
アミノプロピルトリメトキシシラン、Ｎ−β（アミノメ
チル）γ−アミノプロピルトリメトキシシラン、γ−
（ジエチレントリアミノ）プロピルトリメトキシシラ
ン、γ−ウレイドプロピルトリメトキシシラン等が好適
な例として挙げられるが、加水分解性基であるトリメト
キシシランの代わりにトリエトキシシラン、メチルジメ
トキシシラン、エチルジエトキシシランの他、トリクロ
ル基、トリアセトキシ基等の誘導体でも有効である。
ング剤としては、一般式 ＮＨ2−Ｒ−Ｓｉ−ＸnＹ3-n （式中、Ｘ及びＹはアルコキシ基又はクロル基、アセト
キシ基、アセチルアミノ基、プロペノキシ基等の加水分
解性基、ｎは２又は３、Ｒは −[（ＣＨ2)x−ＮＨ]m−（ＣＨ2)y− または −ＣＯＮＨ−[（ＣＨ2)x−ＮＨ]m−（ＣＨ2)y ｘ，ｙはそれぞれ０または２０以下の整数、ｍは０また
は１０以下の整数である。）で表わされ、例えば、γ−
アミノプロピルトリメトキシシラン、Ｎ−β（アミノメ
チル）γ−アミノプロピルトリメトキシシラン、γ−
（ジエチレントリアミノ）プロピルトリメトキシシラ
ン、γ−ウレイドプロピルトリメトキシシラン等が好適
な例として挙げられるが、加水分解性基であるトリメト
キシシランの代わりにトリエトキシシラン、メチルジメ
トキシシラン、エチルジエトキシシランの他、トリクロ
ル基、トリアセトキシ基等の誘導体でも有効である。
【００１５】基材表面の水酸基と１級アミノシランカッ
プリング剤との縮合反応により、基材表面に１級アミノ
シランを導入する方法としては、例えば上述のアミノシ
ランカップリング剤をメタノール、エタノール、アセト
ン、水等を単独又は混合溶媒中０．１％〜９８重量％の
割合に希釈し、５分〜７２時間、好ましくは水：メタノ
ールの割合が０〜８０：１００〜２０の溶媒に１〜５０
重量％の割合に希釈し、１〜４８時間浸漬又は注加して
反応させた後、蒸留水又は、緩衝液で水洗いすればよ
く、反応温度は、４℃〜６５℃、好ましくは２４℃〜６
０℃がよい。
プリング剤との縮合反応により、基材表面に１級アミノ
シランを導入する方法としては、例えば上述のアミノシ
ランカップリング剤をメタノール、エタノール、アセト
ン、水等を単独又は混合溶媒中０．１％〜９８重量％の
割合に希釈し、５分〜７２時間、好ましくは水：メタノ
ールの割合が０〜８０：１００〜２０の溶媒に１〜５０
重量％の割合に希釈し、１〜４８時間浸漬又は注加して
反応させた後、蒸留水又は、緩衝液で水洗いすればよ
く、反応温度は、４℃〜６５℃、好ましくは２４℃〜６
０℃がよい。
【００１６】上記条件によると基材表面には０．１〜２
ｎｍｏｌ／ｃｍ2 の密度でアミノ基が導入され、神経系
細胞の培養においてその形態は良好となる。アミノ基の
密度が０．１ｎｍｏｌ／ｃｍ2 より少ないと陽電荷の効
果が現れず、又、２ｎｍｏｌ／ｃｍ2 より多いと前述し
た側鎖の効果が現れなくなり好ましくない。
ｎｍｏｌ／ｃｍ2 の密度でアミノ基が導入され、神経系
細胞の培養においてその形態は良好となる。アミノ基の
密度が０．１ｎｍｏｌ／ｃｍ2 より少ないと陽電荷の効
果が現れず、又、２ｎｍｏｌ／ｃｍ2 より多いと前述し
た側鎖の効果が現れなくなり好ましくない。
【００１７】
【作用】本発明における培養用器具は、１級アミノシラ
ンシランカップリング剤により培養面に陽電荷を付与す
るのが特徴である。低温アンモニアプラズマ等で基材表
面に直接アミノ基を導入した場合に比べて、１級アミノ
シランのように基材より側鎖を介してその先端に結合さ
れたアミノ基を導入することにより、陽電荷を付与する
と、神経系細胞は良好な形態を長期にわたり維持するこ
とが出来、ラット肝細胞の初代培養においては良好な細
胞塊を形成する。
ンシランカップリング剤により培養面に陽電荷を付与す
るのが特徴である。低温アンモニアプラズマ等で基材表
面に直接アミノ基を導入した場合に比べて、１級アミノ
シランのように基材より側鎖を介してその先端に結合さ
れたアミノ基を導入することにより、陽電荷を付与する
と、神経系細胞は良好な形態を長期にわたり維持するこ
とが出来、ラット肝細胞の初代培養においては良好な細
胞塊を形成する。
【００１８】また、ポリリジン等は基材表面への吸着に
よるものであり、長期間の培養時には培地中に解け出し
て、その効果は徐々に減衰する。これに対して、１級ア
ミノシランカップリング剤を反応させた場合、１級アミ
ノシランは基材表面と共有結合しているので、長期培養
時でも解け出すことはなく、長期にわたって効果を維持
することができる。また、一旦共有結合したアミノシラ
ンは安定であり、室温で長期にわたり保存してもその効
果が失活することはない。
よるものであり、長期間の培養時には培地中に解け出し
て、その効果は徐々に減衰する。これに対して、１級ア
ミノシランカップリング剤を反応させた場合、１級アミ
ノシランは基材表面と共有結合しているので、長期培養
時でも解け出すことはなく、長期にわたって効果を維持
することができる。また、一旦共有結合したアミノシラ
ンは安定であり、室温で長期にわたり保存してもその効
果が失活することはない。
【００１９】１級アミノシランカップリング剤により、
基材表面にアミノ基を導入すること自体は新しいことで
はなく、例えば、免疫学的測定用担体の製造に適用した
例が知られている（特開昭６０−１５５６０号公報）。
しかしながら、ここではアミノ基は、グルタールアルデ
ヒドとの化学的反応によって、基材表面に抗原または抗
体を固定するための官能基として機能している。これに
対して本発明においては、アミノ基は官能基としてでは
なく、基材表面に陽電荷を付与するための媒体として機
能しており、免疫学的測定とは異なる新規な使い方に属
するものである。
基材表面にアミノ基を導入すること自体は新しいことで
はなく、例えば、免疫学的測定用担体の製造に適用した
例が知られている（特開昭６０−１５５６０号公報）。
しかしながら、ここではアミノ基は、グルタールアルデ
ヒドとの化学的反応によって、基材表面に抗原または抗
体を固定するための官能基として機能している。これに
対して本発明においては、アミノ基は官能基としてでは
なく、基材表面に陽電荷を付与するための媒体として機
能しており、免疫学的測定とは異なる新規な使い方に属
するものである。
【００２０】
【実施例】次に、本発明の実施例について説明する。 実施例１ 射出成形した直径３５ｍｍのポリスチレン製シャーレ
を、減圧下で酸素ガスを通気しながら高周波低温プラズ
マを発生させて３分間処理した後、γ−アミノプロピル
トリメトキシシラン１０％メタノール溶液に浸漬し、１
６時間放置してアミノシラン処理を行い、蒸留水で洗浄
し乾燥して、表面のアミノ基密度１．２ｎｍｏｌ／ｃｍ
2 の１級アミノシラン化シャーレを得た。これをγ線に
より滅菌を施して、培養試験に供した。（尚、アミノ基
密度はＸ線光電子スペクトルにより測定した）
を、減圧下で酸素ガスを通気しながら高周波低温プラズ
マを発生させて３分間処理した後、γ−アミノプロピル
トリメトキシシラン１０％メタノール溶液に浸漬し、１
６時間放置してアミノシラン処理を行い、蒸留水で洗浄
し乾燥して、表面のアミノ基密度１．２ｎｍｏｌ／ｃｍ
2 の１級アミノシラン化シャーレを得た。これをγ線に
より滅菌を施して、培養試験に供した。（尚、アミノ基
密度はＸ線光電子スペクトルにより測定した）
【００２１】実施例２ 実施例１で得られたアミノシラン処理シャーレを、室温
で１年間保存した後、培養試験に供した。
で１年間保存した後、培養試験に供した。
【００２２】比較例１ 酸素ガス通気下で低温プラズマ処理をした、実施例１と
同じポリスチレン製シャーレを、γ−アミノプロピルト
リメトキシシラン１％メタノール溶液に浸漬し、２時間
放置してアミノシラン処理を行い、蒸留水で洗浄し乾燥
して、表面のアミノ基密度０．０５ｎｍｏｌ／ｃｍ2 の
１級アミノシラン化シャーレを得、これをγ線により滅
菌を施して、培養試験に供した。
同じポリスチレン製シャーレを、γ−アミノプロピルト
リメトキシシラン１％メタノール溶液に浸漬し、２時間
放置してアミノシラン処理を行い、蒸留水で洗浄し乾燥
して、表面のアミノ基密度０．０５ｎｍｏｌ／ｃｍ2 の
１級アミノシラン化シャーレを得、これをγ線により滅
菌を施して、培養試験に供した。
【００２３】比較例２ 酸素ガス通気下で低温プラズマ処理をした、実施例１と
同じポリスチレン製シャーレを、γ−アミノプロピルト
リメトキシシラン２５％メタノール溶液に浸漬し、１６
時間放置してアミノシラン処理を行い、蒸留水で洗浄し
乾燥して、アミノ基密度２．５ｎｍｏｌ／ｃｍ2 の１級
アミノシラン化シャーレを得、γ線により滅菌を施し
て、培養試験に供した。
同じポリスチレン製シャーレを、γ−アミノプロピルト
リメトキシシラン２５％メタノール溶液に浸漬し、１６
時間放置してアミノシラン処理を行い、蒸留水で洗浄し
乾燥して、アミノ基密度２．５ｎｍｏｌ／ｃｍ2 の１級
アミノシラン化シャーレを得、γ線により滅菌を施し
て、培養試験に供した。
【００２４】比較例３ 射出成形した直径３５ｍｍのポリスチレン製シャーレ
を、減圧下でアンモニアガスを通気しながら高周波低温
プラズマを発生させて５分間処理し、基材表面にアミノ
基を導入して、培養試験に供した。
を、減圧下でアンモニアガスを通気しながら高周波低温
プラズマを発生させて５分間処理し、基材表面にアミノ
基を導入して、培養試験に供した。
【００２５】比較例４ 住友ベークライト（株）製の培養用シャーレ（ＭＳ−１
０３５０）に、無菌操作によりポリ−Ｌ−リジンの０．
０１％燐酸緩衝液溶液を２ｍｌ入れ、約２時間放置した
後、溶液を排出して無菌蒸留水により２回洗浄し、クリ
ーンベチ内で乾燥して得たポリ−Ｌ−リジンコートシャ
ーレを培養試験に供した。
０３５０）に、無菌操作によりポリ−Ｌ−リジンの０．
０１％燐酸緩衝液溶液を２ｍｌ入れ、約２時間放置した
後、溶液を排出して無菌蒸留水により２回洗浄し、クリ
ーンベチ内で乾燥して得たポリ−Ｌ−リジンコートシャ
ーレを培養試験に供した。
【００２６】比較例５ 比較例４で得られたポリ−Ｌ−リジンコートシャーレ
を、室温で１年間保存した後、培養試験に供した。 比較例６ 比較例４で使用した、住友ベークライト（株）製の培養
用シャーレ。
を、室温で１年間保存した後、培養試験に供した。 比較例６ 比較例４で使用した、住友ベークライト（株）製の培養
用シャーレ。
【００２７】上記の実施例及び比較例の試料シャーレを
用いて、下記の方法で、ラット胎児の脳神経細胞の初代
培養、神経系の株細胞であるＰＣ１２細胞の培養、及び
ラット肝細胞の初代培養を行い、その形態及び機能を調
べた。
用いて、下記の方法で、ラット胎児の脳神経細胞の初代
培養、神経系の株細胞であるＰＣ１２細胞の培養、及び
ラット肝細胞の初代培養を行い、その形態及び機能を調
べた。
【００２８】[1] ラット胎児の脳神経細胞の初代培養 ラット胎児（１６日確定妊娠）より大脳神経細胞を採取
し、牛胎児血清１０％添加ＢＥＭ培地中に分散し、３５
ｍｍシャーレ１枚当り２×１０6 個の細胞を播種し、細
胞の接着早さ、形態、神経突起の伸長形態、及び長期培
養での細胞の生存率を比較評価した。（培地交換は３日
毎に行い、培養開始３日目にシトシンアラビノシドを添
加した。）
し、牛胎児血清１０％添加ＢＥＭ培地中に分散し、３５
ｍｍシャーレ１枚当り２×１０6 個の細胞を播種し、細
胞の接着早さ、形態、神経突起の伸長形態、及び長期培
養での細胞の生存率を比較評価した。（培地交換は３日
毎に行い、培養開始３日目にシトシンアラビノシドを添
加した。）
【００２９】[2] ＰＣ１２細胞の培養 神経系の株化細胞であるＰＣ１２細胞を、牛胎児血清１
０％、馬血清５％添加したダルベッコ変法ＭＥＭ培地を
用いて、３５ｍｍシャーレ１枚当り２×１０4個播種
し、細胞の初期接着速度、細胞の培養形態、及び神経突
起の伸長状態を比較評価した。
０％、馬血清５％添加したダルベッコ変法ＭＥＭ培地を
用いて、３５ｍｍシャーレ１枚当り２×１０4個播種
し、細胞の初期接着速度、細胞の培養形態、及び神経突
起の伸長状態を比較評価した。
【００３０】[3] ラット肝細胞の初代培養 ４週令ウィスター系ラット雄よりコラゲナーゼ灌流法に
より肝実質細胞を採取し、牛胎児血清、インシュリン、
トランスフェリン、及びデキサメサゾンを添加したウィ
リアムス培地を用いて、３５ｍｍシャーレ当り５×１０
6 個細胞を播種し、３日毎に培地交換を行い細胞の形態
及びアルブミンの合成量を比較評価した。
より肝実質細胞を採取し、牛胎児血清、インシュリン、
トランスフェリン、及びデキサメサゾンを添加したウィ
リアムス培地を用いて、３５ｍｍシャーレ当り５×１０
6 個細胞を播種し、３日毎に培地交換を行い細胞の形態
及びアルブミンの合成量を比較評価した。
【００３１】評価結果は表１〜表３に示した通りで、１
級アミノシラン化により陽電荷を付与した本発明の培養
用器具は、初代培養、神経系細胞の培養において、細胞
形態、機能維持が良好であり、かつ長期保存してもその
効果が持続していることが明白である。
級アミノシラン化により陽電荷を付与した本発明の培養
用器具は、初代培養、神経系細胞の培養において、細胞
形態、機能維持が良好であり、かつ長期保存してもその
効果が持続していることが明白である。
【００３２】
【発明の効果】以上のように、本発明の基材表面を１級
アミノシラン化することにより陽電荷を付与した培養用
器具は、細胞の初代培養や神経系の細胞の培養におい
て、細胞の機能を長期維持し、又、長期保存においても
安定でありその効果が失われることがなく、細胞の初代
培養用、特に神経系細胞の培養や肝細胞のような機能性
の細胞の培養に好適である。
アミノシラン化することにより陽電荷を付与した培養用
器具は、細胞の初代培養や神経系の細胞の培養におい
て、細胞の機能を長期維持し、又、長期保存においても
安定でありその効果が失われることがなく、細胞の初代
培養用、特に神経系細胞の培養や肝細胞のような機能性
の細胞の培養に好適である。
【００３３】
【表１】
【００３４】
【表２】
【００３５】
【表３】
Claims (2)
- 【請求項１】 水酸基を有する基材表面に１級アミノシ
ランを形成させて、０．１〜２ｎｍｏｌ／ｃｍ2 の密度
のアミノ基を導入し、陽電荷を付与したことを特徴とす
る培養用器具。 - 【請求項２】 表面に水酸基を有するか、もしくは、予
め物理化学的手段による酸化処理で水酸基を導入したプ
ラスチック成形品の表面に、一般式 ＮＨ2−Ｒ−Ｓｉ−ＸnＹ3-n （式中、Ｘ及びＹはアルコキシ基又はクロル基、アセト
キシ基、アセチルアミノ基、プロペノキシ基等の加水分
解性基、ｎは２又は３、Ｒは −[（ＣＨ2)x−ＮＨ]m−（ＣＨ2)y− または −ＣＯＮＨ−[（ＣＨ2)x−ＮＨ]m−（ＣＨ2)y ｘ，ｙはそれぞれ０または２０以下の整数、ｍは０また
は１０以下の整数である。）で表される１級アミノシラ
ンカップリング剤を反応させて、該成形品の表面に１級
アミノシランを形成させることにより、基材表面に陽電
荷を付与することを特徴とする培養用器具の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24352292A JP2755880B2 (ja) | 1992-09-11 | 1992-09-11 | 培養用器具及びその製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24352292A JP2755880B2 (ja) | 1992-09-11 | 1992-09-11 | 培養用器具及びその製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0690738A true JPH0690738A (ja) | 1994-04-05 |
| JP2755880B2 JP2755880B2 (ja) | 1998-05-25 |
Family
ID=17105163
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP24352292A Expired - Fee Related JP2755880B2 (ja) | 1992-09-11 | 1992-09-11 | 培養用器具及びその製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2755880B2 (ja) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002024604A1 (en) * | 2000-09-18 | 2002-03-28 | President And Fellows Of Harvard College | Fabrication of ceramic microstructures |
| US7312025B2 (en) | 2002-07-12 | 2007-12-25 | University Of Washington | Methods and systems for extended in vitro culture of neuronal cells |
| WO2012081470A1 (ja) * | 2010-12-13 | 2012-06-21 | 株式会社資生堂 | 細胞凝集塊の形成方法 |
| JP5025043B2 (ja) * | 1999-03-24 | 2012-09-12 | ユィロス・パテント・アクチボラグ | 表面およびその製造および使用 |
| JP2017019907A (ja) * | 2015-07-08 | 2017-01-26 | フジデノロ株式会社 | 表面改質樹脂成形品 |
| EP1482010B1 (en) * | 2002-03-05 | 2021-01-13 | Nippon Paper Industries Co., Ltd. | Aqueous dispersion, process for producing the same, and use |
-
1992
- 1992-09-11 JP JP24352292A patent/JP2755880B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP5025043B2 (ja) * | 1999-03-24 | 2012-09-12 | ユィロス・パテント・アクチボラグ | 表面およびその製造および使用 |
| WO2002024604A1 (en) * | 2000-09-18 | 2002-03-28 | President And Fellows Of Harvard College | Fabrication of ceramic microstructures |
| US7198747B2 (en) | 2000-09-18 | 2007-04-03 | President And Fellows Of Harvard College | Fabrication of ceramic microstructures |
| EP1482010B1 (en) * | 2002-03-05 | 2021-01-13 | Nippon Paper Industries Co., Ltd. | Aqueous dispersion, process for producing the same, and use |
| US7312025B2 (en) | 2002-07-12 | 2007-12-25 | University Of Washington | Methods and systems for extended in vitro culture of neuronal cells |
| WO2012081470A1 (ja) * | 2010-12-13 | 2012-06-21 | 株式会社資生堂 | 細胞凝集塊の形成方法 |
| JP2012187097A (ja) * | 2010-12-13 | 2012-10-04 | Shiseido Co Ltd | 細胞凝集塊の形成方法 |
| JP2017019907A (ja) * | 2015-07-08 | 2017-01-26 | フジデノロ株式会社 | 表面改質樹脂成形品 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2755880B2 (ja) | 1998-05-25 |
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Legal Events
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