JP3311074B2 - 細胞培養基材 - Google Patents
細胞培養基材Info
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- JP3311074B2 JP3311074B2 JP09729093A JP9729093A JP3311074B2 JP 3311074 B2 JP3311074 B2 JP 3311074B2 JP 09729093 A JP09729093 A JP 09729093A JP 9729093 A JP9729093 A JP 9729093A JP 3311074 B2 JP3311074 B2 JP 3311074B2
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- cells
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- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、少なくとも表面が、カ
チオン性高分子電解質であるキトサンとアニオン性高分
子電解質であるセルロース誘導体とからなる高分子電解
質錯体により形成されている細胞培養基材に関する。
チオン性高分子電解質であるキトサンとアニオン性高分
子電解質であるセルロース誘導体とからなる高分子電解
質錯体により形成されている細胞培養基材に関する。
【０００２】
【従来の技術】近年、動物細胞を培養し、その細胞から
ワクチンやインターフェロン等の生理活性物質を生産す
る研究や、人工臓器等のバイオテクノロジー分野の急速
な発展に伴い、生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）の細胞が有す
る機能を生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で培養した細胞に
発現させるための研究等、細胞培養に関する研究は盛ん
に行われている。従来の細胞培養法には多くの種類があ
るが、ガラスや合成高分子樹脂からなる担体、例えばシ
ャーレ等の表面に細胞を付着させ、増殖と共に単層を形
成させる単層培養法が主体である。
ワクチンやインターフェロン等の生理活性物質を生産す
る研究や、人工臓器等のバイオテクノロジー分野の急速
な発展に伴い、生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）の細胞が有す
る機能を生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で培養した細胞に
発現させるための研究等、細胞培養に関する研究は盛ん
に行われている。従来の細胞培養法には多くの種類があ
るが、ガラスや合成高分子樹脂からなる担体、例えばシ
ャーレ等の表面に細胞を付着させ、増殖と共に単層を形
成させる単層培養法が主体である。
【０００３】接着性動物細胞を増殖させるためには、基
材表面と細胞の接着性が良好であることと共に、接着し
た細胞の形態、配列が、細胞の伸展、増殖に有効な形態
となっていることが必要である。そこで、基材自体の表
面を親水化することで種々改良が試みられてきた（特開
昭５２−４１２９１号公報、特開昭５７−２２６９１号
公報）。しかし、これらの基材を用いても本来生体内で
有していた細胞機能を維持することは不十分であり、細
胞は生存・増殖はするものの急速に脱分化して機能を失
う場合がほとんどである。このような機能の消失を防ぐ
ために、組織を生体外で再構築することにより、細胞機
能の発現を試みようとする機能培養が模索されている。
即ち、ｉｎ ｖｉｔｒｏの培養用基材として細胞外マト
リックスを用い、細胞に組織構築を行わせようとするも
のである。例えば浮遊コラーゲンゲルを基材として用い
る肝実質細胞の培養〔Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．，９
４，７０（１９７５）〕や、コラーゲン合成のコファク
ターであるＬ−アスコルビン酸２−リン酸を培養系に添
加し、細胞のコラーゲン合成を活発化させ、三次元的に
培養する〔生化，６０，２０１（１９８８）〕ことも検
討されている。
材表面と細胞の接着性が良好であることと共に、接着し
た細胞の形態、配列が、細胞の伸展、増殖に有効な形態
となっていることが必要である。そこで、基材自体の表
面を親水化することで種々改良が試みられてきた（特開
昭５２−４１２９１号公報、特開昭５７−２２６９１号
公報）。しかし、これらの基材を用いても本来生体内で
有していた細胞機能を維持することは不十分であり、細
胞は生存・増殖はするものの急速に脱分化して機能を失
う場合がほとんどである。このような機能の消失を防ぐ
ために、組織を生体外で再構築することにより、細胞機
能の発現を試みようとする機能培養が模索されている。
即ち、ｉｎ ｖｉｔｒｏの培養用基材として細胞外マト
リックスを用い、細胞に組織構築を行わせようとするも
のである。例えば浮遊コラーゲンゲルを基材として用い
る肝実質細胞の培養〔Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．，９
４，７０（１９７５）〕や、コラーゲン合成のコファク
ターであるＬ−アスコルビン酸２−リン酸を培養系に添
加し、細胞のコラーゲン合成を活発化させ、三次元的に
培養する〔生化，６０，２０１（１９８８）〕ことも検
討されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】しかし、コラーゲン自
体が生体成分であるために高価であり、また製品の均一
性欠如、劣化、ゲル製造の煩雑さ等に多くの問題点を有
している。従って、本発明の目的は、完全な人工合成材
料からなり、機能培養に適した基材を提供することにあ
る。
体が生体成分であるために高価であり、また製品の均一
性欠如、劣化、ゲル製造の煩雑さ等に多くの問題点を有
している。従って、本発明の目的は、完全な人工合成材
料からなり、機能培養に適した基材を提供することにあ
る。
【０００５】
【課題を解決するための手段】前記の目的は、本発明に
より少なくとも表面が、カチオン性高分子電解質として
のキトサンとアニオン性高分子電解質としてのセルロー
ス誘導体とからなる高分子電解質錯体により形成されて
いることを特徴とする、細胞培養基材によって達成する
ことができる。
より少なくとも表面が、カチオン性高分子電解質として
のキトサンとアニオン性高分子電解質としてのセルロー
ス誘導体とからなる高分子電解質錯体により形成されて
いることを特徴とする、細胞培養基材によって達成する
ことができる。
【０００６】以下、発明を詳細に説明する。本発明に用
いられる高分子電解質錯体（ｐｏｌｙｅｌｅｃｔｒｏｌ
ｙｔｅ ｃｏｍｐｌｅｘ：以下、ＰＥＣともいう）は、
それ自体公知の物質である。ＰＥＣは正荷電を有する高
分子電解質であるカチオンポリマーの溶液と負荷電を有
する高分子電解質であるアニオンポリマーの溶液とを混
合することにより瞬時に形成することができる。こうし
て得られたＰＥＣは、特殊な３元系溶媒（例えば、特定
の組成からなる、水／アセトン／低分子塩）には溶解す
るが、一般的な溶媒には不溶性である。ＰＥＣは、出発
ポリマー（高分子電解質）の種類、それらの混合比、調
製条件などにより、多様な性質を有する各種の高分子電
解質錯体を提供することができる。
いられる高分子電解質錯体（ｐｏｌｙｅｌｅｃｔｒｏｌ
ｙｔｅ ｃｏｍｐｌｅｘ：以下、ＰＥＣともいう）は、
それ自体公知の物質である。ＰＥＣは正荷電を有する高
分子電解質であるカチオンポリマーの溶液と負荷電を有
する高分子電解質であるアニオンポリマーの溶液とを混
合することにより瞬時に形成することができる。こうし
て得られたＰＥＣは、特殊な３元系溶媒（例えば、特定
の組成からなる、水／アセトン／低分子塩）には溶解す
るが、一般的な溶媒には不溶性である。ＰＥＣは、出発
ポリマー（高分子電解質）の種類、それらの混合比、調
製条件などにより、多様な性質を有する各種の高分子電
解質錯体を提供することができる。
【０００７】本発明では、カチオンポリマーとして下記
構造式（１）のキトサンを用いる。周知のとおり、キト
サンは、キチン（β−ポリ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコ
サミン）を脱アセチル化して得られる生成物で、β−ポ
リ−Ｄ−グルコサミンである。式（１）中、Ｒ1 は水素
原子又はアセチル基であり、Ｘ - は対イオンであり、脱
アセチル化度は５０〜１００％（好ましくは７０〜１０
０％）、ｑ1 は１０〜３０００（好ましくは１０〜２０
００）である。
構造式（１）のキトサンを用いる。周知のとおり、キト
サンは、キチン（β−ポリ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコ
サミン）を脱アセチル化して得られる生成物で、β−ポ
リ−Ｄ−グルコサミンである。式（１）中、Ｒ1 は水素
原子又はアセチル基であり、Ｘ - は対イオンであり、脱
アセチル化度は５０〜１００％（好ましくは７０〜１０
０％）、ｑ1 は１０〜３０００（好ましくは１０〜２０
００）である。
【０００８】
【化１】
【０００９】本発明では、アニオンポリマーとして下記
構造式（２）のセルロース誘導体を用いる。式（２）
中、Ｒ2 は水素原子、カルボキシメチル基、硫酸基又は
リン酸基であり、ｑ2 は１０〜１５０００（好ましくは
２０〜５０００）である。
構造式（２）のセルロース誘導体を用いる。式（２）
中、Ｒ2 は水素原子、カルボキシメチル基、硫酸基又は
リン酸基であり、ｑ2 は１０〜１５０００（好ましくは
２０〜５０００）である。
【００１０】
【化２】
【００１１】上記のカチオンポリマーとしてのキトサン
とアニオンポリマーとしてのセルロース誘導体とを通常
の方法で反応させると、前記式（１）中の−Ｎ+ Ｈ2 Ｒ
1 のＮ+ 原子と、前記式（２）中のＣＯＯＨ基、ＳＯ3
Ｈ基及び／又はＰＯ3 Ｈ基の少なくとも一部とが反応し
て、容易にＰＥＣを調製することができる。即ち、前記
のキトサン及びセルロース誘導体の各水溶液（１０-5モ
ル／リットル〜１０-2モル／リットル）を、カチオンポ
リマーのカチオン席とアニオンポリマーのアニオン席と
の濃度比（カチオン席／アニオン席）が０．２５〜４．
０の範囲内、好ましくは０．４〜２．５の範囲内で、水
溶液中で混合して反応させれば良い。カチオン席とアニ
オン席の濃度比が０．２５〜４．０の範囲外になると、
ＰＥＣが形成され難くなるので好ましくない。各ポリマ
ーを溶解する溶媒としては、精製水や各種緩衝液（例え
ばリン酸緩衝液等）、あるいはそれらと水混和性有機溶
媒（例えばメタノール、エタノール、アセトン等）との
混合液を用いることができる。この反応は比較的活性が
高いので、溶液のｐＨ、イオン強度、温度などは比較的
広い範囲であることができるが、一般的にはｐＨ３〜
９、イオン強度０〜１．０及び２０〜６０℃で実施す
る。こうして得られる高分子電解質錯体を直接細胞培養
基材として形成するか、あるいは従来の適当な材料に被
覆することによって、細胞培養基材として用いることが
できる。
とアニオンポリマーとしてのセルロース誘導体とを通常
の方法で反応させると、前記式（１）中の−Ｎ+ Ｈ2 Ｒ
1 のＮ+ 原子と、前記式（２）中のＣＯＯＨ基、ＳＯ3
Ｈ基及び／又はＰＯ3 Ｈ基の少なくとも一部とが反応し
て、容易にＰＥＣを調製することができる。即ち、前記
のキトサン及びセルロース誘導体の各水溶液（１０-5モ
ル／リットル〜１０-2モル／リットル）を、カチオンポ
リマーのカチオン席とアニオンポリマーのアニオン席と
の濃度比（カチオン席／アニオン席）が０．２５〜４．
０の範囲内、好ましくは０．４〜２．５の範囲内で、水
溶液中で混合して反応させれば良い。カチオン席とアニ
オン席の濃度比が０．２５〜４．０の範囲外になると、
ＰＥＣが形成され難くなるので好ましくない。各ポリマ
ーを溶解する溶媒としては、精製水や各種緩衝液（例え
ばリン酸緩衝液等）、あるいはそれらと水混和性有機溶
媒（例えばメタノール、エタノール、アセトン等）との
混合液を用いることができる。この反応は比較的活性が
高いので、溶液のｐＨ、イオン強度、温度などは比較的
広い範囲であることができるが、一般的にはｐＨ３〜
９、イオン強度０〜１．０及び２０〜６０℃で実施す
る。こうして得られる高分子電解質錯体を直接細胞培養
基材として形成するか、あるいは従来の適当な材料に被
覆することによって、細胞培養基材として用いることが
できる。
【００１２】本発明においては、キトサンとセルロース
誘導体との組合せや配合比を変化させることにより、生
成するＰＥＣの荷電バランスを容易に変更し、調整する
ことができる。即ち、種々の荷電バランスを有するＰＥ
Ｃを用いることで、細胞培養基材の表面電荷を調整し、
その使用条件に従って表面特性を適宜選択することが可
能となる。本発明で用いるＰＥＣの荷電バランスは、−
６〜＋６の範囲で選択し得る。ここで、荷電バランスと
は、ＰＥＣの荷電状態を、その出発原料であるカチオン
ポリマー及びアニオンポリマーの、各々のカチオン席及
びアニオン席の濃度比で表現するものである。例えば、
使用するカチオンポリマーのカチオン席及びアニオンポ
リマーのアニオン席の濃度比が等しい場合は、生成する
ＰＥＣの荷電バランスは±０となる。濃度比がこれより
大きければ（即ち、カチオン席の濃度の方が高ければ）
荷電バランスはプラスとなり、小さければ（即ち、アニ
オン席の方が高ければ）マイナスとなる。また、濃度比
が１．５の場合は荷電バランスは＋２となり、濃度比が
０．５の場合は荷電バランスは−３．３となる。荷電バ
ランスの調整は、等濃度のカチオンポリマー溶液及びア
ニオンポリマー溶液の混合量を変化させることによって
容易に行うことができる。
誘導体との組合せや配合比を変化させることにより、生
成するＰＥＣの荷電バランスを容易に変更し、調整する
ことができる。即ち、種々の荷電バランスを有するＰＥ
Ｃを用いることで、細胞培養基材の表面電荷を調整し、
その使用条件に従って表面特性を適宜選択することが可
能となる。本発明で用いるＰＥＣの荷電バランスは、−
６〜＋６の範囲で選択し得る。ここで、荷電バランスと
は、ＰＥＣの荷電状態を、その出発原料であるカチオン
ポリマー及びアニオンポリマーの、各々のカチオン席及
びアニオン席の濃度比で表現するものである。例えば、
使用するカチオンポリマーのカチオン席及びアニオンポ
リマーのアニオン席の濃度比が等しい場合は、生成する
ＰＥＣの荷電バランスは±０となる。濃度比がこれより
大きければ（即ち、カチオン席の濃度の方が高ければ）
荷電バランスはプラスとなり、小さければ（即ち、アニ
オン席の方が高ければ）マイナスとなる。また、濃度比
が１．５の場合は荷電バランスは＋２となり、濃度比が
０．５の場合は荷電バランスは−３．３となる。荷電バ
ランスの調整は、等濃度のカチオンポリマー溶液及びア
ニオンポリマー溶液の混合量を変化させることによって
容易に行うことができる。
【００１３】ＰＥＣの調製時における溶液のｐＨ、塩濃
度、水混和性有機溶媒の含有量を変化させることによ
り、生成ＰＥＣの物性（例えば、硬度や弾性）を自由に
調整することが可能で、粒子状、板状又はフィルム状等
への成型も容易に行えるので、ＰＥＣそれ自体から本発
明の細胞培養基材を形成することができる。また、ＰＥ
Ｃは種々の材料に簡便且つ容易に被覆できるので、適当
な担体や従来の基材に、ＰＥＣを被覆して本発明の細胞
培養基材を形成することもできる。更に、ＰＥＣそれ自
体からなる部分と、適当な担体や従来の基材にＰＥＣを
被覆した部分とから形成してもよい。
度、水混和性有機溶媒の含有量を変化させることによ
り、生成ＰＥＣの物性（例えば、硬度や弾性）を自由に
調整することが可能で、粒子状、板状又はフィルム状等
への成型も容易に行えるので、ＰＥＣそれ自体から本発
明の細胞培養基材を形成することができる。また、ＰＥ
Ｃは種々の材料に簡便且つ容易に被覆できるので、適当
な担体や従来の基材に、ＰＥＣを被覆して本発明の細胞
培養基材を形成することもできる。更に、ＰＥＣそれ自
体からなる部分と、適当な担体や従来の基材にＰＥＣを
被覆した部分とから形成してもよい。
【００１４】ＰＥＣを被覆することのできる担体又は従
来の細胞培養基材としては、既に適当な材質（ガラス、
セルロース、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリアク
リル酸、ポリスチレン、ポリエステル、ポリイソプレ
ン、ポリプロピレン、ポリアミド等の合成高分子樹脂、
綿、紙等の天然高分子、キュプロファン、レーヨン等の
再生樹脂、金属、セラミックス等）で加工されたシャー
レ、プレート、培養容器、培養バッグ、フィルム、繊
維、マイクロキャリア、ビーズ等が挙げられる。従来の
細胞培養基材は、既に形状やサイズ、多孔質の孔径等が
管理されているので、単にＰＥＣをコートするだけで、
種々の規格が管理された本発明による細胞培養基材を簡
便に製造することができる。
来の細胞培養基材としては、既に適当な材質（ガラス、
セルロース、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリアク
リル酸、ポリスチレン、ポリエステル、ポリイソプレ
ン、ポリプロピレン、ポリアミド等の合成高分子樹脂、
綿、紙等の天然高分子、キュプロファン、レーヨン等の
再生樹脂、金属、セラミックス等）で加工されたシャー
レ、プレート、培養容器、培養バッグ、フィルム、繊
維、マイクロキャリア、ビーズ等が挙げられる。従来の
細胞培養基材は、既に形状やサイズ、多孔質の孔径等が
管理されているので、単にＰＥＣをコートするだけで、
種々の規格が管理された本発明による細胞培養基材を簡
便に製造することができる。
【００１５】ＰＥＣを担体又は従来の基材に被覆させる
には、例えば、塗布、噴霧又は浸漬などの方法で行うこ
とができる。ＰＥＣ溶液を担体に単に接触させるだけで
も良い。例えば、キトサン溶液とセルロース誘導体溶液
とを混合し、その溶液と担体又は従来の基材とを０．５
〜４８時間程度接触させておき、そうして処理した担体
又は従来の基材を生理食塩水や精製水で洗浄した後、室
温で風乾あるいは５０〜１００℃程度に加温して乾燥す
る。このとき、例えばＮａＣｌ等の塩を０．０１〜５
Ｍ、温度を０〜１００℃の雰囲気範囲でＰＥＣを生成さ
せ、担体又は従来の基材と接触又は浸漬させることによ
り、ＰＥＣの被覆処理時間を短縮（例えば温度を高める
ことによる）し、温和な条件下でＰＥＣを被覆すること
もできる。
には、例えば、塗布、噴霧又は浸漬などの方法で行うこ
とができる。ＰＥＣ溶液を担体に単に接触させるだけで
も良い。例えば、キトサン溶液とセルロース誘導体溶液
とを混合し、その溶液と担体又は従来の基材とを０．５
〜４８時間程度接触させておき、そうして処理した担体
又は従来の基材を生理食塩水や精製水で洗浄した後、室
温で風乾あるいは５０〜１００℃程度に加温して乾燥す
る。このとき、例えばＮａＣｌ等の塩を０．０１〜５
Ｍ、温度を０〜１００℃の雰囲気範囲でＰＥＣを生成さ
せ、担体又は従来の基材と接触又は浸漬させることによ
り、ＰＥＣの被覆処理時間を短縮（例えば温度を高める
ことによる）し、温和な条件下でＰＥＣを被覆すること
もできる。
【００１６】こうして調製したキトサン−セルロース高
分子電解質錯体からなる本発明の細胞培養基材を用いて
培養することのできる細胞は、従来の細胞培養基材で培
養されているものと特に異なるものではなく、上皮細胞
や繊維芽細胞等の所謂接着性動物細胞全般である。ま
た、本発明の細胞培養基材を用いる培養方法も従来の培
養方法と特に異なるものではなく、培養規模や培養の目
的等に応じて、従来公知の培養法を適用することができ
る。
分子電解質錯体からなる本発明の細胞培養基材を用いて
培養することのできる細胞は、従来の細胞培養基材で培
養されているものと特に異なるものではなく、上皮細胞
や繊維芽細胞等の所謂接着性動物細胞全般である。ま
た、本発明の細胞培養基材を用いる培養方法も従来の培
養方法と特に異なるものではなく、培養規模や培養の目
的等に応じて、従来公知の培養法を適用することができ
る。
【００１７】
【作用】本発明と同様のＰＥＣを利用した細胞培養基材
が、特開昭６３−７９５８７号公報に開示されている。
しかし、この公報記載のＰＥＣは４級化ポリエチレンイ
ミンをカチオンポリマーとして用いるのに対し、本発明
による細胞培養基材のＰＥＣは、かさ高い環構造を主鎖
に含む多糖類をカチオンポリマーとして用いる。従っ
て、本発明のＰＥＣは、前記公報記載のＰＥＣと比較し
て、内部回転の拘束性がはるかに高く、解離基の立体的
配置の自由度が少ないため、規則的な梯子状（ｌａｄｄ
ｅｒ）構造を呈するＰＥＣを形成しやすく、構成成分や
全体構造がかなり異なるので、培養基材としての物性も
異なるものとなる。すなわち、細胞と基材の接着は、血
清に含まれる接着因子による作用以外にも、静電的な結
合力を介して相互作用する。このため、基材表面の親水
性・疎水性、表面エネルギー、ミクロドメイン構造など
が深く関与していることが考えられる。
が、特開昭６３−７９５８７号公報に開示されている。
しかし、この公報記載のＰＥＣは４級化ポリエチレンイ
ミンをカチオンポリマーとして用いるのに対し、本発明
による細胞培養基材のＰＥＣは、かさ高い環構造を主鎖
に含む多糖類をカチオンポリマーとして用いる。従っ
て、本発明のＰＥＣは、前記公報記載のＰＥＣと比較し
て、内部回転の拘束性がはるかに高く、解離基の立体的
配置の自由度が少ないため、規則的な梯子状（ｌａｄｄ
ｅｒ）構造を呈するＰＥＣを形成しやすく、構成成分や
全体構造がかなり異なるので、培養基材としての物性も
異なるものとなる。すなわち、細胞と基材の接着は、血
清に含まれる接着因子による作用以外にも、静電的な結
合力を介して相互作用する。このため、基材表面の親水
性・疎水性、表面エネルギー、ミクロドメイン構造など
が深く関与していることが考えられる。
【００１８】多糖類のＰＥＣの場合には、前記公報など
に記載のその他のＰＥＣが有する特性以外の特性を有す
ることが容易に考えられる。例えば、解離基の種類、密
度や位置により、ＰＥＣ全体としては理論的に中性であ
っても、イオン結合に関与しないフリーの解離基が生
じ、細胞の接着性や増殖性に何らかの影響を与えたり、
ＰＥＣ自体が細胞の増殖に因子的機能を有する可能性
等、従来には予測し得なかった機能を発現させているも
のと考えられる。更に、ＰＥＣはハイドロゲルとしても
機能しているので、物理的な表面の運動性、排除体積効
果なども関与していることが考えられる。このような幾
つかの要因があいまって従来に無い、極めて好適な細胞
培養基材としての機能を発現しているものと思われる。
に記載のその他のＰＥＣが有する特性以外の特性を有す
ることが容易に考えられる。例えば、解離基の種類、密
度や位置により、ＰＥＣ全体としては理論的に中性であ
っても、イオン結合に関与しないフリーの解離基が生
じ、細胞の接着性や増殖性に何らかの影響を与えたり、
ＰＥＣ自体が細胞の増殖に因子的機能を有する可能性
等、従来には予測し得なかった機能を発現させているも
のと考えられる。更に、ＰＥＣはハイドロゲルとしても
機能しているので、物理的な表面の運動性、排除体積効
果なども関与していることが考えられる。このような幾
つかの要因があいまって従来に無い、極めて好適な細胞
培養基材としての機能を発現しているものと思われる。
【００１９】
【実施例】以下、実施例により本発明を更に具体的に説
明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではな
い。なお、以下の実施例に記載の平均分子量は蒸気圧降
下法で測定した数平均分子量である。以下の実施例にお
いて使用したポリマー及びその略称を以下に示す。（１）カチオンポリマー（キトサン） ＣＳ：キトサン（脱アセチル化度１００％；平均分子量
約5000）（２）アニオンポリマー（セルロース誘導体） ＣＣＥＬ：カルボキシメチルセルロ−ス（１ピラノ−ス
酸基当たりの官能基導入率０．９；平均分子量約18000
0） ＰＣＥＬ：リン酸化セルロ−ス（１ピラノ−ス酸基当た
りの官能基導入率０．５；平均分子量約160000） ＳＣＥＬ：硫酸化セルロ−ス（１ピラノ−ス酸基当たり
の官能基導入率０．８；平均分子量約120000）
明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではな
い。なお、以下の実施例に記載の平均分子量は蒸気圧降
下法で測定した数平均分子量である。以下の実施例にお
いて使用したポリマー及びその略称を以下に示す。（１）カチオンポリマー（キトサン） ＣＳ：キトサン（脱アセチル化度１００％；平均分子量
約5000）（２）アニオンポリマー（セルロース誘導体） ＣＣＥＬ：カルボキシメチルセルロ−ス（１ピラノ−ス
酸基当たりの官能基導入率０．９；平均分子量約18000
0） ＰＣＥＬ：リン酸化セルロ−ス（１ピラノ−ス酸基当た
りの官能基導入率０．５；平均分子量約160000） ＳＣＥＬ：硫酸化セルロ−ス（１ピラノ−ス酸基当たり
の官能基導入率０．８；平均分子量約120000）
【００２０】実施例１：ＰＥＣコーティングディッシュ
の調製 カチオンポリマーであるＣＳを1.62mg／mlの濃度（イオ
ン席として１０-2Ｍ；以下１０-2ＵＭともいう）となる
ように１％酢酸溶液（pH６．０）を用いて調製し、ＣＳ
溶液とした。アニオンポリマーであるＣＣＥＬを2.14mg
／mlの濃度（１０-2ＵＭ）となるよう蒸留水（pH７．
０）を用いて調製し、ＣＣＥＬ溶液とした。これらの溶
液を等量ずつ混合しＰＥＣを形成させ、直ちにこのＰＥ
Ｃ溶液１mlを細胞培養用ディッシュ（NUNCLON DELTA)に
注入し、室温で一晩静置した後、上清を除去し、次いで
６５℃で一晩乾燥した。乾燥後、蒸留水１mlを注入して
ディッシュを洗浄し、再度６５℃で乾燥させて、ＰＥＣ
コーティングディッシュを得た。上記のＣＣＥＬに換え
てＰＣＥＬ及びＳＣＥＬを用いて同様の操作を行い、Ｃ
Ｓ−ＰＣＥＬ及びＣＳ−ＳＣＥＬコーティングディッシ
ュをそれぞれ調製した。対照としてＰＥＣ未コートのデ
ィッシュを用い、以下の試験を行った。
の調製 カチオンポリマーであるＣＳを1.62mg／mlの濃度（イオ
ン席として１０-2Ｍ；以下１０-2ＵＭともいう）となる
ように１％酢酸溶液（pH６．０）を用いて調製し、ＣＳ
溶液とした。アニオンポリマーであるＣＣＥＬを2.14mg
／mlの濃度（１０-2ＵＭ）となるよう蒸留水（pH７．
０）を用いて調製し、ＣＣＥＬ溶液とした。これらの溶
液を等量ずつ混合しＰＥＣを形成させ、直ちにこのＰＥ
Ｃ溶液１mlを細胞培養用ディッシュ（NUNCLON DELTA)に
注入し、室温で一晩静置した後、上清を除去し、次いで
６５℃で一晩乾燥した。乾燥後、蒸留水１mlを注入して
ディッシュを洗浄し、再度６５℃で乾燥させて、ＰＥＣ
コーティングディッシュを得た。上記のＣＣＥＬに換え
てＰＣＥＬ及びＳＣＥＬを用いて同様の操作を行い、Ｃ
Ｓ−ＰＣＥＬ及びＣＳ−ＳＣＥＬコーティングディッシ
ュをそれぞれ調製した。対照としてＰＥＣ未コートのデ
ィッシュを用い、以下の試験を行った。
【００２１】実施例２：細胞接着性の評価 細胞として歯周靱体由来の歯根膜細胞（以下、ＨＰＬＦ
という）を用い、培養液はDulbecco's Modified Eagle'
s Medium （以下、ＤＭＥＭという）に牛胎児血清（以
下、ＦＢＳという）１０％を加えた培養液を用いた。こ
の培養液を用いてＨＰＬＦ細胞懸濁液（８×１０4 cell
s/ml）を調製した。この懸濁液１．５ｍｌずつを実施例
１で調製した各ディッシュに注入し（１２×１０4 cell
s/dish）、５％ＣＯ2 及び３７℃で２４時間培養した。
その後上澄み液を回収し、更に20mMリン酸緩衝液（pH
７．４）１ｍｌでディッシュをリンスすることにより、
非接着細胞を完全に回収した。この非接着細胞を血球計
算盤（ビルケルチュルク型）を用いて位相差顕微鏡下で
計数し、接着率を求めた。結果を表１に示す。
という）を用い、培養液はDulbecco's Modified Eagle'
s Medium （以下、ＤＭＥＭという）に牛胎児血清（以
下、ＦＢＳという）１０％を加えた培養液を用いた。こ
の培養液を用いてＨＰＬＦ細胞懸濁液（８×１０4 cell
s/ml）を調製した。この懸濁液１．５ｍｌずつを実施例
１で調製した各ディッシュに注入し（１２×１０4 cell
s/dish）、５％ＣＯ2 及び３７℃で２４時間培養した。
その後上澄み液を回収し、更に20mMリン酸緩衝液（pH
７．４）１ｍｌでディッシュをリンスすることにより、
非接着細胞を完全に回収した。この非接着細胞を血球計
算盤（ビルケルチュルク型）を用いて位相差顕微鏡下で
計数し、接着率を求めた。結果を表１に示す。
【００２２】実施例３：細胞増殖の評価 実施例２で用いた培養液を用いてＨＰＬＦ細胞懸濁液
（２．５×１０4 cells/ml）を調製した。この懸濁液２
ｍｌずつを実施例１で調製した各ディッシュに注入し
（５×１０4 cells/dish）、５％ＣＯ2 及び３７℃で４
日間培養した。その後、浮遊細胞を上澄み液と共に取り
除き、更に20mMリン酸緩衝液（pH７．４）１ｍｌでディ
ッシュをリンスした。0.02W/V%のＥＤＴＡと0.25W/V%の
トリプシンを含む20mMリン酸緩衝液（pH７．４）１ｍｌ
を注入し、３７℃で１０分間インキュベートした後、ピ
ペッティングを行い、接着している細胞を剥離回収し
た。更に、ディッシュを20mMリン酸緩衝液（pH７．４）
１ｍｌでリンスして細胞を完全に回収した。この回収し
た細胞を実施例２と同様に血球計算盤を用いて計数し
た。結果を表１に示す。
（２．５×１０4 cells/ml）を調製した。この懸濁液２
ｍｌずつを実施例１で調製した各ディッシュに注入し
（５×１０4 cells/dish）、５％ＣＯ2 及び３７℃で４
日間培養した。その後、浮遊細胞を上澄み液と共に取り
除き、更に20mMリン酸緩衝液（pH７．４）１ｍｌでディ
ッシュをリンスした。0.02W/V%のＥＤＴＡと0.25W/V%の
トリプシンを含む20mMリン酸緩衝液（pH７．４）１ｍｌ
を注入し、３７℃で１０分間インキュベートした後、ピ
ペッティングを行い、接着している細胞を剥離回収し
た。更に、ディッシュを20mMリン酸緩衝液（pH７．４）
１ｍｌでリンスして細胞を完全に回収した。この回収し
た細胞を実施例２と同様に血球計算盤を用いて計数し
た。結果を表１に示す。
【００２３】
【表１】 ディッシュ 接着性 増殖性 細胞形態 ＣＳ−ＣＣＥＬ ○ ○ Ｒ、Ａ ＣＳ−ＰＣＥＬ ○ ○ Ｓ ＣＳ−ＳＣＥＬ ○ ○ Ｓ 対照 ○ △ Ｓ
【００２４】表１中で、○は良好、△はやや不良、Ｒは
丸いままの状態、Ａは凝集形態、Ｓは伸展を示す。表１
から明らかなように、本発明の細胞培養基材は、接着性
について対照と同程度であるが、増殖性については対照
よりも優れている。従って、ＰＥＣコートディッシュを
用いると、増殖率と長期間培養の点で、対照よりも優れ
ている。また、細胞形態から判断して、特にＣＳ−ＣＣ
ＥＬコートディッシュを用いると、細胞が三次元的に増
殖していることが確認できた。
丸いままの状態、Ａは凝集形態、Ｓは伸展を示す。表１
から明らかなように、本発明の細胞培養基材は、接着性
について対照と同程度であるが、増殖性については対照
よりも優れている。従って、ＰＥＣコートディッシュを
用いると、増殖率と長期間培養の点で、対照よりも優れ
ている。また、細胞形態から判断して、特にＣＳ−ＣＣ
ＥＬコートディッシュを用いると、細胞が三次元的に増
殖していることが確認できた。
【００２５】
【発明の効果】本発明の細胞培養基材には、キトサンと
セルロース誘導体とからなるＰＥＣを用いるので、培養
対象細胞の性質に応じて、キトサンとセルロース誘導体
との組合せや配合比を適宜選択して、適切な物性を有す
る培養基材を容易に提供することができる。また、生体
成分を用いる場合と比較して、製品間の均一性欠如、劣
化、ゲル製造の煩雑さ等の問題がなく、しかも安価であ
る。更に、培養細胞が脱分化して機能を失うことのな
い、機能培養が可能になる。
セルロース誘導体とからなるＰＥＣを用いるので、培養
対象細胞の性質に応じて、キトサンとセルロース誘導体
との組合せや配合比を適宜選択して、適切な物性を有す
る培養基材を容易に提供することができる。また、生体
成分を用いる場合と比較して、製品間の均一性欠如、劣
化、ゲル製造の煩雑さ等の問題がなく、しかも安価であ
る。更に、培養細胞が脱分化して機能を失うことのな
い、機能培養が可能になる。
フロントページの続き (56)参考文献 特開 平４−293481（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−301234（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−79587（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12M 3/00 - 3/06 C12N 11/10 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ)
Claims (1)
- 【請求項１】 少なくとも表面が、カチオン性高分子電
解質としてのキトサンとアニオン性高分子電解質として
のセルロース誘導体とからなる高分子電解質錯体により
形成されていることを特徴とする、細胞培養基材。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP09729093A JP3311074B2 (ja) | 1993-03-31 | 1993-03-31 | 細胞培養基材 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP09729093A JP3311074B2 (ja) | 1993-03-31 | 1993-03-31 | 細胞培養基材 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06277038A JPH06277038A (ja) | 1994-10-04 |
| JP3311074B2 true JP3311074B2 (ja) | 2002-08-05 |
Family
ID=14188377
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP09729093A Expired - Fee Related JP3311074B2 (ja) | 1993-03-31 | 1993-03-31 | 細胞培養基材 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3311074B2 (ja) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20060134158A1 (en) * | 2002-06-28 | 2006-06-22 | Chemical Biology Institute | Chitosan/acidic biopolymer hybrid fiber and culture base for animal cells |
| JP2006333850A (ja) * | 2005-06-06 | 2006-12-14 | Asahi Kasei Corp | 生物粒子分離用基材 |
| JP5917000B2 (ja) * | 2011-01-28 | 2016-05-11 | テルモ株式会社 | シート形成評価方法 |
| JP6369044B2 (ja) * | 2014-02-19 | 2018-08-08 | 凸版印刷株式会社 | 培養装置およびその製造方法 |
| CN109844005B (zh) | 2016-08-24 | 2022-05-10 | 有机点击股份公司 | 具有增加的疏水性的含脂肪族化合物的生物基聚电解质络合物组合物 |
| CN109689761B (zh) | 2016-08-24 | 2022-07-08 | 有机点击股份公司 | 包含非水溶性颗粒的生物基聚电解质络合物组合物 |
| SE1651136A1 (en) * | 2016-08-24 | 2018-02-25 | Organoclick Ab | Bio-based pec compositions as binders for fiber based materials, textiles, woven and nonwoven materials |
-
1993
- 1993-03-31 JP JP09729093A patent/JP3311074B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH06277038A (ja) | 1994-10-04 |
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