WO2018047634A1 - 刺激応答性ポリマー - Google Patents

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WO2018047634A1
WO2018047634A1 PCT/JP2017/030452 JP2017030452W WO2018047634A1 WO 2018047634 A1 WO2018047634 A1 WO 2018047634A1 JP 2017030452 W JP2017030452 W JP 2017030452W WO 2018047634 A1 WO2018047634 A1 WO 2018047634A1
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WO
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site
polymer
temperature
stimulus
responsiveness
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PCT/JP2017/030452
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English (en)
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優史 丸山
啓介 渋谷
千鶴 平井
譲 島崎
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日立化成株式会社
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    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
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    • C08F216/00—Copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and at least one being terminated by an alcohol, ether, aldehydo, ketonic, acetal or ketal radical
    • C08F216/12—Copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and at least one being terminated by an alcohol, ether, aldehydo, ketonic, acetal or ketal radical by an ether radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G59/00—Polycondensates containing more than one epoxy group per molecule; Macromolecules obtained by polymerising compounds containing more than one epoxy group per molecule using curing agents or catalysts which react with the epoxy groups
    • C08G59/18—Macromolecules obtained by polymerising compounds containing more than one epoxy group per molecule using curing agents or catalysts which react with the epoxy groups ; e.g. general methods of curing
    • C08G59/20—Macromolecules obtained by polymerising compounds containing more than one epoxy group per molecule using curing agents or catalysts which react with the epoxy groups ; e.g. general methods of curing characterised by the epoxy compounds used
    • C08G59/22—Di-epoxy compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C08G69/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming a carboxylic amide link in the main chain of the macromolecule
    • C08G69/40—Polyamides containing oxygen in the form of ether groups
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M3/00—Tissue, human, animal or plant cell, or virus culture apparatus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor

Definitions

  • the present invention relates to a stimulus-responsive polymer, a cell culture container using the same, a cell culture method, and a cell detachment method.
  • proteolytic enzymes are often used as a stripping solution in the process of stripping cells from a cell culture vessel.
  • proteolytic enzymes degrade cell membrane proteins and intercellular adhesion proteins, thus damaging cells.
  • Non-invasive stimuli include slight temperature changes, slight pH changes, slight salt concentration changes, the addition of some biocompatible substances such as sugars, peptides and weak reducing agents, and light irradiation.
  • temperature-responsive culture vessels using temperature-responsive polymers are known (Patent Documents 1-4 and Non-Patent Document 1). In such a temperature-responsive culture vessel, cells can be detached by lowering the temperature from the culture temperature.
  • a conventional temperature-responsive culture vessel needs to immobilize a temperature-responsive polymer such as poly (N-isopropylacrylamide) (PNIPAM) derivative at a high density on the surface. It could only be manufactured with a low technique.
  • PNIPAM poly (N-isopropylacrylamide)
  • a temperature-responsive polymer capable of sufficiently acting on cell detachment even at a low surface density, which enables production of a temperature-responsive culture vessel by a simple technique such as immersion or coating.
  • a stimulus-responsive polymer that is responsive to a combined stimulus of a temperature change and a non-invasive stimulus other than a temperature change can improve cell detachability.
  • an object of the present invention is to provide a stimulus-responsive polymer that enables production of a culture vessel capable of non-invasive cell detachment by a simple technique.
  • the stimulus-responsive polymer of the present invention has, as structural units, a site X showing temperature responsiveness and a site Y showing responsiveness to stimuli other than temperature changes.
  • the site X exhibiting sex has an ether partial structure or a sulfide partial structure
  • the site Y exhibiting responsiveness to stimuli other than temperature changes includes a functional group having a pKa in water of 2 to 12 To do.
  • a culture vessel capable of non-invasive cell detachment can be produced by a simple technique using a stimulus-responsive polymer.
  • FIG. 1 shows the temperature responsiveness of polymer 2-2 showing the lower critical solution temperature in the examples.
  • FIG. 2 shows the molecular weight distribution of polymer 2-2 in the examples.
  • FIG. 3 is a photograph showing the progress when the cells were detached in the examples.
  • the stimuli-responsive polymer of the present invention has as constituent units a site X that exhibits temperature responsiveness and a site Y that exhibits responsiveness to stimuli other than temperature changes.
  • the cell culture container provided with the stimulus-responsive polymer of the present invention on the surface changes the adhesiveness to the surface of the cultured cells by changing the surface state due to temperature changes and stimuli other than temperature changes, and promotes cell detachment. be able to.
  • the stimulus-responsive polymer is hydrophobic at the culture temperature and changes to hydrophilicity by the stimulus, the cells generally tend to adhere to the hydrophobic surface, which is advantageous for cell detachment.
  • the stimulus-responsive polymer of the present invention is responsive to both temperature and stimuli other than temperature, and can sufficiently act on cell detachment even at a low surface density. Has cell detachability.
  • the part X showing temperature responsiveness is a part that can change the property or structure such as solubility (hydrophilicity or hydrophobicity) of the polymer in accordance with temperature change.
  • solubility hydrophilicity or hydrophobicity
  • the polymer may exhibit a lower critical solution temperature and / or an upper critical solution temperature.
  • the polymer is soluble below the critical temperature, is insoluble above the critical temperature, and when the upper critical solution temperature is indicated, the polymer may be at or above the critical temperature. It is soluble and insoluble below the critical temperature.
  • the site X may indicate the lower critical solution temperature and / or the upper critical solution temperature. It does not have to be. This is because the lower critical solution temperature and upper critical solution temperature in a polymer are bulk properties and do not necessarily correlate with the molecular state of the material immobilized on the surface of the culture vessel (changes in structure, mobility, physical properties, etc.). is there.
  • the medium contains various organic substances and salts, a compound that does not exhibit the lower critical solution temperature or the upper critical solution temperature in water does not necessarily exhibit the lower critical solution temperature or the upper critical solution temperature in the medium.
  • the stimulus-responsive polymer of the present invention can exhibit a lower critical solution temperature and / or an upper critical solution temperature in an aqueous solution, and preferably can exhibit a lower critical solution temperature in an aqueous solution.
  • part X isomerizes according to a temperature change
  • the structure of a polymer changes according to a temperature change.
  • the temperature change in which the site X showing temperature responsiveness shows responsiveness as long as it does not adversely affect the cells.
  • the temperature change is not limited, for example, from culture temperature (eg 37 ° C.) to room temperature (eg 25 ° C.). ), Temperature drop to 20 ° C. or low temperature (eg 4 ° C.).
  • the site X exhibiting temperature responsiveness has an ether partial structure or a sulfide partial structure.
  • the site X may have an ether partial structure or a sulfide partial structure in either the main chain or the side chain.
  • the site X preferably has two or more ether partial structures or sulfide partial structures. In this case, each ether partial structure or sulfide partial structure may exist continuously or may exist separately.
  • this partial structure has the formula: —O— (C n H 2n ) —O— or —S— (C n H 2n ) -S- (wherein n is, for example, 1 to 20, preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5).
  • the site X exhibiting temperature responsiveness is preferably an alkylene glycol unit: —O—R 1 O— (wherein R 1 O is an oxyalkylene group in which R 1 is a linear or branched alkylene)
  • R 1 is preferably linear or branched C 1 -C 20 alkylene, more preferably linear or branched C 1 -C 10 alkylene, and particularly preferably Chain or branched C 1 -C 5 alkylene.
  • Each alkylene glycol unit may have a linear or branched alkylene moiety.
  • propylene glycol units are 1,2-propylene glycol units (—O—CH (CH 3 ) CH 2 O—) and 1,3-propylene glycol units (—O—CH 2 CH 2 CH 2 O—).
  • Butylene glycol units are 1,2-butylene glycol units (—O—C (CH 2 CH 3 ) CH 2 O—), 1,3-butylene glycol units (—O—CH (CH 3 ) CH 2 CH 2 O—) and 1,4-butylene glycol units (—O—CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 O—).
  • the site X particularly preferably has at least one selected from ethylene glycol units (—O—CH 2 CH 2 O—), propylene glycol units, butylene glycol units and pentylene glycol units.
  • the site X exhibiting temperature responsiveness is preferably a polyalkylene glycol partial structure having two or more oxyalkylene groups: —O— (R 1 O) n — (wherein R 1 is as defined above, n is preferably 1 to 1000).
  • the site X more preferably has at least one selected from a polyethylene glycol partial structure, a polypropylene glycol partial structure, a polybutylene glycol partial structure, and a polypentylene glycol partial structure.
  • the temperature responsive moiety X has the formula: —O— (C n H 2n ) —O— or —S— (C n H 2n ) —S—, where n is, for example, 1 to 20, preferably 2 to 10, more preferably 2 to 5), or a polyethylene glycol partial structure, a polypropylene glycol partial structure, and a polybutylene glycol. It has at least one polyalkylene glycol partial structure selected from a partial structure and a polypentylene glycol partial structure.
  • the site X exhibiting temperature responsiveness includes, for example, alkylene glycol, alkylene dithioether, polyethylene glycol, polypropylene glycol, polybutylene glycol, polypentylene glycol, polyhexylene glycol and other polyalkylene glycols, polyphenylene Glycol, methylcellulose, hydroxypropylcellulose, alkylcelluloses, polyvinyl alcohol methyl ether and polyvinyl alcohol ether as partial structures, preferably alkylene glycol partial structure, alkylene dithioether partial structure, polyethylene glycol partial structure, polypropylene glycol moiety Structure, polybutylene glycol partial structure and polypentylene glycol partial structure.
  • part X may have the combination of these partial structures.
  • a polymer having an ether partial structure or a sulfide partial structure in the side chain can also be used.
  • the polymer capable of introducing an ether partial structure or a sulfide partial structure into the side chain include poly (N-isopropylacrylamide), poly (N-diisopropylacrylamide), poly (N-ethylacrylamide), and poly (N- Diethyl acrylamide), poly (N-methyl acrylamide), poly (N-dimethyl acrylamide), polyacrylamide, poly (butyl methacrylate), poly (propyl methacrylate), poly (ethyl methacrylate), poly (methyl methacrylate) , Polymethacrylic acid, poly (butyl acrylate), poly (propyl acrylate), poly (ethyl acrylate), poly (methyl acrylate), polyacrylic acid, poly (N-vinylpyrrolidone), poly (N-vinyl) Caprolact
  • the part X showing temperature responsiveness has groups derived from raw materials at both ends.
  • the group derived from the raw material is not particularly limited as long as it is a polymerizable group, and examples thereof include a group derived from an epoxy group, a group derived from a carboxylic acid group, and a group derived from an amine group. That is, the site X preferably has an ether partial structure or a sulfide partial structure and groups derived from raw materials at both ends. In one embodiment, the site X consists of an ether partial structure or a sulfide partial structure, and groups derived from raw materials at both ends.
  • the site X exhibiting temperature responsiveness is represented by the following formula: Formula: L—O— (R 1 O) n -L ′ (I) (Wherein R 1 is a linear or branched alkylene group, L and L ′ are groups derived from raw materials, and n is 1 to 1000), Formula: L—O— (C n H 2n ) —OL ′ (II) (N is, for example, 1 to 20, preferably 2 to 10, more preferably 2 to 5), or the formula: LS— (C n H 2n ) —SL ′ (III) (N is, for example, 1 to 20, preferably 2 to 10, more preferably 2 to 5) It is represented by In the formula (I), R 1 is preferably linear or branched C 1 -C 20 alkylene, more preferably linear or branched C 1 -C 10 alkylene, particularly preferably Is a linear or branched C 1 -C 5 alkylene.
  • L and L ′ are, for example, an epoxy group-derived group, a carboxylic acid group-derived group, and an amine group-derived group. Specifically, for example, —CH ( OH) CH 2 —, —CO— or — (CH 2 ) NH—.
  • the site X may be an amino acid-derived moiety such as lysine or glutamic acid substituted with an ether partial structure or a sulfide partial structure.
  • the alkylene part which has an ether partial structure or sulfide partial structure in a side chain formed when the monomer which has a double bond as a raw material is used may be sufficient.
  • the portion X exhibiting temperature responsiveness is particularly preferably at least one selected from the following.
  • a is 1 to 1000, b is 1 to 500, c is 1 to 400, d is 1 to 500, e is 1 to 500, and g is 1 to 500. is there.
  • the site X showing temperature responsiveness may be either a low molecule or a polymer, but an oligomer or a polymer is preferable because it is desirable that the cell has a molecular weight of a certain level or more in order to feel a change in the surface state.
  • the site X is an oligomer or polymer
  • the number average molecular weight of the site X is, for example, about 300 to 10,000.
  • the part X showing temperature responsiveness may be responsive to stimuli other than temperature. If site X is responsive to stimuli other than temperature, cell detachment can be promoted without damaging the cells, and site Y showing responsiveness to stimuli other than temperature changes. The effect of can be enhanced.
  • stimuli other than temperature include non-invasive changes in external environment that are not invasive to cells, and are not particularly limited. For example, pH changes, salt concentration changes, composition changes, sugar / peptide / Examples include addition of a biocompatible substance such as a weak reducing agent and light irradiation.
  • Site X is preferably responsive to changes in pH and / or salt concentration in addition to temperature changes. These stimuli are preferably weak so as not to adversely affect the cells.
  • the pH change is, for example, from pH 7.4 to pH 6.5, pH 7 .4 to pH 7.0 or a slight change from pH 7.4 to pH 8.0
  • site X is responsive to changes in salt concentration or composition, for example, Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Change from serum-free medium for stem cells (TeSR-E8) to PBS buffer or HEPES buffer.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • the site X showing temperature responsiveness includes a structure showing responsiveness to stimuli other than temperature change, or the ether partial structure or sulfide partial structure contained in the site X is sensitive to stimuli other than temperature change. However, by showing responsiveness, it is possible to show responsiveness to these stimuli in addition to temperature responsiveness.
  • the ether moiety or sulfide moiety contained in site X can be responsive to changes in pH and / or salt concentration.
  • the site X includes a coordination site capable of interacting with a salt, a proton, or the like, so that it can respond to changes in pH and / or salt concentration. it can.
  • the coordination site is not particularly limited, and examples thereof include another ether, another thioether, a carboxylic acid group, a nitrogen-containing aromatic group, an amine group, a carboxylic acid group, and a phosphate group. From the viewpoint of preventing non-specific adsorption to the container, a structure such as polyether is preferred.
  • the site Y exhibiting responsiveness to stimuli other than temperature changes is not particularly limited.
  • the site Y can act on cell adhesion or exfoliation, in particular cell exfoliation, by changing properties such as polymer solubility by these stimuli.
  • These stimuli are preferably stimuli that are weak enough not to adversely affect the cells.
  • the pH change is usually from pH 7.4 to pH 6.5, pH 7 .4 to pH 7.0, or a slight change from pH 7.4 to pH 8.0, and if site Y is responsive to changes in salt concentration or composition, eg from DMEM or TeSR-E8 to PBS buffer Change to liquid or HEPES buffer.
  • Site Y is preferably responsive to pH, salt concentration and / or sugar addition, more preferably responsive to pH and / or salt concentration, and particularly responsive to pH.
  • the site Y exhibiting responsiveness to stimuli other than temperature changes has a different structure depending on the stimulus used, but the site Y contains a functional group having a pKa in water of 2 to 12. This is preferred when the stimulus is a pH change and / or a salt concentration change.
  • the pKa in water of the functional group at the site Y is in the above range, the pKa of water is 15.7 or less and the pKa of the oxonium ion in water is -1.7 or more, Responsiveness in the vicinity of pH 7 where culture is possible can be realized.
  • the site Y more preferably contains a functional group having a pKa in water of 3 or more and 11 or less.
  • the functional group of a predetermined pKa includes a functional group in which the pKa of the conjugate acid or conjugate base is within the range.
  • each pKa may be different. Even if the pKa in water when present alone does not fall within the above range, the pKa in water only needs to fall within the above range when present in plural.
  • Examples of the functional group possessed by the site Y that exhibits responsiveness to stimuli other than temperature changes include carboxylic acid groups (aliphatic carboxylic acids and aromatic carboxylic acids), amine groups (aliphatic primary amine groups, aliphatic groups). Secondary amine group, aliphatic tertiary amine group, aromatic primary amine group, aromatic secondary amine group, aromatic tertiary amine group), imine group, thioether group, boronic acid group (aliphatic boronic acid group, Aromatic boronic acid group), phosphoric acid group (aliphatic phosphoric acid group, aromatic phosphoric acid group), nitrogen-containing aromatic group (pyrrole group, imidazolyl group, pyridyl group, pyrimidyl group, oxazolyl group, thiazolyl group and triazolyl group) Etc.) and phenolic hydroxyl groups and the like.
  • carboxylic acid groups aliphatic carboxylic acids and aromatic carboxylic acids
  • the functional group possessed by the site Y is preferably a carboxylic acid group, an amine group, a thioether group, a boronic acid group, and a nitrogen-containing aromatic group (particularly an imidazole group). These groups usually have a pKa in water of 3 or more and 11 or less.
  • the functional group possessed by the site Y may be a combination of the above. Preferred combinations of the functional groups possessed by the site Y include combinations of amine groups and carboxylic acid groups, combinations of amine groups and thioether groups, combinations of amine groups, thioether groups, and carboxylic acid groups, and amine groups and nitrogen-containing aromatic groups ( In particular, a combination of imidazole groups).
  • the site Y exhibiting responsiveness to stimuli other than temperature changes may have at least one of the above functional groups, but preferably the site Y has two or more of the above functional groups, More preferably, it has two or three functional groups.
  • the portion Y that exhibits responsiveness to stimuli other than temperature change preferably has an alkylenediamine partial structure or an alkylaminothioether partial structure, and these may further have a carboxylic acid group or an amine group.
  • a moiety derived from an amino acid eg, lysine, cysteine, glutamic acid, etc. may be used.
  • the site Y that exhibits responsiveness to stimuli other than temperature changes preferably has a raw material-derived group at both ends.
  • the group derived from the raw material is not particularly limited as long as it is a polymerizable group, and examples thereof include a group derived from an amine group, a group derived from a thiol group, and a group derived from a carboxylic acid group.
  • the group derived from the raw material can be a functional group having a pKa in water of 2 or more and 12 or less.
  • moiety Y is of the formula: —R 2 — (C n H 2n ) —R 3 —, wherein R 2 and R 3 are each NH or S, and n is, for example, 1 to 20 and preferably 1 to 10 and more preferably 1 to 5), and the alkylene moiety may be substituted with a carboxylic acid group or an amine group.
  • the site Y is represented by the formula: —NH— (C n H 2n ) —CO— (wherein n is, for example, 1 to 20, preferably 1 to 10, more preferably 1 to The alkylene moiety may be substituted with a carboxylic acid group or an amine group.
  • part Y may be amino acid origin parts, such as a lysine, a cysteine, and glutamic acid.
  • the site Y is represented by the formula: —CH 2 CHR 4 — (wherein R 4 is selected from a carboxylic acid group, an amine group, a boronic acid group and a nitrogen-containing aromatic group, preferably a boronic acid group. And particularly preferably a phenylboronic acid group).
  • the site Y includes, for example, a coordination site selected from an ether, a thioether, a carbonyl group, a nitrogen-containing aromatic group, an amine group, a carboxylic acid group, and a phosphate group when the stimulus is a change in salt concentration.
  • the site Y preferably includes a site capable of reacting with a sugar such as a boronic acid group.
  • site Y preferably includes a reducible site such as disulfide.
  • site Y preferably includes photoresponsive sites such as azobenzene, spiropyran, diarylethene and o-nitrobenzyl groups.
  • a component generated by cleavage of the bond dissolves in the medium. It is necessary to pay attention to the effects on cells.
  • the site Y exhibiting responsiveness to stimuli other than temperature changes is particularly preferably at least one selected from the following.
  • the site Y exhibiting responsiveness to stimuli other than temperature changes may be either a low molecule or a polymer, but is preferably a low molecule.
  • the molar ratio between the site X showing temperature responsiveness in the stimulus-responsive polymer and the site Y showing responsiveness to stimuli other than temperature change is, for example, 10: 1 to 1:10, preferably 5: 1 to 1: 5, more preferably 3: 1 to 1: 3.
  • the stimulus-responsive polymer of the present invention has a site X ′ or Y ′ that regulates physical properties in addition to a site X showing temperature responsiveness and a site Y showing responsiveness to stimuli other than temperature changes. Also good. Having a site X ′ or Y ′ that regulates physical properties allows the polymer to be tuned to the desired physical properties, such as increasing responsiveness to temperature or non-temperature stimuli, changing solubility, charge It is possible to change the density, impart another responsiveness, adjust cell adhesion, impart sustained drug release, and the like.
  • increasing the responsiveness to temperature or a stimulus other than temperature means increasing the degree of responsiveness, or widening the range of stimuli other than the temperature or temperature that can be responded.
  • the site X ′ or Y ′ that regulates physical properties is not particularly limited as long as it includes a physical property regulating site that can change the physical properties of the stimulus-responsive polymer.
  • the site X ′ has a structure similar to the site X
  • the site Y ′ has a structure similar to the site Y.
  • the site X ′ may be one that can be used as the site X, but in one polymer, the site X ′ is different from the site X.
  • the site Y ′ may be one that can be used as the site Y, but the site Y ′ is different from the site Y in one polymer.
  • the site X ′ or Y ′ is a carboxylic acid group, boronic acid group, phosphoric acid group, sulfonic acid, amine group, imine group, imidazolyl group, pyridyl group, guanidyl group, quaternary ammonium group, etc.
  • an amino acid-derived moiety such as lysine
  • the responsiveness to the pH change of the stimulus-responsive polymer can be changed.
  • the site X 'or Y' contains photoresponsive moieties such as azobenzene, spiropyran, diarylethene and o-nitrobenzyl groups, the photoresponsiveness of the stimulus responsive polymer can be increased.
  • Site X ′ or Y ′ is gelatin, collagen, polylysine, RDG peptide, laminin, fibronectin, vitronectin, chitin, chitosan, integrin, cadherin, albumin, globulin, heparin, heparan sulfate, dextran sulfate, polyglutamic acid, polyaspartic acid,
  • an adhesive moiety such as elastin
  • the cell adhesiveness of the stimulus-responsive polymer can be adjusted.
  • the site X ′ or Y ′ includes a structure in which a physiologically active substance is introduced through a hydrolyzable bond such as an ester bond, sustained drug release can be imparted.
  • the site X ′ has a structure similar to the site X.
  • the site X ′ preferably has a group derived from a raw material at both ends.
  • the group derived from the raw material is the same as the raw material of the site X.
  • the part Y ′ has a structure similar to the part Y.
  • the site Y ′ preferably has a group derived from a raw material at both ends.
  • the group derived from the raw material is the same as the raw material of the site Y.
  • the site X ′ or Y ′ that regulates physical properties is particularly preferably at least one selected from the following.
  • the molar ratio of the site X exhibiting temperature responsiveness in the stimulus-responsive polymer to the site X ′ that regulates physical properties is, for example, 100: 1 to 1:10, preferably 20: 1 to 1: 5.
  • the molar ratio of the site Y that exhibits responsiveness to stimuli other than temperature changes and the site Y ′ that regulates physical properties is, for example, 100: 1 to 1:10, preferably 20: 1 to 1: 5.
  • the stimulus-responsive polymer of the present invention is preferably water-soluble.
  • the number average molecular weight of the stimulus-responsive polymer is preferably 500 to 500,000, more preferably 500 to 200,000, and particularly preferably 500 to 100,000.
  • Preferred stimulus-responsive polymers are the polymers 1-1 to 1-4, 2-1 to 2-7, 3-1 to 3-4, 4-1 to 4-4, and 5-1 to 5-4 of the examples. The polymer.
  • the stimuli-responsive polymer of the present invention includes, for example, a raw material of site X that exhibits temperature responsiveness, a raw material of site Y that exhibits responsiveness to stimuli other than changes in temperature, and a site X ′ that adjusts physical properties as the case may be. It can be produced by copolymerizing the raw material of Y ′. A monomer or a macromonomer can be used as a raw material for each part. In addition to these raw materials, copolymerization may be performed in the state where another monomer or macromonomer coexists.
  • the polymerization mode for example, radical polymerization, cationic polymerization, anionic polymerization, coordination polymerization, polycondensation, polyaddition, addition condensation, ring-opening polymerization, metathesis polymerization, etc. can be used, and it is appropriately selected according to the desired structure. it can.
  • the polymerization mode is preferably radical polymerization, polycondensation, polyaddition, addition condensation and ring-opening polymerization.
  • the functional group in the raw material may be protected as necessary. In this case, it is preferable to purify after deprotection after polymerization.
  • the starting materials for the site X and the site Y may be those having groups capable of polycondensation or ring-opening polymerization at both ends. it can.
  • a material having a carboxylic acid group and / or an amine group at both ends can be used as a raw material for the site X and the site Y.
  • a material having a carboxylic acid group at one end and an amine group at the other end can be used, and a material having a carboxylic acid group at both ends is used as a raw material for part X.
  • Those having amine groups at both ends can also be used. It is preferable that the raw materials of the site X ′ and the site Y ′ have the same end groups as the site X and the site Y, respectively.
  • a material having an epoxy group at both ends can be used as the raw material for the site X, and a nucleophilic group (for example, an amine group or a thiol group) can be used as the material for the site Y. What has both ends can be used.
  • the polymerization conditions can be appropriately selected depending on the raw materials used and the polymerization method.
  • the raw material of the site X and the site Y may be any material having a radical addition-polymerizable group, for example, a double bond.
  • the raw material which has is used.
  • the raw material of the site X has an ether partial structure or a sulfide partial structure in the side chain
  • the raw material of the site Y has a functional group in the side chain.
  • a polymer in which the sites X and Y are combined in any order is obtained.
  • the polymerization conditions can be appropriately selected depending on the raw materials used and the polymerization method.
  • the stimuli-responsive polymer of the present invention uses a polymer as a raw material, introduces site X or site Y into the side chain of the polymer, and introduces site X or site Y into all or part of the side chain. It can also be manufactured.
  • a side chain of a polymer having a site X as a structural unit by reacting a polymer having a site X exhibiting temperature responsiveness as a structural unit with a raw material of the site Y exhibiting responsiveness to a stimulus other than a temperature change.
  • a site Y may be introduced into the polymer, or a polymer having a site Y that exhibits responsiveness to a stimulus other than a temperature change as a constituent unit is reacted with a raw material of the site X that exhibits temperature responsiveness to react with the site Y. May be introduced into the side chain of the polymer having as a structural unit.
  • polylysine or polyglutamic acid is used as a polymer having the site Y as a structural unit, and the site X exhibiting temperature responsiveness can be introduced into these side chains.
  • site Y is lysine or glutamic acid, which is a structural unit of polylysine or polyglutamic acid, respectively.
  • the response of a stimulus-responsive polymer to a temperature change or stimulus other than the temperature change is affected by the introduction amount of a site exhibiting the corresponding response and the molecular weight of the polymer.
  • the monomer concentration, the monomer ratio, the solvent By controlling the polymerization conditions such as reaction temperature and atmosphere, the responsiveness range can be controlled.
  • the polymer obtained is not necessarily linear, but may be branched or networked, but may be within a range that does not affect the function.
  • the polymer tacticity, polymerization regioselectivity, and terminal functional groups may be a mixture of multiple structures within a range that does not affect the function, and the bonding mode and terminal structure in the polymer are not limited. .
  • the present invention also includes a stimulus-responsive polymer produced by the production method described above. Therefore, the present invention also includes a stimulus-responsive polymer obtained by copolymerizing the raw material of the site X, the raw material of the site Y, and the raw material of the site X ′ or Y ′ that optionally controls physical properties.
  • the stimulus-responsive polymer of the present invention is represented by the following formula (1-1), formula (1-2), formula (1-3) or formula (2-1) depending on the structural unit and structure. .
  • X is a site showing temperature responsiveness
  • Y is a site showing responsiveness to stimuli other than temperature change
  • X has an ether partial structure or a sulfide partial structure
  • Y is in water.
  • PKa includes a functional group of 2 or more and 12 or less, and n is preferably 2 to 1000).
  • the stimulus-responsive polymer of the formula (1-1) has a site X showing temperature responsiveness and a site Y showing responsiveness to stimuli other than temperature change as structural units.
  • the site X and site Y and preferred ones thereof are as described above.
  • the stimulus-responsive polymer of the formula (1-1) has a structure in which the sites X and Y are alternately bonded. By selecting an appropriate combination of each raw material and an appropriate molecular weight, the desired cell detachability can be obtained.
  • the stimulus-responsive polymer of Formula (1-1) has a site X that exhibits temperature responsiveness and a site Y that exhibits responsiveness to stimuli other than temperature changes, so that the cells can be weakly stimulated without damaging the cells. Can be peeled off and can sufficiently act on cell detachment even at a low density.
  • the stimuli-responsive polymer of the formula (1-1) is, for example, a polycondensation of a raw material at the site X having an epoxy group or a carboxylic acid group at both ends and a raw material at the site Y having a nucleophilic group at both ends. It can be produced by ring-opening polymerization.
  • X is a site showing temperature responsiveness
  • Y is a site showing responsiveness to stimuli other than temperature change
  • Y ′ is a site that regulates physical properties
  • X is an ether partial structure or Y has a sulfide partial structure
  • Y contains a functional group having a pKa in water of 2 or more and 12 or less
  • Y 'contains a physical property controlling site is not the same as Y
  • n is preferably 1 to 1000
  • N ′ is preferably 1 to 500).
  • the polymer of the formula (1-2) has, as structural units, a site X that exhibits temperature responsiveness, a site Y that exhibits responsiveness to stimuli other than temperature changes, and a site Y ′ that regulates physical properties.
  • the site X, the site Y and the site Y ′ and preferred ones thereof are as described above.
  • the polymer of the formula (1-2) has a structure in which a part Y of the site Y has a physical property among the structure in which the part X showing the temperature responsiveness and the part Y showing the responsiveness to the stimulus other than the temperature change are alternately bonded. It has a structure substituted by a site Y ′ that regulates. By having the site Y ′ for controlling the physical properties, it is possible to obtain physical properties that are difficult to obtain with the polymer of the formula (1-1) having only the site X and the site Y as structural units.
  • the stimuli-responsive polymer of the formula (1-2) includes, for example, a raw material of the site X having an epoxy group or a carboxylic acid group at both ends, and a raw material of the site Y and the site Y ′ having a nucleophilic group at both ends. Can be produced by polycondensation or ring-opening polymerization.
  • X is a site showing temperature responsiveness
  • Y is a site showing responsiveness to stimuli other than temperature change
  • X ′ is a site that regulates physical properties
  • X is an ether partial structure or It has a sulfide partial structure
  • Y contains a functional group having a pKa in water of 2 or more and 12 or less
  • X ′ contains a physical property controlling site, is not identical to X
  • n is preferably 1 to 1000
  • N ′ is preferably 1 to 500.
  • the polymer of the formula (1-3) has, as structural units, a site X that exhibits temperature responsiveness, a site Y that exhibits responsiveness to stimuli other than temperature changes, and a site X ′ that regulates physical properties.
  • the site X, the site X ′ and the site Y and preferred ones thereof are as described above.
  • the polymer of the formula (1-3) has a structure in which the site X showing temperature responsiveness and the site Y showing responsiveness to stimuli other than temperature change are alternately bonded. A part of the structure is replaced by a site X ′ that regulates physical properties.
  • site X ′ that regulates physical properties.
  • the stimulus-responsive polymer of the formula (1-3) includes, for example, a raw material of the site X and the site X ′ having an epoxy group or a carboxylic acid group at both ends, and a raw material of the site Y having a nucleophilic group at both ends. Can be produced by polycondensation or ring-opening polymerization.
  • X is a site showing temperature responsiveness
  • Y is a site showing responsiveness to stimuli other than temperature change
  • X has an ether partial structure or a sulfide partial structure
  • Y is in water.
  • the pKa contains a functional group of 2 or more and 12 or less, n is preferably 1 to 1000, and n ′ is preferably 1 to 500)
  • the polymer of the formula (2-1) has a site X showing temperature responsiveness and a site Y showing responsiveness to stimuli other than temperature change as structural units.
  • the polymer of the formula (2-1) has a structure in which the site X and the site Y are combined in any order. For example, a random copolymer, a block copolymer, etc. It has a structure. Such a structure can also be used when the binding order of the part X showing temperature responsiveness and the part Y showing responsiveness to stimuli other than temperature changes is not important.
  • the polymer of the formula (2-1) is, for example, radical polymerization, cationic polymerization, anionic polymerization, coordination polymerization, polycondensation, polyaddition, addition condensation, ring-opening polymerization, using each raw material of site X and site Y. It can be produced by metathesis polymerization or the like. Alternatively, the polymer of the formula (2-1) can be obtained by introducing the site Y into the side chain of the polymer having the site X as a structural unit or the site X into the side chain of the polymer having the site Y as a structural unit. Can be manufactured.
  • the present invention also includes a culture vessel provided with the stimulus-responsive polymer on the surface.
  • the stimulus-responsive polymer functions sufficiently even at a low density, the polymer can be introduced into the culture vessel by a simple method, and the stimulus-responsive polymer is responsive to stimuli other than temperature. Therefore, it has excellent cell detachability.
  • the immobilization of the stimulus-responsive polymer on the surface of the culture vessel is not particularly limited, and can be performed by, for example, covalent bond, charge interaction, physical adsorption and the like. Considering productivity and durability, the stimulus-responsive polymer can be immobilized on the surface of the culture vessel by forming a covalent bond between the functional group of the stimulus-responsive polymer and the functional group on the surface of the culture vessel, which can be easily implemented. preferable.
  • the method for forming a covalent bond used for immobilizing the stimulus-responsive polymer on the surface of the culture vessel is not particularly limited.
  • amide formation, epoxy ring opening, imine formation, Michael type addition, ene reaction, thioene reaction, Diels -Alder reaction, Husgen reaction, native chemical ligation, nucleophilic addition reaction, electrophilic addition reaction, sigmatropic rearrangement, etc. but considering the productivity, as a covalent bond formation method, a common culture vessel substrate Reactions that can utilize functional groups present in are preferred.
  • the culture vessel base material is a resin such as polystyrene.
  • Oxidation or introduction of a cationic polymer may be performed as a hydrophilic treatment on the surface, and products with carboxylic acid groups or amine groups as surface functional groups are available. Easy. From the above, as a method for forming a covalent bond used for immobilizing a stimulus-responsive polymer on the surface of a culture vessel, amide formation, epoxy ring opening, imine formation, Michael type addition, and the like are preferable.
  • the present invention also includes a cell culturing method using a culture vessel provided with the stimulus-responsive polymer on the surface.
  • the cells are adhered and cultured by bringing the cell suspension into contact with the culture vessel.
  • a component that promotes cell adhesion Prior to contacting the cell suspension, a component that promotes cell adhesion may be coated or immobilized on the culture vessel.
  • Components that promote cell adhesion include, for example, gelatin, collagen, poly-L-lysine, RDG peptide, laminin, fibronectin, vitronectin, integrin, cadherin, an antibody specific for a membrane protein, or a molecule containing a partial structure thereof, or Although it is a molecule
  • the surface density of the stimuli-responsive polymer and the component that promotes cell adhesion on the surface of the cell culture container has an effect on cell culture properties and cell detachability. For example, if the surface density of the stimulus-responsive polymer is too high, the cells cannot be cultured because there are few components that promote cell adhesion, and if the surface density of the stimulus-responsive polymer is too low, the cells cannot be detached. It is possible. However, since these depend on the cells to be cultured, it is necessary to select a material and surface density suitable for the target cells when carrying out.
  • the cells to be cultured are preferably adherent cells, such as fibroblasts, mesenchymal stem cells, ES cells, iPS cells, and dedifferentiated cells, but are not limited thereto. In addition, it is necessary to select appropriately the said component which promotes cell adhesion by the cell to culture.
  • the cells can be detached by applying an appropriate stimulus to the surface of the culture container after adhesion-culturing the cells in a culture container having the stimulus-responsive polymer of the present invention on the surface.
  • Appropriate stimuli are changes in the external environment that are non-invasive to the cell, such as medium temperature, pH, salt concentration, chemical potential, redox potential or the light intensity to which the cell is exposed. Change. Therefore, the present invention relates to a cell comprising a process for changing the temperature, pH, salt concentration, chemical potential, redox potential or light intensity to which the cell is exposed, in a state where the cell is adhered to the culture vessel. A peeling method is also included.
  • cells When using a temperature or liquid factor (pH, substance addition, etc.) as a stimulus, cells can be easily detached by adding a stripping solution containing them. Before adding the stripping solution, the medium may or may not be removed. Although appropriate conditions vary depending on the cells to be cultured, general culture conditions can be used. Since the cell detachment method of the present invention can detach cells without damaging the cells, an excellent cell survival rate is achieved.
  • a temperature or liquid factor pH, substance addition, etc.
  • the temperature change in the cell detachment method may be a temperature change within a culturable temperature range, for example, a temperature change from 37 ° C. to 4 ° C., 37 ° C. to 20 ° C., 37 ° C. to 25 ° C., etc. However, it is not limited to these.
  • the pH change in the cell detachment method may be a pH change within a range that does not adversely affect the cells in the short term, for example, pH 7.4 to pH 6.5, pH 7.4 to pH 7.0, pH 7.4.
  • the pH change from pH to 8.0 is not limited to these.
  • the salt concentration change in the cell peeling method is a salt concentration change within a range that does not adversely affect the cells in the short term.
  • This salt concentration may be the salt concentration of the whole solution or the salt concentration of a specific substance, for example, change from medium to PBS buffer, change from medium to HEPES buffer, change from medium to another medium. Although it is a change etc., it is not limited to these. However, it is desirable that the osmotic pressure does not change greatly from the viewpoint of preventing damage to the cells in these cases.
  • a stimulus-responsive polymer of the present invention was prepared.
  • the molar equivalent described in the following polymer preparation is the molar equivalent at the time of preparation, and is the molar equivalent of each raw material relative to the raw material corresponding to the site X. Moreover, what was protected as needed was used for the functional group in a raw material, In this case, it refine
  • Polymers 1-1 to 1-2 represented by formula (1-1) using a raw material having an epoxy group at both ends corresponding to part X and a raw material having two or more nucleophilic parts corresponding to part Y for polymerization 1-4 was prepared.
  • Polymer 1-1 was polymerized by heating a water-ethanol (1: 1) solution of PEG2000-diglycidyl ether and 1,4-butanediamine (1.2 molar equivalent) at 60 ° C. for 2 hours. The obtained polymer was purified by reprecipitation or dialysis (MWCO1000), and pulverized by lyophilization to obtain polymer 1-1. The number average molecular weight of the polymer 1-1 was about 40,000.
  • Polymer 1-2 was prepared in the same manner as Polymer 1-1 from PPG640-diglycidyl ether and ethylenediamine (1.2 molar equivalent). The number average molecular weight of the polymer 1-2 was about 30,000. It was confirmed that the polymer 1-2 exhibited a lower limit dissolution critical temperature in Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM).
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle medium
  • Polymer 1-3 was prepared from PBG400-diglycidyl ether and ethylenediamine (1.4 molar equivalent) in the same manner as Polymer 1-1.
  • the number average molecular weight of the polymer 1-3 was about 20,000.
  • Polymer 1-4 was prepared in the same manner as polymer 1-1 from rand-PEG / PPG1000-diglycidyl ether and lysine (1.4 molar equivalent). The number average molecular weight of the polymer 1-4 was about 10,000.
  • Table 1 shows the structures of the polymers 1-1 to 1-4.
  • a is 1 to 1000, b is 1 to 500, c is 1 to 400, d is 1 to 500, and e is 1 to 500.
  • Polymer 2-1 was prepared in the same manner as Polymer 1-1 from PEG2000-diglycidyl ether, 1,4-butanediamine (0.8 molar equivalent) and cysteine (0.8 molar equivalent).
  • the number average molecular weight of the polymer 2-1 was about 40,000.
  • Polymer 2-2 was prepared in the same manner as polymer 1-1 from PPG640-diglycidyl ether, ethylenediamine (1.2 molar equivalent) and lysine (0.4 molar equivalent). It was confirmed that the polymer 2-2 exhibited a lower limit melting critical temperature in DMEM.
  • FIG. 1 shows the results of measuring the temperature responsiveness of polymer 2-2 in an aqueous solution by measuring the temperature variable light transmittance. 1 confirms that the polymer 2-2 exhibits a lower critical solution temperature in an aqueous solution.
  • the number average molecular weight of the polymer 2-2 was about 30,000.
  • FIG. 2 shows the molecular weight distribution of polymer 2-2.
  • Polymer 2-3 was prepared in the same manner as Polymer 1-1 from PPG640-diglycidyl ether, ethylenediamine (1.25 molar equivalent) and 4,4'-diaminoazobenzene (0.25 molar equivalent). The number average molecular weight of the polymer 2-3 was about 20,000. It was confirmed that the polymer 2-3 exhibited a lower limit melting critical temperature in DMEM.
  • Polymer 2-4 was prepared in the same manner as polymer 1-1 from rand-PEG / PPG1000-diglycidyl ether, ethylenediamine (1.2 molar equivalent) and lysine (0.4 molar equivalent). The number average molecular weight of the polymer 2-4 was about 40,000.
  • Polymer 2-5 was prepared in the same manner as polymer 1-1 from butylene glycol diglycidyl ether, cysteine (1.5 molar equivalent) and ⁇ , ⁇ '-dithiol-PNIPAM (0.3 molar equivalent). The number average molecular weight of the polymer 2-5 was about 50,000. It was confirmed that the polymer 2-5 exhibited a lower limit melting critical temperature in DMEM.
  • Polymer 2-6 was prepared from PEG2000-diglycidyl ether, 1,4-butanediamine (1.6 molar equivalent) and ⁇ -polylysine (0.16 molar equivalent) in the same manner as polymer 1-1.
  • the number average molecular weight of the polymer 2-6 was about 100,000.
  • Polymer 2-7 was prepared in the same manner as Polymer 1-1 from PPG640-diglycidyl ether, ethylenediamine (1.6 molar equivalent) and gelatin (0.16 molar equivalent). The number average molecular weight of the polymer 2-7 was about 100,000. It was confirmed that the polymer 2-7 exhibited a lower limit melting critical temperature in DMEM.
  • Table 2 shows the structures of polymers 2-1 to 2-7.
  • [Y]: [Y ′] represents the charged molar ratio at the time of synthesis.
  • a is 1 to 1000, b is 1 to 500, c is 1 to 400, d is 1 to 500, and e is 1 to 500.
  • a polymer represented by formula (1-3) using a raw material having an epoxy group at both ends corresponding to site X or site X ′ and a raw material having two or more nucleophilic sites corresponding to site Y for polymerization 3-1 to 3-4 were prepared.
  • Polymer 3-1 was prepared in the same manner as Polymer 1-1 from PEG2000-diglycidyl ether, butylene glycol diglycidyl ether (0.5 molar equivalent) and cysteine (1.5 molar equivalent). The number average molecular weight of the polymer 3-1 was about 40,000.
  • Polymer 3-2 was prepared from PEG2000-diglycidyl ether, octafluorodecane bisoxide (0.05 molar equivalent) and 1,4-butanediamine (1.5 molar equivalent) in the same manner as Polymer 1-1. .
  • the number average molecular weight of the polymer 3-2 was about 40,000.
  • Polymer 3-3 was prepared from PEG2000-diglycidyl ether, PBG1000-diglycidyl ether (2 molar equivalents) and ethylenediamine (4.8 molar equivalents) in the same manner as polymer 1-1.
  • the number average molecular weight of the polymer 3-3 was about 40,000.
  • Polymer 3-4 was prepared in the same manner as polymer 1-1 from PPG640-diglycidyl ether, butylene glycol diglycidyl ether (0.33 molar equivalent) and ethylenediamine (2 molar equivalent). The number average molecular weight of the polymer 3-4 was about 30,000.
  • Table 3 shows the structures of polymers 3-1 to 3-4.
  • [X]: [X ′] represents the charged molar ratio at the time of synthesis.
  • a is from 1 to 1000, b is from 1 to 500, and c is from 1 to 400.
  • Polymerization was carried out by stirring ⁇ , ⁇ ′-dicarboxyl PEG 1000 and spermidine (1.5 molar equivalent) with 1.2 equivalents of condensing agent DMT-MM in water-ethanol (1: 1) solvent. Obtained.
  • the obtained polymer was purified by reprecipitation or dialysis (MWCO1000), and pulverized by lyophilization to obtain polymer 4-1.
  • the number average molecular weight of the polymer 4-1 was about 20,000.
  • Polymer 4-2 is composed of 3,5-dithiaoctane-1,8-dicarboxylic acid, spermidine (1.5 molar equivalent) and 1,4-butanediamine (0.3 molar equivalent) in the same manner as polymer 4-1. Prepared. The number average molecular weight of the polymer 4-2 was about 5000.
  • Polymer 4-3 was obtained from ⁇ , ⁇ ′-dicarboxyl PEG1000, ⁇ , ⁇ ′-dicarboxyl PPG640 (2 molar equivalent) and lysine protected with a carboxyl group (4.8 molar equivalent) from polymer 4-1 Prepared in the same manner.
  • the number average molecular weight of the polymer 4-3 was about 10,000.
  • Polymer 4-4 was prepared in the same manner as Polymer 4-1, using ⁇ , ⁇ '-diaminoPPG640 and glutamic acid (1.5 molar equivalent) with the amino group protected.
  • the number average molecular weight of the polymer 4-4 was about 10,000.
  • Table 4 shows the structures of polymers 4-1 to 4-4.
  • [X]: [X '] and [Y]: [Y'] indicate the charged molar ratio at the time of synthesis.
  • a polymer represented by the formula (2-1) was prepared by using dehydration condensation reaction or radical addition reaction for polymerization.
  • Butoxyethoxyacetic acid and ⁇ -polylysine were stirred with 1.2 equivalents of DMT-MM in water to introduce a butoxyethoxyacetamide amide moiety into the side chain of ⁇ -polylysine.
  • the obtained polymer was purified by reprecipitation or dialysis, and powdered by lyophilization to obtain polymer 5-1.
  • the number average molecular weight of the polymer 5-1 was about 6000.
  • N-bis (ethoxyethyl) amine and poly- ⁇ -glutamic acid By stirring N, N-bis (ethoxyethyl) amine and poly- ⁇ -glutamic acid in water with 1.2 equivalents of DMT-MM, N-N-bis (ethoxyethyl) is added to the side chain of poly- ⁇ -glutamic acid. ) An amide moiety was introduced. The obtained polymer was purified by reprecipitation or dialysis, and powdered by lyophilization to obtain polymer 5-2. The number average molecular weight of the polymer 5-2 was about 10,000.
  • Polymerization was carried out by stirring a PPG640 derivative having a carboxylic acid group and an amine group at the terminal and histidine with 1.2 equivalents of DMT-MM in a water-ethanol (1: 1) solvent.
  • the obtained polymer was purified by reprecipitation or dialysis, and pulverized by lyophilization to obtain polymer 5-3.
  • the number average molecular weight of the polymer 5-3 was about 20,000.
  • Polymerization was carried out by heating a mixture of two types of monomers having a carbon-carbon double bond, vinyl (diethylene glycol) ether and styrene boronic acid and AIBN (0.01 equivalent) to 60 ° C. in acetone.
  • the obtained polymer was purified by reprecipitation or dialysis (MWCO1000) and pulverized by lyophilization to obtain polymer 5-4.
  • the number average molecular weight of the polymer 5-4 was about 5000.
  • Table 5 shows the structures of polymers 5-1 to 5-4.
  • [X]: [Y] indicates the charged molar ratio at the time of synthesis.
  • a 6-well dish made of polystyrene having amine groups as surface functional groups 0.1% by weight of a polymer having a carboxylic acid group (polymers 1-4, 2-4, 5-2) and 1% by weight of DMT-MM % 5.8 buffer solution was allowed to act at 40 ° C. for 2 hours. Thereafter, the 6-well dish was washed with PBS of pH 7.4, then washed with pure water, dried, and sterilized with ultraviolet light to produce the culture containers of Examples 5 to 7.
  • the culture containers of Comparative Examples 1 to 5 are polymers that do not contain the temperature-responsive portion X, and include ⁇ -polylysine, poly- ⁇ -glutamic acid, polyvinylamine, amine-terminated poly (N— Isopropyl acrylamide) or gelatin (referred to as polymers 6-1, 6-2, 6-3, 6-4, or 6-5, respectively) is introduced into the surface of the culture vessel in the same manner as in the culture vessels of Examples 1 to 4. Produced.
  • polyethylene glycol or polypropylene glycol (referred to as polymers 6-6 or 6-7, respectively) is used as a compound that does not include a site Y that exhibits responsiveness to stimuli other than temperature changes. In the same manner as in the culture container of the above-mentioned example, it was introduced into the surface of the culture container.
  • Table 6 shows the compound names or structures of the polymers 6-1 to 6-7.
  • an untreated culture vessel (culture vessel used in Examples 1 to 4 and Comparative Examples 1 to 5) having a carboxylic acid group as a surface functional group, the surface of which is not polymer-modified.
  • an untreated culture vessel (culture vessel used in Examples 5 to 7) having an amine group as a surface functional group and having no polymer modification on the surface was used.
  • Cell culture and detachment tests were performed as follows: The surface of the culture vessel was coated with laminin according to a general protocol, iPS cells were seeded in the culture vessel, and cultured in a CO 2 incubator for 7 days. The medium and the like were in accordance with general feeder-less conditions. Thereafter, the culture vessel was taken out from the CO 2 incubator, the medium was replaced with a predetermined stripping solution, and left at room temperature. After a certain time, the cells were detached when the culture vessel was lightly pipetted and stirred.
  • FIG. 3 is a photograph showing the progress of the cell detachment test for one of the culture containers of the examples (during culturing ⁇ after 5 minutes from the addition of the detachment solution (PBS) ⁇ after pipetting).
  • ⁇ Cytotoxicity evaluation> In order to evaluate the cytotoxicity of the polymer 2-2, a study was conducted to add a polymer to the medium when culturing iPS cells using a general protocol (Example 8). When all the polymers reach from the surface of the culture vessel, the polymer concentration in the medium is considered to be about 1 ⁇ g / well at the maximum. Therefore, in this evaluation, the culture was performed in a state where the polymer 2-2 was added to the medium at a concentration of 2 ⁇ g / well, which is twice the estimated maximum value.
  • the growth rate was 68 times and survival rate was 91% on the 6th day, whereas in the medium added with 2 ⁇ g / well of the polymer, the growth rate was 63 on the 6th day.
  • the survival rate was 95%, which was the same result as that of a normal medium. From this, it was found that there is no cytotoxicity derived from the polymer of the present invention in the use for immobilization in a culture vessel.

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Abstract

本発明は、非侵襲的に細胞剥離可能な培養容器の簡便な手法による製造を可能にする刺激応答性ポリマーを提供することを目的とする。　本発明は、温度応答性を示す部位Ｘと、温度変化以外の刺激に対して応答性を示す部位Ｙとを構成単位として有する刺激応答性ポリマーであって、温度応答性を示す部位Ｘがエーテル部分構造またはスルフィド部分構造を有し、温度変化以外の刺激に対して応答性を示す部位Ｙが水中でのｐＫａが２以上１２以下の官能基を含む、前記刺激応答性ポリマー、ならびに該刺激応答性ポリマーを用いた培養容器、培養方法および細胞剥離方法に関する。

Description

刺激応答性ポリマー
　本発明は、刺激応答性ポリマーならびにそれを用いた細胞培養容器、細胞培養方法および細胞剥離方法に関する。
　細胞培養において、細胞を細胞培養容器から剥離する工程では、多くの場合にタンパク分解酵素を剥離液として用いる。しかし、タンパク分解酵素は細胞表面の膜タンパクや細胞間接着タンパクを分解することから、細胞に損傷が与えられる。
　そこで、細胞を細胞培養容器から非侵襲的に剥離する技術として、刺激応答性ポリマーを表面に備える培養容器が開発されている。非侵襲的な刺激としては、若干の温度変化、若干のｐＨ変化、若干の塩濃度変化、糖・ペプチド・弱還元剤のような生体適合性物質の若干量の添加、光照射等があるが、特に温度変化に関して研究が進んでおり、温度応答性ポリマーを用いた温度応答性培養容器が知られている（特許文献１－４、非特許文献１）。このような温度応答性培養容器では、温度を培養温度から低下することで細胞を剥離可能である。
　しかし、従来の温度応答性培養容器は、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）（ＰＮＩＰＡＭ）誘導体等の温度応答性ポリマーを高密度で表面に固定化する必要があるため、放射線重合のような生産性の低い手法でしか製造できなかった。
　そこで、浸漬やコーティングのような簡便な手法での温度応答性培養容器の製造を可能にする、低い表面密度でも十分に細胞剥離に作用することができる温度応答性ポリマーが望まれている。また、温度変化および温度変化以外の非侵襲的な刺激の複合刺激に応答性の刺激応答性ポリマーは、細胞剥離性を向上させることができる。
特開２００８－２２０３２０ 特開２００８－２６３８６３ 特開２０１０－６３４３９ 特開２０１２－１６５７３０
Ｐｏｌｙｍｅｒｓ　２０１２，４，１４７８－１４９８
　前記の通り、従来の温度応答性培養容器では、温度応答性ポリマーが低い表面密度において細胞剥離に十分に作用することができないため、高密度で培養容器に導入しなければならず、温度応答性ポリマーを簡便な手法で培養容器へ導入することは難しかった。また、温度変化および温度変化以外の刺激に応答性の刺激応答性ポリマーは、非侵襲的な細胞剥離を可能にし、細胞剥離性を向上させることができる。よって、本発明は、非侵襲的に細胞剥離可能な培養容器の簡便な手法による製造を可能にする刺激応答性ポリマーを提供することを目的とする。
　前記課題を解決するために、本発明の刺激応答性ポリマーは、温度応答性を示す部位Ｘと、温度変化以外の刺激に対して応答性を示す部位Ｙとを構成単位として有し、温度応答性を示す部位Ｘがエーテル部分構造またはスルフィド部分構造を有し、温度変化以外の刺激に対して応答性を示す部位Ｙが水中でのｐＫａが２以上１２以下の官能基を含むことを特徴とする。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2016-176646号の開示内容を包含する。
　本発明によれば、刺激応答性ポリマーを用いて、非侵襲的に細胞剥離可能な培養容器を簡便な手法により製造できる。
　前記した以外の課題、構成及び効果は、以下の実施形態の説明により明らかにされる。
図１は、実施例における下限臨界溶解温度を示すポリマー２－２の温度応答性を示す。 図２は、実施例におけるポリマー２－２の分子量分布を示す。 図３は、実施例における細胞を剥離した際の経過を写真により示す。
　以下、図面等を用いて、本発明の実施形態について説明する。以下の説明は本発明の内容の具体例を示すものであり、本発明がこれらの説明に限定されるものではなく、本明細書に開示される技術的思想の範囲内において当業者による様々な変更および修正が可能である。また、本発明を説明するための全図において、同一の機能を有するものは、同一の符号を付け、その繰り返しの説明は省略する場合がある。
　本発明の刺激応答性ポリマーは、温度応答性を示す部位Ｘと、温度変化以外の刺激に対して応答性を示す部位Ｙとを構成単位として有する。本発明の刺激応答性ポリマーを表面に備える細胞培養容器は、温度変化および温度変化以外の刺激によって表面状態が変化することで培養された細胞の表面に対する接着性が変化し、細胞の剥離を促すことができる。特に、刺激応答性ポリマーが、培養温度において疎水性で、刺激によって親水性に変化する場合には、一般に、細胞は疎水性表面に接着しやすい傾向があるため、細胞の剥離に有利である。本発明の刺激応答性ポリマーは、温度および温度以外の刺激の両方に応答性であり、低い表面密度でも細胞剥離に十分に作用できるため、簡便な手法で培養容器に導入でき、また、優れた細胞剥離性を有する。
　温度応答性を示す部位Ｘは、温度変化に応じてポリマーの溶解性（親水性または疎水性）等の性質または構造を変化し得る部位である。例えば、部位Ｘが、温度変化に応じてポリマーの溶解性を変化させる場合、ポリマーは、下限臨界溶解温度および／または上限臨界溶解温度を示し得る。下限臨界溶解温度を示す場合には、ポリマーは、臨界温度以下で可溶であり、臨界温度超で不溶であり、また、上限臨界溶解温度を示す場合には、ポリマーは、臨界温度以上で可溶であり、臨界温度未満で不溶である。ここで、細胞の剥離に本質的に必要となる現象は、細胞が感じる表面状態の変化であるため、部位Ｘは、下限臨界溶解温度および／または上限臨界溶解温度を示してもよいし、示さなくてもよい。ポリマーにおける下限臨界溶解温度や上限臨界溶解温度はバルクの性質であって、培養容器表面に固定化された材料の分子の状態（構造、運動性、物性等の変化）とは必ずしも相関しないためである。また、培地は多種の有機物や塩を含むため、水中で下限臨界溶解温度や上限臨界溶解温度を示さない化合物が必ずしも培地中で下限臨界溶解温度や上限臨界溶解温度を示さないとは限らない。ただし、一般に、水溶液中で下限臨界溶解温度や上限臨界溶解温度を示すことは、ポリマーの溶解性が温度応答性であることの参考にすることはできる。一実施形態において、本発明の刺激応答性ポリマーは、水溶液中で下限臨界溶解温度および／または上限臨界溶解温度を示し得、好ましくは、水溶液中で下限臨界溶解温度を示し得る。また、部位Ｘが温度変化に応じて異性化する場合、温度変化に応じてポリマーの構造が変化する。
　温度応答性を示す部位Ｘが応答性を示す温度変化は、細胞に悪影響を与えない範囲内であれば特に制限はないが、例えば、培養温度（例えば、３７℃）から室温（例えば、２５℃）、２０℃または低温（例えば４℃）への降温である。
　温度応答性を示す部位Ｘは、エーテル部分構造またはスルフィド部分構造を有する。部位Ｘは、エーテル部分構造またはスルフィド部分構造を主鎖または側鎖のいずれに有していてもよい。部位Ｘは、好ましくは、エーテル部分構造またはスルフィド部分構造を２つ以上有する。この場合、各エーテル部分構造またはスルフィド部分構造は、連続して存在していてもよいし、離れて存在していてもよい。部位Ｘが、２つ以上のエーテル部分構造またはスルフィド部分構造を連続して有する場合、この部分構造は、式：－Ｏ－（ＣｎＨ２ｎ）－Ｏ－または－Ｓ－（ＣｎＨ２ｎ）－Ｓ－（式中、ｎは、例えば、１～２０であり、好ましくは、１～１０であり、より好ましくは、１～５である）で表すことができる。
　温度応答性を示す部位Ｘは、好ましくは、アルキレングリコール単位：－Ｏ－Ｒ１Ｏ－（式中、Ｒ１Ｏは、Ｒ１が直鎖または分枝のアルキレンであるオキシアルキレン基である）を有する。前記式中、Ｒ１は、好ましくは、直鎖または分枝のＣ１～Ｃ２０アルキレンであり、より好ましくは、直鎖または分枝のＣ１～Ｃ１０アルキレンであり、特に好ましくは、直鎖または分枝のＣ１～Ｃ５アルキレンである。各アルキレングリコール単位は、アルキレン部分が直鎖または分岐のいずれであってもよい。よって、例えば、プロピレングリコール単位は、１，２－プロピレングリコール単位（－Ｏ－ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２Ｏ－）および１，３－プロピレングリコール単位（－Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－）を含み、ブチレングリコール単位は、１，２－ブチレングリコール単位（－Ｏ－Ｃ（ＣＨ２ＣＨ３）ＣＨ２Ｏ－）、１，３－ブチレングリコール単位（－Ｏ－ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－）および１，４－ブチレングリコール単位（－Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－）を含む。部位Ｘは、特に好ましくは、エチレングリコール単位（－Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－）、プロピレングリコール単位、ブチレングリコール単位およびペンチレングリコール単位から選ばれる少なくとも１つを有する。
　温度応答性を示す部位Ｘは、好ましくは、２つ以上のオキシアルキレン基を有するポリアルキレングリコール部分構造：－Ｏ－（Ｒ１Ｏ）ｎ－（式中、Ｒ１は前記の通りであり、ｎは、好ましくは、１～１０００である）を有する。部位Ｘは、より好ましくは、ポリエチレングリコール部分構造、ポリプロピレングリコール部分構造、ポリブチレングリコール部分構造およびポリペンチレングリコール部分構造から選ばれる少なくとも１つを有する。
　好ましい実施形態において、温度応答性を示す部位Ｘは、式：－Ｏ－（ＣｎＨ２ｎ）－Ｏ－または－Ｓ－（ＣｎＨ２ｎ）－Ｓ－（式中、ｎは、例えば、１～２０であり、好ましくは、２～１０であり、より好ましくは、２～５である）で表される部分構造を有するか、または、ポリエチレングリコール部分構造、ポリプロピレングリコール部分構造、ポリブチレングリコール部分構造およびポリペンチレングリコール部分構造から選ばれる少なくとも１つのポリアルキレングリコール部分構造を有するものである。
　具体的には、温度応答性を示す部位Ｘは、例えば、アルキレングリコール、アルキレンジチオエーテル、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリブチレングリコール、ポリペンチレングリコール、ポリヘキシレングリコール等のポリアルキレングリコール類、ポリフェニレングリコール、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、アルキルセルロース類、ポリビニルアルコールメチルエーテルおよびポリビニルアルコールエーテル類を部分構造として有し、好ましくは、アルキレングリコール部分構造、アルキレンジチオエーテル部分構造、ポリエチレングリコール部分構造、ポリプロピレングリコール部分構造、ポリブチレングリコール部分構造およびポリペンチレングリコール部分構造である。部位Ｘは、これらの部分構造の組み合わせを有していてもよい。
　温度応答性を示す部位Ｘとして、エーテル部分構造またはスルフィド部分構造を側鎖に有するポリマーを用いることもできる。エーテル部分構造またはスルフィド部分構造を側鎖に導入することができるポリマーとしては、例えば、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）、ポリ（Ｎ－ジイソプロピルアクリルアミド）、ポリ（Ｎ－エチルアクリルアミド）、ポリ（Ｎ－ジエチルアクリルアミド）、ポリ（Ｎ－メチルアクリルアミド）、ポリ（Ｎ－ジメチルアクリルアミド）、ポリアクリルアミド、ポリ（メタクリル酸ブチル）、ポリ（メタクリル酸プロピル）、ポリ（メタクリル酸エチル）、ポリ（メタクリル酸メチル）、ポリメタクリル酸、ポリ（アクリル酸ブチル）、ポリ（アクリル酸プロピル）、ポリ（アクリル酸エチル）、ポリ（アクリル酸メチル）、ポリアクリル酸、ポリ（Ｎ－ビニルピロリドン）、ポリ（Ｎ－ビニルカプロラクタム）、ポリ乳酸、Ｎ－アシル化－ε－ポリリジン、Ｎ－アルキル化－ε－ポリリジン、γ－ポリグルタミン酸アミド誘導体およびδ－ポリアスパラギン酸アミド誘導体等を用いることができる。
　一実施形態において、温度応答性を示す部位Ｘは、両末端に原料由来の基を有する。原料由来の基は、重合可能な基であれば特に限定されずに、例えば、エポキシ基由来の基、カルボン酸基由来の基およびアミン基由来の基等である。すなわち、部位Ｘは、好ましくは、エーテル部分構造またはスルフィド部分構造と、両末端の原料由来の基とを有する。一実施形態において、部位Ｘは、エーテル部分構造またはスルフィド部分構造と、両末端の原料由来の基とからなる。
　好ましい実施形態において、温度応答性を示す部位Ｘは、下記式：
　　式：Ｌ－Ｏ－（Ｒ１Ｏ）ｎ－Ｌ’　　　　　　（Ｉ）
（式中、Ｒ１は直鎖または分枝のアルキレン基であり、ＬおよびＬ’は原料由来の基であり、ｎは１～１０００である）、
　　式：Ｌ－Ｏ－（ＣｎＨ２ｎ）－Ｏ－Ｌ’　　　　（ＩＩ）
（ｎは、例えば、１～２０であり、好ましくは、２～１０であり、より好ましくは、２～５である）、または
　　式：Ｌ－Ｓ－（ＣｎＨ２ｎ）－Ｓ－Ｌ’　　　　（ＩＩＩ）
（ｎは、例えば、１～２０であり、好ましくは、２～１０であり、より好ましくは、２～５である）
で表される。前記式（Ｉ）において、Ｒ１は、好ましくは、直鎖または分枝のＣ１～Ｃ２０アルキレンであり、より好ましくは、直鎖または分枝のＣ１～Ｃ１０アルキレンであり、特に好ましくは、直鎖または分枝のＣ１～Ｃ５アルキレンである。前記式（Ｉ）～（ＩＩＩ）において、ＬおよびＬ’は、例えば、エポキシ基由来の基、カルボン酸基由来の基およびアミン基由来の基であり、具体的には、例えば、－ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２－、－ＣＯ－または－（ＣＨ２）ＮＨ－である。
　あるいは、部位Ｘは、リジン、グルタミン酸等のアミノ酸由来部分にエーテル部分構造またはスルフィド部分構造が置換したものであってもよい。また、原料として二重結合を有するモノマーを用いた場合に形成される、側鎖にエーテル部分構造またはスルフィド部分構造を有するアルキレン部分であってもよい。
　温度応答性を示す部位Ｘは、特に好ましくは、下記のものから選ばれる少なくとも１つである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
 （式中、ａは１～１０００であり、ｂは１～５００であり、ｃは１～４００であり、ｄは１～５００であり、ｅは１～５００であり、ｇは１～５００である。）
　温度応答性を示す部位Ｘは、低分子またはポリマーのいずれでもよいが、細胞が表面状態の変化を感じるためには一定以上の分子量を有することが望ましいため、オリゴマーまたはポリマーが好ましい。部位Ｘがオリゴマーまたはポリマーである場合、部位Ｘの数平均分子量は、例えば、約３００～１００００である。
　温度応答性を示す部位Ｘは、温度以外の刺激に対しても応答性であり得る。部位Ｘが温度以外の刺激に対しても応答性であると、細胞に損傷を与えることなく細胞の剥離を促進することができ、また、温度変化以外の刺激に対して応答性を示す部位Ｙの効果を増強することができる。温度以外の刺激としては、例えば、細胞に対して非侵襲的な外的環境の変化を用いることができ、特に限定されずに、例えば、ｐＨ変化、塩濃度変化、組成変化、糖・ペプチド・弱還元剤のような生体適合性物質の添加および光照射等が挙げられる。部位Ｘは、好ましくは、温度変化に加えて、ｐＨおよび／または塩濃度の変化に対して応答性である。これらの刺激は、細胞に悪影響を与えない程度に弱い刺激であることが好ましく、例えば、部位ＸがｐＨ変化に応答性である場合、ｐＨ変化は、例えば、ｐＨ７．４からｐＨ６．５、ｐＨ７．４からｐＨ７．０またはｐＨ７．４からｐＨ８．０への若干の変化であり、また、部位Ｘが塩濃度または組成の変化に応答性である場合、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）や幹細胞用無血清培地（ＴｅＳＲ－Ｅ８）からＰＢＳ緩衝液またはＨＥＰＥＳ緩衝液への変化である。
　温度応答性を示す部位Ｘは、温度変化以外の刺激に対しても応答性を示す構造を含むことにより、または、部位Ｘに含まれるエーテル部分構造またはスルフィド部分構造が温度変化以外の刺激に対しても応答性を示すことにより、温度応答性に加えて、これらの刺激にも応答性を示すことができる。例えば、部位Ｘに含まれるエーテル部分構造またはスルフィド部分構造は、ｐＨおよび／または塩濃度の変化に応答性であり得る。また、部位Ｘは、エーテル部分構造またはスルフィド部分構造に加えて、塩やプロトン等と相互作用し得る配位性部位を含むことで、ｐＨおよび／または塩濃度の変化に応答性を示すことができる。配位性部位は、特に限定されずに、例えば、別のエーテル、別のチオエーテル、カルボン酸基、含窒素芳香族基、アミン基、カルボン酸基およびリン酸基等であるが、細胞の培養容器への非特異的な吸着を防ぐ観点からは、ポリエーテルのような構造が好ましい。
　温度変化以外の刺激に対して応答性を示す部位Ｙは、特に限定されずに、例えば、ｐＨ変化、塩濃度変化、組成変化、糖・ペプチド・弱還元剤のような生体適合性物質の添加および光照射等の細胞に対して非侵襲的な刺激に対して応答性を示す。部位Ｙは、これらの刺激によってポリマーの溶解性等の性質を変化させることで、細胞の接着または剥離に、特に細胞の剥離に作用することができる。これらの刺激は、細胞に悪影響を与えない程度に弱い刺激であることが好ましく、例えば、部位ＹがｐＨ変化に応答性である場合、ｐＨ変化は、通常、ｐＨ７．４からｐＨ６．５、ｐＨ７．４からｐＨ７．０またはｐＨ７．４からｐＨ８．０への若干の変化であり、また、部位Ｙが塩濃度または組成の変化に応答性である場合、例えば、ＤＭＥＭやＴｅＳＲ－Ｅ８からＰＢＳ緩衝液またはＨＥＰＥＳ緩衝液への変化である。部位Ｙは、好ましくは、ｐＨ、塩濃度および／または糖添加応答性であり、より好ましくは、ｐＨおよび／または塩濃度応答性であり、特にｐＨ応答性である。
　温度変化以外の刺激に対して応答性を示す部位Ｙは、用いる刺激に応じて適した構造が異なるが、部位Ｙは、水中でのｐＫａが２以上１２以下の官能基を含む。これは、刺激がｐＨ変化および／または塩濃度変化の場合に好ましい。部位Ｙの官能基の水中でのｐＫａが前記範囲内であると、水のｐＫａである１５．７以下かつ水中におけるオキソニウムイオンのｐＫａである－１．７以上の範囲内となり、さらに、細胞培養が可能なｐＨ７付近での応答性を実現することができる。部位Ｙは、水中でのｐＫａが３以上１１以下の官能基を含むことがより好ましい。ここで、本発明では、所定のｐＫａの官能基には、その共役酸または共役塩基のｐＫａがその範囲内となる官能基も含む。なお、一つの分子内に同一の官能基が複数存在する場合にはそれぞれのｐＫａが異なり得る。単独で存在する場合の水中でのｐＫａが上記範囲内に入らなくとも、複数で存在する場合に水中でのｐＫａが上記範囲内に入っていればよい。
　温度変化以外の刺激に対して応答性を示す部位Ｙが有する官能基としては、例えば、カルボン酸基（脂肪族カルボン酸、芳香族カルボン酸）、アミン基（脂肪族１級アミン基、脂肪族２級アミン基、脂肪族３級アミン基、芳香族１級アミン基、芳香族２級アミン基、芳香族３級アミン基）、イミン基、チオエーテル基、ボロン酸基（脂肪族ボロン酸基、芳香族ボロン酸基）、リン酸基（脂肪族リン酸基、芳香族リン酸基）、含窒素芳香族基（ピロール基、イミダゾリル基、ピリジル基、ピリミジル基、オキサゾリル基、チアゾリル基およびトリアゾリル基等）およびフェノール性水酸基等が挙げられるが、それらに限定されない。部位Ｙが有する官能基は、好ましくは、カルボン酸基、アミン基、チオエーテル基、ボロン酸基および含窒素芳香族基（特に、イミダゾール基）である。これらの基は、通常、水中でのｐＫａが３以上１１以下である。部位Ｙが有する官能基は、前記のものの組み合わせであってもよい。部位Ｙが有する官能基の好ましい組み合わせは、アミン基およびカルボン酸基の組み合わせ、アミン基およびチオエーテル基の組み合わせ、アミン基、チオエーテル基およびカルボン酸基の組み合わせ、ならびにアミン基および含窒素芳香族基（特に、イミダゾール基）の組み合わせである。
　温度変化以外の刺激に対して応答性を示す部位Ｙは、前記の官能基を少なくとも１つ有していればよいが、好ましくは、部位Ｙは、前記の官能基を２つ以上有し、より好ましくは、前記の官能基を２つまたは３つ有する。
　温度変化以外の刺激に対して応答性を示す部位Ｙは、好ましくは、アルキレンジアミン部分構造またはアルキルアミノチオエーテル部分構造を有し、これらは、カルボン酸基またはアミン基をさらに有していてもよく、アミノ酸（例えば、リジン、システイン、グルタミン酸等）由来部分であってもよい。
　一実施形態において、温度変化以外の刺激に対して応答性を示す部位Ｙは、好ましくは、両末端に原料由来の基を有する。原料由来の基は、重合可能な基であれば特に限定されずに、例えば、アミン基由来の基、チオール基由来の基およびカルボン酸基由来の基等である。部位Ｙにおいて、原料由来の基が、水中でのｐＫａが２以上１２以下の官能基となり得る。
　好ましい実施形態において、部位Ｙは、式：－Ｒ２－（ＣｎＨ２ｎ）－Ｒ３－（式中、Ｒ２およびＲ３は、それぞれＮＨまたはＳであり、ｎは、例えば、１～２０であり、好ましくは、１～１０であり、より好ましくは、１～５である）で表されるものであり、アルキレン部分は、カルボン酸基またはアミン基で置換されていてもよい。また、部位Ｙは、式：－ＮＨ－（ＣｎＨ２ｎ）－ＣＯ－（式中、ｎは、例えば、１～２０であり、好ましくは、１～１０であり、より好ましくは、１～５である）で表されるものであってもよく、アルキレン部分は、カルボン酸基またはアミン基で置換されていてもよい。また、部位Ｙは、リジン、システイン、グルタミン酸等のアミノ酸由来部分であってもよい。また、部位Ｙは、式：－ＣＨ２ＣＨＲ４－（式中、Ｒ４は、カルボン酸基、アミン基、ボロン酸基および含窒素芳香族基から選択され、好ましくは、ボロン酸基であり、特に好ましくは、フェニルボロン酸基である）で表されるものであってもよい。
　部位Ｙは、刺激が塩濃度変化である場合には、例えば、エーテル、チオエーテル、カルボニル基、含窒素芳香族基、アミン基、カルボン酸基およびリン酸基から選ばれる配位性部位を含む。また、刺激が糖添加である場合には、部位Ｙは、好ましくは、ボロン酸基等のような糖と反応し得る部位を含む。刺激が還元剤の添加である場合には、部位Ｙは、好ましくは、ジスルフィド等のような被還元性の部位を含む。刺激が光照射である場合には、部位Ｙは、好ましくは、アゾベンゼン、スピロピラン、ジアリールエテンおよびｏ－ニトロベンジル基等のような光応答性の部位を含む。なお、例えば、ジスルフィドのような還元により切断される官能基や、ｏ－ニトロベンジル基のような光により切断される官能基を用いる場合は、結合の切断によって生じる成分が培地中に溶け出して細胞に与える影響に留意する必要がある。
　温度変化以外の刺激に対して応答性を示す部位Ｙは、特に好ましくは、下記のものから選ばれる少なくとも１つである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
　温度変化以外の刺激に対して応答性を示す部位Ｙは、低分子またはポリマーのいずれであってもよいが、好ましくは低分子である。
　刺激応答性ポリマーにおける温度応答性を示す部位Ｘと、温度変化以外の刺激に対して応答性を示す部位Ｙとのモル比は、例えば、１０：１～１：１０であり、好ましくは５：１～１：５であり、より好ましくは３：１～１：３である。
　本発明の刺激応答性ポリマーは、温度応答性を示す部位Ｘおよび温度変化以外の刺激に対して応答性を示す部位Ｙに加えて、物性を調節する部位Ｘ’またはＹ’を有していてもよい。物性を調節する部位Ｘ’またはＹ’を有することで、ポリマーを望ましい物性に調節することができ、例えば、温度または温度以外の刺激に対する応答性を増大すること、溶解性を変化させること、電荷密度を変化させること、別の応答性を付与すること、細胞接着性を調節すること、薬物徐放性を付与すること、等が可能となる。ここで、温度または温度以外の刺激に対する応答性を増大することとは、応答性の程度を増大することや、応答可能な温度または温度以外の刺激の範囲を広くすることをいう。
　物性を調節する部位Ｘ’またはＹ’は、特に限定されずに、刺激応答性ポリマーの物性を変化させることができる物性調節部位を含むものであればよい。本発明において、部位Ｘ’は部位Ｘと類似する構造を有し、部位Ｙ’は、部位Ｙと類似する構造を有するものである。また、部位Ｘ’は、部位Ｘとして用いることができるものであってもよいが、１つのポリマーにおいて、部位Ｘ’は部位Ｘとは異なるものである。また、同様に、部位Ｙ’は、部位Ｙとして用いることができるものであってもよいが、１つのポリマーにおいて、部位Ｙ’は部位Ｙとは異なるものである。
　具体的には、例えば、部位Ｘ’またはＹ’がカルボン酸基、ボロン酸基、リン酸基、スルホン酸、アミン基、イミン基、イミダゾリル基、ピリジル基、グアニジル基、４級アンモニウム基、等を有する場合、例えば、リジン等のアミノ酸由来部分を有する場合、刺激応答性ポリマーのｐＨ変化に対する応答性を変化させることができる。部位Ｘ’またはＹ’がアゾベンゼン、スピロピラン、ジアリールエテンおよびｏ－ニトロベンジル基等の光応答性部分を含む場合、刺激応答性ポリマーの光応答性を増大することができる。部位Ｘ’またはＹ’がゼラチン、コラーゲン、ポリリジン、ＲＤＧペプチド、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、キチン、キトサン、インテグリン、カドヘリン、アルブミン、グロブリン、ヘパリン、へパラン硫酸、デキストラン硫酸、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、エラスチン等の接着性部分を含む場合、刺激応答性ポリマーの細胞接着性を調節することができる。部位Ｘ’またはＹ’がエステル結合のような加水分解可能な結合を介して生理活性物質が導入された構造を含む場合、薬物徐放性を付与することができる。
　部位Ｘ’は部位Ｘと類似する構造を有する。部位Ｘ’は、好ましくは、両末端に原料由来の基を有する。原料由来の基は、前記の部位Ｘの原料と同様である。
　部位Ｙ’は部位Ｙと類似する構造を有する。部位Ｙ’は、好ましくは、両末端に原料由来の基を有する。原料由来の基は、前記の部位Ｙの原料と同様である。
　物性を調節する部位Ｘ’またはＹ’は、特に好ましくは、下記のものから選ばれる少なくとも１つである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
　刺激応答性ポリマーにおける温度応答性を示す部位Ｘと、物性を調節する部位Ｘ’とのモル比は、例えば、１００：１～１：１０であり、好ましくは２０：１～１：５であり、温度変化以外の刺激に対して応答性を示す部位Ｙと、物性を調節する部位Ｙ’とのモル比は、例えば、１００：１～１：１０であり、好ましくは２０：１～１：５である。
　本発明の刺激応答性ポリマーは、好ましくは、水溶性である。刺激応答性ポリマーの数平均分子量は、好ましくは５００～５０００００であり、より好ましくは５００～２０００００であり、特に好ましくは５００～１０００００である。好ましい刺激応答性ポリマーは、実施例のポリマー１－１～１－４、２－１～２－７、３－１～３－４、４－１～４－４および５－１～５－４のポリマーである。
　本発明の刺激応答性ポリマーは、例えば、温度応答性を示す部位Ｘの原料と、温度変化以外の刺激に対して応答性を示す部位Ｙの原料と、場合によって物性を調節する部位Ｘ’またはＹ’の原料とを共重合することで製造できる。各部位の原料としては、モノマーまたはマクロモノマーを用いることができる。これらの原料に加えて、別のモノマーまたはマクロモノマーを共存させた状態で共重合してもよい。重合形式としては、例えば、ラジカル重合、カチオン重合、アニオン重合、配位重合、重縮合、重付加、付加縮合、開環重合およびメタセシス重合等を用いることができ、所望の構造に応じて適宜選択できる。重合形式は、好ましくは、ラジカル重合、重縮合、重付加、付加縮合および開環重合である。原料中の官能基は必要に応じて保護したものを用いてもよく、この場合、重合後に脱保護を実施した後に精製することが好ましい。
　一実施形態において、重縮合または開環重合により刺激応答性ポリマーを製造する場合、部位Ｘおよび部位Ｙの原料としては、重縮合または開環重合可能な基を両末端に有するものを用いることができる。例えば、重縮合の場合、部位Ｘおよび部位Ｙの原料として、両末端にカルボン酸基および／またはアミン基を有するものを用いることができ、具体的には、部位Ｘおよび部位Ｙの原料として、一方の末端にカルボン酸基を有し、他方の末端にアミン基を有するものを用いることができ、また、部位Ｘの原料として両末端にカルボン酸基を有するものを用い、部位Ｙの原料として両末端にアミン基を有するものを用いることもできる。部位Ｘ’および部位Ｙ’の原料は、それぞれ部位Ｘおよび部位Ｙと同様の末端基を有することが好ましい。また、開環重合の場合、例えば、部位Ｘの原料として、エポキシ基を両末端に有するものを用いることができ、部位Ｙの原料として、求核性基（例えば、アミン基またはチオール基）を両末端に有するものを用いることができる。重合条件は、用いる原料および重合方法によって適宜選択できる。
　一実施形態において、ラジカル付加重合により刺激応答性ポリマーを製造する場合、部位Ｘおよび部位Ｙの原料は、ラジカル付加重合可能な基を有しているものであればよく、例えば、二重結合を有する原料が用いられる。この場合、好ましくは、部位Ｘの原料は、側鎖にエーテル部分構造またはスルフィド部分構造を有し、また、部位Ｙの原料は、側鎖に官能基を有する。この重合方法では、部位Ｘおよび部位Ｙが順不同で結合したポリマーが得られる。重合条件は、用いる原料および重合方法によって適宜選択できる。
　あるいは、本発明の刺激応答性ポリマーは、ポリマーを原料として用い、該ポリマーの側鎖に、部位Ｘまたは部位Ｙを導入して、側鎖の全てまたは一部に部位Ｘまたは部位Ｙを導入することで製造することもできる。例えば、温度応答性を示す部位Ｘを構成単位として有するポリマーと、温度変化以外の刺激に対して応答性を示す部位Ｙの原料とを反応させて、部位Ｘを構成単位として有するポリマーの側鎖に部位Ｙを導入してもよいし、温度変化以外の刺激に対して応答性を示す部位Ｙを構成単位として有するポリマーと、温度応答性を示す部位Ｘの原料とを反応させて、部位Ｙを構成単位として有するポリマーの側鎖に部位Ｘを導入してもよい。一実施形態において、例えば、部位Ｙを構成単位として有するポリマーとしてポリリジンまたはポリグルタミン酸を用い、これらの側鎖に温度応答性を示す部位Ｘを導入することができる。この場合、部位Ｙは、それぞれ、ポリリジンまたはポリグルタミン酸の構成単位であるリジンまたはグルタミン酸となる。
　刺激応答性ポリマーの温度変化や温度変化以外の刺激に対する応答性は、一般に、該当する応答性を示す部位の導入量やポリマーの分子量に影響を受けるため、例えば、モノマー濃度、モノマー比、溶媒、反応温度および雰囲気等の重合条件を制御することによって、応答性の範囲を制御することができる。
　複数の反応部位を有する原料を用いる場合には、得られるポリマーは必ずしも直鎖状ではなく、枝分かれ状やネットワーク状になるが、機能に影響を与えない範囲内でそれらでも構わない。また、ポリマーのタクティシティや重合の位置選択性や末端官能基は、機能に影響を与えない範囲内で複数の構造の混合物であって構わず、ポリマー内の結合様式や末端構造は不問である。
　本発明は、前記の製造方法で製造された刺激応答性ポリマーも含む。よって、本発明は、部位Ｘの原料と、部位Ｙの原料と、場合によって物性を調節する部位Ｘ’またはＹ’の原料とを共重合することで得られる刺激応答性ポリマーも含む。
　本発明の刺激応答性ポリマーは、構成単位および構造に応じて、下記の式（１－１）、式（１－２）、式（１－３）または式（２－１）で表される。
式（１－１）の刺激応答性ポリマー
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 （式中、Ｘは温度応答性を示す部位であり、Ｙは温度変化以外の刺激に対して応答性を示す部位であり、Ｘはエーテル部分構造またはスルフィド部分構造を有し、Ｙは水中でのｐＫａが２以上１２以下の官能基を含み、ｎは、好ましくは、２～１０００である）。
　式（１－１）の刺激応答性ポリマーは、温度応答性を示す部位Ｘおよび温度変化以外の刺激に対して応答性を示す部位Ｙを構成単位として有する。部位Ｘおよび部位Ｙならびにそれらの好ましいものについては前記の通りである。式（１－１）の刺激応答性ポリマーは、部位Ｘと部位Ｙとが交互に結合した構造を有する。各原料の適切な組み合わせと適切な分子量を選ぶことで、目的の細胞剥離性を得ることができる。式（１－１）の刺激応答性ポリマーは、温度応答性を示す部位Ｘおよび温度変化以外の刺激に対して応答性を示す部位Ｙを有することにより、細胞に損傷を与えない弱い刺激により細胞を剥離することを可能にし、低密度でも十分に細胞剥離に作用できる。
　式（１－１）の刺激応答性ポリマーは、例えば、両末端にエポキシ基またはカルボン酸基を有する部位Ｘの原料と、両末端に求核性基を有する部位Ｙの原料とを重縮合または開環重合することにより製造できる。
式（１－２）の刺激応答性ポリマー
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 （式中、Ｘは温度応答性を示す部位であり、Ｙは温度変化以外の刺激に対して応答性を示す部位であり、Ｙ’は物性を調節する部位であり、Ｘはエーテル部分構造またはスルフィド部分構造を有し、Ｙは水中でのｐＫａが２以上１２以下の官能基を含み、Ｙ’は物性調節部位を含み、Ｙと同一ではなく、ｎは、好ましくは、１～１０００であり、ｎ’は、好ましくは、１～５００である）。
　式（１－２）のポリマーは、温度応答性を示す部位Ｘ、温度変化以外の刺激に対して応答性を示す部位Ｙおよび物性を調節する部位Ｙ’を構成単位として有する。部位Ｘ、部位Ｙおよび部位Ｙ’ならびにそれらの好ましいものについては前記の通りである。
　式（１－２）のポリマーは、温度応答性を示す部位Ｘと、温度変化以外の刺激に対して応答性を示す部位Ｙが交互に結合した構造のうち、部位Ｙの一部が、物性を調節する部位Ｙ’によって置換された構造を有する。物性を調節する部位Ｙ’を有することで、部位Ｘおよび部位Ｙのみを構成単位として有する式（１－１）のポリマーでは得ることが難しい物性を得ることができる。
　式（１－２）の刺激応答性ポリマーは、例えば、両末端にエポキシ基またはカルボン酸基を有する部位Ｘの原料と、両末端に求核性基を有する部位Ｙおよび部位Ｙ’の原料とを重縮合または開環重合することにより製造できる。
式（１－３）の刺激応答性ポリマー
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 （式中、Ｘは温度応答性を示す部位であり、Ｙは温度変化以外の刺激に対して応答性を示す部位であり、Ｘ’は物性を調節する部位であり、Ｘはエーテル部分構造またはスルフィド部分構造を有し、Ｙは水中でのｐＫａが２以上１２以下の官能基を含み、Ｘ’は物性調節部位を含み、Ｘと同一ではなく、ｎは、好ましくは、１～１０００であり、ｎ’は、好ましくは、１～５００である。）
　式（１－３）のポリマーは、温度応答性を示す部位Ｘ、温度変化以外の刺激に対して応答性を示す部位Ｙおよび物性を調節する部位Ｘ’を構成単位として有する。部位Ｘ、部位Ｘ’および部位Ｙならびにそれらの好ましいものについては前記の通りである。
　式（１－３）のポリマーは、温度応答性を示す部位Ｘと、温度変化以外の刺激に対して応答性を示す部位Ｙが交互に結合した構造のうち、温度応答性を示す部位Ｘの一部が、物性を調節する部位Ｘ’によって置換された構造を示す。物性を調節する部位Ｘ’を有することで、部位Ｘおよび部位Ｙのみを構成単位として有する式（１－１）のポリマーでは得ることが難しい物性を得ることができる。
　式（１－３）の刺激応答性ポリマーは、例えば、両末端にエポキシ基またはカルボン酸基を有する部位Ｘおよび部位Ｘ’の原料と、両末端に求核性基を有する部位Ｙの原料とを重縮合または開環重合することにより製造できる。
式（２－１）の刺激応答性ポリマー
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 （式中、Ｘは温度応答性を示す部位であり、Ｙは温度変化以外の刺激に対して応答性を示す部位であり、Ｘはエーテル部分構造またはスルフィド部分構造を有し、Ｙは水中でのｐＫａが２以上１２以下の官能基を含み、ｎは、好ましくは、１～１０００であり、ｎ’は、好ましくは、１～５００である）
　式（２－１）のポリマーは、温度応答性を示す部位Ｘおよび温度変化以外の刺激に対して応答性を示す部位Ｙを構成単位として有する。式（２－１）のポリマーは、式（１－１）のポリマーとは異なり、部位Ｘおよび部位Ｙが順不同で結合した構造を有し、例えば、ランダム共重合体およびブロック共重合体等の構造を有する。温度応答性を示す部位Ｘと、温度変化以外の刺激に対して応答性を示す部位Ｙとの結合順が重要とならない場合には、このような構造を用いることもできる。
　式（２－１）のポリマーは、例えば、部位Ｘおよび部位Ｙの各原料を用いて、ラジカル重合、カチオン重合、アニオン重合、配位重合、重縮合、重付加、付加縮合、開環重合およびメタセシス重合等により製造できる。あるいは、式（２－１）のポリマーは、部位Ｘを構成単位として有するポリマーの側鎖に部位Ｙを、または、部位Ｙを構成単位として有するポリマーの側鎖に部位Ｘを導入することによっても製造できる。
　本発明は、前記の刺激応答性ポリマーを表面に備える培養容器も含む。本発明では、刺激応答性ポリマーが低密度でも十分に機能するため、該ポリマーを簡便な方法で培養容器に導入でき、また、刺激応答性ポリマーが温度以外の刺激に対しても応答性であるため、優れた細胞剥離性を有する。
　刺激応答性ポリマーの培養容器表面への固定化は、特に限定されずに、例えば、共有結合、電荷相互作用および物理吸着等で実施することができる。生産性や耐久性を考慮すると、簡便に実施可能な、刺激応答性ポリマーの官能基と培養容器表面の官能基との共有結合形成により、刺激応答性ポリマーを培養容器表面に固定化することが好ましい。
　刺激応答性ポリマーの培養容器表面への固定化に用いる共有結合形成方法としては、特に限定されずに、例えば、アミド形成、エポキシ開環、イミン形成、マイケル型付加、エン反応、チオエン反応、ディールス－アルダー反応、ヒュスゲン反応、ネイティブケミカルリゲーション、求核付加反応、求電子付加反応およびシグマトロピー転位等が挙げられるが、生産性を考慮すると、共有結合形成方法としては、一般的な培養容器基材に存在する官能基を利用可能な反応が好ましい。一般に、培養容器基材はポリスチレン等の樹脂であり、表面の親水化処理として酸化やカチオン性ポリマーの導入が実施されることがあり、カルボン酸基やアミン基を表面官能基として有する製品が入手容易である。以上より、刺激応答性ポリマーの培養容器表面への固定化に用いる共有結合形成方法としては、アミド形成、エポキシ開環、イミン形成およびマイケル型付加等が好ましい。
　本発明は、前記の刺激応答性ポリマーを表面に備える培養容器を用いた細胞の培養方法も含む。
　本発明の培養方法では、前記培養容器に細胞の懸濁液を接触させることで前記細胞を接着培養する。細胞の懸濁液を接触させる前に、培養容器に細胞接着を促進する成分をコーティングや固定化してもよい。細胞接着を促進する成分は、例えば、ゼラチン、コラーゲン、ポリ－Ｌ－リジン、ＲＤＧペプチド、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、インテグリン、カドヘリン、膜タンパクに特異的な抗体、またはそれらの部分構造を含む分子もしくはそれらを含む分子等であるが、それらに限定されない。
　細胞培養容器の表面における刺激応答性ポリマーや細胞接着を促進する成分の表面密度は、細胞培養性や細胞剥離性に影響がある。例えば、刺激応答性ポリマーの表面密度が高過ぎる場合には、細胞接着を促進する成分が少ないために細胞を培養できず、刺激応答性ポリマーの表面密度が低すぎる場合には、細胞を剥離できないことが考えられる。ただし、これらは培養する細胞にも依存するため、実施する際には、対象の細胞に合わせた材料と表面密度を選択する必要がある。
　培養する細胞は、接着性の細胞が好ましく、例えば、線維芽細胞、間葉系幹細胞、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞および脱分化細胞等であるが、それらに限定されない。なお、培養する細胞によって、上記の細胞接着を促進する成分は適切に選択する必要がある。
　本発明の刺激応答性ポリマーを表面に備える培養容器で細胞を接着培養した後に、培養容器表面に適切な刺激を与えることで、細胞を剥離することができる。適切な刺激とは、細胞に対して非侵襲的な外的環境の変化のことであり、例えば、培地の温度、ｐＨ、塩濃度、化学ポテンシャル、酸化還元電位または細胞が暴露される光強度の変化等である。よって、本発明は、培養容器に細胞が接着している状態に対して、培地の温度、ｐＨ、塩濃度、化学ポテンシャル、酸化還元電位または細胞が暴露される光強度を変化させるプロセスを含む細胞剥離方法も含む。温度や液性の因子（ｐＨ、物質添加等）を刺激として用いる場合には、それらを含む剥離液を添加することで、簡便に細胞を剥離することができる。剥離液を添加する前に、培地を取り除いても取り除かなくてもよい。培養条件は、培養する細胞によって適正な条件が異なるが、一般的な培養条件を用いることができる。本発明の細胞剥離方法は、細胞に損傷を与えることなく細胞を剥離することができるため、優れた細胞生存率が達成される。
　細胞剥離方法における温度変化は、培養可能な温度範囲内での温度変化であればよく、例えば、３７℃から４℃、３７℃から２０℃、３７℃から２５℃への温度変化等であるが、これらに限定されない。細胞剥離方法におけるｐＨ変化は、短期的には細胞に悪影響を与えない範囲内でのｐＨ変化であればよく、例えば、ｐＨ７．４からｐＨ６．５、ｐＨ７．４からｐＨ７．０、ｐＨ７．４からｐＨ８．０へのｐＨ変化等であるが、これらに限定されない。細胞剥離方法における塩濃度変化は、短期的には細胞に悪影響を与えない範囲内での塩濃度変化のことである。この塩濃度は、溶液全体の塩濃度でもよいし、特定の物質の塩濃度でもよく、例えば、培地からＰＢＳ緩衝液への変化、培地からＨＥＰＥＳ緩衝液への変化、培地から別の培地への変化等であるが、これらに限定されない。ただし、これらの際に細胞への損傷を防ぐ観点から、浸透圧は大きく変えないことが望ましい。
　以下、実施例を示して本発明について具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれに限定されるものではない。
本発明の刺激応答性ポリマーを調製した。以下のポリマー調製において記載したモル当量は仕込み時のモル当量であり、また、部位Ｘに対応する原料に対する各原料のモル当量である。また、原料中の官能基は必要に応じて保護したものを用い、この場合、重合後に脱保護を実施した後に精製した。
＜ポリマー１－１～１－４の調製＞
　部位Ｘに対応する両末端にエポキシ基を有する原料と、部位Ｙに対応する２つ以上の求核部位を有する原料を重合に用いて式（１－１）で表されるポリマー１－１～１－４を調製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
　ポリマー１－１は、ＰＥＧ２０００－ジグリシジルエーテルと１，４－ブタンジアミン（１．２モル当量）の水－エタノール（１：１）溶液を６０℃で２時間加熱することで重合させた。得られたポリマーを再沈または透析（ＭＷＣＯ１０００）により精製し、凍結乾燥によって粉末化してポリマー１－１を得た。ポリマー１－１の数平均分子量は約４００００であった。
　ポリマー１－２は、ＰＰＧ６４０－ジグリシジルエーテルおよびエチレンジアミン（１．２モル当量）から、ポリマー１－１と同様にして調製した。ポリマー１－２の数平均分子量は約３００００であった。ポリマー１－２はダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で下限溶解臨界温度を示すことが確認された。
　ポリマー１－３は、ＰＢＧ４００－ジグリシジルエーテルおよびエチレンジアミン（１．４モル当量）から、ポリマー１－１と同様にして調製した。ポリマー１－３の数平均分子量は約２００００であった。
　ポリマー１－４は、ｒａｎｄ－ＰＥＧ／ＰＰＧ１０００－ジグリシジルエーテルおよびリジン（１．４モル当量）から、ポリマー１－１と同様にして調製した。ポリマー１－４の数平均分子量は約１００００であった。
　表１にポリマー１－１～１－４の構造を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
 （式中、ａは１～１０００であり、ｂは１～５００であり、ｃは１～４００であり、ｄは１～５００であり、ｅは１～５００である。）
＜ポリマー２－１～２－７の調製＞
　部位Ｘに対応する両末端にエポキシ基を有する原料と、部位Ｙまたは部位Ｙ’に対応する２つ以上の求核部位を有する原料を重合に用いて式（１－２）で表されるポリマー２－１～２－７を調製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
　ポリマー２－１は、ＰＥＧ２０００－ジグリシジルエーテル、１，４－ブタンジアミン（０．８モル当量）およびシステイン（０．８モル当量）から、ポリマー１－１と同様にして調製した。ポリマー２－１の数平均分子量は約４００００であった。
　ポリマー２－２は、ＰＰＧ６４０－ジグリシジルエーテル、エチレンジアミン（１．２モル当量）およびリジン（０．４モル当量）から、ポリマー１－１と同様にして調製した。ポリマー２－２はＤＭＥＭ中で下限溶解臨界温度を示すことが確認された。図１に、ポリマー２－２の水溶液中での温度応答性を温度可変光透過度測定により測定した結果を示す。図１より、ポリマー２－２は水溶液中で下限臨界溶解温度を示すことが確認された。ポリマー２－２の数平均分子量は約３００００であった。図２にポリマー２－２の分子量分布を示す。
　ポリマー２－３は、ＰＰＧ６４０－ジグリシジルエーテル、エチレンジアミン（１．２５モル当量）および４，４’－ジアミノアゾベンゼン（０．２５モル当量）から、ポリマー１－１と同様にして調製した。ポリマー２－３の数平均分子量は約２００００であった。ポリマー２－３はＤＭＥＭ中で下限溶解臨界温度を示すことが確認された。
　ポリマー２－４は、ｒａｎｄ－ＰＥＧ／ＰＰＧ１０００－ジグリシジルエーテル、エチレンジアミン（１．２モル当量）およびリジン（０．４モル当量）から、ポリマー１－１と同様にして調製した。ポリマー２－４の数平均分子量は約４００００であった。
　ポリマー２－５は、ブチレングリコールジグリシジルエーテル、システイン（１．５モル当量）およびω，ω’－ジチオール－ＰＮＩＰＡＭ（０．３モル当量）から、ポリマー１－１と同様にして調製した。ポリマー２－５の数平均分子量は約５００００であった。ポリマー２－５はＤＭＥＭ中で下限溶解臨界温度を示すことが確認された。
　ポリマー２－６は、ＰＥＧ２０００－ジグリシジルエーテル、１，４－ブタンジアミン（１．６モル当量）およびε－ポリリジン（０．１６モル当量）から、ポリマー１－１と同様にして調製した。ポリマー２－６の数平均分子量は約１０００００であった。
　ポリマー２－７は、ＰＰＧ６４０－ジグリシジルエーテル、エチレンジアミン（１．６モル当量）およびゼラチン（０．１６モル当量）から、ポリマー１－１と同様にして調製した。ポリマー２－７の数平均分子量は約１０００００であった。ポリマー２－７はＤＭＥＭ中で下限溶解臨界温度を示すことが確認された。
　表２にポリマー２－１～２－７の構造を示す。表２中、［Ｙ］：［Ｙ’］は合成時の仕込みモル比を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
 （式中、ａは１～１０００であり、ｂは１～５００であり、ｃは１～４００であり、ｄは１～５００であり、ｅは１～５００である。）
＜ポリマー３－１～３－４の調製＞
　部位Ｘまたは部位Ｘ’に対応する両末端にエポキシ基を有する原料と、部位Ｙに対応する２つ以上の求核部位を有する原料を重合に用いて式（１－３）で表されるポリマー３－１～３－４を調製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
　ポリマー３－１は、ＰＥＧ２０００－ジグリシジルエーテル、ブチレングリコールジグリシジルエーテル（０．５モル当量）およびシステイン（１．５モル当量）から、ポリマー１－１と同様にして調製した。ポリマー３－１の数平均分子量は約４００００であった。
　ポリマー３－２は、ＰＥＧ２０００－ジグリシジルエーテル、オクタフルオロデカンビスオキシド（０．０５モル当量）および１，４－ブタンジアミン（１．５モル当量）から、ポリマー１－１と同様にして調製した。ポリマー３－２の数平均分子量は約４００００であった。
　ポリマー３－３は、ＰＥＧ２０００－ジグリシジルエーテル、ＰＢＧ１０００－ジグリシジルエーテル（２モル当量）およびエチレンジアミン（４．８モル当量）から、ポリマー１－１と同様にして調製した。ポリマー３－３の数平均分子量は約４００００であった。
　ポリマー３－４は、ＰＰＧ６４０－ジグリシジルエーテル、ブチレングリコールジグリシジルエーテル（０．３３モル当量）およびエチレンジアミン（２モル当量）から、ポリマー１－１と同様にして調製した。ポリマー３－４の数平均分子量は約３００００であった。
　表３にポリマー３－１～３－４の構造を示す。表３中、［Ｘ］：［Ｘ’］は合成時の仕込みモル比を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
 （式中、ａは１～１０００であり、ｂは１～５００であり、ｃは１～４００である。）
＜ポリマー４－１～４－４の調製＞
　部位Ｘまたは場合によってＸ’に対応する両末端にカルボン酸を有する原料と、部位Ｙまたは場合によってＹ’に対応する両末端にアミンを有する原料を用いて、脱水縮合反応による重合によって、前記の式（１－１）、式（１－２）または式（１－３）で表されるポリマーを調製した。
　ω，ω’－ジカルボキシルＰＥＧ１０００およびスペルミジン（１．５モル当量）を水－エタノール（１：１）溶媒中で１．２当量の縮合剤ＤＭＴ－ＭＭと撹拌することで重合を実施しポリマーを得た。得られたポリマーを再沈または透析（ＭＷＣＯ１０００）により精製し、凍結乾燥によって粉末化してポリマー４－１を得た。ポリマー４－１の数平均分子量は約２００００であった。
　ポリマー４－２は、３，５－ジチアオクタン－１，８－ジカルボン酸、スペルミジン（１．５モル当量）および１，４－ブタンジアミン（０．３モル当量）から、ポリマー４－１と同様にして調製した。ポリマー４－２の数平均分子量は約５０００であった。
　ポリマー４－３は、ω，ω’－ジカルボキシルＰＥＧ１０００、ω，ω’－ジカルボキシルＰＰＧ６４０（２モル当量）およびカルボキシル基が保護されたリジン（４．８モル当量）から、ポリマー４－１と同様にして調製した。ポリマー４－３の数平均分子量は約１００００であった。
　ポリマー４－４は、ω，ω’－ジアミノＰＰＧ６４０およびアミノ基が保護されたグルタミン酸（１．５モル当量）から、ポリマー４－１と同様にして調製した。ポリマー４－４の数平均分子量は約１００００であった。
　表４にポリマー４－１～４－４の構造を示す。表４中、［Ｘ］：［Ｘ’］および［Ｙ］：［Ｙ’］は合成時の仕込みモル比を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
＜ポリマー５－１～５－４の調製＞
　脱水縮合反応またはラジカル付加反応を重合に用い、式（２－１）で表されるポリマーを調製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
　ブトキシエトキシ酢酸とε－ポリリジンを水中で１．２当量のＤＭＴ－ＭＭと撹拌することで、ε－ポリリジンの側鎖にブトキシエトキシ酢酸アミド部分を導入した。得られたポリマーを再沈または透析により精製し、凍結乾燥によって粉末化してポリマー５－１を得た。ポリマー５－１の数平均分子量は約６０００であった。
　Ｎ，Ｎ－ビス（エトキシエチル）アミンとポリ－γ－グルタミン酸を水中で１．２当量のＤＭＴ－ＭＭと撹拌することで、ポリ－γ－グルタミン酸の側鎖にＮ，Ｎ－ビス（エトキシエチル）アミド部分を導入した。得られたポリマーを再沈または透析により精製し、凍結乾燥によって粉末化してポリマー５－２を得た。ポリマー５－２の数平均分子量は約１００００であった。
　末端にそれぞれカルボン酸基とアミン基を有するＰＰＧ６４０誘導体およびヒスチジンを水－エタノール（１：１）溶媒中で１．２当量のＤＭＴ－ＭＭと撹拌することで重合を実施した。得られたポリマーを再沈または透析により精製し、凍結乾燥によって粉末化してポリマー５－３を得た。ポリマー５－３の数平均分子量は約２００００であった。
　炭素－炭素二重結合を有する２種類のモノマー、ビニル（ジエチレングリコール）エーテルおよびスチレンボロン酸とＡＩＢＮ（０．０１当量）の混合物をアセトン中で６０℃に加熱することで重合を実施した。得られたポリマーを再沈または透析（ＭＷＣＯ１０００）により精製し、凍結乾燥によって粉末化してポリマー５－４を得た。ポリマー５－４の数平均分子量は約５０００であった。
　表５にポリマー５－１～５－４の構造を示す。表５中、［Ｘ］：［Ｙ］は合成時の仕込みモル比を示している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
＜培養容器の作製＞
実施例１～７の培養容器
　前記で得られたポリマーの代表例について、ポリマーを培養容器表面に導入して、該ポリマーを表面に備える培養容器を作製した。
　表面官能基としてカルボン酸基を有するポリスチレン製６ウェルディッシュに、１重量％のＥＤＣ・ＨＣｌ溶液（ｐＨ５．８）を４０℃で２時間作用させた。その後、６ウェルディッシュをｐＨ５．８緩衝溶液で洗浄し、０．１重量％の１級または２級アミン基を有するポリマー（ポリマー１－１、２－２、３－３、４－４）の溶液（ｐＨ５．８）を４０℃で１２時間作用させた。その後、６ウェルディッシュをｐＨ７．４のＰＢＳで洗浄した後に純水で洗浄し、乾燥し、紫外線滅菌して実施例１～４の培養容器をそれぞれ作製した。
　また、表面官能基としてアミン基を有するポリスチレン製６ウェルディッシュに、カルボン酸基を有するポリマー（ポリマー１－４、２－４、５－２）を０．１重量％とＤＭＴ－ＭＭを１重量％含むｐＨ５．８緩衝溶液を４０℃で２時間作用させた。その後、６ウェルディッシュをｐＨ７．４のＰＢＳで洗浄した後に純水で洗浄し、乾燥し、紫外線滅菌して実施例５～７の培養容器を作製した。
比較例１～９の培養容器
　比較例１～５の培養容器は、温度応答性を示す部位Ｘを含まないポリマーとして、ε－ポリリジン、ポリ－γ－グルタミン酸、ポリビニルアミン、アミン末端ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）またはゼラチン（それぞれポリマー６－１、６－２、６－３、６－４または６－５とする）を実施例１～４の培養容器と同様にして培養容器表面へ導入して作製した。
　比較例６および７の培養容器は、温度変化以外の刺激に対して応答性を示す部位Ｙを含まない化合物として、ポリエチレングリコールまたはポリプロピレングリコール（それぞれポリマー６－６または６－７とする）を、前記の実施例の培養容器と同様にして培養容器表面へ導入して作製した。
　表６にポリマー６－１～６－７の化合物名または構造を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
　比較例８の培養容器として、表面にポリマー修飾がされていない、表面官能基としてカルボン酸基を有する無処理の培養容器（実施例１～４および比較例１～５で用いた培養容器）を用いた。また、比較例９の培養容器として、表面にポリマー修飾がされていない、表面官能基としてアミン基を有する無処理の培養容器（実施例５～７で用いた培養容器）を用いた。
＜培養・剥離試験＞
　実施例１～７の培養容器および比較例１～９の培養容器を用いて細胞の培養および剥離試験を実施した。
　細胞の培養および剥離試験は以下のようにして行った：
　一般的なプロトコルにて培養容器表面をラミニンコートし、ｉＰＳ細胞を培養容器に播種し、ＣＯ２インキュベータ中で７日間培養した。培地等は一般的なフィーダーレス用の条件に従った。その後、培養容器をＣＯ２インキュベータから取り出し、培地を所定の剥離液と交換し、室温で静置した。一定時間の後に、培養容器内を軽くピペッティングすることで撹拌したところ、細胞が剥離した。剥離しなかった細胞は酵素処理にて完全に剥離し計数し、刺激応答にて剥離した細胞数と足し合わせることで全細胞数とし、剥離率（全細胞数に対する刺激応答にて剥離した細胞数の比率）の計算に用いた。結果を表７に示す。また、図３に、実施例の培養容器の１つについて、細胞剥離試験の経過を写真で示す（培養時→剥離液（ＰＢＳ）添加５分後→ピペッティング後）。なお、培養容器１～７にて培養したｉＰＳ細胞の未分化状態をＡＬＰ染色にて確認したところ、コロニー全てが青色に染色され、目視で未分化率は少なくとも９０％以上であることが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
　表７より、実施例１～７の培養容器では、いずれも剥離された細胞の生存率は８５％以上であった。一方、比較例１～９の培養容器では、いずれも剥離された細胞の生存率は非常に低かった。本発明のポリマーを用いた培養容器では、剥離された細胞の生存率が顕著に向上し、本発明のポリマーが細胞培養方法および細胞剥離方法において非常に有用であることがわかった。
＜細胞毒性評価＞
　ポリマー２－２の細胞毒性を評価するため、一般的なプロトコルにてｉＰＳ細胞を培養する際に培地にポリマーを添加する検討を実施した（実施例８）。培養容器表面からポリマーが全てリーチングすると、培地中のポリマー濃度は最大でも１μｇ／ｗｅｌｌ程度であると考えられる。そこで本評価では、ポリマー２－２を推定最大値の２倍である２μｇ／ｗｅｌｌの濃度で培地に添加した状態で培養を実施した。その結果、ポリマーを含まない通常の培地では、６日目に増殖率６８倍、生存率９１％であったのに対し、ポリマーを２μｇ／ｗｅｌｌで添加した培地では、６日目に増殖率６３倍、生存率９５％であり、通常の培地と同等の結果であった。このことから、培養容器に固定化する用途において本発明のポリマーに由来する細胞毒性はないことがわかった。
＜ポリマー固定化条件およびラミニン処理条件の検討＞
　ポリマー２－２において、ポリマー固定化とラミニン処理条件のロバスト性に関して検討した（実施例９）。
　ＥＤＣ・ＨＣｌ活性化後の６ウェルディッシュに加えるポリマーの濃度を０．１～０．０１重量％の範囲で、ラミニン添加条件を通常濃度～通常濃度の１／１０の範囲で変更し、ｉＰＳ細胞を用いて実施例２と同様の検討を実施した。その結果、検討した範囲内では、細胞の増殖率、刺激応答による細胞の剥離率、生存率、はほぼ同等であり、ロバスト性が確認された。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (10)

  1. 　温度応答性を示す部位Ｘと、温度変化以外の刺激に対して応答性を示す部位Ｙとを構成単位として有する刺激応答性ポリマーであって、温度応答性を示す部位Ｘがエーテル部分構造またはスルフィド部分構造を有し、温度変化以外の刺激に対して応答性を示す部位Ｙが水中でのｐＫａが２以上１２以下の官能基を含む、前記刺激応答性ポリマー。
  2. 　温度応答性を示す部位Ｘがエーテル部分構造またはスルフィド部分構造を２つ以上有する、請求項１に記載の刺激応答性ポリマー。
  3. 　温度応答性を示す部位Ｘが、ポリエチレングリコール部分構造、ポリプロピレングリコール部分構造、ポリブチレングリコール部分構造およびポリペンチレングリコール部分構造から選ばれる少なくとも１つを有する、請求項２に記載の刺激応答性ポリマー。
  4. 　温度変化以外の刺激に対して応答性を示す部位Ｙが、水中でのｐＫａが３以上１１以下の官能基を含む、請求項１に記載の刺激応答性ポリマー。
  5. 　温度変化以外の刺激に対して応答性を示す部位Ｙが、カルボン酸基、アミン基、イミン基、チオエーテル基、ボロン酸基、リン酸基、含窒素芳香族基およびフェノール性水酸基から選ばれる少なくとも１つを有する、請求項４に記載の刺激応答性ポリマー。
  6. 　物性を調節する部位Ｘ’またはＹ’をさらに有する、請求項１に記載の刺激応答性ポリマー。
  7. 　水溶液中で下限臨界溶解温度を示し得る、請求項１に記載の刺激応答性ポリマー。
  8. 　請求項１～７のいずれか１項に記載の刺激応答性ポリマーを表面に備える培養容器。
  9. 　請求項８に記載の培養容器に細胞の懸濁液を接触させることで前記細胞を接着培養する培養方法。
  10. 　請求項８に記載の培養容器に細胞が接着している状態に対して、培地の温度、ｐＨ、塩濃度、化学ポテンシャル、酸化還元電位または細胞が暴露される光強度を変化させるプロセスを含む細胞剥離方法。
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