JP2013144647A - 多重刺激応答型高分子及びその製造方法 - Google Patents
多重刺激応答型高分子及びその製造方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2013144647A JP2013144647A JP2012004852A JP2012004852A JP2013144647A JP 2013144647 A JP2013144647 A JP 2013144647A JP 2012004852 A JP2012004852 A JP 2012004852A JP 2012004852 A JP2012004852 A JP 2012004852A JP 2013144647 A JP2013144647 A JP 2013144647A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- amino acid
- side chain
- peptide
- polymer
- functional group
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Landscapes
- Medicinal Preparation (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Addition Polymer Or Copolymer, Post-Treatments, Or Chemical Modifications (AREA)
Abstract
Description
このような刺激応答型高分子としては、ポリ(N−イソプロピルアクリルアミド)(PNIPAAm)が知られており、このものは、32℃を境に可逆的に相転移を示す(例えば、非特許文献1,2参照)。すなわち、溶液温度が32℃を超えるとPNIPAAmは凝集して溶解性を失う(このように、低温で溶解していた高分子が温度の上昇により相分離を起こす温度をLCST又は下限臨界溶解温度という)。しかし、PNIPAAmのLCSTは一定であり、変えることができないという欠点があった。
そこで、pH応答型のポリアクリル酸(PAA)などにN−イソプロピルアクリルアミド(NIPAAm)をグラフト鎖として導入することにより、LCSTをpHで制御することも検討されている(例えば、非特許文献3参照)。この方法によれば、LCSTをpHで制御することが可能であるが、pHの変化に対するLCSTの変化は僅かであり、十分なものではなかった。
さらに、PNIPAAmは生分解性ではないので、生体材料としての応用にも限界があった。
その過程において、まず、側鎖としてイオン性官能基(本発明において、「適当な外部pH域においてイオン化し得る官能基」と定義する)を導入することでpH応答性を発現させることを検討し、加えて、このpH応答性に対して高感度の温度応答性を導入するための更なる検討を行った。そして、生体適合性を考慮し生体由来のエラスチンタンパクに着目して、そのVPGVG(Vはバリン残基、Pはプロリン残基、Gはグリシン残基を表し、本発明においては、それぞれ、Val、Pro、Glyと記する場合もある)という特徴的なアミノ酸配列を手本にしてエラスチン類似ペプチドを系統的に合成するとともに、高分子の側鎖として、前記イオン性官能基に加えて、前記エラスチン類似ペプチドを導入することで、高感度のpH及び温度応答性が発現されること、及び、前記アミノ酸配列におけるバリン残基を他のα−アミノ酸残基に置換すると、優れた多重刺激応答性を損なうことなく、応答pH域及び応答温度域を変えることができることをも見出した。
すなわち、本発明にかかる多重刺激応答型高分子は、イオン性官能基を含む第1の側鎖と、下記(1)で表されるアミノ酸配列を構成単位とするペプチド構造を含む第2の側鎖とを少なくとも有することを特徴とする。
本発明にかかる多重刺激応答型高分子は、以下に詳述する第1の側鎖と第2の側鎖とを少なくとも有するものである。
第1の側鎖は、イオン性官能基を含むものである。このイオン性官能基は、外部pHが変動したときに可逆的にイオン化するが、イオン化した際には、各イオン間で電荷による反発が生じる。この外部pHに依拠したイオン間反発の有無により、高分子にpH応答性を与える。
第2の側鎖は、下記(1)で表されるアミノ酸配列を構成単位とするペプチド構造を含むものである。この第2の側鎖は、エラスチン類似の前記特定のペプチド構造を含むことにより、外部温度に応じて、ランダムコイルとβ−ターン構造の構造転移を示し、これにより、高分子に温度応答性を与える。
なお、上記(1)では、便宜上、X1を左末端に、Glyを右末端に表示しているが、これはN末端側がX1、C末端側がGlyでなければならないという意味ではない。すなわち、前記アミノ酸配列を構成するα−アミノ酸単位のいずれがN末端側にあってもよく、例えば、GlyがN末端側にあって、C末端側に向けて、順にX2,Gly,X1,Proが結合している場合も、上記(1)は含んでいる。
本発明にかかる多重刺激応答型高分子は第1の側鎖と第2の側鎖とを少なくとも有するものであればよく、本発明の効果を害しない範囲であれば、第1の側鎖及び第2の側鎖以外の側鎖を有していても良い。第1の側鎖と第2の側鎖の割合については特に限定するわけではないが、例えば、モル比において、両者の合計を100としたとき、第2の側鎖の割合が15以上100未満であることが好ましい。いずれかが過剰でありすぎると、多重刺激応答性が十分に得られにくくなるおそれがある。
nは高分子の重合度を表しており、特に限定するわけではないが、50〜15000の範囲であることが好ましい。
上式(2)において、第2の側鎖における括弧内の特定のアミノ酸配列は、上記(1)に記載の表現で言えば、X1をN末端側に有し、C末端側に向けて、順に、Pro,Gly,X2,Glyが結合しているものである。R1、R2は、前記(1)におけるα−アミノ酸残基X1、X2の種類によって自動的に定まるα−アミノ酸側鎖であって、例えば、バリン残基であればイソプロピル基であり、アラニン残基であればメチル基であり、イソロイシン残基であればsec−ブチル基である。
mは、上記特定のアミノ酸配列の繰り返し数であり、特に限定するわけではないが、上述したように、1〜8の範囲であることが好ましく、3〜5の範囲であることがより好ましい。
上記(2)で示される上記多重刺激応答型高分子では、スペーサーとしてアミノ酸が用いられている。すなわち、Yは、スペーサーとなるアミノ酸のアミノ酸残基に由来する構造部分であり、このような任意のアミノ酸残基としては特に限定されないが、例えば、β−アラニン残基(−Y−=−CH2−CH2−)などが好ましく挙げられる。
上述した本発明の多重刺激応答型高分子は、例えば、以下に詳述する本発明の製造方法により容易に製造することができる。
R1及びR2はそれぞれα−アミノ酸残基の種類に応じて自動的に定まるα−アミノ酸側鎖である。
また、スペーサーがジオール、ジアミンなどであれば、これを介して、カルボキシル基を側鎖に有する高分子の該カルボキシル基とペプチドのC末端とを連結することができる。
さらに、スペーサーがジカルボン酸などであれば、これを介して、アミノ基を側鎖に有する高分子の該アミノ基とペプチドのN末端とを連結することができる。
このように、高分子が有するイオン性官能基の種類や用いるスペーサーの種類により種々の態様が有り得る。
このうち、アミノ酸をスペーサーとして用い、これを介して、カルボキシル基を側鎖に有する高分子の該カルボキシル基とペプチドのN末端、あるいは、アミノ基を側鎖に有する高分子の該アミノ基とペプチドのC末端とを連結するか、または、ジエチレングリコールをスペーサーとして用い、これを介して、カルボキシル基を側鎖に有する高分子の該カルボキシル基とペプチドのC末端とを連結することが好ましい。
但し、第2の側鎖がイオン性官能基を有していると第1の側鎖との電荷による相互作用が生じて、多重刺激応答性の制御が複雑化するおそれがあるので、上式(3)で表されるペプチドはC末端がアミド化され、上式(4)で表されるペプチドはN末端がアセチル化されている。
上式(3)で表されるペプチドにおけるC末端のアミド化は、例えば、ペプチドアミン用レジンを担体として用いることで得ることができる。このようなペプチドアミン用レジンとしては、例えば、Fmoc−NH−SAL−MBHA樹脂、CLEAR−Amide樹脂などが知られている。
また、上式(4)で表されるペプチドにおけるN末端のアセチル化は、例えば、N末端に無水酢酸を作用させることで容易に行うことができ、具体的には、アセチル化を行う対象となるペプチドの溶液に対し、無水酢酸溶液、DIPC(ジイソプロピルカルボジイミド)溶液、HOAt( 1−ヒドロキシベンゾトリアゾール)溶液を加え、撹拌混合する方法などが挙げられる。この場合、溶媒としては、例えば、N,N−ジメチルホルムアミド(DMF)などが好適である。
前記縮合反応は、特に限定するわけではないが、例えば、0〜60℃の範囲の温度で、1〜48時間程度行うことができる。
例えば、カルボキシル基やアミノ基などのイオン性官能基を有する単量体と、上記所定のペプチド鎖を有する単量体を別々に調製し、これらを共重合することにより得ることができる。この場合、共重合は、ランダム共重合でもブロック共重合でも良いが、ランダム共重合がより好ましい。ブロック共重合の場合、得られる多重刺激応答型高分子は、イオン性官能基を有する第1の側鎖同士が近接し、また、ペプチド構造を有する第2の側鎖同士が近接したものとなるので、両側鎖の挙動が個別に現れてしまって、これらの相乗作用に基づく所望の多重刺激応答性が得られなくなるおそれがあるからである。
本発明の多重刺激応答型高分子は、pH及び温度に応じて相転移を示すことから、DDS、細胞足場材料、アクチュエーター、分離材料などとして好適に利用することができる。
下記合成経路1に従い、合成例1〜3にかかるエラスチン類似ペプチド(ELP)を合成した。
以下に詳述するようにして、上記合成経路1に記載の最終生成物において、X=Valである合成例1のELPを得た。
すなわち、まず、Fmoc−NH−SAL−MBHA樹脂1.5g(0.67mmol/g)をDMF15mLにより一晩膨潤させた。このFmoc−NH−SAL−MBHA樹脂に対して、下記(1)脱保護基及び(2)アミノ酸鎖の伸長を逐次行った。
Fmoc基を除去するため、ピペリジン/DMF(体積比=1/4)15mLを加え撹拌した。この操作を3分×2回、20分×1回行った。その後、DMFで溶液が中性になるまで洗浄を繰り返した。
伸長したいアミノ酸鎖に応じたFmoc−アミノ酸のDMF溶液(7mL)、DIPC:0.38g(3.02mmol)のDMF溶液(3mL)、HOAt:0.42g(3.02mmol)のDMF溶液(5mL)を加え、2時間撹拌することで所望のFmoc−アミノ酸鎖を縮合結合した。縮合後、DMFにより洗浄し、未反応のFmoc−アミノ酸を除去した。Fmoc−アミノ酸の使用量は、それぞれ、Fmoc−Gly−OH:0.9g(3.02mmol)、Fmoc−Val−OH:1.02g(3.02mmol)、Fmoc−Pro−OH:1.01g(3.02mmol)とした。
Fmoc−アミノ酸の一つとしてFmoc−Ile−OH:1.07g(3.02mmol)を用いたこと以外は合成例1と同様にして、上記合成経路1に記載の最終生成物において、X=Ileである合成例2のELPを得た。
Fmoc−アミノ酸の一つとしてFmoc−Ala−OH:0.99g(3.02mmol)を用いたこと以外は合成例1と同様にして、上記合成経路1に記載の最終生成物において、X=Alaである合成例3のELPを得た。
下記合成経路2に従い、実施例1〜5にかかる多重刺激応答型高分子を合成した。
以下に詳述するようにして、上記合成経路2に記載の最終生成物において、x=36、X=Valである実施例1の多重刺激応答型高分子を得た。
すなわち、まず、ナスフラスコ内で前記合成例1のエラスチン類似ペプチド0.80g(0.46mmol)をDMFに溶解させ、さらに、トリフルオロ塩を除去するためにトリエチルアミン77μl(0.576mmol)を加えた。
ここに、重量平均分子量25万のポリアクリル酸(PAA)0.083g(0.00035mmol)を溶解させた。溶解後、縮合剤としてDMT−MM0.45g(1.44mmol)を用いて、DMF30ml中で縮合を行った。縮合は、室温で24時間行った。縮合後は、DMFを減圧除去し、超純水に溶解後、蒸留水中4℃下で分画分子量12000〜14000の透析膜を用いて透析を行い、未反応のペプチドおよび縮合剤を除去することで精製を行った。精製確認はUV−visスペクトルにより行った。具体的には、蒸留水を交換する際に透析後の外液を測定し、ペプチドのカルボニル基のπ−π*遷移に基づく198nm付近のピークが消失したことから確認した。透析後、目的物の水溶液を凍結乾燥させることで実施例1の多重刺激応答型高分子を得た。この多重刺激応答型高分子について1H−NMRスペクトルにより構造確認を行いグラフト率x=36(%)と算出した。
実施例1において、合成例1のエラスチン類似ペプチドに代えて、合成例2,3のエラスチン類似ペプチドを用いるとともに、各仕込み量を表1に示す量としたこと以外は同様にして、ペプチド鎖の構成アミノ酸残基及びグラフト率が異なる実施例2,3にかかる多重刺激応答型高分子を得た。また、実施例1において、各仕込み量を表1に示す量としたこと以外は同様にして、グラフト率の異なる実施例4,5にかかる多重刺激応答型高分子を得た。
<濁度測定による多重刺激応答性の評価>
(濁度の測定方法)
多重刺激応答性の評価は、濁度を測定することにより行い、この濁度測定は日本分光社製J−820型を用いて行った。光路長1cmの石英セルを用いるようにし、また、温度変化は日本分光社製PTC−423L型ペルチェ式恒温装置とLAUDA社製E200を用い、温度勾配1℃/minで行った。各温度での濁度は700nmの吸光度から求め、濁度が50%変化したときの温度をLCSTと定義した。
実施例1の多重刺激応答型高分子を用い、これを、所定のpHの50mM、Na2HPO4/クエン酸緩衝溶液に溶解させてサンプル(高分子濃度=1wt%)を調製した。上記方法に従って、一定pH下(pH3.3)での濁度の温度依存性を測定した。同様にして、pH3.9,pH4.2,pH4.9,pH5.4,pH5.9,pH6.4のそれぞれについても測定した。
結果を図1にまとめて示す(図1下図)。
比較のため、従来の多重刺激応答型高分子の温度応答性も併せて図1に示す(図1上図。Allan S.Hoffman,Nature.373,49(1995)からの引用)。
この従来の多重刺激応答型高分子は、下式に示す構造を有するもので、ポリアクリル酸(重量平均分子量250000)にNIPAAm(重量平均分子量2200)がグラフトしたものである。
実施例1の多重刺激応答型高分子を用い、上記と同様にしてサンプル調製及び濁度の測定を行い、一定温度下(=35℃)でのpH応答性を測定した。
結果を図3に示す。
本発明の多重刺激応答型高分子が有する第2の側鎖は、エラスチン類似のペプチド構造を含む。この特徴的な構成に基づく特異な挙動について観察した。
すなわち、まず、実施例1の多重刺激応答型高分子を溶解した50mM、pH4.2、クエン酸/Na2HPO4緩衝液にパパインを溶解させてサンプル(高分子濃度=1wt%、酵素濃度=1mg/mL)を得た。このサンプルの濁度を上記方法に従って測定し、その経時変化を50℃(LCSTを超える温度)下で測定した。
結果を図4に示す。
また、上記と同様にして、5℃(LCST未満の温度)のサンプル(高分子濃度=1wt%、酵素濃度=1mg/mL)を調製し、これを50℃(LCSTを超える温度)まで昇温したところ、図5に示すように、もはや凝集が起こることはなかった。
以上の結果から、本発明の多重刺激応答型高分子は、生分解性という従来の多重刺激応答型高分子にない特性を有することが確認できた。このような特性を有することにより、例えば、温度やpHに関係なく、強制的かつ不可逆的に凝集性を失わせることができることが分かる。
上記のごとき本発明の多重刺激応答型高分子における特徴的な挙動が、特に第2の側鎖における特徴的なペプチド構造によってもたらされていることを、円偏光二色性(CD)スペクトル測定により立体配座の温度依存性を測定することにより確認した。
具体的には、測定対象となる各高分子をそれぞれ5mM、pH6.4、Na2HPO4/クエン酸緩衝溶液に溶解させ、ストック溶液とした。ストック溶液を緩衝溶液で希釈することでpH6.4のサンプル溶液の調製を行った。これらのサンプル溶液について、島津製作所製UV−2100分光光度計を用いて光路長1mmの石英セルでUV−visスペクトル測定を行い、198nm付近のペプチド結合に基づく吸収を測定することにより濃度を決定した(高分子濃度=40μM)。温度を変えてCDスペクトルの測定を行う際には、日本分光社製PTC−423L型ペルチェ式恒温装置とLAUDA社製E200を用い、温度勾配1℃/minで昇温するとともに、その温度に達してから50秒後に測定を行うようにした。
また、実施例1〜5の多重刺激応答型高分子について、波長198nmでの温度ごとの測定値をプロットしたグラフを図7に示す。
Claims (6)
- 前記X1及びX2が、それぞれ独立して、疎水性アミノ酸残基から選ばれる1種のα−アミノ酸残基である、請求項1に記載の多重刺激応答型高分子。
- 前記イオン性官能基がカルボキシル基又はアミノ基である、請求項1又は2に記載の多重刺激応答型高分子。
- 前記イオン性官能基を側鎖に有する高分子としてポリアクリル酸を用い、該ポリアクリル酸のカルボキシル基の一部に、上式(3)で表されるペプチドのN末端を直接に又は1もしくは2以上の任意のアミノ酸を介して結合させてペプチド鎖をグラフトする、請求項5に記載の多重刺激応答型高分子の製造方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2012004852A JP5997902B2 (ja) | 2012-01-13 | 2012-01-13 | 多重刺激応答型高分子及びその製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2012004852A JP5997902B2 (ja) | 2012-01-13 | 2012-01-13 | 多重刺激応答型高分子及びその製造方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2013144647A true JP2013144647A (ja) | 2013-07-25 |
JP5997902B2 JP5997902B2 (ja) | 2016-09-28 |
Family
ID=49040677
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2012004852A Active JP5997902B2 (ja) | 2012-01-13 | 2012-01-13 | 多重刺激応答型高分子及びその製造方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP5997902B2 (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2018047634A1 (ja) * | 2016-09-09 | 2018-03-15 | 日立化成株式会社 | 刺激応答性ポリマー |
JP7004990B2 (ja) | 2017-01-30 | 2022-02-04 | 学校法人同志社 | 環状ペプチドnmp開始剤及びマルチブロック型高分子の製造方法 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2002256075A (ja) * | 2001-02-28 | 2002-09-11 | Sentomedo:Kk | 温度応答性材料およびそれを含む組成物 |
JP2012232961A (ja) * | 2011-05-09 | 2012-11-29 | Osaka Prefecture Univ | 温度応答性複合ポリマー |
-
2012
- 2012-01-13 JP JP2012004852A patent/JP5997902B2/ja active Active
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2002256075A (ja) * | 2001-02-28 | 2002-09-11 | Sentomedo:Kk | 温度応答性材料およびそれを含む組成物 |
JP2012232961A (ja) * | 2011-05-09 | 2012-11-29 | Osaka Prefecture Univ | 温度応答性複合ポリマー |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
JPN6015049217; 深見史郎,ほか: 'elastin類似ペプチドをグラフト鎖に有する新規刺激応答性高分子の合成とその特性' 日本化学会講演予稿集 Vol. 89, No. 1, 20090313, p. 165 * |
JPN6015049218; Colloids Surf B Biointerfaces, 2011, Vol. 85, No. 1, pp. 12-18 * |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2018047634A1 (ja) * | 2016-09-09 | 2018-03-15 | 日立化成株式会社 | 刺激応答性ポリマー |
JP2018039949A (ja) * | 2016-09-09 | 2018-03-15 | 日立化成株式会社 | 刺激応答性ポリマー |
JP7004990B2 (ja) | 2017-01-30 | 2022-02-04 | 学校法人同志社 | 環状ペプチドnmp開始剤及びマルチブロック型高分子の製造方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP5997902B2 (ja) | 2016-09-28 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Hamley | PEG–peptide conjugates | |
Roy et al. | New directions in thermoresponsive polymers | |
Frisch et al. | pH‐Switchable self‐assembled materials | |
JP5162363B2 (ja) | 新規なポリペプチドおよびその製造方法 | |
Löwik et al. | Synthesis of Bio-Inspired Hybrid PolymersUsing Peptide Synthesis and Protein Engineering | |
RU2561108C2 (ru) | Композиция предшественника гидрогеля и способ её приготовления | |
US20130281602A1 (en) | Thermo-responsive polymer covalently bound with a peptide | |
Otter et al. | Supramolecular assembly of functional peptide–polymer conjugates | |
Robson Marsden et al. | Polymer‐peptide block copolymers–an overview and assessment of synthesis methods | |
Khuphe et al. | Poly (amino acids) | |
JP5997902B2 (ja) | 多重刺激応答型高分子及びその製造方法 | |
US20220267522A1 (en) | Process For Preparation Of Bioorganic Nylon Polymers And Their Use As Antibacterial Material | |
Clauss et al. | Polypeptoids and Peptoid–Peptide Hybrids by Transition Metal Catalysis | |
Tang et al. | Block length and topology affect self-assembly and gelation of poly (L-lysine)-block-poly (S-benzyl-l-cysteine) block copolypeptides | |
Radu-Wu et al. | Self-assembled hydrogels from poly [N-(2-hydroxypropyl) methacrylamide] grafted with β-sheet peptides | |
Centore et al. | Self-assembly-assisted kinetically controlled papain-catalyzed formation of mPEG-b-Phe (Leu) x | |
Huang et al. | Effect of tethered sheet-like motif and asymmetric topology on hydrogelation of star-shaped block copolypeptides | |
US7179487B1 (en) | Hydrogels of water soluble polymers crosslinked by protein domains | |
Kojima et al. | Effect of main chain conformation on thermosensitivity in elastin-like peptide-grafted polylysine | |
JP2012232961A (ja) | 温度応答性複合ポリマー | |
Peng et al. | PEGylation of melittin: structural characterization and hemostatic effects | |
Sohdi et al. | Polymer-peptide conjugate hydrogels; towards controlled drug delivery | |
Shen et al. | Adhesion and structure properties of protein nanomaterials containing hydrophobic and charged amino acids | |
JP2005060550A (ja) | 被膜形成組成物 | |
Lazzari | CHIRAL POLYAMIDOAMINO ACIDS WITH POTENTIAL FOR BIOTECHNOLOGICAL APPLICATIONS |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20141006 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20151208 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20160129 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20160517 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20160530 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20160809 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20160829 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5997902 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |