WO2015129901A1 - アミノ酸誘導体蛍光ポリマー及びそれを利用した蛍光プローブ - Google Patents

アミノ酸誘導体蛍光ポリマー及びそれを利用した蛍光プローブ Download PDF

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秀子 金澤
勇樹 蛭田
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株式会社セルシード
秀子 金澤
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    • G01N2021/6441—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks with two or more labels

Definitions

  • the present invention relates to an amino acid derivative fluorescent polymer having an amino acid in a side chain and a fluorescent probe using the amino acid derivative fluorescent polymer.
  • the present invention relates to a polymer in which the fluorescence intensity changes due to changes in the surrounding environment such as temperature and pH, or the fluorescence intensity change pattern changes due to the presence of a specific three-dimensional structure.
  • Fluorescence imaging has attracted attention as a basic technology for elucidating these.
  • fluorescence Imaging is an important technique.
  • fluorescent imaging research is being conducted vigorously, but mainly in in vitro.
  • Some fluorescent probes have low cell membrane permeability, and some introduce probes into cells using cell invasive methods such as microinjection (Non-patent Document 1). Future imaging research needs to be designed to be handled in vivo.
  • Non-patent Document 3 a vesicular transport pathway called endocytosis
  • Nakayama et al. Found that the PNIPAAm-PLA micelle, a nanocarrier modified with a temperature-responsive polymer, did not show localization in intracellular lysosomes seen in general nanoparticles after being taken into the cell. It has been confirmed that it is distributed in the body and endoplasmic reticulum (Non-Patent Document 4, Non-Patent Document 5). Kono et al.
  • Non-patent Documents 6 and 7 modified the polyglycidol (NIPAM-Suc-HPG) ⁇ ⁇ with a succinyl group and NIPAAm on the surface to encapsulate the drug, and they were taken up by endocytosis and transferred to the lysosome. It has been confirmed that it fuses with the endosomal membrane and releases the drug (Non-patent Documents 6 and 7).
  • the temperature-responsive polymer chain modified on the nanocarrier surface has some influence on the cellular uptake, and the detailed intracellular transport mechanism is unknown, but lysosomes such as nucleic acids and proteins Nanocarriers modified with temperature-responsive polymers are expected to be useful tools for achieving intracellular delivery of biopharmaceuticals that are easily degraded in the environment. From the above background, the present inventors examined the intracellular uptake pathway and localization in a fluorescent polymer modified with a temperature-responsive polymer.
  • LAT1 L-type (Amino acid transporter)
  • LAT L amino acid transporter
  • LAT1 substrate is a neutral essential amino acid with high hydrophobicity in the side chain, and it has high specificity when it has ⁇ -carboxyl group and ⁇ -amino group in the molecule. Therefore, N-acryloyl-L-phenylalanine was copolymerized with NIPAAm to evaluate the ability of HeLa cells to recognize LAT1.
  • N-acryloyl-L-phenylalanine is a derivative of L-phenylalanine, the basic structure of melphalan, a therapeutic agent for multiple myeloma taken up by LAT1, and monomers such as N-acryloyl-L-phenylalanine-OMe that have been prepared so far In contrast, the presence of ⁇ -carboxyl group is considered to have high LAT1 selectivity.
  • Non-patent Document 8 Non-patent Document 8
  • Miyawaki et al Noted that different proteins increase in the cell during the growth phase and the resting phase, and that each of the different proteins is bound to a fluorescent substance that exhibits a different color tone, and the cell changes depending on the color of the fluorescence. I was able to tell if it was time.
  • Non-patent Document 9 a research team between the National Institutes of Health and the University of Tokyo of Hisashi Kobayashi et al. Developed a new fluorescent material (Non-patent Document 9). These fluorescent materials emit light more strongly than conventional ones. Therefore, it is expected that small cancers can be found by incorporating these fluorescent substances into cancer cells or binding them to the surface of cancer cells.
  • FRET fluorescence resonance energy transfer
  • PNIPAAm Poly-N-isopropylacrylamide
  • PNIPAAm has a hydrogen bonding site. Therefore, when the environmental temperature is low in water, water molecules adhere strongly around the polymer chain, and as a result, PNIPAAm dissolves in water. However, when the temperature is raised, hydrogen bonds are broken and the polymer becomes naked, phase-separates from water, becomes insoluble and precipitates. If such temperature responsiveness is imparted to the fluorescent material, it is considered that a new application is added to the fluorescent material.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Laid-Open No. 2007-238467
  • a temperature obtained by bonding a benzochromenone compound which is a fluorescent substance, in a molecule of a temperature-responsive polymer, more specifically, a temperature formed by bonding a benzochromenone compound.
  • a fluorescent reagent containing a responsive polymer is disclosed.
  • the fluorescence wavelength of this polymer having a benzochromenonyl group is 460 nm or more in a polar solvent, and therefore has a characteristic that it is not easily influenced by the aromatic ring coexisting in the measurement system. Yes (paragraph number [0033]).
  • Patent Document 1 mentions the use of such a fluorescent reagent as tracking the environmental change in a solution containing the reagent or the change of a molecule labeled with the compound (paragraph number [0033]).
  • Patent Document 2 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2006-162512 discloses a fluorescent temperature probe having temperature responsiveness, and a block polymer or graft polymer composed of two or more segment chains.
  • Patent Document 2 does not show any experimental results on how the fluorescence intensity of the probe according to the invention changes in response to a change in temperature, and the sensor function of the probe is also used for sensing. It only shows the potential for use. That is, Patent Document 2 lacks specific description regarding what kind of polymer is synthesized and what kind of probe can be used under what conditions.
  • an object of the present invention is to provide a fluorescent probe having pathological cell specificity for the purpose of distinguishing normal cells and pathological cells such as cancer by fluorescence imaging.
  • Another object of the present invention is to provide a fluorescent temperature-responsive and / or pH-responsive polymer in which the fluorescence intensity changes due to changes in the surrounding environment of the polymer, specifically, temperature and pH.
  • Another object of the present invention is to provide a method for measuring a substance or the like having a fluorescence generating component by using a fluorescent temperature responsive and / or pH responsive polymer and utilizing the principle of fluorescence resonance energy transfer.
  • the fluorescence generating component is, for example, a compound having an aromatic ring, and the method of the present invention intends to actively utilize the aromatic ring coexisting in the measurement system.
  • Still another object of the present invention is to provide a method for measuring the temperature of an aqueous solvent using a specific fluorescent temperature-responsive polymer, and to adjust the pH of an aqueous solvent using a specific fluorescent pH-responsive polymer. It is to provide a method of measuring.
  • Still another object of the present invention is to use a fluorescent temperature-responsive and / or pH-responsive polymer containing a monomer component having an optical isomer, and a coexisting three-dimensional higher order structure of the measurement object, or the measurement
  • the object is to provide a method for determining the presence or absence of an object.
  • Still another object of the present invention is to provide a fluorescent probe containing the above-described fluorescent temperature-responsive and / or pH-responsive polymer.
  • the present inventors have a polymer or copolymer having an affinity for water or a change in the affinity for water, having a partial amino acid residue in the side chain, and It has been found that a polymer formed by binding a fluorescent substance is useful for solving the above-mentioned problems.
  • the present invention has been made based on such findings.
  • a polymer having an affinity for water or a change in affinity with water comprising an amino acid derivative monomer as a monomer constituting the polymer, and having a fluorescent substance bonded thereto.
  • the polymer according to [1] which contains at least one selected from N-isopropylacrylamide, butyl methacrylate, N-acrylamide, and N, N-dimethylaminomethylacrylamide as a monomer constituting the polymer.
  • R 2 represents H, CH 3 , or CH 2 CH 3 )
  • the polymer according to [3], wherein the polymer having an affinity for water contains at least polyethylene glycol, poly-N-acrylamide, and poly-N, N-dimethylacrylamide.
  • the polymer according to [1], wherein the polymer that changes the affinity with water is one in which the affinity for an aqueous solvent changes due to a change in temperature and / or pH.
  • the amino acid derivative monomer is an amino acid derivative having an optical isomer.
  • the fluorescent substance is a substance that emits stronger fluorescence in a hydrophilic environment.
  • the fluorescent substance is a fluorescein fluorescent substance or a coumarin fluorescent substance.
  • the fluorescent substance is a fluorescein fluorescent substance.
  • polymer according to any one of [1] to [9], wherein the polymer changes in affinity to water at least by a change in pH, and is bound with a fluorescent substance that emits stronger fluorescence under a specific pH environment.
  • polymer A polymer in which the affinity for water is changed by a change in temperature and / or pH, and a polymer to which a fluorescent substance is bound is present in the vicinity of the substance having the fluorescence generating component in water, and the fluorescence generating component and the polymer A method for measuring a change in a substance having a fluorescence generating component or its surrounding environment, comprising a step of causing fluorescence resonance energy transfer with a fluorescent substance therein and measuring the intensity of fluorescence generated as a result.
  • a new fluorescent temperature and / or pH responsive polymer capable of performing fluorescence measurement repeatedly and under different conditions by changing the ambient environment of the polymer, specifically, temperature and pH.
  • This polymer can be used as a fluorescent temperature sensor, a fluorescent pH center, or a fluorescent probe alone or in a state of being bound to a protein, phospholipid, low molecular physiological activity, carrier or the like. Further, it can be used as an imaging probe or a diagnostic probe in clinical examinations or disease diagnosis areas. That is, the present invention provides a new molecular label for bioimaging that is useful for elucidating the dynamic behavior of in vivo molecules.
  • the present invention also provides a method for measuring a substance having a fluorescence generating component using fluorescence resonance energy transfer. According to the present invention, changes in a living body based on protein-protein interactions and the like can be known in real time based on fluorescence intensity.
  • the present invention provides a method for measuring the temperature of an aqueous solvent using a fluorescent temperature-responsive polymer and a method for measuring the pH of an aqueous solvent using a fluorescent pH-responsive polymer. According to the present invention, it is possible to measure and sense environmental changes such as temperature and pH in a minute space.
  • a polymer according to the present invention containing an amino acid derivative having an optical isomer as at least a part of its constituent monomers is used, a certain measurement target (protein, oligo- or polypeptide, low molecular weight) is obtained in an aqueous solvent. It is possible to determine whether a physiologically active substance or the like is present, or the three-dimensional higher order structure of the measurement target.
  • 3 is a chart showing the results of 1 H-NMR measurement (500 MHz, CDCl 3 ) of N-acryloyl-L-tryptophan methyl ester.
  • 2 is a chart showing the results of 1 H-NMR measurement (500 MHz, CDCl 3 ) of N-acryloyl-L-phenylalanine methyl ester.
  • 2 is a chart showing the results of 1 H-NMR measurement (500 MHz, CDCl 3 ) of N-acryloyl-L-phenylalanine.
  • 2 is a chart showing the results of 1 H-NMR measurement (500 MHz, CDCl 3, DMSO) of N-acryloyl-sulfamethazine.
  • 2 is a graph and table showing the effect of copolymer molar ratio on LCST.
  • 2 is a chart showing the results of 1 H-NMR measurement (500 MHz, D 2 O) of PNIPAAm.
  • 3 is a chart showing the results of 1 H-NMR measurement (500 MHz, D 2 O) of P (NIPAAm-co-BMA3%).
  • 3 is a chart showing the results of 1 H-NMR measurement (500 MHz, D 2 O) of P (NIPAAm-co-DMAPAAm2%).
  • 2 is a chart showing the results of 1 H-NMR measurement (500 MHz, CDCl 3 ) of P (NIPAAm-co-L-Phe-OMe1.3% -co-DMAPAAm3%).
  • 2 is a chart showing the results of 1 H-NMR measurement (500 MHz, CDCl 3 ) of P (NIPAAm-co-L-Trp-OMe1.5% -co-DMAPAAm3%).
  • 2 is a chart showing the results of 1 H-NMR measurement (500 MHz, CDCl 3 ) of P (NIPAAm-co-DMAAm48% -co-SMZ10%).
  • 2 is a chart showing the results of 1 H-NMR measurement (500 MHz, CDCl 3 ) of P (NIPAAm-co-L-Phe5%).
  • (a) is a graph showing the temperature dependence of the light transmittance of the H 2 O solution and PBS solution (0.5 w / v%) polymer solution in.
  • each symbol means the following compound.
  • It is explanatory drawing which shows the example of the fluorescent polymer of this invention.
  • the upper row shows an example of a synthesis scheme of an amino acid derivative
  • the lower row shows an example of a synthesis scheme of a ternary polymer. It is the table
  • the ternary polymer LCST is 32.1 ° C for PNIPAAm, 37.9 ° C for L-Phe-OMe1.3D3, and 37.5 ° C for L-Trp-OMe1.5D3. It is possible to adjust to the side.
  • the sizes of the ternary polymers near the LCST are 130 nm for PNIPAAm, 110 nm for L-Phe-OMe1.3D3, and 100 nm for L-Trp-OMe1.5D3, and the particle diameter can be changed corresponding to LCST.
  • the upper diagram is a schematic diagram illustrating cell uptake of the ternary polymer, and the lower diagram is an explanatory diagram showing the procedure of cell uptake. It is a figure which shows the uptake
  • the presence of the ⁇ -carboxyl group of the amino acid derivative monomer is expected to be capable of recognizing cells independent of LCST.
  • This polymer has an LCST of 53.5 ° C., and the carboxyl group of the amino acid derivative is ionized, so that it is always in a hydrophilic state at the temperature at which the cell uptake experiment is performed. Further, this polymer has a particle size of 25 nm or less at a temperature at which a cell uptake experiment is performed, and shows a particle size change corresponding to LCST. It is a figure explaining the cell uptake in a HeLa cell.
  • HLAT1 expression was confirmed in HeLa cells.
  • LAT1 expression was observed on the membrane in HeLa cells.
  • fluorescence due to the fluorescent polymer was confirmed below LCST. It is a graph explaining inhibition of L- [ 3 H] leucine uptake by HeLa cells. L- [ 3 H] leucine intracellular uptake was inhibited by fluorescent polymer ( ⁇ 30%). Therefore, it was suggested that the fluorescent polymer may have affinity for LAT1.
  • the polymer of the present invention itself is a polymer whose affinity for an aqueous solvent changes with changes in temperature and / or pH, and is formed by binding a fluorescent substance.
  • Polymer in the present invention means both a monopolymer (homopolymer) and a copolymer (a copolymer containing two or more chemically different monomers).
  • Examples of the temperature-responsive polymer used in the present invention include poly-Nn-propylacrylamide (lower critical solution temperature of homopolymer 21 ° C.), poly-Nn-propyl methacrylamide (27 ° C.), Poly-N-isopropylacrylamide (32 ° C), poly-N-isopropylmethacrylamide (43 ° C), poly-N-cyclopropylacrylamide (45 ° C), poly-N-ethoxyethylacrylamide (about 35 ° C) ), Poly-N-ethoxyethyl methacrylamide (about 45 ° C.), poly-N-tetrahydrofurfuryl acrylamide (about 28 ° C.), poly-N-tetrahydrofurfuryl methacrylamide (about 35 ° C.), poly- N, N-ethylmethylacrylamide (at 56 ° C), poly-N, N-diethylacrylamido (The 32 ° C.), and the like.
  • polymers having affinity for water used in the present invention include polyacrylamide, poly-N, N-diethylacrylamide, poly-N, N-dimethylacrylamide, polyethylene oxide, polyacrylic acid and salts thereof,
  • water-containing polymers such as polyhydroxyethyl methacrylate, polyhydroxyethyl acrylate, polyethylene glycol, polyvinyl alcohol, polyvinyl pyrrolidone, cellulose, and carboxymethyl cellulose, but are not particularly limited.
  • the “aqueous solvent” includes water, an inorganic salt aqueous solution such as various buffer solutions, and a liquid mainly containing water containing an organic solvent in an amount up to about 30% by volume. It is an “aqueous solvent” as long as it can measure the change in the fluorescence intensity of the polymer of the first invention accompanying changes in temperature and / or pH in the solution containing water as a main component.
  • Examples of the polymer of the present invention include: (1) Polymers of acrylamide monomers or copolymers having a fluorescent substance bonded to one end or both ends and further having amino acid residues in the side chain; ) Copolymerized with an acrylamide monomer and a fluorescent substance having an ethylenically unsaturated group such as an acrylate group or an allyl group, and further having an amino acid residue in the side chain (this is a molecule (3) A polymer in which an acrylamide monomer and a fluorescent material having an ethylenically unsaturated group are copolymerized, and the fluorescent material is bonded to one or both ends thereof.
  • this is a polymer in which a fluorescent substance is bonded to the middle and the end of the molecule
  • (4) polymerization of an acryloyl group-containing monomer has a fluorescent substance bonded to one or both ends of the copolymer and further has an amino acid residue in the side chain, and (5) an acryloyl group-containing monomer and a fluorescent substance having an ethylenically unsaturated group.
  • Copolymerized (this is a polymer in which a fluorescent substance is bonded in the middle of the molecule), and (6) an acryloyl group-containing monomer and a fluorescent substance having an ethylenically unsaturated group are copolymerized.
  • a fluorescent substance is bonded to one or both ends thereof, and further has an amino acid residue in the side chain (this is a polymer in which a fluorescent substance is bonded to the middle and end of the molecule), (7) A fluorescent substance is bonded to one or both ends of a copolymer of an acrylamide monomer and a monomer having an ethylenically unsaturated group and an ionic group, and further has an amino acid residue in the side chain.
  • a copolymer obtained by copolymerizing an acrylamide monomer, a monomer having an ethylenically unsaturated group and an ionic group, and a fluorescent material having an ethylenically unsaturated group, and further having an amino acid residue in the side chain (This is a polymer in which a fluorescent substance is bonded in the middle of the molecule), (9) an acrylamide monomer, a monomer having an ethylenically unsaturated group and an ionic group, and an ethylenically unsaturated group Copolymerized with a fluorescent substance and having a fluorescent substance bonded to one or both ends thereof, and further having amino acid residues in the side chain (this is because the fluorescent substance is present at the middle and end of the molecule) (10) a fluorescent substance bonded to one or both ends of a copolymer of an acryloyl group-containing monomer and a monomer having an ethylenically unsaturated group and an i
  • an acryloyl group-containing monomer a monomer having an ethylenically unsaturated group and an ionic group, and a phosphor having an ethylenically unsaturated group.
  • a copolymer having an amino acid residue in the side chain (this is a polymer in which a fluorescent substance is bonded in the middle of the molecule), and (12) an acryloyl group-containing monomer, A monomer having a saturated group and an ionic group and a fluorescent substance having an ethylenically unsaturated group are copolymerized, and the fluorescent substance is bonded to one or both ends, and an amino acid residue is further added to the side chain. (This is a polymer in which a fluorescent substance is bonded to the middle and the end of a molecule).
  • main constituent monomers used for making the main chain into polyethylene include acrylamide, methacrylamide (hereinafter sometimes referred to as “(meth) acrylamide”), acrylamide derivatives (for example, alkyl (meth) acrylamide), and the like.
  • Examples of (meth) acrylamide monomers used in the production of the above polymers include Nn-propyl (meth) acrylamide, N-isopropyl (meth) acrylamide, N, N-diethyl (meth) acrylamide, and N-propyl.
  • (Meth) acrylamide and (meth) acryloylpyrrolidine are mentioned. In the production of the polymer, it is preferable to use one or more of these (meth) acrylamide monomers.
  • alkyl acrylate such as methyl acrylate and ethyl acrylate (carbon number: about 1 to 20, preferably about 1 to 3) acrylate, methyl methacrylate, ethyl methacrylate, etc.
  • Alkyl (carbon number: about 1 to 20, preferably about 1 to 3) methacrylate, acrylic acid, methacrylic acid, vinyl pyrrolidone, acrylamide, dimethylacrylamide, styrene and the like may be used.
  • alkyl (meth) acrylate when using alkyl acrylate or alkyl methacrylate (hereinafter sometimes referred to collectively as “alkyl (meth) acrylate”) as a comonomer, the amount is the sum of acrylamide monomer and alkyl (meth) acrylate. About 5 to 60% is preferable.
  • the monomer that is a (meth) acryloyl group-containing compound include (meth) acryloyl group-containing compounds such as alkyl (carbon number: about 1 to 20, preferably about 1 to 3) esters of N- (meth) acryloylproline. Examples include amino acid derivatives and (meth) acryloylpyridine. In the production of the polymer, it is preferable to use one or more of these (meth) acryloyl group-containing compounds. Moreover, you may use the said comonomer with these (meth) acryloyl group containing compounds.
  • a constituent monomer of the polymer according to the present invention for example, a compound having an optical isomer such as methyl ester of N-acryloylproline, more specifically, an optically active amino acid derivative can be used.
  • the optically active amino acid derivative may be all of the constituent monomers of the polymer main chain (however, excluding a portion derived from a fluorescent substance) or a part thereof.
  • only one optical isomer of the optically active amino acid derivative may be used as a constituent monomer, or two optical isomers may be used, for example, so as to become a block polymer.
  • the polymer of the present invention can be synthesized using only one of the optical isomers as all the constituent monomers of the polymer main chain. Further, a copolymer of N-isopropylacrylamide and methyl ester of N-acryloylproline described in Journal of Chromatography A, 1106 (2006), pages 152 to 158 is also obtained by binding a fluorescent substance thereto. Can be used as the polymer of the present invention.
  • the affinity of the polymer according to the present invention in an aqueous solvent changes due to a change in pH.
  • the monomer having such an ionic group include acrylic acid and methacrylic acid having a carboxyl group that is an ionic group and having an ethylenically unsaturated group.
  • ionic groups other than the carboxyl group include an ammonium group, a sulfonium group, a tetramethylammonium group, and a sulfonic acid group.
  • the polymer according to the present invention pH responsive, it is about 0.1 to 30 mol%, preferably about 0.5 to 20 mol%, more preferably about 1 to 10 mol% of the main chain constituent monomers. Is preferably a monomer having an ionic group. In general, as the monomer having an ionic group, only one of a compound having a cationic group and a compound having an anionic group is used.
  • fluorescent substance used in the production of the polymer examples include fluorescein, fluorescein isothiocyanate, 4-aminofluorescein, dichlorofluorescein, sulfone fluorescein, N-hydroxysuccinimide fluorescein, Oregon green, Tokyo green, carboxyfluorescein, carboxyfluorescein diester.
  • Fluorescein-based compounds such as acetate, and these fluorescein-based compounds are introduced with groups suitable for bonding to the terminal of the polymer or copolymerization with main chain constituent monomers.
  • the fluorescein fluorescent substance emits stronger fluorescence when the polymer according to the present invention is in a hydrophilic environment.
  • the polymer of the present invention in which a fluorescein fluorescent substance is bonded has a change in fluorescence intensity according to a change in pH even if the above-described ionic group is not used as a monomer constituting the main chain. This is because fluorescein changes its chemical structure with a change in pH, which causes a large change in fluorescence intensity.
  • Examples of monomers constituting the polymer shown in the present invention include amino acid derivative monomers.
  • the structure is not particularly limited as long as the monomer has an amino acid structure.
  • a method in which a monomer having a vinyl group is reacted with an amino group in amino acid, or a carboxyl group in amino acid, amino It can be obtained by a method of reacting a monomer having a vinyl group with a site other than the group.
  • the thing used in that case is not specifically limited, For example, the following [Chemical Formula 5], [Chemical Formula 7], and [Chemical Formula 9] are mentioned.
  • R 2 represents H, CH 3 , or CH 2 CH 3 )
  • the carboxyl group is esterified amino acids (methyl ester, ethyl ester, n- propyl ester, i- propyl ester, n- butyl ester, t- butyl ester , Etc.).
  • amino acid derivative monomer may be a compound represented by the following formula.
  • Ra represents an alkenyl group
  • Rb represents a group obtained by removing NH 2 from an amino acid or an ester of an amino acid
  • Ra examples include, but are not limited to, an alkenyl group such as a vinyl group (CH 2 ⁇ CH—) and a 1-methylvinyl group (CH 2 ⁇ C (CH 3 ) —).
  • Rb for example, by removing groups except the NH 2 from the methyl ester of phenylalanine or phenylalanine, group obtained by removing NH 2 methyl ester of tryptophan or tryptophan, NH 2 methyl ester of proline or proline group, Examples include a group obtained by removing NH 2 from alanine or a methyl ester of alanine.
  • the polymer shown in the present invention is not only a method of obtaining an amino acid residue-containing polymer by polymerizing an amino acid derivative monomer as described above, but also preparing a polymer in advance and then reacting an amino acid as a side chain.
  • the method may be used.
  • the group shown by the said Formula (A) or Formula (B) is mentioned.
  • fluorescent substance used in the production of the polymer examples include a coumarin compound, a benzochromenone compound, a stilbene compound, etc., and a bond to the terminal of the polymer or a main chain constituent monomer. A group suitable for copolymerization is introduced.
  • Specific examples of the coumarin fluorescent substance include 7- (4-trifluoromethyl) coumarin acrylamide.
  • Specific examples of the benzochromenone fluorescent material include 2- (morpholin-4-yl) -benzo [h] chromen-4-one.
  • stilbene fluorescent material examples include resveratrol.
  • Fluorescein fluorescent substances and coumarin fluorescent substances emit stronger fluorescence when the polymer according to the present invention is in a hydrophilic environment.
  • strong fluorescence refers to a fluorescence intensity that is, for example, 2 times or more, preferably 5 times or more, more preferably 10 times or more of the fluorescence intensity in a quenching state in the measurement of fluorescence intensity.
  • fluorescent substances used in the production of the above polymers are dansyl compounds such as dansyl aminoethyl acrylamide, dansyl chloride, dansyl ethylenediamine, and the like.
  • a group suitable for copolymerization with a main chain constituting monomer is introduced.
  • the dansyl fluorescent substance emits stronger fluorescence when the polymer according to the present invention is in a hydrophobic environment.
  • benzofurazan-based fluorescent substances such as 4-N, N-dimethylaminosulfonyl-7-fluoro-2,1,3-benzoxadiazole also exhibit hydrophobic and stronger fluorescence.
  • a reactive group can be introduced to the terminal of the polymer. It is not necessary to use those in which the group is introduced.
  • groups suitable for copolymerization with (meth) acrylamide monomers and (meth) acryloyl group-containing compounds include groups containing an ethylenically unsaturated group such as an acrylate group or an allyl group. It is done.
  • the polymer of the present invention may be a homopolymer in which a fluorescent substance is bonded to the terminal, or a copolymer in which the main chain is composed of a monomer component other than the fluorescent substance and the fluorescent substance.
  • the monomer components other than the fluorescent material constituting the main chain are not limited to one type, and two or more types may be used.
  • the polymer of the present invention is a copolymer, it may be a random copolymer or a block copolymer (including a graft copolymer and the like).
  • the fluorescence intensity change behavior in an aqueous solvent represented by the polymer can be changed depending on the molar ratio of the monomer components and whether the copolymer is random copolymer or block copolymer. Therefore, in particular, the polymer of the present invention used in the fifth invention described later is designed in a molecular design in consideration of the relationship with the measurement object.
  • the introduction ratio of the fluorescent substance is not particularly limited, but the ratio of the fluorescent substance in the monomer component is preferably 0.001 to 20 mol%, and preferably 0.01 to 10 mol%. In general, as the degree of polymerization of the polymer increases (molecular weight increases), the introduction ratio of the fluorescent material decreases.
  • NIPAAm N-isopropylacrylamide
  • MPA 3-mercaptopropionic acid
  • AIBN azobis (isobutyronitrile)
  • DMF N-dimethylformamide
  • PNIPAAm poly (N-isopropylacrylamide) having a group derived from a chain transfer agent at one end
  • N-hydroxysuccinimide hereinafter sometimes referred to as “NHS”
  • N, N-dicyclohexylcarbodiimide hereinafter sometimes referred to as “DCC”
  • ethyl acetate The reaction is carried out at 25 ° C., and the terminal is succinylated (active esterification).
  • the obtained terminal succinylated polymer is reacted with 4-aminofluorescein, which is a fluorescein fluorescent substance, at about 25 ° C. in the presence of 1,4-dioxane. In this way, poly (N-isopropylacrylamide) conjugated with 4-aminofluorescein is produced.
  • NIPAAm N-isopropylacrylamide
  • MPA chain transfer agent 3-mercaptopropionic acid
  • AIBN radical initiator 2,2′-azobis (isobutyrate)
  • DMF N-dimethylformamide
  • a copolymer (N-isopropylacrylamide / fluorescein o-acrylate) (hereinafter referred to as “P or Poly (NIPAAm-co-Fluorescein o-acrylate)) in which a fluorescein fluorescent substance is randomly bonded in the middle of the polymer molecule. Is sometimes obtained).
  • the molecular weight of the polymer is adjusted to the desired value by adjusting the molar ratio of the sum of the two monomers and the MPA.
  • the binding ratio of the fluorescent substance is adjusted to a desired value by adjusting the molar ratio of N-isopropylacrylamide and fluorescein o-acrylate.
  • the polymer terminal is a carboxyl group.
  • the affinity of the terminal of the polymer is adjusted to make the polymer accessible to a specific substance, or the carboxyl group is made to some substance (for example, phospholipid, Protein, carrier, etc.).
  • a carboxyl group can be combined with a phospholipid having an amino group such as phosphatidylethanolamine.
  • the phospholipid part at the end of the polymer approaches or becomes embedded in the phospholipid part of the cell membrane.
  • an immunoglobulin having an amino group introduced in advance at the terminal can be bound to the carboxyl group at the terminal of the polymer.
  • the immunoglobulin moiety at the end of the polymer shows affinity for, for example, the antigen-antibody reaction conjugate moiety. Furthermore, when the polymer is bonded to the solid surface with the carboxyl group, it is considered that the polymer can be used as a sensor based on observing the fluorescence.
  • the temperature-responsive polymer becomes insoluble in water and precipitates when the hydrogen bond is broken.
  • This phenomenon is called the lower critical solution phenomenon, and the temperature at which the phase transition occurs is called the lower critical solution temperature (LCST).
  • This lower critical solution temperature can be adjusted by selecting the monomer constituting the polymer and using the comonomer (type and ratio to be used).
  • poly (N-isopropylacrylamide) has a lower critical solution temperature at 32 ° C.
  • acrylamide and methacrylic acid which are more hydrophilic monomers than N-isopropylacrylamide.
  • Copolymers such as acrylic acid, dimethylacrylamide, and vinyl pyrrolidone may be copolymerized.
  • the lower critical solution temperature when it is desired to be lower than 32 ° C., it may be copolymerized with a comonomer such as styrene, alkyl methacrylate or alkyl acrylate which is a hydrophobic monomer.
  • a comonomer such as styrene, alkyl methacrylate or alkyl acrylate which is a hydrophobic monomer.
  • the polymer of the present invention to which a fluorescein-based fluorescent substance is bonded emits stronger fluorescence on the low temperature side than LCST, and the fluorescence intensity rapidly decreases in the vicinity of LCST.
  • the lower critical solution temperature of the resulting fluorescent temperature-responsive polymer varies depending on the degree of affinity of the fluorescein fluorescent substance and its introduction ratio. It is necessary to consider what to do.
  • NIPAAm N-isopropylacrylamide
  • MPA chain transfer agent 3-mercaptopropionic acid
  • AIBN radical initiator 2,2'-azobis (isobutyronitrile)
  • DMF N, N-dimethylformamide
  • the molecular weight of the polymer is adjusted to the desired value by adjusting the molar ratio of the sum of the two monomers and the MPA. Further, the binding ratio of the fluorescent substance is adjusted to a desired value by adjusting the molar ratio of N-isopropylacrylamide and dansylaminoethylacrylamide.
  • the polymer terminal is a carboxyl group.
  • this carboxyl group By reacting this carboxyl group with some compound, the affinity of the end of the polymer is adjusted, making this polymer easy to access a specific substance, or this carboxyl group is made to some substance (for example, phospholipid, protein
  • the carrier can be bonded to the carrier) in the same manner as in the production example shown in paragraph [0039].
  • the polymer of the present invention in which dansylaminoethylacrylamide is bound has a lower fluorescence intensity at a lower temperature than LCST, and the fluorescence intensity rapidly increases near the LCST.
  • N-isopropylacrylamide NIPAAm
  • MPA chain transfer agent 3-mercaptopropionic acid
  • 7- (4-trifluoromethyl) coumarin acrylamide 7- (4-trifluoromethyl) coumarin acrylamide
  • AIBN butyronitrile
  • DMF N, N-dimethylformamide
  • the molecular weight of the polymer is adjusted to the desired value by adjusting the molar ratio of the sum of the two monomers and the MPA.
  • the binding ratio of the fluorescent substance is adjusted to a desired value by adjusting the molar ratio of N-isopropylacrylamide and 7- (4-trifluoromethyl) coumarin acrylamide.
  • the polymer terminal is a carboxyl group.
  • this carboxyl group By reacting this carboxyl group with some compound, the affinity of the end of the polymer is adjusted, making this polymer easy to access a specific substance, or this carboxyl group is made to some substance (for example, phospholipid, protein
  • the carrier can be bonded to the carrier) in the same manner as in the production example shown in paragraph [0039].
  • the polymer of the present invention to which 7- (4-trifluoromethyl) coumarin acrylamide is bonded has a higher fluorescence intensity on the low temperature side than the LCST, and the fluorescence intensity rapidly decreases near the LCST.
  • methyl esterification of D- or L-proline is performed.
  • the resulting methyl ester of D- or L-proline is reacted with acryloyl chloride to synthesize the methyl ester of N-acryloylproline.
  • This methyl ester of N-acryloylproline was mixed with 3-mercaptopropionic acid (MPA) as a chain transfer agent, 2,2′-azobis (isobutyronitrile) (AIBN) as a radical initiator and N,
  • MFA 3-mercaptopropionic acid
  • AIBN 2,2′-azobis (isobutyronitrile)
  • the reaction is carried out at about 80 ° C. in the presence of N-dimethylformamide (DMF).
  • a polymer of methyl ester of N-acryloylproline (hereinafter sometimes referred to as “P or Poly (NA-Pro-OMe)”) is obtained.
  • the molecular weight of the polymer is adjusted to the desired value by adjusting the molar ratio of monomer to MPA.
  • NIPAAm N-isopropylacrylamide
  • the polymer according to the present invention described above is a “fluorescent temperature-responsive polymer” when the affinity to an aqueous solvent changes due to a change in temperature. If the affinity for the solvent changes, it is called a “fluorescent pH-responsive polymer”.
  • Examples of the chain transfer agent used for producing the polymer according to the present invention include 3-mercaptopropionic acid, 2-mercaptoethanol, and 2-mercaptoethylamine.
  • the chain transfer agent is not limited to these, and various compounds containing thiol groups and carbon tetrachloride can also be used.
  • examples of the group introduced into the fluorescent substance include an amino group, a carboxyl group, and an oxyethylene group.
  • the method is a method for measuring a change in a substance having a fluorescence generating component or its surrounding environment, wherein any fluorescent and temperature and / or pH responsive polymer is added to a substance having a fluorescence generating component in an aqueous solvent.
  • the present invention relates to a method including a step of causing fluorescence resonance energy transfer between a fluorescence-generating component and a fluorescent substance in a polymer to be present in the vicinity, and measuring the intensity of the resulting fluorescence.
  • the fluorescent and temperature and / or pH responsive polymer used is temperature and / or pH responsive, and the fluorescent substance is bound.
  • it is a polymer, it is not particularly limited, but it is preferable to use the polymer of the present invention.
  • the measurement of the change in a substance having a fluorescence generating component is a change in the substance (for example, protein or peptide) having a fluorescence generating component (for example, an aromatic ring compound), specifically, thermal denaturation, change in three-dimensional structure, aggregation, etc. Recognizing whether or not it has occurred by measuring the fluorescence measured as a result of fluorescence resonance energy transfer between the fluorogenic component and the fluorescent material in the fluorescent temperature and / or pH responsive polymer.
  • measurement of changes in the surrounding environment of a substance having a fluorescence-generating component refers to the fluorescence caused by changes in the surrounding environment when the thermal denaturation, three-dimensional structure change, aggregation, etc.
  • a generation component for example, a protein or peptide
  • the fluorescence spectrum of the substance (protein, etc.) having the fluorescence-generating component that is the subject of the change is taken into consideration, and is about 10 to 50 nm longer than the fluorescence wavelength. It is preferable to use a fluorescent temperature and / or pH responsive polymer having an excitation wavelength on the wavelength side.
  • the fluorescence temperature and / or pH responsive polymer is present in the vicinity of the substance having a fluorescence generating component such as a protein in an aqueous solvent. It causes fluorescence resonance energy transfer from the generating component to the fluorescent material in the polymer. For example, when the fluorescence intensity emitted by the protein itself cannot be distinguished from background fluorescence, or the change in fluorescence intensity associated with the change in protein is small, the change cannot be recognized even if the fluorescence intensity is measured.
  • the energy is transferred to the fluorescent substance in the fluorescence temperature and / or pH responsive polymer (fluorescence resonance energy).
  • the intensity of the fluorescence emitted from the fluorescent substance in the fluorescent temperature-responsive polymer is increased, so that the fluorescence emitted from the fluorescent substance in the fluorescent temperature and / or pH-responsive polymer
  • aqueous solvent refers to water, aqueous solutions such as various buffers, or a mixture of water and a polar solvent such as methanol or ethanol, the main component of which is water.
  • a polar solvent such as methanol or ethanol
  • a temperature measurement method including a step of applying excitation energy to a polymer exhibiting temperature responsiveness in the polymer of the present invention in an aqueous solvent and measuring the temperature of the aqueous solvent according to the degree of fluorescence emission will be described.
  • Fluorescent temperature-responsive polymers each have a specific lower critical solution temperature. These polymers are in a hydrophilic environment below the lower critical solution temperature, while being placed in a hydrophobic environment above the lower critical solution temperature. That is, the solubility rapidly decreases.
  • fluorescent temperature-responsive polymers those combined with fluorescein-based fluorescent substances and coumarin-based fluorescent substances emit a strong fluorescence below the lower critical solution temperature, that is, in a hydrophilic environment. The strength is significantly reduced.
  • a polymer to which a dansyl fluorescent substance is bonded is weak in fluorescence below the lower critical solution temperature, and the fluorescence intensity is remarkably increased above this temperature.
  • the temperature measurement method includes a step of applying excitation energy in a water-based solvent to a polymer exhibiting temperature responsiveness and measuring the temperature of the water-based solvent according to the degree of fluorescence emission.
  • This property of the functional polymer is utilized. That is, the temperature of the aqueous environment where the polymer exists is specified by whether or not strong fluorescence derived from the fluorescent temperature-responsive polymer is emitted.
  • Fluorescent temperature-responsive polymers each have a specific lower critical solution temperature, so that a suitable fluorescent temperature-responsive polymer is selected or designed according to the temperature to be measured.
  • the fluorescent substance in the fluorescent temperature-responsive polymer has a specific excitation wavelength and fluorescence wavelength, excitation energy is given at a wavelength corresponding to the fluorescent substance.
  • a pH measurement method including a step of applying excitation energy in a water-based solvent to a polymer exhibiting pH responsiveness in the polymer of the present invention and measuring the pH of the water-based solvent according to the degree of fluorescence emission will be described.
  • Fluorescent pH-responsive polymers each have a unique phase transition pH (pH at which solubility in an aqueous solvent changes rapidly).
  • fluorescent pH-responsive polymers those combined with a fluorescein fluorescent substance or a coumarin fluorescent substance emit strong fluorescence in a hydrophilic environment (the polymer is dissolved in an aqueous solvent at this time).
  • the solubility of the polymer in an aqueous solvent is low
  • the fluorescence intensity is significantly reduced.
  • a polymer to which a dansyl-based fluorescent substance is bonded has weak fluorescence in a hydrophilic environment and significantly increases fluorescence intensity in a hydrophobic environment.
  • a pH measurement method comprising a step of applying excitation energy to a polymer exhibiting pH responsiveness in an aqueous solvent and measuring the pH of the aqueous solvent according to the degree of fluorescence emission is a fluorescent pH response.
  • This property of the functional polymer is utilized. That is, the pH of the aqueous environment in which the polymer exists is specified by whether or not strong fluorescence derived from the fluorescent pH-responsive polymer is emitted.
  • Fluorescent pH-responsive polymers each have a pH at which significant changes occur in their solubility (ie, phase transition), and therefore a suitable fluorescent pH-responsive polymer is selected or designed according to the pH to be measured.
  • the fluorescent substance in the fluorescent pH-responsive polymer has a specific excitation wavelength and fluorescence wavelength, excitation energy is given at a wavelength corresponding to the fluorescent substance.
  • the polymer of the first invention a method of using a fluorescent temperature and / or pH responsive polymer in which at least a part of the constituent monomers of the polymer is an amino acid derivative having an optical isomer will be described.
  • the fluorescence derived from the polymer is subjected to temperature.
  • measuring object refers to, for example, proteins (protein A, G protein, etc.) present in the living body, oligo- or polypeptides (eg, angiotensin, vasopressin, etc.), polysaccharides (N-acetylglucosamine, etc.), and It refers to low molecular weight biologically active substances such as various amino acids, hormone-like substances, and steroids.
  • a fluorescent temperature and / or pH responsive polymer in which at least a part of the constituent monomer of the polymer is an amino acid derivative having an optical isomer coexists with the “measuring object”, whereby the temperature responsive behavior and / or pH of the polymer. Changes in response behavior can occur. Based on the presence or absence of such a change, it is determined whether or not a specific “measurement object” exists, or what three-dimensional higher order structure the specific “measurement object” has.
  • an L-proline polymer is used as a model compound to be “measured”, and a fluorescent temperature-responsive polymer (L--) containing proline having optical activity as a constituent monomer of the main chain as a polymer of the present invention.
  • the relationship between the temperature and the fluorescence intensity of the fluorescent temperature-responsive polymer of the present invention is influenced by whether or not the measurement target coexists using the one containing only proline and the one containing only D-proline). Reference is made to the experiment (Example 9) in which whether or not the measurement was performed.
  • the relationship (I) between the temperature and the fluorescence intensity of the polymer alone (sample (a)) in which the main chain constituting monomer is L-proline-containing monomer coexists (sample (b ))
  • the relationship (II) between the temperature and the fluorescence intensity in the case it can be seen that a different tendency is shown.
  • the relationship (II) between the temperature and the fluorescence intensity in the case it can be seen that almost the same tendency is shown. Based on such differences, whether or not the “measurement target” exists in a certain sample or at a certain location in the living body, and if present, the three-dimensional higher-order structure of the “measurement target” is It is possible to determine how it is.
  • an L-proline polymer was used as a “measurement target” model compound.
  • the “measurement object” is a proline polymer
  • the three-dimensional higher order structure (more specifically, whether it is an L-proline polymer or a D-proline polymer) is determined. Will do.
  • L-proline homopolymer was used as a model compound to be “measured”, but the three-dimensional height of the polynucleotide itself depends on, for example, whether proline in the polynucleotide is L-form or D-form.
  • the secondary structure may be different, and in such a case, the three-dimensional higher order structure of the polynucleotide (measuring object) can be determined by the above method.
  • This fluorescent probe is a polymer of the present invention in which at least one end thereof is bonded to a polymer selected from the group consisting of a protein, a phospholipid, a low molecular physiological activity, and a carrier. It becomes.
  • a fluorescent probe can be produced by causing an amino group of an amino group-containing immunoglobulin to react with a carboxyl group at one end of the polymer of the present invention to form an amide bond.
  • it can manufacture by making the carboxyl group in the one terminal of the polymer of 1st invention react with the amino group of an amino-group containing phospholipid, and producing an amide bond.
  • an immunoglobulin conjugated Poly (NIPAAm-) is reacted with Poly (NIPAAm-co-fluorescein o-acrylate) by reacting with an immunoglobulin into which an amino group has been introduced in a phosphate buffer (pH 7.4). co-fluorescein o-acrylate).
  • Poly (NIPAAm-co-fluorescein o-acrylate) can be converted to an active ester, and the active esterified product can be reacted with a phospholipid into which an amino group is introduced in 1,4-dioxane.
  • Such a fluorescent probe can be used for bioimaging because it stays in an environment having affinity for, for example, a protein, phospholipid, or low-molecular physiologically active substance constituting the probe.
  • a substance having affinity for the polymer portion remains in the vicinity of the fluorescent probe of the present invention having a carrier, and as a result, a change in the temperature or pH responsive behavior of the fluorescent probe may occur. Based on this, it is possible to determine what the substance stays in the vicinity of the fluorescent probe, what kind of three-dimensional higher order structure is taken, and the like.
  • PNIPAAm becomes hydrophilic on the low temperature side and swells on the boundary of LCST, and becomes hydrophobic and shrinks on the high temperature side.
  • the balance between the hydrophilic amide group part of N-isopropylacrylamide and the hydrophobic isopropyl group is the cause of the sensitive temperature response of PNIPAAm, and it is strong between the amide group in the molecule and the water molecule at low temperatures below LCST.
  • Hydrogen bonds work, the polymer hydrates and assumes a random coiled conformation. When the temperature is higher than LCST, hydrogen bonds become unstable and dehydration occurs, causing polymer chains to aggregate and change to a globule shape.
  • This LCST can be freely controlled by the copolymer composition of the polymer. That is, when copolymerization is performed, the LCST of the resulting copolymer can be controlled by adjusting the balance of the introduced NIPAAm monomer, hydrophobic monomer, and hydrophilic monomer. When hydrophobic monomers are copolymerized, the hydrophobic interaction becomes stronger. As a result, the LCST of NIPAAm, which was 32 ° C, shifts to the low temperature side. Conversely, when hydrophilic monomers such as acrylic acid are copolymerized with PNIPAAm, it is known that LCST shifts to a high temperature side.
  • a fluorescent polymer in which a fluorescent molecule is introduced into a temperature-responsive polymer for the purpose of distinguishing normal cells and pathological cells such as cancer by fluorescent imaging. Focus on L-form amino acids with high molecular recognition ability in vivo to give pathological cell specificity and modify 5-amino fluorescein, a polar sensitive fluorescent molecule, to a temperature-responsive polymer with amino acid derivative monomers Thus, a fluorescent polymer was produced that emits light in a hydrophilic environment at a lower temperature than LCST and does not emit fluorescence in a hydrophobic environment at a higher temperature than LCST.
  • 5-aminoKafluorescein has a pKa of 6.4 and exhibits pH-dependent absorption and fluorescence emission in the range of pH 5-9, making it possible to develop fluorescent polymers that have both pH responsiveness and temperature responsiveness.
  • NIPAAm is combined with acryloyl sulfamethazine derivative monomer, which is a pH-responsive monomer, and N, N-dimethylacrylamide (DMAAm), which is a hydrophilic monomer.
  • Polymers have been developed that change the hydrophilicity / hydrophobicity of the polymer depending on the pH as well as the temperature.
  • LAT1 amino acid transporter 1
  • LAT1 amino acid transporter 1
  • reaction solution was separated and extracted with CH 2 Cl 2 and saturated NaHCO 3 , and the organic layer was dried over anhydrous Na 2 SO 4 and then the solvent was distilled off to obtain L-tryptophan methyl ester (19.9 g, 74.2%). .
  • N-acryloyl-L-tryptophan methyl ester (19.9 g, 98 mmol) was dissolved in CH 2 Cl 2 and NEt 3 (16.3 mL, 117.6 mmol) and acryloyl chloride (8.7 mL, 107.8 mmol) was added dropwise at ⁇ 20 ° C. and stirred. After completion of the reaction, liquid separation extraction was performed with H 2 O and CH 2 Cl 2 . The organic layer was dried over anhydrous Na 2 SO 4 and the solvent was distilled off.
  • N-acryloyl-L-phenylalanine methyl ester Using L-phenylalanine methyl ester (9.90 g, 55.8 mmol) as a starting material, synthesis was performed in the same manner as N-Acryloyl-L-tryptophan methyl ester. N-acryloyl-L-phenylalanine methyl ester (9.91 g, 81.2%) was obtained using CH 2 Cl 2 , NEt 3 (9.41 mL, 66.9 mmol) and acryloyl chloride (4.96 mL, 61.3 mmol). However, the crystallinity was good, and column extraction was not performed.
  • NIPAAm N-isopropylacrylamide
  • DMAPAAm N-dimethylaminopropylacrylamide
  • BMA Butylmethacrylate
  • MPA Wako Pure Chemical Industries 3-mercaptopropionic acid
  • AIBN Wako Pure Chemical Industries n-hexane: Wako Pure Chemical Industries N, N'-dimethylformamide
  • DMF Kanto Chemical Liquid Nitrogen: Kotobuki Sangyo Co., Ltd.
  • Diethyl ether Wako Pure Chemical Industries Acetone dehydrated: Wako Pure Chemical Industries 1,4-dioxane dehydrated: Wako Pure Chemical Industries Ethyl acetate dehydrated: Wako Pure Chemical Industries N, N'-dicyclohexylcarbodiimide (DCC): Kanto Chemical N-hydroxysuccinimide (NHS): Merck 5-aminofluorescein (FL): SIGMA-ALDRICH Dulbecco's phosphate-buffered salines (PBS): Life Technologies Purification from H 2 O: Milli-Q water purification system
  • reaction solution was added dropwise to diethyl ether under ice cooling, followed by reprecipitation purification to obtain a crude product. This was reprecipitated and purified twice using acetone and diethyl ether to obtain PNIPAAm (10.7 g, Quant) as a white solid.
  • reaction solution was frozen and degassed under liquid nitrogen ( ⁇ 196 ° C.), and the eggplant-shaped flask was returned to room temperature, followed by polymerization (70 ° C., 5 h). After completion of the reaction, the reaction solution was added dropwise to diethyl ether under ice cooling, followed by reprecipitation purification to obtain a crude product. This was subjected to reprecipitation purification twice using acetone and diethyl ether to obtain the desired product (13.5 g, 86.7%) as a white solid.
  • reaction solution was frozen and degassed under liquid nitrogen ( ⁇ 196 ° C.), and the eggplant-shaped flask was returned to room temperature, followed by polymerization (70 ° C., 5 h). After completion of the reaction, the reaction solution was added dropwise to diethyl ether under ice cooling, followed by reprecipitation purification to obtain a crude product. This was subjected to reprecipitation purification twice using acetone and diethyl ether to obtain the desired product (14.7 g, 95.3%) as a white solid.
  • NIPAAm (15.0 g, 133 mmol), N-Acryloyl-L-Phenylalanine methyl ester (0.42 g, 1.81 mmol), DMAPAAm (0.65 g, 4.17 mmol) were dissolved in DMF and MPA (7.32 mmol; NIPAAm, 1.00 mol) 0.055 mol) and AIBN (0.53 mmol; NIPAAm, 0.004 mol with respect to 1.00 mol) were sequentially added.
  • the reaction solution was frozen and degassed under liquid nitrogen ( ⁇ 196 ° C.), and the eggplant-shaped flask was returned to room temperature, followed by polymerization (70 ° C., 5 h).
  • reaction solution was added dropwise to diethyl ether under ice cooling, followed by reprecipitation purification to obtain a crude product. This was subjected to reprecipitation purification twice using acetone and diethyl ether to obtain the desired product (14.3 g, 89.0%) as a white solid.
  • NIPAAm (3.00 g, 26.5 mmol), N-Acryloyl-L-Tryptophan methyl ester (0.11 g, 0.42 mmol), DMAPAAm (0.13 g, 0.83 mmol) were dissolved in DMF and MPA (1.46 mmol; NIPAAm, 1.00 mol) 0.055 mol) and AIBN (0.11 mmol; NIPAAm, 0.004 mol with respect to 1.00 mol) were sequentially added.
  • the reaction solution was frozen and degassed under liquid nitrogen ( ⁇ 196 ° C.), and the eggplant-shaped flask was returned to room temperature, followed by polymerization (70 ° C., 5 h).
  • reaction solution was added dropwise to diethyl ether under ice cooling, followed by reprecipitation purification to obtain a crude product. This was subjected to reprecipitation purification twice using acetone and diethyl ether to obtain the desired product (3.16 g, 97.5%) as a white solid.
  • NIPAAm (0.646 g, 5.7 mmol), DMAAm (0.647 g, 6.5 mmol), N-acryloyl-sulfamethazine (0.378 g, 1.4 mmol) are dissolved in DMF, and the RAFT agent (2- (Dodecylthiocarbonothioylthio) -2-methylpropionic acid) (0.076 mmol) and AIBN (0.03 mmol) were added sequentially.
  • the reaction solution was frozen and degassed under liquid nitrogen ( ⁇ 196 ° C.), and the eggplant-shaped flask was returned to room temperature, followed by polymerization (70 ° C., 5 h).
  • reaction solution was added dropwise to diethyl ether under ice-cooling, followed by reprecipitation purification to obtain a crude product. This was subjected to reprecipitation purification twice using acetone and diethyl ether to obtain the desired product (1.64 mg, 98.0%) as a white solid.
  • NIPAAm (2.00 g, 17.7 mmol), N-Acryloyl-L-Phenylalanine (0.20 g, 0.93 mmol) are dissolved in DMF, and the RAFT agent (2- (Dodecylthiocarbonothioylthio) -2-methylpropionic acid) (0.2 mmol; 1/75 eq) and AIBN (0.09 mmol; 0.4 / 75 eq) were added sequentially.
  • the reaction solution was frozen and degassed under liquid nitrogen ( ⁇ 196 ° C.), and the eggplant-shaped flask was returned to room temperature, followed by polymerization (70 ° C., 5 h).
  • reaction solution was added dropwise to diethylether under ice-cooling, followed by reprecipitation purification to obtain a crude product. This was subjected to reprecipitation purification twice using acetone and diethyl ether to obtain the desired product (2.21 g, Quant) as a white solid.
  • LCST measurement The LCST of the polymer was calculated by measuring the transmittance.
  • An aqueous polymer solution (H 2 O or PBS) was prepared to 5 mg / mL, the temperature was raised with a temperature gradient of 0.1 ° C./min, and the temperature at which the transmittance was 50% was defined as LCST.
  • P NIPAAm-co-DMAAm48% -co-SMZ10%) is using a pH buffer solution was prepared based on 5 mM Na 2 H PO 4/ 150 mM NaCl solution and 5 mM NaH 2 PO 4/150 mM NaCl aqueous solution Adjusted to 5 mg / mL.
  • PNIPAAm-FL Dissolve the active esterified polymer (0.09 g, 0.02 mmol) obtained by succinylation of the above PNIPAAm in 1,4-dioxane, and add 5-aminofluorescein (0.02 g, 0.05 mmol; 2.5 eq) And stirred at 25 ° C. for 72 h. After completion of the reaction, the solvent was distilled off to obtain a crude product. This was dissolved in methanol and dialyzed with a regenerated cellulose membrane (MWCO 3,500) until the unreacted fluorescent group did not leak into the external solution. Thereafter, the solvent was distilled off to obtain PNIPAAm-FL (0.08 g, 80.0%) as an orange solid.
  • the filtrate was distilled off, dissolved in acetone, dropped into ice-cold diethyl ether and purified by reprecipitation to obtain the desired succinylated polymer (2.30 g, 79.3%) as a white solid.
  • LCST measurement The LCST of the polymer was calculated by measuring the transmittance. A polymer 5 mg / mL solution (PBS) was prepared, and the temperature was raised with a temperature gradient of 0.1 ° C./min, and the temperature at which the transmittance became 50% was defined as LCST. Equipment; Ultraviolet Visible Near-Infrared Spectrophotometer (JASCO V-630), ETC-717 ice-cold Peltier constant temperature cell holder (JASCO) and electric Peltier temperature automatic controller (KRUSS PT31). Measurement wavelength; 600 nm
  • LCST was measured (FIG. 13).
  • the LCST of this polymer was H 2 O
  • PNIPAAm was 32.2 ° C
  • P (NIPAAm-co-BMA3%) was 26.7 ° C
  • P (NIPAAm-co-DMAPAAm2%) was 37.7 ° C
  • P (NIPAAm-co- L-Phe1.3% -co-DMAPAAm3%) was 37.9 ° C
  • P (NIPAAm-co-L-Trp1.5% -co-DMAPAAm3%) was 37.5 ° C.
  • the target amino acid derivative polymer with LCST was synthesized at around 37 ° C, but the polymer aggregation was influenced by ions. It was suggested in the study of ionic interactions. Since the cellular uptake experiment of the fluorescent polymer was carried out in a medium, the LCST of the polymer was measured with a MEM serum-free medium and PBS which is a cell isotonic solution.
  • the polymer LCST in PBS is 29.7 ° C for PNIPAAm, 26.7 ° C for P (NIPAAm-co-BMA3%), 32.4 ° C for P (NIPAAm-co-DMAPAAm2%), P (NIPAAm-co-L-Phe1.3 % -co-DMAPAAm3%) was 32.9 ° C, and P (NIPAAm-co-L-Trp1.5% -co-DMAPAAm3%) was 31.0 ° C.
  • LCST decreased in all polymers. Since there was no difference between PBS and MEM serum-free medium, PBS was used in the subsequent measurements.
  • the LCST of P (NIPAAm-co-L-Phe5%) for LAT1 selectivity was 30.0 ° C / 50.2 ° C in H 2 O / PBS.
  • L-phenylalanine has a pKa of 5.5
  • PBS has a pH of 7.4
  • H 2 O absorbs CO 2 in the air and is inclined toward the acidic side. Therefore, it is considered that the carboxyl group of N-Acryloyl-L-Phenylalanine is ionized in PBS and LCST increases.
  • Particle size measurement by dynamic light scattering was performed with H 2 O and PBS solution (FIG. 15).
  • H 2 O aqueous solution the increase in the particle diameter of P (NIPAAm-co-DMAPAAm2%), which is a polymer having a cation charge, at LCST or higher was enhanced compared to other polymers.
  • PBS solution the polymer had a significant increase in particle size due to the interaction with ions. Since the cell uptake experiment is performed in a medium, it is important to accurately determine the particle size of the polymer in an environment close to that in determining the route of polymer uptake.
  • P (NIPAAm-co-DMAPAAm2%)-FL, P (NIPAAm-co-L-Phe-OMe1.3% -co-DMAPAAm3%)-FL, 2P (NIPAAm-co-L-Trp-OMe1.5%- co-DMAPAAm3%)-FL is positively charged above LCST and is thought to be due to the DMAPAAm unit introduced into the polymer chain in anticipation of cell membrane adhesion.
  • HeLa cells were cultured at 37 ° C. and 5% CO 2 concentration in a 75 cm 2 culture flask using MEM supplemented with 10% FBS, 1% antibacterial agent (Penicillin-Streptomycin Glutamine) and MEM NEAA. At the time of passage, the cells were detached with trypsin and cultured in a 75 cm 2 culture flask for 2-3 days. 3-2-2. Changes over time and examination of optimum concentration RAW264.7 cells were cultured in a 24-well plate (1 ⁇ 10 5 cells, 1 mL / well) at 37 ° C. in a 5% CO 2 concentration environment for 24 hours. Fluorescent polymers were dissolved in PBS and prepared at different concentrations (0.1, 0.5, 1, 2 mg / mL).
  • HeLa cells were cultured in a 24-well plate (2.5 ⁇ 10 4 cells, 1 mL / well) at 37 ° C. in a 5% CO 2 concentration environment for 24 hours.
  • the fluorescent polymer was dissolved in PBS and prepared at different concentrations (0.1, 0.5, 1, 2, 4 mg / mL). 100 mL of this was added to the cultured cells, and the final concentration of the fluorescent polymer in the cell solution was determined. 10, 50, 100, 200, 400 mg / mL. After being left for 1, 2, and 4 h, the wells were washed three times with PBS. Subsequently, it was fixed with 4% paraformaldehyde phosphate buffer solution for 20 min and washed twice with PBS.
  • HeLa cells were cultured on 24-well plates (2.5 ⁇ 10 4 cells, 1 mL / well) at 37 ° C. in a 5% CO 2 concentration environment for 24 hours.
  • the fluorescent polymer was prepared at 4 mg / mL. 100 mL of this was added to the cultured cells, so that the final concentration of the fluorescent polymer in the cell solution was 400 mg / mL.
  • the wells were washed 3 times with 2 mM EDTA / PBS. Subsequently, it was fixed with 4% paraformaldehyde phosphate buffer solution for 20 min and washed twice with 2 mM EDTA / PBS.
  • RAW264.7 cells were cultured on 6-well plates (2 ⁇ 10 5 cells, 2 mL / well) at 37 ° C. in a 5% CO 2 concentration environment for 24 hours.
  • a fluorescent polymer solution (2 mg / mL) prepared by dissolving in PBS was added to 200 mL per 1-well, so that the final concentration of the fluorescent polymer in the cell solution was 200 mg / mL.
  • HeLa cells were cultured on 6-well plates (5 ⁇ 10 4 cells, 2 mL / well) for 24 h in a 37 ° C., 5% CO 2 concentration environment.
  • a fluorescent polymer solution (2 mg / mL) prepared by dissolving in PBS was added to 200 mL per 1-well, so that the final concentration of the fluorescent polymer in the cell solution was 200 mg / mL.
  • the plate was washed 3 times with PBS, fixed with 4% paraformaldehyde phosphate buffer solution for 20 min, and washed twice with PBS. 2 mL of PBS was added and observed with a fluorescence microscope.
  • HeLa cells were Lab-Tek (R) II Chamber Slide TM System 4-well (2.5 ⁇ 10 4 cells, 1 mL / well) over at 37 °C, 5% CO 2 concentration environment under 24 h culture.
  • 100 mL of the fluorescent polymer solution (4 mg / mL) prepared by dissolving in PBS was added to the cultured cells, so that the final concentration of the fluorescent polymer in the cell solution was 400 mg / mL.
  • the plate was washed 3 times with PBS, fixed with 4% paraformaldehyde phosphate buffer solution for 20 min, and washed twice with PBS.
  • the sample was encapsulated with a Fluoromount TM aqueous mounting medium and observed with a fluorescence microscope.
  • the plate was washed 3 times with PBS and fixed with 4% paraformaldehyde phosphate buffer solution for 20 min. After washing once with PBS, 2 mL of Hoechst33258 solution (5 mg / mL) was added and left for 15 min. After washing twice with PBS, 2 mL of PBS was further added, and observation with a fluorescence microscope was performed.
  • HeLa cells were 37 °C, 5% CO 2 concentration environment under 24 h cultured on Lab-Tek (R) II Chamber SlideTM System 4-well (2.5 ⁇ 10 4 cells, 1 mL / well). 100 mL of the fluorescent polymer solution (4 mg / mL) prepared by dissolving in PBS was added to the cultured cells, so that the final concentration of the fluorescent polymer in the cell solution was 400 mg / mL. After standing for 4 h, LysoTracker (R) Red DND-99 (50 nM) was added to the serum-free medium, and left at 37 ° C. in a 5% CO 2 concentration environment for 30 min.
  • LysoTracker (R) Red DND-99 50 nM
  • the plate was washed 3 times with PBS and fixed with 4% paraformaldehyde phosphate buffer solution for 20 min.
  • the wells were washed once with PBS, sealed using VECTORSHIELD HardSet Mainting Medium with DAPI, and observed with a fluorescence microscope.
  • RAW264.7 cells were cultured on multiwell plates (1 ⁇ 10 5 cells, 1 mL / well) for 24 h in a 37 ° C., 5% CO 2 concentration environment. The serum-containing medium was removed, the wells were washed once with PBS, and serum-free medium was added. After adding inhibitor diluted in serum-free medium, 450 ⁇ M sucrose, 10 ⁇ g / mL chlorpromazine multiwell plate was incubated for 1 h, 10 ⁇ g / mL Fillipin, 10 ⁇ M Cytochalasin D added multiwell plate was incubated for 30 min .
  • the fluorescent polymer was dissolved in PBS to prepare 2 mg / mL, and 100 mL was added to the cultured cells, so that the final concentration of the fluorescent polymer in the cell solution was 200 mg / mL. After 4 hours, the wells were washed 3 times with PBS. Subsequently, it was fixed with 4% paraformaldehyde phosphate buffer solution for 20 min and washed twice with PBS. 1 mL of PBS was added, and the fluorescence intensity was measured with a plate reader.
  • clathrin-dependent endocytosis clathrin and a receptor protein that penetrates the plasma membrane create a coating pit of 100 to 150 nm, and further changes the membrane into a spherical shape to form a clathrin-coated vesicle. It is a mechanism that transports various extracellular substances into cells. From the previous chapter, the size of this fluorescent polymer at the time of LCST is 100-150 nm, so it is considered that this result was consistent with the correlation between the size and the cellular uptake pathway. However, there are many unexplained parts about the cellular uptake pathway, and it is difficult to say that only the size is involved in the uptake. In order to clarify this study, it is considered necessary to further study using other inhibitors.
  • FBS (-) could not erase the background of the fluorescent polymer even after washing with 2 mM EDTA / PBS, and the same results were obtained above LCST.
  • FBS (+) there was a difference in the results of fluorescent polymer uptake experiments between LCST and above. This suggested the possibility of blocking nonspecific adsorption of fluorescent polymers in the presence of FBS.
  • the fluorescence derived from the fluorescent polymer was not confirmed in the cells taken up under LCST, and the fluorescence inside the cells was confirmed three-dimensionally when taken up after LCST.
  • the cells were distributed in the form of dots in any fluorescent polymer in cells over LCST. From the above, it was confirmed that cell uptake also shows a temperature-dependent behavior in cancer cells.
  • the whole molecule Since the whole molecule has a planar structure, it is known to have a property of emitting strong fluorescence. Although it has already been reported that the pH response of fluorescent polymers is derived from the nature of this fluorescent group, the pH of lysosomes is maintained at pH 5.5 or more acidic. There is a possibility that the fluorescent polymer is not shining though the fluorescent polymer is present in the inside. Therefore, it is necessary to study using a fluorescent polymer modified with another fluorescent group.
  • Experimental section 4-2-1 Cell Culture HeLa cells were cultured at 37 ° C. and 5% CO 2 concentration in a 75 cm 2 culture flask using MEM supplemented with 10% FBS, 1% antibacterial agent (Penicillin-Streptomycin Glutamine) and MEM NEAA as a medium. At the time of passage, the cells were detached with trypsin and cultured in a 75 cm 2 culture flask for 2-3 days.
  • HeLa cells were cultured on a 35 mm glass bottom dish (5 ⁇ 10 4 cells, 2 mL / well) at 37 ° C. in a 5% CO 2 concentration environment for 24 hours. 200 mL of the fluorescent polymer solution (4 mg / mL) prepared by dissolving in PBS was added to the cultured cells in the glass bottom dish, so that the final concentration of the fluorescent polymer in the cell solution was 400 mg / mL. After leaving at 37 ° C.
  • MeOH Nacalai tesque Immobilon-P (PVDF Pore size 0.45mm): MILLIPORE CHROMATOGRAPHY PAPER Grade: 3MM CHR: GE Healthcare Extra Thick Blot Paper: BIO-RAD Skimmed Milk: Snow Brand Anti human L-type amino acid transpoter 1 (LAT1) polyclonal antibody rabbit: Transgenic Inc.
  • LAT1 L-type amino acid transpoter 1
  • Anti beta-actin antibody rabbit SIGMA ALDRICH ECL anti-rabbit IgG, HRP-Linked Whole Antibody: GE Healthcare ECL Prime Western Blotting Detection Reagent: GE Healthcare Alexa Fluor (R) 594-labeled donkey anti-rabbit IgG antibodies: Invitrogen Fluoromount TM aqueous mounting media: SIGMA-ALDRICH VECTORSHIELD HardSet Mainting Medium with DAPI: Vector Labolatories 4% Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution: Wako Pure Chemical Industries, Ltd. Albumin, from Human Serum: SIGMA-ALDRICH L-Leucine, [4,5- 3 H]: Moravek Biochemicals, Inc.
  • HeLa cells were cultured at 37 ° C. and 5% CO 2 concentration in a 75 cm 2 culture flask using MEM supplemented with 10% FBS, 1% antibacterial agent (Penicillin-Streptomycin Glutamine) and MEM NEAA. At the time of passage, the cells were detached with trypsin and cultured in a 75 cm 2 culture flask for 2-3 days.
  • HEK 293 cells were cultured at 37 ° C. and 5% CO 2 concentration in a 75 cm 2 culture flask using MEM supplemented with 10% FBS, 50 units / mL penicillin, 50 mg / mL streptomycin, and MEM NEAA as a medium. At the time of passage, the cells were detached with trypsin and cultured in a 75 cm 2 culture flask for 3-5 days.
  • SDS sample buffer sodium dodecyl sulfate, 2-mercaptoethanol, 1M Tris-HCl
  • SDS-polyacrylamide gel electrophoresis After protein separation, it was transferred to a PVDF transfer membrane.
  • Anti-human L-type amino acid transporter (hLAT1) polyclonal antibody (1/500) or anti- ⁇ -actin antibody (1/1000) acts as primary antibody for 90 min
  • TBST buffer Tris-HCl, Tween20, 5N NaCl, H 2 O .
  • anti-rabbit IgG and HRP-Linked total antibody (1/10000) were allowed to act for 60 min as secondary antibodies. After washing with TBST and TBS, it was immersed in ECL Prime and observed with Image Quant LAS 4000.
  • an anti-human L-type amino acid transporter (LAT1) polyclonal antibody (1/100) was incubated at 4 ° C. overnight and washed 3 times with PBS for 5 min.
  • Alexa Fluor (R) 594-modified anti-rabbit IgG antibody (1/1000) was incubated as a secondary antibody for 60 min at room temperature and washed 3 times with PBS for 5 min.
  • VECTORSHIELD HardSet Mainting Medium with DAPI was dropped on the slide glass and observed with a fluorescence microscope.
  • Buffer was aspirated and sample was added. After the uptake time, sample was removed from the well and the inside of the well was washed with cold buffer. 1% Triton X / 1N NaOH was added and left in the refrigerator overnight. The next day, 1N HCl was added, then added to the vial containing Clear-sol I, and the measurement was performed with a liquid scintillation counter. Sample; L- [ 3 H] leucine: 2, 5, 10 min, L- [ 3 H] leucine + 2 mM BCH: 10 min, L- [ 3 H] leucine: 2, 10 min.
  • HeLa cells in a fluorescence microscope was Lab-Tek (R) II Chamber Slide TM System 4well (2.5 ⁇ 10 4 cells, 1 mL / well) over at 37 °C, 5% CO 2 concentration environment under 24 h culture.
  • 200 mL of the fluorescent polymer solution (2 mg / mL) prepared by dissolving in PBS was added to the cultured cells in the glass bottom dish, so that the final concentration of the fluorescent polymer in the cell solution was 200 mg / mL.
  • the wells were washed once with PBS, sealed using VECTORSHIELD HardSet Mainting Medium with DAPI, and observed with a fluorescence microscope.
  • HEK 293 cells express less hLAT1 than HeLa cells, but RAW 264.7 cells are derived from mice, so even if the mouse L-type amino acid transporter (mLat1) is expressed. There is a possibility that it was not recognized by the antibody used this time.
  • mLat1 mouse L-type amino acid transporter
  • LAT1 target polymer uptake into L- [ 3 H] leucine cells In order to investigate the effect of polymer on the amount of L- [ 3 H] -leucine taken up via LAT1 in HeLa cells, L- [ 3 H]- The amount of leucine intracellular uptake was measured in the presence of BCH known as a LAT1 inhibitor and L-Phe5% which is a LAT1 target polymer.
  • N-acryloyl-L-Phenylalanine-OMe which is an amino acid derivative unit in a ternary polymer, was not recognized by both cells, but the newly produced polymer N-acryloyl-L-Phenylalanine unit was recognized. As a result, the substrate selectivity of the amino acid transporter increased.
  • Cancer cells NCI-H460 were cultured on commercially available cell culture equipment (cell seeding number 2 ⁇ 10 4 cells, 37 ° C., 5% CO 2 ). Three days later, after confirming that the cancer cells NCI-H460 on the culture substrate became confluent, individual cancer cells were obtained by normal trypsin treatment. 5 ⁇ 10 5 cancer cells were transplanted subcutaneously in the back of 10 nude mice.
  • the cancer tissue is excised from the affected area from the cancer-bearing animal, and (1) the L-Phe5% -FL of the present invention is directly applied to the cancer tissue itself, (2) Cancer cells are obtained from cancer tissues by a conventional method, and then cultured (cell seeding number 2 ⁇ 10 4 cells, 37 ° C., 5% CO 2 ) into cancer cells obtained by the L-Phe5% -FL of the present invention. Was made to act. As a result, it was found that in any method, the fluorescent probe of the present invention was taken into cells and observed under a fluorescence microscope.
  • Cell culture equipment was coated with 2.0 ⁇ g / cm 2 of poly (N-isopropylacrylamide), which is a temperature-responsive polymer, and cancer cells NCI-H460 were cultured (cell seeding number 2 ⁇ 10 4 cells, 37 ° C., 5% CO 2).
  • the cultured cell transfer jig with fibrin gel applied to an acrylic plate was allowed to stand on the cultured cell sheet, and the cultured cancer cells were removed. Adhering, the cell culture substrate was cooled at 20 ° C. for 60 minutes.
  • the detached cell sheet was collected from the jig together with the fibrin gel, and the gel (7 mm ⁇ 17 mm ⁇ 2 mm, 5 ⁇ 10 5 cells) with the cell sheet attached was transplanted subcutaneously to the back of 10 nude mice. .
  • the cancer tissue is grown in vivo, the cancer tissue is excised from the affected area from the cancer-bearing animal, and (1) the L-Phe5% -FL of the present invention is directly applied to the cancer tissue itself, (2) Cancer cells are obtained from cancer tissues by a conventional method, and then cultured (cell seeding number 2 ⁇ 10 4 cells, 37 ° C., 5% CO 2 ) into cancer cells obtained by the L-Phe5% -FL of the present invention. Was made to act. As a result, it was found that in any method, the fluorescent probe of the present invention was taken into cells and observed under a fluorescence microscope.
  • the present invention it is possible to provide a fluorescent probe having pathological cell specificity, and the polymer produced according to the present invention can control cell uptake by temperature and pH. Accordingly, the present invention is expected to be applied as a fluorescence imaging technique for tracking physicochemical changes in the cell environment, and is industrially useful in a wide range of technical fields such as medicine and biology.

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Abstract

　正常細胞とがんなどの病態細胞を蛍光イメージングにより見分けることを目的とし、病態細胞特異性を持つ蛍光プローブを提供すること。　水との親和性を有する、或いは水との親和性が変化するポリマーであって、当該ポリマーを構成するモノマーとしてアミノ酸誘導体モノマーを含み、蛍光物質が結合されてなる、ポリマーを用いる。

Description

アミノ酸誘導体蛍光ポリマー及びそれを利用した蛍光プローブ
　本発明は、アミノ酸を側鎖に有するアミノ酸誘導体蛍光ポリマー及びそれを利用した蛍光プローブに関する。特に、温度やｐＨといった周囲環境の変化によって蛍光強度が変化したり、特定の立体構造の存在によって蛍光強度の変化のパターンが変化するポリマーに関する。
　すべての生命活動は、蛋白質を中心とした生体分子の相互作用によって担われている。即ち、細胞内においては、特定の生体分子が他の物質と相互作用を行い、これによって反応が進行している。従って、蛋白質間相互作用、あるいは蛋白質と他の分子との相互作用を研究し、解明することは、生物の発生・分化・増殖などの生体反応や薬理機構の解明といった領域、さらにはバイオセンサー・新薬の開発といった領域への展開も期待できる。
　生命科学研究の発展とゲノム解読の進展により、細胞内情報伝達物質やその物質を認識する分子が次々と同定され、試験管内での性質が明らかにされてきた。次の目標として残ったのは、実際に発現している遺伝子 (主にタンパク質) の生理的条件での機能の解明である。これらの情報は遺伝子情報だけでは解明できず、細胞の“生きたまま”の機能を調べることが必要とされる。蛍光イメージングは、これらを解明するための基盤技術として注目されている。すなわち生体分子が、どの細胞内小器官に、どの細胞に、どの臓器に、というような“場”の情報、そしてどのような時間経過で発現し消長するかという時間情報を得るために、蛍光イメージングは重要な手法と言える。現在、蛍光イメージング研究が精力的に行われているが、in vitroでのものが中心である。中には、細胞膜透過性が低い蛍光プローブもあり、マイクロインジェクション法などの細胞侵襲的な方法を用いて細胞へプローブを導入しているものもある（非特許文献１）。今後のイメージング研究は、in vivoで扱うことを指向した設計が必要と言える。
　このような背景から、研究では、正常細胞とがんなどの病態細胞を蛍光イメージングにより見分けることを目的とし、病態細胞特異性を持つ蛍光プローブの開発を目指した。そこで、生体内において分子認識能の高いアミノ酸の誘導体モノマーを導入した三元ポリマーを開発し、温度制御型の細胞への取り込み能を評価した。また、がん細胞が正常細胞より高温かつ低pH環境下にあることに着目し、NIPAAmにpH応答性モノマーであるacryloyl sulfamethazine誘導体モノマーを共重合し、温度及びpH制御型の細胞への取り込み能を評価した。蛍光ポリマーは温度及びpHに応答して蛍光シグナルを変化できることは既往研究で確認しており（非特許文献２）、生体内の物理化学的変化をイメージングする際に有用なツールになると考えられる。
　また、前述したように、蛍光イメージングには“場”の情報を提供するツールとして重要である。通常、ナノサイズのキャリアではエンドサイトーシスという小胞輸送系経路で取り込まれる（非特許文献３）(Fig. 3-1)。中山らは、温度応答性ポリマーを修飾したナノキャリアであるPNIPAAm-PLAミセルは、細胞内に取り込まれた後、一般的なナノ粒子に見られる細胞内ライソソームでの局在は見られず、ゴルジ体及び小胞体に分布していることを確認している（非特許文献４、非特許文献５）。また、河野らは、サクシニル基とNIPAAmを結合させたポリグリシドール (NIPAM-Suc-HPG) を表面に修飾し薬物を封入したリポソームにおいて、それらはエンドサイトーシスで取り込まれ、ライソソームに移行する前のエンドソーム膜と融合し、薬物を放出することを確認している（非特許文献６、非特許文献７）。このように、ナノキャリア表面に修飾した温度応答性ポリマー鎖が細胞への取り込みに何らかの影響を及ぼしていることが示唆され、詳細な細胞内移行メカニズムは分かっていないが、核酸やタンパク質などのライソソーム環境で分解されやすいバイオ医薬品の細胞内デリバリーを実現する上で、温度応答性高分子を修飾したナノキャリアは有用なツールとして期待される。以上の背景から、本発明者らは温度応答性ポリマーを修飾した蛍光ポリマーにおける細胞内取り込み経路及び局在化の検討を行った。
　また、病態細胞と正常細胞を見分けるために、温度という指標以外にも病態細胞特異的な標的指標を考える必要がある。そこで、本発明者らはがん細胞特異的に発現するシステムLアミノ酸トランスポーター 1 (L-type Amino acid Transporter; LAT) に着目した。LAT1はがん細胞特異的に発現するトランスポーターであり、ヒト腫瘍組織を用いた検討により、多くのがん組織でLAT1の発現が亢進していることが知られている。Cell Lineでのがん細胞においてはOST、C6 glioma、HeLa、T3M4などにLAT1の発現が多いことが知られている。またLAT1の基質としては側鎖の疎水性の高い中性必須アミノ酸であり、分子内にαカルボキシル基、αアミノ基を持つものの特異性が高いとされる。そこでN-acryloyl-L-phenylalanineをNIPAAmと共重合させ、HeLa細胞におけるLAT1への細胞認識能を評価した。N-acryloyl-L-phenylalanineはLAT1により取り込まれる多発性骨髄腫治療薬のメルファランの基本構造であるL-phenylalanineの誘導体であり、これまで作製したN-acryloyl-L-phenylalanine-OMeなどのモノマーとは異なり、αカルボキシル基が存在することによってLAT1選択性が高いと考えられる。
　上記のような研究には、生体内の状況や物質の変化を可視化する技術の開発が必須である。実際、そのような可視化の技術を伴う研究が盛んになされている。一例を挙げると、理化学研究所の宮脇敦史らのグループによる、増殖期にある細胞と休止期にある細胞との識別技術がある（非特許文献８）。宮脇らは、増殖期と休止期とで、細胞内には異なる蛋白質が増えることに着目し、その異なる蛋白質のそれぞれに別々の色調を示す蛍光物質を結合させ、蛍光の色によって細胞が何れの時期にあるかを見分けられるようにした。
　また、小林久隆らの米国国立衛生研究所と東京大学との研究チームは、新たな蛍光物質を開発した（非特許文献９）。これらの蛍光物質は、従来のものと比べて強く発光する。従って、これらの蛍光物質を癌細胞に取り込ませたり癌細胞の表面に結合させることにより、小さな癌が発見できるようになると期待されている。
　上記のように、高感度での測定では、蛍光が利用されている。そのような蛍光の利用技術の一つとして、蛍光共鳴エネルギー移動（Fluorescence Resonance Energy Transfer:FRET）も知られている。ＦＲＥＴは、蛍光成分を有する物質、例えば蛋白質の空間パターンや時間的変動など、生理現象のより本質的な理解に有用な情報を提供し得ると考えられる。
　ところで、従来の蛍光物質は、一度蛍光を発すると、その状態における測定ができるのみであった。一方、インテリジェント・マテリアルと呼ばれ、環境の変化（光、熱、ｐＨ、電気的刺激等）を感知しそれに対応して自身の機能をコントロールするような刺激感受性ポリマーが知られており、中でも、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）（Poly-N-isopropylacrylamide；PNIPAAm）は、温度応答性材料として有用である。ＰＮＩＰＡＡｍは、水素結合性部位をもっている。そのため、水中において、環境温度が低い場合にはポリマー鎖のまわりに水分子が強く付着し、その結果ＰＮＩＰＡＡｍが水に溶解する。しかし、温度を上げると水素結合が切断されポリマーは裸となり、水と相分離し、不溶性となって沈殿する。このような温度応答性を蛍光物質に付与すれば、蛍光物質に新たな用途が加わると考えられる。
　特許文献１（特開２００７－２３８４６７）には、温度応答性ポリマーの分子中に蛍光物質であるベンゾクロメノン化合物を結合させること、より具体的には、ベンゾクロメノン化合物が結合されてなる温度応答性ポリマーを含む蛍光試薬等が開示されている。特許文献１によると、ベンゾクロメノンイル基を有するこのポリマーの蛍光波長は極性溶媒中で４６０ｎｍ以上であり、従って、測定系に共存する芳香環による影響を受けにくいという特性を有するとのことである（段落番号［００３３］）。また、特許文献１は、このような蛍光試薬の用途として、当該試薬を含む溶液中の環境変化又は当該化合物で標識化した分子の変化の追跡を挙げている（段落番号［００３３］）。
　さらに、特許文献２（特開２００６－１６２５１２）には、温度応答性を有する蛍光性温度プローブであって、二つ以上のセグメント鎖から構成されるブロックポリマーやグラフトポリマーが開示されている。しかし、特許文献２には、温度の変化に応じて発明に係るプローブの蛍光強度がどのように変化したかについて、実験結果が全く示されておらず、当該プローブのセンサー機能についても、センシングに使用できる可能性が示されているにすぎない。すなわち、特許文献２は、具体的にどのようなポリマー合成したら、どのような条件でどのようなプローブとして使用できるかに関し、具体的な記載を欠くものである。
特開２００７－２３８４６７ 特開２００６－１６２５１２
Okabe, I. Noriko, C. Goto, Y. Harada, T. Funatsu, S. Uchiyam a. Intracellular temperature mapping with a fluorescent polymeric thermometer and fluorescence lifetime imaging microscopy.: Nature Communications, 3, 705, (2012) 嶋村美来. 蛍光イメージングへの適用を目指した環境応答型蛍光ポリマーの開発 : 慶應義塾大学 薬学部 2011年度修士論文, (2012) 米田悦啓. 細胞内輸送がわかる タンパク質・核酸輸送の基本から最新の分子イメージング技術まで. 羊土社, (2002) J. Akimoto, M. Nakayama, K. Sakai, T. Okano.Temperature-Induced Intracellular Uptake of Thermoresponsive Polymeric Micelles: Biomacromolecules, 10, 1331, (2009) 中山正道. 温度応答性薬物キャリア. : Drug Delivery System 25, 5, 483-492, 日本医学館, (2010) 河野健司. リポソームを機能化するための高分子材料. : Drug Delivery System 23, 6, 645-653, 日本医学館, (2008) T. Kaiden, E. Yuba, A. Harada, Y. Sakanishi, K. Kono. Dual Signal-Responsive Liposomes for Temperature-Controlled Cytoplasmic Delivery. 出版地不明 : Bioconjugate Chem., 22, 1909-1915, (2011) Sakaue-Sawano A.,et al.,Cell,132,487-498(2008) Urano Y.,et al.,Nat.Med.,15,104-109(2008)
　このような背景から、本発明の目的は、正常細胞とがんなどの病態細胞を蛍光イメージングにより見分けることを目的とし、病態細胞特異性を持つ蛍光プローブを提供することにある。
　また、ポリマーの周囲環境、具体的には温度やｐＨが変化することにより蛍光強度に変化が生じる蛍光性温度応答性及び／又はｐＨ応答性ポリマーを提供することにある。
　本発明の他の目的は、蛍光性温度応答性及び／又はｐＨ応答性ポリマーを用い、蛍光共鳴エネルギー移動の原理を利用して蛍光発生成分を有する物質等を測定する方法を提供することにある。ここで、蛍光発生成分とは、例えば芳香環を有する化合物であり、本発明の方法は、測定系に共存する芳香環を積極的に利用しようとするものである。
　本発明のさらに他の目的は、特定の蛍光性温度応答性ポリマーを用い、水系溶媒の温度を測定する方法を提供することと、特定の蛍光性ｐＨ応答性ポリマーを用い、水系溶媒のｐＨを測定する方法を提供することにある。
　本発明のさらに他の目的は、光学異性体を有するモノマー成分を含む蛍光性温度応答性及び／又はｐＨ応答性ポリマーを用い、これと共存する測定対象の三次元高次構造、又は、当該測定対象の有無を判定する方法を提供することにある。
　本発明のさらに他の目的は、上記の蛍光性温度応答性及び／又はｐＨ応答性ポリマーを含む蛍光プローブを提供することにある。
　本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、水との親和性を有する、或いは水との親和性が変化するポリマーもしくはコポリマーであって、側鎖の一部アミノ酸残基を有し、かつ蛍光物質が結合されてなるポリマーが上記課題を解決するために有用であることを見いだした。本発明はかかる知見に基づいてなされたものである。
　即ち、本発明は以下に示される。
［１］
　水との親和性を有する、或いは水との親和性が変化するポリマーであって、当該ポリマーを構成するモノマーとしてアミノ酸誘導体モノマーを含み、蛍光物質が結合されてなる、ポリマー。
［２］
　ポリマーを構成するモノマーとして、Ｎ－イソプロピルアクリルアミド、ブチルメタクリレート、Ｎ－アクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノメチルアクリルアミドから選択される少なくとも１種を含むものである、［１］記載のポリマー。
［３］
　水との親和性を有する、或いは水との親和性が変化するポリマーもしくはコポリマーであって、側鎖の一部が下式（Ａ）及び／又は下式（Ｂ）なる構造であり、蛍光物質が結合されてなる、ポリマー。
式（Ａ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 （式中、Ｒ1は、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 を表し、
Ｒ２は、Ｈ、ＣＨ３、またはＣＨ２ＣＨ３を表す）
式（Ｂ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 （式中、Ｒ３は、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
 Ｒ２は、Ｈ、ＣＨ３、またはＣＨ２ＣＨ３を表す）
［４］
　水との親和性を有するポリマーを構成するものが、少なくともポリエチレングリコール、ポリ－Ｎ－アクリルアミド、ポリ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアクリルアミドを含むものである、［３］記載のポリマー。
［５］
　水との親和性が変化するポリマーを構成するものが、温度及び／又はｐＨの変化により水系溶媒に対する親和性が変化するものである、［１］記載のポリマー。
［６］
　アミノ酸誘導体モノマーが光学異性体を有するアミノ酸誘導体である、［１］～［５］のいずれか１項記載のポリマー。
［７］
　少なくともｐＨの変化により水に対する親和性が変化するポリマーであって、ポリマーの構成モノマーとしてイオン性基を有する化合物を含む、［１］～［６］のいずれか１項記載のポリマー。
［８］
　蛍光物質が親水性環境下においてより強い蛍光を発する物質である、［１］～［７］のいずれか１項記載のポリマー。
［９］
　蛍光物質がフルオレセイン系蛍光物質又はクマリン系蛍光物質である、［１］～［８］のいずれか１項記載のポリマー。
［１０］
　蛍光物質がフルオレセイン系蛍光物質である、［１］～［８］のいずれか１項記載のポリマー。
［１１］
　少なくともｐＨの変化により水に対する親和性が変化するポリマーであって、特定のｐＨ環境下でより強い蛍光を発する蛍光物質が結合されてなる、［１］～［９］のいずれか１項記載のポリマー。
［１２］
　温度及び／又はｐＨの変化により水に対する親和性が変化するポリマーであって、蛍光物質が結合されてなるポリマーを、水中で蛍光発生成分を有する物質の近傍に存在させて、蛍光発生成分とポリマー中の蛍光物質との間で蛍光共鳴エネルギー移動を生じさせ、その結果として発生した蛍光の強度を測定する工程を含む、蛍光発生成分を有する物質又はその周囲環境の変化の測定方法。
［１３］
　温度及び／又はｐＨの変化により水に対する親和性が変化するポリマーが、温度の変化により水に対する親和性が変化するポリマーである、［１２］に記載の測定方法。
［１４］
　蛍光発生成分を有する物質が、蛋白質、オリゴペプチド又はポリペプチドである、［１２］及び［１３］のいずれか１項記載の測定方法。
［１５］
　温度及び／又はｐＨの変化により水に対する親和性が変化するポリマーであって、蛍光物質が結合されてなるポリマーが、請求項１～９のいずれか１項記載のポリマーである、［１２］～［１４］のいずれか１項記載の測定方法。
［１６］
　［１］～［１１］のいずれか１項記載のポリマーであって、少なくとも温度の変化により水に対する親和性が変化するポリマーに、水で励起エネルギーを与え、蛍光の発光の程度によって水の温度を測定する工程を含む、水の温度の測定方法。
［１７］
　［１］～［１１］のいずれか１項記載のポリマーであって、少なくともｐＨの変化により水に対する親和性が変化するポリマーに、水中で励起エネルギーを与え、蛍光の発光の程度によって水のｐＨを測定する工程を含む、ｐＨの測定方法。
［１８］
　測定対象を含有するか又は含有することが予想される水（ｘ）中において、及び、測定対象を含有しない水（ｙ）中で、請求項４に記載のポリマーに由来する蛍光を温度及び／又はｐＨを変化させながら測定し、水（ｘ）での測定結果を水（ｙ）での測定結果を比較することにより、水（ｘ）中における測定対象の三次元高次構造、又は、水（ｘ）中に測定対象が存在するか否かを判定する、判定方法。
［１９］
　［１］～［１１］のいずれか１項記載のポリマーであって、その少なくとも片末端には蛍光物質が結合されていないポリマーと、蛋白質、リン脂質、低分子生理活性及び担体からなる群から選択されるいずれかが結合されてなる、蛍光プローブ。
［２０］
　［１］～［１１］のいずれか１項記載のポリマーであって、細胞のアミノ酸トランスポーターと特異的に結合する、蛍光プローブ。
［２１］
　アミノ酸トランスポーターがＬＡＴ１である、［２０］記載の蛍光プローブ。
　本発明により、ポリマーの周囲環境、具体的には温度やｐＨを変化させることにより、繰返して、且つ、異なる条件下においても蛍光測定が行える、新たな蛍光性温度及び／又はｐＨ応答性ポリマーが提供される。このポリマーは、単独で、又は、蛋白質、リン脂質、低分子生理活性、担体等に結合させた状態で、蛍光温度センサー、蛍光ｐＨセンター、蛍光プローブとしての利用が可能である。また、イメージング・プローブや診断用プローブとして、臨床検査や疾病の診断領域での利用も可能である。すなわち、本発明により、生体内分子の動的挙動の解明に有用な、バイオイメージングのための新たな分子ラベルが提供される。
　また、本発明により、蛍光共鳴エネルギー移動を用いた蛍光発生成分を有する物質等の測定方法が提供される。本発明によれば、蛋白質間相互作用等に基づく生体内における変化を、蛍光強度に基づいて、リアルタイムで知ることができるようになる。
　さらに、本発明により、蛍光性温度応答性ポリマーを用いる、水系溶媒の温度を測定する方法と、蛍光性ｐＨ応答性ポリマーを用いる、水系溶媒のｐＨを測定する方法が提供される。本発明によれば、微小空間における温度やｐＨ等の環境変化を測定、感知することが可能となる。
　本発明に係るポリマーであって、その構成モノマーの少なくとも一部として光学異性体を有するアミノ酸誘導体を含むものを使用すると、水系溶媒中において、ある測定対象（蛋白質、オリゴ－又はポリペプチド、低分子生理活性物質等）が存在するか否か、又は、その測定対象の三次元高次構造を判定することが可能となる。
N-acryloyl-L-tryptophan methyl esterの1H-NMR測定（500MHz、CDCl3）の結果を示すチャートである。 N-acryloyl-L-phenylalanine methyl ester の1H-NMR測定（500MHz、CDCl3）の結果を示すチャートである。 N-acryloyl-L-phenylalanine の1H-NMR測定（500MHz、CDCl3）の結果を示すチャートである。 N-acryloyl-sulfamethazine の1H-NMR測定（500MHz、CDCl3,DMSO）の結果を示すチャートである。 ＬＣＳＴに及ぼすコポリマーのモル比の影響を示すグラフ及び表である。 PNIPAAm の 1H-NMR測定（500MHz，D2O）の結果を示すチャートである。 P(NIPAAm-co-BMA3%) の 1H-NMR測定（500MHz，D2O）の結果を示すチャートである。 P(NIPAAm-co-DMAPAAm2%) の 1H-NMR測定（500MHz，D2O）の結果を示すチャートである。 P(NIPAAm-co-L-Phe-OMe1.3%-co-DMAPAAm3%) の1H-NMR測定（500MHz、CDCl3）の結果を示すチャートである。 P(NIPAAm-co-L-Trp-OMe1.5%-co-DMAPAAm3%) の1H-NMR測定（500MHz、CDCl3）の結果を示すチャートである。 P(NIPAAm-co-DMAAm48%-co-SMZ10%) の1H-NMR測定（500MHz、CDCl3）の結果を示すチャートである。 P(NIPAAm-co-L-Phe5%) の 1H-NMR測定（500MHz、CDCl3）の結果を示すチャートである。 (a) H2O 溶液及びPBS 溶液（0.5 w/v%）中におけるポリマー溶液の光透過率の温度依存性を示すグラフである。 5 mM Na2H PO4(NaH2PO4)/150 mM NaCl 溶液(0.5 w/v%) 中における(a) PNIPAAm 及び (b) P(NIPAAm-co-DMAAm48%-co-SMZ10%) のの光透過率の温度依存性を示すグラフである。各ゲラフにおけるpH値は次の通りである。pH = (◇) 6.4, (□) 7.0, (△) 7.4, (×) 7.8, (○) 8.4。 (a) H2O 及び(b) PBS 溶液（200mg/mL）中における動的光散乱による粒子径測定の結果を示すグラフである。各ゲラフにおける符号は次の化合物を意味する。(◇) PNIPAAm, (□) P(NIPAAm-co-BMA3%), (△) P(NIPAAm-co-DMAPAAm2%), (×) P(NIPAAm-co-L-Phe-OMe1.3%-co-DMAPAAm3%), (○) P(NIPAAm-co-L-Trp-OMe1.5%-co-DMAPAAm3%), (＊) P(NIPAAm-co-L-Phe5%)。 5 mM Na2H PO4(NaH2PO4)/150 mM NaCl 溶液中におけるP(NIPAAm-co-DMAAm48%-co-SMZ10%) の 光透過性の pH 依存性を示すグラフである。 PBS 溶液（0.5 w/v%）中におけるポリマー（□）と蛍光ポリマー（○）の光透過率の温度依存性を示すグラフである。図中、各符号は次の化合物を意味する。(上段左のグラフの□) PNIPAAm, (上段左のグラフの●) PNIPAAm-FL, (上段右のグラフの□) P(NIPAAm-co-BMA3%), (上段右のグラフの●) P(NIPAAm-co-BMA3%)-FL, (中段左のグラフの□) P(NIPAAm-co-DMAPAAm2%), (中段左のグラフの●) P(NIPAAm-co-DMAPAAm2%)-FL, (中段右のグラフの□) P(NIPAAm-co-L-Phe-OMe1.3%-co-DMAPAAm3%), (中段右のグラフの●) P(NIPAAm-co-L-Phe-OMe1.3%-co-DMAPAAm3%)-FL, (下段左のグラフの□) P(NIPAAm-co-L-Trp-OMe1.5%-co-DMAPAAm3%), (下段左のグラフの●) P(NIPAAm-co-L-Trp-OMe1.5%-co-DMAPAAm3%)-FL, (下段右のグラフの□) P(NIPAAm-co-L-Phe5%), (下段右のグラフの●) P(NIPAAm-co-L-Phe5%)-FL。 各ポリマー溶液 (PBS) の表面電位を計測した結果を示すグラフである。図中、各符号は次の化合物を意味する。(◇) PNIPAAm-FL，(□) P(NIPAAm-co-BMA3%)-FL，(△) P(NIPAAm-co-DMAPAAm2%)-FL，(×) P(NIPAAm-co-L-Phe-OMe1.3%-co-DMAPAAm3%)-FL，(○) P(NIPAAm-co-L-Trp-OMe1.5%-co-DMAPAAm3%)-FL，(＊) P(NIPAAm-co-L-Phe5%)。 本発明の蛍光ポリマーの例を示す説明図である。 上段はアミノ酸誘導体の合成スキームを、下段は三元ポリマー（ternary polymer）の合成スキームの一例を示す図である。 本発明の三元ポリマーの特徴を示す表及びグラフである。三元ポリマーのＬＣＳＴは、ＰＮＩＰＡＡｍが３２．１℃、Ｌ-Ｐｈｅ－ＯＭｅ１．３Ｄ３が３７．９℃、Ｌ－Ｔｒｐ－ＯＭｅ１．５Ｄ３が３７．５℃であり、モノマーの組成により、ＬＣＳＴを高温側に調節することが可能である。また、三元ポリマーのＬＣＳＴ付近のサイズは、ＰＮＩＰＡＡｍが１３０ｎｍ、Ｌ-Ｐｈｅ－ＯＭｅ１．３Ｄ３が１１０ｎｍ、Ｌ－Ｔｒｐ－ＯＭｅ１．５Ｄ３が１００ｎｍであり、ＬＣＳＴに対応した粒子径変化が可能である。 上段は三元ポリマーの細胞取込みを説明する模式図を、下段は細胞取込みの手順を示す説明図である。 Ｌ-Ｐｈｅ－ＯＭｅ１．３Ｄ３－ＦＬ及びＬ－Ｔｒｐ－ＯＭｅ１．５Ｄ３－ＦＬの三元蛍光ポリマーで処理したＲＡＷ２６４．７細胞の取込みの状態及びフローサイトメトリーの分析結果を示す図である。いずれの蛍光ポリマーも、ＬＣＳＴ以下の環境下で細胞内への取り込みが確認されなかったが、ＬＣＳＴ以上の環境下で細胞内の取り込みが確認された。 Ｌ-Ｐｈｅ－ＯＭｅ１．３Ｄ３－ＦＬ及びＬ－Ｔｒｐ－ＯＭｅ１．５Ｄ３－ＦＬの三成分系ポリマーで処理したＨｅＬａ細胞の取込みの状態及びフローサイトメトリーの分析結果を示す図である。がん細胞においてもＬＣＳＴを境とする温度制御による細胞取り込みが可能であることが示された。 細胞取込みの経路及びポリマー取り込みの阻害を示す図である。 ＲＡＷ２６４．７細胞及びＨｅＬａ細胞のＬ-Ｐｈｅ－ＯＭｅ１．３Ｄ３－ＦＬ及びＬ－Ｔｒｐ－ＯＭｅ１．５Ｄ３－ＦＬの蛍光ポリマー取り込みの状態を説明する図及びグラフである。ＲＡＷ２６４．７細胞において蛍光ポリマーはクラスリン依存性エンドサイトーシスにより、細胞内へ取り込まれる可能性が示唆された。ＨｅＬａ細胞においてはライソゾームに局在する可能性が示唆された。 がん細胞標的ポリマーの説明図である。がん細胞に選択性を持たせるため、がん細胞に特異的に発現するアミノ酸トランスポーター１（Lat1:L-type Amino-acid Transporter 1）を標的とした温度応答性ポリマーを作成した。細胞内に取り込まれた三元ポリマーとは異なり、アミノ酸誘導体モノマーのα－カルボキシル基が存在していることでＬＣＳＴによらない細胞認識能が期待される。 ＬＡＴ１標的ポリマーの特性を示すグラフである。このポリマーは、ＬＣＳＴは５３．５℃であり、アミノ酸誘導体のカルボキシル基がイオン化していることから、細胞取り込み実験を行う温度では常に親水的状態である。また、このポリマーは、細胞取り込み実験を行う温度における粒子径は２５ｎｍ以下であり、ＬＣＳＴに対応した粒子径変化を示す。 ＨｅＬａ細胞における細胞取込みを説明する図である。ＨｅＬａ細胞において、ｈＬＡＴ１発現が確認された。また、ＨｅＬａ細胞に膜上にＬＡＴ１発現が観察された。更に、ＬＣＳＴ以下で蛍光ポリマーによる蛍光が確認された。 ＨｅＬａ細胞によるＬ－［３Ｈ］ロイシンの取り込みの阻害を説明するグラフである。Ｌ－［３Ｈ］ロイシン細胞内取り込みが蛍光ポリマーによって阻害された（＜３０％）。したがって、蛍光ポリマーがＬＡＴ１に対して親和性（affinity）を有する可能性が示唆された。
　本発明のポリマーは、それ自体が温度及び／又はｐＨの変化により水系溶媒に対する親和性が変化するポリマーであって、蛍光物質が結合されてなるものである。
　本発明における「ポリマー」は、モノポリマー（単独重合体）及びコポリマー（２種以上の化学的に異なったモノマーを含む共重合体）の双方を意味する。
　本発明において使用される温度応答性ポリマーとして、例えば、ポリ－Ｎ－ｎ－プロピルアクリルアミド（単独重合体の下限臨界溶解温度２１℃）、ポリ－Ｎ－ｎ－プロピルメタクリルアミド（同２７℃）、ポリ－Ｎ－イソプロピルアクリルアミド（同３２℃）、ポリ－Ｎ－イソプロピルメタクリルアミド（同４３℃）、ポリ－Ｎ－シクロプロピルアクリルアミド（同４５℃）、ポリ－Ｎ－エトキシエチルアクリルアミド（同約３５℃）、ポリ－Ｎ－エトキシエチルメタクリルアミド（同約４５℃）、ポリ－Ｎ－テトラヒドロフルフリルアクリルアミド（同約２８℃）、ポリ－Ｎ－テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド（同約３５℃）、ポリ－Ｎ，Ｎ－エチルメチルアクリルアミド（同５６℃）、ポリ－Ｎ，Ｎ－ジエチルアクリルアミド（同３２℃）などが挙げられる。
　また、本発明に用いられる水に親和性を有するポリマーとしては、例えば、ポリアクリルアミド、ポリ－Ｎ、Ｎ－ジエチルアクリルアミド、ポリ－Ｎ、Ｎ－ジメチルアクリルアミド、ポリエチレンオキシド、ポリアクリル酸及びその塩、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリヒドロキシエチルアクリレート、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、セルロース、カルボキシメチルセルロースなどの含水高分子などが挙げられるが、特に制約されるものではない。
　ここで、「水系溶媒」には、水の他、各種緩衝液等の無機塩水溶液や、３０容量％程度までの量で有機溶媒を含有する水を主成分とする液体も包含される。水を主成分とし、当該溶液中で、温度及び／又はｐＨの変化に伴う第一の発明のポリマーの蛍光強度の変化を測定できる限り、「水系溶媒」である。
　本発明のポリマーの例としては、（１）アクリルアミド系モノマーの重合又は共重合体の片末端又は両末端に蛍光物質が結合され、更に側鎖にアミノ酸残基を有してなるもの、（２）アクリルアミド系モノマーとアクリル酸エステル基やアリル（allyl）基等のエチレン性不飽和基を有する蛍光物質とが共重合され、更に側鎖にアミノ酸残基を有してなるもの（これは、分子の中間に蛍光物質が結合されてなるポリマーである）、（３）アクリルアミド系モノマーとエチレン性不飽和基を有する蛍光物質とが共重合されてなり且つその片末端又は両末端に蛍光物質が結合され、更に側鎖にアミノ酸残基を有してなるもの（これは、分子の中間と末端とに蛍光物質が結合されてなるポリマーである）、（４）アクリロイル基含有モノマーの重合又は共重合体の片末端又は両末端に蛍光物質が結合され、更に側鎖にアミノ酸残基を有してなるもの、（５）アクリロイル基含有モノマーとエチレン性不飽和基を有する蛍光物質とが共重合されてなるもの（これは、分子の中間に蛍光物質が結合されてなるポリマーである）、（６）アクリロイル基含有モノマーとエチレン性不飽和基を有する蛍光物質とが共重合されてなり且つその片末端又は両末端に蛍光物質が結合され、更に側鎖にアミノ酸残基を有してなるもの（これは、分子の中間と末端とに蛍光物質が結合されてなるポリマーである）、（７）アクリルアミド系モノマーと、エチレン性不飽和基とイオン性基とを有するモノマーとの共重合体の片末端又は両末端に蛍光物質が結合され、更に側鎖にアミノ酸残基を有してなるもの、（８）アクリルアミド系モノマーと、エチレン性不飽和基とイオン性基とを有するモノマーと、エチレン性不飽和基を有する蛍光物質とが共重合され、更に側鎖にアミノ酸残基を有してなるもの（これは、分子の中間に蛍光物質が結合されてなるポリマーである）、（９）アクリルアミド系モノマーと、エチレン性不飽和基とイオン性基とを有するモノマーと、エチレン性不飽和基を有する蛍光物質とが共重合されてなり且つその片末端又は両末端に蛍光物質が結合され、更に側鎖にアミノ酸残基を有してなるもの（これは、分子の中間と末端とに蛍光物質が結合されてなるポリマーである）、（１０）アクリロイル基含有モノマーと、エチレン性不飽和基とイオン性基とを有するモノマーとの共重合体の片末端又は両末端に蛍光物質が結合され、更に側鎖にアミノ酸残基を有してなるもの、（１１）アクリロイル基含有モノマーと、エチレン性不飽和基とイオン性基とを有するモノマーと、エチレン性不飽和基を有する蛍光物質とが共重合され、更に側鎖にアミノ酸残基を有してなるもの（これは、分子の中間に蛍光物質が結合されてなるポリマーである）、及び（１２）アクリロイル基含有モノマーと、エチレン性不飽和基とイオン性基とを有するモノマーと、エチレン性不飽和基を有する蛍光物質とが共重合されてなり且つその片末端又は両末端に蛍光物質が結合され、更に側鎖にアミノ酸残基を有してなるもの（これは、分子の中間と末端とに蛍光物質が結合されてなるポリマーである）が挙げられる。
　主鎖をポリエチレンとするために使用される主たる構成モノマーの例として、アクリルアミド、メタクリルアミド（以下、まとめて「（メタ）アクリルアミド」ということがある）、アクリルアミド誘導体（例えばアルキル（メタ）アクリルアミド）等の（メタ）アクリルアミド系モノマー類、アクリロイル基又はメタクリロイル基含有化合物（以下、まとめて「（メタ）アクリロイル基含有化合物」ということがある）等が挙げられる。
　上記ポリマーの製造に使用される（メタ）アクリルアミド系モノマーの例としては、Ｎ－ｎ－プロピル（メタ）アクリルアミド、Ｎ－イソプロピル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジエチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ－プロピル（メタ）アクリルアミド及び（メタ）アクリロイルピロリジンが挙げられる。上記ポリマーの製造に際しては、これらの（メタ）アクリルアミド系モノマーの中のいずれか一種、或いは二種以上が使用されることが好ましい。また、これらの（メタ）アクリルアミド系モノマーに加えて、コモノマーとして、メチルアクリレート、エチルアクリレート等のアルキル（炭素数：１乃至２０程度、好ましくは１乃至３程度）アクリレートやメチルメタクリレート、エチルメタクリレート等のアルキル（炭素数：１乃至２０程度、好ましくは１乃至３程度）メタクリレート、アクリル酸、メタクリル酸、ビニルビロリドン、アクリルアミド、ジメチルアクリルアミド、スチレン等を使用してもよい。なお、アルキルアクリレートやアルキルメタクリレート（以下、まとめて「アルキル（メタ）アクリレート」ということがある）をコモノマーとして使用する場合には、その量は、アクリルアミド系モノマーとアルキル（メタ）アクリレートとの合計の５乃至６０％程度が好ましい。
　（メタ）アクリロイル基含有化合物であるモノマーの具体例としては、Ｎ－（メタ）アクリロイルプロリンのアルキル（炭素数：１乃至２０程度、好ましくは１乃至３程度）エステル等の（メタ）アクリロイル基含有アミノ酸誘導体、（メタ）アクリロイルピリジン等が挙げられる。上記ポリマーの製造に際しては、これらの（メタ）アクリロイル基含有化合物の中のいずれか一種、或いは二種以上が使用されることが好ましい。また、これらの（メタ）アクリロイル基含有化合物とともに、上記コモノマーを使用してもよい。
　本発明に係るポリマーの構成モノマーの少なくとも一部として、例えばＮ－アクリロイルプロリンのメチルエステルのような光学異性体を有する化合物、より具体的には光学活性アミノ酸誘導体を使用することができる。光学活性アミノ酸誘導体は、ポリマー主鎖の構成モノマーの全て（但し、蛍光物質に由来する部分を除く）であってもよいし、一部であってもよい。また、構成モノマーとして、光学活性アミノ酸誘導体の一方の光学異性体のみを使用してもよいし、光学異性体二種を、例えばブロック子ポリマーとなるように使用してもよい。
　光学異性体の一方のみをポリマー主鎖の構成モノマーの全てとして使用して、本発明のポリマーを合成することができる。また、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　Ａ、１１０６（２００６）、１５２－１５８ページに記載されている、Ｎ－イソプロピルアクリルアミドとＮ－アクリロイルプロリンのメチルエステルとの共重合体も、これに蛍光物質を結合させることで、本発明のポリマーとして使用することができる。
　主鎖の構成モノマーとして、イオン性基を有するモノマーを使用すると、本発明に係るポリマーが、ｐＨの変化により水系溶媒中での親和性が変化するものとなる。そのようなイオン性基を有するモノマーの例として、イオン性基であるカルボキシル基を有し且つエチレン性不飽和基を有するアクリル酸やメタクリル酸が挙げられる。カルゴキシル基以外のイオン性基の例としては、アンモニウム基、スルホニウム基、テトラメチルアンモニウム基、スルホン酸基等が挙げられる。
　本発明に係るポリマーをｐＨ応答性にするためには、主鎖の構成モノマーの０．１乃至３０モル％程度、好ましくは０．５乃至２０モル％程度、さらに好ましくは１乃至１０モル％程度を、イオン性基を有するモノマーとすることが好ましい。また、イオン性基を有するモノマーとして、一般的には、カチオン性基を有する化合物とアニオン性基を有する化合物の中、いずれかのみを使用する。
　上記ポリマーの製造に使用される蛍光物質は、例えば、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアナート、４－アミノフルオレセイン、ジクロロフルオレセイン、スルホンフルオレセイン、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドフルオレセイン、オレゴングリーン、トーキョーグリーン、カルボキシフルオレセイン、カルボキシフルオレセインジアセテート等のフルオレセイン系化合物や、これらのフルオレセイン系化合物に、ポリマーの末端への結合又は主鎖構成モノマーとの共重合に適する基が導入されてなるものである。フルオレセイン系蛍光物質は、本発明に係るポリマーが親水性環境下にあるときに、より強い蛍光を発する。
　なお、フルオレセイン系蛍光物質が結合されてなる本発明のポリマーは、主鎖を構成するモノマーとして上記したイオン性基が使用されていなくても、ｐＨの変化に応じて蛍光強度に変化が生じる。これは、フルオレセインがｐＨの変化によってその化学構造を変え、それに伴って蛍光強度に大きな変化がもたらされるからである。
　本発明に示されるポリマーを構成するモノマーとして、アミノ酸誘導体モノマーが挙げられる。その構造はモノマー中にアミノ酸構造を有するものであれば特に限定されるものではないが、たとえば、アミノ酸中のアミノ基に対しビニル基を有するモノマーを反応させる方法、或いはアミノ酸中のカルボキシル基、アミノ基以外の部位に対しビニル基を有するモノマーを反応させる方法等で得られる。その際に使用されるものは特に限定されるものではなく、たとえば、下記［化５］、［化７］、［化９］のものが挙げられる。
式（Ａ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
 （式中、Ｒ1は、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
 を表し、
Ｒ２は、　Ｈ、ＣＨ３、またはＣＨ２ＣＨ３を表す）
式（Ｂ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
 （式中、Ｒ３は、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
 を表し、
Ｒ２は、Ｈ、ＣＨ３、またはＣＨ２ＣＨ３を表す）
　上記式の－ＣＯＯＲ２におけるＲ２の定義から明らかなように、アミノ酸のカルボキシル基はエステル化（メチルエステル、エチルエステル、ｎ－プロピルエステル、ｉ－プロピルエステル、ｎ－ブチルエステル、ｔ－ブチルエステル、等）されていてもよい。 
　また、アミノ酸誘導体モノマーとしては下記式で表される化合物であってもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
 （式中、Ｒａは、アルケニル基を表し、Ｒｂは、アミノ酸又はアミノ酸のエステルからＮＨ２を除いた基を表す）
　Ｒａとしては、例えば、ビニル基（ＣＨ２＝ＣＨ－）、１－メチルビニル基（ＣＨ２＝Ｃ（ＣＨ３）－）等のアルケニル基が挙げられるがこれに限定されない。また、Ｒｂとしては、例えば、フェニルアラニン又はフェニルアラニンのメチルエステルからＮＨ２を除いた基、トリプトファン又はトリプトファンのメチルエステルからＮＨ２を除いた基、プロリン又はプロリンのメチルエステルからＮＨ２を除いた基、アラニン又はアラニンのメチルエステルからＮＨ２を除いた基、等が挙げられる。
　また、本発明に示されるポリマーは、上述のようにアミノ酸誘導体モノマーを重合させることでアミノ酸残基を有するポリマーとして得る方法だけではなく、あらかじめポリマーを作製し、その後、側鎖としてアミノ酸を反応させる方法でもよい。例えば、上記式（Ａ）あるいは式（Ｂ）で示される基が挙げられる。
　上記ポリマーの製造に使用される蛍光物質の他の例としては、クマリン系化合物、ベンゾクロメノン化合物、スチルベン系化合物等や、これらの化合物に、ポリマーの末端への結合又は主鎖構成モノマーとの共重合に適する基が導入されてなるものである。クマリン系蛍光物質の具体例としては、７－（４－トリフルオロメチル）クマリンアクリルアミド等が挙げられる。ベンゾクロメノン系蛍光物質の具体例としては、２－（モルフォリン－４－イル）－ベンゾ［ｈ］クロメン－４－オン等が挙げられる。スチルベン系蛍光物質の具体例としては、レスベラトロール等が挙げられる。
　フルオレセイン系蛍光物質やクマリン系蛍光物質は、本発明に係るポリマーが親水性環境下にあるときに、より強い蛍光を発する。ここで、「より強い蛍光」とは、蛍光強度の測定において、消光状態の蛍光強度の例えば２倍以上、好ましくは５倍以上、より好ましくは１０倍以上の蛍光強度をいう。
　上記ポリマーの製造に使用される蛍光物質のさらに他の例としては、ダンシル　アミノエチルアクリルアミド、 ダンシル　クロリド、ダンシル　エチレンジアミン等のダンシル系化合物であって、これらのダンシル系化合物に、ポリマーの末端への結合又は主鎖構成モノマーとの共重合に適する基が導入されてなるものである。ダンシル系蛍光物質は、本発明に係るポリマーが疎水性環境下にあるときに、より強い蛍光を発する。また、４－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノスルホニル－７－フルオロ－２，１，３－ベンゾキサジアゾール等のベンゾフラザン系蛍光物質も、疎水性でより強い蛍光を発する。
　主鎖構成モノマーの重合又は共重合体の末端に蛍光物質を結合させる場合には、ポリマーの末端に反応性の基を導入することもでき、そのような場合には、蛍光物質として、反応性の基が導入されてなるものを使用しなくともよい。また、（メタ）アクリルアミド系モノマーや（メタ）アクリロイル基含有化合物との共重合に適する基の例としては、アクリル酸エステル基やアリル（allyl）基等のエチレン性不飽和基を含む基が挙げられる。
　本発明のポリマーは、末端に蛍光物質が結合されてなる単独重合体であってもよいし、主鎖が蛍光物質以外のモノマー成分と蛍光物質とから構成される共重合体であってもよい。また、主鎖を構成する蛍光物質以外のモノマー成分も、一種類とは限らず、二種以上が使用されていてもよい。本発明のポリマーが共重合体である場合、それは、ランダム共重合体であっても、ブロック共重合体（グラフト共重合体等を包含する）であってもよい。特に共重合体とする場合には、モノマー成分のモル比により、また、ランダム共重合かブロック共重合かにより、そのポリマーが示す水系溶媒中での蛍光強度の変化挙動が変わり得る。従って、特に後記する第五の発明において使用する本発明のポリマーは、測定対象との関係を考慮し、分子設計をすることとなる。
　本発明のポリマーの分子量は、特に限定されないが、モノマーの重合度（ｎ）で表して、１０乃至１、０００程度であることが好ましく、ｎ＝１０乃至５００程度であることがさらに好ましく、ｎ＝１０乃至２００程度であることが特に好ましい。蛍光物質の導入割合も、特に限定されないが、モノマー成分中の蛍光物質の割合が、０．００１乃至２０モル％であることが好ましく、０．０１乃至１０モル％であることが好ましい。なお、一般的には、ポリマーの重合度が大きくなる（分子量が大きくなる）に従い、蛍光物質の導入割合は小さくなる。
　次に、上記ポリマーの製造方法の例を説明する。先ず、片末端にフルオレセイン系蛍光物質が結合されてなるポリマーの製造方法の例を説明する。
　Ｎ－イソプロピルアクリルアミド（以下、「ＮＩＰＡＡｍ」ということがある）と、連鎖移動剤である３－メルカプトプロピオン酸（以下、「ＭＰＡ」ということがある）とを、ラジカル開始剤である２，２´－アゾビス（イソブチロニトリル）（以下、「ＡＩＢＮ」ということがある）及び溶媒であるＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（以下、「ＤＭＦ」ということがある）の存在下で、約７０℃にて反応させる。これにより、片末端に連鎖移動剤に由来する基を有するポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）（以下、「ＰＮＩＰＡＡｍ」ということがある）が得られる。ポリマーの分子量は、ＮＩＰＡＡｍとＭＰＡとのモル比を調節することによって、所望の値となるように調節する。
　次いで、得られたＰＮＩＰＡＡｍをＮ－ヒドロキシスクシンイミド（以下、「ＮＨＳ」ということがある）と、Ｎ，Ｎ－ジシクロヘキシルカルボジイミド（以下、「ＤＣＣ」ということがある）及び酢酸エチルの存在下で、約２５℃にて反応させ、末端をスクシニル化（活性エステル化）させる。得られた末端スクシニル化ポリマーを、１，４－ジオキサンの存在下で、約２５℃にて、フルオレセイン系蛍光物質である４－アミノフルオレセインと反応させる。このようにして、４－アミノフルオレセインが接合されたポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）が製造される。
　中間にフルオレセイン系蛍光物質が結合されてなるポリマーの製造方法の例を説明する。Ｎ－イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＡｍ）と、連鎖移動剤である３－メルカプトプロピオン酸（ＭＰＡ）と、フルオレセイン系蛍光物質であるフルオレセイン　ｏ－アクリレートを、ラジカル開始剤である２，２´－アゾビス（イソブチロニトリル）（ＡＩＢＮ）及び溶媒であるＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）の存在下で、約７０℃にて反応させる。これにより、ポリマー分子の中間にランダムにフルオレセイン系蛍光物質が結合されてなる（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド／フルオレセイン　ｏ－アクリレート）共重合体（以下、「Ｐ又はＰｏｌｙ（ＮＩＰＡＡｍ―ｃｏ－Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ　ｏ－ａｃｒｙｌａｔｅ）」ということがある）が得られる。ポリマーの分子量は、モノマー二種の合計とＭＰＡとのモル比を調節することによって、所望の値となるように調節する。また、蛍光物質の結合割合は、Ｎ－イソプロピルアクリルアミドとフルオレセイン　ｏ－アクリレートとのモル比を調節することによって、所望の値となるように調節する。
　上記した製造例では、ポリマー末端がカルボキシル基となっている。このカルボキシル基に何らかの化合物を反応させることにより、このポリマーの末端の親和性を調節し、このポリマーを、特定の物質に接近し易くさせたり、このカルボキシル基を、何らかの物質（例えば、リン脂質、蛋白質、担体等）に結合させることもできる。一例を挙げると、カルボキシル基をホスファチジルエタノールアミン等のアミノ基を有するリン脂質と結合させることができる。この場合、ポリマー末端のリン脂質部分が細胞膜のリン脂質部分に接近又は埋め込まれるようになる。また、上記ポリマー末端のカルボキシル基に、予め末端にアミノ基が導入されてなるイムノグロブリンを結合させることができる。この場合、ポリマー末端のイムノグロブリン部分が、例えば抗原抗体反応結合体部分に親和性を示すと考えられる。さらに、上記カルボキシル基で上記ポリマーを固体表面に結合させた場合には、このポリマーを、その蛍光を観察することに基づくセンサーとして使用することも可能であると考えられる。
　ところで、温度応答性ポリマーは、水素結合が切断されると水に不溶性となり、沈殿する。このような現象を下限臨界溶解現象といい、相転移が生じる温度を下限臨界溶解温度（Lower Critical Solution Temperature：LCST）と呼ぶ。この下限臨界溶解温度は、ポリマーを構成するモノマーの選択や、コモノマーの利用（種類や使用する割合）によって調節することができる。例えば、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）は３２℃に下限臨界溶解温度を有するが、下限臨界温度を３２℃超にするためには、Ｎ－イソプロピルアクリルアミドよりも親水性のモノマーであるアクリルアミド、メタクリル酸、アクリル酸、ジメチルアクリルアミド、ビニルピロリドンなどのコモノマーを共重合させるとよい。一方、下限臨界溶解温度を３２℃未満にしたいときは、疎水性モノマーであるスチレン、アルキルメタクリレート、アルキルアクリレートなどのコモノマーと共重合させるとよい。なお、フルオレセイン系蛍光物質が結合されてなる本発明のポリマーは、ＬＣＳＴよりも低温側でより強い蛍光を発し、ＬＣＳＴ付近で急激に蛍光強度が低下する。
　中間にフルオレセイン系蛍光物質が結合されてなるポリマーを合成する場合には、フルオレセイン系蛍光物質の親和性の程度や、その導入割合によって、得られる蛍光性温度応答性ポリマーの下限臨界溶解温度が変化することを考慮する必要がある。
　次に、中間に蛍光物質であるダンシル　アミノエチルアクリルアミドが結合されてなるポリマーの製造方法の例を説明する。
　Ｎ－イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＡｍ）と、連鎖移動剤である３－メルカプトプロピオン酸（ＭＰＡ）と、ダンシル　アミノエチルアクリルアミドを、ラジカル開始剤である２，２´－アゾビス（イソブチロニトリル）（ＡＩＢＮ）及び溶媒であるＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）の存在下で、約７０℃にて反応させる。これにより、ポリマー分子の中間にランダムに蛍光物質が結合されてなる（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド／ダンシル　アミノエチルアクリルアミド）共重合体（以下、「Ｐ又はＰｏｌｙ（ＮＩＰＡＡｍ―ｃｏ－ｄａｎｓｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）」ということがある）が得られる。ポリマーの分子量は、モノマー二種の合計とＭＰＡとのモル比を調節することによって、所望の値となるように調節する。また、蛍光物質の結合割合は、Ｎ－イソプロピルアクリルアミドとダンシル　アミノエチルアクリルアミドとのモル比を調節することによって、所望の値となるように調節する。
　上記した製造例においても、ポリマー末端はカルボキシル基となっている。このカルボキシル基に何らかの化合物を反応させることにより、このポリマーの末端の親和性を調節し、このポリマーを、特定の物質に接近し易くさせたり、このカルボキシル基を、何らかの物質（例えばリン脂質、蛋白質、担体）に結合させることもできることは、段落［００３９］に示された製造例の場合と同様である。
　ダンシル　アミノエチルアクリルアミドが結合されてなる本発明のポリマーは、ＬＣＳＴよりも低温側では蛍光強度が小さく、ＬＣＳＴ付近で急激に蛍光強度が上昇する。
　次に、中間に蛍光物質である７－（４－トリフルオロメチル）クマリンアクリルアミドが結合されてなるポリマーの製造方法の例を説明する。
　Ｎ－イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＡｍ）と、連鎖移動剤である３－メルカプトプロピオン酸（ＭＰＡ）と、７－（４－トリフルオロメチル）クマリンアクリルアミドを、ラジカル開始剤である２，２´－アゾビス（イソブチロニトリル）（ＡＩＢＮ）及び溶媒であるＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）の存在下で、約７０℃にて反応させる。これにより、ポリマー分子の中間にランダムに蛍光物質が結合されてなる（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド／７－（４－トリフルオロメチル）クマリンアクリルアミド）共重合体（以下、「Ｐ又はＰｏｌｙ（ＮＩＰＡＡｍ―ｃｏ－７－（４－ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌ）ｃｏｕｍａｒｉｎａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）」ということがある）が得られる。ポリマーの分子量は、モノマー二種の合計とＭＰＡとのモル比を調節することによって、所望の値となるように調節する。また、蛍光物質の結合割合は、Ｎ－イソプロピルアクリルアミドと７－（４－トリフルオロメチル）クマリンアクリルアミドのモル比を調節することによって、所望の値となるように調節する。
　上記した製造例においても、ポリマー末端はカルボキシル基となっている。このカルボキシル基に何らかの化合物を反応させることにより、このポリマーの末端の親和性を調節し、このポリマーを、特定の物質に接近し易くさせたり、このカルボキシル基を、何らかの物質（例えばリン脂質、蛋白質、担体）に結合させることもできることは、段落［００３９］に示された製造例の場合と同様である。
　７－（４－トリフルオロメチル）クマリンアクリルアミドが結合されてなる本発明のポリマーは、ＬＣＳＴよりも低温側では蛍光強度が大きく、ＬＣＳＴ付近で急激に蛍光強度が低下する。
　次に、片末端に蛍光物質である４－アミノフルオレセインが結合されてなるポリマーの製造方法の例を説明する。
　まずは、Ｄ－又はＬ－プロリンのメチルエステル化を行う。次いで、得られたＤ－又はＬ－プロリンのメチルエステルに塩化アクリロイルを反応させ、Ｎ－アクリロイルプロリンのメチルエステルを合成する。このＮ－アクリロイルプロリンのメチルエステルを、連鎖移動剤である３－メルカプトプロピオン酸（ＭＰＡ）、ラジカル開始剤である２，２´－アゾビス（イソブチロニトリル）（ＡＩＢＮ）及び溶媒であるＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）の存在下で、約８０℃にて反応させる。これにより、Ｎ－アクリロイルプロリンのメチルエステルの重合体（以下、「Ｐ又はＰｏｌｙ（Ｎ－Ａ－Ｐｒｏ－ＯＭｅ）」ということがある））が得られる。ポリマーの分子量は、モノマーとＭＰＡとのモル比を調節することによって、所望の値となるように調節する。
　次いで、Ｐｏｌｙ（Ｎ－Ａ－Ｐｒｏ－ＯＭｅ）を、ＮＨＳ、ＤＣＣ及び酢酸エチルの存在下で反応させ、末端をスクシニル化（活性エステル化）させる。得られた末端スクシニル化ポリマーを、１，４－ジオキサンの存在下で、フルオレセイン系蛍光物質である４－アミノフルオレセインと反応させる。このようにして、４－アミノフルオレセインが片末端に結合されたポリ（Ｎ－アクリロイルプロリンのメチルエステル）が製造される。
　上記の例において、Ｎ－アクリロイルプロリンのメチルエステルの一部をＮ－イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＡｍ）に変えることで、主鎖がＮ－アクリロイルプロリンのメチルエステル由来部分とＮ－イソプロピルアクリルアミド由来部分とのランダム共重合体であり、４－アミノフルオレセインが片末端に結合されたポリマーを得ることができる。
　以上説明した本発明に係るポリマーは、それが温度の変化により水系溶媒に対する親和性が変化するものである場合には、「蛍光性温度応答性ポリマー」と、また、それがｐＨの変化により水系溶媒に対する親和性が変化するものである場合には、「蛍光性ｐＨ応答性ポリマー」と呼称される。
　本発明に係るポリマーの製造に使用される連鎖移動剤の例としては、３－メルカプトプロピオン酸、２－メルカプトエタノール、及び２－メルカプトエチルアミンが挙げられる。連鎖移動剤は、これらに限定されず、チオール基を含有する各種化合物や四塩化炭素も使用可能である。また、連鎖移動剤に由来する末端部分に蛍光物質を結合させるために、蛍光物質に導入される基としては、アミノ基、カルボキシル基、オキシエチレン基等が挙げられる。
　次に、蛍光発生成分を有する物質又はその周囲環境の変化の測定方法について説明する。当該方法は、蛍光発生成分を有する物質又はその周囲環境の変化の測定方法であって、任意の蛍光性且つ温度及び／又はｐＨ応答性のポリマーを、水系溶媒中で蛍光発生成分を有する物質の近傍に存在させて、蛍光発生成分とポリマー中の蛍光物質との間で蛍光共鳴エネルギー移動を生じさせ、その結果として発生した蛍光の強度を測定する工程を含む方法に関する。
　蛍光発生成分を有する物質又はその周囲環境の変化の測定方法では、使用する蛍光性且つ温度及び／又はｐＨ応答性ポリマーは、温度及び／又はｐＨ応答性であり、且つ、蛍光物質が結合されてなるポリマーである限り、特に限定されないが、本発明のポリマーを使用することが好ましい。
　蛍光発生成分を有する物質の変化の測定とは、蛍光発生成分（例えば芳香環化合物）を有する物質（例えば蛋白質やペプチド）自体の変化、具体的には熱変性や立体構造の変化、凝集等が生じたか否かを、蛍光発生成分と蛍光性温度及び／又はｐＨ応答性ポリマー中の蛍光物質との間で蛍光共鳴エネルギー移動が生じた結果として測定される蛍光を測定することで、認識することをいう。また、蛍光発生成分を有する物質の周囲環境の変化の測定とは、前記熱変性や立体構造の変化、凝集等が周囲環境の変化によって生じている場合に、その周囲環境の変化が引き起こした蛍光発生成分を有する物質（例えば蛋白質やペプチド）の変化を、前記蛍光共鳴エネルギー移動が生じた結果として測定される蛍光を測定することで、周囲環境の変化を認識することをいう。
　ここで、蛍光共鳴エネルギー移動について説明する。ドナーとなる分子（本発明における「蛍光発生成分を有する物質」又は「蛍光発生成分」）の蛍光スペクトルと、アクセプターとなる分子（本発明における「蛍光性温度及び／又はｐＨ応答性ポリマー中の蛍光物質」）の励起スペクトルに重なりがあり、これら二つの分子が約１００ｎｍ以内、好ましくは１０ｎｍ以内の距離に近づいた場合、ドナーを励起するとエネルギーがアクセプターに移動し、アクセプターとなる分子が励起される現象が生じる。これが、蛍光共鳴エネルギー移動である。従って、蛍光共鳴エネルギー移動を生じさせるためには、通常はドナーの励起波長で光を照射し、検出は、ドナーあるいはアクセプターの蛍光強度測定で行う。ドナーの蛍光強度は、二分子間の距離が近いとアクセプターに光が吸収されるために低くなり、距離が離れると高くなる。アクセプターの蛍光強度は、この逆となる。なお、前記したように、ドナーとなる分子の蛍光スペクトルとアクセプターとなる分子の励起スペクトルとに重なりがあることが必要であるので、好ましい例である、アクセプターである蛍光性温度及び／又はｐＨ応答性ポリマー中の蛍光物質の発する蛍光強度を測定する場合には、変化の測定対象である蛍光発生成分を有する物質（蛋白質等）の蛍光スペクトルを考慮し、その蛍光波長よりも１０乃至５０ｎｍ程度長波長側に励起波長がある蛍光性温度及び／又はｐＨ応答性ポリマーを使用することが好ましい。
　蛍光発生成分を有する物質又はその周囲環境の変化の測定方法では、水系溶媒中で、蛍光性温度及び／又はｐＨ応答性ポリマーを蛋白質等の蛍光発生成分を有する物質の近傍に存在させて、蛍光発生成分からポリマー中の蛍光物質への蛍光共鳴エネルギー移動を生じさせる。例えば、蛋白質自体の発する蛍光強度が、バックグラウンド蛍光と区別できなかったり、蛋白質の変化に伴う蛍光強度の変化が小さいために、蛍光強度を測定してもその変化を認識することができない場合であっても、蛋白質中の蛍光発生成分（トリプトファン等の芳香環化合物）の励起波長で光を照射すると、エネルギーが蛍光性温度及び／又はｐＨ応答性ポリマー中の蛍光物質へ移動し（蛍光共鳴エネルギー移動が生じ）、このとき、蛍光性温度応答性ポリマー中の蛍光物質が励起されて発光する蛍光の強度は大きいため、この蛍光性温度及び／又はｐＨ応答性ポリマー中の蛍光物質が発する蛍光の強度を測定すれば、蛋白質等やその周囲環境の変化を認識することができる。なお、「水系溶媒」とは、水、各種の緩衝液等の水溶液、水とメタノールやエタノール等の極性溶媒との混合物であって、水を主成分とするもの等をいう。水系溶媒を使用すると、バックグラウンド蛍光の強度は、一般的には小さい傾向にある。
　さらに、本発明のポリマー中、温度応答性を示すポリマーに、水系溶媒中で励起エネルギーを与え、蛍光の発光の程度によって水系溶媒の温度を測定する工程を含む、温度の測定方法について説明する。
　蛍光性温度応答性ポリマーは、それぞれ特有の下限臨界溶解温度を有する。これらのポリマーは、下限臨界溶解温度未満では親水的環境下にあり、一方、下限臨界溶解温度を超えると疎水性環境下におかれる。すなわち、溶解性が急激に低下する。蛍光性温度応答性ポリマーの中、フルオレセイン系蛍光物質やクマリン系蛍光物質が結合されてなるものは、下限臨界溶解温度未満、すなわち親水的環境下において強い蛍光を発するが、この温度を超えると蛍光強度は著しく小さくなる。一方、ダンシル系蛍光物質が結合されてなるポリマーは、下限臨界溶解温度未満では蛍光が弱く、この温度を超えると蛍光強度は著しく大きくなる。本発明のポリマー中、温度応答性を示すポリマーに、水系溶媒中で励起エネルギーを与え、蛍光の発光の程度によって水系溶媒の温度を測定する工程を含む、温度の測定方法は、蛍光性温度応答性ポリマーのこの性質を利用するものである。即ち、蛍光性温度応答性ポリマーに由来する強い蛍光が発せられるか否かで、当該ポリマーが存在する水系環境の温度を特定するものである。
　蛍光性温度応答性ポリマーは、それぞれ特有の下限臨界溶解温度を有するので、測定したい温度に応じて、適する蛍光性温度応答性ポリマーを選択し、又は設計する。
　また、蛍光性温度応答性ポリマー中の蛍光物質は、それぞれ特有の励起波長及び蛍光波長を有するので、当該蛍光物質に応じた波長で、励起エネルギーを与える。
　さらに、本発明のポリマー中、ｐＨ応答性を示すポリマーに、水系溶媒中で励起エネルギーを与え、蛍光の発光の程度によって水系溶媒のｐＨを測定する工程を含む、ｐＨの測定方法について説明する。
　蛍光性ｐＨ応答性ポリマーは、それぞれ特有の相転移ｐＨ（水系溶媒に対する溶解性が急激に変化するｐＨ）を有する。蛍光性ｐＨ応答性ポリマーの中、フルオレセイン系蛍光物質やクマリン系蛍光物質が結合されてなるものは、親水的環境下（このとき、ポリマーは水系溶媒中に溶解している）において強い蛍光を発するが、疎水性環境下（このとき、ポリマーの水系溶媒に対する溶解度は低い）では蛍光強度は著しく小さくなる。一方、ダンシル系蛍光物質が結合されてなるポリマーは、親水的環境下では蛍光が弱く、疎水性環境下では蛍光強度は著しく大きくなる。本発明のポリマー中、ｐＨ応答性を示すポリマーに、水系溶媒中で励起エネルギーを与え、蛍光の発光の程度によって水系溶媒のｐＨを測定する工程を含む、ｐＨの測定方法は、蛍光性ｐＨ応答性ポリマーのこの性質を利用するものである。即ち、蛍光性ｐＨ応答性ポリマーに由来する強い蛍光が発せられるか否かで、当該ポリマーが存在する水系環境のｐＨを特定するものである。
　蛍光性ｐＨ応答性ポリマーは、それぞれ特有の溶解性に著しい変化が生じる（すなわち相転移）ｐＨを有するので、測定したいｐＨに応じて、適する蛍光性ｐＨ応答性ポリマーを選択し、又は設計する。
　また、蛍光性ｐＨ応答性ポリマー中の蛍光物質は、それぞれ特有の励起波長及び蛍光波長を有するので、当該蛍光物質に応じた波長で、励起エネルギーを与える。
　第一の発明のポリマー中、ポリマーの構成モノマーの少なくとも一部が光学異性体を有するアミノ酸誘導体である蛍光性温度及び／又はｐＨ応答性ポリマーを使用する方法について説明する。当該方法においては、測定対象を含有するか又は含有することが予想される水系溶媒（ｘ）中において、及び、測定対象を含有しない水系溶媒（ｙ）中で、上記ポリマーに由来する蛍光を温度及び／又はｐＨを変化させながらを測定し、水系溶媒（ｘ）での測定結果を水系溶媒（ｙ）での測定結果を比較することにより、水系溶媒（ｘ）中における測定対象の三次元高次構造、又は、水系溶媒（ｘ）中に測定対象が存在するか否かを判定する。
　ここで、「測定対象」とは、例えば、生体中に存在する蛋白質（プロテインＡ、Ｇ蛋白質等）、オリゴ－又はポリペプチド（アンギオテンシン、バソプレッシン等）、多糖類（Ｎ－アセチルグルコサミン等）、及び各種アミノ酸、ホルモン様物質、ステロイド類等の低分子生理活性物質等をいう。ポリマーの構成モノマーの少なくとも一部が光学異性体を有するアミノ酸誘導体である蛍光性温度及び／又はｐＨ応答性ポリマーは、「測定対象」と共存することにより、そのポリマーの温度応答挙動及び／又はｐＨ応答挙動に変化が生じ得る。そのような変化の有無に基づき、特定の「測定対象」が存在するか否か、あるいは、特定の「測定対象」がどのような三次元高次構造を取っているかを判定する。
　ここで、「測定対象」のモデル化合物としてＬ－プロリン重合体を用い、また、本発明のポリマーとして、その主鎖の構成モノマーとして光学活性を有するプロリンを含む蛍光性温度応答性ポリマー（Ｌ－プロリンのみを含むものとＤ－プロリンのみを含むもの）を使用して、測定対象が共存するか否かにより、本発明の蛍光性温度応答性ポリマーの温度と蛍光強度との関係が影響を受けるか否かを測定した実験（実施例９）について言及する。
　例えば、主鎖構成モノマーがＬ－プロリンを含有するモノマーであるポリマー単独（試料（ａ））での温度と蛍光強度との関係（Ｉ）を、Ｌ－プロリン重合体が共存する（試料（ｂ））場合の温度と蛍光強度との関係（ＩＩ）と比較すると、異なる傾向が示されていることがわかる。一方、主鎖構成モノマーがＤ－プロリンを含有するモノマーであるポリマー単独（試料（ｃ））での温度と蛍光強度との関係（Ｉ）を、Ｌ－プロイン重合体が共存する（試料（ｄ））場合の温度と蛍光強度との関係（ＩＩ）と比較すると、ほぼ同様の傾向が示されていることがわかる。このような相違に基づき、ある試料中に、あるいは例えば生体内のある個所に、「測定対象」が存在するか否か、また、存在する場合、その「測定対象」の三次元高次構造はどのようであるかを判定することができるのである。
　この実験では、「測定対象」のモデル化合物としてＬ－プロリン重合体を使用した。ここで、Ｌ－プロリン重合体とＤ－プロリン重合体とは、三次元高次構造が異なっていることが知られている。従って、上記実験は、「測定対象」をプロリン重合体とする場合には、その三次元高次構造（より具体的にはＬ－プロリン重合体であるかＤ－プロリン重合体でるか）を判定することになる。ここでは、「測定対象」のモデル化合物としてＬ－プロリン単独重合体を使用したが、たとえばポリヌクレオチド中のプロリンがＬ体であるかＤ体であるかの相違により、ポリヌクレオチド自体の三次元高次構造が異なるものとなる場合もあり、そのような場合には、上記方法により、ポリヌクレオチド（測定対象）の三次元高次構造を判定することができるのである。
　次に、蛍光プローブについて説明する。この蛍光プローブは、本発明のポリマー中、その少なくとも片末端には蛍光物質が結合されていないポリマーと、蛋白質、リン脂質、低分子生理活性及び担体からなる群から選択されるいずれかが結合されてなる。このような蛍光プローブは、本発明のポリマーの片末端にあるカルボキシル基に、アミノ基含有イムノグロブリンのアミノ基を反応させてアミド結合を生じさせることにより、製造することができる。また、第一の発明のポリマーの片末端にあるカルボキシル基に、アミノ基含有リン脂質のアミノ基反応させてアミド結合を生じさせることにより、製造することができる。
　先に述べたように、本発明のポリマーの中、その末端がカルボキシル基となっているものは、このカルボキシル基に何らかの化合物を反応させることができる。その一例を説明する。この例では、Ｐｏｌｙ（ＮＩＰＡＡｍ－ｃｏ－ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ　ｏ－ａｃｒｙｌａｔｅ）に、リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中においてアミノ基が導入されてなるイムノグロブリンを反応させることにより、イムノグロブリン接合Ｐｏｌｙ（ＮＩＰＡＡｍ－ｃｏ－ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ　ｏ－ａｃｒｙｌａｔｅ）が得られる。また、Ｐｏｌｙ（ＮＩＰＡＡｍ－ｃｏ－ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ　ｏ－ａｃｒｙｌａｔｅ）を活性エステルに変換し、その活性エステル化体を、１，４－ジオキサン中でアミノ基が導入されてなるリン脂質と反応させることもできる。
　このような蛍光プローブは、例えば、このプローブを構成する蛋白質やリン脂質、あるいは低分子生理活性物質と親和性のある環境に移動して留まるため、バイオイメージングに利用することができる。また、担体を有する本発明の蛍光プローブの近傍には、そのポリマー部分に親和性を有する物質が留まり、その結果、蛍光プローブの温度又はｐＨ応答性の挙動に変化が生じ得るので、その変化に基づき、蛍光プローブの近傍に留まった物質が何であるか、又はどのような三次元高次構造を取っているか等を、判定することができる。
　先に述べたように、PNIPAAmはLCSTを境に、低温側では親水性となり膨潤し高温側では疎水性となり収縮する。N-isopropylacrylamideの親水性のアミド基の部分と疎水性のイソプロピル基のバランスがPNIPAAmの鋭敏な温度応答性の要因となっており、LCST以下の低温では分子中のアミド基と水分子間で強い水素結合が働き、ポリマーは水和しランダムコイル状のコンフォメーションをとる。LCST以上の高温になると水素結合が不安定となり脱水和が起こり、ポリマー鎖が凝集してグロビュール状に変化する。このLCSTはポリマーの共重合体組成により自由に制御可能である。つまり、共重合を行う際、導入するNIPAAmモノマー、疎水性モノマーや親水性モノマーのバランスを調整することで、得られるコポリマーのLCSTを制御することができる。疎水性モノマーを共重合させると疎水性相互作用が強くなり、その結果32℃であったNIPAAmのLCSTは低温側へシフトする。逆にアクリル酸などの親水性モノマーをPNIPAAmと共重合させると、LCSTが高温側にシフトすることが知られている。また、PNIPAAmへ他分子を導入することによる影響は、LCST以外の機能にも影響を及ぼすことが確認されている。カチオン性モノマーであるDMAPAAmをPNIPAAmと共重合させることで、 LCSTが高温にシフトすることが知られており、さらにポリマーの表面荷電密度が温度制御可能となる例や、アクリル酸またはジメチルアミノメタクリレートを導入したpH感受性ポリマーの報告がある。これらをHPLC充填剤表面に修飾し、温度変化に伴い荷電性と疎水性の2つの相互作用を制御し、荷電基を有する生理活性物質を水系条件下で分離する手法を開発した例もある。また、PNIPAAmに蛍光分子を導入し、ポリマーの物性評価や蛍光温度計として利用する研究が行われている。安中らは、温度に応答して体積や特性を変化させることのできる“くし型”PNIPAAmヒドロゲルのメカニズムの研究において、ゲルにダンシル基をラベル化し、温度変化によるゲルの収縮をダンシル基の極大蛍光波長の変化を指標に観察している。内山らはPNIPAAmとN-アルキルアクリルアミド及び蛍光物質であるベンゾフラゾンを用いてナノゲル温度計を作製し、マイクロインジェクション法を用いて細胞に注入し、カンプトテシンを添加後、細胞に化学刺激を与えた際の温度変化を定量化することに成功したという報告もある。しかし、PNIPAAmを本格的に病態細胞イメージングへ適用した例はほとんどない。
　以上の背景から、本発明者らは、正常細胞とがんなどの病態細胞を蛍光イメージングにより見分けることを目的とし、温度応答性ポリマーに蛍光分子を導入した蛍光ポリマーの開発を行った。病態細胞特異性を持たせるために生体内において分子認識能の高いL体アミノ酸に着目し、アミノ酸誘導体モノマーを導入した温度応答性ポリマーに極性感受性の蛍光分子である5-amino fluoresceinを修飾することで、LCSTより低温側の親水的環境下では発光し、LCSTより高温側の疎水的環境下では蛍光を発しない蛍光ポリマーを作製した。5-amino fluoresceinのpKaは6.4であり, pH5～9 の範囲でpH依存性の吸収と蛍光放出を示すことから、温度応答性に加えてpH応答性も併せ持つ蛍光ポリマーの開発が可能となる。また、がん細胞が正常細胞より高温かつ低pH環境下にあることに着目し、NIPAAmにpH応答性モノマーであるacryloyl sulfamethazine誘導体モノマーと親水性モノマーであるN,N-dimethylacrylamide (DMAAm) を共重合し、温度に加えpHにも依存してポリマーの親水/疎水性が変化するポリマーを開発した。さらに、がん細胞特異的に発現することが知られているアミノ酸トランスポーター1 (L-type amino-acid transporter 1; LAT1) を標的としたポリマーを開発した。
　以下に、実施例により、本発明を具体的に説明する。本発明の範囲はこれらの実施例によって何ら制限されるものではない。
１．モノマー合成
１－１．試薬及び装置
試薬
L-Tryptophan: ペプチド研究所
L-Phenylalanine: ペプチド研究所
Sulfamethazine: TCI
Thionyl chloride: 関東化学株式会社
Acryloyl chloride: TCI
Triethylamine: 和光純薬工業
Dichloromethane      : 和光純薬工業
NaHCO3: 和光純薬工業
Ethyl acetate: 和光純薬工業
Hexane: 関東化学株式会社
Acetone: 和光純薬株式会社，関東化学株式会社
Methanol: W和光純薬株式会社，関東化学株式会社
CDCl3: 東京化成工業株式会社
Dimethyl sulfoxide(DMSO): 関東化学株式会社
装置
1H-NMRスペクトル: Varian Inc, UI500 Model 500 Unity Inova
１－２．実験項
１－２－１．モノマー合成
[1] N-acryloyl-L-tryptophan methyl esterの合成
L-Tryptophan methyl esterの合成
　L-Tryptophan (25.1 g, 122 mmol) をMeOH (200 mL) に溶解し、氷冷下、thionyl chloride (10.6 mL, 147 mmol) を滴下し、撹拌した。反応液を室温に戻し、4 h加熱還流後、次いで溶媒を留去し、L-tryptophan methyl ester 塩酸塩を得た。この塩酸塩をH2Oに溶解し、氷冷下、10%NaOH (33 mL) を滴下し中和反応を行った。反応液をCH2Cl2及び飽和NaHCO3で分液抽出し、有機層を無水Na2SO4で乾燥後、溶媒を留去し、L-tryptophan methyl ester (19.9 g, 74.2%) を得た。
N-acryloyl-L-tryptophan methyl esterの合成
　N-Acryloyl-L-tryptophan methyl ester (19.9 g, 98 mmol) をCH2Cl2に溶解し、NEt3 (16.3 mL, 117.6 mmol) 及びacryloyl chloride (8.7 mL, 107.8 mmol) を-20℃で滴下後、撹拌した。反応終了後、H2O及びCH2Cl2で分液抽出した。有機層を無水Na2SO4で乾燥後、溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー[移動相AcOEt－Hexane (1:1) ]に付して白色固体としてN-acryloyl-L-tryptophan-methyl ester (24.1 g, 97.1%) を得た。
1H-NMR (500MHz，CDCl3) δ8.34 (s, 1H)，7.6-7.1 (m, 5H)，7.0 (s, 1H)，6.29 (dd, 1H, J = 1.5, 17.0)，6.21 (d, 1H , J = 8.0), 6.04 (dd, 1H, J = 10.5, 17.0), 5.6 (dd, 1H , J = 1.5, 13.0), 5.05 (m, 1H), 3.78 (s, 3H), 3.40 (m, 2H)．
[2] N-acryloyl-L-phenylalanine methyl esterの合成
L-phenylalanine methyl esterの合成
　L-phenylalanine (10.4 g) を出発物質とし、L-tryptophan methyl esterと同様の工程で合成した。thionyl chloride (4.24 mL) 及びMeOH (80 mL) 、10%NaOH (13.2 mL)を使用し、L-Phenylalanine methyl ester (9.90 g, 88.1%)を得た。
N-acryloyl-L-phenylalanine methyl esterの合成
　L-phenylalanine methyl ester (9.90 g, 55.8mmol)を出発物質とし、N-Acryloyl-L-tryptophan methyl esterと同様の工程で合成した。CH2Cl2、NEt3 (9.41 mL, 66.9mmol) 及びacryloyl chloride (4.96mL, 61.3mmol) を用いてN-acryloyl-L-phenylalanine methyl ester (9.91 g, 81.2%) を得た。ただし結晶性が良く、カラム抽出は行わなかった。
1H-NMR (500MHz，CDCl3) δ7.2-7.1 (m, 5H), 6.3 (dd, 1H, J = 1.5, 17.5), 6.1 (dd, 1H, J = 10.5, 17.0), 5.65 (dd, 1H, J = 1.0, 10.5), 4.95 (m, 1H), 3.78 (s, 3H), 3.20 (m, 2H), 1.9 (s, br,1H)．
[3] N-Acryloyl-L-Phenylalanineの合成
　L-phenylalanine (3.0 g, 18 mmol) をNaOH aq (36 mmol) に溶解し、acryloyl chlori
de (1.5 mL, 21.6 mmol) を氷冷下で滴下後、撹拌した。溶媒を留去し、N-acryloyl-L-phenylalanine (1.2 g, 32.0%) を白色固体として得た。
1H-NMR (500MHz、DMSO) δ8.5 (d, 1H, J = 8), 7.2 (m, 5H), 6.26 (dd, 1H, J = 10.0, 17.0), 6.05 (dd, 1H, J = 2.0, 17.0), 5.58 (dd, 1H, J = 1.5, 10), 4.50 (m, 1H), 3.40 (s, 1H), 3.10 (m, 1H), 2.89 (m,1H)．
[4] N-acryloyl-sulfamethazineの合成
　Sulfamethazine (SMZ) (5.4 g, 20 mmol) をNaOH aq (22 mmol) - acetone (1:1)に溶
解し、acryloyl chloride (1.8 mL, 22 mmol) を滴下し、撹拌した。反応終了後、溶媒を留去し、N-acryloyl-sulfamethazine (3.2 g, 51.4%) を得た。
1H-NMR (CDCl3、DMSO) :11.6 (s, 1H), 10.5 (s, 1H), 7.96-7.8 (m, 4H), 6.8 (s, 1H), 6.4 (dd, 1H, J = 10.0, 17.0), 6.3 (dd, 1H, J = 1.5, 17.0), 5.8 (dd, 1H, J = 2.0, 10.0), 2.2 (s, 6H)．
１－２－２．モノマー評価
1H-NMRの測定
　アミノ酸誘導体モノマーの構造確認は、合成モノマーの重クロロホルム溶液を測定試料とし、1H-NMR測定より行った。
１－３．結果・考察
　Phenylalanine、tryptophanのアミノ酸やsulfamethazineをNIPAAmと共重合するため、acryloyl基の導入を試みた。Tryptophanはカルボキシル基のmethyl ester化を行ったもの、phenylalanineについてはmethyl ester化を行ったものとLAT1トランスポーターによる認識を期待してmethyl ester化を行わなかったものを用いた。その後、acryloyl chlorideを作用させることで重合官能基を導入し、誘導体モノマーを得た (下記Scheme.2-1～Scheme.2-3 を参照)。1H-NMR測定の結果、合成が確認された(図１～図４を参照)。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
２．温度応答性ポリマーの合成
２－１．試薬及び装置
試薬
N-isopropylacrylamide (NIPAAm):興人
N,N-dimethylaminopropylacrylamide (DMAPAAm): 興人
Butylmethacrylate (BMA): 和光純薬工業
3-mercaptopropionic acid (MPA): 和光純薬工業
(2-(Dodecylthiocarbonothioylthio)-2-methylpropionic acid): Sigma Aldrich
2,2’ -azobisisobutyronitrile (AIBN): 和光純薬工業
n-hexane: 和光純薬工業
N,N’ -dimethylformamide (DMF): 関東化学
液体窒素(liquid-nitrogen): 寿産業株式会社
Diethyl ether: 和光純薬工業
Acetone dehydrated: 和光純薬工業
1,4-dioxane dehydrated: 和光純薬工業
Ethyl acetate dehydrated: 和光純薬工業
N,N’ -dicyclohexylcarbodiimide (DCC): 関東化学
N-hydroxysuccinimide (NHS): Merck
5-aminofluorescein (FL): SIGMA-ALDRICH
Dulbecco's phosphate-buffered salines (PBS): Life Technologies
H2O: Milli-Q water purification system から精製
装置
透過率測定: 紫外可視近赤外分光光度計(JASCO V-630) + MCB-100型水冷ペルチェ式恒温
セルホルダ(JASCO) + 電動式ペルチェ温度自動調節機(KRUSS PT31)
蛍光強度及び蛍光スペクトル測定: 蛍光光度計(Spectrofluorometer FP-6300：JASCO) + ETC-273T型水冷ペルチェ式恒温セルホルダ+ KRUSS PT31
GPC測定: GPC-8020シリーズ(TOSOH)
２－２．実験項
２－２－１．温度応答性ポリマーの合成
[1] PNIPAAmの合成
　NIPAAm(10.0 g, 88.4 mmol)、MPA(4.86 mmol ;NIPAAm, 1.00 molに対して0.055 mol)及びAIBN(0.35 mmol ;NIPAAm, 1.00 molに対して0.004 mol)をDMF（20mL）でナス型フラスコ中に溶解させた。反応液を液体窒素下(-196℃)、凍結脱気を行い、ナス型フラスコを室温に戻した後、重合を行った(70℃，5 h)。反応終了後、氷冷下、diethyl etherに反応液を滴下し、再沈精製を行い粗生成物を得た。これをacetone及びdiethyl etherを用いて再沈精製を2回繰り返し、PNIPAAm(10.7 g, Quant)を白色固体として得た。
[2] P(NIPAAm-co-BMA3%)の合成
　BMAの導入率がポリマー全体に対して3 mol%となるように、P(NIPAAm-co-BMA3%)の合成を行った。NIPAAm(15.0g, 133 mmol)、BMA(0.58 g, 4.11 mmol)をDMFに溶解し、MPA(7.32 mmol ; NIPAAm, 1.00 molに対して0.055 mol)及びAIBN(0.53 mmol ; NIPAAm, 1.00 molに対して0.004 mol)を順次添加した。反応液を液体窒素下(-196℃)、凍結脱気を行い、ナス型フラスコを室温に戻した後、重合を行った(70℃，5 h)。反応終了後、氷冷下、diethyl etherに反応液を滴下し、再沈精製を行い粗生成物を得た。これをacetone及びdiethyl etherを用いて再沈精製を2回繰り返し、目的物(13.5 g, 86.7%)を白色固体として得た。
[3] P(NIPAAm-co-DMAPAAm2%)の合成
　DMAPAAmの導入率が2 mol%になるように、P(NIPAAm-co-DMAPAAm2%)の合成を行った。NIPAAm(15.0 g, 133 mmol)、DMAPAAm(0.42 g, 2.71 mmol)をDMFに溶解し、MPA(7.32 mmol ; NIPAAm, 1.00 molに対して0.055 mol)及びAIBN(0.53 mmol; NIPAAm, 1.00 molに対して0.004 mol)を順次添加した。反応液を液体窒素下(-196℃)、凍結脱気を行い、ナス型フラスコを室温に戻した後、重合を行った(70℃，5 h)。反応終了後、氷冷下、diethyl etherに反応液を滴下し、再沈精製を行い粗生成物を得た。これをacetone及びdiethyl etherを用いて再沈精製を2回繰り返し、目的物(14.7 g, 95.3%)を白色固体として得た。
[4] P(NIPAAm-co-L-Phe-OMe1.3%-co-DMAPAAm3%)の合成
　N-Acryloyl-L-Phenylalanine methyl esterの導入率が1.3mol%、DMAPAAmの導入率が3 mol%になるように、P(NIPAAm-co-N-Acryloyl-L-Phenylalanine-OMe1.3%-co-DMAPAAm3%)を合成した。NIPAAm(15.0 g, 133 mmol)、N-Acryloyl-L-Phenylalanine methyl ester(0.42 g, 1.81 mmol)、DMAPAAm(0.65 g, 4.17 mmol)をDMFに溶解し、MPA (7.32 mmol ; NIPAAm, 1.00 molに対して0.055 mol)及びAIBN(0.53 mmol ; NIPAAm, 1.00 molに対して0.004 mol)を順次添加した。反応液を液体窒素下(-196℃)、凍結脱気を行い、ナス型フラスコを室温に戻した後、重合を行った(70℃，5 h)。反応終了後、氷冷下、diethyl etherに反応液を滴下し、再沈精製を行い粗生成物を得た。これをacetone及びdiethyl etherを用いて再沈精製を2回繰り返し、目的物(14.3 g, 89.0%)を白色固体として得た。
[5] P(NIPAAm-co-L-Trp-OMe1.5%-co-DMAPAAm3%)の合成
　N-Acryloyl-L-Tryptophan methyl esterの導入率が1.5 mol%、DMAPAAmの導入率が3 mol%になるように、P(NIPAAm-co-N-Acryloyl-L-Tryptophan-OMe1.5%-co-DMAPAAm3%)を合成した。NIPAAm(3.00 g, 26.5 mmol)、N-Acryloyl-L-Tryptophan methyl ester(0.11 g, 0.42 mmol)、DMAPAAm(0.13 g, 0.83 mmol)をDMFに溶解し、MPA (1.46 mmol ; NIPAAm, 1.00 molに対して0.055 mol)及びAIBN (0.11 mmol ; NIPAAm, 1.00 molに対して0.004 mol)を順次添加した。反応液を液体窒素下(-196℃)、凍結脱気を行い、ナス型フラスコを室温に戻した後、重合を行った(70℃，5 h)。反応終了後、氷冷下、diethyl etherに反応液を滴下し、再沈精製を行い粗生成物を得た。これをacetone及びdiethyl etherを用いて再沈精製を2回繰り返し、目的物(3.16 g, 97.5%)を白色固体として得た。
[6] P(NIPAAm-co-DMAAm48%-co-SMZ10%)の合成　N-acryloyl-sulfamethazine（ＳＭＺ）の導入率が10 mol%、DMAAmの導入率が48 mol%になるように、P(NIPAAm-co-DMAAm48%-co-SMZ10%)を合成した。NIPAAm(0.646 g, 5.7 mmol)、DMAAm (0.647 g, 6.5 mmol)、N-acryloyl-sulfamethazine (0.378 g, 1.4 mmol)をDMFに溶解し、RAFT剤(2-(Dodecylthiocarbonothioylthio)-2-methylpropionic acid) (0.076 mmol)及びAIBN(0.03 mmol)を順次添加した。反応液を液体窒素下(-196℃)、凍結脱気を行い、ナス型フラスコを室温に戻した後、重合を行った(70℃，5 h)。反応終了後、氷冷下、diethyl etherに反応液を滴下し、再沈精製を行い粗生成物を得た。これをacetone及びdiethyl etherを用いて再沈精製を2回繰り返し、目的物(1.64 mg, 98.0%)を白色固体として得た。
[7] P(NIPAAm-co-L-Phe5%)の合成
　N-Acryloyl-L-Phenylalanineの導入率がポリマー全体に対して5 mol%になるように、P(NIPAAm-co-N-Acryloyl-L-Phenylalanine5%)を合成した。NIPAAm(2.00 g, 17.7 mmol)、N-Acryloyl-L-Phenylalanine(0.20 g, 0.93 mmol)をDMFに溶解し、RAFT剤(2-(Dodecylthiocarbonothioylthio)-2-methylpropionic acid) (0.2 mmol ;1/75 eq)及びAIBN(0.09 mmol ; 0.4/75 eq)を順次添加した。反応液を液体窒素下(-196℃)、凍結脱気を行い、ナス型フラスコを室温に戻した後、重合を行った(70℃，5 h)。反応終了後、氷冷下、diethyletherに反応液を滴下し、再沈精製を行い粗生成物を得た。これをacetone及びdiethyl etherを用いて再沈精製を2回繰り返し、目的物(2.21 g, Quant)を白色固体として得た。
２－２－２．温度応答性ポリマーの物理化学的性質の評価
[1] 1H-NMRの測定
　モノマーの導入率は、合成ポリマーの重クロロホルム溶液を測定試料とし、1H-NMR測定より算出した。
[2] 分子量測定
　ポリマーの分子量は、ポリマーの0.05 w/v% DMF溶液をメンブランフィルター(0.2 mm) に通導したものを測定試料とし、GPCを用いて測定した。測定器には東ソーGPC8020シリーズを用いた。
検出器；示差屈折率検出器；RI-8020、紫外吸光度検出器；UV-8020、カラム；TSK-GEL α-M (7.8 mmI.D.×300 mm), 移動相；10 mM LiCl/DMF, 流速；1.0 mL/min, 温度；40℃、
検量線；1000－272000 (内部標準物質:ポリエチレングリコール)。 
[3] LCST測定
　ポリマーのLCSTは透過率測定により算出した。5 mg/mLになるようにポリマー水溶液(H2OまたはPBS) を調製し、0.1℃/minの温度勾配で昇温して、透過率が50%となる温度をLCSTとした。P(NIPAAm-co-DMAAm48%-co-SMZ10%)は5 mM Na2H PO4/ 150 mM NaCl水溶液及び5 mM NaH2PO4/ 150 mM NaCl水溶液をもとに作成したpH緩衝液を用いて5 mg/mLになるように調整した。
装置; 紫外可視近赤外分光光度計(JASCO V-630) にETC-717型氷冷ペルチェ式恒温セルホルダ（JASCO）及び電動式ペルチェ温度自動調節機（KRUSS PT31）．測定波長; 500 nm 
[4] 表面電位(Zeta potential) の計測
　P(NIPAAm-co-DMAAm48%-co-SMZ10%)の表面電位は、合成したポリマーの200 mg/mL溶液(pH緩衝液) をメンブランフィルター(0.2 mm) に通導したものを測定試料としてゼータサイザーを用いて測定した
２－２－３．蛍光ポリマーの合成
[1] PNIPAAm-FLの合成
PNIPAAmのスクシニル化
　PNIPAAm(0.50 g, 1.00 mmol)をdichloromethaneに溶解し、DCC(0.05 g, 2.50 mmol ; 2.50 eq)及びNHS(0.03 g, 2.50 mmol ; 2.50 eq)を順次添加した後、25℃で24 h撹拌した。反応終了後、溶液を濾過し、副生成物の尿素を除去した。濾液を留去し、acetoneに溶解させ、氷冷diethyl ether中に滴下し再沈精製を行い、白色固体として目的物(0.40 g, 68.8%)を得た。
PNIPAAm-FLの合成
　上記PNIPAAmのスクシニル化によって得られた活性エステル化ポリマー(0.09 g, 0.02 mmol)を1,4-dioxaneに溶解し、5-aminofluorescein(0.02 g, 0.05 mmol ; 2.5 eq)を添加し、25℃で72 h撹拌した。反応終了後、溶媒を留去し粗生成物を得た。これをmethanolに溶解し、再生セルロース膜(MWCO 3,500) で外液に未反応の蛍光基が漏れ出ない状態まで透析した。その後、溶媒を留去し橙色固体としてPNIPAAm-FL(0.08 g, 80.0%)を得た。
[2] P(NIPAAm-co-BMA3%)の合成
P(NIPAAm-co-BMA3%)のスクシニル化
　P(NIPAAm-co-BMA) (10.0 mmol)をdichloromethaneに溶解し、DCC(25.0 mmol ; 2.5 eq)及びNHS(25.0 mmol ; 2.5 eq)を順次添加した後、25℃で24 h撹拌した。反応終了後、溶液を濾過し、副生成物の尿素を除去した。濾液を留去し、acetoneに溶解させ、氷冷diethyl ether中に滴下し再沈精製を行い、白色固体として目的物を得た。
P(NIPAAm-co-BMA3%)-FLの合成
　上記P(NIPAAm-co-BMA3%)のスクシニル化によって得られた活性エステル化ポリマー(10.0 mmol)を1,4-dioxaneに溶解し、5-aminofluorescein(25.0 mmol ; 2.5 eq)を添加し、25℃で72 h撹拌した。反応終了後、溶媒を留去し粗生成物を得た。これをmethanolに溶解し、再生セルロース膜(MWCO 3,500)で外液に未反応の蛍光基が漏れ出ないまで透析した。その後、溶媒を留去し橙色固体としてP(NIPAAm-co-BMA3%)-FLを得た。
[3] P(NIPAAm-co-DMAPAAm2%)の合成
P(NIPAAm-co-DMAPAAm2%)のスクシニル化
　コポリマー(10.0 mmol)をdichloromethaneに溶解し、DCC(25.0 mmol ; 2.5 eq)及びNHS(25.0 mmol ; 2.5 eq)を順次添加した後、25℃で24 h撹拌した。反応終了後、溶液を濾過し、副生成物の尿素を除去した。濾液を留去し、acetoneに溶解させ、氷冷diethyl ether中に滴下し、再沈精製を行い白色固体として目的のスクシニル化ポリマーを得た。
P(NIPAAm-co-DMAPAAm2%)-FLの合成
　上記P(NIPAAm-co-DMAPAAm2%)のスクシニル化によって得られた活性エステル化ポリマー(10.0 mmol)を1,4-dioxaneに溶解し、そこに5-aminofluorescein(25.0 mmol ; 2.5 eq)を添加し、25℃で72 h撹拌した。反応終了後、溶媒を留去し粗生成物を得た。これをmethanolに溶解し、再生セルロース膜(MWCO 3,500) で外液に未反応の蛍光基が漏れ出ない状態まで透析した。さらに溶媒を留去し橙色の固体としてP(NIPAAm-co-DMAPAAm2%)-FLを得た。
[4] P(NIPAAm-co--L-Phenylalanine-OMe1.3%-co-DMAPAAm3%)-FLの合成
P(NIPAAm-co -L-Phenylalanine-OMe1.3%-co-DMAPAAm3%)のスクシニル化
　コポリマー(6.00 g, 1.20 mmol)をdichloromethaneに溶解し、DCC(0.62 g, 3.00 mmol ; 2.5 eq)及びNHS(0.35 g, 3.00 mmol ;2.5 eq)を順次添加した。その後25℃で24 h撹拌した。反応終了後、溶液を濾過し、副生成物の尿素を除去した。濾液を留去し、acetoneに溶解させ、氷冷diethyl ether中に滴下し、再沈精製を行い白色固体として目的物(4.90 g, 70.3%)を得た。
P(NIPAAm-co -L-Phenylalanine-OMe1.3%-co-DMAPAAm3%)-FLの合成
　上記P(NIPAAm-co -L-Phenylalanine-OMe1.3%-co-DMAPAAm3%)のスクシニル化によって得られた活性エステル化ポリマー(1.50 g, 0.30 mmol)を1,4-dioxaneに溶解し、そこに5-aminofluorescein (0.11 g, 7.50 mmol ; 2.5 eq)を添加し、25℃で72 h撹拌した。反応終了後、溶媒を留去し粗生成物を得た。これをmethanolに溶解し、再生セルロース膜(MWCO 3,500) で外液に未反応の蛍光基が漏れ出ないまで透析した。さらに溶媒を留去し橙色固体としてP(NIPAAm-co-L-Phenylalanine-OMe1.3%-co-DMAPAAm3%)-FL(1.50 g, 93.2%)を得た。
[5] P(NIPAAm-co-L-Tryptophan-OMe1.5%-co-DMAPAAm3%)-FLの合成
P(NIPAAm-co-L-Tryptophan-OMe1.5%-co-DMAPAAm3%)のスクシニル化
　コポリマー(2.50 g, 0.50 mmol)をdichloromethaneに溶解し、DCC(0.26 g, 1.25 mmol ; 2.5 eq)及びNHS(0.14 g, 1.25 mmol ; 2.5 eq)を順次添加した。その後25℃で24 h撹拌した。反応終了後、溶液を濾過し、副生成物の尿素を除去した。濾液を留去し、acetoneに溶解させ、氷冷diethyl ether中に滴下し、再沈精製を行い白色の固体として目的のスクシニル化ポリマー(2.30 g, 79.3%)を得た。
P(NIPAAm-co-L-Tryptophan-OMe1.5%-co-DMAPAAm3%)-FLの合成
　上記P(NIPAAm-co-L-Tryptophan-OMe1.5%-co-DMAPAAm3%)のスクシニル化によって得られた活性エステル化ポリマー(2.30 g, 0.50 mmol)を1,4-dioxaneに溶解し、そこに5-aminofluorescein(0.43 g, 1.25 mmol ; 2.5 eq)を添加し、25℃で72 h撹拌した。反応終了後、溶媒を留去し粗生成物を得た。これをmethanolに溶解し、再生セルロース膜(MWCO 3,500) で外液に未反応の蛍光基が漏れ出ないまで透析した。さらに溶媒を留去し橙色固体としてP(NIPAAm-co-L-Tryptophan-OMe1.5%-co-DMAPAAm3%)-FL(2.20 g, 80.6%)を得た。
[6] P(NIPAAm-co-DMAAm48%-co-SMZ10%)-FLの合成
P(NIPAAm-co-DMAAm48%-co-SMZ10%)のスクシニル化
　コポリマー(150 mg, 0.50 mmol)をdichloromethaneに溶解し、DCC(257mg, 1.25 mmol ;2.5 eq)及びNHS(143 mg, 1.25 mmol ;2.5 eq)を順次添加した。その後25℃で24 h撹拌した。反応終了後、溶液を濾過し、副生成物の尿素を除去した。濾液を留去し、acetoneに溶解させ、氷冷diethyl ether中に滴下し、再沈精製を行い白色の固体として目的のスクシニル化ポリマーを得た。
P(NIPAAm-co-DMAAm48%-co-SMZ10%)-FLの合成
　上記P(NIPAAm-co-DMAAm48%-co-SMZ10%)のスクシニル化によって得られた活性エステル化ポリマー(152 mg, 0.01 mmol)を1,4-dioxaneに溶解し、そこに5-aminofluorescein(8.8 mg, 0.025 mmol ;2.5 eq)を添加し、25℃で72 h撹拌した。反応終了後、溶媒を留去し粗生成物を得た。これをmethanolに溶解し、再生セルロース膜(MWCO 3,500) で外液に未反応の蛍光基が漏れ出ないまで透析した。さらに溶媒を留去し薄黄色固体としてP(NIPAAm-co-DMAAm48%-co-SMZ10%)-FL (91.4 mg, 60.0 %)を得た。
[7] P(NIPAAm-co-L-Phe5%)-FLの合成
P(NIPAAm-co-L-Phe5%)のスクシニル化
　コポリマー(0.5 g, 0.10 mmol)をdichloromethaneに溶解し、DCC (0.11 mmol ; 1.1 eq)及びNHS(0.11 mmol ; 1.1 eq)を順次添加した。その後25℃で24 h撹拌した。反応終了後、溶液を濾過し、副生成物の尿素を除去した。濾液を留去し、acetoneに溶解させ、氷冷diethyl ether中に滴下し、再沈精製を行い白色の固体として目的のスクシニル化ポリマーを得た。
P(NIPAAm-co-L-Phe5%)-FLの合成
　上記P(NIPAAm-co-L-Phe5%)のスクシニル化によって得られた活性エステル化ポリマー(0.5 g, 0.10 mmol)を1,4-dioxaneに溶解し、そこに5-aminofluorescein(0.09 g, 0.25 mmol ; 2.5 eq)を添加し、25℃で72 h撹拌した。反応終了後、溶媒を留去し粗生成物を得た。これをmethanolに溶解し、再生セルロース膜(MWCO 3,500) で外液に未反応の蛍光基が漏れ出ないまで透析した。さらに溶媒を留去し橙色固体としてP(NIPAAm-co-L-Phe5%)-FL (0.49 g, 83.1 %)を得た。
２－２－４．温度応答性蛍光ポリマーの物理化学的性質の評価
[1] LCST測定
　ポリマーのLCSTは透過率測定により算出した。ポリマーの5 mg/mL溶液(PBS) を調製し、0.1℃/minの温度勾配で昇温して、透過率が50%となる温度をLCSTとした。
装置; 紫外可視近赤外分光光度計(JASCO V-630) にETC-717型氷冷ペルチェ式恒温セルホルダ(JASCO）及び電動式ペルチェ温度自動調節機（KRUSS PT31）．測定波長; 600 nm
[2] 表面電位(Zeta potential) の計測
　蛍光ポリマーの表面電位は、合成した蛍光ポリマーの200 mg/mL溶液(PBS) をメンブランフィルター(0.2 mm) に通導したものを測定試料とし、ゼータサイザーを用いて測定した。
２－３．結果・考察
２－３－１．温度応答性ポリマーの合成
　連鎖移動剤としてMPA、ラジカル開始剤としてAIBNを用いて、DMF中、70℃で重合を行い、PNIPAAm、NIPAAmに疎水性モノマーを共重合したP(NIPAAm-co-BMA3%)、親水性モノマーを共重合したP(NIPAAm-co-DMAPAAm2%)、上記で合成したアミノ酸誘導体モノマーと親水性モノマーを共重合したP(NIPAAm-co-L-Phenylalanine-OMe1.3%-co-DMAPAAm3%)及びP(NIPAAm-co-L-Tryptophan-OMe1.5%-co-DMAPAAm3%)をいずれも白色固体として得た(下記Scheme.2-4～Scheme.2-8 を参照) 。アミノ酸誘導体モノマーを含む共重合三元ポリマーは共重合二元ポリマーのLCSTを参考にモノマーの組成比を検討した(図５)。なお、図５において、(A)はBMA, (B)はL-Phe-OMe, (C)はL-Trp-OMe, (D)はDMAPAAm copolymer に関するグラフである。図５において、(◇)は1%, (□)は2%, (△)は3%, (×)は4%, (○)は5%をそれぞれ意味する。また、連鎖移動剤としてMPA、RAFT剤として(2-(Dodecylthiocarbonothioylthio)-2-methylpropionic acid) を用いて、DMF中、70℃で重合を行い、P(NIPAAm-co-DMAAm48%-co-SMZ10%)及びP(NIPAAm-co-L-Phe5%)を白色固体として得た(下記Scheme.2-9、Scheme.2-10 を参照) 。これらのポリマーの片末端はMPA由来のカルボキシ基を有しており、これをもとに蛍光分子の修飾が可能である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
２－３－２．温度応答性ポリマーの物理化学的性質の評価
　1HNMR測定により共重合モノマーの導入率を算出した(表１, 図６～図１２)。また、合成したそれぞれのポリマーの数平均及び質量平均分子量(Mn，Mw) はGPCにより決定した(下記表１を参照)。PNIPAAm、P(NIPAAm-co-BMA 3％)、P(NIPAAm-co-DMAPAAm2%) 、P(NIPAAm-co-L-Phe1.3%-co-DMAPAAm3%)、P(NIPAAm-co-L-Trp1.5%-co-DMAPAAm3%)の分子量分布は1.9～2.5前後であった。ラジカル重合法は開始・生長反応のみならず、移動・停止反応と呼ばれる副反応が起こるため、生成ポリマーは様々な分子量のポリマーの混合物となっている。そのため, 分子量分布がどのポリマーも大きくなってしまっている。一方、精密重合法であるRAFT重合で合成したP(NIPAAm-co-DMAAm48%-co-SMZ10%)及びP(NIPAAm-co-L-Phe5%)の分子量分布はいずれも1.3前後であった。RAFT重合は開始反応、生長反応のみからなっており、副反応が存在せずポリマーの分子量が制御できるため、狭い分子量分布のポリマーが得られた。
　合成したポリマーの温度応答性を確認するため、LCSTの測定を行った図１３)。今回作製したポリマーのLCSTはH2O中で、PNIPAAmは32.2℃、P(NIPAAm-co-BMA3%)は26.7℃、P(NIPAAm-co-DMAPAAm2%)は37.7℃、P(NIPAAm-co-L-Phe1.3%-co-DMAPAAm3%)は37.9℃、P(NIPAAm-co-L-Trp1.5%-co-DMAPAAm3%)は37.5℃だった。正常細胞と病態細胞を見分けることが目的であるため、目的の37℃前後にLCSTをもつアミノ酸誘導体ポリマーが合成できたように見受けられたが、ポリマーの凝集がイオンの影響を受けることはポリマーのイオン間相互作用の研究において示唆された。蛍光ポリマーの細胞取り込み実験は培地中で行うため、MEM無血清培地及び細胞等張液であるPBSでポリマーのLCSTを測定した。PBS中におけるポリマーのLCSTは、PNIPAAmでは29.7℃、P(NIPAAm-co-BMA3%)では26.7℃、P(NIPAAm-co-DMAPAAm2%)では32.4℃、P(NIPAAm-co-L-Phe1.3%-co-DMAPAAm3%)では32.9℃、P(NIPAAm-co-L-Trp1.5%-co-DMAPAAm3%)では31.0℃であり、すべてのポリマーにおいてLCSTの低下がみられた。PBSとMEM無血清培地では差が見られなかったため、以後の測定においてはPBSを用いた。特にDMAPAAmを共重合したポリマーにおいてLCSTの低下が顕著であり、これはカチオン性であるDMAPAAmがイオンの影響を受けやすいためであると考えられる。また、DMAPAAmはアルブミンのマイナスチャージとの相互作用によってLCSTが低下することも分かった。血清入り培地で取り込み実験をする際には10%FBS入りMEM培地で細胞を24h incubateした所に蛍光ポリマーを添加するため、この溶液を回収し、上清を取り除いた溶液(活性FBSが10%以下になっていると予想される培地) でLCSTを測定したところ、PBSで測定した際と差が見られなかった。そのため、今回の系ではLCSTについてはFBSの影響を受けにくいと仮定し、PBS中におけるLCSTをもとに細胞取り込み実験の温度を決定することにした。温度応答性に加えてpH応答性を期待したP(NIPAAm-co-DMAAm48%-co-SMZ10%)のLCSTはpH = 6.4では29.3℃、pH = 7.0では34.5℃、pH = 7.4では42.0℃、pH = 7.8では44.5℃、pH = 8.4では46.3℃であった(PNIPAAmではpH応答性なし) 。生体内の正常pHが7.4であり、がん細胞付近のpHは6.8~7.0とされているため、がん細胞と正常細胞を識別するのに最適なLCSTを有していた(図１４)。LAT1選択性を目的とするP(NIPAAm-co-L-Phe5%)のLCSTはH2O/PBS中で30.0℃/50.2℃であった。L-phenylalanineのpKaは5.5であるが、PBSのpHは7.4であるのに対し、H2OのpHは空気中のCO2を吸収し酸性側に傾いている。そのため、PBS中ではN-Acryloyl-L-Phenylalanineのカルボキシル基がイオン化し、LCSTが上昇すると考えられる。
　動的光散乱による粒子径測定をH2O及びPBS溶液で行った(図１５) 。どちらの溶液中においてもLCST以上においてポリマーの粒子径の増大が見られた(P(NIPAAm-co-L-Phe5%)/H2O以外)。中でも、H2O水溶液ではカチオンチャージを持つポリマーであるP(NIPAAm-co-DMAPAAm2%) のLCST以上における粒子径の増大が他のポリマーに比べ亢進した。PBS溶液ではポリマーはイオンとの相互作用を受けて粒子径の増大が顕著であった。細胞取り込み実験は培地中で行うため、それに近い環境下でポリマーの粒子径を的確に測定することがポリマーの取り込み経路を判断する上で重要である。
　P(NIPAAm-co-DMAAm48%-co-SMZ10%)のゼータ電位を測定したところ、pHが上昇するにつれてLCST上昇およびzeta potential低下が見られ、これらの相関関係が示唆された(図１６)。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000024
２－３－３．温度応答性蛍光ポリマーの合成
　前項で合成した温度応答性ポリマーを蛍光分子に結合させるため、NHSとDCCを用いて、ポリマーの末端カルボキシル基を活性エステルに変換した。このスクシニル化ポリマーを蛍光分子である5-aminofluorescein (FL) と反応させた. 得られた粗生成物を透析にて精製し、ポリマー末端にFLを有する蛍光ポリマーをそれぞれ合成し, いずれも黄色固体として得た (下記Scheme.2-11 を参照)。 
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
２－３－４．温度応答性蛍光ポリマーの物理化学的性質の評価
　蛍光ポリマーの温度応答性を評価するためLCSTの測定を行った(図１７)。いずれの蛍光ポリマーも温度応答性ポリマー由来の温度応答性を保持したまま作製できたことが確認された。蛍光基修飾前後のポリマーのLCSTを比較したところ、ほぼ同じ温度付近にLCSTを有していたことから, ポリマー末端にFLを導入してもLCSTにほとんど影響を及ぼさないことが分かった。また、ポリマー溶液(PBS) の表面電位を計測したところ(図１８)、PNIPAAm-FLはLCST前後で電位の変化は見られなかった。P(NIPAAm-co-BMA3%)-FLはLCST以上では負に帯電した。P(NIPAAm-co-DMAPAAm2%)-FL、P(NIPAAm-co-L-Phe-OMe1.3%-co-DMAPAAm3%)-FL , 2P(NIPAAm-co-L-Trp-OMe1.5%-co-DMAPAAm3%)-FLはLCST以上では正に帯電しており、細胞膜付着性を期待してポリマー鎖中に導入したDMAPAAmユニットによるものであると考えられる。
３．アミノ酸誘導体ポリマーにおける細胞実験
３－１. 試薬及び装置
試薬
RAW 264.7 培養細胞株: 理化学研究所
HeLa培養細胞株: 理化学研究所
MEM: Life Technologies
Fetal Bovine Serum (FBS): Cell Culture Bioscience (CCB)
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100×, Liquid): Life Technologies
0.05 w/v% Trypsin-0.53 mmol/L EDTA・4Na Solution with Phenol Red: 和光純薬工業株式会社
Dulbecco's phosphate-buffered salines (D-PBS): Life Technologies
0.02mol/L EDTA水溶液: 和光純薬工業株式会社
RecoveryTMCell Culture Freezing Medium: Life Technologies
4% Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution: 和光純薬工業株式会社
LysoTracker(R) Red DND-99: invitrogen
Hoechst33258: invitrogen
FluoromountTM水性マウンティング媒体: SIGMA ALDRICH
VECTORSHIELD HardSet Mainting Medium with DAPI: Vector Laboratries
Propidium iodide: 同仁化学研究所
Fillipin III: CAYMAN CHEMICAL COMPANY
Cytochalasin D: 和光純薬工業株式会社
Chlorpromazine: SIGMA ALDRICH
Sucrose: 和光純薬工業株式会社
装置
Infinite M1000; テカンジャパン株式会社
BIOREVO BZ-9000; 株式会社キーエンス
FACS Calibur; 日本ベクトン・ディッキンソン株式会社
３－２． 実験項
３－２－１． 細胞の培養
　RAW264.7細胞は10% FBS, 1%抗菌剤（Penicillin-Streptomycin Glutamine）、MEM NEAAを添加したMEMを培地として75cm2培養フラスコを用い、37℃、5% CO2濃度で培養した。継代時、 細胞はセルスクレーパーで剥離し、75cm2培養フラスコ内で2-3日間固定化した。
　HeLa細胞は10% FBS、1%抗菌剤（Penicillin-Streptomycin Glutamine）、MEM NEAAを添加したMEMを培地として75cm2培養フラスコを用い、37℃、5% CO2濃度で培養した。継代時、細胞はトリプシンで剥離し、75cm2培養フラスコ内で2-3日間培養した。
３－２－２．経時変化及び最適濃度検討
　RAW264.7細胞は24ウェルプレート(1×105 cells、1 mL/well) 上で37℃、5%CO2濃度環境下24 h培養した。蛍光ポリマーはPBS中に溶解して異なる濃度 (0.1、0.5、1、2 mg/mL) に調製した。これを培養細胞に対し100 mL添加し、細胞溶液中における蛍光ポリマーの最終濃度を10, 50, 100, 200 mg/mLとした。それぞれ1、2、4 h放置後、ウェル内をPBSで3回洗浄した。次いで4% paraformaldehyde phosphate buffer solutionで20 min固定化し、PBSで2回洗浄した。PBSを1 mL添加し,プレートリーダーで蛍光強度測定を行った。
　HeLa細胞は24ウェルプレート(2.5×104cells、1 mL/well) 上で37℃、5%CO2濃度環境下24 h培養した。蛍光ポリマーはPBS中に溶解して異なる濃度 (0.1、0.5、1、2, 4 mg/mL) に調製した. これを培養細胞に対し100 mL添加し、細胞溶液中における蛍光ポリマーの最終濃度を10, 50, 100, 200, 400 mg/mLとした。それぞれ1、2、4 h放置後、ウェル内をPBSで3回洗浄した。次いで4% paraformaldehyde phosphate buffer solutionで20 min固定化し、PBSで2回洗浄した。PBSを1 mL添加し,プレートリーダーで蛍光強度測定を行った。
測定条件; Wavelength; Ex: 490 nm, Bandwidth: 5.0 nm, Em: 515 nm, Bandwidth: 5.0 nm
         Mode: Bottom, Gain: Optimal, Multiple: Reads per Well Type: Square, Size: 4×4, Border: 750 mm, Flashes; Mode 1 [400Hz] 50, Settle time: 100 ms
３－２－３．培養温度による細胞取り込みの効果
プレートリーダー
　RAW264.7細胞は24-wellプレート(1×105 cells、1 mL/well) 上で37℃、5%CO2濃度環境下24 h培養した。蛍光ポリマーは2 mg/mLに調製した. これを培養細胞に対し100 mL添加し、細胞溶液中における蛍光ポリマーの最終濃度を200 mg/mLとした。4 h放置後、ウェル内をPBSで3回洗浄した。次いで4% paraformaldehyde phosphate buffer solutionで20 min固定化し、PBSで2回洗浄した。PBSを1 mL添加し,プレートリーダーで蛍光強度測定を行った。
　HeLa細胞は24-wellプレート(2.5×104 cells、1 mL/well) 上で37℃、5%CO2濃度環境下24 h培養した。蛍光ポリマーは4 mg/mLに調製した。これを培養細胞に対し100 mL添加し、細胞溶液中における蛍光ポリマーの最終濃度を400 mg/mLとした。4 h放置後、ウェル内を2mM EDTA/PBSで3回洗浄した。次いで4% paraformaldehyde phosphate buffer solutionで20 min固定化し、2mM EDTA/PBSで2回洗浄した。2mM EDTA/PBSを1 mL添加し,プレートリーダーで蛍光強度測定を行った。
測定条件; Wavelength; Ex: 490 nm, Bandwidth: 5.0 nm, Em: 515 nm, Bandwidth: 5.0 nm
         Mode: Bottom, Gain: Optimal, Multiple: Reads per Well Type: Square, Size: 4×4, Border: 750 mm, Flashes; Mode 1 [400Hz] 50, Settle time: 100 ms
Flow cytometry analysis
　RAW264.7細胞は6-well プレート(2×105cells, 2 mL/well) 上で37℃、5%CO2濃度環境下24 h培養した。PBS中に溶解し調製した蛍光ポリマー溶液 (2 mg/mL) を1-wellあたり200 mL添加し, 細胞溶液中における蛍光ポリマーの最終濃度を200 mg/mLとした。27℃及び37℃ (BMA-FLのみ25℃及び37℃) で4 h放置後、2mM EDTA/PBSで2回洗浄し、トリプシン処理で細胞を剥離し、血清入り培地を加え、遠心し上清を除去した。2mM EDTA/PBSで1回洗浄・遠心し、propidium iodide溶液 (1 mg/mL) を添加し、室温・暗所で15 min放置した。さらにPBSで2回洗浄・遠心し、PBSを加えた。測定前にBD FalconTMセルストレーナーに通導し、測定サンプルとし、10,000 cellカウントした。
　HeLa細胞は6-well プレート(5×104cells, 2 mL/well) 上で37℃、5%CO2濃度環境下24 h培養した。PBS中に溶解し調製した蛍光ポリマー溶液 (2 mg/mL) を1-wellあたり200 mL添加し, 細胞溶液中における蛍光ポリマーの最終濃度を200 m g/mLとした。27℃及び37℃ (BMA-FLのみ25℃及び37℃) で4 h放置後、2mM EDTA/PBSで2回洗浄し、トリプシン処理で細胞を剥離し、血清入り培地を加え、遠心し上清を除去した。PBSで1回洗浄・遠心し、propidium iodide溶液 (1 mg/mL) を添加し、室温・暗所で15 min放置した。さらにPBSで2回洗浄・遠心し、PBSを加えた。測定前にBD FalconTMセルストレーナーに通導し、測定サンプルとし、10,000 cellカウントした。
測定条件; RAW 264.7 cell ; FSC: E00, SSC: 580, FL1: 540, FL2: 550, FL3: 650
          HeLa cell ; FSC: E00, SSC: 520, FL1: 450, FL2: 550, FL3: 600
蛍光顕微鏡における観察
　RAW264.7細胞は35 mm ガラスボトムディッシュ (2×105cells, 2 mL/well) 上で37℃、5%CO2濃度環境下24 h培養した。PBS中に溶解し調製した蛍光ポリマー溶液 (2 mg/mL) を培養細胞に対し200 mL添加し, 細胞溶液中における蛍光ポリマーの最終濃度を200 mg/mLとした。27℃及び37℃ (BMA-FLのみ25℃及び37℃) で4 h放置後、PBSで3回洗浄し、4% paraformaldehyde phosphate buffer solutionで20 min固定化し、PBSで2回洗浄した。PBSを2 mL添加し、蛍光顕微鏡による観察を行った。
　HeLa細胞はLab-Tek(R)II Chamber SlideTMSystem 4-well (2.5×104 cells, 1 mL/well) 上で37℃、5% CO2濃度環境下24 h培養した。PBS中に溶解し調製した蛍光ポリマー溶液 (4 mg/mL) を培養細胞に対し100 mL添加し, 細胞溶液中における蛍光ポリマーの最終濃度を400 mg/mLとした。27℃及び37℃ (BMA-FLのみ25℃及び37℃) で4 h放置後、PBSで3回洗浄し、4% paraformaldehyde phosphate buffer solutionで20 min固定化し、PBSで2回洗浄した。FluoromountTM水性マウンティング媒体を用いて封入し、蛍光顕微鏡による観察
を行った。
３－２－４．蛍光ポリマーの細胞内における局在
　RAW264.7細胞は35 mm ガラスボトムディッシュ (2×105cells, 2 mL/well) 上で37℃、5%CO2濃度環境下24 h培養した。PBS中に溶解し調製した蛍光ポリマー溶液 (2 mg/mL) を培養細胞に対し200 mL添加し, 細胞溶液中における蛍光ポリマーの最終濃度を200 mg/mLとした。4 h放置後、無血清培地中にLysoTracker(R)Red DND-99 (50 nM) を添加し, 37℃、5% CO2濃度環境下30 min放置した。PBSで3回洗浄し、4% paraformaldehyde phosphate buffer solutionで20 min固定化した。PBSで1回洗浄し、Hoechst33258溶液(5 mg/mL) を2 mL添加し、15 min放置した。PBSで2回洗浄し、さらにPBSを2 mL添加し、蛍光顕微鏡による観察を行った。
　HeLa細胞はLab-Tek(R)II Chamber SlideTM System 4-well (2.5×104 cells, 1 mL/well) 上で37℃、5% CO2濃度環境下24 h培養した。PBS中に溶解し調製した蛍光ポリマー溶液 (4 mg/mL) を培養細胞に対し100 mL添加し, 細胞溶液中における蛍光ポリマーの最終濃度を400 mg/mLとした。4 h放置後、無血清培地中にLysoTracker(R)Red DND-99 (50 nM) を添加し, 37℃、5% CO2濃度環境下30 min放置した。PBSで3回洗浄し、4% paraformaldehyde phosphate buffer solutionで20 min固定化した。ウェル内をPBSで1回洗浄し、VECTORSHIELD HardSet Mainting Medium with DAPIを用いて封入し、蛍光顕微鏡による観察を行った。
３－２－５．阻害剤を用いた細胞取り込み経路の探索
　RAW264.7細胞はマルチウェルプレート (1×105 cells, 1 mL/well) 上で37℃、5% CO2濃度環境下24 h培養した。血清入り培地を除去し、ウェル内をPBSで一回洗浄し、無血清培地を加えた。無血清培地で希釈した阻害剤を添加後、450 μM sucrose、10 μg/mL chlorpromazineのマルチウェルプレートは1 h、10 μg/mL Fillipin、10 μM Cytochalasin Dを添加したマルチウェルプレートは30 minインキュベートした。蛍光ポリマーをPBSに溶解して2 mg/mLに調製し、培養細胞に対し100 mL添加し、細胞溶液中における蛍光ポリマーの最終濃度を200 mg/mLとした。4h放置後、ウェル内をPBSで3回洗浄した。次いで4% paraformaldehyde phosphate buffer solutionで20 min固定化し、PBSで2回洗浄した。PBSを1 mL添加し、プレートリーダーで蛍光強度測定を行った。
測定条件; Wavelength; Ex: 490 nm, Bandwidth: 5.0 nm, Em: 515 nm, Bandwidth: 5.0 nm
         Mode: Bottom, Gain: Optimal, Multiple: Reads per Well Type: Square, Siz
e: 4×4, Border: 750 mm, Flashes; Mode 1 [400Hz] 50, Settle time: 100 ms
３－３． 結果・考察
３－３－１． RAW 264.7 cellにおける検討
３－３－１－１．経時変化及び最適濃度検討
　蛍光ポリマーを細胞イメージングへ適用するために、イメージングに最適な細胞への蛍光ポリマー添加濃度及び培養時間について検討した。細胞溶液中における蛍光ポリマーの最終濃度を10、50、100、200 mg/mLになるよう調製して培養細胞へ添加した。37℃で1、2、4 h放置後、プレートリーダーで蛍光強度測定を行った。いずれの蛍光ポリマーにおいても、 濃度及び時間の増加に応じて高い蛍光強度を発することが確認され, 以降のRAW 264.7 cellにおける実験では細胞溶液中の蛍光ポリマー濃度を200 mg/mL、培養時間を4hに設定した。FBS(-)とFBS(+)における細胞取り込み実験では顕著な差は見られなかった。
３－３－１－２．培養温度による細胞取り込みの効果
　蛍光ポリマーの培養温度による細胞取り込み効果を調べるため、細胞溶液中へ蛍光未修飾ポリマー及び蛍光ポリマー溶液を添加し、LCST以下(27℃、BMA3%-FLのみ25℃) 及びLCST以上(37℃) の温度で4 h放置後、プレートリーダーによる測定、フローサイトメトリー解析及び蛍光顕微鏡観察を室温で行った。プレートリーダーによる測定ではいずれの蛍光ポリマーもLCST以下では蛍光強度が低くLCST以上では蛍光強度が増大した。これは、LCST以上になるとPNIPAAm鎖が疎水性変化を示し蛍光ポリマーの疎水性度が増大することから、蛍光ポリマーの細胞取り込みが促進するためと考えられる。フローサイトメトリー解析においては、FBS(+)に比べ、FBS(-)では蛍光ポリマーのバックグラウンドが高い傾向が見られたが、FBSの有無にかかわらずLCST以上と以下で蛍光ポリマーの取り込み実験を行った結果には差が見られた。蛍光顕微鏡における観察では、LCST以下で取り込み実験したものは細胞内に蛍光ポリマー由来の蛍光が確認されず、LCST以上で取り込み実験したものは細胞内での蛍光が3次元的にも確認された。またLCST以上の細胞内では、いずれの蛍光ポリマーにおいてもドット状に分布していることが確認された。これは蛍光ポリマーが凝集したためであると考えられる. 蛍光ポリマーの粒径は前章で調べているが、その結果からも蛍光ポリマーにおける凝集を確認している。以上のことから, 既往研究と一致する結果となり、アミノ酸誘導体を用いることでも細胞取り込みは温度依存的な挙動を示すことが確認された。 
３－３－１－３。蛍光ポリマーの細胞における局在
　蛍光ポリマーの細胞における局在を確認するため、細胞のライソソームを染めるLysoTracker(R)Red DND-99及び核を染めるHoechst33342を用いて多重染色を行った。培養細胞へ蛍光ポリマーを添加後、37℃、5% CO2濃度で4h培養し、次いでライソソーム及び核染色を行い、蛍光顕微鏡で観察を行った。いずれの蛍光ポリマー (緑) も、核(青) には局在しておらず、ライソソーム (赤) にもほとんど局在していないことが確認された。通常、ナノサイズの物質が細胞外から細胞内へ物質が取り込まれる際にはエンドサイトーシスという小胞輸送経路により取り込まれ、ライソソームと融合し、ライソソーム内の様々な消化酵素により分解を受ける。しかし今回、ライソソームにおいて蛍光ポリマーの局在がほとんど確認されなかったことから、蛍光ポリマーがプロトンスポンジ効果によるエンドソームからの離脱、有用物あるいは不要物として認識され残余小体として細胞質にとどまっている、またはゴルジ体への局在等の可能性が示唆される。緒言でも述べたように温度応答性ポリマーを修飾したナノキャリアにおいて、エンドサイトーシス経路で取り込まれた後、ライソソーム以外の部位で局在が確認されており、表面に修飾した温度応答性ポリマー鎖が細胞への取り込みに何らかの影響を及ぼしていると考えられている。蛍光ポリマーが細胞内のどこに分布しているのかを正確に解明するためには、細胞の他の部位を染めるような試薬等を用いたり, 他の蛍光基を修飾した蛍光ポリマーを用いたりする必要性がある。
３－３－１－４．阻害剤を用いた細胞取り込み経路の探索
　細胞の取り込み経路に関わる因子を阻害薬により阻害することにより、蛍光ポリマーの細胞取り込み経路の探索を行った。カベオラ仲介型エンドサイトーシス阻害剤としてfillipin III、ファゴサイトーシス阻害剤としてcytochaiasin D、クラスリン依存性エンドサイトーシスとしてchlorpromazine、scroseを用いた。いずれの蛍光ポリマーにおいてもクラスリン介在性エンドサイトーシスの阻害剤であるchlorpromazine及びscroseを添加した細胞において取り込みが抑制された。このことから本研究で作製した蛍光ポリマーは、クラスリン依存性エンドサイトーシスにより細胞へ取り込まれていることが示唆された。クラスリン依存性エンドサイトーシスとは、クラスリンと形質膜を貫通する受容体タンパク等が100～150 nmの被覆ピットを作り、さらに膜を球状に変化させクラスリン被覆小胞を形成することにより、細胞外の様々な物質を細胞内へと輸送する機構である。前章より、本蛍光ポリマーのLCST時のサイズは、100～150 nmであることから、サイズと細胞取り込み経路との相関にも今回の結果は一致したと考えられる。しかし、細胞取り込み経路については未だ解明されていない部分も多く、サイズだけが取り込みに関与しているとは言い難い。今回の検討を明確なものにするためには、他の阻害剤等も使用しさらなる検討を重ねていく必要があると考えられる。
３－３－２． HeLa cellにおける検討
３－３－２－１．経時変化及び最適濃度検討
　蛍光ポリマーを細胞イメージングへ適用するために、イメージングに最適な細胞への蛍光ポリマー添加濃度及び取り込み時間について検討した。RAW 264.7 cellにおける実験ではPBSを洗浄液として用いたが、蛍光ポリマーがHeLa cellの表面に吸着しやすいためかPBSによる洗浄ではバックグラウンドが出てLCST以上と以下と差が見られない結果になってしまった。そのため、2mM EDTA/PBSを洗浄液とした。細胞溶液中における蛍光ポリマーの最終濃度を10、 50、100、200、400 mg/mLになるよう調製して培養細胞へ添加した。37℃で1、2、4 h放置後、プレートリーダーで蛍光強度測定を行った。いずれの蛍光ポリマーにおいても, 濃度及び時間の増加に応じて高い蛍光強度を発することが確認され、以降のHeLa cellにおける実験では細胞溶液中の蛍光ポリマー濃度を400 mg/mL、取り込み時間を4hに設定した。FBS(-)とFBS(+)における取り込み実験では顕著な差は見られなかった。
３－３－２－２．培養温度による細胞取り込みの効果
　蛍光ポリマーの培養温度による細胞取り込み効果を調べるため、細胞溶液中へ蛍光未修飾ポリマー及び蛍光ポリマー溶液を添加し、LCST以下(27℃、BMA3%-FLのみ25℃) 及びLCST以上(37℃) の温度で4 h放置後、プレートリーダーによる測定、フローサイトメトリー解析及び蛍光顕微鏡観察を室温で行った。プレートリーダーによる測定ではいずれの蛍光ポリマーもLCST以下では蛍光強度が低くLCST以上では蛍光強度が増大した。フローサイトメトリー解析においては、2mM EDTA/PBSで洗浄を行ってもFBS(-)では蛍光ポリマーのバックグラウンドを消すことができず、LCST以下と以上で同じ結果が生じた。一方、FBS(+)ではLCST以上と以下で蛍光ポリマーの取り込み実験を行った結果には差が見られた。これにより、FBS存在下において蛍光ポリマーの非特異的な吸着をブロックできる可能性が示唆された。蛍光顕微鏡における観察では、LCST以下で取り込み実験したものは細胞内に蛍光ポリマー由来の蛍光が確認されず、LCST以上で取り込み実験したものは細胞内での蛍光が3次元的にも確認された。またLCST以上の細胞内では、いずれの蛍光ポリマーにおいてもドット状に分布していることが確認された。以上のことから、がん細胞においても細胞取り込みは温度依存的な挙動を示すことが確認された。
３－３－２－３．蛍光ポリマーの細胞における局在
　蛍光ポリマーの細胞内における局在を確認するため、細胞のライソソームを染めるLysoTracker(R)Red DND-99及び核を染めるDAPIを用いて多重染色を行った。培養細胞へ蛍光ポリマーを添加後、37℃で4h放置し、次いでライソソーム及び核染色を行い、蛍光顕微鏡で観察を行った. いずれの蛍光ポリマー (緑) もライソソーム(赤) における局在が確認され (黄)、RAW 264.7 cellとは異なる局在をしている可能性が示唆された。 HeLa細胞におけるナノ粒子の細胞内取り込み実験において、25 nm以下の粒子は非古典的経路以外の経路で取り込まれゴルジ周辺に局在していたのに対し、42 nm以上の粒子はクラスリンやカベオラ依存性エンドサイトーシスで取り込まれライソソームに局在していたという報告があるが、本結果はこの報告に一致するものであった。また、本研究で用いた5-aminofluoresceinのpKaは6.4であり、pH 6.4以下ではラクトン構造を有しているのに対し、pH 6.4以上の塩基性環境下では加水分解によりラクトンの開環が生じ、分子全体が平面構造をとるため、強い蛍光を発する性質を有することが知られている。蛍光ポリマーのpH応答性はこの蛍光基の性質に由来するものであることは既に報告しているが、ライソソーム内はpH5.5あるいはより酸性に保たれているため、観察された以外にもライソソーム内に蛍光ポリマーが存在しているにもかかわらず、光っていない可能性も考えられる。そのため、他の蛍光基を修飾した蛍光ポリマーを用い、検討する必要性がある。
３－３－２－４．阻害剤を用いた細胞取り込み経路の探索
　細胞の取り込み経路に関わる因子を阻害薬により阻害することにより、蛍光ポリマーの細胞取り込み経路の探索を行った。カベオラ仲介型エンドサイトーシス阻害剤としてfillipin III、クラスリン依存性エンドサイトーシスとしてchlorpromazine、scrose、マクロピノサイトーシス阻害剤としてcytochaiasin Bを用いた。
　HeLa cellにおいてクラスリン及びカベオラ依存性エンドサイトーシスを阻害するとマクロピノサイトーシスが亢進されるという報告もある。
４．pH応答性ポリマーにおける細胞評価
４－１． 試薬及び装置
試薬
HeLa培養細胞株: 理化学研究所
MEM: Life Technologies
Fetal Bovine Serum (FBS): Cell Culture Bioscience (CCB)
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100×, Liquid): Life Technologies
0.05 w/v% Trypsin-0.53 mmol/L EDTA・4Na Solution with Phenol Red: 和光純薬工業株
式会社Dulbecco's phosphate-buffered salines (D-PBS): Life Technologies
HCl: 和光純薬株式会社
RecoveryTMCell Culture Freezing Medium: Life Technologies
4% Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution: 和光純薬工業株式会社
LysoTracker(R) Red DND-99: invitrogen
Hoechst33258: invitrogen
Propidium iodide: 同仁化学研究所
装置
FACS Calibur; 日本ベクトン・ディッキンソン株式会社
BIOREVO BZ-9000; 株式会社キーエンス
４－２．実験項
４－２－１． 細胞の培養
　HeLa細胞は10% FBS、1%抗菌剤（Penicillin-Streptomycin Glutamine）、MEM NEAAを添加したMEMを培地として75cm2培養フラスコを用い、37℃、5% CO2濃度で培養した。継代時、細胞はトリプシンで剥離し、75cm2培養フラスコ内で2-3日間培養した。
４－２－２． 培養温度による細胞取り込みの効果
Flow cytometry analysis
　HeLa細胞は6-well プレート(5×104cells, 2 mL/well) 上で37℃、5%CO2濃度環境下24 h培養した。PBS中に溶解し調製した蛍光ポリマー溶液 (4 mg/mL) を1-wellあたり200 mL添加し、細胞溶液中における蛍光ポリマーの最終濃度を400 m g/mLとした。pH = 6.8及び7.4で4 h放置後、2 mM EDTA/PBSで2回洗浄し、トリプシン処理で細胞を剥離し、血清入り培地を加え、遠心し上清を除去した。PBSで1回洗浄・遠心し、propidium iodide溶液 (1 mg/mL) を添加し、室温・暗所で15 min放置した。さらにPBSで2回洗浄・遠心し、PBSを加えた。測定前にBD FalconTMセルストレーナーに通導し、測定サンプルとし、10,000 cellカウントした。pH = 6.8の培地はMEM培地にHClを滴下し、Ekicrodisc(R)25 0.2 mm HT-Tuffryn(R)に通導したものを用いた。
測定条件; FSC: E00, SSC: 520, FL1: 450, FL2: 550, FL3: 600
蛍光顕微鏡における観察
　HeLa細胞は35 mm ガラスボトムディッシュ (5×104cells, 2 mL/well) 上で37℃、5%CO2濃度環境下24 h培養した。PBS中に溶解し調製した蛍光ポリマー溶液 (4 mg/mL) をガラスボトムディッシュの培養細胞に対し200 mL添加し, 細胞溶液中における蛍光ポリマーの最終濃度を400 mg/mLとした。pH = 6.8及び7.4で37℃、4 h放置後、2mM EDTA/PBSで3回洗浄し、4% paraformaldehyde phosphate buffer solutionで20 min固定化し、2mM EDTA/PBSで2回洗浄した。2mM EDTA/PBSを2 mL添加し、蛍光顕微鏡による観察を行った。
４－２－３． 蛍光ポリマーの細胞における局在
　HeLa細胞は35 mm ガラスボトムディッシュ (5×104cells, 2 mL/well) 上で37℃、5%CO2濃度環境下24 h培養した。PBS中に溶解し調製した蛍光ポリマー溶液 (4 mg/mL) をガラスボトムディッシュの培養細胞に対し200 mL添加し, 細胞溶液中における蛍光ポリマーの最終濃度を400 mg/mLとした。pH = 6.8及び7.4で37℃、4 h放置後、無血清培地中にLysoTracker(R)Red DND-99 (50 nM) を添加し, 37℃、5% CO2濃度環境下30 min放置した。PBSで3回洗浄し、4% paraformaldehyde phosphate buffer solutionで20 min固定化した。ウェル内をPBSで1回洗浄し、Hoechst33258溶液(5 mg/mL) を2 mL添加し、15 min放置した。PBSで2回洗浄し、さらにPBSを2 mL添加し、蛍光顕微鏡による観察を行った。
４－３．結果・考察
４－３－１． 培養温度による細胞取り込みの効果
　蛍光ポリマーの培養温度による細胞取り込み効果を調べるため、細胞溶液中へID48S10-FL溶液を添加し、pH = 6.8及び7.4で37℃、4 h放置後、フローサイトメトリー解析及び蛍光顕微鏡観察を室温で行った。フローサイトメトリー解析においては、3.2.3.2.2.項におけるBMA-FLにおける結果と同じような挙動を示した (Fig. 3-13)。これらのポリマーはゼータ電位の測定においてともに負電荷を示しており (Fig. 2-16, 2-18) 、正電荷をもつ蛍光ポリマーと比較すると細胞膜付着性が弱い可能性が示唆された 。DMAAmに加えてカチオン性を有するDMAPAAmやアミノ酸等を導入することによって細胞膜付着性が改善されると考えられる。蛍光顕微鏡における観察では、pH = 7.4で取り込み実験したものは細胞内に蛍光ポリマー由来の蛍光が確認されず、pH = 6.8で取り込み実験したものは細胞内での蛍光が確認された。このことから細胞取り込みはpH依存的な挙動を示すことが確認された。
４－３－２．蛍光ポリマーの細胞における局在
　蛍光ポリマーの細胞における局在を確認するため、細胞のライソソームを染めるLysoTracker(R)Red DND-99及び核を染めるHoechst33258を用いて多重染色を行った。培養細胞へ蛍光ポリマーを添加後、pH = 6.8及び7.4で37℃、4h放置し、次いでライソソーム及び核染色を行い、 蛍光顕微鏡で観察を行った (Fig. 3-14)。3.2.3.2.2.項でも述べたように蛍光ポリマー (緑) はライソソーム (赤) における局在が確認された (黄)。細胞内動態を確認するには他の蛍光基を修飾した蛍光ポリマーを用いる必要性があるが、当研究室ではナノ粒子やDDSにおける研究も行っており、細胞内に取り込まれた後に低pH環境である細胞内器官において薬物放出をするナノ粒子やリポソーム表面に修飾することによって低pH環境であるがん細胞付近で崩壊するリポソームなどへの応用も考えられる。
５． LAT1標的ポリマーにおける細胞評価
５－１．試薬及び装置
試薬
RAW 264.7培養細胞株: 理化学研究所
HeLa培養細胞株: 理化学研究所
HEK 293培養細胞株: 理化学研究所
MEM: Life Technologies
Fetal Bovine Serum (FBS): Cell Culture Bioscience (CCB)
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100×, Liquid): Life Technologies
0.05 w/v% Trypsin-0.53 mmol/L EDTA・4Na Solution with Phenol Red: 和光純薬工業株
式会社Dulbecco's phosphate-buffered salines (D-PBS): Life Technologies
RecoveryTMCell Culture Freezing Medium: Life Technologies
PierceTMBCA Assay Kit: Thermo Fisher Scientific Inc.
Sodium Lauryl Sulfate: Nacalai tesque
β-mercaptoethanol: SIGMA-ALDRICH
Glycine: Nacalai tesque
Glycerol: Nacalai tesque
HCl: Nacalai tesque
NaCl: Nacalai tesque
TritonX-100: 関東化学
Tween 20: SIGMA ALDRICH
Bromophenol Blue: 関東化学
Mini-PROTEIN(R)TGX Precast Gels 10% 15mL/well: D.R.C.
SpectraTMMulticolor Broad Range Protein Ladder: Thermo Fisher Scientific Inc.
MeOH: Nacalai tesque
Immobilon-P (PVDF Pore size 0.45mm): MILLIPORE
CHROMATOGRAPHY PAPER Grade: 3MM CHR: GE Healthcare
Extra Thick Blot Paper: BIO-RAD
スキムミルク: 雪印
Anti human L-type amino acid transpoter 1 (LAT1) polyclonal antibody rabbit: 株式会社トランスジェニック
Anti beta-actin antibody rabbit: SIGMA ALDRICH
ECL anti-rabbit IgG, HRP-Linked Whole Antibody: GE Healthcare
ECL Prime Western Blotting Detection Reagent: GE Healthcare
Alexa Fluor(R) 594-labeled donkey anti-rabbit IgG antibodies: Invitrogen
FluoromountTM水性マウンティング媒体: SIGMA-ALDRICH
VECTORSHIELD HardSet Mainting Medium with DAPI: Vector Labolatories
4% Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution: 和光純薬工業株式会社
Albumin, from Human Serum: SIGMA-ALDRICH
L-Leucine, [4,5-3H]:Moravek Biochemicals, Inc.
2-aminobicyclo-(2,2,1)-heptane-2-carboxylic acid (BCH): SIGMA-ALDRICH
NaCl: 和光純薬株式会社
KCl: 和光純薬株式会社
(+)-Glucose: 和光純薬株式会社
CaCl2: 和光純薬株式会社
KH2PO4: 和光純薬株式会社
MgSO4: 和光純薬株式会社
HEPES: 同仁化学研究所
1N NaOH: 和光純薬株式会社
5N HCl: 和光純薬株式会社
Clear-solＩ: Nacalai tesque
装置
Infinite M1000; テカンジャパン株式会社
NEO SHAKER NS-LR
電気泳動装置 BE-280
電源装置 POWER PAC 200
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell
Image Quant LAS 4000
Water bath; TAITEC
ホットプレート: Fast Gene, Dry Bath Incubator
Liquid scintillation analyzer TRL-CARB 317TR/SL: Packard
BIOREVO BZ-9000: 株式会社キーエンス
５－２．実験項
５－２－１．細胞の培養
　RAW 264.7細胞は10% FBS、1%抗菌剤（Penicillin-Streptomycin Glutamine）を添加したMEMを培地として75cm2培養フラスコを用い、37℃、5% CO2濃度で培養した。継代時、細胞はセルスクレーパーで剥離し、75cm2培養フラスコ内で2-3日間固定化した。
　HeLa細胞は10% FBS、1%抗菌剤（Penicillin-Streptomycin Glutamine）、MEM NEAAを添加したMEMを培地として75cm2培養フラスコを用い、37℃、5% CO2濃度で培養した。継代時、細胞はトリプシンで剥離し、75cm2培養フラスコ内で2-3日間培養した。
HEK 293細胞は10% FBS、50 units/mL penicillin及び50 mg/mL streptomycin、MEM NEAAを添加したMEMを培地として75cm2培養フラスコを用い、37℃、5% CO2濃度で培養した。継代時、細胞はトリプシンで剥離し、75cm2培養フラスコ内で3-5日間培養した。
５－２－２．Western Blot Analysis
　RAW 264.7細胞、HeLa細胞及びHEK 293細胞は回収後、Lysis buffer (1M Tris-HCl、5N NaCl、500nM EDTA、20%TritonX-100、complete mini-EDTA-free) で溶解する。超音波破砕をし、氷中に10 minおいた後、16,000×g、4℃、10 minで遠心し、上清を回収した。PierceTM BCA Assay Kitを用いてBCA法でタンパク定量を行い、560 nmのフィルターで測定した。結果をもとに細胞溶解液をLysis bufferで薄め。次いでSDSサンプルbuffer (sodium dodecyl sulfate、2-mercaptoethanol、1M Tris-HCl) を加え98℃で5 min 加熱し、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。タンパク質分離後、PVDF転写膜に転写した。一次抗体として抗ヒトL型アミノ酸トランスポーター (hLAT1) ポリクローナル抗体 (1/500) または抗βアクチン抗体(1/1000) を90min作用させ、TBST buffer (Tris-HCl、Tween20、5N NaCl、H2O) で洗浄した。次いで二次抗体として抗ウサギIgG、HRP-Linked全抗体(1/10000) を60min作用させた。TBST及びTBSで洗浄後、ECL Prime に浸し、Image Quant LAS 4000で観察した。
５－２－３． 免疫蛍光染色
　HeLa細胞はLab-Tek(R)II Chamber SlideTM System (2.5×104cells, 1 mL/well) 上で37℃、5% CO2濃度環境下24 h培養した。血清入り培地を除去し、ウェル内をPBSで一回洗浄し、4% paraformaldehyde phosphate buffer solutionで30 min固定化した。PBSで洗浄後、冷MeOHで-20℃、30 min浸透処理を行った。次いでブロッキングとして1%HAS含有PBS中で30 minインキュベートし、PBSで5 min、3回洗浄した。一次抗体として抗ヒトL型アミノ酸トランスポーター (LAT1) ポリクローナル抗体 (1/100) を4℃、overnightでインキュベートし、PBSで5 min、3回洗浄した。次いで二次抗体としてAlexa Fluor(R) 594修飾抗ウサギIgG抗体 (1/1000) を室温で60minインキュベートし、PBSで5 min、3回洗浄した。スライドガラスにVECTORSHIELD HardSet Mainting Medium with DAPIを滴下し、蛍光顕微鏡で観察した。
５－２－４．L- [3H] leucine細胞内取り込みの阻害効果
　HeLa細胞はマルチウェルプレート(2.5×104 cells、1 mL/well) 上で37℃、5%CO2濃度環境下24 h培養した。37℃に設定したホットプレート上にプレートを乗せ、血清入り培地を除去し、温buffer (125mM NaCl, 4.8mM KCl, 5.6mM (+)-Glucose, 1.2mM CaCl2・2H2O, 1.2mM KH2PO4, 1.2mM MgSO4, 25mM HEPES) でウェル内を洗浄し、10 min プレインキュベートした。Bufferを吸引しsampleを加え、取り込み時間終了後、ウェルからsampleを除去し、冷bufferでウェル内を洗浄した。1% Triton X/1N NaOHを加え、冷蔵庫で一晩放置した。翌日、1N HClを加えた後、Clear-sol Ｉの入ったvialに加え、液体シンチレーションカウンターで測定した。Sample; L-[3H] leucine: 2, 5, 10 min, L-[3H] leucine + 2mM BCH: 10 min, L-[3H] leucine: 2, 10 min.
５－２－５．蛍光顕微鏡における観察
　HeLa細胞はLab-Tek(R)II Chamber SlideTM System 4well (2.5×104 cells, 1 mL/well) 上で37℃、5% CO2濃度環境下24 h培養した。PBS中に溶解し調製した蛍光ポリマー溶液 (2 mg/mL) をガラスボトムディッシュの培養細胞に対し200 mL添加し, 細胞溶液中における蛍光ポリマーの最終濃度を200 mg/mLとした。37℃で60 min 放置後、PBSで3回洗浄し、4% paraformaldehyde phosphate buffer solutionで20 min固定化した。ウェル内をPBSで1回洗浄し、VECTORSHIELD HardSet Mainting Medium with DAPIを用いて封入し、蛍光顕
微鏡による観察を行った。
５－３． 結果・考察
５－３－１．Western Blot Analysis
　RAW 264.7細胞、HeLa細胞及びHEK 293細胞を用いてWestern Blot Analysisを行い、ヒトL型アミノ酸トランスポーター (hLAT1) の発現を調べた。HeLa細胞においては抗hLAT1 ポリクローナル抗体のバンドが38-kDaに観察された。125-kDaに観察されたバンドは2-mercaptoethanolによるジスルフィド結合の還元不足により検出されたLAT1と4F2hcの二量体と考えられる。また、RAW 264.7細胞、HEK 293細胞においてはバンドが観察されなかった。HEK 293細胞についてはHeLa細胞よりもhLAT1の発現量が少ないためと考えられるが、RAW 264.7細胞についてはマウス由来の細胞であるため、マウスL型アミノ酸トランスポーター (mLat1) が発現していたとしても今回用いた抗体によって認識されなかった可能性が考えられる。
５－３－２．免疫蛍光染色
　HeLa細胞のLAT1を免疫染色し、核を染めるDAPIを用いて多重染色を行った。蛍光顕微鏡で観察を行ったところ、LAT1は細胞膜上に観察された。さらに、抗4F2hc抗体を用いて発現部位を観察することによって、細胞表面アミノ酸トランスポーターとしてLAT1と4F2hcが二量体を形成し、機能していることが確認できる。
５－３－３．LAT1標的ポリマーのL- [3H] leucine細胞内取り込み阻害効果
　HeLa細胞においてLAT1経由で取り込まれるL- [3H]-leucine量に対するポリマーの作用について検討するために、L- [3H] -leucine細胞内取り込み量をLAT1阻害剤として知られるBCH及びLAT1標的ポリマーであるL-Phe5%の存在下において測定した。10 min における取り込み結果より、L-[3H]-leucine細胞内取り込み量はL-Phe5%によって有意に阻害されることが確認され、作製したL-Phe5%はLAT1を認識する可能性が示唆された今後、LAT1標的設計していないポリマーを用いて細胞内取り込み量を測定し比較することによって、よりその効果が確かなものとなると考えられる。
５－３－４．蛍光顕微鏡における観察
　蛍光ポリマーの細胞における作用部位を確認するため、HeLa細胞へ蛍光ポリマーを添加後、37℃で60 min 放置し、核を染めるDAPIを用いて多重染色を行った. 蛍光顕微鏡において観察したところ、L-Phe5%-FL (緑) は細胞表面において蛍光が確認された。しかし、3.4.3.2.項の結果と比較するとその局在が異なるように見えるため、洗い等の実験操作について条件検討を行う必要がある。LAT1に対する物質の結合力は、LAT1結合部位と物質のα-アミノ基の正電荷及びα-カルボキシル基の負電荷との相互作用に依存する。しかし、阻害定数 (Ki) が低値であっても側鎖との疎水性相互作用が十分に強い時には高い親和性
を示すことが知られている。今回作製したL-Phe5%-FLはN-acryloyl-L-phenylalanine-OMeを導入し細胞内に取り込まれたポリマーとは異なり、α-カルボキシル基が存在することによってLAT1選択性が高いと考えられる。今後、α-アミノ基が存在するポリマーやその他の認識部位も持つようなポリマーなど分子設計を検討し、よりLAT1認識能の強いポリマーを作製し比較する必要もある。また、Brasilicardin Aの報告にもあるように、本ポリマーの側鎖の分子量から検討してもLAT1によって細胞内に取り込まれるのではなく、阻害効果を示すと考えられる。本ポリマーは、その分子設計によってLAT1との相互作用を調節できる可能性が示唆される。
結語
・三元ポリマーの開発
　作製した三元ポリマーはLCSTを病態細胞内温度の37℃付近に制御した。
　RAW264.7細胞およびHeLa細胞、共にLCSTを境に温度制御による細胞取り込みが見られた。
　アミノ酸誘導体を用いることでも温度による細胞取り込み制御が可能であり、より生体にとって分子認識能の高い新規温度応答性蛍光ポリマーの設計に繋がる結果となった。
・pH応答性蛍光ポリマーの開発
　がん細胞と正常細胞を識別するために最適なpHを有していた。
　HeLa細胞においてpH制御による細胞取り込みが見られた。
・がん細胞標的化温度応答性蛍光ポリマーの開発
　作製したポリマーは三元ポリマーとは異なり、LCST以下でも細胞に認識された。
　LCST以下において、両細胞共に、三元ポリマーでのアミノ酸誘導体ユニットであるN-acryloyl-L-Phenylalanine-OMeは認識しなかったが、新たに作製したポリマーのN-acryloyl-L-Phenylalanineユニットは認識されたことからアミノ酸トランスポーターの基質選択性が高まった。
　市販の細胞培養器材に癌細胞ＮＣＩ－Ｈ４６０を培養した（細胞播種数２×１０４個、３７℃、５％ＣＯ２）。３日後、培養基材上の癌細胞ＮＣＩ－Ｈ４６０がコンフルエントになったことを確認した後、通常のトリプシン処理することで個々の癌細胞を得た。癌細胞数５×１０５個を１０頭のヌードマウスの背部皮下に移植した。生体内で癌組織を増殖させた後、その担癌動物から患部から癌組織を切除し、（１）癌組織そのものへ直接、本発明のＬ－Ｐｈｅ５％－ＦＬを作用させること、（２）癌組織から常法によって癌細胞を得て、その後、培養（細胞播種数２×１０４個、３７℃、５％ＣＯ２）することで得た癌細胞へ本発明のＬ－Ｐｈｅ５％－ＦＬを作用させることを行った。その結果、いずれの方法においても本発明の蛍光プローブが細胞に取り込まれ、蛍光顕微鏡下で観察できることが分かった。
　細胞培養器材に温度応答性ポリマーであるポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）を２．０μｇ／ｃｍ２被覆し、癌細胞ＮＣＩ－Ｈ４６０を培養した（細胞播種数２×１０４個、３７℃、５％ＣＯ２）。３日後、培養基材上の癌細胞ＮＣＩ－Ｈ４６０がコンフルエントになったことを確認した後、アクリル板にフィブリンゲルを塗布した培養細胞移動治具を培養細胞シート上に静置させ培養癌細胞を接着して、細胞培養基材を２０℃下で６０分間冷却した。冷却後、剥離させた細胞シートはフィブリンゲルと共に冶具から採取し、細胞シートの付着したゲル（７ｍｍ×１７ｍｍ×２ｍｍ、細胞数５×１０５個）を１０頭のヌードマウスの背部皮下に移植した。生体内で癌組織を増殖させた後、その担癌動物から患部から癌組織を切除し、（１）癌組織そのものへ直接、本発明のＬ－Ｐｈｅ５％－ＦＬを作用させること、（２）癌組織から常法によって癌細胞を得て、その後、培養（細胞播種数２×１０４個、３７℃、５％ＣＯ２）することで得た癌細胞へ本発明のＬ－Ｐｈｅ５％－ＦＬを作用させることを行った。その結果、いずれの方法においても本発明の蛍光プローブが細胞に取り込まれ、蛍光顕微鏡下で観察できることが分かった。
　本発明によれば、病態細胞特異性を持つ蛍光プローブを提供することが可能であり、本発明により作製したポリマーは温度やｐＨによる細胞取り込みの制御が可能である。したがって、本発明は細胞環境の物理化学的変化を追跡する蛍光イメージング技術等しての応用が期待され、医学、生物学分野など広範囲の技術分野において産業上有用な発明である。

Claims (21)

  1. 　水との親和性を有する、或いは水との親和性が変化するポリマーであって、当該ポリマーを構成するモノマーとしてアミノ酸誘導体モノマーを含み、蛍光物質が結合されてなる、ポリマー。
  2. 　ポリマーを構成するモノマーとして、Ｎ－イソプロピルアクリルアミド、ブチルメタクリレート、Ｎ－アクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノメチルアクリルアミドから選択される少なくとも１種を含むものである、請求項１記載のポリマー。
  3. 　水との親和性を有する、或いは水との親和性が変化するポリマーもしくはコポリマーであって、側鎖の一部が下式（Ａ）及び／又は下式（Ｂ）なる構造であり、蛍光物質が結合されてなる、ポリマー。
    式（Ａ）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （式中、Ｒ1は、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     を表し、
    Ｒ２は、　Ｈ、ＣＨ３、またはＣＨ２ＣＨ３を表す）
    式（Ｂ）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     （式中、Ｒ３は、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     を表し、
    Ｒ２は、Ｈ、ＣＨ３、またはＣＨ２ＣＨ３を表す）
  4. 　水との親和性を有するポリマーを構成するものが、少なくともポリエチレングリコール、ポリ－Ｎ－アクリルアミド、ポリ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアクリルアミドを含むものである、請求項３記載のポリマー。
  5. 　水との親和性が変化するポリマーを構成するものが、温度及び／又はｐＨの変化により水系溶媒に対する親和性が変化するものである、請求項１～４のいずれか１項記載のポリマー。
  6. 　アミノ酸誘導体モノマーが光学異性体を有するアミノ酸誘導体である、請求項１～５のいずれか１項記載のポリマー。
  7. 　少なくともｐＨの変化により水に対する親和性が変化するポリマーであって、ポリマーの構成モノマーとしてイオン性基を有する化合物を含む、請求項１～６のいずれか１項記載のポリマー。
  8. 　蛍光物質が親水性環境下においてより強い蛍光を発する物質である、請求項１～７のいずれか１項記載のポリマー。
  9. 　蛍光物質がフルオレセイン系蛍光物質又はクマリン系蛍光物質である、請求項１～８のいずれか１項記載のポリマー。
  10. 　蛍光物質がフルオレセイン系蛍光物質である、請求項１～９のいずれか１項記載のポリマー。
  11. 　少なくともｐＨの変化により水に対する親和性が変化するポリマーであって、特定のｐＨ環境下でより強い蛍光を発する蛍光物質が結合されてなる、請求項１～９のいずれか１項記載のポリマー。
  12. 　温度及び／又はｐＨの変化により水に対する親和性が変化するポリマーであって、蛍光物質が結合されてなるポリマーを、水中で蛍光発生成分を有する物質の近傍に存在させて、蛍光発生成分とポリマー中の蛍光物質との間で蛍光共鳴エネルギー移動を生じさせ、その結果として発生した蛍光の強度を測定する工程を含む、蛍光発生成分を有する物質又はその周囲環境の変化の測定方法。
  13. 　温度及び／又はｐＨの変化により水に対する親和性が変化するポリマーが、温度の変化により水に対する親和性が変化するポリマーである、請求項１２に記載の測定方法。
  14. 　蛍光発生成分を有する物質が、蛋白質、オリゴペプチド又はポリペプチドである、請求項１２及び１３のいずれか１項記載の測定方法。
  15. 　温度及び／又はｐＨの変化により水に対する親和性が変化するポリマーであって、蛍光物質が結合されてなるポリマーが、請求項１～１１のいずれか１項記載のポリマーである、請求項１２～１４のいずれか１項記載の測定方法。
  16. 　請求項１～１１のいずれか１項記載のポリマーであって、少なくとも温度の変化により水に対する親和性が変化するポリマーに、水で励起エネルギーを与え、蛍光の発光の程度によって水の温度を測定する工程を含む、水の温度の測定方法。
  17. 　請求項１～１１のいずれか１項記載のポリマーであって、少なくともｐＨの変化により水に対する親和性が変化するポリマーに、水中で励起エネルギーを与え、蛍光の発光の程度によって水のｐＨを測定する工程を含む、ｐＨの測定方法。
  18. 　測定対象を含有するか又は含有することが予想される水（ｘ）中において、及び、測定対象を含有しない水（ｙ）中で、請求項４に記載のポリマーに由来する蛍光を温度及び／又はｐＨを変化させながら測定し、水（ｘ）での測定結果を水（ｙ）での測定結果を比較することにより、水（ｘ）中における測定対象の三次元高次構造、又は、水（ｘ）中に測定対象が存在するか否かを判定する、判定方法。
  19. 　請求項１～１１のいずれか１項記載のポリマーであって、その少なくとも片末端には蛍光物質が結合されていないポリマーと、蛋白質、リン脂質、低分子生理活性及び担体からなる群から選択されるいずれかが結合されてなる、蛍光プローブ。
  20. 　請求項１～９のいずれか１項記載のポリマーであって、細胞のアミノ酸トランスポーターと特異的に結合する、蛍光プローブ。
  21. 　アミノ酸トランスポーターがＬＡＴ１である、請求項２０記載の蛍光プローブ。
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