CN111849464B - 一种聚合物荧光探针及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种聚合物基荧光探针，包括两亲性嵌段共聚物与接枝在两亲性嵌段共聚物上的巯基响应性基团和/或二氯荧光素基团。与现有技术相比，本发明以萘酰亚胺类作为巯基响应的荧光分子，其具有较大的刚性共平面结构与共轭体系，该结构中存在光诱导电子转移机制，当萘酰亚胺与巯基发生迈克尔加成后，因PET受阻而产生荧光；以硫醚酯化的二氯荧光素分子作为酸性响应荧光分子，其可因H+水解其结构中的酯键，使其具有共轭结构，从而产生荧光；并且本发明将上述荧光分子接枝在两亲性嵌段共聚物上作为聚合物基荧光探针具有高灵敏性的巯基和/或酸性的检测功能，从而实现胶束进入生物体内路径的荧光跟踪。

Description

一种聚合物荧光探针及其应用
技术领域
本发明属于荧光探针技术领域，尤其涉及一种聚合物基荧光探针及其应用。
背景技术
巯基化合物是生物体中间一种十分重要的化合物，其重要的功能基团为巯基。生命体中的大量的生物化学反应都需要巯基化合物的参加，而在生物体内主要的巯基化合物为谷胱甘肽，半胱氨酸以及同型半胱氨酸等。其中，谷胱甘肽在生物的细胞内分布最广且浓度相较于其他巯基化合物较高，它对于生物体中的氧化还原生化反应起着重要的作用，可以维持蛋白质中的半胱氨酸处于非氧化状态，确保生物体内的蛋白质不被氧化，并且维持蛋白质在生物体内有正常的生物活性，因此谷胱甘肽已成为表征细胞抗氧化能力的一个重要指标。因此，对于检测细胞内的巯基化合物的浓度以及巯基化合物的分布具有重要的医学意义。
目前，用于测量巯基化合物浓度较为普遍使用的试剂为Ellman试剂，但是这种试剂仅可以在体外有用。市售的巯基化合物的荧光探针包括马来酰亚胺，碘乙酰胺和与溴甲烷共轭的双联吡啶，它们均已用于标记细胞蛋白提取物中的巯基化合物。其他的用于检测巯基化合物的方法主要有：拉曼光谱法、HPLC滴定法、荧光法等；其中荧光法具有高灵敏度以及高选择性的特点，更重要的是使用荧光法检测巯基化合物的方法是能够实现对活体甚至单个细胞的实时可视化示踪。
细胞的pH值也是细胞生物学中的重要因素，并在人体生化反应中起着关键作用。在正常的生理条件下，pH值保持在非常狭窄的范围内，细胞器中的pH值异常会导致细胞功能障碍，并影响人体生理，从而导致严重的疾病。此外，溶酶体和与溶酶体有关的细胞器在细胞质中提供了另一个酸性微环境(pH4.5～5.5)，其中存在大量的酶和分泌蛋白并发挥多种功能。因此，监测活细胞内部的pH值变化对于探索细胞功能以及了解生理和病理过程很重要。检测细胞内pH的方法有很多，其中荧光发具有高选择性和高灵敏度等特性，具有较好的检测细胞内pH的能力。
但小分子荧光探针仍然存在很多问题，比如小分子荧光探针大多不溶于水，直接与高分子复合在使用中易发生脱落，难以实现生物体内的长期追踪以及靶向追踪，因此在生物医药领域的应用受到了大大的限制。但是将小分子荧光探针与大分子组装体共价结合后，在生物体内不仅具有稳定性，还可以实现在生物内的长循环，并且还可以通过控制大分子组装体的结构以及纳米粒子的尺寸来实现小分子荧光探针的靶向作用，因此将荧光物质与高分子共价键合越来越受到关注生物医药界关注。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种具有较高检测灵敏性的聚合物基荧光探针、其制备方法及应用。
本发明提供了一种聚合物基荧光探针，包括两亲性嵌段共聚物与接枝在两亲性嵌段共聚物上的巯基响应性基团和/或二氯荧光素基团；
所述巯基响应性基团的结构为：
Figure BDA0002631231960000021
其中，R为C1～C10的烷基；
所述二氯荧光素基团的结构为：
Figure BDA0002631231960000022
其中，R1与R2各自独立地为C1～C5的烷基。
优选的，所述巯基响应性基团的结构为：
Figure BDA0002631231960000031
优选的，所述二氯荧光素基团的结构为：
Figure BDA0002631231960000032
优选的，所述两亲性嵌段共聚物包括亲水嵌段与疏水嵌段；所述亲水嵌段选自N-烷基取代的丙烯酰胺单体单元、N-烷基取代的甲基丙烯酰胺单体单元、氨烷基丙烯酰胺单体单元与氨烷基甲基丙烯酰胺单体单元中的一种或多种；所述疏水嵌段选自丙烯酸羟烷基酯单体单元、甲基丙烯酸羟烷基酯单体单元、烷氧基丙烯酸酯单体单元与烷氧基甲基丙烯酸酯单体单元中的一种或多种。
优选的，所述烷氧基丙烯酸酯单体单元选自丙烯酸甲氧基乙酯单体单元；所述烷氧基甲基丙烯酸酯单体单元选自甲基丙烯酸甲氧基乙酯单体单元；所述丙烯酸羟烷基酯单体单元选自丙烯酸羟乙酯单体单元；所述甲基丙烯酸羟烷基酯单体单元选自甲基丙烯酸羟乙酯单体单元；所述N-烷基取代的丙烯酰胺单体单元选自N，N-二甲基丙烯酰胺单体单元；所述N-烷基取代的甲基丙烯酰胺单体单元选自N，N-二甲基甲基丙烯酰胺单体单元；所述氨烷基丙烯酰胺单体单元选自氨乙基丙烯酰胺单体单元；所述氨烷基甲基丙烯酰胺单体单元选自氨乙基甲基丙烯酰胺单体单元。
优选的，所述聚合物基荧光探针包括共价接枝嵌段；所述共价接枝嵌段选自下面的一种或多种：
Figure BDA0002631231960000041
其中，R为C1～C10的烷基；R1与R2各自独立地为C1～C5的烷基；R′～R3′各自独立地为氢或甲基；a、b、c与d各自独立地为1～5的整数。
优选的，所述R为C2～C6的烷基；R1与R2各自独立地为C1～C3的烷基；R′～R3′各自独立地为氢或甲基；a、b、c与d各自独立地为2～3的整数。
优选的，所述巯基响应性基团与两亲性嵌段共聚物的疏水嵌段共价连接；所述二氯荧光素基团与两亲性嵌段共聚物的亲水嵌段共价连接；所述巯基响应性基团与二氯荧光素基团的摩尔比为(10～100)：1。
优选的，所述聚合物基荧光探针为两亲性嵌段共聚物与接枝在两亲性嵌段共聚物上的巯基响应性基团和/或二氯荧光素基团自组装形成的纳米组装体。
本发明还提供了上述聚合物基荧光探针在检测酸性环境和/或还原环境中的应用。
本发明提供了一种聚合物基荧光探针，包括两亲性嵌段共聚物与接枝在两亲性嵌段共聚物上的巯基响应性基团和/或二氯荧光素基团。与现有技术相比，本发明以萘酰亚胺类作为巯基响应的荧光分子，其具有较大的刚性共平面结构与共轭体系，该结构中存在光诱导电子转移机制，当萘酰亚胺与巯基发生迈克尔加成后，因PET受阻而产生荧光；以硫醚酯化的二氯荧光素分子作为酸性响应荧光分子，其可因H+水解其结构中的酯键，使其具有共轭结构，从而产生荧光；并且本发明将上述荧光分子接枝在两亲性嵌段共聚物上作为聚合物基荧光探针具有高灵敏性的巯基和/或酸性的检测功能，从而实现胶束进入生物体内路径的荧光跟踪。
附图说明
图1为本发明制备例2制备的巯基化合物响应的荧光探针4-马来酰氨基-1,8-萘酰亚胺NAM-COOH的核磁氢谱图；
图2为本发明制备例6制备的两亲性共聚物PMEMA-b-P(DMA-co-HEMA)中亲水嵌段PMEMA的核磁氢谱图；
图3为本发明制备例6制备的两亲性共聚物PMEMA-b-P(DMA-co-HEMA)的核磁氢谱图；
图4为本发明制备例6中大分子链转移剂PMEMA25及两亲性嵌段共聚物PMEMA-b-P(DMA-co-HEMA)的凝胶渗透色谱(GPC)表征图(a)与制备例11中P(MEMA-co-HEMA)及两亲性嵌段共聚物P(MEMA-co-HEMA)-b-P(DMA-co-AEMAboc)的凝胶渗透色谱(GPC)表征图(b)；
图5为本发明制备例4制备的被巯基化合物响应的NAM单修饰的P(DMA-co-NAM)在405nm的激发波长下半胱氨酸为10mM且pH＝7.4的PBbuffer溶液中的荧光光谱跟踪图；
图6为本发明制备例5制备的被酸性响应的DSF单修饰的P(DMA-co-DSF)在490nm的激发波长下pH＝5.0的PB缓冲液中的荧光光谱跟踪图；
图7为本发明制备例8制备的PMEMA-b-P(DMA-co-NAM)纳米组装体和制备13制备的P(DMA-co-AEMAboc)-b-P(MEMA-co-NAM)纳米组装体分别在405nm的激发波长下半胱氨酸为10mM且pH＝6.0和pH＝7.4的PB缓冲液中的荧光光谱跟踪图；
图8为本发明制备例8制备的PMEMA-b-P(DMA-co-NAM)纳米组装体在405nm的激发波长下半胱氨酸为10mM且pH＝7.4和无半胱氨酸存在且pH＝5.0的PB缓冲液中的荧光光谱跟踪图；
图9为本发明制备例13制备的P(DMA-co-AEMAboc)-b-P(MEMA-co-NAM)纳米组装体在405nm的激发波长下，谷胱甘肽为10mM且pH＝6.0和pH＝7.4以及半胱氨酸为10mM且pH＝6.0和pH＝7.4的PB缓冲液中的荧光光谱跟踪图；
图10为本发明制备例13制备的P(DMA-co-AEMAboc)-b-P(MEMA-co-NAM)纳米组装体在405nm的激发波长下，谷胱甘肽为10mM和3mM且pH＝7.4、半胱氨酸为200μM且pH＝7.4以及谷胱甘肽为10mM且pH＝6.0时的荧光光谱跟踪；
图11为本发明制备例10制备的PMEMA-b-P(DMA-co-DSF)纳米组装体在405nm的激发波长下半胱氨酸为100μM且pH＝6.0和pH＝7.4的PB缓冲液中的荧光光谱跟踪图；
图12为本发明制备例15制备的P(DMA-co-DSF)-b-P(MEMA-co-NAM)纳米组装体在405nm激发波长下pH＝5.0无巯基化合物以及pH＝7.4且谷胱甘肽为10mM时的荧光光谱跟踪图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供了一种聚合物基荧光探针，包括两亲性嵌段共聚物与接枝在两亲性嵌段共聚物上的巯基响应性基团和/或二氯荧光素基团；
所述巯基响应性基团的结构为：
Figure BDA0002631231960000061
其中，R为C1～C10的烷基，优选为C2～C8的烷基，更优选为C3～C6的烷基，再优选为C4～C5的烷基，最优选为丁基，即所述巯基响应性基团的结构最优选为：
Figure BDA0002631231960000071
所述二氯荧光素基团的结构为：
Figure BDA0002631231960000072
其中，R1与R2各自独立地为C1～C5的烷基，优选为C1～C4的烷基，更优选为C2～C3的烷基，再优选为丙基，即所述二氯荧光素基团的结构最优选为：
Figure BDA0002631231960000073
在本发明中，所述两亲性嵌段共聚物包括亲水嵌段与疏水嵌段；所述亲水嵌段与疏水嵌段的摩尔比优选为1：(0.01～2)，更优选为1：(0.03～2)，再优选为1：(0.04～2)；所述亲水嵌段优选为丙烯酰胺类单体单元，更优选为N-烷基取代的丙烯酰胺单体单元、N-烷基取代的甲基丙烯酰胺单体单元、氨烷基丙烯酰胺单体单元与氨烷基甲基丙烯酰胺单体单元中的一种或多种；所述N-烷基取代的丙烯酰胺单体单元、N-烷基取代的甲基丙烯酰胺单体单元、氨烷基丙烯酰胺单体单元与氨烷基甲基丙烯酰胺单体单元中烷基的碳原子数各自独立地优选为1～10，更优选为1～8，再优选为2～6，再优选为2～4，最优选为2；在本发明中，所述亲水嵌段最优选为N，N-二甲基丙烯酰胺单体单元、N，N-二甲基甲基丙烯酰胺单体单元、氨乙基丙烯酰胺单体单元与氨乙基甲基丙烯酰胺单体单元中的一种或多种；所述疏水嵌段优选为丙烯酸酯类单体单元，更优选为丙烯酸羟烷基酯单体单元、甲基丙烯酸羟烷基酯单体单元、烷氧基丙烯酸酯单体单元与烷氧基甲基丙烯酸酯单体单元中的一种或多种；所述丙烯酸羟烷基酯单体单元、甲基丙烯酸羟烷基酯单体单元、烷氧基丙烯酸酯单体单元与烷氧基甲基丙烯酸酯单体单元中烷基的碳原子数各自独立地优选为1～10，更优选为1～8，再优选为1～6，再优选为1～5，最优选为1～2；在本发明中，所述疏水嵌段最优选为丙烯酸甲氧基乙酯单体单元、甲基丙烯酸甲氧基乙酯单体单元、丙烯酸羟乙酯单体单元与甲基丙烯酸羟乙酯单体单元中的一种或多种。
在本发明中，所述巯基响应性基团和/或二氯荧光素基团共价接枝在两亲性嵌段共聚物上形成共价接枝嵌段，所述巯基响应性基团和/或二氯荧光素基团可共价接枝于亲水嵌段上，也可共价接枝于疏水嵌段上，即本发明提供的聚合物基荧光探针包括共价接枝嵌段；在本发明中所述共价接枝嵌段优选为下面中的一种或多种：
Figure BDA0002631231960000081
其中，R为C1～C10的烷基；R1与R2各自独立地为C1～C5的烷基；R′～R3′各自独立地优选为氢或甲基；a、b、c与d各自独立地优选为1～5的整数，更优选为2～3的整数，再优选为2。
在本发明中，所述聚合物基荧光探针优选同时包括巯基响应性基团与二氯荧光素基团；所述巯基响应性基团与二氯荧光素基团的摩尔比优选为(10～100)：1，更优选为(20～80)：1，再优选为(30～70)：1，再优选为(40～60)：1，最优选为50：1；当同时包括巯基响应性基团与二氯荧光素基团时，所述巯基响应性基团优选与两亲性嵌段共聚物的疏水嵌段共价连接；所述二氯荧光素基团优选与两亲性嵌段共聚物的亲水嵌段共价连接；在本发明中，最优选地，所述聚合物基荧光探针包括下面两种共价接枝嵌段：
Figure BDA0002631231960000091
本发明提供的聚合物基荧光探针同时包括巯基响应性基团与二氯荧光素基团，两种荧光基团的距离不超过10nm，因此该体系还存在荧光共振能量转移(FRET)效应；在经酸性水解及加入巯基化合物进行处理后，由于两种荧光基元之间的荧光共振能量转移(FRET)效应，即使是在中性或弱碱性条件下用单一波长的激发光照射，也可同时观测到NAM和DSF的荧光发射。因此利用此双重刺激响应性荧光探针可以跟踪纳米载体进入生物体细胞后在胞内不同细胞器中的输运过程。
按照本发明，所述聚合物基荧光探针优选为两亲性嵌段共聚物与接枝在两亲性嵌段共聚物上的巯基响应性基团和/或二氯荧光素基团自组装形成的纳米组装体，从而实现胶束进入生物体内路径的荧光跟踪。
本发明以萘酰亚胺类作为巯基响应的荧光分子，其具有较大的刚性共平面结构与共轭体系，该结构中存在光诱导电子转移机制，当萘酰亚胺与巯基发生迈克尔加成后，因PET受阻而产生荧光；以硫醚酯化的二氯荧光素分子作为酸性响应荧光分子，其可因H+水解其结构中的酯键，使其具有共轭结构，从而产生荧光；并且本发明将上述荧光分子接枝在两亲性嵌段共聚物上作为聚合物基荧光探针具有高灵敏性的巯基和/或酸性的检测功能，从而实现胶束进入生物体内路径的荧光跟踪。
本发明还提供了上述聚合物基荧光探针的制备方法，包括：将疏水单体与亲水单体进行共聚反应，得到两亲性嵌段共聚物；将所述两亲性嵌段共聚物与式(I)所示的巯基响应性单体和/或式(II)所示的二氯荧光素单体进行反应，得到聚合物基荧光探针；
Figure BDA0002631231960000101
其中，R为C1～C10的烷基；R1与R2各自独立地为C1～C5的烷基；所述R、R1与R2均同上所述，在此不再赘述；
所述疏水单体优选为烷氧基丙烯酸酯、烷氧基甲基丙烯酸酯、丙烯酸羟烷基酯与甲基丙烯酸羟烷基酯中的一种或多种；所述烷氧基丙烯酸酯、烷氧基甲基丙烯酸酯、丙烯酸羟烷基酯与甲基丙烯酸羟烷基酯中烷基的碳原子数各自独立地优选为1～10，更优选为1～8，再优选为1～6，再优选为1～5，最优选为1～2；在本发明中，所述疏水单体最优选为丙烯酸甲氧基乙酯、甲基丙烯酸甲氧基乙酯、丙烯酸羟乙酯与甲基丙烯酸羟乙酯中的一种或多种；所述亲水单体优选为N-烷基取代的丙烯酰胺、N-烷基取代的甲基丙烯酰胺、氨烷基丙烯酰胺与氨烷基甲基丙烯酰胺中的一种或多种；所述N-烷基取代的丙烯酰胺、N-烷基取代的甲基丙烯酰胺、氨烷基丙烯酰胺与氨烷基甲基丙烯酰胺中烷基的碳原子数各自独立地优选为1～10，更优选为1～8，再优选为2～6，再优选为2～4，最优选为2；在本发明中，所述亲水单体最优选为N，N-二甲基丙烯酰胺、N，N-二甲基甲基丙烯酰胺、氨乙基甲基丙烯酰胺与氨乙基丙烯酰胺中的一种或多种；所述疏水单体与亲水单体的摩尔比优选为(0.5～25)：1；所述共聚反应优选在引发剂存在的条件下进行；所述引发剂优选为偶氮类引发剂，更优选为偶氮二异丁腈、偶氮二异庚腈、偶氮二异戊腈、偶氮二环己基甲腈与偶氮二异丁酸二甲酯中的一种或多种；所述引发剂的摩尔数优选为单体总摩尔数的0.1％～1％，更优选为0.1％～0.5％；所述共聚反应优选在链转移剂存在的条件下进行；所述链转移剂优选为三硫酯或含有三硫酯的聚合物；所述链转移剂的摩尔数优选为单体总摩尔数的1％～5％，更优选为2％～3％；所述共聚反应优选在有机溶剂中进行；所述有机溶剂优选为二氧六环；所述共聚反应优选在真空条件下进行；所述共聚反应的温度优选为60℃～80℃，更优选为70℃；所述共聚反应的时间优选为8～20h，更优选为10～16h，再优选为12h；共聚反应结束后，优选加入四氢呋喃稀释体系后，在冰的不良溶剂中沉淀，离心后，得到两亲性嵌段共聚物；所述不良溶剂优选为乙醚。
将所述两亲性嵌段共聚物与式(I)所示的巯基响应性单体和/或式(II)所示的二氯荧光素单体进行反应，得到聚合物基荧光探针；所述反应优选在有机溶剂中进行；所述有机溶剂优选为二氯甲烷；所述反应优选在脱水剂存在的条件下进行；所述脱水剂优选为二环己基碳二亚胺(DCC)；所述反应优选在室温条件下进行；所述反应的时间优选为15～30h，更优选为20～30h，再优选为24h；反应结束后优选用冰乙醚沉淀，离心，真空干燥后，得到聚合物基荧光探针。
或者将第一疏水单体与第一亲水单体进行共聚反应，得到中间嵌段共聚物；将所述中间嵌段共聚物与第二疏水单体及活性基团被保护的第二亲水单体进行共聚，得到两亲性嵌段共聚物；将所述两亲性嵌段共聚物与式(I)所示的巯基响应性单体反应，得到接枝巯基响应基团的共聚物；将所述接枝巯基响应基团的共聚物脱保护后，与式(II)所示的二氯荧光素单体进行反应，得到聚合物基荧光探针。
Figure BDA0002631231960000111
其中，R为C1～C10的烷基；R1与R2各自独立地为C1～C5的烷基；所述R、R1与R2均同上所述，在此不再赘述；所述共聚反应及与响应性单体的反应均同上所述，在此不再赘述；所述式(I)所示的巯基响应性单体与式(II)所示的二氯荧光素单体的摩尔比优选为(10～100)：1，更优选为(20～80)：1，再优选为(30～70)：1，再优选为(40～60)：1，最优选为50：1。
按照本发明，所述聚合物基荧光探针优选通过自组装得到纳米组装体；所述自组装的方法优选为将聚合物基荧光探针溶于有机溶剂中，然后慢加水进行自组装；所述慢加水的速度优选为5～15mL/h，更优选为8～12mL/h，再优选为9mL/h。聚合物基荧光探针中的两亲性嵌段共聚物在水体系中组装后可以形成疏水的内核以及亲水的外壳；其中疏水性的胶束内核可以作为药物分子或者探针分子的容器，并且将小分子药物或者小分子探针置于胶束内核可以降低其生物毒副作用，提高其在生物体内的稳定性，因此将两亲性聚合物胶束作为探针载体表现出比其他纳米载体更大的应用前景。
本发明还提供了上述聚合物基荧光探针在检测酸性环境和/或还原环境中的应用。
本发明提供的嵌段共聚物侧基中，具有巯基化合物响应性的4-马来酰氨基-1,8-萘酰亚胺荧光基元(NAM)有着较大的刚性共平面结构的共轭体系，该结构中存在光诱导电子转移机制(PET)，因此无荧光发射性质；而当NAM中的马来酰氨基与巯基(-SH)发生迈克尔加成后，由于PET受阻即产生荧光。此外在嵌段共聚物侧基中引入乙硫基乙酸酯化的二氯荧光素分子(DSF)基元，当处于酸性环境下，由于酯键的水解，暴露出与苯环相连的两个羟基，同时使DSF由非共轭的闭环内酯结构转变为共轭的开环结构，从而显示出荧光发射性质。基于上述嵌段共聚物组装体构筑的纳米探针可以快速地对细胞内的还原性环境和酸性环境进行响应性检测。进一步地，如果将NAM和DSF荧光基元同时分别引入到两亲性嵌段共聚物的疏水和亲水嵌段侧基中，再由嵌段共聚物自组装形成胶束结构的纳米组装体。在经酸性水解及加入巯基化合物进行处理后，由于两种荧光基元之间的荧光共振能量转移(FRET)效应，即使是在中性或弱碱性条件下用单一波长的激发光照射，也可同时观测到NAM和DSF的荧光发射。因此利用此双重刺激响应性荧光探针可以跟踪纳米载体进入生物体细胞后在胞内不同细胞器中的输运过程。
为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种聚合物基荧光探针及其应用进行详细描述。
以下实施例中所用的试剂均为市售。
制备例1：以(乙基硫代)乙酸保护的二氯荧光素分子(DSF-COOH)的制备方法
Figure BDA0002631231960000121
称取巯基乙酸(5g，54.4mmol)，然后将溴乙烷(6.45g，59.8mmol)分批添加到氢氧化钠(3mol/L)的甲醇溶液溶液(100mL)中，回流混合物8h，冷却后旋干，得到乙硫基乙酸(5.9g,产率:90％)；再于搅拌下于0℃将草酰氯(6.8g，53.9mmol)加入到乙硫基乙酸(5.9g，49.2mmol)的二氯甲烷溶液(100mL)中，将反应混合物加热至40℃，直到不再放出氯化氢为止(约两个小时)。反应结束后，在真空条件下旋蒸除去二氯甲烷，可得到乙硫基乙酰氯(6.5g,46.7mmol，产率:95％)；再将乙硫基乙酰氯(6.5g，46.7mmol)和5-羧基-2',7'-二氯荧光素(9.4g，21.2mmol)用无水N，N-二甲基甲酰胺(50mL)溶解，于氮气氛围下向其中滴加无水三乙胺(2.1g，21.2mmol)，于室温条件下反应12h，反应结束后，在真空条件下旋蒸除去溶剂，用淋洗剂为石油醚：乙酸乙酯(v/v)＝1:1为淋洗剂进行柱层析，分离得到二乙硫基乙酸酯化的二氯荧光素分子DSF-COOH(10g,产率:80％)。
制备例2：氨基萘二酰亚胺与马来酸酐的酰胺化反应制备NAM-COOH
Figure BDA0002631231960000131
将4-氨基-N-丁基萘二酰亚胺(5g，18.6mmol)和马来酸酐(2.8g,28.0mmol)用氯仿(80mL)溶解，回流反应12h，反应结束后冷却到室温，在真空条件下旋蒸除去溶剂后，以纯乙酸乙酯为淋洗剂进行柱层析分离，得到目标产物还原环境响应的荧光基元4-马来酰氨基-1,8-萘酰亚胺NAM-COOH(6.7g,产率:80％)。
利用核磁共振对制备例2中得到的4-马来酰氨基-1,8-萘酰亚胺NAM-COOH进行分析，得到其核磁共振氢谱图如图1所示。
制备例3：N,N二甲基丙烯酰胺(DMA)和甲基丙烯酸羟乙基酯(HEMA)无规共聚物P(DMA-co-HEMA)的聚合方法
于封管中，称取链转移剂三硫酯(50mg,0.2mmol)、甲基丙烯酸羟乙基酯(HEMA)(720mg,5.0mmol)和单体N,N二甲基丙烯酰胺(DMA)(247mg,2.5mmol)、引发剂偶氮二异丁腈AIBN(7mg,0.04mmol)以及溶剂二氧六环(1mol/L)，将封管在液氮冷冻后再用油泵真空脱气三次后，在真空状况下封管，于70℃磁子搅拌反应12h,反应结束后，冷却至室温，打开封管，加入四氢呋喃(2mL)稀释封管中的体系后，将体系沉淀到冰的不良溶剂乙醚(40mL)中，离心后得到固体粗产物。然后再将获得的粗产物再通过溶解-沉淀-离心的方法处理两次，离心后真空干燥过夜，得到无规共聚物P(DMA-co-HEMA)。
制备例4：用巯基化合物响应的荧光基元NAM单修饰无规共聚物P(DMA-co-HEMA)
Figure BDA0002631231960000141
将无规共聚物P(DMA-co-HEMA)(350mg,0.05mmol)溶于无水二氯甲烷(2mL)中，向其中加入巯基化合物荧光探针NAM-COOH(25mg,0.08mmol)和脱水剂DCC(15mg,0.75mmol)，于氮气氛围下室温条件下反应24h，反应结束后与冰乙醚沉淀，离心后倒掉上清液，真空干燥过夜，得到巯基响应探针单修饰的无规共聚物P(DMA-co-NAM)。
制备例5：用酸性响应的荧光基元DSF单修饰无规共聚物P(DMA-co-HEMA)
Figure BDA0002631231960000142
将无规共聚物P(DMA-co-HEMA)(350mg,0.05mmol)和二氯荧光素分子(DSF-COOH)(51mg,mmol)溶于无水二氯甲烷中，再加入DCC(15mg,0.75mmol)于室温条件下反应24h，反应结束后与冰乙醚沉淀，离心后真空干燥过夜，得到酸性响应探针单修饰的无规共聚物P(DMA-co-DSF)。
制备例6：两亲性共聚物PMEMA-b-P(DMA-co-HEMA)的聚合方法
Figure BDA0002631231960000151
称取大分子链转移剂PMEMA25(200mg，0.05mmol)、单体N,N二甲基丙烯酰胺(DMA)(250mg，2.5mmol)和甲基丙烯酸羟乙基酯(HEMA)单体(13mg,0.1mmol)、AIBN(2mg,0.01mmol)以及溶剂二氧六环(1mol/L)，加入到封管中，液氮冷冻脱气三次后，封管，于70℃磁子搅拌反应12h,反应结束后，冷却至室温，打开封管，加入四氢呋喃(2mL)稀释封管中的体系后，将体系沉淀到冰的不良溶剂乙醚(40mL)中，离心后得到固体粗产物。然后再将获得的粗产物再通过溶解-沉淀-离心的方法处理两次，离心后真空干燥过夜，得到两亲性嵌段共聚物PMEMA-b-P(DMA-co-HEMA)。
利用核磁共振对制备例6中大分子链转移剂PMEMA25进行分析，得到其核磁共振氢谱图，如图2所示。
利用核磁共振对制备例6中得到的两亲性嵌段共聚物PMEMA-b-P(DMA-co-HEMA)进行分析，得到其核磁共振氢谱图如图3所示。
利用凝胶渗透色谱对制备例6中大分子链转移剂PMEMA25及两亲性嵌段共聚物PMEMA-b-P(DMA-co-HEMA)进行分析，得到其凝胶渗透色谱(GPC)表征图，如图4(a)所示。
制备例7：用巯基化合物响应的荧光基元NAM单修饰两亲性嵌段共聚物PMEMA-b-P(DMA-co-HEMA)
Figure BDA0002631231960000152
用巯基化合物响应性NAM荧光基元对两亲性嵌段共聚物PMEMA-b-P(DMA-co-HEMA)进行单标记；标记方法与前述对无规共聚物P(DMA-co-HEMA)进行单标记的方法和过程类似，得到侧基中含有巯基化合物响应性NAM荧光基元的两嵌段共聚物PMEMA-b-P(DMA-co-NAM)。
制备例8：两亲性嵌段共聚物PMEMA-b-P(DMA-co-NAM)的自组装
具有酸性pH和还原环境双响应性的两亲性嵌段共聚物PMEMA-b-P(DMA-co-NAM)在水溶液中的自组装采用使用传统的慢加水方式进行：首先取5mg两亲性嵌段共聚物溶于过膜后的四氢呋喃溶液(1mL)中,再以9mL/h的慢加水速度逐渐滴加1mL的pH为10的去离子水。滴加完毕再将组装体与室温搅拌除去其中的四氢呋喃溶剂，得到PMEMA-b-P(DMA-co-NAM)纳米组装体。
制备例9：用酸性响应的荧光基元DSF单修饰两亲性嵌段共聚物PMEMA-b-P(DMA-co-HEMA)
Figure BDA0002631231960000161
用酸性pH响应性DSF荧光剂基元对两亲性嵌段共聚物PMEMA-b-P(DMA-co-HEMA)进行单标记；标记方法与前述对无规共聚物P(DMA-co-HEMA)进行单标记的方法和过程类似，得到侧基中含有酸性pH响应性DSF荧光基元的两嵌段共聚物PMEMA-b-P(DMA-co-DSF)。
制备例10：两亲性嵌段共聚物PMEMA-b-P(DMA-co-DSF)的自组装
组装方法与制备例8过程类似，得到PMEMA-b-P(DMA-co-DSF)纳米组装体。
制备例11：两亲性嵌段共聚物P(DMA-co-AEMAboc)-b-P(MEMA-co-HEMA)的合成
Figure BDA0002631231960000162
首先合成两亲性嵌段共聚物的疏水性嵌段部分P(MEMA-co-HEMA)，具体合成过程如下：称取链转移剂三硫酯(50mg,0.2mmol)、甲基丙烯酸甲氧基乙酯(MEMA)(720mg,5.0mmol)和甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)(650mg,5.0mmol)、引发剂偶氮二异丁腈AIBN(7mg,0.04mmol)以及溶剂二氧六环(1mol/L)加入到封管中，将封管在液氮冷冻后再用油泵真空脱气三次后，在真空状况下封管，于70℃磁子搅拌反应12h，反应结束后，冷却至室温，打开封管，加入四氢呋喃(2mL)稀释封管中的体系后，将体系沉淀到冰乙醚(40mL)中，离心后得到固体粗产物。然后再将获得的粗产物再通过溶解-沉淀-离心的方法处理两次，离心后真空干燥过夜，得到P(MEMA-co-HEMA)。
然后合成两亲性嵌段共聚物P(MEMA-co-HEMA)-b-P(DMA-co-AEMAboc)，具体合成过程如下：称取P(MEMA-co-HEMA)(370mg,0.05mmol)、N,N-二甲基丙烯酰胺(247mg,2.5mmol)和氨基由Boc保护的氨乙基甲基丙烯酰胺(AMEA-Boc)(24mg，0.1mmol)、引发剂AIBN(7mg,0.04mmol)以及溶剂二氧六环(1mol/L)，加入到封管中。液氮冷冻脱气三次后，封管，于70℃磁子搅拌反应12h，反应结束后，冷却至室温，打开封管，加入四氢呋喃(2mL)稀释封管中的体系后，将体系沉淀到冰的不良溶剂乙醚(40mL)中，离心后得到固体粗产物。然后再将获得的粗产物再通过溶解-沉淀-离心的方法处理两次，离心后真空干燥过夜，得到两亲性嵌段共聚物P(MEMA-co-HEMA)-b-P(DMA-co-AEMAboc)。
利用凝胶渗透色谱对制备例11中P(MEMA-co-HEMA)及两亲性嵌段共聚物P(MEMA-co-HEMA)-b-P(DMA-co-AEMAboc)进行分析，得到其凝胶渗透色谱(GPC)表征图，如图4(b)所示。
制备例12：用巯基化合物响应的荧光基元NAM单修饰两亲性嵌段共聚物P(DMA-co-AEMAboc)-b-P(MEMA-co-HEMA)
Figure BDA0002631231960000181
用巯基化合物响应性NAM荧光基元对两亲性嵌段共聚物P(DMA-co-AEMAboc)-b-P(MEMA-co-HEMA)进行单标记；标记方法与前述对无规共聚物P(DMA-co-HEMA)进行单标记的方法和过程类似，得到侧基中含有巯基化合物响应性NAM荧光基元的两嵌段共聚物P(DMA-co-AEMAboc)-b-P(MEMA-co-NAM)。
制备例13：两亲性嵌段共聚物P(MEMA-co-NAM)-b-P(DMA-co-AEMAboc)的自组装
组装方法与制备例8过程类似，得到P(MEMA-co-NAM)-b-P(DMA-co-AEMAboc)纳米组装体。
制备例14：酸性pH和还原环境双响应性两亲性嵌段共聚物P(DMA-co-DSF)-b-P(MEMA-co-NAM)的合成
Figure BDA0002631231960000182
首先进行脱Boc处理，将P(MEMA-co-NAM)-b-P(DMA-co-AEMAboc)(640mg,0.05mmol)于冰浴条件下溶于二氯甲烷和三氟乙酸的混合溶液中(9:1)，室温反应4h，脱掉Boc保护，露出氨基，反应结束后，旋干溶剂后用二氯甲烷(2mL)溶解，于冰乙醚沉淀，离心后倒掉上清液，真空干燥过夜，得到P(MEMA-co-NAM)-b-P(DMA-co-AEMA)；再将P(MEMA-co-NAM)-b-P(DMA-co-AEMA)和二氯荧光素分子(DSF-COOH)(51mg,0.08mmol)溶于无水二氯甲烷中，再加入DCC(15mg,0.75mmol)于室温条件下反应24h，反应结束后与冰乙醚沉淀，离心后真空干燥过夜，得到由巯基化合物响应性NAM荧光基元和和酸性pH响应性DSF荧光基元双修饰的两亲性嵌段共聚物P(MEMA-co-NAM)-b-P(DMA-co-DSF)。
制备例15：两亲性嵌段共聚物P(MEMA-co-NAM)-b-P(DMA-co-DSF)的自组装
组装方法与制备例8过程类似，得到P(MEMA-co-NAM)-b-P(DMA-co-DSF)纳米组装体。
应用例1：巯基化合物响应荧光基元NAM引入高分子链后在还原环境下的荧光检测
聚合物的构筑如前所述，为了探索将NAM荧光基元引入高分子链侧基后对其还原环境响应性荧光发射性质的影响，从制备例4获得被巯基化合物NAM荧光基元单修饰的P(DMA-co-NAM)，在浓度为0.5g/L的P(DMA-co-NAM)聚合物溶液中加入10mM的半胱氨酸，对其荧光发射行为进行跟踪测试，得到其荧光光谱跟踪图如图5所示。从溶液体系的荧光光谱变化可以发现，在无半胱氨酸存在的情况下，在波长为405nm光照激发下，由于NAM基元中马来酰胺结构就与萘酰亚胺结构之间的PET效应，P(DMA-co-NAM)聚合物溶液几乎无荧光发射；而在加入半胱氨酸后，溶液体系开始表现出荧光发射性质，在480nm处的NAM荧光基元的发射峰强度随时间延长迅速增加，60min后增加趋势减缓，120min后荧光发射强度趋于平衡；荧光强度约为无半胱氨酸存在情况下的12倍，显示出荧光发射性质对巯基化合物等还原环境的响应性。
实验结果表明，巯基化合物半胱氨酸的加入后，与NAM基元中的马来酰胺结构之间发射迈克尔加成反应，从而阻断PET效应，使NAM荧光发射性质“turn on”，且其强度随反应进行而增加，直至反应达到平衡，这也说明将NAM荧光基元通过共价键引入聚合物侧基中，并不影响其基于PET效应的荧光发射性质的还原环境响应性。
应用例2：酸性响应荧光基元DSF引入高分子链后在酸性环境下的荧光检测
聚合物的构筑如前所述，对于检测酸性的荧光响应性，从制备例5获得被酸性响应荧光基元单修饰的P(DMA-co-DSF)，在0.5g/L的P(DMA-co-DSF)在pH＝5.0的PB缓冲溶液中，在波长为490nm的光照激发下，如图6所示，530nm处DSF的荧光发射峰强度迅速增加，90min后变化开始减缓，约240min后趋于平衡。以上实验结果表明，在酸性pH值条件下，由于乙硫基乙酯结构发生水解，使DSF荧光发射“turn on”，从而使P(DMA-co-DSF)显示出对酸性pH环境的响应性。
实验结果表明，共价键接于聚合物侧基中的DSF荧光基元仍然保持有因乙硫基乙酯结构的水解所造成的荧光发射性质的酸性pH响应性；这为构筑双响应性嵌段共聚物荧光探针提供了重要的参考和数据支持。
应用例3：NAM荧光基元位于组装体不同位置在相同巯基浓度不同pH环境下的荧光检测
聚合物的构筑如前所述，为了检测两亲性共聚物胶束探针的荧光发射性质对还原环境，即巯基化合物的响应性，以及NAM荧光基元位于组装体内不同位置及微环境时对外界刺激的响应速度的影响。制备例8获得的PMEMA-b-P(DMA-co-NAM)纳米组装体中，NAM荧光基元位于亲水壳层，而在制备例13获得的P(MEMA-co-NAM)-b-P(DMA-co-AEMA)纳米组装体中，NAM荧光基元位于胶束的疏水内核中。然后，在相同巯基化合物、相同巯基浓度以及不同的pH值环境中，对两种胶束组装体的荧光发射性质对还原环境的响应性进行了探究。分别在pH＝7.4(模拟细胞胞浆中pH值)和6.0(模拟内涵体pH值)的PB缓冲溶液中，跟踪聚合物组装体(0.5g/L)在加入半胱氨酸(10mM)后的荧光光谱随时间的的变化，由Figure 2-8可以看出，在pH＝7.4和波长405nm的光照激发下，如图7所示，两种组装体溶液在450nm处属于NAM基元的发射峰强度随着时间的延长显著增加，表现出明显的荧光“turn on”现象。相比之下，NAM位于壳层的纳米组装体溶液的荧光强度变化要比NAM位于胶束内核时快，达到平衡的时间也比NAM位于疏水核内的纳米组装体要短，前者的荧光强度在45min左右即基本趋于平衡，而后者则在约90min后才基本不再变化。在pH为6.0的环境中，NAM位于壳层的组装体有一点微弱的荧光“turn on”变化，而NAM位于胶束核内组装体几乎没有荧光变化。
实验结果表明，巯基化合物与NAM之间的加成在酸性条件下反应速率很慢，而这也符合迈克尔加成反应为亲核加成的机理和特点；并且由于P(MEMA-co-NAM)-b-P(DMA-co-AEMA)组装体中的NAM位于胶束核内，因此与巯基化合物的“接触几率”更小，所以与NAM位于胶束壳层的PMEMA-b-P(DMA-co-NAM)组装体相比，加成反应速率要慢得多，因此荧光“turnon”现象不明显。
应用例4：NAM荧光基元位于组装体亲水壳层在不同pH环境下的荧光检测
聚合物的构筑如前所述，考虑到细胞内溶酶体具有更低的pH值，进一步模拟细胞溶酶体内的酸性微环境，对从制备8获得的PMEMA-b-P(DMA-co-NAM)纳米组装体在pH＝5.0的PB缓冲溶液中的稳定性进行了研究。结果发现(图8)，在pH＝5.0和波长为405nm的光照激发下，PMEMA-b-P(DMA-co-NAM)纳米组装体始终无明显的荧光“turn on”。
实验结果表明，巯基响应的NAM荧光探针位于壳层的纳米组装体在pH＝5.0的环境中具有很好的稳定性，可以在溶酶体中稳定存在，这为后续跟踪组装体从生物体外进入到胞浆内打下基础。
应用例5：NAM荧光基元在不同巯基化合物和不同pH的环境下的荧光检测
聚合物的构筑如前所述，考虑到半胱氨酸主要存在于pH＝6.0的细胞内涵体中，而pH＝7.4的细胞胞浆中的巯基化合物主要为谷胱甘肽(谷胱甘肽)，接下来对比了从制备例13获得的P(MEMA-co-NAM)-b-P(DMA-co-AEMAboc)纳米组装体的荧光发射性质对谷胱甘肽和半胱氨酸的刺激响应性。由图9可以看出，在pH＝7.4的组装体溶液中分别加入相同浓度的半胱氨酸和谷胱甘肽，均为使体系的荧发射“turn on”，但相比之下对半胱氨酸的响应性更为灵敏，荧光强度变化更快。
实验结果表明：由于谷胱甘肽为三肽，分子体积要比半胱氨酸大，因此在溶液中扩散进入P(MEMA-co-NAM)-b-P(DMA-co-AEMAboc)纳米组装体疏水内核相对比较困难，与NAM基元之间的反应速率较慢。并且由于因为半胱氨酸分子中巯基的pKa约为8.3，而谷胱甘肽中巯基的pKa约为9.2，因此在相同的pH＝7.4的条件下，谷胱甘肽的巯基更多地以质子化形式存在，因此与NAM之间的亲核加成反应活性相对较低。而在另一方面，在pH＝6.0的酸性条件下，在组装体溶液中分别加入相同浓度的半胱氨酸和谷胱甘肽,由于两者的巯基的反应活性均较弱，均难以使位于胶束疏水内核中的NAM基元的荧光发射“turn on”，这与前面的刺激响应性对环境pH值的依赖性研究结果一致
应用例6：NAM荧光基元位于组装体亲水壳层在不同pH、不同巯基化合物浓度以及种类的环境下的荧光检测
聚合物的构筑如前所述，从制备例13获得的P(MEMA-co-NAM)-b-P(DMA-co-AEMAboc)纳米组装体对谷胱甘肽的刺激响应性速率除了受到微环境pH值影响之外，还与其浓度有关，如图10所示。在pH＝7.4的PB缓冲液中，高浓度谷胱甘肽(10mM)的加入所导致的NAM荧光发射强度的增加要比低浓度(3mM)下要快，到达平衡时所需的时间也更短。
实验结果表明，由于分子体积和扩散速度方面，以及巯基pKa方面的差别，以及相比之下，在溶液中加入半胱氨酸能更快地使NAM的荧光“turnon”，200μM的半胱氨酸所造成的荧光强度的变化与3mM的谷胱甘肽所产生的效果接近。
应用例7：共价键接DSF荧光基元的纳米组装体在不同pH浓度下的荧光检测
聚合物的构筑如前所述，对从制备例10获得的共价键接DSF荧光基元的纳米组装体PMEMA-b-P(DMA-co-DSF)从模拟细胞内不同细胞器的微环境，在不同pH值、不同巯基化合物加入条件下对其的荧光发射性质进行了跟踪研究。由图11可以看出，在模拟细胞溶酶体的pH＝5.0的PB缓冲溶液中，在波长为490nm的光照激发下，聚合物组装体在530nm处归属于水解后DSF的吸收峰强度随时间延长显著增加，表现出明显的酸性pH值响应性荧光“turnon”，240min后逐渐趋于平衡。然而，在pH＝7.4的条件下，荧光发射强度的增加极为缓慢。
实验结果表明，在正常生理环境的pH值条件下，DSF基元中乙硫基乙酯的水解反应较为缓慢，而巯基化合物(谷胱甘肽，10mM)的存在对水解反应也没有明显的影响。在模拟细胞内涵体的pH＝6.0、半胱氨酸浓度为100μM的条件下，组装体的荧光发射随时间延长虽有一定程度的增加，但变化要缓慢得多。以上实验结果表明，PMEMA-b-P(DMA-co-DSF)聚合物组装体对溶酶体的酸性微环境更为敏感，表现出显著的刺激响应性，而巯基化合物的存在并不会对其酸性pH值的刺激响应性产生影响。
应用例8：模拟组装体从生物体外进入胞浆的环境，巯基和酸性环境双响应的聚合物组装体的荧光检测
聚合物的构筑如前所述，为了探究制备例15获得的同时具有巯基化合物和酸性pH双响应性的P(MEMA-co-NAM)-b-P(DMA-co-DSF)聚合物组装体的刺激响应性，模拟细胞内溶酶体和胞浆的微环境，跟踪研究了组装体的荧光发射性质的变化。由图12可以发现，在pH＝5.0的PB缓冲溶液中，组装体表现出明显的荧光“turn on”现象，530nm处(λex＝490nm)DSF的荧光强度随时间延长逐渐增强，这一变化趋势与前述由DSF单标记的PMEMA-b-P(DMA-co-DSF)两嵌段共聚物组装体相似，显示出P(MEMA-co-NAM)-b-P(DMA-co-DSF)聚合物组装体对酸性pH的刺激响应性。180min后将溶液pH调整至7.4并在其中加入谷胱甘肽(10mM)，由于DSF基元中乙硫基乙酯结构的水解已经完成，溶液中DSF荧光不再发生明显的变化。而在此过程中NAM的荧光变化则完全不同。在pH＝5.0的条件下，溶液中几乎检测不到NAM的荧光发射(λex＝405nm)，只有在将溶液pH调整至7.4并在其中加入谷胱甘肽(10mM)后，由于迈克尔加成反应所造成的PET效应的阻断，NAM在450nm处的荧光发生“turn on”，强度逐渐增加直至平衡，表现出对还原环境的刺激响应性。此外，我们发现，在pH＝7.4、有谷胱甘肽存在的中性/弱碱型还原环境中，如果采用405nm的激发波长，除了可以观察到450nm处NAM的荧光发射外，同样还可以观察到530nm处DSF的强荧光发射。这是由于组装体中两种荧光基元之间的FRET效应，即：在405nm波长激发下，处于激发态的NAM基元可以将一部分能量转移给DSF基元，从而使DSF的荧光发射进一步增强。
实验结果表明，制备例15获得的P(MEMA-co-NAM)-b-P(DMA-co-DSF)嵌段共聚物组装体的双响应性荧光探针，可以表现出对细胞内不同位置(胞浆、内含溶酶体)的pH值和巯基化合物浓度的刺激响应性，因此有望用以跟踪监测纳米载体在进入细胞后的输运途径。

Claims (10)

1.一种聚合物基荧光探针，其特征在于，包括两亲性嵌段共聚物与接枝在两亲性嵌段共聚物上的巯基响应性基团和/或二氯荧光素基团；
所述巯基响应性基团的结构为：
Figure FDA0003181810170000011
其中，R为C1～C10的烷基；
所述二氯荧光素基团的结构为：
Figure FDA0003181810170000012
其中，R1与R2各自独立地为C1～C5的烷基；
所述两亲性嵌段共聚物包括亲水嵌段与疏水嵌段；所述亲水嵌段与疏水嵌段的摩尔比为1：(0.01～2)。
2.根据权利要求1所述的聚合物基荧光探针，其特征在于，所述巯基响应性基团的结构为：
Figure FDA0003181810170000013
3.根据权利要求1所述的聚合物基荧光探针，其特征在于，所述二氯荧光素基团的结构为：
Figure FDA0003181810170000021
4.根据权利要求1所述的聚合物基荧光探针，其特征在于，所述亲水嵌段选自N-烷基取代的丙烯酰胺单体单元、N-烷基取代的甲基丙烯酰胺单体单元、氨烷基丙烯酰胺单体单元与氨烷基甲基丙烯酰胺单体单元中的一种或多种；所述疏水嵌段选自丙烯酸羟烷基酯单体单元、甲基丙烯酸羟烷基酯单体单元、烷氧基丙烯酸酯单体单元与烷氧基甲基丙烯酸酯单体单元中的一种或多种。
5.根据权利要求4所述的聚合物基荧光探针，其特征在于，所述烷氧基丙烯酸酯单体单元选自丙烯酸甲氧基乙酯单体单元；所述烷氧基甲基丙烯酸酯单体单元选自甲基丙烯酸甲氧基乙酯单体单元；所述丙烯酸羟烷基酯单体单元选自丙烯酸羟乙酯单体单元；所述甲基丙烯酸羟烷基酯单体单元选自甲基丙烯酸羟乙酯单体单元；所述N-烷基取代的丙烯酰胺单体单元选自N，N-二甲基丙烯酰胺单体单元；所述N-烷基取代的甲基丙烯酰胺单体单元选自N，N-二甲基甲基丙烯酰胺单体单元；所述氨烷基丙烯酰胺单体单元选自氨乙基丙烯酰胺单体单元；所述氨烷基甲基丙烯酰胺单体单元选自氨乙基甲基丙烯酰胺单体单元。
6.根据权利要求1所述的聚合物基荧光探针，其特征在于，所述聚合物基荧光探针包括共价接枝嵌段；所述共价接枝嵌段选自下面的一种或多种：
Figure FDA0003181810170000022
Figure FDA0003181810170000031
其中，R为C1～C10的烷基；R1与R2各自独立地为C1～C5的烷基；R′～R3′各自独立地为氢或甲基；a、b、c与d各自独立地为1～5的整数。
7.根据权利要求6所述的聚合物基荧光探针，其特征在于，所述R为C2～C6的烷基；R1与R2各自独立地为C1～C3的烷基；R′～R3′各自独立地为氢或甲基；a、b、c与d各自独立地为2～3的整数。
8.根据权利要求1所述的聚合物基荧光探针，其特征在于，所述巯基响应性基团与两亲性嵌段共聚物的疏水嵌段共价连接；所述二氯荧光素基团与两亲性嵌段共聚物的亲水嵌段共价连接；所述巯基响应性基团与二氯荧光素基团的摩尔比为(10～100)：1。
9.根据权利要求1所述的聚合物基荧光探针，其特征在于，所述聚合物基荧光探针为两亲性嵌段共聚物与接枝在两亲性嵌段共聚物上的巯基响应性基团和/或二氯荧光素基团自组装形成的纳米组装体。
10.权利要求1～9任意一项所述的聚合物基荧光探针在检测酸性环境和/或还原环境中的应用。
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