KR20030074697A - 분석물의 검출 방법 - Google Patents

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KR20030074697A
KR20030074697A KR10-2003-7009057A KR20037009057A KR20030074697A KR 20030074697 A KR20030074697 A KR 20030074697A KR 20037009057 A KR20037009057 A KR 20037009057A KR 20030074697 A KR20030074697 A KR 20030074697A
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KR
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benzyl
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borono
acid
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KR10-2003-7009057A
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조지 와이. 대닐로프
아리스토틀 쥐. 칼리브렌테노스
알렉산더 브이. 니콜라이트치크
에드윈 에프. 울만
Original Assignee
센서즈 포 메드슨 앤드 사이언스 인코포레이티드
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Abstract

분석물에 노출되는 경우에 분자적 구조 변화를 겪을 수 있는 인디케이터 시스템으로 당과 같은 분석물들을 검출하기 위한 방법이 개시된다. 구조 변화는, 인디케이터 시스템과 관련된 형광과 같은, 검출가능한 성질에 영향을 줌으로써, 분석물의 존재 또는 농도를 검출하는 것을 가능하게 한다.

Description

분석물의 검출 방법{Detection of analytes}
미국특허 제5,503,770호 (James 등)는, 포도당 등의 당류에 결합하게 되면 고강도의 형광을 방출하는 형광성 보론산-함유 화합물을 개시하고 있다. 상기 형광 화합물은 형광단 (fluorophore), 최소한 하나의 페닐보론산 부분 및, 질소 원자가 페닐보론산 부분의 근방에 배치되어 보론산과 분자간 상호작용을 이룰 수 있는 최소한 하나의 아민-제공 질소 원자를 포함하는 분자 구조를 갖는다. 그와 같은 상호작용은 상기 화합물이 당과 결합하면 형광을 방출하게 한다. 미국특허 제5,503,770호는 당류를 검출하는데 적당한 화합물을 개시하고 있다. 또한, T. James 등, J. Am. Chem. Soc. 117 (35): 8982-87 (1995) 참조.
Nature Biotechnology 16,49-53 (1988)은 분자 표지 (molecular beacons), 즉, 형광단/소광인자 (fluorophore/quencher) 쌍으로 표지된 머리핀-형태 (hair-shaped)의 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용하여 대립유전자 (allele)를 구별하는 방법에 관한 것이다. 표적에 결합하면, 프로브는 구조적 재구성을 겪게 되어, 내부 소광된 형광단의 형광을 회복시키게 된다. 그러나, DNA 염기 쌍의 강도가 주위 온도에서 상대적으로 높고, 사용되는 분자 표지 프로브는 큰 구조적 변화 (필연적으로 180°까지)를 겪어야 하기 때문에, 변동하는 분석물 농도를 실시간으로 지속적으로 검출하는 데에는 시스템이 용이하게 사용될 수 없다.
따라서, 분석물의 존재 또는 농도를 더 큰 감도로 검출할 수 있고, 또한 다양한 검출 시스템들을 사용할 수 있으며, 그 농도가 변동될 수 있는 분석물의 실시간 검출에도 사용될 수 있는 인디케이터 시스템에 대한 필요성이 당업계에 존재한다.
관련출원에 대한 상호 참증
본 출원은 2001년 1월 5일에 출원된 미국특허출원 제09/754,219호의 일부계속출원 (continuation-in-part application)이다.
연방 지원 연구 또는 개발에 관한 언급
적용 없음.
본 발명은 분석물 (analyte)의 존재 또는 농도의 검출 방법에 관한 것이다. 더욱 구체적으로는, 본 발명은, 분석물에 노출되는 경우에 분자적 구조 변화 (molecular configurational change)를 겪을 수 있는 인디케이터 (indicator) 시스템으로 분석물을 검출하는 방법에 관한 것이다. 이러한 구조 변화는 인디케이터 시스템의 검출가능한 성질에 영향을 미침으로써, 분석물의 존재 또는 농도의 검출을 가능하게 한다.
도 1은 실시예 1에 서술된 인디케이터의 정규화된 형광 방출 (I/Io @ 535 nm)을 나타낸 것이다.
도 2는 실시예 2에 서술된 인디케이터의 정규화된 형광 방출 (I/Io @ 535 nm)을 나타낸 것이다.
도 3은 실시예 3에 서술된 인디케이터의 형광 방출 (518 nm에서의 I)을 나타낸 것이다.
도 4는 실시예 4에 서술된 인디케이터의 형광 방출 (545 nm에서의 I)을 나타낸 것이다.
도 5는 실시예 5에 서술된 인디케이터의 형광 방출 (532 nm에서의 I)을 나타낸 것이다.
도 6은 실시예 6에 서술된 인디케이터의 형광 방출 (450 nm에서의 I)을 나타낸 것이다.
도 7은 실시예 6에 서술된 인디케이터의 정규화된 형광 방출 (430 nm에서의 I)을 나타낸 것이다.
도 8은 실시예 7에 서술된 인디케이터의 흡수 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 9는 실시예 7에 서술된 인디케이터의 흡광도 비 (A (565 nm)/A (430 nm))를 나타낸 것이다.
도 10은 실시예 7에 서술된 인디케이터의 550 nm에서의 정규화된 형광 방출 (I/Io)을 나타낸 것이다.
일면에 있어서, 본 발명은 시료 중의 폴리히드록실 (polyhydroxyl) 분석물의존재 또는 농도를 검출하기 위한 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은:
a) 상기 시료를,
ⅰ) 상기 분석물과 가역적인 방식으로 공유결합을 형성할 수 있는 제1 인식 요소, 및 A) 상기 제1 인식 요소에 결합된 상기 분석물과 가역적인 방식으로 공유결합을 형성할 수 있는 제2 인식 요소, 또는 B) 상기 분석물의 부존재 시에 상기 제1 인식 요소와 가역적인 방식으로 상호작용할 수 있는 리간드 요소로서, 상기 리간드 요소와 상기 인식 요소와의 상호작용에 의하여 조절되는 검출가능한 성질을 생성하는 표지 (label)를 선택적으로 포함하는 리간드 요소; 및
ⅱ) A) 인디케이터 시스템이 상기 분석물에 노출되는 경우에 농도-의존적인 방식으로 변화하는 검출가능한 성질을 생성하는 공여체/수용체 시스템, 및 B) 상기 표지된 리간드 요소 중의 최소한 하나를 포함하는 검출 시스템
을 포함하는 인디케이터 시스템에 노출시키는 단계; 및
b) 상기 검출가능한 성질의 변화를 측정함으로써 상기 시료 중의 상기 분석물의 존재 또는 농도를 결정하는 단계를 포함하며,
상기 제1 인식 요소를 포함하는 상기 인디케이터 시스템 부분이 상기 제2 인식 요소 또는 상기 리간드 요소를 포함하는 인디케이터 시스템 부분과 공유적으로 또는 비공유적으로 결합되는 것을 특징으로 한다.
다른 면에 있어서, 본 발명은 상기 서술한 방법들을 수행하기 위한 인디케이터 시스템에 관한 것이다.
일면에 있어서, 본 발명은 분석물과의 상호작용에 따라서 구조 변화를 겪을수 있는 인디케이터 시스템을 사용하여 분석물의 존재 또는 농도를 검출하는 방법을 제공한다. 상기 인디케이터 시스템은 상기 인디케이터 시스템이 구조 변화를 겪는 경우에 변화하는 검출가능한 성질을 가지며, 이는 상기 분석물의 존재 또는 농도에 대한 지표가 된다.
본 발명에 따라서 많은 분석물들이 검출될 수 있다. 적당한 분석물들은 분자 분석물들 (예를 들어, 배위결합들 (coordinative bonds)로 이루어진 금속 이온 또는 금속 착물 (metal complex)에 대비되는 것으로서, 공유결합 (covalent bond)으로 이루어진 분자로서 정의될 수 있다); 탄수화물; 폴리히드록실 화합물, 특히 유리 당들 (예를 들어, 포도당, 과당, 젖당 등) 및 지질, 단백질 등에 결합된 당들과 같이, 인접 히드록시기를 갖는 것들; 작은 분자 약물들; 호르몬류; 산소; 이산화탄소; 아연, 칼륨, 수소, 탄산염 등과 같은 다양한 이온들을 포함한다. 본 발명은 작은 분석물들, 구체적으로 5000 달톤 이하의 분석물들의 검출에 특히 적합하다.
일 구현예에서, 본 발명은 검출될 분석물에 대한 최소한 두 개의 인식 요소들을 갖는 인디케이터 시스템을 사용하여 수행될 수 있으며, 상기 인식 요소들은 2 자리 상호작용 (2-site interaction)을 할 수 있는 분석물과 상호작용하는 경우에 상기 인디케이터 시스템에 구조 변화가 일어나게 되도록 배향된다. 인디케이터 시스템은 또한 그와 결합된 검출 시스템 (detection system)을 포함하며, 상기 검출 시스템은 인디케이터 시스템이 분석물과 상호작용하는 경우에 변화하게 되는 검출가능한 성질을 갖는다. 분석물과 상호작용하는 경우에, 상기 인식 요소들은 분석물이 부존재하는 경우의 그들의 구조에 비해 더 가까워지거나 또는 더 멀어지거나, 또는 그들의 분자 운동의 자유도가 제한된 구조를 취할 수 있으며, 이는 신호에 영향을 줄 수 있다. 구조에 있어서의 그러한 변화는 검출가능한 성질의 변화를 야기할 수 있다.
다른 구현예에서, 본 발명은 리간드 요소 이외에도 검출될 분석물에 대한 최소한 하나의 인식 요소를 갖는, 인디케이터 시스템을 사용하여 수행될 수 있다. 상기 리간드 요소는 인식 요소와의 가역적인 상호작용이 가능하며, 인식 요소와의 상호 작용에 대하여 분석물과 경쟁할 수 있다. 인식 요소와 리간드 요소가 분석물의 부존재 하에서 상호작용하는 경우에, 상기 검출 시스템은 분석물이 인식 요소와 상호작용하는 때에 비하여 다른 바람직한 구조 또는 상대적인 배향을 가지며, 이는 인식 요소로부터 리간드 요소가 분리되게 한다. 구조에 있어서의 그러한 변화는 검출가능한 성질에 있어서의 변화를 야기한다. 특정 구현예에서, 상기 리간드 요소는 검출 시스템의 일부일 수도 있다. 예를 들어, 리간드 요소는 소광인자 (quencher)일 수도 있으며, 분석물이 인식 요소와 상호작용하는 경우에는 그의 효과가 제거된다. 더욱이, 상기 리간드 요소는, 예를 들어 리간드 요소가 인식 요소와 상호작용하는가 그렇지 않은가에 따라서 그의 특성들 (예를 들어, 스펙트럼 프로필)이 달라지는 검출가능한 표지 (label)를 포함할 수 있다.
상기 서술된 구현예 중의 하나에 대하여, 적당한 인식 요소들은 검출될 분석물과 바람직하게는 가역적 상호작용을 할 수 있는 부분들을 포함한다. "상호작용 (interaction)"이라는 용어는, 전하 상호작용, 수소결합, 공유결합 등과 같은 다양한 물리적 및 화학적 상호작용들을 포함할 수 있는 것으로 이해된다. 인식 요소(들)와 분석물 사이의 상호작용 및 (존재한다면) 리간드 요소와 인식 요소와의 상호작용은 가역적 방식의 하나 또는 그 이상의 공유결합의 형성인 것이 특히 바람직하다. 본 명세서에서, 공유결합은 바람직하게는 각각의 원자에 의하여 하나의 전자가 제공되는 두 원자들 사이의 결합을 의미하며, 수소결합 (hydrogen bonding), 이온결합 (ionic bonding), 및 두 개의 원자 중 하나로부터 두 개의 전자들이 공여되는 것을 포함하는 배위결합 (coordinative or dative bonding)을 제외한다. 상기 상호작용은 상대적으로 약한 것, 예를 들어 약 10-6M 이상의 해리 상수를 갖는 것이 바람직하다. 몇몇 적당한 인식 요소들이 공지되어 있으며, 바람직하게는 보론산, 보로네이트 이온, 아비산 (arsenious acid), 아비산염 (arsenite) 이온, 텔루르 산 (telluric acid), 텔루르산염 (tellurate) 이온, 게르만산 (germanic acid), 게르만산염 (germanate) 이온 등을 포함하며, 이들 모두는 포도당 및 다른 탄수화물류와 같은 인접 디올들 (vicinal diols)을 인식하는 것으로 알려져 있다. 분석물이 포도당인 경우에, 보론산이 가장 바람직한 인식 요소이다.
인디케이터 시스템이 리간드 요소를 포함하는 경우의 구현예에서, 그와 같은 요소는 인식 요소와 상호작용할 수 있어야 하며, 표적 분석물의 동적 범위 (dynamic range)에 의존하여 고안되어야 한다. 리간드 요소의 선택은, 상기 서술한 지침 내에서, 분석물 및 인식 요소에 의존한다. 바람직한 구현예에서, 분석물이 포도당과 같은 인접 디올이고, 인식 요소가 보론산인 경우에, 리간드 요소는 바람직하게는 가역적인 방식으로 인식 요소와 결합 (예를 들어 에스테르 결합)을 형성할 수 있는 부분이다. 그와 같은 리간드 요소들은, 모든 선택적으로 치환된, 방향족 디올 (예를 들어, 카테콜), 락테이트, 알파-히드록시산, 타르타르산, 말산, 디에탄올아민, β-아미노알콜, 포도당, 폴리히드록시 화합물, 및 인접 히드록시-함유 화합물을 포함한다. 다른 구현예에서, 리간드 요소는 검출 시스템의 일부분일 수도 있다. 예를 들어, 리간드 요소는 인디케이터 시스템과 결합된 형광단의 형광을 조절할 수 있는 것일 수도 있다. 리간드 요소가 인식 요소와 상호작용하는 경우에, 그것은, 예를 들어 형광단을 효과적으로 소광시킬 수 있는 구조일 수 있다. 리간드 요소가 분석물에 의하여 인식 요소로부터 분리되는 경우에, 리간드는 더 이상 형광단을 소광시키는 구조로 존재하지 않게 된다 (실시예 6). 다른 실시예에서는 그 역의 경우가 또한 가능하다 (소광인자가 인식 요소와 상호작용하는 경우에는, 형광단과 상호작용할 수 없게 된다).
사용시에, 본 발명의 인디케이터 시스템은, 바람직하게는 여기에 서술된 구조적 상태들 (configurational states) 간에 동적 평형이 이루어지도록 존재한다. 더욱 바람직하게는, 상대적으로 약한 결합 및 높은 속도의 상호 작용이 존재하며, 이는 유리 분석물의 존재 하에서 더 빠른 평형을 가능하게 한다. 결과적으로, 본 발명을 이용하면, 바람직하게는 다양한 범위의 조건들 하에서 실시간으로 분석물을 검출하는 것이 가능하며, 특히 그 농도가 변동하는 분석물의 검출이 가능하다. 본 발명은 일반적으로 여기에 서술된 방법들을 수행함에 있어서 실질적으로 온도를 변화시킬 필요가 없다. 즉, 본 발명의 방법들은, 분석물 시료가 정상적인 조건들 하에서 발견되는 온도인, 실질적인 주위 온도에서 수행될 수 있다. 주위 온도는 분석물 및 그 환경에 의존하여 다양하게 변화되는 것으로 이해된다. 예를 들어, 주위 온도는 실온 또는 그 이하의 온도를 포함하며; 많은 생체내 (in vivo) 적용의 경우 약 45℃까지; 예를 들어, 특정 발효 적용의 경우 약 80℃ 또는 그 이상의 온도까지를 포함한다.
본 발명의 인디케이터 시스템은, 인디케이터 시스템이 분석물에 노출되는 경우에, 농도-의존적인 방식으로 변화하는 검출가능한 성질을 갖는 검출 시스템을 포함한다. 검출 시스템은 바람직하게는, 신호를 제공하기 위하여 상호작용하는 한 쌍의 다른 기들을 의미하는, 공여체/수용체 (donor/acceptor) 시스템을 포함하며, 상기 기들 사이의 거리 변화는 신호의 특성을 변화시킨다. 바람직하게는, 상기 신호는 전자기적 또는 전기화학적 신호 (예를 들어, 근접하는 경우에 다른 전기화학적 포텐셜을 제공하는 전하 수송 쌍)이다.
많은 그와 같은 성질들/시스템들이 공지되어 있으며, 본 발명에 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 인디케이터 시스템은, 인디케이터 시스템이 구조 변화를 겪게 되면 검출가능한 성질에 변화가 나타나는, 발광 (luminescent) (형광 (fluorescent) 또는 인광 (phosphorescent)) 또는 화학발광 표지 (chemiluminescent label), 흡광 기초 표지 (absorbance based label) 등을 포함할 수 있다. 검출 시스템은 공여 부분 및 수용 부분을 포함할 수 있으며, 이들 부위는 각각 인디케이터 시스템이 분석물과 상호작용하는 경우에는 검출가능한 변화가 존재하도록 배치된다.
검출가능한 성질은, 형광 감쇠 시간 (fluorescent decay time)에 있어서의 변화 (시간 도메인 또는 주파수 도메인 측정에 의하여 결정), 형광 강도, 형광 이방성 (anisotropy) 또는 극성 (polarization)과 같은 검출가능한 스펙트럼 변화; 방출 스펙트럼의 스펙트럼 이동; 시간-분해된 (time resolved) 이방성 감쇠 (시간 도메인 또는 주파수 도메인 측정에 의하여 결정), 흡광 스펙트럼에 있어서의 변화 등일 수 있다.
검출 시스템은 형광단 및 상기 형광단의 형광을 소광시킬 수 있는 부분을 포함할 수 있다. 그러한 구현예에서, 인디케이터 시스템은 두 가지 방식으로 구성될 수 있다. 첫째는, 분석물이 부존재하는 경우에, 상기 형광단 및 소광인자가 서로에 대하여 충분히 가깝게 위치하여 형광 방출이 효과적으로 소광되도록 구성될 수 있다. 분석물과 상호작용하는 경우에, 상기 인디케이터 시스템의 구조는 변화하여, 형광단의 탈소광 (dequenching)이 가능할 정도로 충분히 형광단/소광인자 쌍을 분리시키게 된다. 다른 한편으로 상기 인디케이터 시스템은, 분석물이 부존재하는 경우에, 상기 형광단 및 소광인자가 서로에 대하여 충분히 멀리 떨어져 위치하여, 형광단이 형광을 방출할 수 있도록 구성될 수 있다. 분석물과 상호작용하는 경우에, 상기 인디케이터 시스템의 구조가 변화하고, 형광단/소광인자 쌍은 형광단의 소광이 가능할 정도로 충분히 가깝게 이동된다. 여기에 서술된 바와 같이, 형광단/소광인자 쌍은 상기 쌍의 양 멤버 모두가, 동일하거나 또는 다른, 형광단인 경우를 포함하는 것으로 의도되지만, 인디케이터 시스템이 소광 구조로 되어 있는 경우에는, 근접 효과, 에너지 전달 등에 의하여 하나의 형광단이 다른 하나의 형광에 영향을 미친다.
많은 형광단/소광인자 쌍들이 공지되어 있고, 본 발명에 의하여 의도된다. 예를 들어, DABCYL은, 쿠마린 (coumarin), EDANS, 플루오레세인 (fluorescein), 루시퍼 옐로우 (Lucifer yellow), BODIPYTM에오신 (Eosine), 테트라메틸로다민 (tetramethylrhodamine), 텍사스 레드 (Texas RedTM) 등과 같은 많은 형광단들을 효과적으로 소광시키는 것으로 알려져 있다.
형광단으로부터 방출된 형광은 다양한 메카니즘을 통하여 소광될 수 있는 것으로 이해된다. 한 가지 방법은 형광단 및 소광인자 사이의 광유도된 전자 전달 (photoinduced electron transfer)을 통한 소광에 의한 것이다 (Acc. Chem. Res. 1994,27, 302-308을 참조, 참고문헌으로서 통합). 소광은 중원자 효과 (heavy atom effect)에 의하여 야기된, 또는 상자성 (paramagnetic) 금속 이온과의 상호작용으로 인한, 시스템간 교차 (intersystem crossing)를 통하여 발생될 수 있으며, 그러한 경우에 소광인자는 요오드와 같은 중원자, 또는 Cu2+와 같은 상자성 (paramagnetic) 금속 이온을 포함할 수 있다 (예를 들어,J.Am.Chem.Soc. 1985, 107, 7783-7784, 및J.Chem.Soc. Faraday Trans.,1992, 88, 2129-2137 참조, 양자는 참고문헌으로서 통합). 소광은 또한, 여기에 참고문헌으로서 통합된,Nature Biotechnology,1998, 16, 49-53에 서술된 바와 같이, 형광단 및 소광인자 사이의 바닥 상태 착물 형성 (ground state complex formation)을 통하여 발생될 수도 있다. 또다른 소광 메카니즘은 예를 들어, 여기에 참고문헌으로서 통합된,Meas.Sci. Technol. 10(1999) 127-136 및JACS2000,122, 10466-10467에 서술된 바와 같이, 형광 공명 에너지 전달 (fluorescence resonance energy transfer, FRET)을 포함한다.
본 발명의 검출 시스템에 유용한 또다른 부류의 부분들은 그 흡광 스펙트럼이 분자 구조에 있어서의 변화에 따라서 변화하는, Alizarin Red-S 등과 같은 것들을 포함한다.
본 발명에 사용되기에 적당한 인디케이터 시스템들은 다음과 같은 개략적인 구조들 중의 어느 하나를 포함하는 물질의 조성물들을 포함하며:
상기 식에서:
-R1은 상기 분석물에 대한 하나 또는 그 이상의 인식 요소들이고;
-R2는 ⅰ) 상기 분석물에 대한 하나 또는 그 이상의 인식 요소들, 또는 ⅱ) 선택적으로 표지된 리간드 요소이고;
-D1및 D2는 함께, 에너지 공여체/수용체 시스템을 포함하고, 상기 인디케이터 분자가 상기 분석물과 상호작용하는 경우에 농도 의존적인 방식으로 변화하는 검출가능한 성질을 갖는, 검출 시스템을 구성하거나, 또는 R2가 표지된 리간드 요소인 경우에는, D1및 D2가 부존재할 수도 있으며;
-L1및 L2는 동일하거나 또는 다르고, 상기 상호작용 및 검출가능한 성질 변화가 발생되는 것을 가능하게 할만큼 충분한 길이 및 구조를 갖는 연결기들을 포함하고; 또한
-Z는 L1및 L2사이의 공유 또는 비공유 결합이다.
인식 요소들, 리간드 요소, 및 검출 시스템은 이미 서술되어 있다. 연결기 L1및 L2는 언급한 상호작용 및 변화가 발생하는 것을 가능하게 할 정도로 충분한 길이 및 구조를 갖는다. 연결기들의 정확한 성질은 인디케이터 시스템의 다른 요소들의 구조에 의존한다는 것을 알 수 있다. 연결기들은, 실시예들에 나타낸 바와 같이, 가역적 분석물 검출 시스템 상호작용을 최적화하기 위하여 사용될 수 있는, 구조적 강도, 분자적 거리, 전하 상호작용 등을 고려하여 고안될 수 있다.
본 발명의 인디케이터 시스템의 Z 성분은 바람직하게는 L1및 L2사이의 공유결합을 나타낸다. 인디케이터 시스템은 단일 분자 또는 거대분자의 구조일 수 있다.
L1및 L2는 다양한 형태들을 취할 수 있다. 예를 들어, 적당한 연결기들은, 모든 선택적으로 치환된, 알킬, 아릴, 폴리아미드, 폴리에테르, 폴리아미노, 폴리에스테르 및 그 조합들을 포함한다.
본 발명의 인디케이터 시스템은, 가용성이라면, 필요한 경우에는 용액 형태로서 직접적으로 사용될 수 있다. 반면에, 인디케이터 시스템은, 원하는 적용상 요구되는 경우라면, 유리, 플라스틱, 폴리머 물질 등과 같은 비용해성 표면 또는 매트릭스 상에, 또는 그 내부에 (예를 들어, 기계적 포획 또는 공유 또는 이온 부착과 같은 것들에 의하여) 고정될 수 있다. 인디케이터 시스템이, 예를 들어 폴리머 내부에 포획된 경우에는, 상기 포획 물질은 바람직하게는 분석물에 대하여 충분히 투과성이 있어서, 분석물과 상기 인디케이터 시스템 사이의 적당한 상호작용을 가능하게 하는 것이어야 한다.
인디케이터가 물에 거의 용해되지 않거나 또는 비용해성이지만 수성 매질에서의 검출이 필요한 경우에는, 인디케이터 시스템은 친수성 모노머와 공중합되어, 2000년 8월 4일자로 출원되어 함께 계류 중이며, 그 내용이 여기에 참고문헌으로서 통합된, 미국특허출원 제09/632,624호에 개시된 바와 같은 친수성 거대분자를 형성할 수도 있다.
본 발명의 인디케이터 시스템은 화학적으로 많은 구조들을 취할 수 있다. 예를 들어, 전체 인디케이터 시스템이, 상대적으로 작은 크기의, 하나의 분자일 수있다. 또는, 인디케이터 시스템의 개별적 성분들은 거대분자의 부분일 수 있다. 후자의 경우에, 시스템의 성분들은 동일한 폴리머 내에 통합될 수 있거나, 또는 개별적인 가교화된 폴리머들과 결합될 수도 있다. 예를 들어, 형광단/리간드 요소 부가물 및 소광인자/인식 요소 부가물을 포함하는 개별적인 모노머들은 공중합되어 인디케이터 시스템 폴리머를 형성할 수도 있다 (실시예 5 참조). 다른 한편으로, 상기 모노머들은 개별적으로 중합되어 개별적인 폴리머 사슬을 형성할 수 있고, 이어서 가교화되어 인디케이터 시스템을 형성할 수 있다.
본 발명의 인디케이터에 대해 에너지, 의약 및 농업 분야에서의 인디케이터로서 사용되는 것을 포함하여, 많은 용도들이 존재한다. 예를 들어, 본 발명의 인디케이터 시스템은, 혈액 또는 뇨 중의 포도당의 미달-수준 (sub-levels) 또는 초과-수준 (supra-level)을 검출하는데 사용될 수 있으며, 따라서 당뇨병 및 부신저하증 (adrenal insufficiency)과 같은 질병들을 진단 또는 모니터링하기 위한 소중한 정보를 제공할 수 있다. 두 개의 인식 요소들을 갖는 본 발명의 인디케이터 시스템은, 알파-히드록시 산 (α-hydroxy acids) 또는 베타-디케톤 (β-diketones)의 잠재적 간섭량 (potentially interfering amounts)을 포함할 수 있는 용액 중의 포도당을 검출하는 데에 특히 유용하다 (2001년 1월 5일자로 출원되어 함께 계류 중인, 미국특허출원 제09/754,217호; 2001년 10월 18일자로 출원된 미국특허출원 제60/329,746호; 및 2001년 2월 21일자로 출원되고, 참고문헌으로서 통합된 미국특허출원 제60/269,887호, "알파-히드록시 산 또는 베타-디케톤을 포함하는 용액 중의 포도당의 검출 (Detection of glucose in solutions also containing an alpha-히드록시 acid or beta-diketone)" 참조). 인간 치료에의 응용을 위한 포도당의 의료적/약제학적 생산은 모니터링 및 조절을 필요로 한다.
농업에 있어서 본 발명의 용도는 대두 및 다른 농업 제품들에 있어서 포도당과 같은 분석물의 수준을 검출하는 것을 포함한다. 포도당은 포도주용 포도와 같은 고가 제품들에 대한 결정적인 수확 결정기에 주의 깊게 모니터링되어야만 한다. 발효 공정들에 있어서는 포도당이 가장 고가의 탄소원 및 원료이므로, 최적의 반응기 공급율 (reactor feed rate)조절을 위한 포도당 모니터링은 전력 알코올 생산 (power alcohol production)에 있어서 중요하다. 전세계적으로 가장 많은 양의 포도당 및 발효성 당류 (시스 디올 (cis-diol))를 소비하는, 청량 음료 및 발효 음료의 제조 공정 도중 반응기내 포도당 혼합 및 포도당 농도 조절 또한 매우 중요하다.
검출 시스템이 형광 지시 치환체들과 결합되는 경우에는, 본 발명의 시스템을 사용할 수 있는 다양한 검출 기술들이 또한 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 본 발명의 시스템은 형광 감지 장치들 (예를 들어, 미국특허 제5,517,313호) 중에서 사용될 수 있거나 또는 시각적인 검사를 위하여 시험 종이와 같은 폴리머 물질에 결합될 수 있다. 후자의 기술은, 예를 들어, 리트머스 종이 스트립으로 pH를 측정하는 것과 유사한 방식으로 포도당을 측정하는 것을 가능하게 한다. 여기에 서술된 시스템은 또한 Shimadzu, Hitachi, Jasco, Beckman 및 다른 회사들에 의하여 제조된 스펙트로플루오로미터 (spectrofluorometer) 또는 임상 분석기 (clinical analyzers)와 같은 표준 벤치탑 분석 기계들 (standard benchtopanalytical instruments)에서 간단한 시약으로서 사용될 수도 있다. 이러한 분자들은 또한 Ocean Optics (Dunedin, Florida) 또는 Oriel Optics에 의하여 제조된 광섬유-기초 센서들 (fiber optic-based sensors) 및 분석 플루오로미터에 대한 분석물 특이적 화학적/광학적 신호 변환을 제공할 수도 있다.
여기에 참고문헌으로서 통합된 미국특허 제5,517,313호는 본 발명의 시스템이 액체 매질 중의 포도당 또는 다른 시스-디올 화합물의 존재 또는 농도를 측정하는데 사용될 수 있는 형광 감지 장치를 개시하고 있다. 상기 감지 장치는 형광 인디케이터 시스템-함유 매트릭스 (fluorescent indicator system-containing matrix) (이하 "형광 매트릭스"이라 한다)의 층상 어레이, 고역 필터 (high-pass filter) 및 광검출기 (photodetector)를 포함한다. 이러한 장치에서, 광원, 바람직하게는 발광 다이오드 ("LED")는, 상기 인디케이터 물질 중에 최소한 부분적으로 위치하거나, 또는 인디케이터 매트릭스가 배치되는 파장가이드 (waveguide) 중에 위치함으로써, 광원으로부터의 입사 광선이 인디케이터 시스템으로 하여금 형광을 발하게 한다. 고역 필터는 방출된 빛이 광검출기에 도달하게 하는 동시에, 광원으로부터의 분산된 입사광을 여과 제거한다.
미국특허 제5,517,313호에 개시된 장치에 이용된 인디케이터 분자들의 형광은, 포도당 또는 다른 시스-디올 화합물과 같은 분석물의 국소적 존재에 의하여 조절, 예를 들어 완화 또는 증진된다.
미국특허 제5,517,313호에 개시된 센서에서, 인디케이터를 포함하는 물질은 분석물에 대하여 투과가 가능하다. 따라서, 분석물은 주변 시험 매질로부터 상기물질 내로 확산될 수 있으며, 따라서 인디케이터 시스템에 의하여 방출되는 형광에 영향을 준다. 광원, 인디케이터 시스템-함유 물질, 고역 필터 및 광검출기는 인디케이터 시스템에 의하여 방출된 형광의 최소한 일부가 광검출기와 충돌하여, 주변 매질 중의 분석물 (예를 들어, 포도당) 농도의 표지가 되는 전기적 신호를 발생시키는 구조로 되어 있다.
본 발명의 인디케이터 시스템을 사용하는 가능한 다른 구현예들에 따라서, 또한 감지 장치들이 미국특허 제5,910,661호, 제5,917,605호 및 제5,894,351호에 서술되어 있으며, 이들 모두는 여기에 참고문헌으로서 통합되어 있다.
본 발명의 시스템은 또한, 예를 들어 생체 내에서 (in vivo) 분석물 (예를 들어, 혈중 포도당 농도)을 지속적으로 모니터링하기 위한 이식가능한 (implantable) 장치에서도 사용될 수 있다. 적당한 장치들은, 예를 들어, 미국특허 제5,833,603호, 제6,002,954호 및 제6,011,984호뿐만 아니라, 여기에 참고문헌으로서 통합되고 1999년 8월 26일에 출원되어 함께 계류 중인 미국특허출원 제09/383,148호에도 서술되어 있다.
본 발명의 시스템은 당업자에 의하여 과도한 실험 없이도, 하기 서술된 일반적 공정들과 부합되는 반응 메카니즘들을 포함하여, 공지된 반응 메카니즘 및 시약들을 사용하여 제조될 수 있다.
실시예 1
N-2-[5-(N-4-디메틸아미노벤질)-5-[2-(보로노)벤질]아미노헥실]-[2-(보로노)벤질]아미노에틸-4-부틸아미노-1,8-나프탈이미드 (nBuF-헥사-Q 비스-보로네이트).
포도당 연구에서 사용된 유리 비스 보론산 산물은 MeOH/PBS 완충용액 시스템 중의 N-2-[5-(N-4-디메틸아미노벤질)-5-[2-(5,5-디메틸보리난-2-일)벤질]아미노헥실]-[2-(5,5-디메틸보리난-2-일)벤질]아미노에틸-4-부틸아미노-1,8-나프탈이미드의 용해에 의하여 얻은 것이다.
N-(2,2-디에톡시에틸)-4-브로모-1,8-나프탈이미드.
45 mL EtOH 중의 4-브로모-1,8-나프탈릭 무수물 (10.0 g, 36.1 mmol) 및 아미노아세트알데히드 디에틸 아세탈 (4.81 g, 5.26 mL, 36.1 mmol, 1 당량)의 현탁액을 45℃에서 3일 동안 교반하였다. 이때, 결과물인 현탁액을 여과하고, EtOH로 세척하고, 잔류물을 건조시켜 13.3 g (94%)의 옅은 갈색 고체 산물을 얻었다.
TLC: Merck 실리카 겔 60 플레이트 플레이트, Rf 0.17 with 98/2 CH2Cl2/CH3OH, UV (254/366)로 관찰.
HPLC: HP 1100 HPLC 크로마토그래프, Waters 5 x 100 mm NovaPak HR C18 컬럼, 0.050 mL 주입, 0.75 mL/min, 1.5 mL 주입 루프, 360 nm 검출, A = 물 (0.1% HFBA) 및 B = MeCN (0.1% HFBA), 농도구배 10% B로 2분, 10-80% B로 18분, 80-100% B로 2분, 100% B로 2분, 머무름 시간 24.2분.
N-(2,2-디에톡시에틸)-4-부틸아미노-1,8-나프탈이미드.
8 mL NMP 중의 N-(2,2-디에톡시에틸)-4-브로모-1,8-나프탈이미드 (0.797 g, 2.03 mmol) 및 n-부틸아민 (1.48 g, 2.00 mL, 20.2 mmol, 9.96 당량)의 용액을, 45℃에서 66시간 동안 가열하였다. 이때, 결과물인 현탁액을 25℃로 냉각시키고, 여과시켰다. 잔류물을 50 mL 에테르로 용해시키고, 3 x 50 mL의 물로 추출하였다.유기 추출물을 무수 Na2SO4상에서 건조시키고, 여과 및 농축시켜 황색 분말 조생성물을 얻었다. 조생성물을 실리카 겔 크로마토그래피 (25 g 중력급 (gravity grade) 겔, 0-1% CH3OH/CH2Cl2)에 의하여 정제하여 0.639 g (82%)의 황색 분말을 얻었다.
TLC: Merck 실리카 겔 60 플레이트, Rf 0.71 with 95/5 CH2Cl2/CH3OH, UV (254/366)로 관찰.
HPLC: HP 1100 HPLC 크로마토그래프, Waters 5 x 100 mm NovaPak HR C18 컬럼, 0.050 mL 주입, 0.75 mL/분, 1.5 mL 주입 루프, 450 nm 검출, A = 물 (0.1% HFBA) 및 B = MeCN (0.1% HFBA), 농도구배 10% B로 2분, 10-80% B로 18분, 80-100% B로 2분, 100% B로 2분, 머무름 시간 23.5분.
N-(2-옥소에틸)-4-부틸아미노-1,8-나프탈이미드.
25 mL 아세톤 중의 N-(2,2-디에톡시에틸)-4-부틸아미노-1,8-나프탈이미드 (0.622 g, 1.62 mmol) 및 p-톨루엔술폰산 모노 수화물 (0.010 g, 0.053 mmol, 0.032 당량)의 용액을, 25℃에서 18시간 동안 교반하였다. 이때, 용액을 농축시키고, 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피 (25 g 중력급 겔, 0-1% CH3OH/CH2Cl2)에 의하여 정제하여 0.470 g (94%)의 오렌지색 고체를 얻었다.
TLC: Merck 실리카 겔 60 플레이트, Rf 0.61 with 95/5 CH2Cl2/CH3OH, UV (254/366)로 관찰.
1H NMR (400 MHz, CDCl3); d 1.03 (t, 3H, J = 7.3 Hz), 1.53 (m, 2H), 1.78 (m, 2H), 3.38 (t, 2H, J = 7.2 Hz), 5.02 (s, 2H), 6.64 (d, 1H, J = 8.6 Hz), 7.52 (dd, 1H, J = 7.4, 8.3 Hz), 8.08 (dd, 1H, J = 1 Hz, 8.5 Hz), 8.38 (d, 1H, J = 8.3 Hz), 8.46 (dd, 1 H, J = 1.0, 7.3 Hz), 9.75 (s, 1H).
HPLC: HP 1100 HPLC 크로마토그래프, Waters 5 x 100 mm NovaPak HR C18 컬럼, 0.050 mL 주입, 0.75 mL/분, 1.5 mL 주입 루프, 450 nm 검출, A = 물 (0.1% HFBA) 및 B = MeCN (0.1% HFBA), 농도구배 10% B로 2분, 10-80% B로 18분, 80-100% B로 2분, 100% B로 2분, 머무름 시간 19.6분.
N-(4-디메틸아미노벤질)-1,6-디아미노헥산.
20 mL 무수 EtOH 중의 4-디메틸아미노벤즈알데히드 (1.00 g, 6.70 mmol), Na2SO4(6.70 g, 47.2 mmol, 7.04 당량) 및 1,6-디아미노헥산 (3.89 g, 33.5 mmol, 5.00 당량)의 현탁액을, 질소 기체 하의 25℃ 암실에서 18 시간 동안 교반하였다. 이때, 용액을 여과시키고, 여과물에 NaBH4(1.73 g, 45.8 mmol, 6.84 당량)를 가하였다. 현탁액을 25℃에서 5시간 동안 교반하였다. 이때, 반응 혼합물을 농축시키고, 잔류물을 50 mL 물에 용해시키고, 3 x 50 mL의 에테르 중에서 추출하였다. 결합된 유기 추출물을 2 x 50 mL의 물 중에서 세척하였다. 결합된 수성 추출물을 2 x 50 mL의 에테르 중에서 추출하였다. 결합된 유기 추출물을 Na2SO4상에서 건조시키고, 여과 및 농축시켜 1.35 g (81%)의 점성 오일을 얻었다.
TLC: Merck 실리카 겔 60 플레이트, Rf 0.58 with 80/15/5 CH2Cl2/CH3OH/iPrNH2, 닌히드린 염색, UV (254/366)로 관찰.
HPLC: HP 1100 HPLC 크로마토그래프, Waters 5 x 100 mm NovaPak HR C18 컬럼, 0.050 mL 주입, 0.75 mL/분, 1.5 mL 주입 루프, 280 nm 검출, A = 물 (0.1% HFBA) 및 B = MeCN (0.1% HFBA), 농도구배 10% B로 2분, 10-80% B로 18분, 80-100%B로 2분, 100% B로 2분, 머무름 시간 13.3분.
N-2-[5-(N-4-디메틸아미노벤질)아미노헥실]아미노에틸)-4-부틸아미노-1,8-나프탈이미드.
25 mL 무수 MeOH 중의 N-(2-옥소에틸)-4-부틸아미노-1,8-나프탈이미드 (0.346 g, 1.11 mmol)의 현탁액에, 20 mL 무수 MeOH 중의 N-(4-디메틸아미노벤질)-1,6-디아미노헥산 (0.554 g, 2.22 mmol, 2.00 당량) 및 아세트산 (0.067 g, 1.1 mmol, 1.0 당량)의 용액을 가하였다. 이러한 용액에, 5 mL 무수 MeOH 중의 NaCNBH3(0.070 g, 1.1 mmol, 1.0 당량)의 용액을 가하였다. 반응 혼합물을 25℃에서 15시간 동안 교반하였다. 이때, MeOH을 회전 증발에 의하여 제거하고, 잔류물을 30 mL의 물 중에 용해시켰다. 용액을 1 N HCl로 pH 2로 조정하고, 25℃에서 1시간 동안 교반하였다. 이때, 용액을 1 N NaOH로 pH 12로 조정하고, 3 x 50 mL CH2Cl2중에서 연이어 추출하였다. 결합된 유기 추출물을 3 x 50 mL의 물 중에서 세척하고, 무수 Na2SO4상에서 건조시키고, 여과 및 농축시켜 갈색 오일 조생성물을 얻었다. 조생성물을 실리카 겔 크로마토그래피 (35 g 플래시급 겔, 0-50% CH3OH/CH2Cl2, 다음으로 45/50/5 CH3OH/CH2Cl2/iPrNH2)에 의하여 정제하여, 0.190 g (32%)의 디아민 산물을 얻었다.
FAB MS: 계산치 C33H45N5O2[M]+544; 실험치 [M]+544.
TLC: Merck 실리카 겔 60 플레이트, Rf 0.42 with 80/20 CH2Cl2/CH3OH, 닌히드린 염색 및 UV (254/366)로 관찰.
HPLC: HP 1100 HPLC 크로마토그래프, Waters 5 x 100 mm NovaPak HR C18 컬럼, 0.050 mL 주입, 0.75 mL/분, 1.5 mL 주입 루프, 450 nm 검출, A = 물 (0.1% HFBA) 및 B = MeCN (0.1% HFBA), 농도구배 10% B로 2분, 10-80% B로 18분, 80-100% B로 2분, 100% B로 2분, 머무름 시간 17.6분.
N-2-[5-(N-4-디메틸아미노벤질)-5-[2-(5,5-디메틸보리난-2-일)벤질]아미노헥실]-[2-(5,5-디메틸보리난-2-일)벤질]아미노에틸-4-부틸아미노-1,8-나프탈이미드.
5 mL CHCl3중의 N-2-[5-(N-4-디메틸아미노-벤질)아미노헥실]아미노에틸)-4-부틸아미노-1,8-나프탈이미드 (0.150 g, 0.276 mmole) 및 DIEA (0.355 g, 0.478 mL, 2.81 mmole, 10.0 당량)의 용액에, 2 mL CHCl3중의 (2-브로모메틸페닐)보론산 네오펜틸 에스테르 (0.390 g, 1.38 mmole, 5.00 당량)의 용액을 가하였다. 연이어, 용액을 25℃에서 27시간 동안 교반하였다. 이때, 혼합물을 농축시키고, 잔류물을 알루미나 컬럼 크로마토그래피 (100 g 활성화된 중성 알루미나, 0-5% CH3OH/CH2Cl2)에 의하여 정제하여, 0.024 g (19%)의 점성 갈색 오일을 얻었다.
FAB MS (글리세롤 매트릭스): 계산치 C53H67B2N5O8[M]+924 (보론산의 비스 네오펜틸 에스테르 대신에 비스 글리세롤 부가물); 실험치 [M]+924.
TLC: Merck 중성 알루미나 플레이트, Rf 0.62 with 80/20 CH2Cl2/CH3OH, UV (254/366)로 관찰.
HPLC: HP 1100 HPLC 크로마토그래프, Waters 5 x 100 mm NovaPak HR C18 컬럼, 0.050 mL 주입, 0.75 mL/분, 1.5 mL 주입 루프, 450 nm 검출, A = 물 (0.1% HFBA) 및 B = MeCN (0.1% HFBA), 농도구배 10% B로 2분, 10-80% B로 18분, 80-100% B로 2분, 100% B로 2분, 머무름 시간 20.7분.
nBuF-자일렌-Q 비스-보로네이트:
N-2-[4-(N-4-디메틸아미노벤질)-[2-(보로노)벤질]아미노-메틸]벤질-[2-(보로노)벤질]아미노에틸-4-부틸아미노-1,8-나프탈이미드 (nBuF-자일렌-Q 비스-보로네이트).
본 화합물은, 1-[N-(4-디메틸아미노벤질)아미노]메틸-4-아미노메틸벤젠을 디아민 커플링 파트너로 사용하여, N-2-[5-(N-4-디메틸아미노벤질)-5-[2-(보로노)벤질]-아미노헥실]-[2-(보로노)벤질]아미노에틸-4-부틸아미노-1,8-나프탈이미드 (nBuF-헥사-Q-비스 보로네이트)와 비슷한 방식으로 제조되었다.
대조군 인디케이터 분자 (Control Indicator Molecule):
nBuF 모노-보로네이트:
N-2-(카르복시메틸)-2-[2-(보로노)벤질]아미노에틸-4-부틸아미노-1,8-나프탈이미드 (nBuF 모노-보로네이트)
N-2-(tert-부톡시카르보닐)아미노에틸-4-브로모-1,8-나프탈이미드.
20 mL EtOH 중의 4-브로모-1,8-나프탈릭 무수물 (1.00 g, 3.61 mmol) 및 N-(tert-부톡시카르보닐)-1,2-디아미노에탄 (0.578 g, 3.61 mmol, 1.00 당량)의 현탁액을 45℃에서 2시간 동안 교반하였다. 이때, 온도를 15분에 걸쳐 150℃로 올려주었다. 이어서, 반응 혼합물을 25℃까지 냉각시키고, 15 시간 동안 더 교반하였다.이때, 결과물인 현탁액을 여과하고, EtOH로 세척하고, 잔류물을 건조시켜 1.03 g (68%)의 옅은 갈색 고체 산물을 얻었다.
TLC: Merck 실리카 겔 60 플레이트 플레이트, Rf 0.63 with 95/5 CH2Cl2/CH3OH, UV (254/366)로 관찰.
N-2-(tert-부톡시카르보닐)아미노에틸-4-부틸아미노-1,8-나프탈이미드.
5 mL NMP 중의 N-2-(tert-부톡시카르보닐)아미노에틸-4-브로모-1,8-나프탈이미드 (0.900 g, 2.15 mmol) 및 n-부틸아민 (0.786 g, 1.06 mL, 10.7 mmol, 5.01 당량)의 용액을, 45℃에서 17시간 동안 가열하였다. 이때, n-부틸아민 (0.786 g, 1.06 mL, 10.7 mmol, 5.01 당량)의 2번째 분획을 가하였다. 결과물인 용액을 25℃에서 23시간 이상 교반하였다. 이때, 혼합물을 진공 중에서 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피 (50 g 중력급 겔, 0%, 다음으로 4% CH3OH/CH2Cl2단계적 농도구배)에 의하여 정제하여, 잔류 NMP를 포함하는 0.97 g의 끈적끈적한 황색 고체를 얻었다. 산물은 그 상태로 이후 반응을 수행하였다.
FAB MS: 계산치 C23H29N3O4[M]+411; 실험치 [M]+411.
TLC: Merck 실리카 겔 60 플레이트, Rf 0.5 with 95/5 CH2Cl2/CH3OH, UV (254/366)로 관찰.
N-2-아미노에틸-4-부틸아미노-1,8-나프탈이미드 모노 TFA 염.
20 mL의 20% 트리플루오로아세트산/CH2Cl2중의 N-2-(tert-부톡시카르보닐)아미노에틸-4-브로모-1,8-나프탈이미드 (0.92 g, 2.24 mmol)의 용액을 25℃에서 19시간 동안 교반하였다. 이때, 반응 혼합물을 질소 기체의 흐름 하에서 농축하였다. 잔류물을 에테르를 사용하여 분쇄하고, 결과물인 고체를 진공 중에서 건조시켜 0.772 g (81%)의 오렌지색 분말을 얻었다.
FAB MS: 계산치 C18H21N3O2[M]+311; 실험치 [M + 1]+312.
HPLC: HP 1100 HPLC 크로마토그래프, Vydac 201TP 10 x 250 mm 컬럼, 0.100 mL 주입, 2 mL/분, 450 nm 검출, A = 물 (0.1% HFBA) 및 B = MeCN (0.1% HFBA), 농도구배 10% B로 2분, 10-80% B로 18분, 80-100% B로 2분, 100% B로 2분, 머무름 시간 19.5분.
N-2-[(tert-부톡시카르보닐)메틸]아미노에틸-4-부틸아미노-1,8-나프탈이미드.
2.5 mL CH2Cl2중의 N-2-아미노에틸-4-부틸아미노-1,8-나프탈이미드 모노 TFA 염 (0.99 g, 0.23 mmol), DIEA (0.167 g, 0.225 mL, 1.29 mmol, 5.55 당량) 및 tert-부틸 브로모아세테이트 (0.032 g, 0.024 mL, 0.16 mmol, 0.70 당량)를 25℃에서 23시간 동안 교반하였다. 이때, 25 mL의 CH2Cl2를 가하고, 용액을 1 x 25 mL의 포화 NaHCO3로 세척하고, 유기 추출물을 무수 Na2SO4상에서 건조시키고, 여과 및 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피 (15 g 중력급 겔, 0%-4% CH3OH/CH2Cl2)에 의하여 정제하여 0.051 g (73%)의 황색 유리질 고체를 얻었다.
TLC: Merck 실리카 겔 60 플레이트, Rf 0.27 with 95/5 CH2Cl2/CH3OH, UV(254/366)로 관찰.
N-2-[(tert-부톡시카르보닐)메틸]-2-[2-(5,5-디메틸보리난-2-일)벤질]아미노에틸-4-부틸아미노-1,8-나프탈이미드.
10 mL CH2Cl2중의 N-2-[(tert-부톡시카르보닐)메틸]-아미노에틸-4-부틸아미노-1,8-나프탈이미드 (0.0.051 g, 0.0.12 mmole), DIEA (0.78 g, 0.11 mL, 0.60 mmole, 5.0 당량) 및 (2-브로모메틸페닐)보론산 네오펜틸 에스테르 (0.083 g, 0.29 mmole, 2.4 당량)의 용액을 25℃에서 72시간 동안 교반하였다. 이때, 혼합물을 농축시키고, 실리카 겔 크로마토그래피 (10 g 중력급 겔, 0-1% CH3OH/CH2Cl2)에 의하여 정제하여, 0.035 g (47%)의 유리질 오렌지색 고체를 얻었다. 산물은 그 상태로 이후 반응을 수행하였다.
TLC: Merck 실리카 겔 60 플레이트, Rf 0.39 with 95/5 CH2Cl2/CH3OH, UV(254/366)로 관찰.
N-2-(카르복시메틸)-2-[2-(보로노)벤질]아미노에틸-4-부틸아미노-1,8-나프탈이미드 (nBuF 모노-보로네이트).
20% TFA/CH2Cl25 mL 중의 N-2-[(tert-부톡시카르보닐)메틸]-2-[2-(5,5-디메틸보리난-2-일)벤질]아미노에틸-4-부틸아미노-1,8-나프탈이미드 (0.035 g, 0.056 mmol)의 용액을 25℃에서 16시간 동안 교반하였다. 이때, 용액을 질소 기체의 흐름 하에서 농축시키고, 잔류물을 에테르로 분쇄하여 오렌지색 고체를 얻었다. 조생성물을 실리카 겔 크로마토그래피 (8 g 중력급 겔, 0-5% CH3OH/CH2Cl2)에 의하여 정제하여 0.011 g (39%)의 황색/오렌지색 고체를 얻었다.
FAB MS: 계산치 C30H34BN3O7[M]+559 (모노 글리세롤 부가물); 실험치 [M+1]+560.
TLC: Merck 실리카 겔 60 플레이트, Rf 0.26 with 95/5 CH2Cl2/CH3OH, UV(254/366)로 관찰.
형광의 조절
본 실시예에서 제조된 3가지 화합물들의 포도당에 의한 형광의 조절을 측정하였다. 도 1은, 0-20 mM 포도당을 포함하는 70/30 MeOH/PBS 중의 nBuF-헥사-Q 비스-보로네이트 ("헥사-Q") 인디케이터 (0.015 mM), nBuF-자일렌-Q 비스-보로네이트 ("자일렌 Q") 인디케이터 (0.049 mM) 및 nBuF 모노-보로네이트 대조군 인디케이터 (0.029 mM)의 용액에 대한 정규화된 형광 방출 (I/Io @ 535 nm)을 나타낸 것이다. 스펙트럼은, 450 nm에서 여기; 1.5 nm에서 여기 슬릿; 1.5 nm에서 방출 슬릿; 주위 온도의 Shimadzu RF-5301 스펙트라플루오로미터를 사용하여 기록되었다. 오차 바들은 각각의 데이터 지점에 대하여 3개 실험 값 (triplicate values)의 표준 편차이었다.
상기 데이터는 nBuF 모노-보로네이트 인디케이터 화합물의 형광이 포도당의 존재에 의하여 영향을 받지 않는다는 것을 보여준다. nBuF-자일렌-Q 비스-보로네이트 인디케이터 화합물의 형광은 포도당에 의해서는 거의 영향을 받지 않고, nBuF-헥사-Q 비스-보로네이트 인디케이터 화합물의 형광은 0-5 mM 범위 내의 포도당에 의하여 크게 영향을 받았다. 포도당의 부존재 하에서, 헥사-Q 화합물 중의 상대적으로 유연한 헥사메틸렌 결합은, N-4-디메틸아미노벤질 소광기가 나프탈이미드 형광단에 충분히 가깝게 근접하여, 후자의 형광을 효과적으로 소광시키는 것을 가능하게 하는 것으로 여겨진다. 포도당의 존재 시에는, 보론산 인식 요소들 양자 모두가 포도당 결합에 참여하는 것으로 예상되고, 따라서 인디케이터의 분자적 구조를 변화시키고 형광단과 소광인자를 충분히 분리시킴으로써 형광 방출이 탈소광되게 한다. 동일한 효과가 자일렌-Q 화합물에 대하여도 관찰되지만, 자일렌 연결기가 덜 유연하므로 그 효과는 훨씬 덜하고, 따라서 포도당 결합 시에 형광단과 소광인자 사이의 분리가 덜 일어나게 된다.
대조군 화합물은 형광단을 포함하지만, 소광인자는 포함하지 않는다. 대조군은 포도당의 부존재 시에 형광을 방출하며, 포도당이 부가되는 경우에도 조절되지 않는다.
실시예 2
아미노에톡시F-헥사-Q 비스-보로네이트:
N-2-[5-(N-4-디메틸아미노벤질)-5-[2-(보로노)벤질]-아미노헥실]-[2-(보로노)벤질]아미노에틸-4-[2-(2-아미노에톡시)에톡시에틸)아미노-1,8-나프탈이미드 (아미노에톡시F-헥사-Q 비스-보로네이트).
본 화합물은 하기 변형을 거쳐, N-2-[5-(N-4-디메틸아미노벤질)-5-[2-(보로노)벤질]아미노헥실]-[2-(보로노)벤질]아미노에틸-4-부틸아미노-1,8-나프탈이미드 (nBuF-헥사-Q 비스-보로네이트)와 유사한 방식으로 제조되었다. 1,8-나프탈이미드 부분의 4-브로모 위치는, 디아민 중간 물질의 비스 벤질보론화가 완료된 이후에 2-(2-아미노에톡시)에톡시에틸)아미노기로 변환되었다. 이러한 최종 단계는, N-(2,2-디에톡시에틸)-4-부틸아미노-1,8-나프탈이미드의 합성에 있어서 부틸 아민 첨가 반응 조건과 유사한 조건 하에서 브롬화물에 2,2'-(에틸렌디옥시)비스(에틸아민)을 첨가함으로써 수행되었다.
아미노에톡시F-헥사-C 비스-보로네이트:
N-2-[5-벤질-5-[2-(보로노)벤질]아미노헥실]-[2-(보로노)벤질]아미노에틸-4-[2-(2-아미노에톡시)에톡시에틸)아미노-1,8-나프탈이미드 (아미노에톡시F-헥사-C 비스-보로네이트).
본 화합물은, N-벤질-1,6-디아미노헥산을 디아민 커플링 파트너로 사용하여, N-2-[5-(N-4-디메틸아미노벤질)-5-[2-(보로노)벤질]아미노헥실]-[2-(보로노)벤질]아미노에틸-4-[2-(2-아미노에톡시)에톡시에틸)아미노-1,8-나프탈이미드 (아미노에톡시F-헥사-Q 비스-보로네이트)와 유사한 방식으로 제조되었다.
형광의 조절
본 실시예에서 제조된 두 가지 화합물들에 대한, 포도당에 의한 형광의 조절을 측정하였다. 도 2는 0-20 mM 포도당을 포함하는 70/30 MeOH/PBS 중의 아미노에톡시F-헥사-Q-비스 보로네이트 인디케이터 (0.197 mM) 및 아미노에톡시F-헥사-C-비스 보로네이트 대조군 인디케이터 용액의 정규화된 형광 방출 (I/Io @ 535 nm)을보여준다. 스펙트럼은, 450 nm에서 여기; 1.5 nm에서 여기 슬릿; 1.5 nm에서 방출 슬릿; 주위 온도의 Shimadzu RF-5301 스펙트라플루오로미터를 사용하여 기록되었다. 오차 바들은 각각의 데이터 지점에 대하여 2개 실험 값 (duplicate values)의 표준 편차이었다.
상기 데이터는 헥사-C 인디케이터 화합물의 형광이 포도당의 존재에 의하여 영향을 받지 않고, 헥사-Q 인디케이터 화합물의 형광은 0-10 mM의 범위 내에서 포도당에 의하여 크게 영향을 받는다는 것을 보여준다. 포도당의 부존재 하에서, 헥사-Q 화합물 중의 상대적으로 유연한 헥사메틸렌 결합은, N-4-디메틸아미노벤질 소광기가 나프탈이미드 형광단에 충분히 가깝게 근접하여, 후자의 형광을 효과적으로 소광시키는 것을 가능하게 하는 것으로 여겨진다. 포도당의 존재 시에는, 보론산 인식 요소들 양자 모두가 포도당 결합에 참여하는 것으로 기대되고, 따라서 인디케이터의 분자적 구조를 변화시키고 형광단과 소광인자를 충분히 분리시킴으로써 형광 방출이 탈소광되게 한다.
헥사-C 화합물은 헥사-Q 화합물과 동일하지만, 효과적인 나프탈 이미드 형광단의 소광에 필요한 디메틸아미노기를 갖지 않는다. 헥사-C 화합물은 포도당의 부존재 시에 형광을 방출하며, 이는 포도당이 부가되는 경우에도 조절되지 않는다.
하기 실시예 3-5는 인디케이터 시스템이 보론산 인식 요소 및 카테콜 리간드 요소를 포함하는 경우의 포도당 감지 방법에 대해 서술한다. 이러한 방법의 일반적 원칙은 하기 식에 의하여 설명될 수 있으며:
상기 식에서,
공여체는 형광단이고, 수용체는 형광단 또는 소광인자이고;
공여체 및 수용체는, 공여체로부터의 에너지가 수용체로, 분자 거리 의존적 방식에 의하여 전달될 수 있도록 선택되고;
L1,L2L3, 및 L4는 독립적으로 약 3 내지 약 20개의 연속적인 원자들을 갖는 화학적 연결기들이고, 제한되는 것은 아니지만, 하기 치환 또는/및 비-치환된 화학기들을 포함하고 (지방족, 방향족, 아미노, 아미드, 술포, 카르보닐, 케톤, 술폰아미드 등);
R은 하나 또는 두 개의 페닐보론산기들을 포함하는 포도당 인식 요소이고;
RR은, 예를 들어 방향족 디올 (예를 들어, 카테콜), 락테이트, 알파-히드록시산, 타르타르산, 말산, 포도당, 디에탄올아민, 폴리히드록시 인접 디올 (모두 선택적으로 치환) 등과 같은 R의 페닐보론산 유도체들과 가역적인 에스테르 결합을 형성할 수 있는 화학기이고;
L3-6및 P1-2는 선택적 기들로서, 독립적으로 존재할 수 있고;
L5및 L6는 연결기 L1-4에 대하여 정의된 것과 같은 연결기들, 또는, 예를 들어 아크릴아미드, 아크릴레이트, 폴리글리콜, 또는 다른 친수성 폴리머를 포함하는 폴리머 사슬이고; 또한
P1및 P2는 친수성 또는 소수성 폴리머들이다.
R 및 RR이 유리 용액 내에서 상호작용이 가능하거나, 또는 친수성 폴리머에 적당하게 고정된 경우에는, 공여체 및 수용체는 서로에 대하여 충분히 가깝게 배치됨으로써, 공여체로부터 수용체로의 상대적으로 효율적인 에너지 전달이 (예를 들어, FRET, 충돌 에너지 전달 등을 통하여) 가능하게 된다. 포도당이 용액에 가해지면, 포도당은 R(보로네이트)의 결합에 대하여 RR과 경쟁하여, RR-R ↔RR + R 평형에 있어서 우측으로의 시프트를 야기하게 된다. 용액 중에서 유리 상태로 존재하거나 또는 상대적으로 길고 유연한 연결기들을 사용하여 폴리머 상에 고정되는 경우에는, R-공여체 및 RR-수용체 부분들은 서로에 대하여 멀리 떨어질 수 있고, 공여체 및 수용체 사이의 에너지 전달 효율이 감소하여, 증가된 형광 방출을 야기하게 된다.
실시예 3
N-α-(3-보로네이토-5-니트로)벤조일-N-ε-(4-디메틸아미노-3,5-디니트로)벤조일라이신 (소광인자-보론산 부가물)의 존재 하에서, 인산염 완충 식염수 중의 N-(5-메톡시카르보닐-5-[3,4-디히드록시벤즈아미도]펜틸)-N'-(5-플루오레세이닐)티오유레아 (플루오레세인-카테콜 부가물)의 형광 방출에 대한 포도당의 효과.
N-α-(3,4-디히드록시벤조일)-N-ε-t-BOC-라이신 메틸 에스테르:
3,4-디히드록시 벤조산 (820 mg, 5.3 mmole) 및 N-ε-t-BOC-라이신 메틸 에스테르 (1.38 g, 5.31 mmole)를 50 mL EtOAc/THF (1/1, 무수) 중에 용해시켰다. 디시클로헥실카르보디이미드 (1.24 g, 6 mmole)를 상기 용액에 가하였다. 반응 혼합물을 24시간 동안 교반하고, 여과하고, 용매를 증발시켰다. 얻어진 고체를 EtOAc (50 mL)에 용해시키고, 인산염 완충용액 (200 mM, pH=6.5) 2x50 mL로 추출하였다. 에틸 아세테이트 용액을 염수로 세척하고, 분리하고, Na2SO4로 건조시키고, 증발시켜 1.89 g의 고체 (90% 수율)를 얻었다. 화합물은 TLC에 의하여 순수하였으며, 그 상태로 다음 단계에 사용되었다.
N-α-(3,4-디히드록시벤조일)-라이신 메틸 에스테르 트리플루오로아세테이트 염:
N-α-(3,4-디히드록시벤조일)-N-ε-t-BOC-라이신 메틸 에스테르 (840 mg, 2.12 mmole)를, 10 mL의 CH2Cl2, 3 mL의 트리플루오로아세트산, 및 1 mL의 트리이소프로필실란과 결합시켰다. 실온에서 밤새도록 교반한 후에, 용액을 증발시키고, 결과 잔류물을 에테르로 세척하고, 진공 하에서 건조시켰다. 수율 808 mg (93%).
HPLC: HP 1100 HPLC 크로마토그래프, Waters 5 x 100 mm NovaPak HR C18 컬럼, 0.100 mL 주입, 0.75 mL/분, 2 mL 주입 루프, 370 nm 검출, A = 물 (0.1% HFBA) 및 B = MeCN (0.1% HFBA), 농도구배 10% B로 2분, 10-80% B로 18분, 80-100%B로 2분, 100% B로 2분, 머무름 시간 10.78분.
N-(5-메톡시카르보닐-5-[3,4-디히드록시벤즈아미도]펜틸)-N'-(5-플루오레세이닐)티오유레아:
N-α-(3,4-디히드록시벤조일)-라이신 메틸 에스테르 트리플루오로아세테이트 염 (60 mg, 0.146 mmole), 플루오로세인 이소티오시아네이트 (50 mg, 0.128 mmole), 및 디이소프로필에틸아민 (129 mg, 1 mmole)을 1 mL의 무수 DMF와 결합시켰다. 반응물을 5시간 동안 교반하고, 용매를 증발시켰다. 잔류물을, CH2Cl2/MeOH (부피로 80/20)를 용출액으로 갖는 SiO2(10 g) 상의 크로마토그래피에 가하였다. 분리된 산물 - 68 mg, (77 % 수율).
FAB MS: 계산치 C35H31N3O10S M=685; 실험치 M+1=686.
HPLC: HP 1100 HPLC 크로마토그래프, Waters 5 x 100 mm NovaPak HR C18 컬럼, 0.100 mL 주입, 0.75 mL/분, 2 mL 주입 루프, 370 nm 검출, A = 물 (0.1% HFBA) 및 B = MeCN (0.1% HFBA), 농도구배 10% B로 2분, 10-80% B로 18분, 80-100%B로 2분, 100% B로 2분, 머무름 시간 16.59분.
N-α-(3-보로네이토-5-니트로)벤조일-N-ε-t-BOC-라이신 메틸 에스테르:
(3-카르복시-5-니트로페닐)보론산 (536 mg, 2.54 mmole), N-ε-t-BOC-라이신 메틸 에스테르 염산염 (776 mg, 2.61 mmole), 및 디페닐포스포릴 아지드 (718 mg, 2.6 mmole)를, 5 mL의 무수 DMF와 결합시켰다. 디이소프로필에틸아민 (1.3 mL, 7.5 mmole)을 DMF 용액에 가하였다. 용액을 실온에서 24시간 동안 교반하였다. DMF를 진공 중에 증발시키고, 잔류물을 50 mL의 EtOAc에 용해시키고, EtOAc 용액을 H2O (3x 50 mL)로 추출하였다. 염수로 추출한 후에, 유기상을 분리하고, Na2SO4로 건조시키고, 용매를 증발시켜 880 mg의 산물을 제조하였다 (76 % 수율). 산물은 그 상태로 다음 단계에 사용되었다.
HPLC: HP 1100 HPLC 크로마토그래프, Waters 5 x 100 mm NovaPak HR C18 컬럼, 0.050 mL 주입, 0.75 mL/분, 1.5 mL 주입 루프, 450 nm 검출, A = 물 (0.1% HFBA) 및 B = MeCN (0.1% HFBA), 농도구배 10% B로 2분, 10-80% B로 18분, 80-100%B로 2분, 100% B로 2분, 머무름 시간 17.87분.
N-α-(3-보로네이토-5-니트로)벤조일-라이신 메틸 에스테르 트리플루오로아세테이트 염:
N-α-(3-보로네이토-5-니트로)벤조일-N-ε-t-BOC-라이신 메틸 에스테르 (800 mg, 1.76 mmole)를, 10 mL의 CH2Cl2, 3 mL의 트리플루오로아세트산, 및 1 mL의 트리이소프로필실란과 결합시켰다. 실온에서 밤새도록 교반한 후에, 용액을 증발시키고, 결과 잔류물을 에테르로 세척하고, 진공 하에서 건조시켰다. 수율 715 mg (87%). 산물은 그 상태로 다음 단계에 사용되었다.
N-α-(3-보로네이토-5-니트로)벤조일-N-ε-(4-디메틸아미노-3,5-디니트로)벤조일라이신 메틸 에스테르.
25℃, 3 mL DMF 중의 N-α-(3-보로네이토-5-니트로)벤조일-라이신 메틸 에스테르 트리플루오로아세테이트 염 (0.198 g, 0.42 mmole), DIEA (0.167 g, 0.225 mL, 1.29 mmole, 3.05 당량), 4-디메틸아미노-3,5-디니트로벤조산 (0.120 g, 0.47 mmol, 1.11 당량) 및 디페닐포스포릴아지드 (0.130 g, 0.47 mmole, 1.11 당량)의 용액을, 암실에서 23시간 동안 교반하였다. 이때, 50 mL EtOAc를 가하고, 용액을 100 mM 인산염 완충용액 (pH 6.5)의 2 x 20 mL 분획 중에서 세척하고, 다음으로 1 x 25 mL NaCl (포화 수성 용액) 중에서 세척하였다. 유기 추출물을 무수 Na2SO4상에서 건조시키고, 여과하고, 농축하여 오렌지색 고체 조생성물을 얻었다. 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (10 g 중력급 겔, 0-5% CH3OH/CH2Cl2)로 정제하여 0.0974 g (39%)의 황색-오렌지색 고체를 얻었다. 산물은 그 상태로 다음 단계에 사용되었다.
TLC: Merck 실리카 겔 60 플레이트, Rf 0.60 with 80/20 CH2Cl2/CH3OH, UV (254/366)로 관찰
HPLC: HP 1100 HPLC 크로마토그래프, Waters 5 x 100 mm NovaPak HR C18 컬럼, 0.050 mL 주입, 0.75 mL/분, 1.5 mL 주입 루프, 450 nm 검출, A = 물 (0.1% HFBA) 및 B = MeCN (0.1% HFBA), 농도구배 10% B로 2분, 10-80% B로 18분, 80-100%B로 2분, 100% B로 2분, 머무름 시간 18.91분.
N-α-(3-보로네이토-5-니트로)벤조일-N-ε-(4-디메틸아미노-3,5-디니트로)벤조일라이신.
1:1의 Na2CO3(0.2 M 수성):EtOH 4 mL 중의 N-α-(3-보로네이토-5-니트로)벤조일-N-ε-(4-디메틸아미노-3,5-디니트로)벤조일라이신 메틸 에스테르 (0.095 g, 0.16 mmole)의 용액을, 25℃에서 1시간 동안 교반하였다. 이때, 혼합물을 진공 중에서 농축시키고, 25 mL의 5 % TFA/CH2Cl2를 가하였다. 혼합물을 2 x 10 mL의 물로 세척하고, 유기층에 5% TFA/CH2Cl225 mL를 더 가하였다. 유기 추출물을 무수 Na2SO4상에서 건조시키고, 여과 및 농축하여 0.088 g (95%)의 오렌지색 분말을 얻었다.
FAB MS: 글리세롤 매트릭스; 계산치 C25H29BN6013(모노 글리세롤 부가물) [M]+632; 실험치 [M + 1]+633.
HPLC: HP 1100 HPLC 크로마토그래프, Waters 5 x 100 mm NovaPak HR C18 컬럼, 0.050 mL 주입, 0.75 mL/분, 1.5 mL 주입 루프, 450 nm 검출, A = 물 (0.1% HFBA) 및 B = MeCN (0.1% HFBA), 농도구배 10% B로 2분, 10-80% B로 18분, 80-100% B로 2분, 100% B로 2분, 머무름 시간 17.66분.
형광 조절
도 3은 30 μM의 소광인자-보론산 부가물을 포함하는 PBS 중의 플루오레세인-카테콜 부가물의 2 μM 용액에 대한 형광 방출 (518nm에서의 I)을 나타낸 것이다. 포도당의 농도는 0-160 mM로 변화되었다. 스펙트럼은, 495 nm에서 여기; 3 nm에서 여기 슬릿; 5 nm에서 방출 슬릿; 저 PMT 감도, 주위 온도의 Shimadzu RF-5301 스펙트라플루오로미터를 사용하여 기록되었다. 소광은 포도당의 부가에 따라서 감소되었다.
실시예 4
N-α-(3-보로네이토-5-니트로)벤조일-N-ε-(4-디메틸아미노-3,5-디니트로)벤조일-라이신 (소광인자-보론산 부가물)의 존재 하에서, 인산염 완충 식염수 중의 N-α-(3,4-디히드록시벤조일)-N-ε-(5-디메틸아미노나프탈렌-1-술포닐)-라이신 (DANSYL-카테콜 부가물)의 형광 방출에 대한 포도당의 효과.
N-α-(3,4-디히드록시벤조일)-N-ε-(5-디메틸아미노-나프탈렌-1-술포닐)-라이신 메틸 에스테르:
N-α-(3,4-디히드록시벤조일)-라이신 메틸 에스테르 트리플루오로아세테이트 염 (205 mg, 0.5 mmole, 합성은 실시예 3 참조) 및 DANSYL 염화물 (162 mg, 06 mmole)을, 2 mL의 무수 DMF와 결합시켰다. 디이소프로필에틸아민 (224 mg, 1.7 mmole)을 상기 DMF 용액에 가하였다. 용액을 실온에서 5시간 동안 교반하고, 진공 중에서 DMF를 증발시켰다. 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피 (CH2Cl2/MeOH, 부피로 98/2)에 가하였다. 산물을 황색 고체로서 얻었다 - 240 mg (90 % 수율).
FAB MS: 계산치 C29H31N3O7S M=529; 실험치 M+1=530.
HPLC: HP 1100 HPLC 크로마토그래프, Waters 5 x 100 mm NovaPak HR C18 컬럼, 0.100 mL 주입, 0.75 mL/분, 2 mL 주입 루프, 370 nm 검출, A = 물 (0.1% HFBA) 및 B = MeCN (0.1% HFBA), 농도구배 10% B로 2분, 10-80% B로 18분, 80-100% B로 2분, 100% B로 2분, 머무름 시간 15.45분.
N-α-(3,4-디히드록시벤조일)-N-ε-(5-디메틸아미노-나프탈렌-1-술포닐)-라이신:
N-α-(3,4-디히드록시벤조일)-N-ε-(5-디메틸아미노-나프탈렌-1-술포닐)-라이신 메틸 에스테르 (200 mg, 0.38 mmole) 및 250 mg의 Na2CO3를, 10 mL의 EtOH/H2O (부피로 1/1)와 결합시켰다. 혼합물을 55℃에서 6시간 동안 교반하였다. 용매를 진공 중에서 증발시키고, 과량의 염기를 중화시키기 위하여 1 mL의 트리플루오로아세트산을 가하고, 50 mL의 EtOAc을 혼합물에 가하고, 용액을 H2O (2x40 mL)로 추출하였다. 유기상을 분리하고, Na2SO4로 건조시키고, 증발시켜 190 mg의 고체를 얻었다 (97 % 수율).
HPLC: HP 1100 HPLC 크로마토그래프, Waters 5 x 100 mm NovaPak HR C18 컬럼, 0.100 mL 주입, 0.75 mL/분, 2 mL 주입 루프, 370 nm 검출, A = 물 (0.1% HFBA) 및 B = MeCN (0.1% HFBA), 농도구배 10% B로 2분, 10-80% B로 18분, 80-100% B로 2분, 100% B로 2분, 머무름 시간 14.26분.
N-α-(3-보로네이토-5-니트로)벤조일-N-ε-(4-디메틸아미노-3,5-디니트로)벤조일라이신.
합성을 위해서는 실시예 3 참조.
형광 조절
도 4는 120 μM의 소광인자-보론산 부가물을 포함하는 PBS 중의 DANSYL-카테콜 부가물의 30 μM 용액의 형광 방출 (545 nm에서의 I)을 나타낸 것이다. 포도당의 농도는 0-120 mM에서 변화되었다. 스펙트럼은, 350 nm에서 여기; 3 nm에서 여기 슬릿; 5 nm에서 방출 슬릿; 고 PMT 감도, 주위 온도의 Shimadzu RF-5301 스펙트라플루오로미터를 사용하여 기록되었다. 소광은 포도당의 부가에 따라서 감소되었다.
실시예 5
N-α-(3,4-디히드록시벤조일)-N-ε-(5-디메틸아미노나프탈렌-1-술포닐)-라이신 N-3-(메타크릴아미도)프로필카르복스아미드 (DANSYL-카테콜 모노머) 및 N-α-(3-보로네이토-5-니트로)벤조일-N-ε-(4-디메틸아미노-3,5-디니트로)벤조일라이신 N-3-(메타크릴아미도)프로필카르복스아미드 (소광인자-보론산 모노머)를 포함하는 아크릴아미드 겔의 형광 방출에 대한 포도당의 효과.
N-α-(3,4-디히드록시벤조일)-N-ε-(5-디메틸아미노-나프탈렌-1-술포닐)-라이신 N-3-(메타크릴아미도)-프로필카르복스아미드:
N-α-(3,4-디히드록시벤조일)-N-ε-(5-디메틸아미노-나프탈렌-1-술포닐)-라이신 (75 mg, 0.15 mmole; 합성을 위해서는 실시예 4 참조), 3-아미노프로필메타크릴아미드 염산 염 (30 mg, 0.17 mmole), 디이소프로필에틸아민 (0.1 mL, 0.5 mmole), 및 2 mL의 무수 DMF를 결합시켰다. 1-[3-(디메틸아미노)-프로필]-3-에틸카르보디이미드 염산염 (40 mg, 0.2 mmole)을, 2 mL의 무수 CH2Cl2에 용해시켰다. DMF 및 CH2Cl2용액을 결합시키고, 실온에서 20시간 동안 교반하였다. 용매를 진공 중에서 증발시키고, 잔류물에 대하여 SiO2(7 g) 크로마토그래피를 수행하여 18 mg의 산물을 제조하였다 (19 % 수율).
FAB MS: 계산치 C32H41N5O7S M=640; 실험치 M+=640.
HPLC: HP 1100 HPLC 크로마토그래프, Waters 5 x 100 mm NovaPak HR C18 컬럼, 0.100 mL 주입, 0.75 mL/분, 2 mL 주입 루프, 370 nm 검출, A = 물 (0.1% HFBA) 및 B = MeCN (0.1% HFBA), 농도구배 10% B로 2분, 10-80% B로 18분, 80-100% B로 2분, 100% B로 2분, 머무름 시간 14.78분.
N-α-(3-보로네이토-5-니트로)벤조일-N-ε-(4-디메틸아미노-3,5-디니트로)벤조일라이신 N-3-(메타크릴아미도)프로필-카르복스아미드.
25℃, 1 mL 무수 DMF 중의 3-아미노프로필메타크릴아미드 염산 염 (0.013 g, 0.073 mmole, 1.2 당량), DIEA (0.025 g, 0.034 mL, 0.19 mmole, 3.2 당량), N-α-(3-보로네이토-5-니트로)벤조일-N-ε-(4-디메틸아미노-3,5-디니트로)벤조일라이신 (0.035 g, 0.061 mmole; 합성을 위해서는 실시예 3 참조), 디페닐포스포릴아지드 (0.019 g, 0.015 mL, 0.069 mmole, 1.1 당량) 및 ~ 2 mg의 BHT의 용액을, 암실에서 23.5시간 동안 교반하였다. 이때, 60 mL의 EtOAc을 가하고, 용액을 200 mM 인산염 완충용액 (pH 6.5)의 2 x 20 mL 분획에서 세척하고, 다음으로 1 x 20 mL NaCl (포화 수성 용액)으로 세척하였다. 유기 추출물을 무수 Na2SO4상에서 건조시키고, 여과 및 농축하여 오렌지색 고체를 얻었다. 고체를 에테르로 분쇄하고 건조시켜 0.028 g (65%)의 오렌지색 분말을 얻었다.
FAB MS: 글리세롤 매트릭스; 계산치 C32H41BN8013(모노 글리세롤 부가물) [M]+756; 실험치 [M + 1]+757.
HPLC: HP 1100 HPLC 크로마토그래프, Waters 5 x 100 mm NovaPak HR C18 컬럼, 0.050 mL 주입, 0.75 mL/분, 1.5 mL 주입 루프, 450 nm 검출, A = 물 (0.1% HFBA) 및 B = MeCN (0.1% HFBA), 농도구배 10% B로 2분, 10-80% B로 18분, 80-100% B로 2분, 100% B로 2분, 머무름 시간 17.98분.
N-α-(3,4-디히드록시벤조일)-N-ε-(5-디메틸아미노나프탈렌-1-술포닐)라이신 N-3-(메타크릴아미도)프로필카르복스아미드 및 N-α-(3-보로네이토-5-니트로)벤조일-N-ε-(4-디메틸아미노-3,5-디니트로)벤조일라이신 N-3-(메타크릴아미도)프로필카르복스아미드를 포함하는 아크릴아미드 겔 (20%)의 제조:
에틸렌 글리콜 중의 아크릴아미드 (20 중량%) 및 N,N'-메틸렌비스아크릴아미드 (0.6 중량%)의 용액을 제조하였다. N-α-(3,4-디히드록시벤조일)-N-ε-(5-디메틸아미노나프탈렌-1-술포닐)-라이신 N-3-(메타크릴아미도)프로필카르복스아미드 (0.75 mg, 1.6 x 10-6mole), N-α-(3-보로네이토-5-니트로)벤조일-N-ε-(4-디메틸아미노-3,5-디니트로)벤조일라이신 N-3-(메타크릴아미도)프로필카르복스아미드 (3.5 mg, 5 x 10-6mole), 및 30 μL의 수성 암모늄 퍼설페이트 (5 중량%)의 용액을, 0.5 mL의 에틸렌 글리콜 모노머 용액과 결합시켰다. 결과물인 용액을 질소로 퍼지화된 글러브 박스에 넣었다. 중합반응을 촉진시키기 위하여 모노머 제제에 N,N,N'N'-테트라메틸에틸렌디아민 (30 μL, 5 중량%)의 수용액을 가하였다. 결과물인 제제를 현미경 슬라이드 및 100 μ 스테인레스 스틸 스페이서로 구성된 주형에 부었다. 질소 분위기 중에서 8시간 동안 보관한 후에, 주형을 인산염 완충 식염수 (PBS) (10 mM PBS, pH=7.4) 중에 넣고, 현미경 슬라이드를 분리하고, 히드로겔을 제거하였다. 히드로겔을, 1 mM 라우릴 설페이트 소듐 염 및 1 mM EDTA 소듐 염을 포함하는 100 mL의 PBS로 3일 동안 세척하고, 용액을 매일 바꾸어 주었으며, DMF/PBS (부피로 10/90, 3 x 100 mL)로 세척하고, 최종적으로 PBS (pH=7.4, 3 x 100 mL)로 세척하였다. 결과물인 히드로겔 폴리머를, 0.2 중량%의 소듐 아지드 및 1 mM의 EDTA 소듐 염을 포함하는 PBS (10 mM PBS, pH=7.4) 중에 보관하였다.
형광 조절
도 5는 PBS 중의 2 mM의 DANSYL-카테콜 모노머 및 10 mM의 소광인자-보론산 모노머를 포함하는 아크릴아미드 겔 (20%)의 형광 방출 (532 nm에서의 I)을 나타낸 것이다. 겔 (100㎛ 두께)은 PMMA 큐베트 (cuvette) 중에 탑재되었다. 포도당의 농도는 0-200 mM으로 변화되었다. 스펙트럼은, 350 nm에서 여기; 3 nm에서 여기 슬릿; 10 nm에서 방출 슬릿; 고 PMT 감도, 37℃의 Shimadzu RF-5301 스펙트라플루오로미터를 사용하여 기록되었다. 소광은 포도당의 부가에 따라서 감소되었다.
실시예 6
3,4-디히드록시 벤조산의 존재 하에서 안트라센 비스-보론산 유도체의 형광에 대한 포도당의 효과
PBS 용해성 안트라센 비스 보론산 유도체의 제조:
9,10-비스[[2-(tert-부톡시카르보닐)에틸아미노]메틸]-안트라센.
23℃의 75 mL CHCl3중의 β-알라닌tert-부틸 에스테르 염산염 (3.06 g, 16.8 mmole, 5.09 당량), DIEA (4.27 g, 5.75 mL, 33.0 mmole, 10.00 당량) 및 9,10-비스(클로로메틸)안트라센 (0.910 g, 3.31 mmole)의 용액을 암실에서 93시간 동안 교반하였다. 이때, 용액을 여과하고, NaHCO3(포화 수성 용액)의 1 x 40 mL 및 2 x 60 mL 분획으로 세척하였다. 유기 추출물을 무수 Na2SO4상에서 건조시키고, 여과하고 농축하여 황색 고체 조생성물을 얻었다. 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (30 g 중력급 겔, 0-3% CH3OH/CH2Cl2)에 의하여 정제하여, 점성 황색-오렌지색의 1.06 g (65%)을 얻었다. 산물은 그 상태로 다음 단계에 사용되었다.
TLC: Merck 실리카 겔 60 플레이트, Rf 0.33 with 95/5 CH2Cl2/CH3OH, UV(254/366)로 관찰.
9,10-비스[N-[2-(5,5-디메틸보리난-2-일)벤질]-N-[2-(tert-부톡시카르보닐)에틸아미노]메틸]안트라센.
23℃, 30 mL CHCl3중의 9,10-비스[[2-(tert-부톡시카르보닐)-에틸아미노]메틸]안트라센 (1.60 g, 3.25 mmole), DIEA (4.45 g, 6.00 mL, 34.4 mmole, 10.6 당량) 및 (2-브로모메틸페닐)보론산 네오펜틸 에스테르 (4.80 g, 17.0 mmole, 5.22 당량)의 용액을 암실에서 4.5일 동안 교반하였다. 이때, 혼합물에 45 mL의 CHCl3를 가하고, 혼합물을 NaHCO3(포화 수성 용액)의 2 x 25 mL 분획으로 세척하였다. 유기 추출물을 무수 Na2SO4상에서 건조시키고, 여과 및 농축하여 불그스레한 오일로서 조생성물을 얻었다. 잔류물을 알루미나 컬럼 크로마토그래피 (100 g 활성화된 중성 알루미나, 0-3% CH3OH/CH2Cl2)에 의하여 정제하여 ~ 3.5 g의 오렌지색 고체를 얻었다. 산물을 용해시키고, 백색 침전물 (DIEA-HBr 염)을 형성시켰다. 용액을여과하고, 여과물을 농축시켜 2.72 g (93%)의 오렌지색 고체를 얻었다. 산물은 (RP-HPLC에 의하여 80% 이상으로 순수) 그 상태로 다음 단계에 사용되었다.
TLC: Merck 기본 알루미나 플레이트, Rf 0.66 with 95/5 CH2Cl2/CH3OH, UV (254/366)로 관찰.
HPLC 조건: HP 1100 HPLC 크로마토그래프, Vydac 201TP 10 x 250 mm 컬럼, 0.100 mL 주입, 2 mL/분, 370 nm 검출, A = 물 (0.1% HFBA) 및 B = MeCN (0.1% HFBA), 농도구배 10% B로 2분, 10-80% B로 18분, 80-100% B로 2분, 100% B로 2분, 머무름 시간 23.9 분.
9,10-비스[N-(2-보로노벤질)-N-[3-(프로파노일)아미노]-메틸]안트라센.
23℃, 5 mL 20% TFA/CH2Cl2중의 9,10-비스[N-[2-(5,5-디메틸보리난-2-일)벤질]-N-[2-(tert-부톡시카르보닐)에틸아미노]-메틸]안트라센 (0.556 g, 0.620 mmole)의 용액을 암실에서 25시간 동안 교반하였다. 이때, 반응 혼합물을 N2기체의 흐름 하에서 농축시켰다. 잔류물을 에테르 3 x 10 mL로 분쇄하였다. 잔류물인 고체를 진공 중에서 건조시켜 0.351g (87%)의 솜털 (fluffy) 황색 분말을 얻었다.
FAB MS: 글리세롤 매트릭스; 계산치 C42H46B2N2010(비스 글리세롤 부가물) [M]+760; 실험치 [M]+760.
HPLC: HP 1100 HPLC 크로마토그래프, Waters 5 x 100 mm NovaPak HR C18 컬럼, 0.025 mL 주입, 0.75 mL/분, 1.5 mL 주입 루프, 360 nm 검출, A = 물 (0.1% HFBA) 및 B = MeCN (0.1% HFBA), 농도구배 10% B로 2분, 10-80% B로 18분, 80-100% B로 2분, 100% B로 2분, 머무름 시간 16.7분.
형광 조절
도 6은 본 실시예에서 제조된 PBS 중의 안트라센 비스 보론산 유도체 (40μM)의 형광 강도 (450 nm)에 대한 3,4-디히드록시벤조산의 효과를 보여준다. 스펙트럼은, 370 nm에서 여기; 3 nm에서 여기 슬릿; 3 nm에서 방출 슬릿; 고 PMT 감도, 주위 온도의 Shimadzu RF-5301 스펙트라플루오로미터를 사용하여 기록되었다. 안트라센 비스 보론산 유도체는 낮은 수준의 형광을 방출하였으며, 이는 3,4-디히드록시벤조산의 존재에 의하여 효과적으로 소광된 것이다.
도 7은 PBS 중의 포도당 농도의 함수로서 3,4-디히드록시벤조산 (200 μM)의 존재 하에서 본 실시예의 안트라센 비스 보론산 유도체 (40 μM)의 정규화된 형광 강도 (430 nm) (지점들은 다이아몬드꼴로 표시), 및 PBS 중의 포도당 농도의 함수로서 동일한 인디케이터 (40 μM)의 정규화된 형광 강도 (430 nm) (지점들은 사각형으로 표시)를 나타낸 것이다. 포도당 농도는 0 내지 25 mM에서 변화되었다. 스펙트럼은, 370 nm에서 여기; 3 nm에서 여기 슬릿; 5 nm에서 방출 슬릿; 저 PMT 감도, 주위 온도의 Shimadzu RF-5301 스펙트라플루오로미터를 사용하여 기록되었다. 3,4-디히드록시벤조산 소광인자의 부존재 하에서, 안트라센 비스 보론산 유도체에 포도당을 첨가하면 형광의 증가가 야기되었다. 3,4-디히드록시벤조산 소광인자의 존재 하에서, 안트라센 비스 보론산 유도체에 포도당을 첨가하면 형광의 현저한 증가가 야기되었다. 이는 포도당이 보론산 인식 요소로부터 3,4-디히드록시벤조산 소광인자를 분리시켜서, 형광의 증가를 야기하는 것으로 생각된다. 본 실시예에서, 3,4-디히드록시벤조산기는 검출 시스템의 소광인자 부분 및 인식 요소와 상호작용하는 리간드 요소 모두로서 작용한다.
실시예 7
A. 1,4-비스[[4-(tert-부톡시카르보닐)아미노부틸아미노]메틸]벤젠:
테레프탈디카르복스알데히드 (0.253 g, 1.89 mmole), N-t-Boc-부탄디아민 (0.71 g, 3.77 mmole) 및 소듐 설페이트 (5.5 g, 40 mmole)를 25 ml의 무수 메탄올과 결합시켰다. 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반하고, 소듐 설페이트를 여과제거하고, NaBH4(1.5 g, 40 mmole)를 가하였다. 4시간 후에, 혼합물을 100 ml의 에테르로 희석하고, 여과하였다. 용매의 증발 후에 얻은 잔류물에 대하여, 실리카 겔 상에서, CH2Cl2/MeOH/Et3N (80/15/5 부피%)를 용출액으로 사용한, 컬럼 크로마토그래피를 수행하였다. 산물을 백색 고체 (0.77 g, 86% 수율)로서 분리하였다. 이러한 물질을 그 상태로 다음 단계에서 사용하였다.
B. 1,4-비스 [N-[2-(피나콜라토)보로노벤질]-N- [[4-(tert-부톡시카르보닐)아미노부틸아미노]메틸]벤젠:
2-브로모메틸페닐 보론산, 피나콜 에스테르 (1.4 g, 4.7 mmole), 1,4-비스[[4-(tert-부톡시카르보닐)아미노부틸아미노]메틸]벤젠 (0.74 g, 1.56 mmole), 및 N,N-디이소프로필-N-에틸아민 (1.8 ml, 10 mmole)을, 20 ml의 CH2Cl2에 용해시켰다. 용액을 실온에서 24시간 동안 교반하고, 용매를 증발시키고, 잔류물을 헥산/에테르 (50/50 부피, 3x10 ml)로 세척하였다. 산물은 컬럼 크로마토그래피 (SiO2, 90/10 부피, CH2Cl2/MeOH)에 의하여 더욱 정제하였다. 수율 1.18 g (83%).
C. 1,4-비스 [N-(2-보로노벤질)-N-[4-아미노부틸아미노]메틸]벤젠 비스 트리플루오로아세트산 염:
1,4-비스 [N-[2-(피나콜라토)보로노벤질]-N-[[4-(tert-부톡시카르보닐)아미노부틸아미노]메틸]벤젠 (1.1 g, 1.2 mmole)을, 20% 부피 TFA 및 5% 부피 트리이소프로필실란을 함유하는 20 ml의 CH2Cl2용액에 용해시켰다. 용액을 12시간 동안 교반하고, 용매를 증발시키고, 잔류물을 고진공하, 50℃에서 24시간 동안 건조시켰다. 수율 정량적.
FAB MS: 계산치 C42H64B2N4O4M+=710 (비스 피나콜 에스테르), 실험치 M+2=712.
HPLC: HP 1100 HPLC 크로마토그래프, Waters 5 x 100 mm NovaPak HR C18 컬럼, 0.100 mL 주입, 0.75 mL/분, 2 mL 주입 루프, 280 nm 검출, A = 물 (0.1%HFBA) 및 B = MeCN (0.1% HFBA), 농도구배 10% B로 2분, 10-80% B로 18분, 80-100% B로 2분, 100% B로 2분, 머무름 시간 14.6분.
D. 3,4-디히드록시-9,10-디옥소-2-안트라센술포닐 클로라이드:
3,4-디히드록시-9,10-디옥소-2-안트라센술폰산 소듐 염 (1.4 g, 3.9 mM)을, 30 ml의 클로로술폰산과 결합시키고, 90℃로 5시간 동안 가열하고, 이후에 용액을 0℃까지 냉각시키고, 100g의 얼음에 부었다. 얼음이 녹은 후에, 용액을 CH2Cl2(3 x 100 ml)로 추출하고, 메틸렌 클로라이드 추출물을 결합시키고, Na2SO4로 건조시키고,증발시켜 0.87 g의 고체를 제조하였다 (수율 66%).
E. 1-[N-(2-보로노벤질)-N- [4-아미노부틸아미노]메틸]-4-[N-(2-보로노벤질)-N- [4-[(3,4-디히드록시-9,10-디옥소-2-안트라센)술폰아미도]부틸아미노]메틸]-벤젠 트리플루오로아세트산 염:
3,4-디히드록시-9,10-디옥소-2-안트라센술포닐 클로라이드 (0.095 g, 0.28 mmole)를 3 ml의 무수 CH3CN 중에 용해시키고, 5 ml의 무수 CH3CN 중의 1,4-비스 [N-(2-보로노벤질)-N-[4-아미노부틸아미노]메틸]벤젠 비스 트리플루오로아세트산 염 (1.06 g, 1.37 mmole) 및 N,N-디이소프로필-N-에틸아민 (1 ml, 5.8 mmole)의 용액에 방울로 가하였다. 4시간 동안 교반시킨 후에, 용매를 증발시키고, 잔류물을 고진공 하에서 건조시켰다. 잔류물을 10 ml의 CH3CN/TFA (80/20 부피%)에 용해시키고, 용매를 다시 증발시켰다. 잔류물에 물 (10 ml)을 가하고, 플라스크를 20분 동안 음파분쇄한 후에, 산물을 포함하고 있는 갈색 고체를 여과하였다. 예비적 HPLC를 사용하여 더욱 정제하였다: HP 1100 HPLC 크로마토그래프, Waters 25x100 mm NovaPak HR C18 컬럼, 1.00 mL 주입, 5 mL/분 흐름 속도, 2 mL 주입 루프, 470 nm 검출, A = 물 (0.1% HFBA) 및 B = MeCN (0.1% HFBA), 농도구배 10% B로 2분, 10-80% B로 18분, 80-100% B로 2분, 100% B로 2분, 머무름 시간 18.5분. 수율: 198 mg (79%). 본 화합물을, pH=7.4, MeOH/PBS (1/1, 부피)의 용액 중에서, D-포도당과의 상호작용에 대하여 테스트하였으며, 상호작용은 흡광 스펙트럼을 모니터링함으로써평가되었다.
F. 1-[N-(2-보로노벤질)-N-[4-(메타크릴아미도)부틸아미노]메틸]-4-[N-(2-보로노벤질)-N-[4-[(3,4-디히드록시-9,10-디옥소-2-안트라센)술폰아미도]부틸아미노]메틸]-벤젠:
1-[N-(2-보로노벤질)-N-[4-아미노부틸아미노]메틸]-4-[N-(2-보로노벤질)-N-[4-[(3,4-디히드록시-9,10-디옥소-2-안트라센)술폰아미도]부틸아미노]메틸]벤젠 트리플루오로아세트산 염 (30 mg, 3.34x10-5mole)을, 1 ml의 무수 MeOH 중에 용해시켰다. 메타크릴산 NHS 에스테르 (10 mg, 5.46x10-5mole,J. Am. Chem. Soc., 1999, 121(15), 3617에 따라서 제조)를 가하고, 0.01 ml의 Et3N를 가하였다. 용액을 10시간 동안 교반하였다. 용매를 진공 중에서 증발시키고, 고체를 물로 세척하였다. RP-HPLC 분석은 고체 중에 출발 물질이 존재하지 않음을 보여 주었다. 결과물인 고체를 진공 중에서 건조시키고, 그 상태로 히드로겔 필름으로의 중합반응에 사용하였다.
G. 1-[N-(2-보로노벤질)-N-[4-(메타크릴아미도)부틸아미노]메틸]-4-[N-(2-보로노벤질)-N-[4-[(3,4-디히드록시-9,10-디옥소-2-안트라센)술폰아미도]부틸아미노]메틸]-벤젠을 포함하는 N-N-디메틸아크릴아미드 히드로겔 필름의 제조:
DMF 중의 N,N-디메틸아크릴아미드 (40 중량%) 및 N,N'-메틸렌비스아크릴아미드 (0.8 중량%) 및 D-과당 (200 mM)의 용액을 제조하였다. 1-[N-(2-보로노벤질)-N-[4-(메타크릴아미도)부틸아미노]메틸]-4-[N-(2-보로노벤질)-N-[4-[(3,4-디히드록시-9,10-디옥소-2-안트라센)술폰아미도]부틸아미노]메틸]-벤젠 (30 mg)을, 모노머들 및 D-과당을 함유하는 0.5 ml의 DMF 용액에 용해시켰다. 수성 암모늄 퍼설페이트 (20 mL, 5 중량%)를 상기 제제와 결합시켰다. 결과물인 용액을 질소로 퍼지화된 글러브 박스에 넣었다. N,N,N'N'-테트라메틸에틸렌디아민 (20 mL, 5 중량%)의 수용액을, 중합반응을 촉진시키기 위해서 상기 모노머 제제에 가하였다. 결과물인 제제를 현미경 슬라이드 및 100 μM 스테인레스 스틸 스페이서로 구성된 주형에 부었다. 질소 분위기 중에서 8시간 동안 보관한 후에, 상기 주형을 인산염 완충 식염수 (10 mM pi, pH=7.4) 중에 넣고, 현미경 슬라이드를 분리하고, 히드로겔을 제거하였다. 히드로겔을, 1 mM 라우릴 설페이트 소듐 염 및 1 mM EDTA 소듐 염을 포함하는 인산염 완충 식염수 (PBS) 100 ml 중에서 3일 동안 세척하고, 용액을 매일 바꾸어 주면서, DMF/PBS (부피로 10/90, 3 x 100 ml)로 세척하고, 최종적으로 PBS (pH=7.4, 3 x 100 ml)로 세척하였다. 결과물인 히드로겔 폴리머를, 0.2 중량% 소듐 아지드 및 1 mM EDTA 소듐 염을 포함하는 PBS (10 mM PBS, pH=7.4) 중에 보관하였다.
H. 1-[N-(2-보로노벤질)-N-[4-(메타크릴아미도)부틸아미노]메틸]-4-[N-(2-보로노벤질)-N-[4-[(3,4-디히드록시-9,10-디옥소-2-안트라센)술폰아미도]부틸아미노]메틸]-벤젠을 포함하는 N,N-디메틸아미드 겔의 형광 및 흡광에 대한 D-포도당의 효과:
본 실험은 가변 온도 부착을 구비한 Shimadzu RF-5301 PC 스펙트로플루오리미터 중에서 수행되었다. N,N-디메틸아크릴아미드 히드로겔 필름은, PMMA 형광 셀에 45° 각도로 부착된, 유리 슬라이드의 단편에 부착되었다. 셀은, 다양한 농도의 D-포도당을 포함하는 pH 7.4의 PBS 용액으로 충진되었다. 흡광도 및 형광 강도를 측정하기 전에, 셀을 37℃에서 30분 동안 평형을 이루게 하였다. 형광 강도 측정을 위하여, 여기 파장은 470 nm, 슬릿 폭은 3/3 nm, PMT의 고감도에 맞추어졌다. 히드로겔 필름의 흡광 스펙트럼은 HP 8453 기기를 사용하여 측정되었으며, 각 측정에서의 바탕값 보정 (blank correction)을 위해서 690 nm에서의 흡광 수치를 사용하였다.
결과들은 도 8 내지 10에 도시되어 있다. 도 8은 변화되는 포도당 농도를 갖는 PBS/메탄올 중의 인디케이터의 흡광 스펙트럼을 나타낸 것이다. 도 9는 다양한 포도당 농도를 갖는 인디케이터 겔의 흡광도 비 (A (565 nm)/A (430 nm))를 나타낸 것이다. 도 10은 다양한 포도당 농도에서, 550 nm에서의 정규화된 형광 (I/Io)을 나타낸 것이다.

Claims (24)

  1. 시료 중의 폴리히드록실 (polyhydroxyl) 분석물의 존재 또는 농도를 검출하기 위한 방법에 있어서, 상기 방법은:
    a) 상기 시료를,
    ⅰ) 상기 분석물과 가역적인 방식으로 공유결합을 형성할 수 있는 제1 인식 요소, 및 A) 상기 제1 인식 요소에 결합된 상기 분석물과 가역적인 방식으로 공유결합을 형성할 수 있는 제2 인식 요소, 또는 B) 상기 분석물의 부존재 시에 상기 제1 인식 요소와 가역적인 방식으로 상호작용할 수 있는 리간드 요소로서, 상기 리간드 요소와 상기 인식 요소와의 상호작용에 의하여 조절되는 검출가능한 성질을 생성하는 표지 (label)를 선택적으로 포함하는 리간드 요소; 및
    ⅱ) A) 인디케이터 시스템이 상기 분석물에 노출되는 경우에 농도-의존적인 방식으로 변화하는 검출가능한 성질을 생성하는 공여체/수용체 시스템, 및 B) 상기 표지된 리간드 요소 중의 최소한 하나를 포함하는 검출 시스템
    을 포함하는 인디케이터 시스템에 노출시키는 단계; 및
    b) 상기 검출가능한 성질의 변화를 측정함으로써 상기 시료 중의 상기 분석물의 존재 또는 농도를 결정하는 단계를 포함하며,
    상기 제1 인식 요소를 포함하는 상기 인디케이터 시스템 부분이 상기 제2 인식 요소 또는 상기 리간드 요소를 포함하는 인디케이터 시스템 부분과 공유적으로 또는 비공유적으로 결합되는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 인디케이터 시스템이, 상기 분석물에 대해 두 개 이상의 인식 요소를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 분석물이 당이며, 상기 각각의 인식 요소가 보론산, 보로네이트 이온, 아비산 (arsenious acid), 아비산염 (arsenite) 이온, 텔루르 산 (telluric acid), 텔루르산염 (tellurate) 이온, 게르만산 (germanic acid), 게르만산염 (germanate) 이온 및 그 조합으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 분석물이 포도당이고, 상기 각각의 인식 요소가 하나 또는 그 이상의 보론산기를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 인디케이터 시스템이 분석물에 대한 인식 요소 및 리간드 요소를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 분석물이 당이고, 상기 인식 요소가 보론산, 보로네이트 이온, 아비산, 아비산염 이온, 텔루르 산, 텔루르산염 이온, 게르만산, 또는 게르만산염 이온 중 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 분석물이 포도당이고, 상기 인식 요소가 하나 또는 그 이상의 보론산기를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제5항에 있어서, 상기 리간드 요소가 상기 인식 요소와 에스테르 결합을 형성할 수 있는 것임을 특징으로 하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 리간드 요소가, 방향족 디올, 락테이트, 알파-히드록시산, 타르타르산, 말산, 디에탄올아민, 베타-아미노알코올, 포도당 및 폴리히드록시 화합물, 및 인접 히드록시-함유 화합물 및 선택적으로 치환되어 있는 상기 화합물들로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 검출 시스템이 공여체/수용체 시스템을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 검출 시스템이 형광단 및 소광 부분을 포함하며, 상기 형광단은, 상기 인디케이터 시스템이 상기 분석물에 결합하는 경우에 소광 또는 탈소광되는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 검출 시스템이 상기 표지된 리간드 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 표지된 리간드 요소가 형광단을 포함하며, 상기 형광단의 형광은 상기 인디케이터 시스템과 상기 분석물과의 결합에 의하여 조절되는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제10항에 있어서, 상기 검출 시스템이 두 개 이상의 다른 형광단들을 포함하며, 상기 형광단들의 형광은 상기 인디케이터 시스템과 상기 분석물과의 결합에 의하여 조절되는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제1항에 있어서, 상기 시료가 생리적 유체인 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 생리적 유체는 혈액, 혈장, 혈청, 조직내 유체 (interstitial fluid), 뇌척수액 (cerebrospinal fluid), 뇨, 타액, 안내 유체 (intraocular fluid), 림프, 눈물, 땀 및 생리적 완충용액으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제1항에 있어서, 상기 인디케이터 시스템이 용액 상태로 상기 시료에 노출되는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제1항에 있어서, 상기 인디케이터 시스템이 고형 지지체 상에 또는 고형 지지체 내부에 고정된 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 고형 지지체가 폴리머 매트릭스인 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제1항에 있어서, 상기 인디케이터 시스템이 이식가능한 (implantable) 장치와 연관되며, 상기 a) 단계가 생체내 (in vivo)에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제1항에 있어서, 상기 측정 단계가 실질적으로 주위 온도에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 온도가 약 80℃ 이하인 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제1항에 있어서, 상기 인디케이터 시스템이:
    N-2-[5-(N-4-디메틸아미노벤질)-5-[2-(보로노)-벤질]아미노헥실]-[2-(보로노)벤질]아미노에틸-4-부틸아미노-1,8-나프탈이미드;
    N-2-[4-(N-4-디메틸아미노벤질)-[2-(보로노)-벤질]아미노메틸]벤질-[2-(보로노)벤질]아미노에틸-4-부틸아미노-1,8-나프탈이미드;
    N-2-[5-(N-4-디메틸아미노벤질)-5-[2-(보로노)-벤질]아미노헥실]-[2-(보로노)벤질]아미노에틸-4-[2-(2-아미노에톡시)에톡시에틸)아미노-1,8-나프탈이미드;
    N-(5-메톡시카르보닐-5-[3,4-디히드록시벤즈아미도]펜틸)-N'-(5-플루오레세이닐)티오유레아;
    N-α-(3-보로네이토-5-니트로)벤조일-N-ε-(4-디메틸아미노-3,5-디니트로)벤조일라이신;
    N-α-(3,4-디히드록시벤조일)-N-ε-(5-디메틸아미노나프탈렌-1-술포닐)-라이신;
    N-α-(3,4-디히드록시벤조일)-N-ε-(5-디메틸아미노나프탈렌-1-술포닐)-라이신 N-3-(메타크릴아미도)프로필카르복스아미드; 및
    N-α-(3-보로네이토-5-니트로)벤조일-N-ε-(4-디메틸아미노-3,5-디니트로)벤조일라이신 N-3-(메타크릴아미도)프로필-카르복스아미드
    로 이루어진 군으로부터 선택된 화합물의 잔기를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. N-2-[5-(N-4-디메틸아미노벤질)-5-[2-(보로노)-벤질]아미노헥실]-[2-(보로노)벤질]아미노에틸-4-부틸아미노-1,8-나프탈이미드;
    N-2-[4-(N-4-디메틸아미노벤질)-[2-(보로노)-벤질]아미노메틸]벤질-[2-(보로노)벤질]아미노에틸-4-부틸아미노-1,8-나프탈이미드;
    N-2-[5-(N-4-디메틸아미노벤질)-5-[2-(보로노)-벤질]아미노헥실]-[2-(보로노)벤질]아미노에틸-4-[2-(2-아미노에톡시)에톡시에틸)아미노-1,8-나프탈이미드;
    N-(5-메톡시카르보닐-5-[3,4-디히드록시벤즈아미도]펜틸)-N'-(5-플루오레세이닐)티오유레아;
    N-α-(3-보로네이토-5-니트로)벤조일-N-ε-(4-디메틸아미노-3,5-디니트로)벤조일라이신;
    N-α-(3,4-디히드록시벤조일)-N-ε-(5-디메틸아미노나프탈렌-1-술포닐)-라이신;
    N-α-(3,4-디히드록시벤조일)-N-ε-(5-디메틸아미노나프탈렌-1-술포닐)-라이신 N-3-(메타크릴아미도)프로필카르복스아미드; 및
    N-α-(3-보로네이토-5-니트로)벤조일-N-ε-(4-디메틸아미노-3,5-디니트로)벤조일라이신 N-3-(메타크릴아미도)프로필카르복스아미드
    로 이루어진 군으로부터 선택된 화합물의 잔기를 포함하는 인디케이터 시스템.
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