CN102341696B - 用于高灵敏度荧光分析的检测系统和方法 - Google Patents

用于高灵敏度荧光分析的检测系统和方法 Download PDF

Info

Publication number
CN102341696B
CN102341696B CN201080010177XA CN201080010177A CN102341696B CN 102341696 B CN102341696 B CN 102341696B CN 201080010177X A CN201080010177X A CN 201080010177XA CN 201080010177 A CN201080010177 A CN 201080010177A CN 102341696 B CN102341696 B CN 102341696B
Authority
CN
China
Prior art keywords
top end
antibody
probe
analyte
solution
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201080010177XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN102341696A (zh
Inventor
谭洪
罗伯特·F·祖克
谭玉山
曹二华
夏明�
陈骏
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Access Medical Systems Ltd
Original Assignee
Access Medical Systems Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Access Medical Systems Ltd filed Critical Access Medical Systems Ltd
Priority to CN201310549211.6A priority Critical patent/CN103604786B/zh
Publication of CN102341696A publication Critical patent/CN102341696A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN102341696B publication Critical patent/CN102341696B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54373—Apparatus specially adapted for solid-phase testing involving physiochemical end-point determination, e.g. wave-guides, FETS, gratings
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G01N2021/6439—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2201/00—Features of devices classified in G01N21/00
    • G01N2201/06—Illumination; Optics
    • G01N2201/061—Sources
    • G01N2201/06113—Coherent sources; lasers

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
  • Polyethers (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及在荧光分析中用于测量荧光信号的检测系统。该系统包括探针，其具有结合有荧光标记的传感表面，以及安装在衬底传感表面的近侧的光源和检测器。本发明还涉及用于在液体样品中检测被分析物的方法，其使用具有小表面面积(≤5毫米)和具有多个结合分子和多个荧光标记的探针梢端。通过水平流动反应溶液并且在反应容器中上下移动该探针梢端加速该结合反应。本发明还涉及一种荧光标记组合物，其包括具有多个结合分子和多个荧光标记的交联Ficoll分子。

Description

用于高灵敏度荧光分析的检测系统和方法
技术领域
本发明涉及在荧光分析中用于测量荧光信号的检测系统。该系统包括探针，其具有结合有荧光标记的传感表面，以及安装在衬底传感表面的近侧的光源和检测器。本发明还涉及用于在液体样品中检测被分析物的方法，其使用具有小表面的探针和具有多个结合分子及多个荧光标记的聚合物。本发明还涉及一种荧光标记组合物，其包括具有多个结合分子和多个荧光标记的交联多糖主链分子。
背景技术
在免疫分析系统的研制中，需要满足许多性能要求。分析需要足够灵敏，以在亚皮克毫微克范围的极低水平下检测被分析物。总的分析时间需要为15分钟或更少，以在护理情形下提供及时的结果用于病人管理，或满足批量分析者的处理量需要。在一些情况下，同时用相同的样品进行多重分析的被分析物面板是有利的，以最小化结果的周转时间和测试成本。
许多免疫分析使用荧光标记，因为这类标记有许多实用性的优点。和酶相比，荧光标记稳定得多，并且不需要其它底物试剂。对于多重分析面板，由于每个结合区域可以依次经受荧光激发和放射测量，不受相邻的结合区域干扰，荧光标记可以在同一反应室中使用离散的结合区域。然而，采用荧光标记的分析灵敏度低于基于酶的分析，这主要是由于酶能够催化转化底物，以随着时间的推移积聚大量的产物分子。
芳基磺酸酯花青荧光染料被描述于Mujumdar等(1993)Bioconjugate Chemistry，4：105-111；Southwick等(1990)Cytometry，11：418-430；和美国专利号5,268,486。每一篇参考文献都描述了Cy5，并且其可以从宾夕法尼亚州匹兹堡的Biological DetectionSystems公司买到，商品名为FluorolinkTM Cy5TM。该芳基磺酸酯花青荧光染料具有高消光系数(通常为130,000升/摩尔至250,000升/摩尔)，优良的量子产率，在大多数生物材料和塑料的自体荧光波长范围以外(500纳米至750纳米)的荧光发射谱，优良的溶解性，以及低非特异性结合特性。
尽管有这些优异性能，芳基磺酸酯花青荧光染料也存在某些限制。特别是，这些染料的斯托克斯频移相对较窄，其导致该染料的激发和发射谱之间的明显重叠。当这些染料分子在受激发时彼此位置接近时，该激发和发射谱的重叠可以引起荧光的自熄灭。这种自熄灭限制了可以结合至单个抗体分子用于免疫分析的芳基磺酸酯染料分子的数目。在示范性的芳基磺酸酯花青荧光染料Cy5的情况下，斯托克斯频移是17纳米(其为650纳米的激发波长和667纳米的发射波长之差)。当两至四个Cy5分子被结合至单个抗体分子时，获得最佳的荧光产率。当超过四个染料分子被结合至单一抗体分子时，该荧光信号输出迅速下降。这种不能结合超过四个染料分子至单一的抗体分子的特性明显限制了使用Cy5-标记的抗体及其它结合物质的免疫分析的灵敏度。
需要有改善的光学探测系统和改善的方法，用于通过荧光免疫分析以高灵敏度检测被分析物。该系统和方法应易于由用户操作，并提供高特异性的信号和最小的背景噪声。
发明内容
概述
本发明涉及一种荧光检测系统，其用于测量探针梢端上的荧光信号。该系统包括：(a)长度比宽度的纵横比至少为5比1的探针，该探针具有远端和近端，该近端具有和荧光标记结合的传感表面；(b)用于直接发射激发光至该探针的传感表面的光源；(c)指向该传感表面的会聚透镜；和(d)用于检测该发射荧光的光学探测器；其中该会聚透镜会聚该发射荧光并将其引导至该光学探测器。
本发明还涉及用于通过荧光免疫分析检测被分析物的方法。在一个实施方式中(三步结合)，该方法包括步骤：(a)获得一探针，其具有被固定在该探针梢端上的第一抗体，其中该梢端表面的直径≤5毫米；(b)将该探针梢端浸入包含具有被分析物的样品溶液的样品容器中，在该样品容器中上下移动该探针梢端并水平流动该样品溶液；(c)将该探针梢端浸入包含试剂溶液的试剂容器，该试剂溶液包括和一结合配对的第一成员结合的第二抗体分子，在该试剂容器中上下移动该探针梢端并水平流动该试剂溶液；(d)将该探针梢端浸入含洗液的洗涤容器中；(e)将该探针梢端浸入含有扩增溶液的扩增容器中，该扩增溶液包括分子量至少为约一百万道尔顿，并且和该结合配对的第二成员的至少5个分子和至少25个荧光标记结合的聚合物，在该扩增容器中上下移动该探针梢端并水平流动该扩增溶液，以在该探针梢端上形成该被分析物，该第一抗体，该第二抗体，以及该结合配对的第一和第二成员间的免疫复合体；(f)将该探针梢端浸入含第二洗液的第二洗涤容器;和(g)通过检测该探针梢端上的荧光信号检测所形成的免疫复合体;其中该第一抗体和该第二抗体是针对该被分析物的抗体。
本发明的方法实现了高灵敏度，这是由于独特地组合了(i)采用具有小传感表面面积的用于结合被分析物分子的探针，(ii)在反应容器中上下移动该探针梢端并水平流动该反应溶液，和(iii)采用和多重结合分子和多重荧光标记结合的高分子量聚合物。
本发明还涉及荧光标记组合物，其包括：(a)分子量至少一百万道尔顿的交联Ficol1，(b)至少5个结合分子，和(c)至少25个荧光染料分子，其中这些结合分子和荧光染料分子附着于该交联Ficol1。
附图说明
图1显示了该光学探测系统的第一实施方式。
图2显示了该光学探测系统的第二实施方式。
图3显示了该光学探测系统的第三实施方式。
图4显示了该光学探测系统的第四实施方式。
图5显示了该光学探测系统的第五实施方式。
图6显示了该光学探测系统的第六实施方式。
图7显示了用于检测被分析物的两步结合方法。
图8显示了一光学检测系统，其中光源和检测器两者均被安装在该探针的传感表面的相对侧。
图9显示了该光学检测系统的另一视图，其中该探针被浸入被分析物溶液。
图10显示了制备交联Ficoll400的流程图。
图11显示了制备Cy5-抗体-交联Ficoll400的流程图。
图12显示了通过Sepharose4BCL色层分离法进行的SPDP标记的交联Ficoll400的洗脱图形。
图13显示了用于检测A蛋白的免疫分析形式。Ab：抗体，Ag：抗原(A蛋白)，Sa：链霉亲和素，B：生物素，F：荧光标记。
详细说明
定义
除非在下文定义，权利要求和说明书中使用的术语将根据本领域技术人员所理解的通常含义进行解释。
此处使用的“约”指在所列举值的士15％以内。
此处使用的“被分析物结合”分子指能参与和被分析物分子的特异性结合反应的任何分子。其实例包括，但不限于，(i)抗原分子，其用于检测特异性针对该抗原的抗体的存在；(ii)抗体分子，其用于检测抗原的存在；(iii)蛋白质分子，其用于检测该蛋白质的结合配偶体的存在；(iv)配位体，其用于检测结合配偶体的存在；或(v)单链核酸分子，其用于检测核酸结合分子的存在。
形状的的“纵横比”指其较长尺寸与其较短尺寸的比率。
“结合分子”指能够结合另一个感兴趣的分子的分子。
此处使用的“结合配对”指彼此吸引并特异性结合的两个分子。结合配对的例子包括，但不限于，抗原和针对该抗原的抗体，配位体及其受体，核酸的互补链，生物素和抗生物素蛋白，生物素和链霉亲和素，凝集素和糖类。优选的结合配对是生物素和链霉亲和素，生物素和抗生物素蛋白，荧光素和抗荧光素，洋地黄毒苷/抗洋地黄毒苷(digioxigenin/anti-digioxigenin)。生物素和抗生物素蛋白包括生物素衍生物和抗生物素蛋白衍生物，如链霉亲和素，其可在使用复合物结合序列的分析规程被用作中间结合物质。例如，抗体可以用生物素标记(“生物素酰化”)，并被用于和预先固定在固相表面上的目标物质结合。根据本发明的利用抗生物素蛋白或链霉亲和素的荧光组合物即可被用于引入该荧光标记。
此处使用的“被固定”指试剂被固定在固体表面上。当试剂被固定至固体表面时，其可以被非共价或共价地结合至该表面。
此处使用的“整体式衬底”指具有一个折射指数的单块固体材料，如玻璃，石英，或塑料。
此处使用的“数值孔径”指表征角度范围的无量纲数，该系统可以在该范围上接收或发出光。
此处使用的“光学纤维”是可沿着其长度传送光的玻璃或塑料纤维。光学纤维通常为圆形横截面的绝缘波导管，其由绝缘材料(芯材)及围绕该绝缘材料的另一种具有更低折射指数的绝缘材料(包层)组成。
此处使用的“探针”指在传感侧包覆有被分析物结合分子的薄膜层的衬底。探针具有远端和近端。该近端(在此申请中也称为探针梢端)具有用被分析物结合分子的薄层包覆的传感表面。
荧光检测系统
本发明涉及一种荧光检测系统，其用于测量探针梢端上的荧光信号。发明人已经发现，通过将光源和检测器两者都安装在该探针的传感表面的近侧，进入检测光学器件的不希望的反射被降低，探测效率被提高。
该系统包括：(a)长度比宽度的纵横比至少为5比1的探针，该探针具有第一端和第二端，该第二端具有和荧光标记结合的传感表面；(b)用于直接发射激发光至该探针的传感表面的光源；(c)指向该传感表面的会聚透镜；和(d)用于检测该发射荧光的光学探测器；其中该会聚透镜会聚该发射荧光并将其引导至该光学探测器。
该探针可以为整体式衬底或光学纤维。该探针可以为任何形状，如杆形，圆柱形，圆形，正方形，三角形等，其长度比宽度的纵横比至少为5比1，优选为10比1。因为在免疫分析期间该探针被浸在样品溶液和一种或多种分析溶液中，需要有纵横比至少为5比1的长探针，使该探针的梢端能够浸入该溶液。在该长探针被转移至不同的反应室时也可以进行多相分析。避免了该分析期间分配和吸取试剂和样品。该探针的传感表面被包覆以被分析物结合分子，并与荧光标记结合。
任何可以发射适当的该荧光标记的激发光的光源均适用于本发明。优选的光源是可以发出适于荧光标记的波长的光的激光器。例如，该激光器中心波长对于Cy5荧光染料优选为649纳米。适宜的用于检测发射光的光学探测器是光电倍增管(PMT)，电荷耦合装置(CCD)，或光电二极管。
包括会聚透镜的该光源和该光学探测器被安装在该探针梢端表面(传感表面)的同一侧。如果该传感表面朝下，它们都被安装在该梢端表面以下。如果该传感表面朝上，它们都被安装在该梢端表面以上。它们离该传感表面比该探针的另一端更近。该传感表面始终在该会聚透镜的数值孔径之内。该探针可以是，但不一定是以这些会聚透镜中央对准。
图1显示了第一实施方式。光学透明的杆(探针)由玻璃或石英制成。该杆的下端被用作传感表面。荧光标记被结合至该传感表面。为检测该荧光，该杆的传感端被浸入具有透明底部的容器中，其含有为了荧光发射已优化的缓冲溶液。该透明底部的材料可以选自塑料，玻璃或石英。光学探测器和激发激光器被安装在该容器的同一侧，并且这些会聚透镜在该传感表面下。该激光器经过对准，以使该激光束以入射角α投射在该杆远端的表面上，α大于该杆的数值孔径的角度θ。因为该杆的折射指数比空气大得多，更接近该缓冲溶液，大部分入射激光将透过该杆。较少量的激光在该传感表面被反射。一些激光被结合入该杆，然后从该杆的另一端反射回来。当α＞θ时，该反射光离开该杆的传感表面以形成环形的光带。此环的中间光强低得多。由于这些会聚透镜被置于该环中央，进入该检测光学器件的不希望的反射被降低。为进一步减少此种反射，该杆的上端可以为锥形并砂磨至一定粗糙度。为了检测在该传感表面上的该发射光，可以用光电倍增管或CCD。该杆的传感表面和这些会聚透镜之间的距离是可调节的，以实现最佳探测效率。
图2显示了第二实施方式，其中该杆在容器中包含的空气中测量，而非在缓冲溶液中测量。该激光器和该检测器的结构类似于第一实施方式，其中光学探测系统和激发激光器被安装在该杆的同一侧，并且这些会聚透镜在该传感表面下。该激光器经过对准，以使该激光束以入射角α投射在该杆的传感表面上，α被设定为大于该杆的数值孔径的角度θ。一些入射的激光将透过该杆。大部分激光在该传感表面被反射。剩余的激光被结合入该杆，然后从该杆的上端被反射回来。当α＞θ时，该反射光离开该杆的传感表面以形成环形的光带。该环中间的光强低得多。由于这些会聚透镜被置于该环中央，避免了进入该检测光学器件的不希望的反射。为进一步减少此种反射，该杆的上端可以为锥形并砂磨至一定粗糙度。为了检测在该传感表面上的该发射光，可以用光电倍增管或CCD。该杆的传感表面和这些会聚透镜之间的距离是可调节的，以实现最佳探测效率。
图3显示了第三实施方式，用非透明的杆替换图1的实施方式中的透明杆。该非透明杆的材料可能是塑料，陶瓷，和金属。该杆的下端被用作传感表面。为了检测该荧光，该杆的传感表面被浸入具有透明底部的容器中，该容器包含为了荧光性能已经优化的缓冲溶液。该透明底部的材料可以选自塑料，玻璃或石英。光学探测系统和激发激光器被安装在该杆和该容器的同一侧，并且这些会聚透镜在该传感表面下。该激光器经过对准，以使该激光束以入射角α投射在该杆的传感表面上。因为该杆是非透明的，该激光束在该传感表面被反射和吸收。优选该杆的材料对于该激发激光发射最小限度的荧光。为了检测在该传感表面上的该发射光，可以使用光电倍增管或CCD。在该杆的传感表面和这些会聚透镜之间的距离是可调节的，以实现最佳探测效率。
图4显示了第四实施方式，其具有非透明的杆，其在容器中所含空气中而非缓冲溶液中进行测量。该非透明杆的材料可能是塑料，陶瓷，和金属。该杆的下端被用作传感表面。光学探测系统和激发激光器被安装在该容器的同一侧，并且这些会聚透镜在该传感表面下。该激光器经过对准，以使该激光束以入射角α投射在该杆的传感表面上。因为该杆是非透明的，该激光束在该传感表面被反射和吸收。优选该杆的材料对于该激发激光发射最小限度的荧光。为了检测在该传感表面上的该发射光，可以使用光电倍增管或CCD。在该杆的传感表面和这些会聚透镜之间的距离是可调节的，以实现最佳探测效率。
图5显示了第五实施方式，其具有涂覆在该杆的传感表面上的镜状薄膜。该杆可以是透明的或非透明的。该镜状薄膜涂层被用于反射光，既可以是激发光也可以是发射光。该镜涂层可以采用铝，金或银。SiO2的第二薄膜被任选地涂覆在该第一薄膜上。该非透明杆的材料可以是塑料，陶瓷，或金属。该透明杆的材料选自玻璃，石英，或塑料。荧光标记被结合至该传感表面。为了检测荧光，该杆的传感端被浸入具有透明底部的容器中，该容器包含为了荧光性能已经优化的缓冲溶液。该透明底部的材料可以选自塑料，玻璃或石英。光学探测系统和激发激光器被安装在该容器的同一侧，并且这些会聚透镜在该传感表面下。该激光器经过对准，以使该激光束以入射角α投射在该杆的传感表面上。因为该杆的传感表面被第一镜状薄膜覆盖，该激光束以反射角α被反射。为了检测在该传感表面上的该发射光，可以使用光电倍增管或CCD。在该杆的传感表面和这些会聚透镜之间的距离是可调节的，以实现最佳探测效率。
图6显示了第六实施方式，其在该杆的传感表面上使用镜状薄膜涂层，但是测量在空气中完成。该杆可以是透明的或非透明的。该镜状薄膜涂层被用于反射光，既可以是激发光也可以是发射光。该镜涂层可以使用铝，金或银。另一SiO2的薄层被任选地涂覆在该第一镜状薄膜上。该非透明杆的材料可以是塑料，陶瓷，和金属。该透明杆的材料选自玻璃，石英，或塑料。荧光标记被结合至该传感表面。为了检测该荧光，该杆的传感端，光学探测系统和激发激光器被安装在该杆的传感表面的同一侧，并且这些会聚透镜在该传感表面下。该激光器经过对准，以使该激光束以入射角α投射在该杆的传感表面上。因为该杆的传感表面被镜状薄膜覆盖，该激光束被反射。为了检测在该传感表面上的该发射光，可以用光电倍增管或CCD。该杆的传感表面和这些会聚透镜之间的距离是可调节的，以实现最佳探测效率。
尽管图2，4，和6示范了把激光器和光学探测器安装在探针梢端以下的方式，应当理解该探针可以被上下倒转，且该激光器和该光学探测器可以被安装在该传感表面以上，以检测该荧光信号。
用荧光免疫分析检测被分析物
本发明还涉及用于在液体样品中通过荧光免疫分析检测被分析物的方法。发明人已经发现以下步骤的组合使检测的灵敏度水平增加至皮克/毫升:(i)使用具有小传感表面面积的用于结合被分析物分子的探针，(ii)在反应容器中上下移动该探针梢端并水平流动该反应溶液，和(iii)使用结合了至少5个结合分子和至少25个荧光标记的高分子量聚合物。
图7示范了该方法的一个实施方式。在此实施方式中(两步结合)，该方法包括步骤：(a)获得一探针，其具有被固定在该探针梢端(传感表面)上的第一抗体，其中该梢端表面的直径≤5毫米；(b)将该探针梢端浸入包含具有被分析物的样品溶液的样品容器中；(c)在该样品容器中上下移动该探针梢端并水平流动该样品溶液，以使该被分析物和该第一抗体结合；(d)将该探针梢端浸入包含试剂溶液的试剂容器，该试剂溶液包括分子量至少一百万道尔顿，和至少5个第二抗体分子以及至少25个荧光标记结合的聚合物；(e)在该试剂容器中上下移动该探针梢端并水平流动该试剂溶液，以在该探针梢端上形成该被分析物，该第一抗体，该第二抗体的免疫复合体；(f)将该探针梢端浸入含洗液的洗涤容器中，并通过检测该探针梢端上的荧光信号检测所形成的免疫复合体；其中该第一抗体和该第二抗体是针对该被分析物的抗体；在上述方法中，可以在结合步骤(c)之后加入任选的洗涤步骤。因为由于结合表面面积小，携带溶液的量极少，可能不需要此额外的洗涤步骤。
在另一个实施方式中(两步结合)，该方法包括步骤：a)获得一探针，其具有被固定在该探针的梢端上的第一抗体，其中该梢端表面的直径≤5毫米；(b)将该探针梢端浸入一样品容器中，该样品容器含有(i)具有被分析物的液体样品和(ii)包括分子量至少为约一百万道尔顿，并与至少5个第二抗体分子以及至少25个荧光标记结合的聚合物的试剂溶液；(c)在该样品容器中上下移动该探针梢端并水平流动该试剂溶液，以在该探针梢端形成该被分析物，该第一抗体，和该第二抗体的免疫复合体；(d)将该探针梢端浸入含洗液的洗涤容器；和(e)通过检测该探针梢端上的荧光信号检测所形成的免疫复合体；其中该第一和第二抗体是针对该被分析物的抗体。
在又一个实施方式中(三步骤结合)，该方法包括步骤：(a)获得一探针，其具有被固定在该探针梢端上的第一抗体，其中该梢端表面的直径≤5毫米；(b)将该探针梢端浸入包含具有被分析物的样品溶液的样品容器中，在该样品容器中上下移动该探针梢端并水平流动该样品溶液；(c)将该探针梢端浸入包含试剂溶液的试剂容器，该试剂溶液包括和一结合配对的第一成员结合的第二抗体分子，在该试剂容器中上下移动该探针梢端并水平流动该试剂溶液；(d)将该探针梢端浸入含扩增溶液的扩增容器，该扩增溶液包括分子量至少为约一百万道尔顿，并和至少5个该结合配对的第二成员的分子以及至少25个荧光标记结合的聚合物，在该扩增容器中上下移动该探针梢端并水平流动该扩增溶液，以在该探针梢端上形成该被分析物，该第一抗体，该第二抗体，和该结合配对的第一和第二成员之间的免疫复合体；(e)将该探针梢端浸入含第二洗液的第二洗涤容器中；和(f)通过检测该探针梢端上的荧光信号检测所形成的免疫复合体；其中该第一抗体和该第二抗体是针对该被分析物的抗体；在上述方法中，可以在结合步骤(b)和(c)之后加入任选的洗涤步骤。因为结合表面面积小，携带溶液的量极少，可以不需要此额外的洗涤步骤。
将试剂固定至该固相(该探针梢端的传感表面)的方法在免疫生物化学中是常见的，其涉及该固相和试剂之间共价的，疏水性的或静电键的形成。被分析物结合分子可以被直接固定化在该传感表面上。或者，被分析物结合分子可以通过结合配对被间接固定在该传感表面上。例如，可以先通过对该固体表面的吸附或通过和该固体表面上涂覆的氨基丙基硅烷的共价结合固定抗荧光素，然后用荧光素标记的该被分析物结合分子可以通过荧光素和抗荧光素的结合(结合配对)结合至该固体表面。
本发明的方法实现了高灵敏度，这是由于独特地组合了(i)采用小传感表面面积的用于结合被分析物分子的探针，(ii)在反应容器中上下移动该探针梢端并水平流动该反应溶液，和(iii)采用与多重结合分子和多重荧光标记结合的高分子量聚合物。
本发明的第一要素是使用具有小梢端的用于结合被分析物的探针。该梢端具有较小的表面面积，其直径≤5毫米，优选≤2毫米或≤1毫米。该探针梢端的小表面赋予它若干优点。在固相免疫分析中，具有小表面面积是有利的，因为其具有更少的非特异性结合，并因此产生更低的背景信号。进一步地，由于该梢端的表面面积小，携带在该探针梢端上的试剂或样品也极小。此特征使该探针梢端便于洗涤，由于洗液具有较大的体积，其在该洗液中导致的污染可以忽略。该探针梢端的小表面面积的另一个方面是其结合量小。因此，当该探针梢端被浸入试剂溶液中时，该试剂的结合不会耗损大量该试剂。该试剂的浓度被有效地维持不变。对洗液污染可忽略不计以及试剂消耗少可以使该试剂溶液，该扩增溶液，以及该洗液被重复使用许多次，例如2-8次。
然而，在该探针梢端和表面面积的结合反应是缓慢的。当该探针梢端被浸入溶液时，结合表面面积和溶液体积的比率小，因此需要极长的培育时间，使靶分子扩散到该探针的传感表面。本发明提高灵敏度的第二要素是引起该溶液横向流动(轨道流)经过该探针梢端，经过探针梢端的溶液的横向流动加快靶分子因与已被固定于固定相的配偶体结合而被捕获在探针梢端上。例如，该反应容器可以被装在轨道振荡器上，并且该轨道振荡器以至少50rpm的速度旋转，优选至少200rpm，更优选至少500rpm，如500-1,000rpm。另外，该探针梢端以0.01至10毫米/秒的速度垂直于该轨道流的平面上下移动，以在该探针梢端以上和以下引起额外的溶液混合。将低背景的小表面和为了迅速捕获靶分子的流动的组合产生了高特异性的分析信号和低背景噪音，它们是分析灵敏度的决定因素。
本发明提高灵敏度的第三要素是使用以多重结合分子和多重荧光染料标记的高分子量聚合物。荧光染料作为免疫分析中的标记具有许多实用性的优点;主要是它们很稳定并且易于和结合蛋白相连。荧光染料的主要限制在于它们不能形成用于灵敏分析的足够的荧光信号。因此，在聚合物上具有多重荧光染料标记以增加荧光信号很重要。许多聚合物(如右旋糖酐和Ficoll和核酸聚合物)均适合作为染料载体。荧光标记可以直接附着于该聚合物，或者可以通过结合分子(如抗体或链霉亲和素)被间接附着于该聚合物。
当该结合分子是多肽或蛋白质(如抗体)时，该荧光标记可以采用科学和专利文献中所述的常规的结合化学作用通过各种部分与之共价结合，包括二硫化物，羟苯基，氨基，羧基，吲哚，或其它官能团。另外，抗体可以用已知的技术(见Wilchek和Bayer，(1988)ANAL.BIOCHEM.171：1-32)进行生物素酰化并且通过抗生物素蛋白/链霉亲和素分子连接该荧光标记。
该荧光标记与多核苷酸的共价结合可以用常规的结合化学作用通过各种部分实现，包括醛，酮，异硫氰酸酯，亚氨酸酯，肌苷，酰基和烷基，而许多参考文献也教导了用生物素的衍生。(Leary等(1983)Proc.Natl.AcadSci.USA80:4045-4049；WO86/02929；EP 063 879；Langer等(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA78：6633-6637；和EP 2009 996)。
美国专利号5,268,486；5,650,334描述了将芳基磺酸酯花青荧光染料标记结合至抗体及其它蛋白的示范性的技术，其内容以参考方式被合并于此。由宾夕法尼亚州，匹兹堡的Biological DetectionSystems公司出版的技术通报(标识为Cat.No.A25000)描述了将优选的Cy5荧光标记连接至抗体和核酸的技术。
本发明的方法可以由此申请中如上所述的荧光检测系统进行检测，其中光源和检测器被安装在探针传感表面的同一侧(近侧)。
另外，本发明的方法也可以由光源和检测器均安装在探针的传感表面的相对侧，并且接近于该探针另一端的光学系统(图8-9)进行检测。
在图8中，该探针可从该检测系统移除。激光被直接接入该探针的一端。该探针可以相对于该光学探测系统以X-Y-Z方向移动。此种运动可以在该探针和该光学探测系统之间精确对准。该探针梢端可以被浸入标准微量滴定板的孔中。该板被安装在轨道振荡器上。该探针梢端和该样品溶液在该孔中的相对运动可加快分析速度。
如图9的放大图所示，探针的梢端被直接浸入被分析物样品，用于结合分析。该联接端从该光学探测系统被卸下。光电倍增管(PMT)被用作光电探测器。
该探针可以由整体式衬底或光学纤维构成。如果该探针是光学纤维，则该纤维探针的联接端可以被涂覆以抗反射涂层，以增加联接效率。
在一个实施方式中，一偏振过滤器被置于该激光器的前端，并且一垂直偏振的第二偏振过滤器被置于该PMT的前端。采用两个偏振过滤器，不希望的激光反射被最小化。
在另一个实施方式中，该偏振过滤器可以被带通过滤器取代，其只允许该荧光波长通过。
该探针的芯直径大于0.1毫米，但不超过5毫米，优选不超过2毫米，或1毫米。优选的数值孔径在0.15和0.50之间。
含多个结合分子和荧光标记的高分子量支链多糖。
本发明还涉及荧光标记组合物，其包括(a)分子量至少为一百万道尔顿的交联Ficoll，(b)至少5个结合分子，和(c)至少25个荧光染料分子，其中这些结合分子和荧光染料分子与该交联Ficoll相连。该组合物优选包括5-50或5-100个结合分子和25-100或25-500个荧光染料分子。
在一个实施方式中，该荧光染料分子被直接与该交联Ficoll相连。在另一个实施方式中，该荧光染料分子通过结合分子(如抗体分子或链霉亲和素)被间接与该交联Ficoll相连。为了最小化荧光熄灭，这些荧光染料分子在沿着该交联Ficoll的被间隔开的位置与其相连
此荧光标记组合物是用于本发明上述方法的优选组合物。
Ficoll是商业上可获得的，其分子量为70K和400K道尔顿。Ficoll具有作为高分子载体的优点。将荧光蛋白质进行交联在提高分析灵敏度方面的一个问题是非特异性的背景信号会增加。以相同比例增加的特异性分析信号和背景信号会导致相同的信号和背景比率，而没有灵敏度改善。多糖总体上对于许多通常被应用于免疫分析的固相材料展现的非特异性结合可以被忽略。因此，在最小化对于该固相的非特异性结合时，Ficoll高分子载体增加了特异性结合的信号，由此增加信号和背景的比率，增强灵敏度。
相对于其它多糖右旋糖酐，Ficoll是有利的。由于右旋糖酐为直链，几乎没有分支点，其分子量分布极为多分散(polydisperse)。在将蛋白质连接到多糖载体的过程中，起始材料具有限定的，窄的分子量范围时，可获得可重复的结果。Ficoll的支链结构使其对于化学裂解或机械剪切有一定耐受度，并因此最小化对其分子量的影响。Ficoll的支链结构的另一个方面是其可以最小化该聚合物和用于免疫分析的固相材料的相互作用;因此相比于其它多糖，非特异性结合较少。
Ficoll400(分子量)是多分散的(polydisperse)并且大多数该材料实际上分离为比IgG小得多的分子。理想的多糖载体的分子量应大于一百万道尔顿，其在Sepharose4BCL柱的空隙体积或其附近洗出。极少Ficoll400制品表现为这种实际上有用的高分子量聚合物。
本发明的一个方面是制备Ficoll的交联衍生物，以形成高分子量聚合物。Ficoll的交联进一步增加该聚合物内的支化程度。本发明的这个方面的优点在于，通过控制该交联化学作用，可以在很宽的分子量范围内制备Ficoll聚合物。可以实现分子量大于一百万道尔顿的交联Ficoll，并且这些聚合物保持可溶解。这种聚合物能够进一步衍生，用于结合荧光染料和蛋白质；这些结合后的聚合物在固相结合分析中显示可以放大信号，并且最令人惊讶的是，对于该固相的低非特异性结合。这些性能特征是Ficoll400或其它多糖的商业制品不可预期的。
该交联的Ficoll组合物应具有以下特征：(a)可溶性大于2.5，5或10毫克/毫升；(b)平均水动力直径大于100，150，或200纳米；(c)分子量大于1，2，5，或10MD和(d)每Ficoll有至少25个用于连接结合分子和/或荧光染料分子的官能团。
Ficoll的胺衍生物是商业上可获得的，其能够交联。图10显示了制备交联Ficoll的流程图。
许多荧光发生团是商业上可获得的，如NHS衍生物，其允许和蛋白质(如链霉亲和素或抗体)的氨基结合。Cy5和AlexaFluor647是良好的例子。然后该被荧光标记的蛋白质通过使用沿用已久的马来酰亚胺/巯基蛋白质结合步骤或其它交联方法被结合至氨基Ficoll。图11显示了抗体结合至交联Ficoll的流程图。
交联Ficoll可以作为Cy5抗FITC的大分子载体，这种结合，与单体的Cy5抗FITC相比较，可以增加免疫分析灵敏度。
以下实施例进一步示范了本发明，其不应被解释为将本发明的范围限制为其中所述的特定步骤。
具体实施方式
实施例1交联Ficoll400的制备
图10显示了制备交联Ficoll400的流程图。
向2毫升经过胺化，使每Ficoll400kD含88个胺(SkoldTechnology)的Ficoll400(Sigma/Aldrich)的20毫克/毫升的PBS溶液添加10微升SPDP(6-[3-[2-吡啶二硫基]丙酰胺基]己酸琥珀酰亚胺酯，Invitrogen)的50毫克/毫升的DMF(N，N-二甲基甲酰胺)溶液。该SPDP与Ficoll的分子结合率(MCR)为15。在室温下使该混合物反应1小时，随后渗析。通过标准方法估算的硫醇结合为5.5/Fico11400kD。
为了去保护SPDP标记的Ficoll400上的硫醇，向20毫克在1毫升PBS中的溶液添加30微升DTT(二硫苏糖醇，ThermoScientific)的38毫克/毫升的PBS溶液，并使其在室温下反应两小时。在PD10柱上纯化该SH-Ficoll。
将SMCC(4-[N-马来酰亚胺基甲基]环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯)通过如下两种制备反应连接至胺化的Ficoll400(88个胺/Ficoll):1.)将10毫克胺化的Ficoll400在1毫升PBS中的溶液和25微升SMCC(Pierce Chemical)的10毫克/毫升的DMF溶液混合，使SMCC/Ficoll的MCR为30。该混合物在室温下反应两小时，随后在PDl0柱(GEHealthcare)上纯化。2.)将10毫克胺化的Ficoll400在1毫升PBS中的溶液和12.5微升SMCC的l0毫克/毫升的DMF溶液混合，使SMCC/Ficoll的MCR为15。该混合物在室温下反应2小时，随后在PDl0柱上纯化。
为了交联该SH-Ficoll400和SMCC-Ficoll400，进行了两种制备反应：1.)将10毫克SH-Ficoll400在1毫升PBS中的溶液和10毫克SMCC-Ficoll400在1毫升PBS中的溶液(30MCR)混合。2.)将10毫克SH-Ficoll400在1毫升PBS中的溶液和10毫克SMCC-Ficoll400在1毫升PBS中的溶液(l5MCR)混合。将混合物在30℃反应过夜。
为了提供抗体和该交联Ficoll400的连接位点，随后将残余的胺与过量的SPDP反应。将20毫克交联Ficoll400和75微升SPDP的50毫克/毫升的DMF溶液混合。该混合物在室温下反应1小时，随后相对于PBS渗析。
然后将该SPDP标记的交联Ficoll400制备反应物在Sepharose4BCL(GEHealthcare)柱上分离。结果表明该交联Ficoll是比天然的Ficoll400大得多的聚合物，并且交联的程度取决于SMCC的MCR。用30的SMCCMCR获得了高分子量聚合物，其在4BCL的空隙体积处或其附近，组分40-50被洗出，其峰大致位于组分45(图12)；它们是用于在之后和结合蛋白及荧光染料载体结合的优选的聚合物。作为对比，空隙组分为组分32，该非交联的SPDP-Ficoll高度分散，并且在组分50-120被洗出，其峰大致在组分98。
实施例2.Cy5-抗体-交联Ficoll结合物的制备
图11显示了制备Cy5-抗体-交联Ficoll400的流程图。
将抗FITC(Biospacific)在pH为9.5的1毫升0.1M碳酸钠溶液中的3.2毫克/毫升溶液和10.6微升Cy5-NHS(N-羟基琥珀酰亚胺，GEHealthcare)的10毫克/毫升DMF溶液混合，并使其在30℃反应1/2小时。然后在PD10柱上纯化该混合物。
将该Cy5-抗FITC在1毫升PBS中的1.5毫克/毫升溶液和1.9微升SMCC的5毫克/毫升的DMF溶液混合，并在室温下反应1小时，随后在PD10柱上纯化。
通过向0.7毫克交联Ficoll400-SPDP在1毫升PBS中的溶液加入30微升38毫克/毫升的DTT，并在室温下反应1小时，随后用PD10柱纯化该交联Ficoll，来将交联Ficoll400-SPDP上的硫醇去保护。
将该Cy5-抗FITC-SMCC与交联Ficoll400-SH混合，并在室温下反应过夜。然后加入10微升12.5毫克/毫升的NEM(N-乙基马来酰亚胺，Aldrich)，并在室温下反应1/2小时。然后在Sepharose4BCL柱上纯化该结合物。
实施例3.Cy5-抗体右旋糖酐结合物的制备
制备CyS-抗体右旋糖酐(直链)结合物(描述于美国专利5,650,334)，用于对比研究。
将抗FITC(Biospacific)在pH为9.5的1毫升0.1M碳酸钠溶液中的3.2毫克/毫升溶液和10.6微升Cy5-NHS(GE Healthcare)的10毫克/毫升DMF溶液混合，并使其在30℃反应1/2小时。然后在PD10柱上纯化该混合物。
将该Cy5-抗FITC在l毫升PBS中的1.5毫克/毫升溶液和1.9微升SMCC的5毫克/毫升的DMF溶液混合，并在室温下反应1小时，随后在PD10柱上纯化。
为了硫醇化右旋糖酐，将150微升的34毫克/毫升的6-[3-[2-吡啶二硫基]-丙酰胺基]己酸琥珀酰亚胺酯(LC-SPDP)(Pierce#21651)的DMF溶液加入5毫升含20毫克/毫升氨基右旋糖酐(MolecularProbes，#D-7145，130胺/右旋糖酐，2000kDM.W.)，pH为7.4的PBS溶液。在室温(RT)下进行反应30分钟，然后将该混合物在RT相对于PBS渗析过夜。在该反应期间，氨基右旋糖酐中超过95%的胺被LC-SPDP标记。然后该LC-SPDP-右旋糖酐在Sepharose 4BCL柱上被纯化。为去除低分子量右旋糖酐组分，仅收集空隙峰的组分。
将6.15毫升pH7.4，浓度为2.6毫克/毫升的Cy5-抗FITC的PBS溶液和156微升2.7毫克/毫升的SMCC(Pierce#22320)的DMF溶液混合，并使其在RT反应30分钟。通过在PD10柱上纯化去除未反应的SMCC。
通过将156微升的0.5M二硫苏糖醇加入5.2毫升的3.1毫克/毫升LC-SPDP-右旋糖酐，并在RT培育15分钟，来还原该LC-SPDP-右旋糖酐。然后在PD-10(Pharmacia#17-0851-01)柱上纯化该右旋糖酐。
通过将该被还原的LC-SPDP-右旋糖酐和SMCC-抗-FITC混合并在RT培育过夜，获得结合物。加入NEM(Sigma#12828-7)至1.0mM的最终浓度，以停止该反应。然后将该结合物加样至Sepharose4BCL柱，并且收集在空隙体积洗出的组分。
实施例4.肌钙蛋白I分析材料
反应盘由PMMA塑料制成，在其底部上固定有苯甲酮牛血清白蛋白(BSA)-生物素，其制备如下。然后将每盘100微升苯甲酮BSA-生物素在10微升/毫升的条件下通过紫外线-固化60分钟来固定。
用异双功能连接试剂，S-乙酰基硫代乙醇酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SATA，Pierce#26102)，和SMCC(Pierce#22320)制备链霉亲和素-单克隆抗TnI结合体(SA-抗TnI)。将十五(15)摩尔过量的SATA(以5毫克/毫升溶解于DMF中)与1毫克pH为7.4，0.74毫克/毫升的抗-TnI(BioDesign)的PBS溶液在室温下反应3小时。另外将15摩尔过量的SMCC(以5毫克/毫升溶解于DMF中)与1.1毫克的链霉亲和素在PBS中的1.1毫克/毫升溶液在室温下反应3小时。用PD10柱从抗TnI/SATA和链霉亲和素/SMCC反应混合物中去除未反应的连接物。将纯化的抗TnI-SATA和链霉亲和素-SMCC以1∶3的蛋白摩尔比率混合。通过加入1M羟胺开始该结合反应直至100mM的最终浓度，并在4℃培育18小时以上。通过在该反应混合物中加入100mM的NEM至1mM的最终浓度停止该反应，并在室温下培育15分钟。NEM培育后，用SephacrylS 300柱(GE Healthcare)纯化混合物。
将40微升25微克/毫升的SA-抗-TnI加入每个盘并在室温下培育1小时。分析缓冲液为PBS，1%BSA，0.1%吐温20，pH为7.4。然后洗涤该盘3次。
用荧光素标记亲合力纯化的山羊抗-TnI肽3(Biospacific)如下：将1毫克抗体的1.8毫升PBS溶液和64微升荧光素-NHS(Invitrogen)的2毫克/毫升DMF溶液混合并在室温下反应2小时，随后在PD10柱上纯化。
实施例5.Cy5-抗FITC对Cy5-抗FITC-交联Ficoll在肌钙蛋白I免疫分析中的比较
将40微升样品体积的0，10和50纳克/毫升的肌钙蛋白1加到盘中，并在室温下培育1小时。在分析缓冲液中洗涤这些盘三次。向每个盘加入40微升10微克/毫升荧光黄标记的抗TnI肽3，并在室温下培育25分钟，随后三次洗涤。将40微升10微升/毫升抗体的Cy5-抗FITC或Cy5-抗FITC-交联的(cx)Ficoll加入这些盘并在室温下培育25分钟，随后三次洗涤。接着测量每个盘表面上的Cy5荧光。(表1)。
表1：分析结果
Figure GDA0000365927620000161
实施例6.Cy5-抗FITC-交联Ficoll对Cy5-抗FITC-右旋糖酐在TnI免疫分析中的比较
将40微升样品体积的0 100纳克/毫升的肌钙蛋白I加到盘中，并在室温下培育1小时。在分析缓冲液中洗涤这些盘三次。向每个盘加入40微升10微克/毫升荧光素标记的抗TnI肽3，并在室温下培育120分钟，随后三次洗涤。将40微升10微克/毫升抗体的Cy5-抗FITC-右旋糖酐(实施例3)或Cy5-抗FITC-交联Ficoll(实施例2)加入这些盘并在室温下培育25分钟，随后三次洗涤。接着测量每个盘表面上的Cy5荧光(见表2)。
表2：分析结果
Figure GDA0000365927620000171
实施例7.Cy5-链霉亲和素-交联Ficoll的制备
链霉亲和素的Cy5标记
将32微升Cy5-NHS(GE Healthcare)在DMF中的5毫克/毫升溶液和1毫升链霉亲和素在0.1M，pH为9.5的碳酸钠缓冲液中的2.4毫克/毫升溶液在30℃反应40分钟。将该混合物施加于PD10柱(Pharmacia)，去除未结合的Cy5。光谱分析显示每链霉亲和素分子连接2.8个Cy5。
Cy5-链霉亲和素与交联Ficoll的结合
将5.8微升SMCC(Pierce Chemical)在DMF中的10毫克/毫升溶液和2毫克链霉亲和素在1毫升，pH为7.4的PBS中的溶液在室温下反应1小时。将该混合物施加于PD10柱，去除未结合的SMCC。
通过将30微升38毫克/毫升的DTT加入1毫克交联Ficoll400-SPDP在1毫升PBS中的溶液并在室温下反应1小时，来去保护交联Ficoll400-SPDP上的硫醇，随后用PD10柱纯化该交联Ficoll。
将该Cy5-链霉亲和素-SMCC与交联Ficoll400-SH混合，并在室温下反应过夜。然后加入10微升12.5毫克/毫升的NEM(Aldrich)，并在室温下反应1/2小时。然后在Sepharose4BCL柱上纯化该结合物。
实施例8.Cy5标记的交联Ficoll的制备以及和链霉亲和素的结合
上述方法(实施例2，3和7)需要该结合蛋白经受两次化学修饰，一为Cy5标记，第二是用SMCC修饰以结合至交联Ficoll。在一些情况下，特别是用抗体时，由于可能导致结合活性的损失，两次化学修饰并不令人满意。以下方法要求直接用Cy5标记交联Ficol1，随后结合至该结合蛋白。因此该方法仅需要对此结合蛋白进行单次化学修饰。
Cy5标记的交联Ficoll的制备
向2毫升经过胺化，使每Ficoll400kD含88个胺(SkoldTechnology)的Ficoll400(Sigma/Aldrich)在PBS中的20毫克/毫升溶液添加10微升SPDP(Invitrogen)在DMF中的50毫克/毫升溶液。该SPDP对Ficoll的分子结合率(MCR)为15。在室温下使该混合物反应1小时，随后渗析。通过标准方法估算的硫醇结合为5.5/Ficoll400kD。
为了去保护SPDP标记的Ficoll400上的硫醇，向20毫克在1毫升PBS中的溶液添加30微升DTT(Thermo Scientific)在PBS中的38毫克/毫升溶液，并使其在室温下反应两小时。在PD10柱上纯化该SH-Ficoll。
如下所述，将SMCC连接至胺化的Ficoll400(88个胺/Ficoll):将10毫克胺化的Fico11400(88个胺/Ficoll)在1毫升PBS中的溶液和25微升SMCC(Pierce Chemical)在DMF中的10毫克/毫升溶液混合，使SMCC/Ficoll的MCR为30。在室温下使该混合物反应两小时，随后在PD10柱上纯化。
为了交联该SH-Ficoll400和SMCC-Ficoll400，将10毫克SH-Ficoll400在1毫升PBS中的溶液和10毫克SMCC-Ficoll400在1毫升PBS中的溶液(30MCR)混合。将混合物在30℃反应过夜。
为了提供蛋白质和该交联Ficoll400的结合位点，随后将残余的胺与MCR为30的SPDP反应。将20毫克交联Ficoll400和64微升SPDP在DMF中的10毫克/毫升溶液混合。该混合物在室温下反应1小时，随后相对于PBS渗析。用MCR为30的SPDP进行修饰可留下足够数量的氨基，用于随后的Cy5-NHS标记。随后将该SPDP标记的交联Ficoll400制备反应物在Sepharose4BCL(GE Healthcare)柱上分离。
为了进行Cy5标记，将15微升Cy5-NHS在DMF中的5毫克/毫升溶液和1毫克SPDP-交联的Ficoll在1毫升0.1M，pH为9.0的碳酸钠溶液中的溶液在室温下反应1小时。在PD10柱中纯化该混合物。假定该交联Ficoll平均分子量为4百万道尔顿，光谱分析显示每一个交联的FIcoll结合约45个Cy5。抗体和链霉亲和素通常用约2个Cy5标记。
链霉亲和素与Cy5-交联Ficoll的结合
将5.8微升SMCC(Pierce Chemical)在DMF中的10毫克/毫升溶液和2毫克链霉亲和素在1毫升，pH为7.4的PBS中的溶液在室温下反应1小时。将该混合物加样至PD10柱，去除未结合的SMCC。
通过向0.7毫克交联Fico11400-SPDP在1毫升PBS中的溶液加入30微升38毫克/毫升的DTT，并在室温下反应1小时，在Cy5-交联Ficoll400-SPDP上的硫醇被去保护，随后用PD10柱纯化该交联Ficoll。
将该链霉亲和素-SMCC与Cy5-交联Ficoll400-SH混合，并在室温下反应过夜。然后加入10微升12.5毫克/毫升的NEM(Aldrich)，并在室温下反应1/2小时。然后在Sepharose 4BCL柱上纯化该结合物。
实施例9.A蛋白免疫分析，探针形式
探针制备
石英探针，直径1毫米，长度2厘米，其采用化学气相淀积工艺(Yield EngineeringSystems，1224)按照制造商的方案涂覆以氨基丙基硅烷。然后将该探针梢端浸入鼠单克隆抗荧光素(Biospacific)在pH为7.4的PBS中的10微克/毫升溶液中。在允许该抗体吸附于此探针5分钟之后，在PBS中洗涤该探针梢端。然后将该探针梢端浸入在PBS中包含10微克/毫升亲合力纯化的荧光素标记鸡抗A蛋白(Cygnus Technologies)的溶液中。用标准方法对该抗体进行荧光标记。10分钟后，在PBS中洗涤该探针梢端。
A蛋白免疫分析
图D中显示了该分析方式
将该抗A蛋白涂覆的探针梢端浸入一微孔，该微孔包含200微升稀释于分析缓冲液(PBS，10毫克/毫升BSA，0.1%吐温20)中的A蛋白样品。这些微孔位于轨道搅拌器上(Big Bear Automation)，并且该探针固定不动，微孔以2毫米直径的轨道行程，250rpm的转速运动。30分钟后，用PBS洗涤这些探针梢端3次。然后将这些梢端浸入具有200微升生物素标记亲合力纯化的鸡抗A蛋白(Cygnus Technologies)在分析缓冲液中的10微克/毫升溶液的微孔。通过标准方法将该抗A蛋白进行生物素酰化。在250rpm转速的轨道流动下培育5分钟后，用PBS洗涤这些探针3次。然后将这些探针梢端浸入含有Cy5-链霉亲和素-交联Ficoll在分析缓冲液中的10微克/毫升溶液的微孔。在250rpm转速的轨道流动下培育5分钟后，用PBS洗涤这些探针3次。用图1所示的光学器件测量结合至探针梢端的Cy5荧光。表3显示了结果。
表3
本发明及其制作和使用的方式和步骤现已用充分，清楚，简要和准确的术语进行了叙述，以使其所涉及领域技术人员能够进行同样的制造和使用。应当理解，上述内容描述了本发明的优选实施方式，并且在不离开权利要求所述的本发明范围的前提下，还可以进行修改。为了特别指出和清楚地申明被认为是发明的主题内容，以下列权利要求结束此说明书。

Claims (10)

1.在液体样品中检测被分析物的方法，包括步骤：
获取一探针，其具有被固定在该探针梢端的第一抗体，其中该梢端表面的直径≤5毫米；
将该探针梢端浸入含液体样品的容器中，该液体样品含有被分析物；
在该样品容器中水平流动该液体样品，以将该被分析物和该第一抗体结合；
将该探针梢端浸入含试剂溶液的试剂容器中，该试剂溶液包括分子量至少为一百万道尔顿，并且和至少5个第二抗体分子和至少25个荧光标记结合的聚合物；
在该试剂容器中水平流动该试剂溶液，以在该探针梢端上形成该被分析物，该第一抗体，和该第二抗体之间的免疫复合体；
将该探针梢端浸入含洗液的洗涤容器中；和
通过测量该探针梢端上的荧光信号检测该形成的免疫复合体；
其中该第一抗体和该第二抗体是针对该被分析物的抗体。
2.在液体样品中检测被分析物的方法，包括步骤：
获取一探针，其具有被固定在该探针梢端的第一抗体，其中该梢端表面的直径≤5毫米；
将该探针梢端浸入样品容器中，该样品容器包含(i)具有被分析物的液体样品和(ii)包括分子量至少为一百万道尔顿，并且和至少5个第二抗体分子和至少25个荧光标记结合的聚合物的试剂溶液；
在该样品容器中水平流动该液体样品和该试剂溶液，以在该探针梢端上形成该被分析物，该第一抗体，和该第二抗体的免疫复合体；
将该探针梢端浸入含洗液的洗涤容器中；和
通过测量该探针梢端上的荧光信号检测该形成的免疫复合体；
其中该第一抗体和该第二抗体是针对该被分析物的抗体。
3.在液体样品中检测被分析物的方法，包括步骤：
(a)获取一探针，其具有被固定化在该探针梢端的第一抗体，其中该梢端表面的直径≤5毫米；
(b)将该探针梢端浸入样品容器中，该样品容器含有具有被分析物的样品溶液，并在该样品容器中水平流动该样品溶液；
(c)将该探针梢端浸入含试剂溶液的试剂容器中，该试剂溶液包括和一结合配对的第一成员结合的第二抗体分子，并在该试剂容器中水平流动该试剂溶液；
(d)将该探针梢端浸入含扩增溶液的扩增容器中，该扩增溶液包括分子量至少为一百万道尔顿，并且和该结合配对的至少5个分子的第二成员以及至少25个荧光标记结合的聚合物，并在该扩增容器中水平流动该扩增溶液，以在该探针梢端上形成该被分析物，该第一抗体，该第二抗体，和该结合配对的第一和第二成员的免疫复合体；
(e)将该探针梢端浸入含第二洗液的第二洗涤容器中；和
(f)通过测量该探针梢端上的荧光信号检测形成的免疫复合体，其中该第一抗体和该第二抗体是针对该被分析物的抗体。
4.根据权利要求1，2，或3的方法，其中该梢端表面的直径小于2毫米。
5.根据权利要求3的方法，其中该结合配对的第一成员是生物素，并且该结合配对的第二成员是链霉亲和素。
6.根据权利要求1-3中任一项的方法，其中所述聚合物是交联Ficoll。
7.根据权利要求6的方法，其中所述荧光标记是芳基磺酸酯花青染料。
8.根据权利要求7的方法，其中所述芳基磺酸酯花青染料是Cy5。
9.根据权利要求1-3中任一项的方法，其中所述探针长度比宽度的纵横比至少为5比1。
10.根据权利要求3的方法，其中在步骤（b）在该样品容器中，在步骤（c）在该试剂容器中，和/或在步骤（d）在该扩增容器中，上下移动所述探针梢端。
CN201080010177XA 2009-03-03 2010-03-02 用于高灵敏度荧光分析的检测系统和方法 Active CN102341696B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201310549211.6A CN103604786B (zh) 2009-03-03 2010-03-02 用于高灵敏度荧光分析的检测系统和方法

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US20911609P 2009-03-03 2009-03-03
US61/209,116 2009-03-03
US29952510P 2010-01-29 2010-01-29
US61/299,525 2010-01-29
US30356710P 2010-02-11 2010-02-11
US61/303,567 2010-02-11
PCT/US2010/025938 WO2010101931A2 (en) 2009-03-03 2010-03-02 Detection system and method for high sensitivity fluorescent assays

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201310549211.6A Division CN103604786B (zh) 2009-03-03 2010-03-02 用于高灵敏度荧光分析的检测系统和方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN102341696A CN102341696A (zh) 2012-02-01
CN102341696B true CN102341696B (zh) 2013-12-11

Family

ID=42710193

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201310549211.6A Active CN103604786B (zh) 2009-03-03 2010-03-02 用于高灵敏度荧光分析的检测系统和方法
CN201080010177XA Active CN102341696B (zh) 2009-03-03 2010-03-02 用于高灵敏度荧光分析的检测系统和方法

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201310549211.6A Active CN103604786B (zh) 2009-03-03 2010-03-02 用于高灵敏度荧光分析的检测系统和方法

Country Status (5)

Country Link
US (5) US8309369B2 (zh)
EP (1) EP2404162B1 (zh)
JP (3) JP5775004B2 (zh)
CN (2) CN103604786B (zh)
WO (1) WO2010101931A2 (zh)

Families Citing this family (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050118727A1 (en) * 2003-12-01 2005-06-02 Carsten Schelp Conjugates and their use in detection methods
WO2010101931A2 (en) * 2009-03-03 2010-09-10 Access Medical System Co., Ltd. Detection system and method for high sensitivity fluorescent assays
CN106018782A (zh) * 2011-01-08 2016-10-12 万迈医疗仪器有限公司 用于免疫分析检测的系统
US9804179B2 (en) 2011-01-08 2017-10-31 Access Medical Systems, Ltd. Systems for immunoassay tests
CN105181659A (zh) 2011-04-20 2015-12-23 万迈医疗仪器有限公司 发光聚合物循环扩增
US9568431B2 (en) 2012-04-16 2017-02-14 Access Medical Systems, Ltd. Luminescent immunoassays for quantitating analytes having a wide concentration range
US20130330711A1 (en) * 2012-06-06 2013-12-12 National Taiwan University Sensor for detection of a target of interest
WO2016077486A1 (en) * 2014-11-12 2016-05-19 Becton, Dickinson And Company Polymeric dye specific binding members and methods of making and using the same
GB201506992D0 (en) * 2014-11-14 2015-06-10 Nplex Pty Ltd A portable in-vitro diagnostic detector
CN107533052B (zh) * 2015-05-11 2023-04-28 万迈医疗仪器有限公司 在免疫测定中重复使用测试探针和试剂的方法
CN105486667A (zh) 2015-07-01 2016-04-13 上海睿钰生物科技有限公司 集成式荧光激发光源装置
CN107923908B (zh) * 2015-08-26 2021-01-05 万迈医疗仪器有限公司 具有提高的灵敏度的免疫检定
US10379049B2 (en) 2015-10-15 2019-08-13 Lumos Diagnostics IP Pty Ltd Device for reading an IVD assay
CN110036276A (zh) * 2016-10-11 2019-07-19 万迈医疗仪器有限公司 使用干涉仪的生物分子光学传感器
CN110023756B (zh) * 2016-10-31 2023-06-30 万迈医疗仪器有限公司 基于干涉测量在免疫测定中重复使用测试探针和试剂的方法
CN106841133A (zh) * 2016-12-31 2017-06-13 必欧瀚生物技术（合肥）有限公司 一种基于荧光免疫层析技术的定量检测计算方法
US11415523B2 (en) * 2017-09-06 2022-08-16 Clemson University Research Foundation Coupon design for enhanced color sensitivity for colorimetric-based chemical analysis of liquids
CN111050914B (zh) 2017-09-06 2023-04-04 万迈医疗仪器有限公司 用于搅动微孔中的液体的铁磁转子
TW201942574A (zh) * 2018-02-21 2019-11-01 美商Ｄｏｔｓ科技公司 用於過敏原偵測的系統及方法
JP7035972B2 (ja) * 2018-11-09 2022-03-15 横河電機株式会社 核酸配列計測用デバイス
CN109765407B (zh) * 2019-01-10 2020-03-17 西安交通大学 一种基于一维纳米材料的大长径比探针制备方法
WO2021020910A1 (ko) * 2019-07-30 2021-02-04 피씨엘 ㈜ 다중 바이오마커 동시 분석 기기 및 다중 바이오마커 동시 분석 방법
CN116648458A (zh) * 2020-12-23 2023-08-25 万迈医疗仪器有限公司 使用荧光和化学发光标记两者的检测方法
CN113125421B (zh) * 2021-04-09 2022-07-12 华中农业大学 一种光纤生物传感器及其在均相化学发光生物检测中的应用
WO2023060139A1 (en) * 2021-10-08 2023-04-13 Access Medical Systems, Ltd. Method for re-using a test solid surface in a biochemical assay
WO2023205609A1 (en) * 2022-04-18 2023-10-26 Access Medical Systems, Ltd. Method for determining dna concentration in dna virus

Family Cites Families (57)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3300474A (en) * 1964-02-12 1967-01-24 Pharmacia Ab Sucrose ether copolymerizates
US3996345A (en) * 1974-08-12 1976-12-07 Syva Company Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays
US4272510A (en) * 1976-04-26 1981-06-09 Smith Kendall O Magnetic attraction transfer process for use in solid phase radioimmunoassays and in other assay methods
AT343822B (de) * 1976-08-20 1978-06-26 Immuno Ag Radioimmunologisches verfahren und einrichtung zur bestimmung von antigenen
US4200613A (en) * 1977-06-03 1980-04-29 Ramco Laboratories Inc. Radioimmunoassay apparatus
US4208479A (en) * 1977-07-14 1980-06-17 Syva Company Label modified immunoassays
CA1219824A (en) 1981-04-17 1987-03-31 David C. Ward Modified nucleotides and methods of preparing and using same
US4434150A (en) * 1981-10-19 1984-02-28 Ortho Diagnostic Systems, Inc. Immunological reagents employing polymeric backbone possessing reactive functional groups
US4447546A (en) * 1982-08-23 1984-05-08 Myron J. Block Fluorescent immunoassay employing optical fiber in capillary tube
US4483925A (en) * 1982-12-30 1984-11-20 Becton, Dickinson And Company Liquid removal device
US4599315A (en) * 1983-09-13 1986-07-08 University Of California Regents Microdroplet test apparatus
EP0155224A3 (en) * 1984-03-15 1987-05-06 CHROMAGENICS, Inc. Solid-borne complex bearing chromagen responsive functionality for antibody, antigen, receptor, or ligand detection
DE3416933A1 (de) * 1984-05-04 1985-11-07 Dora 1000 Berlin Köhler Mit antigenen oder antikoerpern beschichteter traeger
SE456346B (sv) * 1984-07-23 1988-09-26 Pharmacia Ab Gel for att forhindra adhesion mellan kroppsvevnader och sett for dess framstellning
US4828979A (en) 1984-11-08 1989-05-09 Life Technologies, Inc. Nucleotide analogs for nucleic acid labeling and detection
US5268486A (en) * 1986-04-18 1993-12-07 Carnegie-Mellon Unversity Method for labeling and detecting materials employing arylsulfonate cyanine dyes
US4778751A (en) * 1986-05-12 1988-10-18 Diagnostic Products Corporation Method for measuring antigens or antibodies in biological fluids using ligand labeled antigens or ligand labeled antibodies
US5252494A (en) * 1986-06-25 1993-10-12 Trustees Of Tufts College Fiber optic sensors, apparatus, and detection methods using controlled release polymers and reagent formulations held within a polymeric reaction matrix
US4891321A (en) * 1987-10-21 1990-01-02 Hubscher Thomas T Apparatus for performing determinations of immune reactants in biological fluids
JP2711332B2 (ja) * 1988-04-15 1998-02-10 株式会社ヤトロン 非水溶性物質の透明な水溶液が得られる凍結乾燥品の製造方法
JP3130513B2 (ja) * 1989-04-19 2001-01-31 イビデン株式会社 生体活性物質測定用装置
JP3025078B2 (ja) * 1990-11-26 2000-03-27 イビデン株式会社 蛍光分析法
US5244813A (en) * 1991-01-25 1993-09-14 Trustees Of Tufts College Fiber optic sensor, apparatus, and methods for detecting an organic analyte in a fluid or vapor sample
US5244636A (en) * 1991-01-25 1993-09-14 Trustees Of Tufts College Imaging fiber optic array sensors, apparatus, and methods for concurrently detecting multiple analytes of interest in a fluid sample
US5250264A (en) * 1991-01-25 1993-10-05 Trustees Of Tufts College Method of making imaging fiber optic sensors to concurrently detect multiple analytes of interest in a fluid sample
US5320814A (en) * 1991-01-25 1994-06-14 Trustees Of Tufts College Fiber optic array sensors, apparatus, and methods for concurrently visualizing and chemically detecting multiple analytes of interest in a fluid sample
JP3107649B2 (ja) * 1991-12-20 2000-11-13 イビデン株式会社 蛍光免疫測定装置
FI930440A0 (fi) * 1993-02-01 1993-02-01 Labsystems Oy Bestaemningsfoerfarande
US5981172A (en) * 1994-02-14 1999-11-09 Abbott Laboratories Non-A, non-B, non-C, non-D, non-E Hepatitis reagents and methods for their use
HUT75018A (en) 1994-05-02 1997-03-28 Ciba Geigy Ag Optical sensor system and their parts and process for determining ph value of electrolyt solutions and their ionic strength
US5690894A (en) * 1995-05-23 1997-11-25 The Regents Of The University Of California High density array fabrication and readout method for a fiber optic biosensor
US5650334A (en) * 1995-08-31 1997-07-22 First Medical, Inc. Fluorescent labelling compositions and methods for their use
US5814524A (en) * 1995-12-14 1998-09-29 Trustees Of Tufts College Optical sensor apparatus for far-field viewing and making optical analytical measurements at remote locations
US6210910B1 (en) * 1998-03-02 2001-04-03 Trustees Of Tufts College Optical fiber biosensor array comprising cell populations confined to microcavities
DK1101115T3 (da) * 1998-07-30 2004-10-25 Oakville Trading Hong Kong Ltd Fremgangsmåde til fremstilling af vandoplöselige tværbundne konjugater
US20020119581A1 (en) 2001-01-05 2002-08-29 Daniloff George Y. Detection of analytes
JP3429282B2 (ja) * 2001-02-02 2003-07-22 リサーチ・インターナショナル・インコーポレーテッド 自動化されたシステム、及びサンプルの分析方法
JP2002236223A (ja) * 2001-02-09 2002-08-23 Olympus Optical Co Ltd ファイバープローブ光検出器
DK2423335T3 (da) * 2001-06-21 2014-08-18 Dynavax Tech Corp Kimæriske immunmodulatoriske forbindelser og fremgangsmåder til anvendelse deraf
CA2474783A1 (en) * 2002-02-06 2003-08-14 Joerg Schierholz Pluripotent embryonic-like stem cells derived from teeth and uses thereof
CN2559982Y (zh) * 2002-08-27 2003-07-09 中国科学院光电技术研究所 具有均匀照明系统的ccd生物芯片检测仪
DE60315043T2 (de) * 2002-09-20 2008-04-10 Queen's University At Kingston, Kingston Nachweis biologischer moleküle mittels differentieller aufteilung von enzymsubstraten und -produkten
CN1200269C (zh) * 2003-02-28 2005-05-04 中国科学院上海光学精密机械研究所 多探头光纤倐逝波生物传感器
JP3986451B2 (ja) * 2003-03-11 2007-10-03 富士通株式会社 免疫測定装置
WO2005054301A1 (ja) * 2003-11-14 2005-06-16 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 架橋多糖微粒子およびその製造方法
CA2544577C (en) * 2003-12-01 2013-01-08 Dako Denmark A/S Methods and compositions for immuno-histochemical detection
EP1586903A1 (en) * 2004-03-30 2005-10-19 Sysmex Corporation Method for screening cervical cancer
EP1790665B1 (en) * 2004-09-07 2014-11-05 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Process for producing water-soluble modified hyaluronic acid
FR2878241B1 (fr) 2004-11-21 2007-01-12 Agroquip Sarl Soc D Expl Des E Machine automatique pour la formation d'un noeud a l'aide d'une ficelle en extremite d'une gaine tubulaire en vue de l'obturer par constriction sous l'effet du serrage du noeud
US8741813B2 (en) * 2005-12-15 2014-06-03 General Electric Company Composition, device and associated method
EP1989547A1 (en) * 2006-02-28 2008-11-12 Medical Research Council Targeted iron oxide nanoparticles
GB2443694B (en) * 2006-11-10 2011-09-14 Platform Diagnostics Ltd Analyte saturation assay, methods and kits and devices
KR101491700B1 (ko) * 2007-08-23 2015-02-11 가부시키가이샤 엘에스아이 메디엔스 비특이반응 억제제
CN101251469A (zh) * 2007-08-24 2008-08-27 港龙生物技术（深圳）有限公司 诊断人乳头瘤病毒感染的荧光pcr方法
CN101118216A (zh) * 2007-09-07 2008-02-06 中国科学院长春光学精密机械与物理研究所 一种光纤生物探针及其制作方法和用途
WO2010101931A2 (en) * 2009-03-03 2010-09-10 Access Medical System Co., Ltd. Detection system and method for high sensitivity fluorescent assays
US9568431B2 (en) * 2012-04-16 2017-02-14 Access Medical Systems, Ltd. Luminescent immunoassays for quantitating analytes having a wide concentration range

Also Published As

Publication number Publication date
US8309369B2 (en) 2012-11-13
EP2404162B1 (en) 2017-12-27
US20130052081A1 (en) 2013-02-28
JP5775004B2 (ja) 2015-09-09
US10379116B2 (en) 2019-08-13
CN103604786B (zh) 2017-01-11
EP2404162A2 (en) 2012-01-11
CN102341696A (zh) 2012-02-01
US20160370363A1 (en) 2016-12-22
US20110312105A1 (en) 2011-12-22
JP6737856B2 (ja) 2020-08-12
JP6461732B2 (ja) 2019-01-30
US20140128596A1 (en) 2014-05-08
WO2010101931A3 (en) 2011-01-06
US9434789B2 (en) 2016-09-06
JP2019048986A (ja) 2019-03-28
US20130041141A1 (en) 2013-02-14
CN103604786A (zh) 2014-02-26
US8415172B2 (en) 2013-04-09
JP2012519850A (ja) 2012-08-30
JP2015166750A (ja) 2015-09-24
WO2010101931A2 (en) 2010-09-10
US8492139B2 (en) 2013-07-23
EP2404162A4 (en) 2012-08-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102341696B (zh) 用于高灵敏度荧光分析的检测系统和方法
US5242797A (en) Nucleic acid assay method
US5268486A (en) Method for labeling and detecting materials employing arylsulfonate cyanine dyes
US5569587A (en) Method for labeling and detecting materials employing luminescent arysulfonate cyanine dyes
CN102072891B (zh) 金属修饰的光子晶体生物检测薄膜及其制备方法和用途
AU703881B2 (en) Fluorescent and luminescent labelling compositions and methods for their use
US6306589B1 (en) Biological assays for analyte detection
CN101339135B (zh) 利用光子晶体提高生物检测灵敏度的方法
Maragos et al. Fiber‐optic immunosensor for mycotoxins
WO2010134592A1 (ja) Ｓｐｆｓ－ｌｐｆｓ系による測定方法に供するプラズモン励起センサおよびアッセイ法
US20210041428A1 (en) Immunoassay with enhanced sensitivity
EP0594606A1 (en) Radiative transfer fluorescence assay
Galla et al. Simultaneous antigen detection using multiplex dyes
JP3025078B2 (ja) 蛍光分析法
JP2951398B2 (ja) 生体活性物質測定用試薬、その製法及び測定方法
WO2023196141A1 (en) Tandem dyes having internally positioned sensors, and methods for making and using the same

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant