JP3025078B2 - 蛍光分析法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、蛍光分析法において、
蛍光物質に塩基性条件下にて最大励起波長の約２倍の波
長の光を照射すると、二光子吸収によって短波長の蛍光
を放射することを利用して、小型の装置を用いて高感度
に蛍光分析を行う方法に関する。

【０００２】

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】従来、
蛍光分析法により生体試料を分析するには、蛍光物質、
とくにフルオレセイン、ウンベリフェロンなどの蛍光物
質に３００〜６００ｎｍの励起光を照射して、発する蛍
光を測定する方法が知られているが、励起光と蛍光との
波長の差は２０〜９０ｎｍと殆んど差がないため、励起
光を吸収除去するために用いるフィルターに蛍光も吸収
され、蛍光の損失が大きかった。また、励起光の発生装
置の小型化が望まれているが、３００〜６００ｎｍの領
域では励起光源として使用できる半導体レーザーがなか
った。

【０００３】

【課題を解決するための手段】本発明者は、塩基性条件
下では蛍光物質が、最大励起波長の１／２のエネルギー
の光子を２個吸収して１個の光子を放出する二光子吸収
により蛍光放射することを見い出した。つまり、従来の
３００〜６００ｎｍの波長の励起光で蛍光を発する物質
は、塩基性条件下では約２倍の６００〜１２００ｎｍの
波長でも励起し、その蛍光は３００〜６００ｎｍで励起
される蛍光と同波長で、同強度又はそれ以上の強度の蛍
光を発する。このため市販の半導体レーザーなどで、高
効率で蛍光物質を励起できるため、装置を小型化するこ
とが可能であり、またフィルターによる蛍光の吸収損失
が少なく、また長波長領域の励起光を使用するので量子
収率がよく、高感度化が実現できることを見い出した。

【０００４】本発明で述べる最大励起波長（λｎｍ）と
は、塩基性条件下にて、一光子励起により発する蛍光の
強度が、最大となる励起波長である。最大励起波長は、
主に塩基性条件下における蛍光物質の極大吸収波長に相
当する。

【０００５】また、最大励起波長（λｎｍ）の約２倍の
波長とは、２λ±１００（ｎｍ）以下の波長を意味し、
より好ましくは２λ±５０（ｎｍ）の波長である。本発
明においては、蛍光物質の最大励起波長（λｎｍ）の約
２倍の波長領域のレーザー光ならば、１種類の波長に限
定されず、波長の異なる複数のレーザー光を励起光源と
して使用できる。

【０００６】本発明の方法は、次のような蛍光分析に利
用することができる。 （１）塩基に可溶性の蛍光性被測定物質を、塩基性条件
下で該蛍光物質の最大励起波長の約２倍の波長のレーザ
ー光で励起し、蛍光を測定することを特徴とする蛍光分
析法。

【０００７】（２）光ファイバーのコア表面に免疫物質
を固定化し、（ａ）該コア表面の免疫物質に対して、被
測定物質及び塩基に可溶性の蛍光物質で標識された被測
定物質と同一の免疫反応を示す物質を競合的に反応させ
るか、或いは、（ｂ）該コア表面の免疫物質と被測定物
質を反応させ、次いで塩基に可溶性の蛍光色素で標識さ
れた被測定物質と免疫反応する物質を反応させた後、塩
基性条件下で該蛍光物質の最大励起波長の約２倍の波長
のレーザー光で励起し、蛍光を測定することを特徴とす
る蛍光免疫分析法。

【０００８】（３）光ファイバーのコア表面に免疫物質
を固定化し、（ａ）該コア表面の免疫物質に対して、被
測定物質及びビオチンが結合した被測定物質と同一の免
疫反応を示す物質を競合的に反応させるか、或いは、
（ｂ）該コア表面の免疫物質と被測定物質を反応させ、
次いで、ビオチンが結合した被測定物質と免疫反応する
物質を反応させた後、塩基に可溶性の蛍光物質で標識し
たアビジンを反応させ、塩基性条件下で該蛍光物質の最
大励起波長の約２倍の波長のレーザー光で励起し、蛍光
を測定することを特徴とする蛍光免疫分析法。

【０００９】蛍光物質としては、塩基に可溶性の４−メ
チルウンベリフェロン、フルオレセイン、ジクロロフル
オレセイン、ビス（ｐ−ヒドロキシフェニルプロピオン
酸）などがあげられる。励起波長と蛍光波長の関係は表
１のとおりである。

【００１０】

【表１】

【００１１】塩基性条件はpH８〜１３が望ましく、pHが
これより高すぎると蛍光物質が加水分解されるおそれが
あり好ましくない。方法（１）は、塩基に可溶性の蛍光
性被測定物質を、塩基性条件下に該蛍光物質の最大励起
波長の約２倍の波長のレーザー光で励起し、蛍光を測定
するものである（実施例１参照）。蛍光性被測定物質は
蛍光標識された被測定物質であってもよい。被測定物質
を蛍光標識する方法としては、被測定物質に蛍光物質を
直接結合させてもよく、被測定物質と特異的に結合する
物質や、アビジン−ビオチンなどを介して結合させても
よい。

【００１２】方法（２）は、競合法（ａ）とサンドイッ
チ法（ｂ）に大別される。競合法（ａ）では、濃度既知
である塩基に可溶性の蛍光性物質で標識された被測定物
質と同一の免疫反応を示す物質（例えば抗原）と被測定
物質を混合し、次いで、この溶液に免疫物質（例えば抗
体）を固定化した光ファイバーを浸漬し、競合的に反応
させる（抗原−抗体反応）。競合法では、被測定試料の
濃度が高ければ、蛍光性物質で標識された被測定物質の
光ファイバーへの結合量が少ないので、蛍光強度が低下
する（実施例５参照）。

【００１３】サンドイッチ法（ｂ）では、被測定物質
（例えば抗原）の溶液に、免疫物質（例えば抗体）を固
定化した光ファイバーを浸漬して反応させ（抗原−抗体
反応）、次いでこの光ファイバーを、塩基に可溶性の蛍
光性物質で標識され、被測定物質と特異的に反応する被
測定物質と免疫反応する物質（例えば抗体）の溶液に浸
漬して反応させる。サンドイッチ法では、光ファイバー
上の免疫物質と蛍光物質で標識された被測定物質と免疫
反応する物質で被測定物質がサンドイッチされた状態と
なる。サンドイッチ法では、被測定物質の濃度が高けれ
ば、蛍光性物質で標識された被測定物質と免疫反応する
物質の光ファイバーへの結合量も多いので、蛍光強度が
高くなる（実施例４参照）。

【００１４】方法（２）により、被測定物質の濃度を測
定する方法において、測定感度を向上させるためには、
免疫分子（抗原又は抗体分子）１個あたりの蛍光物質の
結合量を増やす必要があり、このために、免疫分子すな
わち、被測定物質と同一の免疫反応を示す物質又は被測
定物質と免疫反応する物質が、ビオチンと結合し、該ビ
オチンは塩基に可溶性の蛍光物質で標識されたアビジン
が結合しているか、あるいは複数の反応活性基を有する
物質と結合し、該複数の反応活性基にはビオチンを介し
て塩基に可溶性の蛍光物質で標識されたアビジンが結合
していることが好ましい。このような方法においては、
被測定物質と同一の免疫反応を示す物質又は被測定物質
と免疫反応する物質に、塩基に可溶性の蛍光物質で標識
されたアビジンが多数結合していることにより、免疫分
子すなわち、被測定物質と同一の免疫反応を示す物質分
子又は被測定物質と免疫反応する物質の１分子当りの蛍
光物質の結合量を増やすことができ、検出感度を飛躍的
に向上させるのに役立つ。

【００１５】アビジンとビオチンは、これらと同等の作
用を有する化合物で置き換えることができる。例えば抗
体−プロテインＡなどの組合わせなどが使用できる。複
数の反応活性基を有する物質としては、ポリリジン、キ
トサン、ポリガラクトサミン、ポリノイラミン酸のよう
なポリペプチド又はアミノグリカンが用いられ、とくに
キトサンが好適である。反応活性基は１分子当り２０〜
１０万個、好ましくは４０００〜５０００個が存在して
いることが望ましい。

【００１６】さらに、方法（２）において、不安定な蛍
光物質を標識として使用する場合には、方法（３）が望
ましい。方法（３）は、競合法（ａ）とサンドイッチ法
（ｂ）による蛍光免疫分析法であるが、アビジンとビオ
チンが特異的に結合することを利用して、光ファイバー
上に免疫物質を固定化した後に、前記被測定物質と同一
の免疫反応を示す物質又は被測定物質と免疫反応する物
質に、ビオチンが結合した物質、あるいは複数の反応活
性基を有する物質が結合し、該複数の反応活性基にはビ
オチンが結合した物質を前記光ファイバー上の免疫物質
と反応させた後に、塩基に可溶性の蛍光物質で標識され
たアビジンを結合させるものである。この理由は、水溶
液中ではある種の蛍光物質は加水分解や酸化を受けやす
いので、蛍光物質による標識は測定直前がよいからであ
る。

【００１７】競合法（ａ）では、被測定物質とビオチン
が結合した被測定物質と同一の免疫反応を示す物質を混
合し、この溶液に免疫物質を固定化した光ファイバーを
浸漬して競合的に反応させる（抗原−抗体反応）。次い
で、塩基に可溶性の蛍光物質で標識されたアビジンを反
応させると、ビオチンにアビジンが結合し、被測定物質
と同一の免疫反応を示す物質がビオチン−アビジンを介
して蛍光物質で標識される。競合法では、被測定物質の
濃度が高ければ、蛍光物質で標識された被測定物質と同
一の免疫反応を示す物質の光ファイバーへの結合量が少
ないので、蛍光強度が低下する（実施例３参照）。

【００１８】サンドイッチ法（ｂ）では、被測定物質の
溶液に免疫物質を固定化した光ファイバーを浸漬して反
応させ、光ファイバー上の免疫物質と被測定物質を結合
させる。次いで、この光ファイバーをビオチンが結合し
た被測定物質と免疫反応する物質の溶液に浸漬する。こ
れにより、光ファイバー上の免疫物質とビオチンが結合
した被測定物質と免疫反応する物質が、被測定物質をサ
ンドイッチした状態で結合される。その後、この光ファ
イバーを塩基に可溶性の蛍光物質で標識されたアビジン
の溶液に浸漬すると、ビオチンにアビジンが結合し、被
測定物質と免疫反応する物質がビオチン−アビジンを介
して蛍光物質で標識される。サンドイッチ法では、被測
定物質の濃度が高ければ、蛍光物質で標識された被測定
物質と免疫反応する物質の光ファイバーへの結合量も多
いので、蛍光強度が高くなる（実施例２参照）。

【００１９】方法（２）で述べたように、被測定物質と
同一の免疫反応を示す物質又は被測定物質と免疫反応す
る物質が複数の反応活性基を有する物質に結合し、その
複数の反応活性基にはビオチンが結合していることが望
ましい。アビジンとビオチンはこれらと同等の作用を有
する化合物の組み合わせで置き換えることができる。

【００２０】方法（２）及び方法（３）における、被測
定物質と免疫反応する物質又は被測定物質と同一の免疫
反応を示す物質が、複数の反応活性基を有する物質と結
合し、該反応活性基にビオチンを介して蛍光物質で標識
されたアビジンと結合したものは、次の方法で製造する
ことができる。すなわち、ビオチンを複数の反応活性基
を有する物質の大部分の反応活性基に反応させた後、つ
いで被測定物質と免疫反応する物質または被測定物質と
同一の免疫反応を示す物質と反応させ、さらにビオチン
を蛍光物質で標識されたアビジンで修飾して製造する。
また、複数の反応活性基を有する物質の大部分の反応活
性基に直接蛍光色素を結合させてもよい。この場合に
は、蛍光物質を複数の反応活性基を有する物質の大部分
の反応活性基に反応させた後、ついで被測定物質と免疫
反応する物質または被測定物質と同一の免疫反応を示す
物質と反応させて製造する。

【００２１】本発明の方法（２）及び方法（３）の分析
法においては、図１及び図２に示すように、小型光源
（６）及び励起光又は蛍光を伝播するための光ファイバ
ー（１）と、その一方の端面のコア表面（３）を露出さ
せ、その表面に被測定物質と特異的に結合する抗原
（４）などを固定化した検出部、並びに検出部で励起さ
れた蛍光の強度を測定するための検出器（８）を用いる
ことができる。

【００２２】前記光ファイバーは、樹脂の方が低価格で
あり、使用しやすいため、通常、アクリル酸メチル、ア
クリル酸エチル、メタクリル酸メチルなどのモノマーと
スチレンなどのモノマーとの共重合体である樹脂製ファ
イバーが用いられる。前記樹脂性光ファイバーの表面に
免疫物質を結合させるには、反応活性基としてホルミル
基を導入して免疫物質と共有結合させ固定化させる。

【００２３】

【発明の効果】本発明では、６００〜１２００ｎｍの半
導体レーザーの波長領域で励起できるので、小型の装置
を用いることができ、フィルターによる吸収損失が少な
いので高感度化が実現できる。

【００２４】

【実施例】以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこ
れらの実施例に限られるものでなく、広い範囲で適用可
能である。

【００２５】実施例１（肝臓中のビタミンＢ₂ の測定） （１）肝臓片をリン酸緩衝生理食塩水中ですりつぶし
た。遠心で沈殿除去後、上澄を薄膜クロマトプレートに
スポットした。これを水／ブタノール／ピリジンの体積
比１／１／２の混合溶液（pH９）で展開した。 （２）ビタミンＢ₂ の最大励起波長（３６０ｎｍ）の２
倍の波長である７２０ｎｍの光をクロマトプレートに照
射し、蛍光（５１０ｎｍ）を検出し、その保持位置から
肝臓中のビタミンＢ₂ を確認した。

【００２６】実施例２（サンドイッチ法による抗マウス
ＩｇＧ抗体の測定） （１）水１００μｌに炭酸ナトリウム３mgとビオチン４
mgを溶かし、ついで、１．８μM のキトサン（アミノ基
の数は１分子あたり４０００個）溶液２mlに、上記のビ
オチン溶液を添加した。さらに水１００μｌを添加した
後、水溶性カルボジイミド５０mgを添加し、さらに撹拌
しながら一晩室温で反応させ、酢酸を３滴滴下して反応
を停止させた。ついで、０．３ｇ／mlの炭酸ナトリウム
と０．３ｇ／mlの塩化ナトリウム混合液４mlを加えて、
ビオチン化キトサンを沈殿させた。この沈殿を遠心分離
して回収した後、０．３ｇ／mlの塩化ナトリウムと０．
１ｇ／ml炭酸ナトリウム混合液で沈殿を洗浄した。この
沈殿を１０ｍM のカリウム−リン酸緩衝液（pH７）２ml
に懸濁し、さらに同緩衝液５００mlで４℃一晩透析し
て、ビオチン化キトサン（以下、ＢＣと略す）溶液を得
た。 （２）上記（１）のＢＣ懸濁液２mlにヒツジ由来抗ウサ
ギＩｇＧ抗体（以下ａＲＧと略す）溶液１mgと、水溶性
カルボジイミド１０mgを添加し、４℃で１夜反応させ
た。反応終了後、リン酸緩衝生理食塩水で１２時間透析
を行い、さらに、陰イオン交換カラムを用いて未反応物
を除去し、ａＲＧが結合したビオチン化キトサン（以
下、ａＲＧ−ＢＣと略す）溶液を得た。 （３）アビジン１mg及びトリエチルアミン０．２mlをエ
タノール１mlに溶解し、さらに７−ヒドロキシクマリン
−３−カルボン酸２mgを加えて充分に溶解し、さらにジ
シクロヘキシルカルボジイミド１４mgを加えて、室温で
４時間反応させた。反応終了後、アスピレータでエタノ
ールとトリエチルアミンを減圧除去し、生じた残留物
を、０．０１M 酢酸緩衝液（pH６．５）２mlに懸濁した
後、５０００rpm で１０分間遠心分離して上澄を採取
し、再度遠心分離して７−ヒドロキシクマリン−３−カ
ルボン酸で修飾されたアビジン（以下、ＦＡと略す）溶
液を得た。 （４）ポリメタクリル酸メチルを主成分とする直径１mm
の光ファイバー（三菱レイヨン製、商品名：エスカ）の
先端を酢酸エチルに浸して拭きとり、クラッド層を１cm
剥離し、水洗した。 （５）水０．５mlに硫酸ニッケル１０mgを溶解し、つい
でエタノール２．５mlを加えた。このとき生じた白色沈
殿を３０００rpm で遠心分離して上澄液を採取し、これ
をＮｉ−エタノール溶液とした。５０mM水酸化カリウム
−エタノール溶液０．４mlにＮｉ−エタノール溶液０．
１mlを加え、さらに５０％グルタルアルデヒド５０μl
を添加して反応液とした。 （６）上記（５）で調製した反応液に、上記（４）の光
ファイバーを５０℃で１０分間浸漬した後、水洗した。
ついで、２０mMの塩酸溶液に上記光ファイバーを１０分
間浸漬した後、水で洗浄し、光ファイバーのコア部分表
面にホルミル基を導入した。 （７）Bacillus１６−３Ｆ株が産生する耐熱性α−アミ
ラーゼに対するモノクローナル抗体であるマウスＩｇＧ
（以下、ＭＧと略す）１mgをリン酸緩衝生理食塩水（pH
＝７．５）１mlに溶かした。この溶液に上記（６）の光
ファイバーを４℃で１２時間浸漬した。光ファイバーを
溶液から取り出し、水で洗浄した後、１％ホウ素化水素
ナトリウム水溶液に１５分間浸漬した後、水で洗浄して
ＭＧをブロック化し、ＭＧ固定化センサーとした。この
ようにして製造した光ファイバーのコア部分を図２に示
すセンサーチップとした。 （８）濃度既知のウサギ由来抗マウスＩｇＧ抗体（以
下、ａＭＧと略す）溶液に、上記（７）のセンサーチッ
プを浸漬（ＭＧを抗原として免疫反応を起こす）した
後、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄した。 （９）次に、上記（２）で得たａＲＧ−ＢＣ溶液にセン
サーチップを浸漬（ａＭＧを抗原として免疫反応を起こ
す）して、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄した。 （１０）次に、上記（３）のＦＡ溶液に上記（９）のセ
ンサーチップを浸漬して、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄
し、蛍光標識抗体（ａＲＧ−ＢＣ−ＦＡ）が結合したセ
ンサーチップを得た（結合形式が、ファイバー−ＭＧ−
ａＭＧ−ａＲＧ−ＢＣ−ＦＡ）。 （１１）次に、上記（１０）のセンサーチップを２wt％
の炭酸水素ナトリウム溶液（pH１２）に浸漬し、図１に
示す装置にて、７−ヒドロキシクマリン−３−カルボン
酸の最大励起波長（３８７ｎｍ）の約２倍の波長（７７
０ｎｍ）を有する半導体レーザー光学系で蛍光を検出器
（８）を用いて測定した。 （１２）ａＭＧの濃度を変え、上記（８）〜（１１）と
同様の測定を繰り返し、ａＭＧの濃度と蛍光強度の関係
を調べ検量線を作成した。検量線から、検出限界は０．
６×１０^-4（mg／ml）であった。

【００２７】実施例３（競合法による抗マウスＩｇＧ抗
体の測定） （１）実施例２の（１）〜（２）と同様の方法でａＭＧ
が結合したビオチン化キトサン（以下、ａＭＧ−ＢＣと
略す）溶液を得た。 （２）アビジン１mg及びフルオレセインイソチオシアネ
ート１．８mgを０．５Mの炭酸ナトリウム−炭酸水素ナ
トリウム緩衝液（pH９．０）からなる塩基性溶媒５mlに
溶解し、４℃で光を遮断して撹拌を続け、２０時間反応
させた。反応終了後、アスピレータを用いて減圧下で溶
媒を除去し、この残留物を０．０５M リン酸緩衝液（pH
４．０）５mlに懸濁した後、５０００rpm で１０分間遠
心分離し、未反応物質を除去して、上澄を採取した。上
記操作をさらに２回繰り返し、フルオレセインイソチオ
シアナートで修飾されたアビジン（以下、Ｆ₂ Ａと略
す）溶液を得た。 （３）実施例２の（４）〜（７）と同様の方法でＭＧ固
定化センサーチップを製造した。 （４）濃度既知のａＭＧ溶液と、上記（１）のａＭＧ−
ＢＣ溶液を１：１の体積比で混合し、次いで上記（３）
のセンサーチップを浸漬した後、リン酸緩衝生理食塩水
で洗浄した。 （５）上記（２）のＦ₂ Ａ溶液に上記（４）のセンサー
チップを浸漬し、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄した。 （６）次に、上記（５）のセンサーチップをトリス緩衝
液（pH１２）に浸漬し、図１に示す装置にて、フルオレ
セインの最大励起波長（４９６ｎｍ）の約２倍の波長
（９９４ｎｍ）を有する半導体レーザ光学系で蛍光を検
出器を用いて測定した。 （７）ａＭＧの濃度を変え、上記（４）〜（６）と同様
の測定を繰り返し、ａＭＧの濃度と蛍光強度の関係を調
べ検量線を作成した。検量線から、検出限界は０．６×
１０^-4（mg／ml）であった。

【００２８】実施例４（サンドイッチ法による抗マウス
ＩｇＧ抗体の測定） （１）実施例２の（２）と同様の方法で、ａＲＧ−ＢＣ
溶液を得、実施例２の（３）と同様の方法でＦＡ溶液を
得た。次いで、ａＲＧ−ＢＣ溶液とＦＡ溶液を混合し、
ａＲＧ−ＢＣ−ＦＡからなる測定試薬を調製した。 （２）実施例２の（４）〜（７）と同様の方法でＭＧ固
定化センサーチップを製造した。 （３）濃度既知のａＭＧ溶液に、上記（２）のセンサー
チップを浸漬した後、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄し
た。 （４）次に、上記（１）で得た測定試薬に上記（３）の
センサーチップを浸漬して、リン酸緩衝生理食塩水で洗
浄した。測定試薬中のａＲＧは、ａＭＧを抗原として免
疫反応を起こす。 （５）次に、上記（４）のセンサーチップを２wt％炭酸
水素ナトリウム溶液（pH１２）に浸漬し、図１に示す装
置にて、７−ヒドロキシクマリン−３−カルボン酸の最
大励起波長（３８７ｎｍ）の２倍の波長（７７０ｎｍ）
を有する半導体レーザ光学系で蛍光を検出器（８）を用
いて測定した。 （６）ａＭＧの濃度を変え、上記（３）〜（５）と同様
の測定を繰り返し、ａＭＧの濃度と蛍光強度の関係を調
べ検量線を作成した。検量線から、検出限界は０．６×
１０^-4（mg／ml）であった。

【００２９】実施例５（競合法による抗マウスＩｇＧ抗
体の測定） （１）キトサンの代わりにポリガラクトサミン（アミノ
基の数は１分子あたり５０００個）を用い、実施例３の
（１）と同様の方法で、ａＭＧが結合したビオチン化ポ
リガラクトサミン（以下、ａＭｇ−ＢＧと略す）溶液を
作成した。 （２）実施例３の（２）と同様の方法でＦ₂ Ａ溶液を得
た。 （３）次いで、上記（１）のａＭＧ−ＢＧ溶液と上記
（２）のＦ₂ Ａ溶液を混合し、結合形式が、ａＭｇ−Ｂ
Ｇ−Ｆ₂ Ａからなる測定試薬を調製した。 （４）実施例２の（４）〜（７）と同様の方法でＭＧ固
定化センサーチップを作成した。 （５）濃度既知のａＭＧ溶液と上記（３）の測定試薬を
１：１の体積比で混合し、次いで上記（４）のセンサー
チップを浸漬した後、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄し
た。 （６）次に、上記（５）のセンサーチップを０．１mM水
酸化ナトリウム−炭酸水素ナトリウム水溶液（pH１２）
に浸漬し、図１に示す装置にて、フルオレセインの最大
励起波長（４９６ｎｍ）の２倍の波長（９９４ｎｍ）を
有する半導体レーザー光学系で蛍光を検出器（８）を用
いて測定した。 （７）ａＭＧの濃度を変え、上記（５）〜（６）と同様
の測定を繰り返し、ａＭＧの濃度と蛍光強度の関係を調
べ検量線を作成した。検量線から、検出限界は０．５×
１０^-4（mg／ml）であった。

【００３０】実施例６（２種類の波長のレーザ光を励起
光源とする抗マウスＩｇＧ抗体の測定） （１）実施例２の（２）と同様の方法でａＲＧ−ＢＣ溶
液を作成した。 （２）実施例２の（３）と同様の方法でＦＡ溶液を得
た。 （３）実施例２の（４）〜（７）と同様の方法でＭＧ固
定化センサーチップを作成した。 （４）濃度既知のａＭＧ溶液に上記（３）のセンサーチ
ップを浸漬した後、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄した。 （５）次に、上記（１）のａＲＧ−ＢＣ溶液に上記
（４）のセンサーチップを浸漬して、リン酸緩衝生理食
塩水で洗浄した。 （６）次に、上記（２）のＦＡ溶液に上記（５）のセン
サーチップを浸漬して、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄し
た。 （７）次に、上記（６）のセンサーチップを２wt％炭酸
水素ナトリウム溶液（pH１２）に浸漬し、図３及び図４
に示す装置にて、７−ヒドロキシクマリン−３−カルボ
ン酸の最大励起波長（３８７ｎｍ）の約２倍の波長であ
る７７０ｎｍと７８０ｎｍの２種類の波長の半導体レー
ザー光学系で蛍光を検出器（８）を用いて測定した。 （８）ａＭＧの濃度を変え、上記（４）〜（７）と同様
の測定を繰り返し、ａＭＧの濃度と蛍光強度の関係を調
べ検量線を作成した。検量線から、検出限界は０．４×
１０^-4（mg／ml）であった。

【００３１】実施例７（サンドウィッチ法による耐熱性
α−アミラーゼに対するマウスＩｇＧの測定） （１）実施例２の（３）と同様の方法でＦＡ溶液を得
た。 （２）上記（１）で得たＦＡ溶液の充分量に市販のビオ
チン化ａＭＧ（フナコシ薬品）を添加して、蛍光標識さ
れたａＭＧ−Ｂ−ＦＡ溶液を得た。 （３）実施例２の（４）〜（６）と同様の方法で光ファ
イバーのコア部分表面にホルミル基を導入した。 （４）Bacillus由来の耐熱性α−アミラーゼを２mg/ml
となるようにリン酸緩衝生理食塩水（pH７．５）に溶解
した。この溶液に光ファイバーを４℃で１２時間浸漬し
た。光ファイバーを溶液から取り出し、水で洗浄した
後、１％ホウ素水素ナトリウム水溶液に１５分間浸漬し
た後、水で洗浄して、耐熱性アミラーゼ固定化センサー
チップとした。これを図２に示すセンサーチップとし
た。 （５）濃度既知の耐熱性α−アミラーゼに対するＭＧ溶
液に、上記（４）のセンサーチップを浸漬して、免疫反
応させた。 （６）上記（５）のセンサーチップを取り出し、０．０
５％トゥイーン２０含有リン酸緩衝生理食塩水で洗浄し
た後、上記（２）のａＭＧ−Ｂ−ＦＡ溶液に浸漬して、
トゥイーン２０含有リン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、蛍
光標識抗体が結合したセンサーチップを得た。 （７）次いで、上記（６）のセンサーチップを２wt％炭
酸水素ナトリウム溶液（pH１２）に浸漬し、図１に示す
装置にて、７−ヒドロキシクマリン−３−カルボン酸の
最大励起波長（３８７ｎｍ）の約２倍の波長（７８０ｎ
ｍ）を有する半導体レーザー系で蛍光を検出器（８）を
用いて測定した。 （８）耐熱性α−アミラーゼに対するＭＧ溶液の濃度を
変え、上記（５）〜（７）と同様の測定を繰り返し、耐
熱性α−アミラーゼに対するＭＧ溶液の濃度と蛍光強度
の関係を調べ、検量線を作成した。検量線から、検出限
界は１．０×１０^-4（mg／ｍｌ）であった。

【００３２】実施例８（サンドイッチ法によるマウスＩ
ｇＧの測定） （１）実施例２の（１）と同様の方法でＢＣ溶液を得
た。 （２）上記（１）のＢＣ溶液２mlにヒトアルブミン（フ
ナコシ薬品製、以下、ＨＡＬと略す）溶液１mgと、水溶
性カルボジイミド１０mgを添加し、４℃で一晩反応させ
た。反応終了後、リン酸緩衝生理食塩水で１２時間透析
を行い、さらに、陰イオン交換カラムを用いて未反応物
を除去し、ＨＡＬが結合したビオチン化キトサン（以
下、ＨＡＬ−ＢＣと略す）を得た。 （３）実施例２の（３）と同様の方法でＦＡ溶液を得
た。 （４）実施例２の（４）〜（６）と同様の方法で、光フ
ァイバーのコア部分表面にホルミル基を導入した。 （５）ヤギ由来マウスＩｇＧ（フナコシ薬品製、以下、
ＹＩＧと略す）１mgをリン酸緩衝生理食塩水（pH７．
５）１mlに溶かした。この溶液に上記（４）の光ファイ
バーを４℃で１２時間浸漬した。光ファイバーを溶液か
ら取り出し、水で洗浄した後、１％ホウ素化水素ナトリ
ウム水溶液に１５分間浸漬した後、水で洗浄してＹＩＧ
をブロック化し、ＹＩＧ固定化センサーとした。このよ
うにして製造した光ファイバーのコア部分を図２に示す
センサーチップとした。 （６）濃度既知のマウス由来抗ＨＡＬモノクローナル抗
体であるマウスＩｇＧ（フナコシ薬品製、以下、ＭＩＧ
と略す）溶液に、上記（５）のセンサーチップを浸漬
（ＭＩＧがＹＩＧの抗原となり免疫反応を起こす）した
後、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄した。 （７）次に、上記（２）のＨＡＬ−ＢＣ溶液に上記
（６）のセンサーチップを浸漬（ＭＩＧが抗体として免
疫反応を起こす）して、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄し
た。 （８）次に、上記（３）のＦＡ溶液に上記（７）のセン
サーチップを浸漬して、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄
し、蛍光標識抗体が結合したセンサーチップを得た（結
合形式が、ファイバー−ＹＩＧ−ＭＩＧ−ＨＡＬ−ＢＣ
−ＦＡ）。 （９）次に、上記（８）のセンサーチップを２wt％炭酸
水素ナトリウム溶液（pH１２）に浸漬し、図１に示す装
置にて、７−ヒドロキシクマリン−３−カルボン酸の最
大励起波長（３８７ｎｍ）の約２倍の波長（７７０ｎ
ｍ）を有する半導体レーザー光学系で蛍光を検出器
（８）を用いて測定した。 （１０）ＭＩＧの濃度を変え、上記（６）〜（９）と同
様の測定を繰り返し、ＭＩＧの濃度と蛍光強度の関係を
調べ、検量線を作成した。検出限界は０．６×１０
^-4（mg/ml)であった。

【００３３】実施例９（サンドイッチ法によるマウスＩ
ｇＧの測定） （１）実施例８の（２）と同様の方法でＨＡＬ−ＢＣ溶
液を作成した。 （２）実施例２の（３）と同様の方法でＦＡ溶液を得
た。 （３）ついで、上記（１）のＨＢＬ−ＢＣ溶液と上記
（２）のＦＡ溶液を混合し、ＨＡＬ−ＢＣ−ＦＡの結合
形式からなる測定試薬を調製した。 （４）実施例８の（４）〜（５）と同様の処理を行い、
ＹＩＧ固定化センサーチップを作成した。 （５）濃度既知のＭＩＧ溶液に、上記（４）のセンサー
チップを浸漬（ＭＩＧがＹＩＧの抗原となり免疫反応を
起こす）した後、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄した。 （６）次に、上記（３）のＨＡＬ−ＢＣ−ＦＡ溶液に上
記（５）のセンサーチップを浸漬（ＭＩＧが抗体として
免疫反応を起こす）して、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄
した。 （７）次に、上記（６）のセンサーチップを２wt％炭酸
水素ナトリウム溶液（pH１２）に浸漬し、図１に示す装
置にて、７−ヒドロキシクマリン−３−カルボン酸の最
大励起波長（３８７ｎｍ）の約２倍の波長（７７０ｎ
ｍ）を有する半導体レーザー光学系で蛍光を検出器
（８）を用いて測定した。 （８）ＭＩＧの濃度を変え、上記（５）〜（７）と同様
の測定を繰り返し、ＭＩＧの濃度と蛍光強度の関係を調
べ、検量線を作成した。検出限界は０．６×１０^-4（mg
/ml)であった。

【００３４】比較例１ （１）実施例２の（１）と同様の方法で、ＢＣ懸濁液を
得た。 （２）このＢＣ懸濁液２mlに、ウサギ由来抗ＨＡＬ抗体
（以下、ＵＡＧと略す）溶液１mgと、水溶性カルボジイ
ミド１０mgを添加し、４℃で一晩反応させた。反応終了
後、リン酸緩衝生理食塩水で１２時間透析を行い、さら
に、陰イオン交換カラムを用いて未反応物を除去し、Ｕ
ＡＧが結合したビオチン化キトサン（以下ＵＡＧ−ＢＣ
と略す）を得た。 （３）実施例３の（２）と同様の方法により、Ｆ₂ Ａ溶
液を得た。 （４）実施例２の（４）〜（６）と同様の方法で、光フ
ァイバーのコア部分表面にホルミル基を導入した。 （５）ＭＩＧ１mgをリン酸緩衝生理食塩水（pH７．５）
１mlに溶かした溶液に、上記（４）の光ファイバーを４
℃で１２時間浸漬した。光ファイバーを溶液から取り出
し、水で洗浄した後、１％ホウ素化水素ナトリウム水溶
液に１５分間浸漬した後、水で洗浄してＭＩＧをブロッ
ク化し、ＭＩＧ固定化センサーとした。このようにして
製造した光ファイバーのコア部分を図２に示すセンサー
チップとした。 （６）濃度既知のＨＡＬ溶液に、上記（５）のセンサー
チップを浸漬（ＨＡＬがＭＩＧの抗原となり免疫反応を
起こす）した後、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄した。 （７）次に、上記（２）で得たＵＡＧ−ＢＣ溶液に上記
（６）のセンサーチップを浸漬（ＵＡＧが抗体として免
疫反応を起こす）して、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄し
た。 （８）次に、上記（３）のＦ₂ Ａ溶液に上記（７）のセ
ンサーチップを浸漬して、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄
し、蛍光標識抗体が結合したセンサーチップを得た（結
合形式が、ファイバー−ＭＩＧ−ＨＡＬ−ＵＡＧ−ＢＣ
−Ｆ₂ Ａ）。 （９）次に、上記（８）のセンサーチップを２wt％炭酸
水素ナトリウム溶液（pH１２）に浸漬し、図１に示す装
置にて、フルオレセインイソシアナートの最大励起波長
（４９６ｎｍ）とほぼ同波長（４８６ｎｍ）を有するＡ
ｒレーザー光学系で蛍光を検出器（８）を用いて測定し
た。 （１０）ＨＡＬの濃度を変え、上記（６）〜（９）と同
様の測定を繰り返し、ＭＩＧの濃度と蛍光強度との関係
を調べ、検量線を作成した。検出限界は０．５×１０^-3
（mg/ml)となり、検出限界がほぼ１／１０となった。ま
た、励起光源としてＡｒレーザーを用いたために、測定
装置が大型になり、同時に光学系の調整が難しくなり使
用困難なものとなった。

【００３５】比較例２ （１）実施例８の（２）と同様の方法でＨＡＬ−ＢＣ溶
液を作成した。 （２）実施例３の（２）と同様の方法でＦ₂ Ａ溶液を得
た。 （３）上記（１）のＨＢ−ＬＢＣ溶液と上記（２）のＦ
₂ Ａ溶液を混合し、ＨＡＬ−ＢＣ−Ｆ₂ Ａの結合形式か
らなる測定試薬（以下、ＨＡＬ−ＢＣ−Ｆ₂ Ａと略す）
溶液を調製した。 （４）比較例１の（４）〜（５）と同様の処理を行い、
ＭＩＧ固定化センサーチップを作成した。 （５）濃度既知のＨＡＬ溶液と上記（３）のＨＡＬ−Ｂ
Ｃ−Ｆ₂ Ａ溶液を１：１の体積比で混合し、ついで上記
（４）のセンサーチップを浸漬（ＭＩＧが抗体として免
疫反応を起こす）した後、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄
した。 （６）次に、上記（５）のセンサーチップを２wt％炭酸
水素ナトリウム溶液（pH１２）に浸漬し、図１に示す装
置にて、フルオレセインイソシアナートの最大励起波長
（４９６ｎｍ）とほぼ同波長（４８６ｎｍ）を有するＡ
ｒレーザー光学系で蛍光を検出器（８）を用いて測定し
た。 （７）ＨＡＬの濃度を変え、上記（５）〜（６）と同様
の測定を繰り返し、ＭＩＧの濃度と蛍光強度の関係を調
べ検量線を作成した。検出限界は０．５×１０^-3（mg/m
l)となり、検出限界がほぼ１／１０となった。また、励
起光源としてＡｒレーザーを用いたために、測定装置が
大型になり、同時に光学系の調整が難しくなり使用困難
なものとなった。

【図面の簡単な説明】

【図１】半導体レーザーを使用する蛍光測定系を示す。

【図２】上記装置における蛍光検出部を示す。

【図３】７７０ｎｍ及び７８０ｎｍの２種類の半導体レ
ーザーを使用した蛍光測定装置を示す。

【図４】図３のセンサーチップの拡大図を示す。

【符号の説明】

１ 光ファイバー ３ コア表面 ４ 抗原 ６ Ｈｅ−Ｎｅレーザー発生装置 ７ フィルター ８ 分光光度計 ９ センサーチップ １０ プレート １１ 光軸合せのためのガイドレール Ｙ 蛍光標識抗体 ｙ 抗体 １２ ７８０ｎｍ半導体レーザー １３ ７７０ｎｍ半導体レーザー １４ 反射鏡 １５ ハーフミラー １６ ７７０ｎｍレーザー １７ ７８０ｎｍレーザー １８ 蛍光 １９ クラッド層 ２０ ミラーコーティング

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 国際公開91／7651（ＷＯ，Ａ１) 国際公開90−13029（ＷＯ，Ａ１) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G01N 21/76 G01N 21/64 G01N 33/533 G01N 33/543

Claims (6)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 塩基に可溶性の蛍光性被測定物質を、塩
   基性条件下で該蛍光性被測定物質の最大励起波長の約２
   倍の波長のレーザー光で励起し、蛍光を測定することを
   特徴とする蛍光分析法。
2. 【請求項２】 光ファイバーのコア表面に免疫物質を固
   定化し、（ａ）該コア表面の免疫物質に対して、被測定
   物質及び塩基に可溶性の蛍光物質で標識された被測定物
   質と同一の免疫反応を示す物質を競合的に反応させる
   か、或いは、（ｂ）該コア表面の免疫物質と被測定物質
   を反応させ、次いで塩基に可溶性の蛍光色素で標識され
   た被測定物質と免疫反応する物質を反応させた後、塩基
   性条件下で該蛍光物質の最大励起波長の約２倍の波長の
   レーザー光で励起し、蛍光を測定することを特徴とする
   蛍光免疫分析法。
3. 【請求項３】 前記被測定物質と同一の免疫反応を示す
   物質又は被測定物質と免疫反応する物質が、ビオチンと
   結合し、該ビオチンは塩基に可溶性の蛍光物質で標識さ
   れたアビジンが結合している請求項２記載の蛍光免疫分
   析法。
4. 【請求項４】 前記被測定物質と同一の免疫反応を示す
   物質又は被測定物質と免疫反応する物質が、複数の反応
   活性基を有する物質と結合し、該複数の反応活性基には
   ビオチンを介して塩基に可溶性の蛍光物質で標識された
   アビジンが結合している請求項２記載の蛍光免疫分析
   法。
5. 【請求項５】 光ファイバーのコア表面に免疫物質を固
   定化し、（ａ）該コア表面の免疫物質に対して、被測定
   物質及びビオチンが結合した被測定物質と同一の免疫反
   応を示す物質を競合的に反応させるか、或いは、（ｂ）
   該コア表面の免疫物質と被測定物質を反応させ、次い
   で、ビオチンが結合した被測定物質と免疫反応する物質
   を反応させた後、塩基に可溶性の蛍光物質で標識したア
   ビジンを反応させ、塩基性条件下で該蛍光物質の最大励
   起波長の約２倍の波長のレーザー光で励起し、蛍光を測
   定することを特徴とする蛍光免疫分析法。
6. 【請求項６】 被測定物質と同一の免疫反応を示す物質
   又は被測定物質と免疫反応する物質が、複数の反応活性
   基を有する物質と結合し、該複数の反応活性基にビオチ
   ンが結合している請求項５記載の蛍光免疫分析法。