JP3129482B2 - リン脂質抗体の測定法、測定用チップ及び試薬 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】近年、各種疫病の検査指標として
リン脂質の動態を調べることが有効であることがわかっ
てきた。特に妊娠中毒患者においては羊水中のリン脂質
が増加することが確認されている。そこで、このリン脂
質の増加に伴ない増加しているリン脂質に対する抗体量
を測定することにより、妊娠中毒症の早期発見に役立
つ。本発明は、リン脂質を固定化した光ファイバーを用
いてリン脂質に対する抗体量を免疫学的に測定する方
法、それに用いる測定用チップ及び試薬に関する。

【０００２】本発明の測定法によれは、小型の装置によ
り、多数の検体を一度に処理することができ、かつ高感
度で測定できる。

【０００３】

【従来の技術】リン脂質に対する抗体を測定する方法と
して、従来次のような方法が知られていた。

【０００４】（１）ＥＬＩＳＡ法［Clin. Exp. Immuno
l.68, ２１５〜２２２（１９８７）］ マイクロプレートのウエルにリン脂質の有機溶媒溶液を
加え、溶媒を蒸発させてプレートの壁にリン脂質を物理
吸着させる。これにリン脂質に対する抗体を含む試料を
加えて反応させ、洗浄後、酵素標識が結合した抗原で処
理し、洗浄後、基質を加えて酵素活性を測定し、その値
から試料中の抗体量を算出する方法。

【０００５】（２）ループスアンチコアグラント活性法
［J. Bio. Chem., 261, ９６７２〜９６７７（１９８
６）］ 血液凝固は、凝固因子が血球表面のリン脂質に結合する
ことにより起こるので、リン脂質（ホスファチジルエタ
ノールアミン）に該抗体が結合すると血液凝固が遅延す
ることを利用して、血液凝固活性から抗体量を測定する
方法。

【０００６】（３）リポソーム法［Mol. Immunol. 25,
１０２５〜１０３１（１９８８）］ 蛍光物質で包んだリポソームに［リン脂質の２重膜（Ｐ
Ｉ（４．５）Ｐ₂］にリン脂質を抗原として認識する抗
体試料を反応させ、次にＣ１からＣ９までの補体を抗原
（リポソーム）−抗体複合体に反応させると、抗体が結
合したリポソームだけが破壊され、中の蛍光物質が溶出
されるので、蛍光を測定することにより抗体量を測定す
る方法。

【０００７】しかしながら（１）のＥＬＩＳＡ法は、洗
浄時にプレート壁に物理吸着したリン脂質がはがれ落ち
やすいため、測定値がばらつき、検出濃度はμg/ml〜mg
/mlの範囲でしか可能でない。（２）のループスアンチ
コアグラント活性法は、凝固判定を主観的に行うため測
定値がバラつき、かつ種々のリン脂質に対する特異性が
ない。また（３）のリポソーム法はリポソームの大きさ
にバラつきがあるため、内包される蛍光物質の量が一定
ではなく、定量性がない、などの欠点がある。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】上記のような従来のリ
ン脂質抗体の測定法は、いずれも大型で非常に高価な装
置を用い、検体試料の量も多く必要とし、かつ測定感度
も低いという問題点があった。

【０００９】本発明は、本発明者により開発され、国際
公開されたＷＯ９０／１３０２９に記載された光ファイ
バーをセンサーとして利用する方法を改良して、測定感
度がng/ml のオーダで、検体試料中のリン脂質抗体量の
測定を可能とする免疫測定法、及びそれに用いる測定用
チップ及び試薬を提供する。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明のリン脂質抗体の
測定法は、競合法とサンドウィッチ法に大別される。

【００１１】［競合法］光ファイバーの表面にスペーサ
分子を介して固定化されたリン脂質に、（ａ）検体試料
中のリン脂質に対する抗体と（ｂ）蛍光色素で標識され
たリン脂質に対する抗体とを競合的に反応させ、結合し
た蛍光色素を光で励起して蛍光強度を測定することを特
徴とするリン脂質抗体の測定法。

【００１２】さらに上記（ｂ）蛍光色素で標識されたリ
ン脂質に対する抗体を反応させる代りに、次の方法で測
定することができる。

【００１３】（ｂ−２）リン脂質に対する抗体にビオチ
ンが結合し、該ビオチンに蛍光色素で標識されたアビジ
ンが結合している該抗体を、前記（ａ）のリン脂質抗体
と競合的に反応させる。

【００１４】（ｂ−３）リン脂質に対する抗体にビオチ
ンが結合ている該抗体を、前記（ａ）のリン脂質抗体と
競合的に反応させ、次いで蛍光色素で標識されたアビジ
ンを反応させて、上記ビオチンにアビジンを結合させ
る。

【００１５】（ｂ−４）リン脂質に対する抗体に複数の
反応活性基を有する物質が結合し、該反応活性基に複数
のビオチンが結合し、該ビオチンに蛍光色素で標識され
たアビジンが結合している該抗体を、前記（ａ）のリン
脂質抗体と競合的に反応させる。

【００１６】（ｂ−５）リン脂質に対する抗体に複数の
反応活性基を有する物質が結合し、該反応活性基に複数
のビオチンが結合している該抗体とを、前記（ａ）のリ
ン脂質抗体と競合的に反応させ、次いで蛍光色素で標識
されたアビジンを反応させて、上記ビオチンにアビジン
を結合させる。

【００１７】競合法の原理は模式的に図１に示すよう
に、光ファイバーの表面にスぺーサ分子を介してリン脂
質（Ｐ）が固定化された測定用チップの検出部を、検体
試料中のリン脂質に対する抗体（ｙ）と蛍光色素で標識
されたリン脂質に対する抗体（Ｙ）とを含む混合溶液に
浸漬して、リン脂質（Ｐ）に試料中の抗体（ｙ）と蛍光
標識抗体（Ｙ）とを競合的に反応させると、それぞれの
濃度比に従ってリン脂質（Ｐ）に試料中に抗体（ｙ）と
蛍光標識抗体（Ｙ）とが結合する。したがって、試料中
の抗体（ｙ）の濃度が高ければ、蛍光標識抗体（Ｙ）の
結合量は相対的に少ないので、蛍光強度は低下し、濃度
−蛍光強度の検量線の傾きは負になる。

【００１８】［サンドウィッチ法］光ファイバーの表面
にスぺーサ分子を介して固定化されたリン脂質に、
（ａ）検体試料中のリン脂質に対する抗体を反応させた
後、（ｂ）蛍光色素で標識された抗免疫グロブリン抗体
を、上記（ａ）のリン脂質抗体を抗原として反応させ、
結合した蛍光色素を光で励起して蛍光強度を測定するこ
とを特徴とするリン脂質抗体の測定方法。

【００１９】さらに上記（ｂ）蛍光色素で標識された抗
免疫グロブリン抗体を反応させる代りに、次の方法で測
定することができる。

【００２０】（ｂ−２）抗免疫グロブリン抗体にビオチ
ンが結合し、該ビオチンに蛍光色素で標識されたアビジ
ンが結合している該抗体を、前記（ａ）のリン脂質抗体
を抗原として反応させる。

【００２１】（ｂ−３）抗免疫グロブリン抗体にビオチ
ンが結合している該抗体を、前記（ａ）のリン脂質抗体
を抗原として反応させ、次いで蛍光色素で標識されたア
ビジンを反応させて、上記ビオチンにアビジンを結合さ
せる。

【００２２】（ｂ−４）抗免疫グロブリン抗体に複数の
反応活性基を有する物質が結合し、該反応活性基に複数
のビオチンが結合し、該ビオチンに蛍光色素で標識され
たアビジンが結合している該抗体を、前記（ａ）のリン
脂質抗体を抗原として反応させる。

【００２３】（ｂ−５）抗免疫グロブリン抗体に複数の
反応活性基を有する物質が結合し、該反応活性基に複数
のビオチンが結合している該抗体を、前記（ａ）のリン
脂質抗体を抗原として反応させ、次いで蛍光色素で標識
されたアビジンを反応させて、前記ビオチンにアビジン
を結合させる。

【００２４】（ｂ−６）抗免疫グロブリン抗体又はその
Ｆａｂフラグメントに複数の反応活性基を有する物質が
結合し、該反応活性基に免疫グロブリンＧが結合し、該
免疫グロブリンＧに蛍光色素で標識されたプロティンＡ
が結合している該抗体又はフラグメントを、前記（ａ）
のリン脂質抗体を抗原として反応させる。

【００２５】（ｂ−７）抗免疫グロブリン抗体又はその
Ｆａｂフラグメントに複数の反応活性基を有する物質が
結合し、該反応活性基に免疫グロブリンＧが結合してい
る該抗体又はフラグメントを、前記（ａ）のリン脂質抗
体を抗原として反応させ、次いで蛍光色素で標識された
プロティンＡを反応させて、上記免疫グロブリンＧにプ
ロティンＡを結合させる。

【００２６】サンドウィッチ法の原理は模式的に図２に
示すように、光ファイバーの表面にスペーサ分子を介し
てリン脂質（Ｐ）が固定化された測定用チップの検出部
を、最初に検体試料溶液に浸漬して、リン脂質（Ｐ）に
試料中のリン脂質に対する抗体（ｙ）を反応させると、
リン脂質（Ｐ）に抗体（ｙ）がその濃度に従って結合す
る。次に、抗体（ｙ）が結合した測定用チップの検出部
を蛍光色素で標識された抗免疫グロブリン抗体（Ｙ）の
溶液に浸漬すると、前記抗体（ｙ）を抗原として認識し
て、試料中の抗体（ｙ）と同じ数の蛍光標識抗体（Ｙ）
が抗体（ｙ）に特異的に結合し、リン脂質（Ｐ）と蛍光
標識抗体（Ｙ）の間に試料中の抗体（ｙ）がサンドウィ
ッチされた状態となる。したがって、試料中の抗体
（ｙ）の濃度が高ければ、蛍光標識抗体（Ｙ）の結合量
も増えるので、蛍光強度は増加し、濃度−蛍光強度の検
量線の傾きは正になる。

【００２７】［試薬］上記競合法及びサンドウィッチ法
において、蛍光色素で標識されたリン脂質に対する抗体
又は抗免疫グロブリン抗体（Ｙ）としては、次のような
試薬が用いられる。

【００２８】（ａ）リン脂質に対する抗体又は抗免疫グ
ロブリン抗体に蛍光色素が直接結合している試薬。

【００２９】（ｂ）リン脂質に対する抗体又は抗免疫グ
ロブリン抗体にビオチンが結合し、該ビオチンに蛍光色
素で標識されたアビジンが結合している試薬。

【００３０】（ｃ）（ｉ）リン脂質に対する抗体又は抗
免疫グロブリン抗体にビオチンが結合している試薬、及
び（ii）蛍光色素で標識されたアビジンの組み合せから
なる試薬。

【００３１】（ｄ）リン脂質に対する抗体又は抗免疫グ
ロブリン抗体に複数の反応活性基を有する物質が結合
し、該反応活性基に複数のビオチンが結合し、該ビオチ
ンに蛍光色素で標識されたアビジンが結合している試
薬。

【００３２】（ｅ）（ｉ）リン脂質に対する抗体又は抗
免疫グロブリン抗体に複数の反応活性基を有する物質が
結合し、該反応活性基に複数のビオチンが結合している
試薬、及び（ii）蛍光色素で標識されたアビジンの組み
合せからなる試薬。

【００３３】（ｆ）抗免疫グロブリン抗体又はＦａｂフ
ラグメントに複数の反応活性基を有する物質が結合し、
該反応活性基に免疫グロブリンＧが結合し、該免疫グロ
ブリンＧに蛍光色素で標識されたプロティンＡが結合し
ている試薬。

【００３４】（ｇ）（ｉ）抗免疫グロブリン抗体又はそ
のＦａｂフラグメントに複数の反応活性基を有する物質
が結合し、該反応活性基に免疫グロブリンＧが結合して
いる試薬、及び（ii）蛍光色素で標識されたプロティン
Ａの組合わせからなる試薬。

【００３５】上記（ａ）〜（ｅ）の試薬において、リン
脂質に対する抗体は競合法において用いられ、抗免疫グ
ロブリン抗体はサンドウィッチ法において用いられる。
該抗免疫グロブリン抗体は、リン脂質抗体（ｙ）を抗原
として認識する抗体であればよい。

【００３６】また、上記（ｆ）及び（ｇ）の試薬はサン
ドウィッチ法において用いられ、上記（ｄ）及び（ｅ）
の試薬におけるビオチン−アビジン結合を利用する代り
に免疫グロブリンＧ−プロティンＡ結合を利用するもの
である。

【００３７】上記（ｃ）、（ｅ）及び（ｇ）の試薬は、
蛍光色素とアビジン又はプロティンＡの結合を加水分解
から守るため、最初に（ｉ）の試薬を反応させて結合さ
せた後に、（ii）の試薬を反応させてビオチン−アビジ
ン結合又は免疫グロブリンＧ−プロティンＡの結合を形
成させるもので、蛍光強度の低下を防止できる利点があ
る。

【００３８】上記試薬（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）
及び（ｅ）を用いた競合法及びサンドウィッチ法の模式
図は図１及び図２に示す。（ｆ）及び（ｇ）を用いたサ
ンドウィッチ法は図２の（ｄ）及び（ｅ）に準じる。上
記試薬（ａ）、（ｂ）及び（Ｃ）は、後記する図５の装
置を用いて二光子吸収による蛍光を検出測定する場合に
用いることができ、上記試薬（ｄ）及び（ｅ）は、後記
する図５又は図６の装置を用いて、一光子吸収又は二光
子吸収による蛍光を検出測定するすべての場合に用いる
ことができる。上記試薬（ｆ）及び（ｇ）は図５の装置
を用いて一光子吸収による蛍光を検出測定する場合に用
いることができる。

【００３９】上記試薬（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）及び
（ｇ）における複数の反応活性基を有する物質として
は、キトサン、ポリガラクトサミンのような分子中に多
数のアミノ基を有するアミノグリカン；ポリリジンのよ
うなペプチドを用いることができ、好ましくはアミノグ
リカン、より好ましくはキトサンを用いることができ
る。このような複数の反応活性基を有する物質を介する
ことにより、蛍光色素の結合量を増やすことができ、検
出感度を飛躍的に向上させることができる。

【００４０】キトサンとビオチンとの結合は、両者を塩
基性溶液中、水溶性カルボジイミド（ＣＨＭＣ）、Ｎ−
ヒドロキシスクシンイミドのような脱水剤の存在下で反
応させると、大部分のキトサンのアミノ基にビオチンが
酸アミド結合してビオチン化キトサンを得る。このビオ
チン化キトサンにリン脂質に対する抗体又は抗免疫グロ
ブリン抗体を上記と同様の脱水剤を用いて反応させる
と、キトサンの残余の遊離アミノ基に抗体蛋白が結合
し、ビオチン化キトサンが結合したリン脂質抗体又は抗
免疫グロブリン抗体が得られる。また同様の方法でビオ
チンが結合したリン脂質抗体又は抗免疫グロブリン抗体
が得られる。

【００４１】一方、蛍光色素で標識されたアビジンは、
蛍光色素例えばシアニン色素のカルボキシル基とアビジ
ンのアミノ基を上記と同様の方法で反応させて得ること
ができる。アビジンは、熱、pH、化学変化に対して安定
であり、分子表面に多くのアミノ基をもつので、アビジ
ン１分子当り２〜１０個の蛍光色素を結合させることが
できる。またリン脂質抗体又は抗免疫グロブリン抗体に
蛍光色素が直接結合した試薬も上記と同様の方法で得る
ことができる。

【００４２】上記ビオチン化キトサンが結合したリン脂
質抗体又は抗免疫グロブリン抗体、或いはビオチンが結
合したリン脂質抗体又は抗免疫グロブリン抗体に、上記
蛍光色素で標識されたアビジンを反応させると、アビジ
ンはビオチンと選択的に非常に高い親和力を持って結合
する。

【００４３】蛍光色素としては、次式のアゾニウムイオ
ンを含む複素環をメチン鎖で結合した構造のシアニン色
素が好適に用いられる。

【００４４】

【化３】 （式中、Ｙ及びＹ′はＯ、Ｓ、Ｓｅ、−ＮＨ−又は−Ｃ
Ｈ＝ＣＨ−を表し、Ｒ及びＲ′はメチル、エチル、プロ
ピルのようなアルキル基又はカルボキシエチルのような
カルボキシアルキル基を表し、Ｘはハロゲン原子を表
し、ｎは０〜３の整数を表す）

【００４５】上記シアニン色素のうちでも、次式で示さ
れるカルボシアニン系の色素が特に好ましく、例えばＮ
Ｋ１１６０（日本感光色素研究所製）があげられる。

【００４６】

【化４】 （式中、ｎは０、１、２又は３、特に好ましくはｎが２
である）

【００４７】この外の蛍光色素としては、ウンベリフェ
ロンなどのクマリン誘導体、多環芳香族誘導体、ローダ
ミンイソチオシアネート、フルオレセインイソシアネー
ト、フイコビリタンパクなどが使用できる。

【００４８】また、後記するように、二光子吸収により
蛍光強度を測定する場合には、塩基に可溶性の蛍光色素
が用いられ、そのような色素としてはフルオレセイン、
ジクロロフルオレセイン、ウンベリフェロン、４−メチ
ルウンベリフェロン、ビス（ｐ−ヒドロキシフェニルプ
ロピオン酸）などがあげられる。特に好ましいのはフル
オレセイン及びウンベリフェロンである。

【００４９】上記試薬（ｆ）及び（ｇ）におけるプロテ
ィンＡと結合する免疫グロブリンＧは、ヒト、マウス、
ウサギなどの免疫グロブリンＧであればいずれも用いる
ことができる。また抗免疫グロブリン抗体は、ある種の
プロテアーゼで処理すると抗原との結合能力を有するＦ
ａｂ部分と各種抗免疫グロブリン抗体に共通なＦｃ部分
に分けられるので、リン脂質抗体と結合すべき抗免疫グ
ロブリン抗体の代りにこの抗免疫グロブリン抗体のＦａ
ｂ部分だけを用いることができる。プロティンＡは免疫
グロブリンＧと結合するがＦａｂとは結合しないので、
リン脂質抗体に結合する抗免疫グロブリン抗体はプロテ
ィンＡによる妨害を受けることがない。

【００５０】プロティンＡは、黄色ぶどう球菌の細胞壁
の５％を占める分子量４２０００の蛋白であり、免疫グ
ロブリンと高い親和性をもつため、蛍光色素で標識され
たプロティンＡと反応させて、上記のように免疫グロブ
リンにプロティンＡを結合させることができる。

【００５１】［測定用チップ］本発明の測定法に用いら
れる、光ファイバーの表面にスペーサ分子を介してリン
脂質が結合した測定用チップには、図３に示す対向型と
図４に示す反射型がある。光ファイバーは励起光と蛍光
を伝送することができ、光損失がなく、効率の良い測定
ができる。

【００５２】本発明に用いられる光ファイバーは、石英
や樹脂製ファイバーを用いることができるが、生理活性
物質を吸着しない樹脂で透光性のよいものが有利であ
り、例えばポリスチレン、ポリ（メタ）アクリル酸エス
テル、ポリ（メタ）アクリルアミド、ポリエステル、ポ
リビニルアルコール、ポリエチレンテレフタレート、ポ
リカーボネート、あるいはこれらの共重合体などが使用
できる。これらの樹脂はエステル結合、アミド結合、カ
ルボキシル基、ホルミル基、アミノ基、ヒドロキシル
基、エポキシ基などの官能基を有しているか、官能基を
有していない場合は、該構造部分に適当な官能基を導入
する。官能基の導入試薬としてはグルタルアルデヒド、
スクシンジアルデヒド、アジポアルデヒドなどのジアル
デヒド、Ｎ，Ｎ′−エチレンビスマレイミド、Ｎ，Ｎ′
−Ｏ−フェニレンジマレイミド、ビスジアゾベンゼン、
あるいはヘキサメチレンジイソシアナートなどのジイソ
シアナート又はジイソチオシアナートなどが用いられ
る。

【００５３】本発明の光ファイバーに用いられる好適な
樹脂は、ポリメタクリル酸メチルであり、該エステル基
にホルミル基を導入したものである。ホルミル基を導入
するには、次式に示すように、ポリメタクリル酸メチル
のエステル基にグルタルアルデヒド、スクシンアルデヒ
ドのようなホルミル基を有する求核性試薬を反応させ
る。

【００５４】

【化７】 官能基の導入試薬を反応させる場合、光ファイバーのク
ラッド層を剥離してコア表面を露出させておく。また、
光ファイバーの表面は、アルコールを潤滑剤として研磨
しておくことが望ましい。

【００５５】前記ホルミル基を有する試薬は、５０〜１
００mMのＫＯＨなどの塩基、エタノールなどのアルコー
ル系有機溶媒に、反応の促進とホルミル基の酸化やＯＨ
基の付加を防止するためにＮｉＳＯ₄ のようなＮｉ塩の
エタノール溶液、及びホルミル基を有する求核性試薬を
添加溶解して調製することが望ましい。このような反応
試薬に光ファイバーのコア表面を浸漬して、エステル構
造に反応させるが、反応温度は適宜調節することができ
る。反応後、水で洗浄し、塩酸などの酸に浸漬すると、
アセタール化したアルコールが脱離してホルミル基が結
合した光ファイバーが得られる。

【００５６】リン脂質は、通常次式を有するホスファチ
ジルセリン（以下ＰＳという）又はホスファチジルアミ
ノエタノール（以下ＰＥという）が用いられる。この他
にホスファチジルイノシトール、ホスファチジル酸など
を用いてもよい。

【００５７】

【化８】

【００５８】これらリン脂質のアミノ基は抗体認識部位
であるので、残しておかなければならない。そのためス
ペーサを介してリン脂質を光ファイバーに結合させるこ
とにより、リン脂質の反応活性アミノ基をふさぐことな
く、光ファイバーの表面からリン脂質を離すことができ
る。

【００５９】スペーサ分子としては、次式（Ｉ）、（I
I）又は(III)

【化９】 （式中、Ｒはイミノ基又は酸素原子を表し、ｍは１〜２
１の整数を表し、ｎ及びｎ′はそれぞれ０〜１０の整数
を表す）で示される二価基があげられ、好ましくは次式

【００６０】

【化１０】 （式中、ｍは１〜２１の整数を表す）で示される二価基
である。特に好ましくは、１，４−ジアミノブタン（プ
トレシン）が用いられる。

【００６１】光ファイバーのコア表面のホルミル基にス
ペーサとしてジアミンを結合させるには、次式に示すよ
うに塩基性条件下でジアミンを反応させる。

【００６２】

【化１１】

【００６３】例えば、ホルミル基を導入した上記光ファ
イバーの検出部を、１，４−ジアミンブタン溶液に浸漬
し、ホルミル基とアミノ基をシッフ塩基の反応により結
合させる。これを例えばＮａＢＨ₄ 水溶液に浸漬するこ
とにより還元する。１，４−ジアミノブタン溶液の濃度
は５〜３０％が好適であり、１０％がより好ましい。こ
のときの光ファイバー表面の１，４−ジアミノブタンの
導入量は、３．２×１０¹¹〜４×１０¹⁵アミノ基数／mm
² となる。

【００６４】光ファイバー表面にスペーサ分子を結合さ
せる理由は、リン脂質の抗体認識部位（抗原決定基）の
アミノ基が固定化に使用されないようにするためと、ス
ペーサ分子を介して光ファイバー表面からリン脂質を離
して結合させることにより、立体障害を回避でき、リン
脂質抗体がリン脂質を認識しやすくするためである。

【００６５】次に、導入されたスペーサ分子にＰＳを固
定化するには、次の反応式に示すように、スペーサ分子
を導入した光ファイバーをＰＳ溶液に浸漬し、スペーサ
分子の遊離のアミノ基とＰＳのカルボキシル基とを、ジ
シクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）のような縮合
剤の存在下に反応させることにより、ＰＳ固定化測定用
チップが得られる。

【００６６】

【化１２】

【００６７】ＰＥを固定化するには、ＰＥの有するアミ
ノ基をピリジニウムクロロクロム酸で酸化してイミノ化
した後、次の反応に示すように、この酸化型ＰＥ溶液に
スぺーサ分子を導入した光ファイバーを浸漬し、スペー
サ分子の遊離のアミノ基と酸化型ＰＥの前記イミノ基と
を反応させることにより、ＰＥ固定化測定用チップが得
られる。

【００６８】

【化１３】

【００６９】対向型の測定用チップの概念図は図３に示
すように、光ファイバーのコア表面にスペーサ分子を介
してリン脂質を固定化したものであり、対向型測定用チ
ップは、後記図５及び図６で示す蛍光測定装置のいずれ
にも使用することができ、蛍光のみがフィルターを通っ
て検出装置に伝送されるので、バックグランドが上がる
ことがない。

【００７０】反射型の測定用チップの概念図は図４に示
すように、光ファイバーの先端にミラーが取り付けられ
たものであって、クラッド層を剥離したコアの側面にス
ペーサ分子を介してリン脂質が固定化したものであり、
反射型測定用チップは、後記図５に示す蛍光測定装置に
のみ使用することができ、図５の装置の場合は、励起光
の反射がないので、バックグランドが上がることはな
い。

【００７１】測定用チップの洗浄液としては、変性剤と
しては、チオシアン酸のナトリウム塩、カリウム塩、リ
チウム塩又はアンモニウム塩；グアニジウム塩酸塩、グ
アニジウム誘導体の塩酸塩、尿素等が用いられる。この
ような変性剤は界面活性剤と併用することが好ましく、
界面活性剤としては、ツイン、トリトン系の非イオン系
界面活性剤又はデオキシコール酸ナトリウム等が用いら
れる。緩衝液としては、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、
酢酸緩衝液等が用いられる。

【００７２】［蛍光測定装置］本発明のリン脂質抗体を
測定するには、図５又は図６に示す蛍光測定装置が利用
される。この装置は少なくとも以下の構成からなる。即
ち、レーザ光源（４）、励起光又は蛍光を伝送する光フ
ァイバー（３）、励起光をカットするフィルター（２）
及び蛍光を検出・測定する装置（１）からなり、図５の
装置では蛍光の進行方向を変えるハーフミラー又はプリ
ズムを有する。

【００７３】蛍光色素を励起するための光源としては、
レーザ光又はＬＥＤ（発光ダイオード）光が用いられ、
とくにＨｅ−Ｎｅレーザ又は半導体レーザが好ましい。
これらのレーザ光源は従来のＸｅランプやＡｒレーザ光
源に比べて小型化、低コスト化を図ることができる。

【００７４】図５の装置には、図３の対向型測定用チッ
プ又は図４の反射型測定用チップのいずれも用いること
ができ、蛍光色素を通常の３００〜８００nmの励起波長
で励起し、一光子吸収による蛍光の測定、例えばシアニ
ン系色素の場合は６３３nmのＨｅ−Ｎｅレーザ、６３８
nmの半導体レーザで励起して測定する方法に用いること
ができる外、後記する通常の２倍の励起波長で励起し、
二光子吸収による蛍光の測定にも用いることができる。

【００７５】フルオレセイン又はウンベリフェロンのよ
うな塩基に可溶性の蛍光色素を標識に用いた場合には、
塩基性の条件下で、蛍光色素は最大励起波長の１／２の
エネルギーの光子を２個吸収して１個の光子を放出する
二光子吸収を示すので、６００〜１２００nmの波長で励
起し、３００〜６００nmで励起される蛍光と同波長で、
同強度又はそれ以上の強度の蛍光を発する。このため、
従来の半導体レーザなどで高感度の蛍光物質を励起でき
るので、一層光源の小型化が可能であり、またフィルタ
ーによる吸収損失がなく、また長波長領域の励起光を使
用するので、量子収率がよく、高感度で測定することが
できる。

【００７６】ここに述べる最大励起波長（λnm）とは、
塩基性条件下で一光子励起により発する蛍光の強度が、
最大となる励起波長である。最大励起波長は、主に塩基
性条件下における蛍光物質の拡大吸収波長に相当する。
また最大励起波長の約２倍の波長とは、２λ±１００
（nm）以下の波長を意味し、より好ましくは２λ±５０
（nm）の波長である。最大励起波長の約２倍の波長領域
のレーザならば、１種類の波長に限定されず、複数波長
のレーザを励起光源として使用できる。

【００７７】塩基に可溶性の蛍光色素の励起波長と蛍光
波長の関係を例示すると表１のとおりである。

【表１】

【００７８】図６の装置は、対向型の測定用チップを用
いて、通常の一光子吸収により蛍光の検出測定をする場
合に用いることができる。

【００７９】図５又は図６の装置を用いて、蛍光標識が
示す蛍光強度を検出測定するには、測定用チップ（７）
をガイドレール（６）に装着し、光源（４）からレーザ
光を照射して、測定用チップ（７）に結合した蛍光色素
を励起し、発生した蛍光を光ファイバー（３）で伝送
し、フィルター（２）で反射された励起光をカットし
て、蛍光検出・測定装置（１）で蛍光強度を測定する。

【００８０】

【実施例】以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこ
れら実施例の記載に限定されるものではない。

【００８１】実施例１（サンドウィッチ法、試薬ｅ）

【００８２】（ＰＳ固定化測定用チップの作成） （１）ポリメタクリル酸メチルを主成分とする直径１mm
の樹脂製光ファイバー（三菱レーヨン製；商品名エス
カ）を３cmに切り、両断面のコア表面をポリシングフィ
ルムで研磨した。

【００８３】（２）水０．５mlに硫酸ニッケル１０mgを
溶解し、次いでエタノール２．５mlを加えた。生じた白
色沈澱を遠心分離して上清を採取し、ニッケル−エタノ
ール溶液を得た。

【００８４】（３）２mg/ml 水酸化カリウム−エタノー
ル溶液０．４mlに、上記（２）のニッケル−エタノール
溶液０．１mlを加え、さらに５０％グルタルアルデヒド
溶液５０μl を加え、反応液とした。

【００８５】（４）この反応液に、上記（１）の光ファ
イバーを浸漬し、５０℃で１０分間反応させ、反応終了
後エタノールで洗浄し、コア表面にホルミル基が導入さ
れた光ファイバーを得た。

【００８６】（５）上記（４）の光ファイバーを１０％
１，４−ジアミノブタン溶液に室温で５〜１２時間浸漬
した。さらに水洗浄後、１．５％ＮａＢＨ₄ 水溶液に１
〜３時間浸漬し、水洗浄してコア表面にスペーサを導入
した。得られた光ファイバーの１，４−ジアミノブタン
の導入量を次のようにして測定した。ニンヒドリン０．
１g と１N 酢酸緩衝液（pH５．５）５．５mlを混合して
ニンヒドリン溶液を調製した。この溶液０．４mlに７０
℃で１５分間光ファイバーを浸漬した。ついで急冷後、
エタノール０．６ml加え、一晩放置後、光ファイバーを
取り出し、溶液の吸光度（５７０nm）を測定した。その
結果、１，４−ジアミノブタンの導入量は３．４×１０
¹⁵個／平方ミリメータであった。図１０に１，４−ジア
ミノブタンの濃度と吸光度の関係を示す。

【００８７】（６）ホスファチジルセリン（ＰＳ）３mg
を０．２％炭酸ナトリウム溶液７０μl に懸濁し、さら
にエタノール６３０μl を加え、ＰＳ溶液を得た。

【００８８】（７）上記（６）のＰＳ溶液に、上記
（５）の光ファイバーを浸漬し、さらにジシクロヘキシ
ルカルボジイミド（ＤＣＣ）０．３mlを加えた後、室温
で１時間反応させて、スペーサを介してＰＳを固定化さ
せた。これをエタノール、炭酸ナトリウム及びリン酸緩
衝生理食塩水で洗浄して図３のＰＳ固定化対向型測定用
チップを得た。（抗体が結合したビオチン化キトサン及
び蛍光色素で標識されたアビジンの調製）

【００８９】（８）水５０μl に炭酸ナトリウム３mgと
ビオチン１０mgを溶かし、ビオチン溶液とした。

【００９０】（９）１．８μM のキトサン溶液２mlに、
上記（８）のビオチン溶液５０μl を加えた後、水溶性
カルボジイミド（ＣＨＭＣ）１００mgを加え、攪拌しな
がら室温で５〜１２時間反応させた。これに酢酸を２滴
滴下して反応を停止させた。次いで、これに０．３g/ml
の炭酸ナトリウムと０．３g/mlの食塩の混合液４mlを加
えて、ビオチン化キトサンを沈澱させた。これを遠心分
離して沈澱を回収し、０．３g/mlの食塩と０．１g/mlの
炭酸ナトリウムを含む緩衝液で沈澱を洗浄した。この沈
澱を１０mMカリウム−リン酸緩衝液（pH７）２mlに懸濁
し、同緩衝液５００mlで４℃、１２時間透析してビオチ
ン化キトサンを得た。

【００９１】（１０）上記（９）のビオチン化キトサン
の懸濁液に、ヒト抗免疫グロブリン抗体（ヒトの抗体を
抗原として認識し結合する抗体）溶液とＣＨＭＣを添加
して、４℃で５時間反応させた。反応終了後、前記カリ
ウム−リン酸緩衝液（pH７）に１２時間透析した。さら
に、この懸濁液に硫酸ナトリウム約１００mgを加え、抗
免疫グロブリン抗体が結合したビオチン化キトサンを沈
澱させ、遠心分離により沈澱を回収した。この沈澱を前
記カリウム−リン酸緩衝液（pH７）２mlに再懸濁し、同
緩衝液５００mlで４℃、１２時間透析して、抗免疫グロ
ブリン抗体が結合したビオチン化キトサンを得た。

【００９２】（１１）シアニン系蛍光色素ＮＫ１１６０
（日本感光色素研究所製）２mgとトリエチルアミン０．
２mlをエタノール１mlに溶解し、次いでアビジン１mgを
懸濁した。この懸濁液にＤＣＣ０．３mlを加え、室温で
１２時間反応させた。反応生成物を遠心分離して沈澱を
回収し、エタノール２mlを加えて再懸濁した。これを再
び遠心分離で沈澱を回収し、エタノール２mlに沈澱を再
懸濁した。この懸濁液を遠心分離して沈澱を回収し、さ
らにアスピレータでエタノールを減圧除去した。この工
程で生じた残留物を０．０２M 酢酸緩衝液（pH６．５）
２mlに溶解して蛍光色素で標識されたアビジンを得た。

【００９３】（検量線の作成） （１２）濃度既知のＰＳ抗体試料溶液に、上記（７）で
得たＰＳ固定化測定用チップの検出部を浸漬して、ＰＳ
に試料のＰＳ抗体を結合させた。これを１M チオシアン
酸カリウム＋０．２％界面活性剤（ツイン２０）溶液
（０．０１M リン酸緩衝液、pH７）で洗浄した。

【００９４】（１３）次に、上記（１０）の抗免疫グロ
ブリン抗体が結合したビオチン化キトサン溶液に、上記
（１２）のＰＳ抗体が結合したＰＳ固定化測定用チップ
の検出部を浸漬して、検出部に結合したＰＳ抗体を抗原
として認識する抗免疫グロブリン抗体−キトサン−ビオ
チンを結合させた。この検出部を前記チオシアン酸カリ
ウム−界面活性剤洗浄液で洗浄した。

【００９５】（１４）上記（１３）の検出部を、上記
（１１）の蛍光色素で標識されたアビジン溶液に浸漬
し、ビオチン部分に蛍光色素で標識されたアビジンを結
合させた。この検出部を前記チオシアン酸カリウム−界
面活性剤洗浄液で２回洗浄した。

【００９６】（１５）次に、図５の装置を用い、Ｈｅ−
Ｎｅレーザ光（６３０nm）で励起し、蛍光強度を測定し
た。

【００９７】（１６）さらに、上記（１２）のＰＳ抗体
試料溶液の濃度を変え、前記（１２）〜（１５）と同様
の測定を繰返して、ＰＳ抗体と蛍光強度の関係を調べ、
図７の検量線を作成した。

【００９８】（１７）検体試料を用い、上記（１２）〜
（１５）の方法で蛍光強度を測定し、上記（１６）の検
量線からＰＳ抗体濃度を求める。また、蛍光強度／ノイ
ズの強度＝１となるＰＳ抗体濃度を検出限界とした。

【００９９】実施例２（サンドウィッチ法、試薬ｅ） （１）ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）１０mg
をジエチルエーテルに溶かし、これにピリジニウムクロ
ロクロム酸（ＰＣＣ）１００mgを溶かしたジクロロエタ
ン溶液を加え、室温で５時間反応させ、アミノ基がイミ
ノ基に酸化された酸化型ＰＥをシリカゲルクロマトカラ
ムで分離した。この溶液の溶媒を減圧除去し、次に２％
炭酸ナトリウム溶液を加えて酸化型ＰＥの懸濁液を得
た。

【０１００】（２）上記（１）の酸化型ＰＥ懸濁液に、
実施例１の（５）のスペーサを導入した光ファイバーを
浸漬し、室温で１２時間反応させた。反応後、検出部を
０．５％炭酸ナトリウム及びリン酸緩衝生理食塩水で洗
浄してＰＥ固定化対向型測定用チップを得た。

【０１０１】（３）濃度既知のＰＥ抗体試料溶液に、上
記（２）のＰＥ固定化測定用チップの検出部を実施例１
の（１２）と同様に浸漬して反応させ、光ファイバー表
面上のＰＥに試料のＰＥ抗体を結合させた。

【０１０２】（４）次に、実施例１の（１０）の抗免疫
グロブリン抗体が結合したビオチン化キトサン溶液に、
上記（３）のＰＥ抗体が結合したＰＥ固定化測定用チッ
プの検出部を浸漬し、さらにこの検出部を実施例１の
（１１）の蛍光色素で標識されたアビジン溶液に浸漬
し、ビオチン部分に蛍光色素で標識されたアビジンを結
合させた。

【０１０３】（５）実施例１の（１５）〜（１７）と同
様の方法でＰＥ抗体を測定した。

【０１０４】実施例３（サンドウィッチ法、試薬ｄ） （１）実施例１の（１０）の抗免疫グロブリン抗体が結
合したビオチン化キトサン溶液と実施例１の（１１）の
蛍光色素で標識されたアビジン溶液を混合して反応さ
せ、蛍光色素で標識されたアビジン＋ビオチン＋キトサ
ン＋抗免疫グロブリン抗体溶液を得た。

【０１０５】（２）濃度既知のＰＳ抗体試料溶液に、実
施例１の（７）のＰＳ固定化測定用チップの検出部を実
施例１の（１２）と同様に浸漬して反応させ、ＰＳに試
料のＰＳ抗体を結合させた。

【０１０６】（３）上記（１）の蛍光標識抗体溶液に、
上記（２）のＰＳ抗体が結合したＰＳ固定化測定用チッ
プの検出部を浸漬し、室温で３０分反応させ、ＰＳ抗体
を抗原として認識して蛍光標識抗体を結合させた。

【０１０７】（４）実施例１の（１５）〜（１７）と同
様の方法でＰＳ抗体を測定した。

【０１０８】実施例４（競合法、試薬ｅ） （１）実施例１の（１０）におけるヒト抗免疫グロブリ
ン抗体の代りにＰＳ抗体を用いた以外は同様の方法で、
ＰＳ抗体が結合したビオチン化キトサンを得た。

【０１０９】（２）濃度既知のＰＳ抗体試料溶液に、上
記（１）のＰＳ抗体が結合したビオチン化キトサン溶液
を一定量加え、この溶液に実施例１の（７）のＰＳ固定
化測定用チップの検出部を浸漬して、固定化されている
ＰＳに、試料のＰＳ抗体とビオチン化キトサンに結合し
たＰＳ抗体を競合的に反応させた。

【０１１０】（３）上記（２）の検出部を、実施例１の
（１１）の蛍光色素で標識されたアビジン溶液に浸漬
し、ビオチン部分に蛍光色素で標識されたアビジンを結
合させた。

【０１１１】（４）実施例１の（１２）〜（１６）と同
様の方法でＰＳ抗体と蛍光強度の関係を調べ、図８の検
量線を作成した。

【０１１２】実施例５（競合法、試薬ｄ） （１）０．１M リン酸緩衝液（pH５．５）に、アビジン
１mgとフィコビリタンパク５mgを溶かし、この溶液にＣ
ＨＭＣ１００mgを加え、４℃で１２時間反応させた。次
にこの反応液を陰イオン交換クロマトグラフィーにか
け、フィコビリタンパクで標識されたアビジン溶液を分
離精製した。

【０１１３】（２）実施例１の（１０）の抗免疫グロブ
リン抗体の代りにＰＳ抗体が結合したビオチン化キトサ
ン溶液と上記（１）のフィコビリタンパクで標識された
アビジン溶液を混合して反応させ、フィコビリタンパク
で標識されたアビジン＋ビオチン＋キトサン＋ＰＳ抗体
溶液を得た。

【０１１４】（３）上記（２）に蛍光標識抗体溶液を２
％ウシ血清アルブミンを含んだ２倍濃度のリン酸緩衝生
理食塩水と等量混合し、遮光して４℃で１週間保存し
た。

【０１１５】（４）実施例１の（７）のＰＳ固定化測定
用チップを２％亜硫酸ナトリウム溶液に浸し、密封して
４℃で１週間保存した。

【０１１６】（５）濃度既知のＰＳ抗体試料溶液に、上
記（３）の蛍光標識抗体溶液を一定量加え、この溶液に
上記（４）のＰＳ固定化測定用チップの検出部を浸漬し
て、固定化されているＰＳに、試料のＰＳ抗体と蛍光標
識抗体を競合的に反応させた。

【０１１７】（６）実施例１の（１５）〜（１７）と同
様の方法でＰＳ抗体を測定した。蛍光標識抗体溶液やＰ
Ｓ固定化測定用チップの反応性、検出感度は１週間保存
後も変化がなかった。

【０１１８】実施例６（サンドウィッチ法、試薬ｅ） （１）実施例１の（１）の光ファイバーの先端に銀を真
空蒸着して反射ミラーを形成した反射型測定用チップを
用いたこと、及び実施例１の（５）の１，４−ジアミノ
ブタンの代りに１，１２−ジアミノドデカンをスペーサ
として用いたこと以外は、実施例１の（１）〜（７）と
同様の方法で図４のＰＳ固定化反射型測定用チップを得
た。

【０１１９】（２）上記（１）のＰＳ固定化測定用チッ
プを用いて、実施例１の（８）〜（１７）と同様の方法
でＰＳ抗体を測定した。

【０１２０】実施例７（サンドウィッチ法、試薬ｅ） （１）実施例１の（５）の１，４−ジアミノブタンの代
りに、４−（２−アミノエチル）−シクロヘキサノール
をスペーサとして用いたこと以外は、実施例１の（１）
〜（７）と同様の方法でＰＳ固定化測定用チップを得
た。

【０１２１】（２）上記（１）のＰＳ固定化測定用チッ
プを用いて、実施例３の（１）〜（４）と同様の方法
で、図６の装置を用いてＰＳ抗体を測定した。

【０１２２】実施例８（サンドウィッチ法、試薬ｇ） （１）１．８μM のキトサン溶液２mlに、ウサギ免疫グ
ロブリンＧを混合し、さらに１００mgのＣＨＭＣを添加
して、５時間〜１晩室温で反応させた。反応生成物を１
０mMカリウム−リン酸緩衝液に１２時間透析した。この
懸濁液に硫酸ナトリウム１００mgを加えて、免疫グロブ
リンＧが結合したキトサンを沈澱させ、遠心分離により
回収した。この沈澱を１０mMカリウム−リン酸緩衝液
（pH７）２mlに懸濁し、同緩衝液５００mlに４℃で一晩
透析して免疫グロブリンＧが結合したキトサン溶液を得
た。

【０１２３】（２）上記（１）の免疫グロブリンＧが結
合したキトサン溶液に、マウス由来のヒト抗免疫グロブ
リン抗体のＦａｂフラグメント（生化学工業（株）製、
抗原との結合能力を有するが、プロティンＡとは結合し
ない）１mgを加え、さらにＣＨＭＣ２０mgを加えて、４
℃で５時間反応させると、免疫グロブリンＧ又はキトサ
ンと結合する。この反応生成物を１０mMカリウム−リン
酸緩衝液（pH７）で透析した。この懸濁液に硫酸ナトリ
ウムを加えて沈澱させ、この沈澱を同緩衝液で透析する
操作を行ってヒト抗免疫グロブリン抗体＋キトサン＋免
疫グロブリンＧ懸濁液を得た。

【０１２４】（３）シアニン系蛍光色素ＮＫ１１６０
（日本感光色素研究所製）２mgとトリエチルアミン０．
２mlをエタノール１mlに溶解し、次いでプロティンＡ１
mgを懸濁した。この懸濁液にＤＣＣ０．３mlを加え、４
℃で２晩反応させた。反応生成物を遠心分離して沈澱を
回収し、０℃のエタノール２mlを加えて再懸濁した。こ
れを再び遠心分離で沈澱を回収し、水冷しながらエバポ
レータでエタノールを除去した。この工程で生じた残留
物を０．０２M 酢酸緩衝液（pH６．５）２mlに溶解して
蛍光色素で標識されたプロティンＡを得た。

【０１２５】（４）実施例１の（７）のＰＳ固定化測定
用チップを用いて、実施例１の（１２）〜（１７）と同
様の方法でＰＳ抗体を測定した。

【０１２６】実施例９（競合法、試薬ｃ） （１）水５０mlに炭酸ナトリウム３mgとビオチン１０mg
を溶かした溶液に、２．０μM のＰＳ抗体溶液２mlを加
え、さらにＣＨＭＣ１００mgを加え、攪拌しながら室温
で５〜２４時間反応させた。この反応生成物をカラムク
ロマトグラフィーで精製し、ビオチン化ＰＳ抗体を得
た。

【０１２７】（２）濃度既知のＰＳ抗体試料溶液と上記
（１）のビオチン化ＰＳ抗体とを体積比で１：１の割合
で混合した溶液に、実施例１の（７）のＰＳ固定化測定
用チップの検出部を浸漬して、固定化されているＰＳ
に、試料のＰＳ抗体とビオチン化ＰＳ抗体を競合的に反
応させた。

【０１２８】（３）上記（２）のＰＳ抗体が結合した測
定用チップの検出部を、市販のフルオレセインで標識さ
れたアビジン（フナコシ製薬製）の水溶液に浸漬して反
応させ、ビオチン部分にフルオレセインで標識されたア
ビジンを結合させた。

【０１２９】（４）図５の装置を用い、上記（３）の測
定用チップの検出部を２％炭酸ナトリウム溶液（pH１
２）に浸漬しながら、フルオレセインの通常の励起波長
（４９６nm）の約２倍の波長（９８０nm）の半導体レー
ザの光で励起し、蛍光波長（５１８nm）の蛍光強度を測
定した。

【０１３０】（５）実施例１の（１６）及び（１７）の
方法でＰＳ抗体を測定した。

【０１３１】実施例１０（競合法、試薬ａ） （１）３mg/ml のＰＳ抗体溶液１mlに、７−ヒドロキシ
クマリン−３−カルボン酸（ウンベリフェロン）２０mg
を溶かし、さらにＣＨＭＣ１００mgを加えて４℃で１０
時間反応させた。これをリン酸緩衝生理食塩水に透析し
て、ウンベリフェロンで標識されたＰＳ抗体を得た。

【０１３２】（２）濃度既知のＰＳ抗体試料と、上記
（１）のウンベリフェロンで標識されたＰＳ抗体とを体
積比１：１の割合で混合した溶液に、実施例１の（７）
のＰＳ固定化測定用チップの検出部を浸漬して、固定化
されたＰＳに、試料のＰＳ抗体とウンベリフェロンで標
識されたＰＳ抗体を競合的に反応させた。

【０１３３】（３）図５の装置を用い、上記（２）の測
定用チップの検出部を０．２％炭酸ナトリウム水溶液
（pH９）に浸漬しながら、ウンベリフェロンの通常の励
起波長（３６５nm）の約２倍の波長（７８０nm及び７７
０nmの２種類）の半導体レーザの光で励起して、蛍光波
長（４５０nm）の蛍光強度を測定した。

【０１３４】（４）実施例１の（１６）及び（１７）の
方法でＰＳ抗体を測定した。

【０１３５】実施例１１（サンドウィッチ法、試薬ｄ） （１）実施例１の（１０）のヒト抗免疫グロブリン抗体
が結合したビオチン化キトサン溶液に、市販のフルオレ
セインで標識されたアビジン（フナコシ製薬製）溶液を
混合して反応させ、フルオレセインで標識されたアビジ
ン＋ビオチン＋キトサン＋抗免疫グロブリン抗体溶液を
得た。

【０１３６】（２）濃度既知のＰＥ抗体試料溶液に、実
施例２の（２）のＰＥ固定化測定用チップの検出部を浸
漬して反応させ、ＰＥに試料のＰＥ抗体を結合させた。

【０１３７】（３）上記（２）のＰＥ抗体が結合した測
定用チップの検出部を上記（１）の蛍光標識抗体溶液に
浸漬して、ＰＥ抗体を抗原として認識して蛍光標識抗体
を結合させた。

【０１３８】（４）実施例９の（４）及び（５）と同様
の方法でＰＥ抗体を測定した。

【０１３９】実施例１２（サンドウィッチ法、試薬ｅ） （１）濃度既知のＰＥ抗体試料溶液に、実施例２の
（２）のＰＥ固定化測定用チップの検出部を浸漬して反
応させ、ＰＥに試料のＰＥ抗体を結合させた。

【０１４０】（２）実施例１の（１０）の抗免疫グロブ
リン抗体が結合したビオチン化キトサン溶液に、上記
（１）のＰＥ抗体が結合した測定用チップの検出部を浸
漬して反応させ、ＰＥ抗体と抗免疫グロブリン抗体＋キ
トサン＋ビオチンを結合させた。

【０１４１】（３）上記（２）の測定用チップの検出部
を、フルオレセインで標識されたアビジン溶液に浸漬し
て反応させ、ビオチン部分にフルオレセインで標識され
たアビジンを結合させた。

【０１４２】（４）実施例９の（４）及び（５）と同様
の方法でＰＥ抗体を測定した。

【０１４３】実施例１３（サンドウィッチ法、試薬ａ） （１）実施例１０の（１）におけるＰＳ抗体の代りに抗
免疫グロブリン抗体を用いた以外は同様の方法で、ウン
ベリフェロンで標識された抗免疫グロブリン抗体を得
た。

【０１４４】（２）濃度既知のＰＳ抗体試料溶液に、実
施例１の（７）のＰＳ固定化測定用チップを浸漬して反
応させ、ＰＳに試料のＰＳ抗体を結合させた。

【０１４５】（３）上記（２）のＰＳ抗体が結合した測
定用チップの検出部を、上記（１）のウンベリフェロン
で標識された抗免疫グロブリン抗体溶液に浸漬して反応
させ、ＰＳ抗体にウンベリフェロンで標識された抗免疫
グロブリン抗体を結合させた。

【０１４６】（４）実施例１０の（３）及び（４）と同
様の方法でＰＳ抗体を測定した。

【０１４７】実施例１４（競合法、試薬ｄ） （１）濃度既知のＰＥ抗体試料溶液と、実施例１１の
（１）における抗免疫グロブリン抗体の代りにＰＥ抗体
が結合した、フルオレセインで標識されたアビジン＋ビ
オチン＋キトサン＋ＰＥ抗体溶液とを１：１の体積比で
混合した溶液に、実施例２の（２）のＰＥ固定化測定用
チップの検出部を浸漬して、ＰＥに試料のＰＥ抗体と前
記蛍光標識抗体とを競合的に反応させた。

【０１４８】（２）実施例９の（４）及び（５）と同様
の方法でＰＥ抗体を測定した。

【０１４９】実施例１５（競合法、試薬ｅ） （１）濃度既知のＰＥ抗体試料溶液と、実施例１の（１
０）における抗免疫グロブリン抗体の代りにＰＥ抗体が
結合したビオチン化キトサン溶液とを１：１の体積比で
混合した溶液に実施例２の（２）のＰＥ固定化測定用チ
ップの検出部を浸漬して、ＰＥに試料のＰＥ抗体とビオ
チン化キトサンに結合しているＰＥ抗体とを競合的に反
応させた。

【０１５０】（２）上記（１）のＰＥ抗体が結合した測
定用チップの検出部を、市販のフルオレセインで標識さ
れたアビジン（フナコシ製薬製）の溶液に浸漬し、ビオ
チン部分にフルオレセインで標識されたアビジンを結合
させた。

【０１５１】（３）実施例９の（４）及び（５）と同様
の方法でＰＥ抗体を測定した。

【０１５２】実施例１６（サンドウィッチ法、試薬ｂ） （１）実施例９の（１）のＰＳ抗体の代りに抗免疫グロ
ブリン抗体を用いて調製したビオチン化抗免疫グロブリ
ン抗体溶液と、市販のフルオレセインで標識されたアビ
ジン（フナコシ製薬製）の水溶液を混合して反応させ、
フルオレセインで標識されたアビジン＋ビオチン＋抗免
疫グロブリン抗体溶液を得た。

【０１５３】（２）濃度既知のＰＳ抗体試料溶液に、実
施例１の（７）のＰＳ固定化測定用チップの検出部を浸
漬して反応させ、ＰＳに試料のＰＳ抗体を結合させた。

【０１５４】（３）上記（２）のＰＳ抗体が結合した測
定用チップの検出部を、上記（１）の蛍光標識抗体溶液
に浸漬して、ＰＳ抗体を抗原として認識して蛍光標識抗
体を結合させた。

【０１５５】（４）実施例９の（４）及び（５）と同様
の方法でＰＳ抗体を測定した。

【０１５６】実施例１７（サンドウィッチ法、試薬ｅ） （１）３mg/lのマウス由来ヒト抗免疫グロブリン抗体の
溶液にビオチン２０mgとＣＨＭＣ１００mgを溶かし、４
℃で１２時間反応させた。反応終了後、リン酸緩衝生理
食塩水５００mlに対して透析してビオチン化抗免疫グロ
ブリン抗体溶液をを得た。

【０１５７】（２）濃度既知のＰＳ抗体試料溶液に、実
施例１の（７）のＰＳ固定化測定用チップの検出部を浸
漬して反応させ、ＰＳに試料のＰＳ抗体を結合させた。

【０１５８】（３）上記（１）のビオチン化抗免疫グロ
ブリン抗体溶液に上記（２）のＰＳ抗体が結合した測定
用チップの検出部を浸漬して反応させ、ＰＳ抗体を抗原
として認識して抗免疫グロブリン抗体＋ビオチンを結合
させた。

【０１５９】（４）上記（３）の測定用チップの検出部
を、市販のフルオレセインで標識されたアビジン溶液に
浸漬して反応させ、ビオチン部分にフルオレセインで標
識されたアビジンを結合させた。

【０１６０】（５）実施例９の（４）及び（５）と同様
の方法でＰＳ抗体を測定した。

【０１６１】実施例１８（サンドウィッチ法、試薬ｆ） （１）実施例８の（２）で得た抗免疫グロブリン抗体＋
キトサン＋免疫グロブリンＧ溶液と、実施例８の（３）
で得たシアニン系蛍光色素ＮＫ１１６０で標識されたプ
ロティンＡ溶液を混合し、ＮＫ１１６０で標識されたプ
ロティンＡ＋免疫グロブリンＧ＋キトサン＋ヒト抗免疫
グロブリン抗体懸濁液を得た。

【０１６２】（２）濃度既知のＰＳ抗体試料溶液に、実
施例１の（７）のＰＳ固定化測定用チップの検出部を浸
漬して反応させ、ＰＳに試料のＰＳ抗体を結合させた。

【０１６３】（３）上記（１）で得た懸濁液に、上記
（２）の測定用チップの検出部を浸漬して反応させた。

【０１６４】（４）実施例１の（１２）〜（１７）と同
様の方法でＰＳ抗体を測定した。

【０１６５】比較例（ＥＬＩＳＡ法） （１）３mg/ml のＰＳのジクロロメタン溶液をマイクロ
プレートのウエルに０．１mlづつ入れ、減圧下でジクロ
ロメタンを除去してＰＳをウエルの壁に吸着させた。

【０１６６】（２）濃度既知のＰＳ抗体試料溶液を各ウ
エルに加えて、室温で１時間放置して反応させた。反応
後、ウエルの中の液を捨て、これに０．０５％界面活性
剤（ツイン２０）含有リン酸緩衝生理食塩水を加え、さ
らにこの液を捨てた。この操作を繰り返して洗浄した。

【０１６７】（３）これにペルオキシダーゼ標識ヒト抗
免疫グロブリン抗体溶液を加え、室温で３０分間放置し
て反応させた。反応後上記と同様の洗浄操作を繰り返し
た。

【０１６８】（４）これに微量の過酸化水素を含んだＯ
−フェニレンジアミン溶液を加え、室温で３０分間反応
させた。反応後８M 硫酸を加えて反応を停止させた。

【０１６９】（５）各ウエルの吸光度を測定し、ＰＳ抗
体と吸光度の検量線を図９に示す。

【０１７０】

【発明の効果】本発明の測定法によれば、表２に示すよ
うに高感度でリン脂質抗体量を測定することができ、少
量の検体を用いて、小型化された装置を用いて多数の検
体を一度に測定することができるので、病院等で妊娠中
毒症の検査に用いることができる。

【０１７１】

【表２】

【図面の簡単な説明】

【図１】競合法の模式図を示す。

【図２】サンドウィッチ法の模式図を示す。

【図３】対向型の測定用チップの概念図を示す。

【図４】反射型の測定用チップの概念図を示す。

【図５】蛍光測定装置を示す。

【図６】蛍光測定装置を示す。

【図７】実施例１のサンドウィッチ法によるＰＳ抗体の
検量線を示す。

【図８】実施例４の競合法によるＰＳ抗体の検量線を示
す。

【図９】比較例のＥＬＩＳＡ法によるＰＳ抗体の検量線
を示す。

【図１０】１，４−ジアミノブタンの濃度と吸光度の関
係を示す。

【符号の説明】

Ｐ リン脂質 ｙ 試料中のリン脂質に対する抗体 Ｙ リン脂質抗体に対する抗体又は抗免疫グロブリン抗
体 Ａ アビジン Ｂ ビオチン １ 蛍光を検出・測定する装置 ２ 励起光をカットするフィルター ３ 光を伝送する光ファイバー ４ 光源（レーザ光） ５ 蛍光の進行方向を変えるハーフミラー又はプリズム ６ ガイドレール ７ 測定用チップ（光ファイバー） ８ 測定液の入ったセル ９ ミラー

【化５】

【化６】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｓ 33/547 33/547 (56)参考文献 特開 平３−134567（ＪＰ，Ａ) 特開 昭54−147913（ＪＰ，Ａ) 特開 昭55−156875（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−43947（ＪＰ，Ａ) 特表 昭59−501873（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G01N 33/543 595 G01N 33/543 525 G01N 21/64 G01N 21/78 G01N 33/53 G01N 33/547 ＣＡ（ＳＴＮ)

Claims (2)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 光ファイバー表面のホルミル基に式
   （Ｉ）、（II）、又は（III） 【化１】 （式中、Ｒはイミノ基又は酸素原子を表し、ｍは１〜２
   １の整数を表し、ｎ及びｎ′はそれぞれ０〜１０の整数
   を表す）で示される二価性スペーサー分子を介してリン
   脂質が固定化されている、リン脂質抗体の測定用チッ
   プ。
2. 【請求項２】 請求項１記載の測定用チップを用いたリ
   ン脂質の測定方法。