JP3426602B2 - 多分析物均質蛍光免疫検定用の装置および方法 - Google Patents
多分析物均質蛍光免疫検定用の装置および方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】
発明の背景
技術分野：本出願は、蛍光結合検定により特定物質の試
料を分析する分野に、より詳しくは、消失性光を使用す
るその様な検定を行なうための装置、組成物および方法
に関する。
料を分析する分野に、より詳しくは、消失性光を使用す
るその様な検定を行なうための装置、組成物および方法
に関する。
先行技術：トレーサー分子の蛍光により分析物を光学的
に検出する系のバイオセンサー装置は、近年、ますます
注目されている。その様な装置は、診断および研究の両
方の目的に有用である。特に、所望の分析物に対して特
異性がある抗体または抗体断片を基材に固定し、分析物
と抗体の結合が直接または間接的に（例えば標識を付け
たトレーサーにより）蛍光信号を生ずる、固相蛍光免疫
検定用のバイオセンサーは、重要な光学的バイオセンサ
ーの一種になりつつある。
に検出する系のバイオセンサー装置は、近年、ますます
注目されている。その様な装置は、診断および研究の両
方の目的に有用である。特に、所望の分析物に対して特
異性がある抗体または抗体断片を基材に固定し、分析物
と抗体の結合が直接または間接的に（例えば標識を付け
たトレーサーにより）蛍光信号を生ずる、固相蛍光免疫
検定用のバイオセンサーは、重要な光学的バイオセンサ
ーの一種になりつつある。
ほんどの固相蛍光免疫検定では、十分な感度を達成す
るために、蛍光を測定する前に、結合していないトレー
サーを除去するための“洗浄”工程が必要である。この
問題は、血液、血清および尿を含む体液中で問題とする
多くの分析物の場合の様に、ナノモル未満の濃度で存在
する分析物の検出に特に当てはまる。しかし、洗浄工程
は時間がかかり、再現性がある正確な結果を得るために
は、技術者の側の注意が必要である。したがって、洗浄
工程なしに、10-10〜10-13モル又はそれ以下の分析物濃
度に対する感度が達成される蛍光免疫検定方式を提供す
ることが強く望まれている。
るために、蛍光を測定する前に、結合していないトレー
サーを除去するための“洗浄”工程が必要である。この
問題は、血液、血清および尿を含む体液中で問題とする
多くの分析物の場合の様に、ナノモル未満の濃度で存在
する分析物の検出に特に当てはまる。しかし、洗浄工程
は時間がかかり、再現性がある正確な結果を得るために
は、技術者の側の注意が必要である。したがって、洗浄
工程なしに、10-10〜10-13モル又はそれ以下の分析物濃
度に対する感度が達成される蛍光免疫検定方式を提供す
ることが強く望まれている。
全内部反射（略してTIR）と呼ばれる光学技術が、そ
の様な方式に近づく一つの道を与える。消失性（evanes
cent）光は、導波管中を伝わる光線が、導波管と周囲
の、より低い屈折率を有する媒体との間の界面で完全に
内部反射する場合に生じる光である。内部反射された光
の電磁界の一部が周囲の媒体中に透過し、消失性光界を
構成する。消失性光の強度は、導波管表面からの距離と
共に指数的に低下する。蛍光免疫検定では、消失性光を
使用し、固定された結合剤に直接または間接的に結合し
たトレーサー分子を選択的に励起することができるが、
消失性光透過距離を越える溶液中にある遊離なトレーサ
ー分子は励起されず、したがって“背景”蛍光に寄与し
ない。蛍光測定に消失性光界特性を使用することは、消
失性光感知と呼ばれることがある。ガラスまたは類似の
シリカ系材料、あるいはポリスチレンの様な光学プラス
チックには、周囲媒体が水溶液である場合、消失性光に
よる有効励起区域は一般的に導波管表面から約1000〜20
00Å（オングストローム）である。この深度は、溶液中
に遊離しているトレーサー分子の多くを励起せずに、導
波管表面上の捕獲分子（抗体、レセプター分子等および
それらの断片）の大部分を励起するのに十分である。こ
の様にして生じる蛍光が、固定捕獲分子に結合したトレ
ーサーの量、したがって存在する分析物の量を反映す
る。
の様な方式に近づく一つの道を与える。消失性（evanes
cent）光は、導波管中を伝わる光線が、導波管と周囲
の、より低い屈折率を有する媒体との間の界面で完全に
内部反射する場合に生じる光である。内部反射された光
の電磁界の一部が周囲の媒体中に透過し、消失性光界を
構成する。消失性光の強度は、導波管表面からの距離と
共に指数的に低下する。蛍光免疫検定では、消失性光を
使用し、固定された結合剤に直接または間接的に結合し
たトレーサー分子を選択的に励起することができるが、
消失性光透過距離を越える溶液中にある遊離なトレーサ
ー分子は励起されず、したがって“背景”蛍光に寄与し
ない。蛍光測定に消失性光界特性を使用することは、消
失性光感知と呼ばれることがある。ガラスまたは類似の
シリカ系材料、あるいはポリスチレンの様な光学プラス
チックには、周囲媒体が水溶液である場合、消失性光に
よる有効励起区域は一般的に導波管表面から約1000〜20
00Å（オングストローム）である。この深度は、溶液中
に遊離しているトレーサー分子の多くを励起せずに、導
波管表面上の捕獲分子（抗体、レセプター分子等および
それらの断片）の大部分を励起するのに十分である。こ
の様にして生じる蛍光が、固定捕獲分子に結合したトレ
ーサーの量、したがって存在する分析物の量を反映す
る。
トレーサー蛍光は消失性光的に導波管の中にも逆透過
し、その中で伝播される。導波管により消失性光を効果
的に集めるための最大溶液深度は、溶液中への消失性光
透過区域の深度に近似しているので、トレーサー蛍光の
導波管透過部分は、導波管に結合したトレーサーから来
る蛍光を選択的に測定することにも使用できる。
し、その中で伝播される。導波管により消失性光を効果
的に集めるための最大溶液深度は、溶液中への消失性光
透過区域の深度に近似しているので、トレーサー蛍光の
導波管透過部分は、導波管に結合したトレーサーから来
る蛍光を選択的に測定することにも使用できる。
Carterへの米国特許第RE33,064号、Flanaganらへの第
5,081,012号、Keckへの第4,880,752号、Attridgeへの第
5,166,515号、およびSlovacekおよびLoveへの第5,156,9
76号、および欧州特許出願公開第0517516号および第051
9623号（両方ともSlovacek等によるもの）はすべて消失
性光感知原理を使用する蛍光免疫検定用装置を開示して
いる。
5,081,012号、Keckへの第4,880,752号、Attridgeへの第
5,166,515号、およびSlovacekおよびLoveへの第5,156,9
76号、および欧州特許出願公開第0517516号および第051
9623号（両方ともSlovacek等によるもの）はすべて消失
性光感知原理を使用する蛍光免疫検定用装置を開示して
いる。
免疫蛍光バイオセンサーは、10-12M（モル）以下の濃
度で分析物分子を検出できるのが望ましい。これまで、
消失性光型バイオセンサーのほとんどの報告は、せいぜ
い10-11Mの濃度が検出できるだけであることを示してい
る。
度で分析物分子を検出できるのが望ましい。これまで、
消失性光型バイオセンサーのほとんどの報告は、せいぜ
い10-11Mの濃度が検出できるだけであることを示してい
る。
さらに、“日常”の試験、例えば血液銀行試料のウィ
ルス抗体に対する試験、におけるスピードおよび便利さ
に関して、使い捨てでありかつ多試料測定能力がある消
失性光免疫蛍光バイオセンサーが望ましい。多試料能力
により、試験試料および比較試料（例えばブランク、陽
性比較、あるいは競合型検定の場合は、トレーサー分子
を予め加えた試料）を同時に発光させ、測定することが
できる。また、同時多試料能力により、複数の試料を分
析する工程が迅速化され、代表的な光源で起こることが
分かっている励起光の水準変動の影響が少なくなろう。
しかし、Blockらの米国特許第4,909,990号、1990年３月
20日公布、の装置の様な、典型的な先行技術の消失性光
装置では、導波管がファイバー光学ロッドであり、その
形状のために多貯蔵部（マルチウエル）バイオセンサー
の構築は困難である。
ルス抗体に対する試験、におけるスピードおよび便利さ
に関して、使い捨てでありかつ多試料測定能力がある消
失性光免疫蛍光バイオセンサーが望ましい。多試料能力
により、試験試料および比較試料（例えばブランク、陽
性比較、あるいは競合型検定の場合は、トレーサー分子
を予め加えた試料）を同時に発光させ、測定することが
できる。また、同時多試料能力により、複数の試料を分
析する工程が迅速化され、代表的な光源で起こることが
分かっている励起光の水準変動の影響が少なくなろう。
しかし、Blockらの米国特許第4,909,990号、1990年３月
20日公布、の装置の様な、典型的な先行技術の消失性光
装置では、導波管がファイバー光学ロッドであり、その
形状のために多貯蔵部（マルチウエル）バイオセンサー
の構築は困難である。
得られる感度に影響するもう一つのファクターは、導
波管から放射される励起光の強度に関連する。トレーサ
ー分子から放射される蛍光の強度は、一部、励起光（こ
れは消失性光界である）の強度に依存する。したがっ
て、消失性光強度が増加すると、蛍光が増加し、それに
よって検出感度が改良される。消失性光の水準は、導波
管中を伝播する光線の強度に依存し、これは導波管の断
面積の減少により増加させることができる。
波管から放射される励起光の強度に関連する。トレーサ
ー分子から放射される蛍光の強度は、一部、励起光（こ
れは消失性光界である）の強度に依存する。したがっ
て、消失性光強度が増加すると、蛍光が増加し、それに
よって検出感度が改良される。消失性光の水準は、導波
管中を伝播する光線の強度に依存し、これは導波管の断
面積の減少により増加させることができる。
消失性光バイオセンサーにおいて抗体を光学基材に固
定する従来の方法も、感度低下を引き起こす幾つかの問
題を有する。その様な方法の多くは、タンパク質中のリ
シン残基物のε−アミノ基を利用している。この方法に
は、ほとんどのタンパク質は複数のリシン残基を有する
ために、少なくとも二つの重大な欠点がある。第一に、
複数の潜在的結合部位（複数のリシン残基）の存在が、
基材表面上で抗体の複数の不規則配向を引き起こす。基
材と結合したリシン残基が抗体分子のＮ−末端に近い場
合、抗体の（Ｎ−末端近くにある）抗原結合部位は分析
物を結合するために効果的に利用されないことがある。
定する従来の方法も、感度低下を引き起こす幾つかの問
題を有する。その様な方法の多くは、タンパク質中のリ
シン残基物のε−アミノ基を利用している。この方法に
は、ほとんどのタンパク質は複数のリシン残基を有する
ために、少なくとも二つの重大な欠点がある。第一に、
複数の潜在的結合部位（複数のリシン残基）の存在が、
基材表面上で抗体の複数の不規則配向を引き起こす。基
材と結合したリシン残基が抗体分子のＮ−末端に近い場
合、抗体の（Ｎ−末端近くにある）抗原結合部位は分析
物を結合するために効果的に利用されないことがある。
第二に、同じ抗体分子上の複数のリシンが基材と結合
する場合、その分子は構造的なひずみを受け、抗原結合
部位をねじ曲げ、その結合効率を変化させる。典型的な
先行技術の方法により固定された捕獲分子に関しては、
一般的に分析物結合に対して、結合部位の20％以下しか
機能しない。したがって、捕獲分子が一様に配向し、分
析物の結合に使用できる様に、抗体または他のタンパク
質を結合するための部位に特異的な方法が望ましい。
する場合、その分子は構造的なひずみを受け、抗原結合
部位をねじ曲げ、その結合効率を変化させる。典型的な
先行技術の方法により固定された捕獲分子に関しては、
一般的に分析物結合に対して、結合部位の20％以下しか
機能しない。したがって、捕獲分子が一様に配向し、分
析物の結合に使用できる様に、抗体または他のタンパク
質を結合するための部位に特異的な方法が望ましい。
もう一つの問題は、光学基材の抗体被覆した表面に非
特異的に結合する程度に関連している。これらの程度が
高いために、約10-10M未満の濃度で分析物を検出するの
が非常に困難になる場合が多い。非特異的結合は、試料
を被覆基材で培養した後、結合していないトレーサー分
子を除去するために洗浄工程を含むことにより、減少さ
せることができる。しかし、上に説明した様に、洗浄工
程は好ましくない。第二に、非特異的結合は、ウシ血清
アルブミンの様なマスキング剤またはポリ（エチレング
リコール）またはポリ（メタクリルレート）の様な親水
性重合体で表面を“不動態化”しない限り、深刻な問題
になることがある。その様な不動態化（これは手順にさ
らに別の工程を加える）を行なわないと、非特異的結合
は、特異的結合の50％以上にもなることがある。不動態
化した表面でも、非特異的結合は、検出感度および再現
性を下げるのに十分である場合がある。
特異的に結合する程度に関連している。これらの程度が
高いために、約10-10M未満の濃度で分析物を検出するの
が非常に困難になる場合が多い。非特異的結合は、試料
を被覆基材で培養した後、結合していないトレーサー分
子を除去するために洗浄工程を含むことにより、減少さ
せることができる。しかし、上に説明した様に、洗浄工
程は好ましくない。第二に、非特異的結合は、ウシ血清
アルブミンの様なマスキング剤またはポリ（エチレング
リコール）またはポリ（メタクリルレート）の様な親水
性重合体で表面を“不動態化”しない限り、深刻な問題
になることがある。その様な不動態化（これは手順にさ
らに別の工程を加える）を行なわないと、非特異的結合
は、特異的結合の50％以上にもなることがある。不動態
化した表面でも、非特異的結合は、検出感度および再現
性を下げるのに十分である場合がある。
したがって、均質検定（均質とは、本出願の目的に関
しては、洗浄工程を必要としない検定として定義する）
で所望の感度を与える消失性光バイオセンサーが必要と
されている。さらに、ピコモル濃度以下で分析物を検出
するための、改良された感度を有する装置が必要とされ
ている。また、非特異的結合が低く、一様に配向した捕
獲分子を有する、免疫検定およびバイオセンサーも必要
とされている。安価で、熟練していない人でも容易に使
用できるバイオセンサーおよび検定方式も必要とされて
いる。
しては、洗浄工程を必要としない検定として定義する）
で所望の感度を与える消失性光バイオセンサーが必要と
されている。さらに、ピコモル濃度以下で分析物を検出
するための、改良された感度を有する装置が必要とされ
ている。また、非特異的結合が低く、一様に配向した捕
獲分子を有する、免疫検定およびバイオセンサーも必要
とされている。安価で、熟練していない人でも容易に使
用できるバイオセンサーおよび検定方式も必要とされて
いる。
発明の概要
本発明は、１種類以上の分析物をピコモル未満の濃度
で検出できる、消失性光原理に基づく均質免疫蛍光検定
用の装置および方法の両方を含む方式に関する。この装
置では、導波管の縁部または末端に導入され、導波管の
内部を伝播する光線から隣接する溶液中に透過する消失
性光界により、導波管に結合した蛍光を放射するトレー
サー分子が励起される。次いで、放射された蛍光が、例
えば導波管の縁部または末端からではなく、消失性光透
過区域から直接集められる。
で検出できる、消失性光原理に基づく均質免疫蛍光検定
用の装置および方法の両方を含む方式に関する。この装
置では、導波管の縁部または末端に導入され、導波管の
内部を伝播する光線から隣接する溶液中に透過する消失
性光界により、導波管に結合した蛍光を放射するトレー
サー分子が励起される。次いで、放射された蛍光が、例
えば導波管の縁部または末端からではなく、消失性光透
過区域から直接集められる。
本装置は、第一および第二の平行な平面およびそれら
の間を伸びる縁部を有する平らな導波管からなるバイオ
センサーを含み、その縁部は、内部伝播されるべき光を
受けるための受光区域を有する。半円筒形のレンズが受
光区域に隣接して導波管に一体化されており、導波管表
面の少なくとも一方が、その上に固定された複数の捕獲
分子を有する。捕獲分子は、選択された分析物を特異的
に結合する様に形成されており、縁部分子は抗体、抗体
断片、ハプテン、メンブランレセプター、またはどの様
な、効果的な特異的結合剤でもよい。縁部分子は、異な
った分析物にそれぞれ特異的な複数の種類を含むことが
でき、それぞれの種類は、導波管表面上の異なった、互
いに独占的な区域に位置することができる。
の間を伸びる縁部を有する平らな導波管からなるバイオ
センサーを含み、その縁部は、内部伝播されるべき光を
受けるための受光区域を有する。半円筒形のレンズが受
光区域に隣接して導波管に一体化されており、導波管表
面の少なくとも一方が、その上に固定された複数の捕獲
分子を有する。捕獲分子は、選択された分析物を特異的
に結合する様に形成されており、縁部分子は抗体、抗体
断片、ハプテン、メンブランレセプター、またはどの様
な、効果的な特異的結合剤でもよい。縁部分子は、異な
った分析物にそれぞれ特異的な複数の種類を含むことが
でき、それぞれの種類は、導波管表面上の異なった、互
いに独占的な区域に位置することができる。
本装置はさらに、縁部上にある受光区域を通して導波
管中にシート状の光線を送る様に形成されかつ配置され
た光源、および消失性光区域から蛍光を直接収集するた
めに配置された検出手段を含むが、直接収集とは、導波
管中への蛍光の透過を必要としないこと、と定義する。
検出手段は好ましくは、導波管表面上の異なった区域か
らそれぞれ生じた複数の蛍光信号を同時に、個別に集め
る様に形成された画像形成検出器である。画像形成検出
器は、離れた平行な平面内で互いに間隔を置いて配置さ
れた複数の光検出素子、および該蛍光信号のそれぞれを
各光検出素子上に集める様に配置したレンズ手段を含
む。
管中にシート状の光線を送る様に形成されかつ配置され
た光源、および消失性光区域から蛍光を直接収集するた
めに配置された検出手段を含むが、直接収集とは、導波
管中への蛍光の透過を必要としないこと、と定義する。
検出手段は好ましくは、導波管表面上の異なった区域か
らそれぞれ生じた複数の蛍光信号を同時に、個別に集め
る様に形成された画像形成検出器である。画像形成検出
器は、離れた平行な平面内で互いに間隔を置いて配置さ
れた複数の光検出素子、および該蛍光信号のそれぞれを
各光検出素子上に集める様に配置したレンズ手段を含
む。
非常に好ましい実施態様では、半円筒形レンズおよび
導波管が光学プラスチックで一体成形され、レンズは、
光線を、導波管−液体界面における反射の臨界角度より
小さい、選択された角度で導波管の面に向ける様に配置
されている。導波管は、受光区域と反対側の端部を形成
する、鋸歯状の部分を有することもできる。
導波管が光学プラスチックで一体成形され、レンズは、
光線を、導波管−液体界面における反射の臨界角度より
小さい、選択された角度で導波管の面に向ける様に配置
されている。導波管は、受光区域と反対側の端部を形成
する、鋸歯状の部分を有することもできる。
バイオセンサーの別の好ましい実施態様では、導波管
表面は、非特異的結合を少なくする不動態化する結合被
覆を施した光学基材である。捕獲分子は、光親和力架橋
剤により結合被覆に結合することができる。捕獲分子は
部位特異的な方法で被覆に結合することもできる。
表面は、非特異的結合を少なくする不動態化する結合被
覆を施した光学基材である。捕獲分子は、光親和力架橋
剤により結合被覆に結合することができる。捕獲分子は
部位特異的な方法で被覆に結合することもできる。
本発明はさらに、縁部分子を導波管表面に固定する方
法、異なる捕獲種のパッチで光学基材を製造する方法、
および洗浄工程を含まずに、消失性光蛍光免疫検定を行
なう方法も含む。異なった捕獲分子のパッチで導波管を
製造する方法では、光−親和力架橋剤をマスキング方式
と組合せて使用し、捕獲分子を導波管表面の選択された
区域に選択的に結合させることを含む。非常に好ましい
方法では、導波管表面を、非特異的なタンパク質結合を
阻止する被覆剤で被覆し、光活性化された架橋剤が、捕
獲分子を、捕獲分子上のチオール部位を介して被覆に結
合する。後者の結合により、捕獲分子が部位特異的に固
定されるので、捕獲分子の50％〜70％が、結合に容易に
使用できる分析物結合部位を有する。この方法は、５％
〜10％未満で、１〜２％程度と低い非特異的結合水準も
与える。
法、異なる捕獲種のパッチで光学基材を製造する方法、
および洗浄工程を含まずに、消失性光蛍光免疫検定を行
なう方法も含む。異なった捕獲分子のパッチで導波管を
製造する方法では、光−親和力架橋剤をマスキング方式
と組合せて使用し、捕獲分子を導波管表面の選択された
区域に選択的に結合させることを含む。非常に好ましい
方法では、導波管表面を、非特異的なタンパク質結合を
阻止する被覆剤で被覆し、光活性化された架橋剤が、捕
獲分子を、捕獲分子上のチオール部位を介して被覆に結
合する。後者の結合により、捕獲分子が部位特異的に固
定されるので、捕獲分子の50％〜70％が、結合に容易に
使用できる分析物結合部位を有する。この方法は、５％
〜10％未満で、１〜２％程度と低い非特異的結合水準も
与える。
図面の簡単な説明
図１は、本発明の蛍光免疫検定装置の略図であり、
図２は、本発明による競合免疫蛍光検定の導波管およ
び生物化学成分の一部の側面図であり、 図3Aは、図１の装置のフローバイオセンサーの上面図
であり、 図3Bは、図3Aの線Ｂ−Ｂに沿って切断したフローバイ
オセンサーの側方断面図であり、 図3Cは、円筒形レンズに対して分離して配置し得る導
波管および入射しかつ反射された光波を示し、 図4Aは、免疫検定における励起光線および蛍光の収集
に関する、図3A−3Bの２チャネルフローバイオセンサー
の立面図であり、 図4Bは、導波管区域に関する、検出装置の２つの構成
要素、CCDディテクターおよび入口分光計スリットの配
置を示す２チャネルバイオセンサーの略図であり、 図4Cは、図4Aおよび4Bにより配置したバイオセンサー
の２つのチャネルから検出される蛍光強度のグラフであ
り、 図5Aは、多チャネルバイオセンサーの別の実施態様を
示す立面図であり、 図5Bは、図5Aのバイオセンサーの側面図であり、図5C
は、垂直に配置し、中に試料溶液を含む、図5Aのバイオ
センサーの側面図であり、 図5Dは、図5Cの線Ｄ−Ｄに沿って切断したバイオセン
サーの断面図であり、 図６は、多貯蔵部バイオセンサーの別の実施態様の立
面図であり、 図7Aは、第一検定フォーマットにより図１の装置で行
なった、抗体を検出するためのサンドイッチ蛍光免疫検
定から得た蛍光強度データを示すグラフであり、 図7Bは、別の検定フォーマットにより図１の装置で行
なったサンドイッチ蛍光免疫検定から得たデータを示す
グラフであり、 図８は、図7Aおよび7Bの検定フォーマットで観察され
る蛍光増加を比較するグラフであり、 図9A乃至Ｆは、対応する抗体を使用して分析物を検出
するための、サンドイッチ蛍光免疫検定用の交互の構成
から得たデータを示すグラフであり、 図10A乃至Ｄは、本装置で行なった排除（displacemen
t）蛍光免疫検定から得たデータを示すグラフであり、 図11Aは、バイオセンサーの別の実施態様の立面図で
あり、 図11Bは、図11Aのバイオセンサー実施態様の断面図で
あり、 図11Cは、図11Aのバイオセンサー実施態様の末端図で
あり、 図12Aおよび12Bは、一体成形したバイオセンサーの別
の実施態様の、それぞれ上面図および立面図であり、 図13は、一体化レンズの別の実施態様による成形バイ
オセンサーの側面図であり、 図14Aおよび14Bは、改良された画像形成光検出方式の
側面図およびその方式で使用するためのフォトダイオー
ド列の上面図であり、 図15は、異なったFab'種のパッチで導波管を製造する
ためのフォトマスキング配置の斜視図であり、 図16は、異なったFab'種で導波管表面をパターン化す
る製法の工程を模式的に示す、導波管表面の一部の側面
図であり、 図17は、パターン化製法の別の実施態様を示す、導波
管表面の側面図であり、 図18A、18B、18Cおよび18Dは、本発明で有用な光親和
力架橋剤の化学式、および基材被覆に架橋剤を光結合さ
せる部分的化学反応を示す。
び生物化学成分の一部の側面図であり、 図3Aは、図１の装置のフローバイオセンサーの上面図
であり、 図3Bは、図3Aの線Ｂ−Ｂに沿って切断したフローバイ
オセンサーの側方断面図であり、 図3Cは、円筒形レンズに対して分離して配置し得る導
波管および入射しかつ反射された光波を示し、 図4Aは、免疫検定における励起光線および蛍光の収集
に関する、図3A−3Bの２チャネルフローバイオセンサー
の立面図であり、 図4Bは、導波管区域に関する、検出装置の２つの構成
要素、CCDディテクターおよび入口分光計スリットの配
置を示す２チャネルバイオセンサーの略図であり、 図4Cは、図4Aおよび4Bにより配置したバイオセンサー
の２つのチャネルから検出される蛍光強度のグラフであ
り、 図5Aは、多チャネルバイオセンサーの別の実施態様を
示す立面図であり、 図5Bは、図5Aのバイオセンサーの側面図であり、図5C
は、垂直に配置し、中に試料溶液を含む、図5Aのバイオ
センサーの側面図であり、 図5Dは、図5Cの線Ｄ−Ｄに沿って切断したバイオセン
サーの断面図であり、 図６は、多貯蔵部バイオセンサーの別の実施態様の立
面図であり、 図7Aは、第一検定フォーマットにより図１の装置で行
なった、抗体を検出するためのサンドイッチ蛍光免疫検
定から得た蛍光強度データを示すグラフであり、 図7Bは、別の検定フォーマットにより図１の装置で行
なったサンドイッチ蛍光免疫検定から得たデータを示す
グラフであり、 図８は、図7Aおよび7Bの検定フォーマットで観察され
る蛍光増加を比較するグラフであり、 図9A乃至Ｆは、対応する抗体を使用して分析物を検出
するための、サンドイッチ蛍光免疫検定用の交互の構成
から得たデータを示すグラフであり、 図10A乃至Ｄは、本装置で行なった排除（displacemen
t）蛍光免疫検定から得たデータを示すグラフであり、 図11Aは、バイオセンサーの別の実施態様の立面図で
あり、 図11Bは、図11Aのバイオセンサー実施態様の断面図で
あり、 図11Cは、図11Aのバイオセンサー実施態様の末端図で
あり、 図12Aおよび12Bは、一体成形したバイオセンサーの別
の実施態様の、それぞれ上面図および立面図であり、 図13は、一体化レンズの別の実施態様による成形バイ
オセンサーの側面図であり、 図14Aおよび14Bは、改良された画像形成光検出方式の
側面図およびその方式で使用するためのフォトダイオー
ド列の上面図であり、 図15は、異なったFab'種のパッチで導波管を製造する
ためのフォトマスキング配置の斜視図であり、 図16は、異なったFab'種で導波管表面をパターン化す
る製法の工程を模式的に示す、導波管表面の一部の側面
図であり、 図17は、パターン化製法の別の実施態様を示す、導波
管表面の側面図であり、 図18A、18B、18Cおよび18Dは、本発明で有用な光親和
力架橋剤の化学式、および基材被覆に架橋剤を光結合さ
せる部分的化学反応を示す。
例示する実施態様の詳細な説明
光源100から発せられた光線102が鏡104、106、108に
より、120で示す光学バイオセンサーに向けられる（図
１）。実施態様では、光源100は約488〜514.5ナノメー
トル（略してnm）の波長で光を放射できるアルゴンレー
ザーである。別の実施態様では、光源100として600〜約
700nmの波長で放射するレーザーダイオードを使用する
ことができる。蛍光トレーサーの必要条件に応じて、光
源100は、選択されたトレーサーを励起するのに適当な
波長で十分な量の光を放射する他のレーザーまたは高強
度光源として実施することもできる。
より、120で示す光学バイオセンサーに向けられる（図
１）。実施態様では、光源100は約488〜514.5ナノメー
トル（略してnm）の波長で光を放射できるアルゴンレー
ザーである。別の実施態様では、光源100として600〜約
700nmの波長で放射するレーザーダイオードを使用する
ことができる。蛍光トレーサーの必要条件に応じて、光
源100は、選択されたトレーサーを励起するのに適当な
波長で十分な量の光を放射する他のレーザーまたは高強
度光源として実施することもできる。
図１の実施態様はさらに、光線をバイオセンサー上に
集束させる前に、光線102を垂直光線にするために配置
された45゜の角度鏡を含む。当業者には明らかな様に、
鏡104、106、108、110の数と配置は、様々な空間上の制
限に合わせるために必要に応じて変えることができる
が、唯一の必要条件は、十分な量の光がバイオセンサー
120に向けられることである。
集束させる前に、光線102を垂直光線にするために配置
された45゜の角度鏡を含む。当業者には明らかな様に、
鏡104、106、108、110の数と配置は、様々な空間上の制
限に合わせるために必要に応じて変えることができる
が、唯一の必要条件は、十分な量の光がバイオセンサー
120に向けられることである。
バイオセンサー120は、光線102から光を受け取る様に
配置された一つの末端124を備えた光学基材122を有す
る。光線102から光を末端124の上に集束させるために、
角度鏡110と導波管122の末端124との間に焦点調節レン
ズ126が配置されている。焦点調節レンズ126は、ここで
はその位置を最良の焦点を得るために調整できる様に、
Ｘ−Ｙ移動装置上に取りつけた状態で示してある。免疫
蛍光検定装置に一般的に見られるロッド形状ファイバー
光導波管と対照的に、本発明では、図２に示す様に、光
学基材122は、幅により間隔を置いて配置された２つの
平らな表面を有する一般的に平らな形状を有する。光学
基材122は、例えば、正方形または長方形の顕微鏡用ス
ライドグラスまたはカバーグラス等でよい。光学基材12
2用の材料には、この分野でよく知られている様なガラ
ス、高鉛ガラス、石英、光学プラスチックなどがある。
配置された一つの末端124を備えた光学基材122を有す
る。光線102から光を末端124の上に集束させるために、
角度鏡110と導波管122の末端124との間に焦点調節レン
ズ126が配置されている。焦点調節レンズ126は、ここで
はその位置を最良の焦点を得るために調整できる様に、
Ｘ−Ｙ移動装置上に取りつけた状態で示してある。免疫
蛍光検定装置に一般的に見られるロッド形状ファイバー
光導波管と対照的に、本発明では、図２に示す様に、光
学基材122は、幅により間隔を置いて配置された２つの
平らな表面を有する一般的に平らな形状を有する。光学
基材122は、例えば、正方形または長方形の顕微鏡用ス
ライドグラスまたはカバーグラス等でよい。光学基材12
2用の材料には、この分野でよく知られている様なガラ
ス、高鉛ガラス、石英、光学プラスチックなどがある。
一般的に150で示す光検出手段は、バイオセンサー120
から放射された蛍光を検出する様に配置されている。放
射された光は、図２および７乃至10に関して以下により
詳細に説明する様に、試料中の選択された分析物の濃度
を反映する。光検出手段150は、光学基材122を通る光線
102の伝播方向に対して本質的に直角の方向から放射さ
れた蛍光を収集する様に配置された集光レンズ152を含
む。
から放射された蛍光を検出する様に配置されている。放
射された光は、図２および７乃至10に関して以下により
詳細に説明する様に、試料中の選択された分析物の濃度
を反映する。光検出手段150は、光学基材122を通る光線
102の伝播方向に対して本質的に直角の方向から放射さ
れた蛍光を収集する様に配置された集光レンズ152を含
む。
集光レンズ152と光学基材122の間隔154は、当業者に
は明らかな様に、消失性光透過の区域から放射される光
を最大限に収集する様に選択される。次いで、集光レン
ズ152により集められた光は、収集された蛍光の水準を
反映する出力信号に応答する検出手段150に送られる。
は明らかな様に、消失性光透過の区域から放射される光
を最大限に収集する様に選択される。次いで、集光レン
ズ152により集められた光は、収集された蛍光の水準を
反映する出力信号に応答する検出手段150に送られる。
検出手段150は、この分野で公知の様に、放射された
蛍光の波長領域にわたる波長領域で光を効果的に検出す
る、どの様な型の光検出器でもよい。しかし、同時多分
析物検定用に好ましい実施態様では、検出手段150は、
消失性光区域240で生じる蛍光信号のそれぞれから直接
画像形成する画像形成型検出器である。図１の装置で
は、検出手段150は、図4Cに示す様な信号を発するCCD
（電荷−結合された装置）検出器である。その様な画像
形成信号収集は、各貯蔵部またはパッチを読むのに個別
の光学素子を必要とする方式よりもはるかに簡単な方法
で、複数の試料を同時に測定することができる。この画
像形成検出方式は、導波管中への蛍光の消失性光透過に
よるのではなく、消失性光区域240（図２）から直接放
射される蛍光を収集することもできる。
蛍光の波長領域にわたる波長領域で光を効果的に検出す
る、どの様な型の光検出器でもよい。しかし、同時多分
析物検定用に好ましい実施態様では、検出手段150は、
消失性光区域240で生じる蛍光信号のそれぞれから直接
画像形成する画像形成型検出器である。図１の装置で
は、検出手段150は、図4Cに示す様な信号を発するCCD
（電荷−結合された装置）検出器である。その様な画像
形成信号収集は、各貯蔵部またはパッチを読むのに個別
の光学素子を必要とする方式よりもはるかに簡単な方法
で、複数の試料を同時に測定することができる。この画
像形成検出方式は、導波管中への蛍光の消失性光透過に
よるのではなく、消失性光区域240（図２）から直接放
射される蛍光を収集することもできる。
あるいは、検出手段150は、光倍率器、半導体フォト
ダイオード、またはその様な検出器の列でよい。CCD以
外の実施態様では、列がある種の目的のために単一の検
出器に対して一般的に好ましい。小型検出器の列を使用
することにより、使用者は、ピーク蛍光を検出してお
り、収集および検出光学系の不整列のために不注意で見
落としていないことを確認できる。所望により、格子分
光写真機をCCDまたは他の検出手段に接続し、検出光の
スペクトル解析を行なう。その場合、各ピークを囲む信
号関数を積分し、試料から収集された蛍光全体を決定す
る手段も備える。あるいは、試験室における様な構成で
使用するための、検定のすべてのパラメータが標準化さ
れている実施態様では、分光写真機の代わりに、トレー
サー蛍光の領域における波長だけを透過させるフィルタ
ーを使用することもできる。
ダイオード、またはその様な検出器の列でよい。CCD以
外の実施態様では、列がある種の目的のために単一の検
出器に対して一般的に好ましい。小型検出器の列を使用
することにより、使用者は、ピーク蛍光を検出してお
り、収集および検出光学系の不整列のために不注意で見
落としていないことを確認できる。所望により、格子分
光写真機をCCDまたは他の検出手段に接続し、検出光の
スペクトル解析を行なう。その場合、各ピークを囲む信
号関数を積分し、試料から収集された蛍光全体を決定す
る手段も備える。あるいは、試験室における様な構成で
使用するための、検定のすべてのパラメータが標準化さ
れている実施態様では、分光写真機の代わりに、トレー
サー蛍光の領域における波長だけを透過させるフィルタ
ーを使用することもできる。
図14Aおよび14Bは、図１のCCD画像形成検出器の代わ
りに使用できる、画像形成検出方式の別の、現在好まし
い実施態様を示す。この実施態様では、特定のパッチか
ら来る光が対応するフォトダイオード上に集束する様
に、フォトダイオード680の列が検出レンズ手段に対し
て配置されている（図14A）。この実施態様では、検出
レンズ手段は、一対の対向して配置されたレンズ682、6
84を含む。図14A乃至14Bの画像形成検出方式を有する装
置は、CCD検出器を有する装置よりも本質的に安価に製
造できる。パッチ662、664、666は、光学の分野で一般
的に理解されている様に、フォトダイオードの大きさお
よび間隔、レンズの焦点距離および倍率、および導波管
表面又は検出レンズおよびフォトダイオード列との間の
距離に対応する様に適当な間隔を置いて配置されるべき
である。
りに使用できる、画像形成検出方式の別の、現在好まし
い実施態様を示す。この実施態様では、特定のパッチか
ら来る光が対応するフォトダイオード上に集束する様
に、フォトダイオード680の列が検出レンズ手段に対し
て配置されている（図14A）。この実施態様では、検出
レンズ手段は、一対の対向して配置されたレンズ682、6
84を含む。図14A乃至14Bの画像形成検出方式を有する装
置は、CCD検出器を有する装置よりも本質的に安価に製
造できる。パッチ662、664、666は、光学の分野で一般
的に理解されている様に、フォトダイオードの大きさお
よび間隔、レンズの焦点距離および倍率、および導波管
表面又は検出レンズおよびフォトダイオード列との間の
距離に対応する様に適当な間隔を置いて配置されるべき
である。
好ましくは、１個以上のフィルター688を検出レンズ
に近接して、好ましくは図14Bに示す様に、２個の検出
レンズの間に配置する。この配置により、信号光がフォ
トダイオードに当たる前に、散乱励起光および他の漂遊
光を効果的にフィルターにかけることができる。フィル
ターは、帯域型でもロング−パス型でもよく、通過させ
る波長領域は、励起光およびトレーサー分子の蛍光の波
長に依存する。例えば、670nmにピーク蛍光を有するシ
アニン染料CY5の635nmにおけるレーザーダイオード励起
では、約650nmより長い波長を有する光を通すフィルタ
ーが有用である。現在好ましい実施態様では、670nmに
中心があり、線幅40nmの帯域フィルターを使用する。
に近接して、好ましくは図14Bに示す様に、２個の検出
レンズの間に配置する。この配置により、信号光がフォ
トダイオードに当たる前に、散乱励起光および他の漂遊
光を効果的にフィルターにかけることができる。フィル
ターは、帯域型でもロング−パス型でもよく、通過させ
る波長領域は、励起光およびトレーサー分子の蛍光の波
長に依存する。例えば、670nmにピーク蛍光を有するシ
アニン染料CY5の635nmにおけるレーザーダイオード励起
では、約650nmより長い波長を有する光を通すフィルタ
ーが有用である。現在好ましい実施態様では、670nmに
中心があり、線幅40nmの帯域フィルターを使用する。
平らな基材導波管の末端上に光線102の焦点を合わせ
るには、図3C、5A、および11Aに分かり易く示す様に、
一般的な球形レンズの代わりに、半円筒形のレンズを使
用するのが好ましい。この適用の目的には、“半円筒
形”は、直円柱をその円筒の縦軸に平行な平面に沿って
横に切ったもの、および長円形の直円柱を横に切ったも
のの両方を含む。したがって、レンズ形状は非球面と呼
ばれる型に類似していることができる。双曲断面も適当
である場合がある。しかし、レンズの湾曲表面の形状お
よび寸法は、光線の焦点合わせに使用する区域に沿って
縦方向で一様であるべきである。
るには、図3C、5A、および11Aに分かり易く示す様に、
一般的な球形レンズの代わりに、半円筒形のレンズを使
用するのが好ましい。この適用の目的には、“半円筒
形”は、直円柱をその円筒の縦軸に平行な平面に沿って
横に切ったもの、および長円形の直円柱を横に切ったも
のの両方を含む。したがって、レンズ形状は非球面と呼
ばれる型に類似していることができる。双曲断面も適当
である場合がある。しかし、レンズの湾曲表面の形状お
よび寸法は、光線の焦点合わせに使用する区域に沿って
縦方向で一様であるべきである。
図２に分かり易く示す様に、光学基材124は、少なく
とも１個の平らな表面200および幅202により間隔を置い
て配置された第二の表面201を有する平らな導波管とし
て具体化されている。少なくとも表面201は試料溶液203
と接触して配置されている。複数の捕獲分子204は表面2
01上に固定されている。試料溶液は、選択された分析物
の複数の分析物分子210、および複数のトレーサー分子2
20を含む。捕獲分子は、各分析物分子210の上に存在す
る結合部分に結合する様に、選択または構築される。ト
レーサー分子220は、適当な波長の光による刺激に応答
して蛍光を放射する様に選択または構築される。トレー
サー分子220により放射される蛍光の水準は、捕獲分子
に結合した分析物の量の尺度であり、したがって、溶液
中の分析物分子210の濃度を反映している。
とも１個の平らな表面200および幅202により間隔を置い
て配置された第二の表面201を有する平らな導波管とし
て具体化されている。少なくとも表面201は試料溶液203
と接触して配置されている。複数の捕獲分子204は表面2
01上に固定されている。試料溶液は、選択された分析物
の複数の分析物分子210、および複数のトレーサー分子2
20を含む。捕獲分子は、各分析物分子210の上に存在す
る結合部分に結合する様に、選択または構築される。ト
レーサー分子220は、適当な波長の光による刺激に応答
して蛍光を放射する様に選択または構築される。トレー
サー分子220により放射される蛍光の水準は、捕獲分子
に結合した分析物の量の尺度であり、したがって、溶液
中の分析物分子210の濃度を反映している。
導波管124の中を光が伝播し、表面200、201で内部反
射するときに、距離軸232と強度軸234に対してグラフ化
される（実寸ではない）様に、表面200からの距離に応
じて低下する強度曲線230を有する消失性光界が形成さ
れる。励起区域240は、消失性光の強度がトレーサー分
子220の重要なまたは検出可能な画分を励起するのに十
分である溶液の区域である（実寸ではない）。区域240
の外にあるトレーサー分子220は、蛍光の誘発にほとん
ど、またはまったく寄与しない。励起区域240は、一般
的に約1000〜2000Åの間である。
射するときに、距離軸232と強度軸234に対してグラフ化
される（実寸ではない）様に、表面200からの距離に応
じて低下する強度曲線230を有する消失性光界が形成さ
れる。励起区域240は、消失性光の強度がトレーサー分
子220の重要なまたは検出可能な画分を励起するのに十
分である溶液の区域である（実寸ではない）。区域240
の外にあるトレーサー分子220は、蛍光の誘発にほとん
ど、またはまったく寄与しない。励起区域240は、一般
的に約1000〜2000Åの間である。
捕獲分子204は、抗体全体、Fab'断片の様な抗体断
片、抗原分子（ハプテン）または抗原断片、および抗原
性である、および／または３次元構造で抗体を結合する
エピトープに類似したオリゴペプチドでよい。捕獲分子
204は、細胞または機能質メンブラン上に通常見られる
種類の、所望の分析物に特異性を有するレセプター分
子、またはその部分であって、レセプターの分析物を特
異的に結合する特性を有するものでよい。
片、抗原分子（ハプテン）または抗原断片、および抗原
性である、および／または３次元構造で抗体を結合する
エピトープに類似したオリゴペプチドでよい。捕獲分子
204は、細胞または機能質メンブラン上に通常見られる
種類の、所望の分析物に特異性を有するレセプター分
子、またはその部分であって、レセプターの分析物を特
異的に結合する特性を有するものでよい。
図２は、競合検定構成を示す（排除検定ともいう）。
しかし、当業者には明らかな様に、サンドイッチ検定の
様な別の検定構成も本装置で行なうことができる。
しかし、当業者には明らかな様に、サンドイッチ検定の
様な別の検定構成も本装置で行なうことができる。
捕獲分子204は、表面202上に、この分野で公知の、ど
の様な方法によっても固定することができる。しかし、
好ましい実施態様では、捕獲分子は部位特異的に固定さ
れる。本出願で使用する様に、用語“部位特異的”と
は、代表的な先行技術の方法における様な不規則な部位
ではなく、むしろ捕獲分子上の特異的部位が導波管への
結合に関与することを意味している。実施例Ｉ乃至III
は、基材上の耐タンパク質性被覆により光学基材の表面
に縁部分子を部位特異的に固定する方法を詳細に説明す
る。
の様な方法によっても固定することができる。しかし、
好ましい実施態様では、捕獲分子は部位特異的に固定さ
れる。本出願で使用する様に、用語“部位特異的”と
は、代表的な先行技術の方法における様な不規則な部位
ではなく、むしろ捕獲分子上の特異的部位が導波管への
結合に関与することを意味している。実施例Ｉ乃至III
は、基材上の耐タンパク質性被覆により光学基材の表面
に縁部分子を部位特異的に固定する方法を詳細に説明す
る。
先に述べた様に、消失性光の強度は導波管表面からの
距離と共に急速に低下する。したがって、導波管表面か
ら有効な励起範囲240（必ずしも実寸ではない）内にあ
るトレーサー分子だけが、消失性光により励起され、蛍
光を放つ。該範囲240は、一般的に1000〜2000Åであ
る。この範囲は、捕獲分子204に（直接または間接的
に）結合した本質的にすべてのトレーサー分子220を確
実に検出するのに十分であり、一方、溶液中に遊離して
いるトレーサー分子のほとんどは有効な励起範囲の外に
ある。
距離と共に急速に低下する。したがって、導波管表面か
ら有効な励起範囲240（必ずしも実寸ではない）内にあ
るトレーサー分子だけが、消失性光により励起され、蛍
光を放つ。該範囲240は、一般的に1000〜2000Åであ
る。この範囲は、捕獲分子204に（直接または間接的
に）結合した本質的にすべてのトレーサー分子220を確
実に検出するのに十分であり、一方、溶液中に遊離して
いるトレーサー分子のほとんどは有効な励起範囲の外に
ある。
図１の装置の実施態様では、蛍光の測定は分光計によ
り行なう。ローダミン標識を付けた分子が関与する実施
例では、光源100は、放射波長が514nmのアルゴンイオン
レーザー（LEXEL Model 95−２）である。蛍光検出は、
モノクロメーター（SPEX Industries,Inc.,Model 1680
C）および電荷結合装置（略してCCD）（Photometrics L
td.Series 200またはCH−250）で行なった。あるいは、
光源100は、選択した蛍光染料の励起に望ましい波長で
放射する、どの様な光源でもよい。また、検定手順が実
証され、標準化されたら、蛍光スペクトルまたは蛍光の
空間的分布を測定する必要はなかろう。検出手段は、検
定の最小限の必要条件で簡素化することができる。
り行なう。ローダミン標識を付けた分子が関与する実施
例では、光源100は、放射波長が514nmのアルゴンイオン
レーザー（LEXEL Model 95−２）である。蛍光検出は、
モノクロメーター（SPEX Industries,Inc.,Model 1680
C）および電荷結合装置（略してCCD）（Photometrics L
td.Series 200またはCH−250）で行なった。あるいは、
光源100は、選択した蛍光染料の励起に望ましい波長で
放射する、どの様な光源でもよい。また、検定手順が実
証され、標準化されたら、蛍光スペクトルまたは蛍光の
空間的分布を測定する必要はなかろう。検出手段は、検
定の最小限の必要条件で簡素化することができる。
別の実施態様では、光源100は、Toshibaから市販の赤
色波長領域600〜700nmで放射するレーザーダイオード
（model No.TOLD 9211）である。このレーザーダイオー
ドは、ピーク放射波長約670nmで約５ミリワットの出力
を有する。630nmで放射するレーザーダイオードも市販
されており、使用することができる。この領域の波長を
使用する実施態様には、蛍光が赤色スペクトル領域の波
長で励起されるシアニン染料の様な染料を使用する必要
がある。その様な染料の例は、Biological Detection S
ystems,Inc.,Pittsburgh PAから市販のCY5（カタログ番
号A25000）である。CY5染料は、メーカーの指示および
／またはBDSから市販のキットを使用して所望のトレー
サー分子に共役させることができる。同じメーカーから
市販の第二の染料CY7も好適である。染料および共役方
法は、Southwick,P.L.らの“Cyanine Dye Labelling Re
agents−Carboxymethylindo−cyanine Succinimidyl Es
ters"、Cytometry 11:418−430（1990）に記載されてい
る。光源としてレーザーダイオードを使用することによ
り、バイオセンサーおよび導波管をプラスチックで形成
することができ、それによって製造経費が著しく下が
り、半円筒形レンズと導波管および貯蔵部の一体成形が
容易になる。
色波長領域600〜700nmで放射するレーザーダイオード
（model No.TOLD 9211）である。このレーザーダイオー
ドは、ピーク放射波長約670nmで約５ミリワットの出力
を有する。630nmで放射するレーザーダイオードも市販
されており、使用することができる。この領域の波長を
使用する実施態様には、蛍光が赤色スペクトル領域の波
長で励起されるシアニン染料の様な染料を使用する必要
がある。その様な染料の例は、Biological Detection S
ystems,Inc.,Pittsburgh PAから市販のCY5（カタログ番
号A25000）である。CY5染料は、メーカーの指示および
／またはBDSから市販のキットを使用して所望のトレー
サー分子に共役させることができる。同じメーカーから
市販の第二の染料CY7も好適である。染料および共役方
法は、Southwick,P.L.らの“Cyanine Dye Labelling Re
agents−Carboxymethylindo−cyanine Succinimidyl Es
ters"、Cytometry 11:418−430（1990）に記載されてい
る。光源としてレーザーダイオードを使用することによ
り、バイオセンサーおよび導波管をプラスチックで形成
することができ、それによって製造経費が著しく下が
り、半円筒形レンズと導波管および貯蔵部の一体成形が
容易になる。
図２の実施態様では、免疫検定は、捕獲分子204が分
析物分子210の代わりにトレーサー分子220と結合する様
に、トレーサー分子220が構築されている競合検定であ
る。分析物分子210の濃度が高いために、トレーサー分
子220のほとんどは捕獲分子204から周囲の溶液中に排除
され、基材122の励起範囲240の中にあるトレーサー分子
の数が減少する。トレーサー分子の結合が減少するため
に、蛍光の量が減少する。反対に、分析物分子210の濃
度が低い場合は、トレーサー分子220が捕獲分子204に結
合し、励起範囲240内に保持される。
析物分子210の代わりにトレーサー分子220と結合する様
に、トレーサー分子220が構築されている競合検定であ
る。分析物分子210の濃度が高いために、トレーサー分
子220のほとんどは捕獲分子204から周囲の溶液中に排除
され、基材122の励起範囲240の中にあるトレーサー分子
の数が減少する。トレーサー分子の結合が減少するため
に、蛍光の量が減少する。反対に、分析物分子210の濃
度が低い場合は、トレーサー分子220が捕獲分子204に結
合し、励起範囲240内に保持される。
図１の実施態様では、バイオセンサー120は、図3A乃
至3Bにより詳細に示すフロースルーセルとして示す。例
えば顕微鏡のスライドまたはカバーグラスでよい、平ら
な導波管302が、ねじ308A、308Bにより一緒に保持され
ている２枚の板304、306間に挟まれている。導波管302
と板306の間に、ガスケット320が配置されている。ガス
ケット320は２つの内側開口部を有し、それらの開口部
は、ガスケット320を板306と導波管302の間に固定した
ときに、貯蔵部322、324を形成する。貯蔵部322、324の
中では、導波管302が一方の壁を構成し、板306が第二の
壁を構成し、ガスケットの内側縁部322A、324Aが残りの
壁を構成する。貯蔵部322、324はここでは長方形で示し
てあるが、他の形状も使用できる。また、図3Aに示す様
な２つの貯蔵部の代わりに、ガスケットはただ１つの、
または２つ以上の開口部を有し、対応する数の個別貯蔵
部を形成することもできる。
至3Bにより詳細に示すフロースルーセルとして示す。例
えば顕微鏡のスライドまたはカバーグラスでよい、平ら
な導波管302が、ねじ308A、308Bにより一緒に保持され
ている２枚の板304、306間に挟まれている。導波管302
と板306の間に、ガスケット320が配置されている。ガス
ケット320は２つの内側開口部を有し、それらの開口部
は、ガスケット320を板306と導波管302の間に固定した
ときに、貯蔵部322、324を形成する。貯蔵部322、324の
中では、導波管302が一方の壁を構成し、板306が第二の
壁を構成し、ガスケットの内側縁部322A、324Aが残りの
壁を構成する。貯蔵部322、324はここでは長方形で示し
てあるが、他の形状も使用できる。また、図3Aに示す様
な２つの貯蔵部の代わりに、ガスケットはただ１つの、
または２つ以上の開口部を有し、対応する数の個別貯蔵
部を形成することもできる。
ガスケット320は、励起光の波長領域で導波管材料の
屈折率よりも小さな屈折率を有する半剛性材料からなる
のが好ましい。最良の結果を得るには、ガスケット材料
の屈折率は、導波管の屈折率と比較して、できるだけ低
くすべきであると考えられる。石英またはガラス製の導
波管では、屈折率は一般的に約1.46〜1.52であり、高鉛
ガラスに関しては、より高い。屈折率が1.35〜1.43の透
明な（着色していない）シリコンゴム（シロキサン重合
体）が現時点でガスケット320に好ましい材料である。P
TFE（ポリテトラフルオロエチレン）またはFEP（フッ素
化エチレンプロピレン）の様なTEFLON型の材料は、屈折
率が約1.34〜1.35であり、やはり適当である。しかし、
TEFLON表面は非特異的にタンパク質を吸収する蛍光があ
るので、シリコンゴムが一般的に好ましい。
屈折率よりも小さな屈折率を有する半剛性材料からなる
のが好ましい。最良の結果を得るには、ガスケット材料
の屈折率は、導波管の屈折率と比較して、できるだけ低
くすべきであると考えられる。石英またはガラス製の導
波管では、屈折率は一般的に約1.46〜1.52であり、高鉛
ガラスに関しては、より高い。屈折率が1.35〜1.43の透
明な（着色していない）シリコンゴム（シロキサン重合
体）が現時点でガスケット320に好ましい材料である。P
TFE（ポリテトラフルオロエチレン）またはFEP（フッ素
化エチレンプロピレン）の様なTEFLON型の材料は、屈折
率が約1.34〜1.35であり、やはり適当である。しかし、
TEFLON表面は非特異的にタンパク質を吸収する蛍光があ
るので、シリコンゴムが一般的に好ましい。
図3Bの下側板306は、一対の入口330、332および一対
の出口340、342を有する。これらの入口および出口は、
溶液がそれぞれの貯蔵部322、324を個別に流れる様に配
置されている。下側板306はアルミニウム合金から作ら
れるのが好ましい。
の出口340、342を有する。これらの入口および出口は、
溶液がそれぞれの貯蔵部322、324を個別に流れる様に配
置されている。下側板306はアルミニウム合金から作ら
れるのが好ましい。
図3Cは、導波管302を、バイオセンサーの残りの部分
から分離して示す。レンズ126は、光線102を受け取り、
導波管上に集束する。好ましくは、外周縁部350は、レ
ンズ126からの集束光が導波管に入る、被覆していない
区域352を除いて、反射性の材料で被覆してある（図3
C）。
から分離して示す。レンズ126は、光線102を受け取り、
導波管上に集束する。好ましくは、外周縁部350は、レ
ンズ126からの集束光が導波管に入る、被覆していない
区域352を除いて、反射性の材料で被覆してある（図3
C）。
矢印354は被覆縁部からの反射を示す。図3Cで、１個
のレンズおよび１つの被覆していない区域だけを示して
いるが、２チャネル以上では、光が導波管中に進入でき
る様に、より多くの縁部350を被覆せずにおくこともで
きる（例えば図4A参照）。
のレンズおよび１つの被覆していない区域だけを示して
いるが、２チャネル以上では、光が導波管中に進入でき
る様に、より多くの縁部350を被覆せずにおくこともで
きる（例えば図4A参照）。
反射被覆は、それがなければ縁部350を通って逃げて
しまうであろう光を導波管の中に反射して戻す。それに
よって消失性光波の強度が増加する。好適な反射被覆材
料としては、この分野で公知の様に、アルミニウム、銀
等がある。あるいは、被覆の代わりに、反射体を縁部の
周りに配置し、逃げようとする光を導波管中に反射して
戻すこともできる。
しまうであろう光を導波管の中に反射して戻す。それに
よって消失性光波の強度が増加する。好適な反射被覆材
料としては、この分野で公知の様に、アルミニウム、銀
等がある。あるいは、被覆の代わりに、反射体を縁部の
周りに配置し、逃げようとする光を導波管中に反射して
戻すこともできる。
例えば試験試料の蛍光を、同じ導波管上の比較区域か
ら来る蛍光と同時に測定したい場合、少なくとも２個の
個別の貯蔵部を有する設計が、貯蔵部が１個しかない実
施態様よりも著しく有利である。例えば、導波管への非
特異的結合の水準を、試験試料蛍光から差し引くことが
できる。また、励起光の強度変動による測定変化を補正
することもできる。排除検定では、“比較”区域は、試
料中に分析物が存在しない、または既知量の分析物が存
在する、予め装填した導波管でよい。３個以上の貯蔵部
がある場合、“未知の”、つまり試験試料に加えて、分
析物を含まない比較、および少なくとも１個の既知の校
正用分析物試料の両方に関して蛍光を測定することがで
きる。
ら来る蛍光と同時に測定したい場合、少なくとも２個の
個別の貯蔵部を有する設計が、貯蔵部が１個しかない実
施態様よりも著しく有利である。例えば、導波管への非
特異的結合の水準を、試験試料蛍光から差し引くことが
できる。また、励起光の強度変動による測定変化を補正
することもできる。排除検定では、“比較”区域は、試
料中に分析物が存在しない、または既知量の分析物が存
在する、予め装填した導波管でよい。３個以上の貯蔵部
がある場合、“未知の”、つまり試験試料に加えて、分
析物を含まない比較、および少なくとも１個の既知の校
正用分析物試料の両方に関して蛍光を測定することがで
きる。
図4Aは、導波管励起標準に使用できそうな、図3A乃至
3Bのフロースルーセルを示す。ここでは、光線を２つの
等しい成分400、402に分割し、それぞれの集光レンズ40
4、406を通過させ、導波管302中で“チャネル1"（CH.
1）および“チャネル2"（CH.2）を照明する。実線の矢
印410はCH.1中で蛍光が収集される方向を示し、破線の
矢印412はCH.2中で蛍光が収集される方向を示す。
3Bのフロースルーセルを示す。ここでは、光線を２つの
等しい成分400、402に分割し、それぞれの集光レンズ40
4、406を通過させ、導波管302中で“チャネル1"（CH.
1）および“チャネル2"（CH.2）を照明する。実線の矢
印410はCH.1中で蛍光が収集される方向を示し、破線の
矢印412はCH.2中で蛍光が収集される方向を示す。
集光レンズ404、406が導波管および光源に適切に整列
している場合、光線成分400、402が整列している方向で
導波管に伸びる２つの照明された帯430、432（図4B）が
見える。四角440は、CCD列の検出区域の大体の輪郭を表
し、四角442は分光写真器の入口スリットの大体の輪郭
を示す。先に説明した様に、検出方式の一実施態様は、
CCD列と組合せた分光写真器を含む。図4Cは、CH.1中の
“ブランク”つまり分析物を含まない試料およびCH.2中
の供試つまり“未知”の試料を同時に測定するための、
その様な検出方式から予想される結果を示す。曲線45
0、452はそれぞれCH.1およびCH.2からの蛍光を示す。ブ
ランクおよび試料の蛍光強度は、それぞれの区域460、4
62にわたる曲線450、452の対応する積分値により比較さ
れる。この分野で公知の様に、一般的に、分析物濃度が
既知である一連の校正試料に対して校正曲線を作成し、
未知試料の濃度測定に使用する。
している場合、光線成分400、402が整列している方向で
導波管に伸びる２つの照明された帯430、432（図4B）が
見える。四角440は、CCD列の検出区域の大体の輪郭を表
し、四角442は分光写真器の入口スリットの大体の輪郭
を示す。先に説明した様に、検出方式の一実施態様は、
CCD列と組合せた分光写真器を含む。図4Cは、CH.1中の
“ブランク”つまり分析物を含まない試料およびCH.2中
の供試つまり“未知”の試料を同時に測定するための、
その様な検出方式から予想される結果を示す。曲線45
0、452はそれぞれCH.1およびCH.2からの蛍光を示す。ブ
ランクおよび試料の蛍光強度は、それぞれの区域460、4
62にわたる曲線450、452の対応する積分値により比較さ
れる。この分野で公知の様に、一般的に、分析物濃度が
既知である一連の校正試料に対して校正曲線を作成し、
未知試料の濃度測定に使用する。
さらに図4Aで重要なのは、導波管302に対するレンズ4
04、406の向きである。湾曲した縁部404A、406Aが導波
管302の方を向いているのが分かるが、これは図3Cに示
す向きから180゜である。集光レンズはどちら向きでも
よいが、フロースルーセルを備えた導波管の照明には、
図4Aの配置が現時点では好ましい。
04、406の向きである。湾曲した縁部404A、406Aが導波
管302の方を向いているのが分かるが、これは図3Cに示
す向きから180゜である。集光レンズはどちら向きでも
よいが、フロースルーセルを備えた導波管の照明には、
図4Aの配置が現時点では好ましい。
図5A乃至5Dは、図１の装置に有用なバイオセンサーの
別の実施態様を示す。一般的に500で示すバイオセンサ
ーは、一体的に取り付けた、または成形した集光レンズ
502および導波管504を含み、レンズ502が光を導波管の
前端部506上に焦点を合わせる様に配置されている。集
光レンズ502は、光線を導波管504の受光末端506に集束
する様に形成され、配置されている（図5A、5C）。側壁
511、512、上および底壁516、517、および取り外しでき
る様に密封している後壁518が、導波管504の周囲の空間
を取り囲み、貯蔵部520、522を形成する。
別の実施態様を示す。一般的に500で示すバイオセンサ
ーは、一体的に取り付けた、または成形した集光レンズ
502および導波管504を含み、レンズ502が光を導波管の
前端部506上に焦点を合わせる様に配置されている。集
光レンズ502は、光線を導波管504の受光末端506に集束
する様に形成され、配置されている（図5A、5C）。側壁
511、512、上および底壁516、517、および取り外しでき
る様に密封している後壁518が、導波管504の周囲の空間
を取り囲み、貯蔵部520、522を形成する。
一体化された集光レンズ502が、図１の装置における
集光レンズ126の代わりである。図5A乃至5Dの実施態様
では、集光レンズは、導波管ホルダー500の一部として
ポリスチレン、ポリカーボネート等の光学プラスチック
で成形されている。
集光レンズ126の代わりである。図5A乃至5Dの実施態様
では、集光レンズは、導波管ホルダー500の一部として
ポリスチレン、ポリカーボネート等の光学プラスチック
で成形されている。
バイオセンサー500は、図5B、5Cおよび5Dに最も分か
り易く示す貯蔵部520、522を含み、その中に試料溶液を
入れることができる。所望により、スロット504に沿っ
て、導波管表面の分離区域を限定する縦方向リブ530
（図5D）を設けるのが望ましい場合がある。
り易く示す貯蔵部520、522を含み、その中に試料溶液を
入れることができる。所望により、スロット504に沿っ
て、導波管表面の分離区域を限定する縦方向リブ530
（図5D）を設けるのが望ましい場合がある。
図６は、導波管504上に一連の分離された貯蔵部600、
602、604、606が形成されている以外は、図5A乃至5Cの
バイオセンサーと類似の多貯蔵部バイオセンサーを示
す。図６の実施態様は、貯蔵部600、602、604、606を覆
わなくてもよい様に、水平位置で使用する。
602、604、606が形成されている以外は、図5A乃至5Cの
バイオセンサーと類似の多貯蔵部バイオセンサーを示
す。図６の実施態様は、貯蔵部600、602、604、606を覆
わなくてもよい様に、水平位置で使用する。
レンズを含むバイオセンサーは、好適な光学プラスチ
ックで成形することができる。必要に応じて貯蔵部壁、
レンズ、およびフレーム部品を含むホルダーを予備成形
することができる。続いて、シリカ表面導波管を、屈折
率が適合した接着剤と共に挿入し、所定の位置に固定
し、必要であれば密封し、分離したチャネルを形成す
る。あるいは、ホルダーは、シリカ表面導波管を所定の
位置にして成形し、それによって接着剤の必要性をなく
すこともできる。
ックで成形することができる。必要に応じて貯蔵部壁、
レンズ、およびフレーム部品を含むホルダーを予備成形
することができる。続いて、シリカ表面導波管を、屈折
率が適合した接着剤と共に挿入し、所定の位置に固定
し、必要であれば密封し、分離したチャネルを形成す
る。あるいは、ホルダーは、シリカ表面導波管を所定の
位置にして成形し、それによって接着剤の必要性をなく
すこともできる。
現時点で好ましい別の実施態様では、導波管も光学プ
ラスチックで形成し、レンズおよび／または貯蔵部と同
時に成形する。後者の型の構造は488〜515nmの励起波長
で使用するには適していない。というのは、公知の光学
プラスチックは、この（青および緑）波長領域で励起し
た場合に蛍光を発する傾向があるためである。この蛍光
は背景蛍光として現れる。しかし、600nm以上の波長で
放射する光源を使用する装置の実施態様では、プラスチ
ック製の導波管を使用することができる。プラスチック
の単一装置としてレンズ／導波管、またはレンズ／導波
管／貯蔵部を成形することにより、製造原価が著しく低
減し、使い捨てバイオセンサーがより有用なものにな
る。
ラスチックで形成し、レンズおよび／または貯蔵部と同
時に成形する。後者の型の構造は488〜515nmの励起波長
で使用するには適していない。というのは、公知の光学
プラスチックは、この（青および緑）波長領域で励起し
た場合に蛍光を発する傾向があるためである。この蛍光
は背景蛍光として現れる。しかし、600nm以上の波長で
放射する光源を使用する装置の実施態様では、プラスチ
ック製の導波管を使用することができる。プラスチック
の単一装置としてレンズ／導波管、またはレンズ／導波
管／貯蔵部を成形することにより、製造原価が著しく低
減し、使い捨てバイオセンサーがより有用なものにな
る。
図11A乃至11Cは、図3A乃至3Cに示すバイオセンサーと
類似の、別の実施態様のバイオセンサーを示す。図11A
で、導波管10は、固体の無色プラスチックレンズ14中に
鋸で切った溝12（図11B）の中に挿入したカバーグラス
である。透明壁16、18、20、22は、屈折率が適合した接
着剤により、レンズ14および導波管10の縁部の周りに密
封して取りつけられ、一対の分離貯蔵部30、32を形成し
ている（図11B）。
類似の、別の実施態様のバイオセンサーを示す。図11A
で、導波管10は、固体の無色プラスチックレンズ14中に
鋸で切った溝12（図11B）の中に挿入したカバーグラス
である。透明壁16、18、20、22は、屈折率が適合した接
着剤により、レンズ14および導波管10の縁部の周りに密
封して取りつけられ、一対の分離貯蔵部30、32を形成し
ている（図11B）。
図11A乃至11Cの実施態様では、レンズ14の湾曲した前
端部34が、導波管10の前端部から距離40をおいて配置さ
れている。距離40は、レンズ14の焦点距離に適合する様
に選択される。可視光線に対して不透明な材料からなる
マスク42がレンズ14の後端部44を覆っている。図11A乃
至11Cの実施態様は、図5Cに示す様な垂直配置に使用で
きる。あるいは、バイオセンサーを導波管10と共に本質
的に水平な位置に向け、導波管10の片側だけを使用する
こともできる。その様な場合、貯蔵部の開いた末端を密
封できるキャップを備えなければならない。水平に向け
る構成の利点は、薄い層50の試料溶液だけを必要とする
ことである（図11C）。しかし、図5Dにおけるリブ530の
様なリブを導波管10に沿って設けない限り、水平方向に
おける図11Cのバイオセンサーには、ただ１個の有効試
料チャネルを有する。
端部34が、導波管10の前端部から距離40をおいて配置さ
れている。距離40は、レンズ14の焦点距離に適合する様
に選択される。可視光線に対して不透明な材料からなる
マスク42がレンズ14の後端部44を覆っている。図11A乃
至11Cの実施態様は、図5Cに示す様な垂直配置に使用で
きる。あるいは、バイオセンサーを導波管10と共に本質
的に水平な位置に向け、導波管10の片側だけを使用する
こともできる。その様な場合、貯蔵部の開いた末端を密
封できるキャップを備えなければならない。水平に向け
る構成の利点は、薄い層50の試料溶液だけを必要とする
ことである（図11C）。しかし、図5Dにおけるリブ530の
様なリブを導波管10に沿って設けない限り、水平方向に
おける図11Cのバイオセンサーには、ただ１個の有効試
料チャネルを有する。
レンズ14の湾曲した端部34は本質的に半直円柱形状で
示してあるが、前に図3Aおよび5Cに関して説明した様
に、他のレンズ形状も可能である。
示してあるが、前に図3Aおよび5Cに関して説明した様
に、他のレンズ形状も可能である。
図12Aおよび12Bに示す、バイオセンサーの別の非常に
好ましい実施態様では、平らな導波管の、受光端部から
離れた端部が、鋸歯状または歯の様な部分650を有す
る。角度652A、652Bは、導波管−空気の界面における全
内部反射に対する臨界角度より小さくなければならない
（ポリスチレン／空気に対する臨界角度は約51゜であ
る）。好ましくは、光が導波管の縦軸に沿って直接逆反
射して戻る様に、角度652A、652Bの合計が90゜になるべ
きであり、さらに好ましくは、652A＝652B＝45゜であ
る。この形状の利点は、端部の反射被覆なしに内部反射
の水準が増加し、製造の複雑さおよび原価が低減するこ
とである。TIRの増加により、消失性光界強度が高くな
り、したがって検定の感度が改良される。また、鋸歯状
の端部により、導波管内の強度が均一になる（導波管全
体を通してより一様になる）。バイオセンサーの導波管
部全体は、鋸歯状端部および一体化レンズを含めて、光
学品質の表面を有するべきである。
好ましい実施態様では、平らな導波管の、受光端部から
離れた端部が、鋸歯状または歯の様な部分650を有す
る。角度652A、652Bは、導波管−空気の界面における全
内部反射に対する臨界角度より小さくなければならない
（ポリスチレン／空気に対する臨界角度は約51゜であ
る）。好ましくは、光が導波管の縦軸に沿って直接逆反
射して戻る様に、角度652A、652Bの合計が90゜になるべ
きであり、さらに好ましくは、652A＝652B＝45゜であ
る。この形状の利点は、端部の反射被覆なしに内部反射
の水準が増加し、製造の複雑さおよび原価が低減するこ
とである。TIRの増加により、消失性光界強度が高くな
り、したがって検定の感度が改良される。また、鋸歯状
の端部により、導波管内の強度が均一になる（導波管全
体を通してより一様になる）。バイオセンサーの導波管
部全体は、鋸歯状端部および一体化レンズを含めて、光
学品質の表面を有するべきである。
実施態様では、導波管は厚さが約0.05センチメートル
（cm）であり、貯蔵部の深さが約0.08〜0.1cmである。
導波管を含むバイオセンサーは幅が約2.5cm、長さが約
4.3cmである。
（cm）であり、貯蔵部の深さが約0.08〜0.1cmである。
導波管を含むバイオセンサーは幅が約2.5cm、長さが約
4.3cmである。
図12Aおよび12Bの実施態様は、それぞれ導波管の受光
末端124から長さ方向に伸びる複数の平行な貯蔵部660も
有する。ここで、各貯蔵部は、それぞれ異なった固定Fa
b'種を含む複数のパッチ662、664、666を含む。その様
な異なった種間の、導波管中を伝播する光の方向に伸び
る分離壁を取り除くことにより、検定の感度がさらに増
加する。１）壁を通過する導波管の光損失が避けられ、
２）消失性光透過区域の外にある未結合トレーサーの分
子を励起し、好ましくない背景蛍光を増加することがあ
る励起光の散乱が避けられるので、感度は増加する。
末端124から長さ方向に伸びる複数の平行な貯蔵部660も
有する。ここで、各貯蔵部は、それぞれ異なった固定Fa
b'種を含む複数のパッチ662、664、666を含む。その様
な異なった種間の、導波管中を伝播する光の方向に伸び
る分離壁を取り除くことにより、検定の感度がさらに増
加する。１）壁を通過する導波管の光損失が避けられ、
２）消失性光透過区域の外にある未結合トレーサーの分
子を励起し、好ましくない背景蛍光を増加することがあ
る励起光の散乱が避けられるので、感度は増加する。
別の改良では、シート状の励起光線が、導波管の平面
に対してある角度で導波管の受光端部に入る様にする。
図13は、その様な角度のついた入射光を受け入れる様に
形成された、角度のつけられた一体化レンズ670を示
す。この目的には、レーザーから発する光線は、この分
野で公知の様な円筒形および／または球形のレンズを使
用し、導波管の受光区域の幅に近い幅を有し、比較的小
さな厚さ（好ましくは導波管の厚さの10倍以下、好まし
くは１〜４倍）を有するシート状にすべきである。光線
の入射にその様な角度をつける効果は、導波管に入る光
の比率を増加し、その入る光はマルチモード導波管で伝
播されたより高いオーダーのモードを励起し、それによ
って消失性光界の強度を増加することである。平均光線
入射角度は、導波管／溶液界面の臨界角度未満である
が、臨界角度の近くなる様に選択するのが望ましい。光
線入射角度がこの臨界角度に近い程、消失性光強度の増
加が大きくなる。しかし、光線入射角度が臨界角度に近
過ぎると、入射する光の一部が導波管／溶液界面で逃
げ、導波管の効率および消失性光強度が低下する。その
ため、実験的に求められる最適角度がある。一般的に、
臨界角度より数度小さい（約５〜約15度小さい）光線入
射角度が有用である。
に対してある角度で導波管の受光端部に入る様にする。
図13は、その様な角度のついた入射光を受け入れる様に
形成された、角度のつけられた一体化レンズ670を示
す。この目的には、レーザーから発する光線は、この分
野で公知の様な円筒形および／または球形のレンズを使
用し、導波管の受光区域の幅に近い幅を有し、比較的小
さな厚さ（好ましくは導波管の厚さの10倍以下、好まし
くは１〜４倍）を有するシート状にすべきである。光線
の入射にその様な角度をつける効果は、導波管に入る光
の比率を増加し、その入る光はマルチモード導波管で伝
播されたより高いオーダーのモードを励起し、それによ
って消失性光界の強度を増加することである。平均光線
入射角度は、導波管／溶液界面の臨界角度未満である
が、臨界角度の近くなる様に選択するのが望ましい。光
線入射角度がこの臨界角度に近い程、消失性光強度の増
加が大きくなる。しかし、光線入射角度が臨界角度に近
過ぎると、入射する光の一部が導波管／溶液界面で逃
げ、導波管の効率および消失性光強度が低下する。その
ため、実験的に求められる最適角度がある。一般的に、
臨界角度より数度小さい（約５〜約15度小さい）光線入
射角度が有用である。
ポリスチレン製導波管では、臨界角度は約33゜であ
り、現時点で好ましい光線入射角度は25゜であり、これ
らの値で、消失性光の強度は、０゜光線入射角度を使用
する場合より、少なくとも約２のファクターの増加が達
成される。
り、現時点で好ましい光線入射角度は25゜であり、これ
らの値で、消失性光の強度は、０゜光線入射角度を使用
する場合より、少なくとも約２のファクターの増加が達
成される。
角度のついた光線入射を使用するには、当業者には明
らかな様に、導波管の受光端部に対して半円筒形レンズ
の曲率半径の中心の向きを調節する必要がある。成形さ
れた一体化バイオセンサーでは、一体化レンズ／導波管
は図13の様に形成することができる。
らかな様に、導波管の受光端部に対して半円筒形レンズ
の曲率半径の中心の向きを調節する必要がある。成形さ
れた一体化バイオセンサーでは、一体化レンズ／導波管
は図13の様に形成することができる。
下記の実施例は、捕獲分子を導波管表面に、部位特異
的に付着されるための幾つかの方法を詳細に説明する。
非特異的結合の水準を下げるための一般的な方法では、
導波管を耐タンパク質性の物質で被覆し、次いでその被
覆に抗体を固定する。この方法はさらに、捕獲分子が被
覆に部位特異的に付着するために、抗体または他の捕獲
分子を部位特異的に変性して固定すると共に、耐タンパ
ク質性被覆の誘導体化も含む。
的に付着されるための幾つかの方法を詳細に説明する。
非特異的結合の水準を下げるための一般的な方法では、
導波管を耐タンパク質性の物質で被覆し、次いでその被
覆に抗体を固定する。この方法はさらに、捕獲分子が被
覆に部位特異的に付着するために、抗体または他の捕獲
分子を部位特異的に変性して固定すると共に、耐タンパ
ク質性被覆の誘導体化も含む。
記載する実施例の中で、実施例ＩおよびIIが一般的に
より優れた結果を与えた。現在、アビジン−ビオチン結
合法（実施例II）が最も好ましい。どちらかの結合方式
を使用することにより、固定化したFab'断片の少なくと
も約75％が活性であり、非特異的結合の水準は一般的に
特異的結合の１〜２％以下であった。変性PEG被覆は、
５％〜約25％の、やや高い水準の非特異的結合を与え
た。
より優れた結果を与えた。現在、アビジン−ビオチン結
合法（実施例II）が最も好ましい。どちらかの結合方式
を使用することにより、固定化したFab'断片の少なくと
も約75％が活性であり、非特異的結合の水準は一般的に
特異的結合の１〜２％以下であった。変性PEG被覆は、
５％〜約25％の、やや高い水準の非特異的結合を与え
た。
実施例 Ｉ
導波管表面−ヒドロゲルの製造
ポリメタクリロイルヒドラジド（略してPMahy）を含
むヒドロゲル被覆を有するシリカ表面を製造した。ESC
O,Inc.から市販の、COグレードで厚さ約1mmの融溶石英
スライドが導波管（光学基材）として好適であった。
むヒドロゲル被覆を有するシリカ表面を製造した。ESC
O,Inc.から市販の、COグレードで厚さ約1mmの融溶石英
スライドが導波管（光学基材）として好適であった。
PMahyを該シリカにグラフト化するために、その表面
をアルデヒド基で誘導体化した。この誘導体化は、３−
アミノプロピルトリエトキシシラン（略してAPS）でシ
ラン化してアミノ官能基を加え、続いてグルタルアルデ
ヒドと反応させて遊離のアルデヒド基を形成することに
より行なった。次いでPMahyをこれらのアルデヒド基と
反応させ、ヒドロゲル被覆を形成した。
をアルデヒド基で誘導体化した。この誘導体化は、３−
アミノプロピルトリエトキシシラン（略してAPS）でシ
ラン化してアミノ官能基を加え、続いてグルタルアルデ
ヒドと反応させて遊離のアルデヒド基を形成することに
より行なった。次いでPMahyをこれらのアルデヒド基と
反応させ、ヒドロゲル被覆を形成した。
抗体はこのヒドロゲルに少なくとも２つの方法で結合
させることができた。一つの方法では、メタ過ヨウ素酸
ナトリウムで処理することにより、Fe抗体領域における
炭水化物基をアルデヒドに酸化する。しかし、この目的
に有用な炭水化物部分を含む抗原結合断片はほとんどな
い。そこで、好ましい方法では、スクシンイミジル４−
（Ｎ−マレイミド−メチル）シクロ−ヘキサン−１−カ
ルボキシレート（略してSMCC;Pierce Chemicals）で処
理することにより、ヒドロゲルの懸垂ヒドラジド基をマ
レイミド基に変性する。これらのマレイミド基は、Fab'
断片のＣ−末端領域に一般的に見られる遊離のチオール
基と反応させ、それによってFab'断片をヒドロゲルに結
合させることができる。
させることができた。一つの方法では、メタ過ヨウ素酸
ナトリウムで処理することにより、Fe抗体領域における
炭水化物基をアルデヒドに酸化する。しかし、この目的
に有用な炭水化物部分を含む抗原結合断片はほとんどな
い。そこで、好ましい方法では、スクシンイミジル４−
（Ｎ−マレイミド−メチル）シクロ−ヘキサン−１−カ
ルボキシレート（略してSMCC;Pierce Chemicals）で処
理することにより、ヒドロゲルの懸垂ヒドラジド基をマ
レイミド基に変性する。これらのマレイミド基は、Fab'
断片のＣ−末端領域に一般的に見られる遊離のチオール
基と反応させ、それによってFab'断片をヒドロゲルに結
合させることができる。
ポリ塩化メタクリロイル（略してPMaCl）は、Jantas
ら、J.Polym.Sci.,Part A:Polym.Chem.27:475−485（19
89）に記載されている様に、不活性雰囲気中で、ジオキ
サン中で塩化メタクリロイル（略してMaCl）をラジカル
重合させることにより製造した。
ら、J.Polym.Sci.,Part A:Polym.Chem.27:475−485（19
89）に記載されている様に、不活性雰囲気中で、ジオキ
サン中で塩化メタクリロイル（略してMaCl）をラジカル
重合させることにより製造した。
21.1モル％のMaCl、78.1モル％のジオキサン、および
0.8モル％のAIBN（アゾビスイソブチロ−ニトリル）を
含む反応混合物を撹拌しながら60℃で24時間反応させ
た。そうして製造されたPMaClは、反応の間中、溶液中
に残っていた。次いで混合物を、反応に使用したジオキ
サンの２倍量で希釈し、過剰のヒドラジン水化物に徐々
に加え、希釈されたPMaClに対して2:5の体積比を達成し
た。後者の添加は、窒素雰囲気中、氷浴中で約30分間行
なった。次いで、得られた混合物を室温で約１時間撹拌
した。生成物PMahyは、ジオキサンおよび残留する未反
応ヒドラジン水化物を蒸発させ、続いて蒸留水で洗浄す
ることにより精製した。次いで、洗浄した生成物を、分
子量カット−オフ3,500ダルトンを有するSpectraPor透
析膜中で透析し、未反応モノマーを除去した。
0.8モル％のAIBN（アゾビスイソブチロ−ニトリル）を
含む反応混合物を撹拌しながら60℃で24時間反応させ
た。そうして製造されたPMaClは、反応の間中、溶液中
に残っていた。次いで混合物を、反応に使用したジオキ
サンの２倍量で希釈し、過剰のヒドラジン水化物に徐々
に加え、希釈されたPMaClに対して2:5の体積比を達成し
た。後者の添加は、窒素雰囲気中、氷浴中で約30分間行
なった。次いで、得られた混合物を室温で約１時間撹拌
した。生成物PMahyは、ジオキサンおよび残留する未反
応ヒドラジン水化物を蒸発させ、続いて蒸留水で洗浄す
ることにより精製した。次いで、洗浄した生成物を、分
子量カット−オフ3,500ダルトンを有するSpectraPor透
析膜中で透析し、未反応モノマーを除去した。
その様にして製造した重合体は、ゲル透過クロマトグ
ラフィーにより測定した分子量が塩酸塩形態で約26,000
であった。溶液中の重合体濃度は塩酸塩形態で約５％〜
８％（w/v）であると評価された。この重合体は、窒素
雰囲気下の水溶液中、４℃で、有害な量の自然架橋を起
こさずに、少なくとも５箇月貯蔵できることが分かっ
た。
ラフィーにより測定した分子量が塩酸塩形態で約26,000
であった。溶液中の重合体濃度は塩酸塩形態で約５％〜
８％（w/v）であると評価された。この重合体は、窒素
雰囲気下の水溶液中、４℃で、有害な量の自然架橋を起
こさずに、少なくとも５箇月貯蔵できることが分かっ
た。
シリカチップまたはガラスまたは石英の顕微鏡スライ
ドグラスをクロム酸で洗浄し、次いで５％APS/95％脱イ
オン水（v/v）で、室温で約15分間処理した。このAPS処
理した表面を脱イオン水および無水エタノールですす
ぎ、窒素で少なくとも３回掃気した真空オーブン中、12
0℃で１時間保持した。得られたシラン化された表面
を、0.1M炭酸塩−重炭酸塩緩衝液中2.5％グルタルアル
デヒド（PolysciencesからのE.M.グレード）、pH9.2に
室温で２時間浸漬した。
ドグラスをクロム酸で洗浄し、次いで５％APS/95％脱イ
オン水（v/v）で、室温で約15分間処理した。このAPS処
理した表面を脱イオン水および無水エタノールですす
ぎ、窒素で少なくとも３回掃気した真空オーブン中、12
0℃で１時間保持した。得られたシラン化された表面
を、0.1M炭酸塩−重炭酸塩緩衝液中2.5％グルタルアル
デヒド（PolysciencesからのE.M.グレード）、pH9.2に
室温で２時間浸漬した。
次に、線状PMahyを、処理したチップ上のアルデヒド
基と反応させ、その鎖中に多くの未反応ヒドラジド基を
含む架橋した重合体皮膜を形成した。これは、処理した
チップを約５％〜８％（w/v）のPMahy溶液、pH5.2に室
温〜約60℃の温度で、厚さ約100Å以下の重合体皮膜を
形成するのに十分な時間浸漬することにより行なった。
ヒドロゲル層の厚さは、溶液中に保持する時間および温
度と共に増加した。厚さ100Å以下のフィルムの製造に
最適な条件は、５％（w/v）PMahy中に室温（約25℃）で
２時間保持することであることが分かった。
基と反応させ、その鎖中に多くの未反応ヒドラジド基を
含む架橋した重合体皮膜を形成した。これは、処理した
チップを約５％〜８％（w/v）のPMahy溶液、pH5.2に室
温〜約60℃の温度で、厚さ約100Å以下の重合体皮膜を
形成するのに十分な時間浸漬することにより行なった。
ヒドロゲル層の厚さは、溶液中に保持する時間および温
度と共に増加した。厚さ100Å以下のフィルムの製造に
最適な条件は、５％（w/v）PMahy中に室温（約25℃）で
２時間保持することであることが分かった。
次に、重合体皮膜の遊離ヒドラジドをSMCCで処理する
ことにより変性させ、重合体側鎖の末端上に反応性のマ
レイミド基を与えた。これは、PMahy被覆した基材を、
ジメチルホルムアミド中0.19％（w/v）SMCCの溶液中に2
5℃で約１時間浸漬することにより行なった。
ことにより変性させ、重合体側鎖の末端上に反応性のマ
レイミド基を与えた。これは、PMahy被覆した基材を、
ジメチルホルムアミド中0.19％（w/v）SMCCの溶液中に2
5℃で約１時間浸漬することにより行なった。
SMCCで誘導体化した後、ヒドロゲル被覆した表面を、
5mMEDTAを含むリン酸塩緩衝液、pH6.0中のFab'断片の1m
g/ml溶液で処理した。この様にして製造された導波管表
面は、Fab'分子を表面密度約1.4×10-12モル/cm2で固定
することが分かった。また、この表面は、Fab'断片をそ
れらのＣ−末端チオール基で部位特異的に固定すること
ができた。得られた重合体皮膜の厚さは、エリプソメト
リー（ellipsometry）により、所望される様に約100Å
であると測定された。この皮膜の厚さは、0.35〜25μｍ
（ミクロン）の厚さを有する典型的な先行技術の重合体
皮膜よりはるかに小さい。上記のPMahy重合体の製造方
法は、Kernらにより開示された、ポリメタクリロイル酸
エステルを使用する方法よりも優れている。ヒドラジン
水化物との反応に適したその様なエステルは、分子量が
80,000ダルトン以上であることが多く、そこから導波管
上に所望の薄い皮膜を形成するのは困難である。
5mMEDTAを含むリン酸塩緩衝液、pH6.0中のFab'断片の1m
g/ml溶液で処理した。この様にして製造された導波管表
面は、Fab'分子を表面密度約1.4×10-12モル/cm2で固定
することが分かった。また、この表面は、Fab'断片をそ
れらのＣ−末端チオール基で部位特異的に固定すること
ができた。得られた重合体皮膜の厚さは、エリプソメト
リー（ellipsometry）により、所望される様に約100Å
であると測定された。この皮膜の厚さは、0.35〜25μｍ
（ミクロン）の厚さを有する典型的な先行技術の重合体
皮膜よりはるかに小さい。上記のPMahy重合体の製造方
法は、Kernらにより開示された、ポリメタクリロイル酸
エステルを使用する方法よりも優れている。ヒドラジン
水化物との反応に適したその様なエステルは、分子量が
80,000ダルトン以上であることが多く、そこから導波管
上に所望の薄い皮膜を形成するのは困難である。
最後に、Fab'断片を、重合体被覆表面から突き出た遊
離のマレイミド基に、次の様にして結合させた。製造さ
れた導波管表面を、5mMのEDTAを含むリン酸塩緩衝液（p
H6.0）中に1.5×107モル濃度のFab'断片を含む溶液中
に、４℃で24時間保持した。
離のマレイミド基に、次の様にして結合させた。製造さ
れた導波管表面を、5mMのEDTAを含むリン酸塩緩衝液（p
H6.0）中に1.5×107モル濃度のFab'断片を含む溶液中
に、４℃で24時間保持した。
実施例 II
導波管表面−アビジン−ビオチンの製造
この方法は、アビジンに対するビオチンの非常に強い
結合親和力（結合定数約10-15）を利用することを意図
している。アビジン被覆は、シリカ表面に物理的に吸着
させることにより容易に行なった。次いでFab'断片をビ
オチンと共役させ、ビオチニル化Fab'断片またはｂ−Fa
b'断片とも呼ばれるビオチン−Fab'共役を形成した。ビ
オチンは、Fab'断片上の特定の位置に結合している。次
いでアビジン被覆した表面をｂ−Fab'断片で処理するこ
とにより、ビオチンをアビジンに結合させ、それによっ
てFab'断片を部位特異的にその表面に固定する。実際の
実験手順は次のとおりである。クロム酸で洗浄したシリ
カ表面を３×10-6M（モル）アビジンの溶液に室温で約
３時間浸漬した。次いで、表面をPBS中で数回洗浄し、
吸着されていないアビジンを除去した。
結合親和力（結合定数約10-15）を利用することを意図
している。アビジン被覆は、シリカ表面に物理的に吸着
させることにより容易に行なった。次いでFab'断片をビ
オチンと共役させ、ビオチニル化Fab'断片またはｂ−Fa
b'断片とも呼ばれるビオチン−Fab'共役を形成した。ビ
オチンは、Fab'断片上の特定の位置に結合している。次
いでアビジン被覆した表面をｂ−Fab'断片で処理するこ
とにより、ビオチンをアビジンに結合させ、それによっ
てFab'断片を部位特異的にその表面に固定する。実際の
実験手順は次のとおりである。クロム酸で洗浄したシリ
カ表面を３×10-6M（モル）アビジンの溶液に室温で約
３時間浸漬した。次いで、表面をPBS中で数回洗浄し、
吸着されていないアビジンを除去した。
ビオチニル化Fab'共役物は、十分は量の4mMビオチン
−HPDPをジメチルホルムアミドに加えて20倍モル過剰の
ビオチン−HPDPを形成することにより、PBS中Fab'断片
溶液（0.5〜1mg/ml）から製造した。この混合物を室温
で90分間保持し、ビオチニル化Fab'断片（略してｂ−Fa
b'）を、PBS中で平衡化したSephadex G25を使用するゲ
ル透過クロマトグラフィーにより精製した。
−HPDPをジメチルホルムアミドに加えて20倍モル過剰の
ビオチン−HPDPを形成することにより、PBS中Fab'断片
溶液（0.5〜1mg/ml）から製造した。この混合物を室温
で90分間保持し、ビオチニル化Fab'断片（略してｂ−Fa
b'）を、PBS中で平衡化したSephadex G25を使用するゲ
ル透過クロマトグラフィーにより精製した。
抗体全体をビオチニル化するために使用した別の方法
では、ビオチン−LC−ヒドラジドを、抗体のFe区域にお
ける酸化された炭水化物基に結合させた。９−40と呼ば
れるMab（フルオレセインを結合する鼠のモノクローナ
ルIgG1抗体）を、10mM過ヨウ素酸ナトリウム、0.1M酢酸
ナトリウムpH5.5中１〜2mg/mlタンパク質の濃度で約０
℃で20分間保持することにより、酸化した。次いで、グ
リセロールを最終濃度15mMになるまで加え、反応を急冷
し、混合物を０℃でさらに５分間保持した。酸化したMa
b9−40は、0.1M酢酸ナトリウムはpH5.5で平衡化したSep
hadex G25上のゲル濾過クロマトグラフィーにより精製
し、次いで5mMビオチン−LC−ヒドラジドと、撹拌しな
がら室温で２時間反応させた。未反応ビオチン−LC−ヒ
ドラジドは、PBS中で平衡化したSephadex G25カラムを
使用して除去した。
では、ビオチン−LC−ヒドラジドを、抗体のFe区域にお
ける酸化された炭水化物基に結合させた。９−40と呼ば
れるMab（フルオレセインを結合する鼠のモノクローナ
ルIgG1抗体）を、10mM過ヨウ素酸ナトリウム、0.1M酢酸
ナトリウムpH5.5中１〜2mg/mlタンパク質の濃度で約０
℃で20分間保持することにより、酸化した。次いで、グ
リセロールを最終濃度15mMになるまで加え、反応を急冷
し、混合物を０℃でさらに５分間保持した。酸化したMa
b9−40は、0.1M酢酸ナトリウムはpH5.5で平衡化したSep
hadex G25上のゲル濾過クロマトグラフィーにより精製
し、次いで5mMビオチン−LC−ヒドラジドと、撹拌しな
がら室温で２時間反応させた。未反応ビオチン−LC−ヒ
ドラジドは、PBS中で平衡化したSephadex G25カラムを
使用して除去した。
アビジン被覆した表面をｂ−Fab'断片の1.5×10-7M溶
液中に、室温で約１時間浸漬し、続いてPBSで洗浄し、
結合していないｂ−Fab'断片を除去した。所望により、
ポリエチレングリコール（略してPEG）を、予めｂ−Fa
b'断片で被覆した表面を約５×10-8〜１×10-7M PEGの
溶液に浸漬することにより、ｂ−Fab'断片被覆した表面
に結合させた。未結合PEGは、PBS中で洗浄することによ
り除去した。
液中に、室温で約１時間浸漬し、続いてPBSで洗浄し、
結合していないｂ−Fab'断片を除去した。所望により、
ポリエチレングリコール（略してPEG）を、予めｂ−Fa
b'断片で被覆した表面を約５×10-8〜１×10-7M PEGの
溶液に浸漬することにより、ｂ−Fab'断片被覆した表面
に結合させた。未結合PEGは、PBS中で洗浄することによ
り除去した。
アビジン−ビオチン結合化学反応を使用して得た固定
Fab'断片の密度は約1.4×10-12モル/cm2（平方センチメ
ートル）であった。
Fab'断片の密度は約1.4×10-12モル/cm2（平方センチメ
ートル）であった。
実施例 III
導波管表面−PEG型の製造
この方法では、それぞれエチレンジアミン（略してE
D）またはヒドラジン（略してHZ）との反応により、ポ
リエチレングリコール（略してPEG）の末端水酸基を第
１級アミンまたはヒドラジド基に転化し、PEG−ED2また
はPEG−HZ2を製造した。次いで、その様に変性したPEG
分子を、APSグルタルアルデヒドで活性化したシリカ表
面に結合させた。それぞれのPEG−ED2分子上の１個のED
部分が、シラン化−グルタルアルデヒド処理した導波管
表面上の遊離アルデヒド基と結合する。次いで、他のED
（またはPEG−HZ2を使用する場合はHZ）が、酸化された
抗体または抗体断片の様な捕獲分子（結合タンパク質）
中のアルデヒド部分と結合させるのに使用できる。
D）またはヒドラジン（略してHZ）との反応により、ポ
リエチレングリコール（略してPEG）の末端水酸基を第
１級アミンまたはヒドラジド基に転化し、PEG−ED2また
はPEG−HZ2を製造した。次いで、その様に変性したPEG
分子を、APSグルタルアルデヒドで活性化したシリカ表
面に結合させた。それぞれのPEG−ED2分子上の１個のED
部分が、シラン化−グルタルアルデヒド処理した導波管
表面上の遊離アルデヒド基と結合する。次いで、他のED
（またはPEG−HZ2を使用する場合はHZ）が、酸化された
抗体または抗体断片の様な捕獲分子（結合タンパク質）
中のアルデヒド部分と結合させるのに使用できる。
ダルトンで示された分子量の単官能性（PEG M2000、
M5000）または２官能性（PEG3400、PEG8000、PEG18,50
0）を、クロロギ酸ｐ−ニトロフェニル（略してｐ−NP
C、Aldrich Chemicalsから入手）のベンゼン溶液と反応
させた。この混合物を室温で約24時間撹拌した。無水エ
チルエーテル（水分0.01％未満、J.T.Baker Chemicals
から購入）を使用して溶液からPEG−（ｏ−NP）２を沈
殿させた。沈殿物を一晩真空乾燥させた。この処理によ
り、0.1N水酸化ナトリウムで加水分解して、ｐ−ニトロ
フェノール基を放出させることにより測定されるよう
に、約50％〜約100％のPEG分子がPEG−Onpに転化され
た。402nmにおける吸収を分光測定により決定し、転化
量を決定するために、18400M-1cm-1のモル吸光係数を使
用した。転化の水準は、MPEGのPEG分子量にある程度依
存する。
M5000）または２官能性（PEG3400、PEG8000、PEG18,50
0）を、クロロギ酸ｐ−ニトロフェニル（略してｐ−NP
C、Aldrich Chemicalsから入手）のベンゼン溶液と反応
させた。この混合物を室温で約24時間撹拌した。無水エ
チルエーテル（水分0.01％未満、J.T.Baker Chemicals
から購入）を使用して溶液からPEG−（ｏ−NP）２を沈
殿させた。沈殿物を一晩真空乾燥させた。この処理によ
り、0.1N水酸化ナトリウムで加水分解して、ｐ−ニトロ
フェノール基を放出させることにより測定されるよう
に、約50％〜約100％のPEG分子がPEG−Onpに転化され
た。402nmにおける吸収を分光測定により決定し、転化
量を決定するために、18400M-1cm-1のモル吸光係数を使
用した。転化の水準は、MPEGのPEG分子量にある程度依
存する。
PEG−（ｏ−NP）２をエチレンジアミンに溶解させ、
室温で約３時間穏やかに撹拌した。次いで十分な量の無
水エチルエーテルを加えてPEG−（ED）２を沈殿させ
た。12N（ノルマル）塩酸１滴を加えて黄色のPEG−（E
D）２溶液を無色化し、エチルエーテルによる沈殿をさ
らに２回繰り返した。湿ったPEG−（ED）２を一晩真空
乾燥させた。別に、エチレンジアミンの代わりに、PEG
をヒドラジンで誘導体化し、PEG−Hz2を製造した。
室温で約３時間穏やかに撹拌した。次いで十分な量の無
水エチルエーテルを加えてPEG−（ED）２を沈殿させ
た。12N（ノルマル）塩酸１滴を加えて黄色のPEG−（E
D）２溶液を無色化し、エチルエーテルによる沈殿をさ
らに２回繰り返した。湿ったPEG−（ED）２を一晩真空
乾燥させた。別に、エチレンジアミンの代わりに、PEG
をヒドラジンで誘導体化し、PEG−Hz2を製造した。
変性したPEGを、実施例Ｉに記載する様に製造したシ
ラン化−グルタルアルデヒド処理した導波管表面に結合
させた。24ミリグラム（mg）のPEG−ED粉末を1.2ミリリ
ットル（ml）の0.15M PBS pH7.4または同じ容積の11
％硫酸カリウム−酢酸ナトリウム緩衝液pH5.2に溶解さ
せた溶液。製造した導波管表面をPEG−ED溶液に浸漬
し、60℃で約24時間保持した。K2SO4酢酸塩緩衝液を使
用する手順は、PBS緩衝液を使用する手順より、その表
面に付加したより高密度のPEG分子を生じた。抗体また
は他の結合タンパク質を、下記の様にしてPEG被覆した
導波管に固定した。約3mg/mlの抗体の溶液を0.15M酢酸
ナトリウム緩衝液pH5.2に溶解させた。次いで等重量の5
0mMメタ過ヨウ素酸ナトリウム（NaIO4）の溶液を加え、
反応物を室温で約１時間撹拌した。反応混合物を、酢酸
ナトリウム緩衝液で予め平衡化した脱塩カラム（Pharma
ciaから入手したタイプPD−10）に通すことにより、未
反応メタ過ヨウ素酸ナトリウムを除去した。
ラン化−グルタルアルデヒド処理した導波管表面に結合
させた。24ミリグラム（mg）のPEG−ED粉末を1.2ミリリ
ットル（ml）の0.15M PBS pH7.4または同じ容積の11
％硫酸カリウム−酢酸ナトリウム緩衝液pH5.2に溶解さ
せた溶液。製造した導波管表面をPEG−ED溶液に浸漬
し、60℃で約24時間保持した。K2SO4酢酸塩緩衝液を使
用する手順は、PBS緩衝液を使用する手順より、その表
面に付加したより高密度のPEG分子を生じた。抗体また
は他の結合タンパク質を、下記の様にしてPEG被覆した
導波管に固定した。約3mg/mlの抗体の溶液を0.15M酢酸
ナトリウム緩衝液pH5.2に溶解させた。次いで等重量の5
0mMメタ過ヨウ素酸ナトリウム（NaIO4）の溶液を加え、
反応物を室温で約１時間撹拌した。反応混合物を、酢酸
ナトリウム緩衝液で予め平衡化した脱塩カラム（Pharma
ciaから入手したタイプPD−10）に通すことにより、未
反応メタ過ヨウ素酸ナトリウムを除去した。
次いで、PEG被覆した導波管を、酸化抗体の酢酸ナト
リウム緩衝液、pH5.2の溶液中に４℃で３日間保持し、
次いですすぎ、結合していない抗体を除去した。実施例
Ｉ乃至IIIの各被覆手順により、並びに先行技術の不規
則部位結合法により製造した導波管を分析し、蛍光全体
に対する非特異的結合の程度、および固定された抗体お
よび使用可能な結合部位の量を決定した。これらの分析
の比較結果を表Ｉに示す。
リウム緩衝液、pH5.2の溶液中に４℃で３日間保持し、
次いですすぎ、結合していない抗体を除去した。実施例
Ｉ乃至IIIの各被覆手順により、並びに先行技術の不規
則部位結合法により製造した導波管を分析し、蛍光全体
に対する非特異的結合の程度、および固定された抗体お
よび使用可能な結合部位の量を決定した。これらの分析
の比較結果を表Ｉに示す。
表Ｉのデータは、エピトープ密度が９である（すなわ
ち、BSA分子１個あたり約９個のフルオレセイン分子が
結合する）フルオレセイン−BSA（BSA＝ウシ血清アルブ
ミン）共役物、および抗フルオレセイン抗体（Mab9−4
0、または断片についてはFab'9−40と呼ばれる）を使用
して得た。この抗体を分泌するハイブリドーマ細胞群
は、Urbana−Champaignでイリノイ大学のE.W.Voss教授
から得た。これらの実験および結果を図7A、7B、８、9A
乃至9F、および10A乃至10Dに示す実験では、データの取
得および処理は、Photometrics Series 200と共に供給
されたソフトウェアを使用して行なった。
ち、BSA分子１個あたり約９個のフルオレセイン分子が
結合する）フルオレセイン−BSA（BSA＝ウシ血清アルブ
ミン）共役物、および抗フルオレセイン抗体（Mab9−4
0、または断片についてはFab'9−40と呼ばれる）を使用
して得た。この抗体を分泌するハイブリドーマ細胞群
は、Urbana−Champaignでイリノイ大学のE.W.Voss教授
から得た。これらの実験および結果を図7A、7B、８、9A
乃至9F、および10A乃至10Dに示す実験では、データの取
得および処理は、Photometrics Series 200と共に供給
されたソフトウェアを使用して行なった。
絶対抗原結合は、放射線標識を付けたトレーサーまた
は捕獲分子を使用して測定した。例えば、放射線標識を
付けたBSA−FL9は、固定されたFab'断片とリン酸塩緩衝
液pH7.3中、室温で５または60分間で結合させた。トレ
ーサー濃度は1.5×10-7Mであった。試料あたり3mlの、
濃度10-10M〜10-7Mのフルオレセイン標識を付けたBSA
（BSA−FL9）の試料をフローセル中に注入した。注入
は、５分間隔で行なった。波長488nmにおけるスペクト
ルを取り、PBS緩衝液で洗い流すことにより、大部分のB
SA−FL9を除去した。さらに３つのスペクトルを取り、5
13〜517nmのフルオレセインピークを積分した。これら
の値はBSA−FL9濃度のlogに対して配置し、結合等温線
を得た。
は捕獲分子を使用して測定した。例えば、放射線標識を
付けたBSA−FL9は、固定されたFab'断片とリン酸塩緩衝
液pH7.3中、室温で５または60分間で結合させた。トレ
ーサー濃度は1.5×10-7Mであった。試料あたり3mlの、
濃度10-10M〜10-7Mのフルオレセイン標識を付けたBSA
（BSA−FL9）の試料をフローセル中に注入した。注入
は、５分間隔で行なった。波長488nmにおけるスペクト
ルを取り、PBS緩衝液で洗い流すことにより、大部分のB
SA−FL9を除去した。さらに３つのスペクトルを取り、5
13〜517nmのフルオレセインピークを積分した。これら
の値はBSA−FL9濃度のlogに対して配置し、結合等温線
を得た。
放射能測定では、固定した放射能標識を付けた捕獲分
子、または標識を付けていない捕獲分子に結合した標識
トレーサー分子、を有する被覆シリカチップを適当な緩
衝液中で十分に洗浄し、ガンマ計数管で計数した。放射
能標識には、125I標識を付けた抗体または抗原が好まし
く、これはクロラミンＴ法（Greenwoodら、Biochem.J.8
9:114−123（1963）参照）を使用して行なった。
子、または標識を付けていない捕獲分子に結合した標識
トレーサー分子、を有する被覆シリカチップを適当な緩
衝液中で十分に洗浄し、ガンマ計数管で計数した。放射
能標識には、125I標識を付けた抗体または抗原が好まし
く、これはクロラミンＴ法（Greenwoodら、Biochem.J.8
9:114−123（1963）参照）を使用して行なった。
アビジン−ビオチン（実施例II、表Ｉの上から７およ
び８列）またはヒドロゲル（実施例Ｉ、表Ｉの下の２
列）との部位特異的な結合により製造した導波管上の、
抗原の非特異的吸収水準は、先行技術の結合方法のほと
んどよりも著しく優れており、一般的に１〜３％である
（表Ｉ）。また、これらの結果は、アビジン被覆した導
波管への非特異的結合が、約10-5M未満の分析物分子濃
度に対して、洗浄工程なしで、十分に低いことを示して
いる。
び８列）またはヒドロゲル（実施例Ｉ、表Ｉの下の２
列）との部位特異的な結合により製造した導波管上の、
抗原の非特異的吸収水準は、先行技術の結合方法のほと
んどよりも著しく優れており、一般的に１〜３％である
（表Ｉ）。また、これらの結果は、アビジン被覆した導
波管への非特異的結合が、約10-5M未満の分析物分子濃
度に対して、洗浄工程なしで、十分に低いことを示して
いる。
活性な（分析物を結合し得る）固定された分子の百分
率も、アビジン−ビオチンおよびヒドロゲル結合化学作
用で著しく高く、Fabに対して50％〜75％である。熱処
理、酸処理または酸化により結合したIgG捕獲分子に関
する結果は、IgG結合部位の低い百分率はで活性である
ことを示している（表Ｉ、上から１、２、４、５、６、
10列）。
率も、アビジン−ビオチンおよびヒドロゲル結合化学作
用で著しく高く、Fabに対して50％〜75％である。熱処
理、酸処理または酸化により結合したIgG捕獲分子に関
する結果は、IgG結合部位の低い百分率はで活性である
ことを示している（表Ｉ、上から１、２、４、５、６、
10列）。
ビオチン−PEGで標識を付けたシリカ−アビジン列
は、その表面（捕獲分子を付加した後）にビオチン−PE
G共役物を予め加えることによりさらに精製して得たデ
ータを示す。これは、潜在的な非特異的結合区域を不動
態化するために行なった。しかし、ビオチン−PEGを予
め加えることにより、大きな改良は見られなかった。
は、その表面（捕獲分子を付加した後）にビオチン−PE
G共役物を予め加えることによりさらに精製して得たデ
ータを示す。これは、潜在的な非特異的結合区域を不動
態化するために行なった。しかし、ビオチン−PEGを予
め加えることにより、大きな改良は見られなかった。
結果を表IIおよびIIIに示す実験に関して、鼠の抗ヒ
ト絨毛膜ゴナドトロピン（抗−hCG）モノクローナルIgG
抗体に由来するFab'断片を使用した。親のモノクローナ
ル抗体は、van Erpら、J.Immunol.Methods,140:235−24
1（1991）に記載されている様にして精製した。この抗
−hCG−Ａと呼ばれるマウス抗体は、hCG（BoxtelのOrga
non−Technika、オランダから供給）のβサブユニット
の一部に対して向けられる。実験ではモノクローナル抗
体抗−hCG−Ａ全体を使用し、その結果を図7A、7B、
８、9A乃至9F、および10A乃至10Dに示す。
ト絨毛膜ゴナドトロピン（抗−hCG）モノクローナルIgG
抗体に由来するFab'断片を使用した。親のモノクローナ
ル抗体は、van Erpら、J.Immunol.Methods,140:235−24
1（1991）に記載されている様にして精製した。この抗
−hCG−Ａと呼ばれるマウス抗体は、hCG（BoxtelのOrga
non−Technika、オランダから供給）のβサブユニット
の一部に対して向けられる。実験ではモノクローナル抗
体抗−hCG−Ａ全体を使用し、その結果を図7A、7B、
８、9A乃至9F、および10A乃至10Dに示す。
Ｆ（ab'）２断片は、GreyおよびKunkel,“H Chain Su
bgroups of myeloma proteins and normal 7S globuli
n",J.Exp.Med.120:253−266,1964に記載されている方法
を使用し、ペプシンで消化することにより製造した。消
化に続いて、ジチオトレイトール（DTT）を使用してＦ
（ab'）２断片をFab'断片に還元した。具体的には、33m
gの精製した抗体および1mgのペプシン（シグマ）を0.1M
酢酸ナトリウム緩衝液（pH4.2）中に溶解させ、37℃で1
6時間消化した。2Mトリス塩基で反応混合物のpHを8.0に
調節することにより、消化を終了させた。Ｆ（ab'）２
画分を、リン酸塩緩衝塩水（PBS）、pH7.7を溶離液とし
て使用するゲル透過クロマトグラフィー（Superdex Hil
oad,Pharmacia）により分離した。Fab'断片は、Ｆ（a
b'）２断片（1mg/ml）を、0.17Mトリス緩衝液（pH7.4）
中、1.75mMのDTTおよび3.5mMの四酢酸エチレンジアミン
（EDTA）により、室温で45分間還元して製造した。還元
後、過剰のDTTを、5mMのEDTAを含む0.1Mリン酸ナトリウ
ム緩衝液（pH6.0）中で平衡化したSephadex G25カラム
（Pharmacia）を使用するゲル透過クロマトグラフィー
により除去した。
bgroups of myeloma proteins and normal 7S globuli
n",J.Exp.Med.120:253−266,1964に記載されている方法
を使用し、ペプシンで消化することにより製造した。消
化に続いて、ジチオトレイトール（DTT）を使用してＦ
（ab'）２断片をFab'断片に還元した。具体的には、33m
gの精製した抗体および1mgのペプシン（シグマ）を0.1M
酢酸ナトリウム緩衝液（pH4.2）中に溶解させ、37℃で1
6時間消化した。2Mトリス塩基で反応混合物のpHを8.0に
調節することにより、消化を終了させた。Ｆ（ab'）２
画分を、リン酸塩緩衝塩水（PBS）、pH7.7を溶離液とし
て使用するゲル透過クロマトグラフィー（Superdex Hil
oad,Pharmacia）により分離した。Fab'断片は、Ｆ（a
b'）２断片（1mg/ml）を、0.17Mトリス緩衝液（pH7.4）
中、1.75mMのDTTおよび3.5mMの四酢酸エチレンジアミン
（EDTA）により、室温で45分間還元して製造した。還元
後、過剰のDTTを、5mMのEDTAを含む0.1Mリン酸ナトリウ
ム緩衝液（pH6.0）中で平衡化したSephadex G25カラム
（Pharmacia）を使用するゲル透過クロマトグラフィー
により除去した。
表IIおよびIIIに結果を示す実験では、特異的結合値
を、表Ｉに示す様に、125Iで標識を付けたhCGを使用し
て測定し、非特異的結合の測定には125Iで標識を付けた
BSAを使用した。表IIおよびIIIの両方で、固定した抗体
は抗−hCG Ａであった。
を、表Ｉに示す様に、125Iで標識を付けたhCGを使用し
て測定し、非特異的結合の測定には125Iで標識を付けた
BSAを使用した。表IIおよびIIIの両方で、固定した抗体
は抗−hCG Ａであった。
図7A、7B、８、9A乃至9F、および10A乃至10Dおよび表
Ｉ乃至IIIの蛍光免疫検定は、ユタ大学で製造した界面
フルオロメーターを使用して行なった。それぞれの適当
な抗原を固定したシリカ導波管を図3Aおよび3Bの２チャ
ネルフローセルの中に置いた。２つのチャネルは、図4A
乃至4Cに関して説明した様に、試料および比較物質の測
定に使用した。光源は514.5nmで放射する空冷式アルゴ
ン−イオンレーザーであった。レーザー光線は２つの平
行な光線に分割し、レンズで導波管の２つのチャネルに
集束させた。蛍光放射は、コンピュータ制御CCDカメラ
に接続したモノクロメーターを使用して520〜620nmから
記録した。蛍光スペクトルは560nm〜600nmで積分し、信
号−ノイズ比を改良した。
Ｉ乃至IIIの蛍光免疫検定は、ユタ大学で製造した界面
フルオロメーターを使用して行なった。それぞれの適当
な抗原を固定したシリカ導波管を図3Aおよび3Bの２チャ
ネルフローセルの中に置いた。２つのチャネルは、図4A
乃至4Cに関して説明した様に、試料および比較物質の測
定に使用した。光源は514.5nmで放射する空冷式アルゴ
ン−イオンレーザーであった。レーザー光線は２つの平
行な光線に分割し、レンズで導波管の２つのチャネルに
集束させた。蛍光放射は、コンピュータ制御CCDカメラ
に接続したモノクロメーターを使用して520〜620nmから
記録した。蛍光スペクトルは560nm〜600nmで積分し、信
号−ノイズ比を改良した。
図7A、7Bおよび８は、蛍光免疫検定を行なって抗体を
検出するための２つの別のフォーマットを使用して得た
蛍光強度データを示す。これらの実験では、ヒト絨毛膜
ゴナドトロピン（略してhCG）に対する抗体の検出を、
どのフォーマットが最高の感度を与えるかを決定するた
めのモデルとして使用した。上記の方法は、捕獲分子と
して使用するために必要な抗原を得さえすれば、プラズ
マまたは血清の様な生物学的な液体におけるすべての所
望の抗体の検出、例えばウイルスおよび細菌性病原体の
タンパク質に対する抗体の検出に使用できる。図7A、7B
および８に示す試験の目的に、検出すべき抗体（分析
物）として、hCG抗原（hCG−Ａと呼ぶ）に対するモノク
ローナル抗体（抗−hCG−Ａと呼ぶ）を選択した。図7A
のデータは、検定で捕獲分子（抗原または分析物を結合
する分子）として作用するhCG分子全体で得た。図7Bの
データは、捕獲分子として、抗−hCG−Ａ抗体を選択的
に結合する様に構築したオリゴペプチドを使用して得
た。この目的に好適な、公知のすべての抗原分析物分子
のためのオリゴペプチドは、特許公開第WO86/86487号お
よび米国特許第4,708,871号、並びに科学文献に記載さ
れている様なGeysenらの方法を使用して得ることができ
る。必要な蛍光染料を付加するために、オリゴペプチド
のＮ−末端を変性してアミノ反応性染料用のアミノ基を
与えるか、またはＣ−末端を変性してチオール反応性染
料用のシステインチオール基を与える。また、完全なオ
リゴペプチド配列は、付加された染料が結合部位から少
なくとも２または３個の残基だけ離れて配置されるのに
十分な長さを有するのが好ましい。
検出するための２つの別のフォーマットを使用して得た
蛍光強度データを示す。これらの実験では、ヒト絨毛膜
ゴナドトロピン（略してhCG）に対する抗体の検出を、
どのフォーマットが最高の感度を与えるかを決定するた
めのモデルとして使用した。上記の方法は、捕獲分子と
して使用するために必要な抗原を得さえすれば、プラズ
マまたは血清の様な生物学的な液体におけるすべての所
望の抗体の検出、例えばウイルスおよび細菌性病原体の
タンパク質に対する抗体の検出に使用できる。図7A、7B
および８に示す試験の目的に、検出すべき抗体（分析
物）として、hCG抗原（hCG−Ａと呼ぶ）に対するモノク
ローナル抗体（抗−hCG−Ａと呼ぶ）を選択した。図7A
のデータは、検定で捕獲分子（抗原または分析物を結合
する分子）として作用するhCG分子全体で得た。図7Bの
データは、捕獲分子として、抗−hCG−Ａ抗体を選択的
に結合する様に構築したオリゴペプチドを使用して得
た。この目的に好適な、公知のすべての抗原分析物分子
のためのオリゴペプチドは、特許公開第WO86/86487号お
よび米国特許第4,708,871号、並びに科学文献に記載さ
れている様なGeysenらの方法を使用して得ることができ
る。必要な蛍光染料を付加するために、オリゴペプチド
のＮ−末端を変性してアミノ反応性染料用のアミノ基を
与えるか、またはＣ−末端を変性してチオール反応性染
料用のシステインチオール基を与える。また、完全なオ
リゴペプチド配列は、付加された染料が結合部位から少
なくとも２または３個の残基だけ離れて配置されるのに
十分な長さを有するのが好ましい。
図7Aおよび7Bの両方の実験において、トレーサーは、
テトラメチルローダミン（略してTMR）で標識を付けた
ヤギの抗マウスIgGであった。両検定フォーマットに対
して、捕獲分子は、実施例IIに記載する様にしてビオチ
ニル化し、アビジン被覆したシリカ基材上に固定した。
試験抗体、抗−hCG Ａは、試験溶液中でトレーサー
（ヤギの抗マウスIgG−TMR）と予め混合した。
テトラメチルローダミン（略してTMR）で標識を付けた
ヤギの抗マウスIgGであった。両検定フォーマットに対
して、捕獲分子は、実施例IIに記載する様にしてビオチ
ニル化し、アビジン被覆したシリカ基材上に固定した。
試験抗体、抗−hCG Ａは、試験溶液中でトレーサー
（ヤギの抗マウスIgG−TMR）と予め混合した。
サンドイッチ蛍光免疫検定分野の当業者には明らかな
様に、抗−hCG Ａ抗体は固定された捕獲分子に結合
し、ヤギの抗マウスIgG−TMRは今度はマウス抗−hCG
Ａ抗体に結合した。この様にして、蛍光サンドイッチ
が、基材表面上に、消失性光励起の区域内に保持される
トレーサー分子のTMR部分により形成された。
様に、抗−hCG Ａ抗体は固定された捕獲分子に結合
し、ヤギの抗マウスIgG−TMRは今度はマウス抗−hCG
Ａ抗体に結合した。この様にして、蛍光サンドイッチ
が、基材表面上に、消失性光励起の区域内に保持される
トレーサー分子のTMR部分により形成された。
図7Aおよび7Bのデータは下記の方法により得た。異な
った濃度の抗−hCG Ａをトレーサー抗体（濃度は10-8M
に固定）と予め混合し、試料チャネル中に注入した。10
-8M濃度のトレーサー抗体を比較試料として比較チャネ
ル中に注入した。試料チャネルの蛍光強度を抗−hCG
Ａ濃度に対してプロットし、比較チャネルの蛍光強度も
同じ軸の組にプロットした（比較チャネルには抗−hCG
Ａを注入していないので、これは実際にはトレーサー
抗体の非特異的結合と時間の関係をプロットしたもので
ある）。
った濃度の抗−hCG Ａをトレーサー抗体（濃度は10-8M
に固定）と予め混合し、試料チャネル中に注入した。10
-8M濃度のトレーサー抗体を比較試料として比較チャネ
ル中に注入した。試料チャネルの蛍光強度を抗−hCG
Ａ濃度に対してプロットし、比較チャネルの蛍光強度も
同じ軸の組にプロットした（比較チャネルには抗−hCG
Ａを注入していないので、これは実際にはトレーサー
抗体の非特異的結合と時間の関係をプロットしたもので
ある）。
図7Aおよび7Bは、抗−hCG Ａが固定hCGおよびオリゴ
ペプチドにそれぞれ結合した後の、サンドイッチフォー
マットに関する結果を示す。図８は両方の場合に対応す
る蛍光増加を示す。図7Aおよび7Bから得たデータを、背
景蛍光に関して標準化し、蛍光増加（Fsample/F
reference）対log分析物濃度として再プロットした。応
答曲線は、両方の固定抗原（hCG全体およびオリゴペプ
チド抗原）に関して、10-13M〜10-10Mの抗体濃度の範囲
にわたって同様である。しかし、hCG全体は精度がより
優れていた。
ペプチドにそれぞれ結合した後の、サンドイッチフォー
マットに関する結果を示す。図８は両方の場合に対応す
る蛍光増加を示す。図7Aおよび7Bから得たデータを、背
景蛍光に関して標準化し、蛍光増加（Fsample/F
reference）対log分析物濃度として再プロットした。応
答曲線は、両方の固定抗原（hCG全体およびオリゴペプ
チド抗原）に関して、10-13M〜10-10Mの抗体濃度の範囲
にわたって同様である。しかし、hCG全体は精度がより
優れていた。
また、図7A、7Bおよび８から、この検定により、10
-13モルまでの低い分析物水準（抗−hCG Ａ）を検出で
きることも明らかである。さらに別の実施態様では、ト
レーサー抗体濃度を10-10M以下に下げる。これによっ
て、トレーサー抗体の非特異的吸着のために背景蛍光が
減少し、そのために感度が10-14M以上に改良されること
が期待される。
-13モルまでの低い分析物水準（抗−hCG Ａ）を検出で
きることも明らかである。さらに別の実施態様では、ト
レーサー抗体濃度を10-10M以下に下げる。これによっ
て、トレーサー抗体の非特異的吸着のために背景蛍光が
減少し、そのために感度が10-14M以上に改良されること
が期待される。
図9A乃至9Cは、サンドイッチ型検定で、抗原を検出す
るための捕獲分子として抗体を使用して得たデータを示
す。前に述べた様に、サンドイッチ免疫検定では、固定
された捕獲抗体および溶液中の標識を付けたトレーサー
抗体の２種類の異なった抗体を使用する。捕獲抗体およ
びトレーサー抗体は、抗原の異なった区域に結合しなけ
ればならないので、その様な検定では、抗原上の異なっ
たエピオトープに結合する２種類の異なったモノクロー
ナル抗体を一般的に使用する。抗−hCG−Ａに加えて、
抗−hCG−Ａとは異なったエピオトープに結合する他の
３種類の抗−hCG抗体（それぞれ抗−hCG−Ｂ、抗−hCG
−Ｃおよび抗−hCG−Ｄ）をOrganon Teknikaから入手し
た。抗−hCG ＡだけがhCGに特異的である（他はhCGに
関連する特定のホルモンにも結合する）ので、可能な12
対の抗体組合わせの中の６つだけがhCGに対する厳密な
選択性を示す。
るための捕獲分子として抗体を使用して得たデータを示
す。前に述べた様に、サンドイッチ免疫検定では、固定
された捕獲抗体および溶液中の標識を付けたトレーサー
抗体の２種類の異なった抗体を使用する。捕獲抗体およ
びトレーサー抗体は、抗原の異なった区域に結合しなけ
ればならないので、その様な検定では、抗原上の異なっ
たエピオトープに結合する２種類の異なったモノクロー
ナル抗体を一般的に使用する。抗−hCG−Ａに加えて、
抗−hCG−Ａとは異なったエピオトープに結合する他の
３種類の抗−hCG抗体（それぞれ抗−hCG−Ｂ、抗−hCG
−Ｃおよび抗−hCG−Ｄ）をOrganon Teknikaから入手し
た。抗−hCG ＡだけがhCGに特異的である（他はhCGに
関連する特定のホルモンにも結合する）ので、可能な12
対の抗体組合わせの中の６つだけがhCGに対する厳密な
選択性を示す。
図9A乃至9Fは、Fab'断片を抗−hCG Ａ（Fab'−Ａ）
から製造し、アビジン−ビオチン結合化学反応を使用し
て導波管に固定した、異なった組合わせ対から得た結果
を示す。抗−hCG Ｂ、抗−hCG Ｃおよび抗−hCG Ｄ
から製造したFab'断片をテトラメチルローダミンで標識
を付け、トレーサー抗体として使用した。図9Aおよび9B
は、トレーサー分子としてのFab'−Ｂを使用した結果を
示す。図9C、9Dは、トレーサー分子としてのFab'−Ｃを
使用した結果を示す。図9E、9Fは、トレーサー分子とし
てのFab'−Ｄによる結果を示す。現時点では、hCG検定
に使用するトレーサーとしてはFab'−ＢおよびFab'−Ｃ
が好ましい。
から製造し、アビジン−ビオチン結合化学反応を使用し
て導波管に固定した、異なった組合わせ対から得た結果
を示す。抗−hCG Ｂ、抗−hCG Ｃおよび抗−hCG Ｄ
から製造したFab'断片をテトラメチルローダミンで標識
を付け、トレーサー抗体として使用した。図9Aおよび9B
は、トレーサー分子としてのFab'−Ｂを使用した結果を
示す。図9C、9Dは、トレーサー分子としてのFab'−Ｃを
使用した結果を示す。図9E、9Fは、トレーサー分子とし
てのFab'−Ｄによる結果を示す。現時点では、hCG検定
に使用するトレーサーとしてはFab'−ＢおよびFab'−Ｃ
が好ましい。
別のフォーマットでは、逆の方法、すなわち、Fab'−
Ａをトレーサー分子とし、Fab'−Ｂ、−Ｃまたは−Ｄを
捕獲分子として使用した。しかし、Fab'−Ａを捕獲抗体
として使用するフォーマットは一般的に感度が優れてい
る。図9Bから、10-12Mまで低いhCG濃度は、Fab'−Ａを
捕獲分子とする検定により検出できることが分かる。
Ａをトレーサー分子とし、Fab'−Ｂ、−Ｃまたは−Ｄを
捕獲分子として使用した。しかし、Fab'−Ａを捕獲抗体
として使用するフォーマットは一般的に感度が優れてい
る。図9Bから、10-12Mまで低いhCG濃度は、Fab'−Ａを
捕獲分子とする検定により検出できることが分かる。
図10A乃至10Dは、競合または排除検定から得られるデ
ータを示す。アビジン−ビオチン化学反応（図10A、10
B）またはヒドロゲル結合化学反応（図10C、10D）のい
ずれかを使用してFab'−Ａ断片を導波管に固定した。固
定したFab'−Ａ断片にトレーサーオリゴペプチドを10-8
Mの濃度で予め加えた。フローセルの一方のチャネル
（試料）に増加する濃度のhCGを加え、他方（比較物
質）にPBS緩衝液を加えた。それぞれの結合化学反応に
対して、試料および比較物質の蛍光強度を左側のパネル
（10A ＆ 10C）に示し、完全な蛍光の百分率（hCGが
存在しない）を右側のパネル（10B ＆ 10D）に示す。
後者の値は、比較物質の蛍光の変化に対して標準化し
た。標準誤差をすべてのデータ点についてプロットした
が、場合によってはプロットの記号よりも小さかった。
ータを示す。アビジン−ビオチン化学反応（図10A、10
B）またはヒドロゲル結合化学反応（図10C、10D）のい
ずれかを使用してFab'−Ａ断片を導波管に固定した。固
定したFab'−Ａ断片にトレーサーオリゴペプチドを10-8
Mの濃度で予め加えた。フローセルの一方のチャネル
（試料）に増加する濃度のhCGを加え、他方（比較物
質）にPBS緩衝液を加えた。それぞれの結合化学反応に
対して、試料および比較物質の蛍光強度を左側のパネル
（10A ＆ 10C）に示し、完全な蛍光の百分率（hCGが
存在しない）を右側のパネル（10B ＆ 10D）に示す。
後者の値は、比較物質の蛍光の変化に対して標準化し
た。標準誤差をすべてのデータ点についてプロットした
が、場合によってはプロットの記号よりも小さかった。
現在、幾つかの理由からサンドイッチ免疫検定が好ま
しい。第一に、競合検定に対するピコモル濃度と比較し
て、少なくとも0.1ピコモルまでの濃度の検出を立証す
ることができる。また、本サンドイッチ免疫検定は、５
つのlogすなわち10-8M〜10-13Mの範囲の濃度を検出する
ことができた。したがって、サンドイッチ方法を使用す
る単一の検定方式が、異なった検出限界を必要とする様
々な用途に使用できる。
しい。第一に、競合検定に対するピコモル濃度と比較し
て、少なくとも0.1ピコモルまでの濃度の検出を立証す
ることができる。また、本サンドイッチ免疫検定は、５
つのlogすなわち10-8M〜10-13Mの範囲の濃度を検出する
ことができた。したがって、サンドイッチ方法を使用す
る単一の検定方式が、異なった検出限界を必要とする様
々な用途に使用できる。
被覆化学作用の別の実施態様、および現時点で非常に
好ましい実施態様は、導波管表面に対する結合部分（Fa
b'断片、抗体、その他）の光活性化された結合部分を与
える。光活性化方法を局所的な照射（例えばマスキング
による）と組合せることにより、異なった結合種を導波
管表面の異なった区域に順次結合させることができる。
この様にして、それぞれ異なった捕獲分子種（Fabまた
はFab断片）のパッチでパターン化した導波管表面を、
異なった種同士の間に壁を設ける必要なしに、都合よく
製造することができる。この型の消失性光センサーに関
して、不必要な壁を除去することにより、背景を減少さ
せ、消失性光界強度を高めることにより、装置の感度を
著しく改良することができる。非常に好ましい実施態様
では、被覆化学反応も表面を“不動態化”する、すなわ
ち蛍光トレーサーの非特異的結合を抑え、したがって背
景信号を減少させる。
好ましい実施態様は、導波管表面に対する結合部分（Fa
b'断片、抗体、その他）の光活性化された結合部分を与
える。光活性化方法を局所的な照射（例えばマスキング
による）と組合せることにより、異なった結合種を導波
管表面の異なった区域に順次結合させることができる。
この様にして、それぞれ異なった捕獲分子種（Fabまた
はFab断片）のパッチでパターン化した導波管表面を、
異なった種同士の間に壁を設ける必要なしに、都合よく
製造することができる。この型の消失性光センサーに関
して、不必要な壁を除去することにより、背景を減少さ
せ、消失性光界強度を高めることにより、装置の感度を
著しく改良することができる。非常に好ましい実施態様
では、被覆化学反応も表面を“不動態化”する、すなわ
ち蛍光トレーサーの非特異的結合を抑え、したがって背
景信号を減少させる。
現時点で好ましい被覆は、ここで“ブロック共重合
体”と呼ばれる種類の化合物である。これは、重合した
疎水性残基（ポリプロピレンオキシド、“PPO"）を含む
少なくとも１個の疎水性ブロックに隣接する、重合した
親水性残基（ポリエチレンオキシド、“PEO"）を含む少
なくとも１個の親水性ブロックを含む。その様な化合物
の、ここで“３ブロック共重合体”または“TBCP"と呼
ばれるサブクラスは、親水性ブロックが側面に位置する
疎水性ブロックを含む。一連のTBCPがBASF Corporation
からPLURONICSの商品名で市販されている。現時点で好
ましい化合物の例は、一般的に文献中でPLURONICS F108
または“PF108"として知られているが、これは分子量
（MW）が約14,600であり、一般式（PEO）ｘ（PPO）
ｙ（PEO）ｘを有し、ｘ＝129およびｙ＝56である。ブロ
ック共重合体の中で、疎水性PPO部分がポリスチレンを
含むプラスチックに強く吸着し、比較的移動し易い状態
のPEO側方アームを残す傾向がある。ブロック共重合体
は、非特異的タンパク質吸着を抑制し、FabまたはFab断
片を含むタンパク質に付着するのに有用な親水性側鎖を
与える一般的な特性を有する。
体”と呼ばれる種類の化合物である。これは、重合した
疎水性残基（ポリプロピレンオキシド、“PPO"）を含む
少なくとも１個の疎水性ブロックに隣接する、重合した
親水性残基（ポリエチレンオキシド、“PEO"）を含む少
なくとも１個の親水性ブロックを含む。その様な化合物
の、ここで“３ブロック共重合体”または“TBCP"と呼
ばれるサブクラスは、親水性ブロックが側面に位置する
疎水性ブロックを含む。一連のTBCPがBASF Corporation
からPLURONICSの商品名で市販されている。現時点で好
ましい化合物の例は、一般的に文献中でPLURONICS F108
または“PF108"として知られているが、これは分子量
（MW）が約14,600であり、一般式（PEO）ｘ（PPO）
ｙ（PEO）ｘを有し、ｘ＝129およびｙ＝56である。ブロ
ック共重合体の中で、疎水性PPO部分がポリスチレンを
含むプラスチックに強く吸着し、比較的移動し易い状態
のPEO側方アームを残す傾向がある。ブロック共重合体
は、非特異的タンパク質吸着を抑制し、FabまたはFab断
片を含むタンパク質に付着するのに有用な親水性側鎖を
与える一般的な特性を有する。
また、本説明は主としてPLURONICS型化合物に関する
が、親水性部分および疎水性部分を有し、タンパク質ま
たは光活性化結合剤を付加するための突き出たOH基を与
える他の重合体化合物も有用である。この分野で公知の
様に、これらの化合物は、SEPHAROSE型物質および他の
多糖を含む。また、親水性ブロックとしてポリウレタン
部分を含むブロック共重合体も有用である。
が、親水性部分および疎水性部分を有し、タンパク質ま
たは光活性化結合剤を付加するための突き出たOH基を与
える他の重合体化合物も有用である。この分野で公知の
様に、これらの化合物は、SEPHAROSE型物質および他の
多糖を含む。また、親水性ブロックとしてポリウレタン
部分を含むブロック共重合体も有用である。
図16に関して、パターン化されたポリスチレン導波管
を製造する一般的な方法は下記のとおりである。第一
に、PF108分子702で被覆した導波管表面700を製造す
る。次に、導波管の選択された区域におけるPF108分子7
02の遊離PEO鎖末端704を、光活性化結合反応において光
親和力架橋剤706を用いて誘導体化する。好適な架橋剤
は、イソチオシアネート、スクシンイミドまたはマレイ
ミドの様な反応性官能基に共役結合した光活性化し得る
基を有するヘテロ２官能性試薬である。好適な波長（一
般的に紫外領域）の光線701で照射することにより、架
橋剤706の光活性化し得る基が反応し、遊離PEO鎖末端70
4に共有結合する。マスク712が照射を導波管の第一区域
714に限定する。その結果、導波管表面の第一区域714
が、Fab'断片だけを結合するのに有用な反応性官能基を
有する。次に、導波管表面を第一の種（図16におけるFA
B1 720）のFab'断片の溶液中に、Fab'断片を誘導体化
した区域に完全に結合するのに十分な時間保持する。次
いで未反応のFab'断片を洗い流し、光活性化による誘導
体化方法を、導波管の第二の区域で繰り返し、続いてFa
b'断片の第二の種と反応させる。
を製造する一般的な方法は下記のとおりである。第一
に、PF108分子702で被覆した導波管表面700を製造す
る。次に、導波管の選択された区域におけるPF108分子7
02の遊離PEO鎖末端704を、光活性化結合反応において光
親和力架橋剤706を用いて誘導体化する。好適な架橋剤
は、イソチオシアネート、スクシンイミドまたはマレイ
ミドの様な反応性官能基に共役結合した光活性化し得る
基を有するヘテロ２官能性試薬である。好適な波長（一
般的に紫外領域）の光線701で照射することにより、架
橋剤706の光活性化し得る基が反応し、遊離PEO鎖末端70
4に共有結合する。マスク712が照射を導波管の第一区域
714に限定する。その結果、導波管表面の第一区域714
が、Fab'断片だけを結合するのに有用な反応性官能基を
有する。次に、導波管表面を第一の種（図16におけるFA
B1 720）のFab'断片の溶液中に、Fab'断片を誘導体化
した区域に完全に結合するのに十分な時間保持する。次
いで未反応のFab'断片を洗い流し、光活性化による誘導
体化方法を、導波管の第二の区域で繰り返し、続いてFa
b'断片の第二の種と反応させる。
Fab'断片を遊離のマレイミド基で誘導体化した導波管
区域に結合させる（図16の手順）には、Fab'断片の溶液
による処理を、本質的にPMahy被覆に関して記載した様
にして行なうことができる。
区域に結合させる（図16の手順）には、Fab'断片の溶液
による処理を、本質的にPMahy被覆に関して記載した様
にして行なうことができる。
別の実施態様では、架橋剤がPEO鎖末端704と光反応す
る前に、Fab'断片720を架橋剤706に結合させる（図1
7）。現時点ではこの実施態様が好ましい。というの
は、この様にして形成された表面は、図16の方法により
製造した表面よりも、単位面積あたり多くの分析物並び
にトレーサーを結合できるためである。
る前に、Fab'断片720を架橋剤706に結合させる（図1
7）。現時点ではこの実施態様が好ましい。というの
は、この様にして形成された表面は、図16の方法により
製造した表面よりも、単位面積あたり多くの分析物並び
にトレーサーを結合できるためである。
好適な光親和力架橋剤には、アリールアジド（アミン
とアミンとの結合）、フッ素化アリールアジド（Ｃ−Ｈ
結合手とチオールとの結合）、およびベンゾフェノン
（特定の化合物に応じて、Ｃ−Ｈ結合手とアミンとの結
合またはＣ−Ｈ結合手とチオールとの結合）がある。そ
れぞれの種類の例を、対応する光活性化結合反応と共
に、図18A乃至18Dに示す。現在、Ｃ−Ｈ結合手とチオー
ルとの結合を与えるベンゾフェノンが、Fab'断片への部
位特異的な結合を達成するのに使用できるので好まし
い。ベンゾフェノンのヨードアセトアミドまたはマレイ
ミド誘導体（それぞれ“BPLA"または“BPM"）がこの目
的を達成することができる。現在、特異的結合の程度が
より高く、非特異的吸着の程度が低いので、BPMが好ま
しい。これは、前にPMahy被覆に関して説明した様に、F
ab'断片のＣ−末端チオール基を介して結合が起こるか
らである。遊離のマレイミド基を与える他の光親和力架
橋剤も同様に好適であろう。
とアミンとの結合）、フッ素化アリールアジド（Ｃ−Ｈ
結合手とチオールとの結合）、およびベンゾフェノン
（特定の化合物に応じて、Ｃ−Ｈ結合手とアミンとの結
合またはＣ−Ｈ結合手とチオールとの結合）がある。そ
れぞれの種類の例を、対応する光活性化結合反応と共
に、図18A乃至18Dに示す。現在、Ｃ−Ｈ結合手とチオー
ルとの結合を与えるベンゾフェノンが、Fab'断片への部
位特異的な結合を達成するのに使用できるので好まし
い。ベンゾフェノンのヨードアセトアミドまたはマレイ
ミド誘導体（それぞれ“BPLA"または“BPM"）がこの目
的を達成することができる。現在、特異的結合の程度が
より高く、非特異的吸着の程度が低いので、BPMが好ま
しい。これは、前にPMahy被覆に関して説明した様に、F
ab'断片のＣ−末端チオール基を介して結合が起こるか
らである。遊離のマレイミド基を与える他の光親和力架
橋剤も同様に好適であろう。
光結合方法で、PF108に結合する架橋剤の量は、照射
の期間および強度、架橋剤分子の濃度等により異なる。
これらの変動要素は、容易に試験および最適化すること
ができ、導波管表面に結合する架橋剤および／またはFa
b'タンパク質の所望の程度を達成するパラメータを発見
することができる。一般的に、約0.5mg/ml〜1mg/mlのFa
b'濃度、および20倍モル過剰の架橋剤が、図16および17
の工程に有効である。
の期間および強度、架橋剤分子の濃度等により異なる。
これらの変動要素は、容易に試験および最適化すること
ができ、導波管表面に結合する架橋剤および／またはFa
b'タンパク質の所望の程度を達成するパラメータを発見
することができる。一般的に、約0.5mg/ml〜1mg/mlのFa
b'濃度、および20倍モル過剰の架橋剤が、図16および17
の工程に有効である。
表IVは、架橋剤BPM対BPIAに対して、異なる４種類のT
BCPのひとつで被覆した、または被覆していない表面に
対して、および図16の手順対図17の手順に対して得た、
特異的結合および非特異的結合の程度に関する比較デー
タを示す。これらのTBCPは、PF108とやはりBASFから市
販の、商品名PP105、PF68、およびPF88で呼ばれる他の
３種類である。これらの化合物の、それぞれのPEO/PPO/
PEO比および分子量は、37/56/37（PP105、MW＝6500）、
76/30/76（PF68、MW＝8400）、および104/39/104（PF8
8、MW＝11,400）である。
BCPのひとつで被覆した、または被覆していない表面に
対して、および図16の手順対図17の手順に対して得た、
特異的結合および非特異的結合の程度に関する比較デー
タを示す。これらのTBCPは、PF108とやはりBASFから市
販の、商品名PP105、PF68、およびPF88で呼ばれる他の
３種類である。これらの化合物の、それぞれのPEO/PPO/
PEO比および分子量は、37/56/37（PP105、MW＝6500）、
76/30/76（PF68、MW＝8400）、および104/39/104（PF8
8、MW＝11,400）である。
モデル方式として、９−40抗−フルオレイン抗体に由
来するFab'断片を捕獲分子として、分析物を表わすフル
オレセイン共役BSAを用いて使用する。BSAに放射能標識
を付けた。特異的結合は、フルオレセイン−BSA−共役
の結合として測定し、非特異的結合は本来の（共役して
いない）BSAの結合から測定した。
来するFab'断片を捕獲分子として、分析物を表わすフル
オレセイン共役BSAを用いて使用する。BSAに放射能標識
を付けた。特異的結合は、フルオレセイン−BSA−共役
の結合として測定し、非特異的結合は本来の（共役して
いない）BSAの結合から測定した。
表IVのデータから、非特異的結合の程度は、PF68およ
びPF88に関するよりも、PF108およびPP105被覆に関して
著しく低いことが明白である。この理由から、PF108お
よびPP105が、現時点で好ましいBCPである。一般的に、
TBCP化合物の中で、非特異的結合に対して優れた耐性を
示す（したがって現在好ましい）化合物は、長さが約45
〜50残基以上のPPO部分を有する化合物である。望まし
くは、非特定的結合の程度は、特異的結合の程度の約10
％以下、好ましくは約１％〜２％未満である。あるい
は、またはそれに加えて、非特異的結合の絶対量は約５
×10-14未満、好ましくは約５×10-15未満であるのが望
ましい。TBCPの親水性／疎水性バランスも、総MWも、化
合物中のPEO対PPOの分子量比も、良好な効率で非特異的
結合を抑制するTBCPを選択する上で、PPO断片の長さ程
重要であるとは思われない。
びPF88に関するよりも、PF108およびPP105被覆に関して
著しく低いことが明白である。この理由から、PF108お
よびPP105が、現時点で好ましいBCPである。一般的に、
TBCP化合物の中で、非特異的結合に対して優れた耐性を
示す（したがって現在好ましい）化合物は、長さが約45
〜50残基以上のPPO部分を有する化合物である。望まし
くは、非特定的結合の程度は、特異的結合の程度の約10
％以下、好ましくは約１％〜２％未満である。あるい
は、またはそれに加えて、非特異的結合の絶対量は約５
×10-14未満、好ましくは約５×10-15未満であるのが望
ましい。TBCPの親水性／疎水性バランスも、総MWも、化
合物中のPEO対PPOの分子量比も、良好な効率で非特異的
結合を抑制するTBCPを選択する上で、PPO断片の長さ程
重要であるとは思われない。
表Ｖは、PF108被覆したポリスチレン導波管への非特
異的結合に対する様々なTBCPの被覆時間の効果に関する
比較データを示す。達成された非特異的結合の水準は、
短くて少なくとも10分間から、長くて少なくとも24時間
までの被覆時間に対して見分けがつかないことが分か
る。
異的結合に対する様々なTBCPの被覆時間の効果に関する
比較データを示す。達成された非特異的結合の水準は、
短くて少なくとも10分間から、長くて少なくとも24時間
までの被覆時間に対して見分けがつかないことが分か
る。
表IVおよびＶに示すデータから、最良の結果は、PF10
8およびPP105およびFab'濃度1.5×10-6Mで得られる様で
ある。
8およびPP105およびFab'濃度1.5×10-6Mで得られる様で
ある。
上記のTBCPに加えて、PEO/PPOのジブロック共重合体
（DBCP）も、非特異的結合を抑制するための導波管被覆
として効果的であろう。ここで、TBCPと同様に、一般的
に約40〜45残基を超える、十分な長さのPPO断片を有す
る化合物がより効果的であろう。現在、これらの化合物
の非特異的結合抑制にはPEOブロックが大きく寄与する
ので、DBCPよりTBCPの方が好ましい。
（DBCP）も、非特異的結合を抑制するための導波管被覆
として効果的であろう。ここで、TBCPと同様に、一般的
に約40〜45残基を超える、十分な長さのPPO断片を有す
る化合物がより効果的であろう。現在、これらの化合物
の非特異的結合抑制にはPEOブロックが大きく寄与する
ので、DBCPよりTBCPの方が好ましい。
上記の結合方法はポリスチレン導波管で非常に効果的
であるが、石英、ガラス、およびオキシ窒化ケイ素の様
なシリカ系基材にはあまり効果的ではない。シリカ系基
材は、“集積導波管チップ”バイオセンサーの開発の観
点から得に重要である。したがって、オキシ窒化ケイ素
導波管のための光結合方法の別の実施態様では、表面の
シリカと自由に反応するシリル基を有するシリカ親和性
付与剤をPF108の代わりに使用する。有用なシラン化
（シリカ親和性付与）剤の例は、分子量約3500〜5000の
メトキシポリ（エチレングリコール）トリメトキシシラ
ン（“PEG−シラン”）、アミノプロピル−トリエトキ
シシラン（APS）、およびジクロロジメチルシラン（DD
S）である。この実施態様では、より良い非特異的結合
抑制特性のために、PEG−シランおよびAPSが現在好まし
い。
であるが、石英、ガラス、およびオキシ窒化ケイ素の様
なシリカ系基材にはあまり効果的ではない。シリカ系基
材は、“集積導波管チップ”バイオセンサーの開発の観
点から得に重要である。したがって、オキシ窒化ケイ素
導波管のための光結合方法の別の実施態様では、表面の
シリカと自由に反応するシリル基を有するシリカ親和性
付与剤をPF108の代わりに使用する。有用なシラン化
（シリカ親和性付与）剤の例は、分子量約3500〜5000の
メトキシポリ（エチレングリコール）トリメトキシシラ
ン（“PEG−シラン”）、アミノプロピル−トリエトキ
シシラン（APS）、およびジクロロジメチルシラン（DD
S）である。この実施態様では、より良い非特異的結合
抑制特性のために、PEG−シランおよびAPSが現在好まし
い。
シリカ系基材に関する別の実施態様では、表面をシラ
ン化剤で被覆する。次いで、シラン化した表面を、選択
された区域で、ポリスチレン/PF108の方法に関して説明
したのと同様の方法で、光−親和力架橋剤で変性する。
基礎被覆としてAPSを使用する場合、好適な架橋剤は、A
PS中のアミノ基をFeb中のアミン基に架橋するアリール
アジド（図18A乃至18D）であろう。しかし、この方法で
は、Fabが複数のアミン基を有するので、Fabが導波管表
面に部位特異的に付着しない。あるいは、部位特異的な
Fab付着を達成するために、前に説明した様に、PEGをAP
Sに結合させ、Fab断片をPEGに付着させるのにベンゾフ
ェノン架橋剤を使用できた。後者の方法に関する化学反
応は、ベンゾフェノン架橋剤によるFab断片のPF108への
部位特異的な結合と同様であろう。
ン化剤で被覆する。次いで、シラン化した表面を、選択
された区域で、ポリスチレン/PF108の方法に関して説明
したのと同様の方法で、光−親和力架橋剤で変性する。
基礎被覆としてAPSを使用する場合、好適な架橋剤は、A
PS中のアミノ基をFeb中のアミン基に架橋するアリール
アジド（図18A乃至18D）であろう。しかし、この方法で
は、Fabが複数のアミン基を有するので、Fabが導波管表
面に部位特異的に付着しない。あるいは、部位特異的な
Fab付着を達成するために、前に説明した様に、PEGをAP
Sに結合させ、Fab断片をPEGに付着させるのにベンゾフ
ェノン架橋剤を使用できた。後者の方法に関する化学反
応は、ベンゾフェノン架橋剤によるFab断片のPF108への
部位特異的な結合と同様であろう。
次に、選択されたFab'断片を架橋剤上の遊離官能基に
結合させる。この方法の残り（様々な種のFab'に対する
上記工程の繰り返し）は、ポリスチレン導波管のそれと
同様である。
結合させる。この方法の残り（様々な種のFab'に対する
上記工程の繰り返し）は、ポリスチレン導波管のそれと
同様である。
さらに他の、シリカ型導波管に有用な実施態様では、
DDS（ジクロロジメチルシラン）の様な、疎水性表面を
形成するシリカ親和性付与剤で導波管を被覆し、続いて
PF108の様なブロック共重合体で被覆する。PF108は疎水
性の第一被覆に接着し、結合方法の残りの部分は、ポリ
スチレン導波管に関して説明したのと実質的に同様であ
る。好ましいTBCP化合物およびシリカ親和性被覆剤の選
択において、非特異的結合の相対的および／または絶対
的な水準の同様な考え方が適用される。
DDS（ジクロロジメチルシラン）の様な、疎水性表面を
形成するシリカ親和性付与剤で導波管を被覆し、続いて
PF108の様なブロック共重合体で被覆する。PF108は疎水
性の第一被覆に接着し、結合方法の残りの部分は、ポリ
スチレン導波管に関して説明したのと実質的に同様であ
る。好ましいTBCP化合物およびシリカ親和性被覆剤の選
択において、非特異的結合の相対的および／または絶対
的な水準の同様な考え方が適用される。
上記のパターン化方法は、局所的架橋剤光活性化の好
適な光源を必要とする。上記の様に、局所的な光結合
は、レンズおよびマスクを備えた、キセノンランプの様
な非干渉性光源で実行することができる（図15）。300n
m帯域フィルターおよびマスクを備えた水銀蒸気ランプ
は、有用な非干渉性光源のもう一つの例である。あるい
は、アルゴンイオンレーザーの様な干渉性UV光源を、変
換工程と組合せて使用することができる。後者の実施態
様では、所望の局所的な照射に、マスクを使用しても、
しなくてもよい。
適な光源を必要とする。上記の様に、局所的な光結合
は、レンズおよびマスクを備えた、キセノンランプの様
な非干渉性光源で実行することができる（図15）。300n
m帯域フィルターおよびマスクを備えた水銀蒸気ランプ
は、有用な非干渉性光源のもう一つの例である。あるい
は、アルゴンイオンレーザーの様な干渉性UV光源を、変
換工程と組合せて使用することができる。後者の実施態
様では、所望の局所的な照射に、マスクを使用しても、
しなくてもよい。
上記の実験例および結果は、hCG抗原／抗hCG抗体およ
びフルオレセイン／抗フルオレセイン抗体系を使用して
得たが、当業者には明らかな様に、この装置およびバイ
オセンサー、並びに部位特異的な導波管結合方法および
検定フォーマットはすべて、適当な捕獲分子の様な必要
な試薬が得られるすべての抗原および抗体の検定に、過
度の実験なしに応用できる。さらに、トレーサー分子の
標識付けに有用であるとして、テトラメチルローダミ
ン、フルオレセイン、およびシアニン染料を具体的に挙
げたが、この装置および方法は、所望のトレーサー分子
に共役させることができる他の蛍光染料でも有用である
ことは明らかである。
びフルオレセイン／抗フルオレセイン抗体系を使用して
得たが、当業者には明らかな様に、この装置およびバイ
オセンサー、並びに部位特異的な導波管結合方法および
検定フォーマットはすべて、適当な捕獲分子の様な必要
な試薬が得られるすべての抗原および抗体の検定に、過
度の実験なしに応用できる。さらに、トレーサー分子の
標識付けに有用であるとして、テトラメチルローダミ
ン、フルオレセイン、およびシアニン染料を具体的に挙
げたが、この装置および方法は、所望のトレーサー分子
に共役させることができる他の蛍光染料でも有用である
ことは明らかである。
また、本出願の新規な主題を、主として、消失性光界
により励起し、消失性光界は光線を導波管の縁部または
末端に向けることにより形成し、得られた蛍光を消失性
光区域から直接（例えば、導波管中に戻る消失性光を経
由してではなく）収集する装置に関して説明したが、こ
の主題の光学的並びに化学的部分の多くの要素の有用性
は、その様に限定されるものではない。本主題における
多くの要素は、消失性光バイオセンサーの別の形態でも
有用である。その様な他の形態の一つは、トレーサー分
子が非消失性光源により励起され、蛍光が、導波管中を
伝播し、縁部または末端で収集される消失性光として収
集される形態である。その様な他の形態のもう一つは、
縁部または末端から照明される導波管を経由して消失性
光界励起を与え、導波管中に逆透過する消失性光による
蛍光を収集する。
により励起し、消失性光界は光線を導波管の縁部または
末端に向けることにより形成し、得られた蛍光を消失性
光区域から直接（例えば、導波管中に戻る消失性光を経
由してではなく）収集する装置に関して説明したが、こ
の主題の光学的並びに化学的部分の多くの要素の有用性
は、その様に限定されるものではない。本主題における
多くの要素は、消失性光バイオセンサーの別の形態でも
有用である。その様な他の形態の一つは、トレーサー分
子が非消失性光源により励起され、蛍光が、導波管中を
伝播し、縁部または末端で収集される消失性光として収
集される形態である。その様な他の形態のもう一つは、
縁部または末端から照明される導波管を経由して消失性
光界励起を与え、導波管中に逆透過する消失性光による
蛍光を収集する。
さらに、本発明の概念および範囲から逸れることな
く、上記の装置およびバイオセンサーに様々な修正およ
置き換えが可能であることは明らかである。
く、上記の装置およびバイオセンサーに様々な修正およ
置き換えが可能であることは明らかである。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 クリステンセン，ダグラス，エー.
アメリカ合衆国．84121 ユタ，ソルト
レイクシティ，トップ オブ ザ ワー
ルド サークル 8520
(72)発明者 ワン，フ−クン
アメリカ合衆国．84102 ユタ，ソルト
レイクシティ，ナンバー２，エリザベス
ストリート 73
(72)発明者 コールドウェル，カリン，ディー.
アメリカ合衆国．84121 ユタ，ソルト
レイクシティ，イースト ゴールデン
ヒルス ドライヴ 3645
(72)発明者 ヤナトワ，ヴェラ
チェッコ，162 00 プラハ ６，ナ
ペトリナッハ （番地なし)
(72)発明者 ホアン，シャオ−チー
アメリカ合衆国．84107 ユタ，ソルト
レイクシティ，ナンバー24，サウス
4900 イースト 800
(56)参考文献 特表 平３−506078（ＪＰ，Ａ)
特表 平４−501612（ＪＰ，Ａ)
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
G01N 33/542
G01N 33/533
G01N 33/543
Claims (27)
- 【請求項１】第一および第二の平行で平らな表面、およ
び該第一および第二表面の間を伸びる縁部を有する平ら
な導波管であって、該縁部が光を受けるための受光区域
を有し、該表面の少なくとも一方がその上に固定された
複数の捕獲分子を有し、該捕獲分子がそれぞれ分析物を
選択的に結合する結合部位を有する導波管と、該受光縁
部に隣接して該導波管に一体化されている半円筒形のレ
ンズとからなることを特徴とする均質固相蛍光免疫検定
用装置。 - 【請求項２】所望の波長領域の光線を与え、かつ該光線
を前記レンズ中に向ける様に配置された光源、 前記導波管表面の少なくとも一方の上に形成された１個
以上の貯蔵部であって、該貯蔵部のそれぞれが、緩衝
液、少なくとも１種の前記分析物の複数の分子、および
前記光線から生じた消失性光で刺激したときに蛍光を放
射し得る複数のトレーサー分子を含む試料溶液を含む様
に形成された貯蔵部、および 本質的に前記蛍光からなる蛍光信号を直接検出する様に
配置された検出手段であって、前記表面に対して平行で
前記表面から離れた平面上に前記蛍光が衝突するように
前記蛍光を収集する配置されたレンズ手段を含む検出手
段 をさらに含む請求項１の装置。 - 【請求項３】間隔を置いて配置された前記固定縁部分子
の複数のパッチを有し、かつ前記検出手段が、該パッチ
の個々の一つにそれぞれ対応する複数の蛍光信号を同時
に個別に収集する様に形成されている請求項２の装置。 - 【請求項４】前記検出手段が、前記離れた平行な平面内
で互いに間隔を置いて配置された複数の光検出素子、お
よび前記蛍光信号のそれぞれを該光検出素子のそれぞれ
の一つに集める様に配置されたレンズ手段を有する画像
形成検出器を含む請求項３の装置。 - 【請求項５】前記導波管および前記レンズが、光学プラ
スチックで形成されかつ一体成形されている請求項１ま
たは２の装置。 - 【請求項６】前記半円筒形レンズが、シート状の光線を
非ゼロ角度で前記受光縁部の中に向ける方向で配置され
た焦点区域を有し、該角度が前記導波管および水性媒体
の間の界面で光の全内部反射をする臨界角度未満である
請求項１、２または５の装置。 - 【請求項７】前記導波管が、末端縁部を形成する鋸歯状
部分を有し、該末端縁部が前記受光縁部および前記半円
筒形レンズと反対側の末端に配置されている請求項１ま
たは６の装置。 - 【請求項８】前記導波管が請求項９の光学基材である請
求項１、２、３又は４の装置。 - 【請求項９】前記導波管が、請求項10による光学基材で
あり、かつ導波管厚さを有し、さらに、前記光源と前記
半円筒形レンズの間に位置して、光線を一般的に前記導
波管の厚さの約２倍未満の厚さを有するシート状光線に
形状変換するための光線形状変換手段を含む請求項２、
３又は４の装置。 - 【請求項１０】光信号により対応する分析物を検出する
ために、該分析物を特異的に捕獲するのに有用な捕獲分
子が結合されている、固相検定に有用な光学基材であっ
て、該基材に対する非特異的な結合の量を適度に低くす
る被覆を施した区域を有する光学表面を含み、該被覆
が、ポリメタクリロイル重合体からなるヒドロゲル、シ
リル−誘導体化されたポリエチレングリコール、アビジ
ン、および本質的に親水性残基からなる少なくとも１種
の親水性重合体ブロックに隣接する、本質的に疎水性残
基からなる少なくとも１種の疎水性重合体ブロックを含
むブロック共重合体からなる群から選択されること、お
よび半円筒形のレンズが該基材と一体的に設けられてい
ることを特徴とする光学基材。 - 【請求項１１】前記被覆区域に共有結合された１種類以
上の捕獲分子種をさらに含み、該１種類以上の種のそれ
ぞれが、対応する分析物に特異的に結合する様に構築さ
れている請求項10の光学基材。 - 【請求項１２】光応答性結合部分および捕獲分子を共有
結合できるタンパク質結合部分を有する架橋剤をさらに
含み、該架橋剤が、アリールアジド、フッ素化アリール
アジド、およびベンゾフェノンからなる群から選択さ
れ、該架橋剤が、前記光応答性結合部分を介して前記被
覆に共有結合する請求項10の光学基材。 - 【請求項１３】前記架橋剤の前記タンパク質結合部分を
介して前記被覆区域に共有結合された１種類以上の捕獲
分子種をさらに含み、該１種類以上の種のそれぞれが、
対応する分析物に特異的に結合する様に構築されている
請求項12の光学基材。 - 【請求項１４】前記被覆が、一般式 （PEO）ｘ（PPO）ｙ（PEO）ｚ （式中、PEO＝ポリエチレンオキシドおよびPPO＝ポリプ
ロピレンオキシドであり、ｘ、ｙおよびｚのそれぞれが
約30〜約150である） を有するブロック共重合体である請求項10、12又は13の
光学基材。 - 【請求項１５】前記捕獲分子のそれぞれが、それぞれの
中に反応により配置されたチオール基を有し、および前
記捕獲分子が該チオール基を介して前記被覆に結合され
る、請求項12又は14の光学基材。 - 【請求項１６】前記架橋剤がベンゾフェノンマレイミド
である請求項12又は14の光学基材。 - 【請求項１７】前記光学基材が、シリカ系材料であり、
および前記光学表面と前記被覆の間で前記区域に塗布さ
れた下塗りをさらに含み、該下塗りが、少なくとも１個
の反応性シリル基を有するシリカ親和性剤を含む請求項
10、12又は16の光学基材。 - 【請求項１８】請求項10の光学基材の製造方法であっ
て、光学基材の区域を、ポリメタクリロイル重合体から
なるヒドロゲル、アビジン、メトキシポリ（エチレング
リコール）トリメトキシシラン、および本質的に親水性
残基からなる少なくとも１種の親水性重合体ブロックに
隣接する、本質的に疎水性残基からなる少なくとも１種
の疎水性重合体ブロックを含むブロック共重合体、から
なる群から選択された被覆で被覆する工程を含む方法。 - 【請求項１９】光応答性結合部分および捕獲分子を共有
結合できるタンパク質結合部分を有する、アリールアジ
ド、フッ素化アリールアジド、およびベンゾフェノンか
らなる群から選択された光親和力架橋剤を用意する工
程、 該被覆した光学表面を、該光応答性結合部分を活性化す
るのに適した光で照射する手段を用意する工程、および 該照射手段を操作し、該被覆した光学表面を該架橋剤の
存在下で照射し、該光応答性結合部分を活性化し、それ
によって該架橋剤を該被覆に共有結合させる工程 をさらに含む請求項18の方法。 - 【請求項２０】対応する分析物を特異的に結合する様に
それぞれ構築され、分子内にそれぞれ反応により配置さ
れたチオール基を含む１種類以上の捕獲分子種を用意す
る工程、および 該捕獲分子を、該チオール基を介して前記被覆に結合さ
せる工程 をさらに含む請求項18又は19の方法。 - 【請求項２１】対応する分析物を特異的に結合する様に
それぞれ構築された１種類以上の縁部分子種を用意する
工程、および 該捕獲分子を、前記架橋剤の前記タンパク質結合部分に
結合させる工程 をさらに含む請求項19の方法。 - 【請求項２２】複数の縁部分子種を用意し、前記照射手
段を用意する工程が、前記導波管の前記被覆区域の複数
の部分を個別に順次照射する手段を用意する工程を含
み、および前記照射工程が、前記被覆区域の前記部分を
前記架橋剤の存在下で選択的に順次照射する工程である
請求項21の方法。 - 【請求項２３】前記縁部分子を前記架橋剤に結合させる
前記工程が前記照射工程の前に行なわれる請求項21また
は22の方法。 - 【請求項２４】前記の個別に順次照射する工程が、 遊離架橋剤の存在下で前記被覆区域の前記部分の一つを
照射する工程、 前記縁部分子種の１種類を前記架橋剤に結合させる工
程、および 部分を前記照射する工程および縁部分子の１種を結合す
る工程を交互に繰り返す工程 を含み、該交互に繰り返す工程が、前記部分のそれぞれ
に対して前記複数の種と異なった種で行なわれる請求項
22又は23の方法。 - 【請求項２５】分析物に特異的な縁部分子を光学基材に
結合させ、該分析物が該縁部分子に結合することによ
り、試料中の該分析物の存在に対応する蛍光信号を発生
させる固相蛍光免疫検定を行なう方法であって、 請求項１のバイオセンサーを用意する工程、 半円筒形レンズを通して導波管中に光線を送る様に配置
された光源を用意する工程、 導波管表面と平行なかつ導波管表面から離れた面上に当
たる蛍光を検出するために配置された検出手段を用意す
る工程、 表面上に固定した縁部分子を有する該導波管表面を、緩
衝液、分析物の存在下で該捕獲分子に結合することがで
きかつ光線で刺激したときに蛍光信号を放射できる複数
のトレーサー分子、および未知量の分析物分子を含む溶
液と接触させる工程、 該導波管表面と該接触溶液とを維持し、該トレーサー分
子を該分析物分子および該捕獲分子と結合させる工程、 光源を作動させ、該導波管から消失性光を発生させ、該
トレーサー分子を刺激する工程、 検出手段を作動させ、該トレーサー分子から放射された
該蛍光信号を検出する工程、および 該放射された蛍光信号を解析し、試験試料中の分析物の
量を決定する工程 を含むことを特徴とする方法。 - 【請求項２６】前記導波管バイオセンサーを用意する工
程において、前記導波管が請求項10、11または12の光学
表面を有し、前記用意された検出手段が、複数の光検出
器素子および被覆区域の複数の部分からの光を該光検出
器素子のそれぞれ対応する部分に向ける方向に配置され
たレンズ手段を含む請求項25の免疫検定方法。 - 【請求項２７】結合していないトレーサーを前記表面か
ら洗い流すための洗浄工程なしに行なわれる請求項25の
免疫検定方法。
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/064,608 US5512492A (en) | 1993-05-18 | 1993-05-18 | Waveguide immunosensor with coating chemistry providing enhanced sensitivity |
| US7157993A | 1993-06-02 | 1993-06-02 | |
| US064,608 | 1993-06-02 | ||
| US071,579 | 1993-06-02 | ||
| PCT/US1994/005567 WO1994027137A2 (en) | 1993-05-18 | 1994-05-18 | Apparatus and methods for multianalyte homogeneous fluoroimmunoassays |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08510331A JPH08510331A (ja) | 1996-10-29 |
| JP3426602B2 true JP3426602B2 (ja) | 2003-07-14 |
Family
ID=26744692
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP52581094A Expired - Fee Related JP3426602B2 (ja) | 1993-05-18 | 1994-05-18 | 多分析物均質蛍光免疫検定用の装置および方法 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0700514B1 (ja) |
| JP (1) | JP3426602B2 (ja) |
| AT (1) | ATE209782T1 (ja) |
| AU (1) | AU704947B2 (ja) |
| CA (1) | CA2162996C (ja) |
| DE (1) | DE69429262T2 (ja) |
| DK (1) | DK0700514T3 (ja) |
| ES (1) | ES2169079T3 (ja) |
| WO (1) | WO1994027137A2 (ja) |
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