JPS6138563A - 免疫検定装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 １９８４年５月１日にランス　エイ　リオツタ（Ｌａｎ
ｃｅ　Ａ、　Ｌｉｏｔｔａ）に発行された米国特許第４
．４４６．２３２号明ＩＩＩ書は、酵素免疫検定法に関
し、酵素結合免疫吸収検定法（ＥＬＩＳＡ）についての
稀釈および洗浄工程を必要とせず且つ培養時間が短い改
良法といわれている。この検定法は乾燥して積層した試
験ストリップの形状をしており、試験流動体に直接ｍ露
されると呈色反応を行うものである。この呈色反応は肉
眼的にまた分光光度計のような機器で読み取ることが出
来る。

上記特許明細書に記載されているように、検定装置は３
種の別個な層、すなわち（１）酵素を結合した抗体を含
む第一（外）層、（２）固定された抗原を含む第二（中
間）層および（３）結合された色形成試薬すなわち酵素
と反応して色を生成する材料を含む第三層で構成されて
いる。

簡単に云えば、検定装置は下記のよう、に作用する：試
料中の抗原は第一層中の酵素結合抗体と結合し、こうし
て形成した抗体−抗原複合体は第二層を通って第三層へ
拡散し、酵素標識は呈色試薬と反応して検出可能な信号
を生成し、第一層中の未結合の酵素結合抗体は第二層へ
拡散してその層中の固定された抗原と結合し、第三層中
へ拡散するのを防止する。

従って、この検定法は本質的に、試料中の抗原が酵素結
合抗体を第三層に到達させて呈色し得るようにする能力
に基づいている。定ｍ効率を最高にするには、第三層中
の抗原と反応する抗体はこの第三層に到達し且つ第二の
固定された抗原を含む層に「固定され」ないようにする
のが最適である。

上記検定法には、特許明ａＳに記載さ“れているように
検定法として明確な利点があるが、定囲的試！！！結果
を供するこの特許明ｉ目記載の方法の効率は、未だ遊離
の結合部位を有している第一層中の抗原と反応した抗体
が、第二層中の固定された抗原に結合できるようになっ
ていて、取り込まれてしまい、第三層には到達せず、第
三層中で生成する色信号には寄与しないので、かなり低
下する。

本発明は、ある意味において、米国特許第４．４４６．
２３２号の要旨についての改良であると云うことが出来
、本発明の本質は、上記問題点を取り除くことにより検
定法の効率を向上させて、検出可能な信号の但が試料中
に存在する測定対象物の母の関数である検出可能な信号
を供することである。しかしながら、色を生じさせるの
に酵素ラベルを用いることに限定されないという点で、
幾分広汎である。

発明の詳細な説明 本発明によれば、上記検定法は第一層中の抗体の代わり
に酵素または他のラベルを結合したＦａｂフラグメント
を用いることによって著しく改良される。

１里」」１１虻匙里 上述のように、米国特許第４．４４６．２３２号は、イ
ーライザ（ＥＬＩＳＡ）による酵素標識検定法について
、それを使用する時に稀釈や洗浄工程を必要とせず、培
養時間も短くて済むような改良に関する。この検定法は
、乾燥した積層試験ストリップの形状をしており、試験
流体に直接に暴露される時呈色反応を形成する。このス
トリップは、定Φに要する稀釈工程を自動的に行い、結
合抗体を遊離抗体から分ｌ１１ｔ′？ｉる。呈色反応は
、肉眼的にまたは分光光度計のような曙器で読みとるこ
とが出来る。更に、この反応は、ストリップ状に組み立
てて、尿中の薬物やホルモンのような抗原を迅速に検出
する浸しスティック（ｄｉｐ　５ｔｉｃｋ）として用い
ることも出来る。特別な応用例は、薬物の過剰投与の迅
速な検出または家庭での妊娠試験としてのものである。

この特許明ｍ書に説明したように、−面では本発明は、
第一の領域が抗原とこれらの抗原と免疫学的に反応する
ことが出来る酵素を結合した抗体とを含み、抗体が第一
の領域を通過する抗原と反応する時には第一の領域から
除去されるが、かかる抗原が存在しない時には第一の領
域から除去されないように第一の領域に配置され、第二
の領域は酵素を結合した抗体と反応してこれらの杭体の
存在を示す色形成反応を生じることが出来る物質を含む
ことを特徴とする、抗原の存在を測定する装置に一関す
る。

もう一つの面では、本発明は生物学的流体中の抗原の存
在を測定する独特の方法であって、抗原とこれらの抗原
と免疫学的に反応することが出来る酵素を結合した抗体
とを含む第一の領域であって、抗体がこの第一の領域を
通過する抗原と反応する時には第一の領域から除去され
るが、かかる抗原がない時には第一の領域から除去され
ないように配置されているものど、酵素を結合した抗体
と反応して抗体の存在を示す色を形成する反応を生じる
ことが出来る材料を含む第二の領域とを有する装置に流
体を接触させ、流体を装置または゛マトリックスに浸透
させ、第二の領域において色の変化の有無を観察するこ
とにより、この試験の１題である流体中の抗原の有無を
測定する方法に関する。

米国特許第４．４４６．２３２号明ｔｉＡ書の第一図は
、本発明を示している。この図面とその説明とから分か
るように、装置は三種の別個な層、すなわち可溶性酵素
を結合した抗体を含む第一・層と、結合された抗原を含
む第二層と、酵素と反応して色を生じる物質を含む第三
層とから構成されている。

操作時には、試験する抗原を含む流体試料を、第−廟と
接触さ眩て配置する。試験試料中の遊離抗原は、第二層
中へ、続いて第三層中へと拡散する。試料中の遊離抗原
は、第二層中の固定された結合対照抗原と店抗して酵素
を結合した抗体と結合する。酵素を結合した抗体がＴＩ
離の抗原と結合すると、第三居中に自由に拡散して呈色
反応を生じる。流体試料が抗原を含まない時には、酵素
を結合した抗体は総て、遊離の結合位置を、有して、第
二層の固定されていない抗原と結合する。第二層中の固
定された抗原と結合する酵素を結合した抗体は第三層中
に拡散せず、呈色反応は生じない。

分解される基質の量（および生じる色の強度）の差は、
試験試料中の抗原の量に比例する。第一層中の酵素を標
識した抗体について、第二層中に存在する対照抗原のｍ
によって装置の感度を決定する。通常は、試験装置は、
それぞれ異なる世の抗原を有する一連のサンドイッチ複
合体を含む。一連の対照抗原の濃度は、計測される試ｗ
Ａ溶液に好適な感度範囲に屋るように予め決定しておく
。

米国特許第４，４４６．２３２号明ＩＩＩＩ書の記載に
よって要約すれば、酵素を標識した抗体は上層に分散さ
れ、この抗体に対する抗原は第二層に固定され、抗体上
の酵素標識によって活性化される色形成化合物は第三層
に見い出される。抗原を含む試験試料を上層に加えると
、この試料はその層中の対応するｍの酵素を結合した抗
体と反応して、反応混合物は拡散によって第二層へ移行
する。

上記特許の目的によれば、反応混合物は第三層から第三
層へと継続して所望な色信号を形成するものでなければ
ならない。しかしながら、この反応混合物は遊離の結合
位置を有している抗体の大半を含んでいるので、第二層
中の固定された対照抗原に結合して、トラップされてし
まう。換言すれば、上記特許明ｍ書に記載のように、第
二層中の固定された抗原と結合する酵素を結合した抗体
は、第三層中へは拡散しない。

従って、第一層中の試料抗原と完全に反応した抗体だけ
が第二層を通過して第三層へ到達して、発色性物質を活
性化することが出来、色を生じるということを理解覆る
ことが重要である。こうして生じた色信号は試験試料中
に存在した抗原の最に直接比例すると言われているが、
より正確には、生成する色信号は実際には第三層へ拡散
する酵素を結合した抗体の帝に直接的に比例すると言う
ことが出来る。

本発明は、上記特許の装置において抗原−抗体の２＝１
複合体を形成する必要性をＬ！ｌ！解することによって
開始されたと言うことが出来る。唯一個の抗原分子と反
応した抗体は、未だフリーの結合位置を有しており、第
二層中においてトラップされ得る。従って、重要な信号
の多くが失われる。

第１図は、３段階（２）、（ハ）および（ハ）を順に模
式的に示している。上記問題は最適の色信号を生じてい
る。

図示したように、成分１０は、酵素を結合した抗体１４
の最上層１２と、固定された゛抗原１８の中間層１６と
、発色性物質２２の下層２０とから成っている。［問題
点を説明する簡略化のために、部分図では、存在する試
薬１４．１８および２２の数個だけを示している。］ 第１＠図では、抗原２６を含む試料２４を、例えば適当
な延展機成分などによって最上層１２に加える。

色生成反応の初期段階と考えられる第１（ハ）図では、
試料中の抗原は最上層１２中の抗体と免疫学的に反応す
る。図示したように、生成する複合体２８の中の二つは
抗体の結合位置の一方だけに結合した抗原を有し、三種
の一つだけが両方の結合位置に抗原を有する複合体３０
を供する。

一連の順序の次のまたは最終段階を示す箱体（４図に示
すように、遊離の利用し得る結合位置を有する複合体２
８は、層１６においてトラップされ、Ｍｌｌｌの結合位
置は層１６における対照抗原と免疫学的に反応する。従
って、理論的には層２０へ拡散して発色性物質２２と反
応する３種の図示した酵素を結合した抗体の中、層１２
における反応からの唯一種の複合体３０だけが実際に、
色信号を生成する層２０において所望な目的を達成する
。

説明のために三種の図示した抗体の中の二種だけが中間
層でトラップされ、色信号の強度に寄与づる目的を達成
し得なくなり、実際上問題は強度の悪さの程度にあると
考えられる。

計算によれば、実際的な条件下では、上記のようにこの
損失は理論的な信号の大半に達する。

代表的な抗体−抗原反応の会合速度定数は、１０　から
１０　・トモルート 抗原の現実的な検出下限（＜１０’モル）に対して、合
理的な反応時間を想定して大過剰の抗体を用いなければ
ならない。下記の計算は、かかる条件下では平衡混合物
における１：２複合体の両分は非常に小さい。

第一層中の酵素を結合した抗体に比較して過剰の試料抗
原を用いると、１：２？Ｉ合体を形成することが出来る
と考えられる。しかしながら、明確な結果を得るには高
濃度の抗原を必要とするので、このことはまた検定法に
おける低感度をも意味する。

１：１６よび１：２抗原−抗体複合体が形成される反応
は、次の順序で記載される。

Ｋ。

反応は溶液中で起こり、所定の結合定数に対する平衡状
態は計算機で計算することが出来る。抗体−抗原反応に
対する代表的な結合定数は、Ｋ＝１０の程度である。従
って、この定数を計算の基礎とすることが出来る。また
、結合定数は両反応に対して同じであると仮定すること
も出来る。

［しかしながら、より高い結合定数を用いてもこれらの
結果は極僅か（１％以下）しか変化しない。

＠１層における抗体の濃度は、試験抗原の下限よりも十
分過剰ｍにして、合理的な反応時間と試験の良好なダイ
ナミックレンジを確保するようにしなければならない。

抗原の下限を１０−９モルとして１００倍から１．００
０倍過剰ｍの抗体について計算し、その結果を下記の第
１表に示す。

第１表二　上層の総抗体ｍに対する平衡条件。

１ｘ　１０　　１ｘ　１０　　　　０．９９　ｘ　１０
　　　　０．００１ｘ　１０’３ｘ１ｏ−９ｎ　　　　
　　　　　　−９２、９８　ｘ　１０　　　　０．００
９ｘ　１０’５ｘ　ｉｏ−９ｉｔ　　　　　　　　　　
−９４、９５　Ｘ　１０　　　　０．０２５ｘ　１ｏ−
９１０Ｘ１０’　　Ｈ　　　　　　　　　　’９、８２
　ｘ　１０　　　　０．０９７ｘ　１０’３０×１０−
９〃−９ ２Ｂ．００　ｘ　１０　　　　０．８３０ｘ　１０’５
０ｘ　１ｏ−９ｒｔ　　　　　　　　　　−９４６、０
０　ｘ　１０　　　　２．２２０ｘ　１０−９１Ｘ　１
０　　１Ｘ　１０　　　０．９７　Ｘ　１０　　　０．
００９Ｘ　１０−９３ｘ１０−９ｕ　　　　　　　　　
　−９２、８１　ｘｌｏ　　　　０．０８１ｘｌＯ’５
Ｘ　１０＝　　・　　　　　　　　　−９４、５０　Ｘ
　１０　　　０．２１５ｘ　１ｏ−９１０ＸＩＯ’　　
ＩＩ　　　　　　　　　　−９８、３６　ｘ　１０　　
　０．７７３ｘ　１０−９３０Ｘ１０’　　ＩＩ　　　
　　　　　　’１９、５０　Ｘ　１０　　　　５．　１
００Ｘ　１０−９５０Ｘ１０’　　ｎ　　　　　　　　
　　’２６、６０　ｘ　１０　　　１１．４００ｘ　１
０’これらの結果は、殆ど総ての抗原が１：１複合体中
にトラップされ、上記のように信号を生成しないという
ことを明確に示している。極僅かの両分だけがトラップ
されずに第二層を通過することが出来る２：１複合体を
形成して、第三層において色を生じる。使用される抗体
の過剰量が高くなれば、この両分（約０．１％対約１．
０％）は低くなる。しかしながら、他方では、抗体過剰
量を減少させると逆に抗体を含む層における反応が不十
分であるので信号が減少してしまい、試験ダイナミック
レンジを損失または減少させることになる。

上記装置で考えられるもう一つの固有の問題は、二価の
抗体が大過剰であるために上層が膠質化する可能性があ
ることでＳ　ｉｚ　、　１１ｓかる」■ヒによって、更
に信号が損失することになる。

上記討論は、平衡条件が上層（抗体）中で１ｒ′＃られ
るということを仮定している。しかし、これは必ずしも
正しくはない。抗原−抗体反応についての通常の会合速
度は、１０５から１０６１・モルート秒−１程度である
。このことは、上層中のｌＸ１０−７モルの抗体濃度に
対しては、反応時間は第一会合に対して１０から１００
秒程度であることを意味している。抗原濃度は第一反応
によって直ぐに減少してしまうので、２：１複合体の生
成に要する時間はそれよりも１１つと長くなる。時素標
識を含む免疫学的反応生成物は約１０秒から３０秒で第
三層に到達し始めるので、第一層における滞留時間は平
衡を達成するには不十分であることを示している。第１
表に挙げた計算値は信号達成されない。

装置の速度方程式は、計算喋では数値的に解かいる。

このグラフでは、Ｘ軸は時間を秒で示し、Ｙ軸は検定用
の最上図における２：１酵素を標識した１Ｘ１０−７モ
ルであり、平衡濃度は９．９×１ｏ−１２モルである（
第１表参照）。

グラフに示した抗体−抗原結合のそくどに関しては、 であり、 である。

いずれの場合にも、得ることが出来る２：１複合体のほ
とんどは数分以内で生成して、その後曲線は平坦になっ
てしまう。終局的に、はぼ数週間で平衡が達成される。

しかしながら、これは如何なる可能性のある検定法につ
いても、所定の時間範囲内で可能な訳ではない。

それ故、速度論は二種の別個な相を示していることが分
かるであろう。第一の段階では、かなりの量の遊離の抗
原が未だ存在して、初期に形成された１：１複合体と反
応するので、２：１複合体は比較的速く形成される。後
になれば、遊離の抗原の濃度は極端に減少しで（その大
部分は１：１複合体として結合され）、２：１複合体を
形成する反応は非常に遅くなる。従って、特許権者によ
って想定された時間範囲では、速い速度定数を仮定して
も平・衡限界の約１０から２０％が達成されるだけであ
り、遅い速度定数では約１から２％以下しか達成されな
い。

本発明によれば、上記問題点は、最上層における総ての
抗体をＦａｂフラグメントで単に置換することにより著
しく減少させて、感度を大ぎさで３桁程度まで改善する
ことが出来る。

公知のように、ＩＯＧ抗体は例えばパパインによって３
個の７ラグメントに切ＩＩＩスることが出来る。

これらの中の２！ｌ！ａは同じものであり、総抗体の場
合と同じく抗原と免疫学的に結合することが出来る。こ
れらは１１ＩＩ５の抗体フラグメントであり、Ｆａｂ（
ｒ抗原結合性フラグメントＪ　、Ｆｒａｇｍｅｎｔａｎ
ｔｉｇｅｎ　ｂｉｎｄｉｎｇ　）と命名されテイル。第
三（７）７ラグメントは抗原と結合する力を有さず、Ｆ
ｃ結品形で得られる（［結晶化フラグメント」、Ｆｒａ
Ｈｅｎｔ　ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｂｌｅ）と命名され
ている。

一般に、検定される測定対象物に特異的なＦａｂ”フラ
グメントであれば、本発明の実施に用いることが出来る
。しかしながら、Ｆａｂフラグメントに結合する標識は
、発色性物質と反応して色を形成することが出来る酵素
である必要はない。従って、本発明によれば、標識は検
出可能な信号を供することが出来または検出可能な信号
を供することが出来る物質の前駆体である自体公知のも
のでありは如何なるものでもよい。

従って、本発明の新規検定要素は、ｆＩ３図に示した必
須層から成る。図に示された通り、検定要素１０ａは、
試料を加える標識されたＦａｂフラグメント１４ａを含
む第一層１２ａと、最上層において標識されたＦａｂフ
ラグメント１４ａと免疫学的に反応出来る結合抗原１８
の中間層と、試薬２２ａを含む第三層２０ａであってこ
の試薬がこの層へ拡散する標識されたＦａｂ−分析物複
合体と反応して検出可能な信号を供することが出来るも
のどから成り、上記必須層は互いに流動連絡している。

本発明の検定要素は他の層まｌ〔は特定の所望な機能を
果たす要素を含んでもよく、第３図に示した構造体は、
説明のために検定装置の実施に必須の要素のみを含んで
いる。

例えば、上記必須層は、検出可能な信号を識別すること
が出来るようにした適当な透明支持体またはシート（図
示せず）上に配設されていてもよく且つその方が好まし
い。検定要素としては、信号を減じる色を有する全面の
ような液体試料を想定しているので、加えられた試料を
隠す適当な不透明層を層２０ａと層１２ａとの間に配設
するのが好ましい。この不透明層は、白色物質、例えば
二酸化チタンのような顔料を含み、検出可能な信号を観
察しまたは記録するための白色の反射性背景を供するよ
うにするのが好ましい。

特定の所望な機能を行う他の層または要素を備えていて
もよい。更に説明のため、本発明の新規検定装置は、１
９８４年７月１０日出願のアーネスト　ダブリ１　　ロ
ング（Ｅｒｎｅｓｔ　１ＩＩＬｏｒ＋ｏ　）の同時係属
出願用６２９．４４５号明１ｌＩ書に記載され且つ特許
請求されている検定生成物に用いることが出来る。この
同時系属出願明細団記載の検定生成物は、必須成分とし
て検出可能な信号を供する所望な系について説明した検
定要素と、検出可能な信号を得て記録Ｊるための操作条
件に関する印を備えるコード化装置とから成り、この生
成物は次いで複数の異なる検定のためであって且つコー
ド化された装置を読み取って翻訳して特別な検定要素に
ついての適正な処理および記録条件を得るための装置を
備えているアナライザーまたは検出器と共に用いること
が出来る。上記同時係属出願に更に記載されているよう
に、この検定生成物は、一段階拡散転写法の技術分野で
自体公知の型の流体の裂開可能な容器で、その流体が特
定の検定系に所望な少なくとも１種の試薬を含んでいる
ものを備え、裂開時に、その流体内容物が検定成分上ま
たは内の所望な海綿に空けられるようにその容器は構成
され且つ配置されている。

本発明のＦａｂフラグメント上の標識ｒｔｌは、米国特
許第４，４４６．２３２号明細書記載の色を供する酵素
に限定されないので、当業者が考え得る幾つかの態様で
は、用いられる特定の標識と反応して、検出可能な信号
を形成し始めまたは触媒Ｊ゛る試薬を含むことが所望で
あるかまたは好都合であると考えられる。この場合には
、裂開可能な容器は、その内容物をＦ５２０ａに加える
ことが出来るように配置しなければならない。

上記のように、本発明によれば総抗体の代わりに１価の
Ｆａｂフラグメントを用いると、感度が向上し、それに
より信号の大きさが３から４桁程度まで増加する。この
改良は、単純な定性分析法では勿論大した成果ではない
が、測定対象物の検出についての定ｍ分析を意図する場
合は分析法のダイナミックレンジにおいて非常に大きな
改良である。

Ｆａｂフラグメントで置換することによって上記のよう
に改良された信号が供給される理由は、上述の総抗体を
用いる場合の問題点を考察すると容易に明らかになる。

始めに、最上層において形成される信号形成複合体は、
信号を生成する複合体の全潜在力を実所することが可能
な１：１複合体であることが分かるであろう。こうして
形成された１：１複合体は上記の理由によって、中間層
にトラップされるという不都合はない。ｔａｂフラグメ
ントを用いて形成される１：１複合体は遊離の結合位置
を有さないので、第三層へ完全に移行して、生成した信
号の強度に寄与する。

最上層において大過剰のＦａｂフラグメントを用いても
、信号をｎ失したり膠質化したりしない口とが分かるで
あろう。

他の利益も明らかである。第１表から分かるように、総
抗体を用いると、投与量応答曲線は極端に非直線的にな
る。しかしながら、計ｎ殿で計口した下記の第２表から
分かるように、Ｆａｂフラグメントを用いると投与量応
答曲線はほぼ直線的になり、試験の全ダイナミックレン
ジを用いる場合に好都合になる。

第２表 最上層Ｆａｂフラグメントについての平衡条イ１１ｘ　
１０’　　　　１ｘ　１０−６１．００　ｘ　１Ｏ−９
３ｘ　１０’ ２．９９　Ｘ　１０’ ５ｘ　１０−９ ４．９９　Ｘ　１Ｏ−９ １０ｘ　１０’ ９．９９　Ｘｌ０−９ ＳＯｘ　１０’ ４９．９７　ＸＩＯ’ ｌｘ　１０”９１　ｘ　１０づ　　　１．００　Ｘ　１
Ｏ−９３ｘ　１０’ ２．９７　Ｘ１Ｏ−９ ５×１０−９ ４．９４　ｘｌＯ’ １０ｘ　１０’ ９．８９　ｘ　１０’ ５０ｘ　１０−９ ４９．００　ｘ１０’ 速度論的制御における好都合な効果もＦ　ａ　ｂフラグ
メントの使用によって達成される。初期の処理を比較的
速くすることにより信号生成複合体が形成するだけでな
く、上記説明の通り、より高温段のＦａｂフラグメント
を用いることが出来、反応速度を速めることが可能であ
る。

本発明の実施に用いることが出来る特定のＦａｂフラグ
メントは勿論、天然に産するまたは試料中の特定の測定
対象物に免疫学的に特異的な七ノーまたはポリクローナ
ル杭休の有用性によって大きく変動する。抗体からＦａ
ｂフラグメントを１ηる方法は、勿論当業界では公知で
あり、文献に記載されている。

説明のために、上記米国特許第 ４．４４６．２３２８明細書記載の抗体のＦａｂ　７ラ
グメント、すなわちヒトのｈＣＧ　　（ヒト絨毛性ゴナ
ドトロピン）に対するウサギ抗血清およびパーオキシダ
ーゼ抱合抗ＨＢへ（ヒトＢ型肝炎抗原）を用いることが
出来る。その他の有用なＦａｂフラグメントの例として
は、例えば１９８０年１１月２５日にモツシエ　シュバ
ルツベルグ（ＨｏｓｈｅＳｃｈｗａｒｚｂｅｒｇ）に発
行された米国特許第４．２３５．８６９号明ｉ徂記載の
もの、すなわちＦａｂ抗−ｈｌｇＧ　（ヒト免疫グロブ
リンＧ）およびＦａｂ抗−ｈｌｇＭ　（ヒト免疫グロブ
リンＭ）を挙げることが出来る。その他の用いることが
出来且つこうして本発明によって考えられるＦａｂフラ
グメントは、それらの製造と同様容易に明らかになるで
あろう。

上記のように、Ｆａｂフラグメントは、それらの＋Ｉｌ
造と同様公知である。例えばオイゲン　ディ（Ｅｕｇｅ
ｎｅ　Ｄａｙ）の［アドバンスト　イムノケミストリー
（Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
）　Ｊウィリアムアンド　ゥイルキンス　カンパニー（
Ｗｉｌｌｉａｍｓａｎｄ　Ｗｉｌｋｉｎｓ　Ｃｏｍｐａ
ｒ＋ｙ）、１９７２年、８８ページ以後に記載されてい
る。一般的にそれらは、パパイン、トリプシン″ｔ−計
はペブコノンのようなペプチダーゼで消化づ゛ることに
よって製造することが出来る。その他の処理には、還元
、置換例えばアミノブチレーション、カルボキシアルキ
レーションなどがある。生成する１価のフラグメン１へ
は、高度の特異性と完全な抗体の結合定数を保持してい
ることを特徴とする。

更に説明するために、上記米国特許第 ４．２３５．８６９号明細ｍ記載のＦａｂフラグｊント
の製造について説明する。

例１　［米国特許第４，２３５，８６９号明細書□　　
　の例１による］　Ｆａｂ抗−旧ｇＧの製造抗−ｈｔｇ
ａを含む羊血清５０ｍを、飽和の硫酸アンモニウム５０
ｍで沈澱する。生成する沈澱物を次いで、約４８２００
０Ｘｇで約２０分間遠心分離した後、ＰＢＳ　（０，０
４モル　リン酸の食塩溶液、ｐｌ＋７．２）中に再懸濁
する。このタンパク質のＰＢＳ溶液４ｒｄｌ（タンパク
質４００ｄ）を約０ド吃モルシスティンおよび０．０２
モルＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を含むＰＢＳ
７．１３．５９ｍｆ！のＰＢＳおよし　゛りのパパイン
［ジグ？　（Ｓｉｇｍａ１社製、２５　ｍ９　／　ｒｎ
ｌ、　Ｆ’Ｊ　温液０．１６ｍ１！］と混合する。［酵
素を添加する前に基質溶液を約３７℃に加温して、混合
物を温度を３７℃に保ちながら一晩撹拌しながら培養す
る１１Ｎ塩酸でｐ　Ｈを６．５に調整してから、０．０
５５モル　ヨードアセトアミド溶液２ｄを加える。次に
、生成する混合物を室温で５分間培養して、０．０１モ
ル　リン酸、ｐＨ６，５で透析を開始する。生成した僅
かな沈澱は遠心分離によって除去してもよく、次いで生
成する透明な溶液を０．１５モル塩化ナトリウムで透析
する。透析の後、０．２５モル硫酸亜鉛を加えて材料を
１ａＰｌ。

亜鉛が０．０５モルとして、空温で２時間放買する。生
成する沈澱を次に４８．２００ｘｇで２０分間遠心分離
した後、撹拌を行いながらＥＤＴＡナトリウムを徐々に
加えて１％溶液を供する。生成する沈澱を遠心分離によ
って除去して、次に溶液をＰＢＳで透析して約１４７ｍ
ｇという予想収量のＦａｂフラグメントを提供する。

例２　［米国特許第４．２３５．８６９号明細書の例５
による］　Ｆａｂ抗−ｈｌｇＨの製造固形のリン酸水素
ニナトリウムを、抗−旧９Ｈを含む羊抗血消３０ｍに加
えてｐＨを８に調整する。

次に溶液を硫酸ナトリウム中で１８％として、室温で２
０分間保存する。生成した沈澱を遠心分離によって分離
し、１５ｍｅのリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ８に再溶解
する。生成する溶液をｖ濡で遠心分離し、溶液を硫酸ナ
トリウム中で１２％にして、沈澱を遠心分離によって再
度束める。タンパク質沈澱を０．１モル酢酸ナトリウム
緩衝液、ｐＨ５，４に再溶解して、同じ緩衝液で一晩透
析した。

生成する溶液を、（１０，０００ｒｐｍで約３０分間）
遠心分離して透明にする。次いで、生成する混合物を２
．５１ｎｇのパパインを用いて３７℃で約１０時間培養
する。このＵ合物にヨード酢酸ナトリウム（０，Ｉｄ）
を加えて、ｆｆ１ｎ′ｍ度を２．３ミリモルに調整する
。室温で１時間後、溶液をアミコン　　メンブレン（八
ｍ１ｃｏｎ　ｎ＋ｅｔ＋ｂｒａｎｅ）　ＰＭ　１０上で
０．０５モル　リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ３（１５ｄ
）を用いて小さなペプチドを洗浄除去した後、４Ｉｄま
で濃縮する。次いで、生成する溶液を遠心分離により透
明にして、約１８．５ｍ９／ｄという予想収ＭのＦａｂ
溶液を供する。　　　　−上記のように、本発明のＦａ
ｂフラグメントに対する標識は、米国特許第４．４４６
，２３２号記戒の呈色性醇紫標識の何れでもよい。例え
ば、酵素標識は、過酸化水素の存在でジアミノベンジジ
ンまたはｐ−ニトロフェニルリン１１１Ｈのような呈色
試薬と反応して所望な色信号を供する西洋わさびパーオ
キシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼまたはβ−ガラ
クトシダーゼのような試薬でもよい。

検出可能な信号を発する自体公知の標識の一つでもよい
。検出可能な電磁波を発する標識が、特に興味深い。

更に説明のために、標識は蛍光物質または蛍光体として
一般的に知られているクラスのものでもよい。かかる化
合物は大部分が３００　ｎｏ＋以上の光線、理想的には
４００　ｎｌｌｌ以上の光線を吸収し、好ましくは少な
くとも１０３の吸光係数を有し・、最も好ましくは指示
された波長以上で少なくとも１０４の吸光係数を有する
。

蛍光物質として用いられる化合物の例としては、３．６
−シヒドロキシー９−フェニルキーリ゛ントヒドロール
から１５されるフルオレセインを含むキサンチン染料ｄ
５よび３，６−ジアミツー９−フェニルキザントヒドロ
ールから誘導されるローザミンおよびローダミンが挙げ
られる。ローダミンとフルオレセインは、９−ｏ−カル
ボキシフェニル基を有し、９−０−カルボキシフェニル
キサントヒトロールの誘導体である。

蛍光物質として用いられる他の染料には、下記のような
ものがある。

３−フェニル−７−イツシアナトクマリン、９−イソシ
アナトアクリジンおよびアクリジン　方レンジ　Ｎ−（
ｐ−（２−ベンズオキサシリル）フェニル）マレイミド
のようなアクリジン；４−クロｏ−７−ニドロベンゾー
２−オキサ−１，３−ジアゾールおよび７−（ｐ−メト
キシベンタルアミ−ｔ＞−１Ｈ−Ｈトロベンゾ−２−オ
ギサール。

２−ジアゾールのようなベンズオキサジアゾール；４−
ジメチルアミノ−４′−イソチオシアナトスチルベンお
よび４−ジメチルアミノ−４′−マレイミドスチルベン
Ｎ、Ｎ−ジオクタデシル　オキサカルボシアニン　ｐ−
ｔ−ルエンスルホナートのようなスチルベン；８−ヒド
ロキシ−１，３，６−ピレントリスルボン酸および１−
ピレン酪酸のようなピレン：メロシアニン５４０のよう
なメロシアニン；ローズ　ベンガル；２，４−ジフェニ
ル−３（２Ｈ）−フラノン；サイアニン；アントラキノ
ン；ポルフィリン；トリアリールメタンなど。

その他のクラスの有用な標識は、他の化合物または活性
化剤の存在で発光する発光化合物である。

ルミネッセンスは、化学反応の結果である可視または非
可視光線の放出として単純に定義される。

化学ルミネッセンスにおいては、励起状態で分子を生じ
るエネルギー源は化学反応のエネルギーであり、励起状
態から基底状態への減衰は光の放出（ルミネッセンス）
によって行われる。最も興味深いルミネッセンスの型は
、化学ルミネッセンスおよび生物ルミネッセンスである
。後者は、生物系に見られる化学ルミネッセンスの特殊
な形に与えられた名称であり、触媒性タンパク質が発光
反応の効率を増加させる。

溶液での有機的化学ルミネッセンスのＩＩ　惜は、次の
３段階を有するものとしてまとめることが出来る： （１）キー中間体を供する予備反応；（２）キー中間体
の化学エネルギーを励起エネルギーに転換する励起段階
；および（３）化学反応で形成された励起生成物からの
光の放出。蛍光化合物を加えて化学発光を増進させる反
応では、効率的なエネルギー遷移が起こり、生成するル
ミネッセンスは「増感された化学ルミネッセンス」とし
て知られている。

化学発光反応系は、上記段階（１）と同様にキー中間体
を生成する予備反応によって生成させることが出来る酸
化体（通常は過酸化水素）を必要とする。それらはまた
、例えばミクロペルオキシダーゼ、ヘム、ヘモグロビン
またはコバルトのような触媒をも必要とする。更に、そ
れらは、触媒の効果によってキー中間体（例えば過酸化
水素）から励起エネルギーを受は取る化学発光源性化合
物を必要とする。化学発光源性化合物が高エネルギー励
起状態から基底状態へ戻る時、エネルギーの放出は検出
可能な光の形になっている。

検定法において標識として有用な化学発光化合物の例と
しては、５−゛アミノー２．３−ジヒドロ＝１．４−フ
タルアジンジオン（ルミノール）、６−アミノ−２，３
−ジヒドロフタルアジン−７゜４−ジオン（イソルミノ
ール）、ルミノールのアニールした類似体などのジアシ
ルヒドラジド；ルシゲニン（硝酸ビス−Ｎ−メチルアク
リジニル）、アクリジニウムフェニルカルボキシラード
などのアクリジニウム塩；ビス（トリクロロフェニル）
オキザレートのようなジアリールオキザレートが挙げら
れる。

各種の発光免疫検定法、発光酵素免疫検定法、発光補因
子免疫検定法および発光酵素多重（ｅｎｚｙｍｅ−ｍｕ
　ｌ　ｔ　ｉ　ｏ　Ｉ　ｉ　ｅｄ　）免疫検定法は総て
文献に報告されており、検討の必要はない。一般的に、
本発明によるＦａｂフラグメントに結合させることが出
来る知られた技術の状態からの発光標識は、当業者には
明らかである。例えば、Ｆａｂフラグメントに対して有
用な標識としての米国特許第４．２３５．８６９号明細
書記載の化学発光化合物のリストを用いてもよい。

更に説明すれば、色形成試薬と反応して色を生成するペ
ルオキシダーゼ酵素は、米国特許第４．４４６．２３２
号１！１１細書の例１に記載のように、標準過酸化物法
によって例１または２に示したＦａｂフラグメントに抱
合され、通常の方法により抱合体を精製してもよい。

上記米国特許第４．２３５．８６９号明細書からの下記
の例は、本発明による標識されたＦａｂフラグントの製
造を説明する。

例３　［米国特許第４．２３５．８６９号明細日の例２
による］フルオレセインイソチオシアナート標識Ｆａｂ
抗−ｈｔｇｃの製造１例１で製造した３　ＦＢｈ抗−１
′！　！！７Ｑ溶液４．７４　ヲ１，１ン酸−水素カリ
ウムで９１ｍ８．７５に調整する。次に１．４ｄのフル
オレセインイソチオシアナートを加え、混合物を室温で
２時間放置する。次に、混合物を分離して、０．０５モ
ル　リン酸塩、ｐｌ＋８　（０，０５％ナトリウムアジ
ド）を用いて平衡にする。次に、（特徴的な黄色を有す
る）アリール両分を集めて、フルオレセインを標識した
Ｆａｂを供する。

例４　［米国特許ｍ４．２３５．８６９号明細書の例５
による］フルオレセイン標識ｊａｂ抗−ＩＩＩ（ＩＧの
製造 例２で製造したＦａｂ溶液２ｍに固形の炭酸ナトリウム
を加えることによって、ｐＨ９，０に調整する。１．５
＃Ｉ！？のフルオレセイン　イソチオシアナートを０．
１ｄの乾燥ジメチルホルムアミドに溶解したものを、室
温で３０分間を要して撹拌しながら徐々に加える。更に
２時間復に、溶液を遠心分［１で簡単に４透明にして、
セファデックスＧ−２５のカラムに分離のために加えて
、ｐＨ８，０の０．０５モル　リン酸カリウムで平衡に
することが出来る。次いで、黄色のフルオレセインを標
識したＦａｂ（最初の溶出帯）を集める。

有用なＦａｂフラグメントと標識の上記説明と検討の点
から見て、当業者は本発明の有用な態様の製造を容易に
理解することが出来る。しかしながら、本発明は特定の
試薬の使用を意図するものではなく、添付図面に関して
記載した必須層の配置を目的と１−るものであることを
強調する。

従って、ある意味では、本発明はＦａｂフラグメントを
総抗体の代わりに用いてより効率的な信号を供するとい
う意味において、米国特許第４．４４６．２３２＠明細
書記載の検定装置についての改良であるということが出
来る。

米国特許第４，４４６．２３２号明ｍ書は色を生成する
ことが出来る酵素標識だけを記載しているので、別の意
味では本発明は米国特許第４．４４６．２３２号明４ｌ
ｍに記載された発明に比較して、本発明の目的について
放出される検出可能な信号の種類は重要でないという点
で広汎である。従って、免疫検定法で従来から用いられ
てきたもののような自体公知の標識であればどのような
ものでも、本発明が意図するものである。

総抗体からのＦａｂの製造と逆にそれらの選択された標
識との抱合は、当業者の判断と知識内の日常的な分析処
理を含んでおり、それ自体本発明の部分を構成するもの
ではない。しかしながら、説明のために、適当な標識を
したフラグメントを製造するための処理法を上記米国特
許第 ４．２３５，８６９号および第 ４．４４６，２３２号の明細ｍから「借用」した。

第３図に示した必須層の製造は、例えば適当な厚み、マ
トリックスなどについて米国特許第４．４４６．２３２
号明細書における類似の層の製造に従えばよい。

一般的には、特許明細書に記載のように、層１２ａ、１
６および２０ａは総て試料流体が容易に浸透することが
出来る多孔性マトリックスから成っている。これらの層
を製造するのに好適な材料は、当業界によく知られてい
る。それらは、例えばニトロセルロースまたはジアゾベ
ンジルオキシメチル（ＤＢＭ’）紙のような編まれた繊
維を含む。二１〜ロセルロース紙は直接的にタンパク質
を結合し、抗原を固定するのに有用であることが示され
ている。ＤＢＭマトリックスは、ＤＮＡ。

ＲＮＡおよびタンパク質を結合する。更に、例えばポリ
アクリルアミド、アガロースまたはコラーゲンのような
多孔性ゲルを用いることが出来る。

層１６中の抗原はゲルの孔内にトラップされ、または抗
原のアミノ基とマトリックス上のカルボキシル基によっ
てゲルに交差結合させることが出来る。

更に、セルロースまたはプラスチック１Ｍ維マトリック
ス内にトラップされた結合した抗原を含む粒子またはビ
ーズを利用することが出来る。例えば、！ｔ！ｉ６に対
してペプチド結合で表面に結合された抗原を有する直径
が５から１０ミクロンのポリアクリルアミドビーズを用
いてもよい。ビーズは孔の大きさが１から２ミクロンの
セルロースフィルターマトリックス内にトラップされる
。

標識は実施者または臨床家の希望または意図に従って変
動するので、１ｆｆ１２ｏａ中の試薬２２ａは正確に定
義することは出来ない。如何なる場合にも、試薬２２ａ
は拡散した標識されたＦａｂ−分析物複合体から信号を
生成させるのに必要な試薬または試薬の組合せから成り
、この試薬または試薬の組合せの選択は当業者には」−
分にＬ！ｌ！解されている。

上記および米国特許第４，４４６．２３２号明１Ｍ書に
記載のように、試薬２２ａが酵素５！識と共に用いて色
信号を生成する色形成体である場合には、標識は西洋わ
さびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−
ガラクトシダーゼなとでよい。１凹方、ｍ識が反応して
電磁放ｒＡ線を放出するものである場合は、試薬２２ａ
は自体公知の技術により信号を出す反応またはエネルギ
ー遷移に必要な酸化体、触媒などである。

３）！の必須層の厚みは決定的なものでｔよなく、それ
らの中に含まれる選択された成分の比率によって勿論変
動する。一般的には、ｖ４ａ体は勿論出来るだけ薄くす
べきである。

上記説明は本発鳴の実施に必要な要素を構成するが、説
明のための第３図に示された１要素、すなわち抗体とし
て示されるｌＩ２０ａの試薬３４については、未だ記載
していない。

米国特許第４．４４６．２３２号ｌ１ｌＩＩＩｌｌ書に
記載されたものと同様、上記型は、第三層（図面の層２
０ａ）には媒染剤を有していない。これがないと、信号
が更に損失するごとがある。この層に直接拡散するため
の起動力はない。従って、標識された複合体は層中で平
衡になり、完全には使用されない。拡散する標識された
複合体例えば酵素を標識した複合体に対する媒染剤を使
用すると、明らかな利益があり、ファクターで約３まで
の信号における（り得を期待することが出来る。拡散す
る複合体を結合または固定することが出来る媒染剤をこ
の目的に用いることが出来るが、例えば分析体上の遊離
の結合位置と免疫学的に反応することが出来る抗体が知
られており且つ好ましい。従って、媒染剤３４は、抗体
としての説明のために示される。

上記検定ｖｔ置および米国特許第 ４．４４６．２３２号明細書記載の装置の信号生成層に
おいて！１１！染剤を用いるという概念は、本出願人等
の同時係属出願第（）号の 、主題である。

本文記載の発明の範囲から離反することなくある程度の
変更が可能であるので、本文に記載されまたは添付図面
に示された総ての事項は説明のためのものであり、限定
的な意味のものではないと解釈すべきである。

【図面の簡単な説明】 第１図は、米国特許第４．４４６．２３２号明細日記載
の発明による色信号の形成を段階的に示す部分拡大模式
図であり、 第２図は、計算磯で数値的に解かれＩζ第１図の装置の
速度方程式を示すグラフであり、第３図は、本発明によ
る改良された検定装置の模式図である。 １０：要素 １２：最上層 １４：酵素を結合した抗体 １６：中ｌ２ｉＩ層 １８：固定された抗原 ２０：下層 ２２：発色性物質 ２４：試料 ２６：抗原 ２８：複合体 ３４：媒染剤

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. （１）液体試料中の測定対象物の存在を測定する検定装
   置において、 固定化対照抗原と、検出可能な信号を供する物質を形成
   する前駆体が載つている検出可能な信号を供する標識を
   結合させたＦａｂフラグメントとを含む第一の領域、こ
   の標識されたＦａｂフラグメントは測定対象物および対
   照抗原と免疫学的反応することが出来、標識されたＦａ
   ｂフラグメントが、上記第一の領域を通過する測定対象
   物と反応する時には上記第一の領域から除去されるが、
   測定対象物がない時には上記第一の領域から除去されな
   いように上記第一の領域に設置されており、上記標識さ
   れたＦａｂフラグメントと上記測定対象物との反応生成
   物が上記第一の領域から除去された後に通過し、且つ上
   記標識またはその反応生成物が上記検出可能な信号を出
   す第二の領域とから成る、上記装置。
2. （２）標識は酵素である、特許請求の範囲第１項記載の
   装置。
3. （３）酵素標識は反応して、色を生成することができ、
   第二の領域は酵素標識と反応して検出可能な信号として
   色を生成することが出来る材料を含む、特許請求の範囲
   第２項記載の装置。
4. （４）物質は蛍光体または化学発光物質から成り、第二
   の領域は上記物質と反応して、検出可能な信号として可
   視光線を出しうる試薬を含む、特許請求の範囲第３項記
   載の装置。
5. （５）測定対象物は少なくとも一種の抗原から成る、特
   許請求の範囲第１項記載の装置。
6. （６）試料中の測定対象物の存在を測定する検定用生成
   物であつて、装置が、順に次の必須層、すなわち 検出可能な信号を供するかまたは検出可能な信号を供す
   る物質を形成する前駆体であるラベルを結合させた可動
   性または拡散可能な、Ｆａｂフラグメントを含む第一層
   と、 固定化対照抗原を含む第二層であつて、上記Ｆａｂフラ
   グメントは測定対象物および対照抗原と免疫学的に反応
   可能であるものと、および 測定対象物と標識されたＦａｂフラグメントとの反応生
   成物が拡散することが出来且つ上記標識またはその反応
   生成物が上記検出可能な信号を出すことが出来る第三層
   から成り、上記必須層が互いに流動連絡しており、上記
   第一層の表面に加えられた液体試料が上記第三層へと浸
   透することが出来るようになつていることを特徴とする
   、上記検定用生成物。
7. （７）液体試料を第一層の表面に加える要素を備えてい
   る、特許請求の範囲第６項記載の生成物。
8. （８）必須層は上記第三層に最も近接して設置された透
   明な支持体上に担持されており、それにより検出可能な
   信号を識別することが出来る、特許請求の範囲第６項記
   載の生成物。
9. （９）測定対象物は少なくとも一種類の抗原を含む、特
   許請求の範囲第６項記載の生成物。
10. （１０）標識は酵素から成る、特許請求の範囲第６項記
    載の生成物。
11. （１１）酵素標識は反応可能であつて色を生じ、第三層
    は酵素標識と反応可能な発色材料を含み、検出可能な信
    号として上記色を生じる、特許請求の範囲第１０項記載
    の生成物。
12. （１２）標識は第三層で試薬と反応可能で、検出可能な
    信号としての輻射線を生じる物質である、特許請求の範
    囲第６項記載の生成物。
13. （１３）輻射線を生じる物質は蛍光体から成る、特許請
    求の範囲第１２項記載の生成物。
14. （１４）物質は化学発光物質である、特許請求の範囲第
    １２項記載の生成物。
15. （１５）液体試料中における測定対象物の存在の測定法
    において、 （ａ）この液体試料を特許請求の範囲第１項から第５項
    のいずれかに記載の装置の第一の領域と接触させ、 （ｂ）上記液体を上記装置に浸透させ、 （ｃ）上記第二の領域で放射される検出可能な信号の有
    無を測定することにより、上記液体試料における測定対
    象物の有無を測定することを特徴とする、上記測定法。
16. （１６）液体試料中における測定対象物の存在を測定す
    る方法において、 （ａ）液体試料を特許請求の範囲第６項から第１４項の
    いずれかに記載の生成物の第一層の表面と接触させ、 （ｂ）上記液体を上記生成物の層に浸透させ、（ｃ）上
    記第三層において放射される検出可能な信号の有無を測
    定することにより、上記液体試料における測定対象物の
    有無を測定することを特徴とする、上記測定法。