JPH0246900B2 - Sansonokaigooryoshitasokuteihoho - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は生体液中の物質を定量的に測定するた
めの均一系分析方法に関する。詳しくは酵素に標
識された抗原あるいは抗体を用いず、酵素との特
異的結合性が付与された抗原あるいは抗体を用
い、抗原抗体反応を行なわせ、会合の結果生ずる
酵素活性の変化を主として光学的に測定し、それ
より目的の抗原あるいは抗体を定量する均一系の
分析方法に関する。なお、本発明における会合と
は物質が酵素の周辺に局在的に酵素活性に変化を
およぼす程度に集まることをいう、例えば生物学
的反応である免疫学的凝集反応あるいは凝集素に
よる凝集反応や化学的架橋反応による凝集反応を
いう。

従来から免疫学的手法により抗原抗体反応を利
用し生体液中に物質を測定する方法は種々考えら
れてきた。例えば古くは毛細管沈降法、免疫比濁
法、ネフエロメトリツクイムノアツセイ、ラテツ
クス凝集法、シングルラジアルイムノデイヒユー
ジヨン等直接沈降あるいは凝集を測定する方法や
近くはラジオイムノアツセイ、あるいは謂以エン
ザイムイムノアツセイのように抗原あるいは抗体
に標識を施し微量の成分を正確に測定することが
開発され盛に利用されている。しかしこれらの方
法はいずれも一長一短があり感度に問題があつた
りまたは操作が煩雑であつたり放射性物質の処理
に問題があるなど通常の臨床検査の場においては
不便なものである。

本発明者等は上述の観点から種々研究を重ねた
結果酵素が単独の場合と、酵素との特異的結合性
が付与された抗原あるいは抗体と抗体あるいは抗
原の反応、すなわち抗原抗体反応で会合が起つた
場合とで酵素活性に違いが現われ会合の進むに伴
つて酵素活性が増加することを発見し本発明を完
成した。本発明に従つて、標的物質とその物質に
特異的結合性を有する受容体のいずれか一方に酵
素に特異的結合性を有する物質を結合させたもの
を用い、会合していない標的物質と受容体と酵素
では酵素活性が阻害されるような基質の濃度で、
標的物質と受容体と酵素の会合反応を行なわせそ
の結果生ずる酵素活性の変化から標的物質を分析
定量する方法が提供される。

本発明は上述の通り免疫学的会合による酵素活
性が会合の度合により定量的に増加することに基
づき会合が全くない状態ではその酵素活性が阻害
され発現しないような基質濃度を選ぶことにより
均一系分析方法を可能にした。また、本発明は酵
素に標識された抗原あるいは抗体を必要としない
均一系分析分法である。

本発明による酵素活性の変化は極めて鋭敏で、
非常に僅かの会合物質の量的変化に比例して起る
ので生体成分中の微量物質の定量が可能である。
本発明の方法は抗原抗体反応を酵素を用いて均一
系で測定する面から見れば従来のホモジニアスエ
ンザイムイムノアツセイと類似の方法と考えられ
るが、従来のものは抗原抗体反応により基質が酵
素の活性部位に結合できなくなるという立体障害
を利用して均一系の測定を可能にしたものである
のに対し、本発明の方法は会合による酵素活性の
発現に対する変化に基づいている点で反応機構を
全く異にする新規な方法である。よつて従来不可
能であつた高分子抗原を低分子の基質を用いて測
定することも可能となつた。酵素活性の変化は、
酵素に特異的結合性を有する物質を結合させた抗
体、標的物質である抗原、酵素の三者が結合した
時点より始まり、凝集反応あるいは会合の進行に
対して酵素活性の変化も大きくなるためポリエチ
レングリコール等の反応促進剤を加えることは測
定時間の短縮に有効である。

本発明に用いられる酵素には種々の酵素が考え
られ、それらより適当な酵素を選ぶことは研究者
としてさほど困難ではない。たとえばペルオキシ
ダーゼは好適な酵素の一つである。

また、本発明の酵素活性の測定方法は公知の方
法が使用できるが、ペルオキシダーゼについては
基質として至適濃度より過剰かつ遊離の酵素を完
全に阻害する濃度の過酸化物、たとえば過酸化水
素または過酸化尿素を用い、水素供与体としてフ
エノール類たとえばフエノール、パラクロロフエ
ノールなどを、またそのフエノールに対応する酸
化縮合剤としてたとえば４−アミノアンチピリン
を用い発色の吸光度を測定して行なうことができ
る。この方法は本発明に適用できる最も有効な方
法である。

次に、本発明の標的物質の測定方法の例を示す
が、本発明はこれらに制限されるものではない。

(1) 標的物質に対する抗体（受容体）に酵素に対
する抗体（酵素に特異的結合性を有する物質）
を結合したハイブリツド抗体を用いる方法であ
り、測定対象の標的物質に酵素と前記ハイブリ
ツド抗体を加えると三者が標的物質の量に応じ
て抗原抗体反応を介して会合反応を起こすので
酵素活性の変化から標的物質の量を知ることが
できる。

(2)−(i) 糖とレクチンの反応性も利用することが
できる。酵素がペルオキシダーゼのような糖
蛋白質の場合、その糖鎖に結合性をもつレク
チン（この場合には酵素に特異的結合性を有
する物質）たとえばコンカナバリンＡを受容
体に標識し、標的物質、受容体、酵素の三者
を会合反応させる。会合反応に取り込まれる
酵素の量は標的物質の量に依存するので、酵
素活性の変化から標的物質の量を知ることが
できる。

(2)−(ii) 同様に標的物質にレクチン（この場合に
は酵素に特異的結合性を有する物質）を標識
しても測定可能である。測定対象の未知量標
的物質に既知量のレクチン標識標的物質と受
容体それに酵素を加えると、未知量標的物質
がレクチン標識標的物質と受容体の会合反応
に競合するためレクチンと結合性を有する酵
素の会合反応物への取り込みが減少する。よ
つて酵素活性の変化から未知量標的物質の量
を知ることができる。

(3)−(i) さらに、ビオチン、アビジンの反応性を
利用することもできる。たとえば受容体にビ
オチン、酵素にアビジンを標識する。標的物
質にビオチン標識受容体とアビジン標識酵素
を加えると、標的物質とビオチン標識受容体
の会合反応にアビジン標識酵素が取りこま
れ、酵素活性は標的物質の量に応じて変化す
る。

(3)−(ii) 同様にビオチン標識標的物質とアビジン
標識酵素を用いてもレクチン標識標的物質を
用いる系と同じ理由で未知量標的物質を酵素
活性の変化から知ることができる。

抗原抗体の凝集反応はその一方の量を変化させ
ると両者の比が最適比を得るために他方の量は必
然的に変化する。この性質を利用して酵素に特異
的結合性を有する物質を結合させた抗体に、酵素
に特異的結合性を有する物質を結合させていない
抗体を加えることにより標的抗原の測定範囲を変
えることができる。すなわちあらかじめ酵素に特
異的結合性を有する物質を結合させた抗体に適当
な既知量の抗体を加えておき、その混合液を標的
抗原に加え抗原抗体反応を行なわせ酵素活性を測
定すると添加した酵素に特異的結合性を有する物
質を結合させていない抗体が多い程測定範囲が標
的抗原の高濃度側に移動する。これによつて検体
を希釈することなく通常の濃度範囲の測定系に合
せて測定することができる。

既知量の酵素に特異的結合性を有する物質を結
合させた抗体を用い非競合的に抗原と反応させる
場合、抗原過剰域では凝集反応が起こりにくく、
酵素活性の変化が小さくなる。このことは測定す
る物質の存在する範囲が広い場合、たとえばα−
フエトプロテインの血中濃度測定のような場合に
は、測定可能な範囲に検体を希釈しなくてはなら
ない不便さを生じる。このような場合には、既知
量の酵素に特異的結合性を有する物質を結合させ
た抗体と未知量抗原を反応させ、反応終了後に既
知量の酵素に特異的結合性を有する物質を結合さ
せていない抗体を加え、更に反応を行なうと広い
範囲にわたる測定が可能になる。次に実施例によ
りさらに詳しく本発明を説明する。

実施例 １ ハイブリツド抗体を用いたヒトα−フエトプロ
テイン（AFP）の測定 (a) 西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）と
AFPに対するハイブリツド抗体の調製：抗
AFPウサギ血清はエベレイの方法（J.Solid−
phase Biochem.、２、45−78、1977）に従い
AFP固定化セフアローズ4Bカラムを用いて特
異抗体とする。抗HRPウサギ血清は同様に
HRP固定化セフアローズ4Bカラムを用いて特
異抗体とし、さらにPH4.5、50ｍＭ酢酸緩衝液
に透析した後特異抗体の１％量のパパインを加
え37℃に於て24時間消化する。消化物をセフア
クリルＳ−200カラムに通して分子量4.5万の
Fab分画を得る。0.25M炭酸緩衝液PH8.8に透析
した抗AFP特異抗体と抗HRP特異抗体Fab分
画を等モル混合し蛋白濃度0.2mg／mlに調製す
る。この溶液１mlに上記炭酸緩衝液で調製した
１％グルタルアルデヒド溶液50μを加え室温
で30分間振盪後0.2Mグリシン溶液（PH8.0）３
mlを加えてさらに室温30分間振盪する。この溶
液を生理食塩水に対して透析しハイブリツド抗
体とする。

(b) AFPの測定：３％ポリエチレングリコール
6000（PEG）を含む生食添加20ｍＭリン酸緩衝
液PH7.0（PBS）でAFPの希釈列を調製する。こ
の溶液50μに同緩衝液で2.5μｇ／mlに調製し
たHRP溶液50μと(a)で調製したハイブリツド
抗体50μを加え、37℃に於て20分間反応す
る。反応液に0.5ｍM4−アミノアンチピリン、
25ｍＭフエノール、40ｍＭ過酸化水素を含む
PBS（呈色液）500μを加える。37℃10分間反
応後２％ホルムアルデヒドを含むPBS（停止
液）２mlを加え、500nｍでの吸光度を測定す
る。結果は図１に示す如くAFP濃度が高くな
るほど吸光度が上昇する標準曲線となつた。

【図面の簡単な説明】

第１図はAFPの非競合的均一測定による標準
曲線を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 標的物質とその物質に特異的結合性を有する
   受容体のいずれか一方に酵素に特異的結合性を有
   する物質を結合させたものを用い、会合していな
   い標的物質と受容体と酵素では酵素活性が阻害さ
   れるような基質の濃度で、標的物質と受容体と酵
   素の会合反応を行なわせその結果生ずる酵素活性
   の変化から標的物質を分析定量する方法。 ２ 酵素としてペルオキシダーゼを用い、ペルオ
   キシダーゼの活性を基質として過剰の過酸化物、
   水素供与体としてフエノール類、このフエノール
   類に対する酸化縮合剤を用いて測定することから
   なる特許請求の範囲第１項記載の方法。