JPH0246897B2 - Amiraazeomochiitakogenketsuteikigujubutsushitsusokuteiho - Google Patents
AmiraazeomochiitakogenketsuteikigujubutsushitsusokuteihoInfo
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- JPH0246897B2 JPH0246897B2 JP2771084A JP2771084A JPH0246897B2 JP H0246897 B2 JPH0246897 B2 JP H0246897B2 JP 2771084 A JP2771084 A JP 2771084A JP 2771084 A JP2771084 A JP 2771084A JP H0246897 B2 JPH0246897 B2 JP H0246897B2
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- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
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Description
本発明は、例えば血清、尿などに含まれる薬物
あるいは各種疾患に由来する微量成分などを測定
する方法に関するものである。 血清、尿などの体液に含まれる微量成分の分析
は病気の診断あるいは治療経過の判定などに非常
に有意義であり、日常の臨床検査に活用されてい
る。ところが、これらの体液には多種多様の成分
が含まれており、そのなかには、分子量の近似し
た物質、生理活性の似た物質あるいは構造の近似
した物質なども含まれていることも多い。そこ
で、この分析法は特異性が高く、かつ微小量まで
定量しうることが要求される。さらに、日常検査
として利用されるために、簡便かつルーチン化し
うることが望ましい。 このような条件を備えた分析法として免疫学的
測定法がある。この方法は、抗原−抗体間の高い
親和性と、抗体が抗原決定基を判別する高い特異
性を利用しており、ラジオイムノアツセイ、酵素
免疫測定法、血球等の凝集反応を利用した方法等
に大別される。 ラジオイムノアツセイは、感度はすぐれている
が、人体に有害である放射性物質を用いるところ
から使用場所や使用量が厳しく規制されており、
特殊な施設を必要とする。一方、酵素免疫法はこ
のような問題はないが、ラジオイムノアツセイも
そうであるが、遊離標識物と結合標識物の分離が
必要である。そして、この分離操作は、非常に繁
雑であり、操作及び測定誤差の両面で問題になつ
ていた。血球等の凝集反応を利用した方法の場合
にはこの分離操作は必要ないが、この方法は感度
が低く、数ｎｇ〜ｐｇのような極微量を測定する
ことは困難である。 本発明者らは上記のような欠点のない測定方法
を開発すべく種々検討の結果、水に不溶性の高分
子物質を基質とする酵素に測定対象たる抗原決定
基具有物質に対する抗体を結合させてこの結合物
の抗体に測定対象の抗原決定基具有物質を反応さ
せ、その後この結合物の酵素活性を測定すると測
定対象たる抗原決定基具有物質の量に応じて酵素
活性が顕著に低下することを見出し、この方法を
用いれば抗原決定基具有物質を高感度で、かつ前
述の分離操作を行なわないで簡便に測定しうるこ
とを見出してその内容を特許出願（特願昭58−
231241号（特開昭60−123767号））した。そして、
さらに研究を進め、酵素としてアミラーゼを用い
た場合に抗原決定基具有物質を最も高感度で測定
できることを見出したが、ヒト血清等の高等動物
由来の検体には通常アミラーゼが含まれているた
め測定におけるブランク値が高くなつて測定誤差
が大きくなるという問題を生じた。そこで、この
ブランク値を低下させるために検体中のアミラー
ゼを予め失活させる方法及び検体を希釈する方法
を検討したが、前者の場合にはアミラーゼを失活
させるために検体を加熱処理、酸アルカリ処理等
する際に測定対象の抗原決定基具有物質も変性あ
るいは分解されてしまうことがあり、後者の場合
には感度が低下してしまうためこれらの方法はい
ずれも不適当であつた。さらに、これらの方法
は、操作が繁雑であるため、簡便な測定法の開発
を目指す本発明者らの意図にそぐわないものであ
つた。 そこで、本発明者らは、簡便さと高感度を損な
わずにこのブランク値を低下させる方法を開発す
べくさらに検討の結果、高等動物由来のアミラー
ゼを特異的に阻害するアミラーゼインヒビターを
使用することによつてこの目的を達成しうること
を見出し、本発明を完成するに至つた。 すなわち、本発明は、高等動物由来のアミラー
ゼを含有している検体の抗原決定基具有物質を測
定する方法において、該抗原決定基具有物質と、
この抗原決定基具有物質に対する抗体と検体に実
質的に含まれていないアミラーゼとの結合物を接
触せしめて反応させ、前記の高等動物来のアミラ
ーゼには、このアミラーゼの活性を阻害する程度
が前記の結合物に結合されているアミラーゼの活
性を阻害する程度より大きいアミラーゼインヒビ
ターを接触せしめて反応させ、さらに、前記の結
合物に結合されているアミラーゼが作用しうる水
に不溶性の高分子物質に前記の結合物を接触せし
めて酵素反応させ、アミラーゼ活性を測定するこ
とを特徴とする、抗原決定基具有物質の測定方法
に関するものである。 本発明の方法で測定される検体は高等動物由来
のアミラーゼを含有するものである。高等動物由
来のアミラーゼとは例えば膵臓アミラーゼ、唾液
アミラーゼなどであり、このようなアミラーゼを
含有する検体も通常は高等動物由来のものであ
る。検体の種類は限定されないが、例えば血清、
尿などである。血清、尿などの場合には、通常は
特別な前処理を必要とせず、そのまま測定を行な
うことができる。 抗原決定基具有物質（以下リガンドという。）
は抗原決定基を一又は二以上有しているものであ
り、例えば、各種内分泌腺に由来するホルモン
類、免疫グロブリン、アルブミン、フエリチン等
の血漿蛋白質、HB抗原等のウイルス、バクテリ
ア類、α−フエトプロテイン、癌胎児性抗原等の
各種臓器あるいは血中、尿中に存在する抗原など
である。 結合物を構成している抗体はリガンドと反応す
るものでなければならない。この抗体にはＦ
（ab′）2、Fab′、Fabなどのフラグメントも含まれ
る。 抗体の製造方法としては、リガンド又はリガン
ドと蛋白との結合物を兎、山羊、馬、モルモツ
ト、ニワトリなどの混血動物に体重１Kgあたり
0.3〜２mgを１〜数回背中皮下、フツトパツド、
大腿筋等にアジユバントとともに注射して当該動
物の体内に形成させる。この抗原は血清をそのま
ま用いてもよく、血清から抗体すなわち免疫グロ
ブリンを採取する公知の方法によつて精製してか
ら用いてもよい。 一方、この抗体はモノクローナル抗体として取
得することもできる。その場合には、マウスに前
記のいずれかの抗原をアジユバントとともに数回
腹腔等に注射し、脾臓細胞を取り出してポリエチ
レングリコール等を用いてマウスミエローマ細胞
と融合させる。そして、この融合細胞のなかから
当該抗体を産生するものをクローニングによつて
モノクローン細胞として増殖させ、マウス腹腔中
で増殖させることによつて単一抗体、すなわちモ
ノクローナル抗体を大量に製造することができ
る。 結合物を構成しているアミラーゼはα−アミラ
ーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼなどで
あり、検体中に実質的に含まれていないものであ
つて、かつ後述するアミラーゼインヒビターの阻
害活性が検体中のアミラーゼに対する阻害活性よ
りも低いものである。このようなアミラーゼは検
体の種類及びアミラーゼインヒビターの種類など
に応じて異なるが、例えば麦芽由来のジアスター
ゼ及びβ−アミラーゼ、糸状菌由来のタカジアス
ターゼ、バチルス層細菌由来のアミラーゼ、など
から適宜選択すればよい。 アミラーゼと抗体との結合方法は双方の官能基
を考慮して決定すればよい。官能基は、アミノ
基、カルボキシル基、水酸基、チオール基、イミ
ダゾール基、フエニル基などを利用することがで
き、例えばアミノ基相互間を結合させる場合に
は、ジイソシアネート法、グルタルアルデヒド
法、ジフルオロベンゼン法、ベンゾキノン法等数
多く知られている。また、アミノ基とカルボキシ
ル基との間を結合させる方法としては、カルボキ
シル基をサクシンイミドエステル化する方法のほ
かカルボジイミド法、ウツドワード試薬法等が知
られており、アミノ基と糖鎖を架橋する過ヨウ素
酸酸化法（Nakane法）もある。チオール基を利
用する場合には、例えばもう一方の側のカルボキ
シル基をサクシンイミドエステル化してこれにシ
ステインを反応させてチオール基を導入し、チオ
ール基反応性二価架橋試薬を用いて双方を結合す
ることができる。フエニル基を利用する方法とし
てはジアゾ化法、アルキル化法などがある。結合
方法はこれらの例示に限られるものではなく、こ
のほか例えば「Method in Immunology and
Immunochemistry」あるいは「酵素免疫測定法」
等の成書に記載されている方法のなかから適宜選
択して利用することができる。結合比は１：１に
限らず、目的に応じて任意の比率をとることがで
きることはいうまでもない。反応後は、ゲル過
法、イオン交換クロマトグラフイー、アフイニテ
イークロマトグラフイーなどを適宜組み合わせて
精製を行い、必要により凍結乾燥法等で乾燥す
る。 検体に含まれるリガンドと、前記の抗体とアミ
ラーゼとの結合物を溶液中で接触させる。その
際、溶液の温度は20〜45℃程度、そしてPHは通常
４〜8.5程度が適当である。PHを一定に保つため
に、必要により、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液など
の緩衝液を用いてもよい。その際、結合物の適当
な量は、その種類、リガンドの種類、あるいは接
触時の条件などによつて異なるので予め試験をし
て定めるのがよい。リガンドと結合物との接触時
間はいずれも、通常は充分に反応しうる程度がよ
く、例えば37℃の場合には20〜60分間程度が適当
である。 一方、検体に含まれている高等動物由来のアミ
ラーゼには、このアミラーゼを阻害する程度が前
記の結合物に結合されているアミラーゼの活性を
阻害する程度より大きいアミラーゼインヒビター
を接触させる。 このアミラーゼインヒビターは検体に含まれて
いるすべてのアミラーゼを失活させかつ結合物に
結合されているアミラーゼを全く阻害しないもの
が最も望ましいことはいうまでもないが、実用上
は検体中の主たるアミラーゼを失活させうるもの
であれば足りる場合が多い。この失活な要は測定
時においてブランク値を上昇させなければよく、
測定後にアミラーゼインヒビターが失活するなど
してこのアミラーゼ活性が回復してもよい。この
アミラーゼインヒビターの作用が問題になるもう
一方の、検体に実質的に含まれていないアミラー
ゼは抗体に結合されている状態のものであり、遊
離状態ではアミラーゼインヒビターによつて失活
するものであつてもよい。このようなアミラーゼ
インヒビターの例としては、唾液アミラーゼ及び
膵臓アミラーゼの両方を阻害する小麦由来のアミ
ラーゼインヒビター（M.D.O′Donnell ct al、
Biochim.Biophys.Acta、Vol422、pp159−169
（1976））、唾液アミラーゼを優先的に阻害する小
麦由来のアミラーゼインヒビターSain（特開昭58
−85899号公報）及び膵臓アミラーゼを優先的に
阻害するストレプトミセス属の放線菌が産生する
アミラーゼインヒビターAI−Ｂ（特開昭57−2684
号公報）などがある。そのほか、検体に含まれて
いる高等動物由来のアミラーゼを異種動物に投与
してその抗体を取得し、これをアミラーゼインヒ
ビターとして用いることもできる。抗体の取得方
法は前述のリガンドに対する抗体の取得方法と同
様にして取得することができる。これらは単独で
用いてもよく、併用してもよい。 検体中のアミラーゼにこのようなアミラーゼイ
ンヒビターを接触させる際の溶液の温度及びPHは
通常は前述のリガンドを結合物に接触させる条件
と同一でよい。また、アミラーゼインヒビターの
添加量もその種類、検体中のアミラーゼの種類と
量、結合物の構成しているアミラーゼの種類、あ
るいは接触させる条件などによつて異なるので予
め試験をして定めるのがよい。アミラーゼインヒ
ビターの添加時期は、検体中のアミラーゼによる
後述する水に不溶性の高分子物質の分解を実質的
に防止できればよく、通常はこの高分子物質の添
加前に添加すればよい、しかしながら一般にアミ
ラーゼインヒビターによるアミラーゼ阻害作用は
アミラーゼによる基質の分解速度よりもはるかに
はやいのでアミラーゼインヒビターを高分子物質
と同時あるいは多少遅れて添加してもよい。 リガンドと反応させた結合物は高分子物質に接
触させて反応させる。 高分子物質と接触させる結合物は反応物から分
離したものでもよいが、通常は反応物に含まれて
いる状態のままでよい。 この高分子物質は結合物のアミラーゼが反応し
うるものであり、通常はアミラーゼの基質である
が、水に不溶性であるところに特徴がある。すな
わち、高分子物質が不溶性であるために結合物の
アミラーゼ部分との接触の大部分が固−液間にな
り、その結果、アミラーゼの高分子化による立体
障害が大きく現われる。本発明者らはこのことを
確認するためにペンタオースを用いて測定を行な
い、不溶性デンプンを用いた場合と比較したとこ
ろ前者の場合にはアミラーゼ活性の低下がほとん
ど認められなかつたのに対し、後者の場合にはア
ミラーゼ活性が顕著に低下した。高分子物質の例
としては不溶性デンプンなどがある。この高分子
物質はそれ自身が可溶性であつても、不溶性の担
体に固定化するとか重合させるなどして不溶化し
て用いることもできる。この方法の例としては、
アガロースゲルに包活させる方法がある。 高分子物質に結合物のアミラーゼを作用させる
条件はこのアミラーゼの理化学的性質などに応じ
て適当になるように定めればよい。 アミラーゼを作用させたのちはアミラーゼの活
性を求める。この活性は、この酵素反応による分
解物の増加、原料である高分子物質の減少、その
他、この酵素反応による系の変化を追跡すればよ
い。 本発明の方法は、ヒト血清などの高等動物由来
のアミラーゼを含む検体中のリガンドを特異性高
くかつ極めて高感度で測定できる。また、操作が
簡単であり、安価かつ容易にリガンドを定量する
ことが可能である。本発明の方法はリガンドの種
類を問わず測定できるが比較的高分子の測定に威
力を発揮する。本発明の方法に用いる試薬にはリ
ガンドを直接使用せず、リガンドは抗体の製造に
用いられるだけであるから微量で足りるという利
点も有する。従つて、本発明の方法は測定対象と
同じリガンドが入手しにくい場合とか、高価な場
合に特に有効である。 以下、実施例を示す。 実施例 １ CHM化アミラーゼの調製 バチルス・ズブチリスアミラーゼ５mgを10ｍ
MO−フエナトロリンを含むPH6.3の0.1Mグリ
セロリン酸緩衝液１mlに溶かし、４−（マレイ
ミドメチルシクロヘキサン−１−カルボン酸）
サクシンイミドエステル（CHMS）２mg／ml
のジメチルホルムアミド（DMF）溶液100μ
を加えて室温で１時間放置して反応させた。こ
の反応液をセフアデツクスＧ−25のカラムに入
れ、PH6.3の0.1Mリン酸緩衝液を流してゲル
過を行ない、素通り分画を分取した。 抗ヒトα−フエトプロテインヤギIgGF
（ab′）2の調製 抗ヒトα−フエトプロテインヤギIgG10mgを
0.1M酢酸緩衝液（PH4.0）２mlにペプシン300μ
ｇを加え、37℃で18時間撹拌した。
0.1NNaOHを加えてPHを6.0に調節しこの反応
液を予め0.1Mリン酸緩衝１ｍＭ EDTA溶液
（PH6.3）で緩衝化したセフアクリルＳ−300ゲ
ルカラムに入れ、上記のリン酸緩衝液で溶出し
た。分子量約10万付近に溶出されたピーク部分
を集めて１mlに濃縮し、目的の抗ヒトα−フエ
トプロテインヤギ1gGF（ab′）2を得た。 α−アミラーゼ−抗ヒトα−フエトプロテイ
ンヤギ1gG Fab′結合物の調製 で調製した抗ヒトα−フエトプロテインヤ
ギ1gG Ｆ（ab′）26mgを含む0.1Mリン酸緩衝１ｍ
Ｍ EDTA溶液（PH6.0）１mlに10mg／mlの２
−メルカプトエチルアミン塩酸塩水溶液100μ
を加え、37℃で90分間撹拌した。この反応液
を予め0.1Mリン酸緩衝液（PH6.3）で緩衝化し
たセフアデツクスＧ−25カラムでゲル過して
未反応の２−メルカプトメチルアミンを除去
し、HS−Fab′を得た。これにで調製した
CHM化α−アミラーゼ１mgを加え、37℃で90
分間反応させた。次にこの反応液を0.1M酢酸
緩衝５ｍＭ塩化カルシウム溶液（PH6.0）で緩
衝化したセフアクリルＳ−300カラムゲル過
して分子量20万以上の分画を集め、これを濃縮
して目的の結合物を得た。 ヒトα−フエトプロテインの測定 濃度０〜2000nｇのヒトα−フエトプロテイ
ン溶液100μにで調製した結合物溶液にス
トレプトミセス・ビリドスポラスNo.297−
A2FERM−P5405の産生するアミラーゼイン
ヒビター100μｇ／ml及びポリエチレングリコ
ール6000 ７％を含有せしめた溶液100μｇを加
えて30分間反応させた。反応液にブルースター
チ懸濁液1.0mlを加えて37℃で30分間さらに反
応させ、0.5NNaOH1mlを加えて反応を停止さ
せた。これを攪拌後、3500rpmで２分間遠心
し、得られた上清の620nｍにおける吸光度を
測定した。 得られた吸光度とヒトα−フエトプロテイン
の濃度との関係を示す検量線を第１図に示す。 次に、ヒトα−フエトプロテインを含むヒト
血清100μをとり、20ｍＭグリセロリン酸緩
衝濃PH6.0で希釈して2n希釈列を調製した。
各々100μを小試験管にとり、これにで調
製された結合物溶液にストレプトミセス・ビリ
ドスポラスNo.297−A2FERM−P5405の産生す
るアミラーゼインヒビター100μｇ／ml及びポ
リエチレングリコール6000 ７％を含有せしめ
た溶液100μを加えて37℃で30分間加温した。
続いて、ブルースターチ1.0mlを加えて37℃で
30分間加温後0.5NNaOH1mlを加えて反応を停
止させた。撹拌後、3500rpmで２分間遠心し、
上清の620nｍにおける吸光度を測定した。得
られた結果を第２図に示す。図中、白丸はアミ
ラーゼインヒビターを加えた場合を表わし、黒
丸は加えなかつた場合を表わしている。図に示
す如く、アミラーゼインヒビターを加えない場
合には血清中のアミラーゼによる吸光度の上昇
があるが、アミラーゼインヒビターを加えた場
合には希釈を必要とせず、ブランクなしでも正
確に測定できる。 実施例 ２ SPDP化アミラーゼの調製 バチルス・ズブチリスアミラーゼ１mgを10ｍ
MO−フエナントロリンを含むPH7.5の0.1Mグ
リセロリン酸緩衝液に溶かし、Ｎ−サクシンイ
ミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオ
ン酸（SPDP）１mgを含むDMF溶液100μを
加えて室温で30分間撹拌して反応させた。この
反応液を予め、0.1Mグリセロリン酸緩衝液PH
7.5を用いて平衡化したセフアデツクスＧ−25
のカラムを用いてゲル過を行ない、SPDP化
アミラーゼ１mgを得た。 抗ヒトIgEヤギIgGF（ab′）2の調製 抗ヒトIgEヤギIgG10mgを0.1M酢酸緩衝液
（PH4.0）２mlにペプシン300μｇを加え、37℃で
18時間撹拌した。0.1NNaOHを加えてPHを6.0
に調節しこの反応液を予め0.1Mリン酸緩衝１
ｍＭ EDTA溶液（PH6.3）で緩衝化したセフ
アクリルＳ−300ゲルカラムに入れ、上記のリ
ン酸緩衝液で溶出した。分子量約10万付近に溶
出されたピーク部分を集めて１mlに濃縮し、目
的の抗ヒトIgEヤギIgGF（ab′）2を得た。 α−アミラーゼ−抗ヒトIgEヤギIgG Fab′結
合物の調製 で調製した抗ヒトIgEヤギIgG Ｆ（ab′）26
mgを含む0.1Mリン酸緩衝１ｍＭ EDTA溶液
（PH6.0）１mlに10mg／mlの２−メルカプトエチ
ルアミン塩酸塩水溶液100μを加え、37℃で
90分間撹拌した。この反応液を予め0.1Mグリ
セロリン酸緩衝液（PH7.5）で緩衝化したセフ
アデツクスＧ−25カラムでゲル過して未反応
の２−メルカプトメチルアミンを除去し、HS
−Fab′を得た。これにで調製したSPDP化α
−アミラーゼ２mgを加え、４℃で18時間反応さ
せた。次にこの反応液を0.1M酢酸緩衝５ｍＭ
塩化カルシウム溶液（PH6.5）で緩衝化したセ
あるいは各種疾患に由来する微量成分などを測定
する方法に関するものである。 血清、尿などの体液に含まれる微量成分の分析
は病気の診断あるいは治療経過の判定などに非常
に有意義であり、日常の臨床検査に活用されてい
る。ところが、これらの体液には多種多様の成分
が含まれており、そのなかには、分子量の近似し
た物質、生理活性の似た物質あるいは構造の近似
した物質なども含まれていることも多い。そこ
で、この分析法は特異性が高く、かつ微小量まで
定量しうることが要求される。さらに、日常検査
として利用されるために、簡便かつルーチン化し
うることが望ましい。 このような条件を備えた分析法として免疫学的
測定法がある。この方法は、抗原−抗体間の高い
親和性と、抗体が抗原決定基を判別する高い特異
性を利用しており、ラジオイムノアツセイ、酵素
免疫測定法、血球等の凝集反応を利用した方法等
に大別される。 ラジオイムノアツセイは、感度はすぐれている
が、人体に有害である放射性物質を用いるところ
から使用場所や使用量が厳しく規制されており、
特殊な施設を必要とする。一方、酵素免疫法はこ
のような問題はないが、ラジオイムノアツセイも
そうであるが、遊離標識物と結合標識物の分離が
必要である。そして、この分離操作は、非常に繁
雑であり、操作及び測定誤差の両面で問題になつ
ていた。血球等の凝集反応を利用した方法の場合
にはこの分離操作は必要ないが、この方法は感度
が低く、数ｎｇ〜ｐｇのような極微量を測定する
ことは困難である。 本発明者らは上記のような欠点のない測定方法
を開発すべく種々検討の結果、水に不溶性の高分
子物質を基質とする酵素に測定対象たる抗原決定
基具有物質に対する抗体を結合させてこの結合物
の抗体に測定対象の抗原決定基具有物質を反応さ
せ、その後この結合物の酵素活性を測定すると測
定対象たる抗原決定基具有物質の量に応じて酵素
活性が顕著に低下することを見出し、この方法を
用いれば抗原決定基具有物質を高感度で、かつ前
述の分離操作を行なわないで簡便に測定しうるこ
とを見出してその内容を特許出願（特願昭58−
231241号（特開昭60−123767号））した。そして、
さらに研究を進め、酵素としてアミラーゼを用い
た場合に抗原決定基具有物質を最も高感度で測定
できることを見出したが、ヒト血清等の高等動物
由来の検体には通常アミラーゼが含まれているた
め測定におけるブランク値が高くなつて測定誤差
が大きくなるという問題を生じた。そこで、この
ブランク値を低下させるために検体中のアミラー
ゼを予め失活させる方法及び検体を希釈する方法
を検討したが、前者の場合にはアミラーゼを失活
させるために検体を加熱処理、酸アルカリ処理等
する際に測定対象の抗原決定基具有物質も変性あ
るいは分解されてしまうことがあり、後者の場合
には感度が低下してしまうためこれらの方法はい
ずれも不適当であつた。さらに、これらの方法
は、操作が繁雑であるため、簡便な測定法の開発
を目指す本発明者らの意図にそぐわないものであ
つた。 そこで、本発明者らは、簡便さと高感度を損な
わずにこのブランク値を低下させる方法を開発す
べくさらに検討の結果、高等動物由来のアミラー
ゼを特異的に阻害するアミラーゼインヒビターを
使用することによつてこの目的を達成しうること
を見出し、本発明を完成するに至つた。 すなわち、本発明は、高等動物由来のアミラー
ゼを含有している検体の抗原決定基具有物質を測
定する方法において、該抗原決定基具有物質と、
この抗原決定基具有物質に対する抗体と検体に実
質的に含まれていないアミラーゼとの結合物を接
触せしめて反応させ、前記の高等動物来のアミラ
ーゼには、このアミラーゼの活性を阻害する程度
が前記の結合物に結合されているアミラーゼの活
性を阻害する程度より大きいアミラーゼインヒビ
ターを接触せしめて反応させ、さらに、前記の結
合物に結合されているアミラーゼが作用しうる水
に不溶性の高分子物質に前記の結合物を接触せし
めて酵素反応させ、アミラーゼ活性を測定するこ
とを特徴とする、抗原決定基具有物質の測定方法
に関するものである。 本発明の方法で測定される検体は高等動物由来
のアミラーゼを含有するものである。高等動物由
来のアミラーゼとは例えば膵臓アミラーゼ、唾液
アミラーゼなどであり、このようなアミラーゼを
含有する検体も通常は高等動物由来のものであ
る。検体の種類は限定されないが、例えば血清、
尿などである。血清、尿などの場合には、通常は
特別な前処理を必要とせず、そのまま測定を行な
うことができる。 抗原決定基具有物質（以下リガンドという。）
は抗原決定基を一又は二以上有しているものであ
り、例えば、各種内分泌腺に由来するホルモン
類、免疫グロブリン、アルブミン、フエリチン等
の血漿蛋白質、HB抗原等のウイルス、バクテリ
ア類、α−フエトプロテイン、癌胎児性抗原等の
各種臓器あるいは血中、尿中に存在する抗原など
である。 結合物を構成している抗体はリガンドと反応す
るものでなければならない。この抗体にはＦ
（ab′）2、Fab′、Fabなどのフラグメントも含まれ
る。 抗体の製造方法としては、リガンド又はリガン
ドと蛋白との結合物を兎、山羊、馬、モルモツ
ト、ニワトリなどの混血動物に体重１Kgあたり
0.3〜２mgを１〜数回背中皮下、フツトパツド、
大腿筋等にアジユバントとともに注射して当該動
物の体内に形成させる。この抗原は血清をそのま
ま用いてもよく、血清から抗体すなわち免疫グロ
ブリンを採取する公知の方法によつて精製してか
ら用いてもよい。 一方、この抗体はモノクローナル抗体として取
得することもできる。その場合には、マウスに前
記のいずれかの抗原をアジユバントとともに数回
腹腔等に注射し、脾臓細胞を取り出してポリエチ
レングリコール等を用いてマウスミエローマ細胞
と融合させる。そして、この融合細胞のなかから
当該抗体を産生するものをクローニングによつて
モノクローン細胞として増殖させ、マウス腹腔中
で増殖させることによつて単一抗体、すなわちモ
ノクローナル抗体を大量に製造することができ
る。 結合物を構成しているアミラーゼはα−アミラ
ーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼなどで
あり、検体中に実質的に含まれていないものであ
つて、かつ後述するアミラーゼインヒビターの阻
害活性が検体中のアミラーゼに対する阻害活性よ
りも低いものである。このようなアミラーゼは検
体の種類及びアミラーゼインヒビターの種類など
に応じて異なるが、例えば麦芽由来のジアスター
ゼ及びβ−アミラーゼ、糸状菌由来のタカジアス
ターゼ、バチルス層細菌由来のアミラーゼ、など
から適宜選択すればよい。 アミラーゼと抗体との結合方法は双方の官能基
を考慮して決定すればよい。官能基は、アミノ
基、カルボキシル基、水酸基、チオール基、イミ
ダゾール基、フエニル基などを利用することがで
き、例えばアミノ基相互間を結合させる場合に
は、ジイソシアネート法、グルタルアルデヒド
法、ジフルオロベンゼン法、ベンゾキノン法等数
多く知られている。また、アミノ基とカルボキシ
ル基との間を結合させる方法としては、カルボキ
シル基をサクシンイミドエステル化する方法のほ
かカルボジイミド法、ウツドワード試薬法等が知
られており、アミノ基と糖鎖を架橋する過ヨウ素
酸酸化法（Nakane法）もある。チオール基を利
用する場合には、例えばもう一方の側のカルボキ
シル基をサクシンイミドエステル化してこれにシ
ステインを反応させてチオール基を導入し、チオ
ール基反応性二価架橋試薬を用いて双方を結合す
ることができる。フエニル基を利用する方法とし
てはジアゾ化法、アルキル化法などがある。結合
方法はこれらの例示に限られるものではなく、こ
のほか例えば「Method in Immunology and
Immunochemistry」あるいは「酵素免疫測定法」
等の成書に記載されている方法のなかから適宜選
択して利用することができる。結合比は１：１に
限らず、目的に応じて任意の比率をとることがで
きることはいうまでもない。反応後は、ゲル過
法、イオン交換クロマトグラフイー、アフイニテ
イークロマトグラフイーなどを適宜組み合わせて
精製を行い、必要により凍結乾燥法等で乾燥す
る。 検体に含まれるリガンドと、前記の抗体とアミ
ラーゼとの結合物を溶液中で接触させる。その
際、溶液の温度は20〜45℃程度、そしてPHは通常
４〜8.5程度が適当である。PHを一定に保つため
に、必要により、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液など
の緩衝液を用いてもよい。その際、結合物の適当
な量は、その種類、リガンドの種類、あるいは接
触時の条件などによつて異なるので予め試験をし
て定めるのがよい。リガンドと結合物との接触時
間はいずれも、通常は充分に反応しうる程度がよ
く、例えば37℃の場合には20〜60分間程度が適当
である。 一方、検体に含まれている高等動物由来のアミ
ラーゼには、このアミラーゼを阻害する程度が前
記の結合物に結合されているアミラーゼの活性を
阻害する程度より大きいアミラーゼインヒビター
を接触させる。 このアミラーゼインヒビターは検体に含まれて
いるすべてのアミラーゼを失活させかつ結合物に
結合されているアミラーゼを全く阻害しないもの
が最も望ましいことはいうまでもないが、実用上
は検体中の主たるアミラーゼを失活させうるもの
であれば足りる場合が多い。この失活な要は測定
時においてブランク値を上昇させなければよく、
測定後にアミラーゼインヒビターが失活するなど
してこのアミラーゼ活性が回復してもよい。この
アミラーゼインヒビターの作用が問題になるもう
一方の、検体に実質的に含まれていないアミラー
ゼは抗体に結合されている状態のものであり、遊
離状態ではアミラーゼインヒビターによつて失活
するものであつてもよい。このようなアミラーゼ
インヒビターの例としては、唾液アミラーゼ及び
膵臓アミラーゼの両方を阻害する小麦由来のアミ
ラーゼインヒビター（M.D.O′Donnell ct al、
Biochim.Biophys.Acta、Vol422、pp159−169
（1976））、唾液アミラーゼを優先的に阻害する小
麦由来のアミラーゼインヒビターSain（特開昭58
−85899号公報）及び膵臓アミラーゼを優先的に
阻害するストレプトミセス属の放線菌が産生する
アミラーゼインヒビターAI−Ｂ（特開昭57−2684
号公報）などがある。そのほか、検体に含まれて
いる高等動物由来のアミラーゼを異種動物に投与
してその抗体を取得し、これをアミラーゼインヒ
ビターとして用いることもできる。抗体の取得方
法は前述のリガンドに対する抗体の取得方法と同
様にして取得することができる。これらは単独で
用いてもよく、併用してもよい。 検体中のアミラーゼにこのようなアミラーゼイ
ンヒビターを接触させる際の溶液の温度及びPHは
通常は前述のリガンドを結合物に接触させる条件
と同一でよい。また、アミラーゼインヒビターの
添加量もその種類、検体中のアミラーゼの種類と
量、結合物の構成しているアミラーゼの種類、あ
るいは接触させる条件などによつて異なるので予
め試験をして定めるのがよい。アミラーゼインヒ
ビターの添加時期は、検体中のアミラーゼによる
後述する水に不溶性の高分子物質の分解を実質的
に防止できればよく、通常はこの高分子物質の添
加前に添加すればよい、しかしながら一般にアミ
ラーゼインヒビターによるアミラーゼ阻害作用は
アミラーゼによる基質の分解速度よりもはるかに
はやいのでアミラーゼインヒビターを高分子物質
と同時あるいは多少遅れて添加してもよい。 リガンドと反応させた結合物は高分子物質に接
触させて反応させる。 高分子物質と接触させる結合物は反応物から分
離したものでもよいが、通常は反応物に含まれて
いる状態のままでよい。 この高分子物質は結合物のアミラーゼが反応し
うるものであり、通常はアミラーゼの基質である
が、水に不溶性であるところに特徴がある。すな
わち、高分子物質が不溶性であるために結合物の
アミラーゼ部分との接触の大部分が固−液間にな
り、その結果、アミラーゼの高分子化による立体
障害が大きく現われる。本発明者らはこのことを
確認するためにペンタオースを用いて測定を行な
い、不溶性デンプンを用いた場合と比較したとこ
ろ前者の場合にはアミラーゼ活性の低下がほとん
ど認められなかつたのに対し、後者の場合にはア
ミラーゼ活性が顕著に低下した。高分子物質の例
としては不溶性デンプンなどがある。この高分子
物質はそれ自身が可溶性であつても、不溶性の担
体に固定化するとか重合させるなどして不溶化し
て用いることもできる。この方法の例としては、
アガロースゲルに包活させる方法がある。 高分子物質に結合物のアミラーゼを作用させる
条件はこのアミラーゼの理化学的性質などに応じ
て適当になるように定めればよい。 アミラーゼを作用させたのちはアミラーゼの活
性を求める。この活性は、この酵素反応による分
解物の増加、原料である高分子物質の減少、その
他、この酵素反応による系の変化を追跡すればよ
い。 本発明の方法は、ヒト血清などの高等動物由来
のアミラーゼを含む検体中のリガンドを特異性高
くかつ極めて高感度で測定できる。また、操作が
簡単であり、安価かつ容易にリガンドを定量する
ことが可能である。本発明の方法はリガンドの種
類を問わず測定できるが比較的高分子の測定に威
力を発揮する。本発明の方法に用いる試薬にはリ
ガンドを直接使用せず、リガンドは抗体の製造に
用いられるだけであるから微量で足りるという利
点も有する。従つて、本発明の方法は測定対象と
同じリガンドが入手しにくい場合とか、高価な場
合に特に有効である。 以下、実施例を示す。 実施例 １ CHM化アミラーゼの調製 バチルス・ズブチリスアミラーゼ５mgを10ｍ
MO−フエナトロリンを含むPH6.3の0.1Mグリ
セロリン酸緩衝液１mlに溶かし、４−（マレイ
ミドメチルシクロヘキサン−１−カルボン酸）
サクシンイミドエステル（CHMS）２mg／ml
のジメチルホルムアミド（DMF）溶液100μ
を加えて室温で１時間放置して反応させた。こ
の反応液をセフアデツクスＧ−25のカラムに入
れ、PH6.3の0.1Mリン酸緩衝液を流してゲル
過を行ない、素通り分画を分取した。 抗ヒトα−フエトプロテインヤギIgGF
（ab′）2の調製 抗ヒトα−フエトプロテインヤギIgG10mgを
0.1M酢酸緩衝液（PH4.0）２mlにペプシン300μ
ｇを加え、37℃で18時間撹拌した。
0.1NNaOHを加えてPHを6.0に調節しこの反応
液を予め0.1Mリン酸緩衝１ｍＭ EDTA溶液
（PH6.3）で緩衝化したセフアクリルＳ−300ゲ
ルカラムに入れ、上記のリン酸緩衝液で溶出し
た。分子量約10万付近に溶出されたピーク部分
を集めて１mlに濃縮し、目的の抗ヒトα−フエ
トプロテインヤギ1gGF（ab′）2を得た。 α−アミラーゼ−抗ヒトα−フエトプロテイ
ンヤギ1gG Fab′結合物の調製 で調製した抗ヒトα−フエトプロテインヤ
ギ1gG Ｆ（ab′）26mgを含む0.1Mリン酸緩衝１ｍ
Ｍ EDTA溶液（PH6.0）１mlに10mg／mlの２
−メルカプトエチルアミン塩酸塩水溶液100μ
を加え、37℃で90分間撹拌した。この反応液
を予め0.1Mリン酸緩衝液（PH6.3）で緩衝化し
たセフアデツクスＧ−25カラムでゲル過して
未反応の２−メルカプトメチルアミンを除去
し、HS−Fab′を得た。これにで調製した
CHM化α−アミラーゼ１mgを加え、37℃で90
分間反応させた。次にこの反応液を0.1M酢酸
緩衝５ｍＭ塩化カルシウム溶液（PH6.0）で緩
衝化したセフアクリルＳ−300カラムゲル過
して分子量20万以上の分画を集め、これを濃縮
して目的の結合物を得た。 ヒトα−フエトプロテインの測定 濃度０〜2000nｇのヒトα−フエトプロテイ
ン溶液100μにで調製した結合物溶液にス
トレプトミセス・ビリドスポラスNo.297−
A2FERM−P5405の産生するアミラーゼイン
ヒビター100μｇ／ml及びポリエチレングリコ
ール6000 ７％を含有せしめた溶液100μｇを加
えて30分間反応させた。反応液にブルースター
チ懸濁液1.0mlを加えて37℃で30分間さらに反
応させ、0.5NNaOH1mlを加えて反応を停止さ
せた。これを攪拌後、3500rpmで２分間遠心
し、得られた上清の620nｍにおける吸光度を
測定した。 得られた吸光度とヒトα−フエトプロテイン
の濃度との関係を示す検量線を第１図に示す。 次に、ヒトα−フエトプロテインを含むヒト
血清100μをとり、20ｍＭグリセロリン酸緩
衝濃PH6.0で希釈して2n希釈列を調製した。
各々100μを小試験管にとり、これにで調
製された結合物溶液にストレプトミセス・ビリ
ドスポラスNo.297−A2FERM−P5405の産生す
るアミラーゼインヒビター100μｇ／ml及びポ
リエチレングリコール6000 ７％を含有せしめ
た溶液100μを加えて37℃で30分間加温した。
続いて、ブルースターチ1.0mlを加えて37℃で
30分間加温後0.5NNaOH1mlを加えて反応を停
止させた。撹拌後、3500rpmで２分間遠心し、
上清の620nｍにおける吸光度を測定した。得
られた結果を第２図に示す。図中、白丸はアミ
ラーゼインヒビターを加えた場合を表わし、黒
丸は加えなかつた場合を表わしている。図に示
す如く、アミラーゼインヒビターを加えない場
合には血清中のアミラーゼによる吸光度の上昇
があるが、アミラーゼインヒビターを加えた場
合には希釈を必要とせず、ブランクなしでも正
確に測定できる。 実施例 ２ SPDP化アミラーゼの調製 バチルス・ズブチリスアミラーゼ１mgを10ｍ
MO−フエナントロリンを含むPH7.5の0.1Mグ
リセロリン酸緩衝液に溶かし、Ｎ−サクシンイ
ミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオ
ン酸（SPDP）１mgを含むDMF溶液100μを
加えて室温で30分間撹拌して反応させた。この
反応液を予め、0.1Mグリセロリン酸緩衝液PH
7.5を用いて平衡化したセフアデツクスＧ−25
のカラムを用いてゲル過を行ない、SPDP化
アミラーゼ１mgを得た。 抗ヒトIgEヤギIgGF（ab′）2の調製 抗ヒトIgEヤギIgG10mgを0.1M酢酸緩衝液
（PH4.0）２mlにペプシン300μｇを加え、37℃で
18時間撹拌した。0.1NNaOHを加えてPHを6.0
に調節しこの反応液を予め0.1Mリン酸緩衝１
ｍＭ EDTA溶液（PH6.3）で緩衝化したセフ
アクリルＳ−300ゲルカラムに入れ、上記のリ
ン酸緩衝液で溶出した。分子量約10万付近に溶
出されたピーク部分を集めて１mlに濃縮し、目
的の抗ヒトIgEヤギIgGF（ab′）2を得た。 α−アミラーゼ−抗ヒトIgEヤギIgG Fab′結
合物の調製 で調製した抗ヒトIgEヤギIgG Ｆ（ab′）26
mgを含む0.1Mリン酸緩衝１ｍＭ EDTA溶液
（PH6.0）１mlに10mg／mlの２−メルカプトエチ
ルアミン塩酸塩水溶液100μを加え、37℃で
90分間撹拌した。この反応液を予め0.1Mグリ
セロリン酸緩衝液（PH7.5）で緩衝化したセフ
アデツクスＧ−25カラムでゲル過して未反応
の２−メルカプトメチルアミンを除去し、HS
−Fab′を得た。これにで調製したSPDP化α
−アミラーゼ２mgを加え、４℃で18時間反応さ
せた。次にこの反応液を0.1M酢酸緩衝５ｍＭ
塩化カルシウム溶液（PH6.5）で緩衝化したセ
【表】
実施例 ３
SPDP化アミラーゼの調製
バチルス・ズブチリスアミラーゼ１mgを実施
例２の場合と同様に処理してSPDP化アミラ
ーゼ１mgを得た。 抗ヒトアルブミンヤギIgG Ｆ（ab′）2の調製 抗ヒトアルブミンヤギIgG10mgを0.1M酢酸緩
衝液（PH4.0）２mlにペプシン300μｇを加え、
37℃で18時間撹拌した。0.1NNaOHを加えて
PHを6.0に調節しこの反応液を予め0.1Mリン酸
緩衝１ｍＭ EDTA溶液（PH6.3）で緩衝化し
たセフアクリルＳ−300ゲルカラムに入れ、上
記のリン酸緩衝液で溶出した。分子量約10万付
近に溶出されたピーク部分を集めて１mlに濃縮
し、目的の抗ヒトアルブミンヤギIgG Ｆ
（ab′）2を得た。 α−アミラーゼ−抗ヒトアルブミンヤギIgG
Fab′結合物の調製 で調製した抗ヒトアルブミンヤギIgG Ｆ
（ab′）26mgを含む0.1Mリン酸緩衝１ｍＭ
EDTA溶液（PH6.0）１mlに10mg／mlの２−メ
ルカプトエチルアミン塩酸塩水溶液100μを
加え、37℃で90分間撹拌した。この反応液を予
め0.1Mグリセロリン酸緩衝液（PH7.5）で緩衝
化したセフアデツクスＧ−25カラムでゲル過
して未反応の２−メルカプトメチルアミンを除
去し、HS−Fab′を得た。これにで調製した
SPDP化α−アミラーゼ１mgを加え、４℃で18
時間反応させた。次にこの反応液を0.1M酢酸
緩衝５ｍＭ塩化カルシウム溶液（PH6.5）で緩
衝化したセフアクリルＳ−300カラムでゲル
過して分子量20万以上の分画を集め、これを濃
縮して目的の結合物を得た。 ヒトアルブミンの測定 濃度０〜2560nｇのヒトアルブミン溶液100μ
を小試験管に分注し、これにで調製した結
合物溶液にストレプトミセス・ビリドスポラス
No.297−A2FERM−P5405の産生するアミラー
ゼインヒビター100μｇ／ml及びポリエチレン
グリコール6000 10％を含有せしめた溶液100μ
を加えて37℃で30分間反応させた。反応液に
ブルースターチ1.0mlを加えて37℃で30分間加
温後、0.5N NaOH1mlを加えて反応を停止さ
せた。撹拌後、3500rpmで２分間遠心し、上清
の620nｍにおける吸光度を測定した。得られ
た結果を第５図に示す。
例２の場合と同様に処理してSPDP化アミラ
ーゼ１mgを得た。 抗ヒトアルブミンヤギIgG Ｆ（ab′）2の調製 抗ヒトアルブミンヤギIgG10mgを0.1M酢酸緩
衝液（PH4.0）２mlにペプシン300μｇを加え、
37℃で18時間撹拌した。0.1NNaOHを加えて
PHを6.0に調節しこの反応液を予め0.1Mリン酸
緩衝１ｍＭ EDTA溶液（PH6.3）で緩衝化し
たセフアクリルＳ−300ゲルカラムに入れ、上
記のリン酸緩衝液で溶出した。分子量約10万付
近に溶出されたピーク部分を集めて１mlに濃縮
し、目的の抗ヒトアルブミンヤギIgG Ｆ
（ab′）2を得た。 α−アミラーゼ−抗ヒトアルブミンヤギIgG
Fab′結合物の調製 で調製した抗ヒトアルブミンヤギIgG Ｆ
（ab′）26mgを含む0.1Mリン酸緩衝１ｍＭ
EDTA溶液（PH6.0）１mlに10mg／mlの２−メ
ルカプトエチルアミン塩酸塩水溶液100μを
加え、37℃で90分間撹拌した。この反応液を予
め0.1Mグリセロリン酸緩衝液（PH7.5）で緩衝
化したセフアデツクスＧ−25カラムでゲル過
して未反応の２−メルカプトメチルアミンを除
去し、HS−Fab′を得た。これにで調製した
SPDP化α−アミラーゼ１mgを加え、４℃で18
時間反応させた。次にこの反応液を0.1M酢酸
緩衝５ｍＭ塩化カルシウム溶液（PH6.5）で緩
衝化したセフアクリルＳ−300カラムでゲル
過して分子量20万以上の分画を集め、これを濃
縮して目的の結合物を得た。 ヒトアルブミンの測定 濃度０〜2560nｇのヒトアルブミン溶液100μ
を小試験管に分注し、これにで調製した結
合物溶液にストレプトミセス・ビリドスポラス
No.297−A2FERM−P5405の産生するアミラー
ゼインヒビター100μｇ／ml及びポリエチレン
グリコール6000 10％を含有せしめた溶液100μ
を加えて37℃で30分間反応させた。反応液に
ブルースターチ1.0mlを加えて37℃で30分間加
温後、0.5N NaOH1mlを加えて反応を停止さ
せた。撹拌後、3500rpmで２分間遠心し、上清
の620nｍにおける吸光度を測定した。得られ
た結果を第５図に示す。
第１図は本発明の方法で測定して得られたヒト
α−フエトプロテインの検量線であり、第２図は
ヒト血清の希釈率と吸光度の関係をアミラーゼイ
ンヒビターを添加した場合（白丸）と添加しなか
つた場合（黒丸）について測定した結果を示すも
のである。第３図は測定の一例で使用した多層フ
イルムの構成を示すものであり、第４図はこの多
層フイルムを用いて測定したヒトIgE濃度と相対
反射強度との関係を示すものである。第５図はヒ
トアルブミン濃度と吸光度との関係を示すもので
ある。
α−フエトプロテインの検量線であり、第２図は
ヒト血清の希釈率と吸光度の関係をアミラーゼイ
ンヒビターを添加した場合（白丸）と添加しなか
つた場合（黒丸）について測定した結果を示すも
のである。第３図は測定の一例で使用した多層フ
イルムの構成を示すものであり、第４図はこの多
層フイルムを用いて測定したヒトIgE濃度と相対
反射強度との関係を示すものである。第５図はヒ
トアルブミン濃度と吸光度との関係を示すもので
ある。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 高等動物由来のアミラーゼを含有している検
体の抗原決定基具有物質を測定する方法におい
て、 該抗原決定基具有物質と、この抗原決定基具有
物質に対する抗体と検体に実質的に含まれていな
いアミラーゼとの結合物を接触せしめて反応さ
せ、 前記の高等動物由来のアミラーゼには、このア
ミラーゼの活性を阻害する程度が前記の結合物に
結合されているアミラーゼの活性を阻害する程度
より大きいアミラーゼインヒビターを接触せしめ
て反応させ、 さらに、前記の結合物に結合されているアミラ
ーゼが作用しうる水に不溶性の高分子物質に前記
の結合物を接触せしめて酵素反応させ、アミラー
ゼ活性を測定することを特徴とする、 抗原決定基具有物質の測定法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2771084A JPH0246897B2 (ja) | 1984-02-16 | 1984-02-16 | Amiraazeomochiitakogenketsuteikigujubutsushitsusokuteiho |
| US06/699,675 US4757001A (en) | 1984-02-16 | 1985-02-08 | Method of measuring biological ligand by utilizing amylase |
| EP85300991A EP0152305B1 (en) | 1984-02-16 | 1985-02-14 | Method of measuring biological ligand by utilising amylase |
| DE8585300991T DE3584840D1 (de) | 1984-02-16 | 1985-02-14 | Verfahren zur messung eines biologischen ligands unter verwendung von amylase. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2771084A JPH0246897B2 (ja) | 1984-02-16 | 1984-02-16 | Amiraazeomochiitakogenketsuteikigujubutsushitsusokuteiho |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60171461A JPS60171461A (ja) | 1985-09-04 |
| JPH0246897B2 true JPH0246897B2 (ja) | 1990-10-17 |
Family
ID=12228550
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2771084A Expired - Lifetime JPH0246897B2 (ja) | 1984-02-16 | 1984-02-16 | Amiraazeomochiitakogenketsuteikigujubutsushitsusokuteiho |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0246897B2 (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH05232112A (ja) * | 1992-02-20 | 1993-09-07 | Fuji Photo Film Co Ltd | 乾式免疫分析要素 |
| JP5265257B2 (ja) | 2008-06-30 | 2013-08-14 | 富士フイルム株式会社 | 犬ｃｒｐ及び人ｃｒｐを認識する抗体 |
| JP5292270B2 (ja) | 2009-12-21 | 2013-09-18 | 富士フイルム株式会社 | 犬ｃｒｐ測定用乾式分析要素 |
| JP5492158B2 (ja) | 2011-08-24 | 2014-05-14 | 富士フイルム株式会社 | ヒトｔｓｈ及び犬ｔｓｈに対する抗体 |
-
1984
- 1984-02-16 JP JP2771084A patent/JPH0246897B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS60171461A (ja) | 1985-09-04 |
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