JPH0340831B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、例えば血清、尿などに含まれる薬物
あるいは各種疾患に由来する微量成分などを測定
する方法に関するものである。

血清、尿などの体液に含まれる微量成分の分析
は病気の診断あるいは治療経過の判定などに非常
に有意義であり、日常の臨床検査に活用されてい
る。ところが、これらの体液には多種多様の成分
が含まれており、そのなかには、分子量の近似し
た物質、生理活性の似た物質あるいは構造の近似
した物質なども含まれていることも多い。そこ
で、この分析法は特異性が高く、かつ微少量まで
定量しうることが要求される。さらに、日常検査
として利用されるために、簡便かつルーチン化し
うることが望ましい。

このような条件を備えた分析法として免疫学的
測定法がある。この方法は、抗原−抗体間の高い
新和性と、抗体が抗原決定基を判別する高い特異
性を利用しており、ラジオイムノアツセイ、酵素
免疫測定法、血球等の凝集反応を利用した方法等
に大別される。

ラジオイムノアツセイは、感度はすぐれている
が、人体に有害である放射性物質を用いるところ
から使用場所や使用量が厳しく規制されており、
特殊な施設を必要とする。一方、酵素免疫法はこ
のような問題はないが、ラジオイムノアツセイも
そうであるが、遊離標識物と結合標識物の分離が
必要である。そして、この分離操作は、非常に繁
雑であり、操作及び測定誤差の両面で問題になつ
ている。血球等の凝集反応を利用した方法の場合
にはこの分離操作は必要ないが、この方法は感度
が低く、数ｎｇ〜ｆｇのような極微量を測定する
ことは困難である。

本発明者らは上記のような欠点のない測定方法
を開発すべく種々検討の結果、水に不溶性の高分
子物質を基質とする酵素に抗原決定基具有物質を
結合させ、この抗原決定基具有物質と測定対象た
る抗原決定基具有物質とを抗体に対して競争反応
させ、その後この結合物の酵素活性を測定すると
測定対象たる抗原決定基具有物質の量に応じて酵
素活性が顕著に低下することを見出し、この方法
を用いれば抗原決定基具有物質を高感度で、かつ
前述の分離操作を行なわないで簡便に測定しうる
ことを見出してその内容を特許出願（特願昭58−
38975号、特開昭59−164960号）した。そして、
さらに研究を進め、前記酵素に抗原決定基具有物
質でなく抗体を結合させてこの結合物の抗体に測
定対象の抗原決定基具有物質を反応させ、その後
この結合の酵素活性を測定するとやはり測定対象
たる抗原決定基具有物質の量に応じて酵素活性が
顕著に低下することを見出した。そして、この方
法は先の方法に比べ、操作がさらに簡略になり、
また、抗原決定基具有物質を抗体の製造に使用す
るだけであるところからほとんど消費しないで済
むことを見出して本発明を完成するに至つた。

すなわち本発明は、検体に含まれる抗原決定基
具有物質と、この抗原決定基具有物質に対する抗
体と水に不溶性の高分子物質に作用しうる酵素と
の結合物を、溶液中で接触せしめて反応させ、そ
の後この結合物に前記の高分子物質を接触せしめ
て酵素反応させ、酵素活性を測定することを特徴
とする抗原決定基具有物質の測定方法に関するも
のである。

本発明方法における測定対象は検体に含まれる
抗原決定基具有物質である。検体の種類は限定さ
れないが、例えば血清、尿などである。血清、尿
などの場合には、通常は特別な前処理を必要とせ
ず、そのまま測定を行なうことができる。

抗原決定基具有物質（以下リガンドという。）
は抗原決定基を一又は二以上有しているものであ
り、例えば、各種内分泌腺に由来するホルモン
類、免疫グロブリン、アルブミン、フエリチン等
の血漿蛋白質、HB抗原等のウイルス、バクテリ
ア類、α−フエトプロテイン、癌胎児性抗原等の
各種臓器あるいは血中、尿中に存在する抗原など
である。

結合物を構成している抗体はリガンドと反応す
るものでなければならない。この抗体にはＦ
（ab′）₂、Fab′、Fabなどのフラグメントも含まれ
る。

抗体の製造方法としては、リガンド又はリガン
ドと蛋白との結合物を兎、山羊、馬、モルモツ
ト、ニワトリなどの混血動物に体重１Kgあたり
0.3〜２mgを１〜数回背中皮下、フツトパツド、
大腿筋等にアジユバントとともに注射して当該動
物の体内に形成させる。この抗体は血清をそのま
ま用いてもよく、血清から抗体すなわち免疫グロ
ブリンを採取する公知の方法によつて精製してか
ら用いてもよい。

一方、この抗体はモノクローナル抗体として取
得することもできる。その場合には、マウスに前
記のいずれかの抗原をアジユバントとともに数回
腹腔等に注射し、脾臓細胞を取り出してポリエチ
レングリコール等を用いてマウスミエローマ細胞
と融合させる。そして、この融合細胞のなかから
当該抗体を産生するものをクローニングによつて
モノクローン細胞として増殖させ、マウス腹腔中
で増殖させることによつて単一抗体、すなわちモ
ノクローナル抗体を大量に製造することができ
る。

結合物を構成している酵素は水に不溶性の高分
子化合物に作用しうるものであるが、そのほか活
性の測定方法が容易なものがよい。このような酵
素は、例えばアミラーゼ、セルラーゼ、コラーゲ
ナーゼ、マンナーゼ、プロテアーゼ、エラスター
ゼ、リパーゼ、などである。

酵素と抗体との結合方法は双方の官能基を考慮
して決定すればよい。官能基は、アミノ基、カル
ボキシル基、水酸基、チオール基、イミダゾール
基、フエニル基などを利用することができ、例え
ばアミノ基相互間を結合させる場合には、ジイソ
シアネート法、グルタルアルデヒド法、ジフルオ
ロベンゼン法、ベンゾキノン法等数多く知られて
いる。また、アミノ基とカルボキシル基との間を
結合させる方法としては、カルボキシル基をサク
シンイミドエステル化する方法のほかカルボジイ
ミド法、ウツドワーク試薬法等が知られており、
アミノ基と糖鎖を架橋する過ヨウ素酸酸化法
（Nakane法）もある。チオール基を利用する場
合には、例えばもう一方の側のカルボキシル基を
サクシンイミドエステル化してこれにシステイン
を反応させてチオール基を導入し、チオール基反
応性二価架橋試薬を用いて双方を結合することが
できる。フエニル基を利用する方法としてはジア
ゾ化法、アルキル化法などがある。結合方法はこ
れらの例示に限られるものではなく、このほか例
えば「Method in Immunochemistry」あるいは
「酵素抗体測定法」等の成書に記載されている方
法のなかから適宜選択して利用することができ
る。結合比は１：１に限らず、目的に応じて任意
の比率をとることができることはいうまでもな
い。反応後は、ゲル過法、イオン交換クロマト
グラフイー、アフイニテイークロマトグラフイー
などを適宜組み合わせて精製を行い、必要により
凍結乾燥法等で乾燥する。

検体に含まれるリガンドと、前記の抗体と酵素
との結合物を溶液中で接触させる。その際、溶液
の温度は20〜45℃程度、そしてPHは通常４〜8.5
程度が適当である。PHを一定に保つために、必要
により、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液などの緩衝液
を用いてもよい。その際、結合物の適当な量は、
その種類、リガンドの種類、あるいは接触時の条
件などによつて異なるので予め試験をして定める
のがよい。リガンドと結合物との接触時間はいず
れも、通常は充分に反応しうる程度がよく、例え
ば37℃の場合には20〜60分間程度が適当である。

リガンドと反応させた結合物は高分子物質に接
触させて反応させる。

高分子物質と接触させる結合物は反応物から分
離したものでもよいが、通常は反応物に含まれて
いる状態のままでよい。

この高分子物質は結合物が酵素反応しうるもの
であり、通常は基質であるが、水に不溶性である
ところに特徴がある。すなわち、高分子物質が不
溶性であるために結合物の酵素部分との接触の大
部分が固−液間になり、その結果、酵素の高分子
化による立体障害が大きく現われる。本発明者ら
はこのことを確認するためにα−アミラーゼの系
を用いて検討したところ、ペンタオースの場合に
は酵素の高分子化による酵素活性の低下がほとん
ど認められず、一方、不溶化デンプンの場合には
酵素活性が著しく低下した。高分子物質の例とし
ては、α−アミラーゼの場合には不溶性デンプ
ン、セルラーゼの場合にはセルロース、コラーゲ
ナーゼの場合にはコラーゲン、マンナーゼの場合
にはマンナン、プロテアーゼの場合には不溶性蛋
白質、エラスターゼの場合にはエラスチン、そし
てリパーゼの場合には各種油脂類を挙げることが
できる。この高分子物質はそれ自身が可溶性であ
つても、不溶性の担体に結合させるとか、重合さ
せるなどして不溶化して用いることもできる。

酵素反応条件は用いる酵素に応じて適当になる
ように定めればよい。

酵素反応後は酵素活性を求める。酵素活性は、
この酵素反応による分解物の増加、原料である高
分子物質の減少、その他、酵素反応による系の変
化を追跡すればよい。

本発明の方法は、リガンドを特異性高くかつ極
めて高感度で測定できる。また、操作が簡単であ
り、安価かつ容易にリガンドを定量することが可
能である。本発明の方法はリガンドの種類を問わ
ず測定できるが比較的高分子の測定に威力を発揮
する。本発明の方法に用いる試薬にはリガンドを
直接使用せず、リガンドは抗体の製造に用いられ
るだけであるから微量で足りるという利点も有す
る。従つて、本発明の方法は測定対象と同じリガ
ンドが入手しにくい場合とか、高価な場合に特に
有効である。

以下、実施例を示す。

実施例 １ セルラーゼ基質の調製 紙を20cm×20cmの大きさに切断し、あらか
じめ用意しておいたリアクテイブブルー溶液
（５ｇリアクテイブブルー、５ｇNa₂CO₃蒸留
水200ml）中に浸した。60℃に加温し、時々撹
拌しながら、３日間加熱を続けた。この紙を
蒸留水で十分に洗浄し、過剰の染料を除去し
た。続いて、恒温乾燥器で乾燥させ、１cm×５
cmの大きさに切断して、目的の基質を得た。

セルラーゼ−抗ヒトIgGヤギIgG結合物の調
製 セルラーゼ10mgをPH6.0の0.1Mリン酸緩衝液
２mlに解かし４−（マレイミドメチル）−１−シ
クロヘキサンカルボン酸 Ｎ−ヒドロキシサク
シイミドエステル（CHMS）のジメチルスル
ホキシド溶液（２mg／ml）200μを加え、室
温で１時間、放置した。この反応液をセフアデ
ツクスＧ−25を用いてゲル過し、未反応の
CHMSを除去した。このCHMS化セルラーゼ
を１mlまで濃縮した。

一方、抗ヒトIgGヤギIgG10mgを５ｍＭ
EDTAを含むPH7.5の0.1Mリン酸緩衝液２mlに
とかし９mg／mlのＳ−アセチルメルカプトコホ
ク酸無水物（SAMS）のジオキサン溶液200μ
加えた。それから37℃で一時間放置後、1M
ヒドロキシルアミン水溶液（PH7.5）200μ化
加えた。30分後反応液をセフアデツクスＧ−25
でゲル過し未反応のSAMSを除いた。この
HS−抗ヒトIgGヤギIgG溶液を前述のCHM化
セルテーゼ１mlに加え、37℃で２時間放置し
た。この反応液をセフアクリルＳ−300でゲル
過し目的のセルラーゼ−抗ヒトIgGヤギIgG
結合物を得た。

ヒトIgGの測定 セルラーゼ−抗ヒトIgGヤギIgG結合物を含
む溶液50μにヒトIgGを含む標準溶液50μを
加え、37℃で30分間放置した。これにPH5.0の
0.1M酢酸緩衝液を１ml加え、次にで調製し
たブルーセレロース紙を１枚加えた。１時間
後反応液の吸光度を波長650nｍで測定した。
第１図は標準溶液中のヒトIgG量と吸光度を示
したものである。

実施例 ２ CNM化アミラーゼの調製 バチルス・ズブチリスアミラーゼ５mgをPH
6.3の0.1Mリン酸緩衝液１mlに溶かし、
CHMS2mg／mlのDMF溶液100μを加えて室
温で１時間放置して反応させた。この反応液を
セフアデツクスＧ−25のカラムに入れ、PH6.3
の0.1Mリン酸緩衝液を流してゲル過を行な
い、素通り分画を分取した。

抗ヒトα−フエトプロテインヤギIgG Ｆ
（ab′）₂の調製 抗ヒトα−フエトプロテインヤギIgG10mgを
0.1M酢酸緩衝液（PH4.0）２mlにペプシン300μ
ｇを加え、37℃で18時間撹拌した。0.1N
NaOHを加えてPHを6.0に調節しこの反応液を
予め0.1Mリン酸緩衝１ｍＭ EDTA溶液（PH
6.3）で緩衝化したセフアクリルＳ−300ゲルカ
ラムに入れ、上記のリン酸緩衝液で溶出した。
分子量約10万付近に溶出されたピーク部分を集
めて１mlに濃縮し、目的の抗ヒトα−フエトプ
ロテインヤギIgG Ｆ（ab′）₂を得た。

α−アミラーゼ−抗ヒトα−フエトプロテイ
ンヤギIgG Fab′結合物の調製 で調製した抗ヒトα−フエトプロテインヤ
ギIgG Ｆ（ab′）₂6mgを含む0.1Mリン酸緩衝
1mM EDTA溶液（PH6.0）１mlに10mg／mlの
２−メルカプトエチルアミン塩酸塩水溶液
100μを加え、37℃で90分間撹拌した。この
反応液を予め0.1Mリン酸緩衝液（PH6.3）で緩
衝化したセフアデツクスＧ−25カラムでゲル
過して未反応の２−メルカプトエチルアミンを
除去し、HS−Fab′を得た。これにで調製し
たCHM化α−アミラーゼ２mgを加え、37℃で
90分間反応させた。次にこの反応液を0.1M酢
酸緩衝5mM塩化カルシウム溶液（PH6.0）で緩
衝化したセフアクリルＳ−300カラムでゲル
過して分子量20万以上の分画を集め、これを濃
縮して目的の結合物を得た。

α−フエトプロテインの測定 濃度０〜2000nｇのα−フエトプロテイン溶
液50μにで調製した結合物溶液50μを加
えて20分間反応させた。反応後にブルースター
チ懸濁液1.0mlを加えて37℃で20分間さらに反
応させ、0.5N NaOH1mlを加えて反応を停止
させた。これを撹拌後、3500rpmで２分間遠心
し、得られた上清の620nｍにおける吸光度を
測定した。

得られた吸光度とα−フエトプロテインの濃
度との関係を示す検量線を第２図に示す。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の方法で測定して得られたヒト
IgG量と吸光度との関係を示すものであり、第２
図は同じくα−フエトプロテイン量と吸光度との
関係を示すものである。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 液体に含まれる抗原決定基具有物質と、この
   抗原決定基具有物質に対する抗体と水に不溶性の
   高分子物質に作用しうる酵素との結合物を、溶液
   中で接触せしめて反応させ、その後この結合物に
   前記の高分子物質を接触せしめて酵素反応させ、
   酵素活性を測定することを特徴とする抗原決定基
   具有物質の測定方法。